CN113861292A - 抗cd40抗体或抗原结合片段及其应用 - Google Patents

抗cd40抗体或抗原结合片段及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗CD40抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段特异性结合CD40，能够活化抗原呈递细胞，刺激抗原呈递细胞释放细胞因子，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖。还提供上述抗体或抗原结合片段在制备用于治疗或改善CD40相关疾病的药物中的应用，或在制备用于诊断CD40相关疾病的试剂盒中的应用。

Description

抗CD40抗体或抗原结合片段及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及抗CD40抗体或抗原结合片段及其应用。
背景技术
CD40受体及其配体CD40L(CD154)属于TNFR：TNF家族。B细胞中的CD40-CD40L信号通路对于长时间存活浆细胞及记忆B细胞的产生及其存活具有影响。CD40属于一个共刺激受体，表达于抗原递呈细胞，如树突细胞(DC)、B细胞、单核细胞、及其它一些非淋巴细胞。CD40-CD40L相互作用(一个重要的信号)在调节DC细胞和T细胞(CD4+T细胞和CD8+T细胞)的交互作用，解救耗竭型CTL，翻转DC细胞的耐受性，具有重要作用。此外，B细胞和T细胞之间的CD40-CD40L相互作用影响生发中心(germinal center)反应，诱导抗体同型转换。表达于T细胞的CD40与表达于APC上的CD154相互作用后，将会导致DC细胞成熟，提高细胞因子的产生和共刺激因子的表达，并且可以提高效应T细胞的分化。
CD40为I行跨膜糖蛋白，CD40L为II型跨膜糖蛋白，CD40和TNFR超家族的其他成员一样，会形成三聚体。尽管CD40被认为是CD40L的主要结合受体，但是CD40L还可以和整合素家族的其他受体结合，比如αIIbβ3，α5β1(VLA-5)，αMβ2(Mac-1)。
CD40的激动型抗体，不仅可以激活和刺激固有免疫，也可以作用于适应性免疫，还可以对表达CD40的恶性肿瘤细胞产生直接的细胞毒性。对于肿瘤免疫治疗来说，CD40是一个很有前景的治疗靶点。
发明内容
本发明提供了能特异性结合CD40的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供了能特异性结合人CD40或猴CD40的抗体或抗原结合片段。本发明的抗CD40抗体与CD40特异性结合后，能够激活和刺激固有免疫，对表达CD40的恶心肿瘤细胞产生直接的细胞毒性。
在一些实施方案中，本发明公开了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段特异性结合CD40，所述抗体或抗原结合片段包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3中的一个或多个，其中VH CDR1包含氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7，X1为D、F、G、或Y，X2为I、N、S或T，X3为F，X4为A、D、F、G、T、S或Y，X5为D、G、N、S或T，X6为A、F、N、S或Y，X7为A、S或Y，并且X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7至少包含三个不同的氨基酸，VH CDR2包含氨基酸序列Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10，Z1为A、G或S，Z2为I，Z3为D、I、K或S，Z4为A、G、P、Q、S、T、W或Y，Z5为D、G、H、S或T，Z6为A、F、G、K、S、T或W，Z7为A、D、G或S，Z8为D、G、N、S或T，Z9为A、H、K、N、P、R、S或T，Z10为A、F、G、H、S或Y，并且Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10至少包含五个不同的氨基酸，VH CDR3包含如SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明公开了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段特异性结合CD40，所述抗体或抗原结合片段包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3中的一个或多个，其中VH CDR1包含氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7，X1为D、F、G、或Y，X2为I、N、S或T，X3为F，X4为A、D、F、G、T、S或Y，X5为D、G、N、S或T，X6为A、F、N、S或Y，X7为A、S或Y，并且X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7至少包含三个不同的氨基酸，VH CDR2包含如SEQ ID NO:70或74所示的氨基酸序列，VH CDR3包含如SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，X1为F，X4为D或G，X5为S或T，X6为F、N或Y。
在一些实施方案中，Z1为G，Z3为D或S，Z4为S或W，Z5为D或G，Z6为G或T，Z7为D或G，Z8为N，S或T，Z9为A或P，Z10为F，H或S。
在一些实施方案中，所述VH CDR1包含如SEQ ID NO:4-47中任一项所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述VH CDR2包含如SEQ ID NO:48-78中任一项所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段还包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3中的一个或多个，所述VL CDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述VL CDR2包含SEQID NO:2所示的氨基酸序列，所述VL CDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段特异性结合CD40，所述抗体或抗原结合片段包含VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3中的一个或多个，所述VL CDR1包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述VL CDR2包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述VL CDR3包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述VH CDR1包含如SEQID NO:4-47中任一项所示的氨基酸序列，所述VH CDR2包含如SEQ ID NO:48-78中任一项所示的氨基酸序列，所述VH CDR3包含如SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述VL CDR1包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述VLCDR2包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述VL CDR3包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述VH CDR1包含如SEQ ID NO:4-47中任一项所示的氨基酸序列，所述VH CDR2包含如SEQ ID NO:48-78中任一项所示的氨基酸序列，所述VH CDR3包含如SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述VH CDR1包含如SEQ ID NO:4-9中任一项所示的氨基酸序列，所述VH CDR2包含如SEQ ID NO:48-50中任一项所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:81-126任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:81-126任一项所示的氨基酸序列至少有90％序列同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:81-86任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:81-86任一项所示的氨基酸序列至少有90％序列同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列至少有90％序列同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO:81-126任一项所示的重链可变区和/或氨基酸序列如SEQ ID NO:80所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO:81-86任一项所示的重链可变区和/或氨基酸序列如SEQ ID NO:80所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是IgG、IgM、IgA、IgE或IgD的其中一种同种型。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含如SEQ ID NO:127所示的轻链恒定区，和/或所述抗体或抗原结合片段包含如SEQ ID NO:128所示的重链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是单克隆抗体。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是人源化抗体或全人源抗体。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含如SEQ ID NO:81-86任一项所示的重链可变区，以及如SEQ ID NO:128所示的重链恒定区；所述轻链包含如SEQ ID NO:80所示的轻链可变区，以及如SEQ ID NO:127所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO:129所示的轻链，和/或所述抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO:130所示的重链。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段与CD40的亲和力数值KD≤20nM。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段为分离的抗体或抗原结合片段。
另一方面，本发明还提供一种编码上述抗体或抗原结合片段的核酸分子。在一些实施方案中，所述核酸分子为分离的核酸分子。
另一方面，本发明还提供一种包含上述核酸分子的载体或宿主细胞。在一些实施方案中，所述载体或宿主细胞为分离的载体或宿主细胞。
另一方面，本发明还提供一种组合物，所述组合物包含上述抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体。
另一方面，本发明还提供上述抗体或抗原结合片段在制备用于治疗或改善CD40相关疾病的药物中的应用，或在制备用于诊断CD40相关疾病的试剂盒中的应用。
另一方面，本发明还提供一种试剂盒，其包含所述抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述CD40相关疾病包括癌症。
另一方面，本发明还提供一种在有需要的患者中治疗或改善CD40相关疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用有效剂量的上述抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述方法还包括向所述患者施用一种或多种治疗剂。
