KR101666229B1 - Ｆｃ 리간드 친화성이 감소된 항-ＩＦＮＡＲ１ 항체 - Google Patents

Ｆｃ 리간드 친화성이 감소된 항-ＩＦＮＡＲ１ 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 Fc 수용체 및/또는 리간드에 대한 친화성이 감소된 항IFNAR1 항체, 및 상기 항체를 제조하고 사용하는 방법을 제공한다.

Description

Ｆｃ 리간드 친화성이 감소된 항-ＩＦＮＡＲ１ 항체{ANTI-IFNAR1 ANTIBODIES WITH REDUCED FC LIGAND AFFINITY}
본 출원은 35 U.S.C. §119(e) 하에 2008년 2월 8일 출원된 미국 가출원 번호 제61/006,962호, 2007년 3월 7일 출원된 미국 가출원 번호 제61/034,618호, 및 2008년 3월 2일 출원된 미국 가출원 번호 제61/049,970호(본원에서 상기 개시 내용은 참고로 인용된다)를 주장한다.
1. 본 발명의 기술분야
본 발명은 Fc 리간드에 대한 친화성이 감소된, 인터페론 알파 수용체 1(IFNAR1: interferon alpha receptor)에 대해 특이적인 단리된 항체 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 항체를 코딩하는 핵산, 상보적인 핵산, 벡터, 숙주 세포, 및 그의 제조 방법 및 사용 방법과, 치료학적 조성물, 제형, 투여 및 장치를 비롯한 것을 포함한다.
2. 본 발명의 배경기술
2.1 인터페론:
I형 인터페론(IFN)(IFNα, IFNβ, IFNω, IFNτ)은 항바이러스, 항종양 및 면역조절(immunomodulatory) 효과를 가지며, 구조적으로 관련이 있는 사이토카인 패밀리이다(문헌 ([Hardy et al. (2001) Blood 97:473]; [Cutrone and Langer (2001) J. Biol. Chem. 276:17140])). 인간 IFNα 유전자좌는 2개의 서브패밀리를 포함한다. 첫번째 서브패밀리는 14개의 비대립형질 유전자와, 적어도 80%의 상동성을 갖는 4개의 위유전자로 구성된다. 모든 또는 오메가(ω)인 두번째 서브패밀리는 5개의 위유전자, 및 IFNα 유전자와 70%의 상동성을 갖는 1개의 기능성 유전자로 구성된다(문헌 [Weissmann and Weber (1986) Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol, 33:251-300]). IFNα의 서브타입은 상이하며 특이적인 활성을 갖지만, 이들의 생물학적 스펙트럼은 동일하고(문헌 [Streuli et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2848), 세포학적 수용체도 동일하다(문헌 [Agnet M. et al. in "Interferon 5" Ed. I. Gresser p. 1-22, Academic Press, London 1983]). 인터페론 알파 서브타입은 하기 명명법에 따라 동정되었다: IFNα 1, 2a, 2b, 4, 4b, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 및 21.
인터페론 β(IFNβ)는 IFNα 유전자와 대략 50%의 상동성을 갖는 단일 유전자에 의해 코딩된다.
활성화된 림프구에 의해 생산되는 인터페론 γ는 알파/베타 인터페론과 상동성을 갖지 않으며, 이는 그들의 수용체와도 반응하지 않는다.
2.1.1 인터페론 수용체:
인간의 모든 I형 인터페론은 IFNAR1 및 IFNAR2라는 2개의 경막 단백질로 구성된 세포 표면 수용체(IFN 알파 수용체, IFNAR)에 결합한다(문헌 ([Uze et. al. (1990) Cell 60:225]; [Novick et al. (1994) Cell 77:391])). IFNAR1은 IFNAR 복합체의 고친화성 결합 및 차별적인 특이성에 있어 중요하다(문헌 [Cutrone et al. 2001 J. Bio Chem 276(20):17140-8]). 각각의 I형 IFN 서브타입의 기능상의 차이에 대해서는 확인된 바 없지만, 각각은 IFNAR 수용체와 상이한 상호작용을 나타냄으로써 잠재적으로는 다양한 신호전달 결과를 가져올 수 있다고 여겨진다(문헌 [Cook et al. (1996) J. Biol. Chem. 271 :13448]). 특히, IFNAR1 및 IFNAR2의 돌연변이체 형태를 사용한 연구를 통해서는 알파 및 베타 인터페론이 각각의 쇄와 다르게 상호작용함으로써 수용체를 통해 다르게 신호를 전달한다는 것이 제안되었다(문헌 [Lewerenz et al. (1998) J. Mol. Biol. 282:585]).
2.1.2 인터페론 기능:
I형 IFN의 기능에 관해서 이루어진 초기 연구는 바이러스 감염에 대한 선천적 방어에 대해 중점을 두었다(문헌 [Haller et al. (1981) J. Exp. Med. 154:199]; [Lindenmann et al. (1981) Methods Enzymol. 78:181])). 그러나, 보다 최근 연구는 선천적 면역 반응에서 효능이 있는 면역조절성 사이토카인으로서의 I형 IFN에 대해 이루어진다. 구체적으로, I형 IFN은 Th1 경로를 따라 순수한 T 세포의 분화를 촉진시킴으로써(문헌 [Brinkmann et al. (1993) J. Exp. Med. 178:1655]) 항체 생산을 증진시키고(문헌 [Finkelman et al. (1991) J. Exp. Med. 174: 1179]), 기억 T 세포의 기능적 활성과 생존을 지원하는 것으로 밝혀졌다(문헌 [Santini et al. (2000) J. Exp. Med. 191 :1777; Tough et al. (1996) Science 272:1947).
많은 여러 단체들에 의해 이루어진 최근 연구를 통해 IFNα가 가지 세포(DC: dendritic cell)의 성숙 또는 활성화를 증진시킬 수 있다는 것이 제안되었다(문헌 ([Santini, et al. (2000) J. Exp. Med. 191:1777]; [Luft et al. (1998) J. Immunol. 161:1947]; [Luft et al. (2002) Int. Immunol. 14:367]; [Radvanyi et al. (1999) Scand. J. Immunol. 50:499])). 추가로, I형 인터페론의 발현 증가는 다수의 자가면역 질환에서 설명되어 있다(문헌 ([Foulis et al. (1987) Lancet 2:1423]; [Hooks et al. (1982) Arthritis Rheum. 25:396]; [Hertzog et al. (1988) Clin. Immunol. Immunopathol. 48:192]; [Hopkins and Meager (1988) Clin. Exp. Immunol. 73:88]; [Arvin and Miller (1984) Arthritis Rheum. 27:582])). 이에 대해 연구되어진 대부분의 일례는 인슐린 의존 당뇨병(IDDM: insulin-dependent diabetes mellitus)(문헌 [Foulis (1987)]) 및 전신 홍반 루푸스(SLE: : systemic lupus erythematosus)(문헌 [Hooks (1982)])(이 둘은 IFNα 수준 상승과 관련이 있다), 및 류마티스 관절염(RA: rheumatoid arthritis)(문헌 ([Hertzog (1988)], [Hopkins and Meager (1988)], [Arvin and Miller (1984)]))(여기서는 IFNβ가 보다 더 중요한 역할을 할 수 있다)에 대한 것이다.
또한, 인터페론α를 투여하는 것은 건선 및 다발 경화증을 앓는 환자에서 내재된 질환을 악화시킬 수 있고, 이전에 자가면역 질환에 대한 병력이 없는 환자에서 SLE과 유사한 증후군을 유도한다고 보고되었다. 인터페론α는 또한 정상적인 마우스에서는 사구체신염을 유도하였고, NZB/W 마우스의 자발성 자가면역 질환의 발병을 가속화시키는 것으로 밝혀졌다. 추가로, 몇몇 경우에는 IFNα 요법이 발열 및 신경계 장애를 비롯한, 원치않는 부작용을 일으키는 것으로 나타났다. 따라서, I형 IFN 활성을 저해하는 것이 상기와 같은 환자에게는 유익할 수 있는 병적 상황이 존재하며, I형 IFN 활성을 저해하는 데 유효한 제제가 여전히 요구되고 있다.
2.1.3 항체 효과 또는 기능:
항체의 Fc 영역은 효과기 기능으로서 지칭되는 다수의 중요한 기능적 능력을 부여하면서, Fc 수용체 및 C1q를 비롯한 다수의 리간드(또한 이는 "Fc 리간드"로도 지칭되는데, 이는 항체의 Fc 영역과 특이적으로 결합하는 물질, 예로서, Fc 수용체 및 C1q와 같은 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)와 상호작용한다. Fc 수용체는 항체와 면역계의 세포 아암 사이에 일어나는 의사소통을 매개한다(문헌 ([Raghavan et al, 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220]; [Ravetch et al, 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290])). 인간에서의 상기와 같은 단백질 패밀리로는 FcγRI(CD64)(이소폼 FcγRIA, FcγRIB, 및 FcγRIC 포함); FcγRII(CD32)(이소폼 FcγRIIA, FcγRIIB, 및 FcγRIIC 포함); 및 FcγRIII(CD16)(이소폼 FcγRIIIA 및 FcγRIIB 포함)(문헌 [Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65])을 포함한다. 이러한 수용체는 전형적으로 Fc와의 결합을 매개하는 세포외 도메인과, 세포 내에서 일어나는 몇몇 신호전달 이벤트를 매개할 수 있는 세포내 도메인을 갖는다. 이러한 수용체는 단핵구, 대식세포, 중성구, 가지 세포, 호산구, 비만 세포, 혈소판, B 세포, 대과립 림프구, 랑게르한스 세포, 자연살 세포(NK: natural killer cell), 및 T 세포를 비롯한, 다양한 면역 세포에서 발현된다. Fc/FcγR 복합체가 형성되면 결합되어진 항원 부위로 상기 효과기 세포가 동원이 되고, 전형적으로는 이를 통해 세포 내에서 일어나는 신호전달 이벤트와, 그에 이어지는 중요한 면역 반응, 예로서, 염증 매개 물질의 방출, B 세포 활성화, 세포내이입, 포식작용, 및 세포독성 공격과 같은 것이 일어난다. 세포독성 및 포식작용이라는 효과기 기능을 매개할 수 있는 능력은 항체가 표적화된 세포를 파괴시키는 잠재적인 기전이다. FcγR을 발현하는 비특이 세포독성 세포가 표적 세포 상에 결합되어 있는 항체를 인식한 후, 이어서, 표적 세포의 용해를 유발하는 것인 세포 매개 반응을 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC: antibody dependent cell-mediated cytotoxicity)이라 지칭한다(문헌 ([Raghavan et al, 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220]; [Ghetie et al, 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766]; [Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290])). FcγR을 발현하는 비특이 세포독성 세포가 표적 세포 상에 결합되어 있는 항체를 인식한 후, 이어서, 표적 세포의 포식작용을 유발하는 것인 세포 매개 반응을 항체 의존성 세포 매개 포식작용(ADCP: antibody dependent cell-mediated phagocytosis)이라 지칭한다. 또한, 상기 분자의 Fc 영역 상에 존재하는 중복되는 부위는 또한 보체에 의해 매개되는 세포 비의존성 세포독성 기능(이는 다르게는 보체 의존성 세포독성(CDC: complement dependent cytotoxicity)으로도 알려져 있다)의 활성화를 조정한다.
2.1.4 다른 유형의 인간 Fc γR:
인간의 FcγR은 3가지의 다른 부류: FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)로 분류된다. FcγRI은 고친화성 수용체(Ka: 10-8-10-9 M-1)로서, 면역 복합체와 단량체 IgG 분자, 둘 모두에 결합하는 반면, Fc 수용체 FcγRII 및 FcγRIII은 저친화성(각각 <10-7 및 2-3x10-7)을 보인다(문헌 [Gessner J.E. et al., 1998, Annn Hematology 76:231-48]). FcγR을 통해 이루어지는 신호전달은 모든 경막 수용체에 있어서 면역수용체 티로신에 기초한 활성화 모티프(ITAM: immunoreceptor tyrosine-based activation motif) 또는 면역수용체 티로신에 기초한 저해성 모티프(ITIM: immunoreceptor tyro sine-based inhibitory motif)를 통해 이루어진다(문헌 [Presta 2006, Adv Drug Deli Rev 58:640-656]).
72 kDa의 세포외 당단백질인 FcγRI은 주로 골수성 세포, 예로서, 단핵구, 대식세포 CD4+ 전구체 세포 상에서 발현이 되며, 이는 ADCC, 세포내이입, 및 포식작용 반응을 유도할 수 있다(문헌 [Siberil et al. 2006, J Immunol Lett 106:111-118]).
40 kDa의 FcγRII 수용체 군(A, B 및 C 이소폼)은 세포외 도메인을 나타내지만, 활성의 신호 전달 도메인은 포함하지 않는다. 이들 수용체는 세포질 꼬리 도메인의 인산화를 통해 신호를 전파시킨다(문헌 [Amigorena S. et al., 1992 Science. 256:1808-12]). FcγRIIA는 주로 단핵구, 대식세포, 중성구, 및 혈소판 상에서 발현이 되는 반면, FcγRIIC 수용체는 오직 NK 세포 상에서만 확인되었다. 이들 두 수용체는 ADCC, 세포내이입, 포식작용 및 염증성 매개 물질 방출을 개시하는 것으로 밝혀졌다(문헌 [Cassel et al. 1993. Mol Immunol 30:451-60]). 대조적으로, FcγRIIB(B1 및 B2형) 수용체는 B 세포, 비만 세포, 호염기구, 단핵구, 대식세포 및 가지 세포 상에서 발현되며, A 및 C 이소폼에 의해 일어난 면역 반응을 하향조절하는 것으로 밝혀졌다.
50 kDa의 FcγRIIIA는 NK 세포, 단핵구, 대식세포 및 T 림프구의 서브세트에서 발현되며, 이는 여기서 ADCC, 포식작용, 세포내이입 및 사이토카인 방출을 활성화시킨다(문헌 [Gessner et al]). FcγRIIIB 이소폼은 반응성 산소 중간체의 탈과립화 및 생산에 관여하는, 글리코실 포스파티딜이노시톨(GPI: glycosyl-phosphatidylinositol) 고정된 막 주변 단백질이다(문헌 [Salmon J.E. et al. 1995 J Clin Inves 95:2877-85]).
IgG 분자는 또한 FcγR에 대하여 차별적인 이소형 특이성을 보인다. IgG3 분자는 FcγR 이소폼 모두에 대해 강하게 결합한다. 혈액 중에 가장 우세하게 존재하는 이소폼인 IgG1은 비록 FcγRIIA/B 이소폼에 대해서는 보다 낮은 친화성으로 결합하기는 하나, 모든 FcγR에 결합한다. IgG4는 FcγRI에 대한 중간 결합체이고, FcγRIIB에 대해서는 보다 약한 결합체이다. 마지막으로, IgG2는 FcγRIIA의 한 대립형질(FcγRIIA-H131)에 약하게만 결합을 한다(문헌 [Siberil et al. 2006, J Immunol Lett 106:111-118]).
2.1.5 보체
보체 염증성 캐스캐이드는 선천적 면역 반응의 일부이며, 이는 개체의 감염을 막은 능력에 있어 중요하다. 또다른 중요한 Fc 리간드는 보체 단백질 C1q이다. C1q에 결합한 Fc가 보체 의존성 세포독성(CDC)이라 불리우는 과정을 매개한다(문헌 [Ward et al., 1995, Ther Immunol 2:77-94]에 리뷰). 2개의 IgG에 결합하는 것도 보체 캐스캐이드를 활성화시키는 데에는 충분하지만, C1q는 6개의 항체에 결합할 수 있다. C1q는 C1r 및 C1s 세린 프로테아제와 복합체를 형성함으로써 보체 경로의 C1 복합체를 형성하게 된다.
2.1.6 Fc γR 결합에 관여하는 IgG 의 영역 및 아미노산 잔기
다른 FcγR에 결합하는 인간 IgG 결합 부위에 대한 지도화 연구가 광범위하게 이루어졌다. 이러한 연구는 유전적으로 변경된 IgG 분자에 기초하는 것으로서, 이를 통해 CH2 도메인의 N 말단부에 있는 아미노산 잔기(234-238)의 짧은 연속 스트레치가 모든 FcγR에 결합할 수 있는 것에 직접적으로 관여하는 것으로 확인되었다. 추가로, 잔기 268, 297, 327 및 329는 FcγR의 서브세트에의 결합에 영향을 줄 수 있다. 또한, CH2 및 CH3 도메인에 위치하는 다수의 잔기 또한 FcγR 결합에 기여한다(문헌 (([Canfield SM. et al., 1991 J Exp Med 173:1483-91], [Chappel MS. Et al. 1991, Proc Nat Acad Sci USA 888:9036-40], [Gergely J. et al. 1990 FASEB J 4:3275-83])).
2.2 항체의 치료학적으로 관련된 독성
여러가지 환경하에서, 면역글로불린의 Fc 영역에 의해 매개되는 결합 및 효과기 기능의 자극은 매우 유익하지만, 특정한 경우에 있어서는 효과기 기능을 감소시키거나 제거하는 것이 더욱 이로울 수 있다. 이는 특히 Fc/FcγR 매개된 효과기 기능을 통해 건강한 면역 세포가 거의 치명적으로 페이로드되어진 표적 세포로 약물(예로서, 독소 및 동위원소)을 전달함으로써 표적 세포를 따라 정상적인 림프구성 조직을 제거하도록 디자인된 항체의 경우에 그러하다(문헌 ([Hutchins et al, 1995, PNAS USA 92:11980-11984]; [White et al, 2001, Annu Rev Med 52: 125-145])). 이러한 경우에는 보체 또는 효과기 세포를 불충분하게 동원하는 항체를 사용하는 것이 극도로 이로울 수 있다(예를 들면, 문헌 ([Wu et al., 2000, Cell Immunol 200:16-26]; [Shields et al., 2001, J. Biol Chem 276:6591-6604]; U.S. 6,194,551; U.S. 5,885,573 및 PCT 공개 WO 04/029207) 참조).
다른 경우에 있어서, 예를 들면, 광범위하게 발현된 수용체와 그의 동족 리간드와의 상호작용을 차단하는 것이 목적인 경우에는 모든 항체 효과기 기능을 감소시키거나 제거함으로써 원치않는 독성을 감소시키는 것이 이로울 것이다. 또한, 치료학적 항체가 여러 인간 조직에 걸쳐 무차별적인 결합을 나타내는 경우에는 다양한 조직 세트에 대한 효과기 기능의 표적화를 제한함으로써 독성을 제한하는 것이 현명할 것이다. 특이적인 효과기 기능이 부족한 특정 서브부류의 인간 면역글로불린인 존재하기는 하지만, 천연적으로 발생된 면역글로불린 중 모든 효과기 기능이 부족한 것으로 알려져 있는 것은 없다. 효과기 기능을 담당하는 Fc 영역 중의 중요한 잔기를 공학처리하거나 돌연변이화시키는 것이 대체 접근법이 될 것이다. 예를 들면, PCT 공개 WO 2006076594, WO 199958572, US 20060134709, WO 2006047350, WO 2006053301, 및 U.S. 5,624,821(이들 각각의 전문이 참고로 인용된다)를 참조한다.
많은 질환 상태의 치료에서 모노클로날 항체를 사용하는 것에 관한 문서화가 잘 이루어져 있다. 항체가 일으킬 수 있는 효과기 기능은 무수히 많지만, 항체 치료제의 요건 중 하나는 관심의 대상이 되는 표적에 특이적으로 표적화되어야 한다는 것이다. 예를 들면, 제한없이, 표적 조직의 특이성은 관심의 대상이 되는 조직의 면역조직화학적 특성(IHC)을 조사함으로써 분석된다. 치료제는 오직 관심의 대상이 되는 표적을 함유하는 조직에만 결합하여야 하는 것이 중요하다. 비표적화된 부위에서 유도된 효과기 기능의 부적절한 활성화로 인하여 항체 치료제는 더욱더 큰 독성을 갖지 못할 수 있다. 효과기 기능이 감소되거나 제거될 수 있다면, 치료제가 광범위하게 결합할 수 있는 위험은 회피할 수 있다. 이 모든 사항들을 고려했음에도 불구하고, 효과기 기능을 촉진시키는 것을 담당하는 적어도 하나의 Fc 리간드에 대한 친화성이 감소되거나 제거된 항체에 관한 요구를 충족시키지 못하고 있다. 그러한 항체는 특히 만성 염증성 병태 및 자가면역 병태의 치료에서 사용하기에 유익할 것이다.
본원에서 참고로서 인용되고 논의된 것은 본 발명에 대한 선행 기술이라는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
3. 도면의 간단한 설명
본 발명을 설명하기 위한 목적으로, 본 발명의 특정 실시태양에 관한 도면을 도시한다. 그러나, 본 발명은 도면에 도시된 실시태양에 관한 정확한 장치와 수단으로 제한되는 것은 아니다.
도 1A. 3F11 VH의 핵산(서열번호: 7) 및 아미노산(서열번호: 8) 서열 정렬(CDR 영역은 위쪽에 줄로 표시되어 있다).
도 1B. 3F11 VΚ의 핵산(서열번호: 9) 및 아미노산(서열번호: 10) 서열 정렬(CDR 영역은 위쪽에 줄로 표시되어 있다).
도 2A. 4G5 VH의 핵산(서열번호: 17) 및 아미노산(서열번호: 18) 서열 정(CDR 영역은 위쪽에 줄로 표시되어 있다).
도 2B. 4G5 VΚ의 핵산(서열번호: 19) 및 아미노산(서열번호:20) 서열 정렬(CDR 영역은 위쪽에 줄로 표시되어 있다).
도 3A. 11E2 VH의 핵산(서열번호: 27) 및 아미노산(서열번호: 28) 서열 정렬 (CDR 영역은 위쪽에 줄로 표시되어 있다).
도 3B. 11E2 VΚ의 핵산(서열번호: 29) 및 아미노산(서열번호: 30) 서열 정렬(CDR 영역은 위쪽에 줄로 표시되어 있다).
도 4A. 9D4 VH의 핵산(서열번호: 37) 및 아미노산(서열번호: 38) 서열 정렬(CDR 영역은 위쪽에 줄로 표시되어 있다).
도 4B. 9D4 VΚ의 핵산(서열번호: 39) 및 아미노산(서열번호: 40) 서열 정렬(CDR 영역은 위쪽에 줄로 표시되어 있다).
도 5. 9D4의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열 정렬. 화살표는 안정성을 증가시키고, 적어도 하나의 Fc 리간드에 대한 친화성을 감소시키는 아미노산 치환(비변형→변형)을 표시한다.
도 6A. 각종 항IFNAR1 항체로 처리된 인간 대뇌 조직의 면역조직화학적 염색 프로필. 인간 대뇌 조직과 함께 인큐베이션되었을 때, 9D4 항체는 4G5 및 MDX-1333 항체에 비하여 더 낮은 염색 프로필을 나타낸다.
도 6B. 각종 항IFNAR1 항체로 처리된 인간 단핵구의 면역조직화학적 염색 프로필. 양성 대조군으로서 인간 단핵구에 대한 반응성에 관하여 각종 항IFNAR1 항체를 시험하였다.
도 7. 항IFNAR1 항체 9D4가 세포 기반 STAT 활성화 분석법에서 IFNα 신호전달을 억제시킨다. 상업적으로 이용가능한 STAT 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석법에 의해 측정된 바, 항체 9D4로 처리하면 인터페론 알파를 사용한 자극에 대하여 일어나는 반응으로 STAT 1/3/4 티로신 인산화는 저해된다.
도 8. 항IFNAR1 항체는 다양한 농도의 pDC 세포 유래의 I형 IFN의 신호전달을 차단시킨다. 3명의 독립된 기증자로부터 정제된 I형 IFN 상등액을 이용함으로써 루시퍼라제 리포터 분석법으로 IFN 신호전달을 차단하는 항체 9D4에 관한 IC50 값을 제시한다. 각각의 정제된 I형 인터페론 상등액 중에는 상대적인 양의 IFNα, IFNβ, 및 IFNω가 포함되어 있다.
도 9A, B, C. 항IFNAR1 항체 9D4, 9D4-DM(이중 돌연변이체), 및 9D4-TM(삼중 돌연변이체)는 유사한 결합 특징을 보인다. 두 변형된 항체인 9D4-DM 및 9D4-TM과 함께 비변형된 9D4 항체를 나타내는 데이타를 제시한다. 변형된 항체는 비변형된 항체와 유사한 IFNAR1 결합 특징을 나타낸다.
도 10A. 항IFNAR1 항체 9D4가 가용성 인터페론 알파 수용체(sIFNαR1)에 결합한다. 9D4의 가용성 인터페론 알파 수용체에의 용량 의존성 결합을 입증하는 평형 결합 데이타를 제시한다.
도 10B. 9D4의 인간 PBMC에의 Kd 측정. 인간 PBMC에의 결합에 의해 측정된 9D4의 해리 상수 측정에 관하여 제시한다.
도 11. 항IFNAR1 항체는 루시퍼라제 리포터 분석법에서 IFNα 유도성 신호전달을 저해시킨다. 비변형된 항체 및 변형된 항체를 비롯한 항IFNAR1 항체는 루시퍼라제 리포터 분석 시스템에서 백혈구 IFN 신호전달 차단에 관하여 유사한 IC50 값을 갖는 것으로 입증된다.
도 12A. 9D4(비변형된 항체) 및 변형된 9D4 항체의 등전점 측정. 9D4 WT(비변형된 항체), 9D4-DM, 및 9D4-TM 항체에 대한 pI 상대치를 입증하는 IEF 겔을 제시한다.
도 12B. 9D4(비변형된 항체) 및 변형된 9D4 항체의 열적 융해 온도 측정. 본 도면은 9D4, 9D4-DM, 및 9D4-TM 항체의 상대적인 융해 온도(Tm)를 입증하는 융해 경화점을 제시한다.
도 13. 항IFNAR 항체를 사용한 예방학적 치료법이 Adv-IFNα로 유도되는 단백뇨를 차단한다. 대조군 벡터, Adv-IFNα, Adv-IFNα + 이소형 대조군 전처리, 및 Adv-IFNα + 항IFNAR 전처리로 처리된 마우스를 9주간에 걸쳐 단백뇨에 관하여 분석하였다. 항IFNAR로 전처리된 마우스에서는 IFNα 시험감염 후에 어떤 단백뇨도 나타내지 않았다.
도 14. 항IFNAR 항체를 사용한 예방학적 치료법이 혈액 중 IFNα 반응성 유전자(IFIT1, IFI44, CXCL11, IFI202b, CXCL19, CXCL9)의 상향조절을 차단시킨다. 아데노바이러스에 의해 코딩되는 IFN 알파를 시험감염시켰을 경우, 대조군 바이러스, PBS, 또는 이소형 IgG 대조군으로 전처리된 마우스와 비교할 때, 항IFNAR 항체로 전처리된 마우스에서는 선택된 IFNα 반응성 유전자가 상향조절되지 않았다. Adv-IFNα로 감염시킴으로써 IFNα가 유도된 후 3주가 경과하였을 때 마우스로부터 채취한 혈액 샘플 중 IFNα에 대하여 반응성인 것으로 알려져 있는 6개의 유전자에 관한 상대적인 발현을 제시한다.
도 15A, B. 항IFNAR 항체를 사용한 예방학적 치료법이 IFNα로 유도된 자가항체 생산을 차단시킨다. 아데노바이러스에 의해 코딩되는 IFN 알파를 시험감염시켰을 경우, 대조군 바이러스, PBS, 또는 이소형 IgG 대조군으로 전처리된 마우스와 비교할 때, 항IFNAR 항체로 전처리된 마우스에서는 자가항체의 생산이 증가하지 않았다. Adv-IFNα로 감염시킴으로써 IFNα가 유도된 후 6주가 경과하였을 때 마우스로부터 채취한 혈액 샘플 중 항dsDNA 및 항SSA/Ro의 농도를 제시한다.
도 16A, B. 항IFNAR 항체를 사용한 예방학적 치료법이 신장에서 사이토카인의 상향조절을 차단시킨다. 아데노바이러스에 의해 코딩되는 IFNα5를 시험감염시켰을 경우, 대조군 바이러스, PBS, 또는 이소형 IgG 대조군으로 전처리된 마우스와 비교할 때, 항IFNAR 항체로 전처리된 마우스에서는 신장에서 사이토카인이 상향조절되지 않았다. Adv-IFNα5로 감염시킴으로써 IFNα가 유도된 후 6주가 경과하였을 때 마우스로부터 채취한 신장 샘플 중 IP-10, 및 IL-18 수준을 측정한 것을 제시한다.
도 17. 항IFNAR 항체를 사용한 예방학적 치료법이 IFN로 유도된 자가항체 생산을 차단시킨다. 마우스 혈청으로부터의 항핵 항원(ANA: anti-nuclear antigen)의 상대적 역가를 제시한다. IFN 시험감염 이후, 대조군 바이러스, PBS, 또는 이소형 IgG 대조군으로 전처리된 마우스와 비교할 때, 항IFNAR 항체로 전처리된 마우스는 더 낮은 ANA 혈청 역가를 나타내었다.
도 18. 항체로 매개되는, SLE 혈장으로 매개된 가지 세포 발생 저해. SLE 환자로부터 유래된 IFN을 항IFNAR1 항체 9D4의 존재하에서 인큐베이션시킨 후, 인간 단핵구에 첨가하는 독립된 5개의 실험으로부터 얻은 결과를 제시한다. 항IFNAR1 항체 9D4가 존재함으로써 SLE 환자로부터 유래된 IFN이 분화 단핵구에서 가지 세포 마커 CD38 및 CD123을 유도할 수 있는 능력이 저해되었다.
도 19. 항IFNAR1 항체는 백혈구 인터페론으로 자극을 받은 단핵구에서의 CD38, CD123 및 CD86 발현을 억제시킨다. 대조군에서의 자극을 통해 이루어진 발현에 대한 억제율(%)을 측정한 바, 항IFNAR1 항체 9D4, 9D4-DM 및 9D4-TM은 분화 단핵구 중 CD38, CD123 및 CD86의 발현에 대해 유사한 저해 프로필을 나타내었다.
도 20. 변형된 항IFNAR1 항체는 비변형된 항IFNAR1 항체와 비교하여 Fc 수용체 FcγRI에 대해 감소된 결합을 나타낸다. ELISA 실험으로 플레이트 결합된 FcγRI에 결합할 수 있는 능력에 관하여 항IFNAR1 항체 9D4(비변형된 항체), 9D4-DM(변형된 항체) 및 9D4-TM(변형된 항체)를 분석하였다. Fc 수용체 결합에 대한 양성 대조군으로서는 관련이 없는 비변형된 항체를 사용하였다(대조군 항체).
도 21A, B, C. 변형된 항IFNAR1 항체는 비변형된 항IFNAR1 항체와 비교하여 Fc 수용체 FcγRIIIA에 대해 감소된 결합을 나타낸다. ELISA 실험 포맷으로 유리 FcγRIIIA에 결합할 수 있는 능력에 관하여 플레이트 결합된 비변형된 항IFNAR1 항체 9D4(A) 및 변형된 항IFNAR1 항체 9D4-DM(B) 및 9D4-TM(C)을 분석하였다.
도 22A, B, C. 변형된 항IFNAR1 항체는 Fc 수용체 FcγRIIIA에 대해 감소된 결합을 나타낸다. ELISA 실험 포맷으로 플레이트 결합된 FcγRIIIA에 결합할 수 있는 능력에 관하여 유리 비변형된 항IFNAR1 항체 9D4(A) 및 변형된 항IFNAR1 항체 9D4-DM(B) 및 9D4-TM(C)을 분석하였다.
도 23A-E. SLE 환자 혈청에서의 IFN 서브타입의 중화. 리포터 분석법에 의해 측정된 바, 항IFNAR1 항체 MDX-1333, 9D4-WT 및 9D4-TM은 IFN 매개되는 α10(A), 백혈구 인터페론(B), α2b(C), ω(D), 및 β(E) 신호전달을 저해시켰다.
도 24. 항IFNAR1 항체는 SLE 환자로부터의 I형 인터페론을 중화시킨다. 리포터 분석법에 의해, 항IFNAR1 항체인 9D4는 관련이 없는 항체인 대조군과 비교하였을 때, I형 인터페론 매개된 신호전달을 저해시켰다.
도 25A-D. 항IFNAR 항체는 PBMC 중 IFNα로 유도되는 pDC 군집을 억제시킨다. 항IFNAR 항체는 비장(A), 림프절(B), 말초 혈액(C), 및 골수(D)에서 아데노바이러스 유도성 인터페론 알파의 이소성 발현으로 유도되는 pDC 세포의 증가(이는 세포 표면 이소발현으로 측정된다)을 차단시켰다.
도 26. 항IFNAR1 항체 9D4-WT, 9D4-DM, 및 9D4-TM의 Fc 수용체 FcγRI에의 결합 분석을 비아코어(BIACore) 분석법에 의해 측정하였다. 간략하면, 항IFNAR1 항체를 고정시키고, 유리 FcγRI을 첨가하여 친화성을 측정하였다. 트레이싱법에 의해 입증되는 바, 변형된 항체인 9D4-DM, 및 9D4-TM은 비변형된 9D4-WT 항체와 비교하여 유리 FcγRI에 대하여 더 낮은 친화성을 보였다.
도 27A-C. 항IFNAR1 항체 9D4-WT, 9D4-DM, 및 9D4-TM의 Fc 수용체 FcγRI에의 결합 분석을 비아코어 분석법에 의해 측정하였다. 간략하면, 유리 항IFNAR1 항체를 고정화된 FcγRI 상에 통과시켜 친화성을 측정하였다. 트레이싱법에 의해 입증되는 바, 변형된 항체 9D4-DM(B), 및 9D4-TM(C)는 비변형된 9D4-WT(A) 항체와 비교하여 결합된 FcγRI에 대하여 더 낮은 친화성을 보였다.
도 28. 항IFNAR 항체는 신장에서의 IFNα 반응성 유전자 유도를 저해시킨다. 간략하면, 택맨 분석법에 의해 측정된 바, 가속 루푸스 마우스 모델에서 항IFNAR 항체로 처리하는 것은 대조군 마우스와 비교하였을 때, IFNα의 이소발현에 의해 매개되는 6개의 유전자(ICAM1, VCAM1, CXCL9, CXCL10, 및 IFIT1)가 신장에서 유도되는 것을 차단한다.
도 29. 항IFNAR 항체는 가속 루푸스 마우스 모델에서 항ds DNA 항체의 생산을 저해시킨다. 간략하면, IFNα를 이소발현하는 마우스를 항IFNAR 항체로 처리하였을 때, 상기 마우스는 유사하게 감소되고 IgG 대조군 항체로 처리된 마우스와 유사한 수준으로 항ds DNA 항체를 축적시키지는 못했다.
도 30. 항IFNAR 항체는 가속 루푸스 마우스 모델의 치료학적 배경에서 단백뇨를 감소시킬 수 있다. (A) 간략하면, IFNα를 이소발현하는 마우스에서는 루푸스 유사 증상, 예로서, 단백뇨가 발생하였다. 치료학적 연구에서는 일단 역치 단백뇨 점수에 도달하게 되면 항IFNAR 항체를 마우스에 투여하였다. 항IFNAR 항체, PBS, 또는 대조군 IgG를 5주간에 걸쳐 주 2회씩 투여하였다. PBS만으로 처리된 처리군 또는 대조군 IgG 처리군과 비교하여 항IFNAR 항체 처리군에서는 실험 동안 단백뇨의 중증도가 감소된 것으로 나타났다.
도 31. 항IFNAR 항체는 가속 루푸스 마우스 모델의 치료학적 배경에서 생존율을 증가시킬 수 있다. (A) 간략하면, IFNα를 이소발현하는 마우스에서는 루푸스 유사 증상, 예로서, 단백뇨가 발생한 후 약 8주째 감소된 생존율을 보였다. 치료학적 연구에서는 일단 역치 단백뇨 점수에 도달하게 되면 항IFNAR 항체를 마우스에 투여하였다. 5주 후에 항체 처리를 중단하고, 3개의 처리군 모두에 대하여 사망율을 추적하였다. 항IFNAR 항체 처리군은 PBS만으로 처리된 처리군 또는 대조군 IgG 처리군(이 두 처리군 모두 9주째까지는 100%의 사망율을 보였다).
도 32. L234F/L235E/P331S 돌연변이를 포함하는 Fc-TM 결정의 비대칭 유닛 콘텐츠를 나타내는 것이다. 돌연변이 P331은 적색으로 표시되어 있다. 하나의 아연 이온은 공간적으로 인접해 있는 히스티딘 잔기에 의해 킬레이트화되어 있다. 297에 부착된 당질 잔기는 그의 전자 밀도에 따라 모델링되었다.
도 33. 동역학적 영상이 9D4-TM의 내재화를 입증한다. THP-1 세포를 10분 동안 37℃ CO2 인큐베이터에서 1 μM CFSE로 염색한 후 1시간 동안 얼음 상에서 1 ㎍/ml의 Alexa647-9D4-TM으로 염색하였다. 비결합 물질을 제거한 후, 지정된 시간(0, 15, 30 및 60분) 동안 37℃에서 인큐베이션시킨 후, 세포를 영상 촬영하였다.
도 34. 항IFNAR1 항체인 9D4-TM은 시험관내 분석법에서 CDC 활성을 나타내지 않는다. 9D4-TM 항체가 CDC 활성을 유도할 수 있는 능력을 측정하는 CDC 분석법으로부터 얻은 결과를 본 패널에 제시한다. 제시된 바와 같이, 9D4-TM 항체는 양성 대조군 항체와 비교하여 어떤 CDC 활성도 나타내지 않았다. CDC 활성은 또한 관련이 없는 대조군 항체인 R347에 대해서도 검출할 수 없었다. 간략하면, IFNAR1 항원을 발현하는 세포를 양성 대조군 항체, 9D4-TM, 또는 R347 중 하나와 인큐베이션시켰다. 연속하여 세척한 후, 새로 제조된 인간 혈청을 첨가하였다. 보체 의존성 세포독성(CDC)을 LDH 방출 분석법을 사용하여 측정하였다.
4. 용어
"인터페론 알파," "IFNα," "IFNa," "IFNA" 및 "IFN 알파"는 상호교환적으로 사용되며, 이는 IFN 알파 1(진뱅크(GenBank) 수탁번호 NP_076918 또는 진뱅크 수탁번호 NM_024013에 의해 코딩되는 단백질)과 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 인터페론 알파 유전자 유전자좌의 기능성 유전자에 의해 코딩되는 IFN 알파 단백질을 지칭하는 것으로 의도된다. IFN 알파 서브타입의 예로는 IFN 알파 1, 알파 2a, 알파 2b, 알파 4, 알파 4b 알파 5, 알파 6, 알파 7, 알파 8, 알파 10, 알파 13, 알파 14, 알파 16, 알파 17 및 알파 21을 포함한다. "인터페론 알파," "IFNα," 및 "IFN 알파"라는 용어는 각종 IFN 알파 서브타입의 재조합 형태 뿐만 아니라, IFN 알파 단백질, 예로서, 백혈구 IFN 및 림프아구성 IFN을 포함하는 천연적으로 발생된 시료를 포함하는 것으로 의도된다.
"인터페론 알파 수용체-1," "IFNAR1" "IFNAR1," 및 "IFNAR1 항원"은 상호교환적으로 사용되며, 이는 인간 IFNAR1의 변이체, 이소폼, 종 동족체, 및 IFNAR1과 적어도 하나의 공통된 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 따라서, 특정의 실시태양에서, 본 발명의 인간 항체는 인간 이외의 다른 종으로부터 유래된 IFNAR1과, 또는 인간 IFNAR1과 구조적으로 관련이 있는 기타 다른 단백질(예로서, 인간 IFNAR1 동족체)과 교차 반응할 수 있다. 다른 실시태양에서, 항체는 인간 IFNAR1에 대한 완전하게 특이적일 수는 있지만, 종 또는 기타 다른 유형의 교차 반응성을 나타내지 않을 수 있다. 인간 IFNAR1의 완전한 cDNA 서열은 진뱅크 수탁번호 NM_000629를 갖는다.
