CN106336459B - 抗人白细胞介素-17a单克隆抗体、其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于抗体领域，更具体地，本发明公开了一种重组抗人IL‑17A单克隆抗体、其制备方法和应用。本发明的抗人IL‑17A单克隆抗体能够特异性与人IL‑17A结合，本发明的抗体具有良好的抑制IL‑17A诱导的各种细胞系分泌炎性细胞因子如IL‑6等的效果，可应用于制备治疗免疫介导的炎症反应的疾病的药物。

Description

抗人白细胞介素-17A单克隆抗体、其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及抗体领域，更具体地，本发明公开了一种抗人白细胞介素-17A单克隆抗体、其制备方法和应用。

背景技术

白细胞介素-17(Interleukin 17，IL-17)是一种炎症型细胞因子，主要由辅助性T细胞17(T helper 17，Th17)分泌，其他T细胞及先天性免疫细胞如肥大细胞和嗜中性粒细胞也会分泌一定的IL-17，在多种炎性反应及自身免疫性疾病病理过程中发挥重要作用。IL-17家族成员包括：同源二聚体形式的IL-17A、IL-17F、IL-17B、IL-17C、IL-17D及异源二聚体形式的IL-17A/F、IL-17E/IL-25，此外，还有两个未命名成员。IL-17受体(IL-17receptor，IL-17R)家族包括：IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD及IL-17RE，其中同源二聚体IL-17A与同源二聚体IL-17F及IL-17A/F异源二聚体共同作用于IL-17RA和IL-17RC。在体外，初始T细胞在抗原和共刺激分子的刺激下活化，由转化生长因子-β(transforminggrowth factor-β,TGF-β)、IL-6、IL-23等细胞因子诱导分化Th17，Th17细胞分泌IL-17A、IL-17F细胞因子。IL-17与IL-17R复合物通过信号转导复合体IL-17R-Act1-肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor associated factor6,TRAF6)激活下游NF-κB、c-jun N-端激酶(c-jun N-terminal kinase,JNK)等信号通路，参与炎症反应。

研究表明，IL-17全面参与了自身免疫疾病的各项病理反应[Nat Rev DrugDiscov.2012.11(10):763-76]：IL-17刺激内皮细胞分泌IL-6和IL-8，促使血栓形成；同时诱导上皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞和树突状细胞分泌炎性细胞因子，诱导炎症反应发生；其作用于软骨细胞后，上调一氧化氮的表达，造成软骨破坏；同时诱导成骨细胞分泌核因子κ-B配体受体致活剂(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，RANKL)，促进破骨作用，导致骨损伤。

银屑病又名牛皮癣，是一种慢性炎症性皮肤病，全球发病为1％-3％，在我国发病率为0.1％-0.3％，占全球发病率的10％。目前，尚缺乏长期有效的治疗方法。研究表明，IL-17通路是极佳的银屑病干预靶点，针对IL-17A的抗体在银屑病病人应用12周后，PASI75(银屑病皮损改善达到75％)应答率可达到83.3％[The New England Journal of Medicine,2014,371:326-338.]。市场报告显示，抗IL-17A抗体有望在2018年成为年销售超过10亿美金的重磅炸弹药物。

阻断IL-17A信号通路不但能治疗银屑病，同时也能通过抑制炎性反应从根本上缓解哮喘病人的症状。因此，筛选获得一个高效特异的IL-17A阻断抗体，一直是本领域的技术人员急待解决的问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的发明人进行了大量试验，得到了一个可以通过特异性阻断IL-17A与细胞表面IL-17受体结合从而阻断IL-17A信号传导的单克隆抗体，即本发明的重组抗人IL-17A单克隆抗体，从而完成了本发明。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种抗人IL-17A单克隆抗体。

本发明的第二个目的在于提供编码所述抗人IL-17A单克隆抗体的核酸分子。

本发明的第三个目的在于提供包含所述核酸分子的表达载体。

本发明的第四个目的在于提供包含所述表达载体的宿主细胞。

本发明的第五个目的在于提供一种制备所述抗人IL-17A单克隆抗体的方法。

本发明的第六个目的在于提供包含所述抗人IL-17A单克隆抗体的组合物。

本发明的第七个目的在于提供所述抗人IL-17A单克隆抗体的应用。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明的第一个方面提供了一种抗人IL-17A单克隆抗体，所述抗人IL-17A单克隆抗体包含：(1)重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，和(2)轻链互补决定区CDR1’、CDR2’、CDR3’，所述CDR1’的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述CDR2’的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述CDR3’的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。

