CN116262790A - 嵌合的抗cd27抗体组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了嵌合的抗CD27抗体分子组合物及其应用。本申请的抗CD27抗体分子能够与CD27特异性结合，具有刺激淋巴细胞增殖、活化淋巴细胞等效果。

Description

嵌合的抗CD27抗体组合物及其应用
技术领域
本申请涉及抗体领域，更具体地，本申请涉及抗CD27的抗体组合物及其应用。
背景技术
CD27共刺激分子是一个分子量为120kDa的I型跨膜分子，属于 TNFR超家族成员，主要在大部分T细胞(幼稚T细胞、活化T细胞)、记忆性B细胞和一些NK细胞上表达。当免疫细胞活化时，CD27的表达水平会上调，在T细胞活化时，CD27及其配体会与TCR协调作用。目前已知CD27只有一个配体分子-CD70，CD70在活化的淋巴细胞(B细胞、T细胞)和DC(树突状细胞)上瞬时表达。CD27-CD70相互作用招募胞浆内的TRAFs蛋白，进而活化NF-κB和JNK信号通路，引发包括T细胞活化、增殖、存活和细胞毒等一系列细胞反应。因此，在杀伤肿瘤和抗病毒感染过程中，CD27-CD70作用促进T细胞的激活、分化和产生记忆性等免疫过程，T细胞的活化不仅促使T细胞表面 CD27表达增强，同时活化的T细胞会分泌sCD27(可溶性CD27，分子量为28～32KD)；sCD27会与CD70结合，抑制CD70与细胞表面表达的CD27结合，从而抑制T细胞的持续增殖，起到反馈调节的作用。除了调控T细胞反应，CD27对于生发中心的B细胞扩增以及部分NK 细胞分泌IFN-γ等均有促进作用。通过调控CD27靶点可以增强宿主抗肿瘤作用。
因此，开发CD27靶向抗体有望用于治疗包括肿瘤在内的CD27 相关疾病。目前，仅有Celldex Therapeutics(塞德斯医疗公司)的 Varlilumab(CDX-1127，I/II期临床)和CDX-527(CD27&PD-L1双特异性抗体，I期临床)处于I/II期临床。由于Varlilumab为高亲和力的IgG1亚型抗体，ADCC及CDC是其主要作用机制；考虑到CD27 在免疫细胞上的组成型表达，则靶向CD27的高亲和力IgG1亚型抗体会由于ADCC及CDC而导致对正常免疫细胞的杀伤，从而有可能影响机体的正常免疫功能。
本申请的发明人研发了新的抗CD27抗体，并对其特性和相关应用进行了研究。
发明内容
第一方面，本申请提供了一种特异性结合CD27分子的抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、 HCDR2和/或HCDR3序列。在一些实施方案中，所述HCDR1包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HCDR2序列包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述 HCDR3序列包含SEQ ID NO：3或4的氨基酸序列。在可选的实施方案中，上述抗原结合部分选自Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv 片段、scFv片段、Fd片段和单域抗体。
在一些实施方案中，特异性结合CD27的抗体或其抗原结合部分还包含轻链可变区，其中所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和/或 LCDR3序列。在某些实施方案中，所述LCDR1序列包含SEQ ID NO： 12的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述LCDR2序列包含SEQID NO：13的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述LCDR3序列包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
在一些实施方案中，特异性结合CD27的抗体或其抗原结合部分的重链包含与SEQID NO：6所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列，优选地，所述重链包含SEQID NO：6所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一方面所述的抗体或其抗原结合部分的轻链包含SEQ IDNOs：15-22任一项的氨基酸序列或者与上述序列具有至少80％同源性的氨基酸序列，优选地，所述轻链包含SEQ ID NO：15 所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一方面所述的特异性结合CD27的抗体为单克隆抗体，例如鼠源单克隆抗体。
在一些实施方案中，第一方面所述的特异性结合CD27的抗体为人源化抗体。
在一些实施方案中，第一方面所述的特异性结合CD27的抗体为人-鼠嵌合抗体。
在一些实施方案中，本文公开的抗CD27抗体或其抗原结合部分与抗体6D8-G98A结合CD27上的相同表位，或者与6D8-G98A竞争结合于CD27。在一些实施方案中，所述抗体的重链序列如SEQ ID NO： 6所示，以及所述轻链序列如SEQ ID NO：15所示。
在一些实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合部分能够诱导 T细胞活化。在一些实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合部分能够抑制肿瘤细胞的生长。
第二方面，本申请提供了药物组合物，所述组合物包含第一方面所述的抗CD27抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，所述组合物还包含一种或多种其他活性成分。在一些实施方案中，所述活性成分为抗肿瘤药物或抗病毒感染药物。
在一些实施方案中，所述组合物用于治疗CD27相关的疾病。
第三方面，本申请提供了上述抗CD27抗体或其抗原结合部分、或者上述组合物在制备用于预防或治疗CD27相关疾病，例如肿瘤或病毒感染的药物中的应用。
在一些实施方案中，所述肿瘤包括结肠癌、肝癌、淋巴瘤、胃癌、肺癌、头颈鳞癌、或其转移癌等。