본원에서 사용되는 바, "보존적 서열 변형"이라는 용어는 상기 아미노산 서열을 포함하는 항체의 결합 특징에는 영향을 미치지 않거나, 그를 변경시키지 않는 아미노산 변형을 포함하는 것으로 의도된다. 그러한 보존적 변형으로는 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 당업계에 공지된 표준 기법, 예로서, 예로서, 부위 지정 돌연변이유발 및 PCR에 의해 매개된 돌연변이유발에 의해 본 발명의 항체 내로 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 치환이다. 예를 들면, 극성이 유사한 하나 이상의 아미노산은 기능적 등가물로서 작용을 하며, 이를 통해 펩티드의 아미노산 서열 내에서 침묵 변경을 일으킬 수 있다. 비록 잔기가 다른 군에 속해 있다 하더라도 중성 전하를 띠며, 잔기를 보다 작은 잔기로 대체하는 치환(예로서, 페닐알라닌을 보다 작은 이소류신으로 대체) 또한 "보존적 치환"으로서 간주될 수 있다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리가 당업계에서 정의되어져 있다. 보존적 아미노산 치환 패밀리에 관한 수개의 비제한적인 일례를 하기 표 1에 제시한다.
Figure 112010058184517-pct00001
5. 상세한 설명
앞서 교시된 내용과는 대조적으로, 본 발명자들은 효과기 기능이 감소되거나 제거된 항IFNAR1 항체가 만성 자가면역 및/또는 염증성 질환 치료에 바람직하다는 것을 발견하게 되었다. 효과기 기능이 만성 자가면역 및/또는 염증성 질환 상태를 치료하거나, 적어도 완화시키는 데 있어서 중요한 역할을 할 것이라는 이해를 통해 종래에 IFNAR1에 대한 항체가 개발된 바 있다(예를 들면, 미국 공개 번호 제20060029601호 또는 PCT 공개 번호 WO 06002177 참조). 이러한 개념하에서 다수의 종래 교시 내용은 당업자가 Fc 수용체(예로서, FcRn, FcγRIIIa, FcγRIIb) 및/또는 보체 단백질 C1q에 대한 항체의 친화성을 증가시킴으로써 효과기 기능이 강한 항IFNAR1 항체를 동정할 수 있게 하였고, 추가로 효과기 기능을 증진시킬 수 있게 하였다. 이렇게 생성된 효과기 기능이 증진된 항IFNAR1 항체가 질환 상태의 치료에 있어 유익하다고 판단되었다.
종래 이해되었던 상기 내용과는 대조적으로, 본 발명은 감소되거나 제거된 효과기 기능(예로서, ADCC 및/또는 CDC)이 감소되거나 제거된 항IFNAR1 항체를 기술한다. 놀랍게도, 효과기 기능이 강하거나 증진된 항IFNAR1 항체는 비표적 조직 상의 항IFNAR1의 염색이 널리 퍼져있기 때문에 원치않는 독성을 나타낼 수 있는 성향을 보였다는 것을 조직의 교차 반응성 연구를 통해서 발견하게 되었다. 이러한 독성은 부적절한 부위에서의 ADCC 및/또는 CDC의 비특이적인 활성화로부터 일어날 수 있다. 이와 같이 원치않는 독성을 감소시키거나, 그를 제거하기 위해서 본 발명자들은 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드의 효과기 기능을 감소시킬 필요가 있음을 인지하게 되었다.
따라서, 본 발명의 하나의 측면은, 적어도 하나의 아미노산 잔기가 Fc 영역에 부가되었거나, 치환되었거나, 결실됨으로써 적어도 하나의 Fc 리간드에 대한 친화성이 감소되거나 제거된 것을 포함하는, 항체의 Fc 영역을 포함하는 변형된 항체 또는 기타 다른 폴리펩티드(본원에서는 "본 발명의 변형된 항체," 또는 "변형된 항체" 또는 "본 발명의 항체"로 지칭된다)를 포함한다. Fc 영역은 Fc 수용체(예로서, FcRn, FcγRIIIa, FcγRIIb), 보체 단백질 C1q, 및 기타 다른 분자, 예로서, 단백질 A 및 G를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다수의 리간드와 상호작용을 한다. 이러한 상호작용은 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(CDC)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 효과기 기능과 하류의 신호전달 이벤트에 필수적이다. 따라서, 특정 실시태양에서, 본 발명의 변형된 항체는, 본 발명의 항체와 동일한 아미노산 서열을 갖지만, 적어도 하나의 아미노산 잔기가 Fc 영역에 부가, 치환, 또는 결실되지 않은 것인 항체(본원에서 이는 또한 "비변형된 항체"로도 지칭된다)와 비교할 때에 효과기 기능을 촉진시키는 것을 담당하는 Fc 리간드에 대하여 감소되거나 제거된 친화성을 갖는다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 하기 특성들 중 적어도 하나 또는 그 이상의 특성을 포함한다: 감소되거나 제거된 효과기(ADCC 및/또는 CDC) 기능, 감소되거나 제거된 Fc 수용체에의 결합, 또는 감소되거나 제거된 독성. 더욱 특히, 본 발명의 실시태양은 Fc 수용체(예로서, FcRn, FcγRIIIa, FcγRIIb) 및/또는 보체 단백질 C1q에 대한 친화성이 감소된 항IFNAR1 항체를 제공한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 항체는 234, 235, 및 331번 위치(여기서, 불변 영역의 번호화 체계는 문헌 [Kabat et al. (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA)]에 기재되어 있는 것과 같은 EU 인덱스의 것이다)로 구성된 번호로부터 선택되는 아미노산 잔기의 적어도 하나의 부가, 치환, 또는 결실을 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 L234F, L235E, 및 P331S(여기서, 첫번째 문자와 숫자는 비변형된 아미노산과 그 위치를 나타내고, 두번째 문자는 상기 위치에서 치환된 아미노산을 나타낸다)로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 Fc 영역을 포함한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 추가로 항체의 안정성 증가와 상호관련이 있는 아미노산 잔기의 적어도 하나의 부가, 치환, 또는 결실을 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 아미노산 잔기의 부가, 치환, 또는 결실은 Fc 영역의 228번 위치(여기서, 불변 영역의 번호화 체계는 문헌 [Kabat et al.])에 기재되어 있는 것과 같은 EU 인덱스의 것이다)에서 이루어진다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 228번 위치에서의 아미노산 치환(여기서, 치환은 세린 잔기이다)을 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 또다른 구체적인 실시태양에서, IgG4 서브타입의 본 발명의 항체는 Fc 영역의 228번 위치에 세린의 아미노산 치환을 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 항체가 이미 Fc 영역의 228번 위치에 세린 잔기를 포함하는 경우; 이러한 실시태양에서는 어떠한 변형도 요구되지 않는다. 대체 실시태양에서, 본 발명의 항체는 Fc 영역의 잔기 228에 변형을 필요로 하지 않거나, 상기 위치에 이미 세린을 포함하고 있다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 임의 부류의 것 중 어느 것일 수 있다(예를 들면, IgG, IgM, 및 IgE로 제한되지 않는다). 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 IgG 부류 항체의 구성원이다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 IgG1 서브부류의 것이다. 또다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 항체는 IgG1 서브부류의 것이며, 하기와 같은 아미노산 치환: Fc 영역의 234F, 235E 및 331S를 포함한다. 대체 실시태양에서, 본 발명의 항체는 IgG4 서브부류의 것이다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 IgG4 서브부류의 것이며, 하기와 같은 아미노산 치환: Fc 영역의 S228P 및 L235E를 포함한다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 변형된 항체는 그의 가변 도메인, 또는 그의 단편을, 본원에 개시된 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함하는 Fc 도메인과 조합함으로써 생산될 수 있다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 변형된 항체는 아미노산 치환 잔기 중 하나 이상을 Fc 도메인 내로 도입하여 Fc 도메인을 함유하는 항체를 변형시킴으로써 생산될 수 있다.
5.1 Fc 리간드에의 결합 감소
당업자들을 본 발명의 항체가 (비변형된 항체에 비하여) 변경된 FcγR 및/또는 C1q 결합 특성(결합 특성의 예로는 결합 특이성, 해리 평형 상수(KD), 해리 및 결합 속도(각각 K오프 및 K온), 결합 친화성 및/또는 화합력을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 가질 수 있고, 특정의 변경이 다소 바람직할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 해리 평형 상수(KD)는 K 오프 /K 온 으로 정의된다는 것이 당업계에 알려져 있다. 당업자는 주어진 항체 적용을 위해서는 어떤 동역학적 파라미터가 가장 중요한지 결정할 수 있다. 예를 들면, ADCC 활성을 감소시키는 데에는 하나 이상의 양성 조절 인자(예로서, FcγRIIIA)에의 결합을 감소시키고/거나, 저해성 Fc 수용체(예로서, FcγRIIB)에의 결합을 증진시키는 변형이 적합할 것이다. 따라서, 본 발명의 항체의 ADCC 활성이 증진되었는지 또는 감소되었는지 여부는 결합 친화성의 비(예로서, 해리 평형 상수(KD))가 지시할 수 있다. 추가로, CDC 활성을 감소시키는 데에는 C1q에의 결합을 감소시키는 변형이 적합할 것이다.
Fc 영역의 그의 리간드에 대한 친화성 및 결합 특성은 Fc-FcγR 상호작용, 즉, Fc 영역의 FcγR에의 특이적인 결합을 측정하는 데 있어서 당업계에 공지된 각종의 시험관내 분석 방법(생화학적 또는 면역학적 방법에 기초한 분석법)(평형 방법(예로서, 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 또는 방사선면역분석법(RIA)), 또는 동역학적 성질(예로서, BIACORE® 분석), 및 기타 다른 방법, 예로서, 간접적 결합 분석법, 경쟁 저해 분석법, 형광 공명 에너지 전이(FRET: fluorescence resonance energy transfer), 겔 전기영동 및 크로마토그래피(예로서, 겔 여과)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)에 의해 측정될 수 있다. 이와 기타 다른 방법은 조사되는 성분들 중 하나 이상의 위에서 표지를 사용할 수 있고/거나, 발색성, 형광성, 발광성, 또는 동위원소 표지를 포함하나, 이에 한정되지 않는 각종의 검출 방법을 사용할 수 있다. 결합 친화성 및 동역학적 성질에 관한 상세한 설명은 문헌 [Paul, W.E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)]에서 살펴볼 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 항체는 비변형된 항체와 비교하여, FcγRI(CD64)(이소폼 FcγRIA, FcγRIB, 및 FcγRIC 포함); FcγRII(CD32)(이소폼 FcγRIIA, FcγRIIB, 및 FcγRIIC 포함); 및 FcγRIII(CD16)(이소폼 FcγRIIIA 및 FcγRIIB 포함)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 이상의 Fc 수용체에 대하여 감소된 결합 친화성을 나타낸다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 비변형된 항체(예를 들면, 야생형 Fc 영역을 포함하는 항체)와 비교하여 FcγRIIB 수용체 결합에서의 부수적인 증가는 포함하지 않는다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 항체는 비변형된 항체에 비하여 감소된, FcγRI에의 친화성을 나타낸다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 비변형된 항체보다 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 7배, 또는 적어도 10배, 또는 적어도 20배, 또는 적어도 30배, 또는 적어도 40배, 또는 적어도 50배, 또는 적어도 60배, 또는 적어도 70배, 또는 적어도 80배, 또는 적어도 90배, 또는 적어도 100배, 또는 적어도 200배 더 낮은, FcγRI 수용체에의 친화성을 나타낸다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 비변형된 항체보다 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 적어도 40%, 적어도 30%, 적어도 20%, 적어도 10%, 또는 적어도 5% 더 낮은, FcγRI 수용체에의 친화성을 나타낸다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 항체는 비변형된 항체에 비하여 감소된, FcγRIIIA 수용체에의 친화성을 나타낸다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 비변형된 항체보다 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 7배, 또는 적어도 10배, 또는 적어도 20배, 또는 적어도 30배, 또는 적어도 40배, 또는 적어도 50배, 또는 적어도 60배, 또는 적어도 70배, 또는 적어도 80배, 또는 적어도 90배, 또는 적어도 100배, 또는 적어도 200배 더 낮은, FcγRIIIA 수용체에의 친화성을 나타낸다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 비변형된 항체보다 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 적어도 40%, 적어도 30%, 적어도 20%, 적어도 10%, 또는 적어도 5% 더 낮은, FcγRIIIA 수용체에의 친화성을 나타낸다.
FcγRIIIA 수용체의 F158V 대립형질 변이체가 항체에의 변경된 결합 특징을 갖는다는 것이 당업계에서는 이해되고 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 항체는 비변형된 항체에 비하여 감소된 친화성으로 FcγRIIIA(F158V)와 결합한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 비변형된 항체보다 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 7배, 또는 적어도 10배, 또는 적어도 20배, 또는 적어도 30배, 또는 적어도 40배, 또는 적어도 50배, 또는 적어도 60배, 또는 적어도 70배, 또는 적어도 80배, 또는 적어도 90배, 또는 적어도 100배, 또는 적어도 200배 더 낮은, FcγRIIIA(F158V) 수용체에의 친화성을 나타낸다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 비변형된 항체보다 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 적어도 40%, 적어도 30%, 적어도 20%, 적어도 10%, 또는 적어도 5% 더 낮은, FcγRIII A(F158V) 수용체에의 친화성을 나타낸다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 비변형된 항체와 비교하여 증가된, FcγRIIB 수용체에의 친화성을 나타낸다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 변경되지 않거나, 비변형된 항체보다 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 7배, 또는 적어도 10배, 또는 적어도 20배, 또는 적어도 30배, 또는 적어도 40배, 또는 적어도 50배, 또는 적어도 60배, 또는 적어도 70배, 또는 적어도 80배, 또는 적어도 90배, 또는 적어도 100배, 또는 적어도 200배 만큼 증가된, FcγRIIB 수용체에의 친화성을 나타낸다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 비변형된 항체보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 만큼 증가된, FcγRIIB 수용체에의 친화성을 나타낸다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 FcγRI, FcγRIIIA, 또는 FcγRIIIA(F158V) 수용체에 대하여 약 100 nM 내지 약 100 μM, 또는 약 100 nM 내지 약 10 μM, 또는 약 100 nM 내지 약 1 μM, 또는 약 1 nM 내지 약 100 μM, 또는 약 10 nM 내지 약 100 μM, 또는 약 1 μM 내지 약 100 μM, 또는 약 10 μM 내지 약 100 μM 사이의 친화성을 보인다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 FcγRI, FcγRIIIA, 또는 FcγRIIIA(F158V) 수용체에 대하여 1 μM 초과, 5 μM 초과, 10 μM 초과, 25 μM 초과, 50 μM, 또는 100 μM 초과의 친화성을 보인다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 FcγRIIB 수용체에 대하여 약 100 nM 내지 약 100 μM, 또는 약 100 nM 내지 약 10 μM, 또는 약 100 nM 내지 약 1 μM, 또는 약 1 nM 내지 약 100 μM, 또는 약 10 nM 내지 약 100 μM, 또는 약 1 μM 내지 약 100 μM, 또는 약 10 μM 내지 약 100 μM 사이의 친화성을 보인다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 FcγRI, FcγRIIIA, 또는 FcγRIIIA(F158V) 수용체에 대하여 100 μM 미만, 50 μM 미만, 10 μM 미만, 5 μM 미만, 2.5 μM 미만, 1 μM 미만, 또는 100 nM 미만, 또는 10 nM 미만의 친화성을 보인다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 FcγRIIB 수용체에 대하여 약 100 nM 내지 약 100 μM, 또는 약 100 nM 내지 약 10 μM, 또는 약 100 nM 내지 약 1 μM, 또는 약 1 nM 내지 약 100 μM, 또는 약 10 nM 내지 약 100 μM, 또는 약 1 μM 내지 약 100 μM, 또는 약 10 μM 내지 약 100 μM 사이의 친화성을 보인다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 FcγRI, FcγRIIIA, 또는 FcγRIIIA(F158V) 수용체에 대하여 100 μM 미만, 50 μM 미만, 10 μM 미만, 5 μM 미만, 2.5 μM 미만, 1 μM, 또는 100 nM 미만, 또는 10 nM 미만의 친화성을 보인다.
5.2 ADCC 활성 감소
항체는 당업계에서는 총칭하여 항체 효과기 기능으로서 알려져 있는 다수의 과정을 거쳐 표적화된 항원에의 공격 및 파괴를 지시할 수 있는 것으로 주지되어 있다. "항체 의존성 세포 매개된 세포독성" 또는 "ADCC"로서 알려져 있는 상기 과정들 중 하나는, 특정 세포독성 세포(예로서, 자연살 세포(NK), 중성구, 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체(FcR) 상에 결합되어 있는 분비된 Ig는 이들 세포독성 효과기 세포가 항원을 보유하는 표적 세포에 특이적으로 결합하여, 이후 세포독소를 사용하여 표적 세포를 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성의 한 형태를 지칭한다. 표적 세포의 표면에 대해 특이적인 고친화성 IgG 항체는 세포독성 세포를 "무장시키고," 그러한 사멸을 위해서는 필요시된다. 표적 세포의 용해는 세포외에서 이루어지며, 이는 직접적인 세포 대 세포의 접촉을 필요로 하며, 보체는 포함하지 않는다. 효과기 기능이라는 용어에 포함된 또다른 과정은 보체 의존성 세포독성(이하 "CDC"로 지칭한다)인데, 이는 보체계에 의한 항체 매개된 표적 세포 파괴를 이루는 생화학적 이벤트를 지칭한다. 보체계는 항체와 조합하여 병원균과 기타 다른 외래 세포를 파괴시키는, 정상적인 혈장 내에서 발견되는 단백질 복합체 시스템이다.
ADCC에 의한 표적 세포의 용해를 매개할 수 있는 임의의 특정 항체의 능력을 분석할 수 있다. ADCC 활성을 평가하기 위해서는 관심의 대상이 되는 항체를, 항원 항체 복합체에 의해 활성화됨으로써 표적 세포의 세포용해를 일으킬 수 있는 면역 효과기 세포와 조합하여 함께 표적 세포에 첨가한다. 세포용해는 일반적으로 용해된 세포로부터 방출되는 표지(예로서, 방사성 기질, 형광성 염료 또는 천연 세포내 단백질)에 의해 검출된다. 상기와 같은 분석법에 유용한 효과기 세포로는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC: peripheral blood mononuclear cell) 및 자연살 세포(NK)를 포함한다. 시험관내 ADCC 분석법의 구체적인 예는 문헌 (([Wisecarver et al, 1985 79:277-282]; [Bruggemann et al, 1987, J Exp Med 166:1351-1361]; [Wilkinson et al., 2001, J Immunol Methods 258:183-191]; [Patel et al., 1995 J Immunol Methods 184:29-38]))에 기재되어 있다. 별법으로, 또는 추가적으로, 관심의 대상이 되는 항체의 ADCC 활성은 생체내에서, 예로서, 문헌 [Clynes et al., 1998, PNAS USA 95:652-656]에 개시되어 있는 바와 같이, 동물 모데에서 평가될 수 있다.
본 발명의 항체는 하나 이상의 FcγR 매개된 효과기 세포 기능을 측정하는 시험관내 기능성 분석법을 통해 특징이 규명된다는 점이 주시된다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체의 생체내 모델(예로서, 본원에 기술되고 개시되어 있는 것)에서의 결합 특성 및 효과기 세포 기능은 시험관내 기초 분석법에서의 것과 유사하다. 그러나, 본 발명은 시험관내 기초 분석법에서는 원하는 표현형을 나타내지는 않지만 생체내에서는 원하는 표현형을 나타내는 본 발명의 항체을 배제시키지 않는다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 항체는 비변형된 항체와 비교하여 감소된 ADCC 활성을 나타낸다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 비변형된 항체보다 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 5배 또는 적어도 10배 또는 적어도 50배 또는 적어도 100배 더 낮은 ADCC 활성을 나타낸다. 추가의 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 비변형된 항체에 비하여 적어도 10% 만큼, 또는 적어도 20% 만큼, 또는 적어도 30% 만큼, 또는 적어도 40% 만큼, 또는 적어도 50% 만큼, 또는 적어도 60% 만큼, 또는 적어도 70% 만큼, 또는 적어도 80% 만큼, 또는 적어도 90% 만큼, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 적어도 200% 만큼, 또는 적어도 300% 만큼, 또는 적어도 400% 만큼, 또는 적어도 500% 만큼 감소된 ADCC 활성을 나타낸다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 검출가능한 ADCC 활성을 가지지 않고 있다. 특정 실시태양에서, ADCC 활성의 감소 및/또는 제거는 본 발명의 항체가 Fc 리간드 및/또는 수용체에 대해 보이는 감소된 친화성의 원인이 될 수 있다.
5.3 CDC 활성 감소
보체 활성화 경로는 보체계 제1 성분(C1q)가 예를 들면, 동족 항원과 복합체를 형성한 항체와 같은 분자에 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해서 CDC 분석법, 예로서, 문헌 [Gazzano-Santoro et al, 1996, J. Immunol. Methods, 202:163]에 기재되어 있는 것과 같은 CDC 분석법을 실시할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 항체는 비변형된 항체에 비하여 C1q에 대하여 감소된 친화성을 나타낸다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 비변형된 항체보다 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 7배, 또는 적어도 10배, 또는 적어도 20배, 또는 적어도 30배, 또는 적어도 40배, 또는 적어도 50배, 또는 적어도 60배, 또는 적어도 70배, 또는 적어도 80배, 또는 적어도 90배, 또는 적어도 100배, 또는 적어도 200배 더 낮은, C1q 수용체에 대한 친화성을 나타낸다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 비변형된 항체보다 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 적어도 40%, 적어도 30%, 적어도 20%, 적어도 10%, 또는 적어도 5% 더 낮은, C1q 수용체에 대한 친화성을 나타낸다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 약 100 nM 내지 약 100 μM, 또는 약 100 nM 내지 약 10 μM, 또는 약 100 nM 내지 약 1 μM, 또는 약 1 nM 내지 약 100 μM, 또는 약 10 nM 내지 약 100 μM, 또는 약 1 μM 내지 약 100 μM, 또는 약 10 μM 내지 약 100 μM 사이의, C1q 수용체에 대한 친화성을 나타낸다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 1 μM 초과, 5 μM 초과, 10 μM 초과, 25 μM 초과, 50 μM, 또는 100 μM 초과의, C1q 수용체에 대한 친화성을 나타낸다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 항체는 비변형된 항체와 비교하여 감소된 CDC 활성을 나타낸다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 비변형된 항체보다 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 5배 또는 적어도 10배 또는 적어도 50배 또는 적어도 100배 더 낮은 CDC 활성을 나타낸다. 추가의 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 비변형된 항체에 비하여 적어도 10% 만큼, 또는 적어도 20% 만큼, 또는 적어도 30% 만큼, 또는 적어도 40% 만큼, 또는 적어도 50% 만큼, 또는 적어도 60% 만큼, 또는 적어도 70% 만큼, 또는 적어도 80% 만큼, 또는 적어도 90% 만큼, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 적어도 200% 만큼, 또는 적어도 300% 만큼, 또는 적어도 400% 만큼, 또는 적어도 500% 만큼 감소된 CDC 활성을 나타낸다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 검출가능한 CDC 활성을 가지지 않고 있다. 특정 실시태양에서, CDC 활성의 감소 및/또는 제거는 본 발명의 항체가 Fc 리간드 및/또는 수용체에 대해 보이는 감소된 친화성의 원인이 될 수 있다.
5.4 항체 관련 독성 감소
당업계에서는 생물학적 치료법은 면역계가 원치않는 세포 및/또는 표적을 인식하고 공격하도록 지시하는 복합적인 성질과 관련된 유해 독성 문제를 가질 수 있다고 이해되고 있다. 치료가 필요할 경우에 공격에 대해 인식하지 못하고/거나 그를 표적하지 못했을 때에는 결과, 예로서, 유해 독성이 일어날 수 있다. 예를 들면, 비표적화된 조직의 항체 염색이 잠재적인 독성 문제를 가리킬 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 항체는 비변형된 항체와 비교하여 비표적화된 조직의 감소된 염색을 나타낸다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 비변형된 항체보다 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 7배, 또는 적어도 10배, 또는 적어도 20배, 또는 적어도 30배, 또는 적어도 40배, 또는 적어도 50배, 또는 적어도 60배, 또는 적어도 70배, 또는 적어도 80배, 또는 적어도 90배, 또는 적어도 100배, 또는 적어도 200배 더 낮은, 비표적화된 조직의 감소된 염색을 나타낸다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 비변형된 항체에 비하여 적어도 10% 만큼, 또는 적어도 20% 만큼, 또는 적어도 30% 만큼, 또는 적어도 40% 만큼, 또는 적어도 50% 만큼, 또는 적어도 60% 만큼, 또는 적어도 70% 만큼, 또는 적어도 80% 만큼, 또는 적어도 90% 만큼, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 적어도 200% 만큼, 또는 적어도 300% 만큼, 또는 적어도 400% 만큼, 또는 적어도 500% 만큼 감소된, 비표적화된 조직의 감소된 염색을 나타낸다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 항체는 비변형된 항체와 비교하여 감소된 항체 관련 독성을 나타낸다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 비변형된 항체보다 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 7배, 또는 적어도 10배, 또는 적어도 20배, 또는 적어도 30배, 또는 적어도 40배, 또는 적어도 50배, 또는 적어도 60배, 또는 적어도 70배, 또는 적어도 80배, 또는 적어도 90배, 또는 적어도 100배, 또는 적어도 200배 더 낮은 독성을 나타낸다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 비변형된 항체에 비하여 적어도 10% 만큼, 또는 적어도 20% 만큼, 또는 적어도 30% 만큼, 또는 적어도 40% 만큼, 또는 적어도 50% 만큼, 또는 적어도 60% 만큼, 또는 적어도 70% 만큼, 또는 적어도 80% 만큼, 또는 적어도 90% 만큼, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 적어도 200% 만큼, 또는 적어도 300% 만큼, 또는 적어도 400% 만큼, 또는 적어도 500% 만큼 감소된 독성을 나타낸다.
5.5 내재화( internalizing) 항체
본 발명의 항체는 추가로 항체를 세포 내로 운반하면서 내재화할 수 있는, 세포 표면 항원에 결합할 수 있다. 일단 세포내에 존재하게 되면, 항체는 세포질 내로 방출되고, 특정 구획에 표적되거나, 세포 표면으로 재순환될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항체는 내재화하는 세포 표면 항원에 결합한다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 특정 세포소기관 또는 구획에 표적화될 수 있다. 추가의 다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 내재화된 후 세포 표면 또는 주변부로 재순환될 수 있다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 IFNAR1에 특이성을 띤다.
항체의 내재화는 예로서, 실시예 34에 제시된 것과 같이, 당업계에서 인정받은 기법을 통해 측정될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 내재화 정도는 세포에 결합한 전체 항체 비율(%)로서 나타낸다. 다른 실시태양에서, 항체 내재화 정도는 비특이 대조군 항체와의 비교로 나타낸다. 다른 실시태양에서, 항체 내재화 정도는 내재화되지 않은 세포 표면 항원에 결합한 항체와의 비교로 나타낸다. 추가의 다른 실시태양에서, 항체 내재화 정도는 항체 분해와 상관관계에 있다. 추가의 다른 실시태양에서, 항체 내재화 정도는 세포질 대 세포 표면 염색의 비율로서 나타낸다.
하나의 실시태양에서, 일단 결합한 본 발명의 항체는 비특정 대조군 항체보다 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 110%, 적어도 약 130%, 적어도 약 140%, 적어도 약 150%, 적어도 약 160%, 또는 적어도 약 170% 더 많이 세포 내로 내재화된다.
또다른 실시태양에서, 일단 결합한 본 발명의 항체는 비특정 대조군 항체보다 1-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-100%, 100-110%, 110-120%, 120-130%, 130-140%, 140-150%, 150-160%, 160-170% 더 많이 세포 내로 내재화된다.
또다른 실시태양에서, 일단 결합한 본 발명의 항체는 2차 항체를 사용하여 이루어진 내재화 분석법에 의해 측정된 바, 대조군 항체보다 1-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%,40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-100%, 100-110%, 110-120%, 120-130%, 130-140%, 140-150%, 150-160%, 160-170% 더 많이 세포 내로 내재화된다.
5.6 인간 Fc 영역의 3차 구조
본 발명은 또한, Fc-TM으로 명시되는 인간 Fc 영역이 문헌 [Kabat]에 기재되어 있는 것과 같은 EU 인덱스에 의해 번호화된 L234F, L235E 및 P331S라는 아미노산 치환을 포함하고 감소되거나 제거된 효과기(ADCC 및/또는 CDC) 기능, 감소되거나 제거된 Fc 수용체에의 결합, 및/또는 감소되거나 제거된 독성을 나타내는 것인, 인간 IgG Fc 영역의 결정질 형태도 제공한다. 특정 실시태양에서, 결정은 유닛 셀이 a=50.18, b=147.30 및 c=75.47인, 사방결정계 공간군 C2221을 특징으로 한다. 특정 실시태양에서, 결정은 결정질 폴리펩티드(들)의 3차원 X선 회절 구조가 고해상도로, 바람직하게는 약 3 Å 초과의 해상도로, 전형적으로는 약 2 Å 내지 약 3 Å 범위의 해상도로 측정될 수 있도록 양질의 회절을 나타낸다.
본 발명은 추가로 Fc-TM 결정의 고해상 3차원 구조 및 원자 구조 좌표를 제공한다. 결정 및 구조 좌표를 수득하는 데 사용되는 구체적인 방법은 하기 실시예에서 제공한다.
C2221 형태의 결정으로부터 2.3 Å 해상도까지로 수득되는, 결정질 Fc-TM의 원자 구조 좌표가 표 6에 열거되어 있다. 236번 내지 445번 위치에 있는 모든 잔기는 전자 밀도로 추적될 수 있고, L234F 및 L235E 돌연변이를 비롯한 236번 위치 앞의 힌지 잔기에 대해서는 어떤 전자 밀도도 관찰되지 않았다. 331번 위치에 있는 전자 밀도는 세린에 상응하였다.
Fc-TM의 전반적인 3차원 구조는 앞서 보고된 바 있는 비리간드형 인간 Fc 영역의 구조와 매우 유사하였다(문헌 ([Deisenhofer, (1981). Biochemistry, 20, 2361-2370]; [Krapp et al, (2003). J. Mol. Biol. 325, 979-989]; [Matsumiya et al, (2007). J. Mol. Biol. 368, 767-779]; [Oganesyan et al, (2007) Molecular Immunology, December 11, 2007, in press])). 개별적으로 고려하였을 때, Fc-TM CH2 및 CH3 도메인은 기타 다른 비리간드형, 비돌연변이형의 인간 Fc 구조와 비교하였을 때에 큰 구조상의 보존성과 강직성을 나타내었다.
구조 정보는 생물학적 특성을 변경시키는 항IFNAR 항체를 스크리닝, 디자인 또는 동정하는 각종 전산 방법 또는 컴퓨터를 기반으로 하는 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 구조 정보로부터 얻은 결정 및 구조 좌표를 사용하여 Fc 수용체에의 결합을 감소 또는 제거시키거나, 효과기 (ADCC 및/또는 CDC) 기능을 감소 또는 제거시키거나, 독성을 감소 또는 제거시키는 Fc 영역에서의 아미노산 부가, 치환 또는 결실을 스크리닝, 디자인 또는 동정할 수 있다.
일단 상기 방법에 의해서 항체를 디자인하거나 선택하였다면, 그의 효과기 기능, Fc 수용체에의 결합, 또는 독성을 시험할 수 있고, 당업자에게 공지되어 있는 임의의 방법에 의해서 최적화시킬 수 있다. 예시적인 방법은 상기 섹션 5.1-5.4에 기술되어 있다.
본 발명은 또한 Fc-TM의 구조 정보를 사용함으로써 디자인되거나 선택되고, 원하는 생물학적 활성을 보이는 항IFNAR1 항체도 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 그러한 항체는 L234F, L235E, 및 P331S라는 돌연변이를 갖는 Fc 영역을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 그러한 항체는 아미노산 잔기 234, 235, 및 331 이외의 아미노산 잔기에 하나 이상의 부가, 치환, 또는 결실을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
5.7 항 IFNAR1 항체
하나의 실시태양에서, 본 발명의 항체는 IFNAR1에 특이적이다(즉, 특이적으로 결합한다). 그러한 항체는 또한 "본 발명의 항IFNAR1 항체"로도 지칭될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 인간 IFNAR1에 특이적이다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 인간 이외의 다른 종으로부터 유래된 IFNAR1과, 또는 인간 IFNAR1과 구조적으로 관련이 있는 기타 다른 단백질(예를 들면, 인간 IFNAR1 동족체)과 교차 반응할 수 있다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 오직 인간 IFNAR1에만 특이적일 수 있고, 종 또는 기타 다른 유형의 교차 반응성을 나타내지 않을 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 Fc 리간드에 대한 감소된 결합 친화성을 나타내고, 하기 특성들 중 적어도 하나를 갖는다: 비변형된 항체와 비교하여 감소되거나 제거된 효과기(ADCC 및/또는 CDC) 기능, 감소되거나 제거된 Fc 리간드에의 결합, 또는 감소되거나 제거된 독성.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 L234F, L235E, 및 P331S로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 부가, 치환 또는 결실을 포함한다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 Fc 영역의 아미노산 치환: L234F, L235E, 및 P331S를 포함한다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 IgG 이소형 항체이다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 IgG4 서브부류의 것이다. 추가의 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 IgG4 항체는 Fc 영역의 아미노산 치환 L235E를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 IgG4 항체는 또한 안정성 증가와 상관 관계에 있는 아미노산 변화를 포함한다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 IgG4 항체는 추가로 Fc 영역의 아미노산 치환 S228P를 포함한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 비변형된 항체와 비교하여, Fc 수용체(예를 들면, 제한하는 것은 아니지만, FcγRI(CD64)(이소폼 FcγRIA, FcγRIB, 및 FcγRIC 포함); FcγRII(CD32)(이소폼 FcγRIIA, FcγRIIB, 및 FcγRIIC 포함); 및 FcγRIII(CD16)(이소폼 FcγRIIIA 및 FcγRIIB 포함))에 대하여 감소되거나 제거된 결합 친화성을 나타낸다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR 1 항체는 비변형된 항체에 비하여 FcγRI에 대해 감소된 친화성을 나타낸다. 또다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 비변형된 항체에 비하여 FcγRIIIA 수용체에 대해 감소된 친화성을 나타낸다. 또다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 비변형된 항체에 비하여 감소된 FcγRIIIA의 F158V 대립유전자에의 친화성을 나타낸다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 C1q에 대하여 감소되거나 제거된 결합 친화성을 나타낸다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 비변형된 항체에 비하여 FcγRI에의 감소된 친화성을 나타낸다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 감소되거나 제거된 효과기 기능을 나타낸다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 감소되거나 제거된 ADCC 및/또는 CDC 활성을 나타낸다. 또다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 감소되거나 제거된 독성을 나타낸다.
5.7.1 항 IFNAR1 항체 서열
하나의 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 각각 본원의 도 1A, 2A, 3A, 4A 및 도 1B, 2B, 3B, 4B에서 제공한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 각각 본원의 도 1A, 2A, 3A, 4A 및 도 1B, 2B, 3B, 4B에서 제공한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체의 선택된 서열은 미국 특허 번호 제5,919,453호, 미국 특허 출원 시리얼 번호 제10/831,459호, 제10/182,058호, 제11/157,494호, 및 제11/521,102호(이들 각각은 전문이 모든 목적을 위해서 참고로 인용된다)에서 살펴볼 수 있다. 대체 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체의 서열은 미국 특허 번호 제5,919,453호, 미국 특허 출원 시리얼 번호 제10/831,459호, 제10/182,058호, 제11/157,494호, 및 제11/521,102호에서 살펴볼 수 있는 서열을 포함하지 않는다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 미국 특허 가출원 시리얼 번호 제 60/842,925호(2006년 9월 8월 출원); 제60/866,917호(2006년 11월 22일 출원); 제60/911,397호(2007년 4월 12일 출원); 제60/915,309호(2007년 5월 22일 출원); 미국 특허 출원 시리얼 번호 제11/852,106(2007년 9월 7일 출원); 및 PCT 출원 시리얼 번호 US2007/07791(2007년 9월 7일 출원)(이들 각각은 전문이 모든 목적을 위해서 참고로 인용된다)에 개시되어 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 또한 3F11, 11E2, 4G5, 및 9D4 항체의 중쇄 가변 및/또는 경쇄 가변의 아미노산 서열(서열에 대해서는 도 1-4를 참조한다)과 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 중쇄 가변 및/또는 경쇄 가변의 아미노산 서열을 포함하는 항체를 포함한다.
본원에서 언급되는 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region) 잔기 번호는 문헌 [Kabat et al. (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA)]의 것임을 이해할 것이다. 특히, 경쇄 가변 도메인에서 잔기 24-34(CDR1), 50-56(CDR2) 및 89-97(CDR3) 및 중쇄 가변 도메인에서 31-35(CDR1), 50-65(CDR2) 및 95-102(CDR3)가 있다. CDR은 항체마다 상당히 다를 수 있다는 것(그리고, 정의에 의해 카바트(Kabat) 공통 서열과 상동성을 나타내지 않을 수 있다는 것)에 주의한다. Fv 영역에 대해 사용하고자 하는 경우, 골격 잔기는 빈번하게는 최대로 배열될 수 있도록 번호화 체계에 "스페이서" 잔기의 삽입을 필요로 할 수 있다. 본원에서 언급되는 CDR은 문헌 [Kabat et al. 상기 문헌 동일]의 것임을 이해할 것이다. 또한, 임의의 주어진 카바트 부위 번호에 있는 특정 개개의 잔기의 동일성은 종간 또는 대립형질 발산에 기인하여 항체에 따라 달라질 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 표 2에 열거된 VH CDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 VH CDR을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 표 2에 열거된 VL CDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 VL CDR을 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 표 2에 열거된 VH CDR 중 하나 이상 및 VL CDR 중 하나 이상을 포함한다. 추가의 다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 표 2에 열거된 VH CDR 및 VL CDR의 임의의 조합을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 표 2로부터 선택된 적어도 1개, 또는 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개의 CDR을 포함할 수 있다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 각각이 1, 2, 또는 3개의 CDR을 포함하는 것인 VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 표 2에 열거된 1, 2, 또는 3개의 중쇄 CDR(CDRH#)을 추가로 포함하는 VH를 포함할 수 있다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 표 2에 열거된 1, 2, 또는 3개의 경쇄 CDR(CDRL#)을 추가로 포함하는 VL을 포함할 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 항체 3F11의 CDR을 포함한다(예를 들면, 표 2 참조). 또다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 항체 4G5의 CDR을 포함한다(예를 들면, 표 2 참조). 또다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 항체 11E2의 CDR을 포함한다(예를 들면, 표 2 참조). 추가의 또다른 특정 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 항체 9D4의 CDR을 포함한다(예를 들면, 표 2 참조).