优选的，所述抗人IL-17A单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

优选的，所述抗人IL-17A单克隆抗体为抗人IL-17A人源化单克隆抗体，所述抗人IL-17A人源化单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。

本发明的第二个方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码如上所述的抗人IL-17A单克隆抗体。

优选的，所述核酸分子编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

优选的，所述核酸分子编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。

本发明的第三个方面提供了一种表达载体，所述表达载体含有如上所述的核酸分子。

优选的，所述表达载体为pDR1，pcDNA3.1(+)，pDHFF或pCHO 1.0。

更优选的，所述表达载体为pCHO 1.0。

本发明的第四个方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如上所述的表达载体。.

优选的，所述宿主细胞为COS、CHO、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)或TG1。

更优选的，所述宿主细胞为CHO。

本发明的第五个方面提供了一种制备如上所述的抗人IL-17A单克隆抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在表达条件下，培养如上所述的宿主细胞，从而表达抗人IL-17A单克隆抗体；

b)分离并纯化a)所述的抗人IL-17A单克隆抗体。

本发明的第六个方面提供了一种组合物，所述组合物含有如上所述的抗人IL-17A单克隆抗体和药学上可接受的载体。

本发明的第七个方面提供了如上所述的抗人IL-17A单克隆抗体在制备治疗免疫介导的炎症反应的药物中的应用。

优选的，所述免疫介导的炎症反应包括：银屑病，类风湿性关节炎，银屑性关节炎，强直性脊柱炎，多发性硬化，哮喘，葡萄膜炎，白塞氏葡萄膜炎，干眼症，慢性自发性荨麻疹。

本发明的有益效果：

本发明的抗IL-17A单克隆抗体能够特异性与人IL-17A结合，具有良好的抑制IL-17A诱导的各种细胞系分泌炎性细胞因子如IL-6等的效果，可应用于制备治疗免疫介导的炎症反应的疾病的药物。

附图说明

图1为pCHO 1.0结构示意图。

图2为E.coli表达的IL-17A抗原的蛋白检测电泳图。

图3为八只IL-17A抗原免疫小鼠的滴度检测结果。

图4为抗人IL-17A单克隆抗体对IL-17A结合其受体IL-17R的阻断结果。

图5为抗人IL-17A单克隆抗体抑制IL-17A对Hela细胞的IL-6表达的诱导结果。

具体实施方式

本发明中，任何合适的表达载体都可以使用，可以为pDR1，pcDNA3.1(+)，pDHFF及pCHO 1.0之一，表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。

本发明中，可用的宿主细胞为含有上述表达载体的细胞，可以是真核细胞，如哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统均可用于本发明的融合蛋白的表达，COS，CHO(中国仓鼠卵巢，Chinese Hamster Ovary)，NS0，sf9及sf21等均可适用于本发明；也可以为含有上述表达载体的原核细胞，可以为DH5α，BL21(DE3)，TG1之一。

本发明中公开的抗人IL-17A单克隆抗体的制备方法包括：在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达抗人IL-17A单克隆抗体；分离和纯化所述的抗人IL-17A单克隆抗体。利用上述方法，可以将重组蛋白纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。

可以利用亲和层析的方法对本发明公开的重组蛋白进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合蛋白多肽。

本发明公开的抗人IL-17A人源化单克隆抗体是通过以下方法得到的：利用实验室制备的IL-17A抗原免疫Balb/c小鼠，在多次免疫小鼠滴度较高后取小鼠脾细胞与杂交瘤细胞融合并筛选出具有抑制IL-17A功能活性的杂交瘤细胞株。更具体地，本发明的发明人通过大量实验，首先分别表达了IL-17A抗原、IL-17RA胞外段。在此基础上利用不同的佐剂与IL-17A抗原混合免疫小鼠，然后进一步将上述小鼠的脾细胞与杂交瘤细胞株sp2/0融合，融合后的杂交瘤利用IL-17A抗原筛选出阳性细胞株，在验证其对IL-17A与IL-17R结合的阻断并确实抑制IL-17A的功能后获得目标细胞株。将目标分子进行人源化改造后，将轻链和重链基因同时克隆到真核表达载体pCHO 1.0中。将此表达载体通过脂质体法转染CHO细胞，然后用嘌呤霉素和甲胺蝶呤筛选阳性细胞克隆。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱分离或纯化抗人IL-17A人源化单克隆抗体。