在某些实施方案中，上述组合物被配制成药学上可接受的剂型，优选为注射剂或植入剂。在某些实施方案中，包含本发明抗癌有效成分的药物以注射、灌注或植入的方式给药。
在其他方面，本申请提供了预防或治疗CD27相关疾病的方法，其包括给予有需要的个体第一方面所述的抗体或其抗原结合部分、或第二方面所述的药物组合物。
本申请的抗CD27抗体或其抗原结合部分能够特异性与CD27结合，具有以下的一种或多种效应：产生T细胞增殖和活化所需的第二信号，促进抗原特异性T细胞的增殖和活化；刺激机体产生免疫应答；促进T细胞对癌细胞的杀伤作用；具有不依赖于ADCC和CDC的免疫细胞刺激活性；和/或抑制肿瘤生长等。
附图的简要说明
图1为通过信号报告检测法测定鼠抗人CD27杂交瘤细胞培养上清的结果图，显示了部分鼠抗人CD27杂交瘤细胞株 (Clone116-Clone138)培养上清信号报告测定结果。
图2为候选鼠抗人CD27抗体信号报告测定法功能验证图，显示了6D8，20C9和31G9培养上清抗体测定的结果。
图3为通过流式细胞术测定候选鼠抗人CD27抗体与人CD27细胞系结合的结果图，显示了6D8，20C9和31G9培养上清抗体与表达 hCD27的细胞的结合率。
图4显示了人CD27配体阻断实验的结果。
图5为候选鼠抗人CD27抗体与猴CD27结合的ELISA结果图，显示了候选单克隆杂交瘤细胞株抗体6D8，20C9和31G9与猴CD27 的结合。
图6显示了候选鼠抗人CD27抗体6D8与人CD27蛋白结合解离曲线图，图6A为6D8结合解离曲线，图6B为Varlilumab抗体结合解离曲线。
图7A-B显示了基于HEK：：CD27细胞进行的6D8抗体人源化抗体细胞功能测试的结果，图7A添加了二抗，图7B没有添加二抗。
图8显示了6D8-G98A抗体体内共刺激实验的结果，证实了 6D8-G98A抗体刺激B-hCD27小鼠的T细胞增殖。
图9显示了6D8-G98A抗体体内药效实验中小鼠的肿瘤体积变化曲线。
具体实施方式
本申请提供了特异性结合于CD27的新型抗CD27抗体或其抗原结合部分。在优选实施方案中，本申请的抗体或其抗原结合部分结合于T细胞表面的CD27并激活T细胞。本申请还提供了包含上述抗CD27抗体或其抗原结合部分的组合物以及所述抗体或其抗原结合片段的医学和生物学应用，例如预防或治疗CD27相关疾病或病症。本申请还涵盖使用所述抗体或其抗原结合片段来检测CD27及调节 CD27活性的方法以及相关试剂盒。
为容易地理解本申请，首先定义本文中使用的某些术语。
本文所用术语“抗体”指包含四条多肽链，即通过双硫键互连的两条重链(H)链及两条轻链(L)的免疫球蛋白分子，以及其多聚体(例如 IgM)。各重链包含重链可变区(缩写为VH)及重链恒定区(缩写为CH)。重链恒定区包含三个域，即CH1、CH2及CH3。各轻链包含轻链可变区(缩写为VL)及轻链恒定区(缩写为CL)。轻链恒定区包含一个域 (CL1)。VH及VL区可进一步细分成称为互补决定区(CDR)的高变区，其中穿插有称为构架区(FR)的保守区。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”是指负责结合抗原的完整抗体分子的一部分或区段。抗原结合域可以包含重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)或上述两者。抗体的抗原结合片段可使用任何适合的标准技术从完整抗体分子制备，所述标准技术包括蛋白水解消化或重组遗传工程化技术等。抗原结合部分的非限制性实例包括：Fab片段； F(ab′)2片段；Fd片段；Fv片段；单链Fv(scFv)分子；单域抗体；dAb 片段及由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元(例如分离的CDR)。术语“抗原结合部分”也包括其它工程化的分子，如双抗体、三抗体、四抗体及微型抗体等。
本领域技术人员公知，互补决定区(CDR，通常有CDR1、CDR2 及CDR3)是可变区中对抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。VH 或VL的CDR序列有两种常见的定义方式，即kabat定义和Chothia 定义，例如参见Kabat et al，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)； A1-Lazikani et al.，J.Mol.Biol.273∶927-948(1997)；以及Martin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86∶9268-9272(1989)。对于给定抗体的可变区序列，可以根据Kabat定义或者Chothia定义来确定VH和VL序列中CDR区序列。在本申请的实施方案中，利用Kabat定义CDR序列。在本文中，重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3分别简称为HCDR1、 HCDR2及HCDR3；轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3分别简称为LCDR1、LCDR2及LCDR3。
对于给定抗体的可变区序列，可以通过多种方式分析可变区序列中CDR区序列，例如可以利用在线软件Abysis确定 (http：//WWW.abysis.org/)。
如本文所用术语“特异性结合”，是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体至抗原表位的结合，例如抗体以比其对非特异性抗原的亲和性大至少两倍的亲和性结合于特异性抗原的能力。然而应了解，抗体能够特异性结合于两种或更多其序列相关的抗原。例如，本发明的抗体可特异性结合于人类与非人类(例如小鼠或非人类灵长动物)的 CD27。
本文所用术语“单克隆抗体”指由基本同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能在少量个体中存在自然发生的突变以外，组成群体的各个抗体是相同的。本文所述单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于具体物种或属于具体抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而重链和/或轻链的余下部分与来源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，并且还包括这样的抗体的片段，只要它们能表现出所期望的生物学活性(参见，美国专利号4,816,567；和Morrisonet al，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 81：6851-6855(1984))。
