CN112142847B - 改造的Fc片段，包含其的抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及改造的Fc片段，包含其的抗体及其应用。所述Fc片段为人IgG1来源，并且所述Fc片段的恒定区CH2结构域包含多处替换。该替换可以显著降低Fc片段与Fcγ受体(FcγR)的结合能力，减少抗体(如抗CD3抗体)对T细胞的非特异性激活。

Description

改造的Fc片段，包含其的抗体及其应用
本申请是国际申请号“PCT/CN2019/075881”，国际申请日“2019年2月22日”，中国申请号“201980003210.7”，进入中国国家阶段日期2019年12月25日，发明名称为“改造的Fc片段，包含其的抗体及其应用”的分案申请。
技术领域
本发明涉及抗体领域。具体地，涉及改造的Fc片段，包含其的抗体。
背景技术
人的天然抗体，如IgG1，IgG2，IgG3和IgG4都具有与FcγR结合的能力，人的FcγR分为FcγRI(CD64)，FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)三类，其中每一类受体对应表达在不同的单核细胞表面，并且每一类受体又分为a、b、c等多种亚型。天然抗体通过自身的Fc与FcγR结合产生如下免疫效应功能：抗体依赖型细胞介导的细胞毒性(ADCC)，抗体依赖型细胞介导的细胞吞噬(ADCP)，以及补体介导的细胞毒性(CDC)等。在抗体药物研究过程中，对于有些类型的抗体，需要降低与FcγR结合能力，以减少ADCC、ADCP和CDC的产生，从而降低抗体的毒性和副作用。在一些特殊情况下，比如抗CD3的抗体，特别是多功能抗体可以同时靶向肿瘤细胞和CD3表达的T淋巴细胞，需要尽量去除与FcγR的结合，从而减少T细胞的非特异性激活产生的大量细胞因子释放所带来的毒副作用。
多功能抗体(multifunctional antibody)为具有多种不同结合特异性的抗体或抗体类分子。多功能抗体广泛应用于生物医学，尤其是针对肿瘤的免疫治疗中。目前，对于免疫治疗研究的一个关注焦点为如何利用多功能抗体介导的细胞毒性来杀死目标细胞。多功能抗体可设计为同时靶向作用于肿瘤细胞和效应细胞，同时激发效应细胞使其杀灭肿瘤细胞。
多功能抗体可通过例如化学工程、细胞工程以及基因工程的方法制备。基因工程的优势在于能够容易地改造抗体，使得能够设计和生产许多不同形式的多功能抗体片段，包括双体，串联的(tanderm)ScFv和单链双体及其衍生物(参见Jin和Zhu，于“The designand engineering of IgG-Like bispecific antibodies”，RE Kontermann(编)，Bispecific antibodies)。由于这些多功能抗体不具有IgG Fc结构域，因此它们的小的尺寸使得它们渗透进入肿瘤的能力增强，但它们在体内具有相当短的半衰期并且缺乏ADCC作用，该作用与抗体的恒定区相关联。
现阶段已有一些Fc改造的技术，可以降低Fc与FcγR的结合能力，如：(1)在文献“Curr Opin Biotechnol.2011Dec；22(6)：858-67.Bypassing glycosylationengineering aglycosylated fulllength IgG antibodies for human therapy”中提到，通过对人IgG1的Fc第297位的天冬酰胺(N297)进行突变，可以有效去除Fc的糖基化，从而降低与FcγR的结合；(2)在专利申请“WO2009100309A2”中，提到对人IgG1的Fc第234位(亮氨酸L234)、第235位(亮氨酸L235)和第331位(脯氨酸P331)分别突变为苯丙氨酸、谷氨酸和丝氨酸(L234F/L235E/P331S)，从而降低与FcγR的结合；(3)在专利申请“US20130078249A1”提到，通过对人IgG1的Fc第234位(亮氨酸L234)、第235位(亮氨酸L235)和第331位(脯氨酸P329)分别突变为丙氨酸、丙氨酸和甘氨酸(L234A/L235A/P329G)，能降低与FcγR的结合；(4)在文章“Protein Eng Des Sel.2016Oct；29(10)：457-466.Novel human IgG1 andIgG4 Fc-engineered antibodies with completely abolished immune effectorfunctions”中提到，对人IgG1的Fc第234位亮氨酸(L234)和第235位亮氨酸(L235)分别突变为丙氨酸和丙氨酸(L234A/L235A)，能降低与FcγR的结合能力；(5)在专利申请“WO2011066501A1”中提到，通过对人的Ig62的Fc第234位(缬氨酸V234)、第237位(甘氨酸G237)、第238位(脯氨酸P238)、第268位(组氨酸H268)、第309位(缬氨酸V309)、第330位(丙氨酸A330)和第331位(脯氨酸P331)分别突变为丙氨酸、丙氨酸、丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸和丝氨酸(V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S)，能降低与FcγR的结合能力。
但是，上述对于Fc改造的技术，应用于多功能抗体结构中时，并不能完全消除抗CD3抗体对T细胞的非特异性激活(如人IgG1中，L234F/L235E/P331S突变、L234A/L235A/P329G突变和L234A/L235A突变)，并且某些位点的改造，会导致抗体的稳定性变差(如人IgG1的第297位天冬酰胺的突变去除糖基化)，另外在文献“J Immunol 2003；170：3134-3138；Human IgG2 can form covalent dimers.”中提到人IgG2容易发生二聚化形成分子量达300kD的四价复合物，而对人IgG2进行多达7个位置的氨基酸突变(如V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S)，存在增加免疫原性的风险。
为解决上述问题，既需要降低Fc与FcγR结合能力以去除非特异性激活T细胞(如抗CD3抗体)，也需要避免抗体的稳定性变差、免疫原性变强，本发明通过一种新的Fc改造方法，将人IgG1的Fc中CH2结构域整体替换为人IgG2的CH2结构域，同时对该结构域的氨基酸残基进行突变，可以显著降低抗体与FcγR的结合能力，更有效地消除抗体(如抗CD3抗体)对T细胞的非特异性激活，而维持抗体良好的稳定性。
发明内容
本发明提供了一种Fc改造的方法，将人IgG1的恒定区CH2结构域整体替换为人IgG2的CH2结构域，优选对替换后的CH2结构域进行若干氨基酸残基的替换。
该CH2的残基替换可以有效降低抗体与FcγR的结合能力。当抗体的一个结合位点是CD3时，该CH2的替换也可以显著降低抗体对T细胞的非特异性激活。
本发明提供了3种多功能抗体及制备方法，具体的多功能抗体结构见图1-3。
具体地，本发明涉及以下几个方面：
1.多肽，其包含修饰的Fc片段，或由其组成，其中所述Fc片段为人IgG1来源，并且所述Fc片段的恒定区CH2结构域被替换为人IgG2的CH2结构域，其中人IgG2的CH2结构域如SEQ ID NO：94所示。
2.上述1所述的多肽，其中所述Fc片段的CH2结构域进一步包含选自由以下位置组成的组的突变：根据Kabat编号的C229，D265，D270或其任意组合。
3.上述2所述的多肽，其中所述突变为C229位置的突变，优选所述突变选自由以下各项组成的组：C229A，C229G，C229P，C229S，C229V，C229L，C229I，C229T，C229M，C229N，C229Q，C229D，C229E，C229K，C229R，C229F，C229Y，C229W或C229H，优选C229S，C229A，C229G和C229P。
4.上述2所述的多肽，其中所述突变为D265位置的突变，优选所述突变选自由以下各项组成的组：D265A，D265G，D265P，D265S，D265V，D265L，D265I，D265T，D265M，D265N，D265Q，D265E，D265K，D265R，D265F，D265Y，D265W或D265H，优选D265A。
5.上述2所述的多肽，其中所述突变为D270位置的突变，优选所述突变选自由以下各项组成的组：D270A，D270G，D270P，D270S，D270V，D270L，D270I，D270T，D270M，D270N，D270Q，D270E，D270K，D270R，D270F，D270Y，D270W或D270H，优选D270A。
6.上述2-5任一项所述的多肽，其中所述突变为位置C229，D265和D270的任意两种组合的突变，或是位置C229，D265和D270的组合突变，优选位置D265和D270的组合的突变。
7.上述2-5任一项所述的多肽，其中所述Fc片段的CH2结构域进一步包含选自以下位置组成的组的突变：G327，T339或其组合。
8.上述6所述的多肽，其中所述突变选自G327A，G327V，G327L，G327I和/或T339A。
9.上述2-8任一项所述的多肽，其中所述突变选自C229P/G327A，C229P/T339A，D270A/G327A，D270A/T339A，D270A/G327A/T339A或C229P/D265A/D270A。
10.上述2-5任何一项所述的多肽，其中所述Fc片段的CH2结构域的序列选自SEQIDNO：94-101和122-176组成的组。
11.包含上述1-10任一项所述多肽的抗体或其抗原结合片段，所述抗体选自单特异性抗体，多特异性抗体，更优选双特异性抗体，优选地，所述抗原结合片段选自Fab，Fab’，F(ab’)2，Fd，Fv，dAb，Fab/c，互补决定区(CDR)片段，单链抗体(例如，scFv)，双价抗体或结构域抗体。
12.上述11所述的抗体，其中所述抗体特异性结合选自以下组成的组的抗原：肿瘤抗原，病毒或细菌抗原，内毒素，免疫抗原，优选地，所述肿瘤抗原选自PD-L1(优选如SEQ IDNO：118表示)，B7-H3，SLAMF7(优选如SEQ ID NO：119表示)，CD38(优选如SEQ ID NO：116表示)，EpCAM，CEA(优选如SEQ ID NO：120表示)，CD19和BCMA(优选如SEQ ID NO：117表示)；所述免疫抗原选自CD3(优选如SEQ ID NO：121表示)、CD16A、CD47和NKG2D。
13.上述12所述的抗体，其是非对称双特异性抗体，包含轻链、重链和融合肽1，融合肽1包含scFv和Fc片段，所述抗体具有轻链-重链配对，和重链-融合肽1配对，每个配对形成链间二硫键；轻链-重链配对靶向肿瘤抗原，融合肽1中ScFv靶向免疫细胞抗原。
14.上述12所述的抗体，其是非对称三价双特异性抗体，包含2条轻链、1条重链和1条融合肽2，具有轻链-重链配对，轻链-融合肽2配对，和重链-融合肽2配对，每个配对形成链间二硫键；融合肽2包含重链可变区VH、重链第一恒定区CH1、ScFv和Fc，其中ScFv位于CH1和Fc之间并通过接头连接，轻链-重链配对靶向肿瘤抗原，融合肽2中VH-CH1和轻链配对靶向相同的肿瘤抗原，ScFv靶向免疫细胞抗原。
15.上述12所述的抗体，其是非对称三价双特异性抗体，包含融合重链、cross轻链、重链和轻链，具有轻链-重链配对、轻链-融合重链配对，cross轻链-融合重链配对，和融合重链-重链配对，每个配对形成链间二硫键；轻链包含第一轻链可变区VLm和轻链恒定区CL；融合重链包含第一重链可变区VHm、重链第一恒定区CH1、第二重链可变区VHs、轻链恒定区CL和Fc，其中VHs和CL通过接头连接形成肽段“VHs-接头-CL”，“VHs-接头-CL”位于CHl和Fc之间并通过接头/铰链连接；cross轻链包含第二轻链可变区VLs和CH1，VLs和CH1之间通过接头连接，VLm-VHm配对靶向肿瘤抗原，VLs-VHs配对靶向免疫细胞抗原。
16.上述13-15任一项所述的抗体，所述抗体具有两个不同的CH3，两个CH3之间以“杵-入-臼”或/和“盐桥”方式配对形成异二聚体，优选CH3结构域的序列如SEQ ID NO：102-115所示。
17.上述13-16任一项所述的抗体，其中所述轻链-重链配对或VLm-VHm配对选自以下组成的组：
(1)靶向肿瘤抗原B7-H3的SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：11；
(2)靶向肿瘤抗原B7-H3的SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：13；
(3)靶向肿瘤抗原CD38的SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：15；
(4)靶向肿瘤抗原CD38的SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：17；
(5)靶向肿瘤抗原CD38的SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：19；
(6)靶向肿瘤抗原EpCAM的SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：21；
(7)靶向肿瘤抗原EpCAM的SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：23；
(8)靶向肿瘤抗原BCMA的SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：25；
(9)靶向肿瘤抗原BCMA的SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：27；
(10)靶向肿瘤抗原BCMA的SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：29；
(11)靶向肿瘤抗原PD-L1的SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：31；
(12)靶向肿瘤抗原PD-L1的SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：33；
(13)靶向肿瘤抗原PD-L1的SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：35；
(14)靶向肿瘤抗原CD19的SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：37；
(15)靶向肿瘤抗原SLAMF7的SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：39；
(16)靶向肿瘤抗原CEA的SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：41；
(17)靶向免疫抗原CD3的SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：1；
(18)靶向免疫抗原CD3的SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：3；
(19)靶向免疫抗原CD3的SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：5；
(20)靶向免疫抗原CD3的SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：7；和
(21)靶向免疫抗原CD3的SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：9。
18.上述13-17任一项所述的抗体，其中所述抗体选自以下各项组成的组：
(1)PDL1-M1-G2，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：94和SEQ IDNO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(2)PDL1-M1-SG2，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：95和SEQ IDNO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(3)CD38-M1-G2，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：94和SEQ IDNO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(4)CD38-M1-SG2，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：95和SEQ IDNO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(5)CD38-M1-SG2-1，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(6)CD38-M1-G2-3，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(7)CD38-M1-SG2-2，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(8)CD38-M1-G2-2，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(9)CD38-M1-G2-1，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(10)CD38-M1-SG2-3，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(11)CD38-M1-AG2，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：96和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：96和SEQ ID NO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(12)CD38-M1-GG2，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(13)CD38-M1-PG2，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(14)CD38-M1-DG2，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(15)CD38-M1-G2D，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(16)CD38-M1-DG2D，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(17)CD38-M1-G2D-1，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(18)M1IC-SG2，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQID NO：9，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：95和SEQ IDNO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(19)M1IC-G2，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQ IDNO：9，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：94和SEQ IDNO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(20)M1IC-AG2，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQID NO：9，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：96和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：96和SEQ IDNO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(21)M1IC-GG2，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQID NO：9，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：97和SEQ IDNO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(22)M1IC-PG2，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQID NO：9，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：98和SEQ IDNO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(23)M1IC-DG2，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQID NO：9，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：99和SEQ IDNO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(24)M1IC-G2D，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQID NO：9，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：100和SEQID NO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(25)M1IC-DG2D，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQID NO：9，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：101和SEQID NO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(26)M1IC-G2-1，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：94和SEQ IDNO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(27)M1IC-SG2-1，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：95和SEQ IDNO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(28)M1IC-AG2-1，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：96和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：96和SEQ IDNO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(29)M1IC-GG2-1，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：97和SEQ IDNO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(30)M1IC-PG2-1，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：98和SEQ IDNO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(31)M1IC-DG2-1，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：99和SEQ IDNO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(32)M1IC-G2D-1，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：100和SEQ IDNO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(33)M1IC-DG2D-1，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：109，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：108，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(34)M1IC-DG2D-1A，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：107，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(35)M1IC-DG2D-1B，其包含融合肽1，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽1包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：115，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：114，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(36)BCMA-M2-G2，其包含融合肽2，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽2包含SEQID NO：29，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQID N0：2，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：107，或由其组成；重链包含SEQ IDNO：29，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(37)BCMA-M2-SG2，其包含融合肽2，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽2包含SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：107，或由其组成；重链包含SEQID NO：29，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID No：95和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(38)BCMA-M2-AG2，其包含融合肽2，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽2包含SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：96和SEQ ID NO：107，或由其组成；重链包含SEQID NO：29，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：96和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(39)BCMA-M2-GG2，其包含融合肽2，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽2包含SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：107，或由其组成；重链包含SEQID NO：29，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(40)BCMA-M2-PG2，其包含融合肽2，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽2包含SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：107，或由其组成；重链包含SEQID NO：29，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(41)BCMA-M2-DG2，其包含融合肽2，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽2包含SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：107，或由其组成；重链包含SEQID NO：29，SEQ ID No：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：99和SEQ ID No：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(42)BCMA-M2-G2D，其包含融合肽2，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽2包含SEQ ID No：29，SEQ ID NO：82，SEQ ID No：74，SEQ ID No：48，SEQ ID No：1，SEQ ID No：54，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：107，或由其组成；重链包含SEQID NO：29，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(43)BCMA-M2-DG2D，其包含融合肽2，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽2包含SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：1107，或由其组成；重链包含SEQID NO：29，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(44)M2IC-G2，其包含融合肽2，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽2包含SEQ IDNO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：107，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(45)M2IC-SG2，其包含融合肽2，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽2包含SEQID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQID NO：2，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：107，或由其组成；重链包含SEQ IDNO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(46)M2IC-AG2，其包含融合肽2，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽2包含SEQID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQID NO：2，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：96和SEQ ID NO：107，或由其组成；重链包含SEQ IDNO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：96和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(47)M2IC-GG2，其包含融合肽2，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽2包含SEQID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQID NO：2，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：107，或由其组成；重链包含SEQ IDNO：43，SEQ ID No：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(48)M2IC-PG2，其包含融合肽2，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽2包含SEQID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQID NO：2，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：107，或由其组成；重链包含SEQ IDNO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(49)M2IC-DG2，其包含融合肽2，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽2包含SEQID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQID NO：2，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：107，或由其组成；重链包含SEQ IDNO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(50)M2IC-G2D，其包含融合肽2，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽2包含SEQID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQID NO：2，SEQ ID NO：68，SEQ ID N0：100和SEQ ID NO：1 07，或由其组成；重链包含SEQ IDNO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(51)M2IC-DG2D，其包含融合肽2，重链和轻链，或由其组成；其中融合肽2包含SEQID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：54，SEQID NO：2，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：101和SEQ ID No：107，或由其组成；重链包含SEQ IDNO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(52)CEA-M3-G2，其包含融合重链，cross轻链，重链和轻链，或由其组成；其中融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：46，SEQID NO：81，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：107，或由其组成；cross轻链包含SEQID NO：2，SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：82，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(53)CEA-M3-SG2，其包含融合重链，cross轻链，重链和轻链，或由其组成；其中融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：46，SEQID NO：81，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：107，或由其组成；cross轻链包含SEQID NO：2，SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：82，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(54)CEA-M3-AG2，其包含融合重链，cross轻链，重链和轻链，或由其组成；其中融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：46，SEQID NO：81，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：96和SEQ ID NO：107，或由其组成；cross轻链包含SEQID