PT2250279E - Anticorpos anti-ifnár1 com afinidade reduzida para o ligando fc - Google Patents

Anticorpos anti-ifnár1 com afinidade reduzida para o ligando fc Download PDF

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Wu Herren
Coyle Anthony
Cibotti Ricardo
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Description

DESCRIÇÃO
"ANTICORPOS ANTI-IFNAR1 COM AFINIDADE REDUZIDA PARA O LIGANDO FC"
1. CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO A presente invenção relaciona-se com anticorpos isolados e composições especificas para o recetor 1 do interferão alfa (IFNAR1) com afinidade reduzida para ligandos Fc. A invenção também compreende ácidos nucleicos codificando tais anticorpos, ácidos nucleicos complementares, vetores, células hospedeiras, e métodos de produção e uso relacionados, incluindo composições terapêuticas, formulações, administrações e dispositivos.
2. ANTECENDENTES TÉCNICOS DA INVENÇÃO 2.1 Interferões:
Interferões (IFN) do Tipo 1 (IFNa, IFNP, IFNgú, IFNt) são uma familia de citocina estruturalmente relacionadas possuindo efeitos antiviricos, antitumorais e imunomodeladores (Hardy et al. (2001) Sangue 97:473; Cutrone e Langer (2001) J. Biol. Chem. 276:17140). O lócus IFNa humano inclui duas subfamilias. A primeira subfamilia consiste de 14 genes não-alélicos e 4 pseudogenes possuindo pelo menos 80% de homologia. A segunda subfamilia, all ou omega (ω) , contém 5 pseudogenes e 1 gene funcional que exibe 70% de homologia com os genes de IFNa (Weissmann e Weber (1986) Proc. Nucl. Acid Res. Mol. Biol., 33:251-300). Os subtipos de IFNa possuem diferentes atividades especificas mas possuem o mesmo espectro biológico (Streuli et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:2848) e apresentam o mesmo recetor celular (Agnet M. et al. in "Interferon 5" Ed. I. Gresser p. 1-22, Academic Press, London 1983) . Os subtipos de interferão alfa foram identificados com a seguinte nomenclatura: IFNa 1, 2a, 2b, 4, 4b, 5, 6, 7,8, 10, 14, 16, 17, e 21. 0 interferão β (IFN3) é codificado por um único gene, que apresenta aproximadamente 50% de homologia com os genes IFN a. O interferão γ, que é produzido via linfócitos ativados, não possui qualquer homologia com os interferões alfa/beta e não reage com os seus recetores. 2.1.1 Recetores de interferão:
Todos os interferões humanos do Tipo 1 ligam-se a um recetor da superfície celular (recetor do IFN alfa, IFNAR), consistindo de duas proteinas transmembranares, IFNAR1 e IFNAR2 (Uze et al. (1990) Cell 60:225; Novick et al. (1994) Cell 77:391). IFNAR1 é essencial para uma elevada afinidade de ligação e especificidade diferencial do complexo IFNAR (Cutrone et al. (2001) J. Biol Chem 276(20):17140-8). Enquanto diferenças funcionais para cada um dos subtipos do IFN Tipo 1 não foram identificadas, pensa-se que cada uma delas possa exibir diferentes interações com as componentes do recetor IFNAR levando a resultados de sinalização potencialmente diferentes (Cook et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 13448). Em particular, estudos utilizando formas mutantes de IFNAR1 e IFNAR2 sugerem que os interferões alfa e beta sinalizam diferentemente através do recetor ao interagirem diferentemente com as respetivas cadeias (Lewerenz et al. (1998) J. Mol. Biol. 282:585). 2.1.2 Função dos Interferões:
Estudos funcionais iniciais sobre IFNs Tipo 1 focaram-se na defesa inata contra infeções viricas (Haller et al. (1981) J. Exp. Med. 154:199; Lindenmann et al. (1981) Methods Enzymol. 78:181). Estudos mais recentes, contudo, implicam IFNs Tipo 1 como potentes citocinas imunorreguladoras na resposta imune adaptativa. Especificamente, foi demonstrado que IFNs Tipo 1 facilitam a diferenciação de células T naive ao longo da via Thl (Brinkmann et al. (1993) J. Exp. Med. 178: 1655), para aumentar a produção de anticorpos (Finkelman et al. (1991) J. Exp. Med. 174: 1179) e para apoiar a atividade funcional e sobrevivência de células T de memória (Santini et al. (2000) J. Exp. Med. 191:1777; Tough et al. (1996) Science 272:1947).
