PT2734549T - Anticorpo monoclonal contra interleucina-31 canina - Google Patents

Anticorpo monoclonal contra interleucina-31 canina Download PDF

Info

Publication number
PT2734549T
PT2734549T PT127485472T PT12748547T PT2734549T PT 2734549 T PT2734549 T PT 2734549T PT 127485472 T PT127485472 T PT 127485472T PT 12748547 T PT12748547 T PT 12748547T PT 2734549 T PT2734549 T PT 2734549T
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
seq
antibody
ser
leu
amino acid
Prior art date
Application number
PT127485472T
Other languages
English (en)
Inventor
F Bammert Gary
A Dunham Steven
Original Assignee
Zoetis Services Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=46704979&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PT2734549(T) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Zoetis Services Llc filed Critical Zoetis Services Llc
Publication of PT2734549T publication Critical patent/PT2734549T/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/08—Antiseborrheics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6869—Interleukin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/54—Interleukins [IL]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

"ANTICORPO MONOCLONAL CONTRA INTERLEUCINA-31 CANINA"
DESCRIÇÃO
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao campo de anticorpos monoclonais recombinantes e suas utilizações em procedimentos clínicos e científicos, incluindo procedimentos diagnósticos. A presente invenção também proporciona anticorpos anti-IL31 isolados na forma de composições veterinárias úteis para tratar uma condição patológica prurítica ou uma condição patológica alérgica em cães.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A dermatite atópica foi definida pela equipa de trabalho da Ordem de Dermatologia Veterinária Americana como "uma doença da pele alérgica prurítica e inflamatória predisposta geneticamente com características clínicas típicas" (Olivry, et ai. Veterinary Immunology e Immunopathology 2001; 81: 143-146). A equipa de trabalho também reconheceu que a doença em caninos foi associada com IgE específica de alergénios (Olivry, et ai. 2001 supra; Marsella & Olivry Clinics in Dermatology 2003; 21: 122-133) . Prurido severo, juntamente com alopécia secundária e eritema, são os sintomas mais evidentes e preocupantes dos donos de animais de estimação. A prevalência de dermatite atópica não é conhecida com precisão devido a dados epidemiológicos fracos e inconsistentes, mas estima-se que seja 10% da população canina total (Marsella & Olivry 2003 supra; Scott, et ai. Canadian Veterinary Journal 2002; 43: 601-603; Hillier Veterinary
Immunology e Immunopathology 2001; 81: 147-151) . Em todo o mundo, cerca de 4,5 milhões de cães são afetados com esta condição patológica crónica que dura toda a vida. A incidência parece estar a aumentar. Têm-se suspeitado de predileções de raça e sexo, mas podem variar grandemente dependendo da região geográfica (Hillier, 2001 supra; Picco, et ai. Vet Dermatol. 2008; 19: 150-155).
Os fatores potenciais envolvidos na dermatite alérgica são numerosos e fracamente compreendidos. Componentes nos alimentos podem despoletar a dermatite atópica (Picco, 2008 supra), bem como alergénios ambientais, tais como pulgas, ácaros do pó, tanaceto, extratos de plantas, etc. Fatores genéticos também desempenham um papel importante. Apesar de não ter sido confirmada qualquer predileção por raça, pensa-se que algum modo de hereditariedade aumenta a predisposição para a dermatite atópica (Sousa & Marsella Veterinary Immunology e Immunopathology 2001; 81: 153-157; Schwartzman, et al. Clin. Exp. Immunol. 1971; 9: 549-569. A interleucina-31 (IL-31) é uma citocina que foi clonada em 2004. É produzida principalmente por células auxiliares T (Th) 2 ativadas (Dillon et al. Nat Immunol 2004; 5:752-60), mas também é produzida em mastócitos e macrófagos. IL-31 liga um co-recetor composto de recetor A de IL-31 (IL-31 RA) e um recetor M de oncostatina (OSMR) (Dillon et al. 2004 supra e Bilsborough et al. J Allergy Clin Immunol. 2006 117 (2) :418-25) . A ativação do recetor resulta na fosforilação de STAT através de recetores JAK. A expressão do co-recetor foi mostrada em macrófagos, queratinócitos e no gânglio da raiz dorsal. Recentemente, verificou-se que a IL-31 está envolvida na dermatite, lesões da pele pruríticas, alergia e hiperssensibilidade das vias respiratórias. Ver Fig. 1. A estimulação das células T com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 regula imediatamente para cima a expressão de mRNA de IL-31 (Dillon et al. 2004 supra). Análise de microensaios mostrou que a IL-31 induz certos genes quemotáticos, tais como CXCLl, CLL17 (timo e quimiocina regulada para ativação [TARC] ) , CCL19 (proteína inflamatória de macrófago [πύχ]3β), CCL22 (quimiocina derivada de monócito [MDC], CCL23 (MIP3) e CCL4 (ΜΙΡβ) (Dillon et al. 2004 supra).
Ratinhos transgénicos que sobre-expressam a IL-31 mostram inflamação da pele, prurite, dermatite severa e alopécia (Dillon et al. 2004 supra). A injeção subcutânea de IL-31 em ratinhos despoleta infiltração pelas células inflamatórias, neutrófilos, eosinófilos, linfócitos e macrófagos e resulta em espessamento epidérmico e acantose dérmica. Em ratinhos NC/Nga, com dermatite atópica (AD) devido a causas naturais, IL-31 é sobre-expressa em lesões da pele e correlaciona-se com prurido (Takaoka et al. Eur J. Pharmacol. 2005; 516, 180-181; Takaoka et al. Exp. Dermatol. 2006; 15, 161-167) . Além disso, em modelos murinos, a IL-31 mostrou induzir começo rápido de prurido (Raap et al. J Allergy Clin Immunol. 2008;122(2):421-3).
Estudos adicionais indicaram que a IL-31 está associada com inflamação da pele e prurido induzidos por dermatite atópica em humanos. Em pacientes com AD humana, a expressão de mRNA de IL-31 é consideravelmente superior em lesões da pele do que em pele não lesionada e a expressão em pele não lesionada é superior à em pele normal de pacientes saudáveis (Sonkoly et al. J Allergy Clin Immunol 2006; 117:411-7) . Outro estudo reportou que células T (CLA)-positivas a antigeno linfócito cutâneo CD45RO+ (memória) na pele de pacientes com AD expressam mRNAeproteína de IL-31 (Bilsborough et al. 2006 supra). Também foi reportado que a sobre-expressão de mRNA de IL-31 na pele de pacientes ou dermatite de contacto alérgica está correlacionada com a expressão de mRNA de IL-4 e IL-13, mas não com a expressão de mRNA de interferão (IFN)-y (Neis et al. J. Allergy Clin. Immunol. 2006; 118, 930-937). Além disso, mostrou-se que os níveis no soro de IL-31 estão elevados em pacientes humanos com urticária espontânea crónica e ainda mais em pacientes com AD (Raap et al. Exp Dermatol. 2010; 19 (5) : 464-6) . Além disso, foi observada em humanos uma correlação da severidade de AD com os níveis no soro de IL-31 (Rapp et al. 2008 supra). Também se mostrou que a secreção de IL-31 é potenciada em mastócitos após reticulação de IgE e como uma resposta ao superantígeno Staphylococcal em indivíduos atópicos. Além disso, mostrou-se que a IL-31 estimula a produção de vários mediadores pró-inflamatórios, incluindo IL-6, IL-8, CXCLl, CC17 e múltiplas metaloproteinases em miofibroblastos colónicos humanos (Yagi et ai. International Journal of Molecular Medicine 2007; 19(6): 941-946. A hiperssensibilidade de tipo I contra alergénios ambientais é considerada como o principal mecanismo da AD canina e os níveis de citocinas mediadas por Th2, tais como IL-4 são aumentados nas lesões da pele de cães com AD (Nuttall, et ai. Vet. Immunol. Immunopathol. 2002; 87, 379-384). Além disso, a infiltração por células inflamatórias, linfócitos e neutrófilos, é um mecanismo importante subjacente ao agravamento das lesões da pele; a sobre-expressão de genes quemotáticos, tais como CCL17/TARC, CCR4 e CCL28/quimiocina epitelial associada às mucosas (MEC) contribui para o agravamento de lesões da pele nos cães com AD (ver, Maeda, et ai. Vet. Immunol. Immunopathol. 2005; 103, 83-92; Maeda, et ai . Vet. Immunol. Immunopathol.2002b; 90, 145-154; e Maeda, et ai. J. Vet. Med. Sei. 2008; 70, 51-55).
Evidência recente sugeriu que a IL-31 pode estar envolvida na promoção de inflamação alérgica e numa resposta epitelial das vias respiratórias característica de asma alérgica (Chattopadhyay, et ai. J Biol Chem 2007; 282:3014-26; e Wai, et ai. Immunology, 2007; 122, 532-541) . Mizuno et ai. (Vet.Imm. 2009, 131 (1-2) : 140-143) clonaram IL-31 canina e detetaram níveis baixos de IL-31 canina no timo, testículos, baço e rins, mas não na pele de cães atópicos.
Estas observações suportam a hipótese de que a IL-31 desempenham um papel significativo em ambas condições patológicas pruríticas e alérgicas. Seria desejável proporcionar um anticorpo terapêutico contra a IL-31 útil para tratar uma condição patológica prurítica e/ou uma condição patológica alérgica em cães ou gatos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO O tema da invenção é definido pelas reivindicações. A presente invenção proporciona um anticorpo isolado que se liga especificamente a uma IL-31 canina. 0 anticorpo isolado reduz, inibe ou neutraliza a sinalização pSTAT mediada por IL-31 canina num ensaio à base de células. Nalgumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Numa modalidade, 0 anticorpo monoclonal é quimérico. Noutra modalidade, o anticorpo é caninizado. Nalgumas modalidades, o anticorpo reduz, inibe ou neutraliza a atividade de IL-31 num cão ou num gato. Em modalidades preferidas, o anticorpo reduz, inibe ou neutraliza uma condição patológica prurítica ou uma condição patológica alérgica. Condições patológicas pruríticas incluem, por exemplo, dermatite atópica, eczema, psoríase, escleroderma, e prurido.prurido. Condições patológicas alérgicas incluem, por exemplo, dermatite alérgica, eczema estiai, urticária, arquejos, doença inflamatória das vias respiratórias, obstrução recorrente das vias respiratórias, hiperresponsividade das vias respiratórias, doença pulmonar obstrutiva crónica e processos inflamatórios que resultam de autoimunidade, tais como sindrome do cólon irritável (IBS). Numa modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo isolado, ou porção que se liga a antigeno do mesmo, incluindo pelo menos uma das seguintes: uma região determinante de complementaridade (CDR)1 da cadeia pesada (VH) variável com a sequência de aminoácidos YYDIN (SEQ ID NO: 1; 11E12-VH-CDR1), SYDMS (SEQ ID NO: 2; 19D07-VH-CDR1) ou NYGMS (SEQ ID NO: 3; 34D03- VH-CDRl); uma CDR2 da cadeia pesada variável com a sequência de aminoácidos WIFPGDGGTKYNETFKG (SEQ ID NO: 4; 11E12- VH-CDR2), TITSGGGYTYSADSVKG (SEQ ID NO: 5; 19D07-VH-CDR2) ou TISYGGSYTYYPDNIKG (SEQ ID NO: 6; 34D03-VH-CDR2); uma CDR3 da cadeia pesada variável com a sequência de aminoácidos ARGGTSVIRDAMDY (SEQ ID NO: 7; 11E12-VH- CDR3), ARQNWWGLAY (SEQ ID NO: 8; 19D07-VH-CDR3) ou VRGYGYDTMDY (SEQ ID NO: 9; 34D03-VH- CDR3); e uma variante do mesmo com uma ou mais substituições de aminoácidos conservadoras em pelo menos uma de CDRl, CDR2 ou CDR3 .
Noutra modalidade, a invenção proporciona um anticorpo isolado, ou porção que se liga a antígeno do mesmo, incluindo pelo menos um dos grupos seguintes: uma cadeia leve variável (VL) que compreende uma região determinante de complementaridade (CDR) 1 com a sequência de aminoácidos RASESVDNYGISFMH (SEQ ID NO: 10; 11E12-VL-CDR1), KSSQSLLNSGNQKNYLA (SEQ ID NO: 11; 19D07-VL-CDRl) ou KASQSVSFAGTGLMH (SEQ ID NO: 12; 34D03-VL-CDR1); uma CDR2 da cadeia leve variável com a sequência de aminoácidos RASNLES (SEQ ID NO: 13; 11E12-VL-CDR2), GASTRES (SEQ ID NO: 14; 19D07-VL-CDR2) ou RASNLEA (SEQ ID NO: 15; 34D03-VL-CDR2); uma CDR3 da cadeia leve variável com a sequência de aminoácidos QQSNKDPLT (SEQ ID NO: 16; 11E12-VL-CDR3), QNDYSYPYT (SEQ ID NO: 17;19D07-VL-CDR3) ou QQSREYPWT (SEQ ID NO: 18; 34D03-VL-CDR3); e uma variante do mesmo com uma ou mais substituições de aminoácidos conservadoras em pelo menos uma de CDRl, CDR2 ou CDR3.
Ainda noutras modalidades, um anticorpo com pelo menos uma das CDRs da cadeia leve variável descritas acima, pode ainda incluir pelo menos uma das seguintes CDRs da cadeia pesada variável: uma região determinante de complementaridade (CDR)1 da cadeia pesada variável com a sequência de aminoácidos YYDIN (SEQ ID NO: 1; 11E12-VH-CDR1) , SYDMS (SEQ ID NO: 2; 19D07-VH-CDR1) ou NYGMS (SEQ ID NO: 3; 34D03-VH- CDRl); uma CDR2 da cadeia pesada variável com a sequência de aminoácidos WIFPGDGGTKYNETFKG (SEQ ID NO: 4; 11E12-VH-CDR2), TITSGGGYTYSADSVKG (SEQ ID NO: 5; 19D07- VH-CDR2) ou TISYGGSYTYYPDNIKG (SEQ ID NO: 6; 34D03-VH-CDR2); uma CDR3 da cadeia pesada variável com a sequência de aminoácidos ARGGTSVIRDAMDY (SEQ ID NO: 7; 11E12-VH- CDR3), ARQNWWGLAY (SEQ ID NO: 8; 19D07-VH-CDR3) ou VRGYGYDTMDY (SEQ ID NO: 9; 34D03-VH- CDR3); e uma variante do mesmo com uma ou mais substituições de aminoácidos conservadoras em pelo menos uma de CDRl, CDR2 ou CDR3.
Nalgumas modalidades, o anticorpo pode incluir pelo menos uma das seguintes: a) uma cadeia leve variável que compreende
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASN
LESGIPA RFSGSGSRTDFTLTINPVETDDVATYYCQQSNKDPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 19; MU-11 E12-VL), DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASN LESGVPD RFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQSNKDPLTFGAGTKLEIK (SEQ ID NO: 20; CAN-11 El2-VL-cUn-FW2), DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASESVDNYGISFMHWFQQKPGQSPQLLIYRASN LESGVPD RFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQSNKDPLTFGAGTKLEIK (SEQ ID NO: 21; CAN-llEl2-VL-cUn-13), DIVMSQSPSSLSVSAGDKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPWQPPKLLIYGA STRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 22; MU-19D07-VL), EIVMTQSPASLSLSQEEKVTITCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQAPKLLIYGA STRESGV PSRFSGSGSGTDFSFTISSLEPEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 23; CAN-19D07-VL-998-1), DILLTQSPASLAVSLGQRAIISCKASQSVSFAGTGLMHWYQQKPGQQPKLLIYRASN LEAGVPT RFSGSGSRTDFTLNIHPVEEEDAATYFCQQSREYPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 24; MU-34D03-VL) ou EIVMTQSPASLSLSQEEKVTITCKASQSVSFAGTGLMHWYQQKPGQAPKLLIYRASN LEAGVPS RFSGSGSGTDFSFTISSLEPEDVAVYYCQQSREYPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 25; CAN-34D03-VL-998-1);
b) uma cadeia pesada variável que compreende QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFKYYDINWVRQRPEQGLEWIGWIFPGDGG TKYNE TFKGKATLTTDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYFCARGGTSVIRDAMDYWGQGTSVTV SS (SEQ ID NO: 26; MU- 11 E12-VH),
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFKYYDINWVRQAPGAGLDWMGWIFPGDGG TKYN
ETFKGRVTLTADTSTSTAYMELSSLRAGDIAVYYCARGGTSVIRDAMDYWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 27; CAN- 11E12-VH-415-1),
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQIPEKRLEWVATITSGGGY
TYSADS VKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRSEDTAVYYCARQNWVVGLAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 28; MU-19D07- VH),
EVQLVESGGDLVKPGGSLRLSCVASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLQWVATITSGGGY
TYSA DSVKGRFTISRDNARNTLYLQMNSLRSEDTAVYYCARQNWVVGLAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 29; CAN- 19D07-VH-400-1),
EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFSFSNYGMSWVRQTPDKRLEWVATISYGGSY
TYYPD NIKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCVRGYGYDTMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 30; MU- 34D03-VH) ou
EVQLVESGGDLVKPGGSLRLSCVASGFTFSNYGMSWVRQAPGKGLQWVATISYGGSY
TYYP DNIKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCVRGYGYDTMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 31; CAN- 34D03-VH-568-1); e c) variantes do mesmo com uma ou mais substituições de aminoácidos conservadoras.
Numa modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a uma região entre aproximadamente os resíduos de aminoácidos 95 e 125 da sequência de aminoácidos IL-31 canina de SEQ ID NO: 32 . Nalgumas modalidades, o anticorpo se liga especificamente a uma região entre aproximadamente os resíduos de aminoácidos 102 e 122 da sequência de aminoácidos IL-31 canina de SEQ ID NO: 32. A presente invenção também proporciona uma composição veterinária incluindo uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um anticorpo descrito anteriormente.
Noutras modalidades, a invenção proporciona uma célula hospedeira que produz um anticorpo descrito anteriormente.
Ainda em modalidades adicionais, a invenção proporciona um ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo de acordo com a presente invenção, incluindo uma sequência de ácido nucleicos que codifica pelo menos uma das seguintes: uma região determinante de complementaridade (CDR)1 da cadeia pesada variável (VH) com a sequência de aminoácidos YYDIN (SEQ ID NO: 1; 11 E12-VH-CDR1), SYDMS (SEQ ID NO: 2; 19D07-VH-CDR1) ou NYGMS (SEQ ID NO: 3; 34D03- VH-CDRl); uma CDR2 da cadeia pesada variável com a sequência de aminoácidos WIFPGDGGTKYNETFKG (SEQ ID NO: 4; 11E12- VH-CDR2), TITSGGGYTYSADSVKG (SEQ ID NO: 5; 19D07-VH-CDR2) ou TISYGGSYTYYPDNIKG (SEQ ID NO: 6; 34D03-VH-CDR2); uma CDR3 da cadeia pesada variável com a sequência de aminoácidos ARGGTSVIRDAMDY (SEQ ID NO: 7; 11E12-VH- CDR3), ARQNWVVGL AY (SEQ ID NO : 8; 1 9D0 7 -VH-CDR3) ou VRGYGYDTMDY (SEQ ID NO: 9; 34D03-VH- CDR3); e uma variante do mesmo com uma ou mais substituições de aminoácidos conservadoras em pelo menos uma de CDRl, CDR2 ou CDR3 .
Em modalidades adicionais, o ácido nucleico isolado descrito anteriormente pode ainda incluir uma sequência de ácido nucleicos que codifica pelo menos uma das seguintes: uma cadeia leve variável (VL) que compreende uma região determinante de complementaridade (CDR)1 com a sequência de aminoácidos RASESVDNYGISFMH (SEQ ID NO: 10; 11E12-VL-CDR1), KSSQSLLNSGNQKNYLA (SEQ ID NO: 11; 19D07-VL- CDRl) ou KASQSVSFAGTGLMH (SEQ ID NO: 12; 34D03-VL-CDR1); uma CDR2 da cadeia leve variável com a sequência de aminoácidos RASNLES (SEQ ID NO: 13; 11E12-VL-CDR2), GASTRES (SEQ ID NO: 14; 19D07-VL-CDR2) ou RASNLEA (SEQ ID NO: 15; 34D03-VL-CDR2) ; uma CDR3 da cadeia leve variável com a sequência de aminoácidos QQSNKDPLT (SEQ ID NO: 16; 11E12-VL-CDR3) , QNDYSYPYT (SEQ ID NO: 17; 19D07-VL-CDR3) ou QQSREYPWT (SEQ ID NO: 18; 34D03-VL-CDR3); e uma variante do mesmo com uma ou mais substituições de aminoácidos conservadoras em pelo menos uma de CDRl, CDR2 ou CDR3. A presente invenção proporciona ainda um vetor incluindo pelo menos um dos ácidos nucleicos descritos anteriormente.
Noutras modalidades, a presente invenção proporciona um método de produzir um anticorpo que compreende cultivar uma célula hospedeira descrita anteriormente em condições que resultam na produção do anticorpo e isolar o anticorpo da célula hospedeira ou meio de cultura da célula hospedeira. Também é proporcionado um anticorpo para utilização no tratamento de uma condição patológica ou distúrbio selecionado de uma condição patológica prurítica ou uma condição patológica alérgica, incluindo administrando uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo descrito anteriormente. Nalgumas modalidades, a condição patológica prurítica é selecionada de dermatite atópica, eczema, psoríase, escleroderma e prurido. Noutras modalidades, a condição patológica alérgica a ser tratada é selecionada de dermatite alérgica, eczema estiai, urticária, arquejos, doença inflamatória das vias respiratórias, obstrução recorrente das vias respiratórias, hiperresponsividade das vias respiratórias, doença pulmonar obstrutiva crónica e processos inflamatórios que resultam de autoimunidade, tais como síndrome do cólon irritável (IBS). É ainda proporcionado um anticorpo para utilização no tratamento de um cão em necessidade do mesmo inibindo a atividade de IL-31 num cão, administrando um anticorpo descrito anteriormente.
Também é proporcionado um método de detetar ou quantificar IL-31 numa amostra, incluindo o método incubar uma amostra clínica ou biológica que contém IL-31 na presença de um anticorpo descrito anteriormente; e detetar o anticorpo que está ligado a IL-31 na amostra. Numa modalidade, o anticorpo é marcado de forma detetável. Noutra modalidade, o anticorpo não é marcado e é utilizado em combinação com um segundo anticorpo que é marcado.
Breve descrição dos desenhos A Figura 1 é uma representação esquemática da via IL-31. A Figura 2 é uma representação esquemática da estrutura geral de uma molécula G de imunoglobulina (IgG) de ratinho salientando o local de ligação ao antígeno. A Figura 3 é uma representação esquemática da estrutura geral de uma IgG quimérica murino:canina A Figura 4 é uma ilustração que mostra especiação ou "caninização" de uma IgG de ratinho, CDRs de ratinho são enxertadas em estruturas caninas identificadas de bases de dados de sequências A Figura 5 é uma ilustração de um anticorpo monoclonal "heteroquimérico" emparelhando a cadeia leve quimérica com uma cadeia pesada completamente caninizada. A Figura 6 títulos ELISA de ratinhos imunizados com IL-31 (CF-1 MU#1 - 4) em relação a ratinhos controlo positivos e antes da colheita de sangue. A Figura 7 é uma ilustração de cadeias variáveis de anticorpo que mostra iniciadores de regiões constantes e iniciadores degenerados dirigidos às regiões variáveis de ratinho. A Figura 8 é um gráfico da eficácia piloto de 11 E12 quimérico num estudo SC controlado por placebo, de dose única (7 6A60) . A Figura 9 é de um quadro que mostra as classificações pruríticas individuais de cães admitidos no estudo 76A60. A Figura 10 é de Western blots que mostram a ligação de versões quiméricas (Blot #1), caninizadas (Blot#2) e heteroquiméricas (Blots #3 e 4) de 11 E12 à IL-31 canina. A heteroquimera no Blot #3 tem uma cadeia leve caninizada emparelhada com uma cadeia pesada quimérica. A heteroquimera no Blot #4 tem a cadeia leve quimérica emparelhada com a cadeia pesada caninizada. Cada blot de nitrocelulose contém-na via esquerda, padrões de proteína pré-corados (Seeblue plus 2, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) e via direita, 800 ng de IL-31 canina. A Figura 11 é uma visão esquemática de trabalho de substituição da estrutura da cadeia leve de 11 E12 caninizada. A Figura 12 é de Western blots que mostram a ligação de versões caninizadas de 11 E12 com mutações reversas únicas a resíduos de cadeia leve 2 de estrutura de ratinho. Cada blot de nitrocelulose contém- na via esquerda, padrões de proteína pré-corados (Seeblue plus 2, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) e via direita, 800 ng de IL-31 canina. A Figura 13 é de Western blots com proteínas IL-31 canina de comprimento inteiro e truncadas. Blots de nitrocelulose individuais foram sondados com anticorpos A) anti-His B) 34D03 e C) 11E12. As vias 1-9 dos blots correspondem aos seguintes: Via 1- padrões de proteína pré-corados (Seeblue plus 2, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA); Via 2- IL-31 canina de comprimento inteiro; Via 3- truncação de N-terminal - 20N; Via 4- truncação de N-terminal -40N; Via 5- truncação de N-terminal -60N; Via 6- truncação de C-terminal -20C; Via 7-truncação de C-terminal -40C; Via 8- truncação de C-terminal -60C; e Via 9- beta-galactosidase (lacZ). Nota: IL-31 de comprimento inteiro e proteínas com truncações de C-terminal (-20, -40C e -60C) não mostraram qualquer expressão detetável nestas condições. A Figura 14 é de Western blots com proteínas IL-31 canina truncadas. Blots de nitrocelulose individuais foram sondados com anticorpos A) anti-His B) 11 E12 e C) 34D03. Vias 1-5 dos blots correspondem aos seguintes: Via 1- padrões de proteína pré-corados (Seeblue plus 2, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA); Via 2- truncações do C-terminal nas posições 20-122; Via 3- truncações do C-terminal nas posições 20-100; Via 4-truncações do C-terminal nas posições 20-80; e Via 5-beta-galactosidase (lacZ) . A Figura 15 é uma secção de Western blots com lisados de estirpes de E. Coli que expressam IL-31 canina com alanina substituída para cada posição de aminoácido (76-122). Blots de nitrocelulose individuais foram sondados com anticorpos anti-His, 11 E12 e 34D03, conforme mostrado na Figura. A Figura 16 é uma secção de Western blots com mutações duplas e triplas na IL-31 canina. O lisado proteico -20N foi corrido como um controlo positivo. A Figura 17 é um gráfico que mostra as classificações pruríticas para cães injetadas por via subcutânea com anticorpo caninizado 34D03 (1,0 mg/kg). Classificações pruríticas foram medidas em cada dia do estudo anterior a (resposta de referência) e após o desafio (resposta após 2 h) com 1,5 pg/kg de IL-31 canina. A Figura 18 é um PAGE SDS 4-12% Bis com proteínas IL-31 canina e felina purificadas. O painel A mostra coloração com azul de Coomassie de proteínas corridas em condições redutoras. O painel B mostra coloração com azul de Coomassie de proteínas corridas em condições não redutoras Painéis. Os painéis C e D são os Western blots de géis idênticos a A e B, respetivamente, sondados com um anticorpo anti-His. Via l-IL-31 canina; Via 2- IL-31 felina; Via 3- padrões de proteína pré-corados (Seeblue plus 2, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA); Via 4-IL-31 canina; e Via 5- IL-31 felina. A Figura 19 é um gráfico de sinalização pSTAT em monócitos DH-82 caninos induzidos por IL-31 canina e felina produzidos em E. coli. A IL-31 canina (CHO) é a proteína de referência utilizada para todos os ensaios baseados em células prévios, modelo canino de prurido e como o imunogene para identificação inicial de anticorpos. A Figura 20 é um alinhamento que mostra a conservação de sequência entre IL-31 canina e felina na região da proteína envolvida na ligação dos anticorpos 11E12 e 34D03 (anotado com um sinal positivo). A Figura 21 é de Western blots com proteínas IL-31. Blots de nitrocelulose individuais foram sondados com anticorpos A) anti-His B) 11 E12 e C) 34D03. Nota- a IL-31 canina (CHO) não contém um rótulo 6-His. A Figura 22 é um gráfico que mostra a inibição da sinalização pSTAT induzida pela IL-31 canina em monócitos DH82 caninos comparando anticorpo 34D03 felinizado e caninizado. A Figura 23 é um Western blot de IL-31 canina e felina em condições redutoras sondado com anticorpo 34D03 felinizado.
BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1 é uma cadeia pesada variável CDRl referida aqui como 11 E12-VH-CDR1; SEQ ID NO: 2 é uma cadeia pesada variável CDRl referida aqui como 19D0 7-VH-CDRl; SEQ ID NO: 3 é uma cadeia pesada variável CDRl referida aqui como 34DO3-VH-CDRl; SEQ ID NO: 4 é uma CDR2 da cadeia pesada variável referida aqui como 11 E12-VH-CDR2; SEQ ID NO: 5 é uma CDR2 da cadeia pesada variável referida aqui como 19D07-VH-CDR2; SEQ ID NO: 6 é uma CDR2 da cadeia pesada variável referida aqui como 34D03-VH-CDR2; SEQ ID NO: 7 é uma CDR3 da cadeia pesada variável referida aqui como 11 E12-VH-CDR3; SEQ ID NO: 8 é uma CDR3 da cadeia pesada variável referida aqui como 19D07-VH-CDR3; SEQ ID NO: 9 é uma CDR3 da cadeia pesada variável referida aqui como 34D03-VH-CDR3; SEQ ID NO: 10 é uma cadeia leve variável CDRl referida aqui como 11E12-VL-CDR1; SEQ ID NO: 11 é uma cadeia leve variável CDRl referida aqui como 19D0 7-VL-CDRl; SEQ ID NO: 12 é uma cadeia leve variável CDRl referida aqui como 34DO3-VL-CDRl; SEQ ID NO: 13 é uma CDR2 da cadeia leve variável referida aqui como 11E12-VL-CDR2; SEQ ID NO: 14 é uma CDR2 da cadeia leve variável referida aqui como 19D07-VL-CDR2; SEQ ID NO: 15 é uma CDR2 da cadeia leve variável referida aqui como 34D03-VL-CDR2; SEQ ID NO: 16 é uma CDR3 da cadeia leve variável referida aqui como 11E12-VL-CDR3; SEQ ID NO: 17 é uma CDR3 da cadeia leve variável referida aqui como 19D0 7-VL-CDR3; SEQ ID NO: 18 é uma CDR3 da cadeia leve variável referida aqui como 34D03-VL-CDR3; SEQ ID NO: 19 é uma sequência da cadeia leve variável referida aqui como MU-11 E12-VL; SEQ ID NO: 20 é uma sequência da cadeia leve variável referida aqui como CAN-llEl2-VL-cUn-FW2; SEQ ID NO: 21 é uma sequência da cadeia leve variável referida aqui como CAN-11 El2-VL-cUn-13; SEQ ID NO: 22 é uma sequência da cadeia leve variável referida aqui como MU-19D07-VL; SEQ ID NO: 23 é uma sequência da cadeia leve variável referida aqui como CAN-19D07-VL-998-1; SEQ ID NO: 24 é uma sequência da cadeia leve variável referida aqui como MU-34D03-VL; SEQ ID NO: 25 é uma sequência da cadeia leve variável referida aqui como CAN-34D03-VL-998-1; SEQ ID NO: 26 é uma sequência da cadeia pesada variável referida aqui como MU-11E12-VH; SEQ ID NO: 27 é uma sequência da cadeia pesada variável referida aqui como CAN-11E12-VH-415-1; SEQ ID NO: 28 é uma sequência da cadeia pesada variável referida aqui como MU-19D07-VH; SEQ ID NO: 29 é uma sequência da cadeia pesada variável referida aqui como CAN-19D07-VH-400-1; SEQ ID NO: 30 é uma sequência da cadeia pesada variável referida aqui como MU-34D03-VH; SEQ ID NO: 31 é uma sequência da cadeia pesada variável referida aqui como CAN-34D03-VH-568-1; SEQ ID NO: 32 é a sequência de aminoácidos correspondente à Acessão do GenBank N.° C7G0W1 e corresponde à proteína IL-31 canina de comprimento inteiro; SEQ ID NO: 33 é a sequência nucleotídica correspondente à Acessão do GenBank N.° C7G0W1 e corresponde à sequência nucleotídica que codifica a proteína IL-31 canina de comprimento inteiro; SEQ ID NO: 34 é a sequência nucleotídica que codifica a sequência da cadeia leve variável referida aqui como MU-11 E12-VL; SEQ ID NO: 35 é a sequência nucleotidica que codifica a sequência da cadeia pesada variável referida aqui como MU-11 E12-VH; SEQ ID NO: 36 é a sequência nucleotidica que codifica a sequência da cadeia leve variável referida aqui como MU-19D07-VL; SEQ ID NO: 37 é a sequência nucleotidica que codifica a sequência da cadeia pesada variável referida aqui como MU-19D07-VH; SEQ ID NO: 38 é a sequência nucleotidica que codifica a sequência da cadeia leve variável referida aqui como MU-34D03-VL; SEQ ID NO: 39 é a sequência nucleotidica que codifica a sequência da cadeia pesada variável referida aqui como MU-34D03-VH; SEQ ID NO: 40 é a sequência de aminoácidos para a região constante da cadeia pesada canina referida aqui como HC-64 (Acessão do GenBank N.° AF354264); SEQ ID NO: 41 é a sequência nucleotidica que codifica a região constante da cadeia pesada canina referida aqui como HC-64 (Acessão do GenBank N.° AF354264); SEQ ID NO: 42 é a sequência de aminoácidos para a região constante da cadeia pesada canina referida aqui como HC-65 (Acessão do GenBank N.° AF354265); SEQ ID NO: 43 é a sequência nucleotidica que codifica a região constante da cadeia pesada canina referida aqui como HC-65 (Acessão do GenBank N.° AF354265); SEQ ID NO: 44 é a sequência de aminoácidos para a região constante da cadeia leve canina referida aqui como K (Acessão do GenBank N.° XP_532962); SEQ ID NO: 45 é a sequência nucleotidica que codifica a região constante da cadeia leve canina referida como K (Acessão do GenBank N.° XP_532962); SEQ ID NO: 46 é a sequência nucleotídica que codifica a sequência da cadeia leve variável referida aqui como CAN-19D07-VL-998-1; SEQ ID NO: 47 é a sequência nucleotídica que codifica a sequência da cadeia pesada variável referida aqui como CAN-19D07-VH-998-1; SEQ ID NO: 48 é a sequência nucleotídica que codifica a sequência da cadeia leve variável referida aqui como CAN-34D03-VL-998-1; SEQ ID NO: 49 é a sequência nucleotídica que codifica a sequência da cadeia pesada variável referida aqui como CAN-34D03-VH-568-1; SEQ ID NO: 50 é a sequência nucleotídica que codifica a sequência da cadeia leve variável referida aqui como CAN-HEl2-VL-cUn-FW2; SEQ ID NO: 51 é a sequência nucleotídica que codifica a sequência da cadeia pesada variável referida aqui como CAN-11E12-VH-415-1; SEQ ID NO: 52 é a sequência nucleotídica que codifica a sequência da cadeia leve variável referida aqui como CAN- 11 El2-VL-cUn-13; SEQ ID NO: 53 é uma sequência da cadeia leve variável referida aqui como CAN-11E12 VL cUn 1; SEQ ID NO: 54 é a sequência nucleotídica que codifica a sequência da cadeia leve variável referida aqui como CAN-HEl2-VL-cUn-l; SEQ ID NO: 55 corresponde à sequência de aminoácidos da construção de IL-31 canina de comprimento inteiro utilizada aqui para expressão de E.coli; SEQ ID NO: 56 é a sequência nucleotídica correspondente à construção de IL-31 canina de comprimento inteiro utilizada aqui para expressão de E.coli; SEQ ID NO: 57 é a sequência de aminoácidos da construção de IL-31 canina -20N para expressão de E.coli; SEQ ID NO: 58 é a sequência nucleotídica correspondente à construção de IL-31 canina -20N para expressão de E.coli; SEQ ID NO: 59 é a sequência de aminoácidos da construção de IL-31 canina -40N para expressão de E.coli; SEQ ID NO: 60 é a sequência nucleotidica correspondente à construção de IL-31 canina -40N para expressão de E.coli; SEQ ID NO: 61 é a sequência de aminoácidos da construção de IL-31 canina -60N para expressão de E.coli; SEQ ID NO: 62 é a sequência nucleotidica correspondente à construção de IL-31 canina -60N para expressão de E.coli; SEQ ID NO: 63 é a sequência de aminoácidos da construção de IL-31 canina 20-122 para expressão de E.coli; SEQ ID NO: 64 é a sequência nucleotidica correspondente à construção de IL-31 canina 20-122 para expressão de E.coli; SEQ ID NO: 65 é a sequência de aminoácidos da construção de IL-31 canina 20-100 para expressão de E.coli; SEQ ID NO: 66 é a sequência nucleotidica correspondente à construção de IL-31 canina 20-100 para expressão de E.coli; SEQ ID NO: 67 é a sequência de aminoácidos da construção de IL-31 canina 20-80 para expressão de E.coli; SEQ ID NO: 68 é a sequência nucleotidica correspondente à construção de IL-31 canina 20-80 para expressão de E.coli; SEQ ID NO: 69 é a sequência nucleotidica correspondente à construção de IL-31 felina de comprimento inteiro para expressão de E.coli; SEQ ID NO: 70 é a sequência de aminoácidos correspondente à construção de IL-31 felina de comprimento inteiro para expressão de E.coli; SEQ ID NO: 71 é uma sequência da cadeia leve variável referida aqui como FEL-34D03-VL-021-1; SEQ ID NO: 72 é a sequência nucleotidica que codifica a sequência da cadeia leve variável referida aqui como FEL-34D03-VL-021-1; SEQ ID NO: 73 é uma sequência da cadeia pesada variável referida aqui como FEL-34D03-VH-035-1; SEQ ID NO: 74 é a sequência nucleotidica que codifica a sequência da cadeia pesada variável referida aqui como FEL-34D03-VH-035-1; SEQ ID NO: 75 é a sequência de aminoácidos para a região constante da cadeia pesada felina referida aqui como HC-A Felina (Acessão do GenBank N.° AB016710.1); SEQ ID NO: 76 é a sequência nucleotidica que codifica a região constante da cadeia pesada felina referida aqui como HC-A Felina (Acessão do GenBank N.° AB016710.1); SEQ ID NO: 77 é a sequência de aminoácidos para a região constante da cadeia leve felina referida aqui como LC-K Felina (Acessão do GenBank N.° AF198257.1); SEQ ID NO: 78 é a sequência nucleotidica que codifica a região constante da cadeia leve felina referida aqui como LC-K Felina (Acessão do GenBank N.° AF198257.1);
DEFINIÇÕES
Antes de descrever a presente invenção com detalhe, serão definidos vários termos utilizados no contexto da presente invenção. Além destes termos, outros são definidos noutros sítios na especificação, conforme necessário. A menos que, de outra forma, expressamente definido aqui, os termos da técnica utilizados nesta especificação terão os seus significados reconhecidos pela técnica.
Conforme utilizado na especificação e reivindicações, a forma singular "a(s)", "uma(s)" e "o(s)/um(ns)" incluem referências plurais, a menos que o contexto claramente dite o contrário. Por exemplo, referência a "um anticorpo" inclui uma pluralidade de tais anticorpos.
Conforme utilizado aqui, o termo "que compreende" pretende-se que signifique que as composições e métodos incluam os elementos recitados, mas não excluindo outros.
Epítopo, conforme utilizado aqui, refere-se ao determinante antigénico reconhecido pelas CDRs do anticorpo. Por outras palavras, epítopo refere-se àquela porção de qualquer molécula capaz de ser reconhecida por, e ligada por, um anticorpo. A menos que indicado o contrário, o termo "epítopo", conforme utilizado aqui, refere-se à região de IL-31 à qual um agente anti-IL-31 é reativo.
Um "antigeno" é uma molécula ou uma porção de uma molécula capaz de ser ligada por um anticorpo que é adicionalmente capaz de ser reconhecido por, e ligado por, um anticorpo (podendo a região de ligação ao anticorpo correspondente ser referida como um parátopo) . Em geral, epitopos consistem em agrupamentos de moléculas de superfície quimicamente ativa, por exemplo, aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e têm características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. 0 termo "especificamente" no contexto da ligação do anticorpo, refere-se a ligação de elevada avidez e/ou de elevada afinidade de um anticorpo a um antigeno específico, isto é, um polipeptídeo ou epítopo. Em muitas modalidades, o antigeno específico é um antigeno (ou um fragmento ou subfração de um antigeno) utilizado para imunizar o hospedeiro animal do qual foram isoladas células produtoras de anticorpo. Anticorpo que se liga especif icamente a um antigeno é mais forte do que a ligação do mesmo anticorpo a outros antígenos. Anticorpos que se ligam especificamente a um polipeptídeo podem ser capazes de ligarem outros polipeptídeos a um nível fraco, mas detetável (por exemplo, 10% ou inferior da ligação mostrada ao polipeptídeo de interesse). Tal ligação fraca ou ligação de fundo é prontamente discernível da ligação do anticorpo específica a um polipeptídeo sujeito, por exemplo, pela utilização de controlos apropriados. Em geral, anticorpos específicos ligam-se a um antigeno com uma afinidade de ligação com uma KD de IO-7 M ou inferior, por exemplo, 10“8 M ou inferior (por exemplo, 10“9 M ou inferior, 10“10 ou inferior, 10-11 ou inferior, 10-12 ou inferior ou 10-13 ou inferior, etc.) .