NO：2，SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：82，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：96和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(55)CEA-M3-GG2，其包含融合重链，cross轻链，重链和轻链，或由其组成；其中融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：46，SEQID NO：81，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：107，或由其组成；cross轻链包含SEQID NO：2，SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：82，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(56)CEA-M3-PG2，其包含融合重链，cross轻链，重链和轻链，或由其组成；其中融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：46，SEQID NO：81，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：107，或由其组成；cross轻链包含SEQID NO：2，SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：82，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(57)CEA-M3-DG2，其包含融合重链，cross轻链，重链和轻链，或由其组成；其中融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：46，SEQID NO：81，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：107，或由其组成；cross轻链包含SEQID NO：2，SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：82，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(58)CEA-M3-G2D，其包含融合重链，cross轻链，重链和轻链，或由其组成；其中融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：46，SEQID NO：81，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：107，或由其组成；cross轻链包含SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：82，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：41，SEQ IDNO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(59)CEA-M3-DG2D，其包含融合重链，cross轻链，重链和轻链，或由其组成；其中融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：46，SEQID NO：81，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：107，或由其组成；cross轻链包含SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：82，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：41，SEQ IDNO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(60)M3IC-G2，其包含融合重链，cross轻链，重链和轻链，或由其组成；其中融合重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：46，SEQ IDNO：81，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：107，或由其组成；cross轻链包含SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：82，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQID NO：75，或由其组成；
(61)M3IC-SG2，其包含融合重链，cross轻链，重链和轻链，或由其组成；其中融合重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：46，SEQID NO：81，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：107，或由其组成；cross轻链包含SEQID NO：2，SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：82，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID No：75，或由其组成；
(62)M3IC-AG2，其包含融合重链，cross轻链，重链和轻链，或由其组成；其中融合重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：46，SEQID NO：81，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：96和SEQ ID NO：107，或由其组成；cross轻链包含SEQID NO：2，SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：82，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：96和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(63)M3IC-GG2，其包含融合重链，cross轻链，重链和轻链，或由其组成；其中融合重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：51，SEQ ID No：1，SEQ ID No：46，SEQID NO：81，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：107，或由其组成；cross轻链包含SEQID NO：2，SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：82，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(64)M3IC-PG2，其包含融合重链，cross轻链，重链和轻链，或由其组成；其中融合重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：46，SEQID NO：81，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：107，或由其组成；cross轻链包含SEQID NO：2，SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：82，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(65)M3IC-DG2，其包含融合重链，cross轻链，重链和轻链，或由其组成；其中融合重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：46，SEQID NO：81，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：107，或由其组成；cross轻链包含SEQID NO：2，SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：82，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(66)M3IC-G2D，其包含融合重链，cross轻链，重链和轻链，或由其组成；其中融合重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：46，SEQID NO：81，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：107，或由其组成；cross轻链包含SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：82，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：43，SEQ IDNO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(67)M3IC-DG2D，其包含融合重链，cross轻链，重链和轻链，或由其组成；其中融合重链包含SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：46，SEQID NO：81，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：107，或由其组成；cross轻链包含SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：82，或由其组成；重链包含SEQ ID NO：43，SEQ IDNO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：106，或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：75，或由其组成；
(68)CD3mAb-G2，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(69)CD3mAb-SG2，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(70)CD3mAb-AG2，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：96和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(71)CD3mAb-GG2，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(72)CD3mAb-PG2，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(73)CD3mAb-G2-C229L，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：128和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(74)CD3mAb-G2-C229F，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(75)CD3mAb-G2-C229R，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：130和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(76)CD3mAb-G2-C229V，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：131和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(77)CD3mAb-G2-C229Q，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：132和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(78)CD3mAb-G2-C229K，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID No：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：133和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(79)CD3mAb-G2-C229D，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：134和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(80)CD3mAb-G2-C229I，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(81)CD3mAb-G2-C229Y，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID No：136和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(82)CD3mAb-G2-C229N，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(83)CD3mAb-G2-C229M，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：138和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(84)CD3mAb-G2-C229T，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID No：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：139和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(85)CD3mAb-G2-C229H，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：140和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(86)CD3mAb-G2-C229E，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：141和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(87)CD3mAb-G2-C229W，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：142和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(88)CD3mAb-G2-C229L，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：128和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(89)CD3mAb-DG2，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(90)CD3mAb-G2-D265P，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：143和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(91)CD3mAb-G2-D265K，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：144和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(92)CD3mAb-G2-D265S，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：145和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(93)CD3mAb-G2-D265F，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：146和SEQ ID No：102，或由其组成；
(94)CD3mAb-G2-D265R，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：147和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(95)CD3mAb-G2-D265L，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNo：66，SEQ ID NO：148和SEQ ID No：102，或由其组成；
