CN109311974B

CN109311974B - 抗人白细胞介素-17a单克隆抗体、其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109311974B
Application number: CN201780033670.5A
Authority: CN
Inventors: 张成海; 朱玲巧; 郭锦林; 赵杰; 高宏海; 马琳; 党尉; 杨燕
Original assignee: Sunshine Guojian Pharmaceutical Shanghai Co Ltd
Current assignee: Sunshine Guojian Pharmaceutical Shanghai Co Ltd
Priority date: 2016-06-12
Filing date: 2017-06-09
Publication date: 2021-07-09
Anticipated expiration: 2037-06-09
Also published as: EP3470427A4; CN107488227A; EP3470427A1; JP6883591B2; US10738112B2; US20190161544A1; JP2019525730A; CN109311974A; WO2017215524A1

Abstract

提供了一种抗人IL‑17A单克隆抗体、其制备方法和应用。该抗人IL‑17A单克隆抗体能够特异性与人IL‑17A结合，具有良好的抑制IL‑17A诱导的各种细胞系分泌炎性细胞因子如IL‑6等的效果，可应用于制备治疗免疫介导的炎症反应的疾病的药物。

Description

抗人白细胞介素-17A单克隆抗体、其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及抗体领域，更具体地，本发明公开了一种抗人白细胞介素-17A单克隆抗体、其制备方法和应用。

背景技术

白细胞介素-17(Interleukin 17，IL-17)是一种炎症型细胞因子，主要由辅助性T细胞17(T helper 17，Th17)分泌，其他T细胞及先天性免疫细胞如肥大细胞和嗜中性粒细胞也会分泌一定的IL-17，在多种炎性反应及自身免疫性疾病病理过程中发挥重要作用。IL-17家族成员包括：同源二聚体形式的IL-17A、IL-17F、IL-17B、IL-17C、IL-17D及异源二聚体形式的IL-17A/F、IL-17E/IL-25，此外，还有两个未命名成员。IL-17受体(IL-17receptor，IL-17R)家族包括：IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD及IL-17RE，其中同源二聚体IL-17A与同源二聚体IL-17F及IL-17A/F异源二聚体共同作用于IL-17RA和IL-17RC。在体外，初始T细胞在抗原和共刺激分子的刺激下活化，由转化生长因子-β(transforminggrowth factor-β,TGF-β)、IL-6、IL-23等细胞因子诱导分化Th17，Th17细胞分泌IL-17A、IL-17F细胞因子。IL-17与IL-17R复合物通过信号转导复合体IL-17R-Act1-肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)激活下游NF-κB、c-jun N-端激酶(c-jun N-terminal kinase,JNK)等信号通路，参与炎症反应。

研究表明，IL-17全面参与了自身免疫疾病的各项病理反应[Nature ReviewsDrug Discovery,2012.11(10):763-776]：IL-17刺激内皮细胞分泌组织因子，促使血栓形成；同时诱导内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞和树突状细胞分泌炎性细胞因子IL-6和IL-8，诱导炎症反应发生；其作用于软骨细胞后，上调一氧化氮的表达，造成软骨破坏；同时诱导成骨细胞分泌核因子κ-B配体受体致活剂(Receptor activator of nuclearfactor kappa-B ligand，RANKL)，促进破骨作用，导致骨损伤。

自身免疫性疾病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病，包括类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、红斑狼疮和银屑病等病种。由于其一旦患病，将伴随终身，且目前没有疗法可以根治，被称为“不死的癌症”，在人群中的发病率约为3％。自身免疫性疾病会累及中枢神经系统、肺、肝脏、肾等多种器官，导致各器官功能退化甚至衰竭，使患者丧失劳动行动能力，最终危及生命。在我国，大约3-4千万人罹患自身免疫性疾病，目前国内常用的治疗药物未能满足患者的治疗需求。因此，为这些患者开发高效低毒副作用的治疗手段刻不容缓。

近年的研究表明，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、IL-6、IL-17A等炎性细胞因子全面介导自身免疫性疾病的发生和发展，拮抗炎性细胞因子的生物制剂已逐渐成为自身免疫性疾病治疗的主要手段。专门应用于各种自身免疫性疾病治疗的抗TNF-α抗体修美乐(Humira)已连续两年蝉联全球药物销售冠军，2014年的销售额更是达到125亿美元，而拮抗IL-6受体的雅美罗抗体药物也已经在类风湿性关节炎临床应用多年。另一方面，在TNF抑制剂治疗效果最显著的疾病类风湿性关节炎中仍有超过1/3的病人对这些制剂不应答或发展出耐药机制；同时，自身免疫性疾病不同疾病间的主要炎性细胞因子很有可能也存在很大差异：自身免疫性疾病病人的皮肤组织活检结果显示组织中IL-17、IL-6和IL-23、IL-22细胞因子高表达。同时，在病人的血液及病变皮肤部位发现大量Th17细胞存在，且与疾病进展正相关[Nature Reviews Drug Discovery.2012,11:763-776]。鉴于炎性细胞因子IL-6及趋化因子CXCL1的分泌极有可能是IL-17信号通路活化的结果[NatureImmunology.2007,8:247-256]，靶向IL-17可成为自身免疫性疾病治疗的策略之一。已有证据表明，靶向IL-17A信号通路的药物分子，可有效阻止自身免疫性疾病进展[The NewEngland Journal of Medicine.2014,371:326-338；Nature Review DrugDiscovery.2012,11:763-776]。

