CN109678959B

CN109678959B - 抗cd40抗体及其应用

Info

Publication number: CN109678959B
Application number: CN201910134095.9A
Authority: CN
Inventors: 高新; 王敏; 史丽滨; 刘玉杰; 徐桂利; 刘蕴慧; 刘晶莹; 窦晓倩; 张春青; 万德有; 李宏杰; 潘秀颉; 徐勤枝; 刘荷中
Original assignee: Beijing Mianyifangzhou Medicine Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Mianyifangzhou Medicine Technology Co ltd; Taize Huikang Biomedical Co Ltd
Priority date: 2019-02-22
Filing date: 2019-02-22
Publication date: 2020-12-08
Anticipated expiration: 2039-02-22
Also published as: CN109678959A

Abstract

本申请提供了重组的抗CD40抗体及其用途。本申请的抗CD40抗体能够与CD40特异性结合，具有诱导树突状细胞成熟、活化淋巴细胞等效果，可用于治疗CD40相关疾病，例如CD40相关的肿瘤。

Description

抗CD40抗体及其应用

技术领域

本申请涉及抗体领域，更具体地，本申请涉及抗CD40的抗体及其应用。

背景技术

CD40是TNF受体(TNFR)超家族的成员，主要在B细胞和其他抗原呈递细胞(APC)，如树突状细胞和巨噬细胞上表达。CD40配体(CD40L)主要由活化的T细胞表达。CD40和CD40L的相互作用是T细胞活化的共刺激信号。静息B细胞上的CD40-CD40L相互作用能诱导B细胞增殖、免疫球蛋白类别转变和抗体分泌，并且对生发中心的发展和记忆性B细胞的存活都有影响，这些都是体液免疫应答必不可少的(Kehry MR.J Immunol 1996；156：2345-2348)。树突状细胞上的CD40与CD40L结合可诱导DC的成熟，这表现在共刺激分子，如B7家族(CD80，CD86)的表达增加，以及促炎细胞因子，如白细胞介素12的产生，这将导致显著的T细胞应答(Stout RD,et al.Immunol 1996；17：487-492；Brendan O′Sullivan,et al.CriticalReviews in Immunology2003；23：83-97；Cella M.,et al.J Exp Med 1996；184:747-452)。

CD40信号转导激活多种通路，包括NF-κB(核因子-κB)、MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)和STAT3(信号转导子和转录激活子-3)(Pype S，et al.J Biol Chem.2000；275(24)：18586-18593)，其通过激活活化蛋白、c-Jun、ATF2(激活转录因子-2)和Rel转录因子(Dadgostar H,et al.Proc Natl Acad Sci USA.2002；99(3)：1497-1502)调节基因表达。通过CD40信号应答而激活的基因包括各种细胞因子和趋化因子，如IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α和巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP1α)。在某些细胞类型中，CD40激活可能会导致产生细胞毒性自由基(Dadgostar H,et al.Proc Natl Acad Sci USA.2002；99(3)：1497-1502)、COX-2(环氧合酶-2)，并产生NO(一氧化氮)。

CD40不但在正常的免疫细胞上表达，还可以在许多恶性细胞上表达。例如，CD40在以下疾病中过表达：B系NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、多毛细胞白血病(HCL)、霍奇金病(Uckun FM，et al.Blood 1990；76：2449-2456；O’Grady JT，et al.Am J Pathol 1994；144：21-26)、多发性骨髓瘤(Pellat-Deceunynck C,et al.Blood 1994；84(8)：2597-2603)以及膀胱癌、肾癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、恶性黑色素瘤(Young LS,etal.Immunol Today 1998；19：502-506；Ziebold JL,et al.Arch Immunol Ther Exp(Warsz)2000；48：225-233；Gladue R,et al.J Clin Oncol 2006；2(18S)：103s)等。

在许多情况下，抗体结合了肿瘤细胞表面上CD40分子后，能介导直接的细胞毒作用，通过细胞凋亡和细胞坏死使肿瘤退缩(Grewal IS，et al.Annu Rev Immunol 1998；16：111-135；以及van Kooten C，et al.J Leukoc Biol 2000；67(1)：2-17)。除了直接的肿瘤抑制之外，CD40信号激活还解救了荷瘤宿主中抗原呈递细胞的功能，并触发或恢复了针对肿瘤相关抗原的活化的免疫应答。据报道，CD40激动剂能克服荷瘤小鼠内的T细胞耐受，激起针对肿瘤相关抗原的有效的细胞毒T细胞应答，并增强抗肿瘤疫苗的效力(EliopoulosAG，et al.Mol Cell Biol 2000；20(15)：5503-5515；Tong AW，et al.Clin CancerRes2001；7(3)：691-703)。

因此开发CD40靶向抗体将有望用于治疗包括肿瘤在内的CD40相关疾病。

发明内容

第一方面，本申请提供了一种特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，所述重链可变区包含HCDR1,HCDR2和/或HCDR3。在一些实施方案中，上述HCDR1序列包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，上述HCDR2序列包含SEQ IDNO:2或3所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，上述HCDR3序列包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在可选的实施方案中，上述抗原结合部分选自Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、scFv片段、Fd片段和单域抗体。

在一些实施方案中，特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分还包含轻链可变区，其中所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和/或LCDR3序列。在某些实施方案中，所述LCDR1序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述LCDR2序列包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述LCDR3序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。

在一些实施方案中，特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分的重链包含选自SEQ ID NOs:20-24任一项的氨基酸序列或者与上述序列具有至少80％同源性的氨基酸序列，优选地，所述重链包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，上述抗体或其抗原结合部分的轻链包含SEQ ID NOs:25-30任一项的氨基酸序列或者与上述序列具有至少80％同源性的氨基酸序列，优选地，所述轻链包含选自SEQ ID NOs:26和30所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一方面所述的特异性结合CD40的抗体为单克隆抗体。

在一些实施方案中，第一方面所述的特异性结合CD40的抗体为人源化抗体。在优选的实施方案中，所述抗体为抗人IgG4亚型CD40单克隆抗体。

在一些实施方案中，本文公开的抗CD40抗体或其抗原结合部分与抗体Hu1D7-11或Hu1D7-15结合CD40上的相同表位，或者与人CD40配体(CD40L，或CD154)竞争结合于CD40。在一些实施方案中，所述抗体的重链序列如SEQ ID NO:23所示，以及所述轻链序列如SEQ IDNOs:26或30所示。

在一些实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合部分能够诱导树突状细胞的成熟。在一些实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合部分能够诱导T淋巴细胞活化。

第二方面，本申请提供了核苷酸分子，所述核苷酸分子编码第一方面所述的特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分。

第三方面，本申请提供了表达载体，所述表达载体含有第二方面所述的核苷酸分子。

第四方面，本申请提供了宿主细胞，所述宿主细胞含有第三方面所述的表达载体。

第五方面，本申请提供了药物组合物，所述组合物包含第一方面所述的抗CD40抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体。

第六方面，本申请提供了疫苗，其包含第一方面所述的抗CD40抗体或其抗原结合部分，以及任选的免疫佐剂。

在一些实施方案中，所述组合物或疫苗用于治疗CD40相关的疾病。

第七方面，本申请提供了第一方面所述的抗CD40抗体或其抗原结合部分在制备用于预防或治疗CD40相关疾病，例如肿瘤的药物中的应用。

在一些实施方案中，所述肿瘤包括胰腺癌、黑素瘤、间皮质瘤、恶性血液瘤、淋巴瘤、晚期实体瘤、或其转移瘤等。

在其他方面，本申请提供了预防或治疗CD40相关疾病的方法，其包括给予有需要的个体第一方面所述的抗体或其抗原结合部分、或第五方面所述的药物组合物、或第六方面所述的疫苗。