(96)CD3mAb-G2-D2656，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：149和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(97)CD3mAb-G2-D265T，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：150和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(98)CD3mAb-G2-D265Y，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：151和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(99)CD3mAb-G2-D265W，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：152和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(100)CD3mAb-G2-D265H，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：153和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(101)CD3mAb-G2-D265V，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：154和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(102)CD3mAb-G2-D265Q，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：155和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(103)CD3mAb-G2-D265E，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：156和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(104)CD3mAb-G2-D265M，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：157和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(105)CD3mAb-G2-D265N，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：158和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(106)CD3mAb-G2-D265I，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：159和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(107)CD3mAb-G2D，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(108)CD3mAb-G2-D270L，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：160和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(109)CD3mAb-G2-D270R，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：161和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(110)CD3mAb-G2-D270P，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：162和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(111)CD3mAb-G2-D270G，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：163和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(112)CD3mAb-G2-D270V，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：164和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(113)CD3mAb-G2-D270H，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：165和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(114)CD3mAb-G2-D270Y，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：166和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(115)CD3mAb-G2-D270I，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：167和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(116)CD3mAb-G2-D270E，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：168和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(117)CD3mAb-G2-D270F，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：169和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(118)CD3mAb-G2-D270K，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：170和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(119)CD3mAb-G2-D270W，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：171和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(120)CD3mAb-G2-D270S，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：172和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(121)CD3mAb-G2-D270T，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：173和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(122)CD3mAb-G2-D270Q，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：174和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(123)CD3mAb-G2-D270M，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：175和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(124)CD3mAb-G2-D270N，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：176和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(125)CD3mAb-PG2-GA，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：122和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(126)CD3mAb-PG2-TA，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：123和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(127)CD3mAb-G2D-GA，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：124和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(128)CD3mAb-G2D-TA，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：102，或由其组成；
(129)CD3mAb-G2D-GATA，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQID NO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：126和SEQ ID NO：102，或由其组成；或
(130)CD3mAb-PDG2D，其包含轻链和重链，或由其组成，其中所述轻链包含SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：75，或由其组成；所述重链包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：127和SEQ ID NO：102，或由其组成。
19.上述11-18任一项所述的抗体的缀合物，所述缀合物包含于所述抗体偶联或融合的物质A，所述物质A选自治疗剂、药物前体、蛋白(例如酶)、病毒、脂质、生物反应调节剂(如免疫调节剂)、PEG、激素、寡核苷酸、诊断剂、细胞毒性剂，其可为药物或毒素，超声增强剂，非放射性标记物，可检测标记物，如化学发光物标记化合物(如鲁米诺、异鲁米诺、热性吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓盐和草酸酯)，或荧光发光金属(如152Eu，或镧系标记)。
20.编码上述1-10任一项所述多肽的多核苷酸。
21.细胞，其包含上述20所述的多核苷酸。
22.组合物，优选药物组合物，其包含上述1-10任一项所述的多肽，或包含上述11-18任一项所述的抗体。
23.将多肽或抗体递送到哺乳动物(优选人)受试者中而不诱导抗体依赖性细胞毒性作用的方法，包括给受试者施用上述1-10任一项所述的多肽或上述11-18任一项所述的抗体。
24.上述1-10任一项所述的多肽，或上述11-18任一项所述的抗体在制备施用给哺乳动物(优选人)受试者后不诱导抗体依赖性细胞毒性作用的药物中的应用。
技术解决方案
抗体具有重链恒定区的Fc片段，Fc包含铰链、CH2和CH3，其中CH2结构域包含一处或多处替换，该替换可以显著降低Fc片段与Fcγ受体(FcγR)的结合能力，减少抗体(如抗CD3抗体)对T细胞的非特异性激活。
在某些方面，抗体的Fc包含CH3结构域，且CH3结构域包含一处或多处替换，该替换在两种不同的CH3结构域之间形成杵-入-臼(knobs-into-holes)结构配对。
该Fc片段在同时进行上述CH2和CH3的替换后，可以显著降低Fc片段与FcγR的结合能力，减少抗体(如抗CD3抗体)对T细胞的非特异性激活。
在某些方面，该抗体具有轻链-重链对或VLm-VHm配对，这些配对针对肿瘤抗原具有特异性。一方面，该肿瘤抗原选自：PD-L1，SLAMF7，B7-H3，CEA，CD38，EpCAM，CD19和BCMA等。一方面，该轻链-重链对或VLm-VHm配对针对较对应的非肿瘤细胞而言在肿瘤细胞上过表达的蛋白具有特异性。
在某些方面，该抗体的轻链-重链对或VLm-VHm配对针对病毒或细菌具有特异性。一方面，该轻链-重链对或VLm-VHm配对针对内毒素具有特异性。
在某些方面，该抗体具有融合肽或轻重链可变区配对(VLs-VHs配对)，该融合肽或轻重链可变区配对针对免疫细胞表面抗原具有特异性，该表面抗原为CD3、CD16A、CD47、NKG2D等。
在某些方面，该免疫细胞选自T细胞、CIK细胞、NKT细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞和肥大细胞。
在某些方面，与野生型抗体片段相比，该重链、融合重链和/或该融合肽的Fc片段包含一处或多处替换，该替换在该重链和融合肽，或该重链和融合重链之间形成杵-入-臼结构配对(knobs-into-holes)。该配对可显著提高重链和融合肽的异二聚体配对效率。
在某些方面，该重链、融合重链和/或该融合肽的Fc片段包含一处或多处替换，该替换在该重链和融合肽，或该重链和融合重链之间形成盐桥配对(salt-bridge)。该配对可显著提高重链和融合肽的异二聚体配对效率。
在某些方面，该融合肽中的该CH2结构域位于该scFv片段和CH3结构域之间。一方面，该融合肽不包含CH1结构域。
在某些方面，该融合重链的VH和铰链区之间为轻链恒定区。
在某些方面，该融合重链和cross轻链配对，该cross轻链为VL-CHl结构。
在一个实施方案中，本发明还提供一种包含上述任一实施方案中的抗体的组合物。一方面，所述组合物还包含载体，所述载体为药用载体。
另一实施方案提供了一种复合体，该复合体包含与一个或多个抗原结合的上述任一实施方案中的抗体。
本申请进一步提供了一种制备上述抗体的方法。
定义
应注意非明确数量的实体限定应指一或多个(种)该实体；例如，“多功能抗体”应理解为表示一或多个(种)多功能抗体。同样地，非明确数量限定的、术语“一个或多个”和“至少一个”本文中可互换使用。
本文使用的术语“多肽”用于包括单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并且也指通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指两个或多个氨基酸的任一条或多条链，而不是指特定长度的该产物。因此、肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白”、“氨基酸链”、或任何指两个或多个氨基酸组成的一条或多条链的其他术语都包括在“多肽”的定义中，且术语“多肽”可代替这些术语的任何一个或与它们互换使用。术语“多肽”也用于指多肽的表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护基/阻断基衍生化、蛋白水解裂解或通过非自然产生的氨基酸的修饰。多肽可衍生自天然的生物源或通过重组技术生产，但不一定由指定核酸序列翻译而成。其可以任何方式产生，包括通过化学合成方式。
本文使用的术语“重组”，在涉及多肽或多核苷酸时指自然状态下不存在的多肽或多核苷酸的形式，其中一个非限制性的例子，可以通过将通常不会一起出现的多核苷酸或多肽组合在一起来实现。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽链分子之间或两个核酸分子之间的序列相似程度。同源性可通过比较每个序列中的位置来测定，可通过比对来进行比较。当在被比较的序列中的位置上有相同的碱基或氨基酸时，在该位置上的分子为同源的。多个序列之间的同源度为这些序列共有的配对或同源位点数量的函数。“无关的”或“非同源的”序列与本发明的序列之一之间具有少于40％的同源性，但优选小于25％的同源性。
多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一序列具有一定的百分比(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)的“序列同一性”是指，在比对时，在这两个序列比较时该百分比的碱基(或氨基酸)是相同的。此种比对和百分比同源性或序列同一性，可使用本领域中已知的软件程序测定，例如，通过Ausubel等人编的(2007)Current Protocols in Molecular Biology描述的那些软件。优选地，使用默认参数用于比对。BLAST是一种比对程序，使用默认参数。具体地，程序为BLASTN和BLASTP，使用如下默认参数：Genetic code＝standard；filter＝none；strand＝both；cutoff＝60；expect＝10；Matrix＝BLOSUM62；Descriptions＝50sequences；sort by＝HIGH SCORE；Databases＝non-redundant，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详细信息，可于以下互联网地址获得：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi，2008年5月21日最后一次访问。生物学等效的多核苷酸是具有上面提到的特定百分比的同源性，并编码具有相同或相似的生物活性多肽的多核苷酸。
术语“编码”在其应用于多核苷酸时指被认为“编码”某一多肽的多核苷酸，以其天然的状态或由本领域技术人员熟知的方法操作时，它可以被转录和/或翻译以产生该多肽的mRNA和/或其片段。反义链是此种核酸的互补物，该编码序列可以由其推导出。
本文使用的，“抗体”或者“抗原结合多肽”指特定识别并结合抗原的多肽或多肽复合体。抗体可为整个抗体也可为任何抗原结合片段或者其单链。因此术语“抗体”包括含有特定分子的任何蛋白或肽，该特定分子含有至少一部分的免疫球蛋白分子，该免疫球蛋白分子具有结合至抗原的生物活性。此种情况的实例包括但不限于，重链或轻链或其配体结合部分的互补决定区(CDR)，重链或轻链可变区，重链或轻链恒定区，框架(FR)区或其任何部分，或结合蛋白的至少一部分。
本文使用的术语“抗体片段”或“抗原结合片段”为抗体的一部分，例如F(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab、Fv、Fd、dAb、Fab/c、scFv等。不管结构如何，与相同的抗原结合的抗体片段被认为是完整抗体。术语“抗体片段”包括适配体、适配体对映体(spiegelmers)和双体(diabodies)。术语“抗体片段”也包括任何合成的或基因改造的蛋白，它们与抗体一样可结合至特定的抗原以形成复合体。
“单链可变片段”或“scFv”指免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区域的融合蛋白。在某些方面，这些区域用10至约25个氨基酸的短接头肽连接。该接头可富含甘氨酸以具有柔性，也含有丝氨酸或苏氨酸以具有可溶性，且能将VH的N-末端连接至VL的C末端，反过来也一样。该蛋白质保留了原始的免疫球蛋白的特性，只是去除了恒定区并引入了接头。ScFv分子为本领域已知的，且描述于美国专利5,892,019中。
术语抗体包括多种宽泛类别的多肽，这些多肽可被生化识别。本领域技术人员应理解重链分为gamma、mu、alpha、delta、及epsilon(γ，μ，α，δ，ε)并具有一些亚类(例如，γ1-4)。该链的性质决定了抗体的“类”，如IgG，IgM，IgA，IgD，IgE，或者IgY。免疫球蛋白亚类(同型)例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5等被很好表征并在功能上具有特异性。本领域技术人员参考本发明可容易识别这些类和同型的每一种修饰形式，因此，这些形式在本发明范围内。所有免疫球蛋白类明确地在本发明的范围内，下列讨论通常将针对免疫球蛋白分子的IgG类。关于IgG，标准免疫球蛋白分子包含两个相同的轻链多肽(它们的分子量约为23，000道尔顿)和两个相同的重链多肽(它们的分子量为53,000-70,000)。这四条链通常经二硫键以“Y”型连接在一起，其中轻链在“Y”结构的口部开始支撑重链，并延伸穿过可变区。