如本文所用，术语“同源性”被定义为经过序列比对和引入空位后，氨基酸或核苷酸序列变体中相同的残基的百分比，如果需要，达到最大百分比的同源性。用于比对的方法和计算机程序在本领域内是公知的。本文所述的“至少80％同源性”是指同源性为80％至100％的任一值，例如85％、90％、95％、99％等。
如本文所用，术语“CD27相关疾病”包括与CD27信号通路相关的疾病和/或症状。示例性CD27相关疾病或病症包括病毒感染和肿瘤，例如结肠肿瘤等。
本申请特异性结合CD27的抗体或其抗原结合部分体包含重链可变区和/或轻链可变区。下表1-5中示例性列出了适用于本申请公开的抗体的CDR、重链和轻链氨基酸序列。在某些实施方案中，抗CD27 抗体或其抗原结合部分包含HCDR1、HCDR2和/或HCDR3序列，其独立地选自表1中所示的HCDR1、HCDR2或HCDR3序列中任一者。在某些实施方案中，本申请的抗CD27抗体可进一步包含轻链CDR，其独立地选自表2中所示的轻链CDR1、CDR2或CDR3序列中任一者。举例而言，本申请的抗CD27抗体可包含表3中所示的重链中的任一者，任选地与表4中所示的轻链的任一者配对。
表1：示例性抗CD27抗体的重链CDR氨基酸序列
Figure BDA0003412516600000071
表2：示例性抗CD27抗体的轻链CDR氨基酸序列
Figure BDA0003412516600000072
表3：示例性抗CD27抗体的重链氨基酸序列
抗体编号 重链氨基酸序列
6D8 SEQ ID NO.5
6D8-G98A SEQ ID NO.6
Hu6D8-1至Hu6D8-6 SEQ ID NO.8
Hu6D8-7至Hu6D8-12 SEQ ID NO.9
Hu6D8-13至Hu6D8-18 SEQ ID NO.10
Hu6D8-19至Hu6D8-24 SEQ ID NO.11
表4：示例性抗CD27抗体的轻链氨基酸序列
抗体编号 轻链氨基酸序列
6D8 SEQ ID NO.15
6D8-G98A SEQ ID NO.15
Hu6D8-1，Hu6D8-7，Hu6D8-13，Hu6D8-19 SEQ ID NO.17
Hu6D8-2，Hu6D8-8，Hu6D8-14，Hu6D8-20 SEQ ID NO.18
Hu6D8-3，Hu6D8-9，Hu6D8-15，Hu6D8-21 SEQ ID NO.19
Hu6D8-4，Hu6D8-10，Hu6D8-16，Hu6D8-22 SEQ ID NO.20
Hu6D8-5，Hu6D8-11，Hu6D8-17，Hu6D8-23 SEQ ID NO.21
Hu6D8-6，Hu6D8-12，Hu6D8-118，Hu6D8-24 SEQ ID NO.22
在一些实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合部分的HCDR1 为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，HCDR2为 SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，HCDR3选自 SEQ ID NOs：3和4所示的氨基酸序列。例如，HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
本文公开的抗体或其抗原结合部分在包含重链可变区的基础上还可以进一步包含轻链可变区。
在一些实施方案中，所述轻链可变区的CDR1(LCDR1)为SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，LCDR2为SEQ ID NO： 13所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，LCDR3为SEQ ID NO：14 的氨基酸序列。
在具体的实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合部分的重链与选自SEQ IDNOs：5-11的氨基酸序列具有至少80％的同源性，例如 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。在更具体的实施方案中，上述抗体重链由选自SEQID NOs： 5-11任一项的氨基酸序列组成。在具体的实施方案中，上述抗体重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
在具体的实施方案中，本文公开的抗体的轻链与选自SEQ ID NOs：15-22的序列具有至少80％的同源性，例如具有90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。在更具体的实施方案中，所述抗体轻链由选自SEQ ID NOs：15-22任一项的氨基酸序列组成。在具体的的实施方案中，上述抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。
在一些实施方案中，本文公开的抗体的重链或重链可变区、轻链或轻链可变区可以在上述所列举的各自对应的具体氨基酸序列的基础上取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且得到的变体仍保持结合CD27 的活性。
在某些实施方案中，上述氨基酸取代、缺失或添加的数目为1-30 个或1-30之间的任一数值，优选为1-20个，更优选为1-10个。在优选的实施方案中，序列变体与原氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、 7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。在更优选的实施方案中，序列变体与原氨基酸序列相差约1、2、3、4或5个氨基酸的取代、缺失或添加。在具体的实施方案中，所述氨基酸取代为保守性取代。