Conforme utilizado aqui, o termo "anticorpo" refere-se a uma imunoglobulina intacta com duas cadeias leves e duas pesadas. Assim, um anticorpo ou fragmento isolado único pode ser um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo sintético, um anticorpo recombinante, um anticorpo quimérico, um anticorpo heteroquimérico ou um anticorpo caninizado. 0 termo "anticorpo" refere-se preferencialmente a anticorpos monoclonais, e fragmentos dos mesmos, e equivalentes de ligação imunológicos dos mesmos que se podem ligar à proteína IL-31 e fragmentos da mesma. 0 termo anticorpo é utilizado tanto para se referir a um molecular homogéneo ou uma mistura, tal como um produto de soro feito de uma pluralidade de entidades moleculares diferentes. "Anticorpos nativos" e "imunoglobulinas nativas" são normalmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150,000 Daltons, compostas por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfido covalente, enquanto o número de ligações dissulfido varia entre as cadeias pesadas de diferentes isótipos de imunoglobulina. Cada cadeia leve e pesada também tem pontes de dissulfido intra-cadeia espaçadas regularmente. Cada cadeia pesada tem numa extremidade um domínio variável (VH) seguido de um número de domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável numa extremidade (VL) e um domínio constante na sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve é alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve é alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Pensa-se que resíduos de aminoácidos particulares formam uma interface entre os domínios variáveis da cadeia leve e pesada. A Figura 2 é um exemplo da estrutura geral de uma imunoglobulina G nativa (IgG) de ratinho salientando o local de ligação ao antígeno. O termo "fragmento de anticorpo" refere-se a menos de uma estrutura de anticorpo intacta, incluindo, sem limitação, uma cadeia de anticorpo único isolado, uma construção Fv, uma construção Fab, uma construção Fc, uma sequência da região determinante de complementaridade (CDR) ou da cadeia leve variável, etc. 0 termo região "variável" compreende estrutura e CDRs (de outra forma conhecidas como hipervariáveis) e refere-se ao facto de certas porções dos domínios variáveis diferirem extensivamente em sequência entre anticorpos e serem utilizadas na ligação e especificidade de cada anticorpo particular para o seu antígeno particular. Contudo, a variabilidade não está igualmente distribuída pelos domínios variáveis dos anticorpos. Está concentrada em três segmentos chamados regiões hipervariáveis ambas nos domínios variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis são chamadas a região estrutura (FR) . Os domínios variáveis das cadeias leve e pesada nativas cada compreendem múltiplas FRs, adotando em grande medida uma configuração β pura, ligados por três regiões hipervariáveis que formam alças que se ligam e, nalguns casos, formam parte da estrutura em folha a. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em estreita proximidade pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação ao antígeno dos anticorpos (ver Rabat, et ai., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), páginas 647-669). Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tais como participação do anticorpo em toxicidade celular dependente de anticorpo. 0 termo "região hipervariável", quando utilizado aqui, refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácidos de uma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" (Rabat, et ai. (1991), acima) e/ou daqueles resíduos de uma "alça hipervariável" (Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987). Resíduos "estrutura" ou "FR" são aqueles resíduos do domínio variável que não os resíduos da região hipervariável, conforme definido aqui. A digestão com papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação ao antigeno idênticos, designados fragmentos "Fab", cada um com um local de ligação ao antigeno único e um fragmento "Fc" residual cujo nome reflete a sua capacidade para cristalizar prontamente. 0 tratamento com pepsina origina um fragmento F(ab')2 que tem dois locais de combinação ao antigeno e é capaz ainda de reticular o antigeno. "Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um local de ligação e de reconhecimento ao antigeno completo. Esta região consiste num dímero de um domínio variável de uma cadeia pesada e uma cadeia leve em associação estreita, não covalente. É nesta configuração que as três regiões hipervariáveis de cada domínio variável interagem para definir um local de ligação ao antigeno na superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis regiões hipervariáveis conferem especificidade de ligação ao antigeno ao anticorpo. Contudo, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv que compreende apenas três regiões hipervariáveis específicas de um antigeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar um antigeno, embora a menor afinidade do que o local de ligação inteiro. 0 fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CHI) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pela adição de uns poucos resíduos no terminal carboxilo do domínio CHI da cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteína (s) da região dobradiça do anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui para Fab' no qual o(s) resíduo (s) de cisteína dos domínios constantes carregam um grupo tiol livre. Os fragmentos F(ab')2 de anticorpo foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteínas de dobradiça entre eles. Também são conhecidos outros emparelhamentos químicos dos fragmentos de anticorpo.
As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquer espécie de vertebrado podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos, designados capa (k) e lambda (λ) , com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes.
Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante das duas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes. Presentemente, existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias destas podem ainda ser divididas em subclasses (isótipos), por exemplo, IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2 (conforme definido pela designação murina e humana). Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados alfa, delta, épsilon, gama e mu, respetivamente. As estruturas subunidade e configurações tridimensionais das diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas em múltiplas espécies. A prevalência de isótipos individuais e atividades funcionais associadas com estes domínios constantes são específicas da espécie e têm de ser definidas experimentalmente. "Anticorpo monoclonal", conforme definido aqui, é um anticorpo produzido por um único clone de células (especificamente, um único clone de células hibridoma) e, portanto, um único tipo homogéneo puro de anticorpo. Todos os anticorpos monoclonais produzidos a partir do mesmo clone são idênticos e têm a mesma especificidade de antígeno. 0 termo "monoclonal" pertence a um único clone de células, uma única célula e à prole dessa célula.
Os anticorpos monoclonais aqui especificamente incluem anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica às ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular, enquanto que o restante da(s) cadeia (s) é idêntico às ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada. Tipicamente, anticorpos quiméricos são anticorpos cujos genes da cadeia leve e pesada foram construídos, tipicamente por engenharia genética, a partir de genes da região constante e variável de anticorpo pertencentes a diferentes espécies. Por exemplo, os segmentos variáveis dos genes de um anticorpo monoclonal de ratinho podem ser unidos a segmentos constantes caninos. A Figura 3 é uma representação esquemática da estrutura geral de uma modalidade de uma IgG murina : canina . Nesta modalidade, o local de ligação ao antígeno é derivado de ratinho, ao passo que a porção Fc é canina.
Formas "caninizadas" de anticorpos não caninos (por exemplo, murinos) são anticorpos fabricados por engenharia genética que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não canina. Anticorpos caninizados são sequências de imunoglobulina canina (anticorpo recetor) nos quais resíduos de região hipervariável do recetor são substituídos por resíduos da região hipervariável de uma espécie não canina (anticorpo dador), tal como ratinho, com a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Nalguns exemplos, resíduos da região estrutura (FR) das sequências de imunoglobulina canina são substituídos por resíduos correspondentes não caninos. Além disso, anticorpos caninizados podem incluir resíduos que não são encontrados no anticorpo recetor nem no anticorpo dador. Estas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo caninizado incluirá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas das regiões hipervariáveis correspondem às de uma sequência de imunoglobulina não canina e todas ou substancialmente todas das FRs são aquelas de uma sequência de imunoglobulina canina. 0 anticorpo caninizado também compreenderá opcionalmente uma região constante (Fc) completa, ou pelo menos uma porção, de imunoglobulina, tipicamente a de uma sequência de imunoglobulina canina. A Figura 4 é uma ilustração de uma modalidade que mostra especiação ou caninização de uma IgG de ratinho. Nesta modalidade, CDRs de ratinho são enxertadas em estruturas caninas.
Formas "felinizadas" de anticorpos não felinos (por exemplo, murinos) são anticorpos fabricados por engenharia genética que contêm sequência minima derivada de imunoglobulina não felina. Anticorpos felinizados são sequências de imunoglobulina felina (anticorpo recetor) nos quais os resíduos da região hipervariável do recetor são substituídos pelos resíduos da região hipervariável de uma espécie não felina (anticorpo dador), tal como ratinho, com a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Nalguns exemplos, resíduos da região estrutura (FR) das sequências de imunoglobulina felina são substituídos pelos resíduos não felinos correspondentes. Além disso, anticorpos felinizados podem incluir resíduos que não são encontrados no anticorpo recetor nem no anticorpo dador. Estas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo felinizado incluirá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas das regiões hipervariáveis correspondem às de uma sequência de imunoglobulina não felina e todas ou substancialmente todas das FRs são aquelas de uma sequência de imunoglobulina felina. 0 anticorpo felinizado também compreenderá opcionalmente uma região constante (Fc) completa, ou pelo menos uma porção, de imunoglobulina, tipicamente a da sequência de imunoglobulina felina. 0 termo "heteroquimérico", conforme definido aqui, refere-se a um anticorpo no qual uma das cadeias do anticorpo (pesada ou leve) é caninizada, enquanto a outra é quimérica. A Figura 5 representa uma modalidade de uma molécula heteroquimérica. Nesta modalidade, uma cadeia pesada variável caninizada (onde todas as CDRs são murinas e todas as FRs são caninas) é emparelhada com uma cadeia leve variável quimérica (onde todas as CDRs são murinas e todas as FRs são murinas. Nesta modalidade, ambas as cadeias leve variável e pesada variável são fundidas a uma região constante canina. Uma "variante" de anticorpo anti-IL-31 refere-se aqui a uma molécula que difere na sequência de aminoácidos de uma sequência de aminoácidos de anticorpo anti-IL-31 "parental" como resultado da adição, deleção e/ou substituição de um ou mais resíduo (s) de aminoácidos na sequência parental do anticorpo e retém pelo menos uma atividade desejada do anticorpo anti-IL-31 parental. Atividades desejadas podem incluir a capacidade de ligar o antígeno especificamente, a capacidade de reduzir, inibir ou neutralizar a atividade de IL-31 num animal e a capacidade de inibir a sinalização pSTAT mediada por IL-31 num ensaio baseado em células. Numa modalidade, a variante compreende uma ou mais substituição(ões) de aminoácidos e uma ou mais região(ões) hipervariável(eis) e/ou estrutura (s) do anticorpo parental. Por exemplo, a variante pode compreender pelo menos um, por exemplo, de cerca de um a cerca de dez, e preferencialmente de cerca de dois a cerca de cinco, substituições em uma ou mais região(ões) hipervariável(eis) e/ou estrutura(s) do anticorpo parental. Normalmente, a variante teria uma sequência de aminoácidos com pelo menos 50% de identidade de sequência de aminoácidos com as sequências do domínio variável da cadeia leve ou pesada do anticorpo parental, mais preferencialmente pelo menos 65%, mais preferencialmente pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90% e o mais preferido pelo menos 95% de identidade de sequência. Identidade ou homologia em relação a esta sequência é definida como a percentagem de resíduos de aminoácidos na sequência candidata que são idênticos aos resíduos do anticorpo parental, após alinhamento das sequências e introdução de espaços, se necessário, para atingir a percentagem máxima de identidade de sequência. Nenhum dos N-terminal, C-terminal ou extensões internas, deleções ou inserções na sequência do anticorpo deverá ser interpretada como afetando a identidade de sequência ou homologia. A variante retém a capacidade de ligar uma IL-31 e preferencialmente tem atividades desejadas que são superiores às do anticorpo parental. Por exemplo, a variante pode ter uma afinidade de ligação mais forte, capacidade potenciada de reduzir, inibir ou neutralizar a atividade de IL-31 num animal e/ou capacidade potenciada de inibir a sinalização pSTAT mediada por IL-31 num ensaio baseado em células.
Um ácido nucleico "variante", refere-se aqui a uma molécula que difere em sequência de um ácido nucleico "parental". Divergência de sequência polinucleotidica pode resultar de alterações mutacionais, tais como deleções, substituições ou adições de um ou mais nucleotideos. Cada uma destas alterações pode ocorrer sozinha ou em combinação, uma ou mais vezes, numa dada sequência. 0 anticorpo "parental" aqui é um que é codificado por uma sequência de aminoácidos utilizada para a preparação da variante. Preferencialmente, o anticorpo parental tem uam região estrutura canina e, se presente, tem região(ões) constante(s) de anticorpo canino. Por exemplo, o anticorpo parental pode ser um anticorpo caninizado ou canino. Ainda como outro exemplo, o anticorpo parental é um anticorpo monoclonal murino. 0 termo "isolado" significa que o material (por exemplo, anticorpo ou ácido nucleico) é separado e/ou recuperado de um componente do seu ambiente natural. Componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interfeririam com utilizações diagnósticas ou terapêuticas para o material e podem incluir enzimas, hormonas e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em relação ao ácido nucleico, um ácido nucleico isolado pode incluir um que é separado das sequências 5' a 3' com as quais está normalmente associado no cromossoma. Em modalidades preferidas, o material será purificado para mais de 95% por peso do material e mais preferencialmente mais de 99% por peso. Material isolado inclui o material in situ dentro de células recombinantes, uma vez que pelo menos um componente ambiente natural do material não estará presente. Normalmente, contudo, será preparado material isolado por pelo menos uma etapa de purificação. A palavra "rótulo", quando utilizada aqui, refere-se ao composto ou composição detetável que é conjugado diretamente ou indiretamente com o anticorpo ou ácido nucleico. 0 rótulo pode ser detetável por ele próprio (por exemplo, rótulos radioisótopos ou rótulos fluorescentes) ou, no caso de um rótulo enzimático, pode catalisar alteração química de um composto substrato ou composição que é detetável.
Os termos "ácido nucleico", "polinucleotídeo", "ácido nucleico molécula" e afins podem ser utilizados alternadamente aqui e referem-se a uma série de bases nucleotídicas (também designadas "nucleotídeos") no ADN e ARN. 0 ácido nucleico pode conter desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e/ou seus análogos. 0 termo "ácido nucleico" inclui, por exemplo, moléculas de cadeia simples e de cadeia dupla. Um ácido nucleico pode ser, por exemplo, um gene ou fragmento de gene, exões, intrões, uma molécula de ADN (por exemplo, ADNc), uma molécula de ARN (por exemplo, mRNA), ácidos nucleicos recombinantes, plasmídeos e outros vetores, iniciadores e sondas. Ambos polinucleotídeos 5' a 3' (senso) e 3' a 5' (antissenso) estão incluídos.
Um "sujeito" ou "paciente" refere-se a um cão em necessidade de tratamento que pode ser afetado por moléculas da invenção.
Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" (ou "quantidade eficaz") refere-se a uma quantidade de um ingrediente ativo, por exemplo, um agente de acordo com a invenção, suficiente para efetuar resultados benéficos ou desejados quando administrada a um sujeito ou paciente. Uma quantidade eficaz pode ser administrada numa ou mais administrações, aplicações ou dosagens. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição de acordo com a invenção pode ser prontamente determinada por alguém com habilitação comum na técnica. No contexto desta invenção, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é uma que produz uma alteração objetivamente medida em um ou mais parâmetros associados com o tratamento de uma condição patológica prurítica ou uma condição patológica alérgica incluindo melhoria clinica nos sintomas. Obviamente, a quantidade terapeuticamente eficaz variará dependendo do sujeito particular e da condição patológica a ser tratada, do peso e da idade do sujeito, da severidade da condição patológica, do composto particular escolhido, do regime de dosagem a ser seguido, momento da administração, do composto particular escolhido, do regime de dosagem a ser seguido, momento da administração, do modo de administração e afins, todos os quais podem ser prontamente determinados por alguém com habilitação comum na técnica.
Conforme utilizado aqui, o termo "terapêutico" abrange o espetro complete de tratamentos para uma doença ou distúrbio. Um agente "terapêutico" da invenção pode atuar de uma maneira que é profilático ou preventivo, incluindo aqueles que incorporam procedimentos desenhados para dirigir animais que podem ser identificados como estando em risco (farmacogenética); ou de uma forma que é melhorativa ou curativa em natureza; ou pode atuar para retardar a taxa ou extensão da progressão de pelo menos um sintoma de uma doença ou distúrbio a ser tratado. "Tratamento", "tratar" e afins referem-se a ambos tratamento terapêutico e medidas profiláticas ou preventivas. Animais em necessidade de tratamento incluem aqueles já com o distúrbio, bem como aqueles no qual o distúrbio é para ser prevenido. 0 termo "tratamento" ou "tratar" de uma doença ou distúrbio inclui prevenir ou proteger contra a doença ou distúrbio (ou seja, fazer com que os sintomas clínicos não se desenvolvam); inibir a doença ou distúrbio (isto é, parar ou suprimir o desenvolvimento dos sintomas clínicos; e/ou aliviar a doença ou distúrbio (isto é, causar a regressão dos sintomas clínicos). Como será apreciado, nem sempre é possível distinguir entre "prevenir" e "suprimir" uma doença ou distúrbio, uma vez que o derradeiro evento ou eventos indutor(es) podem ser desconhecidos ou latentes. Em conformidade, o termo "profilaxia" será compreendido como constituindo um tipo de "tratamento" que abrange ambas "prevenção" e "supressão." 0 termo "tratamento" inclui, assim, "profilaxia". 0 termo "condição patológica alérgica" é definido aqui como um distúrbio ou doença causada por uma interação entre o sistema imune e uma substância estranha ao corpo. Esta substância estranha é designada "um alergénio". Alergénios comuns incluem aeroalergénios, tais como pólenes, pó, mofos, proteínas dos ácaros do pó, saliva injetada de mordidas de insetos, etc. Exemplos de condições patológicas alérgicas incluem, mas não se limitam a, as seguintes: dermatite alérgica, eczema estiai, urticária, arquejos, doença inflamatória das vias respiratórias, obstrução recorrente das vias respiratórias, hiperresponsividade das vias respiratórias, doença pulmonar obstrutiva crónica e processos inflamatórios que resultam de autoimunidade, tais como síndrome do cólon irritável (IBS). 0 termo "condição patológica prurítica" é definida aqui como uma doença ou distúrbio caracterizado por uma sensação de comichão intensa que produz o desejo de esfregar ou coçar a pele para obter alívio. Exemplos de condições patológicas pruríticas incluem, mas não se limitam a, as seguintes: dermatite atópica, eczema, psoríase, escleroderma e prurido.
Conforme utilizado aqui, os termos "célula", "linha de células" e "cultivo celular" podem ser utilizados alternadamente. Todos estes termos também incluir a sua prole que são todas e quaisquer gerações subsequentes. Entende-se que toda a prole pode não ser idêntica devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. No contexto de expressar uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga, "célula hospedeira" refere-se a uma célula procarionte ou eucarionte (por exemplo, células bacterianas, células de levedura, células de mamífero e células de insetos) estejam localizadas in vitro ou in vivo. Por exemplo, as células hospedeiras podem estar localizadas num animal transgénico. Célula hospedeira pode ser utilizada como um recetor para vetores e pode incluir qualquer organismo transformável que é capaz de replicar um vetor e/ou expressar um ácido nucleico heterólogo codificado por um vetor.
Uma "composição" pretende-se que signifique uma combinação de agente ativo e outro composto ou composição que pode ser inerte (por exemplo, um rótulo) ou ativo, tal como um adj uvante.
Conforme definido aqui, veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados para utilização na invenção são bem conhecidos daqueles habilitados na técnica. Tais veículos incluem, sem limitação, água, solução salina, solução salina tamponada, tampão fosfato, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões. Outros diluentes, adjuvantes e excipientes empregues convencionalmente podem ser adicionados de acordo com técnicas convencionais. Tais veículos podem incluir etanol, polióis, e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, e ésteres orgânicos injetáveis. Tampões e agentes de ajuste do pH também podem ser empregues. Tampões incluem, sem limitação, sais preparados a partir de um ácido ou base orgânica. Tampões representativos incluem, sem limitação sais de ácidos orgânicos, tais como sais de ácido cítrico, por exemplo, citratos, ácido ascórbico, ácido glucónico, histidina-HCl, ácido carbónico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acético ou ácido ftálico, Tris, cloridrato de trimetanmina ou tampões fosfato. Veículos parentéricos podem incluir solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose, trehalose, sacarose e cloreto de sódio, óleos fixos ou Ringer lactado. Veículos intravenosos podem incluir reabastecedores de fluidos e nutrientes, reabastecedores de eletrólitos, tais como aqueles baseados na dextrose de Ringer e afins. Conservantes e outros aditivos, tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes (por exemplo, EDTA), gases inertes e afins também podem ser proporcionados nos veículos farmacêuticos. Apresente invenção não está limitada pela seleção do veículo. A preparação destas composições farmaceuticamente aceitáveis, a partir dos componentes anteriormente descritos, com isotonicidade de pH, estabilidade e outras características convencionais apropriadas está dentro da habilitação na técnica. Ver, por exemplo, textos tais como Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edição, Lippincott Williams e Wilkins, publicado em 2000; e The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4a edição, editores R. C. Rowe et ai, Publicações APhA, 2003. O termo "substituição de aminoácidos conservadora" indica qualquer substituição de aminoácidos por um dado resíduo de aminoácido, onde o resíduo substituto é tão semelhante quimicamente ao do resíduo dado que não resulta em nenhuma diminuição substancial na função do polipeptídeo (por exemplo, atividade enzimática). Substituições de aminoácidos conservadoras são vulgarmente conhecidas na técnica e exemplos das mesmas são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. N.°s 6 790 639, 6 774 107, 6 194 167 ou 5 350 576. Numa modalidade preferida, uma substituição de aminoácidos conservadora será qualquer uma que ocorre dentro de um dos seguintes seis grupos • 1. Resíduos pequenos, alifáticos, substancialmente não polares: Ala, Gly, Pro, Ser e Thr; • 2. Resíduos grandes, alifáticos, não polares: lie, Leu e Vai; Met; • 3. Resíduos polares, negativamente carregados e suas amidas: Asp e Glu; • 4. Amidas de resíduos polares, negativamente carregados: Asn e Gin; His; • 5. Resíduos polares, positivamente carregados: Arg e Lys; His; e • 6. Grandes resíduos aromáticos: Trp e Tyr; Phe.
Numa modalidade preferida, uma substituição de aminoácidos conservadora será qualquer uma das seguintes, que estão listadas como pares de Resíduos Nativos (Substituições Conservadoras) : Ala (Ser); Arg (Lys); Asn (Gin; His); Asp (Glu); Gin (Asn); Glu (Asp); Gly (Pro); His (Asn; Gin); lie (Leu; Vai); Leu (lie; Vai); Lys (Arg; Gin; Glu); Met (Leu; lie); Phe (Met; Leu; Tyr) ; Ser (Thr) ; Thr (Ser) ; Trp (Tyr) ; Tyr (Trp; Phe); e Vai (lie; Leu).
Tal como um polipeptídeo pode conter substituição (ões) de aminoácidos conservadora(s) , um polinucleotídeo deste pode conter substituição(ões) de codão conservadora(s). Uma substituição de codão é considerada conservadora se, quando expressa, produz uma substituição de aminoácidos conservadora, conforme descrito anteriormente. Uma substituição de codão degenerada, que não resulta em qualquer substituição de aminoácidos, também é útil em polinucleotídeos de acordo com a presente invenção. Assim, por exemplo, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo selecionado útil numa modalidade da presente invenção pode ser mutado por substituição de codão degenerada para aproximar a frequência de utilização do codão exibida por uma célula hospedeira de expressão a ser transformada com ele ou, de outra forma, melhorar a expressão do mesmo.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Deveria ser entendido que esta invenção não está limitada à metodologia, protocolos e reagentes particulares, etc., descritos aqui e como tal pode variar. A menos que definido de outra forma, os termos científicos e técnicos utilizados em ligação com os anticorpos descritos aqui terão os significados que são normalmente entendidos por aqueles de habilitação comum na técnica. Além disso, a menos que de outra forma requerido pelo contexto, os termos no singular deverão incluir pluralidades e os termos no plural deverão incluir o singular. Em geral, as nomenclaturas utilizadas em ligação com, e técnicas de, cultura de células e de tecidos, biologia molecular e química de proteínas e oligo- ou polinucleotídeos e hibridização descritas aqui são aquelas bem conhecidas e vulgarmente utilizadas na técnica. São utilizadas técnicas convencionais para ADN recombinante, síntese de oligonucleotídeos e cultura de tecidos e transfeção (por exemplo, eletroporação, lipofeção). Reações enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante ou conforme vulgarmente realizadas na técnica ou conforme descritas aqui. As técnicas e procedimentos anteriores são geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e conforme descritos em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo da presente especificação, Ver, por exemplo, Sambrook et ai. MOLECULAR CLONING: LAB. MANUAL (3a edição, Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 2001) e Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (Nova Iorque: Greene Publishing Association/Wiley Interscience), 1993. As nomenclaturas utilizadas em ligação com, e os procedimentos e técnicas laboratoriais de, química analítica, química orgânica sintética e química médica e farmacêutica descritos aqui são aqueles bem conhecidos e vulgarmente utilizados na técnica. São utilizadas técnicas convencionais para sínteses químicas, análises químicas, preparação, formulação e entrega farmacêutica e tratamento de pacientes.
Além dos exemplos operativos ou onde, de outra forma, indicado, todos os números que expressam quantidades de ingredientes ou condições de reação utilizados aqui deveriam ser compreendidos como modificados em todos os exemplos pelo termo "cerca de." A presente invenção proporciona anticorpos monoclonais recombinantes e suas utilizações em procedimentos clínicos e científicos, incluindo procedimentos diagnósticos.
Com o advento de métodos de biologia molecular e tecnologia recombinante, é possível produzir anticorpos e moléculas tipo anticorpo por meios recombinantes e gerar, por este meio, sequências génicas que codificam sequências de aminoácidos especificas encontradas na estrutura polipeptídica dos anticorpos. Tais anticorpos podem ser produzidos ou por clonagem das sequências génicas que codificam as cadeias polipeptidicas de ditos anticorpos ou por síntese direta de ditas cadeias polipeptidicas, com montagem das cadeias sintetizadas para formar estruturas tetraméricas ativas (H2L2) com afinidade para epítopos específicos e determinantes antigénicos. Isto permitiu a produção imediata de anticorpos com sequências características anticorpos neutralizantes de diferentes espécies e fontes.
Independentemente da fonte dos anticorpos ou de como eles são construídos por via recombinante ou de como eles são sintetizados, in vitro ou in vivo, utilizando animais transgénicos, cultivos de células grandes de tamanho de laboratório ou comercial, utilizando plantas transgénicas ou por síntese química direta não empregando organismos vivos em qualquer estádio do processo, todos os anticorpos têm uma estrutura tridimensional geral semelhante. Esta estrutura é com frequência dada como H2L2 e refere-se ao facto de que os anticorpos vulgarmente compreendem duas cadeias de aminoácidos leves (L) e duas cadeias de aminoácidos 2 pesadas (H). Ambas cadeias têm regiões capazes de interagir com um alvo antigénico estruturalmente complementar. As regiões que interatuam com o alvo são referidas como "variáveis" ou regiões "V" e caracterizam-se por diferenças na sequência de aminoácidos de anticorpos de diferente especificidade antigénica. As regiões variáveis quer da cadeia H ou da cadeia L contêm as sequências de aminoácidos capazes de se ligarem especificamente aos alvos antigénicos.
Conforme utilizado aqui, o termo "região de ligação ao antígeno" refere-se àquela porção de uma molécula de anticorpo que contém os resíduos de aminoácidos que interagem com um antígeno e conferem ao anticorpo a sua especificidade e afinidade pelo antígeno. A região de ligação do anticorpo inclui os resíduos de aminoácidos "estrutura" necessários para manter a conformação apropriada dos resíduos de ligação ao antígeno.
Dentro das regiões variáveis das cadeias H ou L que proporcionam regiões de ligação ao antígeno estão sequências mais pequenas apelidadas "hipervariáveis", por causa da sua variabilidade extrema entre anticorpos de especificidade diferente. Tais regiões hipervariáveis também são referidas como "regiões determinantes de complementaridade" ou regiões "CDR". Estas regiões CDR são responsáveis pela especificidade básica do anticorpo para uma estrutura determinante antigénica particular.
As CDRs representam trechos não contíguos de aminoácidos dentro das regiões variáveis mas, independentemente da espécie, verificou-se que as localizações posicionais destas sequências de aminoácidos críticas dentro das regiões da cadeia pesada e da cadeia leve têm localizações semelhantes dentro das sequências de aminoácidos das cadeias variáveis. As cadeias variáveis pesada e leve de todos os anticorpos cada uma têm três regiões CDR, cada uma não contígua com as outras.
Em todas as espécies de mamíferos, os péptidos de anticorpo contêm regiões constantes (isto é, altamente conservadas) e variáveis, e, dentro destas últimas, existem as CDRs e as designadas "regiões estrutura" feitas de sequências de aminoácidos dentro da região variável da cadeia pesada ou leve, mas fora das CDRs.
Em relação ao determinado antigénico reconhecido pelas regiões CDR do anticorpo, este é também referido como o "epítopo." Por outras palavras, epítopo refere-se àquela porção de qualquer molécula capaz de ser reconhecida por, e ligada por, um anticorpo (a correspondente região de ligação do anticorpo pode ser referida como um parátopo).
Um "antígeno" é uma molécula ou uma porção de uma molécula capaz de ser ligada por um anticorpo que é adicionalmente capaz de induzir um animal de produzir um anticorpo capaz de se ligar a um epítopo daquele antígeno. Um antígeno pode ter um ou mais do que um epítopo. A reação específica referida anteriormente pretende-se que indique que o antígeno reagirá, de uma maneira altamente seletiva, com o seu anticorpo correspondente e não com a multitude de outros anticorpos que podem ser evocados por outros antígenos.
Pretende-se que o termo "anticorpo" inclua ambas moléculas de imunoglobulina intactas, bem como porções, fragmentos, péptidos e derivados das mesmas, tais como, por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fse, regiões CDR, parátopos ou qualquer porção ou sequência peptídica do anticorpo que é capaz de se ligar a um antígeno ou epítopo. Um anticorpo é dito ser "capaz de ligar" uma molécula se durante capaz de reagir especificamente com a molécula para ligar, assim, a molécula ao anticorpo.
Anticorpo também inclui anticorpos quiméricos, anticorpos heteroquiméricos ou anticorpos caninizados, bem como fragmentos, porções, regiões, péptidos ou derivados dos mesmos, proporcionados por qualquer técnica conhecida, tais como, mas não limitadas a, clivagem enzimática, síntese peptídica ou técnicas recombinantes. Tais anticorpos da presente invenção são capazes de se ligarem especificamente a IL-31 canina. Fragmentos ou porções de anticorpos podem carecer do fragmento Fc do anticorpo intacto, eliminar mais rapidamente da circulação e podem ter menos ligação ao tecido não específica do que um anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo podem ser produzidos a partir de anticorpos intactos utilizando métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, por clivagem proteolítica com enzimas, tais como papaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos F(ab').2). Ver, por exemplo, Wahl et ai., 24 J. Nucl. Med. 316-25 (1983) . Porções de anticorpos podem ser feitas por qualquer um dos métodos anteriores ou podem ser feitas expressando uma porção da molécula recombinante. Por exemplo, a(s) região(ões) CDR de um anticorpo recombinante podem ser isoladas e subclonadas num vetor de expressão apropriado. Ver, por exemplo, Patente U.S. N.° 6 680 053.
Nucleotideos e Sequências de aminoácidos dos Clones 11E12, 34D03 e 19D07
Nalgumas modalidades, a presente invenção proporciona novos anticorpos monoclonais que se ligam especificamente a IL-31 canina. Numa modalidade, um anticorpo monoclonal da invenção liga-se a IL-31 canina e previne a sua ligação a, e ativação de, o seu complexo co-recetor que compreende recetor A de IL-31 (IL-3lRa) e recetor especifico de Oncostatina-M (OsmR ou IL-3lRb). Os anticorpos monoclonais da presente invenção são identificados aqui como "11 E12", "34D03" e "19D07", que se refere ao número atribuído ao seu clone hibridoma. Aqui, "11 E12", "34D03" ou "19D07" também se refere à porção do anticorpo monoclonal, o parátopo ou CDRs, que se ligam especif icamente com um epítopo de IL-31 identificado como 11 E12, 34D03 ou 19D07, por causa da sua capacidade de se ligar aos anticorpos 11 E12, 34D03 ou 19D07, respetivamente. As várias formas recombinantes, quiméricas, heteroquiméricas e/ou caninizadas de 11 E12, 34D03 e 19D07 descritas aqui podem ser referidas utilizando o mesmo nome.
Numa modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo isolado ou porção que se liga ao antígeno do mesmo incluindo pelo menos uma das seguintes: uma região determinante de complementaridade (CDR)1 da cadeia pesada (Vh) variável com a sequência de aminoácidos YYDIN (SEQ ID NO: 1; 11E12-VH-CDR1), SYDMS (SEQ ID NO: 2; 19D07-VH-CDR1) ou NYGMS (SEQ ID NO: 3; 34D03- VH-CDRl); uma CDR2 da cadeia pesada variável com a sequência de aminoácidos WIFPGDGGTKYNETFKG (SEQ ID NO: 4; 11E12-
VH-CDR2), TITSGGGYTYSADSVKG (SEQ ID NO: 5; 19D07-VH-CDR2) ou TISYGGSYTYYPDNIKG (SEQ ID NO: 6; 34D03-VH-CDR2); uma CDR3 da cadeia pesada variável com a sequência de aminoácidos ARGGTSVIRDAMDY (SEQ ID NO: 7; 11E12-VH- CDR3), ARQNWVVGL AY (SEQ ID NO : 8; 1 9D0 7 -VH-CDR3) ou VRGYGYDTMDY (SEQ ID NO: 9; 34D03-VH- CDR3); e uma variante do mesmo com uma ou mais substituições de aminoácidos conservadoras em pelo menos uma de CDRl, CDR2 ou CDR3 .
Noutra modalidade, a invenção proporciona um anticorpo isolado ou porção que se liga ao antigeno do mesmo incluindo pelo menos um dos grupos seguintes: uma cadeia leve variável (VL) que compreende uma região determinante de complementaridade (CDR) 1 com a sequência de aminoácidos RASESVDNYGISFMH (SEQ ID NO: 10; 11E12-VL-CDR1), KSSQSLLNSGNQKNYLA (SEQ ID NO: 11; 19D07-VL- CDRl) ou KASQSVSFAGTGLMH (SEQ ID NO: 12; 34D03-VL-CDR1); uma CDR2 da cadeia leve variável com a sequência de aminoácidos RASNLES (SEQ ID NO: 13; 11E12-VL-CDR2), GASTRES (SEQ ID NO: 14; 19D07-VL-CDR2) ou RASNLEA (SEQ ID NO: 15; 34D03-VL-CDR2); uma CDR3 da cadeia leve variável com a sequência de aminoácidos QQSNKDPLT (SEQ ID NO: 16; 11E12-VL-CDR3) , QNDYSYPYT (SEQ ID NO: 17; 19D07-VL-CDR3) ou QQSREYPWT (SEQ ID NO: 18; 34D03-VL-CDR3); e uma variante do mesmo com uma ou mais substituições de aminoácidos conservadoras em pelo menos uma de CDRl, CDR2 ou CDR3.
Ainda noutras modalidades, um anticorpo com pelo menos uma das CDRs da cadeia leve variável descritas acima, pode ainda incluir pelo menos uma das seguintes CDRs da cadeia variável pesada: uma região determinante de complementaridade (CDR)1 da cadeia pesada variável com a sequência de aminoácidos YYDIN (SEQ ID NO: 1; 11E12-VH-CDR1) , SYDMS (SEQ ID NO: 2; 19D07-VH-CDR1) ou NYGMS (SEQ ID NO: 3; 34D03-VH- CDRl); uma CDR2 da cadeia pesada variável com a sequência de aminoácidos WIFPGDGGTKYNETFKG (SEQ ID NO: 4; 11 E12- VH-CDR2), TITSGGGYTYSADSVKG (SEQ ID NO: 5; 19D07-VH-CDR2) ou TISYGGSYTYYPDNIKG (SEQ ID NO: 6; 34D03-VH-CDR2); uma CDR3 da cadeia pesada variável com a sequência de aminoácidos ARGGTSVIRDAMDY (SEQ ID NO: 7; 11E12-VH- CDR3), ARQNWWGLAY (SEQIDNO: 8; 19D07-VH-CDR3) ou VRGYGYDTMDY (SEQ ID NO: 9; 34D03-VH- CDR3); e uma variante do mesmo com uma ou mais substituições de aminoácidos conservadoras em pelo menos uma de CDRl, CDR2 ou CDR3 .