Trabalhos recentes efetuados por um número de grupos sugerem que IFNcx possa estimular a maturação ou a activação de células dendriticas (DCs) (Santini et al. (2000) J. Exp. Med. 191: 1777; Luft et al. (1998) J. Immunol. 161:1947; Luft et al. (2002) Int. Immunol. 14:367; Radvanyi et al. (1999) Scand. J. Immunol. 50:499). Adicionalmente, expressão aumentada de interferões do Tipo 1 foi descrita em numerosas doenças autoimunes (Foulis et al. (1987) Lancet 2:1423; Hooks et al. (1982) Arthritis Rheum. 25:396; Hertzog et al. (1988) Clin. Immunol. Immunopathol. 48:192; Hopkins and Meager (1988) Clin. Exp. Immunol. 73:88; Arvin and Miller (1984) Arthritis Rheum. 27:582). Os exemplos mais estudados deste tipo de doenças são a Diabetes mellitus dependente de insulina (IDDM) Foulis (1987)) e lúpus eritematosa sistémica (SLE) 1982)), que se encontram associadas com elevados níveis de IFNcx, e artrite reumatoide (RA) (Hertzog (1988), Hopkins e Meager (1988),
Arvin e Miller (1984)), na qual ΙΕΝβ pode desempenhar um papel mais significativo.
Adicionalmente, a administração de interferão α foi reportada como exacerbando a doença subjacente em pacientes com psoriase e esclerose múltipla e induzindo uma sindrome semelhante a SLE em pacientes em um historial prévio de doenças autoimunes. 0 interferão α foi também demonstrado como induzindo glomerulonefrite em ratinhos saudáveis e acelerando o inicio de doenças autoimunes espontâneas em ratinhos NZB/W. Adicionalmente, terapia com IFNcx foi demonstrada em alguns casos como levando a efeitos secundários indesejados, incluindo febre e distúrbios neurológicos. Consequentemente, existem situações patológicas em que a inibição da atividade de IFN Tipo 1 pode ser benéfica para o paciente e uma necessidade existe para o desenvolvimento de agentes eficazes na inibição da atividade de IFN Tipo 1. 2.1.3 Funções Executoras de Anticorpos: A região Fc de um anticorpo interage com um número de ligandos (também aqui referidos como "ligandos Fc" que incluem mas não estão limitados a agentes que especificamente se ligam à região Fc dos anticorpos, tais como recetores Fc e Clq, transmitindo-lhes uma gama de importantes capacidades funcionais referidas como funções executoras. Os recetores Fc medeiam a comunicação entre anticorpos e o "braço" celular do sistema imunitário (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290). Em humanos, esta família de proteínas inclui FcyRI (CD64), incluindo as isoformas FcyRIA, FcyRIE, e FcyRIC; FcyRII (CD32), incluindo as isoformas FcyRIIA, FcyRIIB, e FcyRIIC; e FcyRIII (CD16), incluindo as isoformas FcyRIIIA e FcyRIIB (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65). Estes recetores tipicamente possuem um dominio extracelular que medeia a ligação a Fc, uma região abrangente da membrana, e um dominio intracelular que pode mediar algum evento de sinalização na célula. Estes recetores são expressos numa variedade de células imunitárias incluindo monócitos, macrófagos, neutrófilos, células dendriticas, esosinófilos, mastócitos, plaquetas, Células B, linfócitos granulares grandes, Células de Langerham, células exterminadoras naturais (NK), e Células T. A formação do complexo Fc/FcyR recruta essas células executoras para locais de ligação ao antigénio, tipicamente resultando em eventos de sinalização em células e importantes respostas imunológicas subsequentes tais como a libertação de mediadores de inflamação, ativação de células B, endocitose, fagocitose, e ataque citotóxico. A capacidade para mediar as funções executoras citotóxicas e fagociticas é um mecanismo potencial através do qual anticorpos destroem células-alvo. A reação mediada por células onde células citotóxicas inespecificas que expressam FcyRs reconhecem anticorpo ligado a uma célula-alvo e subsequentemente causam a lise da célula-alvo é conhecida como citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766; Ravetch et al. , 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290). A reação mediada por células onde células citotóxicas inespecificas que expressam FcyRs reconhecem o anticorpo ligado a uma célula-alvo e subsequentemente causam a fagocitose da célula-alvo é conhecida como fagocitose mediada por células dependente de anticorpos (ADCP). Adicionalmente, um local de sobreposição na região Fc da molécula também controla a ativação de uma função citotóxica independente de células mediada pelo complemento, também conhecida como a citotoxicidade dependente do complemento (CDC). 2.1.4 Os diferentes tipos de FcyR humano:
Os FcyRs humanos encontram-se divididos em três classes distintas: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16). FcyRI é um recetor de alta afinidade (Ka: 10“8-10‘9 M_1) e liga ambos os complexos imunológicos e as moléculas de IgG monoméricas enquanto os recetores Fc FcyRII e FcyRIII exibem afinidades mais baixas (Ka: 10‘7 M_1 e 2-3*10~7 M"1, respetivamente) (Gessner J.E. et al., 1998, Ann. Hematology 76:231-48). A sinalização através de FcyRs é feita ou através de um motivo de ativação de imunorecetores baseado em tirosina (ITAM) ou através de um motivo de inibição de imunorecetores baseado em tirosina (ITIM) para todos os recetores transmembranares (Presta, 2006, Adv. Drug Deliv. Rev 58:640-656) . A glicoproteina extracelular FcyRI de 72 kDa é maioritariamente expressa em células mieloides tais como monócitos, macrófagos, células progenitoras CD4+, e pode gerar respostas ADCC, endociticas, e fagociticas (Siberil et al. , 2006, J. Immunol. Lett. 106: 111- 118). O grupo de recetores FcyRII de 40 Kda (isoformas A, B, e C) exibe domínios extracelulares mas não contêm domínios de transdução de sinal ativos. Estes recetores propagam sinais através da fosforilação de um domínio de de uma cauda citoplasmática (Amigorena S. et al., 1992 Science. 256:1808-12). O FcyRIIA é maioritariamente expresso em monócitos, macrófagos, neutrófilos, e plaquetas onde o recetor FcyRIIC foi apenas identificado em células NK. Estes dois recetores foram demonstrados como sendo os iniciadores da libertação de mediadores inflamatórios e de respostas ADCC, endociticas e fagociticas (Cassei et al. , 1993. Mol Immunol30:451-60). Por contraste, os recetores FcyRIIB (tipos BI e B2) são expressos em células B, mastócitos, basófilos, monócitos, macrófagos e células dendriticas e foram demonstrados como subregulando a resposta imunitária despoletada pelas isoformas A e C. O FcyRIIIA de 50 kDa, é expresso em células NK, monócitos, macrófagos e um subconjunto de Linfócitos T onde ativa a ADCC, fagocitose, endocitose e libertação de citocinas (Gessner et al.) . A isoforma FcyRIIIB é uma proteina membranar periférica ancorada de glicosil-fosfatidilinositol (GPI) envolvida na desgranulação e na produção de intermediários/espécies reativas de oxigénio (Salmon J.E. et al.,1995, J. Clin. Inves. 95:2877-85).
As moléculas IgG também exibem especificidade isotipica diferencial para FcyRs. As moléculas IgG3 ligam-se fortemente a todas as isoformas FcyR. IgGl, a isoforma mais prevalente no sangue liga-se a todos os FcyRs embora com uma afinidade inferior para as isoformas FcyRIIA/B. IgG4 é um agente de ligação médio a FcyRI um agente de ligação fraco a FcyRIIB. Finalmente, IgG2 liga-se apenas fracamente a uma forma alélica de FcyRIIA (FcyRIIA-H131) (Siberil et al., 2006, J. Immunol. Lett. 106:111-118). 2.1.5 Complemento A cascata de resposta inflamatória associada ao complemento é uma parte da resposta imunitária inata e é crucial para a capacidade de um indivíduo em combater a infeção. Outro ligando Fc importante é a proteína do complemento Clq. A ligação de Fc a Clq medeia um processo denominado de citotoxicidade dependente de complemento (CDC) (revisto em Ward et al. , 1995, Ther Immunol 2:77-94). Clq é capaz de se ligar a seis anticorpos, embora a ligação a duas IgGs seja suficiente para ativar a cascata do complemento. Clg forma um complexo com as protéases Cie e Cls de serina para formar o complexo Cl da via do complemento.