本申请的抗CD40抗体或其抗原结合部分能够特异性与CD40结合，具有以下的一种或多种效应：具有CD40激动剂功能，刺激树突状细胞成熟，刺激抗原特异性T细胞的增殖活化，诱导CD40介导的抗肿瘤免疫应答，和/或抑制肿瘤生长等。

附图的简要说明

图1显示了候选杂交瘤细胞的体外功能。

图2显示了抗CD40单克隆抗体的体外细胞功能。

图3显示了抗CD40单克隆抗体的体外结合活性，通过流式细胞术检测候选抗体与HEK Blue::CD40L细胞表面CD40分子的结合。

图4显示了抗CD40单克隆抗体对人CD40蛋白与其配体CD40L结合的阻断作用。

图5显示了抗CD40单克隆抗体与猴CD40蛋白的体外结合。

图6显示了抗CD40单克隆抗体可以促进DC细胞的成熟，其中图6A显示了抗CD40单克隆抗体可以刺激DC细胞分泌IL-12；图6B显示了抗CD40单克隆抗体可以刺激DC细胞表达MHC II分子。

图7为抗CD40单克隆抗体的hCD40KI鼠的体内刺激实验结果，显示了CD8+细胞中CD44+OT1+的百分比。

图8为抗CD40单克隆抗体在hCD40KI鼠体内刺激实验基础上进行的抑瘤实验结果，显示了B16-OVA瘤模型的瘤体积变化曲线。

图9显示了人源化抗CD40单克隆抗体的体外细胞功能，其中图9A-B显示了人源化抗CD40单克隆抗体在没有二抗的情况下不同抗体浓度下的体外细胞功能；图9C显示了人源化抗CD40单克隆抗体在有二抗的情况下的体外细胞功能。

图10显示了人源化抗CD40单克隆抗体的体外细胞结合结果。

图11显示了人源化抗CD40单克隆抗体的EC50值。图11A显示了人源化抗CD40单克隆抗体11#(Hu1D7-11)与表达人CD40蛋白的细胞在不同浓度下的结合拟合曲线。图11B显示了人源化抗CD40单克隆抗体15#(Hu1D7-15)与表达人CD40蛋白的细胞在不同浓度下的结合拟合曲线。图11C显示了人源化抗CD40单克隆抗体的EC50值的总结。

图12显示了抗CD40抗体与人CD40蛋白结合解离拟合曲线，其中图12A显示了人源化抗CD40单克隆抗体11#(Hu1D7-11)与人CD40蛋白结合解离拟合曲线；图12B显示了人源化抗CD40单克隆抗体15#(Hu1D7-15)与人CD40蛋白结合解离拟合曲线；以及图12C显示了参比抗体与人CD40蛋白结合解离拟合曲线。

图13为人源化抗CD40单克隆抗体15#(Hu1D7-15)的hCD40KI鼠的体内刺激实验结果。图13A为人源化抗CD40单克隆抗体15#(Hu1D7-15)的hCD40KI鼠的体内刺激实验结果。图13B为人源化抗CD40单克隆抗体15#(Hu1D7-15)的hCD40KI鼠的二次体内刺激实验结果。图13C为人源化抗CD40单克隆抗体15#(Hu1D7-15)的hCD40KI鼠的二次体内刺激实验结果的总结，显示了CD8+T细胞中CD44+OT1+细胞的百分比。

图14为人源化抗CD40单克隆抗体15#(Hu1D7-15)的抑瘤曲线，其中图14A为人源化抗CD40单克隆抗体15#(Hu1D7-15)的整体抑瘤曲线，显示了B16-OVA瘤模型的瘤体积变化；图14B为人源化抗CD40单克隆抗体15#(Hu1D7-15)的个体抑瘤曲线，分别显示了各组的瘤体积变化。

图15为人源化抗CD40单克隆抗体15#(Hu1D7-15)对荷瘤(B16-OVA)hCD40KI鼠的体重影响曲线。图15A-B显示了各处理组对体重的影响。

图16为经人源化抗CD40单克隆抗体15#(Hu1D7-15)处理的hCD40KI鼠的生存曲线。

图17为人源化抗CD40单克隆抗体11#(Hu1D7-11)和15#(Hu1D7-15)的抑瘤曲线，其中图17A为人源化抗CD40单克隆抗体的整体抑瘤曲线；图17B为人源化抗CD40单克隆抗体的个体抑瘤曲线。

图18为人源化抗CD40单克隆抗体11#(Hu1D7-11)和15#(Hu1D7-15)对荷瘤(MC38)hCD40KI鼠的体重影响曲线。图18A-B显示了各处理组对体重的影响。

具体实施方式

本申请提供了特异性结合于CD40的新型抗CD40抗体或其抗原结合部分。在优选实施方案中，本申请的抗体或其抗原结合部分结合于靶细胞表面的CD40分子并具有CD40激动剂功能。本申请还提供了编码该抗体或其抗原结合片段的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含所述多核苷酸或载体的宿主细胞、制备和纯化该抗体的方法以及所述抗体或其抗原结合片段的医学和生物学应用，例如预防或治疗CD40相关疾病或病症。本申请还涵盖使用所述抗体或其抗原结合片段来检测CD40及调节CD40活性的方法以及相关试剂盒。

为容易地理解本申请，首先定义本文中使用的某些术语。

本文所用术语“抗体”指包含四条多肽链，即通过双硫键互连的两条重链(H)链及两条轻链(L)的免疫球蛋白分子，以及其多聚体(例如IgM)。各重链包含重链可变区(缩写为VH)及重链恒定区(缩写为CH)。重链恒定区包含三个域，即CH1、CH2及CH3。各轻链包含轻链可变区(缩写为VL)及轻链恒定区(缩写为CL)。轻链恒定区包含一个域(CL1)。VH及VL区可进一步细分成称为互补决定区(CDR)的高变区，其中穿插有称为构架区(FR)的保守区。在一些实施方案中，从N-末端至C-末端，轻链与重链可变结构域均包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3与FR4区。

如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”是指负责结合抗原的完整抗体分子的一部分或区段。抗原结合域可以包含重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)或上述两者。抗体的抗原结合片段可使用任何适合的标准技术从完整抗体分子制备，所述标准技术包括蛋白水解消化或重组遗传工程化技术等。抗原结合部分的非限制性实例包括：Fab片段；F(ab')2片段；Fd片段；Fv片段；单链Fv(scFv)分子；单域抗体；dAb片段及由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元(例如分离的CDR)。术语“抗原结合部分”也包括其它工程化的分子，如双抗体、三抗体、四抗体及微型抗体等。例如，本文中所述Fd片段指该由VH与CH1结构域组成的抗体片段；Fv片段由抗体的单臂中VL与VH结构域组成；dAb片段(Ward,etal.Nature 1989；341：544-546)由VH结构域组成。

本领域技术人员公知，互补决定区(CDR，通常有CDR1、CDR2及CDR3)是可变区中对抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。VH或VL的CDR序列有两种常见的定义方式，即Kabat定义和Chothia定义，例如参见Kabat et al,“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”，National Institutes of Health,Bethesda，MD.(1991)；Al-Lazikani et al.，J Mol Biol 273:927-948(1997)；以及Martin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9268-9272(1989)。对于给定抗体的可变区序列，可以根据Kabat定义或者Chothia定义来确定VH和VL序列中CDR区序列。在本申请的实施方案中，利用Kabat定义CDR序列。在本文中，重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3分别简称为HCDR1、HCDR2及HCDR3；轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3分别简称为LCDR1、LCDR2及LCDR3。