综上所述，研制高效特异的IL-17A阻断抗体阻断IL-17A信号通路将为自身免疫性疾病的治疗带来新的选择。自身免疫性疾病的慢性疾病及较难根治的特征决定了病人需要长期用药，而抗体药物复杂的生产工艺使得大分子药物的平均价格远远高于小分子药物，因此研发具有更高生物学活性的药物将能降低给药剂量，缩减用药成本，提高药物的可及性。筛选获得具有更高生物学活性的抗IL-17A抗体一直是本领域的技术人员急待解决的问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供可以通过特异性阻断IL-17A与细胞表面IL-17受体结合从而阻断IL-17A信号传导的单克隆抗体，其阻断IL-17A介导的生物学活性的效率更高，即重组抗人IL-17A单克隆抗体。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种抗人IL-17A单克隆抗体。

本发明的第二个目的在于提供编码所述抗人IL-17A单克隆抗体的核苷酸分子。

本发明的第三个目的在于提供包含所述核苷酸分子的表达载体。

本发明的第四个目的在于提供包含所述表达载体的宿主细胞。

本发明的第五个目的在于提供一种制备所述抗人IL-17A单克隆抗体的方法。

本发明的第六个目的在于提供包含所述抗人IL-17A单克隆抗体的组合物。

本发明的第七个目的在于提供所述抗人IL-17A单克隆抗体的应用。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明的第一个方面提供了一种抗人IL-17A单克隆抗体，所述抗人IL-17A单克隆抗体包含：(1)重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，和(2)轻链互补决定区CDR1’、CDR2’、CDR3’，所述CDR1’的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述CDR2’的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述CDR3’的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。

优选的，所述抗人IL-17A单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

优选的，所述抗人IL-17A单克隆抗体为人源化的抗人IL-17A单克隆抗体，所述人源化的抗人IL-17A单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。

优选的，所述抗人IL-17A单克隆抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。

本发明的第二个方面提供了一种核苷酸分子，所述核苷酸分子编码如上所述的抗人IL-17A单克隆抗体。

优选的，编码所述抗人IL-17A单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码其轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

更优选的，编码所述抗人IL-17A单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO：17所示，编码其轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示。

优选的，编码所述抗人IL-17A单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO：11所示，编码其轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。

更优选的，编码所述抗人IL-17A单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO：19所示，编码其轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。

本发明的第三个方面提供了一种表达载体，所述表达载体含有如上所述的核苷酸分子。

优选的，所述表达载体为pDR1，pcDNA3.1(+)，pDHFF或pCHO 1.0。

更优选的，所述表达载体为pCHO 1.0。

本发明的第四个方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如上所述的表达载体。.

优选的，所述宿主细胞为COS、CHO、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)或TG1。

更优选的，所述宿主细胞为CHO。

本发明的第五个方面提供了一种制备如上所述的抗人IL-17A单克隆抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在表达条件下，培养如上所述的宿主细胞，从而表达抗人IL-17A单克隆抗体；

b)分离并纯化a)所述的抗人IL-17A单克隆抗体。

本发明的第六个方面提供了一种组合物，所述组合物含有如上所述的抗人IL-17A单克隆抗体和药学上可接受的载体。

本发明的第七个方面提供了如上所述的抗人IL-17A单克隆抗体在制备治疗免疫介导的炎症反应的药物中的应用。

优选的，所述免疫介导的炎症反应包括：银屑病、类风湿性关节炎、银屑性关节炎、强直性脊柱炎、多发性硬化、哮喘、葡萄膜炎、白塞氏葡萄膜炎、干眼症或慢性自发性荨麻疹中的一种或多种。

本发明的有益效果：

本发明的抗IL-17A单克隆抗体能够特异性与人IL-17A结合，具有良好的抑制IL-17A诱导的各种细胞系分泌炎性细胞因子如IL-6等的效果，可应用于制备治疗免疫介导的炎症反应的疾病的药物。

附图说明

图1为人源化的抗人IL-17A单克隆抗体对人IL-17A诱导的Hela细胞IL-6分泌阻断结果。

图2为人源化的抗人IL-17A单克隆抗体在小鼠体内抑制人IL-17A诱导的CXCL1分泌的实验结果。

具体实施方式

本发明中，任何合适的表达载体都可以使用，可以为pDR1，pcDNA3.1(+)，pDHFF及pCHO 1.0之一，表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。

本发明中，可用的宿主细胞为含有上述表达载体的细胞，可以是真核细胞，如哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统均可用于本发明的融合蛋白的表达，COS，CHO(中国仓鼠卵巢，Chinese Hamster Ovary)，NS0，sf9及sf21等均可适用于本发明；也可以为含有上述表达载体的原核细胞，可以为DH5α，BL21(DE3)，TG1之一。

以上使用的表达载体和宿主细胞均可通过商业途径购买得到。

本发明中公开的抗人IL-17A单克隆抗体的制备方法包括：在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达抗人IL-17A单克隆抗体；分离和纯化所述的抗人IL-17A单克隆抗体。利用上述方法，可以将重组蛋白纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。

可以利用亲和层析的方法对本发明公开的重组蛋白进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合蛋白多肽。

本发明公开的人源化的抗人IL-17A单克隆抗体是通过以下方法得到的：利用实验室制备的IL-17A抗原免疫Balb/c小鼠，在多次免疫小鼠滴度较高后取小鼠脾细胞与杂交瘤细胞融合并筛选出具有抑制IL-17A功能活性的杂交瘤细胞株。更具体地，本发明的发明人通过大量实验，首先分别表达了IL-17A抗原、IL-17RA胞外段。在此基础上利用不同的佐剂与IL-17A抗原混合免疫小鼠，然后进一步将上述小鼠的脾细胞与杂交瘤细胞株sp2/0融合，融合后的杂交瘤利用IL-17A抗原筛选出阳性细胞株，在验证其对IL-17A与IL-17R结合的阻断并确实抑制IL-17A的功能后获得目标细胞株。将目标分子进行人源化改造后，将轻链和重链基因同时克隆到真核表达载体pCHO 1.0中。将此表达载体通过脂质体法转染CHO细胞，然后用嘌呤霉素和甲胺蝶呤筛选阳性细胞克隆。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱分离或纯化人源化的抗人IL-17A单克隆抗体。