在一些实施方案中，所述治疗剂包括紫杉醇或其盐，和/或卡铂或其盐。
本发明提供的抗体或抗原结合片段，能够特异性的识别并结合CD40，阻断CD40与CD40L结合。该抗体或抗原结合片段是CD40激动剂，能够活化抗原呈递细胞，刺激抗原呈递细胞释放细胞因子，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，并通过抗体依赖性细胞毒性、补体依赖性细胞毒性和/或抗体依赖性细胞吞噬作用诱导杀死肿瘤细胞。
附图说明
图1为抗CD40抗体和Raji细胞的结合结果。
图2为抗CD40抗体分别与cCD40-His(食蟹猴CD40)、mCD40-his(小鼠CD40)的结合结果；其中图2A为与cCD40-His的结合结果，图2B为与mCD40-His的结合结果。
图3为抗CD40抗体在NFκB报告系统的体外激活能力；图3A、图3B为不与Anti-hIgG1-Fc偶联(no crosslink)的抗CD40抗体的体外激活结果；图3C、图3D为与Anti-hIgG1-Fc偶联(crosslink)的抗CD40抗体的体外激活结果。
图4为抗CD40抗体在MLR实验中对IFN-γ的分泌促进作用。
具体实施方式
定义
除非另有定义，本发明中使用的科学和技术术语的含义是本领域技术人员所通常理解的含义。通常，本文所述的细胞培养、分子生物学以及蛋白质纯化使用的命名和技术是本领域公知且普遍使用的。对于重组DNA、寡核苷酸合成和细胞培养与转化(如电穿孔、脂质转染)，使用了标准技术。酶促反应和纯化技术根据生产商的说明书或本领域普遍使用或本文所述的方法进行。前述技术和方法通常根据本领域公知且本说明书中引用和讨论的多部综合和较具体的文献中描述的那样使用。参见例如Sambrook等，Molecular Cloning:ALaboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)(第2版，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港(1989))。
本文所用的术语“包含”或“包括”意味着组合物和方法等包括所列举的元素，例如组份或步骤，但不排除其它。“基本上由……组成”意味着组合物和方法排除对组合的特征有根本影响的其它元素，但不排除对组合物或方法无本质上影响的元素。“由……组成”意味着排除未特别列举的元素。
在本领域中使用和/或接受的术语有两个或多个定义的情况下，除非明确地对立指出，否则本文使用的术语的定义包括所有这些含义。
应当注意的是，术语“一种”实体是指一种或多种该实体，例如“一种抗体”应当被理解为一种或多种抗体，因此，术语“一种”(或“一个”)、“一种或多种”和“至少一种”可以在本文中互换使用。
在本发明中，术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何单条链或多条链，并且不涉及产物的特定长度。因此，“多肽”的定义中包括肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或多个氨基酸链的任何其他术语，并且术语“多肽”可以用来代替上述任何一个术语，或者与上述任何一个术语交替使用。术语“多肽”也意在指多肽表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割或非天然发生的氨基酸修饰。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术产生，但其不必从指定的核酸序列翻译所得。它可以包括化学合成等任何方式产生。
“氨基酸”是指含有氨基和羧基两种官能团化合物，比如α-氨基酸。两个或多个氨基酸可以通过酰胺键(也称为肽键)组成多肽。单个氨基酸由三个核苷酸(所谓的密码子或碱基三联体)组成的核酸编码。每一个氨基酸由至少一个密码子编码。相同氨基酸由不同密码子编码称为“遗传密码的简并性”。氨基酸包括天然氨基酸和非天然氨基酸。天然氨基酸包括丙氨酸(三字母代码：Ala，一字母代码：A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)和缬氨酸(Val，V)。
“保守氨基酸取代”是指一个氨基酸残基被另一个含有化学性质(例如电荷或疏水性)相似的侧链(R基团)的氨基酸残基所取代。一般而言，保守氨基酸取代不大会在实质上改变蛋白质的功能性质。含有化学性质相似侧链的氨基酸类别的实例包括：1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸。
本发明中关于细胞、核酸、多肽、抗体等所使用的术语“分离的”，例如“分离的”DNA、RNA、多肽、抗体是指分别于细胞天然环境中的其它组分如DNA或RNA中的一种或多种所分离的分子。本发明使用的术语“分离的”还指当通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞材料、病毒材料或细胞培养基的核酸或肽，或化学合成时的化学前体或其他化学品。此外，“分离的核酸”意在包括不以天然状态存在的核酸片段，并且不会以天然状态存在。术语“分离的”在本发明中也用于指从其他细胞蛋白质或组织分离的细胞或多肽。分离的多肽意在包括纯化的和重组的多肽。分离的多肽、抗体等通常通过至少一个纯化步骤制备。在一些实施方案中，分离的核酸、多肽、抗体等的纯度至少为约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。
在本发明中，术语“重组”涉及多肽或多聚核苷酸，意指天然不存在的多肽或多聚核苷酸的形式，可以通过组合产生通常并不存在的多聚核苷酸或多肽。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。通过比较每个序列中可以比对的位置来确定同源性。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。序列之间的同源程度是由序列共有的匹配或同源位置的数目组成的一个函数。
多聚核苷酸或多聚核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一序列有具有一定百分比(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或者99％)的“序列同一性”或“序列同源性”是指当序列比对时，所比较的两个序列中该百分比的碱基(或氨基酸)相同。可以使用本领域已知的软件程序来确定该比对和同源性百分比或序列同一性，比如Ausubel et al.eds.(2007)在Current Protocols in Molecular Biology中所述的软件程序。在一些实施方案中，使用默认参数进行比对。其中一种比对程序是使用默认参数的BLAST。生物学上等同的多聚核苷酸是具有上述指定百分比的同源性并编码具有相同或相似生物学活性的多肽的多聚核苷酸。
多聚核苷酸是由四个核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)，或当多聚核苷酸是RNA时胸腺嘧啶换为尿嘧啶(U)。“多聚核苷酸序列”可以以多聚核苷酸分子的字母表示。该字母表示可以被输入到具有中央处理单元的计算机中的数据库中，并用于生物信息学应用，例如用于功能基因组学和同源性搜索。
术语“多聚核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸或其类似物。多聚核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行已知或未知的任何功能。比如：基因或基因片段(例如探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、重组多聚核苷酸、分支的多聚核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA和任何序列的分离的RNA。多聚核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。对核苷酸的结构修饰可以在组装多聚核苷酸之前或之后进行。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。聚合后可以进一步修饰多聚核苷酸。这个术语也指双链和单链分子。除另有说明或要求外，本公开的任何多聚核苷酸包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两种可互补单链形式中的每一种。
术语“编码”应用于多核苷酸时，是指被称为“编码”多肽的多核苷酸，在其天然状态或当通过本领域技术人员公知的方法操作时，经转录和/或翻译可以产生该多肽和/或其片段。
在本发明中，“抗体”或“抗原结合片段”是指特异性识别和结合抗原的多肽或多肽复合物。抗体可以是完整的抗体或其任何抗原结合片段或其单链。因此术语“抗体”包括分子中含有与抗原结合的具有生物学活性的免疫球蛋白分子的部分或整体的蛋白质或肽。包括但不限于重链或轻链或其配体结合部分的互补决定区(CDR)、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、重链恒定区(CH)、轻链恒定区(CL)、框架区(FR)或其任何部分。CDR区包括轻链的CDR区(VL CDR1-3)和重链的CDR区(VH CDR1-3)。可变区可包含结构FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
抗体重链的类别包括γ、μ、α、δ、ε，其中还有一些亚类(例如γ1-γ4)。该链的性质决定了抗体的“种类”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。其中一些可进一步分成免疫球蛋白亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。轻链的类别包括κ、λ。每个重链可以与κ或λ轻链结合。一般来说，当由杂交瘤、B细胞或基因工程宿主细胞生产免疫球蛋白时，其轻链和重链通过共价键结合，两条重链的“尾巴”部分通过共价二硫键或非共价键结合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的叉状末端的N末端延伸至每条链底部的C末端。免疫球蛋白κ轻链可变区为Vκ；免疫球蛋白λ轻链可变区为Vλ。本发明通常用的VL为Vκ。虽然某些讨论针对免疫球蛋白分子的IgG种类，所有的免疫球蛋白种类都在本发明公开的保护范围内。关于IgG，标准的免疫球蛋白分子包含分子量约23,000道尔顿的两条相同的轻链多肽和分子量约为53,000-70,000的两条相同的重链多肽。VL和VH决定了抗原识别和特异性。VL和VH上的抗原结合位点能够识别抗原决定簇并且与抗原特异性结合。抗原结合位点由VH和VL中各自的三个CDR定义(即VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3)。CL和CH(CH1、CH2或CH3)赋予重要的生物学性质，如分泌、经胎盘移动、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区的编号随着它们变得更远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。N端部分是可变区，C端部分是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。
在本发明中，抗体的重链恒定区可以来源于不同的免疫球蛋白分子。例如，抗体的重链恒定区可以包括源自IgG1分子的CH1结构域和源自IgG3分子的铰链区。在一些实施方案中，重链恒定区可以包括部分源自IgG1分子和部分源自IgG3分子的铰链区。在一些实施方案中，部分重链可以包括部分源自IgG1分子和部分源自IgG4分子的嵌合铰链区。
在本发明中，术语“铰链区”包括连接CH1结构域和CH2结构域的部分重链结构。所述铰链区包含约25个残基并且是有韧性的，从而使得两个N端抗原结合区能够独立移动。
在本发明中，术语“二硫键”包括两个硫原子之间形成的共价键。半胱氨酸包含可以与第二个硫醇基团形成二硫键或桥接的硫醇基团。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键连接，两条重链通过两个二硫键相连接。