对于给定抗体的可变区序列，可以通过多种方式分析可变区序列中CDR区序列，例如可以利用在线软件Abysis确定(http://www.abysis.org/)。

如本文所用术语“特异性结合”，是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体至抗原表位的结合，例如抗体以比其对非特异性抗原的亲和性大至少两倍的亲和性结合于特异性抗原的能力。然而应了解，抗体能够特异性结合于两种或更多其序列相关的抗原。例如，本发明的抗体可特异性结合于人类与非人类(例如小鼠或非人类灵长动物)的CD40。

本文所用术语“单克隆抗体”指由基本同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能在少量个体中存在自然发生的突变以外，组成群体的各个抗体是相同的。本文所述单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于具体物种或属于具体抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而重链和/或轻链的余下部分与来源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，并且还包括这样的抗体的片段，只要它们能表现出所期望的生物学活性(参见，美国专利号4,816,567；和Morrisonet al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。

本文所用术语“人源化抗体”是指其中所有恒定结构域序列均为人类序列的任何抗体。此类抗体可依下文中说明的多种方式制备。

本文所用术语“嵌合抗体”是指包含来自两种或多种不同抗体的区段的抗体。在一些实施方案中，一个或多个CDRs衍生自小鼠抗CD40抗体。在另一些实施方案中，所有CDRs均衍生自小鼠抗CD40抗体。在一些实施方案中，在嵌合抗体中组合来自一种以上小鼠抗CD40抗体的CDRs。例如，嵌合抗体可包含来自第一种小鼠抗CD40抗体中轻链的CDR1、来自第二种小鼠抗CD40抗体中轻链的CDR2、与来自第三种小鼠抗CD40抗体中轻链的CDR3，以及来自重链的CDRs可衍生自一种或多种其它抗CD40抗体。此外，构架区可来自相同抗CD40抗体或来自一个或多个不同的个体。

本文所用术语“激动剂”抗体是指该抗体当加至表达CD40的细胞、组织或生物体中时，可使一种或多种CD40活性提高至少约20％。有些实施方案中，具有激动剂功能的抗体使CD40活性提高至少40％，50％或60％。在一些实施方案中，使用树突状细胞分析法测定IL-12的释放，以测定活化型抗体的活性。在本文中，术语“激动剂抗体”、“激动型抗体”和“活化型抗体”可以互换使用。

如本文所用，术语“同源性”被定义为经过序列比对和引入空位后，氨基酸或核苷酸序列变体中相同的残基的百分比，如果需要，达到最大百分比的同源性。用于比对的方法和计算机程序在本领域内是公知的。本文所述的“至少80％同源性”是指同源性为80％至100％的任一值，例如85％、90％、95％、99％等。

如本文所用，术语“CD40相关疾病”包括与CD40信号通路相关的疾病和/或症状。示例性CD40相关疾病或病症包括肿瘤，例如结肠肿瘤、黑素瘤、白血病、淋巴瘤等。

如本文所用，术语“EC50”是指半数最大效应浓度(concentration for 50％ofmaximal effect,EC50)，指能引起50％最大效应的浓度。

如本文所用，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。

一方面，本申请提供了特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和/或轻链可变区。下表1-4中示例性列出了适用于本申请公开的抗体的CDR、重链和轻链氨基酸序列。在某些实施方案中，抗CD40抗体或其抗原结合部分包含HCDR1、HCDR2和/或HCDR3序列，其独立地选自表1中所示的HCDR1、HCDR2或HCDR3序列中任一者。在某些实施方案中，本申请的抗CD40抗体可进一步包含轻链CDR，其独立地选自表2中所示的轻链CDR1、CDR2或CDR3序列中任一者。举例而言，本申请的抗CD40抗体可包含表3中所示的重链中的任一者，任选地与表4中所示的轻链的任一者组合或配对。

表1：示例性抗CD40抗体的重链CDR氨基酸序列

表2：示例性抗CD40抗体的轻链CDR氨基酸序列

表3：示例性抗CD40抗体的重链氨基酸序列

抗体编号	重链氨基酸序列
		1D7	SEQ ID NO.20
1D7-G53A	SEQ ID NO.21
		Hu1D7-6至Hu1D7-10	SEQ ID NO.22
Hu1D7-11至Hu1D7-15	SEQ ID NO.23
		Hu1D7-1至Hu1D7-5	SEQ ID NO.24

表4：示例性抗CD40抗体的轻链氨基酸序列

在一些实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合部分的HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。在一些实施方案中，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2或3所示。在一些实施方案中，HCDR3的氨基酸序列SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。在优选的实施的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本文公开的抗体或其抗原结合部分在包含重链可变区的基础上还可以进一步包含轻链可变区。

在一些实施方案中，所述轻链可变区的CDR1(LCDR1)为SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，LCDR2为SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，LCDR3为SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。

在具体的实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合部分的重链与选自SEQ IDNOs:20-24的氨基酸序列具有至少80％的同源性，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。在更具体的实施方案中，上述抗体重链由选自SEQID NOs:20-24任一项的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，上述抗体重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:22,23或24所示。在优选的实施放方案中，上述抗体重链的氨基酸序列如SEQID NO:23所示。

在具体的实施方案中，本文公开的抗体的轻链与选自SEQ ID NOs:25-30的序列具有至少80％的同源性，例如具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。在更具体的实施方案中，所述抗体轻链由选自SEQ ID NOs:25-30任一项的氨基酸序列组成。在优选的实施方案中，上述抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:26或30所示。

在一些实施方案中，本文公开的抗体的重链或重链可变区、轻链或轻链可变区可以在上述所列举的各自对应的具体氨基酸序列的基础上取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且得到的变体仍保持结合CD40的活性。

在某些实施方案中，上述氨基酸取代、缺失或添加的数目为1-30个或1-30之间的任一数值，优选为1-20个，更优选为1-10个。在优选的实施方案中，序列变体与原氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。在更优选的实施方案中，序列变体与原氨基酸序列相差约1、2、3、4或5个氨基酸的取代、缺失或添加。在具体的实施方案中，所述氨基酸取代为保守性取代。

在优选的实施方案中，本文公开的抗体为抗体Hu1D7-11或Hu1D7-15，其中抗体Hu1D7-11的重链序列如SEQ ID NO：23所示，轻链序列如SEQ ID NO：26所示；抗体Hu1D7-15的重链序列如SEQ ID NO：23所示，轻链序列如SEQ ID NO：30所示。

在一些实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合部分与抗体Hu1D7-11或Hu1D7-15结合CD40上的相同表位，或者与Hu1D7-11或Hu1D7-15竞争结合于CD40。

在一些的实施方案中，本文公开的抗体为单克隆抗体。在具体的实施方案中，本文公开的抗体为人源化的抗体。人源化CD40抗体使本来对非人类单克隆抗体或非人类衍生的单克隆抗体的免疫原性及过敏反应降至最低，因此可提高所施用抗体的效力与安全性。

在更具体的实施方案中，本文公开的抗体为抗人IgG4亚型CD40单克隆抗体。CD40抗体类型与亚型可由本领域已知的任何方式确定。通常，抗体类型与亚型可使用特异于特定抗体类型与亚型的抗体确定。

本文公开的抗体或其抗原结合部分能够特异性结合CD40。在一些实施方案中，CD40抗体显示物种与分子选择性。在具体的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分特异性结合灵长类CD40，或者与灵长类CD40具有高度同源性的物种的CD40。在一些实施方案中，抗CD40抗体与人类、猕猴或恒河猴CD40结合。在具体的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分特异性结合人CD40和猴CD40。在其它实施方案中，抗CD40抗体不与小鼠、大鼠、狗或兔子CD40结合。