进一步的，可以使用本领域的常规技术，例如PCR诱变进一步改变鼠源的亲本抗体来产生抗体的嵌合或人源化形式或其他变异形式。本发明的亲本抗体可以在例如CDR结构域内被诱变来产生变异抗体，可筛选其目的性质的存在，例如结合亲和力(更低的KD)、IC50、特异性、优先结合等等。优选的，变异抗体中目的性质是相对于亲本抗体中性质的改善。优选氨基酸替代变异抗体，并且亲本抗体分子的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基被去除且在它的位置上插入不同的残基。用于替代诱变的最感兴趣的位点是一个或更多个CDR区，但是也考虑FR改变。优选保守的氨基酸替代，也可引入非保守氨基酸改变并用获得的变异抗体筛选目的性质。

通过对上述的抗人IL-17A单克隆抗体进行了体外、体内生物学实验，结果表明此抗体能很好地与IL-17A结合。

具体地说，通过对上述的抗人IL-17A单克隆抗体进行亲和力检测、阻断IL-17A与IL-17R结合的实验分析、体外细胞功能检测等实验，实验结果表明，本发明的抗人IL-17A单克隆抗体可以结合细胞分泌的IL-17A，阻断IL-17A与IL-17R之间的信号传导，抑制了炎症反应的发生。本发明的上述抗人IL-17A单克隆抗体，可以和药学上可以接受的载体一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明的抗人IL-17A单克隆抗体的氨基酸核心序列的构像完整性，同时还保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。通常情况下，对于液体制剂，通常可以在2℃-8℃条件下保存至少稳定一年，对于冻干制剂，在30℃至少六个月保持稳定。所述抗人IL-17A单克隆抗体制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂，对于本发明的上述抗人IL-17A单克隆抗体的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括但不限于：表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合。其中表面活性剂包括但不限于：非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80)；poloxamer(如poloxamer188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUAT^TM等，其加入量应使抗人IL-17A单克隆抗体的颗粒化趋势最小。溶液稳定剂包括但不限于以下列举之一或其组合：糖类，例如，还原性糖和非还原性糖；氨基酸类，例如，谷氨酸单钠或组氨酸；醇类，例如：三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇等，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态。等渗调节剂包括但不限于氯化钠、甘露醇之一或其组合。缓冲液包括但不限于：Tris、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一或其组合。

上述制剂为包含抗人IL-17A单克隆抗体的组合物，在对包括人在内的动物给药后，抗免疫介导的炎症反应效果明显。具体地说，对免疫介导的炎症反应的预防和/或治疗有效，可以作为抗炎症药物使用。

本发明所述的免疫介导的炎症反应，包括但不限于：银屑病，类风湿性关节炎，银屑性关节炎，强直性脊柱炎，多发性硬化，哮喘，葡萄膜炎，白塞氏葡萄膜炎，干眼症，慢性自发性荨麻疹。除了上述的炎症相关疾病外，还可用于多发性硬化，克罗恩病，结肠炎，溃疡性结肠炎，系统性红斑狼疮，移植物抗宿主病等。这里不再一一列举。

本发明所称的抗免疫介导的炎症反应药物，指具有抑制和/或治疗免疫介导的炎症反应的药物，可以包括伴随免疫介导的炎症反应相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，它进一步还包括已存在的炎症反应伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还包括减少或防止炎症反应的转移。

本发明中抗人IL-17A单克隆抗体及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是1-1800mg/天。

以下实施例、实验例是对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2ndedition，Cold spring Harbor Laboratory Press。

实施例1 IL-17A抗原、阳性抗体Seckinumab、Ixekizumab及可溶性IL-17受体胞外段的制备

人IL-17A抗原序列来自于Pubmed(NM_002190.2)，将C端加载6个组氨酸(his)标签的hIL-17A(hIL-17A-histag)氨基酸序列提供给生工生物公司，按照Cricetulus griseus的密码子使用偏好进行密码子优化并合成基因片段，然后亚克隆到pUC57载体(来源自生工生物公司)中，得到了pUC57-hIL-17A-histag。利用AvrII和EcoRV酶切位点将hIL-17A-histag片段从pUC57-hIL-17A-histag载体上酶切下来并构建至pCHO 1.0表达载体(购自Life technologies公司)上，获得pCHO 1.0(hIL-17A-histag)，然后进行测序，选取序列完全正确的克隆进行转染。

通过脂质体法将pCHO 1.0(hIL-17A-histag)载体转染至CHO-S细胞系(购自Lifetechnologies公司)，在含6mM谷氨酰胺(购自Gibco公司)的CD FortiCHO培养基(购自Lifetechnologies公司)中培养2天后用嘌呤霉素(购自GeneOperation公司)和甲胺蝶呤(购自Sigma公司)筛选阳性细胞克隆。将3×10⁵阳性克隆细胞接种至200ml/1L摇瓶中，培养基为含6mM谷氨酰胺和1/100体积比的抗凝集试剂(购自Invitrogen公司)的CD FortiCHO培养基，培养12天后，收集上清，利用镍柱纯化hIL-17A-histag抗原。蛋白的定量通过二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)方法进行。纯化得到的蛋白用于以下的小鼠免疫及进一步分析与研究。

根据who.int公布的抗IL-17A单克隆抗体Secukinumab(IgG1，κ)氨基酸序列(参见WHO Drug Information Vol.23,No.4,2009.P342)，经过密码子优化后全基因合成核苷酸序列，克隆到pCHO 1.0表达载体，测序验证确认获得了正确的克隆载体标记为pCHO 1.0(Secukinumab)。将pCHO 1.0(Secukinumab)载体瞬时转染至CHO-S细胞系，利用含6mM谷氨酰胺的CD FortiCHO培养基培养数天后，利用Protein A亲和层析柱(购自Pharmacia公司)从细胞培养上清中纯化阳性抗体蛋白。