本发明的抗体、抗原结合多肽、它们的变体或衍生物包括但不限于，多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化的抗体、灵长类化的(primatized)抗体、或嵌合抗体、单链抗体、抗原结合片段，例如，Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、包含VL结构域或VH结构域的片段、由Fab表达库产生的片段、和抗独特型(idiotypic)(抗-Id)抗体(包括，例如，本文公开的抗Id抗体至LIGHT抗体)。本发明的免疫球蛋白分子或抗体分子可为任何类型的(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、免疫球蛋白分子的任何类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或亚类。
轻链分为kappa或lambda(κ，λ)。每类重链均可结合kappa或1ambda轻链。通常，轻链和重链共价地结合在一起，且当这些免疫球蛋白由杂交瘤、B细胞或基因改造的宿主细胞产生时，两条重链的“尾部”部分通过共价二硫键或非共价连接结合在一起。在该重链中，氨基酸序列从Y型结构的叉端的N末端向每条链的底部C末端延伸。
轻链和重链两者都分成结构区和功能同源区。术语“恒定”和“可变的”为功能上的使用。在此，应认识到轻链可变结构域(VL)和重链可变结构域(VH)同时决定了抗原识别和特异性。相反地，轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域(CH1，CH2或CH3)提供了重要的生物学性质，例如分泌、经胎盘的流动性、Fc受体结合，补体结合等。通常恒定区结构域的数量随着远离抗体的抗原结合位点或氨基端的末端位置而增加。N末端部分为可变区，而在C末端部分为恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端。
如上所述，该可变区域使得抗体能选择性识别并特异性结合抗原上的抗原表位。即，抗体的VL结构域和VH结构域，或互补决定区(CDR)的亚类组合形成定义三维抗原结合位点的可变区域。这种四价抗体结构形成了抗原结合位点，该抗原结合位点存在于Y构型的每个臂的末端。更具体地，该抗原结合位点被每个VH和VL链(即，CDR-H1，CDR-H2，CDR-H3，CDR-L1，CDR-L2和CDR-L3)上的三个CDR定义。在一些实例中，例如，某些衍生自骆驼种或基于骆驼免疫球蛋白改造的免疫球蛋白，完整的免疫球蛋白分子可仅由重链组成，而没有轻链。参见，例如，Hamers-Casterman等，Nature363：446-448(1993)。
自然产生的抗体中，存在于每个抗原结合域中的六个“互补决定区”或“CDR”是短的，非连续的氨基酸序列，它们具有特定的定位以形成抗原结合结构域，对于抗体假定其三维构型处于水环境中。该抗原结合结构域的其余氨基酸，称为“框架”区，具有更少的分子内可变性。该框架区主要采用β-折叠片构型，且CDR形成环，该环连接该β-折叠片结构，有时形成该β-折叠片结构的一部分。因此，框架区用于形成支架，该支架使CDR通过链内的、非共价作用在正确方向上定位。由该定位的CDR形成的抗原结合域定义了互补于免疫活性抗原表位的表面。该互补表面促进了抗体与其同源表位的非共价结合。本领域技术人员可对分别包括CDR和框架区的氨基酸针对任何给定的重链或轻链可变区容易地识别，因为它们已经被明确定义(参见，“Sequences of Proteins of Immunological Interest，”Kabat，E.，等，美国卫生和公共服务部(U.S.Department of Health and Human Services，)，(1983)；Chothia和Lesk，J.MoI.Biol.，196：901-917(1987)，其在此通过引用以全文形式结合至本文)。
在本技术领域内使用和/或可接受的情况下，一个术语有两个或两个以上定义时，本文使用的术语的定义用于包括所有的含义，除非明确说明与此相反。一个具体的例子为，使用术语“互补决定区”(“CDR”)来描述在重链和轻链多肽的可变区中都存在的非连续的抗原结合位点。这种具体区域由Kabat等描述于美国卫生和公共服务部，“Sequences ofProteins of Immunological Interest”(1983)和由Chothia等描述与J.MoI.Biol.196：901-917(1987)中，其通过全文引用结合至本文。根据Kabat和Chothia的定义，CDR包括相互比较时重叠的氨基酸残基，或氨基酸亚结构。然而，每种关于抗体或其变体的CDR的定义的应用都将在本文定义和使用的术语的范围内。包含如以上引用的每一篇参考文献定义的CDR的合适的氨基酸残基列于下表中作为比较。包含特定CDR的精确残基数将随该CDR的序列和大小变化。如果给定该抗体的可变区氨基酸序列，则本领域技术人员通常可确定哪些残基包含特定CDR。
[表1]抗体可变区的定义
Kabat Chothia
CDR-H1 31-35 26-32
CDR-H2 50-65 52-58
CDR-H3 95-102 95-102
CDR-L1 24-34 26-32
CDR-L2 50-56 50-52
CDR-L3 89-97 91-96
Kabat等也定义了用于可变结构域序列的编号系统，该系统适用于任一种抗体。本领域技术人员可毫无疑义地将该“Kabat编号”系统用于任何可变结构域序列，而不依赖于该序列自身之外的任何实验数据。本文使用的“Kabat编号”是指Kabat等描述的编号系统，其内容记载于美国卫生和公共服务部，“Sequence of Proteins of ImmunologicalInterest”(1983)。
除了上表，Kabat编号系统描述的CDR区如下：CDR-H1在大约31号氨基酸处开始(即，第一半胱氨酸残基后约9个残基)，包括约5-7个氨基酸，并在下一个色氨酸残基处终止。CDR-H2在CDR-H1的末端后第15个残基处开始，包括约16-19个氨基酸，并在下一个精氨酸或赖氨酸残基处终止。CDR-H3在CDR-H2的末端后约第33个氨基酸残基处开始；包括3-25个氨基酸；并在序列W-G-X-G处终止，其中X为任意氨基酸。CDR-L1在约残基24处开始(即，在半胱氨酸残基之后)；包括大约10-17个残基；并终止于下一个色氨酸残基。CDR-L2在CDR-L1的末端后约16个残基后开始，并包括约7个残基。CDR-L3在CDR-L2的末端后约第33个残基处开始(即，在半胱氨酸残基之后)；包括约7-11个残基，并在序列F或W-G-X-G处终止，其中X为任意氨基酸。
本文描述的抗体可来自任何动物源，包括鸟和哺乳动物。优选地，抗体为人、鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、驼马、马或鸡的抗体。在另一个实施例中，可变区可来自于软骨鱼(condricthoid)(例如，来自鲨鱼)。
本文使用的术语“重链恒定区”包括来自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链恒定区的多肽至少包含以下一种：CH1结构域，铰链(例如，上部铰链区、中间铰链区，和/或下部铰链区)结构域，CH2结构域，CH3结构域，或其变体或片段。例如，本发明中使用的抗原结合多肽可包含具有CHl结构域的多肽链；具有CHl结构域、至少一部分的铰链结构域和CH2结构域的多肽；具有CH1结构域和CH3结构域的多肽链；具有CH1结构域、至少一部分铰链结构域和CH3结构域的多肽链，或者具有CH1结构域，至少一部分铰链结构，CH2结构域，和CH3结构域的多肽链。在另一个实施方案中，本发明的多肽包括具有CH3结构域的多肽链。另外，在本发明中使用的抗体可能缺少至少一部分CH2结构域(例如，所有的或一部分的CH2结构域)。如上文所述，但本技术领域的普通技术人员应理解，重链恒定区可能会被修改，使得它们在氨基酸序列上与天然存在的免疫球蛋白分子不同。
本文所公开的抗体的重链恒定区可以来自于不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链恒定区可以包含来自IgG1分子的CH1结构域和来自IgG3的分子的铰链区。在另一实施方案中，重链恒定区可以包含铰链区，该铰链区部分来自IgG1分子，且部分地来自IgG3分子。在另一实施方案中，重链部分可包含嵌合铰链，该嵌合铰链一部分来自IgG1分子，并且一部分来自IgG4分子。
本文使用的术语“轻链恒定区”包括来自抗体轻链的氨基酸序列。优选地，所述轻链恒定区包括恒定kappa结构域和恒定lambda结构域中的至少一个。
“轻链-重链对”是指轻链和重链的集合，它们可通过轻链的CL结构域和CH1结构域之间的二硫键形成二聚体。
如前面所指出的，各种免疫球蛋白类的恒定区的亚基结构和三维结构是已知的。本文使用的，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，而术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(多数为氨基末端)恒定区。CH1结构域邻近VH结构域并且是免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端。
本文使用的术语“CH2结构域”包括一部分的重链分子，该部分范围，例如，从抗体的约残基244到残基360，使用常规的编号方案(残基244至360，Kabat编号系统；和残基231-340，EU编号系统；见Kabat等，美国卫生和公共服务部，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”(1983)。CH2结构域是独特的，因为它与另一个结构域配对不紧密。相反，两个N-连接的支链的糖链插入至完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。有文献记载，CH3结构域从CH2结构域延伸至IgG分子的C-末端，并包含约108个残基。
本文使用的术语“铰链区”包括重链分子的将CH1结构域连接至CH2结构域的那一部分。该铰链区包含约25个残基并且是柔性的，从而使两个N-末端抗原结合区独立地移动。铰链区可分为三个不同的结构域：上部、中部、和下部铰链结构域(Roux等人，J.Immunol161：4083(1998))。
本文使用的术语“二硫键”包括两个硫原子之间形成的共价键。半胱氨酸含有巯基，该巯基可以与第二个巯基形成二硫键或桥连。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区由二硫键连接并且两个重链由两个二硫键连接，在对应于使用Kabat编号系统的239和242处(位置226或229，EU编号系统)连接。
本文使用的术语“嵌合的抗体”将用于指以下任何抗体：其中其免疫反应区或位点得自或来自第一物种且其恒定区(该恒定区可以是完整的，部分的或根据本发明修改过的)得自第二物种。在某些实施例中靶结合区或位点将来自非人类来源(例如小鼠或灵长类)且恒定区来自人。
本文使用的“百分比人源化”通过以下方式计算：测定人源化的结构域和种系结构域之间的框架氨基酸差值的数量(即，非CDR差)，用氨基酸总数减去该数量，然后除以氨基酸总数，再乘以100。
所谓“特异性结合”或“对…有特异性”，通常意味着抗体通过它的抗原结合结构域结合抗原表位，并且该结合使得抗原结合结构域和抗原表位之间必须有一些互补性。根据这个定义，抗体被认为是“特异性结合”至抗原表位，当它结合到该抗原表位时，经抗原结合结构域的结合比结合至随机的、不相关的抗原表位更容易。本文中使用术语“特异性”以确定某一抗体结合至特定抗原表位的亲和力。例如，抗体“A”可能被视为对于一给定的抗原表位比抗体“B”具有更高的特异性，或抗体“A”可被说成是结合至抗原表位“C”比其对于相关抗原表位“D”具有更高的特异性。
本文使用的术语“治疗”(“treat”或“treatment”)是指治疗性治疗和预防或防治措施，其中对于受试者进行防止或减慢(减轻)不良的生理变化或疾病，如癌症的发展。有益的或所需的临床结果包括但不限于，减轻症状，降低疾病的程度、稳定(例如使其不恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病发展，改善或缓和疾病状态，并缓解(无论是部分或全部)，无论可否被检测到。“治疗”也可指与不接受治疗时的预计生存期相比能延长生存期。那些需要治疗的状况包括那些已经具有病症或症状以及那些容易具有病症或症状或那些将对病症或症状进行预防的情况。
多功能抗体
本发明的实施方案提供了多种多功能抗体，这些抗体包含两种不同的抗原结合多肽单元。结合抗原的抗体结构域为Fab，或ScFv，或重链可变区(VH)-轻链可变区(VL)之间非共价配对。特别地，这些多功能抗体都具有抗体重链恒定区的Fc片段，Fc包含：(1)铰链，(2)重链第二恒定区(CH2)，和/或重链第三恒定区(CH3)。其中铰链和CH3均为人IgG1型对应的结构域且CH3进行“杵-入-臼”的突变改造，CH2为人IgG2型对应的CH2结构域。
任何上述的抗体或多肽还可包括额外的多肽，由此构成融合蛋白或融合肽，例如，如本文所述的编码的多肽，抗体恒定区的信号肽，该信号肽用于指导分泌，或如本文所述的其他异源多肽。
本技术领域的普通技术人员还应当理解，本文所述的抗体可会被修改，以使得它们的氨基酸序列与天然存在的结合多肽不同，它们得自这些天然存在的结合多肽。例如，来自于指定的蛋白的多肽或氨基酸序列可与起始序列类似，例如，与起始序列具有一定百分比的同一性，例如，其可与起始序列有60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。
此外，也可进行核苷酸或氨基酸替换，缺失，或插入以在“非必需”氨基酸区域进行保守替换或改变。例如，来自指定的蛋白质的多肽或氨基酸序列可与启动顺序相同，除了一个或多个独立的氨基酸的替换，插入，或缺失，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个或更多独立的氨基酸替换，插入，或缺失。在某些实施方案中，来自指定的蛋白质的多肽或氨基酸序列相对于起始序列有1至5个、1至10个、1至15个或1至20个独立的氨基酸的替换，插入，或缺失。
在其它实施例中，本发明的抗原结合多肽可包含保守的氨基酸替换。
“保守氨基酸替换”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替换。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义，其包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸，谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)，β-支链的侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽的非必需氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替换。在另一实施方案中，一段氨基酸序列可被结构上类似的氨基酸序列替换，后者在顺序上和/或侧链家族的组成上不同。
在下表中提供了保守性氨基酸替换的非限制性实例，其中相似性得分为0或更高表示在这两个氨基酸之间有保守替换。
[表2]保守型氨基酸替换的非限制性列表
C G P S A T D E N Q H K R V M I L F Y W
W -8 -7 -6 -2 -6 -5 -7 -7 -4 -5 -3 -3 2 -6 -4 -5 -2 0 0 17
Y 0 -5 -5 -3 -3 -3 -4 -4 -2 -4 0 -4 -5 -2 -2 -1 -1 7 10
F -4 -5 -5 -3 -4 3 6 5 4 5 2 5 4 1 0 1 2 9
L -6 -4 -3 -3 -2 2 4 3 3 2 2 3 3 2 4 2 6
I -2 -3 -2 -1 -1 0 2 2 2 2 2 2 2 4 2 5
M -5 -3 -2 -2 -1 -1 -3 -2 0 -1 -2 0 0 2 6
V -2 -1 -1 -1 0 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4
R -4 -3 0 0 -2 -1 -1 -1 0 1 2 3 6
K -5 -2 -1 0 -1 0 0 0 1 1 0 5
H -3 -2 0 -1 -1 -1 1 1 2 3 6
Q -5 -1 0 -1 0 -1 2 2 1 4
N -4 0 -1 1 0 0 2 1 2
E -5 0 -1 0 0 0 3 4
D -5 1 -1 0 0 0 4
T -2 0 0 1 1 3
A -2 1 1 1 2
S 0 1 1 1
P -3 -1 6
G -3 5
C 12  
在一些实施方案中，涉及抗体偶联物，其中所述抗体可以结合治疗剂、药物前体、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物反应调节剂、药剂或PEG。
该抗体可以连接至或融合至治疗剂上，该治疗剂可包括可检测标记物，如放射性标记物、免疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光活性治疗剂或诊断剂、细胞毒性剂，其可为药物或毒素，超声增强剂，非放射性标记物，它们的组合和其他这类本领域已知的成分。
通过将其偶联化学发光化合物，该抗体被可检测地标记。然后，通过检测化学反应过程中产生的发光来确定化学发光物标记的抗原结合多肽的存在。特别有用的化学发光物标记化合物的例子有鲁米诺、异鲁米诺、热性(theromatic)吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓盐和草酸酯。
该抗体也可被可检测地标记，使用荧光发光金属如152Eu，或其他的镧系标记。这些金属可使用以下金属螯合基团连接到抗体上，如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。将多种基团连接至抗体的技术是公知的，参见，例如，Arnon等，“MonoclonalAntibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”，in MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(编.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.(1985)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”，in Controlled Drug Delivery(第二版)，Robinson等(编)，Marcel Dekker，Inc.，pp.623-53(1987)；Thorpe，“AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”，in MonoclonalAntibodies′84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等(编)，pp.475-506(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，in Monoclonal Antibodies For CancerDetection And Therapy，Baldwin等(编)，Academic Press pp.303-16(1985)，以及Thorpe等，“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”，Immunol.Rev.(52：119-58(1982))。