Figure 112010058184517-pct00002
Figure 712016003505178-pct00190
하나의 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 도 1, 2, 3, 또는 4에 제시되어 있는 중쇄 가변 및/또는 경쇄 가변과 비교하여 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개, 또는 적어도 20개의 아미노산 치환, 부가, 또는 결실을 포함하는 중쇄 가변 및/또는 경쇄 가변의 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 표 2에 열거된 하나 이상의 CDR 중 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 10개의 아미노산 치환, 결실, 또는 부가를 갖는 하나 이상의 CDR을 포함한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 엄격한 조건하에서 도 1, 2, 3, 또는 4에 제시되어 있는 뉴클레오티드 서열과 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 항체를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 엄격한 조건하에서 도 1, 2, 3, 또는 4에 열거된 하나 이상의 CDR의 뉴클레오티드 서열과 하이브리드화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 하나 이상의 CDR을 포함한다. 엄격한 하이브리드화 조건은 고도로 엄격한 조건인 경우, 약 45℃에서 6X 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC) 중 필터에 결합된 DNA에 하이브리드화시킨 후, 약 50-65℃에서 0.2X SSC/0.1% SDS 중 1회 이상 세척하는 것, 예로서, 약 45℃에서 6X SSC 중 필터에 결합된 DNA에 하이브리드화시킨 후, 약 60℃에서 0.1X SSC/0.2% SDS 중 1회 이상 세척하는 것, 또는 당업자에게 공지된(예를 들면, 문헌 [Ausubel, F. M. et al, eds. 1989 Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley and Sons, Inc., NY at pages 6.3.1 to 6.3.6 and 2.10.3] 참조) 임의의 기타 다른 엄격한 하이브리드화 조건을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 항체 3F11, 11E2, 4G5, 또는 9D4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(도 1-4 참조)과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 항체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
5.7.2 항 IFNAR1 결합 친화성
특정 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 IFNAR1에 대하여 고도한 결합 친화성을 나타낸다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 적어도 105 M-1s-1, 적어도 5x105 M-1s-1, 적어도 106 M-1s-1, 적어도 5x106 M-1s-1, 적어도 107 M-1s-1, 적어도 5x107 M-1s-1, 적어도 108 M-1s-1의 결합 속도(K온)를 나타낸다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 적어도 2x105 M-1s-1, 적어도 5x105 M-1s-1, 적어도 106 M-1s-1, 적어도 5x106 M-1s-1, 적어도 107 M-1s-1, 적어도 5x107 M-1s-1, 적어도 108 M-1s-1의 K온을 나타낸다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 10-1s-1 미만, 5x10-1s-1 미만, 10-2 s-1 미만, 5x10-2 s-1 미만, 10-3 s-1 미만, 5x10-3 s-1 미만, 10-4 s-1 미만, 5x10-4 s-1 미만, 10-5 s-1 미만, 5x10-5 s-1 미만, 10-6 s-1 미만, 5x10-6 s-1 미만, 10-7 s-1 미만, 5x10-7 s-1 미만, 10-8 s-1 미만, 5x10-8 s-1 미만, 10-9 s-1 미만, 5x10-9 s-1 미만, 10-10 s-1 미만의 해리 속도(K오프)를 나타낸다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 5x10-4 s-1 미만, 10-5 s-1 미만, 5x10-5 s-1 미만, 10-6 s-1 미만, 5x10-6 s-1 미만, 10-7s-1 미만, 5x10-7 s-1 미만, 10-8 s-1 미만, 5x10-8 s-1 미만, 10-9 s-1 미만, 5x10-9 s-1 미만, 10-10 s-1 미만 K오프를 나타낸다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 적어도 102 M-1, 적어도 5x102 M-1, 적어도 103 M-1, 적어도 5x103 M-1, 적어도 104 M-1, 적어도 5x104 M-1, 적어도 105 M-1, 적어도 5x105 M-1, 적어도 106 M-1, 적어도 5x106 M-1, 적어도 107 M-1, 적어도 5x107 M-1, 적어도 108 M-1, 적어도 5x108 M-1, 적어도 109 M-1, 적어도 5x109 M-1, 적어도 1010 M-1, 적어도 5x1010 M-1, 적어도 1011 M-1, 적어도 5x1011 M-1, 적어도 1012 M-1, 적어도 5x1012 M-1, 적어도 1013 M-1, 적어도 5x1013 M-1, 적어도 1014 M-1, 적어도 5x1014 M-1, 적어도 1015 M-1, 적어도 5x1015 M-1의 친화성 상수 또는 Ka(K온/K오프)를 나타낸다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 10-2 M-1 미만, 5x10-2 M-1 미만, 10-3 M-1 미만, 5x10-3 M-1 미만, 10-4 M-1 미만, 5x10-4 M-1 미만, 10-5 M-1 미만, 5x10-5 M-1 미만, 10-6 M-1 미만, 5x10-6 M-1 미만, 10-7 M-1 미만, 5x10-7 M-1 미만, 10-8 M-1 미만, 5x10-8 M-1 미만, 10-9 M-1 미만, 5x10-9 M-1 미만, 10-10 M-1 미만, 5x10-10 M-1 미만, 10-11 M-1 미만, 5x10-11 M-1 미만, 10-12 M-1 미만, 5x10-12 M-1 미만, 10-13 M-1 미만, 5x10-13 M-1 미만, 10-14 M-1 미만, 5x10-14 M-1 미만, 10-15 M-1 미만, 5x10-15 M-1 미만의 해리 상수 또는 Kd(K오프/K온)를 나타낸다.
5.7.3 인터페론 알파 서브타입 특이성
하나의 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 IFNAR1에의 결합을 차단하고/거나, IFNα, IFNβ, 및 IFNω를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 하나 이상의 I형 인터페론(IFN)의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는 능력을 나타낸다. IFNα 서브타입의 결합은 통상적인 경쟁 분석법, 예로서, 문헌 [Antibody: A Laboratory Manual, CSHL]에 기재되어 있는 방법에 의해 측정될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 IFNAR1에의 결합을 차단하고/거나, IFNα, IFNβ, 및 IFNω를 포함하나, 이에 한정되지 않는 것의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는 능력을 나타낸다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 IFNAR1에의 결합을 차단하고/거나, IFNα 서브타입 1, 2a, 2b, 4, 4b, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 및 21을 포함하나, 이에 한정되지 않는, IFNα의 하나 이상의 서브타입의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는 능력을 나타낸다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 IFNAR1에의 결합을 차단하고/거나, IFNα의 모든 서브타입의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는 능력을 나타낸다. 이와 관련하여, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 IFNα 서브타입 IFNα 1, 2a, 2b, 4, 4b, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 및 21에의 결합을 차단하고/거나, 그의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는 능력을 나타낸다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 IFNAR1에의 결합을 차단하고/거나, IFNα 서브타입 1, 2a, 2b, 4, 4b, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 및 21을 포함하나, 이에 한정되지 않는, IFNα의 하나 이상의 서브타입의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는 능력을 나타내지 않는다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 IFNAR1에의 결합을 차단하고/거나, IFNα21을 제왼한, IFNα의 모든 서브타입의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는 능력을 나타낸다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 IFNAR1에의 결합을 차단하고/거나, 하기 IFNα 서브타입: 1, 2a, 2b, 4, 4b, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 및 21 중 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 또는 적어도 13개의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는 능력을 나타낸다. 대체 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 IFNAR1에의 결합을 차단하고/거나, 하기 IFNα 서브타입: 1, 2a, 2b, 4, 4b, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 및 21 중 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 또는 적어도 13개의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는 능력을 나타내지 않는다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 IFNAR1에의 결합을 차단하고/거나, 비천연적으로 발생된 I형-유사 인터페론의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는 능력을 나타낸다. 상기와 같이 비천연적으로 발생된 I형-유사 인터페론, 또는 하이브리드 I형-유사 인터페론은 재조합 또는 합성 기법에 의해 그의 천연적으로 발생된 구조로부터 변경된 구조를 나타낸다. 미국 특허 번호 제7,232,563호에 기재되어 있는 하이브리드 인터페론은 효능은 증가하고/거나 독성은 감소된 분자가 형성되도록, 천연적으로 발생된 인터페론 구조의 각종 세그먼트를 대체시킨 분자 대체물을 나타낸다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 IFNAR1에의 결합을 차단하고/거나, 돌연변이화된 I형 인터페론의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는 능력을 나타낸다. 돌연변이화된 I형 인터페론은 미국 특허 번호 제6,299,870호 및 제6,300,474호(상기 문헌의 전문이 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.
추가의 다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 IFNAR1에의 결합을 차단하고/거나, 기타 다른 동물 종으로부터 유래된 I형-유사 인터페론의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는 능력을 나타낸다. 상기와 같은 I형-유사 인터페론은 닭, 고양이, 마우스, 래트, 토끼, 염소, 말 또는 기타 다른 동물 종으로부터 단리된 것이다. 특정 실시태양에서, 인간 I형 인터페론은 닭, 고양이, 마우스, 래트, 토끼, 염소, 말 또는 기타 다른 동물 종으로부터 유래된 세포로부터 단리된 것이다. 다른 실시태양에서, 인간 I형 인터페론은 닭, 고양이, 마우스, 래트, 토끼, 염소, 말 또는 기타 다른 동물 종으로부터 유래된 경우, 상이한 글리코실화 패턴을 수반한다. 기타 다른 동물 종으로부터 유래된 인터페론에 관한 추가 논의는 WIPO 공개 번호 WO06099451 A3(본원에서 참고로 인용된다)에서 살펴볼 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, IFNα의 활성을 중화시킬 수 있는 본 발명의 항IFNAR1 항체의 능력은 예를 들면, WO 95/14930(1995년 1월 1일 공개)에 기재되어 있는 키나제 수용체 활성화(KIRA: Kinase Receptor Activatio) 분석법으로 IFNAR1/R2 수용체 복합체의 티로신 인산화(리간드 결합으로부터 일어나는 티로신 인산화)를 감소시킬 수 있는 후보 항체의 능력을 측정함으로써 모니터링할 수 있다.
별법으로, 또는 임의로, 본 발명의 목적을 위해, IFNα에 의한 세포 반응 유발을 중화시킬 수 있는 본 발명의 항IFNAR1 항체의 능력은 문헌 ([Kawade, J. Interferon Res. 1:6170 (1980)], 또는 [Kawade and Watanabe, J. Interferon Res. 4:571 584 (1984)], 또는 ]Yousefi, et al, Am. J. Clin. Pathol. 83: 735 740 (1985)])에 기재되어 있는 바와 같이, IFNα의 항바이러스 활성의 중화를 모니터링하거나, 문헌 [Kurabayashi et al., Mol. Cell Biol, 15: 6386 (1995)]에 기재되어 있는 바와 같이, 전기 영동상 변화 분석법으로 신호전달 분자인 인터페론 자극 인자 3(ISGF3: interferon-stimulated factor 3)이 인터페론 자극 반응 요소(ISRE: interferon-stimulated response element)로부터 유래된 올리고 뉴클레오티드에 결합하는 것을 활성화시킬 수 있는 IFNα의 능력을 중화시킬 수 있는 본 발명의 항IFNAR1 항체의 능력을 시험함으로써 시험할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 IFNAR1 수용체의 적어도 하나의 IFNα 매개된 기능을 억제시킬 수 있는 능력을 나타낸다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 IFNα 또는 그의 서브타입에 대한 반응에서 IFNAR1 수용체의 활성을 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 만큼 억제시킨다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 상기 기술된 KIRA 분석법에 의해 측정되는 바, IFNα 또는 그의 서브타입에 대한 반응에서 IFNAR1 수용체의 활성을 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 만큼 억제시킨다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 문헌 [Kurabayashi et al., Mol. Cell Biol, 15: 6386 (1995)]에 기재된 바와 같이, 전기 영동상 변화 분석법으로 신호전달 분자인 인터페론 자극 인자 3 (ISGF3)이 인터페론 자극 반응 요소(ISRE)로부터 유래된 올리고 뉴클레오티드에 결합함으로써 측정되는 바, IFNα 또는 그의 서브타입에 대한 반응에서 IFNAR1 수용체의 활성을 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 만큼 억제시킨다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 당업계에 공지된 분석법에 의해 측정된 바, IFNα 또는 그의 서브타입에 대한 반응에서 IFNAR1 수용체의 활성을 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 만큼 억제시킨다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 IFNα 또는 그의 서브타입의 항바이러스 특성을 중화시킬 수 있는 능력을 나타낸다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 문헌 ([Kawade (1980)] 또는 [Yousefi (1985)])의 항바이러스 분석법에 의해 측정된 바, IFNα 또는 그의 서브타입의 항바이러스 활성을 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 중화시킨다. 대체 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 IFNα 또는 그의 서브타입의 항바이러스 특성을 중화시키지 못한다.
본 발명의 목적을 위해, IFNα 또는 그의 서브타입이 IFNAR1에 결합하는 것을 차단시킬 수 있는 본 발명의 항IFNAR1 항체의 능력은 통상의 경쟁 분석법, 예로서, 문헌 [Antibody: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재되어 있는 분석법에 의해 측정될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 하기 IFNα 서브타입: 1, 2, 4, 5, 8, 10, 및 21이 IFNAR1에 결합하는 것을 차단하거나 억제시킬 수 있는 능력을 나타낸다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 하기 IFNα 서브타입: 1, 2, 4, 5, 8, 10, 및 21 중 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 또는 적어도 7개의 서브타입이 IFNAR1에 결합하는 것을 차단하거나 억제시킬 수 있는 능력을 나타낸다.
본 발명의 항체는 IFNAR에 작용함으로써 IFN-I 반응성 유전자를 조절할 수 있다. IFN-I 반응성 유전자는 발명의 명칭이 "IFN alpha-induced Pharmacodynamic Markers"이며, 하기 시리얼 번호를 갖는 미국 특허 출원: 60/873,008(2006년 12월 6일 출원); 60/907,762(2007년 4월 16일 출원); 60/924, 584(2007년 5월 21일 출원); 60/960,187(2007년 9월 19일 출원); 60/966, 176(2007년 11월 5일 출원)과, PCR 출원 시리얼 번호 PCT/US2007/02494(2007년 12월 6일 출원)(이들 각각의 전문이 참고로 인용된다)에서 확인된 바 있다.
5.7.4 항체
본 발명의 항체는 모노클로날 항체, 다중특이적 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 카멜화된 항체, 키메라 항체, 단일 쇄 Fv(scFv: single-chain Fv), 디설피드-결합 Fv(sdFv: disulfide-linked Fv), 및 항이디오타입 (항Id) 항체, 및 상기 중 어느 것의 에피토프 결합 단편을 포함할 수 있다. 특히, 항체는 면역글로불린 분자, 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 단편, 즉, 항원 결합 부위를 포함하는 분자를 포함하는데, 이들 단편은 Fc 영역 또는 그의 단편을 포함하나, 이에 한정되지 않는 또다른 면역글로불린 도메인에 융합될 수 있거나, 융합되지 않을 수 있다. 본원에서 개략적으로 설명된 바와 같이, "항체(antibody and antibodies)"라는 용어는 구체적으로 본워에 기술된 변형된 항체를 포함한다. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예로서, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예로서, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브부류의 것일 수 있다. 본 발명의 항체는 임의 이소형의 것일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형의 것일 수 있다. 본 발명의 항체는 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 전장 항체일 수 있거나, 그의 항원 결합 단편, 예로서, 단일 쇄 항체일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 항체의 "항원 결합 단편"(또는 간단하게, "항체 단편")이라는 용어는 항원(예로서, IFNAR1)에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 "항원 결합 단편"이라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에 디설피드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 구성되는 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(문헌 [Ward et al., (1989) Nature 341 :544-546]); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 추가로, Fv 단편의 두 도메인, VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 코딩되기는 하지만, 이들은 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자(단일 쇄 Fv(scFv)로서 알려져 있는 분자)를 형성하는 단백질 단쇄로서 만들어지도록 할 수 있는 합성 링커에 의해, 재조합 방법을 이용하여 결합될 수 있다(예로서, 문헌 ([Bird et al.(1988) Science 242:423-426]; 및 [Huston et al.(1988) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:5879-5883])을 참조한다). 그러한 단일 쇄 항체 또한 용어 항체의 "항원 결합 단편"이라는 용어 내에 포함시키고자 한다. 이러한 항체 단편은 당업자에게 공지되어 있는 종래 기법을 사용함으로써 수득할 수 있고, 이러한 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대하여 스크리닝된다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질과 동일한 아미노산 서열은 갖지만, Fc 영역에의 적어도 하나의 아미노산 잔기의 부가, 치환, 또는 결실은 포함하지 않는 Fc 영역과 비교하여, 효과기 기능 촉진을 담당하는 Fc 리간드에 대한 친화성이 감소되거나 제거된, 변형된 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질(이하 본원에서 "본 발명의 융합 단백질"로서 언급된다)을 제공한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 융합 단백질은 변형된 Fc 영역에 융합된 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 스캐폴드, scFv, dsFv, 디아바디, Tandab, 또는 항체 모방체를 포함할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 융합 단백질은 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 스캐폴드, scFv, dsFv, 디아바디, Tandab, 또는 항체 모방체를 변형된 Fc 영역에 연결시키는 링커 영역을 포함한다. 폴리펩티드를 신규의 연결된 융합 폴리펩티드로 연결시키는 천연적으로 발생된 펩티드 뿐만 아니라, 인공 펩티드의 용도를 문헌에서 잘 알 수 있다(문헌 [Hallewell et al. (1989), J. Biol. Chem. 264, 5260-5268]; [Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8, 725-731]; [Robinson & Sauer (1996), Biochemistry 35, 109-116]; [Khandekar et al. (1997), J. Biol. Chem. 272, 32190-32197]; [Fares et al. (1998), Endocrinology 139, 2459-2464]; [Smallshaw et al. (1999), Protein Eng. 12, 623-630]; 미국 특허 번호 제5,856,456호).
하나의 실시태양에서, 본 발명의 융합 단백질은 234, 235, 및 331(여기서, 불변 영역의 번호화 체계는 문헌 [Kabat et al. (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA)]에 기재되어 있는 것과 같은 EU 인덱스의 것이다)로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기의 적어도 하나의 부가, 치환, 또는 결실을 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 융합 단백질은 L234F, L235E, 및 P331S로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 잔기를 포함하는 Fc 영역을 포함한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 융합 단백질은 추가로 융합 단백질의 안정성 증가와 상호관련이 있는 아미노산 잔기의 적어도 하나의 부가, 치환, 또는 결실을 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 아미노산 잔기의 부가, 치환, 또는 결실은 Fc 영역의 228번 위치(여기서, 불변 영역의 번호화 체계는 문헌 [Kabat et al.])에 기재되어 있는 것과 같은 EU 인덱스의 것이다)에서 이루어진다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 융합 단백질은 228번 위치에서의 아미노산 치환(여기서, 치환은 세린 잔기이다)을 포함하는 Fc 영역을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항체 또는 융합 단백질은 하나 이상의 공학처리된 글리코형태, 즉, Fc 영역을 포함하는 분자에 공유 결합된 당질 조성물을 포함한다. 공학처리된 글리코형태는 효과기 기능을 감소시키는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 목적에 유용할 수 있다. 공학처리된 글리코형태는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들면, 공학처리된 발현 균주 또는 변이체 발현 균주의 사용에 의해, 하나 이상의 효소, 예를 들면 DI N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnTI11)과의 공발현에 의해, 각종 유기체 또는 각종 유기체로부터의 세포주에서 Fc 영역을 포함하는 분자를 발현시킴으로써, 또는 Fc 영역을 포함하는 분자의 발현 이후 당질(들)을 변형시킴으로써 생성될 수 있다. 공학처리된 글리코형태를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 이는 (문헌 ([Umana et al, 1999, Nat . Biotechnol 17:176-180]; [Davies et al, 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294]; [Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740]; [Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473)]; 미국 특허 번호 제6,602,684호; 미국 시리얼 번호 제10/277,370호; 미국 시리얼 번호 제10/113,929호; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1)에 기재되어 있는 것; 포틸레젠트(Potillegent)™기술(뉴저지주 프린스턴 소재의 바이오와 인크.(Biowa, Inc.)); 글리코(Glyco) MAb™ 글리코실화 공학처리 기술(스위스 취리히 소재의 글리카트 바이오테크놀러지 아게(GLYCART biotechnology AG))을 포함하나, 이에 한정되지 않는다(상기 문헌 각각의 전문이 본원에서 참고로 인용된다). 예로서, WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; [Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49](이들 각각의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)를 참조한다.
5.7.5 항체 접합체
본 발명은 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 융합 단백질, 핵산 분자, 소분자, 모방제, 합성 약물, 무기 분자, 및 유기 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 이상의 부분에 접합되거나 융합된, 항체 또는 그의 단편의 용도를 포함한다.
본 발명은 융합 단백질을 생성하기 위해 이종 단백질 또는 폴리펩티드에(또는 그의 단편에, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90 또는 적어도 100개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드에) 재조합적으로 융합되거나, 화학적으로 접합된(공유 및 비공유 접합, 둘 모두 포함) 항체 또는 그의 단편의 용도를 포함한다. 융합이 반드시 직접 이루어질 필요는 없고, 링커 서열을 통해 일어날 수 있다. 예를 들면, 항체를 특정 세포 표면 수용체에 대하여 특이적인 항체에 융합시키거나 접합시킴으로써 시험관내에서 또는 생체내에서 이종 폴리펩티드를 특정 세포 유형에 표적하는 데 항체를 사용할 수 있다. 이종 폴리펩티드에 융합되거나 접합된 항체는 또한 당업계에 공지된 방법을 사용하는 시험관내 면역분석법 및 정제 방법에 사용될 수 있다. 예로서, 국제 공개 번호 WO 93/21232; 유럽 특허 번호 EP 439,095; [Naramura et al., 1994, Immunol. Lett. 39:91-99]; 미국 특허 번호 제5,474,981호; [Gillies et al., 1992, PNAS 89:1428-1432]; 및 [Fell et al., 1991, J. Immunol. 146:2446-2452](이들의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)를 참조한다.
추가적인 융합 단백질은 유전자 셔플링, 모티프-셔플링, 엑손 셔플 링 및/또는 코돈 셔플링(총칭하여 "DNA 셔플링"이라고 지칭한다)의 기법을 통해 생성될 수 있다. DNA 셔플링을 사용하여 본 발명의 항체 또는 그의 단편의 활성을 변경시킬 수 있다(예를 들어, 친화성이 더 높고 해리 속도가 더 낮은 항체 또는 그의 단편). 일반적으로 미국 특허 번호 제5,605,793호; 제5,811,238호; 제5,830,721호; 제5,834,252호; 및 제5,837,458호, 및 문헌 [Patten et al, 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33]; [Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82]; [Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76]; 및 [Lorenzo and Blasco, 1998, Bio기법 24(2):308-313] (이들 특허 및 공개문헌 각각은 그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)을 참조한다. 항체 또는 그의 단편, 또는 코딩된 항체 또는 그의 단편은 재조합 전에 오류 유발 PCR, 무작위 뉴클레오티드 삽입 또는 기타 다른 방법들을 통한 무작위 돌연변이유발을 수행하여 변형시킬 수 있다. 그의 부분이 IFNAR1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 부분을 하나 이상의 이종성 분자의 하나 이상의 성분, 모티프, 절편, 부분, 도메인, 단편 등과 재조합시킬 수 있다.
또한, 항체 또는 그의 단편은 마커 서열, 예로서, 펩티드에 접합되어 정제를 용이하게 할 수 있다. 다른 실시태양에서, 마커 아미노산 서열은 헥사-히스티딘 펩티드로서, 상업적으로 이용가능한 다수의 벡터 중에서 특히 pQE 벡터에 제공되는 태그이다(캘리포니아주 91311 채스워스 에톤 애비뉴 소재의 QIAGEN, Inc.). 문헌 [Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824]에 기재된 바와 같이, 예를 들면, 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 위해 제공된다. 정제에 유용한 다른 펩티드 태그로는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응하는 헤마글루티닌 "HA" 태그(문헌 [Wilson et al., 1984, Cell 37:767]) 및 "플래스(Flag)" 태그를 포함한다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편, 유사체, 또는 유도체는 진단제 또는 검출 시약에 접합된다. 이러한 항체는 임상 시험 과정, 예컨대, 특정 요법의 효능을 측정하는 과정의 일부로서 염증성 질병의 발병 또는 진행을 모니터링하거나 또는 예측하는 데 유용할 수 있다. 그러한 진단 및 검출은 각종 효소, 예로서, 제한하는 것은 아니지만, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스터라제; 보결기, 예로서, 제한하는 것은 아니지만, 스트렙트아비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴; 형광성 물질, 예로서, 제한하는 것은 아니지만, 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린; 발광성 물질, 예로서, 제한하는 것은 아니지만, 루미놀; 생물발광성 물질, 예로서, 제한하는 것은 아니지만, 루시퍼라제, 루시페린 및 에쿠오린; 방사성 물질, 예로서, 제한하는 것은 아니지만, 요오드(131I, 125I, 123I, 121I), 탄소(14C), 황(35S), 트리튬(3H), 인듐(115In, 113In, 112In, 111In), 및 테크네튬(99Tc), 탈륨(201Ti), 갈륨(68Ga, 67Ga), 팔라듐(103Pd), 몰리브덴(99Mo), 제논(133Xe), 불소(18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, 및 117Tin; 다양한 양전자 방출 단층촬영기를 이용한 양전자 방출 금속, 및 비방사성 상자성 금속 이온, 및 특정 방사성동위원소에 방사표지되거나 접합된 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는 검출가능한 물질에 항체를 커플링시킴으로써 달성될 수 있다.
치료학적 부분을 항체에 접합시키는 기법은 잘 알려져 있으며, 예로서, 문헌 ([Arnon et al, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56. (Alan R. Liss, Inc. 1985)]; [Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)]; [Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)]; ["Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)], 및 [Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58])을 참조한다.
별법으로, 미국 특허 번호 제4,676,980호(Segal)(상기 문헌의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 기재된 바와 같이, 항체를 제2 항체에 접합시킴으로써 항체 이종접합체를 형성할 수 있다.
피험체에서 특정 질병에 대하여 원하는 예방학적 또는 치료학적 효과(들)을 얻기 위해 IFNAR1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편에 접합된 치료학적 부분 또는 약물을 선택할 수 있다. 임상의 또는 기타 다른 의료인은 하기 사항: 언제 어떤 치료학적 부위를, IFNAR1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편에 접합시켜야 할지 여부; 질환의 성질, 질환의 중증도, 및 피험체의 상태를 고려하여야 한다.
5.7.6 항체 생산 방법
항체 또는 그의 단편은 당업계에 공지되어 있는 임의의 항체 생산 방법, 특히 화학적 합성법 또는 재조합 발현 기법에 의해 생산할 수 있다.
모노클로날 항체는 하이브리도마, 재조합 및 파지 디스플레이 기술, 또는 그의 조합의 사용을 비롯한, 당업계에 공지된 매우 다양한 기법들을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌 ([Harlow et al, Antibody: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]; [Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibody and T-Cell Hybridoms 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)])(상기 문헌의 전문이 참고로 인용된다)에 교시되어 있는 기법을 비롯한, 하이브리도마 기법을 사용하여 생산할 수 있다. 본원에 사용된 바, "모노클로날 항체"라는 용어는 하이브리도마 기술을 통해 생성된 항체에 한정되지 않는다. 용어 "모노클로날 항체"라는 용어는 임의의 진핵 클론, 원핵 클론 또는 파지 클론을 비롯한, 단일 클론으로부터 유래되나, 생산 방법에 의한 것은 아닌 항체를 지칭한다.
하이브리도마 기술을 사용하여 특정 항체를 생산하고 스크리닝하는 방법은 통상적이며, 당업계에 공지되어 있다. 간략히 설명하면, 마우스를 IFNAR1로 면역화시킬 수 있고, 일단 면역 반응이 검출되면, 예로서, IFNAR1에 대해 특이적인 항체가 마우스 혈청에서 검출되고, 마우스 비장을 수거하고, 비장세포를 단리시킨다. 이어서, 주지된 기법에 의해 비장세포를 임의의 적합한 골수종 세포, 예를 들면, ATCC로부터 이용가능한 세포주 SP20으로부터의 세포에 융합시킨다. 하이브리도마를 선택하여 제한 희석법에 의해 클로닝한다. 이어서, 당업계에 공지된 방법에 의해 하이브리도마 클론을, 본 발명의 폴리펩티드와 결합할 수 있는 항체를 분비하는 세포인지 여부에 대해 분석한다. 일반적으로 고수준의 항체를 함유하는 복수액은 양성 하이브리도마 클론으로 마우스를 면역화시킴으로써 생산할 수 있다.
따라서, 모노클로날 항체는, IFNAR1로 면역화된 마우스로부터 단리된 비장세포를 골수종 세포와 융합시킨 후, IFNAR1에 결합할 수 있는 항체를 분리하는 하이브리도마 클론에 대한 융합체로부터 수득되는 하이브리도마를 스크리닝함으로써 생성되는 것인, 본 발명의 항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 배양함으로써 생성될 수 있다.
특이적인 특정 IFNAR1 에피토프를 인식하는 항체 단편은 당업자에게 공지된 임의의 기법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 Fab 및 F(ab')2 단편은 효소, 예를 들어, 파파인(Fab 단편을 생산) 또는 펩신(F(ab')2 단편을 생산)을 이용하여, 면역글로불린 분자의 단백분해성 절단에 의해 생산될 수 있다. F(ab')2 단편은 중쇄의 가변 영역, 경쇄 불변 영역, 및 CH1을 함유한다. 추가로, 본 발명의 항체는 또한 당업계에 공지된 다양한 파지 디스플레이 방법을 이용하여 생성될 수 있다.
파지 디스플레이 방법에 있어서, 기능성 항체 도메인은 이 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 보유하는 파지 입자의 표면 상에서 디스플레이된다. 특히, VH 및 VL 도메인을 코딩하는 DNA 서열은 동물 cDNA 라이브러리(예로서, 림프구성 조직의 인간 또는 뮤린 cDNA 라이브러리)로부터 증폭된다. VH 및 VL 도메인을 코딩하는 DNA는 scFv 링커와 함께 PCR에 의해 재조합되어, 파지미드 벡터(예로서, p CANTAB 6 또는 pComb 3 HSS) 내로 클로닝된다. 벡터를 E. 콜라이(E. Coli) 내로 전기천공시키고, E. 콜라이를 헬퍼 파지로 감염시킨다. 이들 방법에서 사용된 파지는 전형적으로 fd 및 M13을 포함한 섬유상 파지이고, VH 및 VL 도메인은 일반적으로 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII에 재조합적으로 융합된다. 관심의 대상이 되는 IFNAR1에 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파지는 항원, 예로서, 표지된 항원 또는 고체 표면이나 비드에 결합되거나 포획된 항원으로 선택되거나 동정될 수 있다. 본 발명의 항체 생산에 사용될 수 있는 파지 디스플레이법의 예로는 문헌 ([Brinkman et al, 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50]; [Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186]; [Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958]; [Persic et al., 1997, Gene 187:9-18]; [Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57: 191-280]; 국제 출원 번호 PCT/GB91/01134; 국제 공개 번호 WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, WO 95/20401, 및W097/13844; 및 미국 특허 번호 제5,698,426호, 제5,223,409호, 제5,403,484호, 제5,580,717호, 제5,427,908호, 제5,750,753호, 제5,821,047호, 제5,571,698호, 제5,427,908호, 제5,516,637호, 제5,780,225호, 제5,658,727호, 제5,733,743호 및 제5,969,108호(이들 각각의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 개시되어 있는 것을 포함한다.
상기 참고문헌에 기재된 바와 같이, 파지 선택 후, 파지로부터 유래하는 항체 코딩 영역을 단리하여, 인간 항체를 비롯한 전체 항체, 또는 기타 임의의 원하는 항원 결합 단편을 생성시키기 위해 사용할 수 있으며, 또한 예를 들어, 하기에 기재되는 바와 같이, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 세균을 비롯한, 임의의 원하는 숙주 내에서 발현될 수 있다. 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합 생성하는 기법도 또한 당업계에 공지된 방법, 예로서, 국제 공개 번호 WO 92/22324; 문헌 [Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12(6):864-869]; [Sawai et al., 1995, AJRI 34:26-34]; 및 [Better et al., 1988, Science 240:1041-1043](이들 참고문헌의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 개시된 방법들을 이용하여 수행될 수 있다.
전체 항체를 생성시키기 위하여, VH 또는 VL 뉴클레오티드 서열, 제한 부위, 및 제한 부위를 보호하기 위한 인접 서열을 포함하는 PCR 프라이머를 이용하여 scFv 클론내 VH 또는 VL 서열을 증폭시킬 수 있다. 당업자에게 공지된 클로닝 기법을 이용하여, PCR 증폭된 VH 도메인을, 예를 들어, VH 불변 영역, 예로서, 인간 감마 4 불변 영역을 발현시키는 벡터 내로 클로닝할 수 있고, PCR 증폭된 VL 도메인은 VL 불변 영역, 예컨대, 인간 카파 또는 람다 불변 영역을 발현시키는 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 특정 실시태양에서, VH 또는 VL 도메인을 발현시키기 위한 벡터는 EF-1 알파 프로모터,분비 신호, 가변 도메인을 위한 클로닝 부위, 불변 도메인, 및 네오마이신과 같은 선택적 마커를 포함한다. VH 및 VL 도메인은 또한 필요한 불변 영역을 발현시키는 하나의 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 이어서, 당업자에게 공지된 기법을 이용하여, 상기 중쇄 전환 벡터 및 경쇄 전환 벡터를 세포주에 함께 형질감염시켜, 전장 항체, 예로서, IgG를 발현시키는 안정한 또는 일과성 세포주를 생성한다.
인간에서의 항체의 생체내 용도 및 시험관내 검출 분석을 비롯한 일부 용도에서는, 인간 또는 키메라 항체를 사용하는 것이 이로울 수 있다. 인간 피험체를 치료를 위해서는 완전한 인간 항체가 특히 바람직할 수 있다. 인간 항체는, 상기 기술한 바와 같이 인간 면역글로불린 서열로부터 유도된 항체 라이브러리를 이용하는 파지 디스플레이 방법을 비롯한, 당업계에 공지된 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 제4,444,887호 및 제4,716,111호; 및 국제 공개 번호 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, W098/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741(이들 각각의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)를 참조한다.
키메라 항체는, 항체의 상이한 부분은 상이한 면역글로불린 분자들로부터 유래된 분자이다. 키메라 항체의 생산 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예로서, 문헌 ([Morrison, 1985, Science 229:1202]; [Oi et al, 1986, BioTechniques 4:214]; [Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202]; 및 미국 특허 번호 제5,807,715호, 제4,816,567호, 제4,816,397호, 및 제6,311,415호)(이들 각각의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)를 참조한다.
인간화된 항체는, 소정의 항원에 결합할 수 있고, 실질적으로 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 골격 영역을 포함하며, 실질적으로 비인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 항체, 또는 그의 단편이다. 인간화된 항체는 실질적으로 적어도 하나의, 전형적으로는 2개의 가변 도메인(Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv)(여기서, 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역들이 비-인간 면역글로불린(즉, 공여 항체)의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 골격 영역은 인간 면역 글로불린 공통 서열의 것에 상응한다)을 실질적으로 모두 포함한다. 특정 경우에서, 인간화된 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부분, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 적어도 일부분을 포함한다. 보통, 항체는 두 경쇄 모두와, 중쇄 중 적어도 하나의 가변 도메인을 함유할 것이다. 항체는 또한 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 CH4 영역을 포함할 수 있다. 인간화된 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE, 및 임의의 이소형, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 면역글로불린 부류로부터 선택될 수 있다. 통상적으로, 인간화된 항체가 세포독성 활성을 나타내는 것이 요구되는 경우, 불변 도메인은 보체 고정 불변 도메인이고, 이 부류는 전형적으로 IgG1이다. 이러한 세포독성이 바람직하지 않다면, 불변 도메인은 전형적으로 IgG2 부류의 것일 수 있다. 인간화된 항체는 1 초과의 부류 또는 이소형의 서열을 함유할 수 있고, 원하는 효과기 기능을 최적화하는 특정 불변 도메인을 선택하는 것은 당업자의 통상적인 기술에 속한다. 인간화된 항체의 골격 및 CDR 영역이 모체 서열과 정확히 일치할 필요는 없고, 예를 들면, 공여 CDR 또는 공통 골격이 적어도 하나의 잔기의 치환, 삽입 또는 결실로 돌연변이가 유발됨으로써 그 부위의 CDR 또는 골격 잔기가 공통 또는 유입된 항체의 것에 상응하지 않을 수 있다. 그러나 이러한 돌연변이가 광범위한 것은 아닐 것이다. 통상적으로, 인간화된 항체 잔기의 적어도 75%는 더욱 종종 90%, 및 가장 가능하게는 95% 초과의 서열이 모체 골격 영역(FR) 및 CDR 서열에 상응할 것이다. 인간화된 항체는, CDR-그래프팅(유럽 특허 번호 EP 239,400; 국제 공개 번호 WO 91/09967; 및 미국 특허 번호 제5,225,539호, 제5,530,101호, 및 제5,585,089호), 베니어링(veneering) 또는 표면 재생(resurfacing)(유럽 특허 번호 EP 592,106 및 EP 519,596; 문헌 [Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498]; [Studnicka et al, 1994, Protein Engineering 7(6):805-814]; 및 [Roguska et al., 1994, PNAS 91 :969-973]), 쇄 셔플링 (미국 특허 번호 제5,565,332호), 및 예로서, 미국 특허 번호 제6,407,213호, 제5,766,886호, WO 9317105, 문헌 ([Tan et al., J. Immunol. 169:1119-25 (2002)], [Caldas et al., Protein Eng. 13(5):353-60 (2000)], [Morea et al., Methods 20(3):267-79 (2000)], [Baca et al., J. Biol. Chem. 272(16): 10678-84 (1997)], [Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895-904 (1996)], [Couto et al., Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995)], [Couto et al., Cancer Res. 55(8): 1717-22 (1995)], [Sandhu J S, Gene 150(2):409-10 (1994)], 및 [Pedersen et al., J. Mol. Biol. 235(3):959-73 (1994)])에 개시된 기법을 포함하나, 이에 제한되지 않은, 당업계에 공지된 다양한 기법을 사용함으로써 생산될 수 있다. 종종, 골격 영역 내의 골격 잔기는 CDR 공여 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환되어, 항원 결합을 변형 또는 개선시킬 것이다. 이러한 골격 치환은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 항원 결합에 중요한 골격 잔기를 확인하기 위해 CDR 및 골격 잔기의 상호작용을 모델링하고, 특정 위치에 있는 특이한 골격 잔기를 확인하기 위해 서열 비교를 수행함으로써 확인된다(예를 들어, 미국 특허 제5,585,089호(Queen et al.); 및 문헌 [Riechmann et al., 1988, Nature 332:323](이들 전문이 본원에서 참고로 인용된다)을 참조한다).
5.7.7 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
본 발명은 또한 예를 들어, 상기 정의된 바와 같이 고도로 엄격한 하이브리드화, 중간 정도 또는 더 낮은 정도의 엄격한 하이브리드화 조건하에 본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드도 포함한다.
당업계에 공지된 임의의 방법에 의해서 폴리뉴클레오티드를 수득할 수 있고, 그러한 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 결정할 수 있다. 항체의 아미노산 서열이 공지되어 있기 때문에, 이러한 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 당업계에 공지된 방법을 사용함으로써 결정될 수 있으며, 즉, 특정 아미노산을 코딩하는 것으로 알려져 있는 뉴클레오티드 코돈을 본 발명의 항체, 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산이 생성될 수 있는 방식으로 조립한다. 항체를 코딩하는 상기와 같은 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 조립될 수 있는데(예로서, 문헌 [Kutmeier et al., BioTechniques 17:242 (1994)]에 기재된 것과 같은 것), 이는 간략하면, 항체를 코딩하는 서열의 일부를 포함하는 중첩 올리고뉴클레오티드의 합성 단계, 이러한 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 결찰 단계, 및 이어서, 결찰된 올리고뉴클레오티드를 PCR에 의해 증폭시키는 단계를 포함한다.
별법으로, 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 적합한 공급원으로부터의 핵산으로부터 생성될 수 있다. 특정 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 클론을 이용할 수는 없지만, 그 항체 분자의 서열이 공지되어 있는 경우라면, 그 면역글로불린을 코딩하는 핵산은 적합한 공급원(예컨대, 항체 cDNA 라이브러리, 또는 예로서, 본 발명의 항체를 발현하도록 선택된 하이브리도마 세포와 같이 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포로부터 생성되는 cDNA 라이브러리, 또는 상기와 같은 조직 또는 세포로부터 단리되는 핵산, 바람직하게는 폴리 A + RNA)으로부터, 3' 및 5' 말단 서열에 하이브리드화할 수 있는 합성 프라이머를 이용한 PCR 증폭에 의하거나, 또는 예컨대, 항체를 코딩하는 cDNA 라이브러리로부터 cDNA 클론을 동정하기 위한 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용한 클로닝에 의해 화학적으로 합성되거나 또는 수득될 수 있다. 이후, PCR에 의해 생성되어진 증폭된 핵산은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 복제가능한 클로닝 벡터로 클로닝될 수 있다.
항체의 뉴클레오티드이 일단 결정되면, 항체의 뉴클레오티드은 뉴클레오티드 서열 조작을 위해 당업계에 공지된 방법들, 예컨대, 재조합 DNA 기법, 지정 부위 돌연변이유발법, PCR 등(예를 들어, 문헌 ([Sambrook et al, 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.] 및 [Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY])(이 둘 모두의 전문이 본원에서 참고로 인용된다))에 기재된 기법 참조)을 이용하여 조작함으로써 다른 아미노산 서열을 가지는 항체를 생성하는 것, 예를 들어 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 형성할 수 있다.