Ixekizumab(IgG4，κ)的氨基酸序列来自who.int(参见WHO Drug InformationVol.25,No.2,2011.P176),同样克隆至pCHO 1.0表达载体，瞬转至CHO-S细胞系后，在含6mM谷氨酰胺的CD FortiCHO培养基中培养数天，然后收集细胞培养上清利用Protein A亲和层析柱纯化获得蛋白，培养和纯化条件与上述Secukinumab一致。

可溶性IL-17受体A胞外段(IL-17receptor A-extracellular domain,IL-17RA-ECD)-Fc融合蛋白的制备方法如下：以IL-17RA基因(购自北京义翘神州公司)为模板，PCR扩增N端第1-288位核苷酸片段，利用甘氨酸丝氨酸(GS)作为人工连接子与人IgG1的恒定区(Fc)片段相连。人IgG1的恒定区序列采用了Secukinumb的恒定区序列。将序列构建至pCHO1.0载体中，获得pCHO 1.0(IL-17RA-ECD-Fc)。然后进行测序，选取序列完全正确的克隆进行稳定转染。转染表达按照hIL-17-histag的条件进行。利用Protein A亲和层析柱从细胞培养液上清中纯化获得IL-17RA-ECD-Fc。

实验例2 IL-17A的免疫

50μg/鼠的hIL-17A-histag抗原在用生理盐水稀释成75μl后，与等体积的弗氏完全佐剂混合，并经超声乳化完全后对4-5周龄的Balb/c小鼠(购自上海灵畅生物科技有限公司，动物生产许可证号：SCXK(沪)2013-0018)进行皮下多点注射。三周后，等量蛋白同样稀释成75μl后与等体积弗氏不完全佐剂混合，超声乳化完全后对小鼠进行皮下多点免疫，两周后再次重复此免疫。所有小鼠在第三次免疫后一周剪尾取血分离血清，利用包被hIL-17A-histag抗原的ELISA进行血清滴度的检测。对于血清抗体效价>10000的小鼠，在取血后一周进行冲击免疫：尾静脉注射10μg抗原蛋白/100μl生理盐水/鼠。

滴度的检测通过ELISA方法进行：利用hIL-17A-histag抗原包被ELISA板，包被浓度为2.5μg/ml，每孔100μl，4℃包被过夜。PBST(含0.5％Tween-20的PBS)洗板2次后拍干。每孔加入含1％BSA的包被液封闭200μl，常温下封闭4小时后拍干，至-20℃冰箱中保存待用。检测时在ELISA板中每孔加入不同浓度的小鼠血清100μl，设2个复孔，室温孵育1.5小时。PBST洗涤3次后拍干。加入用PBST1:10000倍稀释的HRP标记的兔抗鼠Ig抗体(购自Sigma公司)100μl，室温孵育1小时。PBST洗涤3次后拍干。每孔加100μl显色液(临用前将ELISA显色A液与显色B液按照1：1的体积比混匀)显色，随后每孔加入100μl 2M H₂SO4终止液终止反应。立即用酶标仪(Molecular Device)在450nm波长处测量各孔OD值。

实施例3杂交瘤融合和筛选

小鼠冲击免疫三天后取脾细胞进行融合。

生长状态良好的杂交瘤sp2/0细胞(来源自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)在37℃、5％CO₂孵箱中培养，融合前一天换液。融合与筛选过程如下：取小鼠脾脏，研磨洗涤后计数。按照脾细胞:sp2/0细胞＝10:1混合两种细胞，1500rpm离心7分钟。洗去上清液。1分钟内加入1ml PEG(1450)，轻摇90秒，在2.5分钟内加入无血清DMEM培养液(购自Gibco公司)5ml，再一次性加5ml无血清培养液终止反应，静置5分钟，1280rpm离心8分钟。按照一块96孔板两百万个sp2/0细胞的数量均匀接种入96孔板每孔200μl，先用含次黄嘌呤(hypoxanthine，H)、甲胺蝶呤(aminopterin，A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)的HAT培养基筛选，每3～4天半量换液，第10天改用HT培养基。10天后，待杂交瘤细胞铺满96孔板底部大于10％时，取上清用hIL-17A-histag抗原包被的酶标板进行ELISA检测。ELISA检测方法同上。挑选出阳性杂交瘤克隆于24孔板中扩大培养并通过有限稀释法进行亚克隆。获得稳定表达目的抗体的杂交瘤株后进行保种建库。

实施例4鼠源的抗人IL-17A单克隆抗体对IL-17A结合IL-17RA-ECD-Fc的阻断

用ELISA方法研究鼠源的抗人IL-17A单克隆抗体对IL-17A结合IL-17R的阻断。hIL-17A-histag抗原包被酶标板，封闭后同时加入IL-17RA-ECD-Fc和300μl亚克隆中的鼠源的抗人IL-17A单克隆抗体杂交瘤细胞培养上清，最终加入HRP-羊抗人IgG抗体进行显色检测。保留能阻断IL-17A与IL-17RA-ECD-Fc结合的细胞株进入下一轮的亚克隆。

实施例5鼠源的抗人IL-17A单克隆抗体对IL-17A诱导的Hela细胞IL-6分泌的抑制

将第三轮亚克隆后的杂交瘤细胞株进行扩大无血清培养，然后收集细胞上清利用Protein G(购自GE公司)亲和柱进行抗体纯化。将纯化后的抗体进行定量并验证其功能活性。

IL-17A识别细胞表面的IL-17R后诱发炎性细胞因子包括IL-6等的分泌,是IL-17A在自身免疫性疾病中主要的致病机制，因此抗IL-17A抗体的体外生物学活性考察利用其对IL-17A诱导的Hela细胞IL-6分泌的抑制来进行。