在优选的实施方案中，本文公开的抗体为抗体6D8-G98A，其重链序列如SEQ IDNO：6所示，轻链序列如SEQ ID NO：15所示。
在一些实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合部分与抗体 6D8-G98A结合CD27上的相同表位，或者与6D8-G98A竞争结合于 CD27。
在一些实施方案中，本文公开的抗体为单克隆抗体。在具体的实施方案中，本文公开的抗体为人源化的抗体。在更具体的实施方案中，抗体为抗人CD27-IgG4亚型单克隆抗体，其相比于IgG1亚型抗体，具有不依赖于ADCC和CDC的免疫细胞刺激活性，在体内可有效抑制肿瘤生长，同时又能减少免疫毒性所导致的潜在副反应。
本文公开的抗体或其抗原结合部分能够特异性结合CD27。在具体的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分特异性结合灵长类CD27 或鼠CD27，或者与灵长类CD27或鼠CD27具有高度同源性的任一物种的CD27。在优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分特异性结合人CD27。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分特异性结合猴CD27。
在一些实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合部分特异性结合CD27分子，并具有低毒性(例如ADCC和CDC较弱)，因此适用于诊断或治疗CD27活性相关疾病，例如癌症。
在一些实施方案中，本文公开的抗体为IgG4亚型抗体，例如抗人 CD27-IgG4亚型单克隆抗体。IgG1亚型抗体通常有很强的抗体依赖的细胞毒性作用(ADCC)和补体依赖的细胞毒性作用(CDC)，ADCC和 CDC是其主要作用机制。考虑到CD27在免疫细胞上的组成型表达，靶向CD27的高亲和力IgG1亚型抗体会由于ADCC及CDC而导致对正常免疫细胞的杀伤，从而有可能影响机体的正常免疫功能。因此，在一些具体实施方案中，发明人通过筛选与人CD27亲合力适中、同时具有激动活性的抗体杂交瘤细胞株，得到了CD27-IgG4亚型抗体。与IgG1亚型抗体相比，所述CD27-IgG4亚型抗体具有不依赖于ADCC 和CDC的免疫细胞刺激活性，在体内可有效抑制肿瘤生长，同时又能减少免疫毒性所导致的潜在副反应。
在一些实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合部分与淋巴细胞表面的CD27结合，刺激机体产生免疫应答，促进T淋巴细胞的增殖、活化和杀伤作用。
例如，发明人对本文公开的抗CD27抗体进行了体外、体内生物学实验，结果表明此抗体能够很好地与CD27分子进行结合，诱导淋巴细胞的活化，和/或抑制肿瘤的生长。
在一些实施方案中，本文公开的抗CD27单克隆抗体的制备方法包括：在表达条件下，培养宿主细胞，从而表达抗CD27单克隆抗体；分离和纯化表达的抗CD27单克隆抗体。利用上述方法，可以将重组蛋白纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。
在一些实施方案中，可以利用亲和层析的方法对本文公开的抗 CD27抗体进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的抗 CD27抗体。
在具体的实施方案中，本文公开的人源化的抗CD27单克隆抗体是通过以下方法得到的：通过人CD27蛋白免疫小鼠、杂交瘤技术，获得可表达抗人CD27抗体的杂交瘤细胞株(系)，然后通过体外ELISA 方法筛选出候选杂交瘤细胞株，并对候选杂交瘤细胞株表达的抗体进行人CD27蛋白的结合、阻断以及交叉反应实验验证。此外，对候选鼠抗人CD27抗体进行体内刺激实验。根据CD27人源化小鼠刺激实验结果，从候选抗体中选出一个进行人源化设计、合成及表达，获取人源抗CD27抗体，并进行亲和力、结合和体外功能实验验证，以及进行后续的体内抗小鼠MC38结肠癌肿瘤生长实验。基于上述实验结果，最终获得新的抗人CD27的人源化抗体，例如嵌合抗体。
本申请提供了药物组合物，其包含本文公开的抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体。本文公开的上述抗CD27抗体例如抗人CD27单克隆抗体，可以和药学上可接受的载体一起配制成药物制剂，从而更稳定地发挥疗效。在一些实施方案中，这些制剂可以保证本文公开的抗CD27抗体例如抗人CD27单克隆抗体的氨基酸核心序列的构像完整性，同时还保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱酰胺或氧化)。在一些实施方案中，对于液体制剂，通常可以在2℃-8℃条件下保存至少稳定一年。在一些实施方案中，对于冻干制剂，在30℃下至少六个月保持稳定。
本申请所述的“药学上可接受的载体”指不干扰活性成分的生物活性有效性的载体，包括制药领域常规使用的那些。本申请的药学上可接受的载体可以为固体或液体，包括药学上可接受的赋形剂、缓冲剂、乳化剂、稳定剂、防腐剂、稀释剂、封装剂、填充剂等。例如，药学上可接受的缓冲剂进一步包括磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐以及碳酸盐等。
本申请的药物组合物可以呈现为单位剂量形式，并且可以通过任一制药领域公知的方法制备。所有方法都包括将本申请的活性成分与一种或几种药学上可接受的载体结合的步骤。通常，通过将活性成分与液体载体、固体载体或二者结合来制备组合物，随后根据需要来定型制备的产物。例如，适于胃肠外给药的组合物可以是包含活性组分的无菌水性或非水性制剂。可以根据已知的方法，使用合适的分散剂或湿润剂以及悬浮剂制备上述制剂。在可接受的载体或溶剂中，可以使用水、林格氏液以及等渗的氯化钠溶液等。
在某些实施方案中，本发明所述的抗体或其组合物被配制成药学上或临床上可接受的任一剂型。在优选的实施方案中，所述剂型为缓释剂。更优选地，配制的剂型为注射剂或植入剂。
本发明的“注射剂”是指由药物制成的供注入体内的溶液(包括乳浊液和混悬液)以及供临用前配成溶液或混悬液的粉末或溶液。所述注射剂包括但不限于水溶液注射剂、微球注射剂、凝胶型注射剂、脂质体注射剂、纳米粒注射剂、储库型控释注射剂、无针注射释药系统等。