특정 실시 태양에서, 통상적인 재조합 DNA 기법을 이용하여 하나 이상의 CDR을 골격 영역 내로 삽입될 수 있다. 골격 영역은 천연적으로 발생된 골격 영역 또는 공통 골격 영역일 수 있고, 특정 경우에서는 인간 골격 영역일 수 있다(예로서, 인간 기본골격 영역 목록에 대해서는 문헌 [Chothia et al., 1998, J. Mol. Biol. 278: 457-479] 참조). 임의로, 골격 영역 및 CDR의 조합에 의해 생성된 폴리뉴클레오티드는 IFNAR1에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩한다. 임의로, 하나 이상의 아미노산 치환이 골격 영역 내에서 이루어질 수 있고, 특정 경우에, 아미노산 치환은 항체가 그의 항원에 결합하는 것을 개선시킨다. 추가로, 그러한 방법을 사용하여 쇄내 디설피드 결합에 참여하는 하나 이상의 가변 영역 시스테인 잔기를 아미노산 치환 또는 결실시킴으로써 하나 이상의 쇄내 디설피드 결합을 포함하지 않는 항체 분자를 생성할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 다른 변경도 본 발명에 포함되며, 이는 당업계에 포함되어 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 도 1-4에 예시되어 있는 도 1-4에 의해 코딩된다. 다른 특정 실시태양에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 각각 서열 번호 41 및 41에 상응하는 경쇄 및 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체를 코딩한다. 추가의 다른 특정 실시태양에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 대립형질 변이가 EU 인덱스 번호화 체계에 의해 정의된 214번, 221번, 356번, 및 358번 위치로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 잔기에 있는 것인 대립형질 변이를 허용하는, 서열번호: 42에 상응하는 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체를 코딩한다.
5.7.8 항체의 재조합 발현
본 발명의 항체, 그의 유도체, 유사체 또는 단편(예로서, 본 발명의 항체의 중쇄 또는 경쇄 또는 그의 단편, 또는 본 발명의 단일 항체)의 재조합 발현은 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터의 구성을 필요로 할 수 있다. 일단 본 발명의 항체 분자, 또는 그의 중쇄 또는 경쇄, 또는 그의 일부분(중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 반드시 함유할 필요는 없다)을 코딩하는 폴리펩티드가 수득되면, 당업계에 공지된 기법을 이용하여 항체 분자를 생산하는 벡터를 재조합 DNA 기술로 생산할 수 있다. 따라서, 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써 단백질을 제조하는 방법이 본원에 기술되어 있다. 당업자에게 주지된 방법을 사용하여, 항체 코딩 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 함유하는 발현 벡터를 구성할 수 있다. 이 방법에는 예를 들어 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 유전자 재조합이 포함된다. 따라서, 본 발명은 프로모터에 작동가능하게 연결된, 본 발명의 항체 분자, 항체의 중쇄 또는 경쇄, 항체 또는 그의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 또는 중쇄 또는 경쇄 CDR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 복제가능한 벡터를 제공한다. 그러한 벡터는 항체 분자의 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고(예로서, 국제 공개 번호 WO 86/05807; 국제 공개 번호 WO 89/01036; 및 미국 특허 번호 제5,122,464호 참조), 전체 중쇄, 전체 경쇄, 또는 전체 중쇄 및 경쇄 둘 모두를 발현시키기 위해, 그러한 벡터 내로 항체의 가변 도메인을 클로닝할 수 있다.
발현 벡터를 통상적 기법에 의해 숙주 세포로 전달한 후, 형질감염된 세포를 통상적 기법에 의해 배양하여, 본 발명의 항체를 생산한다. 따라서, 본 발명은 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된, 본 발명의 항체 또는 그의 단편, 또는 그의 중쇄 또는 경쇄, 또는 그의 단편, 또는 본 발명의 단일 쇄 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 숙주 세포를 포함한다. 다른 실시태양에서, 이중 쇄 항체의 발현을 위한 경우, 상기에서 상세히 설명되는 바와 같이, 중쇄 및 경쇄, 둘 모두를 코딩하는 벡터들을 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위해 숙주 세포 내에서 공발현시킬 수 있다.
각종 숙주 발현 벡터 시스템들을 이용하여 본 발명의 항체 분자를 발현시킬 수 있다(예로서, 미국 특허 번호 제5,807,715호 참조). 그러한 숙주 발현 시스템은 관심의 대상이 되는 코딩 서열을 생성시킨 후, 정제할 수 있는 비히클을 나타내지만, 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환되거나 형질감염될 때는 본 발명의 항체 분자를 동소에서 발현시킬 수 있는 세포를 나타낸다. 이에는 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 세균(예로서, E. 콜라이 및 B. 섭틸리스(B. subtilis))과 같은 미생물; 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예를 들어, 사카로마이세스(Saccharomyces) 및 피치아(Pichia)); 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예로서, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 항체 코딩 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되었거나, 또는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스에서 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아(vaccinia) 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구성물을 보유하는 포유동물 세포 시스템(예로서, COS, CHO, BHK, 293, NSO, 및 3T3 세포)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정 실시태양에서, 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli)와 같은 세균 세포, 및 다른 실시태양에서, 특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위해서는 진핵 세포가 재조합 항체 분자의 발현에 사용된다. 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO: Chinese hamster ovary cells)와 같은 포유동물 세포가, 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 주요 중간 초기 유전자 프로모터 요소(major intermediate early gene promoter element)와 같은 벡터와 함께, 항체의 효과적인 발현 시스템일 수 있다(문헌 [Foecking et al., 1986, Gene 45:101]; 및 문헌 [Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2]). 특정 실시태양에서, IFNAR1에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현은 구성 프로모터, 유도성 프로 모터 또는 조직 특이적 프로모터에 의해 조절된다.
세균 시스템에서, 발현되는 항체 분자의 사용 의도에 따라, 다수의 발현 벡터들이 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 항체 분자의 약제학적 조성물의 생산을 위해 다량의 상기 항체를 생산하고자 할 때는, 용이하게 정제되는 고수준의 융합 단백질 산물을 발현시키도록 지정하는 벡터가 바람직할 수 있다. 그러한 벡터로는 항체 코딩 서열이 lac Z 코딩 영역과 프레임내 벡터 내로 개별적으로 결찰되어 융합 단백질이 생산될 수 있는 E. 콜라이 발현 벡터 pUR278 벡터(문헌 [Ruther et al., 1983, EMBO 12:1791]); pIN 벡터9(문헌 ([Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109]; [Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509])) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. pGEX 벡터를 또한 사용하여, 글루타티온 5-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 외부 폴리펩티드를 발현시킬 수도 있다. 일반적으로, 그러한 융합 단백질들은 가용성이고, 매트릭스 글루타티온 아가로스 비드에 흡착 및 결합시킨 후, 유리 글루타티온의 존재 하에 용출시킴으로써, 용해된 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 클로닝된 표적 유전자 산물이 GST 부분으로부터 유리될 수 있도록, 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 디자인된다.
포유동물 숙주 세포에서, 다수의 바이러스 기반 발현 시스템이 이용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로 사용되는 경우, 관심의 대상이 되는 항체 코딩 서열을 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체, 예를 들어, 후기 프로모터 및 3부분(tripartite) 리더 서열에 결찰시킬 수 있다. 이어서, 이 키메라 유전자를 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입할 수 있다. 바이러스 게놈의 비필수 영역(예를 들어, 영역 E1 또는 E3) 중의 삽입은, 감염 숙주 중에서 생존 가능하며 항체분자를 발현시킬 수 있는 재조합 바이러스를 초래할 것이다(예로서, 문헌 [Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359] 참조). 또한, 특정 개시 신호는 삽입된 항체 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 요구될 수 있다. 이들 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열들을 포함한다. 또한, 전체 삽입물의 번역을 확실히 하기 위하여, 개시 코돈은 원하는 코딩 서열의 리딩 프레임과 상(phase)이 일치해야 한다. 이들 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 천연 및 합성 양자의 각종 기원들을 가질 수 있다. 발현 효율은 적절한 전사 인핸서 요소, 전사 종결자 등을 포함시킴으로써 향상될 수 있다(예로서, 문헌 [Bittner et al, 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544] 참조).
또한, 삽입된 서열의 발현을 조정하거나, 원하는 특정 방식으로 유전자 생성물을 변형시키고 프로세싱하는 숙주 세포 균주를 선택할 수 있다. 그러한 단백질 생성물의 변형(예를 들어, 글리코실화) 및 프로세싱(예를 들어, 절단)은 이 단백질의 기능을 위해 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 번역 후 프로세싱 및 변형을 위한 특징적이고 특이적인 기전을 가진다. 적절한 세포주 또는 숙주 시스템을 선택하여, 발현되는 외래 단백질의 올바른 변형 및 프로세싱을 확실히 할 수 있다. 이 목적으로, 유전자 생성물의 1차 전사체, 글리코실화, 및 인산화의 적절한 처리를 위한 세포 장치를 가지는 진핵 숙주 세포를 사용할 수 있다. 그러한 포유동물 숙주 세포에는 CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 및 T47D, NSO(내인성으로 임의의 면역글로불린 쇄를 생산하지 않는 뮤린 골수종 세포주), CRL7030 및 HsS78Bst 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
재조합 단백질의 장기간 고수율 생산을 위해서는 안정한 발현이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 항체 분자를 안정적으로 발현하는 세포주를 공학처리할 수 있다. 바이러스 복제 기점을 함유하는 발현 벡터를 사용하기보다는, 적절한 발현 제어 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결인자, 폴리아데닐화 부위 등)에 의해 제어되는 DNA, 및 선택가능한 마커로 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 외래 DNA의 도입에 이어, 공학처리된 세포를 강화 배지에서 1 내지 2일간 성장시킨 후, 선택 배지로 교체할 수 있다. 재조합 플라스미드 중의 선택가능한 마커는 선택에 내성을 부여하며 세포가 플라스미드를 그들의 염색체 내로 안정하게 통합하고 성장하여, 클로닝되어 세포주 내로 확장될 수 있는 포커스를 형성하도록 한다. 이 방법은 항체 분자를 발현하는 세포주를 공학처리하기 위해 유리하게 사용될 수 있다. 그러한 공학처리된 세포주는, 항체 분자와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 조성물의 스크리닝 및 평가에 특히 유용할 수 있다.
단순포진 바이러스 티미딘 키나제(문헌 [Wigler et al., 1977, Cell 11: 223]), 히포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라제(문헌 [Szybalska＆ Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 202]), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(문헌 [Lowy et al., 1980, Cell 22: 8-17]) 유전자를 포함하나, 이에 제한되지 않는 다수의 선택 시스템을 사용할 수 있으며, 이에는 tk-, hgprt-또는 aprt-세포에 각각 이용될 수 있다. 또한, 하기 유전자들의 선택을 위한 기초로서 항대사물질 내성을 이용할 수 있다: 메토트렉세이트에 내성을 부여하는 dhfr(문헌 ([Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:357]; [O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527])); 미코페놀산에 내성을 부여하는 gpt(문헌 [Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072]); 아미노글리코시드 G-418에 내성을 부여하는 neo(문헌 ([Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95]; [Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596]; [Mulligan, 1993, Science 260:926-932]; 및 [Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217]; [May, 1993, TIB TECH 11(5): 155-215]); 및 하이그로마이신에 내성을 부여하는 hygro(문헌 [Santerre et al., 1984, Gene 30:147]). 재조합 DNA 기술 분야에 보편적으로 공지되어 있는 방법을 통상적으로 적용하여 원하는 재조합 클론을 선택할 수 있으며, 그러한 방법은 예를 들어, 문헌 ([Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)]; [Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)]; 및 [Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994)]; [Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1])(이들 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.
항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있다(리뷰를 위해, 문헌 [Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3. (Academic Press, New York, 1987)]을 참조한다). 항체를 발현하는 벡터 시스템 중의 마커가 증폭가능한 경우, 숙주 세포 배양물 중 존재하는 저해제의 수준의 증가는 마커 유전자의 카피 수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역이 항체 유전자와 관련되어 있기 때문에, 항체의 생산도 또한 증가할 것이다(문헌 [Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257]).
숙주 세포는 본 발명의 두 발현 벡터, 즉, 중쇄 유래 폴리펩티드를 코딩하는 제1 벡터 및 경쇄 유래 폴리펩티드를 코딩하는 제2 벡터와 함께 공형질감염될 수 있다. 두 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 동등한 발현을 가능케 하는 동일한 선택가능한 마커를 함유할 수 있다. 별법으로, 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 양자 모두를 코딩하고 발현시킬 수 있는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 그러한 상황에서, 경쇄는 중쇄 앞에 위치하여 과량의 독성 유리 중쇄를 막아야 한다(문헌 [Proudfoot, 1986, Nature 322:52]; 및 [Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2 197]). 중쇄 및 경쇄를 위한 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
일단 본 발명의 항체 분자가 재조합 발현에 의해 생산되면, 그것은 면역글로불린 분자의 정제를 위한 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 특히 단백질 A 이후의 특정 항원에 대한 친화성 크로마토그래피, 및 크기 분류 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 분별 용해도에 의해, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 기타 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 본원에 기재되거나 또는 달리 당업계에 공지된 이종 폴리펩티드 서열에 융합되어, 정제를 용이하게 할 수 있다.
5.8 항체의 확장성 생산
본 발명의 항체를 다량으로 수득하기 위한 노력으로 확장성 프로세스(이하 "본 발명의 확장성 프로세스")로 지칭한다)를 통해 본 발명의 항체를 생산할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 항체를 확장성 연구 실험실에서 본 발명의 확장성 프로세스에 의해 생산함으로써 분석 규모의 생체반응기(예를 들면, 제한하는 것은 아니지만, 5 L, 10 L, 15 L, 30 L, 또는 50 L 생체반응기) 중에서 본 발명의 항체를 생산할 수 있다. 다른 실시태양에서, 항체를 확장성 연구 실험실에서 본 발명의 확장성 프로세스에 의해 생산함으로써 생산 규모의 생체반응기(예를 들면, 제한하는 것은 아니지만, 75 L, 100 L, 150 L, 300 L, 또는 500 L) 중에서 본 발명의 항체를 생산할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 확장성 프로세스를 통해서는 연구 실험실에서 수행되는 생산 프로세스와 비교할 때 생산 효율이 거의 또는 전혀 감소되지 않는다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 확장성 프로세스를 통해 약 10 mg/L, 약 20 m/L, 약 30 mg/L, 약 50 mg/L, 약 75 mg/L, 약 100 mg/ L, 약 125 mg/L, 약 150 mg/L, 약 175 mg/L, 약 200 mg/L, 약 250 mg/L, 약 300 mg/L 이상의 생산 효율로 항체를 생산한다. 다른 실시태양에서, 융합 단백질은 본 발명의 확장성 프로세스에 의해 생산될 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 확장성 프로세스는 적어도 약 10 mg/L, 적어도 약 20 m/L, 적어도 약 30 mg/L, 적어도 약 50 mg/L, 적어도 약 75 mg/L, 적어도 약 100 mg/L, 적어도 약 125 mg/L, 적어도 약 150 mg/L, 적어도 약 175 mg/L, 적어도 약 200 mg/L, 적어도 약 250 mg/L, 적어도 약 300 mg/L 이상의 생산 효율로 항체를 생산한다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 확장성 프로세스는 약 10 mg/L 내지 약 300 mg/L, 약 10 mg/L 내지 약 250 mg/L, 약 10 mg/L 내지 약 200 mg/L, 약 10 mg/L 내지 약 175 mg/L, 약 10 mg/L 내지 약 150 mg/L, 약 10 mg/L 내지 약 100 mg/L, 약 20 mg/L 내지 약 300 mg/L, 약 20 mg/L 내지 약 250 mg/L, 약 20 mg/L 내지 약 200 mg/L, 20 mg/L 내지 약 175 mg/L, 약 20 mg/L 내지 약 150 mg/L, 약 20 mg/L 내지 약 125 mg/L, 약 20 mg/L 내지 약 100 mg/L, 약 30 mg/L 내지 약 300 mg/L, 약 30 mg/L 내지 약 250 mg/L, 약 30 mg/L 내지 약 200 mg/L, 약 30 mg/L 내지 약 175 mg/L, 약 30 mg/L 내지 약 150 mg/L, 약 30 mg/L 내지 약 125 mg/L, 약 30 mg/L 내지 약 100 mg/L, 약 50 mg/L 내지 약 300 mg/L, 약 50 mg/L 내지 약 250 mg/L, 약 50 mg/L 내지 약 200 mg/L, 50 mg/L 내지 약 175 mg/L, 약 50 mg/L 내지 약 150 mg/L, 약 50 mg/L 내지 약 125 mg/L, 또는 약 50 mg/L 내지 약 100 mg/L의 생산 효율로 항체를 생산한다.
5.8.1 항체를 공학처리하는 추가의 방법
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체의 Fc 힌지 영역은 항체의 생물학적 반감기를 감소시키기 위해서 돌연변이화된다. 더욱 특히, 하나 이상의 아미노산 돌연변이화를 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 경계면 영역 내로 도입함으로써 항체는 천연 Fc-힌지 도메인 SpA 결합에 비하여 손상된 스타필로코코실 단백질 A(SpA: Staphylococcyl protein A) 결합을 갖게 된다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 제6,165,745호(Ward et al.)에 추가로 상세히 기재되어 있다.
또다른 실시태양에서, 항체는 그의 생물학적 반감기를 감소시키기 위해 변형된다. 각종 접근법이 가능하다. 예를 들면, 미국 특허 번호 제6,277,375호에 기재되어 있는 바와 같이, 하기 돌연변이 중 하나 이상이 도입될 수 있다: T252L, T254S, T256F. 또다른 실시태양에서, 미국 특허 번호 제7,083,784호에 기재되어 있는 바와 같이, 하기 돌연변이 중 하나 이상이 도입될 수 있다: M252Y, S254T, T256E. 별법으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해 미국 특허 번호 제5,869,046호 및 제6,121,022호(Presta et al.)에 기재되어 있는 바와 같이, IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 두 루프로부터 취한 구제 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 항체를 CH1 또는 CL 영역 내에서 변형시킬 수 있다.
다른 실시태양에서, Fc 영역은 적어도 하나의 아미노산 잔기를, 항체의 효과기 기능(들)을 감소시키는 다른 아미노산 잔기로 대체시킴으로써 변형된다. 예를 들면, 항체가 효과기 리간드에 대해서는 감소된 친화성을 갖지만, 모체 항체의 항원-결합 능력을 보유할 수 있도록 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 그에 대한 친화성이 감소되는 것인 효과기 리간드는 예를 들면, Fc 수용체 또는 보체 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 제5,624,821호 및 제5,648,260호(둘 모두 Winter et al.)에 추가로 상세히 기재되어 있다.
또다른 일례로, 항체가 감소된 C1q 결합 및/또는 감소된 또는 제거된 보체 의존성 세포독성(CDC)을 갖도록 아미노산 잔기 329, 331 및 322로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 제6,194,551호(Idusogie et al.)에 추가로 상세히 기재되어 있다.
또다른 일례로, 아미노산 231번 239번 위치 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변형시켜 항체가 보체를 고정시킬 수 있는 능력을 감소시킬 수 있다. 이러한 접근법은 PCT 공개 WO 94/29351(Bodmer et al.)에 추가로 상세히 기재되어 있다.
추가의 또다른 실시태양에서, 하기 위치: 238번, 239번, 248번, 249번, 252번, 254번, 255번, 256번, 258번, 265번, 267번, 268번, 269번, 270번, 272번, 276번, 278번, 280번, 283번, 285번, 286번, 289번, 290번, 292번, 293번, 294번, 295번, 296번, 298번, 301번, 303번, 305번, 307번, 309번, 312번, 315번, 320번, 322번, 324번, 326번, 327번, 329번, 330번, 333번, 334번, 335번, 337번, 338번, 340번, 360번, 373번, 376번, 378번, 382번, 388번, 389번, 398번, 414번, 416번, 419번, 430번, 434번, 435번, 437번, 438번 또는 439번의 하나 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 본 발명의 항체의 Fc 영역을 추가로 변형시켜 항체의, 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC)를 매개할 수 있는 능력 및/또는 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화성을 감소시킬 수 있는 능력을 감소시킬 수 있다. 이러한 접근법은 PCT 공개 WO 00/42072(Presta)에 추가로 상세히 기재되어 있다.
본 발명에 의해 주시되는 본원의 항체의 또다른 변형 방법은 페길화이다. 예를 들면, 항체의 생물학적(예로서, 혈청) 반감기를 증가시키기 위하여 항체를 페길화시킬 수 있다. 항체를 페길화시키기 위하여, 항체, 또는 그의 단편을 전형적으로는 하나 이상의 PEG 기가 항체, 또는 항체 단편에 부착될 수 있게 하는 조건하에서 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 예로서, PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응시킨다. 특정 경우에는, 페길화는 반응성 PEG 분자(또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행된다. 본원에서 사용되는 바, "폴리에틸렌 글리콜"이라는 용어는 기타 다른 단백질을 유도화시키기 위해 사용되는 임의 형태의 PEG, 예로서, 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포함하는 것으로 한다. 특정 실시태양에서, 페길화되는 항체는 글리코실화되지 않은 항체이다. 단백질을 페길화시키는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 이는 본 발명의 항체에 적용될 수 있다. 예를 들면, EP 0 154 316(Nishimura et al.) 및 EP 0 401 384(Ishikawa et al.)를 참조한다.
따라서, 본 발명의 또다른 측면에서, 항IFNAR1 항체의 구조적인 특징, 예를 들면, 제한하는 것은 아니지만, 3F11, 4G5, 11E2, 및 9D4를 사용하여 예를 들면, IFNAR1에의 결합과 같은, 본 발명의 항체의 적어도 하나의 기능적 특성을 보유하는 구조적으로 관련이 있는 항IFNAR1 항체를 형성할 수 있다. 상기에서 논의된 바와 같이, 예를 들면, 3F11, 4G5, 11E2, 또는 9D4의 하나 이상의 CDR 영역, 또는 그의 돌연변이를 공지된 골격 영역 및/또는 기타 다른 CDR과 재조합적으로 결합시켜 추가의 재조합적으로 공학처리된 본 발명의 항IFNAR1 항체를 형성할 수 있다. 다른 유형의 변형은 상기 섹션에서 기술된 것을 포함한다. 공학처리 방법을 위한 출발 물질은 본원에서 제공하는 VH 및/또는 VL 서열 중 하나 이상, 또는 그의 하나 이상의 CDR 영역이다. 공학처리된 항체를 형성하기 위해서 본원에서 제공하는 VH 및/또는 VL 서열 중 하나 이상, 또는 그의 하나 이상의 CDR 영역을 갖는 항체를 실제로 제조(즉, 단백질로서 발현)할 필요는 없다. 대신, 서열(들)에 포함되어 있는 정보를 원래의 서열(들)로부터 유래되는 "2세대" 서열(들)을 형성하기 위한 출발 물질로서 사용하고, 이어서, "2세대" 서열(들)을 제조하고 단백질로서 발현시킨다.
5.9. 조성물
또다른 측면에서, 본 발명은 담체와 함께 제조된, 본원에 기술된 바와 같은, 하나의 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체의 조합, 또는 그의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 그러한 조성물은 본 발명의 하나의 항체, 융합 단백질, 면역접합체, 또는 이중특이적 분자, 또는 (예로서, 2 이상의 상이한) 항체, 융합 단백질, 면역접합체, 또는 이중특이적 분자의 조합을 포함할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 그러한 조성물은 생리학적으로 내성을 띠고, 그 자체로서 피험체에게 투여되기에 적합하다(이는 또한 "본 발명의 약제학적 조성물"로서 지칭된다). 예를 들면, 본 발명의 약제학적 조성물은 표적 항원 상의 다른 에피토프에 결합하거나, 상보적인 활성을 갖는 항체 (또는 면역접합체 또는 이중특이체)의 조합을 포함할 수 있다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 염을 포함할 수 있다. 이러한 염의 예로서는 산 부가염 및 염기 부가염을 포함한다. 산 부가염으로는 무독성 무기산, 예컨대, 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등으로부터 유래한 것들뿐만 아니라, 무독성 유기산, 예컨대, 지방족 모노카복실산 및 디카복실산, 페닐 치환된 알카노산, 하이드록시 알카노산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 설폰산 등으로부터 유래한 것들을 포함한다. 염기 부가염으로는 알칼리토 금속, 예컨대, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터 유래된 것들뿐만 아니라, 무독성 유기 아민, 예컨대, N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유래된 것들을 포함한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 조성물은 또한 약제학적으로 허용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 항산화제의 예로서는: (1) 수용성 항산화제, 예컨대, 아스코르브산, 시스테인 염산염, 이황산나트륨, 메타이황산나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 지용성 항산화제, 예컨대, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트제, 예컨대, 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함한다.
본 발명의 주시되는 조성물에서 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예로는 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 그의 적합한 혼합물, 식물성유, 예컨대, 올리브유 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대, 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 필요한 입자 크기를 유지시킴으로써, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 조성물은 또한 애주번트, 예컨대, 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 포함할 수도 있다. 미생물의 존재는 멸균 방법에 의해, 그리고 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 솔빈산 등을 포함시킴으로써 예방할 수 있다. 또한, 조성물에 등장화제, 예컨대, 당, 염화나트륨 등을 포함하는 것도 바람직할 수 있다. 또한, 주사가능한 약제학적 제형의 흡수 기간은 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 흡수를 지연시키는 제제를 포함시킴으로써 연장시킬 수 있다.
약제학적으로 허용되는 담체로는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 제조용 멸균 분말을 포함한다. 약제학적으로 활성인 물질에 대하여 상기와 같은 매질 및 제제를 사용하는 것을 당업계에 공지되어 있다. 임의의 종래 매질 또는 제제가 활성 화합물과 비화합성이 아닌 한, 본 발명의 약제학적 조성물에서 임의의 종래 매질 또는 제제를 사용하는 것도 주시된다. 보충적 활성 화합물이 조성물 내로 혼입될 수 있다. 치료학적 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건하에서 멸균성을 띠고 안정성을 띠어야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포좀, 또는 고농도 약물에 적합한 기타 정돈된 구조로서 제형화될 수 있다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적절한 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 필요한 입자 크기를 유지시킴으로써, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 다수의 경우, 등장화제, 예를 들어, 당, 다가알코올, 예컨대, 만닛톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 적절할 것이다. 또한, 주사가능한 조성물의 흡수 기간은 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 흡수를 지연시키는 제제를 포함시킴으로써 연장시킬 수 있다.
멸균 주사액은 상기 열거한 성분들 중 하나 또는 그의 조합을 적절한 용매 중에 필요량의 활성 화합물을 혼입한 후, 필요한 경우, 멸균 미세여과를 수행함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매질과 상기 열거한 다른 성분들 중 필요한 성분들을 포함하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 혼입시켜 제조한다. 멸균 주사액 제조용 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분에 더하여 이의 멸균 여과액으로부터 임의의 추가적으로 원하는 성분을 혼합한 분말을 생산해 내는 진공 건조 및 동결 건조(냉동진공건조)이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 조성물(예로서, 액상 제형)은 내독소 및/또는 관련 발열성 물질이 실질적으로 없는 무발열성 제형이다. 내독소는 미생물 유기체 내부에 국한되는 독소를 포함하며, 미생물이 파괴되거나 사멸될 때 방출된다. 발열성 물질은 또한 세균 및 다른 미생물의 외막의 열유발성, 열안정성 물질(당단백질)도 포함한다. 이러한 두 물질들 모두가 인간에게 투여될 경우 열, 저혈압 및 쇼크를 발생시킬 수 있다. 잠재적인 유해 효과 때문에, 정맥내 투여된 약제학적 약물 용액으로부터 소량의 내독소라도 제거하는 것이 좋다. 미국 식품 의약품 안정청("FDA": Food & Drug Administration)은 정맥내 약물 적용에 있어서 1 시간 동안 체중 1 kg당 투여량에 있어서 5 내독소 유닛(EU)의 상한선을 설정해놓았다. (문헌 [The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000)]). 치료 단백질이 체중 1 kg 당 수백 또는 수천 밀리그램의 양으로 투여되는 경우, 미량의 내독소라도 제거하는 것이 좋다. 하나의 실시태양에서, 조성물 내의 내독소 및 발열 물질의 수준은 10 EU/mg 미만, 또는 5 EU/mg 미만, 또는 1 EU/mg 미만, 또는 0.1 EU/mg 미만, 또는 0.01 EU/mg 미만, 또는 0.001 EU/mg 미만이다. 또다른 실시 양태에서, 조성물 내의 내독소 및 발열 물질의 수준은 약 10 EU/mg 미만, 또는 약 5 EU/mg 미만, 또는 약 1 EU/mg 미만, 또는 약 0.1 EU/mg 미만, 또는 약 0.01 EU/mg 미만, 또는 약 0.001 EU/mg 미만이다.
단일 제형을 생산하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 피험체, 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 단일 제형을 생산하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료학적 효과를 발휘하는 조성물의 양이 될 것이다. 일반적으로, 약제학적으로 허용되는 담체와 조합되는 상기 양의 범위는 100% 중 활성 성분 약 0.01% 내지 약 99%, 또한, 활성 성분 약 0.1% 내지 약 70%, 또한 활성 성분 약 1% 내지 약 30%가 될 것이다.
투여 요법은 최적의 원하는 반응 (예로서, 치료 반응)을 제공할 수 있도록 조정된다. 예를 들면, 단일 볼루스를 투여할 수 있거나, 시간을 두고 수개로 분할된 투여량을 투여할 수 있거나, 치료 상황의 긴급한 정도에 따라 지시되는 바와 같이 그 투여량은 비례하여 감소되거나 증가될 수 있다. 투여를 용이하게 하고 투여량을 균일하게 하기 위해서는 단위 제형으로 비경구용 조성물로서 제조하는 것이 특히 이롭다. 본원에서 사용되는 단위 제형이란 치료하고자 하는 피험체를 위한 단위 투여량으로 적합화된 물리학상 분리된 단위의 것을 지칭하는데; 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 함께 원하는 치료학적 효과를 발휘할 수 있도록 계산된 미리결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 단위 제형에 대한 구체적인 사항은 (a) 활성 화합물의 독특한 특징 및 이루고자 하는 특정의 치료학적 효과, 및 (b) 개체의 감수성을 치료하기 위해 상기와 같은 활성 화합물을 화합하는 분야에 있어서 고유한 제한에 의해 영향을 받고, 직접적으로 그에 따라 달라진다.
항체 투여를 위해, 투여량 범위는 약 0.0001 내지 100 mg/kg(숙주 체중), 및 더욱 일반적으로 0.01 내지 5 mg/kg(숙주 체중)이다. 예를 들면, 투여량은 0.3 mg/kg(체중), 1 mg/kg(체중), 3 mg/kg(체중), 5 mg/kg(체중) 또는 10 mg/kg(체중)일 수 있거나, 그 범위는 1-10 mg/kg(체중)일 수 있다. 예시적인 투여 요법으로는 주마다 1회, 매 2주마다 1회, 매 3주마다 1회, 매 4주마다 1회, 매월 1회, 매 3개월마다 1회 또는 매 3 내지 6개월마다 1회 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 항IFNAR1 항체에 대한 투여 요법으로는 하기 투약 스케줄: (i) 매 4주마다 6회 투약한 후, 매 3개월마다 투약하는 스케줄; (ii) 매 3주마다 투약하는 스케줄; (iii) 매 3주마다 3 mg/kg(체중) 1회 투약한 후, 1 mg/kg(체중) 투약하는 스케줄 중 하나를 사용하여 정맥 투여를 통해 1 mg/kg(체중) 또는 3 mg/kg(체중)의 항체를 투여하는 것을 포함한다.
별법으로, 융합 단백질의 항체는 지효성 방출 제형으로서 투여될 수 있는데, 이러한 경우에는 덜 빈번하게 투여되어야 한다. 투여량과 빈도는 환자에서 항체의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간 항체의 반감기가 가장 길고, 그 다음으로는 인간화된 항체, 키메라 항체, 및 비인간 항체 순이다. 투여량과 투여 빈도는 그 치료가 예방을 위한 치료인지 또는 치료를 위한 치료인지에 따라 달라진다. 예방학적인 적용인 경우, 상대적으로 낮은 투여량이 상대적으로 덜 빈번한 간격을 두고 장기간에 걸쳐 투여된다. 몇몇 환자들은 남은 여생 동안 계속하여 치료를 받게 된다. 치료학적인 적용인 경우, 질환 진행이 감소되거나 종결될 때까지, 및 보통은 환자가 질환 증상에 대해 부분적으로 또는 완전하게 호전이 되는 것을 보일 때까지 상대적으로 높은 투여량이 상대적으로 짧은 간격을 두고 투여되는 것이 종종 필요하다. 이후, 환자는 예방학적 요법으로 투여받을 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은, 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 있어서 환자에게 독성을 부여하지 않으면서 원하는 치료 반응을 달성하기에 유효한 활성 성분의 양을 수득하기 위해서는 다양할 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물, 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료의 지속 시간, 사용되는 특정 조성물과 병용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료할 환자의 연령, 성별, 체중, 병태, 일반 건강 상태 및 이전 병력 사항 및 의학 업계에 공지된 기타 요인들을 비롯한 다양한 약동역학적 요인들에 따라 다를 것이다.
본 발명의 항IFNAR1 항체의 치료학적으로 유효한 투여량은 질환 증상의 중증도를 감소시키거나, 질환의 무증상 기간의 빈도와 지속 기간을 증가시키거나, 질환의 고통으로 일어나는 손상 또는 장애를 예방할 수 있다. 예를 들면, 전신 홍반 루푸스(SLE)의 경우, 치료학적 유효량은 예로서, 동통, 피로감 또는 허약과 같이 SLE과 관련되어 나타나는 신체적인 증상이 악화되지 못하게 막을 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 SLE의 발병을 예방하거나 지연시킬 수 있는데, 예를 들면, 이는 상기 질환의 조기 징후 또는 예비 징후가 존재할 경우에 필요할 수 있다. 유사하게, SLE과 관련된 만성적인 진행을 지연시키는 것을 포함한다. SLE 진단에 사용되는 실험실용 시험으로는 화학법, 혈액학적 방법, 혈청학적 방법 및 방사선법을 포함한다. 따라서, 상기 중 어느 것을 모니터링하는 임의의 임상적 또는 생화학적 분석법을 사용하여 특정의 치료법이 SLE 치료를 위해 치료학적으로 유효한 투여량인지 여부를 측정할 수 있다. 당업계의 숙련인은 피험체의 크기, 피험체 증상의 중증도, 특정 조성물 또는 선택된 투여 경로와 같은 인자에 기초하여 유효한 투여량을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법들 중 하나 이상의 방법을 사용하여 하나 이상의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 당업자가 이해하고 있는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 투여 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 항체에 대해 선택된 투여 경로로는 정맥내, 근육내, 진피내, 복강내, 피하, 척수 또는 기타 다른 비경구 투여 경로, 예를 들면, 주사에 의해 또는 주입에 의한 투여를 포함한다. 비경구 투여는 소화관내 투여 및 국소 투여 이외의 기타 다른 투여 방식, 일반적으로는 주사에 의한 투여 방식을 나타낼 수 있고, 제한없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 낭내, 안내, 심장내, 진피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피밑, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내측 주사 및 주입을 포함한다.
별법으로, 본 발명의 항체는 비경구 경로, 예로서, 국소, 표피, 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들면, 비내, 경구내, 질내, 직장내, 설하 또는 국소적으로 투여될 수 있다.
활성 화합물은 임플란트, 경피용 패취, 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 비롯한 방출 조절형 제형과 같이, 화합물이 빠르게 방출되는 것으로부터 보호하는 담체와 함께 제조될 수 있다. 생체분해성, 생체화합성 중합체, 예로서, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 그러한 제형을 제조하는 다수의 방법이 특허가 되어 있으며, 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 예로서, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
치료학적 조성물은 당업계에 공지된 의료 장치를 사용함으로써 투여될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 예를 들면, 본 발명의 치료학적 조성물은 바늘이 없는 피하 주사용 장치, 예로서, 미국 특허 번호 제5,399,163호; 제5,383,851호; 제5,312,335호; 제5,064,413호; 제4,941,880호; 제4,790,824호; 또는 제4,596,556호에 개시되어 있는 장치를 사용함으로써 투여될 수 있다. 본 발명에 유용한 것으로서 주지되어 있는 임플란트 및 모듈의 예로서는 미국 특허 번호 제4,487,603호에 개시되어 있는, 속도 조절형으로 의약을 분배할 수 있는 임플란트형 미세주입식 펌프; 미국 특허 번호 제4,486,194에 개시되어 있는, 피부를 통해 의약을 투여할 수 있는 치료학적 장치; 미국 특허 번호 제4,447,233에 개시되어 있는, 정확한 주입 속도로 의약을 전달하는 의약 주입식 펌프; 미국 특허 번호 제4,447,224에 개시되어 있는, 연속 약물 전달을 위한 가변 유동식의 임플란트형 주입식 기기; 미국 특허 번호 제4,439,196호에 개시되어 있는, 다중 챔퍼 구획을 갖고 있는 삼투압 약물 전달 시스템; 및 미국 특허 번호 제4,475,196에 개시되어 있는, 삼투압 약물 전달 시스템을 포함한다. 이들 특허는 본원에서 참고로 인용된다. 다수의 기타 다른 임플란트, 전달 시스템, 및 모듈이 당업자에게 공지되어 있다.
특정 실시 태양에서, 본 발명의 항체는 생체내에서 적절하게 분포되도록 제조될 수 있다. 예를 들어, 혈액 뇌 장벽(BBB: blood-brain barrier)은 다수의 고친수성 화합물을 차단한다. 본 발명의 치료 화합물이 BBB를 통과하기 위해서는(필요하다면), 이들은 예를 들어, 리포좀으로 제조될 수 있다. 리포좀 제조 방법에 대해서는, 예컨대, 미국 특허 제4,522,811호; 제5,374,548호; 및 제5,399,331호를 참조한다. 상기 리포좀은 특정 세포 또는 기관 내로 선택적으로 수송되는 하나 이상의 부분을 포함하여, 표적화된 약물 전달을 향상시킬 수 있다(예컨대, 문헌 [V.V. Ranade (1989) J. Clin . Pharmacol. 29:685] 참조). 예시적인 표적화 부분으로는 엽산 또는 비오틴(예컨대, 미국특허 제5,416,016호(Low et al.)); 만노시드(문헌 [Umezawa et al, (1988) Biochem . Biophys . Res . Commun . 153:1038]); 항체(문헌 ([P.G. Bloeman et al., (1995) FEBS Lett . 357:140]; [M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180])); 계면활성 단백질 A 수용체(문헌 [Briscoe et al. (1995) Am . J. Physiol. 1233:134]); p120(문헌 [Schreier et al. (1994) J. Biol . Chem . 269:9090])을 포함하며; 또한 문헌 [K. Keinanen; ML. Laukkanen (1994) FEBS Lett . 346:123]; [J.J. Killion; J.J. Fidler (1994); Immunomethods 4:273]도 참조한다.
5.10. 진단 용도
다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 시험관내 및 생체내 진단 및 치료학적 유용성을 갖는다. 예를 들면, 이들 분자는 배양물 중, 예로서, 시험관내 또는 생체외, 또는 피험체에서, 예로서, 생체내에서 각종 질병의 치료, 예방 또는 진단을 위해 투여될 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 항체는 IFNAR1의 수준, 또는 IFNAR1을 발현하는 세포의 수준을 검출하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 항체 및 IFNAR1 사이에 복합체가 형성될 수 있도록 하는 조건하에서 샘플(예로서, 시험관내 샘플) 및 대조군 샘플을 항IFNAR1 항체와 접촉시킴으로써 이루어질 수 있다. 항체 및 IFNAR1 사이에 형성된 임의의 복합체를 검출하고, 샘플 및 대조군에서 비교한다. 예를 들면, 본 발명의 조성물을 사용함으로써 당업계에 주지되어 있는 표준 검출 방법, 예로서, ELISA 및 유식세포 측정법을 수행할 수 있다.