Nalgumas modalidades, o anticorpo pode incluir pelo menos uma das seguintes: a) uma cadeia leve variável que compreende DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASN LESGIPA RFSGSGSRTDFTLTINPVETDDVATYYCQQSNKDPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 19; MU-11 E12-VL), DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASN LESGVPD RFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQSNKDPLTFGAGTKLEIK (SEQ ID NO: 20; CAN-11 El2-VL-cUn-FW2), DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASESVDNYGISFMHWFQQKPGQSPQLLIYRASN LESGVPD RFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQSNKDPLTFGAGTKLEIK (SEQ ID NO: 21; CAN-llEl2-VL-cUn-13), DIVMSQSPSSLSVSAGDKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPWQPPKLLIYGA STRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 22; MU-19D07-VL), EIVMTQSPASLSLSQEEKVTITCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQAPKLLIYGA STRESGV PSRFSGSGSGTDFSFTISSLEPEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 23; CAN-19D07-VL-998-1), DILLTQSPASLAVSLGQRAIISCKASQSVSFAGTGLMHWYQQKPGQQPKLLIYRASN LEAGVPT RFSGSGSRTDFTLNIHPVEEEDAATYFCQQSREYPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 24; MU-34D03-VL) ou EIVMTQSPASLSLSQEEKVTITCKASQSVSFAGTGLMHWYQQKPGQAPKLLIYRASN LEAGVPS RFSGSGSGTDFSFTISSLEPEDVAVYYCQQSREYPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 25; CAN-34D03-VL-998-1);
b) uma cadeia pesada variável que compreende QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFKYYDINWVRQRPEQGLEWIGWIFPGDGG TKYNE TFKGKATLTTDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYFCARGGTSVIRDAMDYWGQGTSVTV SS (SEQ ID NO: 26; MU- 11 E12-VH),
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFKYYDINWVRQAPGAGLDWMGWIFPGDGG
TKYN ETFKGRVTLTADTSTSTAYMELSSLRAGDIAVYYCARGGTSVIRDAMDYWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 27; CAN- 11E12-VH-415-1),
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQIPEKRLEWVATITSGGGY
TYSADS VKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRSEDTAVYYCARQNWVVGLAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 28; MU-19D07- VH),
EVQLVESGGDLVKPGGSLRLSCVASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLQWVATITSGGGY
TYSA DSVKGRFTISRDNARNTLYLQMNSLRSEDTAVYYCARQNWVVGLAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 29; CAN- 19D07-VH-400-1),
EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFSFSNYGMSWVRQTPDKRLEWVATISYGGSY TYYPD NIKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCVRGYGYDTMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 30; MU- 34D03-VH) ou
EVQLVESGGDLVKPGGSLRLSCVASGFTFSNYGMSWVRQAPGKGLQWVATISYGGSY TYYP DNIKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCVRGYGYDTMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 31; CAN- 34D03-VH-568-1); e c) variantes do mesmo com uma ou mais substituições de aminoácidos conservadoras.
Noutras modalidades, a invenção proporciona uma célula hospedeira que produz um anticorpo descrito anteriormente. A presente invenção também inclui, no seu âmbito, sequências nucleotidicas que codificam um anticorpo descrito anteriormente, que codifica as regiões variáveis das cadeias leve e pesada do anticorpo anti-IL-31 da presente invenção. Também está incluída no âmbito da invenção qualquer sequência nucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos de 11 E12, 34D03 ou 19D07 ou péptidos dos mesmos.
Nalgumas modalidades, a invenção proporciona um ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo descrito anteriormente, incluindo uma sequência de ácido nucleicos que codifica pelo menos uma das seguintes: uma região determinante de complementaridade (CDR)1 da cadeia pesada (Vh) variável com a sequência de aminoácidos YYDIN (SEQ ID NO: 1; 11E12-VH-CDRl), SYDMS (SEQ ID NO: 2; 19D07-VH-CDR1) ou NYGMS (SEQ ID NO: 3; 34D03- VH-CDRl); uma CDR2 da cadeia pesada variável com a sequência de aminoácidos WIFPGDGGTKYNETFKG (SEQ ID NO: 4; 11E12- VH-CDR2), TITSGGGYTYSADSVKG (SEQ ID NO: 5; 19D07-VH-CDR2) ou TISYGGSYTYYPDNIKG (SEQ ID NO: 6; 34D03-VH-CDR2); uma CDR3 da cadeia pesada variável com a sequência de aminoácidos ARGGTSVIRDAMDY (SEQ ID NO: 7; 11E12-VH- CDR3), ARQNWVVGL AY (SEQ ID NO : 8; 1 9D0 7 -VH-CDR3) ou VRGYGYDTMDY (SEQ ID NO: 9; 34D03-VH- CDR3); e uma variante do mesmo com uma ou mais substituições de aminoácidos conservadoras em pelo menos uma de CDRl, CDR2 ou CDR3 .
Em modalidades adicionais, o ácido nucleico isolado descrito anteriormente pode ainda incluir uma sequência de ácido nucleicos que codifica pelo menos uma das seguintes: uma cadeia leve variável (VL) que compreende uma região determinante de complementaridade (CDR)1 com a sequência de aminoácidos RASESVDNYGISFMH (SEQ ID NO: 10; 11E12-VL-CDR1), KSSQSLLNSGNQKNYLA (SEQ ID NO: 11; 19D07-VL- CDRl) ou KASQSVSFAGTGLMH (SEQ ID NO: 12; 34D03-VL-CDR1); uma CDR2 da cadeia leve variável com a sequência de aminoácidos RASNLES (SEQ ID NO: 13; 11E12-VL-CDR2) , GAS-TRES (SEQ ID NO: 14; 19D07-VL-CDR2) ou RASNLEA (SEQ ID NO: 15; 34D03-VL-CDR2) ; uma CDR3 da cadeia leve variável com a sequência de aminoácidos QQSNKDPLT (SEQ ID NO: 16; 11E12-VL-CDR3), QNDYSYPYT (SEQ ID NO: 17; 19D07-VL-CDR3) ou QQSREYPWT (SEQ ID NO: 18; 34D03-VL-CDR3); e uma variante do mesmo com uma ou mais substituições de aminoácidos conservadoras em pelo menos uma de CDRl, CDR2 ou CDR3. A presente invenção proporciona ainda um vetor incluindo pelo menos um dos ácidos nucleicos descrito anteriormente.
Uma vez que o código genético é degenerado, pode ser utilizado mais de um codão para codificar um aminoácido particular. Utilizando o código genético, podem ser identificadas uma ou mais sequências nucleotidicas diferentes, cada uma das quais seria capaz de codificar o aminoácido. A probabilidade de que um oligonucleotideo particular constituirá, de facto, a verdadeira sequência codificante XXX pode ser estimada considerando relações de emparelhamento de bases anormais e a frequência com que um codão particular é realmente utilizado (para codificar um aminoácido particular) em células eucariontes ou procariontes que expressam um anticorpo ou porção anti-IL-31. Tais "regras de utilização do codão" são reveladas por Lathe, et ai., 183 J. Molec. Biol. 1-12 (1985). Utilizando as "regras de utilização do codão" de Lathe, pode ser identificada uma única sequência nucleotidica ou um conjunto de sequências nucleotidicas, que contém uma sequência nucleotidica teórica "mais provável" capaz de codificar sequências anti-IL-31. Também se pretende que regiões codificantes do anticorpo para utilização na presente invenção também possam ser proporcionadas alterando genes existentes de anticorpo utilizando técnicas biológicas moleculares convencionais que resultam em variantes (agonistas) dos anticorpos e péptidos descritos aqui. Tais variantes incluem, mas não se limitam a, deleções, adições e substituições na sequência de aminoácidos dos anticorpos ou péptidos anti-IL-31.
Por exemplo, uma classe de substituições é as substituições de aminoácidos conservadoras. Tais substituições são aquelas que substituem um dado aminoácido num péptido do anticorpo anti-IL-31 por outro aminoácido de caracteristicas semelhantes. Tipicamente vistas como substituições conservadoras são as substituições, uma por outra, entre os aminoácidos alifáticos Ala, Vai, Leu e lie; intercâmbio dos resíduos hidroxilo Ser e Thr, troca dos resíduos acídicos Asp e Glu, substituição entre os resíduos amida Asn e Gin, troca dos resíduos básicos Lys e Arg, substituições entre os resíduos aromáticos Phe, Tyr e afins.
Orientação relativamente a que alterações de aminoácidos serão provavelmente fenotipicamente silenciosas é encontrada em Bowie et ai., 247 Science 1306-10 (1990).
Variantes ou agonistas de anticorpos ou péptidos anti-IL-31 podem ser completamente funcionais ou podem carecer de função em uma ou mais atividades. Variantes completamente funcionais tipicamente contêm apenas variações conservadoras ou variações em resíduos não críticos ou em regiões não críticas. Variantes funcionais também podem conter substituição de aminoácidos semelhantes que resultam em nenhuma alteração ou numa alteração insignificante em função. Em alternativa, tais substituições podem afetar positivamente ou negativamente a função em alguma medida. Variantes não funcionais tipicamente contêm uma ou mais substituições de aminoácidos não conservadoras, deleções, inserções, inversões ou truncação ou uma substituição, inserção, inversão ou deleção num resíduo crítico ou região crítica.
Aminoácidos que são essenciais para função podem ser identificados por métodos conhecidos na técnica, tais como mutagénese sitio-dirigida ou mutagénese de varredura de alanina. Cunningham et ai., 244 Science 1081-85 (1989) . O último procedimento introduz mutações de alanina únicas em cada resíduo na molécula. As moléculas mutantes resultantes são depois testadas para atividade biológica, tal como ligação ao epítopo ou atividade in vitro ADCC. Locais que são críticos para ligação ligando-recetor também podem ser determinados por análise estrutural, tais como cristalografia, ressonância nuclear magnética ou rotulagem de foto-afinidade . Smith et ai ., 224 J. Mol. Biol. 899-904 (1992); de Vos et ai., 255 Science 306-12 (1992) .
Além disso, polipeptídeos contêm, com frequência, aminoácidos além dos vinte aminoácidos "que ocorrem naturalmente". Além disso, muitos aminoácidos, incluindo os aminoácidos terminais, podem ser modificados por processos naturais, tais como processamento e outras modificações pós-translacionais ou por técnicas de modificação química bem conhecidas na técnica. Modificações conhecidas incluem, mas não se limitam a, acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, anexação covalente de flavina, anexação covalente de uma fração heme, anexação covalente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, anexação covalente de um lípido ou derivado de lípido, anexação covalente de fosfotidilinositol, reticulação, ciclização, formação de ligações dissulfido, desmetilação, formação de reticulados covalentes, formação de cistina, formação de piroglutamato, formilação, carboxilação gama, glicosilação, formação de âncora GPI, hidroxilação, iodinação, metilação, miristoilação, oxidação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfação, adição mediada por ARN de transferência de aminoácidos a proteínas, tais como arginilação e ubiquitinação.
Tais modificações são bem conhecidas daqueles habilitados na técnica e foram descritas com grande detalhe na literatura científica. Várias modificações particularmente comuns, glicosilação, anexação lipídica, sulfação, carboxilação gama de resíduos de ácido glutâmico, hidroxilação e ADP-ribosilação, por exemplo, são descritas na maioria dos textos básicos, tais como Proteins--Structure and Molecular Properties (2a edição, T. E. Creighton, W.H. Freemane Co., Nova Iorque, 1993). Muitas revisões detalhadas estão disponíveis sobre este tema, tais como por Wold, Posttranslational Covalent Modification of proteins, 1-12 (Johnson, editor, Academic Press, Nova Iorque, 1983); Seifter et al. 182 Meth. Enzymol. 626-46 (1990); e Rattan et al. 663 Ann. NY Acad. Sci. 48-62 (1992).
Em conformidade, os anticorpos da presente invenção também abrangem derivados ou análogos nos quais um resíduo de aminoácido substituído não é um codificado pelo código genético.
Da mesma forma, as adições e substituições na sequência de aminoácidos, bem como as variações e modificações descritas acima, podem ser igualmente aplicáveis à sequência de aminoácidos do antigeno e/ou epítopo ou péptidos de IL-31 da mesma. Conforme mencionado anteriormente, os genes que codificam um anticorpo monoclonal de acordo com a presente invenção são especificamente eficazes no reconhecimento de IL-31.
Derivados de Anticorpo
Estão incluídos no âmbito desta invenção derivados de anticorpo. Um "derivado" de um anticorpo contém frações químicas adicionais que não são normalmente uma parte da proteína. Modificações covalentes da proteína estão incluídas no âmbito desta invenção. Tais modificações podem ser introduzidas na molécula reagindo resíduos de aminoácidos dirigidos do anticorpo com um agente derivador orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou resíduos terminais. Por exemplo, derivatização com agentes bifuncionais, bem conhecida na técnica, é útil para reticular o anticorpo ou fragmento a uma matriz de suporte insolúvel em água ou a outros veículos macromoleculares.
Derivados também incluem anticorpos monoclonais marcados radioativamente que são marcados. Por exemplo, com iodo radioativo C25I,1311), carbono (14C) , enxofre (35S) , índio (111In) , trítio (3H) ou afins; conjugados de anticorpos monoclonais com biotina ou avidina, com enzimas, tais como peroxidase de raiz-forte, fosfatase alcalina, beta-D-galactosidase, glicose oxidase, glucoamilase, ácido carboxílico anidrase, acetilcolina esterase, lisozima, malato desidrogenase ou glicose 6-fosfato desidrogenase; e também conjugados de anticorpos monoclonais com agentes bioluminescentes (tais como luciferase), agentes quimioluminescentes (tais como ésteres de acridina) ou agentes fluorescentes (tais como ficobiliproteínas).
Outro anticorpo derivado bifuncional da presente invenção é um anticorpo bispecífico, gerado combinando partes de dois anticorpos separados que reconhecem dois grupos antigénicos diferentes. Isto pode ser conseguido por reticulação ou técnicas recombinantes. Além disso, podem ser adicionadas frações ao anticorpo, ou a uma porção do mesmo, para aumentar a meia-vida in vivo (por exemplo, alongando o tempo de eliminação da corrente sanguínea. Tais técnicas incluem, por exemplo, adicionar frações PEG (também designado peguilação) e são bem conhecidas na técnica. Ver Publicação do Pedido de Patente U.S. N.° 20030031671.
Expressão Recombinante de Anticorpos
Nalgumas modalidades, os ácidos nucleicos que codificam um anticorpo monoclonal sujeito são introduzidos diretamente numa célula hospedeira e a célula é incubada em condições suficientes para induzir a expressão do anticorpo codificado. Depois dos ácidos nucleicos sujeitos terem sido introduzidos numa célula, a célula é tipicamente incubada, normalmente a 37 °C, às vezes sob seleção, durante um período de cerca de 1-24 horas para permitir a expressão do anticorpo. Numa modalidade, o anticorpo é segregado no sobrenadante dos meios nos quais a célula está a crescer.
Tradicionalmente, anticorpos monoclonais foram produzidos como moléculas nativas em linhas de hibridoma murino. Além dessa tecnologia, a presente invenção proporciona expressão de ADN recombinante de anticorpos monoclonais. Isto possibilita a produção de anticorpos caninizados, bem como um espetro de derivados de anticorpo e proteínas de fusão numa espécie hospedeira escolhida.
Uma sequência de ácido nucleicos que codifica pelo menos um anticorpo anti-IL-31 da presente invenção pode ser recombinada com ADN de vetor de acordo com técnicas convencionais, incluindo terminais com extremidades sem ponta ou extremidades escalonadas para ligação, digestão com enzima de restrição para proporcionar terminais apropriados, preenchimento de extremidades coesas conforme apropriado, tratamento com fosfatase alcalina para evitar junção indesejada e ligação com ligases apropriadas. Técnicas para tais manipulações são reveladas, por exemplo, por Maniatis et ai., MOLECULAR CLONING, LAB. MANUAL, (Cold Spring Harbor Lab. Press, Nova Iorque, 1982 e 1989) e Ausubel et al. 1993 supra, podem ser utilizados para construir sequências de ácido nucleicos que codificam uma molécula de anticorpo monoclonal ou região de ligação ao antígeno da mesma.
Uma molécula de ácido nucleico, tal como ADN, é dita ser "capaz de expressar" um polipeptídeo se contiver sequências nucleotídicas que contêm informação reguladora transcricional e translacional e tais sequências estão "operativamente ligadas" às sequências nucleotídicas que codificam o polipeptídeo. Uma ligação operativa é uma ligação na qual as sequências de ADN reguladoras e a sequência de ADN que se procura expressar são ligadas de tal forma que possibilitam expressão dos genes como péptidos ou porções de anticorpo anti-IL-31 em quantidades recuperáveis. A natureza exata das regiões reguladoras necessárias para a expressão dos genes pode variar de organismo para organismo, como é bem conhecido na técnica análoga. Ver, por exemplo, Sambrook et al., 2001 supra; Ausubel et al., 1993 supra.
Em conformidade, a presente invenção abrange a expressão de um anticorpo anti-IL-31 em células procariontes ou eucariontes. Hospedeiros adequados incluem hospedeiros eucariontes ou bacterianos incluindo células de bactérias, leveduras, insetos, fungos, aves e mamíferos seja in vivo ou in situ ou células hospedeiras de origem mamífero, inseto, ave ou levedura. A célula ou tecido de mamífero pode ser de origem humana, primata, hamster, coelho, roedor, vaca, porco, ovelha, cavalo, cabra, cão ou gato, mas pode ser utilizada qualquer outra célula de mamífero.
Numa modalidade, a sequência nucleotídica introduzida será incorporada num plasmídeo ou vetor virai capaz de replicação autónoma no hospedeiro recetor. Qualquer um de uma ampla variedade de vetores pode ser empregue para este fim. Ver, por exemplo, Ausubel et al., 1993 supra. Fatores de importância na seleção de um plasmídeo ou vetor virai particular incluem: a facilidade com a qual as células recetoras que contêm o vetor podem ser reconhecidas e selecionadas daquelas células recetoras que não contêm o vetor; o número de cópias do vetor que são desejadas num hospedeiro particular; e se é desejável ser capaz de "shuttle" o vetor entre células hospedeiras de diferentes espécies.
Exemplos de vetores procariontes conhecidos na técnica incluem plasmídeos, tais como aqueles capazes de replicação em E. coli (tais como, por exemplo, pBR322, ColEl, pSClOl, pACYC 184, .pi.VX) . Tais plasmídeos são, por exemplo, revelados por Maniatis et al., 1989 supra; Ausubel et al, 1993 supra. Plasmídeos de Bacillus incluem pCl94, pC221, pTl27, etc. Tais plasmídeos são revelados por Gryczan, em THE MOLEC. BIO. OF THE BACILLI 307-329 (Academic Press, Nova Iorque, 1982). Plasmídeos adequados de Streptomyces incluem pIJlOl (Kendall et al., 169 J. Bacteriol. 4177-83 (1987)) e bacteriófagos de Streptomyces tais como .phi.C31 (Chater et al. , em SIXTH INT'L SYMPOSIUM ON ACTINOMYCETALES BIO. 45-54 (Akademiai Kaido, Budapeste, Hungria 1986). Plasmídeos de Pseudomonas são revistos em John et al., 8 Rev. Infect. Dis. 693-704 (1986); Izaki, 33 Jpn. J. Bacteriol. 729-42 (1978); e Ausubel et al., 19 93 s upra.
Em alternativa, elementos da expressão génica úteis para a expressão de ADNc que codificam anticorpos ou péptidos anti-IL-31 incluem, mas não se limitam a, (a) promotores de transcrição virai e seus elementos potenciadores, tais como o promotor inicial SV40 (Okayama et al., 3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983)), vírus do sarcoma de Rous LTR (Gorman et al., 79 Proc. Natl. Acad. Sei., USA 6777 (1982)) e vírus da leukemia murina de Moloney LTR (Grosschedl et al., 41 Cell 885 (1985)); (b) regiões de encaixe e locais de poliadenilação, tais como aqueles derivados da região final SV40 (Okayarea et al., 1983), e (c) locais de poliadenilação, tais como em SV40 (Okayama et al., 1983) .
Os genes ADNc de imunoglobulina podem ser expressos conforme descrito por Weidle et al., 51 Gene 21 (1987), utilizando como elementos de expressão o promotor inicial SV40 e o seu potenciador, os potenciadores do promotor da cadeia H de imunoglobulina de ratinho, encaixe de mRNA da região final SV40, sequência interveniente da S-globina de coelho, locais de poliadenilação da S-globina de coelho e imunoglobulina e elementos de poliadenilação de SV40.
Para os genes de imunoglobulina compostos de parte ADNc, parte ADN genómico (Whittle et al., 1 Protein Engin. 499 (1987)), o promotor transcricional pode ser o citomegalovirus humano, os potenciadores do promotor podem ser imunoglobulina murina/humana e citomegalovirus e encaixe de mRNA e regiões de poliadenilação podem ser as sequências de imunoglobulina cromossómica nativas.
Numa modalidade, para expressão de genes de ADNc em células de roedor, o promotor transcricional é uma sequência LTR virai, os potenciadores do promotor transcricional são um dos ou ambos potenciador da cadeia pesada de imunoglobulina de ratinho e o potenciador LTR viral, a região encaixe contém um intrão superior a 31 pb e as regiões de terminação da poliadenilação e transcrição são derivadas da sequência cromossómica nativa correspondente à cadeia de imunoglobulina a ser sintetizada. Noutras modalidades, sequências de ADNc que codificam outras proteínas são combinadas com os elementos de expressão anteriormente recitados para conseguir expressão das proteínas nas células de mamíferos.
Cada gene fundido pode ser montado em, ou inserido em, um vetor de expressão. Células recetoras capazes de expressar o produto génico da cadeia de imunoglobulina quimérica são depois transfetadas unicamente com um péptido anti-IL-31 ou gene codificante da cadeia H quimérica ou L quimérica ou são co-transf etadas com um gene da cadeia H quimérica ou L quimérica. As células recetoras transfetadas são cultivadas em condições que permitem a expressão dos genes incorporados e as cadeias de imunoglobulina expressas ou anticorpos intactos ou fragmentos são recuperados da cultura.
Numa modalidade, os genes fundidos que codificam o péptido anti-IL-31 ou cadeias H e L quiméricas, ou porções das mesmas, são montados em vetores de expressão separados que são depois utilizados para co-transfetar uma célula recetora. Em alternativa, os genes fundidos que codificam as cadeias H e L quiméricas podem ser montados no mesmo vetor de expressão.
Para transfeção dos vetores de expressão e produção do anticorpo quimérico, a linha de células recetoras pode ser uma célula de mieloma. Células de mieloma podem sintetizar, montar e segregar imunoglobulinas codificadas por genes de imunoglobulina transfetados e possuem o mecanismo para glicosilação da imunoglobulina. Células de mieloma podem ser crescidas em cultura ou na cavidade peritoneal de um ratinho, onde pode ser obtida imunoglobulina segregada a partir de fluido ascites. Outras células recetoras adequadas incluem células linfoides, tais como linfócitos B de origem humana ou não humana, células de hibridoma de origem humana ou não humana ou células de heterohibridoma inter-espécie. 0 vetor de expressão que transporta uma construção de anticorpo caninizado ou quimérico ou polipeptideo anti-IL-31 da presente invenção pode ser introduzido numa célula hospedeira apropriada por qualquer um de uma variedade de meios adequados, incluindo tais meios bioquímicos como transformação, transfeção, conjugação, fusão de protoplasto, precipitação com fosfato de cálcio e aplicação com policatiões, tais como dietilaminoetil (DEAE) dextrano, e tais meios mecânicos como eletroporação, microinjeção direta e bombardeamento com microprojéteis. Johnston et al., 240 Science 1538 (1988).
Leveduras podem proporcionar vantagens substanciais sobre bactérias para a produção de cadeias H e L de imunoglobulina. Leveduras realizam modificações peptídicas pós-translacionais incluindo glicosilação. Existe atualmente um número de estratégias de ADN recombinante que utiliza fortes sequências promotoras e plasmideos de número de cópias elevado que podem ser utilizados para produção das proteínas desejadas na levedura. Levedura reconhece sequências líder de produtos génicos de mamíferos clonados e segrega péptidos que transportam sequências líder (isto é, pré-péptidos). Hitzman et ai., 11a Conferência Internacional sobre Leveduras, Genética e Biol. Molec. (Montpelier, França, 1982).
Sistemas de expressão génica de leveduras podem ser avaliados de forma rotineira em relação aos níveis de produção, secreção e a estabilidade de péptidos anti-IL-31, anticorpo e anticorpos quiméricos, heteroquiméricos, caninizados ou felinizados murinos montados, fragmentos e regiões dos mesmos. Qualquer de uma série de sistemas de expressão génica de leveduras que incorporam elementos promotores e de terminação dos genes ativamente expressos que codificam enzimas glicolíticas produzidas em grandes quantidades quando as leveduras são crescidas em meios ricos em glicose pode ser utilizado. Genes glicolíticos conhecidos também podem proporcionar sinais de controlo de transcrição muito eficientes. Por exemplo, podem ser utilizados os sinais promotores e de terminação do gene da fosfoglicerato quinase (PGK) . Pode ser levado a cabo um número de abordagens para avaliar plasmideos de expressão ótima para a expressão de ADNc de imunoglobulina clonados em levedura. Ver Volume II DNA Cloning, 45-66, (Glover, editor) IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1985).
Também podem ser utilizadas estirpes bacterianas como hospedeiros para a produção de moléculas ou péptidos de anticorpo descritas por esta invenção. Vetores plasmídeo que contêm sequências replicão e de controlo que são derivadas de espécies compatíveis com uma célula hospedeira são utilizados em ligação com estes hospedeiros bacterianos. 0 vetor transporta um local de replicação, bem como genes específicos que são capazes de proporcionar seleção fenotípica em células transformadas. Pode ser levado a cabo um número de abordagens para avaliar plasmídeos de expressão para a produção de anticorpos murinos, quiméricos, heteroquiméricos, caninizados ou felinizados, fragmentos e regiões ou cadeias de anticorpo codificados pelos ADNc de imunoglobulina clonados em bactérias (ver Glover, 1985 supra; Ausubel, 1993 supra; Sambrook, 2001 supra; Colligan et ai., editores. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nova Iorque, Nova Iorque (1994-2001); Colligan et al., editores. Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, Nova Iorque, Nova Iorque (1997-2001) . Células de mamífero hospedeiras podem ser crescidas in vitro ou in vivo. Células de mamífero proporcionam modificações pós-translacionais a moléculas proteicas de imunoglobulina incluindo remoção de péptido líder, dobragem e montagem de cadeias H e L, glicosilação de moléculas de anticorpo e secreção de proteína de anticorpo funcional. Células de mamífero que podem ser úteis como hospedeiros para a produção de proteínas de anticorpo, além das células de origem linfoide descritas anteriormente, incluem células de origem fibroblasto, tais como células Vero (ATCC CRL 81) ou CHO-K1 (ATCC CRL 61).
Muitos sistemas vetor estão disponíveis para a expressão de genes de cadeia H e L de péptidos anti-IL-31 clonados em células de mamífero (ver Glover, 1985 supra). Podem ser seguidas abordagens diferentes para obter anticorpos H2L2 completos. É possível co-expressar cadeias H e L nas mesmas células para atingir associação intracelular e ligação de cadeias H e L em anticorpos H2L2 tetraméricos completos e/ou péptidos anti-IL-31. A co-expressão pode ocorrer utilizando ou os mesmos plasmídeos ou plasmídeos diferentes no mesmo hospedeiro. Genes para ambas cadeias H e L e/ou péptidos anti-IL-31 podem ser colocados no mesmo plasmídeo, que é depois transfetado nas células, selecionando, assim, diretamente células que expressam ambas cadeias. Em alternativa, as células podem ser transfetadas primeiro com um plasmídeo que codifica uma cadeia, por exemplo, a cadeia L, seguido de transfeção da linha de células resultante com um plasmídeo da cadeia H que contém um segundo marcador selecionável. Linhas de células que produzem péptidos anti-IL-31 e/ou moléculas H2L2 através de qualquer uma dessas vias poderiam ser transfetadas com plasmídeos que codificam cópias adicionais de péptidos, H, L ou cadeias H mais L em conjunto com marcadores selecionáveis adicionais para gerar linhas de células com propriedades potenciadas, tais como produção superior de moléculas H2L2 de anticorpo montadas ou estabilidade aumentada das linhas de células transfetadas.
Para produção a longo-prazo, de alto rendimento de anticorpos recombinantes, pode ser utilizada expressão estável. Por exemplo, podem ser fabricadas por engenharia genética linhas de células, que expressam de forma estável molécula de anticorpo. Em vez de utilizar vetores de expressão que contêm origens virais de replicação, células hospedeiras podem ser transformadas com cassetes de expressão de imunoglobulina e um marcador selecionável. Após introdução do ADN estranho, as células fabricadas por engenharia genética podem ser permitidas crescer durante 1-2 dias em meios enriquecidos e depois são trocadas para um meio seletivo. 0 marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite que as células integrem de forma estável o plasmídeo num cromossoma e cresçam para formar focos que, por sua vez, podem ser clonados e expandidos em linhas de células. Tais linhas de células fabricadas por engenharia genética podem ser particularmente úteis no rastreio e avaliação de compostos/componentes que interagem diretamente ou indiretamente com molécula de anticorpo.
Assim que um anticorpo da invenção tenha sido produzido, pode ser purificado por qualquer método conhecido na técnica para purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, de troca de iões, afinidade, particularmente afinidade pelo antígeno específico após Proteína A, e cromatografia por dimensionamento de coluna), centrifugação, solubilidade diferencial ou por qualquer outra técnica convencional para a purificação de proteínas. Em muitas modalidades, os anticorpos são segregados a partir da célula para o meio de cultura e colhidos do meio de cultura.
Aplicações farmacêuticas
Os anticorpos anti-IL-31 da presente invenção podem ser utilizados, por exemplo, no tratamento de condições patológicas pruríticas e/ou alérgicas em cães. Mais especificamente, a invenção proporciona ainda uma composição farmacêutica que compreende um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável e, como ingrediente ativo, um anticorpo de acordo com a invenção. 0 anticorpo pode ser um anticorpo quimérico, heteroquimérico ou caninizado de acordo com a presente invenção. Imunoglobulinas intactas ou os seus fragmentos de ligação, tais como Fab, também estão contempladas. 0 anticorpo e composições farmacêuticas do mesmo desta invenção são úteis para administração parentérica, por exemplo, por via subcutânea, intramuscular ou intravenosa.
Anticorpos anti-IL-31 da presente invenção podem ser administrados ou como agentes terapêuticos individuais ou em combinação com outros agentes terapêuticos. Eles podem ser administrados sozinhos, mas são geralmente administrados com um veiculo farmacêutico selecionado com base na via de administração escolhida e prática farmacêutica convencional.
Administração dos anticorpos revelados aqui pode ser realizada por quaisquer meios adequados, incluindo injeção parentérica (tal como injeção intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular), oralmente ou por administração tópica dos anticorpos (tipicamente realizada numa formulação farmacêutica) para uma superfície das vias aéreas. A administração tópica para uma superfície das vias aéreas pode ser realizada por can administração intranasal (por exemplo, através da utilização de um conta-gotas, esfregaço ou inalador). A administração tópica dos anticorpos para uma superfície das vias aéreas também pode ser realizada por administração por inalação, tal como criando partículas respiráveis de uma formulação farmacêutica (incluindo ambas partículas sólidas e líquidas) que contém os anticorpos como uma suspensão aerossol e depois fazer com que o sujeito inale as partículas respiráveis. Métodos e aparelhos para administrar partículas respiráveis de formulações farmacêuticas são bem conhecidos e pode ser empregue qualquer técnica convencional. A administração oral pode ser, por exemplo, na forma de um líquido ingerível ou formulação sólida.
Nalgumas modalidades desejadas, os anticorpos são administrados por injeção parentérica. Para administração parentérica, os anticorpos ou péptidos anti-IL-31 podem ser formulados como uma solução, suspensão, emulsão ou pó liofilizado em associação com um veículo parentérico farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, o veículo pode ser uma solução do anticorpo ou um cocktail do mesmo dissolvido num veículo aceitável, tal como um veículo aquoso, tais veículos são água, solução salina, solução de Ringer, solução de dextrose, solução de trehalose ou sacarose ou 5% albumina do soro, 0,4% solução salina, 0,3% glicina e afins. Lipossomas e veículos não aquosos, tais como óleos fixados, também podem ser utilizados. Estas soluções são estéreis e geralmente livres de matérias particulada. Estas composições podem ser esterilizadas por técnicas convencionais, de esterilização bem conhecidas. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis conforme requerido para aproximar condições fisiológicas, tais como agentes de ajuste do pH e tamponantes, agentes de ajuste de toxicidade e afins, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio, etc. A concentração do anticorpo nestas formulações pode variar amplamente, por exemplo, de menos de cerca de 0,5%, normalmente a ou pelo menos cerca de 1 % até ao máximo de 15% ou 20% por peso e será selecionada primariamente com base nos volumes do fluido, viscosidades, etc., de acordo com o modo de administração particular selecionado. O veículo ou pó liofilizado pode conter aditivos que mantêm a isotonicidade (por exemplo, cloreto de sódio, manitol) e estabilidade química (por exemplo, tampões e conservantes). A formulação é esterilizada por técnicas vulgarmente utilizadas. Métodos reais de preparação de composições administráveis parentericamente serão conhecidos ou aparentes àqueles habilitados na técnica e são descritos com maior detalhe em, por exemplo, REMINGTON'S PHARMA. SCI. (15a edição, Mack Pub. Co., Easton, Pa., 1980).
Os anticorpos desta invenção podem ser liofilizados para armazenamento e reconstituídos num veículo adequado antes da utilização. Esta técnica mostrou-se ser eficaz com imunoglobulinas convencionais. Podem ser empregues quaisquer técnicas de liofilização e reconstituição adequadas. Será apreciado por aqueles habilitados na técnica que a liofilização e reconstituição podem conduzir a graus variados de perda de atividade do anticorpo e que os níveis de utilização poderão ter de ser ajustados para compensar.
As composições que contêm os presentes anticorpos ou uma mistura dos mesmos podem ser administradas para prevenção de tratamentos de recorrência e/ou terapêuticos para a doença existente. Veículos farmacêuticos adequados são descritos na edição mais recente de REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, um texto referência convencional neste campo da técnica.
Na aplicação terapêutica, as composições são administradas a um sujeito que já padece de uma doença, numa quantidade suficiente para curar ou pelo menos parar ou aliviar parcialmente a doença e suas complicações. Uma quantidade adequada para conseguir isto é definida como uma "dose terapeuticamente eficaz" ou uma "quantidade terapeuticamente eficaz". Quantidades eficazes para esta utilização dependerão da severidade da doença e do estado geral do sistema imune do próprio sujeito, mas geralmente oscilam entre cerca de 0,1 mg anticorpo por kg de peso corporal a cerca de 10 mg anticorpo por kg de peso corporal, preferencialmente cerca de 0,3 mg anticorpo por kg de peso corporal a cerca de 5 mg de anticorpo por kg de peso corporal. Com vista à minimização de substâncias extrínsecas e a probabilidade menor de rejeições de "substâncias estranhas" que são conseguidas pelo presente tipo canino desta invenção, pode ser possível administrar excessos substanciais destes anticorpos. A dosagem administrada variará, obviamente, dependendo de fatores conhecidos, tais como as características farmacodinâmicas do agente particular e seu modo e via de administração; idade, estado de saúde e peso do recetor; natureza e extensão do tipo de sintomas do tratamento concorrente, frequência de tratamento e o efeito desejado.
Como um exemplo não limitante, pode ser proporcionado tratamento de patologias relacionadas com IL-31 em cães como uma dosagem bissemanalmente ou mensalmente de anticorpos anti-IL-31 da presente invenção no intervalo de dosagem descrito anteriormente.
Anticorpos exemplo para utilização terapêutica em cães são anticorpos de elevada afinidade (estes também podem ser de elevada avidez), e fragmentos, regiões e derivados dos mesmos, com atividade in vivo anti-IL-31 potente, de acordo com a presente invenção.
Administrações únicas ou múltiplas das composições podem ser realizadas sendo os níveis e padrões de dose selecionados pelo veterinário a tratar da condição patológica. De qualquer forma, as formulações farmacêuticas deveriam proporcionar uma quantidade do(s) anticorpo (s) desta invenção suficiente para tratar de forma eficaz o sujeito.
Aplicações diagnósticas A presente invenção também proporciona os anticorpos anti-IL-31 anteriores para utilização em métodos diagnósticos para detetar IL-31 em animais de companhia conhecidos por terem ou suspeitos de terem uma condição patológica prurítica e/ou alérgica.
Anticorpos anti-IL-31 da presente invenção são úteis para imunoensaios que detetam ou quantificam anticorpos IL-31 ou anti-IL-31, numa amostra. Um imunoensaio para IL-31 compreende tipicamente incubar uma amostra clinica ou biológica na presença de um anticorpo anti-IL-31 marcado de forma detetável de elevada afinidade (ou elevada avidez) ou polipeptídeo da presente invenção capaz de se ligar seletivamente a IL-31 e detetar o péptido ou anticorpo marcado que está ligado numa amostra. Vários procedimentos de ensaios clínicos são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, IMMUNOASSAYS durante THE 80'S (Voller et ai., editores, Univ. Park, 1981). Tais amostras incluem amostras de biópsia de tecido, sangue, soro e fecais ou líquidos recolhidos de sujeitos animais e sujeitos a análise ELISA, conforme descrito a seguir.
Nalgumas modalidades, a ligação do antígeno ao anticorpo é detetada sem a utilização de um suporte sólido. Por exemplo, a ligação do antígeno ao anticorpo pode ser detetada num formato líquido.