本发明的发明人对上述的抗人IL-17A单克隆抗体进行了体外、体内生物学实验。体外生物学实验结果表明此抗体能很好地与IL-17A结合。

具体地说，本发明的发明人对上述的抗人IL-17A单克隆抗体进行亲和力检测、阻断IL-17A与IL-17R结合的实验分析、体外细胞功能检测等实验，实验结果表明，本发明公开的抗人IL-17A单克隆抗体可以结合细胞分泌的IL-17A，阻断IL-17A与IL-17R之间的信号传导，抑制了炎症反应的发生。

本发明公开的上述抗人IL-17A单克隆抗体，可以和药学上可以接受的载体一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的抗人IL-17A单克隆抗体的氨基酸核心序列的构像完整性，同时还保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。通常情况下，对于液体制剂，通常可以在2℃-8℃条件下保存至少稳定一年，对于冻干制剂，在30℃至少六个月保持稳定。所述抗人IL-17A单克隆抗体制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂，对于本发明公开的上述抗人IL-17A单克隆抗体的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括但不限于：表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合。其中表面活性剂包括但不限于：非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80)；poloxamer(如poloxamer 188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUAT^TM等，其加入量应使抗人IL-17A单克隆抗体的颗粒化趋势最小。溶液稳定剂包括但不限于以下列举之一或其组合：糖类，例如，还原性糖和非还原性糖；氨基酸类，例如，谷氨酸单钠或组氨酸；醇类，例如：三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇等，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态。等渗调节剂包括但不限于氯化钠、甘露醇之一或其组合。缓冲液包括但不限于：Tris、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一或其组合。

上述制剂为包含抗人IL-17A单克隆抗体的组合物，在对包括人在内的动物给药后，抗免疫介导的炎症反应效果明显。具体地说，对免疫介导的炎症反应的预防和/或治疗有效，可以作为抗炎症药物使用。

本发明所指的免疫介导的炎症反应，包括但不限于：银屑病，类风湿性关节炎，银屑性关节炎，强直性脊柱炎，多发性硬化，哮喘，葡萄膜炎，白塞氏葡萄膜炎，干眼症，慢性自发性荨麻疹。除了上述的炎症相关疾病外，还可用于多发性硬化，克罗恩病，结肠炎，溃疡性结肠炎，系统性红斑狼疮，移植物抗宿主病等。这里不再一一列举。

本发明所称的抗免疫介导的炎症反应药物，指具有抑制和/或治疗免疫介导的炎症反应的药物，可以包括伴随免疫介导的炎症反应相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，它进一步还包括已存在的炎症反应伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还包括减少或防止炎症反应的转移。

本发明中抗人IL-17A单克隆抗体及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是1-1800mg/天。

以下实施例、实验例是对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2ndedition，Cold spring Harbor Laboratory Press。

实施例1 IL-17A抗原、阳性抗体Seckinumab及可溶性IL-17受体胞外段的制备

人IL-17A抗原序列来自于Pubmed(NM_002190.2)，将C端加载6个组氨酸(his)标签的hIL-17A(hIL-17A-histag)氨基酸序列提供给生工生物公司，按照Cricetulus griseus的密码子使用偏好进行密码子优化并合成基因片段，然后亚克隆到pUC57载体(来源自生工生物公司)中，得到了pUC57-hIL-17A-histag。利用AvrII和EcoRV酶切位点将hIL-17A-histag片段从pUC57-hIL-17A-histag载体上酶切下来并构建至pCHO 1.0表达载体(购自Life technologies公司，结构如图1所示)上，获得pCHO 1.0(IL-17A-histag)，然后进行测序，选取序列完全正确的克隆进行转染。