2.1.6 Regiões e resíduos aminoacidicos de IgG envolvidos na ligação FcyR 0 mapeamento de locais de ligação IgG humanos para diferentes FcyR foi extensivamente estudado. Estes estudos, baseados em moléculas de IgG geneticamente alteradas, identificaram uma peguena seguência continua de resíduos aminoacidicos (234-238) da secção N-terminal do domínio CH2 como estando diretamente envolvidos na ligação de todos os FcyRs. Adicionalmente, os resíduos 268, 297, 327 e 329 podem influenciar a ligação a um subconjunto de FcyRs. Também, resíduos múltiplos localizados nos domínios CH2 e CH3 também contribuem para a ligação de FcyR (Canfield SM. et al., 1991, J. Exp. Med. 173:1483-91; Chappel MS. et al., 1991, Proc Nat Acad Sei USA 888:9036-40; Gergely J. et al., 1990 FASEB J 4:3275-83). 2.2 Toxicidade relacionada com a terapêutica de anticorpos
Em muitas circunstâncias, a ligação e estimulação das funções executoras mediadas pela região Fc das imunoglobulinas é altamente benéfica, contudo, em certas circunstâncias pode ser mais vantajoso o decréscimo ou eliminação da função executora. Isto é particularmente verdade para agueles anticorpos desenhados para transportar um fármaco (p.ex., toxinas e isótopos) até à célula-alvo onde as funções executoras mediadas por Fc/FcyR transformam as células imunes saudáveis na proximidade da carga mortífera útil, resultando na depleção do tecido linfoide normal conjuntamente com as células T-alvo (Hutchins et al., 1995, PNAS USA 92:11980-11984; White et al. , 2001, Annu. Rev. Med. 52: 125-145). Nestes casos, o uso de anticorpos que pobremente recrutam o complemento ou células executoras seria de um remendo benefício (ver, por exemplo, Wu et al., 2000, Cell Immunol200:16-2 6; Shields et al., 2001, J. Biol. Chem 276:6591-6604; U.S. 6,194,551; U.S. 5,885,573 e a publicação PCT WO 04/029207).
Noutras circunstâncias, por exemplo, onde o bloqueio da interação de um recetor amplamente expresso com o seu ligando cognato é o objetivo, seria vantajoso o decréscimo ou eliminação de toda a função executora de anticorpos de modo a reduzir a toxicidade indesejada. Também, em circunstâncias onde o anticorpo terapêutico exibe ligação promíscua através de um número de tecidos humanos, seria prudente limitar o direcionamento da função executora a um conjunto diverso de tecidos para limitar a toxicidade. Embora existam certas subclasses de imunoglobulinas humanas que careçam de funções executoras específicas, não se conhecem imunoglobulinas de ocorrência natural que careçam de todas as funções executoras. Uma abordagem alternativa seria o desenvolvimento ou mutação de resíduos críticos na região Fc que são responsáveis pela função executora. Para exemplos, ver as publicações W02006076594, W01999058572, US20060134709, W02006047350, W02006053301, e U.S. 5,624,821. O uso de anticorpos monoclonais no tratamento de muitos estádios de doença tem sido bem documentado. Dentre da miríade de funções executoras que um anticorpo pode despoletar, um dos requerimentos da terapêutica com anticorpos é que eles são direcionados especificamente a um alvo de interesse. Por exemplo, mas não estando limitados a, a especificidade de um tecido-alvo é analisada através da examinação da imunihistoquimica (IHC) de um tecido de interesse. É importante que o agente terapêutico apenas se ligue a tecidos que contenham um alvo de interesse. A falha deste objetivo poderia resultar numa toxicidade mais elevada da terapêutica de anticorpos devido à ativação inapropriada da função executora gerada no local não-direcionado. Caso a função executora pudesse ser diminuída ou eliminada, o perigo da ligação alargada do agente terapêutico poderia ser evitada. Com todas essas considerações, existe uma necessidade ainda por cumprir de anticorpos com afinidade reduzida ou nula para pelo menos um ligando Fc responsável por facilitar a função executora. Tais anticorpos seriam de um benefício particular para uso no tratamento de condições crónicas inflamatórias e autoimunes. A Patente U.S. 2006/0029601 Al descreve anticorpos monoclonais humanos isolados que se ligam a IFNAR1 e inibem a atividade biológica do interferão Tipo 1; a modificação da região Fc em resíduos específicos alterando a função executora do anticorpo é também descrita. A Patente U.S. 2005/0226876 Al descreve várias modificações na região Fc de um anticorpo anti-selectina-P para reduzir a ligação a FcR.
Radaev et al. , (2001) J. Biol. Chem., vol. 276: 16469 -16477 descrevem a estrutura de um recetor Fcy Tipo III humano num complexo com uma região Fc IgG humana.
Shields et al., (2001) J. Bio. Chem., vol 276: 6591 - 6604 descreve o mapeamento de alta resolução do local de ligação em IgGl humana para FcyRI, FcyRII, FcyRIII e FcRn, assim como o design de variantes de IgGl cim ligação melhorada a FcyR. US 2004/0132101 Al descreve uma região Fe modificada para reduzir a ligação a um ligando Fc. WO 2006/002177 A2 descreve anticorpos monoclonais humanos que se ligam a IFNAR1 e são capazes de inibirem a atividade biológica de interferões do Tipo 1. US 6, 194,551 BI descreve uma variante da região Fc da IgG3 humana com função executora alterada. WO 94/029351 A2 descreve modificações de Fc que alteram a função executora. US 5, 624, 821 A descreve modificações de Fc que alteram a função executora. US 5, 648, 260 A descreve modificações de Fc que alteram a função executora e decrescem a ligação ao recetor Fc de alta afinidade. WO 2006/036291 A2 descreve modificações de Fc que limitam a função executora de anticorpos. EP 1 707 627 Al descreve modificações de Fc que decrescem ADCC.