在本发明中，术语“片段”、“抗体片段”或“抗原结合片段”是抗体的一部分，例如F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等。不管其结构如何，抗体片段与被完整抗体识别的同一抗原结合。术语“抗原结合片段”包括适体、镜像异构体和双价抗体，还包括通过与特定抗原结合形成复合物起抗体作用的任何合成或基因工程蛋白质。
“单链可变片段”或“scFv”是指免疫球蛋白的VH和VL的融合蛋白。在一些方面，这些区域与约10个至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头可以富含甘氨酸以增加柔韧性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以增加溶解性，并且可以连接VH的N端和VL的C端，反之亦然。尽管该蛋白质被除去了恒定区和引入了接头，但其保留了原始免疫球蛋白的特异性。ScFv分子通常是本领域中已知的，例如在美国专利5,892,019中有相关描述。
本发明公开的抗体、抗原结合片段、变体或衍生物包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性，全人源、人源化、灵长类化，或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段。
本文所用术语“表位”包括任意能够特异性结合免疫球蛋白或其片段或T细胞受体的蛋白决定区。表位决定区通常由分子的化学活性表面基团(如氨基酸或糖侧链)组成且通常有特定的三维结构性质以及特定的电荷性质。当解离常数小于等于1μM(例如小于等于100nM、小于等于10nM或小于等于1nM)时，即可称抗体特异性结合抗原。
根据Kabat和Chothia定义的CDR包括相互比较时的氨基酸残基的重叠或子集。尽管如此，应用任一定义来指代抗体或其变体的CDR都在本发明范围内。包含特定CDR的确切残基编号将根据CDR的序列和大小而变化。本领域技术人员通常可以根据抗体的可变区氨基酸序列确定出CDR包含哪些特定的残基。
Kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员可以不依赖于序列本身以外的其他实验数据将该“Kabat编号”系统应用到任何可变区序列。“Kabat编号”是指由Kabat etal.,U.S.Dept.of Health and Human Services在“SequenceofProteinsof Immunological Interest”(1983)提出的编号系统。抗体还可以用EU编号系统。
本发明公开的抗体可以来源于任何动物，包括鸟类和哺乳动物。较佳地，抗体是人源、鼠源、驴源、兔源、山羊源、豚鼠源、骆驼源、美洲驼源、马源或鸡源抗体。在一些实施方案中，可变区可以是软骨鱼纲来源(例如来自鲨鱼)。
在本发明中，术语“嵌合抗体”被认为是指抗体的可变区从第一个物种中获得或衍生，而其恒定区(在本发明中可以是完整的、部分的或修饰过的)来源于第二个物种的任何抗体。在一些实施方案中，可变区来自非人源(例如小鼠或灵长类动物)，而恒定区是人源。
“特异性结合”或“对……具有特异性”通常是指抗体或抗原结合片段与特定抗原通过其抗原结合结构域与表位互补性结合形成相对稳定的复合物。“特异性”可以用抗体或抗原结合片段与特定抗原或表位结合的相对亲和力表达。例如，如果抗体“A”比抗体“B”与同一抗原的相对亲和力大，可以认为抗体“A”比抗体“B”对该抗原具有更高的特异性。特异性结合可以用平衡解离常数(KD)来描述，较小的KD意味着较紧密的结合。确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域内众所周知的，并包括例如平衡透析、表面等离子共振、生物膜层光学干涉测量法等。“特异性结合”CD40蛋白的抗体包括与CD40蛋白平衡解离常数KD小于或等于约100nM、小于或等于约20nM、小于或等于约10nM、小于或等于约5nM、小于或等于约3nM或小于或等于约1nM的抗体。
“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施，其目的是预防、减缓、改善或停止不良的生理改变或紊乱，例如疾病的进程，包括但不限于以下无论是可检测还是不可检测的结果，症状的缓解、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善、缓和、减轻或消失(无论是部分还是全部)、延长与不接受治疗时预期的生存期限等。需要治疗的患者包括已经患有病症或紊乱的患者，容易患有病症或紊乱的患者，或者需要预防该病症或紊乱的患者，可以或预期从施用本发明公开的抗体或药物组合物用于检测、诊断过程和/或治疗中受益的患者。
“患者”通常指需要诊断、预后或治疗的任何患者，特别是哺乳动物患者。哺乳动物患者包括人类、狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等，特别是人类。
在本发明中，诸如“需要治疗的患者”包括从施用本发明公开的抗体或组合物中用于检测、诊断过程、预防和/或治疗中受益的患者，例如哺乳动物患者。
除非另有说明，术语“CD40”指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物诸如灵长类(如人、恒河猴)和啮齿类(如小鼠和大鼠))的任何CD40。该术语涵盖“全长”，未加工的CD40以及因细胞中的加工所致的任何形式的CD40。
术语“细胞因子”是由一种细胞群释放的，作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子、白介素(IL)(诸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15)、肿瘤坏死因子(诸如TNF-α或TNF-β)及其它多肽因子(包括LIF和kit配体(KL)和γ-干扰素)。如本文中使用的，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物。生物学活性等效物包括通过人工合成产生的小分子实体，及其药剂学可接受的衍生物和盐。
如本文所用，术语“标记”或“经标记的”是指掺入可检测标记，例如，通过掺入放射性标记的氨基酸，或者附着于可标记的亲和素(例如，含有荧光标记或可由光学方法或量热法检测的具有酶活性的链霉亲和素)检测的生物素基部分的多肽。在某些情况下，标记物或标记也可为治疗性的。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的并且可以使用。用于多肽的标记物的示例包括但不限于以下项：放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光标记物(例如FITC、罗丹明、镧系磷光体)、酶标记物(例如辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记、生物素酰基、被二级报告基因识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、二级抗体结合位点、金属结合结构域、表位标签)。
抗CD40抗体
本发明的抗体具有结合CD40的能力。在一些实施方案中，本发明的抗体具有结合人CD40的能力。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体或抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，其中所述VL包含互补决定区域(CDR)VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中VL CDR1包含与选自SEQ ID NO:1(QGISSY)的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％或90％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，VL CDR2包含与选自SEQ ID NO:2(AASS)的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％或90％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，VLCDR3包含与选自SEQ ID NO:3(QQHYTTPP)的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％或90％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段包含VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3中的一个或多个，其中VH CDR1包含氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7，X1为D、F、G、或Y，X2为I、N、S或T，X3为F，X4为A、D、F、G、T、S或Y，X5为D、G、N、S或T，X6为A、F、N、S或Y，X7为A、S或Y，并且X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7至少包含三个不同的氨基酸，VH CDR2包含氨基酸序列Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10，Z1为A、G或S，Z2为I，Z3为D、I、K或S，Z4为A、G、P、Q、S、T、W或Y，Z5为D、G、H、S或T，Z6为A、F、G、K、S、T或W，Z7为A、D、G或S，Z8为D、G、N、S或T，Z9为A、H、K、N、P、R、S或T，Z10为A、F、G、H、S或Y，并且Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10至少包含五个不同的氨基酸，VH CDR3包含如SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段，X1为F，X4为D或G，X5为S或T，X6为F、N或Y。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段，Z1为G，Z3为D或S，Z4为S或W，Z5为D或G，Z6为G或T，Z7为D或G，Z8为N，S或T，Z9为A或P，Z10为F，H或S。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体或抗原结合片段包含重链可变区(VH)，其中所述的VH包含互补决定区VH CDR1、VH CDR 2和VH CDR3。其中VH CDR1包含与选自SEQID NO:4-47的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％或90％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，VH CDR2包含与选自SEQ ID NO:48-78的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％或90％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，且VHCDR3包含与选自SEQ ID NO:79的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％或90％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体或抗原结合片段包含重链可变区(VH)，其中所述的VH包含互补决定区VH CDR1、VH CDR 2和VH CDR3。