通过脂质体法将pCHO 1.0(IL-17A-histag)载体转染至CHO-S细胞系(购自Lifetechnologies公司)，在含6mM谷氨酰胺(购自Gibco公司)的CD FortiCHO培养基(购自Lifetechnologies公司)中培养2天后用嘌呤霉素和甲胺蝶呤筛选阳性细胞克隆。将3×10⁵阳性克隆细胞接种至200ml/1L摇瓶中，培养基为含6mM谷氨酰胺和1/100体积比的抗凝集试剂(购自Invitrogen公司)的CD FortiCHO培养基，培养12天后，收集上清，利用镍柱纯化IL-17A-histag抗原。纯化后蛋白的电泳图谱见图2，如图2所示，在非还原条件下，蛋白主要以二聚体形式存在(泳道2-4，IL-17A二聚体的分子量约为30KDa)，而在还原条件下，蛋白解聚成单体(泳道6-8，IL-17A单体分子量约为15KDa)。蛋白的定量通过二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)方法进行。纯化得到的蛋白用于以下的小鼠免疫及进一步分析与研究。

根据who.int公布的抗IL-17A单克隆抗体Secukinumab(IgG1，κ)氨基酸序列(参见WHO Drug Information Vol.23,No.4,2009.P342)，经过密码子优化后全基因合成核苷酸序列，克隆到pCHO 1.0表达载体，测序验证确认获得了正确的克隆载体标记为pCHO 1.0(Secukinumab)。将pCHO 1.0(Secukinumab)载体瞬时转染至CHO-S细胞系，培养数天后，利用Protein A亲和层析柱(购自Pharmacia公司)从细胞培养上清中纯化阳性抗体蛋白。

可溶性IL-17受体A胞外段(IL-17receptor A-extracellular domain,IL-17RA-ECD)-Fc融合蛋白的制备方法如下：以IL-17RA基因(购自北京义翘神州公司)为模板，PCR扩增N端第1-288位核苷酸片段，利用甘氨酸丝氨酸(GS)作为人工连接子与人IgG1的恒定区(Fc)片段相连。人IgG1的恒定区序列采用了Secukinumb的恒定区序列。将序列构建至pCHO1.0载体中，获得pCHO 1.0(IL-17RA-ECD-Fc)。然后进行测序，选取序列完全正确的克隆进行稳定转染。转染表达按照IL-17-histag的条件进行。利用Protein A亲和层析柱从细胞培养液上清中纯化获得IL-17RA-ECD-Fc。

实验例2 IL-17A的免疫

50μg/鼠的IL-17A-histag抗原在用生理盐水稀释成75μl后，与等体积的弗氏完全佐剂混合，并经超声乳化完全后对3-4周龄的Balb/c小鼠进行皮下多点注射。三周后，等量蛋白同样稀释成75μl后与等体积弗氏不完全佐剂混合，超声乳化完全后对小鼠进行皮下多点免疫，两周后再次重复此免疫。在最后一次免疫后一周将小鼠进行剪尾取血，利用包被IL-17A-histag抗原的ELISA进行血清滴度的检测。所有小鼠在第三次免疫后一周剪尾取血分离血清用于滴度检测，血清抗体效价>10000时，在最后一次加强免疫两周后进行冲击免疫：尾静脉注射10μg抗原蛋白/100μl生理盐水/鼠。

滴度的检测通过ELISA方法进行：利用IL-17A-histag抗原包被ELISA板，封闭后加入不同浓度的小鼠血清，然后加入HRP标记的兔抗鼠Ig抗体进行检测。图3为8只小鼠的滴度检测结果。