本发明的“植入剂”指将药物与辅料制成的小块状或条状供植入体内的无菌固体制剂。植入剂可采用特制的注射器植入，也可用手术切开植入。本发明的植入剂还包括以液体形式注射于人体、在生理条件下转变为固体或半固体药物贮库的植入剂形式，即注射型原位形成植入剂。
在一些的实施方案中，将本发明的抗体组合物制备成局部应用的水溶液。优选地，将所述组合物制备成在相对小体积中抗体浓度较高的水溶液。优选地，用新鲜蒸馏的去离子无菌水来制备用于可注射用溶液的缓冲液。可以使用任何合适的缓冲溶液如磷酸缓冲液、Ringers 缓冲液或Tris缓冲液来配制抗癌组合物。优选的缓冲液的pH范围约为6.0到8.0，优选为6.5到7.5。例如，可以使用浓度为0.1-0.25mol/L、优选0.15-0.2mol/L的氯化钠来溶解或稀释组合物。再例如，使用的磷酸缓冲液的浓度为0.02-0.2mol/L，优选为0.05-0.15mol/L。
本申请还提供了预防或治疗CD27相关疾病的方法，其包括给予个体抗CD27抗体、或者包含抗CD27抗体例如抗人CD27单克隆抗体的组合物。在一些实施方案中，在对包括人在内的动物给药后，抗肿瘤效果明显。具体地说，本文公开的抗CD27抗体能够有效地预防和/或治疗癌症，可以作为抗癌症药物使用。
本申请还提供了抗CD27抗体、或者包含抗CD27抗体的组合物在制备用于预防或治疗CD27相关疾病或症状的药物中的用途。在一些实施方案中，所述CD27相关疾病或症状为病毒感染或肿瘤。
本文所用的“治疗”包括抑制、治愈和减轻癌症或其症状以及预防或延缓原发癌的转移。
在一些实施方案中，所述药物经皮下、肌肉内、腹腔内或静脉给药。
在某些实施方案中，所述癌症可以是原发性癌症，也可以是转移癌。
在一些实施方案中，上述肿瘤为结肠癌、肝癌、淋巴瘤、胃癌、肺癌、头颈鳞癌、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、恶性黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌或其转移癌等。
本文公开的抗人CD27抗体及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因个体的年龄和体重、疾病特性和严重性以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和综合情况，总给药量不能超过一定范围。
抗体或其组合物的施用剂量和频率可根据对疾病进行预防或治疗而变化。在预防性应用中，向尚未处于疾病状态的患者施用含有本申请的抗体或其混合物的组合物以增强患者抵抗力，此量定义为“预防性有效剂量”。在此用途中，具体的剂量又视患者健康状况及全身免疫性而定。通常以相对不频繁的间隔施用相对较低剂量较长时间。在治疗性应用中，有时需要以相对较短间隔施用相对较高剂量直至疾病进展减缓或终止为止，且优选直至患者显示疾病症状部分或完全改善为止。此后，可向患者施用预防性方案。本领域普通技术人员可以容易地根据实际需要掌握具体的剂量和频率。
本文使用的术语“个体”是指哺乳动物，包括但不限于灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫以及诸如大鼠和小鼠的啮齿类动物。优选地，哺乳动物为非人类的灵长类或者人类。特别优选的哺乳动物是人。
本说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”和“含有”意指“包括但不限于”，且并非意图排除其他部分、添加物、组分或步骤。
应该理解，在本申请的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，除非与之矛盾。
上述公开内容总体上描述了本申请，以下实施例是对本申请作进一步的说明，不应理解为对本申请的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，例如参见Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniais， T.(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd edition， Cold spring Harbor Laboratory Press。
实施例
实施例1.抗体体外筛选
人的CD27蛋白购自Sino Biological Inc.(Catalog No.10039-H08B1)，经SDS-PAGE鉴定，纯度在85％以上。用CD27 蛋白免疫Balb/c小鼠，然后用ELISA方法测定小鼠血清抗体滴度。选取血清抗体滴度合适的小鼠，用杂交瘤技术获得杂交瘤细胞株；铺板，获得1000个左右单克隆杂交瘤细胞株；用ELISA方法(包被人CD27 蛋白，二抗为抗小鼠IgG-HRP结合物)测定细胞上清，选取OD值大于 2.0的单克隆细胞株共计200个左右作为候选杂交瘤细胞株。
实施例2.候选杂交瘤细胞株筛选
构建稳定表达人CD27的细胞系(HEK：：CD27细胞)；采用信号报告检测法(signaling reporter assay)筛选候选杂交瘤细胞株，从上述200 个左右的杂交瘤细胞株中，筛选出了16个，如图1所示。
纯化上述16个候选杂交瘤细胞株的细胞培养上清，重复上述检测，选定3个杂交瘤细胞株(6D8，20C9和31G9)用于后续筛选，如图 2所示。
实施例3.人CD27结合实验确认候选杂交瘤细胞株
采用流式细胞术测定上述3株杂交瘤细胞株(6D8，20C9和31G9) 产生的抗体与表达人CD27的细胞的结合能力，结果如图3所示，6D8、 20C9和31G9均与表达人CD27的细胞有较高的结合率(85％以上)。
实施例4.人CD27配体阻断实验
由以上3个候选单克隆细胞株(6D8，20C9和31G9)制备得到的抗体，每种抗体均依次按照1ng、10ng、100ng、1000ng的抗体量，分别与表达hCD27的细胞孵育。将人CD27配体(CD70-hFc融合蛋白) 100ng与上述细胞再次孵育。通过流式细胞术检测，结果如图4所示，随着3种候选抗体的抗体量增加，对hCD27配体与hCD27结合的阻断作用增强；10ng以上时，部分甚至完全阻断hCD27配体与hCD27 的结合。
实施例5.猴CD27结合实验