其中VH CDR1包含与选自SEQID NO:4-9的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％或90％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，VH CDR2包含与选自SEQ ID NO:48-50的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％或90％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，且VHCDR3包含与选自SEQ ID NO:79的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％或90％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体或抗原结合片段的VH CDR1包含如SEQID NO:4所示的氨基酸序列，VH CDR2包含如SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，VH CDR3包含如SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列；VL CDR1包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，VLCDR2包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，VL CDR3包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体或抗原结合片段的VH CDR1包含如SEQID NO:5所示的氨基酸序列，VH CDR2包含如SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，VH CDR3包含如SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列；VL CDR1包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，VLCDR2包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，VL CDR3包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体或抗原结合片段的VH CDR1包含如SEQID NO:6所示的氨基酸序列，VH CDR2包含如SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，VH CDR3包含如SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列；VL CDR1包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，VLCDR2包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，VL CDR3包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体或抗原结合片段的VH CDR1包含如SEQID NO:7所示的氨基酸序列，VH CDR2包含如SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，VH CDR3包含如SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列；VL CDR1包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，VLCDR2包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，VL CDR3包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体或抗原结合片段的VH CDR1包含如SEQID NO:8所示的氨基酸序列，VH CDR2包含如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列，VH CDR3包含如SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列；VL CDR1包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，VLCDR2包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，VL CDR3包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体或抗原结合片段的VH CDR1包含如SEQID NO:9所示的氨基酸序列，VH CDR2包含如SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，VH CDR3包含如SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列；VL CDR1包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，VLCDR2包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，VL CDR3包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体或抗原结合片段的VH CDR1包含如SEQID NO:18所示的氨基酸序列，VH CDR2包含如SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列，VH CDR3包含如SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列；VL CDR1包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，VLCDR2包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，VL CDR3包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
本发明抗体或其抗原结合片段中VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3可以是表1中各CDR对应的氨基酸序列的任一组合。
表1 CDR序列
Figure BDA0003139308440000111
Figure BDA0003139308440000121
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区VL，其包含与选自SEQ ID NO:80的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体或其片段包含重链可变区VH，其包含与选自SEQ ID NO:81-126的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体或其片段包含VH和VL，其中VH包含如SEQID NO:81所示的氨基酸序列，VL包含如SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体或其片段包含VH和VL，其中VH包含如SEQID NO:82所示的氨基酸序列，VL包含如SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体或其片段包含VH和VL，其中VH包含如SEQID NO:83所示的氨基酸序列，VL包含如SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体或其片段包含VH和VL，其中VH包含如SEQID NO:84所示的氨基酸序列，VL包含如SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体或其片段包含VH和VL，其中VH包含如SEQID NO:85所示的氨基酸序列，VL包含如SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体或其片段包含VH和VL，其中VH包含如SEQID NO:86所示的氨基酸序列，VL包含如SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体或其片段包含VH和VL，其中VH包含如SEQID NO:96所示的氨基酸序列，VL包含如SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段还包含重链恒定区、轻链恒定区、Fc区或其结合。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含如SEQ ID NO:127所示的轻链恒定区(CL)，以及如SEQ ID NO:128所示的重链恒定区(CH)。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含由VH和CH组成的重链，以及由VL和CL组成的轻链。其中，VH的序列如SEQ ID NO:81所示，CH的序列如SEQ ID NO:128所示；VL的序列如SEQ ID NO:80所示，CL的序列如SEQ ID NO:127所示。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含由VH和CH组成的重链，以及由VL和CL组成的轻链。其中，VH的序列如SEQ ID NO:82所示，CH的序列如SEQ ID NO:128所示；VL的序列如SEQ ID NO:80所示，CL的序列如SEQ ID NO:127所示。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含由VH和CH组成的重链，以及由VL和CL组成的轻链。其中，VH的序列如SEQ ID NO:83所示，CH的序列如SEQ ID NO:128所示；VL的序列如SEQ ID NO:80所示，CL的序列如SEQ ID NO:127所示。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含由VH和CH组成的重链，以及由VL和CL组成的轻链。其中，VH的序列如SEQ ID NO:84所示，CH的序列如SEQ ID NO:128所示；VL的序列如SEQ ID NO:80所示，CL的序列如SEQ ID NO:127所示。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含由VH和CH组成的重链，以及由VL和CL组成的轻链。其中，VH的序列如SEQ ID NO:85所示，CH的序列如SEQ ID NO:128所示；VL的序列如SEQ ID NO:80所示，CL的序列如SEQ ID NO:127所示。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含由VH和CH组成的重链，以及由VL和CL组成的轻链。其中，VH的序列如SEQ ID NO:86所示，CH的序列如SEQ ID NO:128所示；VL的序列如SEQ ID NO:80所示，CL的序列如SEQ ID NO:127所示。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含由VH和CH组成的重链，以及由VL和CL组成的轻链。其中，VH的序列如SEQ ID NO:96所示，CH的序列如SEQ ID NO:128所示；VL的序列如SEQ ID NO:80所示，CL的序列如SEQ ID NO:127所示。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含如SEQ ID NO:130所示的重链，以及如SEQID NO:129所示的轻链。
在一些实施方案中，可以在混合淋巴细胞(MLR)反应中测量本文提供的抗CD40抗体和片段对免疫应答的调节。在一个实施方案中，本文提供的抗CD40抗体增加MLR中淋巴细胞的细胞因子产生的水平。在一个实施方案中，抗CD40抗体增加MLR中IFNγ产生的水平。