实施例3杂交瘤融合和筛选

小鼠冲击免疫三天后取脾细胞进行融合。

生长状态良好的杂交瘤sp2/0细胞(来源自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)在37℃、5％CO₂孵箱中培养，融合前一天换液。融合与筛选过程如下：取小鼠脾脏，研磨洗涤后计数。按照脾细胞:sp2/0细胞＝10:1混合两种细胞，1500rpm离心7分钟。洗去上清液。1分钟内加入1ml PEG(1450)，轻摇90秒，在2.5分钟内加入无血清DMEM培养液(购自Gibco公司)5ml，再一次性加5ml无血清培养液终止反应，静置5分钟，1280rpm离心8分钟。按照一块96孔板两百万个sp2/0细胞的数量均匀接种入96孔板每孔200μl，先用含次黄嘌呤(hypoxanthine，H)、甲胺蝶呤(aminopterin，A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)的HAT培养基筛选，每3～4天半量换液，第10天改用HT培养基。10天后，待杂交瘤细胞铺满96孔板底部大于10％时，取上清用IL-17A-histag抗原包被的酶标板进行ELISA检测。ELISA检测方法同上。挑选出阳性杂交瘤克隆于24孔板中扩大培养并通过有限稀释法进行亚克隆。获得稳定表达目的抗体的杂交瘤株后进行保种建库。

实施例4抗人IL-17A单克隆抗体对IL-17A结合IL-17RA-ECD-Fc的阻断

用ELISA方法研究鼠源的抗人IL-17A单克隆抗体对IL-17A结合IL-17R的阻断。IL-17A-histag抗原包被酶标板，封闭后同时加入IL-17RA-ECD-Fc和300μl需筛选的鼠源的抗人IL-17A单克隆抗体杂交瘤细胞培养上清，最终加入HRP-羊抗人IgG抗体进行显色检测。结果如图4所示，其中IgG为不相关抗体对照,可以发现候选的10个鼠源的抗人IL-17A单克隆抗体均对IL-17A结合IL-17R有一定的阻断。

实施例5抗人IL-17A单克隆抗体对IL-17A诱导的Hela细胞IL-6分泌的抑制

将第三轮亚克隆后的杂交瘤细胞株进行扩大无血清培养，然后收集细胞上清利用Protein A亲和柱进行抗体纯化。将纯化后的抗体进行定量并验证其功能活性。

在生长状态良好的Hela细胞(来源自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)中加入15ng/ml IL-17A(购自R&D Systems)及不同浓度的鼠源的抗人IL-17A单克隆抗体，每组设立四个复孔，37℃，5％CO₂中孵育培养24小时后收集细胞培养上清，用ELISA试剂盒检测各组细胞分泌IL-6的含量。结果如图5所示。

图5显示了候选的10个鼠源的抗人IL-17A单克隆抗体阻断IL-17A诱导的Hela细胞IL-6分泌的功能活性，可以发现，所评测的抗体大部分效能与阳性抗体Secukinumab相当，挑取mAb2进行进一步的功能分析与应用，其对IL-17A的功能抑制IC50值为74.6ng/ml，而阳性抗体Secukinumab的IC50值为183.6ng/ml。因此，本发明的鼠源的抗人IL-17A单克隆抗体对IL-17A的抑制功能强于Secukinumab。

实施例6抗人IL-17A单克隆抗体亲和力的测定

鼠源的抗人IL-17A单克隆抗体与IL-17A的亲和力通过Biacore 3000检测，将不同浓度的IL-17A通过氨基偶联包被在Biacore 3000的芯片上后，检测抗体的亲和力，阳性抗体Secukinumab作为对照。实验结果见表1，结果表明本发明的鼠源的抗人IL-17A单克隆抗体与IL-17A的亲和力高于阳性抗体Secukinumab。

表1、鼠源的抗人IL-17A单克隆抗体对人IL-17A的亲和力

实施例7抗人IL-17A单克隆抗体序列的测定

使用Trizol(购自上海生工生物)提取mAb2杂交瘤细胞株的总RNA，用逆转录试剂盒(购自Takara公司)将mRNA逆转录成cDNA，以Mouse Ig-Primer Set(购自Novagen公司)为引物通过PCR扩增鼠源的抗人IL-17A单克隆抗体的轻链和重链可变区基因，然后将PCR产物克隆入pMD18-T载体，测序并分析可变区基因序列。结果：重链可变区基因序列全长351bp，编码117个氨基酸残基，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；轻链可变区基因序列全长336bp，编码112个氨基酸残基，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。在GeneBank中对氨基酸序列进行比对分析，二者均符合小鼠IgG可变区基因的特征。