따라서, 하나의 측면에서, 본 발명은 추가로 항체 또는 그의 일부 및 IFNAR1 사이에 복합체가 형성될 수 있도록 하는 조건하에서 샘플, 및 대조군 샘플을, IFNAR1에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합부와 접촉시키는 단계를 포함하는, 샘플 중 IFNAR1(예로서, 인간 IFNAR1 항원)의 존재를 검출하는 방법, 또는 IFNAR1의 양을 측정하는 방법을 제공한다. 이어서, 복합체 형성을 검출하는데, 여기서, 대조군 샘플과 비교하여 샘플과 복합체 형성에 있어 차이가 난다면 이는 샘플 중에 IFNAR1에 존재한다는 것을 나타내는 것이다.
5.11 치료학적 적용
IFNAR1은 I형 인터페론에 대한 세포 수용체의 일부이며, I형 인터페론은 T 세포 분화, 항체 생산 및 기억 T 세포의 활성 및 생존에 관여하는 면역조절성 사이토카인으로 알려져 있다. 또한, I형 인터페론의 발현 증가는 다수의 자가면역 질환, HIV 감염, 이식 거부 및 이식편 대 숙주 질환(GVHD: graft versus host disease)에 대해 설명되어 있다. 따라서, I형 인터페론의 기능적 활성을 저해시키는 본 발명의 항IFNAR1 항체 또는 그의 단편은 비정상적이거나 원치않는 I형 인터페론 활성이 관여하는 각종의 임상적 징후에 사용될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 항체, 또는 항원 결합부를 투여하는 단계를 포함하는, I형 인터페론 매개 질환 또는 질병을 예방, 치료, 유지, 호전 또는 저해시키는 방법을 포함한다.
본 발명의 항체가 사용될 수 있는 자가면역 병태의 구체적인 예로는 하기:전신 홍반 루푸스(SLE), 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM), 염증성 장 질환(IBD: inflammatory bowel disease)(크론병, 궤양성 대장염 및 복강 질환 포함), 다발 경화증(MS: multiple sclerosis), 건선, 자가면역 갑상선염, 류마티스 관절염(RA) 및 사구체신염을 포함한다. 추가로, 본 발명의 항체 조성물은 이식 거부를 저해 또는 예방하는데, 또는 이식편 대 숙주 질환(GVHD)의 치료에 또는 HIV 감염/AIDS의 치료에 사용될 수 있다.
전신 홍반 루푸스(SLE)를 앓는 환자의 혈청 중에서 고수준의 IFNα가 관찰되었다(예로서, 문헌 [Kim et al. (1987) Clin . Exp . Immunol. 70:562-569] 참조). 또한, 예를 들면, 암 또는 바이러스 감염 치료에서 IFNα를 투여하였을 때 SLE가 유도되는 것으로 나타났다(문헌 [Garcia-Porrua et al. (1998) Clin . Exp . Rheumatol. 16:107-108]). 따라서, 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 치료를 필요로 하는 피험체에게 항체를 투여함으로써 SLE를 치료하는 데 사용될 수 있다.
SLE를 치료하는 기타 다른 방법이 발명의 명칭이 "Methods of treating SLE"인 하기의 미국 특허 출원: 시리얼 번호 제60/907,767호(2007년 4월 16일 출원); 제60/966,174호(2007년 11월 5일 출원) 및 PCT 출원 시리얼 번호 PCT/US2007/02494(2007년 12월 9월 출원)(이들 각각의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.
IFNα는 또한 I형 당뇨병의 병상에도 관련이 있는 것으로 나타났다. 예를 들면, I형 당뇨병 환자의 췌장 베타 세포에 면역반응성 IFNα가 존재하는 것으로 보고되었다(문헌 [Foulis et al. (1987) Lancet 2: 1423-1427]). 항바이러스 요법에서 IFNα를 장기간 사용할 경우에는 또한 I형 당뇨병이 유도되는 것으로 나타났다(문헌 [Waguri et al. (1994) Diabetes Res . Clin . Pract . 23:33-36]). 따라서, 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체 또는 그의 단편은 치료를 필요로 하는 피험체에게 항체를 투여함으로써 I형 당뇨병 치료에 사용될 수 있다. 항체는 단독으로, 또는 기타 다른 항당뇨병제, 예로서, 인슐린과 함께 조합하여 사용될 수 있다.
IFNAR1에 대한 항체는 염증성 장 질환 동물 모델에서 효과적인 것으로 나타났다(미국 출원 60/465,155 참조). 따라서, 본 발명의 항IFNAR1 항체 또는 그의 단편은 치료를 필요로 하는 피험체에게 항체를 투여함으로써, 궤양성 대장염 및 크론병을 비롯한 염증성 장 질환(IBD)의 치료에 사용될 수 있다.
IFNα를 사용한 치료법은 또한 자가면역 갑상선염을 유도하는 것으로 관찰되었다(문헌 ([Monzani et al. (2004) Clin . Exp . Med . 3:199-210]; [Prummel and Laurberg (2003) Thyroid 13:547-551])). 따라서, 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 치료를 필요로 하는 피험체에게 항체를 투여함으로써, 자가면역 원발성 갑상선기능저하증, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염 및 갑상선기능저하증을 동반한 파괴성 갑상선염을 비롯한 자가면역 갑상선 질환 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 단독으로, 또는 예로서, 항갑상선 약물, 방사성 요오드 및 갑상선아전 절제술과 같은 기타 다른 제제 또는 치료법과 함께 조합하여 사용될 수 있다.
HIV 감염을 앓는 환자의 순환에서 고수준의 IFNα가 또한 관찰되었으며, 그의 존재는 AIDS 진행을 예측하는 마커가 된다(문헌 ([DeStefano et al. (1982; J. Infec. Disease 146:451]; [Vadhan-Raj et al. (1986) Cancer Res. 46:417])). 따라서, 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 치료를 필요로 하는 피험체에게 항체를 투여함으로써, HIV 감염 또는 AIDS 치료에 사용될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 단독으로, 또는 예로서, 뉴클레오시드 역전사효소 저해제, 비뉴클레오시드 역전사효소 저해제, 프로테아제 저해제 및 융합 저해제와 같은 항HIV 제제와 함께 조합하여 사용될 수 있다.
IFNAR1에 대한 항체는 동종이식 거부를 저해시키는 데 및 동종이식 생존을 장기화시키는 데 효과적인 것으로 입증되었다(예로서, 문헌 ([Tovey et al. (1996) J. Leukoc. Biol. 59:512-517]; [Benizri et al. (1998) J. Interferon Cytokine Res. 18:273-284])). 따라서, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 또한 동종이식 거부를 저해시키고/거나 동종이식 생존을 장기화시키기 위해 이식 수혜자에서 사용될 수 있다. 본 발명은 치료를 필요로 이식 수혜자에게 본 발명의 항IFNAR1 항체를 투여함으로써 이식 거부를 저해시키는 방법을 제공한다. 치료될 수 있는 조직 이식의 예로는 간, 폐, 신장, 심장, 소장, 및 췌장 섬 세포 뿐만 아니라, 이식편 대 숙주 질환(GVHD)의 치료를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 항체는 단독으로, 또는 예로서, 면역억제제(예로서, 사이클로스포린, 아자티오프린, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손, 미코페놀레이트 모페틸, 시롤리무스, 라파마이신, 타크롤리무스), 소염제(예로서, 아사이클로비르, 클로트리마졸, 간시클로비르, 니스타틴, 트리메토설파르네톡사졸), 이뇨제(예로서, 부메타니드, 푸로세미드, 메톨라존) 및 궤양약(예로서, 시메티딘, 파모티딘, 란소프라졸, 오메프라졸, 라니티딘, 수크랄페이트)과 같이, 이식 거부를 저해하는 기타 다른 제제와 함께 조합하여 사용될 수 있다.
다른 특정 실시태양에서, 본 발명은 예로서, 제한하는 것은 아니지만, 충수염, 소화성 궤양, 위 궤양 및 십이지장 궤양, 복막염, 췌장염, 궤양성 결장염, 거짓막 결장염, 급성 결장염 및 허혈성 결장염, 게실염, 후두개염, 이완불능증, 담관염, 담낭염, 간염, 크론병, 장염, 휘플병, 천식, 알레르기, 아나필락시스 쇼크, 면역 복합체병, 기관 허혈, 재관류 손상, 기관 괴사, 건초열, 패혈증(sepsis), 패혈증(septicemia), 내독소, 악액질, 고열증, 호산구성 육아종, 육아종증, 사르코이드증, 패혈 유산, 부고환염, 질염, 전립선염, 요도염, 기관지염, 폐공기증, 비염, 낭성 섬유증, 폐렴, 뉴모노울트라마이크로스코픽실리코볼케이노코니오시스(pneumoultramicroscopicsilicovolcanoconiosis(진폐증)), 폐포염, 세기관지염, 인두염, 늑막염, 동염, 인플루엔자, 호흡기 세포 융합 바이러스 감염, 헤르페스 감염, HIV 감염, B형 간염 바이러스 감염, C형 간염 바이러스 감염, 파종성 세균혈증, 댕기열, 칸디다증, 말라리아, 사상충증, 아메바증, 포충낭, 화상, 피부염, 피부근육염, 일광 화상, 두드러기, 사마귀, 팽진, 혈관염, 맥관염, 심내막염, 동맥염, 죽상동맥경화증, 혈전정맥염, 심장막염, 심근염, 심근 허혈, 결절 동맥 주위염, 류마티스열, 알츠하이머병, 셀리아크병, 울혈성 심장 기능상실, 재협착, COPD 성인 호흡 곤란 증후군, 수막염, 뇌염, 다발 경화증, 뇌경색, 뇌색전증, 길랭-바레 증후군, 신경염, 신경통, 척수 손상, 마비, 포도막염, 관절염, 관절통, 골수염, 근막염, 파제트병, 통풍, 치주 질환, 류마티스 관절염, 윤활막염, 중증 근육무력증, 갑상선염, 전신 홍반 루푸스, 굿파스처 증후군, 베체트 증후군, 동종이식 거부, 이식편 대 숙주 질환, I형 당뇨병, 강직성 척추염, 버거병, 라이터 증후군, 및 호지킨병을 비롯한, 만성 및 급성 두 병태를 포함하는 광범위한 염증성 병태를 치료 및 예방하기 위하여 본 발명의 조성물 및 항체를 투여 및 사용하는 방법을 제공한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체를 투여하는 방법 및 항체 조성물은 하기 병태 또는 질환 상태: 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 크론병, 건선, 건선성 관절염, 교감성 안염, 자가면역 난소염, 자가면역 고환염, 자가면역 림프증식 증후군, 항인지질 증후군, 쇼그렌 증후군, 공피증, 애디슨병, 다내분비선 결핍 증후군, 길랭-바레 증후군, 면역 혈소판감소성 자색반병, 악성 빈혈, 중증 근육무력증, 원발성 담즙성 간경변, 혼합 결합 조직병, 백반증, 자가면역 포도막염, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 저혈소판증, 셀리아크병, 포진성 피부염, 자가면역 간염, 천포창, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 수포성 유천포창, 자가면역 심근염, 자가면역 혈관염, 원형 탈모증, 자가면역 아태롬성동맥경화증, 베체트병, 자가면역 골수병, 자가면역 혈우병, 자가면역 간질성 방광염, 자가면역 요붕증, 자가면역 자궁내막증, 재발성 다발성 연골염, 강직성 척추염, 자가면역 두드러기, 피부근육염, 밀러-피셔 증후군, IgA 신장병증, 굿파스처 증후군, 및 임신 헤르페스와 관련된 증상을 예방, 치료, 호전시키는 데 유용할 수 있다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체를 투여하는 방법 및 항체 조성물은 쇼그렌 증후군과 관련된 증상을 예방, 치료, 호전시키는 데 유용할 수 있다. 쇼그렌 증후군은 면역 세포가 눈물과 타액을 생산하는 외분비선을 공격하고 파괴하는 자가면역 질병이다. 이는 상기 질병을 최초로 설명한 스웨덴 안과 의사 헨릭 쇼그렌(Henrik Sjogren)(1899-1986)의 이름을 딴 것이다. 쇼그렌 증후군은 또한 예로서, 류마티스 관절염과 같은 류마티스병과도 관련이 있으며, 이는 사례의 90%에서 양성을 띠는 류마티스 인자이다. 상기 질병의 특징이 되는 증상은 구강 건조증과 안구 건조증이다. 또한, 쇼그렌 증후군은 피부, 코, 및 질 건조증을 유발할 수 있고, 신장, 혈관, 폐, 간, 췌장, 및 뇌를 비롯한 기타 다른 신체 기관에도 영향을 줄 수 있다. 비록 쇼그렌 증후군이 모든 연령대의 여성 및 남성, 둘 모두에게서 발생할 수는 있지만, 십중팔구, 대개 쇼그렌 증후군 환자는 여성이며, 상기 질병이 발병하는 평균 연령대는 40대 후반이다. 미국에서만도 4백만명 정도의 사람들이 상기 질병에 걸린 것으로 추정되며, 이는 2번째로 가장 일반적인 자가면역 류마티스병이다.
근육염은 골격근 또는 수의근의 염증을 특징으로 하는 일반 병태이다. 근육 염증은 알레르기 반응, 독성 물질 또는 약물에의 노출, 또다른 질병, 예로서, 암, 류마티스 병태, 또는 바이러스 또는 기타 다른 감염원으로 유발될 수 있다. 만성 염증성 근육병증은 특발성인 것으로서, 이는 어떤 원인불명의 것을 의미하는 것이다. (보통은 질병과 싸우는) 체내 백혈구 세포가 혈관, 정상 근육 섬유, 및 기관, 뼈, 및 관절의 결합 조직을 공격하는 자가면역 질병으로 이해되고 있다.
다발성 근육염은 신체 양쪽 모두의 (움직임을 가능하게 하는) 골격근에 영향을 준다. 이는 18세 이하의 사람에서는 거의 일어나지 않고; 대개의 경우 환자는 31세 내지 60세 사이이다. 상기 열거한 증상 이외에도, 진행성 근무력증으로 인해 삼키기, 말하기, 앉은 자리에서 일어나기, 계단 오르기, 물건 들어올리기, 또는 머리 위로 손올리기를 함에 있어 어려움을 겪게 된다. 다발성 근육염을 앓는 환자는 또한 관절염, 호흡 곤란 및 심장 부정맥도 경험할 수 있다.
피부근육염은 진행성 근무력증보다 앞에 일어나거나, 이를 동반한 피부 발진을 특징으로 한다. 발진은 반점형으로 청보라색 또는 붉은 변색을 띠는 것처럼 보이며, 특징적으로는 손가락 관절, 팔꿈치, 발뒤꿈치 및 발가락을 비롯한 관절을 뻗거나 쭉 펴는 데 사용되는 근육, 및 눈꺼풀 상에서 발병이 된다. 붉은색 발진은 또한 안면, 목, 어깨, 상흉부, 등, 및 기타 다른 부위에서 일어날 수 있으며, 환부의 팽윤도 일어날 수 있다. 발진은 종종 근육과 뚜렷한 관련없이 일어날 수도 있다. 피부근육염을 앓는 성인은 체중 감소 또는 미열을 경험할 수 있고, 염증성 폐를 가질 수 있고, 빛에 민감할 수 있다. 다발성 근육염과는 달리 성인 피부근육염은 유방 종양, 폐 종양, 여성 음부 종양, 또는 장 종양을 동반할 수 있다. 피부근육염을 앓는 어린이 및 성인에서는 석회 침착이 발생할 수 있는데, 이는 피부밑 또는 근육에서 딱딱한 덩어리로서 나타난다(이는 석회증으로 명명된다). 석회증은 가장 많이는 질병 발병 후 1-3년이 경과한 후에 일어나지만, 수년이 지난 후에도 일어날 수 있다. 이러한 침착은 성인 시기에 시작된 피부근육염보다는 소아기 피부근육염에서 더 자주 관찰된다. 피부근육염은 콜라겐-혈관 또는 자가면역 질환과 관련이 있을 수 있다.
봉입체 근육염(IBM: inclusion body myositis)은 진행성 근무력증 및 쇠약을 특징으로 한다. IBM는 다발성 근육염과 유사하기는 하지만, 그 자신만의 뚜렷한 특징을 갖고 있다. 근무력증은 발병은 일반적으로 (수개월 또는 수년간에 걸쳐서) 점진적으로 일어나며, 이는 근위 근육 및 원위 근육, 둘 모두에 영향을 미친다. 근무력증은 신체 한쪽에만 영향을 줄 수도 있다. 공포라는 작은 구멍이 환부 근육 섬유에서 관찰된다. 넘어짐 및 헛디딤의 행동이 보통 IBM의 가장 주목할 만한 증상이다. 몇몇 환자의 경우, 상기 질병은 손목 및 손가락 무력증과 함께 시작되는데, 이로써 물건을 펀칭하고, 단추를 잠그고, 물건을 잠는데 어려움을 겪게 된다. 손목 및 손가락 근육의 근무력증 및 아래팔 근육 및 다리 대퇴사두근의 위축증(근육 부피가 얇아지거나 손실)이 있을 수 있다. IBM 사례 중 대략 절반에서는 삼키는 데 있어서 어려움을 겪게 된다. 비록 상기 질환이 조기에도 일어날 수는 있지만, 상기 질환의 증상은 보통 50세 이후에 시작된다. 다발성 근육염 및 피부근육염과는 달리, IBM은 여성보다는 남성에서 더욱 빈번하게 일어난다.
소아 근육염은 성인 피부근육염 및 다발성 근육염과 몇가지 유사성을 지닌다. 전형적으로는 2세 내지 15세 어린이에게 영향을 미치며, 그 증상으로는 원위 근육 근무력증 및 염증, 부종(팽윤을 유발하는 신체 조직 내의 비정상적인 체액 수집), 근육통, 피로감, 피부 발진, 복통, 열, 및 구축(이는 근육 힘줄 내의 염증으로 유발되는 관절 주변의 근육 또는 힘줄의 만성 단축으로서, 이 때문에 관절을 자유롭게 움직일 수 없다)을 포함한다. 소아 근육염을 앓는 어린이는 또한 삼킴 및 호흡에 어려움을 겪을 수 있고, 심장도 영향을 받을 수 있다. 소아 피부근육염을 앓는 어린이 중 대략 20 내지 30%에서 석회증이 발생한다. 소아 환자의 혈액 중 근육 효소 크레아틴 키나제의 수준은 정상 수준보다는 높게 나타날 수 없지만, 기타 다른 다른 근육 효소는 정상 수준보다는 높다.
따라서, 다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 심근염, 염증성 근육염, 특발성 근육염, 다발성 근육염, 피부근육염, 봉입체 근육염(IBM), 소아 근육염 또는 이들 병태와 관련이 있는 증상을 예방, 치료 또는 호전시키는 데 유용할 수 있다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 혈관염과 관련이 있는 증상을 예방, 치료 또는 호전시키는 데 유용할 수 있다.
본 발명의 항체는 공피증 치료에 유용할 수 있다. 공피증을 치료하는 방법은 발명의 명칭이 "Methods Of Treating Scleroderma"인 하기의 미국 특허 출원: 시리얼 번호 제60/996,175호(2007년 11월 5일 출원); 및 PCT 출원 번호 PCT/US2008/82481(이들 각각의 전문이 모든 목적을 위해 본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 사르코이드증과 관련된 증상을 예방, 치료 또는 호전시키는 데 유용할 수 있다. 사르코이드증(또는 사르코이드 또는 베스니어-베크병(Besnier-Boeck disease)으로도 명명된다)은 비괴사성 육아종(작은 염증성 결절)을 특징으로 하는 면역계 질병이다. 실제로는 어느 기관이든 영향을 받을 수 있지만, 육아종은 가장 많이는 폐 또는 림프절에서 나타난다. 증상이 때로는 갑자기 나타날 수도 있지만, 보통은 점진적으로 나타난다. 폐를 X으로 검사해 보면, 사르코이드증에서는 결핵 또는 림프종이 나타난 것을 볼 수 있다.
본 발명의 조성물(예로서, 항IFNAR1 항체) 및 사용 설명서를 포함하는 키트도 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다. 키트는 추가로 추가의 시약, 또는 하나 이상의 본 발명의 추가적인 항체(예로서, 제1 항체와는 상이한 표적 항원 상의 에피토프에 결합하는 상보적인 활성을 갖는 항체)를 포함할 수 있다. 키트는 전형적으로 키트 성분의 사용 의도를 설명하는 표지를 포함한다. 표지라는 용어는 키트 상에 또는 키트와 함께 제공되거나, 다르게는 키트를 수반하는 임의의 문서 또는 기록물을 포함한다.
5.12 병용법
본 발명의 조성물은 또한 병용 요법으로, 예를 들면, 기타 다른 제제와 함께 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 병용 요법은 적어도 하나의 기타 다른 면역억제제와 함께 조합된 본 발명의 항IFNAR1 항체를 포함한다.
몇몇 방법에서, 상이한 결합 특이성을 갖는 2개 이상의 모노클로날 항체가 동시에 투여되는데, 이러한 경우, 각 항체의 투여량은 명시된 범위 내에 포함되어 있다. 항체는 일반적으로 다회에 걸쳐 투여된다. 단일 투약 사이의 간격은 예를 들면, 매주, 매월, 매 3개월 마다 또는 매년일 수 있다. 그러한 간격은 또한 환자에서 표적 항원에 대한 항체의 혈액내 수준을 측정함으로써 지시되는 바에 따라 불규칙적일 수 있다. 몇몇 방법에서, 투여량은 혈장 항체 농도가 약 1-1000 ㎍/ml에 도달하도록, 몇몇 방법에서는 약 25-300 ㎍/ml에 도달하도록 조정된다.
IFNAR1에 대한 항체를 또다른 제제와 함꼐 투여하는 경우, 2개는 임의의 순서대로 또는 동시에 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 하기 제제들 중 하나 이상과 함께 조합하여 사용될 수 있다: 메살라민(설파살라진 및 5-아미노살리실산(5-ASA)을 함유하는 기타 다른 제제, 예로서, 올살라진 및 발살라진)을 함유하는 약물, 비스테로이드성 소염제 약물(NSAID: non-steroidal antiinflammatory drug), 진통제, 코르티코스테로이드(예로서, 프레드니손, 하이드로코르티손), TNF-저해제(아달리무맙(HUMIRA®), 이타너셉트(ENBREL®) 및 인플릭시맙(REMICADE®) 포함), 면역억제제(예로서, 6-머캅토퓨린, 아자티오프린 및 사이클로스포린 A), 및 항생제 항IFNα 항체, 항IFNγ 수용체 항체, 및 가용성 IFNγ 수용체. 추가로, 본 발명의 항IFNAR1 항체는 Flt3 리간드 길항제(예로서, 미국 출원 번호 2002/0160974 참조)와 함께 조합하여 사용될 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 조성물은 또한 SLE 치료에 유용한 제제를 포함할 수 있다. 그러한 제제로는 진통제, 코르티코스테로이드(예로서, 프레드니손, 하이드로코르티손), 면역억제제(예로서, 사이클로포스파미드, 면역억제제 및 메토트렉세이트), 항말라리아제(예로서, 하이드록시클로로퀸) 및 dsDNA 항체의 생산을 저해시키는 생물학적 약물(예로서, LJP 394)을 포함한다.
5.13 등가물
당업자라면 통상적인 실험만을 이용하여도 본원에 기술된 본 발명의 실시태양에 대한 많은 등가물을 인식하거나, 확인할 수 있을 것이다.
본 명세서에서 언급한 모든 공개 문헌, 특허 및 특허 출원은 마치 각 개개의 공개 문헌, 특허 및 특허 출원이 본원에서 참고로 인용된다고 구체적으로 개별적으로 언급되어 있는 것과 동일한 정도로 본원에서 참고로 인용된다.
또한, 하기 미국 가특허 출원: 제61/006,962호(2008년 2월 8일 출원), 제61/034,618호(2007년 3월 7일 출원), 및 제61/049,970호(2008년 5월 2일 출원)는 그의 전문이 모든 목적을 위해 본원에서 참고로 인용된다.
5.14 구체적인 실시태양
1. L234F, L235E, 및 P331S(문헌 [Kabat]에 기재된 바와 같이 EU 인덱스에 의해 번호화된 것)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환을 Fc 영역 중에 포함하며, 여기서, 비변형된 항체와 비교하여 적어도 하나의 Fc 리간드에 대하여 감소된 친화성을 나타내는, IFNAR1에 대해 특이성인 변형된 IgG 부류의 모노클로날 항체.
2. 실시태양 1에 있어서, 상기 항체가 IgG1 또는 IgIgG4 서브부류인 것인 항체.
3. 실시태양 2에 있어서, 상기 항체가 IgG1 부류 분자인 것인 항체.
4. 실시태양 3에 있어서, 상기 항체가 P331S의 아미노산 치환을 포함하는 것인 항체.
5. 실시태양 3에 있어서, 상기 항체가 아미노산 치환: L234F 및 L235E를 포함하는 것인 항체.
6. 실시태양 3에 있어서, 상기 항체가 아미노산 치환: L234F, L235E 및 P331S를 포함하는 것인 항체.
7. 실시태양 3에 있어서, 상기 항체가 IgG4 부류 분자인 것인 항체.
8. 실시태양 7에 있어서, 상기 항체가 Fc 영역의 L235E의 아미노산 치환을 포함하는 것인 항체.
9. 실시태양 7에 있어서, 상기 항체가 추가로 Fc 영역 중에 아미노산 치환 S228P를 포함하는 것인 항체.
10. 실시태양 1-9 중 어느 한 실시태양에 있어서, 상기 항체가 표 2로부터 선택되는 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 것인 항체.
11. 실시태양 1-10 중 어느 한 실시태양에 있어서, 상기 항체가:
a. 서열 번호 31을 포함하는 인간 중쇄 가변 영역 CDR1;
b. 서열 번호 32를 포함하는 인간 중쇄 가변 영역 CDR2;
c. 서열 번호 33을 포함하는 인간 중쇄 가변 영역 CDR3;
d. 서열 번호 34를 포함하는 인간 경쇄 가변 영역 CDR1;
e. 서열 번호 35를 포함하는 인간 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
f. 서열 번호 36을 포함하는 인간 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 것인 항체.
12. 실시태양 1-10 중 어느 한 실시태양에 있어서, 상기 항체가:
a. 서열 번호 1을 포함하는 인간 경쇄 가변 영역 CDR1;
b. 서열 번호 2를 포함하는 인간 경쇄 가변 영역 CDR2;
c. 서열 번호 3을 포함하는 인간 경쇄 가변 영역 CDR3;
d. 서열 번호 4를 포함하는 인간 중쇄 가변 영역 CDR1;
e. 서열 번호 5를 포함하는 인간 중쇄 가변 영역 CDR2; 및
f. 서열 번호 6을 포함하는 인간 중쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 것인 항체.
13. 실시태양 1-10 중 어느 한 실시태양에 있어서, 상기 항체가:
a. 서열 번호 11을 포함하는 인간 중쇄 가변 영역 CDR1;
b. 서열 번호 12를 포함하는 인간 중쇄 가변 영역 CDR2;
c. 서열 번호 13을 포함하는 인간 중쇄 가변 영역 CDR3;
d. 서열 번호 14를 포함하는 인간 경쇄 가변 영역 CDR1;
e. 서열 번호 15를 포함하는 인간 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
f. 서열 번호 16을 포함하는 인간 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 것인 항체.
14. 실시태양 1-10 중 어느 한 실시태양에 있어서, 상기 항체가:
a. 서열 번호 21을 포함하는 인간 경쇄 가변 영역 CDR1;
b. 서열 번호 22를 포함하는 인간 경쇄 가변 영역 CDR2;
c. 서열 번호 23을 포함하는 인간 경쇄 가변 영역 CDR3;
d. 서열 번호 24를 포함하는 인간 중쇄 가변 영역 CDR1;
e. 서열 번호 25를 포함하는 인간 중쇄 가변 영역 CDR2; 및
f. 서열 번호 26을 포함하는 인간 중쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 것인 항체.
15. 실시태양 1-10 중 어느 한 실시태양에 있어서, 상기 항체가
a. 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 인간 중쇄 가변 영역; 및
b. 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 인간 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체.
16. 실시태양 1-10 중 어느 한 실시태양에 있어서, 상기 항체가
a. 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 인간 중쇄 가변 영역; 및
b. 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 인간 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체.
17. 실시태양 1-10 중 어느 한 실시태양에 있어서, 상기 항체가
a. 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 인간 중쇄 가변 영역; 및
b. 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 인간 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체.
18. 실시태양 1-10 중 어느 한 실시태양에 있어서, 상기 항체가
a. 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 인간 중쇄 가변 영역; 및
b. 서열 번호30의 아미노산 서열을 포함하는 인간 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체.
19. 실시태양 1-18 중 어느 한 실시태양에 있어서, 상기 항체가 서열 번호 41의 경쇄 불변 영역 서열을 포함하는 것인 항체.
20. 실시태양 1-18 중 어느 한 실시태양에 있어서, 상기 항체가 서열 번호 42의 중쇄 불변 영역 서열을 포함하는 것인 항체.
21. 실시태양 1-18 중 어느 한 실시태양에 있어서, 상기 항체가 서열 번호 41의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역 및 서열 번호 42의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하는 것인 항체.
22. 실시태양 19-21 중 어느 한 실시태양에 있어서, 상기 항체가 대립형질 변이를 포함하는 중쇄 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, 상기 대립형질 변이는 214, 221, 356 및 358(EU 인덱스 번호화 체계에 의해 정의된 것)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 위치에 있는 것인 항체.
23. 실시태양 1-22 중 어느 한 실시태양에 있어서, 상기 항체가 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 인트라바디, 및 합성 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 항체.
24. 실시태양 1-23 중 어느 한 실시태양의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
25. 실시태양 24에 있어서, 상기 핵산이 복제가능한 벡터인 것인 핵산.
26. 실시태양 25에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 핵산.
27. 실시태양 25 또는 26의 벡터를 포함하거나, 그로 형질전환된 것인 숙주 세포.
28. 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 트랜스진을 포함하고, 실시태양 1-23 중 어느 한 실시태양의 항체를 발현하는 것인 트랜스제닉 마우스.
29. 상기 항체를 생산하는, 실시태양 28의 마우스로부터 제조된 하이브리도마.
30. 실시태양 1-23 중 어느 한 실시태양의 항체, 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
31. 면역 질병과 관련된 병태 또는 질환을 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 피험체에게 실시태양 30의 조성물을 유효량 투여하는 단계를 포함하는, 치료하는 방법.
32. 실시태양 31에 있어서, 상기 질환이 I형 인터페론이 매개된 질환인 것인 방법.
33. 실시태양 32에 있어서, 상기 I형 인터페론이 인터페론 알파인 것인 방법.
34. 실시태양 33에 있어서, 상기 I형 인터페론이 매개된 질환이 I형 인터페론 수용체와 관련된 것인 방법.
35. 실시태양 31에 있어서, 상기 질환 또는 질병이 AIDS의 HIV 감염인 것인 방법.
36. 실시태양 31에 있어서, 상기 질환 또는 질병이 전신 홍반 루푸스인 것인 방법.
37. 실시태양 31에 있어서, 상기 질환 또는 질병이 쇼그렌 증후군인 것인 방법.
38. 실시태양 31에 있어서, 상기 질환 또는 질병이 근육염인 것인 방법.
39. 실시태양 31에 있어서, 상기 질환 또는 질병이 염증성 근육염인 것인 방법.
40. 실시태양 31에 있어서, 상기 질환 또는 질병이 다발성 근육염인 것인 방법.
41. 실시태양 31에 있어서, 상기 질환 또는 질병이 피부근육염인 것인 방법.
42. 실시태양 31에 있어서, 상기 질환 또는 질병이 봉입체 근육염인 것인 방법.
43. 실시태양 31에 있어서, 상기 질환 또는 질병이 소아 근육염인 것인 방법.
44. 실시태양 31에 있어서, 상기 질환 또는 질병이 특발성 염증성 근육염인 것인 방법.
45. 실시태양 31에 있어서, 상기 질환 또는 질병이 혈관염인 것인 방법.
46. 실시태양 31에 있어서, 상기 질환 또는 질병이 사르코이드증인 것인 방법.
47. 실시태양 31에 있어서, 상기 질환 또는 질병이 염증성 장 질환, 다발 경화증, 자가면역 갑상선염, 류마티스 관절염, 인슐린 의존성 당뇨병, 사구체신염, 및 이식편 대 숙주 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
48. 실시태양 31에 있어서, 상기 질환 또는 질병이 건선 또는 그의 결과로 유발되는 병태인 것인 방법.
49. 실시태양 31에 있어서, 상기 질환 또는 질병이 이식 거부 또는 이식편 대 숙주 질환인 것인 방법.
50. 실시태양 31에 있어서, 상기 질환 또는 질병이 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 크론병, 건선, 건선성 관절염, 교감성 안염, 자가면역 난소염, 자가면역 고환염, 자가면역 림프증식 증후군, 항인지질 증후군, 쇼그렌 증후군, 공피증, 애디슨병, 다내분비선 결핍 증후군, 길랭-바레 증후군, 면역 혈소판감소성 자색반병, 악성 빈혈, 중증 근육무력증, 원발성 담즙성 간경변, 혼합 결합 조직병, 백반증, 자가면역 포도막염, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 저혈소판증, 셀리아크병, 포진성 피부염, 자가면역 간염, 천포창, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 수포성 유천포창, 자가면역 심근염, 자가면역 혈관염, 원형 탈모증, 자가면역 아태롬성동맥경화증, 베체트병, 자가면역 골수병, 자가면역 혈우병, 자가면역 간질성 방광염, 자가면역 요붕증, 자가면역 자궁내막증, 재발성 다발성 연골염, 강직성 척추염, 자가면역 두드러기, 피부근육염, 밀러-피셔 증후군, IgA 신장병증, 굿파스처 증후군, 및 임신 헤르페스로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
51. 실시태양 31-50 중 어느 한 실시태양에 있어서, 광선요법, 코르티코스테로이드, 프레드니손, NSAIDS, 혈장분리반출술, 면역억제제, 메토트렉세이트, 레티노산, 티오구아닌, 미코페놀레이트 모페틸, 푸마르산 에스테르, 사이클로포스파미드, 아자티오프린 사이클로스포린, 및 면역글로불린으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
52. 실시태양 31-51 중 어느 한 실시태양에 있어서, 알레파셉트(AMEVIVE™), 이타너셉트(ENBREL®), 아달리무맙(HUMIRA®), 인플릭시맙(REMICADE®), 벨리무맙(LYMPHOSTATB™), 리툭수맙(RITUXAN®), 및 에팔리주맙(RAPTIVA®)으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
53. 인간 IgG Fc 영역이 L234F, L235E, 및 P331S(문헌 [Kabat]에 기재된 바와 같이 EU 인덱스에 의해 번호화된 것)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서, 상기 단편은 비변형된 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 Fc 리간드에 대하여 감소된 친화성을 나타내는 것인, 인간 IgG Fc 영역을 포함하는 결정.
54. 실시태양 53에 있어서, 인간 IgG Fc 영역이 아미노산 치환 L234F, L235E 및 P331S를 포함하는 것인 결정.
55. 실시태양 53에 있어서, 양질의 회절을 나타내는 것인 결정.
56. 실시태양 53에 있어서, 천연 결정인 것인 결정.
57. 실시태양 53에 있어서, a=50.18±0.2 Å, b=147.30±0.2 Å, 및 c=75.47±0.2 Å의 사방결정계 유닛 셀을 특징으로 하는 것인 결정.
58. 실시태양 53에 있어서, C2221의 공간군을 갖는 것인 결정.
59. 아미노산 치환 L234F, L235E, 및 P331S(문헌 [Kabat]에 기재된 바와 같이 EU 인덱스에 의해 번호화된 것)를 Fc 영역 중에 포함하며, 여기서, 비변형된 항체와 비교하여 적어도 하나의 Fc 리간드에 대하여 감소된 친화성을 나타내는, 변형된 모노클로날 항체.
60. Fc 영역이 아미노산 치환 L234F, L235E, 및 P331S(문헌 [Kabat]에 기재된 바와 같이 EU 인덱스에 의해 번호화된 것)를 포함하고, 여기서, 상기 Fc 영역이 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 Fc 리간드에 대하여 감소된 친화성을 나타내는 것인, 변형된 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질.
61. 실시태양 1-23 또는 59 중 어느 한 실시태양의 항체를 제조하는 방법.
62. 실시태양 1-23 또는 59 중 어느 한 실시태양에 있어서, 상기 항체가 내재화 항체인 것인 항체.
63. 실시태양 60에 있어서, 상기 융합 단백질이 내재화 융합 단백질인 것인 융합 단백질.
64. 실시태양 63에 있어서, 상기 융합 단백질이 IFNAR1에 특이적으로 결합하는 것인 융합 단백질.
65. 실시태양 1-23, 59, 또는 62 중 어느 한 실시태양에 있어서, 상기 항체가 상기 비변형된 항체와 비교하여 감소되거나 제거된 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 나타내는 것인 항체.
66. 실시태양 1-23, 59, 또는 62 중 어느 한 실시태양에 있어서, 상기 항체가 상기 비변형된 항체와 비교하여 감소되거나 제거된 보체 매개된 세포독성(CDC)을 나타내는 것인 항체.
67. 실시태양 1-23, 59, 또는 62 중 어느 한 실시태양에 있어서, 상기 항체가 상기 비변형된 항체와 비교하여 감소되거나 제거된 ADCC 및 CDC를 나타내는 것인 항체.
5.15 서열
경쇄 불변 영역 (서열 번호 41)
Figure 112010058184517-pct00004
중쇄 불변 영역 (서열 번호 42)
Figure 112010058184517-pct00005
6. 실시예
이에 본 발명은 하기 실시예를 참고로 하여 설명한다. 이들 실시예는 단지 설명하기 위한 목적으로 제공되는 것이며, 본 발명은 어느 방식으로든 이들 실시예로 제한되는 것으로서 해석되지 않아야 하며, 본원에서 제공하는 교시의 결과로서 명백해진 임의의 그리고 모든 변형을 포함하는 것으로서 해석되어야 한다.
6.1 실시예 1: 다중 항 IFNAR1 항체의 IHC 프로필
목적: 다양한 조직 세트 상에서 항IFNAR1 항체의 IHC 프로필을 평가하고자 한다.
방법: 항체 결합 특징을 연구하는 면역조직화학 기법은 당업계에서 쉽게 알 수 있으며, 이는 예를 들면, 원하는 세포 또는 조직을 단리시키고, 표준 고정 및 탑재 기법에 의해서 상기 세포 또는 조직을 현미경법을 위해 준비함으로써 수행될 수 있다.
마우스 대식세포: 세포 현탁액을 원심 침전시켜 소성 펠릿을 형성하였다. 펠릿을 OCT 냉동 배지 중에서 냉동시켜 블록을 형성하였다. 슬라이드 절편을 두께 5 마이크론으로 절단하고, 이를 10분 동안 아세톤에 침지시키고, 건조제를 사용하여 밤새도록 건조시켰다. 사용하기 이전에 슬라이드를 10초 동안 10% 중성 완충처리된 포르말린 중에 디핑하고, 완충액 중 (0.01% Tween20을 포함하는 1X TBS)에서 3회에 걸쳐 세척하였다.
인간 단핵구: 세포 현탁액을 직접 슬라이드 상에 도말/스폿팅하였다. 슬라이드를 밤새도록 건조시킨 후, 10분 동안 아세톤에 침지시키고, 대기 건조시켰다. 사용하기 이전에 슬라이드를 10초 동안 10% 중성 완충처리된 포르말린 중에 디핑하고, 완충액 중 (0.01% Tween20을 포함하는 1X TBS)에서 3회에 걸쳐 세척하였다.
인간 대뇌 및 심장 조직: 기증자로부터 얻은 조직 샘플을 OCT 냉동 배지 중에서 냉동시켜 블록을 형성하였다. 슬라이드 절편을 두께 5 마이크론으로 절단하고, 이를 10분 동안 아세톤에 침지시키고, 건조제를 사용하여 밤새도록 건조시켰다. 사용하기 이전에 슬라이드를 10초 동안 10% 중성 완충처리된 포르말린 중에 디핑하고, 완충액 중 (0.01% Tween20을 포함하는 1X TBS)에서 3회에 걸쳐 세척하였다.