Armour et al. , (2003) Molecular Immunology Vol. 40, No, 9: 585-593 descreveram a ligação diferencial a recetores
FcYRIIa e FcyRIIb humanos por parte de anticorpos wildtype e mutantes IgG.
Organesyan et ai., (2008) Ata Crystallographica Section D: Biological Crystallography vol. 64, no. 6: 700 - 704 descreve a caracterização estrutural de um fragmento Fc humano desenvolvido para falta de funções executoras.
3. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura IA. Alinhamento das sequências nucleotidica (SEQ ID No:7) e aminoacidica (SEQ ID No:8) de 3F11 VH com as regiões CDR como indicado pelo sublinhado.
Figura 1B. Alinhamento das sequências nucleotidica (SEQ ID No: 9) e aminoacidica (SEQ ID No:10) de 3F11 VK com as regiões CDR como indicado pelo sublinhado.
Figura 2A. Alinhamento das sequências nucleotidica (SEQ ID N° : 17) e aminoacidica (SEQ ID No: 18) de 405 VH com as regiões CDR como indicado pelo sublinhado.
Figura 2B. Alinhamento das sequências nucleotidica (SEQ ID No: 19) e aminoacidica (SEQ ID No:20) de 405 VK com as regiões CDR como indicado pelo sublinhado.
Figura 3A. Alinhamento das sequências nucleotidica (SEQ ID No:27) e aminoacidica (SEQ ID No:28) de 11E2 VH com as regiões CDR como indicado pelo sublinhado.
Figura 3B. Alinhamento das sequências nucleotidica (SEQ ID No:29) e aminoacidica (SEQ ID No:30) de 11E2 VK com as regiões CDR como indicado pelo sublinhado.
Figura 4A. Alinhamento das sequências nucleotídica (SEQ ID No:37) e aminoacídica (SEQ ID No:38) de 9D4 VH com as regiões CDR como indicado pelo sublinhado.
Figura 4B. Alinhamento das sequências nucleotídica (SEQ ID No:39) e aminoacídica (SEQ ID No:40) de 9D4 VK com as regiões CDR como indicado pelo sublinhado.
Figura 5. Alinhamento da sequência aminoacídica das regiões constantes da cadeia pesada para 9D4. As setas indicam as substituições aminoacídicas (de não-modifiçadas para modificadas) que aumentam a estabilidade e reuzem a afinidade para pelo menos um ligando Fc.
Figura 6A. Perfil de coloração imunohistoquímica de tecido cerebral humano tratado com vários anticorpos anti-IFNARl. 0 anticorpo 9D4 exibe um perfil de coloração muito inferior quando incubado com tecido cerebral humano, comparativamente com os anticorpos 405 e MDX-1333.
Figura 6B. Perfil de coloração imunohistoquímica de monócitos humanos tratados com vários anticorpos anti-IFNARl. Como controlo positivo, vários anticorpos anti-IFNARl foram testados para a reatividade contra monócitos humanos.
Figura 7. O anticorpo anti-IFNARl 9D4 inibe a sinalização IFNcx num ensaio de ativação STAT baseado em células. Tratamento com anticorpo 9D4 inibe a fosforilação tirosina STAT1/3/4 em resposta à estimulação com interferão alfa como determinado por análise Western Blot com anticorpos STAT comercialmente disponíveis.
Figura 8. Anticorpos anti-IFNARl bloqueiam a sinalização a várias concentrações de IFNs Tipo 1 derivados de células pDC. Representados estão os valores de IC50 para o bloqueio da sinalização IFN por parte de anticorpos 9D4 num ensaio com gene repórter luciferase utilizando sobrenadantes IFN Tipo 1 purificados de 3 dadores independentes. Incluídos estão as quantidades relativas de IFNoí, IFNP e IFNoo em cada um dos sobrenadantes de interferão Tipo 1 purificados.
Figura 9 A, B, C. Anticorpos anti-IFNARl 9D4, 9D4-DM (Duplo Mutante), e 9D4-TM (Triplo Mutante) exibem características de ligação similares. Aqui representados estão dados representando o anticorpo 9D4 não-modifiçado com 2 anticorpos modificados, 9D4-DM e 9D4-TM. Os anticorpos modificados exibem características similares de ligação a IFNAR1 comparativamente com o anticorpo não-modifiçado.