Noutras modalidades, um anticorpo ou polipeptídeo anti-IL-31 pode, por exemplo, ser fixado a nitrocelulose ou outro suporte sólido que é capaz de imobilizar células, partículas de células ou proteínas solúveis. 0 suporte pode depois ser lavado com tampões adequados seguidos de tratamento com o péptido ou anticorpo específico de IL-31 marcado de forma detetável. 0 suporte de fase sólida pode depois ser lavado com o tampão uma segunda vez para remover péptido ou anticorpo não ligado. A quantidade de rótulo ligado no suporte sólido pode depois ser detetada por etapas do método conhecidas. "Suporte de fase sólida" ou "veículo" refere-se a qualquer suporte capaz de ligar péptido, antígeno ou anticorpo. Suportes ou veículos bem conhecidos, incluem vidro, polistireno, polipropileno, polietileno, polivinilidenefluoreto (PVDF), dextrano, náilon, amilases, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, agaroses e magnetite. A natureza do veículo pode ser ou solúvel até certo ponto ou insolúvel para os fins da presente invenção. 0 material suporte pode ter virtualmente qualquer configuração estrutural possível desde que a molécula acoplada seja capaz de se ligar a IL-31 ou a um anticorpo anti-IL-31. Logo, a configuração do suporte pode ser esférica, como numa pérola, ou cilíndrica, como a superfície interna de um tubo de ensaio ou a superfície externa de um bastão. Em alternativa, a superfície pode ser rasa, tal como uma folha, prato de cultura, faixa de ensaio, etc. Por exemplo, suportes podem incluir pérolas de polistireno. Aqueles habilitados na técnica conhecerão muitos outros veículos adequados para ligar anticorpo, péptido ou antígeno ou podem determinar o mesmo por experimentação rotineira.
Etapas de método bem conhecidas podem determinar a atividade de ligação de um dado lote de péptido e/ou anticorpo anti-IL-31. Aqueles habilitados na técnica podem determinar condições de ensaio operativas e ótimas por experimentação rotineira.
Rotular de forma detetável um péptido e/ou anticorpo anti-IL-31 pode ser conseguido ligando a uma enzima para utilização num imunoensaio enzimático (EIA) ou ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). A enzima ligada reage com o substrato exposto para gerar uma fração química que pode ser detetada, por exemplo, por meios espetrofotométricos, fluorométricos ou visuais. Enzimas que podem ser utilizadas para rotular de forma detetável os anticorpos específicos de IL-31 da presente invenção incluem, mas não se limitam a, malato desidrogenase, nuclease de Staphylococcus, delta-5-esteroide isomerase, álcool desidrogenase de levedura, alfa-glicerofosfato desidrogenase, triose fosfato isomerase, peroxidase de raiz-forte, fosfatase alcalina, asparaginase, glicose oxidase, beta-galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, glicose-6-fosfato desidrogenase, glucoamilase e acetilcolinesterase.
Ao rotular radioativamente os anticorpos específicos de IL-31, é possível detetar a IL-31 através da utilização de um radioimunoensaio (RIA) . Ver Work et ai., LAB. TECHNIQUES & BIOCHEM. 1 N MOLEC. Bio. (No. Holland Pub. Co., Nova Iorque, 1978). 0 isótopo radioativo pode ser detetado através de tais meios como a utilização de um contador gama ou um contador de cintilação ou por autorradiografia. Isótopos que são particularmente úteis para o fim da presente invenção incluem: 3H, 125I, 131I, 35S, 14C e 125I.
Também é possível rotular os anticorpos específicos de IL-31 com um composto fluorescente. Quando o anticorpo marcado fluorescente é exposto à luz de comprimento de onda adequado, a sua presença pode ser detetada devido à fluorescência. Entre os compostos de rotulagem fluorescentes mais vulgarmente utilizados estão isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldeído e fluorescarnina.
Os anticorpos específicos de IL-31 também podem ser marcados de forma detetável utilizando metais emissores de fluorescência, tais como 125Eu ou outros da série lantanida. Estes metais podem ser anexados aos anticorpos específicos de IL-31 utilizando tais grupos quelantes de metal como ácido dietilenotriaminepentaacético (DTPA) ou ácido etilenodiamina-tetraacético (EDTA).
Os anticorpos específicos de IL-31 também podem ser marcados de forma detetável acoplando-se a um composto quimioluminescente. A presença do anticorpo marcado de forma quimioluminescente é depois determinada detetando a presença de luminescência que surge durante uma reação química. Exemplos de compostos de rotulagem quimioluminescente úteis são luminol, isoluminol, éster de acridínio teromático, imidazol, sal de acridínio e éster de oxalato.
Da mesma forma, um composto bioluminescente pode ser utilizado para rotular o anticorpo, porção, fragmento, polipeptideo ou derivado especifico de IL-31 da presente invenção. Bioluminescência é um tipo de quimioluminescência encontrada em sistemas biológicos no qual uma proteína catalítica aumenta a eficiência da reação quimioluminescente. A presença de uma proteína bioluminescente é determinada detetando a presença de luminescência. Compostos bioluminescentes importantes para fins de rotulagem são luciferina, luciferase e aequorina. A deteção do anticorpo, porção, fragmento, polipeptideo ou derivado específico de IL-31 pode ser conseguida por um contador de cintilação, por exemplo, se o rótulo detetável é um emissor de gama radioativo ou por um fluorómetro, por exemplo, se o rótulo é um material fluorescente. No caso de um rótulo enzimático, a deteção pode ser conseguida por métodos colorimétricos que empregam um substrato para a enzima. A deteção também pode ser conseguida por comparação visual da extensão da reação enzimática de um substrato em comparação com padrões igualmente preparados.
Para os fins da presente invenção, a IL-31 que é detetada pelos ensaios anteriores pode estar presente numa amostra biológica. Qualquer amostra que contém IL-31 pode ser utilizada. Por exemplo, a amostra é um fluido biológico, tal como, por exemplo, sangue, soro, linfa, urina, fezes, exsudato inflamatório, fluido cerebrospinal, fluido amniótico, um extrato ou homogenato de tecido e afins. A invenção não está limitada a ensaios que utilizam apenas estas amostras, contudo, sendo possível para alguém com habilitação comum na técnica, à luz da presente especificação, determinar condições adequadas que permitem a utilização de outras amostras. A deteção in situ pode ser conseguida removendo um espécime histológico de um sujeito animal e proporcionando a combinação de anticorpos marcados da presente invenção a tal espécime. 0 anticorpo (ou porção do mesmo) pode ser proporcionado aplicando ou sobrepondo o anticorpo marcado (ou porção) a uma amostra biológica. Através da utilização de tal procedimento, é possível determinar não só a presença de IL-3, mas também a distribuição de IL-31 no tecido examinado. Utilizando a presente invenção, aqueles com habilitação comum perceberão prontamente que qualquer de uma ampla variedade de métodos histológicos (tais como procedimentos de coloração) podem ser modificados para obter tal deteção in situ. 0 anticorpo, fragmento ou derivado da presente invenção pode ser adaptado para utilização num ensaio imunométrico, também conhecido por um ensaio "dois locais" ou "sanduíche". Num ensaio imunométrico típico, uma quantidade de anticorpo não marcado (ou fragmento de anticorpo) é ligada a um suporte sólido que é insolúvel no fluido a ser testado e uma quantidade de anticorpo solúvel marcado de forma detetável é adicionado para permitir deteção e/ou quantificação do complexo ternário formado entre anticorpo de fase sólida, antígeno e anticorpo marcado.
Os anticorpos podem ser utilizados para detetar quantitativamente ou qualitativamente a IL-31 numa amostra ou para detetar a presença de células que expressam a IL-31. Isto pode ser conseguido por técnicas de imunofluorescência que empregam um anticorpo marcado de forma fluorescente (ver a seguir) acoplado com microscopia de fluorescência, citometria de fluxo ou deteção fluorométrica. Para fins de diagnóstico, os anticorpos podem ser marcados ou não marcados. Anticorpos não marcados podem ser utilizados em combinação com outros anticorpos marcados (segundos anticorpos) que são reativos com o anticorpo, tais como anticorpos específicos para regiões constantes de imunoglobulina canina. Em alternativa, os anticorpos podem ser marcados diretamente. Pode ser empregue uma ampla variedade de rótulos, tais como radionuclídeos, flúores, enzimas, substratos enzimáticos, co-fatores de enzima, inibidores enzimáticos, ligandos (particularmente haptenos), etc. Numerosos tipos de imunoensaios, tais como aqueles discutidos previamente, estão disponíveis e são bem conhecidos daqueles habilitados na técnica.
Numa modalidade, o método diagnóstico de detetar IL-31 é um teste imunoensaio de fluxo lateral. Isto também é conhecido como o ensaio imunocromatográfico, ImunoMigração Rápida (RIM™) ou teste de tira. Os imunoensaios de fluxo lateral são essencialmente imunoensaios adaptados para operar ao longo de um único eixe para se ajustar ao formato do teste de tira. Foi desenvolvido um número de variações da tecnologia em produtos comerciais, mas todos eles operam de acordo com o mesmo principio básico. Um teste de tira típico consiste nos seguintes componentes: (1) almofada da amostra - uma almofada absorvente sobre a qual a amostra teste é aplicada; (2) almofada de conjugado ou reagente - isto contém anticorpos específicos do analito alvo conjugado com partículas coloridas (normalmente partículas coloidais ou microsferas de látex); (3) membrana de reação - tipicamente uma membrana de nitrocelulose hidrofóbica ou de acetato de celulose sobre a qual os anticorpos analitos anti-alvo são imobilizados numa linha através da membrana como uma zona de captura ou linha de teste (também pode estar presente uma zona controlo, que contém anticorpos específicos para os anticorpos conjugados); e (4) pavio ou reservatório de resíduos - uma almofada ainda mais absorvente desenhada para puxar a amostra através da membrana de reação por ação capilar e recolhê-la. Os componentes da tira são normalmente fixos a um material de suporte inerte e podem ser apresentados num formato em vareta simples ou dentro de um estojo de plástico com uma porta da amostra e janela de reação que mostra as zonas de captura e controlo.
Existem dois tipos principais de imunoensaio de fluxo lateral utilizado em testes microbiológicos : ensaios sanduíche duplo de anticorpo e ensaios competitivos. No ensaio sanduíche duplo de anticorpo, a amostra migra da almofada da amostra através da almofada de conjugado onde qualquer analito alvo presente se ligará ao conjugado. A amostra depois continua a migrar através da membrana até atingir a zona de captura onde o complexo alvo/conjugado se ligará aos anticorpos imobilizados produzindo uma linha visível na membrana. A amostra depois migra ainda mais ao longo da tira até atingir a zona controlo, onde um excesso de conjugado se ligará e produzirá uma segunda linha visível na membrana. Esta linha controlo indica que a amostra migrou através da membrana conforme pretendido. Duas linhas claras na membrana é um resultado positivo. Uma única linha na zona controlo é um resultado negativo. Os ensaios competitivos diferem do formato sanduíche duplo de anticorpo pelo facto da almofada do conjugado conter anticorpos que já estão ligados ao analito alvo ou a um análogo do mesmo. Se o analito alvo está presente na amostra não ligará, portanto, com o conjugado e permanecerá não marcado. À medida que a amostra migra ao longo da membrana e atinge a zona de captura, um excesso de analito não marcado ligará aos anticorpos imobilizados e bloqueará a captura do conjugado, de modo que não é produzida qualquer linha visível. 0 conjugado não ligado ligar-se-á depois aos anticorpos na zona controlo produzindo uma linha visível controlo. Uma única linha controlo na membrana é um resultado positivo. Duas linhas visíveis nas zonas de captura e controlo é um resultado negativo. Contudo, se um excesso de analito alvo não marcado não estiver presente, pode ser produzida uma linha ténue na zona de captura, indicando um resultado inconclusivo. Existe um número de variações da tecnologia de fluxo lateral. A zona de captura na membrana pode conter antígenos ou enzimas imobilizados - dependendo do analito alvo - em vez de anticorpos. Também é possível aplicar múltiplas zonas de captura para criar um teste multiplex. Por exemplo, foram desenvolvidas tiras teste comerciais capazes de detetar ambas toxinas STl e ST2 de EHEC Shiga separadamente na mesma amostra.
De forma importante, os anticorpos da presente invenção podem ser úteis para diagnosticar uma condição patológica prurítica e/ou alérgica em cães ou gatos. Mais especif icamente, o anticorpo da presente invenção pode identificar a sobre-expressão de IL-31 em animais de companhia. Assim, o anticorpo da presente invenção pode proporcionar uma importante ferramenta imunohistoquimica.
Os anticorpos da presente invenção podem ser utilizados em arranjos de anticorpo, altamente adequados para medir perfis de expressão qénica.
Kits
Também estão incluídos no âmbito da presente invenção kits para praticar os métodos sujeitos. Os kits incluem pelo menos um ou mais dos anticorpos da presente invenção, um ácido nucleico que codifica os mesmos ou uma célula que contém os mesmos. Numa modalidade, pode ser proporcionado um anticorpo da presente invenção, normalmente numa forma liofilizada, num recipiente. Os anticorpos, que podem ser conjugados com um rótulo ou toxina, ou não conjugados, estão tipicamente incluídos nos kits com tampões, tais como Tris, fosfato, carbonato, etc., estabilizadores, biocidas, proteínas inertes, por exemplo, albumina do soro ou afins. Em geral, estes materiais estarão presentes em menos de 5% peso. com base na quantidade de anticorpo ativo e normalmente presentes numa quantidade total de, pelo menos, cerca de 0,001% peso com base de novo na concentração do anticorpo. Frequentemente, será desejável incluir um extensor ou excipiente inerte para diluir os ingredientes ativos, onde o excipiente pode estar presente em de cerca de 1% a 99% peso da composição total. Onde é empregue num ensaio um segundo anticorpo capaz de se ligar ao anticorpo primário, este estará normalmente presente num frasco de vidro separado. O segundo anticorpo é tipicamente conjugado com um rótulo e formulado de uma maneira análoga com as formulações do anticorpo descritas anteriormente. O kit também incluirá em geral um conjunto de instruções para utilização.
Numa modalidade, um kit de acordo com a presente invenção é um kit de tiras de teste (kit de imunoensaio de fluxo lateral) útil para detetar proteína de IL-31 canina numa amostra. Tal tira de teste incluirá tipicamente uma almofada da amostra sobre a qual a amostra teste é aplicada; uma almofada de conjugado ou reagente que contém um anticorpo específico de IL-31 canina, em que o anticorpo é conjugado com partículas coloridas (normalmente partículas de ouro coloidal); uma membrana de reação sobre a qual anticorpos anti-IL-31 são imobilizados numa linha através da membrana como uma zona de captura ou linha teste (uma zona controlo também pode estar presente, que contém anticorpos específicos dos anticorpos conjugados); e uma almofada absorvente adicional desenhada para puxar a amostra através da membrana de reação por ação capilar e recolhê-la. 0 kit de tiras de teste também incluirá em geral instruções para utilização. A invenção será agora descrita adicionalmente pelos exemplos não limitantes a seguir.
EXEMPLOS
Exemplo 1 Identificação de anticorpos monoclonais de ratinho que reconhecem Interleucina 31 (IL-31) canina IL-31 canina recombinante foi criada em células CHO utilizando o sistema CHROMOS ACE (Expressão Cromossómica Artificial) (Chromos Molecular Systems, Inc., Burnaby, Columbia Britânica) para gerar a proteína IL-31 canina segregada com a sequência da SEQ ID NO: 32. Esta proteína é codificada pela sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 33. Foi obtido meio condicionado de 400 ml de cultura de células (linha de células CHO) e dialisado contra 10 volumes de tampão QA (Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 20 mM) durante 4,5 horas . Meio dialisado foi filtrado em 0,2 μιη e carregado a 1 ml/min numa coluna SOURCE™ Q (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) pré-equilibrada com tampão QA. A proteína foi eluída utilizando um gradiente linear multi-etapa. A maioria de IL-31 permaneceu no fluxo através da fração (FT) , uma pequena quantidade de IL- 31 eluiu precocemente no gradiente. A identidade da proteína foi confirmada previamente por análise Western imunoblot e de massa-espetro (MS) de uma digestão tríptica. Proteína na fração FT foi concentrada 4-5 vezes e dialisada durante a noite contra solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 4 °C. A estabilidade da proteína foi verificada após diálise em PBS. Não foi observada precipitação e não foi observada proteólise após vários dias a 4 °C. Experiências de desglicosilação utilizando N-glicosidase F resultaram na condensação da proteína até uma única banda de -15 kDa em SDS-PAGE. A concentração da proteína foi determinada utilizando um ensaio bicinconínico (ensaio BCA) com Albumina do Soro BovinA (BSA) como um padrão (ThermoFisher Scientific, Inc., Rockford, IL) . A solução proteica foi dividida em aliquotas, congelada rapidamente (N2 líquido) e armazenada a -80 °C.
Anticorpos monoclonais de ratinho foram identificados utilizando imunizações padrão de ratinhos fêmea CF-1 com IL-31 canina recombinante produzida em células CHO. Os títulos de ratinhos imunizados foram determinados utilizando um ensaio de imunoabsorção ligado a enzima (ELISA). IL-31 canina (50 ng/poço) foi imobilizada a microplacas de polistireno e utilizada como um antígeno de captura. Soro de ratinhos imunizados foi diluído em solução salina tamponada com fosfato com 0,05% tween-20 (PBST). A presença de anticorpos anti-IL-31 canina de ratinho foi detetada com um anticorpo secundário anti-ratinho de cabra conjugado com peroxidase de raiz-forte (HRP) (Kirkegard e Perry Laboratories, Inc. (KPL, Inc.), Gaithersburg, MD) . Após adição de um substrato cromogénico (SureBlue Reserve TMB 1-Component Microwell Peroxidase Substrate, KPL, Inc., Gaithersburg, MD) e uma incubação de dez minutos à temperatura ambiente (RT) a reação foi parada com a adição de 100 pL de HC1 0,1 N. A absorvância de cada poço foi determinada a uma densidade ótica (OD) de 450 nm. A Figura 6 sumariza a resposta do anticorpo de ratinhos individuais imunizados com IL-31 canina. Um grupo de esplenócitos dadores dos ratinhos 3 e 4 foram utilizados para fusão. Após fusão e rastreio por ligação a anti IL-31 através de ELISA direta, foram escolhidos 100 poços para expansão e rastreio secundário de atividade anti IL-31. O rastreio secundário confirmou que 81 fusões retiveram a capacidade de produzir anticorpos anti IL-31. Stocks de células congeladas e sobrenadantes destes 81 candidatos foram preservados para avaliação posterior.
Para identificar candidatos com atividade inibidora, todos os 81 sobrenadantes foram avaliados em relação à sua capacidade de afetar a sinalização pSTAT mediada por IL-31 num ensaio à base de células. Este ensaio à base de células mede a sinalização pSTAT em células de monócito DH-82 caninas pré-tratadas durante 24 horas com interferão gama canino (R&D Systems, Minneapolis, MN) a 10 ng/mL e privado de soro durante 2 horas antes do tratamento com IL-31 para aumentar a expressão do recetor IL-31. Após este pré-tratamento, IL-31 canina recombinante é adicionada a 1 yg/mL durante 5 minutos e fosforilação STAT é avaliada utilizando a tecnologia Alfa Screen (Perkin Elmer, Waltham, MA). Uma vez que as concentrações e pureza do anticorpo são desconhecidas nos sobrenadantes do hibridoma, estes sobrenadantes foram medidos qualitativamente pela sua capacidade de inibir a fosforilação STAT após uma co-incubação de 1 hora com 1 yg/ml IL-31 utilizando 1:2 ou 1:20 diluições dos sobrenadantes. Esta experiência identificou 31 sobrenadantes que inibiram >50% da fosforilação STAT relativa aos poços não tratados, justificando, assim, purificação e caracterização adicional.
Após purificação e quantificação de cada anticorpo monoclonal (mAb), os valores IC50 de todos os 31 anticorpos foram avaliados no ensaio de células DH-82 . Com base nos valores IC50 resultantes e ELISAs competitivas para definir classes de anticorpo com base em blocos de epítopo, três anticorpos descritos no Quadro 1 foram retidos para caracterização adicional, 11 E12, 19D07 e 34D03.
Exemplo 2 Sequências de ADN que codificam Anticorpos 11E12, 19D07 e 34D03 Ácido ribonucleico (ARN) foi isolado de células hibridoma 11 E12, 19D07 e 34D03 utilizando o mini kit Rneasy (Qiagen, Inc., Germantown, MD) conforme descrito pelo fabricante. Foi colhido um milhão de células congeladas de cada hibridoma por centrifugação e ARN foi purificado a partir dos lisados celulares utilizando a coluna Rneasy spin de acordo com o método descrito no protocolo. 0 ARN foi eluído de cada coluna e utilizado imediatamente para quantificação e preparação de ADNc. 0 ARN foi analisado em relação ao rendimento e pureza medindo a sua absorvância a 260 nm e 280 nm utilizando um espetrofotómetro GeneQuant pro (GE Healthcare, Uppsala, Suécia). Após isolamento, o ARN remanescente foi armazenado a -80° C para utilização adicional.
Foram utilizados iniciadores oligonucleotídeos desenhados para amplificação dos domínios variáveis da imunoglobulina (Ig) de ratinho de acordo com as instruções do fabricante (EMD Chemicals, Inc., Gibbstown, NJ) . ADNc foi preparado a partir do ARN do hibridoma total por transcrição reverse (RT) utilizando o kit thermoscript RT (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) de acordo comas instruções do fabricante. 200-400 ng de ARN de cada hibridoma foi adicionado a um tubo de reação individual que contém um iniciador da região constante da Ig 3' . O iniciador Ig constante 3' está posicionado próximo da região variável da Ig transcreverá a primeira cadeia do ADNc representando a região variável do anticorpo de ratinho. Para cada ARN hibridoma, foi realizada uma reação RT individual utilizando uma 3' cadeia pesada constante e um iniciador da cadeia leve K constante 3'. ADNc de cada hibridoma foram utilizados como um molde numa reação em cadeia de polimerase (PCR) para amplificar o ADNc da cadeia leve K e pesada da IgG variável para o fim de determinação da sequência. Foram realizadas múltiplas reações para cada PCR utilizando um iniciador degenerado 5' ou grupos de iniciadores desenhados para emparelhar com as regiões codificantes da sequência sinal do domínio variável da Ig de ratinho. Reações de PCR separadas foram realizadas com um iniciador degenerado ou grupos de iniciadores para amplificação de regiões de cadeia leve variável e pesada variável murinas (Figura 7). PCR foi realizada com 1 μΐ da reação com ADNc utilizando o kit da ADN polimerase de alta fidelidade Expandido (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN) de acordo com o protocolo do fabricante. Parâmetros de termociclação para as PCR foram como se segue; 94 °C durante 2 min., 35 ciclos (94 °C 15 seg., 55 °C 30 seg., 72 °C 1 min.), 72 °C 7 min. Fragmentos amplificados da PCR foram separados por eletroforese em gel num gel de agarose a 1 % e purificados utilizando kit de extração em gel Qiagen (Qiagen, Inc., Germantown, MD). Iniciadores forward para a região variável da cadeia leve e pesada incorporam os locais EcoRI ou Sail (New England Biolabs (NEB) , Inc. , Ipswich, MA) e reversos da região variável da cadeia leve e pesada, HindIII (NEB Inc., Ipswich, MA) para facilitar a clonagem num plasmídeo pUC19. Fragmentos purificados de PCR e plasmídeo pUC19 foram digeridos com as endonucleases de restrição anteriores a 37 °C durante 1-2 horas. Após digestão, os fragmentos PCR foram purificados utilizando um kit de limpeza de PCR Qiaquick (Qiagen, Inc., Germantown, MD). O plasmídeo digerido foi separado por eletroforese em gel num gel de agarose a 1 % e purificado utilizando um kit de extração em gel Qiagen. Fragmentos purificados de PCR que representam ADN da cadeia leve K e pesada da IgG variável foram ligados num plasmídeo pUC19 utilizando T4 ADN ligase e tampão de ligação (NEB, Inc., Ipswich, MA) a 4 °C durante a noite. 3 μΐ de cada reação de ligação foi utilizado para transformar células TOPIO de E. coli (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA).
Os plasmídeos foram isolados a partir de clones positivos que representam as regiões variáveis de cada hibridoma utilizando um kit mini prep Qiagen (Qiagen 27106) de acordo com o protocolo do fabricante. Iniciadores forward e reverso M13 foram utilizados para amplificar sequência de ADN para cada inserção clonada utilizando a reação de sequenciação BigDye (Applied Biosystems by Life Technologies Corp., Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. As reações de sequenciação foram purificadas utilizando um kit de purificação com 96 poços (Zymo Research, Irvine, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. As amostras foram carregadas num sequenciador capilar ABI-3730 e os resíduos da sequência resultantes foram analisados utilizando Sequencher (GeneCodes v. 4.2) para a presença de fases de leitura aberta completas. As sequências variáveis da anti IL-31 canina murina determinadas para cada anticorpo são como se segue, cadeia leve variável 11 E12 (SEQ ID NO: 19 MU-11 E12-VL, para a qual a sequência nucleotídica correspondente é SEQ ID NO: 34) , cadeia pesada variável 11 E12 (SEQ ID NO: 26 MU-11 E12-VH, para a qual a sequência nucleotídica correspondente é SEQ ID NO: 35), cadeia leve variável 19D07 (SEQ ID NO:22 MU-19D07-VL, para a qual a sequência nucleotídica correspondente é SEQ ID NO: 36) , cadeia pesada variável 19D07 (SEQ ID NO: 28 MU-19D07-VH, para a qual a sequência nucleotídica correspondente é SEQ ID NO: 37) , cadeia leve variável 34D03 (SEQ ID NO:24 MU-34D03- VL, para a qual a sequência nucleotídica correspondente é SEQ ID NO: 38) , e cadeia pesada variável 34D03 (SEQ ID NO:30 MU-34D03-VH, para a qual a sequência nucleotídica correspondente é SEQ ID NO: 39) .
Para confirmar a validade da sequência de ADNc derivada de cada uma das cadeias leve e pesada variável dos anticorpos, foi realizada análise da sequência N-terminal em proteína mAb purificada utilizando degradação de Edman num sequenciador de proteína em fase gasosa modelo Applied Biosystems 494.0 Quadro 2 a seguir descreve a confirmação das sequências da cadeia leve variável para os anticorpos 11 E12 e 34D03 e a sequência da cadeia pesada variável de 34D03. 0 aminoácido N-terminal da cadeia pesada variável do anticorpo 11 E12, derivado pela tradução da sequência de ADNc, foi determinado como sendo glutamina. Glutamina, como resíduo amino terminal de uma proteína, pode suportar espontaneamente ciclização para ácido piroglutâmico prevenindo a determinação da sequência por degradação de Edman (Chelius et al., Anal Chem. 2006 78 (7) :2370-6) .
* No Quadro 2, "DIVLT" corresponde aos resíduos 1-5 da SEQ ID NO: 19, "DIVMS" corresponde aos resíduos 1-5 da SEQ ID NO: 22, "DILLT" corresponde aos resíduos 1-5 da SEQ ID NO: 24, "QVQLQ" corresponde aos resíduos 1-5 da SEQ ID NO: 26, "EVKLV" corresponde aos resíduos 1-5 da SEQ ID NO: 28, e "EVQLV" corresponde aos resíduos 1-5 da SEQ ID NO: 30.
Exemplo 3 Construção de Anticorpos quiméricos 11E12, 19D07 e 34D03
Conforme descrito anteriormente, anticorpos são compostos de um emparelhamento homodímero de duas proteínas heterodiméricas. Cada cadeia proteica (uma pesada e uma leve) do heterodímero consiste num domínio variável e num domínio constante. Cada domínio variável contém três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) que contribuem para a ligação ao antígeno. CDRs são separadas no domínio variável por regiões estrutura que proporcionam um andaime para apresentação espacial apropriada los locais de ligação no anticorpo. Em conjunto, as regiões CDR e estrutura contribuem para a capacidade dos anticorpos de se ligarem ao seu antigeno cognato (Figura 2).
Conforme descrito adicionalmente anteriormente, um anticorpo quimérico consiste na sequência variável (ambas CDR e estrutura) de anticorpo de ratinho (conforme determinado pela análise de sequência anterior) enxertado nas respetivas regiões constantes das cadeias pesada e leve de uma molécula de IgG canina (Figura 3) . Como o domínio variável é responsável pela ligação ao antigeno, espera-se que o enxerto do domínio variável completamente de ratinho numa região constante canina tenho pouco ou nenhum impacto sobre a capacidade do anticorpo para se ligar ao imunogene IL-31.
Para confirmar simultaneamente que a sequência correta das regiões variáveis da cadeia leve e pesada foram identificadas e para produzir material recombinante, homogéneo, foram gerados vetores de expressão para produzir os anticorpos quiméricos em sistemas de expressão de mamífero. Foram desenhados iniciadores forward e reversos para amplificar a região variável da cadeia leve e pesada de ratinho da sequência de anticorpo derivada dos hibridomas 11 E12, 19D07 e 34D03. Um único local de endonuclease de restrição, sequência de consenso Kozak e sequência líder de secreção foram incorporados em cada iniciador forward para facilitar a expressão e secreção do anticorpo recombinante de uma linha de células de mamífero. Cada iniciador reverso foi desenhado para amplificar cada cadeia leve e pesada variável respetiva e incluiu um único local de restrição para facilitar a clonagem. Foi realizada PCR para amplificar cada cadeia leve e pesada utilizando ADN de anticorpo de cadeia variável de hibridoma clonada como um molde para cada reação. Cada produto de PCR foi clonado num plasmídeo de expressão de mamífero que contém as regiões constantes ou da cadeia pesada da IgG canina (referida aqui como HC-64 ou HC-65) ou da cadeia leve (referida aqui como K) com base nas sequências dos números de acessão ao GenBank AF354264 ou AF354265 e XP_532962, respetivamente. As sequências de aminoácidos e nucleotidica de HC-64 são representadas pelas SEQ ID NO: 40 e 41, respetivamente. As sequências de aminoácidos e nucleotidica de HC-65 são representadas pelas SEQ ID NO: 42 e 43, respetivamente. As sequências de aminoácidos e nucleotidica de K são representadas pelas SEQ ID NO: 44 e 45, respetivamente. Os plasmideos que codificam cada cadeia pesada e leve, sob o controlo do promotor CMV, foram co-transfetados em células HEK 293 utilizando métodos convencionais de lipofectamina. Após seis dias de expressão, mAbs quiméricos foram purificados a partir de 30ml de sobrenadantes de células HEK293FS temporariamente transfetadas utilizando resina A de proteína MabSelect SuRe (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) de acordo com métodos convencionais para purificação de proteínas. As frações eluídas foram agrupadas, concentradas para ~500ul utilizando um dispositivo centrífugo 10,000 nominal MW cutoff Nanosep da Omega (Pall Corp., Port Washington, Nova Iorque), dialisadas durante a noite a 4o C em lx PBS, pH 7,2 e armazenadas a 4o C. para utilização adicional.
Expressão de IgG canina quimérica foi avaliada utilizando eletroforese em poliacrilamida SDS (SDS PAGE) em condições nativas e desnaturantes. Anticorpos monoclonais (mAbs) de cada transfeção foram separados num gel a 4-12% Bis Tris utilizando tampão de corrida SDS MES de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Após eletroforese, as proteínas foram visualizadas com Corante de Azul de Coomassie Simples (Invitrogen Corp ., Carlsbad, CA) para assegurar que o emparelhamento apropriado ocorreu e proporcionar uma avaliação grosseira da homogeneidade proteica. Para avaliar se os mAbs recombinantes retiveram a capacidade de se ligar a IL-31 canina, mAbs foram avaliados em relação à sua capacidade de se ligarem a IL-31 canina através de Western Blots. Padrões de proteína e IL-31 canina recombinante (800 ng) foram resolvidos em SDS PAGE transferido para uma membrana de nitrocelulose utilizando o dispositivo iBlot da Invitrogen (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) . Após transferência, as membranas foram lavadas com água desionizada destilada e bloqueadas com leite seco sem gordura a 5 % (NFDM) em solução salina tamponada com fosfato que contém 0,05% tween-20 (PBST) durante 1 hora à temperatura ambiente (RT) . Após bloqueio, as membranas foram lavadas em PBST e incubadas ou com o sobrenadante diluído da expressão temporária ou com anticorpos quiméricos purificados. A ligação dos anticorpos quiméricos foi avaliada utilizando conjugado de anticorpo IgG anti-cão de cabra-peroxidase (Betil Laboratories Inc., Montgomery, TX ou Rockland, Immunochemicals, Inc., Gilbertsville, PA) a uma diluição 1:5000 em PBST durante 1 hora à RT. Confirmação da ligação a IL-31 foi determinada pela presença de uma banda colorimétrica (massa molecular aparente de 15 kDa) correspondente à forma glicosilada de IL-31 canina após adição do substrato TMB ao blot (KPL, Inc., Gaithersburg, MD) .
Os mAbs quiméricos que mostram expressão de células HEK 293 e ligação ao imunogene da IL-31 canina recombinante por Western blot foram ainda analisados em relação à afinidade e funcionalidade. Para caracterizar a afinidade com a qual mAbs candidatos se ligam a IL-31, ressonância de plasmon de superfície (SPR) foi avaliada utilizando um sistema Biacore (Biocore Life Sciences (GE Healthcare), Uppsala, Suécia). Para evitar diferenças de afinidade associadas com preparação diferencial da superfície que pode ocorrer quando se imobilizam os anticorpos às superfícies; foi empregue uma estratégia onde a IL-31 foi conjugada diretamente com a superfície. A imobilização foi obtida por acoplamento de amina com 5 yg/mL IL-31 utilizando química com N-hidroxisuccinimida (NHS)/l-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC). Os fragmentos foram extintos com etanolamina e foi avaliada a afinidade com a qual todos os mAbs candidatos se ligaram à IL-31 imobilizada. Todas as curvas foram ajustadas para um modelo 1:1. Afinidades <E-11 estão abaixo do limite inferior de quantificação de deteção para o instrumento.
Todos os mAbs candidatos também foram avaliados em relação à sua capacidade de inibir a sinalização de IL-31 num ensaio à base de células em dois formatos independentes. No formato de co-incubação, complexos mAb:IL-31 foram pré-incubados durante uma hora para assegurar a formação de complexo antes da adição das células. Para aumentar o potencial para diferenciação entre mAbs, foi realizado um segundo conjunto de a experiências que careceram de co-incubação e os mAbs foram adicionados diretamente às células durante 5 minutos seguido de adição de IL-31. Em ambos casos, a estimulação de IL-31 ocorreu durante 5 minutos. Conforme apresentado no Quadro 3 a seguir, a conversão dos monoclonais de ratinho 11 E12, 19D07 e 34D03 para uma forma quimérica canina, teve pouco impacto na sua capacidade de se ligar a IL-31 ou inibir a sinalização mediada pelas células. Os resultados também verificam as sequências da cadeia leve variável e da cadeia pesada variável corretas derivadas de cada hibridoma de ratinho.
11E12 Quimérico-para a cadeia pesada, MU-11E12-VH foi emparelhado com HC-64 e para a cadeia leve, MU-11E12-VL foi emparelhado com K. *Quimérico 19D07-para a cadeia pesada, MU-19D07-VH foi emparelhado com HC-64 e para a cadeia leve, MU-19D07-VL foi emparelhado com K. π Quimérico 34D03-para a cadeia pesada, MU-34D03-VH foi emparelhado com HC-64 e para a cadeia leve, MU-34D03-VL foi emparelhado com K.
Exemplo 4 Avaliação in vivo de mAbs quiméricos
Para confirmar que a inibição de sinalização das células mediada por IL-31, observada no ensaio DH-82, está correlacionada com inibição de prurido mediado por IL-31 no cão, o anticorpo monoclonal quimérico 11 E12 descrito anteriormente no Quadro 3 (11 E12-64 Quimérico) foi avaliado no modelo de prurido canino de IL-31. Neste modelo, IL-31 canina, quando dada por via intravenosa (IV) a uma dose de 1 a 1,5 yg/kg, produz uma resposta prurítica consistente inicial rápida que pode ser quantificada ao longo de um período de duas horas de observação. Para avaliar respostas pruríticas, os cães foram colocados em cubículos únicos e foram realizadas medições da atividade prurítica utilizando vídeovigilância. Após um período de aclimatação de > 1 hora, foram determinadas as classificações de base pruríticas para cada cão utilizando vídeovigilância em tempo real utilizando um sistema de classificação categórico. Especificamente, em intervalos consecutivos de 1 minuto, foram tomadas decisões "sim/não" em relação a se era exibido comportamento prurítico por cada cão. A exibição de comportamento prurítico tais ações como lamber/roer patas, flanco e/ou regiões anais, coçar dos flancos, pescoço e/ou pavimento, sacudir de cabeça e arrastar o traseiro pelo pavimento da jaula foi suficiente para despoletar uma resposta "sim" durante o intervalo de tempo designado. No final deste período, os números de determinações sim foram adicionados para calcular o índice de Classificações Pruríticas cumulativo (PSI). Classificações pruríticas foram determinadas duas vezes para cada animal, sendo a primeira medida uma classificação de base aos 30 minutos imediatamente antes do início do período de tratamento teste-artigo. Após conclusão de cada observação programada, os cães foram devolvidos às suas localizações de alojamento normais.
Para avaliar se a administração subcutânea (SC) de 11 E12-64 quimérico pode inibir o prurido mediado por IL-31, foi realizado um estudo piloto (76A03) que incluiu um grupo tratado e um placebo (N = 4/grupo). Neste estudo, as respostas de referências foram realizadas com todos os 8 cães e os cães foram randomizados em grupos e alojados com base no seu PSI. De forma importante, cada grupo consistiu em dois altos respondedores (PSI >55) e dois respondedores moderados (PSI = 30 a 55) . Estes cães foram depois administrados com 11 E12-64 quimérico no dia 7 e foram realizados desafios com IL-31 nos dias 8, 14 e 22. Os resultados deste estudo são apresentados na Figura 8 . Estes resultados demonstram que a administração de 11 E12-64 quimérico resultou numa redução superior a 75% no PSI médio para os dias 8 e 14, em relação ao dia 1, para os animais tratados com 11 E12-64 quimérico. Isto contrasta com um aumento de 37 - 51% nas classificações PSI para os animais não tratados. O PSI regressou à linha de base duas semanas após o tratamento com mAb, o que sugere uma duração da eficácia entre uma e duas semanas para a dose administrada de 0,3 mg/kg.