항체 표지화: 하기 프로토콜에 의해 항체를 비오틴에 접합시켰다. 대략 500 ㎍의 항체를 20배 과량의 비오틴과 함께 혼합하고, 4℃ 암실에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 2시간에 걸친 인큐베이션 후에 항체/비오틴 믹스를 1X PBS로 왔다가 사전 평형화된 PD10 칼럼에 가하였다. 이어서, YM-30 센트리콘(Centricon) 농축 튜브를 사용하여 비오틴 접합된 항체를 원하는 농도로 농축시켰다.
슬라이드 염색: 완충액 중에서 세척한 후, 1시간 동안 실온에서 글루코스 옥시다제(1 U/ml, Sigma G0543), B-D(+) 글루코스(10 mM, Sigma G5250), 아지드화 나트륨(1 mM, Sigma, S8032) 용액으로 처리함으로써 슬라이드 처리로 내인성 퍼옥시다제를 퀸칭시켰다. 이어서, 슬라이드를 세척 완충액(1X TBS, 0.01% Tween 20 포함) 중에서 세정하였다. 실온에서 30분 동안 슬라이드를 단백질 차단 용액 (1x PBS(pH 7.2), 0.5% 카제인(N-Z 아민, Sigma C0626), 1% BSA(Sigma A7906), 1.5% 일반 염소 혈청(Jackson Labs #005-000-001) 중에 놓았다. 비오틴화된 항체(상기 참조)를 단백질 차단 용액 내로 희석시킴으로써 슬라이드에 가하였다. 실온에서 2시간 동안 슬라이드를 비오틴화된 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 세척 완충액(1X TBS, 0.01% Tween 20) 중에서 슬라이드를 3회에 걸쳐 세정하였다. 벡타스테인 키트(Vectastain Kit)(Vector Laboratories)를 사용하여 항체를 검출하였다. 슬라이드를 세척하고, 헤마톡실린으로 대조 염색시켰다. 슬라이드를 탈수시키고, 관찰하기 전에 커버슬립을 탑재하였다.
결과: 각종 항IFNAR1 및 대조군 항체로 염색된 인간 대뇌 조직에 관해 IHC 분석한 결과는 도 6A에 제시되어 있다. 샘플 전역에 걸쳐 관찰되는 갈색/검은색 염색으로 예시되는 바와 같이, 항체 MDX-1333 (75 ㎍/ml) 및 4G5 (50 ㎍/ml)는 대뇌 조직이 강하게 염색된 것을 보였다. MDX-1333 및 4G5 뿐만 아니라, 항체 9D4 (50 ㎍/ml)는 샘플 전역에 걸쳐 갈색/검은색 염색이 감소된 것으로 입증되는 바와 같이, 인간 대뇌 조직 샘플을 염색시키지는 못했다. 개개 항체의 결합 특이성을 입증하기 위해 IgG1 이소형 대조군을 포함시켰다.
각종 항IFNAR1 및 대조군 항체로 염색시킨 단핵구에 관해 IHC 분석한 결과는 도 6B에 제시되어 있다. 샘플이 갈색/검은색으로 염색된 것으로 입증되는 바와 같이, 항체 MDX-1333(50 및 20 ㎍/ml), 4G5(50 ㎍/ml) 및 9D4(50 및 20 ㎍/ml), 모두 인간 단핵구 상에서 뚜렷한 염색을 나타내었다. 이소형 대조군 항체 R3-47(50 ㎍/ml)는 인간 단핵구 상에서 뚜렷한 염색을 나타내지 못했다. 또한, MDX-1333(50 ㎍/ml)은 정제된 마우스 대식세포는 마우스 대식세포를 염색시키지 못했다.
결론: IHC 연구에서, 항IFNAR1 항체 9D4는 기타 다른 항IFNAR1 항체, 예로서, MDX-1333 및 4G5와 비교하여 더 낮은 수준의 염색을 나타내었다.
6.2 실시예 2: 항체 9 D4 TM
하기 방법을 통해 "9D4-TM"으로 지정된 변형된 항IFNAR1 항체를 생성하였다;
먼저 전체 RNA를 단리시키고, cDNA로 전사시킨 후, 포유동물 벡터 PEE6 내로 클로닝시키기 위해 제한 부위 ApaI 및 EcoRI를 함유하는 유전자 특이 프라이머로 불변 영역을 PCR 증폭시킴으로써 인간 γ1 Fc를 인간 PBL로부터 클로닝하고 공학처리하였다. 삼중 돌연변이체(TM)는 인간 IgG에 ADCC 효과기 기능(L234F, L235E, 및 P331S)을 감소시키는 3개의 아미노산 변화를 포함한다. 주형으로서는 인간 IgG1(KOL)을 사용하고, 부위 지정 돌연변이유발법(QuickChange XL, Stratagene)을 이용하여 TM을 공학처리함으로써 Fc 중에서 3개의 잔기 변화를 코딩하였다. L234F/L235E/P331S 변화를 코딩하는 데 사용된 돌연변이유발 프라이머의 서열은 하기와 같았다:
MD 1056 = 5' cgtgcccagcacctgaaTtcGAggggggaccgtcagtcttc 3' L234F, L235E 전방향(서열 번호 43)
MD 1057 = 5' gaagactgacggtccccccTCgaAttcaggtgctgggcacg 3' L234F, L235E 역방향(서열 번호 44)
MD 1058 = 5' ccaacaaagccctcccagccTccatcgagaaaaccatctcc 3' P331S 전방향(서열 번호 45)
MD 1059 = 5' ggagatggttttctcgatggAggctgggagggctttgttgg 3' P331S 역방향(서열 번호 46)
9D4-TM 항체를 코딩하는 클론을 시퀀싱하여 삼중 돌연변이를 확인하고, ABI3100 유전자 분석기 상에서 분석하였다.
6.3 실시예 3: 항체 9 D4 DM 생성
하기 방법을 통해 "9D4-DM"으로 지정된 변형된 항IFNAR1 항체를 생성하였다;
먼저 전체 RNA를 단리시키고, cDNA로 전사시킨 후, 포유동물 벡터 PEE6 내로 클로닝시키기 위해 제한 부위 ApaI 및 EcoRI를 함유하는 유전자 특이 프라이머로 불변 영역을 PCR 증폭시킴으로써 인간 γ4 Fc를 인간 PBL로부터 클로닝하고 공학처리하였다. 삼중 돌연변이체(TM)는 인간 IgG에 ADCC 효과기 기능(L234F, L235E, 및 P331S)을 감소시키는 3개의 아미노산 변화를 포함한다. 주형으로서는 인간 IgG1(KOL)을 사용하고, 부위 지정 돌연변이유발법(QuickChange XL, Stratagene)을 이용하여 TM을 공학처리함으로써 Fc 중에서 3개의 잔기 변화를 코딩하였다. L234F/L235E/P331S 변화를 코딩하는 데 사용된 돌연변이유발 프라이머의 서열은 하기와 같았다:
이중 돌연변이체(DM)는 인간 IgG4 Fc에 2개의 돌연변이: S228P 및 L235E로 구성된다. DM을 코딩하는 돌연변이유발 프라이머는 하기를 포함한다:
MD 1060 = 5' ggtcccccatgcccaCcatgcccagcacctg 3' 힌지 S228P 전방향(서열 번호 47)
MD 1061 = 5' caggtgctgggcatgGtgggcatgggggacc 3' 힌지 S228P 역방향(서열 번호 48)
MD 1062 = 5 ' ccagcacctgagttcGAggggggaccatcagtc 3 'IgG4 L234F, L235E 전방향(서열 번호 49)
MD 1063 = 5' gactgatggtccccccTCgaactcaggtgctgg 3' IgG4 L234F, L235E 역방향(서열 번호 50)
9D4-DM 항체를 코딩하는 클론을 시퀀싱하여 코딩된 변화를 확인하고, ABI3100 유전자 분석기 상에서 분석하였다.
6.4 실시예 4 항 IFNAR1 항체는 IFN 매개된 STAT 인산화를 저해시킨다
목적: 항IFNAR1 항체 9D4-TM이 말초 혈액 단핵 세포에서 IFN 매개된 STAT 인산화를 저해시킬 수 있는 능력을 확립시키고자 한다.
방법: LSM 배지(오하이오주 솔론 소재의 MP Biomedical)를 사용하여 건강한 인간 기증자로부터 말초 혈액 단핵 세포를 정제하였다. PBMC를 정량하고, 조건 1개마다 웰당 106개의 세포로 시딩하였다. 항체를 10 ㎍/mL로 적절한 웰에 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 항체와 함께 사전 인큐베이션시킨 후, 재조합 인간 IFN α2a(뉴저지주 피츠카타웨이 소재의 PBL Biomedical) 또는 인간 형질세포모양 가지 세포 유래의 IFN(PDC 유래의 I형 IFN 상등액 생성에 대해서는 하기 참조)을 100 또는 500 IU/mL로 20분 동안 적절한 웰에 첨가하였다. 세포를 1200 rpm으로 5분 동안 회전시키고, 멸균 1x PBS로 세척하였다. 추가로 한번 더 회전시킨 후, PBS를 제거하고, 300 ㎕의 1x 포스파타제 저해제 칵테일 1 및 2(미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma) 및 1x 프로테아제 저해제(뉴저지주 너틀리 소재의 Roche Biomedical)로 보충된 포유동물 단백질 추출 시약(일리노이주 로크포드 소재의 Pierce)을 사용하여 세포를 용해시켰다. 용해물을 궤도식 진탕기 상에서 10분 동안 인큐베이션시켜 완전하게 용해시키고, 마이크로퓨즈(microfuge) 튜브로 옮기고, 14000 rpm으로 회전시켜 세포 파편을 제거하였다. 최종 농도 1x이 되도록 NuPAGE 샘플 완충액(캘리포니아주 칼즈배드 소재의 Invitrogen) 및 dTT(미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma)을 용해물에 첨가하고, 모든 샘플을 열 블록 중 100℃에서 대략 10분 동안 변성시켰다. 15 ㎕의 각각의 샘플을 1x NuPAGE 항산화제 완충액으로 보충된 NuPAGE MES SDS 전개 완충액 중 NuPage 10% 비스-트리스 폴리아크릴아미드 겔(캘리포니아주 칼즈배드 소재의 Invitrogen)에 첨가하였다. 단백질 밴드 분리를 위해 30분 동안 180 V에서 샘플을 전개시켰다. 이어서, 4℃에서 밤새도록 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 5% BSA(미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma)를 함유하는 1xPBS(캘리포니아주 칼즈배드 소재의 Gibco BRL)로 블롯을 차단하였다. 이어서, 차단 배지를 제거하고, 0.2 ㎍/mL 항STAT1, 항STAT1 pY701, 또는 1:1000의 β-액틴 항체 희석액(매사추세츠주 댄버스 소재의 Cell Signaling Technology)을 적절한 블롯에 첨가하고, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 블롯을 0.05% 트윈 20(미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma)으로 1x TBS 중에서 3회에 걸쳐 세척하였다. 1:2500로 희석된, HRP 접합된 항토끼 2차 항체를 블롯에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 상기 기술된 바와 같이 블롯을 세척하고, 1:1의 피코 수퍼시그널 웨스트(Pico Supersignal West) 시약 혼합물(일리노이주 록퍼드 소재의 Pierce) 3 mL를 1분 동안 각 블롯에 첨가하였다. 블롯을 배출시키고, 과량을 시약을 제거하고, 코닥 X-오매트 1000A 프로세서(Kodak X-omat 1000A Processor)를 사용하여 밴드를 시각화하였다.
결과: 항IFNAR1 항체의 존재 또는 부재하에서 백혈구 IFN으로 세포가 자극을 받은 것인 STAT 활성화 분석법의 결과는 도 7에 제시되어 있다. 항체의 부재하에서 백혈구 인터페론이 STAT 이소폼 1, 3 및 5의 인산화를 자극하였다. 세포를 9D4-TM 항체와 함께 인큐베이션시키면 백혈구 인터페론 처리로 매개되는 인산화는 저해되었다. 이소형 대조군 항체 R3-47로 처리된 세포는 백혈구 인터페론 자극에 대한 반응으로 일어나는 STAT 인산화를 저해시키지 못한 것으로 나타났다.
결론: 도 7의 결과는 9D4-TM이 IFNα에 대한 반응, 예로서, 말초 혈액 단핵 세포에서의 STAT 인산화 유도를 저해시킬 수 있다는 것을 입증한다.
6.5 실시예 5: 항 IFNAR1 항체가 I형 IFN 신호전달을 저해시킨다
목적: pDC 세포로부터의 정제된 I형 IFN을 이용하여 리포터 분석법을 사용함으로써 I형 IFN 신호전달을 차단시킬 수 있는 항IFNAR1 항체의 능력에 대해 시험하였다.
방법: 림프구 분리 배지(오하이오주 솔론 소재의 MP Biomedical)를 사용하여 건강한 기증자의 전혈로부터 형질세포모양 가지 세포(PDC)를 단리시키고, CD304(BDCA-4/뉴로필린-1(Neuropilin-1)) 마이크로비드 키트(MicroBead Kit) (캘리포니아주 오번 소재의 Milteny Biotec)를 사용하여 양성 선별을 실시하였다. 이어서, 10% FBS(Gibco BRL) 및 6 ㎍/mL CpGA(캘리포니아주 샌디에고 소재의 InVivogen)로 보충된 RPMI 1640 중에서 정제된 PDC를 1x106개의 세포/mL로 배양하였다. 상등액을 수거하고, 배양물 중에서 20시간이 경과한 후에 정화시키고, 안정하게 형질감염된 HEK293-ISRE 리포터 세포주를 사용하여 I형 IFN를 인간 백혈구 IFN(뉴저지주 피츠카타웨이 소재의 PBL Biomedical)의 표준 곡선에 대하여 정량하였다.
상기 기술한 바와 같이, 3명의 건강한 인간 기증자로부터 유래된 pDC를 사용하여 인간 pDC 유래의 I형 인터페론 상등액을 생성하였다. HEK293(버지니아주 매나사스 소재의 ATCC) 세포를 pHTS-ISRE로 리포팅된 플라스미드(캘리포니아주 샌디에고 소재의 Biomyx Technology) 안정하게 형질감염시키고, 10% FBS, 1x NEAA, 및 700 ㎍/mL G418(캘리포니아주 칼즈배드 소재의 Invitrogen)로 보충된 DMEM 중에서 유지시켰다. 옵틸릭스(Optilix) 백색/투명 96 웰 플레이트(펜실베니아주 웨스트체스터 소재의 VWR) 중에 웰당 80,000개의 세포인 농도로 세포를 시딩하였다. 적절한 농도의 항체 (611-0.00004 nM)를 각 웰에 첨가한 후, 적절한 농도의 인간 PDC 유래의 I형 인터페론 상등액을 첨가하였다. 세포, IFN, 및 항체를 밤새도록 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시키고, 세포 배양물 용해 시약을 사용하여 세포를 용해시키고, 루시퍼라제 분석 시스템(위스콘신주 매디슨 소재의 Promega)을 사용하여 시각화함으로써 루시퍼라제 단백질의 증폭을 평가하였다. 신호(cps)를 측정하고, IC50 값을 작성하였다.
결과: 개개의 기증자 3명으로부터 유래된 pDC 세포로부터 I형 IFN 상등액을 수거하였다. 루시퍼라제 리포터 분석에서 항IFNAR1 항체를 인큐베이션시키면 다양한 농도의 I형 IFN 상등액이 갖는 신호전달 능력을 저해되었다(도 8).
결론: 이러한 결과는, 리포터 분석 활성에 의해 측정된 바, 항IFNAR1 항체가 I형 IFN 매개된 신호전달을 저해시킬 수 있다는 것을 입증한다.
6.6 실시예 6: 변형된 항 IFNAR1 항체는 비변형된 모체 항체와 유사한 결합 특징을 나타낸다.
목적: 비변형된 모체 버전과 비교되는 변형된 항체의 IFNAR1 결합 특징을 조사하기 위한 것이다. 9D4, 9D4DM, 및 9D4TM에 대한 결합 친화도 곡선은 도 9에 제시되어 있다. 9D4, 9D4DM, 및 9D4TM 항IFNAR1 항체에 대한 결합 상수(Kd)를 결합 곡선으로부터 측정하였다.
방법: 10% FBS로 보충된 50 ㎕ RPMI 1640 배지를 사용하여 200,000개의 HEK 293F 세포를 둥근 바닥의 96 웰 플레이트에 시딩하였다. 퍼킨엘머 라이프(PerkinElmer Life)와 아날리티컬 사이언스(Analytical Sciences)의 계약하에 유로퓸으로 표지된 9D4-TM을 제조하였다. 비특이 유로퓸 신호를 측정하기 위해, 표지된 9D4-TM을 첨가하기 전에 5-10분 동안 100배 과량의 비표지된, 일련의 희석된 항IFNAR1 항체 25 ㎕를 적절한 웰에 첨가하였다. 이어서, 유로퓸이 접합된, 일련의 희석된 항체 25 ㎕를 적절한 웰에 첨가하고, 세포와 항체를 1-2시간 동안 실온에서 완만하게 교반시켰다. 결합 인큐베이션 이후, 150 ㎕의 세포 배지를 모든 웰에 첨가하고, 플레이트를 1200 rpm으로 5분 동안 실온에서 회전시켰다. 플레이트를 신속하게 경사분리시키고, 250 ㎕의 세포 배지를 모든 웰에 첨가하였다. 회전과 세척을 반복하여 총 3회에 걸쳐 세척하였다. 이어서, 세포를 100 ㎕의 세포 배지 중에 재현탁시켰다. 50 ㎕의 재현탁된 세포를 DELPHIA 황색 미세역가 플레이트 중 200 ㎕의 DELPHIA 증강액(PerkinElmer)으로 옮기고, 빅터2 다중표지 판독기(Victor2 Multilabel reader) (PerkinElmer) 상에서 유로퓸 방출량을 측정하였다. 신호(cps)를 측정하고, 그래프패드 프리즘 4(GraphPad Prism 4) 분석 소프트웨어를 사용하여 Kd 값 및 B최대 값을 작성하였다.
결과: 도 9에 제시된 데이타는, 변형된 항체 9D4-TM 및 9D4-DM의 IFNAR1에 대한 결합 친화도(9D4 = 0.06 +/- 0.02 nM, 9D4-DM = 0.06 +/- 0.02 nM, 9D4-TM = 0.03 +/- 0.01 nM)는 비변형된 모체 항체와 유사하다는 것을 입증한다.
결론: 본 실시예에서 제시된 데이타는, 변형된 항체가 비변형된 모체 항체와 함께 유사한 IFNAR1 결합 특징을 공유한다는 것을 입증한다.
6.7 실시예 7: 9 D4 - TM 대 sIFN α RI 에 대한 평형 결합 분석 데이타
목적: 가용성 IFNAR1(srIFNAR1)을 사용하여 9D4-TM에 대한 평형 결합 데이타를 측정하고자 한다.
방법: 4℃에서 1-2일간의 기간 동안 srIFNAR1 리간드를 코팅 완충액(50 mM 탄산나트륨 완충액(pH 9)) 중 5 ㎍/mL 및 50 ㎍/mL의 농도로 울트라링크® 바이오서포트 비드(UltraLink® Biosupport bead)(일리노이주 록퍼드 소재의 PIERCE) 상에 코팅하였다. 이어서, 비반응 리간드 용액으로부터 코팅된 비드를 분리하고(완만한 펄스 회전), 실온(RT)에서 약 15분 동안 차단 완충액(1 mL 1 M 트리스 (pH 8), 10 mg/mL BSA 함유) 중에서 완만하게 흔들어 주었다. 이어서, 비드 슬러리를 다시 회전시켜 차단액을 제거한 후, 신선한 분취량의 차단 완충액을 사용하여 RT에서 약 2시간 동안 차단 단계를 반복하였다. 차단 단계 이후, 사용할 때까지 코팅된 비드를 4℃에서 보관하였다. 사용하기 전에 srIFNAR1 코팅된 비드를 비드 바이알로 옮기고, 27 mL의 장치 전개 완충액(PBS, pH 7.4 - 0.02% NaN3) 중에 재현탁시킨 후, KinExA 3000 장치에 부착시켰다.
KinExA 3000 장치(아이다호주 보이스 소재의 Sapidyne Instruments) 상에서 측정하여 모든 평형 결합 상수(KD)를 수득하였다. 간략히 설명하면, 9D4-TM IgG를 1 pM, 10 pM 및 50 pM으로 제조하고, 3개의 일련의 튜브로 분배하였다. 수용체- 및 KD-조절된 조건, 둘 모두하에서 측정할 수 있도록 하기 위해 IgG 농도를 상기 범위로 디자인하였다. 이어서, 2배로 희석된 일련의 srIFNAR1 리간드 희석액을 19.5 fM - 1 nM 범위의 농도로 상기 전체 IgG 용액에 대해 적정하였다. 소프트웨어(아이다호주 보이스 소재의 Sapidyne Instruments)를 통해 이용가능한 것으로서, 업체가 제공한 이론 곡선 시뮬레이션에 기초하여, 상기 평형 혼합물을 RT에서 2-6일 동안 어디서든 인큐베이션시켰다. 상기 시간이 종료되면, 신호-시험 실험을 수행하여 적절한 진행 조건을 결정하였다. 종 특이성인 Cy5-표지된 2차 항체 시약(Cy5 AffiniPure F(ab')2 단편 염소 항인간 IgG, Part #109-176-097, Jackson Immuno Research Laboratories)과, 0.1, 1.0 또는 2.0 ㎍/mL의 PBS(pH 7.4) - 1 mg/mL의, 0.02% NaN3 함유 BSA를 사용함으로써 유리 항체를 검출할 수 있었다. 이어서, 상기 실험으로부터 얻은 데이타를 동시에, n-곡선 분석 특징을 제공하는 소프트웨어를 사용하여 피팅함으로써 기록한 바와 같은 결합 상수(KD)를 수득하였다.
결과: 3가지 농도의 9D4-TM(1 pM, 10 pM, 및 50 pM)과 sIFNαRI 사이의 결합에 대한 결합 곡선을 도 10A에 도시하였다. 적어도 3개의 독립 실험으로부터 얻은 데이타를 소프트웨어 유도 결합 곡선에 피팅하여 9D4-TM에 대한 상대적인 KD를 확립하였다. 본 결합 분석에서 9D4-TM의 KD는 1.1 pM으로 측정되었고, 0.603 pM - 1.8 pM의 95% 신뢰 구간을 가졌다. 1.1 pM의 KD 측정에 대한 오차율은 1.96%였다. 9D4-TM에 대한 K온 및 K오프 또한 각각 7 x 106 +/- 1.3 x 106 S-1 및 7.7 x 10-6 +/- 1.57 x10-6 1/M로 측정되었다(데이타를 나타내지 않음).
결론: 변형된 항IFNAR1 항체 9D4-TM은 KinExa 분석법으로 측정된 바, sIFNAR1에 대하여 대략 1.1 pM의 매우 낮은 KD를 나타내었다.
6.8 실시예 8: 인간 PBMC 에의 9 D4 - TM 의 결합 친화성 측정
목적: 인간 PBMC에의 결합 친화성을 측정하고자 한다.
방법: LSM 배지(오하이오주 솔론 소재의 MP Biomedical)를 사용하여 건강한 인간 기증자로부터 말초 혈액 단핵 세포를 정제하였다. 세포를 계수하고, 10% FBS로 보충된 50 ㎕ RPMI 1640 배지를 사용하여 200,000개의 세포를 둥근 바닥의 96 웰 플레이트에 시딩하였다. 퍼킨엘머 라이프의 계약하에 유로퓸으로 표지된 9D4-TM을 제조하였다. 비특이 유로퓸 신호를 측정하기 위해, 표지된 9D4-TM을 첨가하기 전에 5-10분 동안 100배 과량의 비표지된, 일련의 희석된 9D4-TM 25 ㎕를 적절한 웰에 첨가하였다. 이어서, 유로퓸이 접합된, 일련의 희석된 9D4-TM 25 ㎕를 적절한 웰에 첨가하고, 세포와 항체를 1-2시간 동안 실온에서 완만하게 교반시켰다. 결합 인큐베이션 이후, 150 ㎕의 세포 배지를 모든 웰에 첨가하고, 플레이트를 1200 rpm으로 5분 동안 실온에서 회전시켰다. 플레이트를 신속하게 경사분리시키고, 250 ㎕의 세포 배지를 모든 웰에 첨가하였다. 회전과 세척을 반복하여 총 3회에 걸쳐 세척하였다. 이어서, 세포를 100 ㎕의 세포 배지 중에 재현탁시켰다. 50 ㎕의 재현탁된 세포를 DELPHIA 황색 미세역가 플레이트 중 200 ㎕의 DELPHIA 증강액(PerkinElmer)으로 옮기고, 빅터2 다중표지 판독기(PerkinElmer) 상에서 유로퓸 방출량을 측정하였다. 신호(cps)를 측정하고, 그래프패드 프리즘 4(GraphPad Prism 4) 분석 소프트웨어를 사용하여 Kd 값 및 B최대 값을 작성하였다.
결과: 도 10B에 상세히 기록되어 있는 친화성 측정법을 사용한 바, 인간 PBMC에 대한 9D4-TM 결합 Kd는 0.29 nM +/- 0.11 nM이고, 결합 부위수는 1448 +/- 447인 것으로 측정되었다. 유사한 접근법을 사용한 바, 사이노몰거스 원숭이 IFNAR에 대한 친화성 결합 상수는 0.65 +/- 0.42 nM로 측정되었고, 결합 부위수는 648 +/- 204(데이타를 나타내지 않음)로 측정되었다.
결론: 도 10B에 제시된 결과는 9D4-TM이 특이적이며 고친화성으로 인간 PBMC에 결합한다는 것을 입증한다.
6.9 실시예 9: 변형된 항 IFNAR1 항체는 비변형된 모체 항체와 유사한 효능을 보인다.
목적: 변형된 항IFNAR2 항체(즉, Fc 리간드 친화성이 감소된 항IFNAR1 항체)가 비변형된 모체 항체와 유사한 효능을 보인다는 것은 입증하고자 한다.
방법: 본 실시예에서 사용되는 루시퍼라제 리포터 분석 시스템은 앞서 상기(실시예 3 참조)에서 기술된 바 있다. 본 실시예에서 사용되는 IFNAR1에 대한 항체로는 9D4, 9D4-DM, 9D4-TM, MDX-1333을 포함한다. 대조군 항체 R3-47도 포함한다.
결과: 루시퍼라제 리포터 시스템을 사용하여, 상기 기술된 각종 항IFNAR1 항체에 대한 IC50 값을 작성하였다(도 11A 참조). 항IFNAR1 항체 9D4(0.01 nM) 및 변형된 항체, 예로서, 9D4-DM (0.01 nM) 및 9D4-TM (0.02 nM)은 각각 리포터 분석법에서 유사한 IC50 값을 유도하였는제, 이는 효능이 유사하다는 것을 입증하는 것이다. 또다른 항IFNAR1 항체인 MDX1333 (0.04 nM) 또한 비변형된 9D4 항체에 대하여 유사한 효능을 보였다. 이소형 대조군은 상기 루시퍼라제 리포터 분석법에서 I형 IFN 매개된 신호전달을 저해시키지 못했다.
결론: IFN 신호전달 이벤트를 정량하기 위하여 디자인된 루시퍼라제 리포터 분석 시스템에서 작성된 IC50 값을 통해 입증된 바, 변형된 항IFNAR1 항체는 비변형된 버전과 유사한 효능을 공유한다.
6.10 실시예 10: 9 D4 - TM 은 다중 I형 인터페론 알파 이소폼의 활성을 저해시킨다
목적: 9D4-TM이 특이적인 다중 인터페론 알파 이소폼에 기인한 신호전달을 저해시킨다는 것을 입증하고자 한다.
방법: 본 실시예에서 사용되는 루시퍼라제 리포터 분석 시스템은 앞서 상기(실시예 5 참조)에서 기술된 바 있다.
결과: 9D4-TM에 의해 매개되는, I형 인터페론 활성 저해에 대한 IC50 값을 표 4에 제시한다.
Figure 112010058184517-pct00006
나타낸 바와 같이, 9D4-TM은 다중 인터페론 알파 이소폼, 백혈구 인터페론, 및 인터페론 오메가에 대하여 서브나노 몰 범위의 IC50 값을 나타낸다.
결론: 변형된 항IFNAR1 항체 9D4-TM은 리포터 분석법에서 다중 특이적인 인터페론 알파 서브타입 뿐만 아니라, 백혈구 인터페론 알파에 기인하는 신호전달을 저해시킬 수 있는 능력을 입증한다.
6.11 실시예 11: 9 D4 , 9 D4DM 및 9 D4TM 의 등전점 측정
목적: 변형된 항체 9D4-DM 및 9D4-TM과 비교하여 비변형된 모체 항체 9D4의 생물리학적 특징을 평가하고자 한다.
방법: 하기와 같이 고유 등전점 초점화 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(IEF-PAGE) 분석을 수행하였다: 프리캐스트 암폴린 겔(Amersham Bio sciences, pI 범위 3.5-9.5)에 8 ㎍ 단백질을 로딩하였다. 겔 상에 로딩하기 전에 단백질 샘플을 10 mM 히스티딘 pH-6 중에서 투석하였다. 광범위한 pI 마커 표준(Amersham, pI 범위 3-10, 8 ㎕)를 사용하여 Mab에 대한 상대적인 pI를 측정하였다. 105분 동안 1500 V, 50 mA에서 전기영동을 실시하였다. 1x 정제수로 희석시킨 시그마(Sigma) 고정액(5x)을 사용하여 45분 동안 겔을 고정시켰다. 심플리 블루 염료(Invitrogen)을 사용하여 밤새도록 실온에서 염색을 실시하였다. 25% 에탄올, 8% 아세트산, 및 67% 정제수로 구성된 용액을 사용하여 탈색시켰다. 콴터티 원 이매징 소프트웨어(Quantity One Imaging Software)를 사용하는 바이오-래드 GS-800 덴시토미터(Bio-Rad GS-800 Densitometer)를 이용함으로써 등전점을 측정하였다.
결과: 항체 9D4WT, 9D4DM, 및 9D4TM에 대한 등전점(pI) 측정치를 도 12A에 도시한다. 상기 방법에 따라 항체 샘플이 전개되었고, 하기와 같은 특징을 보였다. 9D4 WT 항체는 8.2, 8.35 및 8.51에 상응하는 뚜렷한 단백질 밴드를 나타내었다. 9D4 DM 항체는 7.13에 상응하는 뚜렷한 단백질 밴드를 나타내었다. 9D4 TM 항체는 8.09 및 8.18에 상응하는 뚜렷한 단백질 밴드를 나타내었다.
결론: 본 실시예에서 제시된 바와 같이, 변형된 항체 9D4-DM 및 9D4-TM은 비변형된 모체 항체 9D4와 매우 유사한 생물리학적 특징(pI)을 나타낸다.
6.12 실시예 12: 9 D4 , 9 D4 - DM 및 9 D4 - TM 의 열안정성
목적: 변형된 항체 9D4-DM 및 9D4-TM과 비교하여 비변형된 모체 항체 9D4의 생물리학적 특징을 평가하기 위한 것이다.
방법: 하기와 같이 시차 주사 열량 측정을 수행하였다: 1.0℃/분의 주사 속도와 20-110℃의 온도 범위를 사용하여 VP-DSC(MicroCal, LLC)로 열적 융해 온도(Tm)을 측정하였다. 주사 전 15분에 이어 필터 기간은 8초로 하였다. 피어스(Pierce) 투석 카세트(3.5 kD)를 사용하여 10 mM 히스티딘-HCl(pH 6)으로 투석함으로써 샘플을 제조하였다. A280에 의해 측정된 바, Mab 농도는 0.14 mg/ml, 0.79 mg/ml, 및 0.64 mg/ml였다. 본 시스템과 함께 공급되는 오리진 소프트웨어(Origin software)를 사용함으로써 제조사의 방법에 따라 융해 온도를 측정하였다. 간략하면, 샘플 세포 및 참고 세포, 둘 모두에서 완충액을 사용하여 다중 기준선을 전개시켜 열적 평행을 확립시켰다. 기준선을 샘플 온도기록도로부터 감산한 후, 데이타를 농도에 대해서 정규화하였다.
결과: 상기 상세히 설명된 바와 같이 항체 9D4, 9D4-DM, 9D4-TM을 시차 주사 열량 측정법에 사용하여 도 12B에 제시한 결과를 수득하였다. 각각의 연구 항체는 분석법에서 유사한 융해 온도를 나타내었다. 구체적으로, 항체는 하기 융해 온도; 9D4 WT = 70.41℃, 9D4-DM = 70.41℃, 및 9D4-TM = 70.88℃를 나타내었다.
결론: 본 실시예에서 제시된 바와 같이, 변형된 항체 9D4-DM 및 9D4-TM은 비변형된 모체 항체 9D4와 매우 유사한 생물리학적 특징(Tm)을 나타낸다.
6.13 실시예 13: 대용 항 IFNAR 항체가 마우스를 IFN α 유도성 단백뇨로부터 보호한다.
목적: 항IFNAR 항체가 SLE 모델에서 마우스를 유도성 단백뇨로부터 보호한다는 것을 입증하기 위한 것이다 .
방법: 암컷 NZB/W F1 마우스를 잭슨 랩(Jackson Labs)으로부터 구입하고, 무균 사육 시설에서 사육하였다. CMV 프로모터/인핸서의 제어하에 마우스 IFNα 서브타입 5 cDNA를 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터(Adv-mIFNα5)를 사용하여 상기 마우스에서 조기 루푸스를 유도하였다. 8-11주령째 마우스(1군당 8마리의 마우스)에 0.3x1010> Adv-mIFNα5 바이러스 입자(vp: viral particle)를 단일 i.v. 주사하여 처리하였다. 대조군에는 동량의 대조군 Adv 입자를 투여하였다. 몇몇 실시태양에서, 마우스 1마리당 0.01 x 1010 내지 1.0 x 1010개의 vp 범위로 Adv-mIFNα5의 투여량을 점진적으로 증가시키면서 마우스에 주사하였다. 항IFNAR1의 효능을 시험하기 위해서 Adv 전달시 10 mg/kg에서 출발해서 연속 5회 매일 항체를 i.p. 투약하여 처리하였다. 단백뇨에 대해서는 뇨를 딥스틱(Chemstrip 2 GP; Roche Diagnostics)을 사용하여 시험하였다. 30 mg/dl 수준을 1로, 100 mg/dl를 2로, 및 > 500 mg/dl 수준을 3으로 하여 단백뇨를 점수화하였다. 연속적으로 2개의 뇨 샘플 점수가 2 이상일 경우, 마우스가 단백뇨를 갖는 것으로 간주하였다.
결과: 아데노바이러스로 감염된 마우스를 항IFNAR1 항체로 처리하였을 때의 결과를 도 13에 제시한다. Adv-mIFNα5로 감염된 마우스에서는 3주째 단백뇨가 발생하였다. 약 4주째에 단백뇨가 발생한 것으로 입증되는 바와 같이, 실험이 진행되는 동안 대조군 마우스 IgG 항체로 처리된 감염된 마우스는 단백뇨 발병으로부터 보호받지 못했다. 항IFNAR 항체로 처리된 마우스에서는 8주간 과정 동안 단백뇨에 대한 어떤 증거도 보이지 않았다. 아데노바이러스 대조군으로 처리된 마우스는 실험이 진행되는 동안 단백뇨를 보이지 않았다.
결론: 상기 샘플에서 데이타는 모두 함께, 항IFNAR 항체의 존재가 생체내 마우스 모델에서 adv-IFN 유도성 단백뇨로부터 보호한다는 것을 입증한다.
6.14 실시예 14: 항 IFNAR 항체가 I형 IFN 유도성 유전자 조절을 차단한다.
목적: 항IFNAR1 항체가 SLE의 마우스 모델에서 I형 인터페론 유전자 조절을 저해시키거나 감소시킨다는 것을 입증하기 위한 것이다.
방법: 실시예 13에 기술된 실험 방법으로부터 얻은 마우스가 또한 본 실시예에서의 분석을 위한 샘플을 제공한다. RLT 용해 완충액(Qiagen)을 사용하여 조직으로부터 RNA를 제조하였다. 고형 조직(신장, 비장, 피부)의 경우, RNA 프로세싱할 때마다 매번 50 mg 미만의 조직을 사용하였다. 샘플을 용해 완충액 및 용해 매트랙스 A(Qbiogene) 중에 놓고, 패스트프렙24(Fastprep24) 균질기 기구(매사추세츠주 월섬 소재의 Thermo Electron Corporation)를 사용하여 4.5 m/s로 30초 동안 프로세싱하였다. PBMC의 경우, 전혈 샘플을 원심분리하고, RLT 완충액 중에서 펠릿을 용해시켰다. 추가 프로세싱할 때까지 용해시에 샘플을 -80℃에서 급속 냉동시켰다. RNA를 단리시키기 위해서 해동된 조직 용해물을 먼저 퀴아슈레더(Qiashredder) 스핀 칼럼을 사용하여 프로세싱한 후, 동량의 70% 에탄올을 조직 용해물에 첨가하고, 제조사의 설명서에 따라 Rn이지 미니 스핀 칼럼 키트(Rneasy mini spin column kit)를 사용하여 RNA를 정제하였다.
제조사(캘리포니아주 칼즈배드 소재의 Invitrogen)의 프로토콜에 기재되어 있는 바와 같이 수퍼스크립트 III(Superscript III) 역전사효소 및 올리고 d(T)를 사용하여 3 ㎍의 RNA로부터 cDNA를 생성하였다. cDNA 샘플을 뉴클레아제 무함유 물 중에 희석하고, -80℃에서 보관하였다.
ABI 7900HT 패스트 실시간 PCR 시스템(ABI 7900HT Fast Real-time PCR system)(캘리포니아주 포스터 시티 소재의 Applied Biosystems)을 사용하여 실시간으로 PCR 택맨(TaqMan)® 분석에 의해 선택된 유전자의 발현 수준을 측정하였다. 하우스키핑 유전자 β-액틴을 내인성 대조군으로서 사용하였다. 반응 혼합물은 1 ㎕의 cDNA, 2 ㎕의 2Ox 프라이머 및 프로브(TaqMan® Gene Expression Assay, Applied Biosystems) 및 18 ㎕의 희석된 택맨® 패스트 유니버살 PCR 마스터 믹스(TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix)로 구성된 것으로서 그 최종 부피는 20 ㎕였다. 증폭 조건은 하기와 같았다: 95℃에서 20초, 95℃에서 1초로 50 사이클 및 60℃에서 20초. CT 값은 0 내지 50 범위인데, 여기서, 숫자 50은 어떤 생성물도 형성되지 않은 것으로 가정되는 값이다. 경쟁 CR 방법(Sequence Detector User Bulletin 2; Applied Biosystems)을 사용하여 유전자 발현을 정량하고, 하우스키핑 유전자와의 비교로 차이 배수를 기록하였다.
결과: 마우스에서 이소발현된 I형 인터페론(실시예 13 참조)은 다수의 유전자를 유도한다. 본 실험에서 사용된 상이한 마우스 군집에서의 6개의 I형 인터페론 반응성 유전자의 변화 배수가 도 14에 제시되어 있다. 구체적으로, 유전자 IFIT1, IFI44, IFI202b, CXCL9, CXCL10, 및 CXCL11은 모두 IFNα를 이소발현하고 비특이 마우스 IgG로 처리된 마우스에서 유도되었다. IFNα를 이소발현하고 항IFNAR 항체로 처리된 마우스에서는 6개의 I형 인터페론 반응성 유전자 중 어느 것도 유도되지 않은 것으로 나타났다. 아데노바이러스에 의해 코딩되는 IFNα의 특이성을 입증하는 대조군으로서, PBS 또는 대조군 아데노바이러스로 처리된 마우스에서는 6개의 유전자 중 어느 것도 유도되지 않은 것으로 나타났다. 이러한 결과는, 항IFNAR 항체 투여가 생체내 마우스 모델에서 IFN 알파에 대한 유전자 유도 반응을 차단시킬 수 있다는 것을 입증한다.
결론: 항IFNAR 항체가 SLE의 마우스 모델에서 I형 반응성 유전자의 조절을 차단시킬 수 있다.