在生长状态良好的Hela细胞(来源自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)中加入15ng/ml重组hIL-17A(购自R&D Systems)及不同浓度的鼠源的抗人IL-17A单克隆抗体，培养基为DMEM培养基(购自Gibco公司)含10％胎牛血清(购自Sigma公司)，100U/ml青霉素(购自Gibco公司)和100mg/ml链霉素(购自Gibco公司)，每组设立四个复孔，37℃，5％CO₂中孵育培养24小时后收集细胞培养上清，用ELISA检测各组细胞分泌IL-6的含量。

ELISA分析方法如下：采用大鼠抗人IL-6包被ELISA板(购自R&D Systems)，包被浓度为2.5μg/ml，每孔100μl，4℃包被过夜。PBST洗板2次后拍干。每孔加入含1％BSA的包被液封闭200μl，常温下封闭4小时后拍干，至-20℃冰箱中保存待用。检测时用培养基配制hIL-6标准品(购自R&D Systems)，使其终浓度分别为10ng/ml、3.3ng/ml、1.1ng/ml、370pg/ml、120pg/ml、41pg/ml、13pg/ml及4.6pg/ml，每孔100μl加入包被好的ELISA板中，每个浓度设2个复孔；同样细胞上清用DMEM培养液稀释两倍后取100μl加入至包被好的ELISA板中，设2个复孔，室温孵育1.5小时。PBST洗涤3次后拍干。每孔加生物素化的大鼠抗人IL-6(购自R&DSystems，用含1％BSA的PBST稀释1000倍)100μl，室温孵育1小时。PBST洗涤3次后拍干。每孔加Streptavidin HRP(购自BD Pharmingen，用含1％BSA的PBST稀释1000倍)100μl，室温孵育1小时。每孔加100μl显色液(临用前将ELISA显色A液与显色B液按照1：1的体积比混匀)显色，随后每孔加入100μl 2M H₂SO₄终止液终止反应。立即用酶标仪(Molecular Device)在450nm波长处测量各孔OD值。

分析了候选的10个鼠源的抗人IL-17A单克隆抗体阻断IL-17A诱导的Hela细胞IL-6分泌的功能活性后可以发现，所评测的抗体中大部分效能与阳性抗体Secukinumab相当，挑取多个抗体进行进一步的功能分析与应用，编号为120的抗体对IL-17A的功能抑制IC50值为30.52pM，而阳性抗体Secukinumab的IC50值为108.70pM，Ixekizumab的IC50值为60.60pM。因此，本发明的鼠源的抗人IL-17A单克隆抗体对IL-17A的抑制功能强于Secukinumab和Ixekizumab。

实施例6鼠源的抗人IL-17A单克隆抗体亲和力的测定

鼠源的抗人IL-17A单克隆抗体与IL-17A的亲和力通过Biacore T200(GEhealthcare)检测，阳性抗体Secukinumab和Ixekizumab作为对照。具体实验方法为：利用Amine Coupling Kit(GE healthcare)激活CM5传感芯片(GE healthcare)并将Protein A/G融合蛋白(ThermoPierce)固定于芯片上，标记量为2000RU。以FC3(Flow cell 3)为参照通道，FC4(Flow cell 4)为样品通道。在FC4通道分别捕获鼠源抗体或对照抗体，随后注射不同浓度的hIL-17A。循环条件为：在FCs所有通道中以50μl/min注射4min分析物，解离时间为20min，以10μl/min速率注射6M盐酸胍(国药集团化学试剂有限公司)30s进行表面再生，然后利用Biacore T200Evaluation Software Ver 1.0计算捕获抗体的信号和无捕获抗体的信号差值及相互作用的亲和力。

实验结果见表1，结果表明本发明的鼠源的抗人IL-17A单克隆抗体与IL-17A的亲和力高于阳性抗体Secukinumab和Ixekizumab。

表1、鼠源的抗人IL-17A单克隆抗体对人IL-17A的亲和力

抗体	Ka(1/Ms)	Kd(1/s)	KD(pM)
				120	2.035×10<sup>5</sup>	6.076×10-<sup>8</sup>	0.299
Ixekizumab	5.151×10<sup>5</sup>	3.28×10-<sup>5</sup>	63.68
				Secukinumab	2.65×10<sup>5</sup>	3.16×10-<sup>5</sup>	118

实施例7鼠源的抗人IL-17A单克隆抗体序列的测定

使用Trizol(购自上海生工生物)提取各杂交瘤细胞株的总RNA，用逆转录试剂盒(购自Takara公司)将mRNA逆转录成cDNA，以Mouse Ig-Primer Set(购自Novagen公司)为引物通过PCR扩增鼠源的抗人IL-17A单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区基因，然后将PCR产物克隆入pMD18-T载体，测序并分析可变区基因序列。根据多种功能实验及序列分析结果，我们最终挑取了120号克隆作为先导抗体，其序列信息如下：重链可变区基因序列全长345bp，编码115个氨基酸残基，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；轻链可变区基因序列全长321bp，编码107个氨基酸残基，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。在GenBank中对氨基酸序列进行比对分析，二者均符合小鼠IgG可变区基因的特征。

此外，通过进一步对上述重链可变区基因和轻链可变区基因序列进行密码子优化，使得其更契合细胞表达系统，优化后的重链可变区基因核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示，优化后的轻链可变区基因核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示。

实施例8抗人IL-17A单克隆抗体的人源化

嵌合抗体(120-chimera，120-Ch)的构建通过截取鼠源120号抗体的重链可变区和轻链可变区，利用overlapping PCR分别与人IgG1的轻重链恒定区(来自Secukinumab抗体)连接而成。