Um desafio particular ao avaliar PSI é a variação de dia para dia associada com o comportamento prurítico dos cães. Para ajudar a controlar esta variação, o PSI da linha de base dos 30 minutos foi determinado para cada cão, em cada dia anterior ao desafio com IL-31. A Figura 9 mostra as classificações pruríticas individuais de cães admitidos neste estudo (76A60). Os dados na Figura 9 ilustram que o PSI da linha base do dia 8 e dia 14 foi aproximadamente 25% do pós desafio com IL-31 no grupo tratado com 11 E12-64 quimérico. Esta observação é consistente com uma anulação completa do prurido relacionado com IL-31, uma vez que o período de tempo de observação da linha de (0,5 h) é 25% do período de tempo de observação do pós IL-31 (2h) . Em conjunto, estes dados in vivo proporcionam evidência muito forte de que; 1) o monoclonal 11 E12 quimérico pode neutralizar a capacidade de IL-31 induzir prurido em cães, 2) a inibição de sinalização mediada por IL-31 no ensaio à base de células correlaciona-se com a eficácia in vivo e 3) os parâmetros necessários para utilizar este modelo de IL-31 para avaliação de mAb estão estabelecidos para a avaliação de outros anticorpos candidatos.
Exemplo 5 Estratégia de caninização A geração de anticorpos anti-fármacos (ADAs) pode estar associada a perda de eficácia para qualquer proteína bioterapêutica incluindo anticorpos monoclonais. A avaliação exaustiva da literatura mostrou que a especiação de anticorpos monoclonais pode reduzir a propensão para mAbs serem imunogénicos, apesar de poderem ser encontrados exemplos de mAbs humanos completamente imunogénicos e mAbs quiméricos não imunogénicos. Para ajudar a mitigar os riscos associados com formação de ADA para os anticorpos monoclonais anti IL-31 de ratinho proporcionados aqui, foi empregue uma estratégia de caninização. Esta estratégia de caninização é baseada na identificação da sequência de anticorpo da linha germinativa canina mais apropriada apara enxerto CDR (Figura 4) . Após análise extensiva de todas as sequências da linha germinativa canina disponíveis para ambas a cadeia leve e pesada, os candidatos da linha germinativa foram selecionados com base na sua homologia aos mAbs de ratinho e as CDRs dos mAbs de ratinho progenitores foram utilizadas ara substituir CDRs caninas nativas. 0 objetivo foi reter elevada afinidade e atividade baseada nas células utilizando estruturas completamente caninas para minimizar o potencial de imunogenicidade in vivo. mAbs caninizados foram expressos e caracterizados em relação à sua capacidade de se ligarem a IL-31 através de análise Western blot. Estes resultados estão descritos abaixo no Exemplo 8. Apenas os mAbs que retiveram a capacidade de se ligarem a IL-31 após caninização foram avançados para caracterização posterior. Estes mAbs que perderam a capacidade de se ligar a IL-31 foram sistematicamente dissecados para identificar; 1) a cadeia responsável pela perda de função, 2) a estrutura responsável pela perda de função e 3) o(s) aminoácidos(s) responsável(is) pela perda de função.
Exemplo 6 Caninização dos anticorpos 11E12, 19D07 e 34D03
Foram feitas construções de nucleotídeos sintéticas que representam as cadeias leve e pesada variável caninizadas dos mAbs 11 E12, 19D07 e 34D03. Após subclonagem de cada cadeia variável em plasmídeos que contêm a respetiva região constante K ou pesada canina, os plasmídeos foram co-transfetados para a expressão do anticorpo em células HEK 293. Em suma, ambos os mAbs 19D07 e 34D03 retiveram a ligação a IL-31 no momento da caninização. As sequências variáveis da anti-IL-31 canina caninizada determinadas para cada anticorpo são como se seguem, cadeia leve variável 19D07 (SEQ ID NO: 23 CAN-19D07- VL-998-1, para a qual a sequência nucleotídica correspondente é SEQ ID NO: 46), cadeia pesada variável 19D07 (SEQ ID NO: 29 CAN-19D07-VH-400-1, para a qual a sequência nucleotídica correspondente é SEQ ID NO: 47) , cadeia leve variável 34D03 (SEQ ID NO: 25 CAN-34D0 3-VL-9 9 8 -1, para a qual a sequência nucleotídica correspondente é SEQ ID NO: 48) e cadeia pesada variável 34D03 (SEQ ID NO: 31 CAN-34D03-VH-568-1, para a qual a sequência nucleotídica correspondente é SEQ ID No: 49).
Em contraste, as sequências da linha germinativa utilizadas para os esforços de caninização de 11 E12 resultaram em certos mAbs não funcionais. Com referência à Figura 10, versões quiméricas, heteroquiméricas e caninizadas de mAb 11 E12 foram expressas e caracterizadas em relação à sua capacidade de se ligarem a IL-31 canina através de análise Western blot. Estes resultados demonstram que o anticorpo 11 E12 caninizado não ligou a IL-31 canina (Blot #2) . Além disso, em relação às heteroquimeras, a cadeia pesada quimérica emparelhada com a leve caninizada perdeu a ligação à IL-31 (Blot #3), ao passo que a cadeia pesada caninizada emparelhada com a leve quimérica reteve a atividade de ligação a IL-31 (Blot #4). Com base nos resultados obtidos das heteroquimeras, foi deduzido que a cadeia leve caninizada foi responsável pela perda de atividade.
Num esforço de restaurar a ligação das versões caninizadas de 11 E12 a IL-31 canina, a cadeia leve caninizada foi modificada trocando as sequências estrutura. A Figura 11 proporciona uma visão geral do trabalho de substituição da estrutura da cadeia leve de 11 E12. Este trabalho identificou um anticorpo que substitui a estrutura canina II (FWII) com estrutura de ratinho II e restaura a ligação a IL-31 canina (cadeia leve variável 11 E12 (SEQ ID NO: 20 CAN-11 El2-VL-cUn-FW2, para a qual a sequência nucleotidica correspondente é SEQ ID NO: 50) , cadeia pesada variável 11 E12 (SEQ ID NO: 27 CAN-11 E12-VH-415-1, para a qual a sequência nucleotidica correspondente é SEQ ID NO: 51)).
Aperfeiçoamento adicional destas mutações reversas identificaram que um anticorpo com uma única mutação reversa arginina para leucina (R50L) na estrutura II poderia restaurar a ligação a IL-31 através de análise Western blot (cadeia leve variável 11 E12 (SEQ ID NO: 21 CAN-11 El2-VL-cUn-13, para a qual a sequência nucleotidica correspondente é SEQ ID NO: 52), cadeia pesada variável 11 E12 (SEQ ID NO: 27 CAN-11E12-VH-415-1)) (Figura 12). Assim que foram identificadas versões 'caninizadas' de cada candidato potencial os mAbs foram purificados e dialisados em PBS para avaliação adicional. O Quadro 4 sumariza os resultados de ambas medições de afinidade e dados de inibição baseada em células. Estes dados demonstram que os derivados caninizados de ambos 11 E12 e 34D3 retêm atividade inibidora excelente no ensaio à base de células e afinidade para IL-31, conforme medido por Biacore. De notar ainda a observação de que, enquanto que a molécula 19D7 caninizada original retém potência excelente, conforme medido por Biacore, a capacidade de inibir a sinalização IL-31 à base de células parece estar comprometida em relação ao seu progenitor de ratinho. Incorreu-se em pouca ou nenhuma perda de afinidade ao converter mAbs do seu isótipo de ratinho para o derivado canino.
Cadeias pesadas: Todas as formas caninizadas e heteroquiméricas de 11E12 incluíram a sequência VH de CAN-11E12-VH-415-1 (SEQ ID NO: 27) e a região constante designada HC-64 (SEQ ID NO: 40) ; 19D07 Caninizado incluiu a sequência VH de CAN-19D07-VH-400-1 (SEQ ID NO: 29) e HC-64;
34D03 Caninizado incluiu a sequência VH de CAN-34D03- VH-568-1 (SEQ ID NO: 31) e HC-64.
Cadeias leves: 11E12 Caninizado incluiu a sequência VL de CAN-1lE12-VL-cUn-l (SEQ ID NO: 53) e a região constante designada K (SEQ ID NO: 44); 11E12 Heteroquimérico incluiu a sequência VL de MU-11E12-VL (SEQ ID NO: 19) e K; 11E12 Caninizado FW2 incluiu a sequência VL de CAN- HE12-VL-cUn-FW2 (SEQ ID NO: 20) e K; 11E12 13 Caninizado incluiu a sequência VL de CAN-llE12-VL-cUn-13 (SEQ ID NO: 21) e K; 19D07 Caninizado incluiu a sequência VL de CAN-19D07-VL-998-1 (SEQ ID NO: 23) e K; 34D03 Caninizado incluiu a sequência VL de CAN-34D03-VL-998-1 (SEQ ID NO: 25) e K._
Exemplo 7 Caracterização de ligação de IL-31 canina aos anticorpos 11E12 e 34D03
Para determinar os resíduos de aminoácidos envolvidos com a ligação de IL-31 canina aos anticorpos 11E12 e 34D03, foi utilizada uma estratégia mutacional que envolveu 1) truncação da proteína IL-31 de ambos os terminais N e C e 2) substituição de aminoácidos individuais com alanina (ala scan) para determinar o impacto da ligação a mAb. Foram desenhados iniciadores de PCR para amplificar o gene da IL-31 canina que foi otimizado para codão para expressão num hospedeiro E. coli. A sequência desta construção de IL-31 canina de comprimento inteiro otimizada para codão para expressão de E. coli é representada pela SEQ ID NO: 55, para a qual a sequência nucleotídica correspondente é SEQ ID NO: 56. Foram desenhados iniciadores para amplificar o gene de comprimento inteiro e para criar 20 truncações de aminoácidos da proteína movendo-se para o interior a partir dos terminais N e C. Para o fim destas truncações N-terminal, a posição 1 correspondeu ao resíduo de glicina imediatamente após a etiqueta 6-His N-terminal na construção otimizada para codão. Produtos de amplificação de PCR foram clonados em pETl 01 D (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. O plasmídeo pETlOl D permite a fusão da proteína recombinante com uma etiqueta epítopo 6-His N-terminal para confirmação da expressão. Foram utilizados plasmídeos confirmados pela sequência para transformar células BL21 Star TOPIO de E. coli (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) e a expressão da proteína recombinante foi induzida utilizando 1 mM Isopropil β-D-l-tiogalactopiranosida (IPTG) em condições de cultura padrão. Após as induções, as células foram tornadas em bolas e lisadas utilizando Reagentes de Extração de Proteína Bacteriana (abreviado B-PER, ThermoFisher Scientific Inc., Rockford, IL) . Os lisados em bruto foram sujeitos a SDS-PAGE e foi realizada análise Western blot, conforme descrito previamente. Todas as análises Western blot para análise mutacional foram realizadas utilizando a versões de ratinho de 11 E12 e 34D03 devido à disponibilidade de anticorpos purificados e reagentes necessários. Cada anticorpo foi testado em relação à sua capacidade de ligar o blot do lisado da proteína em bruto que representa IL-31 de comprimento inteiro e truncada. Os blots controlo também foram sondados com o mAb anti-His para confirmar a expressão de cada proteína. Todas as proteínas com uma truncação N-terminal (-20N, -40N, e -60N) mostraram expressão robusta em E. coli e foram capazes de ligar a 11 E12 e 34D03 (Figura 13) . As sequências de aminoácidos e nucleotídicas correspondente à construção -20N são as SEQ ID NO: 57 e 58, respetivamente. As sequências de aminoácidos e nucleotídicas correspondente à construção -40N são as SEQ ID NO: 59 e 60, respetivamente. As sequências de aminoácidos e nucleotídicas correspondente à construção -60N são as SEQ ID NO: 61 e 62, respetivamente. Contudo, IL-31 de comprimento inteiro e proteínas com truncações C-terminal (-20C, -40C, e -60C) não expressaram nestas condições.
Foi observado que a proteína IL-31 de comprimento inteiro foi expressa muito fracamente. Contudo, a construção com os primeiros 20 aminoácidos removida (-20N) do N-terminal mostrou expressão robusta. Anticorpos 11 E12 e 34D03 todos ligaram-se à proteína -20N. Logo, foi realizado trabalho adicional utilizando esta construção -20 N. Foram feita construções que representam truncações C-terminal nas posições 20-122 (MW 15.3 com esta etiqueta) , 20-100 (MW 12.9 com esta etiqueta) e 20-80 (MW 10.4 com esta etiqueta), para avaliar a ligação de mAb a estas áreas na proteína IL-31. As sequências de aminoácidos e nucleotídicas correspondente à construção 20-122 são as SEQ ID NO: 63 e 64, respetivamente. As sequências de aminoácidos e nucleotídicas correspondente à construção 20-100 são as SEQ ID NO: 65 e 66, respetivamente. As sequências de aminoácidos e nucleotídicas correspondente à construção 20-80 são as SEQ ID NO: 67 e 68, respetivamente. A Figura 14 mostra Western blots de lisados da proteína em bruto destas proteínas truncadas que foram sondados com mAbs 11E12 (Blot B) e 34D03 (Blot C) . Conforme mostrado nesta Figura, mAbs 11E12 e 34D03 ligaram-se às proteínas truncadas de IL-31 20-122 e 20-100, mas não se ligaram a 20-80. Estes resultados indicaram que os aminoácidos entre as posições 80 e 100 da construção de IL-31 canina de comprimento inteiro da SEQ ID NO: 55 (utilizando "SSHMA" como o N-terminal) estiveram envolvidos na ligação destes anticorpos. Esta região corresponde aos aminoácidos N.°s entre resíduos de aminoácidos 102 e 122 da sequência da proteína IL-31 canina de comprimento inteiro da SEQ ID NO: 32 . Um blot controlo que utiliza o mAb anti-His (Blot A) mostrou que todas as proteínas truncadas foram expressas. Além disso, a proteína pETlOlD-lacZ foi utilizado como um controlo para confirmar a falta de ligação não específica de mAbs às proteínas hospedeiras.
Para identificar ainda os aminoácidos na IL-31 canina envolvidos na ligação aos mAbs 11 E12 e 34D03, foi realizada mutagénese de varredura de alanina de acordo com métodos conhecidos. Foram feitas construções individuais (no plasmideo -20N) substituindo a alanina para cada posição na IL-31 canina dos aminoácidos 76 aos 122. Após confirmação da sequência, foi realizada a expressão da proteína e lisados da proteína em bruto foram sujeitos a análise Western blot. A Figura 15 mostra um sumário dos resultados indicando as posições na IL-31 canina que, quando mutadas para alanina, impactam a ligação por mAbs 11 E12 e 34D03. Conforme mostrado nesta Figura, todas as posições 77, 78, 81 e 85 da construção de IL-31 de comprimento inteiro impactam a ligação dos anticorpos 11 E12 ou 34D03 . Estas correspondem aos resíduos de aminoácidos 99, 100, 103 e 107, respetivamente, da sequência da proteína IL-31 canina de comprimento inteiro da SEQ ID NO: 32.
Para examinar o impacto de múltiplas mutações na região de IL-31 importante para ligação aos anticorpos 11 E12 e 34D03, foram construídos plasmídeos de expressão com substituições duplas (D82A, I85A) e triplas (I81A, D82A, I85A) de alanina. Lisados de E. coli que expressam IL-31 canina com estas mutações duplas e triplas além do controlo -20N foram sujeitos a análise blot com os anticorpos 11 E12 e 34D03 (Figura 16). É aparente que estes três aminoácidos na IL-31 canina estão envolvidos no reconhecimento de 11 E12 e 34D03, uma vez que é observada anulação completa de ligação quando estes locais são alterados para alanina. Estes três aminoácidos correspondem aos resíduos de aminoácidos 103, 104 e 107 da sequência da proteína IL-31 canina de comprimento inteiro da SEQ ID NO: 32.
Em suma, a análise de truncação de IL-31 canina revelou resíduos de aminoácidos (anotados na Figura 15 entre as posições 80 e 122) que estão envolvidos na ligação aos anticorpos 11 E12 e 34D03. Além disso, análise mutacional fina utilizando varredura de alanina revelou que todos os ASP77, LYS78, ILE81, ASP82 e ILE85 da construção de IL-31 de comprimento inteiro impactam a ligação de 11 E12 ou 34D03, o que indica que esta região define muito provavelmente o epítopo responsável pelo reconhecimento destes anticorpos. De forma interessante, esta região da proteína IL-31 humana mostrou estar envolvida na ligação à subunidade GPL do seu co-recetor (Le Saux S et ai. Biol Chem. 2010 Jan 29; 285(5) :3470-7. Epub 2009 Nov 17). Estas observações, juntamente com a capacidade dos mAbs 11 E12 e 34D03 de neutralizarem a atividade pSTAT mediada por IL-31 em monócitos, suportam a hipótese de que estes mAbs ligam-se a resíduos na IL-31 canina que são essenciais para a ligação desta citocina ao seu recetor, inibindo, assim, a sua capacidade para induzir sinalização.
Exemplo 8 Produção de anticorpos 34D03 caninizados a partir de plasmídeos glutamina sintetase (GS)
Os genes que codificam o mAb 34D03 caninizado (cadeias pesada e leve, Quadro 4 anterior) foram clonados em plasmídeos GS pEE 6.4 e pEE 12.4, respetivamente (Lonza, Basileia, Suíça). Os plasmídeos resultantes foram digeridos de acordo com o protocolo do fabricante e ligados juntos para formar um único plasmídeo de expressão de mamífero. Cada plasmídeo foi utilizado para transfetar células HEK 293 e a expressão foi realizada em meios de cultura de 20L. a proteína foi isolada do meio HEK condicionado utilizando cromatografia por afinidade de proteína A de acordo com métodos de purificação de proteína convencionais. O meio foi carregado para a resina cromatográfica e eluído por alteração do pH. A proteína eluída foi ajustada para pH, dialisada e filtrada estéril antes de utilização. O anticorpo resultante foi mais de 99 percentagem monomérico por cromatografia por exclusão de tamanho analítica sem observação de agregados de elevada massa molecular, este anticorpo foi subsequentemente utilizado para avaliação no modelo de prurido canino para avaliar a eficácia in vivo. Exemplo 9 Avaliação do anticorpo 34D03 caninizado no modelo de prurido canino A atividade anti-prurítica de 34D03 caninizado (CAN 34D03-65 representado por SEQ ID NO 31 (VH) emparelhada com SEQ ID NO 25 (VL) na SEQ ID NO 42 (HC-65) e SEQ ID NO 44 (LC-K)) foi avaliada utilizando um modelo canino de prurido induzido por IL-31. Com este modelo, uma dose de desafio intravenosa de 1.5 yg/kg de IL-31 canina recombinante conhecida por induzir um período temporário de comportamento prurítico em cães da raça Beagle (desafio com IL-31, duração do prurido <24 horas) foi entregue repetidamente a animais antes de e até 63 dias após uma única dose SC de 1,0 mg/kg de CAN 34D03-65. A cada período do desafio com IL-31, foi utilizada videovigilância em tempo real para obter uma medida do comportamento prurítico durante 0,5 horas antes da entrega da citocina (período de referência pré-IL-31) seguido de uma medição semelhante de 2 horas que se iniciou 20 minutos após a injeção de citocina (2h após o período de desafio com IL-31) . Classificações pruríticas foram geradas a cada período de tempo em avaliação fazendo determinações "sim/não" em relação a se foi exibido comportamento prurítico ao longo de intervalos de tempo consecutivos de 1 minuto (classificação prurítica máxima = 30 para cada período de referência; 120 para o pós período de desafio com IL-31) . A Figura 17 sumariza as classificações pruríticas obtidas antes e depois do tratamento com CAN 34 D03-65, que foi dado no dia 0 do estudo. Sete dias após o tratamento com mAb, a classificação prurítica média pós desafio com IL-31 dos cães foi 68 ± 13 (E.P., n=4) . Por comparação, nos dias 7, 14, 21 do estudo, as classificações pruríticas médias após o desafio com IL-31 foram reduzidas para 5 ± 2, 8 ± 4, e 9 ± 5, respetivamente. Estas alterações nas classificações pruríticas entre o dia -7 e os dias 7-21 representam uma redução >85% na reatividade prurítica geral a IL-31. O grau de inibição de prurido induzido por IL-31 pode, na realidade, ter estado mais próximo de 100% ao longo deste intervalo de tempo se se considerar que entre os dias 0 e 21, as classificações de referência pré-IL-31 à 0,5h foram de média
1.6 ± 0,6—um nível que extrapolaria para uma classificação prurítica de 6-7 durante um período de 2h. A reatividade prurítica dos cães tratados a IL-31 exógena recuperaram gradualmente com o tempo. Ao dia 63 pós tratamento com CAN D03-65, a classificação prurítica média 2h após o desafio com IL-31 aumentou para 57 ± 8 ou aproximadamente 84% das respostas pré-mAb ao desafio com IL-31 observadas no dia -7. Logo, num modelo de prurido induzido por IL-31, uma única injeção bólus SC de CAN 34D03-65 proporcionou semanas de proteção anti-prurítica aos cães tratados.
Exemplo 10 Caracterização de IL-31 felina A sequência da IL-31 felina foi identificada por uma pesquisa de semelhança do genoma felino com a IL-31 canina utilizando os recursos do genoma do NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). 0 gene que representa a IL-31 felina foi sintetizado para expressão ótima em E. coli. Construções de expressão foram criados com genes de IL-31 canina e felina de comprimento inteiro que contêm uma etiqueta 6-His N-terminal para deteção e purificação. A construção felina de comprimento inteiro utilizada para expressão em E.coli é representada pela sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 69 e a sequência proteica da SEQ ID NO: 70. Foram utilizados plasmídeos confirmados para sequência para transformar E. coli BL21 Star™ (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) e a expressão foi realizada a 30 C durante 5 horas. Após a lise das bolas de células, verificou-se que a proteína reativa imunorreativa estava altamente enriquecida no lisado insolúvel. Estas bolas de células foram solubilizadas em 6M ureia e foi realizada purificação das proteínas recombinantes em condições desnaturantes utilizando uma resina em cobalto e níquel (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL) . As frações eluídas agrupadas mostradas ser positivas para a a presença da etiqueta His, foram dialisadas em etapas contra 0, 8 M ureia PBS seguido por PBS e analisadas por SDS PAGE (Figura 18). Conforme previamente observado, o rendimento de IL-31 canina recombinante de indução por E. coli foi baixo. Contudo, foi recuperada proteína após purificação que migrou de acordo com a massa molecular esperada por SDS-PAGE.
Para examinar a atividade biológica da IL-31 canina e felina produzida de E. coli, cada proteína foi analisada em relação à sua capacidade de induzir sinalização pSTAT no ensaio de células DH82. Uma vez que a IL-31 recombinante de células de mamífero (IL-31(CHO) canina) é altamente glicosilada, não era claro se a forma não glicosilada reteria atividade biológica. A Figura 19 mostra que a IL-31 felina tem bioatividade comparável à IL-31 referência produzida nas células CHO.
Mutagénese de varredura de alanina de IL-31 canina definiu uma região dentro da proteína que é necessária para ligar aos anticorpos 11 E12 e 34D03. Colocou-se a hipótese, devido à conservação de sequência nesta região (Figura 20), que estes mAbs reagiriam de forma cruzada com a IL-31 felina. A Figura 21 mostra que mAbs 11E12 e 34D03 são capazes de se ligar a IL-31 canina (E. coli) e também são capazes de reagir de forma cruzada com a proteína IL-31 felina. Com base nestes dados, continuou-se com a especiação do anticorpo 34D03 para felino (felinização) .
Exemplo 11 Felinização no anticorpo 34D03
Semelhante à estratégia de caninização descrita, foram identificadas sequências de anticorpo da linha germinativa apropriadas a partir de todas as sequências felinas disponíveis para enxerto de CDR de mAb 34D03. Cadeia leve variável (SEQ ID NO: 71 FEL-34D03-VL-021-1, para a qual a sequência nucleotídica correspondente é SEQ ID NO: 72) e cadeia pesada variável (SEQ ID NO: 73 FEL-34D03-VH-035-1, para a qual a sequência nucleotídica correspondente é SEQ ID NO: 74) foram selecionadas com base na maior homologia com as suas respetivas estruturas caninas em 34D03caninizado. Foi produzido 34D03 felinizado recombinante utilizando as regiões variáveis selecionadas juntas com a sua respetiva sequência da cadeia pesada constante IgGI (SEQ ID NO: 75 HC-A Felina, para a qual a sequência nucleotídica correspondente é SEQ ID NO: 76 Acessão do GenBank N.° AB016710.1) e leve constante K (SEQ ID NO: 77 LC-K Felina, para a qual a sequência nucleotídica correspondente é SEQ ID NO: 78 Acessão do GenBank N.° AF198257.1). Anticorpo foi produzido a partir de células HEK e purificado conforme previamente descrito. A Figura 22 mostra a capacidade de 34D03 felino de neutralizar a sinalização pSTAT com um IC50 comparável à da versão canina. 34D03 felinizado foi avaliado em relação à sua capacidade de ligar ambas IL-31 canina e felina. A Figura 23 mostra Western blots com 34D03 felinizado utilizando proteína purificada de ambas fontes de mamífero e de E. coli. Foi observada ligação conclusiva a ambas proteínas canina e felina o que indica reatividade cruzada complete da forma felinizada de 34D03 e verificação da ligação à proteína felina. Em conjunto, estes resultados sugerem que um epítopo conservado na IL-31 felina pode ser um alvo adequado para inibição desta citocina em gatos. Exemplo 12 Deteção de citocina IL-31 em cães com dermatite atópica que ocorre naturalmente
No presente exemplo, o nível de proteína IL-31 no soro recolhido de populações de cães, incluindo aqueles com dermatite atópica, foi avaliado utilizando uma técnica de imunoensaio quantitativo.
Foi recolhido soro das seguintes populações de cães e congelado antes das medições de IL-31 no soro. 1) Vinte e quatro beagles criados para este fim (Marshall BioResources, North Rose, Nova Iorque) antes de e após sensibilização a alergénios ácaros do pó domésticos (Dermatophagoides farina, Greer Labs) . Todos os animais tinham aproximadamente 9 meses de idade. Os dois sexos estavam representados aproximadamente igualmente. 2) Trinta cães alérgicos a pulgas (Youngs Veterinary Research Services, T urlock, CA) antes de infestação com pulgas ou aproximadamente uma semana após infestação com pulgas de gato adultas (Ctenocephalides felis). A maioria dos cães nesta colónia eram de raça mista. A idade média foi aproximadamente 10,5 anos. Os dois sexos estavam representados aproximadamente igualmente. 3) Oitenta e sete cães com dono com doença periodontal subclínica, mas de outra forma determinados como estando de boa saúde. As amostras foram recolhidas em 18 clinicas veterinárias dos Estados Unidos. Os animais eram representativos da população canina dos Estados Unidos em termos de género e raça e tinham idades compreendidas entre os dois e cinco anos. 4) Duzentos e vinte e quatro animais com dono diagnosticados com dermatite atópica crónica, não sazonal, de pelo menos duração 1 ano (com base nos critérios de Willemse modficados e
Prelaud (Willemse T. J small Anim Pract 1986; 27:771-778 e Prelaud et ai. Revue de Medecine Veterinaire 1998; 149: 1057-1064) com um mínimo de "comichão moderada", conforme avaliado pelo dono, e uma classificação de lesão da pele mínima de 25 no CADESI-02), conforme avaliada por um veterinário. As amostras foram recolhidas de 14 clínicas veterinárias dos Estados Unidos especializadas em dermatologia veterinária. Aproximadamente 75% dos cães eram de raça pura e -25% da população total eram retrievers (Labrador (17,3%) e Golden (8,2%) ) . Os cães tendiam a ser de meia idade (~6 anos de idade) . Os dois sexos estavam representados aproximadamente igualmente.
Um imunoensaio sanduíche foi utilizado para quantificar os níveis de cIL-31 no soro canino. As amostras de soro foram diluídas 1:2 em tampão Rexxip (Gyrolab, Warren, NJ) e corridas em CDs Bioaffy 1000 nL (Gyrolab) utilizando a banca de trabalho Gyrolab xP. cIL-31 foi capturada com um anticorpo monoclonal anti-IL-31 marcado com biotina de acordo com a presente invenção e detetada com um anticorpo anti-IL-31 monoclonal marcado com Alexaflour 647 de acordo com a presente invenção. As concentrações das amostras de cIL-31 foram extrapoladas a partir de uma curva padrão com 8 pontos com um intervalo dinâmico de 0,013-250 ng/mL utilizando um modelo de ajuste com 5 parâmetros com o programa Gyrolab Evaluator.
Os níveis de cIL-31 foram detetados nas amostras de soro de 57% dos cães com dermatite atópica que ocorre naturalmente (>13 pg/mL), mas não foram detetados (< 13 pg/mL) no soro de beagles criados para esse fim +/- sensibilizados a HDM, cães de raça mista +/- infestação com pulgas ou cães com dono com doença periodontal, mas de outra forma considerados de boa saúde, independentemente da raça. Nos cães com dermatite atópica que ocorre naturalmente, 53% das amostras analisadas mostrou níveis de IL-31 no soro entre 13-1000 pg/mL e 4% mostrou níveis acima de 1000 pg/mL (Quadro 5).
Quadro 5: Níveis de IL-31 no soro em várias populações caninas
Os resultados do presente exemplo demonstram que a proteína IL-31 é elevada num número significativo de cães com dermatite atópica canina. Sem desejar ficar ligado por qualquer teoria, pensa-se que a via IL-31 desempenha um papel na patobiologia de condições patológicas da pele alérgicas pruríticas, tais como, mas não limitadas a, dermatite atópica canina, e representa uma nova via para intervenção terapêutica com um antagonista de IL-31, tal como incluindo, mas não limitada a, olacitnib e/ou um anticorpo anti-IL-31 que se liga especificamente a IL-31 canina.
LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Pfizer Inc. Bammert, Gary F. Dunham, Steven A. <120> ANTICORPO MONOCLONAL INTERLEUCINA-31 <130> PC71750 <150> 61/510.268 <151> 21-07-2011 <160> 78 <170> Patentln versão 3.4 <210> 1 <211> 5
<212> PRT <213> Mus musculus <400> 1
Tyr Tyr Asp lie Asn 1 5
<210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2
Ser Tyr Asp Met Ser 1 5
<210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3
Asn Tyr Gly Met Ser 1 5
<210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4
Trp lie Phe Pro Gly Asp Gly Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Thr Phe Lys 15 10 15
Gly
<210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5
Thr lie Thr Ser Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Ser Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15
Gly
<210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6
Thr lie Ser Tyr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn lie Lys 15 10 15
Gly
<210> 7 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7
Ala Arg Gly Gly Thr Ser Val lie Arg Asp Ala Met Asp Tyr 15 10
<210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8
Ala Arg Gin Asn Trp Val Val Gly Leu Ala Tyr 15 10
<210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9
Val Arg Gly Tyr Gly Tyr Asp Thr Met Asp Tyr 15 10
<210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly lie Ser Phe Met His 15 10 15
<210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11
Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gin Lys Asn Tyr Leu 15 10 15
Ala
<210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12
Lys Ala Ser Gin Ser Val Ser Phe Ala Gly Thr Gly Leu Met His 15 10 15
<210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13
Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5
<210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14
Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5
<210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <40 0> 15
Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala 1 5
<210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16
Gin Gin Ser Asn Lys Asp Pro Leu Thr 1 5
<210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <40 0> 17
Gin Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr 1 5
<210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18
Gin Gin Ser Arg Glu Tyr Pro Trp Thr 1 5
<210> 19 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19
Asp lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15
Gin Arg Ala Thr lie Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr 20 25 30
Gly lie Ser Phe Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45
Lys Leu Leu lie Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly lie Pro Ala 50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn 65 70 75 80
Pro Val Glu Thr Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn 85 90 95
Lys Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 20 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> sequência mAb da cadeia leve variável caninizada de Mus musculus e Canis <400> 20
Asp lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr 20 25 30
Gly lie Ser Phe Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45
Lys Leu Leu lie Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg lie Ser 65 70 75 80
Arg Val Glu Ala Asp Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn 85 90 95
Lys Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210> 21 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> sequência mAb da cadeia leve variável caninizada de Mus musculus e Canis <400> 21
Asp lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr 20 25 30
Gly lie Ser Phe Met His Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro 35 40 45
Gin Leu Leu lie Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg lie Ser 65 70 75 80
Arg Val Glu Ala Asp Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn 85 90 95
Lys Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110
<210> 22 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22
Asp lie Val Met Ser Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly 15 10 15
Asp Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30
Gly Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Trp Gin 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Asn 85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie 100 105 110
Lys <210> 23 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> sequência mAb da cadeia leve variável caninizada de Mus musculus e Canis <400> 23
Glu lie Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Leu Ser Gin Glu 15 10 15
Glu Lys Val Thr lie Thr Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30
Gly Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Phe Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Asn 85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie 100 105 110
Lys
<210> 24 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 24
Asp lie Leu Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15
Gin Arg Ala lie lie Ser Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val Ser Phe Ala 20 25 30
Gly Thr Gly Leu Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Gin Pro 35 40 45
Lys Leu Leu lie Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Thr 50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Asn lie His 65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Arg 85 90 95
Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210> 25 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> sequência mAb da cadeia leve variável caninizada de Mus musculus e Canis <400> 25
Glu lie Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Leu Ser Gin Glu 15 10 15
Glu Lys Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val Ser Phe Ala 20 25 30
Gly Thr Gly Leu Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro 35 40 45
Lys Leu Leu lie Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Ser 50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Phe Thr lie Ser 65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Arg 85 90 95
Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110
<210> 26 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26
Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Lys Tyr Tyr 20 25 30
Asp lie Asn Trp Val Arg Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Trp lie Phe Pro Gly Asp Gly Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Thr Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Gin Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95
Ala Arg Gly Gly Thr Ser Val lie Arg Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 27 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> sequência mAb da cadeia pesada variável caninizada de Mus musculus e Canis <400> 27
Glu Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Lys Tyr Tyr 20 25 30
Asp lie Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Ala Gly Leu Asp Trp Met 35 40 45
Gly Trp lie Phe Pro Gly Asp Gly Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Thr Phe 50 55 60
Lys Gly Arg Vai Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ala Gly Asp Ile Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Gly Gly Thr Ser Vai lie Arg Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120
<210> 28 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28
Glu Vai Lys Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Asp Met Ser Trp Vai Arg Gin lie Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Vai 35 40 45
Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Ser Ala Asp Ser Vai 50 55 €0
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Gin Asn Trp Vai Vai Gly Leu Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Vai Thr Vai Ser Ala 115 <210> 29 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> sequência mAb da cadeia pesada variável caninizada de Mus musculus e Canis <400> 29
Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Asp Leu Vai Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Vai Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Asp Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gin Trp Vai 35 40 45
Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Ser Ala Asp Ser Vai 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Gin Asn Trp Vai Vai Gly Leu Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115
<210> 30 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30
Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Asp Leu Vai Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr 20 25 30
Gly Met Ser Trp Vai Arg Gin Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Vai 35 40 45
Ala Thr Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn lie 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Vai Arg Gly Tyr Gly Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Ser Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 31 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> sequência mAb da cadeia pesada variável caninizada de Mus musculus e Canis <400> 31
Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Asp Leu Vai Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Vai Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30
Gly Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gin Trp Vai 35 40 45
Ala Thr Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn lie 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Vai Arg Gly Tyr Gly Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115
<210> 32 <211> 159 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 32
Met Leu Ser His Thr Gly Pro Ser Arg Phe Ala Leu Phe Leu Leu Cys 15 10 15
Ser Met Glu Thr Leu Leu Ser Ser His Met Ala Pro Thr His Gin Leu 20 25 30
Pro Pro Ser Asp Vai Arg Lys lie lie Leu Glu Leu Gin Pro Leu Ser 35 40 45