实施例8抗人IL-17A单克隆抗体的人源化

根据Kabat法则对鼠源的抗人IL-17A单克隆抗体轻链和重链可变区氨基酸序列基因进行分析并确定了3个抗原互补决定区(complementarity-determining region,CDR)和4个框架区(frame region,FR)。其中，重链互补决定区的氨基酸序列为CDR1：PIVYMS(SEQID NO：5)、CDR2：DILPSLGRIFYGEKFED(SEQ ID NO：6)和CDR3：GDYGFAY(SEQ ID NO：7)，轻链互补决定区的氨基酸序列为CDR1’：KSSQSLLGSDGKTYLN(SEQ ID NO：8)、CDR2’：LVSKLDS(SEQID NO：9)和CDR3’：WQVTHFPYT(SEQ ID NO：10)。

通过在NCBI IgBlast与人IgG胚系序列(Germline)进行同源性比较，选择IGHV1-69*08为重链CDR移植模板，将鼠源的抗人IL-17A单克隆抗体的CDR区移植入IGHV1-69*08的骨架区，构建成重链的人源化抗体。同样地，经过与人IgG胚系序列同源性比较，选择IGKV2-30*02为轻链CDR移植模板，将鼠源的抗人IL-17A单克隆抗体的CDR区移植入IGKV2-30*02的骨架区，构建成轻链的人源化抗体。优选地，在此基础上，可对骨架区个别位点氨基酸进行优化，优选地，对一些框架区的氨基酸位点进行回复突变，更优选的，对于重链可变区序列，将第24位的A回复为鼠源的D，第26位的G回复为D，第27位的G回复为S，第49位的M回复为I，第71位的I回复为L，第75位的K回复为T，第78位的S回复为N。对于轻链可变区序列，将第41位的F回复为L。最终，人源化后的重链可变区基因序列全长351bp，编码117个氨基酸残基，核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示；人源化后的轻链可变区基因序列全长336bp，编码112个氨基酸残基，核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。

上述可变区基因序列由生工生物按照Cricetulus griseus的密码子使用偏好进行密码子优化并合成。将合成的人源化可变区序列与人IgG1恒定区相连，利用pTT5载体(购自NRC biotechnology Research Institute)分别构建人源化重链、轻链的瞬时表达载体，将人源化的轻链、重链分别及组合利用HEK293系统(购自NRC biotechnology ResearchInstitute)进行瞬时转染并表达抗体。

表达纯化的抗体通过ELISA(参见实施例3)，竞争ELISA(参见实施例4)，及Biacore的方法(参见实施例6)进行抗体亲和力与生物学活性的评价。结果显示，人源化后的抗体对IL-17A的亲和力为42.8pM，与人源化改造前的25.2pM没有显著差异。

Claims (11)

1.一种抗人IL-17A单克隆抗体，其特征在于，所述抗人IL-17A单克隆抗体包含：

(1)重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，和

(2)轻链互补决定区CDR1’、CDR2’、CDR3’，所述CDR1’的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述CDR2’的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述CDR3’的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。

2.如权利要求1所述的抗人IL-17A单克隆抗体，其特征在于，所述抗人IL-17A单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：4所示。

3.如权利要求1所述的抗人IL-17A单克隆抗体，其特征在于，所述抗人IL-17A单克隆抗体为抗人IL-17A人源化单克隆抗体，所述抗人IL-17A人源化单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。

4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1-3中任一项所述的抗人IL-17A单克隆抗体。

5.如权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

6.如权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。

7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有如权利要求4-6中任一项所述的核酸分子。

8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求7所述的表达载体。

9.一种制备如权利要求1-3中任一项所述的抗人IL-17A单克隆抗体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a)在表达条件下，培养如权利要求8所述的宿主细胞，从而表达抗人IL-17A单克隆抗体；

b)分离并纯化a)所述的抗人IL-17A单克隆抗体。

10.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有如权利要求1-3中任一项所述的抗人IL-17A单克隆抗体和药学上可接受的载体。

11.如权利要求1-3中任一项所述的抗人IL-17A单克隆抗体在制备治疗免疫介导的炎症反应的药物中的应用，所述免疫介导的炎症反应包括：银屑病，类风湿性关节炎，银屑性关节炎，强直性脊柱炎，多发性硬化，哮喘，葡萄膜炎，白塞氏葡萄膜炎，干眼症，慢性自发性荨麻疹。

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