同时根据Kabat法则对鼠源的抗人IL-17A单克隆抗体120的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列进行分析并确定了3个抗原互补决定区(complementarity-determiningregion,CDR)和4个框架区(frame region,FR)。其中，重链互补决定区的氨基酸序列为CDR1：SFDMS(SEQ ID NO：5)、CDR2：FMSSGGSTYYPDSVKG(SEQ ID NO：6)和CDR3：GERYGSY(SEQID NO：7)，轻链互补决定区的氨基酸序列为CDR1’：KASDHINNWLA(SEQ ID NO：8)、CDR2’：GATSLET(SEQ ID NO：9)和CDR3’：QQYWSTPFT(SEQ ID NO：10)。

通过在NCBI IgBlast与人IgG胚系序列(Germline)进行同源性比较，选择IGHV3-66*02为重链CDR移植模板，将鼠源的抗人IL-17A单克隆抗体120的重链CDR区移植入IGHV3-66*02骨架区，构建成重链的CDR移植抗体。同样地，经过与人IgG胚系序列同源性比较，选择IGKV1-NL1*01为轻链CDR移植模板，将鼠源的抗人IL-17A单克隆抗体120的轻链CDR区移植入IGKV1-NL1*01的骨架区，构建成轻链的CDR移植抗体，所得的抗体定义为120-Gr(120-Grafting)。同时，在此基础上，对一些框架区的氨基酸位点进行了回复突变。在进行回复突变时，将氨基酸序列进行了Kabat编码，位点的位置由Kabat码指示。优选的，对于重链可变区序列，将Kabat编码第29位的V回复为鼠源的F，第37位的V回复为G，第44位的G回复为R，第49位的S回复为A。对于轻链可变区序列，将Kabat编码第48位的L回复为I，第49位的Y回复为S。上述可变区基因序列由生工生物按照Cricetulus griseus的密码子使用偏好进行密码子优化并合成。将合成的人源化可变区序列与人IgG1恒定区相连，此抗体定义为120的人源化抗体(120-Humanization，120-Hu)。

同时，以此抗体为基础，我们构建了其他的亲和力成熟人源化序列，包括：120-LcT69K(依照Kabat编码系统，进一步将120-Hu轻链上69位的T回复成K)；120-Lc K45R(将120-Hu轻链上45位的K回复成R)；120-Lc K42N(将120-Hu轻链上42位的K回复成N)及120-HcK75R(将120-Hu重链上75位的K回复成R)。120-Lc突变序列与120-Hu重链组合成一个抗体基因；120-Hc突变序列与120-Hu轻链组合成一个抗体基因。

利用pTT5载体(购自NRC biotechnology Research Institute)分别构建人源化重链、轻链的瞬时表达载体，将上述轻重链组合利用HEK293系统(购自NRC biotechnologyResearch Institute)进行瞬时转染并表达抗体。HEK293细胞在Free Style293Expression Medium(购自Gibco公司)培养基中培养，利用PEI转染法将质粒转入细胞5天后收取细胞上清，利用Protein A纯化后获得抗体。

由于此5个抗体中，120-Hu的人源化程度最高，以120-Hu为标准，将其余四个抗体的细胞活性与120-Hu进行了比较，这四个抗体的细胞活性等于或弱于120-Hu，为使目的抗体有最高的人源化比例，在这些抗体中我们选择了120-Hu作为先导抗体分子。

在此基础上，为进一步提高抗体的人源化程度，我们将120-Hu的每一个回复突变位点分别再次突变成人源氨基酸残基。对于重链可变区序列，分别将120-Hu的Kabat编码第29位的F回复为鼠源的V；或第37位的G回复为V；或第44位的R回复为G；或第49位的A回复为S。将每一个单点突变后的重链序列与120-Hu的轻链基因组合成一个抗体基因。对于轻链可变区序列，分别将120-Hu的Kabat编码第48位的I回复为L；或第49位的S回复为Y。将每一个单点突变后的轻链序列与120-Hu的重链基因组合成一个抗体基因。

再用跟上述同样的条件将抗体分子瞬转、表达、进行细胞活性检测后证实，所有单点突变后的抗体其活性均低于120-Hu，因此，120-Hu是合适的人源化抗体最终目标分子。

最终，120人源化后的重链可变区基因序列全长345bp，编码115个氨基酸残基，核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示；人源化后的轻链可变区基因序列全长321bp，编码107个氨基酸残基，核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。与人IgG1恒定区相连后，最终得到445个氨基酸的120-Hu人源化重链(序列如SEQ ID NO：15所示)和214个氨基酸的120-Hu人源化轻链(序列如SEQ ID NO：16所示)。

此外，通过进一步对上述重链可变区基因和轻链可变区基因序列进行密码子优化，使得其更契合细胞表达系统，优化后的重链可变区基因核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示，优化后的轻链可变区基因核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。

实施例9人源化的抗人IL-17A单克隆抗体对IL-17A的亲和力

表达纯化的120-Hu抗体通过Biacore的方法(参见实施例6)进行抗体亲和力的评价。结果显示，人源化后的抗体120-Hu对hIL-17A的亲和力为0.02pM(见表2)，远远高于阳性抗体Secukinumab和Ixekizumab。由于Biacore仪器检测的精确范围在pM级别，120-Hu的亲和力已超出此精确范围，因此我们标为<1pM。

表2、120-Hu对IL-17A的亲和力

抗体	Ka(1/Ms)	Kd(1/s)	KD(pM)
				120-Hu	4.45×10<sup>5</sup>	8.77×10-<sup>9</sup>	<1pM
Ixekizumab	2.30×10<sup>6</sup>	9.45×10-<sup>5</sup>	41.08
				Secukinumab	2.65×10<sup>5</sup>	3.16×10-<sup>5</sup>	119.25