在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分以高亲和性与CD40结合。在具体的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分以1×10^-8至10×10^-8M的KD特异性结合于CD40分子，例如KD为5.16×10^-8M。

在一些实施方案中，本文公开的CD40抗体为活化型抗体，即具有CD40激动剂的功能。活化型抗体可扩大或取代CD40L对CD40的效应。在一些实施方案中，活化型抗体基本上为CD40L的模拟物，且与CD40L竞争结合CD40。在一些实施方案中，抗CD40抗体会活化CD40。

在一些实施方案中，抗CD40活化型单克隆抗体可通过至少一种以下机制抑制或根除肿瘤：活化宿主的树突细胞以加强肿瘤抗原加工与呈递、加强CD40阳性肿瘤细胞本身的抗原呈递或免疫原性、活化肿瘤特异性CD4+与CD8+淋巴细胞等。在一些实施方案中，其它抗肿瘤活性可受CD40信号传递的其它免疫-加强效应介导(产生趋化因子与细胞因子，募集与活化单核细胞，及加强CTL与NK溶胞活性等)，以及通过诱发细胞凋亡或刺激针对ADCC的体液反应而直接消灭CD40+肿瘤等。凋亡及死亡的肿瘤细胞可成为肿瘤特异性抗原的重要来源，这些抗原被CD40活化的APCs处理及呈递。

在一些实施方案中，本文公开的抗体为抗CD40激动型抗体，其与现有的罗氏公司的IgG2亚型CD40抗体(罗氏公司编号：RO7009789，原辉瑞编号为：CP870893)相比较，在解离常数、刺激树突状细胞成熟、肝毒性等方面具有明显的优势，在小鼠体内可以快速刺激特异性T细胞的增殖活化，并抑制肿瘤细胞的生长。

在具体的实施方案中，本文公开的抗体能够阻断人CD40蛋白与其配体CD40L的结合，且具有一定的量效关系。

在一些实施方案中，本文公开的抗体可以促进树突状细胞的成熟。例如，在具体实施方案中，本文公开的抗体可以提高树突状细胞表达MHC II分子的能力。在具体实施方案中，本文公开的抗体可以刺激树突状细胞与附着性单核细胞分泌细胞因子，包括但不限于IL-8、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23等。

在一些实施方案中，本文公开的抗体可以激活抗原特异性T细胞，例如激活hCD40KI鼠体内特异T细胞。在一些实施方案中，本文公开的抗体可以抑制肿瘤瘤的生长。例如，在具体实施方案中，本文公开的抗体可以抑制hCD40KI鼠的B16-OVA皮下移植瘤的生长。在具体实施方案中，本文公开的抗体可以抑制hCD40KI鼠的MC38皮下移植瘤的生长。在具体的实施方案中，上述抗体抑制肿瘤生长至少达50％，55％或60％。在一些实施方案中，在荷瘤个体接受本文公开的抗体处理后14天即可检测到抑制肿瘤生长的情形。在另一些实施方案中，在初次接受抗体处理后7天即可检测到抑制肿瘤生长的情形。

本申请还提供了编码本文公开的抗体或其抗原结合部分的核苷酸分子、包含所述多核苷酸的载体、包含所述多核苷酸或载体的宿主细胞、以及制备和纯化该抗体的方法。

在一些实施方案中，编码所述抗体或其抗原结合部分的核苷酸分子可操作地连接到调控序列，调控序列可以被用所述载体转化过的宿主细胞识别。

在一些实施方案中，任何合适的表达载体都可以用于本申请。例如，所述表达载体可以为pQK1、pTT5、pUC57、pDR1、pcDNA3.1(+)、pDHFF及pCHO 1.0中的一种。表达载体中可以包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。

在一些实施方案中，可用的宿主细胞为含有上述表达载体的细胞，可以是真核细胞，如哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统均可用于本申请的抗体或其抗原结合部分的表达。例如，HEK 293细胞、COS、CHO、NS0、sf9及sf21等均可适用于本发明。所述宿主细胞也可以为含有上述表达载体的原核细胞，例如可以为DH5α、BL21(DE3)或TG1等。

在一些实施方案中，本文公开的抗CD40单克隆抗体的制备方法包括：在表达条件下，培养宿主细胞，从而表达抗CD40单克隆抗体；分离和纯化表达的抗CD40单克隆抗体。利用上述方法，可以将重组蛋白纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。

在一些实施方案中，可以利用亲和层析的方法对本文公开的抗CD40抗体进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的抗CD40抗体。

在一些实施方案中，动物接种CD40抗原后，可自动物体内得到抗体和/或产生抗体的细胞。产生抗体的永生化细胞系可由经免疫的动物体中分离出的细胞制备。免疫接种后，杀死动物，取淋巴结和/或脾脏B细胞进行永生化处理，经过致癌性化合物及诱变化合物处理，与永生化细胞(例如骨髓瘤细胞)融合，去除肿瘤抑制基因的活性。若使用骨髓瘤细胞进行融合时，该骨髓瘤细胞最好不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌性细胞系)。使用CD40、其部分或表达CD40的细胞筛选永生化细胞。优选实施方案中，初次筛选是利用酶联免疫分析法(ELISA)进行。选取产生抗CD40抗体的细胞例如杂交瘤进行克隆，再进一步筛选所需的特性，包括生长良好、抗体产量高、及具有所需抗体特性等。杂交瘤的筛选、克隆及扩增方法是本领域普通技术人员熟知的。在一些实施方案中，经免疫接种的动物为非人类动物，其中脾脏B细胞与来自与该非人类动物相同物种的骨髓瘤细胞系融合。在一些实施方案中，该经免疫接种的动物为Balb/c小鼠且骨髓瘤细胞系为非分泌性小鼠骨髓瘤细胞SP2/0。

本申请提供了药物组合物，其包含本文公开的抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体。本文公开的上述抗CD40抗体例如抗人CD40单克隆抗体，可以和药学上可接受的载体一起配制成药物制剂，从而更稳定地发挥疗效。在一些实施方案中，这些制剂可以保证本文公开的抗CD40抗体例如抗人CD40单克隆抗体的氨基酸核心序列的构像完整性，同时还保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱酰胺或氧化)。在一些实施方案中，对于液体制剂，通常可以在2℃-8℃条件下保存至少稳定一年。在一些实施方案中，对于冻干制剂，在30℃下至少六个月保持稳定。

本申请提供了疫苗，其包含本文公开的抗体或其抗原结合部分，以及任选的免疫佐剂。当所述的疫苗是CD40结合蛋白自身的时候，例如是完整的抗体或其片段时，则这些“活性组分”可以使用现有技术中已知的方法制成疫苗，例如第4608251、4601903、4599231、4599230和4578770号美国专利中所述的方法。一般地来说，该疫苗制备成可注射的，例如制备成液态的溶液或者悬浮液，或者适于在注射前再悬浮于液体中的固体形式。该制备物也可以是乳化的。活性的免疫原性组分通常与药学上可接受的并且与所述活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂为如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等或者其组合。除此之外，疫苗也可以按照需要含有少量的辅料，如润湿剂或者乳化剂，pH缓冲剂或者提高所述疫苗的效果的佐剂。

将疫苗以与其剂型相容的方式给予，并且施用量是治疗上有效的和能产生免疫性的。所施用的量取决于所治疗的受试者，包括例如个体的免疫系统产生免疫应答的能力、给药途径等，具体的量由医师判断。对于初次给予和加强注射而言，适用的治疗方案也是可以变化的。在一些实施方案中，疫苗经静脉内递送，或者直接地递送到肿瘤或者感染的位点，或者其他的疫苗给药的传统方法。