Arg Gly Leu Leu Glu Asp Tyr Gin Lys Lys Glu Thr Gly Vai Pro Glu 50 55 60
Ser Asn Arg Thr Leu Leu Leu Cys Leu Thr Ser Asp Ser Gin Pro Pro 65 70 75 80
Arg Leu Asn Ser Ser Ala lie Leu Pro Tyr Phe Arg Ala lie Arg Pro 85 90 95
Leu Ser Asp Lys Asn lie lie Asp Lys lie lie Glu Gin Leu Asp Lys 100 105 110
Leu Lys Phe Gin His Glu Pro Glu Thr Glu Ile Ser Vai Pro Ala Asp 115 120 125
Thr Phe Glu Cys Lys Ser Phe Ile Leu Thr Ile Leu Gin Gin Phe Ser 130 135 140
Ala Cys Leu Glu Ser Vai Phe Lys Ser Leu Asn Ser Gly Pro Gin 145 150 155
<210> 33 <211> 477 <212> ADN <213> Canis familiaris <400> 33 atgctctccc acacaggacc atccaggttt gccctgttcc tgctctgctc tatggaaacc €0 ttgctgtcct cccatatggc acccacccat cagctaccac caagtgatgt acgaaaaatc 120 atcttggaat tacagccctt gtcgagggga cttttggaag actatcagaa gaaagagaca 180 ggggtgccag aatccaaccg taccttgctg ctgtgtctca cctctgattc ccaaccacca 240 cgcctcaaca gctcagccat cttgccttat ttcagggcaa tcagaccatt atcagataag 300 aacattattg ataaaatcat agaacagctt gacaaactca aatttcaaca tgaaccagaa 300 acagaaattt ctgtgcctgc agatactttt gaatgtaaaa gcttcatctt gacgatttta 420 cagcagttct cggcgtgcct ggaaagtgtg tttaagtcac taaactctgg acctcag 477
<210> 34 <211> 333 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 34 gacattcrtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60 atctcctgca gagccagcga aagtgttgat aattatggca ttagttttat gcactggtac 120 cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaatct 180 gggatccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattaat 240 cctgtggaga ctgatgatgt tgcaacctat tactgtcagc aaagtaataa ggatccgctc 300 acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa 333
<210> 35 <211> 363 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 35 caggttcagc tgcagcagtc tggagctgaa ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagttg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcaaa tactatgata taaactgggt gaggcagagg 120 cctgaacagg gacttgagtg gattggatgg atttttcctg gagatggtgg tactaagtac 180 aatgagacgt tcaagggcaa ggccacactg actacagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcaggctgac atctgaggac tctgctgtct atttctgtgc aagagggggg 300 acttcggtga taagggatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360 tea 363
<210> 36 <211> 339 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 36 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctgagtgtgt cagcaggaga taaggtcact 60 atgagetgea agtecagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttggcc 120 tggtaccagc agaaaccatg gcagcctcct aaactgetga tetacgggge atecactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 300 ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaa 339
<210> 37 <211> 354 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 37 gaagtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cgctttcagc agctatgaca tgtcttgggt tcgccagatt 120 ccggaaaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attactagtg gtggtggtta cacctactct 180 gcagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaggaa caccctgtac 240 ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccgtgt attattgtgc aagacaaaac 300 tgggtcgtgg ggttagctta ttggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354
<210> 38 <211> 333 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 38 gacattttgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccatc 60 atctcctgca aggccagcca aagtgtcagt tttgctggta ctggtttaat gcactggtac 120 caacagaaac caggacagca acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaagct 180 ggggttccta ccaggtttag tggcagtggg tctaggaaag acttcaccct caatatccat 240 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat ttctgtcagc aaagcaggga atatccgtgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333
<210> 39 <211> 353 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 39 gaggtgcagt tggtggagtc tgggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt ctctttcagt aactatggca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccagacaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagttatg gtggtagtta cacctactat 180 ccagacaata taaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240 ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgt aagggggtat 300 ggttacgata ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc gag 353
<210> 40 <211> 331 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 40
Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly 15 10 15
Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ser val Leu Gin Ser Ser Gly Leu His Ser 50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr 65 70 75 80
Phe Thr Cys Asn Val Val His Pro Ala Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95
Pro Val Phe Asn Glu Cys Arg Cys Thr Asp Thr Pro Pro Cys Pro Val 100 105 110
Pro Glu Pro Leu Gly Gly Pro Ser Val Leu lie Phe Pro Pro Lys Pro 115 120 125
Lys Asp lie Leu Arg lie Thr Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 130 135 140
Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp Pro Glu Val Gin lie Ser Trp Phe Val 145 150 155 160
Asp Gly Lys Glu Val His Thr Ala Lys Thr Gin Ser Arg Glu Gin Gin 165 170 175
Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro lie Glu His Gin 180 185 190
Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His lie Asp 195 200 205
Leu Pro Ser Pro He Glu Arg Thr lie Ser Lys Ala Arg Gly Arg Ala 210 215 220
His Lys Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser 225 230 235 240
Ser Ser Asp Thr Val Ser He Thr Cys Leu He Lys Asp Phe Tyr Pro 245 250 255
Pro Asp He Asp Val Glu Trp Gin Ser Asn Gly Gin Gin Glu Pro Glu 260 265 270
Arg Lys His Arg Met Thr Pro Pro Gin Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr 275 280 285
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 290 295 300
Asp Pro Phe Thr Cys Ala Val Met His Glu Thr Leu Gin Asn His Tyr 305 310 315 320
Thr Asp Leu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 325 330
<210> 41 <211> 993 <212> ADN <213> Canis familiaris <400> 41 gcctccacca cggcgccctc ggttttccca ctggccccca gctgcgggtc cacttccggc 60 tccacggtgg ccctggcctg cctggtgtca ggctacttcc ccgagcctgt aactgtgtcc 120 tggaactccg gctccttgac cagcggtgtg cacaccttcc cgtccgtcct gcagtcctca 180 gggcttcact ccctcagcag catggtgaca gtgccctcca gcaggtggcc cagcgagacc 240 ttcacctgca acgtggtcca cccagccagc aacactaaag tagacaagcc agtgttcaat 300 gaatgcagat gcactgatac acccccatgc ccagtccctg aacctctggg agggccttcg 360 gtcctcatct ttcccccgaa acccaaggac atcctcagga ttacccgaac acccgaggtc 420 acctgtgtgg tgttagatct gggccgtgag gaccctgagg tgcagatcag ctggttcgtg 480 gatggtaagg aggtgcacac agccaagacc cagtctcgtg agcagcagtt caacggcacc 540 taccgtgtgg tcagcgtcct ccccattgag caccaggact ggctcacagg gaaggagttc 600 aagtgcagag tcaaccacat agacctcccg tcteccatcg agaggaccat ctctaaggcc 660 agagggaggg cccataagcc cagtgtgtat gtcctgccgc catccccaaa ggagttgtca 720 tccagtgaca cagtcagcat cacctgcctg ataaaagact tctacccacc tgacattgat 780 gtggagtggc agagcaatgg acagcaggag cccgagagga agcaccgcat gaccccgccc 840 cagctggacg aggacgggtc atacttcctg tacagcaagc tctctgtgga caagagccgc 900 tggcagcagg gagacccctt cacatgtgcg gtgatgcatg aaactctaca gaaccactac 960 acagatctat ccctctccca ttctccgggt aaa 993
<210> 42 <211> 335 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 42
Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly 15 10 15
Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr 65 70 75 80
Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95
Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys 100 105 110
Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe lie 115 120 125
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu lie Ala Arg Thr Pro Glu 130 135 140
Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gin 145 150 155 160 lie Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gin Met Gin Thr Ala Lys Thr Gin 165 170 175
Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 180 185 190
Pro He Gly His Gin Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gin Phe Thr Cys Lys 195 200 205
Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro lie Glu Arg Thr lie Ser Lys 210 215 220
Ala Arg Gly Gin Ala His Gin Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser 225 230 235 240
Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu He Lys 245 250 255
Asp Phe Phe Pro Pro Asp lie Asp Val Glu Trp Gin Ser Asn Gly Gin 260 265 270
Gin Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gin Leu Asp Glu 275 280 285
Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg 290 295 300
Trp Gin Arg Gly Asp Thr Phe lie Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu 305 310 315 320
His Asn His Tyr Thr Gin Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 325 330 335
<210> 43 <211> 1005 <212> ADN <213> Canis familiaris <400> 43 gcctcaacaa ctgctcctag cgtgtttccc ctggccccta gctgcggaag tacctcaggc 60 agcacagtgg ccctggcttg tctggtgtct ggatatttcc ctgagccagt gaccgtgagt 120 tggaacagcg gctctctgac ctccggggtg cacacatttc catctgtgct gcagtctagt 180 ggcctgtact ccctgtcaag catggtgact gtgccttcct ctaggtggcc atcagaaact 240 ttcacctgca acgtggccca tcccgccagc aagaccaaag tggacaagcc cgtgcctaaa 300 agggagaatg gaagggtgcc aagaccacct gattgcccta agtgtccagc tccagaaatg 360 ctgggaggac caagcgtgtt catctttcca cccaagccca aagacacact gctgattgct 420 agaactcccg aggtgacctg cgtggtggtg gacctggatc cagaggaccc cgaagtgcag 480 atctcctggt tcgtggatgg gaagcagatg cagacagcca aaactcagcc tcgggaggaa 540 cagtttaacg gaacctatag agtggtgtct gtgctgccaa ttggacacca ggactggctg 600 aagggcaaac agtttacatg caaggtgaac aacaaggccc tgcctagtcc aatcgagagg 660 actatttcaa aagctagggg acaggctcat cagccttccg tgtatgtgct gcctccatcc 720 cgggaggaac tgtctaagaa cacagtgagt ctgacttgtc tgatcaaaga tttctttccc 780 cctgacattg atgtggagtg gcagagcaat gggcagcagg agccagaatc caagtacaga 840 accacaccac cccagctgga cgaagatggc tcctatttcc tgtacagtaa gctgtcagtg 900 gacaaatcta ggtggcagcg cggggatacc tttatctgcg ccgtgatgca cgaggctctg 960 cacaatcatt acacacaaga aagtctgtca catagccccg gcaag 1005
<210> 44 <211> 106 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 44
Arg Asn Asp Ala Gin Pro Ala Val Tyr Leu Phe Gin Pro Ser Pro Asp 15 10 15
Gin Leu His Thr Gly Ser Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Ser Phe 20 25 30
Tyr Pro Lys Asp lie Asn Val Lys Trp Lys Val Asp Gly Val lie Gin 35 40 45
Asp Thr Gly lie Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Lys Asp Ser Thr 50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu Tyr Leu Ser 65 70 75 80
His Glu Leu Tyr Ser Cys Glu lie Thr His Lys Ser Leu Pro Ser Thr 85 90 95
Leu lie Lys Ser Phe Gin Arg Ser Glu Cys 100 105
<210> 45 <211> 318 <212> ADN <213> Canis familiaris <400> 45 aggaacgacg cccagoctgc tgtgtatctg tttcagccct cccctgatca gctgcacact 60 ggctctgcta gtgtggtgtg tctgctgaac agcttctacc caaaggatat caatgtgaag 120 tggaaagtgg acggcgtgat ccaggatact gggattcagg agtccgtgac cgaacaggac 180 aaagattcaa catatagcct gagctccact ctgaccatgt ctagtaccga gtacctgagc 240 cacgaactgt attcctgcga gatcactcat aagtccctgc cctctaccct gatcaagagc 300 ttccagagat cagagtgt 318
<210> 46 <211> 339 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> sequência nucleotidica que codifica uma sequência mAb da cadeia leve variável caninizada de Mus musculus e Canis <400> 4 6 gagatcgtga tgacccagag ccccgccagc ctgagcctga gccaggaaga gaaagtcacc 60 atcacatgca agagcagcca gagcctgctg aacagcggca accagaagaa ctacctggcc 120 tggtatcagc agaagcccgg ccaggccccc aagctgctga tctacggcgc cagcacccgc 180 gagagcggcg tgccaagcag attttccggc agcggctccg gcaccgactt cagcttcacc 240 atcagcagcc tggaacccga ggacgtggcc gtgtactact gccagaacga ctacagctac 300 ccctacacct tcggccaggg taccaagctg gagatcaag 339 <210> 47 <211> 354 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> sequência nucleotidica que codifica uma sequência mAb da cadeia pesada variável caninizada de Mus musculus e Canis <400> 47 gaggtgcagc tggtggaatc tggcggcgac ctggtcaagc ctggcggcag cctgagactg 60 agctgtgtgg ccagcggctt caccttcagc agctacgaca tgagctgggt ccgacaggcc 120 cctggcaagg gactgcagtg ggtggccacc atcaccagcg gcggaggcta cacctacagc 180 gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acgcccggaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagacagaac 300 tgggtcgtgg gcctggccta ctggggccag ggaacactcg tgaccgtctc gagc 354 <210> 48 <211> 333 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> sequência nucleotidica que codifica uma sequência mAb da cadeia leve variável caninizada de Mus musculus e Canis <400> 48 gagatcgtga tgacccagag ccccgccagc ctgagcctga gccaggaaga gaaagtcacc 60 atcacatgca aggccagcca gagcgtgtcc ttcgccggca caggcctgat gcactggtat 120 cagcagaagc ccggccaggc ccccaagctg ctgatctacc gggccagcaa cctggaagcc 180 ggcgtgccaa gcagattcag cggcagcggc tccggcaccg acttcagctt caccatcagc 240 agcctcgaac ccgaggacgt ggccgtgtac tactgccagc agagcagaga gtacccctgg 300 accttcggcc agggtaccaa gctggagatc aag 333 <210> 49 <211> 354 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> sequência nucleotidica que codifica uma sequência mAb da cadeia pesada variável caninizada de Mus musculus e Canis <400> 49 gaggtgcagc tggtggaatc tggcggcgac ctggtcaagc ctggcggcag cctgagactg 60 agctgtgtgg ccagcggctt caccttcagc aactacggca tgagctgggt ccgacaggcc 120 cctggcaagg gactgcagtg ggtggccacc atcagctacg gcggcagcta cacctactac 180 cccgacaaca tcaagggccg gttcaccatc agccgggaca acgccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccatgt actactgcgt gcggggctac 300 ggctacgaca caatggacta ctggggccag ggcaccctcg tgaccgtctc gagc 354 <210> 50 <211> 333 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> sequência nucleotidica que codifica uma sequência mAb da cadeia leve variável caninizada de Mus musculus e Canis <400> 50 gatatagtga tgacacaaac tcctctcagt ctttccgtat caccgggaga accggcttcc 60 atttcctgtc gggcctcaga gtctgtggac aactacggga tatccttcat gcactggtat 120 cagcagaaac ccggccagcc ccctaaactc cttatttaca gggccagtaa tctggaaagc 180 ggtgtgcccg atcgatttag cggttccggg agcggcacag atttcaccct gcgaatctct 240 agagttgaag cggatgatgc aggagtatat tactgccagc aatccaataa ggatcccctt 300 acattcggcg cgggtaccaa gctggagatc aag 333 <210> 51 <211> 363 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> sequência nucleotidica que codifica uma sequência mAb da cadeia pesada variável caninizada de Mus musculus e Canis <400> 51 gaggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgccag cgtgaaggtg 60 tcctgcaaga ccagcggcta caccttcaag tactacgaca tcaactgggt ccgacaggcc 120 cctggcgccg gactggattg gatgggctgg atcttccccg gcgacggcgg caccaagtac 180 aacgagacat tcaagggcag agtgaccctg accgccgaca ccagcaccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgag agccggcgat atcgctgtgt actactgcgc cagaggcggc 300 accagcgtga tccgggacgc tatggactac tggggccagg gcaccctcgt gaccgtctcg 360 age 363 <210> 52 <211> 333 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> sequência nucleotidica que codifica uma sequência mAb da cadeia leve variável caninizada de Mus musculus e Canis <400> 52 gacattgtta tgactcagac gcccctgagc ctgagcgtct cccccggcga gcccgctagt 60 attagttgcc gggcatccga gtcagtggac aattatggca tcagctttat gcattggttt 120 cagcagaaac caggtcagtc ccctcaactc ctgatttaca gagcttccaa tctggaatca 180 ggcgttcctg acagatttag cggatcaggc tccgggacag atttcaccct gcgcatcagt 240 cgcgtggaag ccgatgacgc aggcgtctat tattgtcaac agtccaacaa ggatcccctt 300 acattcggag ccggtaccaa gctggagatc aag 333 <210> 53 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> sequência mAb da cadeia leve variável caninizada de Mus musculus e Canis <400> 53
Asp lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr 20 25 30
Gly lie Ser Phe Met His Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro 35 40 45
Gin Arg Leu lie Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg lie Ser 65 70 75 80
Arg Val Glu Ala Asp Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn 85 90 95
Lys Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210> 54 <211> 333 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> sequência nucleotidica que codifica uma sequência mAb da cadeia leve variável caninizada de Mus musculus e Canis <400> 54 gacatcgtga tgacccagac ccccctgagc ctgagcgtgt cccctggcga gcctgccagc 60 atcagctgca gagccagcga gagcgtggac aactacggca tcagcttcat gcactggttc 120 cagcagaagc ccggccagag cccccagcgg ctgatctaca gagccagcaa cctggaaagc 180 ggcgtgcccg atcggtttag cggctctggc agcggcaccg acttcaccct gcggatctct 240 cgggtggaag ccgatgacgc cggagtgtac tactgccagc agagcaacaa ggaccccctg 300 acctttggcg ccggtaccaa getggagatc aag 333 <210> 55 <211> 148 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> proteína IL-31 canina de comprimento inteiro codificada por sequência nucleotidica otimizada por codão <400> 55
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ser His Met Ala 15 10 15
Pro Thr His Gin Leu Pro Pro Ser Asp Val Arg Lys lie lie Leu Glu 20 25 30
Leu Gin Pro Leu Ser Arg Gly Leu Leu Glu Asp Tyr Gin Lys Lys Glu 35 40 45
Thr Gly Val Pro Glu Ser Asn Arg Thr Leu Leu Leu Cys Leu Thr Ser 50 55 60
Asp Ser Gin Pro Pro Arg Leu Asn Ser Ser Ala lie Leu Pro Tyr Phe 65 70 75 80
Arg Ala lie Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn lie lie Asp Lys lie lie 85 90 95
Glu Gin Leu Asp Lys Leu Lys Phe Gin His Glu Pro Glu Thr Glu lie 100 105 110
Ser Val Pro Ala Asp Thr Phe Glu Cys Lys Ser Phe lie Leu Thr lie 115 120 125
Leu Gin Gin Phe Ser Ala Cys Leu Glu Ser Val Phe Lys Ser Leu Asn 130 135 140
Ser Gly Pro Gin 145 <210> 56 <211> 444 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> sequência nucleotidica otimizada por codão que codifica proteína IL-31 canina de comprimento inteiro <400> 56 atgagaggat cccatcacca tcaccaccac ggctcatctc atatggctcc tactcaccaa 60 ttaccaccct ccgatgtccg taaaattatt ctcgaattac aacctttatc ccgcggtctg 120 ctcgaagatt accaaaaaaa agaaacaggc gtcccagaaa gcaaccgtac attactcctt 180 tgccttacct ccgattccca accacctcgt cttaactcat cagccattct cccttatttc 240 cgtgccattc gccctctttc tgataaaaat attattgaca aaattattga acaactcgac 300 aaattaaaat tccaacacga acccgaaacc gaaatctccg tacctgccga tacctttgaa 360 tgcaaatcct ttatcctcac tattttacaa caattctccg catgtctcga atccgtcttc 420 aaatctctca attccggtcc acag 444 <210> 57 <211> 151 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> sequência de aminoácidos correspondente a proteína IL-31 canina com truncação do N-terminal (-20N) <400> 57
Met Leu Glu Leu Gin Pro Leu Ser Arg Gly Leu Leu Glu Asp Tyr Gin 15 10 15
Lys Lys Glu Thr Gly Val Pro Glu Ser Asn Arg Thr Leu Leu Leu Cys 20 25 30
Leu Thr Ser Asp Ser Gin Pro Pro Arg Leu Asn Ser Ser Ala lie Leu 35 40 45
Pro Tyr Phe Arg Ala He Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn lie He Asp 50 55 60
Lys He He Glu Gin Leu Asp Lys Leu Lys Phe Gin His Glu Pro Glu 65 70 75 80
Thr Glu He Ser Val Pro Ala Asp Thr Phe Glu Cys Lys Ser Phe He 85 90 95
Leu Thr He Leu Gin Gin Phe Ser Ala Cys Leu Glu Ser Val Phe Lys 100 105 110
Ser Leu Asn Ser Gly Pro Gin Lys Gly Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu 115 120 125
Gly Lys Pro He Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr 130 135 140
Gly His His His His His His 145 150 <210> 58 <211> 456 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> sequência nucleotidica que codifica a proteína IL-31 canina com truncação do N-terminal (-20N) <400> 58 atgctcgaat tacaaccttt atcccgcggt ctgctcgaag attaccaaaa aaaagaaaca 60 ggcgtcccag aaagcaaccg tacattactc ctttgcctta cctccgattc ccaaccacct 120 cgtcttaact catcagccat tctcccttat ttccgtgcca ttcgccctct ttctgataaa 180 aatattattg acaaaattat tgaacaactc gacaaattaa aattccaaca cgaacccgaa 240 accgaaatct ccgtacctgc cgataccttt gaatgcaaat cctttatcct cactatttta 300 caacaattct ccgcatgtct cgaatccgtc ttcaaatctc tcaattccgg tccacagaag 360 ggcgagctca attcgaagct tgaaggtaag cctatcccta accctctcct cggtctcgat 420 tctacgcgta ccggtcatca tcaccatcac cattga 456 <210> 59 <211> 131 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> sequência de aminoácidos correspondente a proteína IL-31 canina com truncação do N-terminal (-40N) <400> 59
Met Val Pro Glu Ser Asn Arg Thr Leu Leu Leu Cys Leu Thr Ser Asp 15 10 15
Ser Gin Pro Pro Arg Leu Asn Ser Ser Ala lie Leu Pro Tyr Phe Arg 20 25 30
Ala lie Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn lie lie Asp Lys lie lie Glu 35 40 45
Gin Leu Asp Lys Leu Lys Phe Gin His Glu Pro Glu Thr Glu lie Ser 50 55 60
Val Pro Ala Asp Thr Phe Glu Cys Lys Ser Phe lie Leu Thr lie Leu 65 70 75 80
Gin Gin Phe Ser Ala Cys Leu Glu Ser Val Phe Lys Ser Leu Asn Ser 85 90 95
Gly Pro Gin Lys Gly Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu Gly Lys Pro lie 100 105 110
Pro Asn Fro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His His 115 120 125
His His His 130 <210> 60 <211> 393 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> sequência nucleotidica que codifica a proteína IL-31 canina com truncação do N-terminal (-40N) <400> 60 atggtcccag aaagcaaccg tacattactc ctttgcctta cctccgattc ccaaccacct 60 cgtcttaact catcagccat tctcccttat ttccgtgcca ttcgccctct ttctgataaa 120 aatattattg acaaaattat tgaacaactc gacaaattaa aattccaaca cgaacccgaa 180
accgaaatct ccgtacctgc cgataccttt gaatgcaaat cctttatcct cactatttta 24Q caacaattct ccgcatgtct cgaatccgtc ttcaaatctc tcaattccgg tccacagaag 300 ggcgagctca attcgaagct tgaaggtaag cctatcccta accctctcct cggtcwcgat 360 tctacgcgta ccggtcatca tcaccatcac cat 393 <210> 61 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> sequência de aminoácidos correspondente a proteína IL-31 canina com truncação do N-terminal (-60N) <400> 61
Met Leu Asn Ser Ser Ala lie Leu Pro Tyr Phe Arg Ala lie Arg Pro 15 10 15
Leu Ser Asp Lys Asn lie lie Asp Lys lie lie Glu Gin Leu Asp Lys 20 25 30
Leu Lys Phe Gin His Glu Pro Glu Thr Glu lie Ser Val Pro Ala Asp 35 40 45
Thr Phe Glu Cys Lys Ser Phe lie Leu Thr lie Leu Gin Gin Phe Ser 50 55 60
Ala Cys Leu Glu Ser Val Phe Lys Ser Leu Asn Ser Gly Pro Gin Lys 65 70 75 80
Gly Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu Gly Lys Pro lie Pro Asn Pro Leu 85 90 95
Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His His His His His 100 105 110 <210> 62 <211> 333 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> sequência nucleotidica que codifica a proteína IL-31 canina com truncação do N-terminal (-60N) <400> 62 atgcttaact catcagccat tctcccttat ttccgtgcca ttcgccctct ttctgataaa 60 aatattattg acaaaattat tgaacaactc gacaaattaa aattccaaca cgaacccgaa 120 accgaaatct ccgtacctgc cgataccttt gaatgcaaat cctttatcct cactatttta 180 caacaattct ccgcatgtct cgaatccgtc ttcaaatctc tcaattccgg tccacagaag 240 ggcgagctca attcgaagct tgaaggtaag cctatcccta accctctcct cggtctcgat 300 tctacgcgta ccggtcatca tcaccatcac cat 333 <210> 63 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> sequência de aminoácidos correspondente a proteína IL-31 canina com truncação do C-terminal na posição 20-122 <400> 63
Met Leu Glu Leu Gin Pro Leu Ser Arg Gly Leu Leu Glu Asp Tyr Gin 15 10 15
Lys Lys Glu Thr Gly Val Pro Glu Ser Asn Arg Thr Leu Leu Leu Cys 20 25 30
Leu Thr Ser Asp Ser Gin Pro Pro Arg Leu Asn Ser Ser Ala lie Leu 35 40 45
Pro Tyr Phe Arg Ala lie Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn He lie Asp 50 55 60
Lys He He Glu Gin Leu Asp Lys Leu Lys Phe Gin His Glu Pro Glu 65 70 75 80
Thr Glu lie Ser Val Pro Ala Asp Thr Phe Glu Cys Lys Ser Phe lie 85 90 95
Leu Thr He Leu Gin Gin Phe Ser Lys Gly Glu Leu Asn Ser Lys Leu 100 105 110
Glu Gly Lys Pro He Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg 115 120 125
Thr Gly His His His His His His 130 135
<210> 64 <211> 411 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> sequência nucleotidica que codifica a proteína IL-31 canina com truncação do C-terminal na posição 20-122 <400> 64 atgctcgaat tacaaccttt atcccgcggt ctgctcgaag attaccaaaa aaaagaaaca 60 ggcgtcccag aaagcaaccg tacattactc ctttgcctta cctccgattc ccaaccacct 120 cgtcttaact catcagccat tctcccttat ttccgtgcca ttcgccctct ttctgataaa 180 aatattattg acaaaattat tgaacaactc gacaaattaa aattccaaca cgaacccgaa 240 accgaaatct ccgtacctgc cgataccttt gaatgcaaat cctttatcct cactatttta 300 caacaattct ccaagggcga gctcaattcg aagcttgaag gtaagcctat ccctaaccct 360 ctcotcggtc tcgattctac gcgtaccggt catcatoacc atcaccattg a 411 <210> 65 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> sequência de aminoácidos correspondente a proteína IL-31 canina com truncação do C-terminal na posição 20-100 <400> 65
Met Leu Glu Leu Gin Fro Leu Ser Arg Gly Leu Leu Glu Asp Tyr Gin 15 10 15
Lys Lys Glu Thr Gly Val Pro Glu Ser Asn Arg Thr Leu Leu Leu Cys 20 25 30
Leu Thr Ser Asp Ser Gin Pro Pro Arg Leu Asn Ser Ser Ala lie Leu 35 40 45
Pro Tyr Phe Arg Ala lie Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn lie lie Asp 50 55 60
Lys lie lie Glu Gin Leu Asp Lys Leu Lys Phe Gin His Glu Pro Glu 65 70 75 80
Thr Glu Lys Gly Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu Gly Lys Pro lie Pro 85 90 95
Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His His His 100 105 110
His His <210> 66 <211> 345 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> sequência nucleotidica que codifica a proteína IL-31 canina com truncação do C-terminal na posição 20-100 <4 0 0 > 66 atgctcgaat tacaaccttt atcccgcggt ctgctcgaag attaccaaaa aaaagaaaca 60 ggcgtcccag aaagcaaccg tacattactc ctttgcctta cctccgattc ccaaccacct 120 cgtcttaact catcagccat tctcccttat ttccgtgcca ttcgccctct ttctgataaa 180 aatattattg acaaaattat tgaacaactc gacaaattaa aattccaaca cgaacccgaa 240 accgaaaagg gcgagctcaa ttcgaagctt gaaggtaagc ctatccctaa ccctctcctc 300 ggtctcgatt ctacgcgtac cggtcatcat caccatcacc attga 345 <210> 67 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> sequência de aminoácidos correspondente a proteína IL-31 canina com truncação do C-terminal na posição 20-80 <400> 67
Met Leu Glu Leu Gin Pro Leu Ser Arg Gly Leu Leu Glu Asp Tyr Gin 15 10 15
Lys Lys Glu Thr Gly Val Pro Glu Ser Asn Arg Thr Leu Leu Leu Cys 20 25 30
Leu Thr Ser Asp Ser Gin Pro Pro Arg Leu Asn Ser Ser Ala lie Leu 35 40 45
Pro Tyr Phe Arg Ala lie Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn lie Lys Gly 50 55 60
Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu Gly Lys Pro lie Pro Asn Pro Leu Leu 65 70 75 80
Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His His His His His 85 90 <210> 68 <211> 285 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> sequência nucleotidica que codifica a proteína IL-31 canina com truncação do C-terminal na posição 20-80 <400> 68 atgctcgaat tacaaccttt atcccgcggt ctgctcgaag attaecaaaa aaaagaaaca €0 ggcgtcccag aaagcaaccg tacattactc ctttgcctta cctccgattc ccaaccacct 120 cgtcttaact catcagccat tctcccttat ttccgtgcca ttcgccctct ttctgataaa 180 aatattaagg gcgagctcaa ttcgaagctt gaaggtaagc ctatccctaa ccctctcctc 240 ggtctcgatt ctacgcgtac cggtcatcat caccatcacc attga 285 <210> 69 <211> 444
<212> ADN <213> Fells catus <400> 69 atgagaggat cccatcacca tcaccaccac ggctcatctc atatggcccc cgcacatcgc 60 ctgcagccga gtgacattcg taaaattatc ttggagctgc gcccgatgtc caagggctta 120 ctgcaggatt atctgaagaa agagatcggg ctgcctgaaa gcaaccatag tagcctgccg 180 tgtttatcgt ctgatagcca gttaccacac atcaatggct ctgcgatttt gccctacttt 240 cgcgccatcc gtccgctgtc cgataaaaat accatcgaca aaattatcga acaactggat 300 aaattgaagt ttcagcgcga gcctgaagcg aaagtttcga tgccagonga taacttcgaa 360 cgcaaaaact ttattttagc ggtgttgcag cagttttctg cctgtctgga acacgtgctc 420 cacftcactca atagtgggcc acaa 444 <210> 70 <211> 148 <212> PRT <213> Fells catus <400> 70
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ser His Met Ala 15 10 15
Pro Ala His Arg Leu Gin Pro Ser Asp lie Arg Lys lie lie Leu Glu 20 25 30
Leu Arg Pro Met Ser Lys Gly Leu Leu Gin Asp Tyr Leu Lys Lys Glu 35 40 45 lie Gly Leu Pro Glu Ser Asn His Ser Ser Leu Pro Cys Leu Ser Ser 50 55 60
Asp Ser Gin Leu Pro His lie Asn Gly Ser Ala lie Leu Pro Tyr Phe 65 70 75 80
Arg Ala lie Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn Thr lie Asp Lys lie lie 85 90 95
Glu Gin Leu Asp Lys Leu Lys Phe Gin Arg Glu Pro Glu Ala Lys Val 100 105 110
Ser Met Pro Ala Asp Asn Phe Glu Arg Lys Asn Phe lie Leu Ala Val 115 120 125
Leu Gin Gin Phe Ser Ala Cys Leu Glu His Val Leu Gin Ser Leu Asn 130 135 140
Ser Gly Pro Gin 145 <210> 71 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> sequência mAb da cadeia leve variável felinizada de Mus musculus e Felis catus <400> 71
Glu lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly 15 10 15
Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Ser Vai Ser Phe Ala 20 25 30
Gly Thr Gly Leu Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Vai Pro 35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Vai Pro Ser 50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Arg 85 90 95
Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 72 <211> 333 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> sequência nucleotidica que codifica sequência mAb da cadeia leve variável felinizada de Mus musculus e Felis catus <400> 72 gagattcaaa tgacccagag tcctagctca ctgagcgcat cacccgggga ccgcgtgacc 60 atcacgtgca aggcatctca gtccgtgtca ttcgctggaa ccggtctgat gcactggtat 120 □agcaaaaac cagggaaagt ccctaaactg ctgatctatc gcgcctccaa tcttgaggcc 180 ggggtgccat ctcggttctc tggtagcggc agcggaactg actttaccct gacaatctcc 240 tcactcgagc ctgaagaogc cgccacctac tactgtcaac agtccagaga ataaccatgg 300 acctttggac agggtaccaa gctggagatc aaa 333 <210> 73 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> sequência mAb da cadeia pesada variável felinizada de Mus musculus e Felis catus <400> 73
Asp Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Asn Tyr 20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gin Trp Val 35 40 45
Ala Thr lie Ser Tyr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn lie 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95
Val Arg Gly Tyr Gly Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 74 <211> 354 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> sequência nucleotidica que codifica a sequência mAb da cadeia pesada variável felinizada de Mus musculus e Felis catus <400> 74 gacgtgcaac tggtcgaaag cggaggcgat cttgtgaagc caggtgggag tctccggctc 60 acatgcgtgg cctctggctt tacctacagc aactacggga tgagttgggt tcgccaggca 120 ccaggaaagg gcctgcaatg ggtggccact ataagctatg gtgggtccta tacctactac 180 cctgataata tcaaggggag attaactatt tcecgcgaea atgctaagaa tactctctac 240 ctccagatga atagcctgaa gactgaggat acegetacct actattgegt gcgcggctac 300 ggctacgata ccatggacta ctggggacag ggaacccttg tcactgtctc gage 354 <210> 75 <211> 335
<212> PRT <213> Fells catus <400> 75
Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly 15 10 15
Thr Thr Ser Gly Ala Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Leu Gly Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ala Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Leu Ser Asp Thr 65 70 75 80
Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95
Thr Val Arg Lys Thr Asp His Pro Pro Gly Pro Lys Pro Cys Asp Cys 100 105 110
Pro Lys Cys Pro Pro Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser lie Phe lie 115 120 125
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser lie Ser Arg Thr Pro Glu 130 135 140
Val Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp Val Gin 145 150 155 160 lie Thr Trp Phe Val Asp Asn Thr Gin Val Tyr Thr Ala Lys Thr Ser 165 170 175
Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 180 185 190
Pro lie Leu His Gin Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys 195 200 205
Val Asn Ser Lys Ser Leu Pro Ser Pro lie Glu Arg Thr lie Ser Lys 210 215 220
Ala Lys Gly Gin Pro His Glu Pro Gin Val Tyr Val Leu Pro Pro Ala 225 230 235 240
Gin Glu Glu Leu Ser Arg Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu lie Lys 245 250 255
Ser Phe His Pro Pro Asp lie Ala Val Glu Trp Glu lie Thr Gly Gin 260 265 270
Pro Glu Pro Glu Asn Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gin Leu Asp Ser 275 280 285
Asp Gly Thr Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Arg Ser His 290 295 300
Trp Gin Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His Glu Ala Leu 305 310 315 320
His Ser His His Thr Gin Lys Ser Leu Thr Gin Ser Pro Gly Lys 325 330 335 <210> 76 <211> 1005 <212> ADN <213> Fells catus <400> 76 gcctccacca cggccccatc ggtgttccca ctggccccca gctgcgggac cacatctggc 60 gccaccgtgg ccctggcctg cctggtgtta ggctacttcc ctgagccggt gaccgtgtcc 120 tggaactccg gcgccctgac cagcggtgtg cacaccttcc cggccgtcct gcaggcctcg 180 gggctgtact ctctcagcag catggtgaca gtgccctcca gcaggtggct cagtgacacc 240 ttcacctgca acgtggccca cccgcccagc aacaccaagg tggacaagac cgtgcgcaaa 300 acagaccacc caccgggacc caaaccctgc gactgtccca aatgcccacc ccctgagatg 360 cttggaggac cgtccatctt catcttcccc ccaaaaccca aggacaccct ctcgatttcc 420 cggacgcccg aggtcacatg cttggtggtg gacttgggcc cagatgactc cgatgtccag 480 atcacatggt ttgtggataa cacccaggtg tacacagcca agacgagtcc gcgtgaggag 540 cagttcaaca gcacctaccg tgtggtcagt gtcctcccca tcctacacca ggactggctc 600 aaggggaagg agttcaagtg caaggtcaac agcaaatccc tcccctcccc catcgagagg 660 accatctcca aggccaaagg acagccccac gagccccagg tgtacgtcct gcctccagcc 720 caggaggagc tcagcaggaa caaagtcagt gtgacctgcc tgatcaaatc cttccacccg 780 cctgacattg ccgtcgagtg ggagatcacc ggacagccgg agccagagaa caactaccgg 840 acgaccccgc cccagctgga cagcgacggg acctacttcg tgtacagcaa gctctcggtg 900 gacaggtccc actggcagag gggaaacacc tacacctgct cggtgtcaca cgaagctctg 960 cacagccacc acacacagaa atccctcacc cagtctccgg gtaaa 1005 <210> 77 <211> 110
<212> PRT <213> Fells catus <400> 77
Arg Ser Asp Ala Gin Pro Ser Val Phe Leu Phe Gin Pro Ser Leu Asp 15 10 15
Glu Leu His Thr Gly Ser Ala Ser lie Val Cys lie Leu Asn Asp Phe 20 25 30
Tyr Pro Lys Glu Val Asn Val Lys Trp Lys Val Asp Gly Val Val Gin 35 40 45
Asn Lys Gly lie Gin Glu Ser Thr Thr Glu Gin Asn Ser Lys Asp Ser 50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu Tyr Gin 65 70 75 80
Ser His Glu Lys Phe Ser Cys Glu Val Thr His Lys Ser Leu Ala Ser 85 90 95
Thr Leu Val Lys Ser Phe Asn Arg Ser Glu Cys Gin Arg Glu 100 105 110 <210> 78 <211> 330
<212> ADN <213> Fells catus <400> 78 cggagtgatg ctoagccatc tgtctttctc ttccaaccat ctctggacga gttacataca 60 ggaagtgcct ctatcgtgtg catattgaat gacttctacc ccaaagaggt caatgtcaag 120 tggaaagtgg atggcgtagt ccaaaacaaa ggcatccagg agagcaccac agagcagaac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacga tgtccagtac ggagtaccaa 240 agtcatgaaa agttctcctg cgaggtcact cacaagagcc tggcctccac cctcgtcaag 300 agcttcaaca ggagcgagtg tcagagagag 330
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição • US 6790639 B [0062] • US 6774107 B [0062] • US 6194167 B [0062] • US 5350576 A [0062] • US 6680053 B [0077] • US 20030031671 A [0098] • WO 61510268 A [0200]
Documentos de não patente citados na descrição • OLIVRY et al. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2001, vol. 81, 143-146 [0002] • MARSELLA ; OLIVRY. Clinics in Dermatology, 2003, vol. 21, 122-133 [0002] • SCOTT et al. Canadian Veterinary Journal, 2 0 02, vol. 43, 601-603 [0003] • HILLIER. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2001, vol. 81, 147-151 [0003] • PICCO et al. Vet Dermatol., 2008, vol. 19, 150-155 [0003] • SOUSA; MARSELLA. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2001, vol. 81, 153-157 [0004] • SCHWARTZMAN et al. Clin. Exp. Immunol., 1971, vol. 9, 549-569 [0004] • DILLON et al. Nat Immunol, 2004, vol. 5, 752-60 [0005] • BILSBOROUGH et al. J Allergy Clin Immunol., 2006, vol. 117 (2), 418-25 [0005] • TAKAOKA et al. Eur J. Pharmacol., 2005, vol. 516, 180-181 [0007] • TAKAOKA etal. Exp. Dermatol., 2006, vol. 15, 161-167 [0007] • RAAP et al. J Allergy Clin Immunol., 2008, vol. 122 (2), 421-3 [0007] • SONKOLY et al. J Allergy Clin Immunol, 2006, vol. 117, 411-7 [0008] •NEISetal. J. Allergy Clin . Immunol. , 200 6, vol. 118, 930-937 [0008] • RAAP et al. Exp Dermatol., 2010, vol. 19 (5), 464-6 [0008] • YAGI. International Journal of Molecular Medicine, 2007, vol. 19 (6), 941-946 [0008] • NUTTALL et al. Vet. Immunol. Immunopathol., 2002, vol. 87, 379-384 [0009] • MAEDA et al. Vet. Immunol. Immunopathol.,· 2 0 05, vol. 103, 83-92 [0009] • MAEDA et al. Vet. Immunol. Immunopathol, 2002, vol. 90, 145-154 [0009] • MAEDA et al. J. Vet. Med. Sci., 2008, vol. 70, 51-55 [0009] • CHATTOPADHYAY et al. J Biol Chem, 2007, vol. 282, 3014-26 [0010] • WAI et al. Immunology, 2007, vol. 122, 532-541 [0010] • MIZUNO et al. Vet.Imm., 2009, vol. 131 (1-2), 140-143 [0010] • RABAT et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest. Public Health Service, National Institutes of Health, 1991, 647-669 [0036] • CHOTHIA ; LESK. J. Mol. Biol., 1987, vol. 196, 901-917 [0037] • Remington: The Science and Practice of Pharmacy. Lippincott Williams &amp; Wilkins, 2000 [0061] • The Handbook of Pharmaceutical Excipients. APhA Publications, 2003 [0061] • SAMBROOK et al. MOLECULAR CLONING: LAB. MANUAL. Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001 [0066] • AUSUBEL et al. Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Association/Wiley Interscience, 1993 [0066] • WAHL et al. J. Nucl. Med., 1983, vol. 24, 316-25 [0077] • LATHE et al. J. Molec. Biol., 1985, vol. 183, 1-12 [0088] • BOWIE et al. Science, 1990, vol. 247, 1306-10 [0089] • CUNNINGHAM et al. Science, 1989, vol. 244, 1081-85 [0091] • SMITH et al. J. Mol. Biol., 1992, vol. 224, 899-904 [0091] • DE VOS et al. Science, 1992, vol. 255, 306-12 [0091] • T. E. CREIGHTON. Proteins--Structure and Molecular Properties. W.H. Freeman &amp; Co, 1993 [0093] • WOLD. Posttranslational Covalent Modification of proteins. Academic Press, 1983, 1-12 [0093] • SEIFTERetal. Meth. Enzymol., 1990, vol. 182, 626-46 [0093] • RATTAN et al. Ann. NY Acad. Sci . , 1992, vol. 663, 48-62 [0093] • MANIATIS et al. MOLECULAR CLONING, LAB. MANUAL. Cold Spring Harbor Lab. Press, 1982 [0101] • GRYCZAN. THEMOLEC. BIO. OF THE BACILLI. Academic Press, 1982, 307-329 [0105] • KENDALL etal. J. Bacteriol., 1987, vol. 169, 4177-83 [0105] • CHATER et al. SIXTH INT'L SYMPOSIUM ON ACTINOMYCETALES BIO. Akademiai Kaido, 1986, 45-54 [0105] • JOHN et al. Rev. Infect. Dis., 1986, vol. 8, 693-704 [0105] • IZAKI. Jpn. J. Bacteriol., 1978, vol. 33, 729-42 [0105] • OKAYAMA et al. Mol. Cell. Biol., 1983, vol. 3, 280 [0106] • GORMAN et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1982, vol. 79, 6777 [0106] • GROSSCHEDL et al. Cell, 1985, vol. 41, 885 [0106] • WHITTLE et al. Protein Engin., 1987, vol. 1, 499 [0108] • JOHNSTON et al. Science, 1988, vol. 240, 1538 [0113] • HITZMAN et al. 11th Int 1 Conference on Yeast, Genetics &amp; Molec. Biol., 1982 [0114] • DNA Cloning. IRL Press, 1985, vol. II, 45-66 [0115] • Current Protocols in Immunology. John Wiley &amp; Sons, 1994 [0116] • Current Protocols in Protein Science. John Wiley &amp; Sons, 1997 [0116] • REMINGTON'S PHARMA. SCI. Mack Pub. Co, 1980 [0126] • IMMUNOASSAYS FOR THE 80'S. Univ. Park, 1981 [0135] • WORK et al. LAB. TECHNIQUES &amp; BIOCHEM. 1 N MOLEC. Bio. Holland Pub. Co, 1978 [0141] • CHELIUS et al. Anal Chem., 2006, vol. 78 {1), 2370-6 [0166] • LE SAUX S et al. Biol Chem., 29 January 2010, vol. 285 (5), 3470-7 [0185] • WILLEMSE T. J small Anim Pract, 1986, vol. 27, 771-778 [0196] • PRELAUD et al. Revue de Medecine Veterinaire 19 98, vol. 149, 1057-1064 [0196]