用猴CD27蛋白包被ELISA板，将10μL和50μL的来自细胞株 6D8、20C9和31G9的培养上清分别与猴CD27孵育，然后加入抗小鼠IgG-HRP二抗再进行孵育，孵育结束并显色后于450nm处测定OD 值，结果如图5所示。10μL和50μL条件下，来自3个候选单克隆细胞株(6D8，20C9和31G9)的抗体均与猴CD27蛋白有较高的结合。
实施例6.抗体体外亲和力测定
本实施例中，利用Reichert4 SPR仪器测定6D8抗体亲和力。
首先在SPR芯片(SR7000 GOLD SENSOR SLIDE，MIXED SELF-ASSEMBLED，PART NO：13206066)上包被人CD27蛋白(Cat： 10039-H03H，购自Sino Biological Inc.)；然后不同浓度的6D8抗体和抗CD27参比抗体(Varlilumab，CDX-1127)上样，与包被有人CD27蛋白的芯片结合；结合完成后，开始洗脱，结合和洗脱过程由设备检测相应的数据并分析，最终获得6D8抗体的结合和解离曲线。根据结合和解离曲线，计算6D8抗体的亲和力。结果如图6、表5所示，与 Varlilumab抗体相比，6D8抗体的亲和力适中，为5.14E-10M，稍低于 Varlilumab(其为1.9E-12M)。
表5抗体亲和力计算结果 6D8抗体
曲线名称 Bmax([Signal（uRIU)]) ka(1/(M*s)) kd(1/s) KD(M)
6D8(2.50e-8)-参考曲线拟合 502.27 1.88E+05 9.69E-05 5.14E-10
6D8(1.25e-8)-参考曲线拟合 400.04 1.88E+05 9.69E-05 5.14E-10
6D8(6.25e-9)-参考曲线拟合 320.45 1.88E+05 9.69E-05 5.14E-10
6D8(5.00e-8)-参考曲线拟合 503.17 1.88E+05 9.69E-05 5.14E-10
Varlilumab
曲线名称 Bmax([Signal(uRIU)]) ka(1/(M*s)) kd(1/s) KD(M)
Varlilumab(1.25e-8)-参考曲线拟合 429.85 1.16E+05 2.14E-07 1.85E-12
Varlilumab(6.25e-9)-参考曲线拟合 432.38 1.16E+05 2.14E-07 1.85E-12
Varlilumab(2.50e-8)-参考曲线拟合 498.18 1.16E+05 2.14E-07 1.85E-12
Varlilumab(5.00e-8)-参考曲线拟合 505.48 1.16E+05 2.14E-07 1.85E-12
实施例7.鼠抗人CD27单克隆抗体6D8的人源化
对候选抗体6D8的轻、重链可变区基因进行扩增和测序，序列提供给南京金斯瑞生物科技有限公司进行人源化序列设计。简而言之，即将小鼠的CDR区移植进入人IgG4抗体轻链和重链可变区的框架中，得到嵌合的6D8，然后采用计算机辅助技术进行相应的回复突变，不同轻、重链组合形成多种人源化抗体，在哺乳动物细胞中表达并纯化。
最终，获得的人源化的抗体的重链和轻链如表6所示，其中得到的24种人源化的抗体分别以Hu6D8-1，Hu6D8-2，Hu6D8-3，Hu6D8-4， Hu6D8-5，Hu6D8-6，Hu6D8-7，Hu6D8-8，Hu6D8-9，Hu6D8-10， Hu6D8-11，Hu6D8-12，Hu6D8-13，Hu6D8-14，Hu6D8-15，Hu6D8-16，Hu6D8-17，Hu6D8-18，Hu6D8-19，Hu6D8-20，Hu6D8-21，Hu6D8-22， Hu6D8-23和Hu6D8-24表示；嵌合的6D8-G98A是在嵌合的6D8基础上将第98位的甘氨酸突变为丙氨酸得到的。上述抗体重链的具体序列如表7所示，轻链的具体序列如表8所示。
表6
Figure BDA0003412516600000171
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Figure BDA0003412516600000181
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Figure BDA0003412516600000191
实施例8.抗体体外结合实验
本实施例采用流式细胞术测定了若干代表性的6D8人源化抗体 (参见表6)与表达hCD27的细胞(HEK：：CD27)的结合率，人源化CD27 抗体量均依次为10ng和100ng；抗体与HEK：：CD27孵育后，利用流式细胞仪检测HEK：：CD27细胞的阳性率。结果如表9所示，与抗CD27 参比抗体(Varlilumab，CDX-1127)相比，6D8-G98A(人鼠嵌合抗体)、 6D8抗体(鼠抗人抗体)以及表9中所示的6D8人源化抗体均能够显著地与表达人CD27的HEK：：CD27细胞结合。
表96D8抗体人源化抗体与HEK：：CD27细胞的结合率及中值
Figure BDA0003412516600000201
实施例9.抗体细胞功能实验
首先在96孔板中加入一定量的HEK：：CD27细胞，然后依次加入 6D8人源化抗体Hu6D8-1至Hu6D8-24(参见表2)，使每一人源化抗体的终浓度分别为1μg/mL；加入3倍人源化抗体浓度的Anti-human IgG Fc(二抗)；37℃，5％CO2条件下孵育20h；取40μL细胞培养上清加入含160μLQuanti Blue的96孔板中，混合均匀，37℃孵育1h；620nm 处测定OD值。
结果如图7所示，与抗CD27参比抗体(Varlilumab，CDX-1127) 相比，6D8-G98A(人鼠嵌合抗体)、6D8抗体(鼠抗人抗体)以及人源化抗体(Hu6D8-1至Hu6D8-24)均与参比抗体具有相当的或更优的体外活性，特别是在不添加二抗的情况下。
实施例10.抗体体内刺激实验
CD27人源化小鼠(B-hCD27小鼠)，纯合子，雌性，6～8周龄，购自百奥赛图江苏基因生物技术有限公司。按照小鼠体重随机分组，分为对照组、6D8-G98A组，每组3只；D0(首次给药时间记为D0)、D2 时，腹腔注射，300μg/只。D0、D10时，采集100～200μL小鼠外周血，用EDTA·K2进行抗凝处理。然后，用小鼠Ficoll淋巴细胞分离液分离血中淋巴细胞(PBMC)，孵育CD3、CD8、CD44、CD62L抗体，采用流式细胞术检测外周血中CD3+CD8+CD44+CD62L-比例。