本申请还提供了预防或治疗CD40相关疾病的方法，其包括给予个体抗CD40抗体、或者包含抗CD40抗体例如抗人CD40单克隆抗体的组合物或疫苗。在一些实施方案中，在对包括人在内的动物给药后，抗肿瘤效果明显。具体地说，本文公开的抗CD40抗体能够有效地预防和/或治疗癌症，可以作为抗癌症药物使用。

本申请还提供了抗CD40抗体在制备用于预防或治疗CD40相关疾病或症状的药物中的用途。在一些实施方案中，所述CD40相关疾病或症状包括肿瘤。

在一些实施方案中，上述肿瘤为结肠癌、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、结肠癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、或其转移癌等。

本文公开的抗人CD40抗体及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因个体的年龄和体重、疾病特性和严重性以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和综合情况，总给药量不能超过一定范围。

抗体或其组合物的施用剂量和频率可根据对疾病进行预防或治疗而变化。在预防性应用中，向尚未处于疾病状态的患者施用含有本申请的抗体或其混合物的组合物以增强患者抵抗力，此量定义为“预防性有效剂量”。在此用途中，具体的剂量又视患者健康状况及全身免疫性而定。通常以相对不频繁的间隔施用相对较低剂量较长时间。在治疗性应用中，有时需要以相对较短间隔施用相对较高剂量直至疾病进展减缓或终止为止，且优选直至患者显示疾病症状部分或完全改善为止。此后，可向患者施用预防性方案。本领域普通技术人员可以容易地根据实际需要掌握具体的剂量和频率。

本说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”和“含有”意指“包括但不限于”，且并非意图排除其他部分、添加物、组分、或步骤。

应该理解，在本申请的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，除非与之矛盾。

上述公开内容总体上描述了本申请，以下实施例是对本申请作进一步的说明，不应理解为对本申请的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，例如参见Sambrook,J.,Fritsch,EF.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd edition，Cold spring Harbor Laboratory Press。

实施例

实施例1.产生抗CD40抗体的杂交瘤的制备

取8-10周大的Balb/c小鼠经腹膜内接种CD40蛋白(10μg/剂/只)。人CD40(TNFRSF5)蛋白订购自义翘神州，货号为No.10774-H08H，DNA序列为NP_001241.1，蛋白序列为胞外区Met 1-Arg 193，C末端含有His标签，通过SDS－PAGE验证其分子量在30kDa。在3-8周内，重复此剂量5-7次。进行融合前4天，为小鼠注射最后一剂含于PBS中的人类CD40的细胞外结构域。使来自经免疫接种的小鼠的脾与淋巴结的淋巴细胞与非分泌性骨髓瘤SP2/0细胞系融合，按照之前文献的记载，对融合的细胞进行HAT选择(Galfre and Milstein,Methods Enzymol 1981；73：3-46)。回收一组均分泌抗CD40特异性抗体的杂交瘤。初次筛选是利用酶联免疫分析法(ELISA)确定杂交瘤分泌的抗CD40抗体的滴度。

实施例2.候选杂交瘤细胞株的体外功能试验

构建稳定表达人CD40的细胞系(HEK::CD40L细胞)。采用HEK Blue::CD40L细胞的NF-kB报告系统进行筛选。将HEK Blue::CD40L细胞与杂交瘤上清于5％CO₂的37℃细胞培养箱孵育20h；取细胞上清与Quanti Blue于37℃中孵育1h，630nm下检测OD值。

测试结果显示，多个杂交瘤的抗体分泌能力高且抗体可与人CD40抗原的胞外区结合并引发激发下游信号通路。此实验结果示于图1中。

实施例3.抗体的表达纯化

采用200mL培养基进行培养7-10天后，取细胞上清，3500rpm离心30min，收集上清，采用Protein A亲和层析进行抗体纯化。纯化过程严格遵守纯化的标准操作规程进行。

实施例4.抗体的体外功能实验验证

采用HEK Blue::CD40L细胞的NF-kB报告系统进行验证。将HEK Blue::CD40L细胞与由实施例3得到的纯化抗体于5％CO₂，37℃下在细胞培养箱中孵育20h；取细胞上清与Quanti Blue于37℃下孵育1h，630nm下检测OD值。

结果如图2所示，测试抗体可与人CD40抗原的胞外区结合并引发下游信号。

实施例5.抗体的体外结合活性验证

采用FACS分析法来测定本申请的抗体在不同浓度下与HEK Blue::CD40L细胞的结合活性。将HEK Blue::CD40L细胞和不同浓度的测试抗体于4℃孵育30min；FACS缓冲液洗2次；抗体组加入1：20稀释的二抗，4℃孵育30min；FACS缓冲液洗1次，用FACS缓冲液重悬，上机检测。

结果如图3所示，测试抗体能够与人CD40抗原的胞外区结合。

实施例6.抗体的阻断作用验证

采用FACS分析法来测定本申请的抗体对人CD40配体与人CD40的阻断作用。将HEKBlue::CD40L细胞与不同浓度的抗体混合，4℃孵育30min；然后加入人CD40配体-hFc(hCD40L-hFc)融合蛋白混合，4℃孵育30min，然后用FACS缓冲液洗2次；加入1:20稀释的二抗，4℃孵育30min；FACS缓冲液洗1次，300μL FACS缓冲液重悬，上机检测。

结果如图4所示，测试抗体可以阻断人CD40配体(CD40L，或CD154)与人CD40的结合，且具有一定的量效关系。

实施例7.抗体的物种交叉反应

采用ELISA分析法来测定本申请的抗体对猴类CD40的结合性。采用猴CD40包被Biolegend的ELISA板，与候选抗体的杂交瘤上清共孵育，加入显色液，在450nm出检测其OD值。

结果如图5所示，测试抗体能够结合猴CD40，表明本申请的抗体具有与人类和猴类的CD40蛋白的结合能力。

实施例8.抗体促进树突状细胞成熟

根据树突状细胞的成熟实验来确定本申请的抗体是否可以促进树突状细胞的成熟以及能否调节树突状细胞表面MHC II类分子和分泌因子的表达。

将正常志愿者的PBMC加入6孔板中；37℃孵育2h，轻柔洗掉未贴壁的细胞；添加1000U/mL的GM-CSF+500U/mL的IL-4，37℃孵育7天；收集细胞，10％FBS的培养基洗1次后重悬计数；将刺激激活的树突状细胞铺入96孔板；将DMEM、同种型抗体、本申请制备的抗体以及参比抗体(即罗氏公司RO7009789)分别加入96孔板，37℃孵育24h；取上清用于IL-12的ELISA检测；收集细胞，FACS缓冲液洗2次后，进行MHC II和CD80的流式检测。

结果如图6所示，测试抗体可以促进树突状细胞的成熟，刺激树突状细胞释放IL-12(P40)(图6A)，并上调树突状细胞表面MHC II类分子的表达(图6B)；而且测试抗体的刺激效果优于参比抗体，这表明本申请的抗体在刺激树突状细胞成熟和活化方面具有优势。

实施例9.抗体的体内刺激实验

使用人CD40KI鼠验证本申请的抗体是否可以刺激hCD40KI鼠体内特异性T细胞的增殖。采用CD40KI鼠(购于百奥赛图)，第0天腹腔给药(i.p.)；第6天时取抗凝全血提取白膜层；流式仪检测外周血PBMC中CD8+CD44+OT1+的百分比。

在本实验中，给药1次，测试的抗CD40抗体(1D7)、参比抗体或同种型相应的对照抗体(抗-KLH，即OVA+polyIC:LC组)剂量均为5mg/kg。结果如图7所示，测试抗体可以激活hCD40KI鼠体内特异性T细胞，刺激hCD40KI鼠体内特异性T细胞的增殖，增加比例大约为6％左右；而且测试抗体的刺激效果比较平稳，优于参比抗体。