抗体制备方法
抗体的制备方法在本技术领域是公知的，在此进行描述。在一些实施方案中，本发明的抗原结合多肽的可变区和恒定区是完全人类的。完全人抗体可使用现有技术中描述的技术制备，并如本文所述。例如，抗特定抗原的完全人抗体可以通过将该抗原施用至转基因动物来制备，该转基因动物已被修改以产生此种响应抗原刺激的抗体，但其内源性基因座已被禁用。可以用来制造这种抗体的示例性的技术描述于美国专利：6,150,584、6,458,592、6,420,140，其全部内容通过引用并入本文。
本发明的抗原结合多肽的结合特异性可通过体外实验测得，例如免疫沉淀，放射免疫分析法(RIA)或酶联免疫吸附法(ELISA)。
或者，描述的制备单链单元的技术(美国专利4,694,778号；Bird，Science 242：423-442(1988)；Huston等的Proc.Natl.Acad.Sci.USA 55：5879-5883(1988)；和Ward等的Nature 334：544-554(1989))可用于产生本发明的单链单元。经氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段形成单链单元，获得单链融合肽。在大肠杆菌(E.coli)中合成功能性Fv片段的技术也可以使用(Skerra等的Science 242：1038-1041(1988))。
可以用于产生单链Fvs(scFvs)和抗体的技术实例包括描述在美国专利第4,946,778号和5,258,498号；Huston等的Methods in Enzymology 203：46-88(1991)；Shu等的Proc.Natl.Sci.USA 90：1995-1999(1993)；和Skerra等的Science 240：1038-1040(1988)。对于某些应用，包括在人体内体内使用抗体和体外检测分析，可优选使用嵌合的、人源化的或人抗体。嵌合抗体为抗体的不同部分来自不同动物种类的分子，例如含有来自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。嵌合抗体的制造方法是本领域已知的。见，例如，Morrison，Science 229：1202(1985)；Oi等的BioTechniques 4：214(1986)；Gillies等的J.Immunol.Methods 125：191-202(1989)；美国专利第5,807,715；4,816,567和4,816397号，其全部内容通过引用的方式并入本文。
人源化的抗体为来自于非人类物种的抗体分子，并且该抗体分子结合所需的抗原，该抗体分子具有一个或多个来自非人类物种的互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区。通常，在人框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的对应残基替换所改变，优选提高抗原结合能力。这些框架替换通过本领域已知的方法识别，例如，通过建立CDR和框架残基的相互作用模型，以鉴定对于抗原结合和序列比较重要的框架残基，以找出在特定位置的异常的框架残基。(见，例如，Queen等的美国专利第5,585,089号；Riechmann等的Nature 332：323(1988)，其全部内容通过引用并入本文)。可使用多种本领域已知的技术对抗体进行人源化，这些技术包括，例如，CDR-移植(EP 239,400；PCT公开号WO 91/09967；美国专利第5,225,539；5,530,101和5,585,089号)，饰面(veneering)或表面置换(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等的，Protein Engineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska等的Proc.Natl.Sci.USA 91：969-973(1994))，和链改组(shuffling)(美国专利第5,565,332号，其全部内容通过引用结合至本文)。
使用常规的重组DNA技术，本发明的抗原结合多肽的一个或多个CDR，可插入框架区内，例如，插入至人框架区以使非人类抗体人源化。该框架区可以是天然存在的或共有的框架区，且优选为人的框架区(见，例如，Chothia等的J.Mol.Biol.278：457-479(1998)，人的框架区的列表)。优选地，该框架区和CDR的组合所产生的多核苷酸编码多肽，该多肽特异性地结合至所需多肽的至少一个抗原表位，例如，LIGHT。优选地，可在框架区内进行一个或多个氨基酸替换，并且，优选地，该氨基酸替换提高该抗体对抗原结合能力。此外，这种方法可用于获得一个或多个可变区半胱氨酸残基(该半胱氨酸残基参与链内二硫键形成)的氨基酸替换或缺失，这样产生缺乏一个或多个链内二硫键的抗体分子。其他对于该多核苷酸进行的改变都包含在本发明的范围内，并在现有技术范围内。
此外，可使用用于通过对来自小鼠抗体分子的基因剪接生产“嵌合抗体”的技术(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA：851-855(1984)；Neuberger等的Nature 372：604-608(1984)；Takeda等的Nature 314：452-454(1985))，具有合适的抗原特异性，与具有合适生物活性的人抗体分子基因一起。如本文使用的，嵌合抗体为其中不同部分来自不同动物种类的分子，例如含有来自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。
然而，另一种用于产生重组抗体的高效方法公开于Newman，Biotechnology 10：1455-1460(1992)。具体地，该技术导致产生含有猴可变结构域和人恒定序列的灵长类化的抗体。该文件通过引用全文结合至本文中。此外，这种技术也被描述在共同转让的美国专利号5,658,570、5,693,780和5,756,096，其中每一篇通过引用并入本文。
或者，产生抗体的细胞系可使用本领域技术人员熟知的技术选择和培养。这样的技术描述在多种实验室手册和主要出版物中。在这方面，本文中适合使用的技术如下所述描述于Current Protocols in Immunology，Coligan等编，Green Publishing Associatesand Wiley-Interscience，John Wiley和Sons，New York(1991)，其通过引用以全文并入本文中，包括补充参考。
此外，本领域技术人员公知的标准技术可用于在编码本发明抗体的核苷酸序列中引入突变，包括，但不限于，定点诱变和PCR介导的突变，这产生氨基酸替换。优选地，所述变体(包括衍生物)，相对于参考可变重链区，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、轻链可变区、CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3，编码少于50个氨基酸替换、少于40个氨基酸替换、少于30个氨基酸替换、少于25个氨基酸替换、少于20个氨基酸替换、少于15个氨基酸替换、少于10个氨基酸替换、少于5个氨基酸替换、少于4个氨基酸替换、少于3个氨基酸替换、或少于2个氨基酸替换。或者，可将沿着全部或部分的编码序列随机引入突变，例如通过饱和诱变，可对所得到的突变体针对生物活性筛选，以确定保留有活性的突变。
抗体结构信息
单特异性抗体为：对称抗体，包含两条相同的轻链和两条相同的重链，轻链和重链之间通过二硫键连接并靶向相应的抗原，重链和重链之间通过二硫键连接，整个抗体为“Y”型结构。轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(Lc)，重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区，其中重链恒定区包含CH1和Fc，其中Fc包含铰链、CH2和CH3。
多功能抗体结构1为：非对称双特异性抗体，包含轻链、重链和融合肽1，融合肽1包含scFv和Fc片段；该双抗体具有轻-重链配对，和重链-融合肽1配对，每个配对会形成链间二硫键；轻-重链配对靶向肿瘤抗原，融合肽1中ScFv靶向免疫细胞抗原。
图1A为多功能抗体结构1的结构示意图，图1B为抗体各组分的蛋白质一级结构示意图。
多功能抗体结构2为：非对称三价双特异性抗体，包含2条轻链、1条重链和1条融合肽2，具有轻-重链配对，轻链-融合肽2配对，和重链-融合肽2配对，每个配对会形成链间二硫键；融合肽2包含重链可变区(VH)、重链第一恒定区(CH1)、ScFv和Fc，其中ScFv位于CH1和Fc之间并通过接头连接，轻-重链配对靶向肿瘤抗原，融合肽2中VH-CH1和轻链配对靶向相同的肿瘤抗原，ScFv靶向免疫细胞抗原。
图2A为多功能抗体结构2的结构示意图，图2B为抗体各组分的蛋白质一级结构示意图。
多功能抗体结构3为：非对称三价双特异性抗体，包含融合重链、cross轻链、重链和轻链，具有轻链-重链配对、轻链-融合重链配对，cross轻链-融合重链配对，和融合重链-重链配对，每个配对会形成链间二硫键；轻链包含第一轻链可变区(VLm)和轻链恒定区(CL)；融合重链包含第一重链可变区(VHm)、重链第一恒定区(CH1)、第二重链可变区(VHs)、轻链恒定区(CL)和Fc，其中VVHs和CL通过接头连接形成肽段“VHs-接头-CL”，“VHs-接头-CL”位于CH1和Fc之间并通过接头/铰链连接；cross轻链包含第二轻链可变区(VLs)和CH1，VLs和CH1之间通过接头连接。VLm-VHHm配对靶向肿瘤抗原，VLs-VHVHs配对靶向免疫细胞抗原。
图3A为多功能抗体结构3的结构示意图，图3B为抗体各组分的蛋白质一级结构示意图。
上述3种多功能抗体结构都具有Fc片段，该Fc片段包含CH2和/或CH3，其中CH2为人IgG2的CH2的天然序列或者氨基酸点突变改造的序列，部分具体序列见SEQ ID NO：83-101，122-176；每种多功能抗体具有两个不同的CH3，两个CH3之间以“杵-入-臼”或/和“盐桥”方式配对形成异二聚体，具体序列见SEQ ID NO：102-115。
其他结构域的序列
(1)接头结构域的氨基酸序列
[表13]接头的氨基酸序列
(2)铰链结构域的氨基酸序列
[表14]铰链的氨基酸序列
(3)轻链恒定区CL结构域的氨基酸序列
[表15]CL的氨基酸序列
(4)重链恒定区CH1结构域的氨基酸序列
[表16]CH1的氨基酸序列
Fc改造具体信息
Fc氨基酸编号遵从Kabat编号。“Kabat编号”是指Kabat等描述的编号系统，其内容记载于美国卫生和公共服务部，“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)。具体的编号见下表：
[表17]基于Kabat编号系统的Fc氨基酸编号
其中，
第221-227位氨基酸为铰链(hinge)结构域，
第228-340位氨基酸为重链第二恒定区CH2结构域，
第341-447位氨基酸为重链第三恒定区CH3结构域。
一方面，该CH2结构域包含一处或多处替换，降低Fc与FcγR的结合能力。可被替换的氨基酸残基包括，但不限于，E233、L234、L235、6236、D265、D270、K274、Y296、N297、Y300、L309、A327、P329、P331、A339。下表列出这些替换的组合的非限制性实例：
[表18]CH2氨基酸替换的组合降低Fc与FcγR的结合能力
*表示该位点的残基被删除，上表组合10中删除第236位甘氨酸残基后的Fc的序列及编码如下：
[表19]基于Kabat编号系统的残基删除后的Fc(表6的组合10)氨基酸编号
在上表中，第236位甘氨酸(G236)被删除，但氨基酸编号“236”保留，用“-”表示。
可对抗体CH3结构域进行修改以提高异二聚体配对效率。比如，在某些方面，与野生型的抗体片段比较，该单价单元重链的Fc片段和/或该融合肽的Fc片段可包含一处或多处替换，这些替换之间形成杵-入-臼结构对。杵-入-臼构型在本领域中是已知的。参见，例如Ridgway等的“‘Knob-into-holes’engineering of antibody CH3 domains for heavychain heterodimerization，”Protein Engineering 9(7)：617-21(1996)。
一方面，一个CH3结构域上的T366被相对较大的氨基酸残基替换，如酪氨酸(Y)或色氨酸(W)替换。然后，另一CH3结构域上的Y407可被相对较小的氨基酸残基替换，如苏氨酸(T)，丙氨酸(A)或缬氨酸(V)。下表20显示了这些替换的组合的一些非限制性实例。
[表20]Fc氨基酸替换的组合在不同的Fc之间形成杵-入-臼结构对提高异二聚体配对效率
一方面，该CH3结构域之一含有一处或多处替换，经在生理条件下有正电荷的氨基酸残基替换，而另一CH3结构域包含一处或多处替换，经一个或多个在生理条件下具有负电荷的氨基酸残基替换。一方面，该带正电的氨基酸残基可为精氨酸(R)，组氨酸(H)或赖氨酸(K)。另一方面，该带负电荷的氨基酸残基可为天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)。可被替换的氨基酸残基包括，但不限于D356、L368、K392、D399和K409。下表21列出这些替换的组合的非限制性实例。
[表21]CH3氨基酸替换的组合在不同的Fc之间形成离子键提高异二聚体配对效率
组合序号 一个CH3上的替换 另一CH3上的替换
CH3-6 D356K D399K K392D K409D
CH3-7 L368R D399K K392D K409D
CH3-8 L368K D399K K392D K409D
CH3-9 L368R D399K K409D
CH3-10 L368K D399K K409D
CH3-11 L368R K409D
CH3-l2 L368K K409D
一方面，一个CH3结构域上的S354被替换为半胱氨酸，另一CH3结构域上的Y349也被替换为半胱氨酸，两个被替换位置的残基形成了二硫键。下表显示了该替换组合的一个实例。
[表22]CH3氨基酸替换的组合在不同的Fc之间形成二硫键提高异二聚体配对效率
组合序号 一个CH3上的替换 另一CH3上的替换
CH3-13 S354C Y349C
在某些方面，该抗体可包含降低FcγR结合的CH2或提高异二聚体配对的CH3或两者都有。
一方面，一个CH3结构域上的H435和Y436分别被替换为精氨酸和苯丙氨酸，该替换导致Fc与蛋白A之间的结合能力显著降低，从而使异二聚体和同二聚体之间具有不同的蛋白A结合活性，在亲和层析过程中易于将两者分离。下表显示了该替换组合的一个实例。
[表23]一个CH3的氨基酸替换导致与蛋白A的结合能力下降
组合序号 CH3上的替换
CH3-14 H435R，Y436F
上述表18-表23，不同结构域的氨基酸替换组合，均可以按照“铰链-CH2-CH3”的连接方式构建形成完整的Fc片段，该Fc片段满足：(1)降低与FcγR结合能力，(2)利于形成异二聚体，(3)改变与蛋白A的结合能力。
附图说明：
图1：多功能抗体1结构示意图，其中图1A为多功能抗体1结构的示意图；图1B为多功能抗体1各组分的蛋白质一级结构示意图。
图2：多功能抗体2结构示意图，其中图2A为多功能抗体2结构的示意图；图2B为多功能抗体2各组分的蛋白质一级结构示意图。
图3：多功能抗体3结构示意图，其中图3A为多功能抗体3结构的示意图；图3B为多功能抗体3各组分的蛋白质一级结构示意图。
图4：多功能抗体结构1的不同的多功能抗体对非小细胞肺癌细胞H358的体外杀伤能力。
图5：多功能抗体结构1的不同的同型对照抗体对非小细胞肺癌细胞H358的体外杀伤能力。
图6：多功能抗体结构1的CD38×CD3抗体对多发性骨髓瘤细胞MC/CAR的体外杀伤能力。
图7：多功能抗体结构1的同型对照抗体对多发性骨髓瘤细胞MC/CAR的体外非特异性杀伤能力。
图8：多功能抗体结构1的同型对照抗体对PBMC中T细胞的激活及CD3+CD69+T细胞的比例。
图9：多功能抗体结构1的同型对照抗体对PBMC中T细胞的激活及CD3+CD25+T细胞的比例。
图10：多功能抗体结构1的同型对照抗体对FcγR1的结合能力以及对Jurkat-luciferase细胞的激活荧光信号检测。
图11：多功能抗体结构1的同型对照抗体对FcγR2的结合能力以及对Jurkat-luciferase细胞的激活荧光信号检测
图12：多功能抗体结构1的同型对照抗体对FcγR3A的结合能力以及对Jurkat-luciferase细胞的激活荧光信号检测。
图13：多功能抗体结构2的不同的多功能抗体对骨髓瘤细胞U266B1的体外杀伤能力。
图14：多功能抗体结构2的不同的同型对照抗体对骨髓瘤细胞U266B1的体外杀伤能力。
图15：多功能抗体结构2的同型对照抗体对PBMC中T细胞的激活及CD3+CD69+T细胞的比例。
图16：多功能抗体结构2的同型对照抗体对PBMC中T细胞的激活及CD3+CD25+T细胞的比例。
图17：多功能抗体结构3的CEA×CD3抗体对胃癌细胞MKN-45的体外杀伤能力。
图18：多功能抗体结构3的同型对照抗体对胃癌细胞MKN-45的体外杀伤能力。
图19：多功能抗体结构3的同型对照抗体对PBMC中T细胞的激活及CD3+CD69+T细胞的比例。
图20：多功能抗体结构3的同型对照抗体对PBMC中T细胞的激活及CD3+CD25+T细胞的比例。
图21：多功能抗体结构1的不同抗体40℃处理14天加速热稳定性检测。
图22：多功能抗体结构1的不同抗体的耐酸性检测。
图23：多功能抗体结构2的不同抗体40℃处理14天加速热稳定性检测。
图24：多功能抗体结构2的不同抗体的耐酸性检测。
图25：多功能抗体结构3的不同抗体40℃处理14天加速热稳定性检测。
图26：多功能抗体结构3的不同抗体的耐酸性检测。
图27：单克隆抗体的结构示意图。
图28：流式细胞术检测及分析不同Fc改造的4420单抗与巨噬细胞结合情况。
图29：流式细胞术检测及分析不同Fc改造的4420单抗与B细胞结合情况。
图30：流式细胞术检测及分析不同Fc改造的4420单抗与NK细胞结合情况。
图31：流式细胞术检测当IGG1型CD3单抗的Fc的CH2结构域替换为IGG2的CH2后，Fc第229位残基替换为不同氨基酸残基的CD3单抗对PBMC中T细胞激活程度，(A)CD69+在T细胞中的比例，(B)CD25+在T细胞中的比例。
图32：流式细胞术检测当IGG1型CD3单抗的Fc的CH2结构域替换为IGG2的CH2后，Fc第265位替换为不同氨基酸残基的CD3单抗对PBMC中T细胞激活程度，(A)CD69+在T细胞中的比例，(B)CD25+在T细胞中的比例。
图33：流式细胞术检测当IGG1型CD3单抗的Fc的CH2结构域替换为IGG2的CH2后，Fc第270位替换为不同氨基酸残基的CD3单抗对PBMC中T细胞激活程度，(A)CD69+在T细胞中的比例，(B)CD25+在T细胞中的比例。