结果如图8和表10所示，D0时，两组小鼠外周血中 CD3+CD8+CD44+CD62L-比例均在7％以下；D10时，对照组小鼠外周血中CD3+CD8+CD44+CD62L-比例稍微升高，而6D8-G98A组小鼠则明显升高(平均30％以上)。经统计学分析，两组间存在显著性统计学差异(P＜0.01)，这表明6D8-G98A抗体能够明显刺激机体免疫应答，使T细胞大量活化。
表106D8-G98A抗体刺激B-hCD27小鼠T细胞增殖的个体数据
Figure BDA0003412516600000211
实施例11.抗-hCD27抗体体内抑瘤药效学实验
CD27人源化小鼠(B-hCD27小鼠)，纯合子，雌性，6～8周龄，购自百奥赛图江苏基因生物技术有限公司。
MC38小鼠结肠癌模型建立及分组：每只小鼠皮下接种5×105个细胞/0.1mL；小鼠肿瘤体积在100～150mm3时，按照肿瘤体积随机分组，分对照组、6D8-G98A组，每组5只腹腔给药，6D8-G98A剂量为 3mg/kg，每三天给药一次(Q3D)，共给药6次。
指标测定：1)体重变化：每三天测量一次各组小鼠体重，并观察小鼠状态；2)肿瘤体积变化：每三天测量一次各组小鼠肿瘤长和宽，并计算肿瘤体积(体积＝长×宽2/2)。
实验结果表明，两组小鼠体重均缓慢增长，组间无差异。随着时间延长，对照组小鼠肿瘤体积逐渐增加，而6D8-G98A组小鼠肿瘤体积缓慢增加(参见图9和表11)。通过计算肿瘤生长抑制率(TGI％，tumor growth inhibition rate)发现，6D8-G98A组均显著抑制肿瘤生长，TGI％大于50％。上述结果表明，6D8-G98A抗体对MC38小鼠结肠癌具有抑制作用。
表11对照组和6D8-G98A抗体组的肿瘤体积的变化
Figure BDA0003412516600000221
可以理解，尽管本申请以上述具体形式描述了所涉及的发明，但这些发明并不局限于这些具体形式描述的特定内容。对本领域的技术人员显而易见的是，在不偏离本申请所描述的发明精神的前提下，还可对其中所涉及的发明包含的技术特征进行各种等同变化，这些变化都应该属于所述发明的范围之内。
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北京免疫方舟医药科技有限公司
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Gly Asp Gly Phe Asp Ser
1 5
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Gly Asp Ala Phe Asp Ser
1 5
<210> 5
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Asp Gly Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Asp Ala Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 7
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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100 105 110
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
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100 105 110
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
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100 105 110
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
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100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 11
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Asp Gly Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Ser Ala Thr Ser Ser Val Asn Tyr Met His
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Asp Thr Ser Arg Leu Ala Ser
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gln Gln Trp Asn Thr Asn Pro Trp Thr
1 5
<210> 15
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Asn Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Arg Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Thr Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 16
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Asn Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Lys
35 40 45
Asp Thr Ser Arg Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Thr Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 17