实施例10人源化的抗人IL-17A单克隆抗体对IL-17A诱导的Hela细胞IL-6分泌的抑制

对人源化后的120抗体进行了hIL-17A诱导的Hela细胞IL-6分泌抑制的检测(实验方法参见实施例5)。本实施例中的Secukinumab(Consentyx)购自Novartis，Ixekizumab根据实施例1制备。结果显示，人源化后的抗体保持了较高的生物学活性，且多次实验证实120-Hu的体外活性强于阳性对照Secukinumab(p<0.05,n＝3)和Ixekizumab(p<0.01,n＝3)(表3；代表实验见图1)。抗体的体外生物学活性是决定抗体的体内效能的重要因素之一，120-Hu极强的抑制IL-17A功能的能力预示着其将是高效能的抗体候选药物。

表3、120-Hu对IL-17A诱导的Hela细胞IL-6分泌的抑制

实施例11人源化的抗人IL-17A单克隆抗体的体内生物学活性

由于120-Hu不识别非灵长类动物来源的IL-17A，我们无法利用正常啮齿类动物直接构建相关动物疾病模型来检测120-Hu在自身免疫性疾病治疗中的效能。通过外源给予hIL-17A，我们在小鼠中评估了120-Hu对级联型炎症应答的抑制作用。

在自身免疫性疾病中，IL-17A被诱导高水平表达，其识别IL-17R后激活信号通路，级联诱导细胞大量分泌包括CXCL1(C-X-C motif ligand 1，C-X-C模体配体1)等在内的趋化因子和细胞因子，从而引发炎症反应，攻击机体正常细胞和器官。因此，利用抗体拮抗IL-17A将能抑制此应答反应的发生并阻止自身免疫性疾病的进展[World J Rheumatol.2013；3:25-31]。人IL-17A能识别小鼠IL-17R并引发后续级联应答。因此，观测抗体对IL-17A诱导的小鼠CXCL1分泌的抑制将能预测抗体在自身免疫性疾病治疗中的效能。

5-8周的雄性昆明小鼠(购自上海灵畅生物科技有限公司，动物生产许可证号：SCXK(沪)2013-0018)在第一天腹腔注射不同浓度的抗体(20μg/鼠-50μg/鼠)，24小时后，皮下注射3μg/鼠的重组人IL-17A，3小时后处死小鼠并取血。利用鼠CXCL1ELISA检测试剂盒(购自R&D Systems)检测血清中CXCL1的浓度。实验分别以IgG1对照抗体和Ixekizumab作为阴性和阳性对照，结果显示120-Hu在较低浓度时(20μg/鼠)即已能显著抑制了IL-17A诱导CXCL1的分泌，且同样浓度下120-Hu对体内IL-17A的中和能力远远高于Ixekizumab(见图2)。

SEQUENCE LISTING

<110> 三生国健药业（上海）股份有限公司

<120> 抗人白细胞介素-17A单克隆抗体、其制备方法和应用

<130> 17P421571

<150> CN 201610405511.0

<151> 2016-06-12

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 345

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码抗人IL-17A单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列

<400> 1

gaagtgaaac tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcgcc cgggcggcac cctgaaactg 60

agctgcgcgg cgagcggctt tacctttagc agctttgata tgagctgggg ccgccagacc 120

ccggaaaaac gcctggaatg ggtggcgttt atgagcagcg gcggcagcac ctattatccg 180

gatagcgtga aaggccgctt taccattagc cgcgataacg tgcgcaacat tctgtatctg 240

cagatgatta gcctgcgcag cgaagatacc gcgatgtatt attgcgcgcg cggcgaacgc 300

tatggcagct attggggcca gggcaccctg gtgaccgtga gcgcg 345

<210> 2

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 抗人IL-17A单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列

<400> 2

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Asp Met Ser Trp Gly Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Phe Met Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Arg Asn Ile Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Ile Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Glu Arg Tyr Gly Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala

115

<210> 3

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码抗人IL-17A单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列

<400> 3

gatattcaga tgacccagag cagcagctat ctgagcgtga gcctgggcgg ccgcgtgacc 60

attacctgca aagcgagcga tcatattaac aactggctgg cgtggtatca gcagaaaccg 120

ggcaacgcgc cgcgcctgct gattagcggc gcgaccagcc tggaaaccgg cgtgccgagc 180

cgctttagcg gcagcggcag cggcaaagat tataccctga gcattaccag cctgcagacc 240

gaagatgtgg cgacctatta ttgccagcag tattggagca ccccgtttac ctttggcagc 300

ggcaccaaac tggaaattaa a 321

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 抗人IL-17A单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列

<400> 4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Tyr Leu Ser Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gly Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Thr

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 抗人IL-17A单克隆抗体的重链互补决定区CDR1氨基酸序列

<400> 5

Ser Phe Asp Met Ser

1 5

<210> 6

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 抗人IL-17A单克隆抗体重链互补决定区CDR2的氨基酸序列

<400> 6

Phe Met Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 抗人IL-17A单克隆抗体重链互补决定区CDR3的氨基酸序列

<400> 7

Gly Glu Arg Tyr Gly Ser Tyr

1 5

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 抗人IL-17A单克隆抗体的轻链互补决定区CDR1'的氨基酸序列

<400> 8

Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 抗人IL-17A单克隆抗体轻链互补决定区CDR2'的氨基酸序列

<400> 9

Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 抗人IL-17A单克隆抗体的轻链互补决定区CDR3'的氨基酸序列

<400> 10

Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Phe Thr

1 5

<210> 11

<211> 345

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码人源化的抗人IL-17A单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列

<400> 11

gaagtgcagc tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcagc cgggcggcag cctgcgcctg 60

agctgcgcgg cgagcggctt tacctttagc agctttgata tgagctgggg ccgccaggcg 120

ccgggcaaac gcctggaatg ggtggcgttt atgagcagcg gcggcagcac ctattatccg 180

gatagcgtga aaggccgctt taccattagc cgcgataaca gcaaaaacac cctgtatctg 240

cagatgaaca gcctgcgcgc ggaagatacc gcggtgtatt attgcgcgcg cggcgaacgc 300

tatggcagct attggggcca gggcaccctg gtgaccgtga gcagc 345

<210> 12

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人源化的抗人IL-17A单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列