6.15 실시예 15: 항 IFNAR 항체는 I형 인터페론에 의해 유도된 항 dsDNA 및 항SSA/Ro(항핵 항원) 항체의 생산을 차단한다.
목적: SLE 모델에서 I형 인터페론에 의해 유도된 항핵 항체, 예로서, 항dsDNA 및 항SSa/Ro의 생산을 차단시킬 수 있는 항IFNAR 항체의 능력을 입증하기 위한 것이다.
방법: 실시예 13에 기술된 바와 같이 마우스를 준비하고 처리하였다. ELISA에 의해 혈청 항dsDNA 자가항체 수준을 평가하였다. 간략하면, 폴리(L-리신)(100 ㎍/ml)로 전처리된 ELISA 플레이트를 송아지 흉선 활성화된 DNA(탄산염-중탄산염 완충액 중 5 ㎍/ml)(Sigma)로 코팅하였다. 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨 후, 플레이트를 PBS/10% FCS로 차단하였다. 혈청(1/200 희석액)을 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트에 첨가된 퍼옥시다제-접합된 염소 항마우스 IgG(1/4000)(KPL)를 사용하여 결합된 IgG를 30분 동안 검출하였다. TMB 기질(KPL) 및 종결 용액(KPL)을 첨가하여 결합을 측정하고, 450 nm에서 OD를 판독하였다. 혈청 중 마우스 항ds DNA IgG 표준을 각 플레이트 상의 일련의 희석액(625 ng/ml로부터)(Alpha Diagnostic) 중에서 진행시킴으로써 표준화할 수 있었다. 제조사의 설명에 따라 ELISA(Alpha Diagnostic)에 의해 혈청 항SSA/Ro 자가항체 수준을 측정하였다.
결과: 마우스에서 이소발현된 I형 인터페론(실시예 13 참조)은 항dsDNA 및 항SSA/Ro 항체를 축적시켰다. ELISA에 의해 측정된 바, 상이한 마우스 군집(대조군 아데노바이러스, Adv-IFNα + PBS, Adv-IFNα+MuIgG, 및 Adv-IFNα + 항IFNAR)에서의 항dsDNA 항체(A) 및 항SSA/Ro 항체(B)의 상대적인 정량을 도 15에 제시한다. 본 실험에서 대조군인 아데노바이러스로 감염된 마우스에서는 항dsDNA 또는 항SSA/Ro 항체의 축적이 전혀 일어나지 않았다. IFNα를 코딩하는 아데노바이러스로 감염되고 PBS로 처리된 마우스에서는 항dsDNA 및 항 SSA/Ro 항체가 축적되었다. Adv-IFNα로 감염된 마우스를 항IFNAR 항체로 처리하면 Adv-IFNα로 감염된 마우스를 비특이 IgG로 처리하였을 때보다 적은 항dsDNA 및 항SSA/Ro 항체가 형성되었다. 이러한 결과는, 항IFNAR 항체로 처리하는 것이 이소발현된 I형 IFN에 대한 반응으로 일어나는 항dsDNA 및 항SSA/Ro 항체의 축적을 저해시킨다는 것을 입증한다.
6.16 실시예 16 : 항 IFNAR 항체는 I형 인터페론에 의해 유도되는 IP -10 및 IL-18의 생산을 차단시킨다 .
목적: SLE의 마우스 모델에서 IFNα 유도성 사이토카인의 축적을 차단시킬 수 있는 항IFNAR 항체의 능력을 입증하기 위한 것이다.
방법: 실시예 13에 기술된 실험 방법으로부터 얻은 마우스가 또한 본 실시예에서의 분석을 위한 샘플을 제공하였다. 제조사의 설명서에 따라 ELISA(R&D systems)에 의해서 혈청내 사이토카인 수준을 측정하였다.
결과: 마우스에서 이소발현된 I형 인터페론(실시예 13 참조)은 IP-10 및 IL-18 사이토카인을 축적시켰다. ELISA에 의해 측정된 바, 상이한 마우스 군집(PBS, 대조군 아데노바이러스, Adv-IFNα+MuIgG, 및 Adv-IFNα + 항IFNAR)에서의 IP-10(A) 및 IL-18(B)의 상대적인 정량을 도 16에 제시한다. 마우스에서 이소발현된 I형 인터페론(실시예 12 참조)은 사이토카인인 IP-10 및 IL-18을 축적시켰다. 본 실험에서 대조군인 아데노바이러스로 감염된 마우스에서는 IP-10(A) 또는 IL-18(B) 사이토카인의 축적이 전혀 일어나지 않았다. Adv-IFNα로 감염된 마우스를 항IFNAR 항체로 처리하면 Adv-IFNα로 감염된 마우스를 비특이 IgG로 처리하였을 때보다 적은 IP-10 및 IL-18 사이토카인이 축적되었다. 이러한 결과는, 항IFNAR 항체로 처리하는 것이 이소발현된 I형 IFN에 대한 반응으로 일어나는 사이토카인인 IP-10 및 IL-18의 축적을 저해시킨다는 것을 입증한다.
결론: 항IFNAR 항체는 SLE의 마우스 모델에서 IFNα로 유도된 사이토카인의 축적을 차단시킬 수 있다.
6.17 실시예 17: 항 IFNAR 항체는 I형 인터페론에 의해 유도되는 ANA ( 항핵 항체)의 생산을 차단시킨다 .
목적: SLE의 마우스 모델에서 IFNα 유도성 항핵 항체의 축적을 차단시킬 수 있는 항IFNAR 항체의 능력을 입증하기 위한 것이다.
방법: 실시예 13에 기술된 실험 방법으로부터 얻은 마우스가 또한 본 실시예에서의 분석을 위한 샘플을 제공하였다. 제조사의 설명서에 따라 ELISA(R&D systems)에 의해서 혈청내 사이토카인 수준을 측정하였다. 제조사의 설명서에 따라 Hep-2 안정화된 기질 및 유사분열상을 사용하여 ANA 시험용 키트(Antibodies Incorporated)에 의해 항핵 항체(ANA) 수준을 측정하였다. 혈청을 일련으로 희석시키고, 슬라이드 상에서 Hep-2 세포와 함께 인큐베이션시킨 후, Hi-FITC 표지된 염소 항마우스 IgG(H+L)(Antibodies Incorporated)에 의해 결합된 항핵 항체를 검출하였다. ANA 역가란 ANA를 더 이상 검출할 수 없는 혈청 희석 배율로서 정의된다.
결과: 마우스에서 이소발현된 I형 인터페론(실시예 13 참조)은 항ANA 항체를 축적시켰다. HEP2 세포 상에서의 일련의 희석액 염색을 통해 측정된 바, 상이한 마우스 군집(바이러스 비포함, 대조군 아데노바이러스, Adv-IFNα + PBS, Adv-IFNα+MuIgG, 및 Adv-IFNα + 항IFNAR)에서의 항 ANA 항체의 혈청 역가를 도 17에 제시한다. 본 실험에서 대조군인 아데노바이러스로 감염된 마우스에서는 항 ANA 항체의 축적이 전혀 일어나지 않았다. IFNα를 코딩하는 아데노바이러스로 감염되고 PBS로 처리된 마우스에서는 항ANA 항체가 축적되었다. Adv-IFNα로 감염된 마우스를 항IFNAR 항체로 처리하면 Adv-IFNα로 감염된 마우스를 비특이 IgG로 처리하였을 때보다 적은 항ANA 항체가 형성되었다. 이러한 결과는, 항IFNAR 항체로 처리하는 것이 이소발현된 I형 IFN에 대한 반응으로 일어나는 항ANA 항체의 축적을 저해시킨다는 것을 입증한다.
결론: 항IFNAR 항체는 SLE의 마우스 모델에서 IFNα에 의해 유도되는 항핵 항체의 축적을 차단시킬 수 있다.
6.18 실시예 18: 항체의, SLE 혈장으로 매개된 가지 세포 발생 저해
목적: SLE 혈장은 정상 인간 단핵구로부터 가지 세포 발생을 유도한다. 본 실험에서는, SLE 혈장에 의한 세포 표면 마커 CD38, 및 CD123의 유도를 저해시킬 수 있는 항체의 능력에 의해 평가되는 바, 정제된 모노클로날 항체 9D4-TM를 가지 세포 발생 저해에 대하여 시험하였다.
방법: 본 방법은 미국 특허 출원 번호 제20006/0029601호에 앞서 기술된 바 있고, 이는 그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다. 본질상, 실험을 하기와 같이 수행하였다: 인산염 완충처리된 염수(PBS: phosphate buffered saline)를 사용하여 25 ml 연막을 4배 희석시켰다. 샘플을 원뿔형 튜브로 분리해 내고, 15 ml의 림프구 분리 배지(ICN Biomedicals)를 아래에 적층시켰다. 500 g에서 30분 동안 회전시킨 후, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 함유하는 연막층을 제거하고, PBS로 세척하였다. 1%의 열 불활성화된 인간 혈청을 함유하는 배양 배지 중에 세포를 4x106 세포/ml로 재현탁시켰다. 배양 배지 중 37℃에서 1.5시간 동안 PBMC(2.Ox107 세포/5 ml/25 ㎠ 플라스크)를 인큐베이션시킨 후, 2회에 걸쳐 비부착성 세포를 세척해 냄으로써 단핵구를 단리시켰다. 단핵구 성숙을 유도하기 위하여 건강한 자원자 또는 SLE을 앓는 환자로부터 유래된 25%의 인간 혈장을 함유하는 배지와 함께 세포를 인큐베이션시켰다. 30 ㎍/ml의 항IFNAR1 항체 또는 이소형 대조군인 IgG1을 배양물에 첨가하여 항체 차단 연구를 수행하였다. 세포를 4일 동안 인큐베이션시킨 후, PBS로 세척하고, 37℃에서 10분 동안 1:5000 베르센(Versene)으로 처리하였다. 필요한 경우, 세척 및 분석 이전에 세포를 온화하게 스크랩핑하여 세포를 탈착시켰다. 각각의 배양물을 염색 배지(0.2% 중탄산나트륨, 0.01% 아지드화 나트륨, 0.1 mM EDTA, 20 mM HEPES, 및 2% 우태아 혈청을 포함하는 행크 평형 염 용액) 중에 재현탁시키고, V형 바닥을 갖는 96웰 플레이트의 6개의 웰로 동일하게 분리해 놓았다. 소르발 RTH-750 로터(Sorvall RTH-750 rotor) 상에서 2100 rpm으로 펄스식으로 회전시키고, 25 ㎕의 염색 중에 재현시켰다. 1 ㎍의 특이적인 피코에리트린 접합된 항체를 각 웰에 첨가하고, 45분 동안 얼음상에서 인큐베이션시켰다. 3회에 걸쳐 세포를 세척하고, PBS 중 200 ㎕의 2% 파라포름알데히드 중에 재현탁시키고, 벡톤 디킨슨 FACS캘리부르(Becton Dickinson FACScalibur)를 사용하여 유식세포 측정법에 의해 분석하였다. 전방 υ 측면 산점도 상에 게이트를 그려 분석으로부터 오염 세포를 제거하였다.
결과: 본 실험에서는 SLE 환자의 혈장으로부터 유래된 IFN에 대한 반응으로 인간 단핵구가 가지 세포로 분화되는 것이 9D4-TM 처리에 의해 차단되는 것에 대해서 2개의 가지 세포 마커, CD38 및 CD123의 표면 발현에 의해 측정하였다. 도 18에서, SLE 환자로부터 유래된 다중 혈청 샘플은 9D4-TM의 존재하에서는 CD38 및 CD123의 표면 발현을 증가시키지 못했다. 9D4-TM에 대한 IC50 값은 CD38 및 CD123, 둘 모두에 대하여 0.02 nM 내지 0.06 nM로 다양하였다.
결론: 세포 표면 마커 발현에 의해 측정된 바, 항IFNAR1 항체 9D4-TM은 pDC 성숙을 유도하는 SLE 환자로부터 유래된 IFNα의 능력을 차단시킬 수 있다.
6.19 실시예 19: 항 IFNAR 항체는 백혈구- IFN 으로 자극을 받은 단핵구에서의 CD38, CD123 및 CD86 발현을 억제시킨다 .
목적: 본 실시예에서는 백혈구 IFN에 의한 세포 표면 마커 CD38, 및 CD123의 유도를 억제시킬 수 있는 항체의 능력에 의해 평가하는 바, 가지 세포 발생 억제에 대하여 항체 9D4, 9D4-DM 및 9D4 TM을 시험하였다.
방법: 림프구 분리 배지(오하이오주 솔론 소재의 MP Biomedical)를 사용하여 건강한 기증자의 전혈로부터 단핵구를 단리시킨 후, 단핵구 단리 키트 II(Monocyte Isolation kit II)(캘리포니아주 오번 소재의 Milteny Biotec)를 사용하여 양성 선별을 실시하였다. 이어서, 10% FBS(Gibco BRL)로 보충된 RPMI 1640 중에서 정제된 단핵구를 1x106개의 세포/mL로 배양하였다. 일련으로 희석된 항체를 배지 중 3 ㎍/mL - 20 pg/mL의 최종 농도로 제조하고, 이를 세포의 적절한 웰에 첨가하였다. 대략 5분 동안 사전 인큐베이션시킨 후, 100 IU/mL의 인간 백혈구 IFN(뉴저지주 피츠카타웨이 소재의 PBL Biomedical)을 적절한 웰에 첨가하고, 48시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시킨 후, CD38 및 CD123의 표면 발현을 평가하였다. 간략하면, 세포를 5분 동안 1200 rpm으로 펠릿화시키고, 흡인시키고 멸균 PBS로 1회 1x에 걸쳐 세척함으로써 단일층으로부터 배양 배지를 제거하였다. PBS를 제거하고, 1 mL 멸균 세포 해리 완충액(캘리포니아주 칼즈배드 소재의 Gibco BRL) 또는 0.05% 트립신(캘리포니아주 칼즈배드 소재의 Invitrogen)을 웰에 첨가하여 단일층으로부터 세포를 제거하였다. 5분 후, 그리고 간단히 교반시킨 후, 10% FBS로 보충된 동량의 RPMI 1640을 각 웰에 첨가한 후, 2회 연속하여 원심분리시키고, 멸균 PBS로 세척하였다. 5% BSA(미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma) 및 10 ㎍/mL 전체 인간 IgG(펜실베니아주 웨스트 그로브 소재의 Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove PA)로 보충된 50 ㎕의 1x PBS를 비특이적인 Fc 항체 결합의 차단을 위해 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 5% BSA 및 PE-항 인간 CD123 및 FITC-항 인간 CD38 항체(뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재의 Becton Dickinson)로 보충된 50 ㎕의 1x PBS를 적절한 웰에 첨가하고, 30분 동안 얼음상에서 인큐베이션시켰다. 5% BSA로 보충된 1x PBS 중에서 1회에 걸쳐 세포를 세척하고, BD LSRII(뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재의 Becton Dickinson) 상에서 표면 단백질 발현을 측정하였다.
결과: 백혈구-IFN으로 자극을 받은 PBMC를 항IFNAR 항체 9D4, 9D4DM, 및 9D4TM과 함께 인큐베이션시켰을 때, 상기 PBMC에 의해 나타난 CD38(A), CD123(B), 및 CD86(C) 발현 억제 곡선을 도 19에 제시한다. 각 CD 분자에 대하여 항IFNAR 항체는 유사한 억제 곡선을 유도하였고, 이를 사용하여 IC50 값을 작성하였다. 백혈구-IFN으로 자극을 받은 PBMC 상에서의 CD38 발현의 경우(A), 항IFNAR 항체는 하기와 같은 IC50 값을 유도하였다: 9D4=4.3 ng/ml, 9D4DM=40 ng/ml, 9D4TM=25 ng/ml. 백혈구-IFN으로 자극을 받은 PBMC 상에서의 CD123 발현의 경우(B), 항IFNAR 항체는 하기와 같은 IC50 값을 유도하였다: 9D4=7 ng/ml, 9D4DM=21 ng/ml, 9D4TM=10 ng/ml. 백혈구-IFN으로 자극을 받은 PBMC 상에서의 CD86 발현의 경우(C), 항IFNAR 항체는 하기와 같은 IC50 값을 유도하였다: 9D4=20 ng/ml, 9D4DM=20 ng/ml, 9D4TM=26 ng/ml.
결론: 본 실시예에서의 결론은 본 발명의 항체, 9D4-DM 및 9D4-TM이 모체 9D4 항체와 비교하여 pDC 세포 표면 마커의 IFN 유도에 대해 유사한 억제 곡선을 보인다는 것을 입증한다.
6.20 실시예 20: 변형된 항 IFNAR1 항체는 Fc 수용체 Fc γ RI 에의 감소된 결합을 나타낸다.
목적: 특이적인 Fc 수용체의 변형된 항IFNAR1 항체에의 감소된 결합을 입증하기 위한 것이다.
방법: ELISA에 의해 변형된 항체 9D4-DM 및 9D4-TM의 인간 FcγRI(CD64)에 의 결합 활성을 평가하였다. 밤새도록 4℃에서 PBS(pH 7.4) 중 FcγRI를 20 ㎍/ml의 농도의 미세역가 플레이트(Costar 카탈로그 3690) 중에 25 ㎕/웰로 코팅하였다. 실온에서 1시간 동안 4% 우유로 세척하고 차단시킨 후, 500 ㎍/ml로 출발하여 이어서는 2배 일련의 희석액으로 비오틴화된 9D4, 9D4TM, 9D4DM 및 대조군 항체를 앞서 차단된 플레이트에 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 0.05% of Tween 20을 함유하는 PBS(pH 7.4)로 플레이트를 세척하고, 25㎕의 HRP로 접합된 아비딘(Avidin)을 각각의 웰에 첨가하였다. 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 플레이트를 다시 세척하고, 50 ㎕/웰의 기질-슈어블루(SureBlue) TMB 퍼옥시다제(KPL 카탈로그 52-00-03)를 첨가하였다. 5-10분 동안 전개시킨 후 50 ㎕의 0.2M H2SO4를 사용하여 반응을 종결시켰다. ELISA 신호를 450 nM에서 판독하였다.
결과: ELISA 기반 결합 분석에서(도 20), 변형된 항IFNAR1 항체 9D4DM 및 9D4TM이 FcγRI에 대하여 비변형된 9D4WT 항체 뿐만 아니라, 대조군 항체보다 더 낮은 결합 친화성을 보였다.
결론: 이러한 결과는, 변형된 항IFNAR1 항체 9D4-DM 및 9D4-TM이 비변형된 9D4 항체와 비교하여 Fc 수용체 FcγRI에 대한 더 낮은 친화성을 유도한다는 것을 입증한다. FcγRI 수용체에 대해 더 낮은 친화성을 인하여 ADCC 유도는 더 낮아질 것이다.
6.21 실시예 21: Fc 수용체 Fc γ RIIIA 는 변형된 항 IFNAR1 항체에 대하여 감 소된 결합을 나타낸다.
목적: 특이적인 Fc 수용체의 변형된 항IFNAR1 항체인 9D4-DM 및 9D4-TM에의 결합이 비변형된 항IFNAR1 항체 9D4와 비교하여 감소되었음을 입증하기 위한 것이다.
방법: PBS 중에 희석된 50 ㎍/ml의 9D4, 9D4TM, 및 9D4DM 항체를 4℃에서 밤새도록 이뮨론 IV(Immunlon IV) 미세역가 플레이트 상에 코팅하였다. 실온에서 1시간 동안 4% 우유로 세척하고 차단시킨 후, 50 ㎍/ml로 출발하여 이어서는 2배 일련의 희석액으로, 플래그(Flag) 태그를 갖는 FcγRIIIA 변이체 158F(저친화성) 및158V(고친화성)를 차단된 플레이트의 웰에 첨가하였다. 1시간 후에 플레이트를 세척하고, 비오틴에 접합된 항플래그 항체(Sigma)와 2 ㎍/ml로 함께 인큐베이션시켰다. 세척한 후, 25㎕의 HRP로 접합된 아비딘을 각각의 웰에 첨가하였다. 인큐베이션시킨 후 1시간 동안 세척하여 비결합 물질을 제거하였다. 결합 신호는 기질 TMB로 검출하였다.
결과: 항IFNAR1 항체 (9D4WT, 9D4DM, 및 9D4TM)와 고친화성 및 저친화성 Fc 수용체 FcγRIIIA 사이의 ELISA 기반 결합 분석으로부터 얻은 결과를 도 21(A, B, C)에 제시한다. 도 21(A)에서, ELISA 플레이트 상에 코팅된 9D4WT 항체는 3 ng/ml 초과의 농도에서 고친화성 FcγRIIIA 수용체에 효율적으로 결합하는 반면, 저친화성 FcγRIIIA 수용체에의 결합은 모든 시험 농도에서 제한적으로 나타났다. 도 21(B)에서, ELISA 플레이트 상에 코팅된 변형된 9D4DM 항체는 어떤 시험 농도에서든 고친화성 또는 저친화성 FcγRIIIA 수용체에 효율적으로 결합하지 못했다. 유사하게, 도 21(C)에서, ELISA 플레이트 상에 코팅된 변형된 9D4TM 항체는 어떤 시험 농도에서든 고친화성 또는 저친화성 FcγRIIIA 수용체에 효율적으로 결합하지 못했다.
결론: 이러한 결과는 변형된 항IFNAR1 항체 9D4-DM 및 9D4-TM의 FcγRIIIA 수용체에 대한 친화성이 비변형된 항IFNAR1 항체 9D4와 비교하여 감소되었음을 제안하는 것이다. 추가로, 특이적인 Fc 수용체에 대한 친화성 감소로 ADCC 효과기 기능이 감소하게 될 것이다.
6.22 실시예 22: 변형된 항체 9 D4DM 및 9 D4TM 은 Fc 수용체 Fc γ RIIIA 에 대하여 감소된 결합을 나타낸다.
목적: 특이적인 Fc 수용체의 변형된 항체 9D4DM 및 9D4TM에의 감소된 결합을 입증하기 위한 것이다.
방법: PBS 중 50 ㎍/ml의 FcγRIIIA 변이체(FcγRIIIA-10 158F 및 FcγRIIIA-10 158V)를 4℃에서 밤새도록 이뮨론 IV 미세역가 플레이트 상에 코팅하였다. 실온에서 1시간 동안 4% 우유로 세척하고 차단시킨 후, 비오틴화된 9D4, 9D4TM, 및 9D4DM 항체를 100 ㎍/mL로 차단된 플레이트의 웰에 첨가하였다. 1시간 후에 플레이트를 세척하고, HRP로 접합된 아비딘과 함께 인큐베이션시켰다. 인큐베이션시킨 후 1시간 동안 세척하여 비결합 물질을 제거하였다. 결합 신호는 기질 TMB로 검출하였다.
결과: 고친화성 및 저친화성 Fc 수용체 FcγRIIIA와, 항IFNAR1 항체 (9D4WT, 9D4DM, 및 9D4TM) 사이의 ELISA 기반 결합 분석으로부터 얻은 결과를 도 22(A, B, C)에 제시한다. 도 22(A)에서, 비변형된 항IFNAR1 항체 9D4는 3 ng/ml 초과의 농도에서 ELISA 플레이트에 고정화된 고친화성 FcγRIIIA 수용체에 효율적으로 결합하는 반면, 항체는 모든 시험 농도에서 고정화된 저친화성 FcγRIIIA 수용체에의 제한적인 결합을 나타내었다. 도 22(B)에서, 변형된 항IFNAR1 항체 9D4DM은 비변형된 9D4WT 항IFNAR1 항체와 비교하여 어떤 시험 농도에서든 고정화된 고친화성 또는 저친화성 FcγRIIIA 수용체에 효율적으로 결합하지 못했다. 유사하게, 도 22(C)에서, 변형된 항IFNAR1 항체 9D4TM은 비변형된 9D4WT 항IFNAR1 항체와 비교하여 어떤 시험 농도에서든 고정화된 고친화성 또는 저친화성 FcγRIIIA 수용체에 효율적으로 결합하지 못했다.
결론: 본 실시예는 변형된 항체 9D4DM 및 9D4TM의 Fc 수용체인 FcγRIIIA에 대한 친화성이 비변형된 모체 9D4 항체와 비교하여 감소되었음을 나타낸다. 이러한 감소된 친화성으로 인해 FcγRIIIA 매개된 ADCC 효과기 기능은 모체 항체와 비교하여 감소하게 될 것이다.
6.23 실시예 23: 항 IFNAR1 항체에 의한 IFN α 서브타입의 중화
목적: 리포터 분석법으로 항IFNAR1 항체 MDX-1333, 9D4WT, 및 9D4TM의 특이적인 IFNα 서브타입을 중화시킬 수 있는 능력을 입증하기 위한 것이다.
방법: IFNα 중화에 대한 리포터 분석법은 당업계에 잘 문서화되어 있다. 본 실시예에서는 HiL3 기반 리포터 분석법에 의해 IFNα 중화를 측정하였다. 리포터로서 HiL3 세포를 사용한 FNα 중화 분석 방법의 일례는 하기와 같다: 인간 간암 세포주 HiL3을 IFNα 자극 반응 요소 - 루시퍼라제(ISRE-Luc), 및 네오마이신 내성 유전자를 함유하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 이들 세포는 미가엘 토베이 박스(Dr Michael Tovey)(미국 파리스 소재의 CNRS)가 흥쾌히 제공해 주었다. 웰당 30,000개의 세포로 Hi3을 백색 반사층을 갖는 96웰 플레이트(DYNEX Microlite) 중에서 배양하고, 10% 우태아 혈청 및 1 mg/ml G418(+페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민)을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 중에서 밤새도록 성장시켰다. 상기와 같이 인큐베이션시킨 후, 각종 형태의 인터페론을 첨가하고, 플레이트를 18시간 동안 배양하였다. 10 ml의 용해 완충액을 루시퍼라제 기질 바이알(Luc Lite Plus kit, Perkin-Elmer)에 첨가함으로써 반응을 종결시켰다; 100 ㎕의 상기 기질 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 10분 동안 탑 카운트(Top Count) 상에서 판독하였다(10분 동안 암실에서 대기한 후, 웰당 1초간 판독). 각 IFN 농도에서의 초당 계수(cps: counts per second)를 측정하고, 선형 회귀 파라미터를 이용하여 프리즘(Prism) 소프트웨어(캘리포니아주 샌디에고)를 사용함으로써 IFN 역가 곡선으로부터 각 샘플의 IFN 농도 또는 cps를 계산하였다.
결과: HiL3 리포터 분석에서의 각종 IFN 종에 대한 항IFNAR1 항체의 중화 능력이 도 23(A-E)에 제시되어 있다. 항IFNAR1 항체 MDX-1333, 9D4WT 및 9D4TM은 유사한 효능으로 다중 I형 인터페론 서브타입을 저해시킨다. 항IFNAR1 항체 MDX-1333, 9D4WT 및 9D4TM은 IFNα10(A)을 중화시키는데, 각각의 IC50 값은 0.09880 ㎍/ml, 0.008345 ㎍/ml, 및 0.004287 ㎍/ml였다. 항IFNAR1 항체 MDX-1333, 9D4WT 및 9D4TM은 인간 백혈구 IFN(B)를 중화시키는데, 각각의 IC50 값은 1.121 ㎍/ml, 0.02104 ㎍/ml, 및 0.02120 ㎍/ml였다. 항IFNAR1 항체 MDX-1333, 9D4WT 및 9D4TM은 IFNα 2b(C)를 중화시키는데, 각각의 IC50 값은 0.0006462 ㎍/ml, 0.002789 ㎍/ml, 및 0.0008279 ㎍/ml였다. 항IFNAR1 항체 MDX-1333, 9D4WT 및 9D4TM은 IFNω(D)를 중화시키는데, 각각의 IC50 값은 5.323 ㎍/ml, 0.01015 ㎍/ml, 및 0.01423 ㎍/ml였다. 항IFNAR1 항체 MDX-1333, 9D4WT 및 9D4TM은 IFNβ(E)를 중화시키는데, 각각의 IC50 값은 18.97 ㎍/ml, 0.7403 ㎍/ml, 및 0.2611 ㎍/ml였다.
결론: 이들 결과는, 항IFNAR1 항체 MDX-1333, 9D4WT(비변형된 항체) 및 9D4TM(변형된 항체)이 다중 I형 인터페론에 대하여 유사한 중화 특이성과 능력을 보인다는 것을 시사한다.
6.24 실시예 24: 항 IFNAR1 항체는 SLE 환자로부터 유래된 혈장 중 I형 IFN 을 중화시킨다.
목적: 리포터 분석법으로 측정되는 바, SLE 환자로부터 단린된 혈장 중 I형 IFN을 중화시킬 수 있는 항IFNAR1 항체의 능력을 입증하기 위한 것이다.
방법: 안정하게 형질감염된 PIL-5 ISRE 세포를 RPMI 1640 + 1X Pen-strep-글루타민 + 10% FBS 중에 유지시키고, 옵틸릭스(Optilix) 백색/투명 96웰 플레이트(펜실베니아주 웨스트체스터 소재의 펜실베니아주 웨스트체스터 소재의) 중에 웰당 100,000개의 세포로 시딩하였다. 90 ㎍/mL - 60 pg/mL 범위의 최종 농도를 위해 항체를 적절한 웰에 역가하여 첨가하였다. I형 인터페론 양성 인간 SLE 환자 혈청 샘플을 최종 혈청 비율이 웰당 50%가 되도록 각 웰에 첨가하였다. 세포, IFN, 및 항체를 37℃, 5% CO2에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 밤새도록 인큐베이션시킨 후, 세포를 5분 동안 1200 rpm으로 간단하게 펠릿화시킨 후, 세포 배양 용해 시약(Cell Culture Lysis reagent)으로 세포를 용해시키고, 루시퍼라제 분석 시스템(위스콘신주 매디슨 소재의 Promega)을 사용하여 시각화함으로써 루시퍼라제 단백질의 증폭을 평가하였다. 신호(cps)를 측정하고, 그래프패드 프리즘 4(GraphPad Prism 4) 분석 소프트웨어를 사용하여 IC50 곡선을 작성하였다.
결과: 9D4-TM은 SLE 환자 혈장 중의 I형 인터페론을 중화시킨다. SLE 환자 혈장 중의 I형 인터페론에 관한 중화 분석으로부터 얻은 결과를 도 24에 제시한다. SLE 환자 혈장 샘플 중에 함유되어 있는 I형 인터페론의 중화는 항체 농도가 증가함에 따라서 이소형 대조군에 비하여 9D4-TM으로 특이적으로 중화된다. 특히, 9D4-TM은 SLE 환자로부터 채취한 상기 혈장 샘플 중의 I형 인터페론의 중화에 대하여 0.04 nM의 IC50을 나타낸다.
결론: 본 결과는 변형된 항IFNAR1 항체 9D4-TM이 SLE 환자에서 I형 인터페론을 효과적으로 중화시킬 수 있는 능력을 갖고 있다는 것을 제안한다.
6.25 실시예 25: 항 IFNAR 항체는 PBMC 에서 IFN α로 유도되는 pDc 군집을 억제시킨다 .
목적: SLE의 마우스 모델로부터 얻은 말초 혈액 중 pDC 세포의 축적을 억제시킬 수 있는 항IFNAR 항체의 능력을 입증하기 위한 것이다.
방법: 실시예 13에 기술된 실험 방법으로부터 얻은 마우스가 또한 본 실시예에서의 분석을 위한 샘플을 제공하였다. 표준 단리 기법을 사용하여 비장, 림프절, 골수 및 말초 혈액으로부터 PBMC를 단리시키고, B220 및 Ly6C 표면 마커에 대해 염색하였다. 단리된 PBMC를 FACS에 의해 분석하고, 이중 양성(B220 및 Ly6C) 세포를 pDC 세포로서 점수화하고, 상대적인 군집을 도 25에 나타낸다.
결과: 도 25에 나타낸 바와 같이, IFNα가 이소발현되면 PBS 또는 마우스 비특이 IgG의 존재하에 비장(A), 림프절(B), 혈액(C), 및 골수(D)로부터 단리된 PBMC 내에서 pDC 세포는 증가하게 된다. 항IFNAR 항체로 처리된 마우스에서는 IFN알파에 대한 반응으로 pDC 세포가 축적되지 않았다. 대조군 아데노바이러스로 처리된 마우스 경우, PBMC 군집에서 pDC의 축적은 일어나지 않았다.
결론: 이러한 결과는 항IFNAR 항체가 IFNα로 유도되는 pDC 세포의 상향조절을 특이적으로 차단시킨다는 것을 제안한다.
6.26 실시예 26: 변형된 항 IFNAR1 항체는 Fc 수용체에 대해 더 낮은 결합 친화성을 나타낸다.
목적: 비변형된 모체 항체 9D4와 변형된 항IFNAR1 항체 9D4-DM 및 9D4-TM의 각종 Fc 수용체에 대한 상대적인 결합 친화성을 평가하기 위한 것이다.
방법: 비아코어 3000 기기(BIAcore 3000 instrument)(스웨덴 웁살라 소재의 BIAcore, Inc.) 상에서 모든 실험을 수행하였다. 전형적인 실험에서는 표준 아미노 커플링 프로토콜(BIAcore, Inc.)을 사용함으로써 1 μM 9D4 IgG 용액을 사용하여 CM5 센서 칩 표면상에 어디든 ~ 7000 RU - ~ 11,000 RU의 단백질로 고정시켰다. 별도로, 동일한 프로토콜을 사용하여, 단, 단백질은 제외시킨 상태에서 각각의 칩 상에 블랭크 표면 또한 제작하였다. 상기 블랭크 표면을 전 실험을 통해 참고 셀로서 사용하였고, 이는 비특이 결합 및 특정 하우스키핑 인공물, 둘 모두에 대한 것을 보정하는 역할을 하였다. 시험-결합 실험을 위해, FcγRI을 HBS-EP 완충액(BIAcore, Inc., 하기: 10 mM HEPES 완충액(pH 7.4), 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 및 0.005% P20으로 구성) 중 20 nM으로 제조하였다. FcγRI을 주사하는 중간에 5 mM HCl을 1분간 주사하여 IgG 표면을 재생시켰다. 비아이벨류에이션 4.1 소프트웨어(BIAevaluation 4.1 software)(스웨덴 웁살라 소재의 BIAcore, Inc.)를 사용하여 센서그램 오버레이를 작성하였다.
결과: 항IFNAR1 항체 9D4 및 변형된 항IFNAR1 항체 9D4-TM 및 9D4-DM을 비아코어 분석 포맷으로 고정화된 FcγRI 단백질에의 결합 친화성에 대하여 시험하였다. 도 26에 도시한 바와 같이, 항IFNAR1 항체 9D4는 고정화된 FcγRI에 대하여 고친화성을 보였다. 오브알부민을 사용하여 진행된 유사한 분석법에서는 고정화된 수용체에 대하여 거의 친화성을 보이지 않았는 바, 항IFNAR1 항체 9D4의 FcγRI에의 결합은 특이적이다. 변형된 항IFNAR1 항체 9D4-TM 및 9D4-DM은 비변형된 9D4 항IFNAR1 항체와 비교하여 고정화된 수용체 FcγRI에 대해 더 낮은 친화성을 보였다.
결론: 변형된 항IFNAR1 항체 9D4-TM 및 9D4-DM의 FcγRI에 대한 보다 낮은 친화성 결과는 상기 항체들이 생체내에서 ADCC를 활성화시킬 수 있는 능력이 감소하게 될 것이라는 것을 제안한다.
6.27 실시예 27: Fc 수용체는 변형된 항 IFNAR1 항체에 대하여 감소된 결합 친화성을 나타낸다.
목적: 변형된 항IFNAR1 항체 9D4-DM 및 9D4-TM 및 모체 비변형된 항IFNAR1 항체 9D4에 대한 각종 Fc 수용체의 상대적인 결합 친화성을 평가하기 위한 것이다.
방법: 표면 플라즈몬 공명 측정
비아코어 3000 기기(BIAcore 3000 instrument)(스웨덴 웁살라 소재의 BIAcore, Inc.) 상에서 모든 실험을 수행하였다. 전형적인 실험에서는 표준 아미노 커플링 프로토콜(BIAcore, Inc.)을 사용함으로써 1 μM FcγRI 용액을 사용하여 CM5 센서 칩 표면상에 어디든 ~ 7000 RU - ~ 11,000 RU의 단백질로 고정시켰다. 별도로, 동일한 프로토콜을 사용하여, 단, 단백질은 제외시킨 상태에서 각각의 칩 상에 블랭크 표면 또한 제작하였다. 상기 블랭크 표면을 전 실험을 통해 참고 셀로서 사용하였고, 이는 비특이 결합 및 특정 하우스키핑 인공물, 둘 모두에 대한 것을 보정하는 역할을 하였다. 시험-결합 실험을 위해, 항체를 HBS-EP 완충액(BIAcore, Inc., 하기: 10 mM HEPES 완충액(pH 7.4), 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 및 0.005% P20으로 구성) 중 333 nM으로 제조하였다. 항체를 주사하는 중간에 3 M MgCl2를 1분간 주사하여 FcγRI 표면을 재생시켰다. 비아이벨류에이션 4.1 소프트웨어(스웨덴 웁살라 소재의 BIAcore, Inc.)를 사용하여 센서그램 오버레이를 작성하였다.
결과: 항IFNAR1 항체 9D4, 9D4-TM 및 9D4-DM를 고정시키고, 가용성 FcγRI과 함께 인큐베이션시켰다. 각 항IFNAR1 항체에 대한 가용성 FcγRI 수용체의 결합 친화성을 비아코어 분석법으로 측정하고, 생성된 트레이싱을 도 27 A, B, C을 나타내었다. 도 27A에 나타난 바와 같이, FcγRI은 고정화된 항IFNAR1 항체 9D4에 고친화성으로 결합하였다. 이러한 상호작용은, 가용성 오브알부민이 고정화된 항IFNAR1 항체 9D4에의 어떤 결합도 나타내지 않는 바, 고도로 특이적인 것이다. 변형된 항체 9D4-TM 및 9D4-DM은 야생형의 비변형된 9D4 항체만큼 강하게 FcγRI에 결합하지는 않았다. 도 27B에서, 변형된 항IFNAR1 항체 9D4-DM을 고정화시키고, 가용성 FcγRI 또는 오브알부민과 함께 인큐베이션시켰다. FcγRI은 고정화된 9D4-DM 항체에 대하여 낮은 결합 친화성을 보였다. 이러한 결합 친화성은 가용성 오브알부민과도 관찰되어 지는 비특이 상호작용과 유사하다. 도 27C에서, 변형된 항IFNAR1 항체 9D4-TM을 고정화시키고, 가용성 FcγRI 또는 오브알부민과 함께 인큐베이션시켰다. FcγRI은 고정화된 9D4-TM 항체에 대하여 낮은 결합 친화성을 보였다. 이러한 결합 친화성은 가용성 오브알부민과도 관찰되어 지는 비특이 상호작용과 유사하다.
결론: Fc 수용체 FcγRI의 비변형된 항IFNAR1 항체 9D4에 비해 고정화된 변형된 항IFNAR1 항체 9D4-DM 및 9D4-TM에 대하여 더 낮은 친화성은 ADCC 반응을 유도할 수 있는 능력이 더 낮을 것이라는 것을 제안한다.
6.28 실시예 28: 항 IFNAR 항체는 IFN α 반응성 유전자 유도를 차단한다.
목적: SLE의 마우스 모델에서 항IFNAR 항체의 IFNα 반응성 유전자 유도를 차단할 수 있는 능력을 입증하기 위한 것이다.
방법: 실시예 13에 기술된 실험 방법으로부터 얻은 마우스가 또한 본 실시예에서의 분석을 위한 샘플을 제공하였다. 실험에 착수한지 8주가 경과하였을 때, 마우스를 희생시키고, 신장 조직을 제거하였다. RLT 용해 완충액(Qiagen)을 사용하는 RNA 추출을 위해 50 mg 이하의 조직을 사용하였다. 샘플을 용해 완충액 및 용해 매트릭스 A(Qbiogene)중에 놓고, 패스트프렙24 균질기 기구(매사추세츠주 월섬 소재의 Thermo Electron Corporation)를 사용하여 4.5 m/s로 30초 동안 프로세싱하였다. RNA를 단리시키기 위해서 해동된 조직 용해물을 먼저 퀴아슈레더 스핀 칼럼을 사용하여 프로세싱한 후, 동량의 70% 에탄올을 조직 용해물에 첨가하고, 제조사의 설명서에 따라 Rn이지 미니 스핀 칼럼 키트를 사용하여 RNA를 정제하였다. 제조사(캘리포니아주 칼즈배드 소재의 Invitrogen)의 프로토콜에 기재되어 있는 바와 같이 수퍼스크립트 III 역전사효소 및 올리고 d(T)를 사용하여 3 ㎍의 RNA로부터 cDNA를 생성하였다. cDNA 샘플을 뉴클레아제 무함유 물 중에 희석하고, -80℃에서 보관하였다.