图34：流式细胞术检测当IGG1型CD3单抗的Fc的CH2结构域替换为IGG2的CH2后，Fc多位点突变的CD3单抗对PBMC中T细胞激活程度，(A)CD69+在T细胞中的比例，(B)CD25+在T细胞中的比例。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明的保护范围以权利要求书为准，不受下面公开的具体实施的限制。
实施例1.抗体制备
A.抗体表达质粒的构建
按照表28-30的序列，由武汉金开瑞分别合成其编码序列DNA，并克隆入载体pcDNA3.1(购自Invitrogen公司)中。然后分别转化Trans10感受态细胞(购自北京全式金生物公司)。经测序鉴定，获得表达质粒。
具体涉及表达质粒构建如下：
1)图1中的多功能抗体结构1，涉及三种质粒的构建。三种质粒分别为：轻链表达质粒(pL)、重链表达质粒(pH)、和融合肽1表达质粒(pF1)。
2)图2中的多功能抗体结构2，涉及三种质粒的构建。三种质粒分别为：轻链表达质粒(pL)、重链表达质粒(pH)、和融合肽2表达质粒(pF2)。
3)图3中的多功能抗体结构3，涉及四种质粒的构建。四种质粒分别为：轻链表达质粒(pL)、重链表达质粒(pH)、cross轻链表达质粒(pcL)和融合重链表达质粒(pFH)。
B.多功能抗体表达方法：
利用CHO-S(购自Gibco)或293E(购自ATCC)两种瞬时转染表达体系进行转染。
共转染的质粒DNA具体如下：
1)表达图1所示的多功能抗体1，需要质粒pL、pH和pF1共转染至CHO-S或293E细胞进行表达；
2)表达图2所示的多功能抗体2，需要质粒pL、pH和pF2共转染至CHO-S或293E细胞进行表达；
3)表达图3所示的多功能抗体3，需要质粒pL、pH、pcL和pFH共转染至CHO-S或293E细胞进行表达。
一般情况下，如是两种质粒共转染表达，则两种质粒的摩尔数之比可以为1∶1，也可以为其他任意比例；如是三种质粒共转染表达，则三种质粒的摩尔数之比可以为1∶1∶1，也可以为其他任意比例；如是四种质粒，则四种质粒的摩尔数之比可以为1∶1∶1∶1，也可以为其他任意比例。
C.多功能抗体的纯化方法：
抗体纯化主要为亲和层析、离子交换层析、疏水层析及分子筛，这些是本领域的常规操作。具体可以参考分子克隆实验指南。本实施例中纯化方法第一步为protein A亲和层析，再利用离子交换层析去除聚集体，使最终的蛋白纯度达到95％以上。
实施例2：抗体的生物学活性检测
1.细胞亲和力
1)细胞准备：多功能抗体分子CD3端亲和力检测用CD3阳性的人全血分离的T细胞，肿瘤抗原的亲和力检测用对应抗原的阳性肿瘤细胞进行检测：如CD38抗原检测用CD38阳性的MM.1S细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)或RPMI 8226细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)，PD-L1抗原检测用PD-L1阳性的H358细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)等。用1％FBS-PBS重悬细胞，调整密度为4×106/ml，每孔取50μl，按照细胞每孔为2×105铺板。细胞铺板在冰上操作。
2)抗体添加：按照实验设计，梯度稀释抗体，稀释抗体在冰上操作。比如抗体稀释的初始浓度为3000nM，3倍稀释，稀释11个浓度梯度。将稀释好的抗体每孔50μl加入到细胞孔中，混匀，在4度1100rpm/min震荡孵育2h；洗涤后1％FBS-PBS重悬细胞，加入稀释好的二抗PE anti-humanIgG FC(Biolegend，409304)，二抗终浓度为8ug/ml，体积为50μl/孔，同时设置只加细胞和二抗的孔作为对照，混匀，4度避光1100rpm/min震荡孵育1h；
3)洗涤和固定：1％FBS-PBS重悬洗涤细胞后，每孔加入2％多聚甲醛室温固定细胞；
4)流式细胞仪检测：用1％FBS-PBS重悬细胞，流式细胞仪上机检测；
5)数据分析：用流式分析软件FlowJo 7.6分析数据得到特定抗体浓度的平均荧光强度，用Graphpad Prism 5做图，以抗体浓度(nM)为横坐标，平均荧光强度为纵坐标，采用One site--Specific binding方法计算EC50值，该值即为该抗体与对应的靶点抗原的细胞亲和力。
[表31]多功能抗体结构1的部分抗体的细胞亲和力及瞬时转染表达水平
注：PDL1-M1系列分子均为双靶向PD-L1和CD3的多功能抗体结构1的抗体；CD38-M1系列分子均为双靶向CD38和CD3的多功能抗体结构1的抗体；M1IC系列分子均为多功能抗体结构1的同型对照抗体，靶向CD3和荧光素酶(无肿瘤靶向性)。
[表32]多功能抗体结构2的部分抗体的细胞亲和力及瞬时转染表达水平
注：BCMA-M2系列均为双靶向BCMA和CD3的多功能抗体结构2的抗体；M2IC系列均为多功能抗体结构2的同型对照抗体，靶向CD3和荧光素酶，无肿瘤靶向性。
[表33]多功能抗体结构3的部分抗体的细胞亲和力及瞬转表达水平
注：CEA-M3系列均为双靶向CEA和CD3的多功能抗体结构3的抗体；M3IC系列均为多功能抗体结构3的同型对照抗体，靶向CD3和荧光素酶，无肿瘤靶向性。
综合以上数据，可知在相同的抗体结构和抗体可变区序列的条件下，Fc的不同改造，抗体与靶点的结合活性无显著差异，同时各抗体的表达量之间无显著差异。
2.体外杀伤
1)取足够量的肿瘤细胞，制备单细胞悬液；
2)CFSE染色肿瘤细胞：取一定量的细胞悬液离心(300×g，5min)去上清；加入2ml用PBS配制的CFSE溶液，CFSE终浓度为5μM；将细胞置于5％CO2、37℃培养箱，孵育15min；取出细胞，PBS洗涤，离心(300×g，5min)去上清，重复洗涤三次，完全培养基重悬细胞，取悬液细胞计数；
3)肿瘤细胞铺板：用完全培养基将细胞密度重悬至2×105/ml，按照2×104个/孔，即100μl/孔加入96孔板；
4)加入效应细胞PBMC(外周血单核细胞，从人全血中分离)：效应细胞用实验体系中肿瘤细胞使用的完全培养基重悬，按实验设计中效靶比换算加入相应效应细胞数，按照体积50μl/孔加入；
5)加入稀释抗体：按照实验设计，抗体最高浓度为10μg/ml，因抗体补入50μl，占总体积200μl的1/4，抗体均需配成4倍浓度再补入，所以抗体先稀释至40μg/ml，从40μg/ml开始10倍稀释，9个梯度，体积50μl/孔；
6)镜下观察96孔板，保证细胞均匀分散在培养孔，放置5％CO2、37℃细胞培养箱培养，待检测；
7)到达检测时间后，贴壁细胞处理：吸出细胞上清，30μl/孔PBS洗涤，吸出洗涤液体并入之前吸出的上清；细胞孔内加入胰酶30μl/孔，放置5％CO2、37℃细胞培养箱消化3-5min，加入之前收集到的上清，吹打各孔细胞为单细胞悬液；悬浮细胞处理：多次吹打混匀；
8)各样品于流式上机前10-15min加入PI(终浓度为10μg/ml)，10ul/孔；
9)流式细胞仪上机检测；将流式细胞仪检测结果在FlowJo软件分析，MicrosoftExcel导出数据分析，GraphPad进行制表分析，杀伤计算公式：CFSE、PI双阳性细胞占CFSE阳性细胞比例为靶细胞的死亡率。
计算公式如下：
10)抗体对肿瘤细胞的杀伤能力计算：根据靶细胞死亡率计算公式，计算在每一个抗体浓度下的靶细胞死亡率，并以抗体浓度为横坐标、靶细胞死亡率为纵坐标绘图，数据分析软件为Graphpad Prism 5，采用log(agonist)vs.response--Variable slope方法计算得到EC50值，即为该抗体的细胞杀伤能力。
3.T细胞激活(抗体+PBMC共培养体系)
1)从健康志愿者全血中密度梯度离心分离PBMC，按照实验设计的效靶比(E：T)往肿瘤细胞板中加入PBMC；
2)按照实验设计对抗体进行一系列3倍浓度梯度稀释，加入各浓度抗体；
3)将96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中孵育至检测时间。收集悬浮的PBMC细胞，加入相应的CD3，CD69，CD25检测抗体(均购自BD)孵育1h后洗去多余抗体，重悬细胞，流式检测CD3和CD69双阳性细胞比例或CD3和CD25双阳性细胞比例，即为抗体诱导PBMC中T细胞的活化比例，具体计算：
用“GraphPad Prism 5”软件以双抗体浓度作为横坐标，以CD3&CD69(CD3&CD25)％值作为纵坐标进行非线性拟合(log(agonist)vs.response--Variable slope)，计算得到T细胞活化曲线及EC50值。
4.T细胞激活(抗体+肿瘤细胞+PBMC共培养体系)
1)取培养状态良好的肿瘤细胞，制备单细胞悬液，按照2*104/孔细胞数铺入96孔板
2)从健康志愿者全血中密度梯度离心分离PBMC，按照实验设计的效靶比(E：T)往肿瘤细胞板中加入PBMC
3)按照实验设计对抗体进行一系列浓度梯度稀释，加入各浓度抗体
4)将96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中孵育至检测时间。收集悬浮的PBMC细胞，加入相应的CD3，CD69，CD25检测抗体孵育1h后洗去多余抗体，重悬细胞，流式检测CD3和CD69双阳性细胞比例或CD3和CD25双阳性细胞比例，即为抗体诱导PBMC中T细胞的活化比例，具体计算：
用“GraphPad Prism 5”软件以双抗体浓度作为横坐标，以CD3&CD69(CD3&CD25)％值作为纵坐标进行非线性拟合(log(agonist)vs.response--Variable slope)，计算得到T细胞活化曲线及EC50值。
5.Jurkat-luciferase细胞激活
1)将不同的FcγR(FcγR1，FcγR2，FcγR3A(均购自ACRO Biosystems)分别包被至酶标板上，蛋白浓度1ug/ml，100μl/孔，4℃孵育过夜；弃包被液，PBS洗一遍；
2)在前述酶标板中每孔加入不同浓度的抗体(1～10000ng/m1)40ul，和一定数量的Jurkat-luciferase细胞2×106/ml，40ul/孔，37℃孵育6h；
3)按照试剂盒Bio-Glo Luciferase Assay System(货号G7940，Promega)的说明进行荧光显示，并用荧光酶标仪(LUX 3020，厂家：Thermo)检测荧光信号值。结果部分：
1.多功能抗体结构1的PD-L1×CD3抗体对非小细胞肺癌细胞H358(PD-L1阳性表达，中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)的杀伤能力检测结果见图4(其中效应细胞人PBMC与靶细胞H358数量之比为10∶1，处理时间为48h，PD-L1 mAb购自Roche)。hIgG为人血清分离的IgG抗体为阴性对照组，E+T为不加抗体的阴性对照组，下同。
[表34]多功能抗体结构1的PD-L1×CD3抗体杀伤肿瘤细胞H358的EC50值
由图4和表34可知，当多功能抗体结构1的抗体序列相同，Fc经过不同的改造，对肿瘤细胞H358的杀伤能力无显著差异，说明Fc的改造不影响具有双靶向功能抗体的细胞毒性，即不影响所述抗体的药效。
2.多功能抗体结构1的同型对照抗体(4420×CD3)对非小细胞肺癌细胞H358的杀伤能力检测结果见图5(其中效应细胞人PBMC与靶细胞H358数量之比为10∶1，处理时间为48h)。
[表35]多功能抗体结构1的同型对照抗体杀伤肿瘤细胞H358的EC50值
由图5和表35可知，不同Fc改造的同型对照抗体对肿瘤细胞H358的杀伤能力不同。因为同型对照抗体本身仅有CD3靶向性，而不具有肿瘤抗原靶向性，则同型对照抗体的杀伤为CD3阳性T细胞的非特异性激活导致的杀伤，其中M1IC-WT具有显著杀伤，说明该抗体的Fc(对应的CH2为WT，SEQ ID NO：83)可引起显著的T细胞的非特异性激活；M1IC-NQ具有显著高的最大杀伤，说明Fc对应的CH2为N297Q(SEQ ID NO：89)时可引起T细胞的特异性激活；其他抗体则对T细胞无激活，说明Fc的改造显著降低了对T细胞的非特异性激活。
3.多功能抗体结构1的CD38×CD3抗体对多发性骨髓瘤细胞MC/CAR(CD38阳性表达，购自ATCC)的杀伤能力检测结果见图6(其中效应细胞人PBMC与靶细胞MC/CAR数量之比为5∶1，处理时间为48h，CD38 mAb为CD38单克隆抗体对照组，其中CD38 mAb的序列为VL为SEQ ID NO：16，CL为SEQ ID NO：75，VH为SEQ ID NO：15，CHl为SEQ ID NO：82，铰链为SEQ IDNO：66，CH2为SEQ ID NO：83，CH3为SEQ ID NO：102)。
[表36]多功能抗体结构1的CD38×CD3抗体杀伤肿瘤细胞MC/CAR的EC50值
由图6和表36可知，具有相同的抗体可变区序列的多功能抗体，即使Fc改造不同，杀伤MC/CAR肿瘤细胞的能力之间也无显著差异，说明Fc的改造不影响具有双靶向功能抗体的细胞毒性，即不影响所述抗体的药效。
4.多功能抗体结构1的同型对照抗体(4420×CD3)对多发性骨髓瘤细胞MC/CAR(CD38阳性表达)的杀伤能力检测结果见图7(其中效应细胞人PBMC与靶细胞MC/CAR数量之比为5：1，处理时间为48h)。
[表37]多功能抗体结构1的同型对照抗体非特异性杀伤肿瘤细胞MC/CAR的EC50值
由图7和表37可知，不同Fc改造的同型对照抗体对肿瘤细胞MC/CAR的杀伤能力不同。因为同型对照抗体本身仅有CD3靶向性，而不具有肿瘤抗原靶向性，则同型对照抗体的杀伤为CD3阳性T细胞的非特异性激活导致的杀伤，其中M1IC-WT具有显著杀伤，说明该抗体的Fc(对应的CH2为WT)可引起显著的T细胞的非特异性激活。而相比而言，含有本发明改造的Fc的同型对照抗体仅引起弱的T细胞非特异性激活或可完全避免T细胞的非特异性激活。
5.多功能抗体结构1的同型对照抗体(4420×CD3)对外周血单核细胞中的T细胞的激活实验，检测结果见图8和图9。
[表38]多功能抗体结构1的同型对照抗体对PBMC中T细胞激活的EC50值
由图8、图9和表38可知，上述同型对照抗体在PBMC中，M1IC-WT对T细胞具有最强的非特异性激活，M1IC-SG2、M1IC-G2、M1IC-SG2-1和M1IC-G2-1具有较弱的对T细胞的非特异性激活，M1IC-AG2/GG2/DG2/G2D/DG2D对T细胞无激活。说明当多功能抗体结构1的抗体具有CD3靶向性且CH2为SG2CH2(SEQ ID NO：95)或G2CH2(SEQ ID NO：94)时，具有弱化的对T细胞的非特异性激活；当多功能抗体结构1的同型对照抗体为AG2CH2(SEQ ID NO：96)、GG2CH2(SEQ ID NO：97)、PG2CH2(SEQ ID NO：98)、DG2CH2(SEQ ID NO：99)、G2DCH2(SEQ ID NO：100)和DG2DCH2(SEQ ID NO：101)时，更有效的避免T细胞的非特异性激活。
6.多功能抗体结构1的同型对照抗体(4420×CD3)对Jurkat-luciferase细胞的激活实验，检测结果见图10，图11和图12。
当抗CD3抗体与固定的Fc受体结合后，再结合具有CD3表面抗原的Jurkat-luciferase细胞，可激活该细胞，并检测到荧光信号。荧光信号越强，说明对该细胞的激活程度越高，进而表明该抗体与Fc受体结合越强。由图10-12可知，上述同型对照抗体中，M1IC-WT-1对Jurkat-luciferase细胞具有最强的激活；当固定抗原为FcγR2时，M1IC-FES-1具有相对显著的对Jurkat-luciferase细胞的激活；M1IC-AG2-1、M1IC-GG2-1、M1IC-PG2-1、M1IC-DG2-1、M1IC-G2D-1、M1IC-DG2D-1、M1IC-DG2D-1A和M1IC-DG2D-1B均对Jurkat-luficerase细胞的激活非常微弱且之间无显著差异。由此说明当多功能抗体结构1的同型对照抗体CH2为AG2CH2(SEQ ID NO：96)、GG2CH2(SEQ ID NO：97)、PG2CH2(SEQ ID NO：98)、DG2CH2(SEQ ID NO：99)、G2DCH2(SEQ ID NO：100)和DG2D(SEQ ID NO：101)时，可以比FES(SEQ ID NO：85)更有效的避免T细胞的非特异性激活。
7.多功能抗体结构2的BCMA×CD3抗体及同型对照抗体对骨髓瘤细胞U266B1(BCMA阳性表达，中国典型培养物保藏中心)的杀伤能力检测结果见图13和图14(其中效应细胞人PBMC与靶细胞U266B1数量之比为5∶1，处理时间为48h)。
[表39]多功能抗体结构2的BCMA×CD3抗体及同型对照抗体杀伤肿瘤细胞U266B1的杀伤程度和EC50值
由图13和表39可知，不同Fc改造的多功能抗体结构2的BCMA×CD3抗体均可显著杀伤肿瘤细胞U266B1，且杀伤效果之间无显著差异，说明Fc的改造不影响具有双靶向功能抗体的细胞毒性，即不影响所述抗体的药效。
[表40]多功能抗体结构2的同型对照抗体(4420×CD3)杀伤肿瘤细胞U266B1的杀伤程度和EC50值
由图14和表40可知，当多功能抗体结构2的抗体可变区序列相同，Fc经过不同的改造，其中同型对照抗体M2IC-WT对U266B1有显著的杀伤，说明该Fc可引起T细胞的非特异性激活；Fc的CH2为G2CH2(SEQ ID NO：94)时，可以看到有较弱的细胞杀伤效果，说明可引起较弱的T细胞非特异性激活；Fc的CH2为SG2CH2(SEQ ID NO：95)，AG2CH2(SEQ ID NO：96)，GG2CH2(SEQ ID NO：97)，PG2CH2(SEQ ID NO：98)，DG2CH2(SEQ ID NO：99)，G2DCH2(SEQ IDNO：100)和DG2DCH2(SEQ ID NO：101)时，无细胞杀伤，说明这五种Fc不引起T细胞的非特异性激活。
8.多功能抗体结构2的同型对照抗体对外周血单核细胞(PBMC)中的T细胞的激活实验(处理时间48h)，检测结果见图15和图16。
[表41]多功能抗体结构2的同型对照抗体对PBMC中T细胞激活的比例和EC50值
由图15、图16和表41可知，在无相关肿瘤细胞存在时，分析最大激活程度可以看到，M2IC-WT对T细胞有显著的非特异性激活，M2IC-G2和M2IC-SG2对T细胞的非特异性激活减弱，其余抗体无显著激活，Fc的CH2为AG2CH2(SEQ ID NO：96)，GG2CH2(SEQ ID NO：97)，PG2CH2(SEQ ID NO：98)，DG2CH2(SEQ ID NO：99)，G2DCH2(SEQ ID NO：100)和DG2DCH2(SEQID NO：101)时，无细胞杀伤，说明这五种Fc不引起T细胞的非特异性激活。
9.多功能抗体结构3的CEA×CD3抗体对胃癌细胞MKN-45(CEA阳性表达，中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心)的杀伤能力检测结果见图17和图18(其中效应细胞人PBMC与靶细胞MKN-45数量之比为5∶1，处理时间为48h)。
[表42]多功能抗体结构3的CEA×CD3抗体杀伤肿瘤细胞MKN-45的杀伤程度和EC50值
由图17和表42可知，当多功能抗体结构3的CEA×CD3抗体序列相同，Fc经过不同的改造，对肿瘤细胞MKN-45的杀伤能力无显著差异，说明Fc的改造不影响具有双靶向功能抗体的细胞毒性，即不影响所述抗体的药效。