Claims (28)

REIVINDICAÇÕES
1. Um anticorpo isolado que se liga especificamente a IL-31 canina, em que o dito anticorpo reduz, inibe ou neutraliza a sinalização pSTAT mediada por IL-31 canina num ensaio à base de células.
2. 0 anticorpo da reivindicação 1, em que o dito anticorpo é um anticorpo monoclonal.
3. 0 anticorpo da reivindicação 2, em que o anticorpo é quimérico.
4. 0 anticorpo da reivindicação 2, em que o anticorpo é canini zado.
5. 0 anticorpo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou porção que se liga a antigeno do mesmo, que compreende pelo menos um do grupo que consiste em: uma região determinante de complementaridade (CDR)1 da cadeia pesada (VH) variável com a sequência de aminoácidos YYDIN (SEQ ID NO: 1; 11 E12-VH-CDR1), SYDMS (SEQ ID NO: 2; 19D07-VH-CDR1) ou NYGMS (SEQ ID NO: 3; 34D03-VH-CDR1); uma CDR2 da cadeia pesada variável com a sequência de aminoácidos WIFPGDGGTKYNETFKG (SEQ ID NO: 4; 11E12-VH-CDR2), TITSGGGYTYSADSVKG (SEQ ID NO: 5; 19D0 7-VH-CDR2) ou TISYGGSYTYYPDNIKG (SEQ ID NO: 6; 34D03-VH-CDR2); uma CDR3 da cadeia pesada variável com a sequência de aminoácidos ARGGTSVIRDAMDY (SEQ ID NO: 7; 11 E12- VH-CDR3), ARQNWVVGL AY (SEQ ID NO : 8; 1 9D0 7 -VH-CDR3) ou VRGYGYDTMDY (SEQ ID NO: 9; 34D03- VH-CDR3); e uma variante do mesmo com uma ou mais substituições de aminoácidos conservadoras em pelo menos uma de CDRl, CDR2 ou CDR3 .
6. 0 anticorpo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou porção que se liga a antigeno do mesmo, que compreende pelo menos um do grupo que consiste em: uma cadeia leve variável (VL) que compreende uma região determinante de complementaridade (CDR) 1 com a sequência de aminoácidos RASESVDNYGISFMH (SEQ IDNO:10; 11E12-VL-CDRl), KSSQSLLNSGNOKNYLA (SEQ ID NO: 11; 19D07-VL-CDRl) ou KASQSVSFAGTGLMH (SEQ ID NO: 12; 34D03-VL-CDR1) ; uma CDR2 da cadeia leve variável com a sequência de aminoácidos RASNLES (SEQ ID NO: 13; 11E12-VL-CDR2) , GASTRES (SEQ ID NO: 14; 19D07-VL-CDR2) ou RASNLEA (SEQ ID NO: 15; 34D03-VL-CDR2) ; uma CDR3 da cadeia leve variável com a sequência de aminoácidos QQSNKDPLT (SEQ ID NO: 16; 11E12-VL-CDR3) , QNDYSYPYT (SEQ ID NO: 17; 19D0 7-VL-CDR3) ou QQSREYPWT (SEQ ID NO: 18; 34D03-VL-CDR3) ; e uma variante do mesmo com uma ou mais substituições de aminoácidos conservadoras em pelo menos uma de CDRl, CDR2 ou CDR3.
7 . 0 anticorpo da reivindicação 6 que compreende ainda pelo menos um do grupo que consiste em: uma região determinante de complementaridade (CDR)1 da cadeia pesada variável com a sequência de aminoácidos YYDIN (SEQ ID NO: 1; 11 E12-VH-CDR1) , SYDMS (SEQ ID NO: 2; 19D07-VH-CDR1) ou NYGMS (SEQ ID NO: 3; 34D03-VH-CDR1); uma CDR2 da cadeia pesada variável com a sequência de aminoácidos WIFPGDGGTKYNETFKG (SEQ ID NO: 4; 11 E12-VH-CDR2), TITSGGGYTYSADSVKG (SEQ ID NO: 5; 19D07-VH-CDR2) ou TISYGGSYTYYPDNIKG (SEQ ID NO: 6; 34D03-VH-CDR2); uma CDR3 da cadeia pesada variável com a sequência de aminoácidos ARGGTSVIRDAMDY (SEQ ID NO: 7; 11E12- VH-CDR3), ARQNWVVGL AY (SEQ ID NO : 8; 1 9D0 7 -VH-CDR3) ou VRGYGYDTMDY (SEQ ID NO: 9; 34D03- VH-CDR3); e uma variante do mesmo com uma ou mais substituições de aminoácidos conservadoras em pelo menos uma de CDRl, CDR2 ou CDR3 .
8 . 0 anticorpo da reivindicação 7 que compreende pelo menos um do grupo que consiste em: a) uma cadeia leve variável que compreende DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASN LE SGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVETDDVATYYCQQSNKDPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 19; MU-11 E12- VL), DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASN LE SGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQSNKDPLTFGAGTKLEIK (SEQ ID NO: 20; CAN-11 E12- VL-cUn-FW2), DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASESVDNYGISFMHWFQQKPGQSPQLLIYRASN LE SGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQSNKDPLTFGAGTKLEIK (SEQ ID NO: 21; CAN-11 El2- VL-cUn-13), DIVMSQSPSSLSVSAGDKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPWQPPKLLIYGA STRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 22; MU- 19D07-VL), EIVMTQSPASLSLSQEEKVTITCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQAPKLLIYGA ST RESGVPSRFSGSGSGTDFSFTISSLEPEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 23; CAN- 19D07-VL-998-1), DILLTQSPASLAVSLGQRAIISCKASQSVSFAGTGLMHWYQQKPGQQPKLLIYRASN LE AGVPTRFSGSGSRTDFTLNIHPVEEEDAATYFCQQSREYPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 24; MU-34D03- VL) ou EIVMTQSPASLSLSQEEKVTITCKASQSVSFAGTGLMHWYQQKPGQAPKLLIYRASN LE AGVPSRFSGSGSGTDFSFTISSLEPEDVAVYYCQQSREYPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 25; CAN-34D03- VL-998-1); b) uma cadeia pesada variável que compreende QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFKYYDINWVRQRPEQGLEWIGWIFPGDGG TKYNETFKGKATLTTDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYFCARGGTSVIRDAMDYWGQG T SVTVSS (SEQ ID NO: 26; MU-11E12-VH), EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFKYYDINWVRQAPGAGLDWMGWIFPGDG GTKYNETFKGRVTLTADTSTSTAYMELSSLRAGDIAVYYCARGGTSVIRDAMDYWGQ G TLVTVSS (SEQ ID NO: 27; CAN-11E12-VH-415-1), EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQIPEKRLEWVATITSGGGY τ YSADSVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRSEDTAVYYCARQWVVGLAYWGQGTLVT VSA (SEQ ID NO: 28; MU-19D07-VH), EVQLVESGGDLVKPGGSLRLSCVASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLQWVATITSGGGY TYSADSVKGRFTISRDNARNTLYLQMNSLRSEDTAVYYCARQNWVVGLAYWGQGTLV TVSS (SEQ ID NO: 29; CAN-19D07-VH-400-1), EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFSFSNYGMSWVRQTPDKRLEWVATISYGGSY TYYPDNIKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCVRGYGYDTMDYWGQGTSV TVSS (SEQ ID NO: 30; MU-34D03-VH) ou EVQLVESGGDLVKPGGSLRLSCVASGFTFSNYGMSWVRQAPGKGLQWVATISYGGS YTYYPDNIKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCVRGYGYDTMDYWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 31; CAN-34D03-VH-568-1); e c) variantes do mesmo com uma ou mais substituições de aminoácidos conservadoras.
9. O anticorpo de qualquer uma das reivindicações anteriores em que o anticorpo compreende pelo menos um do grupo que consiste em: a) uma cadeia leve variável que compreende DILLTQSPASLAVSLGQRAIISCKASQSVSFAGTGLMHWYQQKPGQQPKLLIYRASN LE AGVPTRFSGSGSRTDFTLNIHPVEEEDAATYFCQQSREYPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 24; MU-34D03- VL) ou EIVMTQSPASLSLSQEEKVTITCKASQSVSFAGTGLMHWYQQKPGQAPKLLIYRASN LE AGVPSRFSGSGSGTDFSFTISSLEPEDVAVYYCQQSREYPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 25; CAN-34D03- VL-998-1); b) uma cadeia pesada variável que compreende EVQLVESGGDLVKPGGSLRLSCVASGFTFSNYGMSWVRQAPGKGLQWVATISYGGS YTYYPDNIKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCVRGYGYDTMDYWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 31; CAN-34D03-VH-568-1); e EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFSFSNYGMSWVRQTPDKRLEWVATIS YGGSYTYYPDNIKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCVRGYGYDTMDYWG QGTSVTVSS (SEQ ID NO: 30; MU-34D03-VH) ou c) variantes do mesmo com uma ou mais substituições de aminoácidos conservadoras.
10. Uma composição veterinária que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
11. Uma célula hospedeira que produz um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
12. Um ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, que compreende uma sequência de ácido nucleicos que codifica pelo menos um do grupo que consiste em: uma região determinante de complementaridade (CDR)1 da cadeia pesada (VH) variável com a sequência de aminoácidos YYDIN (SEQ ID NO: 1; 11 E12-VH-CDR1), SYDMS (SEQ ID NO: 2; 19D07-VH-CDR1) ou NYGMS (SEQ ID NO: 3; 34D03-VH-CDR1); uma CDR2 da cadeia pesada variável com a sequência de aminoácidos WIFPGDGGTKYNETFKG (SEQ ID NO: 4; 11 E12-VH-CDR2), TITSGGGYTYSADSVKG (SEQ ID NO: 5; 19D07-VH-CDR2) ou TISYGGSYTYYPDNIKG (SEQ ID NO: 6; 34D03-VH-CDR2); uma CDR3 da cadeia pesada variável com a sequência de aminoácidos ARGGTSVIRDAMDY (SEQ ID NO: 7; 11E12- VH-CDR3), ARQNWVVGL AY (SEQ ID NO : 8; 1 9D0 7 -VH-CDR3) ou VRGYGYDTMDY (SEQ ID NO: 9; 34D03- VH-CDR3); e uma variante do mesmo com uma ou mais substituições de aminoácidos conservadoras em pelo menos uma de CDRl, CDR2 ou CDR3, e que compreende ainda uma sequência de ácido nucleicos que codifica pelo menos um do grupo que consiste em: uma cadeia leve variável (VL) que compreende uma região determinante de complementaridade (CDR)1 com a sequência de aminoácidos RASESVDNYGISFMH (SEQ ID NO: 10; 11 E12-VL-CDR1), KSSQSLLNSGNQKNYLA (SEQ ID NO: 11; 19D07-VL-CDR1) ou KASQSVSFAGTGLMH (SEQ ID NO: 12; 34D03-VL-CDR1); uma CDR2 da cadeia leve variável com a sequência de aminoácidos RASNLES (SEQ ID NO: 13; 11E12-VL-CDR2) , GASTRES (SEQ ID NO: 14; 19D07-VL-CDR2) ou RASNLEA (SEQ ID NO: 15; 34D03-VL-CDR2) ; uma CDR3 da cadeia leve variável com a sequência de aminoácidos QQSNKDPLT (SEQ ID NO: 16; 11E12-VL- CDR3) , QNDYSYPYT (SEQ ID NO: 17; 19D07-VL-CDR3) ou QQSREYPWT (SEQ ID NO: 18; 34D03-VL- CDR3); e uma variante do mesmo com uma ou mais substituições de aminoácidos conservadoras em pelo menos uma de CDRl, CDR2 ou CDR3.
13. Um vetor que compreende o ácido nucleico da reivindicação 12 .
14 . Um método de produzir um anticorpo que compreende cultivar a célula hospedeira da reivindicação 11 em condições que resultam na produção do anticorpo e isolar o anticorpo da célula hospedeira ou meio de cultura da célula hospedeira.
15. Um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 para utilização em terapêutica.
16. Um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 para utilização no tratamento de uma condição patológica ou distúrbio selecionado de uma condição patológica pruritica ou uma condição patológica alérgica, em que o tratamento compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
17. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 para a utilização de acordo com a reivindicação 16 em que a condição patológica pruritica é selecionada do grupo que consiste em dermatite atópica, eczema, psoríase, escleroderma e prurite.
18. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 para a utilização de acordo com a reivindicação 17 em que a condição patológica pruritica é dermatite atópica.
19. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 para a utilização de acordo com a reivindicação 18 em que a condição patológica prurítica é caracterizada por comichão.
20. O anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 para a utilização de acordo com a reivindicação 16 em que a condição patológica alérgica é selecionada do grupo que consiste em dermatite alérgica, eczema estival, urticária, arquejos, doença inflamatória das vias respiratórias, obstrução recorrente das vias respiratórias, hiperresponsividade das vias aéreas, doença pulmonar de obstrução crónica e processos inflamatórios que resultam de autoimunidade.
21. Um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 para utilização no tratamento de um cão em necessidade do mesmo inibindo a atividade de IL-31.
22 . Um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 20, no qual a quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo é administrada num intervalo de dosagem de 0,1 - lOmg de anticorpo por kg de peso corporal, quinzenal ou mensalmente.
23. Um anticorpo para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 22 em que o anticorpo designado aqui como CAN34D03-65 é administrado por via subcutânea a 1, 0 mg/kg, em que CAN34D03-65 é representado pela SEQ ID NO: 31 (VH) emparelhada com SEQ ID NO: 25 (VL) na SEQ ID NO:42 (HC-65) e SEQ ID NO: 44 (LC-k).
24. Um método de detetar ou quantificar IL-31 numa amostra, compreendendo o método: (a) incubar uma amostra clinica ou biológica que contém IL-31 na presença de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9; e (b) detetar o anticorpo que está ligado a IL-31 na amostra.
25. 0 método da reivindicação 24, em que o anticorpo é marcado de forma detetável.
26. 0 método da reivindicação 25, em que o anticorpo não é marcado e é utilizado em combinação com um segundo anticorpo que é marcado de forma detetável.
27 . Um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 que se liga especificamente a uma região entre os resíduos de aminoácidos 95 e 125 da sequência de aminoácidos IL-31 canina de SEQ ID NO: 32.
28 . 0 anticorpo da reivindicação 27, em que o anticorpo se liga especificamente a uma região entre os resíduos de aminoácidos 102 e 122 da sequência IL-31 canina de SEQ ID NO: 32.
PT127485472T 2011-07-21 2012-07-05 Anticorpo monoclonal contra interleucina-31 canina PT2734549T (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161510268P 2011-07-21 2011-07-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PT2734549T true PT2734549T (pt) 2017-08-29