Figura 10A. 0 anticorpo anti-IFNARl 9D4 liga-se ao recetor de interferão alfa solúvel (sIFNARl). Aqui representados estão dados de ligação em equilíbrio que demonstram a ligação dependente de dosagem de 9D4 ao recetor de interferão alfa solúvel.
Figura 10B. Determinação de Kd de 9D4 em PBMCs humanas. Aqui representada está a determinação da constante de dissociação de 9D4 como medida pela ligação a PBMCs humanas.
Figura 11. Anticorpos anti-IFNARl inibem a sinalização induzida por IFNoí num ensaio com o gene repórter da luciferase. Anticorpos anti-IFNARl incluindo anticorpos modificados e não-modifiçados demonstram valores de IC50 para o bloqueio da sinalização IFN em leucócitos num sistema de ensaio com o gene repórter da luciferase.
Figura 12A. Determinação do ponto isoelétrico de anticorpos 9D4 (não-modifiçados) e 9D4 modificados. Aqui representado está um gel IEF documentando os valores relativos de pi para anticorpos 9D4-WT (não-modifiçados), 9D4-DM, e 9D4-TM.
Figura 12B. Determinação das temperaturas de fusão térmica de anticorpos 9D4 (não-modifiçados) e 9D4 modificados. Aqui representado está uma curva de fusão documentando as temperaturas de fusão (Tm) para os anticorpos 9D4, 9D4-DM, e 9D4-TM.
Figura 13. Tratamento profilático com anticorpos anti-IFNAR bloqueia a proteinúria induzida por Adv-IFNa. Ratinhos tratados com o vetor de controlo, Adv-IFNa, Adv-IFNa + pré-tratamento de controlo com o isótipo foram analisados relativamente à proteinúria durante 9 semanas. Ratinhos pré-tratados com anti-IFNAR não exibiram proteinúria após exposição a IFNa.
Figura 14. Tratamento profilático com anticorpos anti-IFNAR bloqueia a sobrerregulação dos genes responsivos IFNa (IFIT1, IFI44, CXCL11, IFI202b, CXCL19, CXCL9) no sangue. Ratinhos pré-tratados com anticorpos anti-IFNAR não exibiram genes responsivos IFNa sobrerregulados após exposição a IFN alfa codificado por adenovirus, comparativamente com ratinhos pré-tratados com vírus de controlo, PBS, ou controlos IgG isotípicos. Aqui representados estão a expressão relativa de seis genes conhecidos por serem responsivos a IFNa em amostras de sangue retiradas de ratinhos 3 semanas após indução via IFNa por infeção com Adv-IFNa.
Figura 15 A, B. Tratamento profilático com anticorpos anti-IFNAR bloqueia a produção de autoanticorpos induzidos por IFNa. Ratinhos pré-tratados com anticorpos anti-IFNAR não exibiram produção aumentada de autoanticorpos após exposição a IFNa codificado por adenovirus comparativamente com ratinhos pré-tratados como virus de controlo, PBS ou controlos IgG isotipicos. Aqui representadas estão as concentrações de anticorpos antidsDNA e anti-SSA/Ro em amostras de sangue retiradas de ratinhos 6 semanas após indução via IFNa por infeção com Adv-IFNa.
Figura 16 A, B. Tratamento profilático com anticorpos anti-IFNAR bloqueia a sobrerregulação de citocinas no rim. Ratinhos pré-tratados com anticorpos anti-IFNAR não exibiram citocinas sobrerreguladas no rim após exposição com IFN codificado por adenovirus comparativamente com ratinhos pré-tratados com virus de controlo, PBS ou controlos IgG isotipicos. Aqui representadas estão as medições dos niveis de IP-10, e IL-18 em amostras de rim retiradas de ratinhos 6 semanas após indução via IFNa por infeção com Adv-IFNa5.
Figura 17. Tratamento profilático com anticorpos anti-IFNAR bloqueia a produção de autoanticorpos induzidos por IFN. Aqui representados estão os titulos relativos de anticorpos antiantigénio nuclear (ANA) em soro murino. Ratinhos pré-tratados com anticorpos anti-IFNAR exibiram titulos inferiores de ANA sérico após exposição com IFN comparativamente com ratinhos pré-tratados com virus de controlo, PBS, ou controlo isotipico.
Figura 18. A inibição mediada por anticorpos de SLE plasmático influenciou o desenvolvimento células dendriticas. Aqui representados estão os resultados de experiências individuais A5 nas quais IFN derivado de pacientes SLE foi incubado na presença de anticorpo anti- IFNAR1 9D4 e subsequentemente adicionado a monócitos humanos. A presença do anticorpo anti-IFNARl 9D4 inibiu a capacidade de IFN derivado de pacientes de SLE para induzirem os marcadores de células dendríticas CD38 e CD123 em monócitos em diferenciação.