[表43]多功能抗体结构3的同型对照抗体(4420×CD3)杀伤肿瘤细胞MKN-45的杀伤程度和EC50值
由图18和表43可知，最大杀伤率显示抗体M3IC-WT具有显著杀伤；M3IC-G2和M3IC-SG2具有较弱的杀伤，而其余抗体均无显著杀伤，说明多功能抗体结构3的Fc的CH2改造为G2CH2(SEQ ID NO：94)和SG2CH2(SEQ ID NO：95)具有与对照M3IC-WT相比弱化的T细胞非特异性激活的效果，而AG2CH2(SEQ ID NO：96)，GG2CH2(SEQ ID NO：97)，PG2CH2(SEQ ID NO：98)，DG2CH2(SEQ ID NO：99)，G2DCH2(SEQ ID NO：100)和DG2DCH2(SEQ ID NO：101)这五种Fc不引起T细胞的非特异性激活。
10.多功能抗体结构3的同型对照抗体(4420×CD3)对外周血单核细胞(PBMC)中的T细胞的激活实验(处理时间48h)，检测结果见图19和图20。
[表44]多功能抗体结构3的同型对照抗体对PBMC中T细胞激活的比例和EC50值
由图19、图20和表44可知，多功能抗体结构3的同型对照抗体中，M3IC-WT对T细胞有最强的显著激活，M3IC-G2对T细胞有较弱的激活，由此可知当CH2为G2CH2(SEQ ID NO：94)时，相比M2IC-WT显示减弱的T细胞的非特异性激活，其余抗体相比M2IC-WT对T细胞均为更弱激活，其中CH2为G2DCH2(SEQ ID NO：100)最优。
实施例3：抗体的稳定性检测
实验操作：
A.40℃热加速稳定性检测，具体操作步骤为：
1)将样品置换到缓冲液中，缓冲液的成分为20mM柠檬酸，pH5.5，并将样品浓度调整至1mg/mL；
2)将每种样品分装为500μL每管(共6管)密封后放置于40℃的水浴中，第0天、3天、5天、7天、10天和14天分别取样进行HPLC-SEC检测，水浴时间共计14天。
B.耐酸性检测，也称为低pH稳定性，是考察抗体分子在酸性环境中处理一段时间后再中和至生理条件是否还能保持原来的状态。具体操作步骤为：
抗体分子进行proteinA亲和层析时，在酸洗脱步骤中(使用pH3.5的柠檬酸缓冲液)，洗脱下来的抗体溶液不进行中和，在该缓冲液中保持一段时间后，在第30min和第60min取样加入1/10体积的1M Tris-HCl(pH8.0)进行中和，并进行该样品的HPLC-SEC检测。结果部分：
1.多功能抗体结构1的40℃加速热稳定性的检测结果见图21。
由图21可知，多功能抗体结构1的不同抗体，40℃处理14天后纯度均维持在90％以上，没有出现大量聚集或降解情况，其中Fc的CH2为N297Q的抗体相比其他抗体纯度会出现显著下降，其他CH2改造的抗体之间则没有显著差异，证明CH2为G2CH2(SEQ ID NO：94)、SG2CH2(SEQ ID NO：95)、AG2CH2(SEQ ID NO：96)、GG2CH2(SEQ ID NO：97)、PG2CH2(SEQ IDNO：98)、DG2CH2(SEQ ID NO：99)、G2DCH2(SEQ ID NO：100)和DG2DCH2(SEQ ID NO：101)时多功能抗体结构1具有良好的热稳定性。
2.多功能抗体结构1的耐酸性检测结果见图22。
由图22可知，不同Fc改造的多功能抗体结构1的抗体，在低pH条件下处理60分钟，抗体纯度均没有发生显著改变，不同抗体之间无显著差异，说明上述Fc改造的多功能抗体结构1具有良好的耐酸性。
综合图21和图22可以看到，CH2为G2CH2(SEQ ID NO：94)、SG2CH2(SEQ ID NO：95)、AG2CH2(SEQ ID NO：96)、GG2CH2(SEQ ID NO：97)、PG2CH2(SEQ ID NO：98)、DG2CH2(SEQ IDNO：99)、G2DCH2(SEQ ID NO：100)和DG2DCH2(SEQ ID NO：101)的多功能抗体结构1的抗体具有良好的热稳定性和耐酸性。
3.多功能抗体结构2的40℃加速热稳定性的检测结果见图23。
由图23可知，多功能抗体结构2的CH2为N297A(SEQ ID NO：87)时，40℃处理14天后纯度出现显著下降；其他抗体纯度没有出现显著改变，抗体之间也没有显著差异，证明除M2IC-NA之外的这些多功能抗体结构2的抗体具有良好的加速热稳定性。
4.多功能抗体结构2的耐酸性的检测结果见图24。
由图24可知，不同Fc改造的多功能抗体结构1的抗体，在低pH条件下处理60分钟，抗体纯度均没有发生显著改变，不同抗体之间无显著差异，说明上述Fc改造的多功能抗体结构2具有良好的耐酸性。
综合图23和图24可以看到，CH2为G2CH2(SEQ ID NO：94)、SG2CH2(SEQ ID NO：95)、AG2CH2(SEQ ID NO：96)、GG2CH2(SEQ ID NO：97)、PG2CH2(SEQ ID NO：98)、DG2CH2(SEQ IDNO：99)、G2DCH2(SEQ ID NO：100)和DG2DCH2(SEQ ID NO：101)的多功能抗体结构2的抗体具有良好的热稳定性和耐酸性。
5.多功能抗体结构3的40℃加速热稳定性的检测结果见图25。
由图25可知，不同的多功能抗体结构3的抗体40℃处理14天后纯度没有出现显著改变，抗体之间相比也没有显著差异，证明上述的多功能抗体结构3的抗体具有良好的加速热稳定性。
6.多功能抗体结构3的耐酸性的检测结果见图26。
由图26可知，不同Fc改造的多功能抗体结构3的抗体，在低pH条件下处理60分钟，抗体纯度均没有发生显著改变，不同抗体之间无显著差异，说明上述Fc改造的多功能抗体结构3具有良好的耐酸性。
综合图25和图26可以看到，CH2为G2CH2(SEQ ID NO：94)、SG2CH2(SEQ ID NO：95)、AG2CH2(SEQ ID NO：96)、GG2CH2(SEQ ID NO：97)、PG2CH2(SEQ ID NO：98)、DG2CH2(SEQ IDNO：99)、G2DCH2(SEQ ID NO：100)和DG2DCH2(SEQ ID NO：101)的多功能抗体结构3的抗体具有良好的热稳定性和耐酸性。
实施例4：单克隆抗体的Fc改造与FeγR表达的细胞结合实验
1.单克隆抗体的制备
(1)在本发明中，制备的单克隆抗体与天然的抗体如人IaG1、IgG2、IgG3或IaG4亚型的结构一致或类似，为对称的“Y”型结构，具有二价的结合相同靶点抗原的功能和对应亚型的Fc结构域。
具体的结构示意图见图27。
(2)单克隆抗体的表达质粒构建、转染表达和纯化方法，与本发明的实施例1提到的多功能抗体的相关方法一致，使用的序列参见表45。
2.单克隆抗体与表达FcγR的细胞结合实验
(1)与人IgG抗体Fc结合的FcγR有三类：FcγRI，FcγRII和FcγRIII。其中FcγRI(又称CD64)和FcγRIIA在巨噬细胞和中性粒细胞上有表达，FcγRIIB在B细胞上有表达，FcγRIIIA(又称CD16A)在自然杀伤(NK)细胞上有表达。树突状细胞的表面标记物为CD83，巨噬细胞的表面标记物为CD14，B细胞的表面标记物为CD20，NK细胞的表面标记物为CD56。
将表45里的9种单抗制备后，分别进行生物素标记。阴性对照为Fab结构的4420抗体(VL为SEQ ID NO：44，CL为SEQ ID NO：75，VH为SEQ ID NO：43，CH1为SEQ ID NO：82)，无Fc，也进行了生物素标记。
从健康捐献者的血液中分离得到PBMC，分为三组：
a)第1组考察4420单抗Fc与巨噬细胞的结合能力，PBMC与PE标记的抗CD14抗体(购自Thermofisher)及前述9种生物素标记的4420单抗(每种抗体分500μg/ml、50μg/ml和5μg/ml三个浓度)共孵育2h(室温)，洗涤3次然后加入FITC标记的亲和素再孵育30分钟(室温)，洗涤5次然后进行流式细胞仪检测，圈出PE荧光细胞群，再从中分析FITC平均荧光强度；
b)第2组考察4420单抗Fc与B细胞的结合能力，步骤与a)的步骤相同，仅采用PE标记的抗CD20抗体(购自Thermofisher)代替PE标记的抗CD14抗体；
c)第3组考察4420单抗Fc与NK细胞的结合能力，步骤与a)的步骤相同，仅采用抗CD56抗体(购自Thermofisher)代替PE标记的抗CD14抗体；
流式细胞检测结果，见图28-30。由图28可知，4420mAb-WT与巨噬细胞有显著结合，当CH2为G2CH2(SEQ ID NO：94)、SG2CH2(SEQ ID NO：95)、AG2CH2(SEQ ID NO：96)、GG2CH2(SEQ ID NO：97)、PG2CH2(SEQ ID NO：98)、DG2CH2(SEQ ID NO：99)、G2DCH2(SEQ ID NO：100)和DG2DCH2(SEQ ID NO：101)时，显著降低或去除了与FcγRI或FcγRIIA结合功能。
由图29可知，4420mAb-WT与B细胞有显著结合，与4420mAb-WT相比，当抗体的Fc的CH2为SG2CH2(SEQ ID NO：95)、G2CH2(SEQ ID NO：94)、AG2CH2(SEQ ID NO：96)、GG2CH2(SEQID NO：97)、PG2CH2(SEQ ID NO：98)、DG2CH2(SEQ ID NO：99)、G2DCH2(SEQ ID NO：100)和DG2DCH2(SEQ ID NO：101)时，显著降低或去除了与FcγRIIB的结合功能。
由图30可知，仅4420mAb-WT与NK有显著结合，说明Fc的CH2为SG2CH2(SEQ ID NO：95)、G2CH2(SEQ ID NO：94)、AG2CH2(SEQ ID NO：96)、GG2CH2(SEQ ID NO：97)、PG2CH2(SEQID NO：98)、DG2CH2(SEQ ID NO：99)、G2DCH2(SEQ ID NO：100)和DG2DCH2(SEQ ID NO：101)时，均显著降低或去除了与FcγRIIIA的结合功能。
综合图28-30，可知改造Fc，使CH2为G2CH2(SEQ ID NO：94)、SG2CH2(SEQ ID NO：95)、AG2CH2(SEQ ID NO：96)、GG2CH2(SEQ ID NO：97)、PG2CH2(SEQ ID NO：98)、DG2CH2(SEQID NO：99)、G2DCH2(SEQ ID NO：100)和DG2DCH2(SEQ ID NO：101)时，可以极大的减弱或去除抗体Fc与其受体FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB以及FcγRIIIA的结合功能。已知CD3抗体对T细胞的激活，很大程度上是因为抗体Fc与其他细胞表面的FcγR结合所引起的。本发明中创新性的对Fc进行了改造，将人IgG1的Fc中CH2结构域用人IgG2的CH2结构域替换，优选进行若干氨基酸残基的替换，获得了与FcγR结合能力显著降低甚至去除的抗体或融合蛋白，并且，这些Fc的改造方式，完全不影响抗体本身的稳定性和生物学活性。
实施例5：抗CD3单克隆抗体对T细胞激活实验
1.单克隆抗体的制备
参见实施例4的部分1，使用的序列参见表46。
[表46]部分单克隆抗体的代号及可变区氨基酸序列
2.CD3单克隆抗体对PBMC中T细胞激活实验
本实验方法同“实施例2：抗体的生物学活性检测”中“3.T细胞激活(抗体+PBMC共培养体系)”一致。检测结果见表47-48和图31-34
[表47]Fc单点突变的抗CD3单克隆抗体对PBMC中T细胞激活的程度
由表47和图31-33可知，当IgG1型CD3单抗的Fc的CH2结构域替换为IgG2的CH2后，将第229位半胱氨酸(C)、第265位的天冬氨酸(D)或270位的天冬氨酸(D)替换为其他必需氨基酸后，与利用Fc的CH1结构域相比，均可显著减弱T细胞激活。
[表48]Fc多点突变的抗CD3单克隆抗体对PBMC中T细胞激活的程度
由表48和图34可知，当IgGl型CD3单抗的Fc的CH2结构域替换为IgG2的CH2后，部分位点氨基酸作如下替换：(1)无替换；(2)单位点替换，C229S，C229A，C229G，C229P，D265A，D270A；(3)双位点替换，C229P/G327A，C229P/T339A，D270A/G327A，D270A/T339A；(4)三位点替换，D270A/G327A/T339A，C229P/D265A/D270A等，可以看到与野生型IgG1相比，上述4类替换后的单抗均显著弱化了对T细胞激活，甚至比FES弱化更显著。

Claims (22)

1.一种非对称双特异性抗体，其特征在于：所述的抗体包含轻链、重链和融合肽1，融合肽1由scFv和Fc片段组成，所述抗体具有轻链-重链配对，和重链-融合肽1配对，每个配对形成链间二硫键；轻链-重链配对靶向肿瘤抗原CD38；融合肽1中ScFv靶向免疫细胞抗原，所述免疫细胞抗原为CD3；所述重链和融合肽包含的Fc片段为人IgG1来源，并且所述Fc片段的恒定区CH2结构域被替换为人IgG2的CH2结构域，其中人IgG2的CH2结构域如SEQ ID NO:94所示。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于：其中所述Fc片段的CH2结构域进一步包含选自由以下位置组成的组的突变：根据Kabat编号的C229，D265，D270或其任意组合，其中所述C229突变选自由以下各项组成的组：C229A,C229G,C229P,C229S,C229V,C229L,C229I，C229T，C229M，C229N,C229Q，C229D，C229E，C229K，C229R，C229F，C229Y，C229W或C229H，
所述D265突变选自由以下各项组成的组：D265A,D265G,D265P,D265S,D265V,D265L,D265I，D265T，D265M，D265N,D265Q，D265E，D265K，D265R，D265F，D265Y，D265W或D265H，和
所述D270突变选自由以下各项组成的组：D270A,D270G,D270P,D270S,D270V,D270L,D270I，D270T，D270M，D270N,D270Q，D270E，D270K，D270R，D270F，D270Y，D270W或D270H。
3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于：所述突变为C229位置的突变。
4.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于：所述突变选自由以下各项组成的组：C229S,C229A,C229G和C229P。
5.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于：所述突变为D265位置的突变。
6.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于：所述突变为D265A。
7.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于：所述突变为D270位置的突变。
8.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于所述突变为D270A。
9.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于：所述突变为位置C229，D265和D270的任意两种组合的突变，或是位置C229，D265和D270的组合突变。
10.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于：所述突变为位置D265和D270的组合的突变。
11.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于：所述Fc片段的CH2结构域进一步包含选自以下位置组成的组的突变：G327，T339或其组合，其中所述突变选自G327A，G327V，G327L，G327I和/或T339A，和所述突变选自C229P/G327A，C229P/T339A，D270A/G327A，D270A/T339A，D270A/G327A/T339A或C229P/D265A/D270A。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的抗体，其特征在于：所述抗体具有两个不同的CH3，两个CH3之间以“杵-入-臼”或/和“盐桥”方式配对形成异二聚体。
13.根据权利要求12所述的抗体，其中CH3结构域的序列如SEQ ID NO:102-115所示。
14.根据权利要求1～11中任一项所述的抗体，其中所述轻链-重链配对选自以下组成的组：
(1)靶向肿瘤抗原CD38的SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:15；
(2)靶向肿瘤抗原CD38的SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:17；
(3)靶向肿瘤抗原CD38的SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:19；
所述融合肽1中ScFv中的轻链和重链可变区配对选自以下各项组成的组：
(4)靶向免疫抗原CD3的SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:1；
(5)靶向免疫抗原CD3的SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:3；
(6)靶向免疫抗原CD3的SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:5；
(7)靶向免疫抗原CD3的SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:7；和
(8)靶向免疫抗原CD3的SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:9。
15.包含权利要求1～14中任一项所述的抗体的缀合物，其中所述缀合物包含与所述抗体偶联的物质A，所述物质A选自脂质、PEG、寡核苷酸、细胞毒性剂，可检测标记物。
16.权利要求15所述的缀合物，其中所述物质A为非放射性标记物。
17.包含权利要求1～14中任一项所述的抗体的缀合物，其中所述缀合物包含与所述抗体偶联的物质A，所述物质A选自酶，药物或毒素，化学发光物标记化合物或荧光发光金属。
18.根据权利要求17所述的缀合物，其中所述化学发光物标记化合物为鲁米诺、异鲁米诺、热性吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓盐或草酸酯，荧光发光金属为152Eu，或镧系标记。
19.组合物，其包含权利要求1～14中任一项所述的抗体或权利要求15-18任一项所述的缀合物。
20.权利要求19所述的组合物，其为药物组合物。
21.根据权利要求1～14中任一项所述的抗体在制备施用给哺乳动物受试者后不诱导抗体依赖性细胞毒性作用的试剂中的应用。
22.根据权利要求21所述的应用，其中所述哺乳动物为人。
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