Family

ID=46704979

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT171685746T PT3219729T (pt) 2011-07-21 2012-07-05 Anticorpo monoclonal contra interleucina-31
PT127485472T PT2734549T (pt) 2011-07-21 2012-07-05 Anticorpo monoclonal contra interleucina-31 canina

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT171685746T PT3219729T (pt) 2011-07-21 2012-07-05 Anticorpo monoclonal contra interleucina-31

Country Status (24)

Country Link
US (6) US8790651B2 (pt)
EP (4) EP3653645B1 (pt)
JP (1) JP6022563B2 (pt)
KR (2) KR101742928B1 (pt)
CN (2) CN103890009B (pt)
AR (1) AR087281A1 (pt)
AU (2) AU2012285432C1 (pt)
BR (1) BR112014001407A8 (pt)
CA (2) CA2842475C (pt)
CY (2) CY1119475T1 (pt)
DK (2) DK3653645T3 (pt)
ES (2) ES2638340T3 (pt)
HR (2) HRP20171198T1 (pt)
HU (2) HUE034282T2 (pt)
LT (2) LT2734549T (pt)
ME (1) ME02837B (pt)
MX (1) MX349053B (pt)
PL (2) PL2734549T3 (pt)
PT (2) PT3219729T (pt)
RS (2) RS56268B1 (pt)
SI (2) SI3219729T1 (pt)
UY (1) UY34206A (pt)
WO (1) WO2013011407A1 (pt)
ZA (1) ZA201400768B (pt)

Families Citing this family (127)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004045512A2 (en) * 2002-11-15 2004-06-03 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against cd25
SI3345607T1 (sl) 2006-12-29 2023-03-31 Ossifi-Mab Llc Postopki spreminjanja rasti kosti z dajanjem antagonista ali agonista SOST ali WISE
SG178789A1 (en) * 2007-02-16 2012-03-29 Merrimack Pharmaceuticals Inc Antibodies against erbb3 and uses thereof
WO2009071696A2 (en) 2007-12-07 2009-06-11 Zymogenetics, Inc. Humanized antibody molecules specific for il-31
SG185465A1 (en) * 2010-05-14 2012-12-28 Amgen Inc High concentration antibody formulations
AU2011268229B2 (en) 2010-06-18 2015-04-16 Xbiotech Inc. Arthritis treatment
EP4303236A3 (en) * 2010-11-30 2024-03-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
US8790651B2 (en) 2011-07-21 2014-07-29 Zoetis Llc Interleukin-31 monoclonal antibody
CN107043424B (zh) 2012-08-21 2021-03-16 詹森药业有限公司 利培酮的抗体及其用途
CN104736561B (zh) * 2012-08-21 2018-06-12 詹森药业有限公司 帕潘立酮的抗体及其用途
AU2013322628B2 (en) * 2012-09-26 2017-03-02 Julius-Maximilians-Universitat Wurzburg Monoclonal antibodies to growth and differentiation factor 15 (GDF-15)
CA2893977C (en) * 2012-12-21 2024-02-13 Seattle Genetics, Inc. Anti-ntb-a antibodies and related compositions and methods
EP2983711A4 (en) * 2013-04-08 2016-11-23 Cytodyn Inc FELLINED ANTIBODIES AND METHODS OF TREATING RETROVIRAL INFECTIONS IN FELINES
EP3024851B1 (en) * 2013-07-25 2018-05-09 CytomX Therapeutics, Inc. Multispecific antibodies, multispecific activatable antibodies and methods of using the same
PL3065774T3 (pl) * 2013-11-06 2021-12-13 Janssen Biotech, Inc Przeciwciała anty-ccl17
US11072647B2 (en) * 2013-12-19 2021-07-27 Onsejo Nacional DE Investigation Cientiticay Tecnica TGF-receptor II isoform, fusion peptide, methods of treatment and methods in vitro
US10023636B2 (en) 2013-12-20 2018-07-17 Intervet Inc. Caninized murine antibodies to human PD-1
RU2016129959A (ru) * 2013-12-30 2018-02-02 Эпимаб Биотерепьютикс Инк. Иммуноглобулин с тандемным расположением fab-фрагментов и его применение
US11485787B2 (en) * 2014-02-05 2022-11-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Agents that modulate RGMb-neogenin-BMP signaling and methods of use thereof
US12103962B2 (en) * 2014-02-06 2024-10-01 X4 Pharmaceuticals (Austria) GmbH E. coli specific antibodies
DK3122775T3 (da) * 2014-03-26 2020-02-03 Univ Wuerzburg J Maximilians Monoklonale antistoffer til vækst- og differentieringsfaktor 15 (gdf-15), og anvendelser deraf til behandling af cancer kakeksi og cancer
WO2015196142A1 (en) * 2014-06-20 2015-12-23 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Treatment of congestive heart failure and other cardiac dysfunction using a gdf15 modulator
US9212225B1 (en) * 2014-07-01 2015-12-15 Amphivena Therapeutics, Inc. Bispecific CD33 and CD3 binding proteins
KR102504758B1 (ko) * 2014-07-16 2023-02-28 트랜스진 종양 세포 붕괴성 바이러스와 면역 체크포인트 조절제의 배합물
CA2967222C (en) * 2014-11-12 2023-10-31 Rinat Neuroscience Corp. Inhibitory chimeric antigen receptors
WO2016104657A1 (ja) * 2014-12-26 2016-06-30 橋本 正 癌治療剤
EP3252074A4 (en) 2015-01-30 2018-07-11 Saitama Medical University Anti-alk2 antibody
CN107921104A (zh) * 2015-02-22 2018-04-17 索伦托治疗有限公司 结合cd137的抗体疗法
WO2016156440A1 (en) * 2015-03-31 2016-10-06 Medimmune Limited A novel il33 form, mutated forms of il33, antibodies, assays and methods of using the same
BR112017022101A2 (pt) 2015-04-14 2018-07-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha composição farmacêutica para prevenção e/ou tratamento de dermatite atópica contendo antagonista de il-31 como ingrediente ativo
AU2016248786B2 (en) * 2015-04-14 2022-01-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition for prevention and/or treatment of atopic dermatitis containing lL-31 antagonist as active ingredient
US11424061B2 (en) * 2015-04-14 2022-08-23 Hanchett Entry Systems, Inc. Solenoid assembly actuation using resonant frequency current controller circuit
CA2987037A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Amphivena Therapeutics, Inc. Use of cd33/cd3 bispecific tandem diabodies for the treatment of acute myeloid leukemia (aml)
CN106336459B (zh) * 2015-07-13 2020-12-08 三生国健药业（上海）股份有限公司 抗人白细胞介素-17a单克隆抗体、其制备方法和应用
BR112018009064A8 (pt) * 2015-11-17 2019-02-26 Jiangsu Hengrui Medicine Co anticorpo de pd-l1, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e aplicação médica do mesmo
JP6949025B2 (ja) 2015-12-17 2021-10-13 ヤンセン ファーマシューティカ エヌ．ベー． リスペリドンに対する抗体及びその使用
US20190023786A1 (en) * 2016-01-12 2019-01-24 Palleon Pharmaceuticals Inc. Use of siglec-7 or siglec-9 antibodies for the treatment of cancer
US10946078B2 (en) * 2016-04-27 2021-03-16 Benchmark Animal Health Ltd. Treatment of canine atopic dermatitis
CN107474134B (zh) * 2016-06-08 2021-07-27 苏州康乃德生物医药有限公司 用于结合白细胞介素4受体的抗体
EP3471759A1 (en) * 2016-06-15 2019-04-24 Novartis AG Methods for treating disease using inhibitors of bone morphogenetic protein 6 (bmp6)
UY37325A (es) * 2016-07-14 2018-01-31 Bristol Myers Squibb Company Una Corporacion Del Estado De Delaware Anticuerpos monoclonales que se enlazan a tim3 para estimular respuestas inmunitarias y composiciones que los contienen
MA46098A (fr) 2016-09-01 2019-07-10 Regeneron Pharma Méthodes de prévention ou de traitement de l'allergie par administration d'un antagoniste d'il-4 r
KR102644544B1 (ko) * 2016-09-21 2024-03-11 넥스트큐어 인코포레이티드 Siglec-15를 위한 항체 및 이의 사용 방법
CN110167965A (zh) 2016-11-08 2019-08-23 瑞泽恩制药公司 拮抗瘦素受体的抗原结合蛋白
WO2018089335A1 (en) 2016-11-09 2018-05-17 North Carolina State University Treatment of allergic diseases with chimeric protein
CN110325548B (zh) * 2016-12-21 2023-11-17 美莱奥生物制药第三有限公司 抗硬化蛋白抗体在治疗成骨不全症中的用途
EP3574017A1 (en) * 2017-01-27 2019-12-04 Kymab Limited Anti-opg antibodies
MX2019009798A (es) * 2017-02-16 2020-01-30 Xbiotech Inc Tratamiento de la hidradenitis supurativa.
WO2018156250A1 (en) * 2017-02-21 2018-08-30 Remd Biotherapeutics, Inc. Cancer treatment using antibodies that bind cytotoxic t-lymphocyte antigen-4 (ctla-4)
WO2018156367A1 (en) * 2017-02-24 2018-08-30 Kindred Biosciences, Inc. Anti-il31 antibodies for veterinary use
WO2018156180A1 (en) 2017-02-24 2018-08-30 Kindred Biosciences, Inc. Anti-il31 antibodies for veterinary use
JP7314115B2 (ja) * 2017-03-31 2023-07-25 セレクティス ソシエテ アノニム ユニバーサル抗ｃｄ２２キメラ抗原受容体操作免疫細胞
CN110650976B (zh) * 2017-04-13 2024-04-19 赛罗帕私人有限公司 抗SIRPα抗体
MY200912A (en) * 2017-05-26 2024-01-23 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Biopharmaceutical Compositions and Related Methods
CA3064298A1 (en) * 2017-06-01 2018-12-06 Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. Anti-cd40 antibody, antigen binding fragment thereof and medical use thereof
TWI726228B (zh) * 2017-08-09 2021-05-01 國立臺灣大學 Ｃｄ１４拮抗分子用於治療癌症
JP2020531438A (ja) * 2017-08-16 2020-11-05 ドラゴンフライ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｎｋｇ２ｄ、ｃｄ１６、およびｅｇｆｒ、ｈｌａ−ｅ、ｃｃｒ４、またはｐｄ−ｌ１に結合するタンパク質
MX2020003219A (es) * 2017-09-21 2020-07-20 Imcheck Therapeutics Sas Anticuerpos que tienen especificidad para btn2 y usos de los mismos.
RU2698048C2 (ru) * 2017-10-03 2019-08-21 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО К IL-5Rα
WO2019086694A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Geert Mudde Il31 antigen and vaccine
WO2019104157A1 (en) * 2017-11-21 2019-05-31 The University Of Vermont And State Agricultural College Highly specific zika neutralizing human antibodies
WO2019118512A2 (en) * 2017-12-11 2019-06-20 Ubi Ip Holdings Peptide immunogens of il-31 and formulations thereof for the treatment and/or prevention of atopic dermatitis
US11834500B2 (en) 2017-12-18 2023-12-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecific antigen binding molecules that bind leptin receptor and/or GP130, and methods of use thereof
CN109957026A (zh) * 2017-12-22 2019-07-02 成都恩沐生物科技有限公司 共价多特异性抗体
AU2019218136A1 (en) 2018-02-08 2020-08-13 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibody variable domains targeting the NKG2D receptor
JP2021512917A (ja) * 2018-02-09 2021-05-20 ガルデルマ ホールディング エスエー 中等度から重度の掻破痕を有するアトピー性皮膚炎の治療におけるネモリズマブ
BR112020017715A2 (pt) 2018-03-16 2020-12-29 Zoetis Services Llc Vacinas de peptídeo contra interleucina-31
EP3765500A2 (en) 2018-03-16 2021-01-20 Zoetis Services LLC Interleukin-31 monoclonal antibodies for veterinary use
WO2019177138A1 (ja) * 2018-03-16 2019-09-19 国立大学法人滋賀医科大学 異常ｔｄｐ－４３を分解除去する抗体断片
US12060437B2 (en) 2018-03-23 2024-08-13 North Carolina State University Methods and compositions for antibody to high affinity receptor for IgE
KR20200141461A (ko) * 2018-04-06 2020-12-18 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 렙틴 수용체 작용제 항체를 사용한 치료 방법
AU2019267050B2 (en) * 2018-05-09 2024-09-12 Good T Cells, Inc. Epitope of regulatory T cell surface antigen and antibody specifically binding thereto
CA3100818A1 (en) * 2018-06-13 2019-12-19 Kymab Limited Treatments etc
TWI822815B (zh) * 2018-07-14 2023-11-21 財團法人生物技術開發中心 抗-人類ｐｄ-ｌ１之抗體及其用途
BR112021003173A2 (pt) * 2018-08-20 2021-05-11 Pfizer Inc. anticorpos anti-gdf15, composições e métodos de uso
PE20211072A1 (es) * 2018-09-28 2021-06-09 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Moleculas de union a antigeno capaces de unirse al cumulo de diferenciacion 3 (cd3) y al cumulo de diferenciacion 137 (cd137) pero no simultaneamente
WO2020077120A1 (en) * 2018-10-10 2020-04-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University BLOCKADE OF RGMb FOR TREATING INFLAMMATORY BOWEL DISEASE AND COLITIS
CA3120474A1 (en) * 2018-12-21 2020-06-25 23Andme, Inc. Anti-il-36 antibodies and methods of use thereof
EP3902921A1 (en) * 2018-12-29 2021-11-03 berYsol GmbH Selenium binding protein 1 detection from body fluids for diagnosis of peracute tissue damage
CN113544153A (zh) * 2019-01-03 2021-10-22 因外泰克斯公司 用于增加治疗剂在犬中的半衰期的组合物及使用方法
JP2022526738A (ja) * 2019-03-21 2022-05-26 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド アレルギーを治療するためのｉｌ－４／ｉｌ－１３経路阻害剤と形質細胞除去の組み合わせ
CA3131705A1 (en) * 2019-03-27 2020-10-01 Umc Utrecht Holding B.V. Engineered iga antibodies and methods of use
AU2020268619A1 (en) * 2019-05-03 2021-12-16 National University Of Singapore Treatment and prevention of metabolic diseases
CN110283246A (zh) * 2019-06-20 2019-09-27 长春西诺生物科技有限公司 一种抗猫细小病毒的猫源化基因工程抗体
AU2020329191A1 (en) * 2019-08-12 2022-03-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Macrophage stimulating 1 receptor (MST1R) variants and uses thereof
JP2022545585A (ja) * 2019-08-27 2022-10-28 エルピサイエンス（スーチョウ）・バイオファーマ，リミテッド 新規の抗ｃｄ３９抗体
CA3114467C (en) * 2019-08-29 2024-06-11 Remegen Co., Ltd. Anti pd-l1 antibody and use thereof
US11890353B2 (en) * 2019-10-15 2024-02-06 Northwestern University Anti-polyethylene glycol (PEG) antibody mouse model for rigorous assessment of PEG-based therapies
BR112022006590A2 (pt) * 2019-11-20 2022-06-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Preparação contendo anticorpos
US20230002485A1 (en) * 2019-12-06 2023-01-05 Korea Atomic Energy Research Institute Anti-tm4sf4 antibody and uses thereof
WO2021123094A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Intervet International B.V. Bispecific caninized antibodies and bispecific binding partners for treating atopic dermatitis
AU2020407853A1 (en) 2019-12-20 2022-06-09 Intervet International B.V. Antibodies to canine interleukin-4 receptor alpha
US11987640B2 (en) * 2020-04-07 2024-05-21 Fred Hutchinson Cancer Center Anti-mesothelin antigen-binding molecules and uses thereof
IL297290A (en) 2020-04-17 2022-12-01 Zoetis Services Llc Feline antibody variants
WO2021212081A1 (en) 2020-04-17 2021-10-21 Zoetis Services Llc Canine antibody variants
KR20230005268A (ko) * 2020-04-24 2023-01-09 밀레니엄 파머슈티컬스 인코퍼레이티드 항-cd19 항체 및 이의 용도
TWI800824B (zh) * 2020-05-08 2023-05-01 大陸商亘喜生物科技（上海）有限公司 一種抗cd19抗體的抗體及其製備和應用
MX2022014150A (es) 2020-05-11 2023-02-27 Invetx Inc Composiciones para aumentar la semivida de un agente terapeutico en caninos y metodos de uso.
AU2021277398A1 (en) * 2020-05-22 2023-02-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating eosinophilic esophagitis by administering an IL-4R inhibitor
WO2022010652A1 (en) 2020-07-10 2022-01-13 Invetx Inc. Compositions for increasing half-life of a therapeutic agent in felines and methods of use
KR20230061390A (ko) * 2020-08-05 2023-05-08 신테카인, 인크. Il27 수용체 결합과 관련된 조성물 및 방법
US12018085B2 (en) 2020-08-05 2024-06-25 Synthekine, Inc. Interferon-gamma R2 (IFNGR2) binding molecules comprising single-domain antibodies and method of use thereof to treat autoimmune and inflammatory diseases
GB202012331D0 (en) 2020-08-07 2020-09-23 Petmedix Ltd Therapeutic antibodies
FR3113458B1 (fr) 2020-08-21 2022-10-14 Purally Composition comprenant au moins un flavonoide glycosyle et son utilisation en cosmetique ou dermatologie
CN116323666A (zh) * 2020-08-21 2023-06-23 建新公司 Fgfr3抗体和使用方法
AU2021349301A1 (en) 2020-09-28 2023-08-24 Zoetis Services Llc Canine antibody variants
AR123645A1 (es) 2020-09-29 2022-12-28 Zoetis Services Llc Variantes de anticuerpos felinos
MX2023004438A (es) 2020-10-15 2023-05-08 Intervet Int Bv Anticuerpos de rata caninizados para el receptor alfa de interleucina-31 canino.
TW202221039A (zh) 2020-10-19 2022-06-01 美商碩騰服務公司 犬及貓抑瘤素Ｍ受體β之抗體及其用途
WO2022094009A1 (en) * 2020-10-30 2022-05-05 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy Single domain antibodies to sars-cov-2 nucleocapsid protein
US20220144956A1 (en) * 2020-11-06 2022-05-12 Xencor, Inc. HETERODIMERIC ANTIBODIES THAT BIND TGFbetaRII
AU2021383841A1 (en) * 2020-11-23 2023-06-22 Scout Bio, Inc. Antigen-binding molecules and uses thereof
IL303732A (en) * 2020-12-18 2023-08-01 Zoetis Services Llc Mutations in constant regions in feline antibodies
JP2024505072A (ja) 2021-01-28 2024-02-02 ゾエティス・サービシーズ・エルエルシー イヌ科動物抗体の定常領域における変異
KR20230136172A (ko) 2021-01-29 2023-09-26 바이엘 애니멀 헬스 게엠베하 자기-관용을 파괴하기 위한 백신 조성물
BR112023016043A2 (pt) 2021-02-22 2023-12-05 Zoetis Services Llc Modelo de prurido induzido por il-31 de cavalo
EP4313309A1 (en) * 2021-03-22 2024-02-07 Novimmune S.A. Bispecific antibodies targeting cd47 and pd-l1 and methods of use thereof
WO2022204316A2 (en) * 2021-03-24 2022-09-29 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for cd3
US20220348669A1 (en) * 2021-04-23 2022-11-03 Astrazeneca Ab Treatment of lupus nephritis
WO2023021170A2 (en) 2021-08-20 2023-02-23 Intervet International B.V. Fusion proteins for treating atopic dermatitis
MX2024007090A (es) 2021-12-16 2024-08-22 Intervet Int B V Anticuerpos caninizados para el receptor alfa ii de interleucina-31 canino.
AU2023219227A1 (en) 2022-02-09 2024-08-01 Petmedix Ltd Therapeutic antibodies
WO2023161526A1 (en) 2022-02-28 2023-08-31 Tridem Bioscience Gmbh & Co Kg A CONJUGATE CONSISTING OF OR COMPRISING AT LEAST A ß-GLUCAN OR A MANNAN
WO2024057096A1 (en) 2022-09-14 2024-03-21 Ceva Sante Animale Treatment of atopic dermatitis using self-replicating rna expressing il-31
CN115505575B (zh) * 2022-11-16 2023-03-24 中国科学院天津工业生物技术研究所 两株分泌犬il-31单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
WO2024170486A1 (en) 2023-02-13 2024-08-22 Intervet International B.V. Canine antibodies to canine il-4
WO2024170485A1 (en) 2023-02-13 2024-08-22 Intervet International B.V. Canine antibodies to canine il-13

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5350576A (en) 1991-09-13 1994-09-27 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolates for controlling acarides
US6194167B1 (en) 1997-02-18 2001-02-27 Washington State University Research Foundation ω-3 fatty acid desaturase
EP1082432A2 (en) * 1998-05-29 2001-03-14 Heska Corporation Canine and feline immunoregulatory proteins, nucleic acid molecules, and uses thereof
US6774107B1 (en) 1999-03-18 2004-08-10 Merck Patent Gmbh Protein for blocking platelet adhesion
US6790639B2 (en) 2000-02-29 2004-09-14 Pfizer Inc. Mammalian osteoregulins
US6989145B2 (en) 2000-03-03 2006-01-24 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Recombinant antibody and antibody fragment
KR100419555B1 (ko) 2000-05-29 2004-02-19 주식회사유한양행 비형간염바이러스의 에스-표면항원을 인식하는단일클론항체의 가변영역 및 이를 코딩하는 유전자
US6818444B2 (en) * 2000-08-04 2004-11-16 Heska Corporation Canine and feline proteins, nucleic acid molecules and uses thereof
US20030031671A1 (en) 2001-08-01 2003-02-13 Sydney Welt Methods of treating colon cancer utilizing tumor-specific antibodies
WO2003060080A2 (en) * 2001-12-21 2003-07-24 Idexx Laboratories, Inc. Canine immunoglobulin variable domains, caninized antibodies, and methods for making and using them
ES2377188T3 (es) * 2002-01-18 2012-03-23 Zymogenetics, Inc. Nuevo ligando de citocina ZCYTOR17
US20040208870A1 (en) 2003-01-30 2004-10-21 Medimmune, Inc. Stabilized high concentration anti-integrin alphanubeta3 antibody formulations
CA2522894C (en) * 2003-05-31 2013-06-25 Micromet Ag Pharmaceutical composition comprising a bispecific antibody specific for epcam
AR049390A1 (es) 2004-06-09 2006-07-26 Wyeth Corp Anticuerpos contra la interleuquina-13 humana y usos de los mismos
AU2006207945B2 (en) 2005-01-28 2012-02-09 Zymogenetics, Inc. Homogeneous preparations of IL-31
WO2008021976A2 (en) 2006-08-09 2008-02-21 Baylor Research Institute Anti-interferon alpha monoclonal antibodies and methods for use
MX2007009577A (es) 2005-02-14 2008-01-30 Zymogenetics Inc Metodos para predecir respuesta terapeutica en dermatitis atopica a antagonistas del il-31.
JP2008530132A (ja) 2005-02-14 2008-08-07 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド Ｉｌ−３１ｒａアンタゴニストを用いて皮膚障害を治療する方法
US20070098715A1 (en) * 2005-03-25 2007-05-03 Seth Ettenberg Antibodies against the tenascin major antigens
EP2301969B1 (en) 2005-05-06 2015-12-23 ZymoGenetics, Inc. IL-31 monoclonal antibodies and methods of use
AU2007254715B2 (en) 2005-05-06 2013-08-29 Zymogenetics, Inc. Methods of treating pain and inflammation in neuronal tissue using IL-31 antagonists
US8101183B2 (en) * 2005-05-06 2012-01-24 Zymogentics, Inc. Variable region sequences of IL-31 monoclonal antibodies
EP2759549B1 (en) 2006-09-01 2015-08-19 ZymoGenetics, Inc. IL-31 monoclonal antibodies and methods of use
CN101588816B (zh) 2006-10-19 2013-06-19 Csl有限公司 白介素-13受体α1的高亲和性抗体拮抗物
WO2009071696A2 (en) 2007-12-07 2009-06-11 Zymogenetics, Inc. Humanized antibody molecules specific for il-31
BRPI0917459B1 (pt) * 2008-08-20 2017-09-12 Zoetis Services Llc N-methyl-1- [trans-4- [methyl (7h-pyrrol [2,3-d] pyridol [2,3-d] pyrimidine compounds, use of these in therapy and crystalline a form of n-methyl- pyrimidin-4-yl) amino] cyclohexyl} methanosulphonamide
WO2010027488A2 (en) 2008-09-04 2010-03-11 Vet Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies
WO2011065935A1 (en) 2009-11-24 2011-06-03 Cornell University Methods for monoclonal antibody production
WO2010117448A2 (en) * 2009-04-05 2010-10-14 Provenance Biopharmaceuticals Corp. Chimeric immunocytokines and methods of use thereof
TW201119676A (en) 2009-10-15 2011-06-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
KR20220017432A (ko) 2010-02-24 2022-02-11 이뮤노젠 아이엔씨 엽산염 수용체 1 항체와 면역접합체 및 이들의 용도
KR101398363B1 (ko) 2010-11-17 2014-05-22 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 혈액응고 제viii 인자의 기능을 대체하는 기능을 갖는 다중특이성 항원 결합 분자
US8790651B2 (en) * 2011-07-21 2014-07-29 Zoetis Llc Interleukin-31 monoclonal antibody
BR112014001052A2 (pt) 2011-07-22 2017-02-21 Glaxosmithkline Biologicals Sa método para reduzir a agregação de uma proteína, uso de uma composição polianiônica, composição, e, método e processo para a produção de uma composição
EP3765500A2 (en) * 2018-03-16 2021-01-20 Zoetis Services LLC Interleukin-31 monoclonal antibodies for veterinary use

Also Published As

Publication number Publication date
EP3219729A1 (en) 2017-09-20
PT3219729T (pt) 2020-10-23
EP3653645A1 (en) 2020-05-20
ZA201400768B (en) 2015-12-23
HUE051068T2 (hu) 2021-01-28
LT3219729T (lt) 2020-11-25
US9206253B2 (en) 2015-12-08
CA2926379A1 (en) 2013-01-24
US20190389944A1 (en) 2019-12-26
KR20140041858A (ko) 2014-04-04
US8790651B2 (en) 2014-07-29
AR087281A1 (es) 2014-03-12
WO2013011407A1 (en) 2013-01-24
UY34206A (es) 2013-02-28
CN103890009A (zh) 2014-06-25
EP3653645B1 (en) 2024-08-21
KR101742928B1 (ko) 2017-06-01
CY1119475T1 (el) 2018-03-07
CN103890009B (zh) 2017-02-15
KR101613024B1 (ko) 2016-04-18
NZ620031A (en) 2016-03-31
CA2842475C (en) 2018-01-02
ES2827231T3 (es) 2021-05-20
DK2734549T3 (en) 2017-09-11
RS60924B1 (sr) 2020-11-30
CY1123791T1 (el) 2022-03-24
JP2014529295A (ja) 2014-11-06
ES2638340T3 (es) 2017-10-19
DK3653645T3 (da) 2024-09-16
SI3219729T1 (sl) 2020-11-30
MX349053B (es) 2017-07-06
MX2014000803A (es) 2014-03-31
EP3219729B1 (en) 2020-09-09
PL2734549T3 (pl) 2017-11-30
US10526405B2 (en) 2020-01-07
US20130022616A1 (en) 2013-01-24
AU2016203590A1 (en) 2016-06-16
LT2734549T (lt) 2017-09-11
KR20160028488A (ko) 2016-03-11
HRP20171198T1 (hr) 2017-10-20
JP6022563B2 (ja) 2016-11-09
CN105504059B (zh) 2020-08-11
US10421807B2 (en) 2019-09-24
ME02837B (me) 2018-01-20
HRP20201634T1 (hr) 2020-12-25
US20190359702A1 (en) 2019-11-28
AU2012285432A1 (en) 2014-01-30
CA2842475A1 (en) 2013-01-24
CN105504059A (zh) 2016-04-20
SI2734549T1 (sl) 2017-10-30
AU2012285432B2 (en) 2016-06-16
US20140286958A1 (en) 2014-09-25
EP3842456B1 (en) 2024-09-18
US20140315251A1 (en) 2014-10-23
EP2734549A1 (en) 2014-05-28
PL3219729T3 (pl) 2021-01-25
BR112014001407A8 (pt) 2022-11-08
AU2012285432C1 (en) 2016-12-22
RU2014101250A (ru) 2015-08-27
HUE034282T2 (en) 2018-02-28
BR112014001407A2 (pt) 2017-03-01
RS56268B1 (sr) 2017-11-30
AU2016203590B2 (en) 2017-12-21
US20190092854A1 (en) 2019-03-28
EP3842456A1 (en) 2021-06-30
EP2734549B1 (en) 2017-05-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10526405B2 (en) IL-31 dog pruritus model
KR102587633B1 (ko) 수의학적 용도를 위한 인터류킨-31 단클론성 항체
KR20200142010A (ko) 인터루킨-31에 대한 펩티드 백신
TW202221039A (zh) 犬及貓抑瘤素Ｍ受體β之抗體及其用途
RU2786441C2 (ru) Пептидные вакцины против интерлейкина-31
RU2795411C2 (ru) Моноклональные антитела к интерлейкину-31 для ветеринарного применения
RU2588462C2 (ru) Моноклональное антитело против интерлейкина-31
NZ620031B2 (en) Interleukin-31 monoclonal antibody