抗CD40抗体的Fc区可与多数Fc受体之间发生相互作用，以传递一系列重要的功能性能力，称为效应器功能。在一些实施方案中，本发明提供一种偶联物包含本发明的抗CD40抗体与Fc受体的偶联。在一些实施方案中，体外实验时，采用抗人IgG1-Fc抗体模拟体内细胞表达的Fc受体，反映抗CD40抗体与Fc受体的偶联对抗CD40抗体活性的影响。在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体可以与抗人IgG1-Fc抗体偶联，以增强抗CD40抗体的活性。在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体可以与Fc受体偶联，以增强抗CD40抗体的活性。在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体可以与表达Fc受体的细胞表面的Fc受体结合，以增强抗CD40抗体的活性。在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体可以通过表达Fc受体的细胞实现体内偶联，增强抗CD40抗体的活性。Fc受体在多种免疫细胞中表达，包括单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、朗格罕氏细胞、自然杀伤(NK)细胞、和T细胞。
在一些实施方案中，公开了抗CD40抗体、抗原结合片段、变体或衍生物。变体是指对抗体或抗原结合片段中的一个或多个氨基酸残基进行删除和/或替换，或插入一个或多个氨基酸残基而得到的抗体或抗原结合片段。衍生物包括被修饰的衍生物，即通过任何类型的分子与抗体的共价连接进行修饰，其中共价连接不会阻止抗体与表位结合。包括但不限制以下实例，抗体可以通过例如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、连接至细胞配体或其他蛋白质等。众多化学修饰中的任一种修饰可以通过现有技术进行，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，抗体可以含有一个或多个非自然的氨基酸。
在一些实施方案中，抗体可以与治疗剂、药物前体、肽、蛋白质、酶、病毒、脂类、生物反应调节剂、药剂或PEG缀合。
抗体可以与治疗剂缀合或融合，所述治疗剂可包括可检测标记，如放射性标记、免疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光敏治疗剂或诊断剂、可以是药物或毒素的细胞毒性剂、超声增强剂、非放射性标记物及其组合物，和本领域已知的其它此类试剂。
抗体可通过将其偶联至化学发光化合物来被可检测地标记。然后通过检测在化学反应过程中出现的发光从而确定化学发光标记的抗原结合片段的存在。特别有用的化学发光标记化合物的实例包括鲁米诺、异鲁米诺、芳香吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
在一些实施方案中，本发明的抗体还涵盖抗CD40抗体的氨基酸序列的变体，以及与上文所述的任何抗体结合相同表位的抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体还涵盖其抗体片段；在一些实施方案中，选自以下的抗体片段：Fab、Fab'-SH、Fv、scFv或(Fab’)2片段。
在一些实施方案中，本发明提供了编码以上任何抗CD40抗体或片段的核酸。在一个实施方案中，提供包含所述核酸的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体。表达载体包括质粒、逆转录病毒、YAC、EBV衍生的附加体等等。在一个实施方案中，提供包含所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如CHO细胞或293F细胞)或适用于制备抗体或抗原结合片段的其它细胞。
在一些实施方案中，编码抗CD40抗体或片段的核酸序列可根据抗CD40抗体或片段的氨基酸序列通过本领域常规的方法获得。在一些实施方案中，编码如SEQ ID NO:129所示的抗体轻链的核酸如SEQ ID NO:131所示，其中，下划线部分可编码产生抗体CDR区。在一些实施方案中，编码如SEQ ID NO:130所示的抗体重链的核酸如SEQ ID NO:132所示，其中，下划线部分可编码产生抗体CDR区。
表2 抗CD40抗体(抗体25)的氨基酸序列和核酸序列
Figure BDA0003139308440000151
Figure BDA0003139308440000161
在一些实施方案中，所述抗体是嵌合、人源化或全人源的。在一些实施方案中，所述抗体或片段能激活T细胞，促进其增殖或分泌炎性因子。在一些实施方案中，所述抗体或片段是一种IgG同种型，所述IgG同种型选自IgG1同种型、IgG2同种型、IgG3同种型和/或IgG4同种型组成的组。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是选自IgG1的IgG同种型。
本发明还包括与本文所述抗CD40抗体结合同一表位的抗体。例如，本发明的抗体特异性结合包括人CD40上一个或多个氨基酸残基的表位(人CD40的序列参见Uniprot上的P25942)。
本领域技术人员将认识到，只需要通过查明待测抗体是否阻止已知抗体与CD40结合，而无需进行过多实验就可以确定抗体是否与本文所述抗体结合同一表位。如果受试抗体与本公开抗体竞争，则两种抗体可能结合至相同或相近的表位。
一种用于确定抗体是否具有本文所述抗体的特异性的替代方法是将本文所述抗体与通常该抗体对其有反应的可溶CD40蛋白质一起预温育，然后加入测试的抗体以确定测试的抗体与CD40结合的能力是否受到抑制。如果测试的抗体受到抑制，则其具有与本公开的抗体相同、或功能相同的表位特异性。
在一些实施方案中，本发明的抗体，可以使用例如下文所提供实施例中描述的方法制备。在一些实施方案中，还可通过使用Trioma技术，人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor等人，1983,Immunol Today 4:72)，以及EBV杂交瘤技术(参见Cole等人，1985,In:MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.，第77-96页)等来制备产生。
使用常规重组DNA技术，可将本发明的抗体的一个或多个CDR插入框架区，例如插入到人类框架区以构建人源化非全人源抗体。框架区可以是天然存在的或共有的框架区，优选人类框架区(参见Chothia et al.,J.Mol.Biol.278:457-479(1998)，其列出一系列人类框架区)。一些多核苷酸可以编码产生含框架区和CDR组合的能与目标抗原的至少一个表位特异性结合的抗体。在框架区内可以进行一个或多个氨基酸取代，可以选择能够改善抗体与其抗原结合的氨基酸取代。另外，可用此法进行参与链间二硫键形成的一个或多个可变区中半胱氨酸残基的取代或缺失，从而产生缺少一个或多个链间二硫键的抗体分子。本领域技术范围内的对多核苷酸进行的其他改变也涵盖于本发明中。
此外，抗体可以通过使用常规重组DNA技术制备。通过使用本领域技术人员公知的重组DNA技术可以选择、构建和培养生产抗体的载体及细胞系。这些技术在各种实验室手册和主要出版物中均有描述，例如Recombinant DNA Technology for Production ofProtein Therapeutics in Cultured Mammalian Cells，D.L.Hacker,F.M.Wurm,inReference Module in Life Sciences,2017，其全部内容包括补充内容通过引用并入全文。
在一些实施方案中，可以按常规方法根据本文所述抗体氨基酸序列设计合成编码抗体的DNA，将其置入表达载体中，然后转染宿主细胞，在培养基中培养被转染的宿主细胞产生单克隆抗体。在一些实施方案中，表达抗体载体包括至少一个启动子元件，抗体编码序列，转录终止信号和polyA尾。其他元件包括增强子，Kozak序列及插入序列两侧RNA剪接的供体和受体位点。可以通过SV40的前期和后期启动子，来自逆转录病毒的长末端重复序列如RSV、HTLV1、HIVI及巨细胞病毒的早期启动子来获得高效的转录，也可应用其它一些细胞的启动子如肌动蛋白启动子。合适的表达载体可包括pIRES1neo，pRetro-Off，pRetro-On，PLXSN，或者Plncx，pcDNA3.1(+/-)，pcDNA/Zeo(+/-)，pcDNA3.1/Hygro(+/-)，PSVL，PMSG，pRSVcat，pSV2dhfr，pBC12MI和pCS2等。常使用的哺乳动物细胞包括293细胞，Cos1细胞，Cos7细胞，CV1细胞，鼠L细胞和CHO细胞等。
在一些实施方案中，插入基因片段需含有筛选标记，常见的筛选标记包括二氢叶酸还原酶，谷氨酰胺合成酶，新霉素抗性，潮霉素抗性等筛选基因，以便于转染成功的细胞的筛选分离。将构建好的质粒转染到宿主细胞，经过选择性培养基培养，转染成功的细胞大量生长，产生想要获得的目的蛋白。
抗体可以通过公知的技术纯化，例如利用蛋白A或蛋白G进行亲和层析，免疫亲和色谱等。例如D.Wilkinson(The Scientist，由The Scientist,Inc.,Philadelphia Pa.出版，第14卷，第8期(2000)，第25-28页)讨论了免疫球蛋白的纯化。
Fc修饰
本文所述抗体的有关效应子功能可以通过修饰，以提高例如抗体在治疗与CD40信号传导相关的疾病和障碍中的有效性。例如，因为在肿瘤浸润的调节性T细胞(Treg)是遍在表达的，所以可将一个或多个突变引入到抗体的Fc区中，从而提高ADCC的功能，由此更有效杀死Treg。也例如，CD40的胞内信号的充分激活，需要多个CD40受体的聚集，甚至需要其发生寡聚化，所以可将一个或多个突变引入到抗体的Fc区中，从而提高抗体本身的聚集能力或提高和Fc受体的结合能力来促进抗体的聚集，从而更充分激活CD40的胞内信号。
在一些实施方案中，本文所述的抗体是IgG同种型。在一些实施方案中，抗体的恒定区为人IgG1同种型。在一些实施方案中，对人IgG1恒定区上的特定氨基酸进行修饰以修改抗体的糖基化，例如N297的去岩藻糖。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段含有少量的岩藻糖修饰，或几乎不含岩藻糖修饰，或不含岩藻糖修饰，ADCC效果明显提高。在一些实施方案中，所述抗体或片段最多有一个(或者最多两个，或三个)氨基酸残基有岩藻糖修饰。在一些实施方案中，包含所述抗体或片段最多有不到0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、或5％的蛋白分子被岩藻糖修饰。
在一些实施方案中，对抗体恒定区上的特定氨基酸进行修饰以改变Fc受体相互作用，例如N297A、L234A和/或L235A的突变。
在一些实施方案中，抗体的恒定区为人IgG2同种型。在一些实施方案中，抗体的恒定区为人IgG4同种型。
针对抗CD40抗体或抗原结合片段的使用
本领域技术人员应理解本发明的抗体有多种用途。例如，本发明的抗体可用作治疗剂、用作诊断试剂盒中的试剂或用作诊断工具、或用作竞争实验中的试剂以生成治疗剂。
在一些实施方案中，提供一种在有需要的患者中预防、治疗或改善CD40相关疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用有效剂量的本文所述的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，提供本文抗体或抗原结合片段在制备用于预防、治疗或改善CD40相关疾病的药物中的应用。本文所述抗CD40抗体可以治疗的疾病或病症包括血液癌症和/或实体瘤。
血液癌症包括例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。在一些实施方案中，白血病包括急性淋巴细胞性白血病(ALL)；急性骨髓性白血病(AML)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；慢性骨髓性白血病(CML)；骨髓性增生疾病/肿瘤(MPDS)。淋巴瘤包括霍奇金淋巴瘤、无痛性和侵袭性非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤(小细胞和大细胞)。骨髓瘤包括多发性骨髓瘤(MM)、巨细胞骨髓瘤、重链骨髓瘤和轻链或本斯-琼斯骨髓瘤。实体瘤包括例如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、黑素瘤、结直肠癌、肺癌、头颈癌、膀胱癌、食道癌、肝癌和肾癌。
在一些实施方案中，本发明的抗体可以激活免疫应答，从而用于治疗感染。