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Asn Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Arg Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Thr Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 18
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Asn Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Arg Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu
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Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Thr Asn Pro Trp Thr
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 19
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Asn Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Arg Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Thr Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 20
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Asn Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Arg Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Thr Asn Pro Trp Thr
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100 105
<210> 21
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Asn Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Arg Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Thr Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 22
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Asn Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Arg Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Thr Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105

Claims (10)

1.组合物，其包含特异性结合CD27的嵌合抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中所述HCDR1序列包含氨基酸序列NYGMN(SEQ ID NO:1)；所述HCDR2序列包含氨基酸序列WINTNTGEPTYADDFKG(SEQ ID NO:2)；和所述HCDR3序列包含氨基酸序列EGDGFDS(SEQ ID NO:4)；优选地，所述抗原结合部分选自Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、scFv片段、Fd片段和单域抗体。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述重链包含与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列，优选地，所述重链包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述抗体还包含轻链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和/或LCDR3序列，其中所述LCDR1序列包含氨基酸序列SATSSVNYMH(SEQ IDNO:12)；所述LCDR2序列包含氨基酸序列DTSRLAS(SEQ ID NO:13)；和/或所述LCDR3序列包含氨基酸序列QQWNTNPWT(SEQ ID NO:14)。
4.如权利要求3所述的组合物，其中所述轻链包含与SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列，优选地，所述轻链包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
5.如权利要求1-4任一项所述的组合物，其还包含一种或多种其他活性成分，优选地，所述活性成分选自抗肿瘤药物和抗病毒感染药物。
6.权利要求1-5任一项所述的组合物、或权利要求1-5任一项中记载的嵌合抗体或其抗原结合部分在制备用于预防或治疗CD27相关疾病的药物中的用途。
7.如权利要求6所述的用途，其中所述CD27相关疾病为肿瘤或病毒感染。
8.如权利要求7所述的用途，其中所述肿瘤选自结肠癌、肝癌、淋巴瘤、胃癌、肺癌、头颈鳞癌、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、恶性黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、卵巢癌或其转移癌。
9.如权利要求6-8任一项所述的用途，其中所述组合物被配制成药学上可接受的剂型，优选为注射剂或植入剂。
10.如权利要求6-8任一项所述的用途，其中所述药物经皮下、肌肉内、腹腔内或静脉给药。
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