实施例10.抗体在免疫基础上的抑瘤实验

使用已刺激的人CD40KI鼠验证本申请的抗体是否可以抑制小鼠皮下移植瘤B16-OVA的生长。在即将注射肿瘤(仅注射一次)之前，经腹膜内注射本申请的抗CD40抗体或相应的同种型对照抗体(抗KLH抗体,图8中所示的poly IC+OVA组)。抗体的注射剂量为5mg/kg。经皮下注射肿瘤细胞(黑素瘤B16-OVA细胞)，浓度为1x10⁶个细胞/只动物。使用测径器，于植入后12天时测量肿瘤的生长。对瘤体积数据进行统计学分析。

测试抗体显著抑制B16-OVA瘤体积的增加，抑制率达到65％，优于参比抗体(图8中所示的poly IC+OVA+positive组)。此实验结果示于图8中，图中每一点表示来自单个动物的测定值。这表明本申请的抗体抑制B16-OVA的生长，具有免疫疫苗的功能。

实施例11.抗CD40抗体的序列

为了分析所产生抗体的结构，我们提取抗CD40单克隆抗体的杂交瘤中克隆出编码重链与轻链片段的核酸。克隆与序列分析方法如下：采用TRIzol法从分泌抗CD40抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA，使用PrimeScript^TM1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录RNA获得cDNA。使用GenScript的快速扩增标准操作规程扩增抗体的VH和VL。将扩增的VH和VL分别构建入载体中，通过单克隆PCR获得插入正确大小片段的克隆。测序获得的5个克隆，经过序列比对获得VH和VL的基因序列，其中单克隆抗体1D7、10H5和ADD9D5的重链DNA序列如SEQID NO:8，12和16所示，其从5’端至3’端依次为：先导序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4；单克隆抗体1D7、10H5和ADD9D5的轻链DNA序列如SEQ ID NO:10，14和18所示，其从5’端至3’端依次为：先导序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4；单克隆抗体1D7、10H5和ADD9D5的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:9，13和17所示，其从N端至C端依次为：先导序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4；以及单克隆抗体1D7、10H5和ADD9D5的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:11，15和19所示，其从N端至C端依次为：先导序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

实施例12.抗CD40抗体序列的人源化

根据实施例11中的测序结果，将小鼠的CDR区移植进入人IgG1的框架中，然后采用计算机辅助技术将连接区进行相应的突变，不同轻、重链组合形成多种人源化抗体，结果示于表5中，将不同的轻重链组合得到的人源化抗体，在哺乳动物细胞中表达并纯化。

最终，获得的全人源化的抗体的重链和轻链的组合方式如表5所示，其中得到的15种全人源化的抗体分别以Hu1D7-1,Hu1D7-2,Hu1D7-3,Hu1D7-4,Hu1D7-5,Hu1D7-6,Hu1D7-7,Hu1D7-8,Hu1D7-9,Hu1D7-10,Hu1D7-11,Hu1D7-12,Hu1D7-13,Hu1D7-14和Hu1D7-15表示；其中表6显示了重链的人源化氨基酸序列，表7显示了轻链的人源化氨基酸序列，其中加阴影的位点为回复突变位点，1D7VK.1是CDR移植的，没有回复突变。

表5人源化抗体轻重链的组合方式

实施例13.人源化CD40抗体的功能实验

采用HEK Blue::CD40L细胞的NF-kB报告系统来验证人源化抗体的体外活性。HEKBlue::CD40L细胞与不同浓度的抗体于5％CO₂的37℃细胞培养箱孵育20h；取细胞上清与Quanti Blue于37℃中孵育1h，620nm下检测OD值。

经过验证，人源化的CD40抗体与本发明提供的小鼠原型抗体1D7具有相当的体外活性，即其活性未发生较大变化。在高浓度组人源化CD40抗体的体外活性明显优于参比抗体。在低浓度组人源化抗体的体外活性与参比抗体相当。此实验结果示于图9中。图9C显示了人源化抗CD40单克隆抗体在有二抗的情况下的体外细胞功能，说明本申请的抗体可以与二抗形成交联复合物，然后与人CD40的胞外蛋白区结合并激发下游信号通路。图9A-B显示了人源化抗CD40单克隆抗体在没有二抗的情况下的体外细胞功能，说明本申请的抗体可以在游离状态下与人CD40的胞外蛋白区结合并激发下游信号通路，这一作用具有一定的量效关系。

实施例14.人源化CD40抗体的结合实验

采用HEK Blue::CD40L细胞进行验证人源化抗体的结合活性。将HEK Blue::CD40L细胞和不同浓度的人源化CD40抗体于4℃孵育30min；FACS缓冲液洗2次；抗体组加入1:20稀释的二抗，4℃孵育30min；FACS缓冲液洗1次，FACS缓冲液重悬，上机检测。

经过验证，人源化的CD40抗体与小鼠原型抗体1D7具有相当的结合活性，即其结合活性并未因为人源化而发生较大变化。实验结果示于图10中。

经过实施例13和14选择功能和结合力与未人源化的抗体相当的人源化CD40抗体11#(Hu1D7-11)和15#(Hu1D7-15)作为后续实验的对象。

实施例15.人源化CD40抗体的EC50值检测

采用HEK Blue::CD40L细胞的NF-κB报告系统进行人源化CD40抗体的EC50值检测。HEK Blue::CD40L细胞与一定浓度梯度的抗体于5％CO₂的37℃细胞培养箱中孵育20h；取细胞上清与Quanti Blue于37℃下孵育1h，620nm下检测OD值。检测抗体的EC50值大约在10^- ⁹nM。此实验结果示于图11中。图11A显示了人源化抗CD40单克隆抗体11#(Hu1D7-11)与表达人CD40蛋白的细胞在不同浓度下的结合拟合曲线，其EC50值为0.251nM，R²为0.9996。图11B显示了人源化抗CD40单克隆抗体Hu1D7-15#(Hu1D7-15)与表达人CD40蛋白的细胞在不同浓度下的结合拟合曲线，其EC50值为0.1508nM，R²为0.9979。图11C对人源化抗CD40单克隆抗体的EC50值进行了总结。

实施例16.人源化CD40抗体的KD值检测

采用Fortebio检测制备的人源化CD40抗体的亲和力。抗体包被传感器后，进行结合和解离曲线的拟合，从而获得结合解离常数。测试抗体的结合解离常数显示于表8中。

表8人源化CD40抗体的解离常数

抗体	Kon(1/Ms)	Koff(1/s)	KD(M)	R<sup>2</sup>
					Hu1D7-11	4.81×10<sup>4</sup>	3.68×10<sup>-3</sup>	7.64×10<sup>-8</sup>	0.915197
Hu1D7-15	8.59×10<sup>4</sup>	4.43×10<sup>-8</sup>	5.16×10<sup>-8</sup>	0.909259
					参比抗体	2.59×10<sup>4</sup>	＜1.0×10<sup>-7</sup>	＜1.0×10<sup>-12</sup>	0.966883

注：参比抗体未出现解离曲线，数据只作为参考。

在本实施例中，罗氏公司的参比抗体(IgG2亚型抗体)的Kon值与本发明抗体制备的人源化抗体接近，但是参比抗体结合后并没有解离，参见图12A-C，其中图12C说明参比抗体可以与人CD40蛋白结合但是无法解离，因此本申请制备的抗体的安全性优于参比抗体。