感染是由致病因子侵入生物体组织、它们的繁殖以及宿主组织对这些生物体及它们产生的毒素的反应。感染可能由传染原引起，例如病毒、类病毒、朊病毒、细菌、线虫如寄生性蛔虫和蛲虫、节肢动物如蜱、螨虫、跳蚤和虱子、真菌如癣以及其他大寄生物如绦虫和其他蠕虫。在某一方面，传染原是细菌，如革兰氏阴性细菌。在某一方面，传染原是病毒，例如DNA病毒、RNA病毒和逆转录病毒。病毒的非限制性实例包括腺病毒、柯萨奇病毒、EB病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、巨细胞病毒、人疱疹病毒8型、HIV、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒、副流感病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、呼吸道合胞病毒、风疹病毒、水痘-带状疱疹病毒。
本发明的抗体还可以用于治疗由微生物引起的传染病，或者通过靶向结合微生物和免疫细胞杀灭微生物以实现消除微生物的目的。在某一方面，微生物是包括RNA和DNA病毒的病毒、革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、原生动物或真菌。
本发明的抗体的治疗有效量涉及达到治疗目标所需的量。给药所需的量取决于抗体对其特异抗原的结合亲和力，疾病、紊乱或病症的严重程度、给药途径、在接受给药的对象中给予的抗体从自由体积耗尽的速率等。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段的治疗有效剂量的范围为从约0.01mg/kg到约100mg/kg。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段的治疗有效剂量的范围为从约0.1mg/kg到约30mg/kg。剂量频率范围可以是例如每两周一次或每三周一次。
在一些实施方案中，本发明的抗体可与治疗剂联合使用。治疗剂为抑制或阻止细胞机能和/或引起细胞破坏的任何物质。在一些实施方案中，治疗剂可以是美登素或其衍生物、喜树碱或其衍生物、紫杉醇或其衍生物、卡铂或其衍生物、顺铂或其衍生物、吉西他滨或其衍生物中的一种或多种。在一些实施方案中，治疗剂可以是紫杉醇或其盐。在一些实施方案中，治疗剂可以是卡铂或其盐。在一些实施方案中，治疗剂可以是紫杉醇和卡铂。
在一些实施方案中，将抗CD40抗体给予经诊断具有一种或多种前述疾病(包括但不限于癌症或其他肿瘤病症)相关临床症状的患者。诊断后，给予抗CD40抗体以减轻或反转一种或多种前述疾病相关临床症状的效果。
在某些肿瘤样品中观察到CD40的过表达，并且具有CD40过表达的细胞的患者可能对使用本发明的抗CD40抗体的治疗有响应。因此，本发明的抗体也可以用于诊断和预后。
在一些实施方案中，包含细胞的样品可以从患者体内获得，该患者可以是癌症患者或待诊断的患者。细胞是肿瘤组织或肿瘤块、血液样本、尿液样本或来自患者的任何样本的细胞。在选择性地对样品进行预处理之后，可以在允许抗体与可能存在于样品中的CD40蛋白相互作用的条件下，将样品与本发明的抗体一起孵育，利用抗CD40抗体来检测样品中CD40蛋白的存在。
本发明的抗体还用于检测患者样品中的CD40，并因此可用于诊断。例如，本发明的抗CD40抗体用于体外试验(如ELISA)以检测患者样品中的CD40水平。
在一个实施方案中，本发明的抗CD40抗体固定在固体支持物(如微量滴定板的孔)上。固定的抗体作为捕捉抗体，捕捉测试样品中可能存在的任何CD40。在使固定的抗体接触患者样品前，清洗固相载体并使用封闭试剂(如牛奶蛋白或白蛋白)处理以避免分析物的非特异性吸附。随后使用可能含有抗原的测试样品或使用含有标准量抗原的溶液处理所述孔。这类样品是例如来自对象的血清样品，其可能具有被认为可诊断某一病变的循环抗原水平。洗去测试样品或标准品后，使用可检测标记的二抗处理固相支持物。标记的二抗用作检测抗体。测量可检测标记的水平，通过与标准样品所建立的标准曲线进行比较确定测试样品中CD40的浓度。
在一些实施方案中，使用本文所述的抗CD40抗体或抗原结合片段时，抗体或片段以药物组合物的形式存在。其中，药物组合物可以由抗CD40抗体或抗原结合片段与药学上可接受的载体组成。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物给药相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。合适载体描述于最新版的Remington's Pharmaceutical Sciences中。此类载体或稀释剂包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和/或5％的人血清白蛋白。
在一些实施方案中，含有抗CD40抗体的药物组合物与其预期施用途径相容。给药途径的示例包括肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、经口(例如吸入)、经皮(即局部的)、经粘膜和直肠给药。药物组合物可包括以下组分中的一种或多种：注射用无菌稀释剂，例如水、盐溶液、固定油、聚乙二醇类、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抑菌剂，例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，例如组氨酸盐酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；渗透压调节剂，例如氯化钠或右旋糖；稳定剂，例如精氨酸、甲硫氨酸、海藻糖、蔗糖、山梨醇；表面活性剂，例如吐温20、吐温80。pH可用酸或碱进行调节，例如盐酸或氢氧化钠。可将药物组合物包装在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制多剂量小瓶内。在一些实施方案中，适于注射用途的药物组合物包括无菌水性溶液(在此是水溶性的)或分散体以及用于即时制备无菌注射液或分散体的无菌粉末。使用时，组合物必须是无菌的并且应当为流动性达到易于注射的程度。其在制造和储存条件下必须是稳定的并且必须能防止微生物例如细菌和真菌的污染作用。注射用组合物的延长吸收可通过在所述组合物中包含延缓吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来达到。根据需要，可以通过将抗体以所需量掺入具有上文所列成分中的一种或多种组合(按需要)的合适溶剂中来制备无菌注射溶液，然后过滤消毒。也可以将前述的无菌溶液通过冷冻干燥获得粉末，用于在给药时制备无菌注射溶液。
在一些实施方案中，抗CD40抗体和其它治疗剂被制备为单个治疗组合物，并同时给予抗CD40抗体和其它治疗剂。或者，抗CD40抗体和其它治疗剂彼此独立，例如分别制备为独立的治疗组合物，并同时给予抗CD40抗体和其它治疗剂，或在治疗方案期间在不同时间给予抗CD40抗体和其它治疗剂。例如，在给予其它治疗剂前给予抗CD40抗体，在给予其它治疗剂后给予抗CD40抗体，或在以交替的方案给予抗CD40抗体和其它治疗剂。本文中，以单个剂量或多个剂量给予抗CD40抗体和其它治疗剂。
实施例
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径或已知方法得到。
实施例1：阳性对照抗体CP870893和APX005的制备。
CP870893的重链和轻链的序列如下：
CP870893重链氨基酸序列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:133)；
CP870893轻链氨基酸序列：
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:134)。
APX005的重链和轻链的序列见专利US9676861。
将编码上述抗体重链和轻链的核苷酸通过酶切连接分别连接到pcDNA3.0载体(购自Invitrogen)中，得到用于表达全抗的重组质粒。把对应的轻链重组质粒和重链质粒通过PEI共转染HEK293进行瞬时表达，培养7天后，收集上清液，最后通过纯化得到CP870893和APX005抗CD40抗体，用于下面各种实施例。
实施例2：抗CD40抗体的制备
按照如表3所示46种抗体的可变区和恒定区；各抗体的重链由VH和CH组成，各抗体的轻链由VL和CL组成。编号“1-VH”指抗体1的VH序列，以此类推；46种抗体的VL、CH和CL相同。通过分子克隆技术，把编码上述抗体的核酸序列插入到pcDNA3.0载体(购自Invitrogen)中，得到用于表达全抗的重组质粒。把对应的轻链重组质粒和重链质粒通过PEI共转染HEK293进行瞬时表达，把上述重组质粒转入293F细胞系，培养7天后，收集上清液，最后通过纯化得到46种抗体，测序证实序列，用于下面各种实施例。
表3 各抗体的VH、VL、CH及CL序列
Figure BDA0003139308440000211
Figure BDA0003139308440000221
Figure BDA0003139308440000231
Figure BDA0003139308440000241
实施例3：抗人CD40抗体的结合能力鉴定
3.1抗CD40抗体的亲和力
采用本领域常规的方法BIACORE法测定抗体1、抗体7、抗体15、抗体25、抗体28、抗体35、抗体41以及阳性对照抗体CP870893的亲和力。结果如表4所示。
表4 BIACORE法测定抗CD40抗体的亲和力(KD)
Figure BDA0003139308440000242
Figure BDA0003139308440000251
3.2抗CD40抗体的Daudi细胞表面抗原的结合能力
使用表达CD40的Daudi细胞检测抗CD40抗体与细胞表面的CD40分子结合能力。
抗体1、抗体7、抗体25、抗体28、抗体35、抗体41，以及阳性对照抗体APX005，用不同浓度的抗体去孵育Daudi细胞。抗体1、抗体7抗体浓度从10μg/ml开始，共十个浓度点，抗体25、抗体28、抗体35、抗体41抗体浓度从6μg/ml开始按照2.5倍往下稀释，共9个浓度点，统计MFI，并用SoftMax Pro处理数据，测得抗体1、抗体7、抗体25、抗体28、抗体35、抗体41和抗体APX005与Daudi细胞结合的EC50值分别为961.6ng/ml、620.7ng/ml、413.8ng/ml、651.3ng/ml、223.3ng/ml、765.2ng/ml、859.7ng/ml；采用同样检测方法，抗体27、29、36、45与Daudi细胞结合的EC50值分别为92.53ng/ml、323.3ng/ml、185.4ng/ml和125.9ng/ml。
3.3抗CD40抗体的HT1080-hCD40细胞表面抗原的结合能力
将梯度抗体浓度的抗体1、抗体7、抗体25、抗体28、抗体35、抗体41以及对照抗体APX005，去孵育HT1080-hCD40细胞(表达人CD40的HT1080细胞，购自康源博创生物科技(北京)有限公司，KC-0142)。抗体浓度从15μg/ml开始，2.5倍往下稀释，共十个浓度点，统计MFI，并用SoftMax Pro处理数据，测得抗体1、抗体7、抗体25、抗体28、抗体35、抗体41和APX005与HT1080-hCD40细胞结合的EC50值分别为2154ng/ml、2191ng/ml、593.3ng/ml、944.4ng/ml、4698ng/ml、3517ng/ml、995.1ng/ml。
3.4抗CD40抗体的细胞结合特异性
把100nM抗CD40抗体(抗体1、抗体7、抗体25、抗体28、抗体34、抗体41)或人IgG1(阴性对照)分别与Jurkat细胞、CHO细胞、293F细胞、Raji细胞孵育1h，加入Anti-hIgG-FC-PE(Thermofisher，Ref 12-4998-82)，然后在Accuri C6流式细胞仪上进行检测，信号采集用FL2通道。Jurkat细胞、CHO细胞、293F细胞上均无CD40抗原表达，Raji细胞有CD40抗原表达。抗CD40抗体和Jurkat、CHO、293F细胞均无明显结合，和Raji细胞有强结合，显示了抗CD40抗体细胞结合良好的特异性，见图1。
3.5抗CD40抗体的种属特异性