<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Asp Met Ser Trp Gly Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Phe Met Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

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Arg Gly Glu Arg Tyr Gly Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

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Val Ser Ser

115

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<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码人源化的抗人IL-17A单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列

<400> 13

gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60

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ggcaaagcgc cgaaactgct gattagcggc gcgaccagcc tggaaaccgg cgtgccgagc 180

cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tataccctga ccattagcag cctgcagccg 240

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<210> 14

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人源化的抗人IL-17A单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列

<400> 14

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Phe

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Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人源化的抗人IL-17A单克隆抗体的重链的氨基酸序列

<400> 15

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Asp Met Ser Trp Gly Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Phe Met Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Glu Arg Tyr Gly Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

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Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

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Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

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Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

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Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 16

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人源化的抗人IL-17A单克隆抗体轻链的氨基酸序列

<400> 16

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 17

<211> 345

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码抗人IL-17A单克隆抗体重链可变区的优化核苷酸序列

<400> 17

gaagtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaggc ctggagggac cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctttgaca tgtcttgggg tcgccagact 120

ccagaaaaga ggctggagtg ggtcgcattt atgagtagtg gtggtagcac ctactatcca 180

gacagtgtga agggccgatt caccatctcc agagataatg tcaggaacat cctgtacctt 240

caaatgatca gtctgaggtc tgaggacacg gccatgtatt actgtgcaag aggcgaaagg 300

tacgggtctt actggggcca agggactctg gtcactgtct ctgca 345

<210> 18

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码抗人IL-17A单克隆抗体轻链可变区的优化核苷酸序列

<400> 18

gacatccaga tgacacaatc ttcatcctac ttgtctgttt ctctaggagg cagagtcacc 60

attacttgca aggcaagtga ccacattaat aattggttag cctggtatca gcagaaacca 120

ggaaatgcgc ctaggctctt aatatctggt gcaaccagtt tggaaactgg ggttccttca 180

agattcagtg gcagtggatc tgggaaggat tacactctca gcattaccag tcttcagact 240

gaagatgttg ctacttatta ctgtcaacag tattggagta ctccattcac gttcggctcg 300

gggacaaagt tggaaataaa a 321

<210> 19

<211> 345

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 编码人源化的抗人IL-17A单克隆抗体重链可变区的优化核苷酸序列

<400> 19

gaggtgcagc tcgtcgaatc tggaggcggc ctcgtgcagc ctggggggtc tcttagattg 60

tcctgcgcag cttcaggatt cactttctcc agcttcgaca tgagctgggg gaggcaggct 120

ccagggaaga ggctggagtg ggtcgccttt atgtcctccg gaggcagtac atactacccc 180

gatagtgtga aagggaggtt taccatcagc cgcgacaaca gcaagaacac cctgtacctg 240

cagatgaata gcctgcgggc cgaggataca gccgtctact actgtgcccg gggcgagcgg 300

tacggctcct attggggcca agggacactg gtgactgtga gcagc 345

<210> 20

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码人源化的抗人IL-17A单克隆抗体轻链可变区的优化核苷酸序列

<400> 20

gatattcaga tgacccagag cccaagcagc ctgtccgcat ctgtcggaga tagggtgact 60

atcacctgca aggcttccga ccacatcaac aattggctcg cctggtacca gcagaagcct 120

ggaaaggccc ctaagttgct catctccggc gccacatctc ttgaaaccgg ggtgccaagt 180

cggttttcag ggagtggcag cgggactgac tatacactga caatttcctc cctgcaaccc 240

gaggacttcg ccacatacta ctgtcagcag tactggagca caccctttac tttcgggagc 300

ggcaccaaac tggagattaa g 321

Claims

1. 一种抗人IL-17A单克隆抗体，其特征在于，所述抗人IL-17A单克隆抗体包含：

（1）重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，和

（2）轻链互补决定区CDR1’、CDR2’、CDR3’，所述CDR1’的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述CDR2’的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述CDR3’的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。

2.如权利要求1所述的抗人IL-17A单克隆抗体，其特征在于，所述抗人IL-17A单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：4所示。

3.如权利要求1所述的抗人IL-17A单克隆抗体，其特征在于，所述抗人IL-17A单克隆抗体为人源化的抗人IL-17A单克隆抗体，所述人源化的抗人IL-17A单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。

4.如权利要求3所述的抗人IL-17A单克隆抗体，其特征在于，所述抗人IL-17A单克隆抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。

5.一种核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子编码如权利要求1-4中任一项所述的抗人IL-17A单克隆抗体。

6.如权利要求5所述的核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子中编码抗人IL-17A单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码其轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

7.如权利要求5所述的核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子中编码抗人IL-17A单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示，编码其轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示。

8.如权利要求5所述的核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子中编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。

9.如权利要求5所述的核苷酸分子，其特征在于所述核苷酸分子中编码抗人IL-17A单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示，编码其轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。

10.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有如权利要求5-9中任一项所述的核苷酸分子。

11.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求10所述的表达载体。

12.一种制备如权利要求1-4中任一项所述的抗人IL-17A单克隆抗体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a)在表达条件下，培养如权利要求11所述的宿主细胞，从而表达抗人IL-17A单克隆抗体；

b)分离并纯化a)所述的抗人IL-17A单克隆抗体。

13.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有如权利要求1-4中任一项所述的抗人IL-17A单克隆抗体和药学上可接受的载体。

14.如权利要求1-4中任一项所述的抗人IL-17A单克隆抗体在制备治疗与IL-17A相关的免疫介导的炎症反应的药物中的应用。

15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，所述免疫介导的炎症反应选自银屑病、类风湿性关节炎、银屑性关节炎、强直性脊柱炎、多发性硬化、哮喘、葡萄膜炎、干眼症和慢性自发性荨麻疹中的一种或多种。