ABI 7900HT 패스트 실시간 PCR 시스템(캘리포니아주 포스터 시티 소재의 Applied Biosystems)을 사용하여 실시간으로 PCR 택맨® 분석에 의해 선택된 유전자의 발현 수준을 측정하였다. 하우스키핑 유전자 β-액틴을 내인성 대조군으로서 사용하였다. 반응 혼합물은 1 ㎕의 cDNA, 2 ㎕의 2Ox 프라이머 및 프로브(TaqMan® Gene Expression Assay, Applied Biosystems) 및 18 ㎕의 희석된 택맨® 패스트 유니버살 PCR 마스터 믹스로 구성된 것으로서 그 최종 부피는 20 ㎕였다. 증폭 조건은 하기와 같았다: 95℃에서 20초, 95℃에서 1초로 50 사이클 및 60℃에서 20초. CT 값은 0 내지 50 범위인데, 여기서, 숫자 50은 어떤 생성물도 형성되지 않은 것으로 가정되는 값이다. 경쟁 CR 방법(Sequence Detector User Bulletin 2; Applied Biosystems)을 사용하여 유전자 발현을 정량하고, 하우스키핑 유전자와의 비교로 차이 배수를 기록하였다.
결과: 가속 루푸스 마우스 모델에서 8주 경과 후에 인터페론 알파에 의해 유도된 6개의 유전자에 관한 신장에서의 비교 발현 분석으로부터 얻은 결과를 도 28에 제시하였다. 마우스에서 이소발현되는 인터페론 알파를 마우스 IgG 또는 항IFNAR 항체로 처리하였다. 8주 후, 대조군 IgG로 처리된 마우스는 IFNα 반응성 유전자, 즉, ICAM1, VCAM1, CXCL9, CXCL10, 및 IFIT1을 고도로 유도하는 것이 입증되었다. 항IFNAR 항체로 처리된 마우스는 8주 후 IFNα 반응성 유전자를 유도하지 않은 것으로 나타났다.
결론: 택맨 분석법에 의해 측정된 바, 가속 루푸스 마우스 모델에서 항IFNAR 항체로 처리하는 것은 대조군 마우스와 비교하였을 때, IFN-알파의 이소발현에 의해 매개되는 6개의 유전자(ICAM1, VCAM1, CXCL9, CXCL10, 및 IFIT1)가 신장에서 유도되는 것을 차단한다. 이러한 결과는 항IFNAR 항체가 SLE 마우스 모델에서 IFNα 매개성 신호전달을 차단할 수 있다는 것을 입증한다.
6.29 실시예 29: 항 IFNAR 항체가 혈청 중 자가항체의 축적을 저해시킨다.
목적: SLE 마우스 모델의 혈청 중 자가항체의 축적을 저해시킬 수 있는 항IFNAR 항체의 능력을 입증하기 위한 것이다.
방법: 실시예 13에 기술된 실험 방법으로부터 얻은 마우스가 또한 본 실시예에서의 분석을 위한 샘플을 제공한다. 요법 2-7주째부터 1주 간격으로 전혈 샘플을 채취하였다. ELISA에 의해 혈청 항dsDNA 자가항체 수준을 평가하였다. 간략하면, 폴리(L-리신)(100 ㎍/ml)으로 전처리된 ELISA 플레이트를 송아지 흉선 활성화된 DNA(탄산염-중탄산염 완충액 중 5 ㎍/ml)(Sigma)로 코팅하였다. 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨 후, 플레이트를 PBS/10% FCS로 차단하였다. 혈청(1/200 희석액)을 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트에 첨가된 퍼옥시다제-접합된 염소 항마우스 IgG(1/4000)(KPL)를 사용하여 결합된 IgG를 30분 동안 검출하였다. TMB 기질(KPL) 및 종결 용액(KPL)을 첨가하여 결합을 측정하고, 450 nm에서 OD를 판독하였다. 혈청 중 마우스 항ds DNA IgG 표준을 각 플레이트 상의 일련의 희석액(625 ng/ml로부터)(Alpha Diagnostic) 중에서 진행시킴으로써 표준화할 수 있었다.
결과: 가속 루푸스 마우스 모델에서 시간이 경과함에 따른 마우스 혈청 중 항ds DNA 항체의 수준에 관한 ELISA 기반 분석으로부터 얻은 결과를 도 29에 제시하였다. 7주간의 요법 기간 동안 IFNα를 이소발현하는 마우스를 항IFNAR 항체 또는 마우스 IgG 대조군 항체로 처리하였다. 항IFNAR 항체로 처리된 마우스는 대조군 IgG 항체로 처리된 마우스와 같은 속도 또는 같은 정도로 항dsDNA 항체를 축적시키지는 못했다. 대조군 아데노바이러스로 처리된 마우스에서는 시간이 결과함에 따라 항ds DNA 항체가 발생하지는 않았다.
결론: 이러한 결과는 항IFNAR 항체가 IFN 알파 수준 증가에 따른 반응으로 항dsDNA 항체가 축적되는 것을 감소시킨다는 것을 입증한다.
6.30 실시예 30: 항 IFNAR 항체가 가속 루푸스 마우스 모델에서 단백뇨를 감소시킨다.
목적: SLE 마우스 모델에서 확립된 단백뇨(치료학적 배경)을 감소시킬 수 있는 능력을 입증하기 위한 것이다.
방법: 실시예 13에 기술된 실험 방법으로부터 얻은 마우스가 또한 본 실시예에서의 분석을 위한 샘플을 제공하였다. 그러나, 치료학적 접근법으로 마우스에서 항체를 적용하기 이전에 루푸스의 한 증상으로서 단백뇨를 발생시켰다. 구체적으로, 상기 기술된 바와 같이, 마우스에서 점수 2.0 - 2.5의 단백뇨를 발생시켰다. 일단 단백뇨가 역치 수준을 통과하면, PBS, 대조군 IgG 또는 항IFNAR 항체를 주 2회씩 투약하는 치료 요법을 추가의 5주 동안 수행하였다. 주 2회 간격으로 뇨 샘플을 시험하고, 단백뇨를 점수화하였다.
결과: 항IFNAR 항체가 가속 루푸스 마우스 모델로부터의 단백뇨 점수를 감소시킨다는 치료학적 연구로부터 얻은 결과를 도 30A에 제시하였다. 간략하면, 마우스에서 단백뇨를 발생시켰고, 이 시점에서 코호트는 치료법으로서 PBS, 대조군 IgG 또는 항IFNAR 항체를 투여받았다. 도면으로 충분히 입증되는 바와 같이, 단백뇨 점수는 항IFNAR 항체를 투여받은 군에서만 감소하였다. 처리법으로서 PBS 또는 대조군 IgG를 투여받은 마우스에서는 시간이 경과함에 따라 단백뇨 점수가 계속하여 증가하였다. (B) 5주간에 걸쳐 얻은 상기 결과에 대한 곡선하 면적에 관한 분석 결과를 통해 항IFNAR 항체 처리군이 PBS 단독 또는 Ig 대조군(이들 둘 모두는 매우 유사하였다)과 상이하다고 결정되었다.
결론: 이러한 결과는 항IFNAR 항체가 SLE의 치료학적 배경에서 사용될 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 31: 항 IFNAR 항체가 가속 루푸스 마우스 모델에서 사망율을 감소시킨다.
목적: SLE 루푸스 마우스 모델의 치료학적 배경에서 사망율을 감소시킬 수 있는 항IFNAR 항체의 능력을 입증하기 위한 것이다.
방법: 실시예 30에 기술된 실험 방법으로부터 얻은 마우스가 또한 본 실시예에서의 분석을 위한 샘플을 제공하였다. 치료학적 접근법으로 마우스에서 항체를 적용하기 이전에 루푸스의 한 증상으로서 단백뇨를 발생시켰다. 구체적으로, 상기 기술된 바와 같이, 마우스에서 점수 2.0 - 2.5의 단백뇨를 발생시켰다. 일단 단백뇨가 역치 수준을 통과하면, PBS, 대조군 IgG 또는 항IFNAR 항체를 주 2회씩 투약하는 치료 요법을 추가의 5주 동안 수행하였다. 추가의 4주 동안 전체 사망율을 추적하였다.
결과: 가속 루푸스 모델에서 항IFNAR 항체에 관한 치료학적 연구로부터 얻은 사망율을 도 31에 제시하였다. 간략하면, 마우스에서 단백뇨를 발생시켰고, 이 시점에서 코호트는 치료법으로서 PBS, 대조군 IgG 또는 항IFNAR 항체를 투여받았다. 항IFNAR 항체로 처리된 마우스에서의 5주째 사망율은 0인 반면, PBS 또는 대조군 IgG로 처리된 마우스에서의 사망율은 각각 87.5% 및 62.5%인 것으로 나타났다. 추가로, 9주간의 연구 기간 동안 항IFNAR로 처리된 동물은 PBS 또는 대조군 IgG로 처리된 동물과 비교하여 높은 생존율을 나타내었다.
결론: 본 실시예에서의 결과는 항IFNAR 항체가 루푸스와 관련된 사망율을 감소시킬 수 있다는 것을 입증한다.
6.32 실시예 32: 9 D4 - TM 으로 매개되는 ADCC 활성의 부재
목적: FcγRI 및 FcγRIIIA에 대한 결합 친화성이 부족하기 때문에 9D4-TM은 ADCC 활성을 유도할 수 없다는 것을 확인하기 위하여 일련의 실험을 수행하였다.
방법: 293F 표적 세포를 DiO 세포 표지(Invitrogen, 실험 I & II)로 표지하고, 10 ㎍/ml의 9D4-TM, 인간 IgG1 이소형 음성 대조군 R3-47, 9D4-WT 또는 양성 대조군으로서 사용된 항EphA2 항체의 부재 또는 존재하에서 (4시간 동안 37℃에서) 표지되지 않은 효과기 PBMC와 함께 조합하였다. DiO+/PI+(요오드화 프로피디움) 이중 양성 염색부를 측정함으로써 표적 세포의 용해를 평가하였다. 효과기-표적 비율 = 50-1, 하기 식에 따라 용해율을 계산하였다: [(항체 존재하의 이중 양성 염색부의 비율(%) - 배지만 단독으로 있는 것 중 이중 양성 염색부의 비율(%))/(용해 완충액 존재하의 이중 양성 염색부의 비율(%)-배지만 단독으로 있는 것 중 이중 양성 염색부의 비율(%))]. 용해 완충액(Promega)을 첨가하였을 때 100%의 용해율을 얻었다.
별법으로, 293F 표적 세포를 10 ㎍/ml의 9D4-TM, 인간 IgG1 이소형 음성 대조군 R3-47, 9D4-wt 또는 양성 대조군으로서 사용된 항EphA2 항체의 존재 또는 부재하에서 37℃에서 4시간 동안 FcγRIIIA를 안정적으로 발현하는 트랜스제닉 NK 세포주로부터의 세포와 함께 인큐베이션시켰다(실험 III). 효과기-표적 비율 =4-1 및 하기 식에 따라 용해율을 계산하였다: 100 x (실험치 - 효과기 자발성 값 - 표적 자발성 값)/(표적 최대치-표적 자발성 값).
실험 I & II(PBMC-293H 비율 = 50-1)에서, 하기 식에 따라 용해율을 계산하였다: [(항체 존재하의 이중 양성 염색부의 비율(%) - 배지만 단독으로 있는 것 중 이중 양성 염색부의 비율(%))/(용해 완충액 존재하의 이중 양성 염색부의 비율(%)-배지만 단독으로 있는 것 중 이중 양성 염색부의 비율(%))]. 실험 III(FcγIIIA를 발현하는 트랜스제닉 NK 세포주-293H 비율 = 4-1)에서, 하기 식에 따라 용해율을 계산하였다: 100 x (실험치 - 효과기 자발성 값 - 표적 자발성 값)/(표적 최대치-표적 자발성 값).
결과: 변형된 항체 9D4-TM 또는 비변형된 항체 9D4-WT는 R3-47 항체를 사용하여 관찰되는 것과 비교하였을 때, 293F 세포 상에서는 검출가능한 ADCC 활성을 보이지 않았다(표 4). 대조적으로, 양성 대조군 항체인 항EphA2 항체는 배경 수준에 비하여 세포독성이 2개 증가하여 나타났다. 이러한 결과는 9D4-TM이 IFNAR1을 발현하는 표적에 대한 ADCC를 매개할 수 없다는 것을 확인시켜 준다.
항IFNAR1 항체의 ADCC 활성 평가
항체 Exp.I
표적 용해율(%)		 Exp.II
표적 용해율(%)		 Exp.III
표적 용해율(%)
양성 대조군:
항EphA2		 33±4 36±1 43.4±0.5
음성 대조군:
R3-47		 14±1 18±3 18.1±1.1
9D4-WT 14±2 20±2 17.5±1.6
9D-TM 14±2 20±2 ND
Exp.I/II/III: 실험 I/II/III. ND: 비수행
결론: 이러한 결과는 변형된 항IFNAR1 항체 9D4-TM이 IFNAR1을 발현하는 표적 세포에 대해 유도되는 검출가능한 ADCC 활성을 자극하지 못한다는 것을 입증한다.
6.33 실시예 33: L234F / L235E / P331S 돌연변이를 포함하는 인간 Fc 영역의 3차원 구조
목적: L234F/L235E/P331S 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역(Fc-TM)의 3차원 구조를 측정하기 위한 것이다.
방법:
Fc - TM 정제: 9D4-TM을 효소로 절단하여 인간 Fc/TM 단편을 수득하였다. 제조사의 설명서(Pierce)에 따라 고정화된 피신을 사용하여 분해하였다. 우선, 제조사의 설명서(뉴저지주 피츠카타웨이 소재의 GE Healthcare)에 따라 하이트랩 단백질 A 칼럼(HiTrap Protein A column) 상에서 정제를 수행하였다. 50 mM NaOAc/pH 5.2 중에서 투석시킨 후, 단백질 용액을 하이트랩 SP HP 칼럼(GE Healthcare)에 가하고, 유통식(flow throug)으로 수집하였다. 유통물을 하이트랩 Q 칼럼(GE Healthcare) 상에 로딩하고, NaCl 구배로 용출시키고, 환원성 및 비환원성 SDS-PAGE로 판단하여 동질성인 Fc/TM 시료를 수득하였다. Fc-TM SDS-PAGE 프로필은 각각 환원 또는 비환원 조건하에 25 kDa 또는 50 kDa 주변에서 오직 하나의 밴드만이 존재하는 것으로 나타났다. 이러한 관찰 결과는 C226 및/또는 C229 위치에 적어도 하나의 쇄간 디설피드 결합이 존재한다는 것을 명확하게 입증시켜 준다. 결과적으로, 돌연변이화된 '하류' 잔기F234 및 E235는 결정을 포함하는 폴리펩티드 쇄 중에 존재하였다.
Fc - TM 의 결정화: 정제된 Fc-TM을 센트리콘(Centricon) 농축기(Millipore, Billerica MA, 30 KDa 컷오프)를 사용하여 약 5 mg/ml로 농축시켰다. 결정화 조건은 햄프턴 리서치(Hampton Research)(캘리포니아주 알리소 비에호 소재의 Hampton Research), 에메랄드 바이오시스템즈(Emerald BioSystems)(워싱턴주 베인브리지 아일랜드 소재의 Emerald BioSystems, Inc.) 및 몰레큘라 디벤션즈(Molecular Dimensions)(플로리다주 아팝카 소재의 Molecular Dimensions Inc.)로부터 입수한 시판용 스크린을 사용하여 확인하였다. 각 스크린이 수개의 잠재적으로 이용가능한 결정화 조건을 제공하였다. 최적화되었을 때, 0.2 M 아세트산 아연, 0.1 M 이미다졸-말레이트(pH 8.0), 5% PEG 3350, 5% 글리세롤로부터 단백질 농도 2.0 mg/ml에서 양질의 회절을 나타내는 결정을 수득하였다. 이러한 조건하에서 0.1 내지 0.2 mm 범위의 3차원 구조의 모양이 우수한 결정이 2-3일 동안 성장하였다.
데이타 수집: R-AXIS IV++ 영상 플레이트가 장착된 리가쿠 마이크로맥스(Rigaku MicroMax)™ 007 회전식 애노드 생성 장치(텍사스주 더 우스랜즈 소재의 Rigaku/MSC)를 사용하여 센터 포 어드밴스드 리서치 인 바이오테크놀러지(CARB: Center for Advanced Research in Biotechnology, University of Maryland Biotechnology Institute)(매릴랜드주 로크빌 소재)에서 단일 결정으로부터 회절 데이타를 수집하였다. 냉각시키기 전에, 20% 글리세롤로 보충된 성장 용액 중에서 몇분 동안 결정을 보관하였다. 이어서, X-스트림 2000 극저온 냉각기(Rigaku/MSC)를 사용하여 결정을 105 켈빈으로 냉각시켰다. (문헌 [Oganesyan et al., 2007]에) 설명되어 있는 바와 같이, 1회 어닐링한 후 2.3Å 이하로 회절이 일어났다. 0.5°의 진동 범위, 200 mm의 결정/검출기 거리 및 600 s의 노출 시간을 사용하여 234개의 영상을 포함하는 회절 데이타를 수집하였다. HKL 2000 소프트웨어를 사용하여 데이타를 통합하고 크기 조정을 하였다(문헌 [Otwinowski & Minor, 1997]).
구조 결정: CCP4(Collaborative Computational Project: 협력 컴퓨터 프로젝트) 프로그램 수트를 사용하여 분자 치환법, 정밀화, 및 전자 밀도 계산을 수행하였다. C-면심 사방결정계 결정의 솔벤트 함량비는 58%이고, VM은 2.9이고, 가정컨대, 비대칭 셀 단위당 1개의 Fc 폴리펩티드가 존재한다. Fc/TM의 결정 구조는 분자 치환법으로 측정하고, 2.3 Å 해상도로 정밀화하였다. PDB ID 번호 2DTQ(문헌 [Matsumiya et al., (2007) J. Mol. Biol. 368:767-779])에 상응하는 인간 Fc 구조체는 해상도가 높고 리간드가 없는 상태이기 때문에 모델로서 사용하였다. 특히, CH2 및 CH3 도메인은 입체형태에 상대적인 도메인이라는 측면에서 어떤 치우침도 최소화시키기 위하여 별개의 것으로 별개로 간주하였다. 페이저(Phaser)(문헌 [McCoy et al., (2005) Acta Cryst. D61, 458-464])를 사용하는 분자 치환법 문제에 대해서는 3.0 Å 이하의 데이타를 사용하였다. 해상도를 정밀화한 후, 최종 LL-득점 및 Z-점수는 각각 1192 및 31이었다. 3.0 Å에서 FWT/PHWT로 계산된 가중치화된 전자 밀도는 모델과 우수한 매치가 이루어지는 것으로 나타났는데, 단, CH2 및 CH3 도메인 중 몇몇 루프에서는 예외적이었다. N297에 부착된 N-연결된 당질 잔기로 예측되는 위치에서 DELFWT/PHDELWT로 계산된 전자 밀도의 강한 양성 차이를 볼 수 있었다. 236번 위치 앞의 어떤 힌지 잔기에 대해서 어떤 밀도도 존재하지 않았고, 이러한 결과는 상기 영역이 고도로 가요성이라는 이유로 가정할 수 있는 것이다. 앞서 기술된 오직 2개의, 리간드가 없는 인간 Fc 구조체만이 234번 및 235번 위치인 것으로 밝혀졌다는 것에 주목한다(2DTQ/2DTS; 문헌 [Matsumiya et al, (2007) J. Mol. Biol. 368:767-779]). 유사하게, 446번 및 447번 위치는 시각화될 수 없었다. 처음으로 331번 위치에 있는 잔기가 알라닌으로서 모델링되었다.
'Refmac 5'(문헌 [Murshudov et al, (1997) Acta Cryst. D53, 240-255])를 사용하는 정밀화 및 "O" 그래픽 소프트웨어(문헌 [Jones et al, (1991) Acta Cryst. A47, 110-119])를 사용하는 수동식 구축을 수회에 걸쳐 교대로 진행함으로써 해상도가 2.3 Å 이하인 데이타에 대해서 R인수 = 21.6 및 유리 R인수 = 27.5로 수렴되었다. 1회차 정밀화를 수행한 후, 전자 밀도를 통해 당질을 배치할 수 있었고, 331번 위치에 세린 잔기로 치환하였다. 이후 정밀화 단계에서는 그의 웹 서버 상에서 운용되는 TLS 모션 디터미네이션(TLSMD: TLS Motion Determination) 프로그램(문헌 ([Painter et al. (2006). J. Appl. Cryst. 39, 109-111]; [Painter et al. (2006) Acta Cryst. D62, 439-450]))을 사용하여 모델을 분석하였다. 이어서, 5개의 다른 잔기 군(236-324, 325-341, 342-358, 359-403 및 404-445)을 사용하여 TLS 및 구속형 정밀화 모드로 Refmac 5를 사용하여 추가 정밀화를 수행하였다. 결정화 완충액 중에 존재하는 아연 이온을 전자 밀도로 검출하고, 배위권 및 좌표 거리가 허용될 때 그 자체로서 모델링하였다. 특히, 하나의 아연 이온이 H310 및 H435와 배위 결합하는 것으로 밝혀졌다. 또다른 하나는 대칭인 관련 폴리펩티드의 H285 및 H268과 배위 결합하였다. 2개의 다른 아연 이온은 E318 및 E345에 결합하였다. 모든 경우에 있어서, 물 분자가 아연 이온의 예측되는 4면 배위권을 완성시켰다. 당질 부분은 그의 전자 밀도에 따라 모델링되었고, 본질적으로는 본 발명자들이 또다른 인간 Fc 구조체와 관련하여 기술한 바와 같이(문헌 [Oganesyan et al, (2007) Molecular Immunology, December 11, 2007, in press]), 최종 모델은 9개의 당 잔기를 포함하였다. 최종 모델은 75개의 솔벤트 분자를 함유하였다. 결정학적 데이타 및 정밀화에 대한 통계학적 자료를 표 6에 제시한다.
X선 데이타 수집 및 모델 정밀화에 대한 통계학적 자료
파장(Å) 1.54
해상도(Å) 36.83 - 2.30 (2.38-2.30)a
공간군 C2221
셀 파라미터(Å) 50.18, 147.30, 75.47
전반사 54,409
고유 반사(Unique reflection) 12,617
평균 중복도 4.31 (2.72)a
완성도(%) 98.3 (90.0)a
R병합 0.062 (0.300)a
I/σ(I) 13.0 (3.3)a
R인수/유리 R 인수 0.216/0.275
RMSD 결합(Å) 0.012
RMSD 각도(°) 1.48
{φ,ψ} 공간의 가장 바람직한 영역에 있는 잔기(%) 89.9
{φ,ψ} 공간의 추가로 허용되는 영역에 있는 잔기(%) 10.1
단백질 원자 개수 1678
비단백질 원자 개수 189
B 인수(모델/윌슨)(Å2) 43/40
a 괄호 안의 값이 최고 해상도 쉘에 상응하는 값이다
결과: Fc-TM은 공간군 C2221에서 결정화되었고, 비대칭 유닛에 하나의 폴리펩티드를 가졌다(도 32). 결정은 2.3 Å 해상도로 회절이 이루어졌고, 1.26 °의 상대적으로 높은 평균 모자이크도(mosaicity)를 나타내었다. 이와 같이 높은 모자이크도는 냉각 및 비냉각된 결정, 둘 모두의 특성으로 나타났다. 236번 내지 445번 위치에 있는 있는 잔기들 모두 전자 밀도로 트레이싱될 수 있고, 236번 위치 앞에 있는 힌지 잔기에 대해서는 어떤 전자 밀도도 관찰되지 않았으며, 따라서, L234F 및 L235E 돌연변이는 관찰되지 못했다. 331번 위치의 전자 밀도는 세린에 상응하였다.
Fc-TM의 원자 좌표 및 실험상의 구조 인자를 수탁번호 3C2S 하에 단백질 데이타 은행(Protein Data Bank)에 기탁하였다.
Fc-TM의 전체 3차원 구조는 앞서 보고된 바 있는(문헌 ([Deisenhofer, (1981). Biochemistry, 20: 2361-2370]; [Krapp et al, (2003). J. Mol. Biol. 325, 979-989]; [Matsumiya et al, (2007). J. Mol. Biol. 368:767-779]; [Oganesyan et al, (2007) Molecular Immunology, December 11, 2007, in press])), 리간드가 없는 인간 Fc 영역의 구조체와 매우 유사하였다. 보다 정확하게는, PDB ID 번호 1H3W (문헌 [Krapp et al., (2003). J. Mol. Biol. 325:979-989]) 및 2QL1(문헌 [Oganesyan et al., (2007) Molecular Immunology, December 11, 2007, In the press])에 상응하는 인간 Fc 구조체는 셀 파라미터, 비대칭 유닛 콘텐츠, 공간군 및 패킹에 있어서 Fc-TM과 가장 유사하였다. 개별적으로 보면, Fc-TM CH2 및 CH3 도메인은 기타 다른, 리간드가 없고 돌연변이화되지 않은 인간 Fc 구조체와 비교할 때 구조상 보존성 및 강직성이 더 컸다. 예를 들면, Fc-TM을 PDB ID 번호 2DTQ9(문헌 [Matsumiya et al., (2007). J. Mol. Biol. 368, 767-779])의 쇄 A와 중첩시켰을 때, Cα 원자의 rms 좌표 변위값은 CH2 및 CH3 도메인에 대하여 각각 0.6 및 0.4 Å이었다.
하기의 표 7은 Fc-TM의 원자 구조 좌표를 제공한다. 하기와 같은 약어가 표 7에서 사용된다.
"원자 유형"은 그의 좌표로 제공되는 원소를 지칭한다. 칼럼에서 첫번째 문자가 상기 원소를 정의한다.
"A. A."는 아미노산을 지칭한다.
"X, Y 및 Z"는 원소의 데카르트 좌표(Cartesian coordinate)를 제공한다.
"B"는 원자 중심 주변의 원자 움직임을 측정하는 열적 인자이다.
"OCC"는 점유 시간을 지칭하며, 이는 원자 유형이 특정 좌표를 점유하고 있는 시간을 비율로서 나타낸다. OCC 값의 범위는 0부터 1까지이며, 1이 100%이다.
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결론: Fc/TM의 3차원 구조는 기타 다른 리간드가 없고 돌연변이화되지 않은 인간 Fc 영역의 것과 매우 유사한 것으로 밝혀졌다. TM 세트 치환으로 일어나는 매우 극적인 범위의 기능적 효과는 Fc 구조체 중의 주된 구조상의 재배열로 이루어지는 것이 아니라, 돌연변이 부위에서의 작은 상호작용의 국소화된 손실로 이루어지는 것이었다.
6.34 실시예 34: 항 IFNAR1 항체의 내재화
목적: 항IFNAR1 항체가 세포 내로 내재화될 수 있는 능력을 조사하기 위한 것이다.
방법: THP-1 세포를 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 0.05 mM 2-머캅토에탄올 및 10% 우태아 혈청을 함유하는 RPMI-1640 배지 중에서 배양하였다. 실험 1일 전에 THP-1 세포를 신선한 배지 중에 2 x 105개의 세포/ml로 시딩하였다. 실험 당일, 세포를 세척하고, 계수하고, 3 x 106개의 세포/ml로 PBS 중에 재현탁시켰다. 세포를 10분 동안 37℃ CO2 인큐베이터에서 1 μM CFSE로 염색하였다. 2회 추가로 PBS를 사용하여 세척한 후, 세포를 얼음 상에 놓고, 5분 동안 얼음 상에서 106개의 세포당 20 ㎕의 FcR을 사용하여 함께 인큐베이션시킨 후, 1시간 동안 얼음 상에서 1 ㎍/ml의 Alexa647-9D4-TM 또는 Alexa 647-R347(비특정 대조군 항체)로 염색하였다. PBS를 사용하여 3회 세척함으로써 비결합 mAb를 제거한 후, 지정된 시간(0, 15, 30 및 60분) 동안 37℃에서 인큐베이션시킨 후, 2% BSA 및 아지드화 나트륨을 함유하는 PBS 중에 세포를 재현탁시켰다. 37℃, 5% CO2 및 습도 70%하에 환경이 조정되는 챔버로 세포를 옮겨 내재화가 개시될 수 있도록 하고, Alexa647-9D4-TM의 내재화 동역학적 성질을 세포의 형광을 영상화함으로써 시간 경과에 따라 기록하였다.
알고리즘을 사용하여 세포의 형광 영상을 분석하였다. 알고리즘은 CFSE 세ㅗ질 염료를 사용하여 세포와 막 영역의 경계를 확인하였다. 알고리즘은 세포내, 및 막 상의 9D4-TM 관련 형광을 정량하였다. SAAMII 소프트웨어를 사용하여 데이타를 피팅하는 모델에 의해 세포내 형광 축적 속도를 계산하였다.
결과: THP-1 세포에 결합한 Alexa647-9D4-TM. 같은 세포 상에서 9D4-TM의 이소형 대조군인 Alexa647-R347의 결합은 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 9D4-TM에 의한 THP-1 세포에의 특이적인 결합을 입증하는 것이었다(도 33). 4℃에서, 9D4-TM 결합은 지배적으로 세포 표면에 위치하였다(0분 - 도 33). 일단 세포를 37℃에서 인큐베이션시켰을 때, 9D4-TM 염색에 대한 형광 신호는 세포 표면으로부터 현저히 감소하였고, 구두점 형태의 스폿으로서 세포질 구획에 축적되었다. 60분 동안에 걸쳐 기록된 동역학적 영상을 통해 형광이 세포 표면으로부터 세포질 구획에 위치하는 구두점 형태의 스폿으로 점진적으로 이동한 것으로 나타났다(15, 30 및 50분 시점, 도 33). 본 결과를 통해 THP-1 세포 상에서 9D4-TM이 내재화된 것이 뚜렷이 입증되었다.
6.35 실시예 35: 9 D4 - TM 으로 매개되는 CDC 활성의 부재
목적: 9D4-TM이 CDC 활성을 유도할 수 없는지를 측정하기 위하여 일련의 실험을 수행하였다.
방법: 건강한 인간 기증자로부터 새로 단리된 인간 혈액을 수집하고(대략 100 ml), 3000 G로 10분 동안 원심 침전시켜 세포로부터 혈청을 분리하였다. 혈청 분획을 2개의 튜브로 분리하였다. 첫번째 튜브를 페놀 무함유 RPMI 1640으로 희석시켜 최종 농도가 10%인 혈청을 만들었다(열로 불활성화되지 않은 것 또는 NHI(non-heat inactivated)). 두번째 튜브를 30분 동안 56℃ 수조에 놓고, 보체 성분을 열로 불활성화시켰다. 이어서, 두번째 튜브를 페놀 무함유 RPMI 1640으로 희석시켜 최종 농도가 10%인 열-불활성화된(HI: heat-inactivated) 인간 혈청을 만들었다.
다우디(Daudi)) B 세포가 CD20(양성 대조군 항체에 대한 표적) 및 IFNAR1을 발현하기 때문에 이를 표적 세포로서 사용하였다. 표적 세포를 세척하고, 10%의 열로 불활성화되지 않은 혈청을 포함하는 페놀 무함유 RPMI 배지 또는 10%의 열 불활성화된 혈청을 포함하는 페놀 무함유 RPMI 배지 중에 최종 농도 0.4x106개의 세포/mL로 재현탁시켰다. 항체 용액은 50 ug/mL - 1.3x106 ㎍/mL 범위의 농도로 3x 희석액 연속물으로서 제조하였다. 열로 불활성화되지 않은 인간 혈청 또는 열 불활성화된 인간 혈청을 포함하는 배지 중에서 같은 항체 희석액 시료 복제물을 제조하였다. 50 ㎕의 NHI 또는 HI 배지를 둥근 바닥의 96 웰 플레이트의 적절한 웰에 첨가하여 CDC 분석을 준비하였다. 50 ㎕의 항체 희석액 연속물을 적절한 웰에 첨가하였다. 이어서, 표적 세포 시료 중 50 ㎕를 상기 웰에 첨가하였으며, 대조군으로서 표적 세포만을 포함하는 추가의 웰도 포함하였다. 플레이트를 5% CO2 중 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 3.5시간 동안 인큐베이션시킨 후, 최대 용해 신호를 측정하기 위해 지정된 적절한 대조군 웰에 20㎕의 용해 완충액을 첨가하였다. 프로메가(Promega)에서 정의된 프로토콜인 비-방사성 세포독성 분석법, #G1780을 사용하여 퀀티테이트(Quantitate)™ LDH 방출 분석법을 수행하였다. 490 nM에서 흡광도를 측정하고, 그래프패드 프리즘 4 분석 소프트웨어를 사용하여 Kd 값을 작성하였다.
결과: 상기 기술된 바와 같이 수행된 CDC로부터 얻은 결과를 도 34에 제시한다. 변형된 항IFNAR1 항체인 9D4-TM은 R347 항체을 사용한 경우에 관찰되는 것과 비교하였을 때, 표적 다우디 B 세포상에서 검출가능한 CDC 활성을 나타내지 않았다. 반대로, 다우디 B 세포상에서 발현되는 CD20에 결합하는 양성 대조군 항체는 배경 수준에 비하여 용량의 의존하는 방식으로 세포독성을 증가시켰다. 이러한 결과는 9D4-TM이 IFNAR1을 발현하는 표적 세포 상에서 CDC를 매개할 수 없다는 것을 확인시켜준다.
6.36 실시예 36: 변형된 항 IFNAR1 항체인 9 D4 - TM 은 어떤 유해 독성도 보이지 않는다.
목적: 9D4-TM이 어떤 유해 독성도 유도하지 않는다는 것을 확립시키기 위해 사이노몰거스 원숭이에서 단일 투약 독성 연구를 수행하였다.
방법: 본 연구에서, 첫째날 각 군당 10마리로 구성된 4개의 군(각 군당 한 성별로 5마리씩)에 0, 5, 30, 또는 100 mg/kg의 9D4-TM을 단일 투여량으로 투여하였다. 투여한 후, 3일째에는 각 군당 한 성별로 2마리씩 부검하는 것으로 지정하고, 나머지 동물은 모두 70일째까지 모니터링한 후, 부검하지 않고 연구에서 제외시키는 것으로 하였다. 사망율, 임상 징후(월경 포함), 면역표현형 분석, 체중, 신체 검사(심장박동수, 호흡수, 및 체온 포함), 임상 병리, 기관 중량, 및 현미경 관찰 데이타에 기초하여 독성을 평가하였다.
결과: 상기 설명된 조건하에 사망율, 임상 징후(월경 포함), 체중, 신체 검사(심장박동수, 호흡수 및 체온), 임상 병리, 기관 중량 및 현미경 관찰 데이타에 있어서 9D4-TM과 관련되어 일어나는 유해적 변화는 없었다. 이러한 결과는 변형된 항IFNAR1 항체인 9D4-TM이 어떤 유해 독성도 유도하지 않는다는 것을 제안한다.
본 발명의 특정 실시태양이 그를 설명하기 위한 목적으로 상기와 같이 기술되었지만, 첨부되는 특허청구범위에 기술되는 바와 같은 본 발명으로부터 벗어남 없이 상세하게 다수의 많은 변형이 이루어질 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
본 명세서에서 언급한 모든 공개 문헌, 특허 및 특허 출원은 마치 각 개개의 공개 문헌, 특허 및 특허 출원이 본원에서 참고로 인용된다고 구체적으로 개별적으로 언급되어 있는 것과 동일한 정도로 본원에서 참고로 인용된다.
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Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 42 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 42 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 43 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 43 cgtgcccagc acctgaattc gaggggggac cgtcagtctt c 41 <210> 44 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 44 gaagactgac ggtcccccct cgaattcagg tgctgggcac g 41 <210> 45 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 45 ccaacaaagc cctcccagcc tccatcgaga aaaccatctc c 41 <210> 46 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 46 ggagatggtt ttctcgatgg aggctgggag ggctttgttg g 41 <210> 47 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 47 ggtcccccat gcccaccatg cccagcacct g 31 <210> 48 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 48 caggtgctgg gcatggtggg catgggggac c 31 <210> 49 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 49 ccagcacctg agttcgaggg gggaccatca gtc 33 <210> 50 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 50 gactgatggt cccccctcga actcaggtgc tgg 33

Claims (67)

  1. IFNAR1에 특이적인 변형된 IgG1 부류 모노클로날 항체로서, Kabat에 기재된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 번호화된, 아미노산 치환 L234F, L235E 및 P331S를 Fc 영역에 포함하고, 비변형된 항체와 비교하여 1 이상의 Fc 리간드에 대해 감소된 친화성을 나타내는 것인 모노클로날 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체가
    a. 서열 번호 1을 포함하는 인간 경쇄 가변 영역 CDR1;
    b. 서열 번호 2를 포함하는 인간 경쇄 가변 영역 CDR2;
    c. 서열 번호 3을 포함하는 인간 경쇄 가변 영역 CDR3;
    d. 서열 번호 4를 포함하는 인간 중쇄 가변 영역 CDR1;
    e. 서열 번호 5를 포함하는 인간 중쇄 가변 영역 CDR2; 및
    f. 서열 번호 6을 포함하는 인간 중쇄 가변 영역 CDR3
    을 포함하는 것인 항체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체가
    a. 서열 번호 21을 포함하는 인간 경쇄 가변 영역 CDR1;
    b. 서열 번호 22를 포함하는 인간 경쇄 가변 영역 CDR2;
    c. 서열 번호 23을 포함하는 인간 경쇄 가변 영역 CDR3;
    d. 서열 번호 24를 포함하는 인간 중쇄 가변 영역 CDR1;
    e. 서열 번호 25를 포함하는 인간 중쇄 가변 영역 CDR2; 및
    f. 서열 번호 26을 포함하는 인간 중쇄 가변 영역 CDR3
    을 포함하는 것인 항체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체가
    a. 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 인간 중쇄 가변 영역; 및
    b. 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 인간 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 것인 항체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항체가
    a. 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 인간 중쇄 가변 영역; 및
    b. 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 인간 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 것인 항체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항체가
    a. 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 인간 중쇄 가변 영역; 및
    b. 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 인간 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 것인 항체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항체가 서열 번호 41의 경쇄 불변 영역 서열, 및 서열 번호 42의 중쇄 불변 영역 서열을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역 서열이 EU 인덱스 번호화 체계에 의해 정의된, 214, 221, 356 및 358로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1 이상의 위치에 대립형질 변이를 포함하는 것인 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물로서, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 크론병, 건선, 건선성 관절염, 교감성 안염, 자가면역 난소염, 자가면역 고환염, 자가면역 림프증식 증후군, 항인지질 증후군, 쇼그렌 증후군, 공피증, 애디슨병, 다내분비선 결핍 증후군, 길랭-바레 증후군, 면역 혈소판감소성 자색반병, 악성 빈혈, 중증 근육무력증, 원발성 담즙성 간경변, 혼합 결합 조직병, 백반증, 자가면역 포도막염, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 저혈소판증, 셀리아크병, 포진성 피부염, 자가면역 간염, 천포창, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 수포성 유천포창, 자가면역 심근염, 자가면역 혈관염, 원형 탈모증, 자가면역 아태롬성동맥경화증, 베체트병, 자가면역 골수병, 자가면역 혈우병, 자가면역 간질성 방광염, 자가면역 요붕증, 자가면역 자궁내막증, 재발성 다발성 연골염, 강직성 척추염, 자가면역 두드러기, 피부근육염, 밀러-피셔 증후군, IgA 신장병증, 굿파스처 증후군, 및 임신 헤르페스에서 선택된 면역 질환 또는 질병을 치료하는 데 사용하는 약학 조성물.
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