用ELISA的方法，先包被2μg/ml的小鼠的CD40(mCD40-his，购自近岸生物，Catalog#CS43)以及猴子的CD40(cCD40-his，购自近岸生物，Catalog#CA90)，4℃过夜，洗涤后，再孵育抗CD40抗体(抗体1、抗体7、抗体25、抗体28、抗体34、抗体41)和阳性对照抗体(APX005)、阴性对照抗体(IgG1)，最后通过HRP标记的二抗进行标记显色。抗CD40抗体与猴cCD40-His有梯度依赖地结合，与小鼠的mCD40-his不结合。检测所得的OD值如图2A和图2B所示。
实施例4：抗CD40抗体的生物活性检测
4.1用NFκB报告基因系统检测抗CD40抗体的体外激活活性。
将hCD40对应的基因序列构建到pCDNA3.1载体得到pCDNA3.1-hCD40质粒，将pCDNA3.1-hCD40质粒和pGL4.32[luc2P-NF-κB-RE-Hygro]Vector(购自Promega公司)通过PEI共转染293T细胞构建293T-CD40-NFkb-luciferase-reporter(报告系统)细胞株，用于体外检测抗CD40抗体的细胞活性。
抗CD40抗体的细胞活性检测(报告系统)方法为，将状态良好的293T-CD40-NFkb-luciferase-reporter按照5×104细胞/孔进行铺板过夜，第二天加入梯度稀释的抗CD40抗体(抗体1、抗体7、抗体25、抗体28、抗体34、抗体41)和阳性抗体APX005，抗体浓度从5μg/ml开始，3倍稀释，8个浓度点，在细胞培养箱中反应6h，然后每孔加入100μl ONE-Glo试剂(ONE-GloTM Luciferase Assay System，购自Promega公司)，在加入试剂后10min内读取荧光值，抗CD40抗体和阳性抗体APX005能梯度依赖地激活报告系统。结果如图3A、图3B所示。
在抗CD40抗体的细胞活性检测(报告系统)中，上述方法在加入抗体时，同时加入5μg/ml的抗人IgG1-Fc抗体(Anti-hIgG1-Fc，购自Sigma，货号I2136)偶联抗CD40抗体，其它操作相同。结果表明(图3C、图3D)，Anti-hIgG1-Fc偶联能显著增强抗CD40抗体的活性。本发明的抗CD40抗体可以通过与表达Fc受体的细胞实现体内偶联，增强抗CD40抗体的活性。
4.2抗CD40抗体在MLR(淋巴细胞混合反应)实验中对IFN-γ的分泌促进作用
通过本领域常规的方法诱导志愿者A(年龄：20，男，身体状况良好)的外周血来源DC(Mo-DC)成熟，即将志愿者A的PBMC贴壁后，加入IL4和GM-CSF诱导培养5天，加入TNF-α、IL-β、IL6、PEG2成熟培养2天，得到成熟Mo-DC。将志愿者A的Mo-DC与志愿者B(年龄：29，男，身体状况良好)的PBMC在96孔板共同培养，同时加入梯度稀释的抗CD40抗体(抗体1、抗体7、抗体25、抗体28、抗体34、抗体41)和阳性抗体APX005，抗体浓度从166ng/ml开始，3倍稀释，5个浓度点，72h后用IFN-γELISA KIT(欣博盛公司，EHC102g)检测共培养体系上清的IFN-γ。抗CD40抗体和阳性抗体APX005能梯度依赖地提高MLR实验中IFN-γ的分泌(用OD450表示IFN-γ差异)。结果如图4所示。
本文引用的所有出版物和专利文献都通过引用纳入本文，就好像每个所述出版物或文献都特定和单独表示通过引用纳入本文。对上述出版物和专利文献的引用并不表示承认上述任何内容是相关的在先技术，也并不表示承认其内容或日期。现在，本发明已以书面说明书方式描述，本领域技术人员应认识到可以多种实施方案实践本发明，而上文的说明书和实施例旨在说明而非限制本发明的权利要求。
序列表
<110> 百奥泰生物制药股份有限公司
<120> 抗CD40抗体或抗原结合片段及其应用
<150> CN202010610151.4
<151> 2020-06-30
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Ala Arg Ala Leu Tyr Tyr Thr Gly Phe Tyr Arg Pro Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 114
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Gly Asn Phe
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asp Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Leu Tyr Tyr Thr Gly Phe Tyr Arg Pro Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 115
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ile Gly Ser Gly Ala Thr Ala Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Leu Tyr Tyr Thr Gly Phe Tyr Arg Pro Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 116
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Ser Gly Phe
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asp Trp Thr Trp Ser Ser His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Tyr Tyr Thr Gly Phe Tyr Arg Pro Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 117
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Thr Phe
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asn Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Leu Tyr Tyr Thr Gly Phe Tyr Arg Pro Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 118
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asn Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Leu Tyr Tyr Thr Gly Phe Tyr Arg Pro Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 119
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Phe Gly Thr Phe
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Leu Tyr Tyr Thr Gly Phe Tyr Arg Pro Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 120
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ala Thr Tyr
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asp Ser Thr Ala Asp Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Leu Tyr Tyr Thr Gly Phe Tyr Arg Pro Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 121
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Gly Thr Phe
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asp Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Leu Tyr Tyr Thr Gly Phe Tyr Arg Pro Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 122
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Trp Gly Gly Asp Ser Ala Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Leu Tyr Tyr Thr Gly Phe Tyr Arg Pro Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 123
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Ser Thr Asn
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asp Ser Gly Phe Gly Gly Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Leu Tyr Tyr Thr Gly Phe Tyr Arg Pro Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 124
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asp Ser Gly Thr Gly Thr Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Leu Tyr Tyr Thr Gly Phe Tyr Arg Pro Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 125
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asp Phe
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly His Lys Asp Thr Lys Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Leu Tyr Tyr Thr Gly Phe Tyr Arg Pro Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 126
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Ser Thr Phe
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asn Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Leu Tyr Tyr Thr Gly Phe Tyr Arg Pro Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 127
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 128
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 129
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 130
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 130
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Gly Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asn Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Leu Tyr Tyr Thr Gly Phe Tyr Arg Pro Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 131