Figura 19. Anticorpos anti-IFNARl suprimem a expressão de CD38, CD123 e CD86 em monócitos estimulados com interferão de leucócitos. Como medido pela percentagem da expressão estimulada do controlo, anticorpos anti-IFNARl 9D4, 9D4-DM e 9D4-TM exibiram perfis de inibição similares para a expressão de CD38, CD123 e CD86 em monócitos em diferenciação.
Figura 20. Anticorpos anti-IFNARl modificados exibem uma ligação diminuída ao recetor Fc FcyRI comparativamente com anticorpos não-modifiçados anti-IFNARl. Anticorpos anti-IFNARl 9D4 (não-modifiçados), 9D4-DM (modificados) e 9D4-TM (modificados) foram analisados quanto à sua capacidade para se ligarem a uma superfície acoplada a FcyRI numa experiência ELOSA. Como controlo positivo para a ligação ao recetor Fc, anticorpos não-modifiçados não-relacionados foram usados (anticorpo de controlo).
Figura 21, A, B, C. Anticorpos anti-IFNARl modificados exibem ligação diminuída ao recetor Fc FcyRIIIA comparativamente com anticorpos não-modifiçados anti-IFNARl. Anticorpos anti-IFNARl 9D4 não-modifiçados acoplados a superfície (A) e anticorpos anti-IFNARl modificados 9D4-DM (B) e 9D4-TM( C) foram analisados quanto à sua capacidade para se ligarem a FcyRIIIA livre num formato experimental ELISA.
Figura 22, A, B, C. Anticorpos anti-IFNARl modificados exibem ligação diminuída ao recetor Fc FcyRIIIA. Anticorpos livres não-modifiçados anti-IFNARl 9D4(A) e anticorpos anti-IFNARl modificados 9D4-DM(B) e 9D4-TM(C) foram analisados quanto à sua capacidade para se ligarem a FcyRIIIA acoplado à superfície num formato experimental ELISA.
Figura 23 A-E. Neutralização dos subtipos IFN em soro de pacientes de SLE. Como medido no ensaio com gene repórter, anticorpos anti-IFNARl MDX-1333, 9D4-WT e 9D4-TM inibiram a sinalização mediada por IFN de cxlO (A) , Interferão do leucócito (B) , cx2b (C) , ω (D) , e β (E) .
Figura 24. Anticorpos anti-IFNARl neutralizam interferão Tipo 1 de pacientes de SLE. Como verificado em ensaio com gene repórter, o anticorpo anti-IFNARl, 9D4, inibiu a sinalização mediada por interferão Tipo 1 comparativamente com um controlo, um anticorpo não-relacionado.
Figura 25 A-D. Anticorpos anti-IFNAR suprimem a população de pDC induzida por IFNa em PBMC's. Anticorpos anti-IFNAR bloquearam o aumento de células pDC como medido pela expressão de epítopo na superfície celular, induzida pela expressão promovida por adenovirus ectópicos de interferão alfa no baço (A), nódulos linfáticos (Β), sangue periférico (C) e medula óssea (D).
Figura 26. Análise de ligação de anticorpos anti-IFNARl 9D4-WT, 9D4-DM, e 9D4-TM ao recetor Fc FcyRI foi determinada por análise BIACore. Sucintamente, anticorpos anti-IFNARl foram imobilizados e FcyRI livre foi adicionado para medir a afinidade. Como demonstrado pelos traçados, os anticorpos modificados, 9D4-DM, e 9D4-TM exibiram afinidades mais baixas ao FcyRI livre comparativamente com os anticorpos não-modifiçados 9D4-WT.
Figura 27 A-C. Análise de ligação de anticorpos anti-IFNARl 9D4-WT, 9D4-DM, e 9D4-TM ao recetor Fc FcyRI foi determinado por análise BiaCore. Sucintamente, anticorpos anti-IFNARl livres foram passados através de FcyRI imobilizado para medir a afinidade. Como demonstrado pelo traçado, os anticorpos modificados 9D4-DM (B), e 9D4-TM (C) exibiram afinidades mais baixas ao FcyRI imobilizado comparativamente com os anticorpos não-modifiçados 9D4-WT (A) .
Figura 28. Anticorpos anti-IFNAR inibem a indução de genes responsivos IFNoí no rim. Sucintamente, no modelo murino de lúpus acelerado, tratamento com anticorpos anti-IFNAR bloqueia a indução no rim de seis genes (ICAM1, VCAM1, CXCL9, CXCL10, e IFIT1) mediada pela expressão ectópica de IFNoí comparativamente com ratinhos de controlo como medido por um ensaio Taqman.