实施例17.人源化CD40抗体的体内刺激实验

使用人CD40KI鼠验证本申请制备的人源化CD40抗体是否可以刺激hCD40KI鼠体内特异性T细胞的增殖。

采用CD40KI鼠(购于百奥赛图)，第0天腹腔给药(i.p.)。第6天时取抗凝全血提取白膜层；流式细胞仪检测外周血PBMC中CD8+CD44+OT1+的百分率。第6天给予第二次给药。第6天时取抗凝全血提取白膜层；流式机检测外周血PBMC中CD8+CD44+OT1+的百分率。

在本实验中，本申请制备的人源化抗CD40抗体、参比抗体或同种型相应的对照抗体(抗KLH)剂量均为5mg/kg，2次给药。本申请制备的人源化CD40抗体在给药后第6天可以刺激hCD40KI鼠体内特异性T细胞的增殖，增加比例大约为6％左右。本申请制备的人源化CD40抗体在给药后第12天可以强化刺激hCD40KI鼠体内特异性T细胞的增殖，增加比例大约为25％左右。测试抗体的刺激效果明显优于罗氏公司的参比抗体。

实验结果示于图13中。图13A为人源化抗CD40单克隆抗体15#(Hu1D7-15)对hCD40KI鼠的体内刺激实验结果，其表明本申请的抗体可以激活hCD40KI鼠体内特异性T细胞。图13B为人源化抗CD40单克隆抗体15#(Hu1D7-15)对hCD40KI鼠的二次体内刺激实验结果，其表明本申请的抗体在一定周期内再次给药可以加强hCD40KI鼠体内特异性T细胞的活化。图13C对人源化抗CD40单克隆抗体15#(Hu1D7-15)对hCD40KI鼠的二次体内刺激实验结果进行了总结。

实施例18.人源化CD40抗体对B16-OVA皮下移植瘤的抑制实验

使用已刺激的人CD40KI鼠验证本申请的CD40抗体是否可以抑制小鼠皮下移植瘤B16-OVA的生长。

经皮下注射肿瘤细胞(B16-OVA细胞)，浓度为1x10⁵个细胞/只动物。在注射肿瘤(仅注射一次)之后第7天，经腹膜内注射本申请制备的人源化CD40抗体或同种型相应的对照抗体(抗-KLH)，每6天一次给药，共两次给药。抗体的注射剂量为5mg/kg。使用测径器，测量肿瘤的生长。对瘤体积数据进行统计学分析。测试抗体可以抑制B16-OVA瘤体积的增加，抑制率达到45％。此实验结果示于图14中。图中每一点表示来自单个动物的测定值。图14A为人源化抗CD40单克隆抗体的整体抑瘤曲线，其表明本申请的抗体可以明显抑制hCD40KI鼠的B16-OVA皮下移植瘤的生长。图14B为人源化抗CD40单克隆抗体15的个体抑瘤曲线，其也证实了本申请的抗体可以抑制hCD40KI鼠的B16-OVA皮下移植瘤的生长。

测试抗体对小鼠的体重未造成明显影响，如图15A-B所示。这表明本申请的抗体对荷瘤(B16-OVA)hCD40KI鼠无毒性作用，不会引起其体重的较大变化，指示抗体的安全性良好。

此外，我们还观测记录了小鼠的生存期。对生存数据进行统计学分析。如图16所示，测试抗体可以延长荷瘤(B16-OVA)鼠的生存期。

实施例19.人源化CD40抗体对MC38皮下移植瘤的抑制实验

在本实施例中，经皮下注射肿瘤细胞(MC38细胞)，浓度为5x10⁵个细胞/只动物。在注射肿瘤(仅注射一次)之后第10天，经腹膜内注射本申请提供的人源化CD40抗体或同种型相应的对照抗体(抗-KLH)，1周2次给药，共4次给药。抗体的注射剂量为15mg/kg。使用测径器，测量肿瘤的生长。对瘤体积数据进行统计学分析。测试抗体可以抑制MC38瘤体积的增加。此实验结果示于图17中。图中每一点表示来自单个动物的测定值。图17A为人源化抗CD40单克隆抗体(Hu1D7-11和Hu1D7-15)的整体抑瘤曲线，其表明本申请的抗体可以明显抑制hCD40KI鼠的MC38皮下移植瘤的生长。图17B为人源化抗CD40单克隆抗体(Hu1D7-11和Hu1D7-15)的个体抑瘤曲线，其也证实了本申请的抗体可以抑制hCD40KI鼠的MC38皮下移植瘤的生长。

测试抗体对小鼠的体重未造成明显影响，如图18A-B所示。这表明本申请的抗体对对荷瘤(MC38)hCD40KI鼠无毒性作用，不会引起其体重的较大变化，指示抗体的安全性良好。

可以理解，尽管本申请以上述具体形式描述了所涉及的发明，但这些发明并不局限于这些具体形式描述的特定内容。对本领域的技术人员显而易见的是，在不偏离本申请所描述的发明精神的前提下，还可对其中所涉及的发明包含的技术特征进行各种等同变化，这些变化都应该属于所述发明的范围之内。

序列表

<110> 北京免疫方舟医药科技有限公司

<120> 抗CD40抗体及其应用

<130> 18C12378CN

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Tyr Tyr Met Tyr

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Tyr Ile Asn Asn Gly Gly Asp Ser Thr His Tyr Pro Asp Ile Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Tyr Ile Asn Asn Ala Gly Asp Ser Thr His Tyr Pro Asp Ile Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Leu Gly Pro Gly Gln Gly Gly Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Tyr Thr Ser Arg Leu Lys Ser

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr

1 5

<210> 8

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgaacttgg ggctcagcct gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt ccagtgtgaa 60

gtgaagctgg tggagtctgg gggaggctta atgcagcctg gagggtccct gaacctctcc 120

tgtgcagcct ctggattcac tttcagtgac tattacatgt attgggttcg ccagactcca 180

gagaagaggc tggagtgggt cgcttacatt aataatggtg gtgatagcac ccattatcca 240

gacattgtaa agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300

caaatgagcc gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgcaag actaggaccg 360

ggacagggtg gctggtattt cgatgtctgg ggcacaggga ccacggtcac cgtctcctca 420

<210> 9

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Asn Leu Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Met Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Asn Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Asp Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Tyr Ile Asn Asn Gly Gly Asp Ser Thr His Tyr Pro

65 70 75 80

Asp Ile Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Pro Gly Gln Gly Gly Trp Tyr Phe Asp

115 120 125

Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

<210> 10

<211> 381

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgatgtcct ctgctcagtt ccttggtctc ctgttgctct gttttcaagg taccagatgt 60

gatatccaaa tgacacagac tacattctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 120

atcagttgca gggcaagtca ggacattagc tattatttaa actggtatca gcagaaacca 180

gatggaactc ttaaactcct gatctactac acatcaagat taaaatcagg agtcccatca 240

aggttcagtg gcagtgggtc tggagcagat tattctctca ccattagcaa cctggaacaa 300

gaagatgttg ccacttactt ttgccaacag ggaaatacgc ttccgtggac gttcggtgga 360

ggcaccaagc tggaaatcaa a 381

<210> 11

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln

1 5 10 15

Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Phe Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp

35 40 45

Ile Ser Tyr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Leu

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Asn Leu Glu Gln Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn

100 105 110

Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125

<210> 12

<211> 426

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgaagttgt ggctgaactg gattttcctt gtaacacttt taaatggtat ccagtgtgag 60

gtgaagctgg tggagtctgg aggaggcttg gtacagcctg ggggttctct gagtctctcc 120

tgtgcagctt ctggattcac cttcactgat tactacatga gctgggtccg ccagcctcca 180

gggaaggcac ttgagtggtt gggttttatt agaaacaaac ctaatggtta cacaacagag 240

tacagtgcat ctgtgaaggg tcggttcacc atctccagag ataattccca aagcatcctc 300

tatcttcaaa tgaatgccct gagagctgag gacagtgcca cttattactg tgcaagatat 360

ggggggaaac taactgggtt ctactttgac tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc 420

tcctca 426

<210> 13

<211> 142

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly

1 5 10 15

Ile Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Thr Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu

50 55 60

Glu Trp Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Pro Asn Gly Tyr Thr Thr Glu

65 70 75 80

Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

85 90 95

Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu Arg Ala Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Gly Gly Lys Leu Thr Gly Phe Tyr

115 120 125

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

130 135 140

<210> 14

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgtcctctg ctcagttcct tggtctcctg ttgctctgtt ttcaaggtac cagatgtgat 60

atccagatga cacagactac atcctccctg tctgcctctc tgggagacag agtcaccatc 120

agttgcaggg caagtcagga cattaggaaa tatttaaact ggtatcagca gaaaccagat 180

ggaactgtta aactcctgat ctactacaca tcaagattac actcaggagt cccatcaagg 240

ttcagtggca gtgggtctgg aacagattat tctctcacca ttagcaacct ggagcaagaa 300

gatattgcca cttacttttg ccaacagggt aatacgcttc cgtggacgtt cggtggaggc 360

accaagctgg aaatcaaa 378

<210> 15

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln Gly

1 5 10 15

Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala

20 25 30

Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile

35 40 45

Arg Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys

50 55 60

Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn

85 90 95

Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr

100 105 110

Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125

<210> 16

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atgaacttgg ggctcagctt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt ccaatgtgaa 60

gtgaagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactcacc 120

tgtgcagcct ctggattcac tttcagtgac tattacatgt attgggttcg ccagactcca 180

gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtaatagtg gtggtaacac ctattatcca 240

gacactgtaa agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagagcac cctgttcctg 300

caaatgagcc gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt tctgtgcaag actttctccg 360

ggactgggtg gattctactt tgactactgg ggccaaggca cctctctcac agtctcctca 420

<210> 17

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Met Asn Leu Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Asp Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Asn Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro

65 70 75 80

Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser

85 90 95

Thr Leu Phe Leu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Leu Ser Pro Gly Leu Gly Gly Phe Tyr Phe Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Leu Thr Val Ser Ser

130 135 140

<210> 18

<211> 381

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

atgatgtcct ctgctcagtt ccttggtctc ctgttgctct gttttcaagg taccagatgt 60

gatatccaga tgacacagac tccatcctcc ctgtctgcct ctctgggagg cagagtcacc 120

atcacttgca gggcaggtca ggacattagc aaatatttaa actggtatca gcagaaacca 180

gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacgctcagg ggtcccatca 240

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggaacaa 300

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaattccc ttccgtggac gttcggtgga 360

ggcaccaagc tggaaatcaa a 381

<210> 19

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln

1 5 10 15

Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Leu Gly Gly Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Gln Asp

35 40 45

Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn

100 105 110

Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125

<210> 20

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Met Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Asn Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asn Asn Gly Gly Asp Ser Thr His Tyr Pro Asp Ile Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Pro Gly Gln Gly Gly Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 21

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Met Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Asn Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asn Asn Ala Gly Asp Ser Thr His Tyr Pro Asp Ile Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Pro Gly Gln Gly Gly Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 22

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asn Asn Gly Gly Asp Ser Thr His Tyr Pro Asp Ile Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Pro Gly Gln Gly Gly Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 23

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asn Asn Gly Gly Asp Ser Thr His Tyr Pro Asp Ile Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Pro Gly Gln Gly Gly Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 24

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asn Asn Gly Gly Asp Ser Thr His Tyr Pro Asp Ile Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Pro Gly Gln Gly Gly Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 25

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Phe Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Leu Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 26

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 27

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Leu Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 28

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Leu Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 29

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Leu Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 30

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Leu Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

Claims

1.特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分，其包含含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区以及含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区，其中所述HCDR1序列为DYYMY(SEQ ID NO: 1);所述HCDR2序列为YINNGGDSTHYPDIVKG (SEQ ID NO: 2)或YINNAGDSTHYPDIVKG (SEQ ID NO: 3)；所述HCDR3序列为LGPGQGGWYFDV (SEQ ID NO: 4)；所述LCDR1序列为RASQDISYYLN (SEQ ID NO: 5)；所述LCDR2序列为YTSRLKS (SEQ ID NO:6)；以及所述LCDR3序列为QQGNTLPWT (SEQ ID NO: 7)；

其中所述抗原结合部分选自Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段、Fv片段和scFv片段。

2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述重链包含选自SEQ ID NOs:20-24任一项的氨基酸序列。

3.如权利要求2所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述重链包含SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列。

4.如权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述轻链包含选自SEQID NOs: 25-30任一项的氨基酸序列。

5.如权利要求4所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述轻链包含选自SEQ ID NOs:26和30所示的氨基酸序列。

6.如权利要求1-3和5中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分特异性结合于灵长类CD40。

7.如权利要求4所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分特异性结合于灵长类CD40。

8.如权利要求6所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述灵长类CD40选自人CD40和猴CD40。

9.如权利要求7所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述灵长类CD40选自人CD40和猴CD40。

10.如权利要求1-3、5和7-9中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体为人源化抗体。

11.如权利要求4所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体为人源化抗体。

12.如权利要求6所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体为人源化抗体。

13.如权利要求10所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体为抗人CD40-IgG4亚型单克隆抗体。

14.如权利要求11或12所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体为抗人CD40-IgG4亚型单克隆抗体。

15.如权利要求10所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的重链可变区的序列如SEQ ID NO: 23所示，以及所述抗体的轻链可变区的序列如SEQ ID NO: 26或30所示。

16.如权利要求11或12所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的重链可变区的序列如SEQ ID NO: 23所示，以及所述抗体的轻链可变区的序列如SEQ ID NO: 26或30所示。

17.如权利要求1-3、5、7-9、11-13和15中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分以1×10^-8至10×10^-8M的KD特异性结合于CD40分子。

18.如权利要求4所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分以1×10^-8至10×10^-8M的KD特异性结合于CD40分子。

19.如权利要求6所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分以1×10^-8至10×10^-8 M的KD特异性结合于CD40分子。

20.如权利要求10所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分以1×10^-8至10×10^-8 M的KD特异性结合于CD40分子。

21.如权利要求14所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分以1×10^-8至10×10^-8 M的KD特异性结合于CD40分子。

22.如权利要求16所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分以1×10^-8至10×10^-8 M的KD特异性结合于CD40分子。

23.如权利要求17所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体具有CD40激动剂功能，能够诱导树突状细胞的成熟和/或T细胞活化。

24.如权利要求18-22中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体具有CD40激动剂功能，能够诱导树突状细胞的成熟和/或T细胞活化。

25.药物组合物，其包含权利要求1-24中任一项所述的抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体。

26.疫苗，其包含权利要求1-24中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。

27.如权利要求26所述的疫苗，其还包含免疫佐剂。

28.多核苷酸分子，其编码权利要求1-24中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。

29.表达载体，其包含权利要求28所述的多核苷酸分子。

30.宿主细胞，其包含权利要求28所述的多核苷酸分子或权利要求29所述的表达载体。

31.权利要求1-24中任一项所述的抗体或其抗原结合部分在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的用途。

32.如权利要求31所述的用途，其中所述药物为疫苗。

33.如权利要求31或32所述的用途，其中所述肿瘤选自胰腺癌、黑素瘤、间皮质瘤、恶性血液瘤、淋巴瘤、晚期实体瘤以及上述的转移瘤。