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
gatatccaga tgacccagtc ccccagctcc ctgagcgcta gcgtgggcga ccgggtgacc 60
atcacctgca gggcctccca gggcatcagc tcctacctgg cttggtatca gcagaagcct 120
ggcaaggccc ctaagctgct gatctatgcc gcttcctccc tgcagtccgg cgtgccttcc 180
aggttcagcg gctccggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctgcagcct 240
gaggacttcg ccacctatta ttgccagcag cactatacca cccctcctac ctttggccag 300
ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 132
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
gaagtgcaat tggtggagag cggcggagga ctggtgcagc ccggaggatc cctgaggctg 60
agctgtgctg cctccggctt ctcctttggc acctacgcta tgagctgggt gcggcaggct 120
cccggcaagg gactggagtg ggtgtccggc atcgactccg gcaccggcaa tcctttctat 180
gctgattccg tgaagggcag gttcaccatc tcccgggaca attccaagaa taccctgtac 240
ctgcagatga atagcctgcg ggccgaggac accgctgtgt actattgtgc ccgggccttg 300
tattacaccg gcttctacag gcctctggat tactggggcc agggcaccct ggtgacggtg 360
agcagcgcct ctaccaaggg cccctctgtg tttcctctgg ctccctccag caagtctacc 420
tctggtggaa cagctgccct gggctgcctg gtcaaggatt actttcctga gcctgtcacc 480
gtgtcctgga actctggcgc tctgacatct ggcgtgcaca cctttccagc tgtgctccag 540
tcctccggcc tgtactctct gtcctctgtc gtgaccgtgc cttctagctc tctgggcacc 600
cagacctaca tctgcaatgt gaaccacaag ccttccaaca ccaaggtgga caagaaggtg 660
gaacccaagt cctgcgacaa gacccacacc tgtcctccat gtcctgctcc agaactgctc 720
ggcggacctt ccgtgttcct gtttcctcca aagcctaagg acaccctgat gatctctcgg 780
acccctgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtctcacg aagatcccga agtgaagttc 840
aactggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagcctag agaggaacag 900
tacaactcca cctacagagt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ttggctgaac 960
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgctcctat cgaaaagacc 1020
atctccaagg ccaagggcca gcctagggaa ccccaggttt acaccttgcc tccatctcgg 1080
gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaagggctt ctacccctcc 1140
gacatcgccg tggaatggga gtctaatggc cagcctgaga acaactacaa gacaacccct 1200
cctgtgctgg actccgacgg ctcattcttc ctgtactcca agctgacagt ggacaagtcc 1260
agatggcagc agggcaacgt gttctcctgc tccgtgatgc acgaggccct gcacaatcac 1320
tacacccaga agtccctgtc tctgtcccct ggcaaa 1356
<210> 133
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr
100 105 110
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr
130 135 140
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr
195 200 205
Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val
210 215 220
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
225 230 235 240
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
290 295 300
Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 134
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ile Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210

Claims (10)

1.一种抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段特异性结合CD40，所述抗体或抗原结合片段包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3中的一个或多个，其中VH CDR1包含氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7，X1为D、F、G、或Y，X2为I、N、S或T，X3为F，X4为A、D、F、G或Y，X5为D、G、N、S或T，X6为A、F、N、S或Y，X7为A、S或Y，并且X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7至少包含三个不同的氨基酸，VH CDR2包含氨基酸序列Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10，Z1为A、G或S，Z2为I，Z3为D、I、K或S，Z4为A、G、P、Q、S、T、W或Y，Z5为D、G、H、S或T，Z6为A、F、G、K、S、T或W，Z7为A、D、G或S，Z8为D、G、N、S或T，Z9为A、H、K、N、P、R、S或T，Z10为A、F、G、H、S或Y，并且Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10至少包含五个不同的氨基酸，VH CDR3包含如SEQ IDNO:79所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，X1为F，X4为D或G，X5为S或T，X6为F、N或Y。
3.如权利要求1或2所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，Z1为G，Z3为D或S，Z4为S或W，Z5为D或G，Z6为G或T，Z7为D或G，Z8为N，S或T，Z9为A或P，Z10为F，H或S。
4.如权利要求1-3任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段还包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3中的一个或多个，所述VL CDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述VL CDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
5.如权利要求4所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
6.一种抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段特异性结合CD40，所述抗体或抗原结合片段包含VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3中的一个或多个，所述VL CDR1包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述VL CDR2包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述VL CDR3包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述VH CDR1包含如SEQ ID NO:4-47中任一项所示的氨基酸序列，所述VH CDR2包含如SEQ IDNO:48-78中任一项所示的氨基酸序列，所述VH CDR3包含如SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列。
7.一种抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含VL CDR1、VLCDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述VL CDR1包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述VL CDR2包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述VL CDR3包含如SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列，所述VH CDR1包含如SEQ ID NO:4-47中任一项所示的氨基酸序列，所述VH CDR2包含如SEQ ID NO:48-78中任一项所示的氨基酸序列，所述VH CDR3包含如SEQID NO:79所示的氨基酸序列。
8.如权利要求6或7所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述VH CDR1包含如SEQID NO:4-9中任一项所示的氨基酸序列，所述VH CDR2包含如SEQ ID NO:48-50中任一项所示的氨基酸序列。
9.如权利要求1-8任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:81-126任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:81-126任一项所示的氨基酸序列至少有90％序列同源性的氨基酸序列。
10.如权利要求1-9任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列，或与SEQID NO:80所示的氨基酸序列至少有90％序列同源性的氨基酸序列。
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