Figura 29. Anticorpos anti-IFNAR inibiram a produção de anticorpos antidsDNA no modelo murino de lúpus acelerado. Sucintamente, ratinhos expressando ectopicamente IFNoí e tratados com anticorpos anti-IFNAR não acumularam anticorpos antidsDNA ao mesmo nivel que ratinhos similarmente infetados e tratados com um anticorpo IgG de controlo.
Figura 30. Anticorpos anti-IFNAR são capazes de reduzir proteinuria numa configuração terapêutica no modelo murino de lúpus acelerado. (A) Sucintamente, ratinhos expressando ectopicamente IFNoí desenvolveram sintomas semelhantes a lúpus, tais como proteinuria. Num estudo terapêutico, anticorpos anti-IFNAR foram administrados a ratinhos caso a avaliação de proteinúria limite tiver sido alcançada. Anticorpos anti-IFNAR, PBS, ou IgG de controlo foram administrados semissemanalmente ao longo de um periodo de 5 semanas. 0 grupo tratado com anticorpos anti-IFNAR exibiu uma gravidade diminuída de proteinuria durante a experiência comparativamente com grupos tratados com PBS isolado ou IgG de controlo.
Figura 31. Anticorpos anti-IFNAR são capazes de aumentar a sobrevivência numa configuração terapêutica no modelo murino de lúpus acelerado. (A) Sucintamente, ratinhos expressando ectopicamente IFNa apresentaram uma taxa de sobrevivência reduzida cerca de 8 semanas após desenvolverem sintoma associados a lúpus tais como proteinuria. No estudo terapêutico, anticorpos anti-IFNAR foram administrados a ratinhos caso a avaliação de proteinúria limite tiver sido alcançada. Anticorpos anti-IFNAR, PBS, ou IgG de controlo foram administrados semissemanalmente ao longo de um período de 5 semanas. Após as cinco semanas, tratamento com anticorpos foi terminado e a mortalidade rastreada para todos os três grupos de tratamento. O grupo tratado com anticorpos anti-IFNAR exibiu uma taxa de mortalidade muito inferior do que a apresentada pelos grupos trarados com PBS isoladamente, ou IgG de controlo, os quais exibiram mortalidade completa após 9 semanas.
Figura 32. Representação dos conteúdos de unidade assimétrica de cristais de Fc-TM que compreende as mutações L234F/L235E/P331S. A mutação P331 encontra-se indicada a vermelho. Um ião de zinco é complexado por dois resíduos de histidina espacialmente próximos. Os resíduos de hidratos de carbono acoplados a 297 foram modelados de acordo com a sua densidade de eletrões.
Figura 33. Imagens cinéticas demonstram a internalização de 9D4-TM. Células THP-1 foram marcadas com 1 μΜ CFSE numa incubadora a 37 °C com CO2 durante 10 min seguido por 1 pg/ml de Alexa647-9D4-TM em gelo durante 1 hr. Após remoção do marcador não-ligado, as células foram incubadas a 37°C pelos períodos de tempo indicados (0, 15,30 e 60 minutos) e as imagens das células foram registadas.
Figura 34. O anticorpo anti-IFNARl, 9D4-TM não exibe atividade CDC num ensaio in vitro. Representados nesta figura estão os resultados de um ensaio CDC para determinar a capacidade do anticorpo 9D4-TM para gerar atividade CDC. Como representado, o anticorpo 9D4-TM não exibiu qualquer atividade CDC comparativamente com o anticorpo de controlo positivo. A atividade CDC permaneceu também indetetada para um anticorpo de controlo não-relacionado, R348. Sucintamente, células expressando o antigénio IFNAR1 foram Os incubadas ou com o anticorpo de controlo positivo, 9D4-TM, ou R347. Após uma série de lavagens, soro humano fresco preparado foi adicionado. A Citotoxicidade Dependente do Complemento (CDC) foi medida usando um ensaio de libertação da LDH.
4. TERMINOLOGIA
Os termos "interferão alfa", "IFNa", "IFNa", "IFNA" e "IFN alfa" são usados intercambiavelmente e pretendem referir-se a proteínas IFN alfa codificadas por um gene funcional do lócus genético de interferão alfa com uma identidade de sequência igual ou superior a 75% relativamente a IFN alfa 1 (Número de acesso da GenBank NP 076918 ou proteína codificada pelo número de acesso da GenBank NM_024013). Exemplos de subtipos de IFN alfa incluem IFN alfa 1, alfa 2a, alfa 2b, alfa 4, alfa 4b alfa 5, alfa 6, alfa 7, alfa 8, alfa 10, alfa 13, alfa 14, alfa 16, alfa 17 e alfa 21. Os termos "interferão alfa", "IFNa", e "IFN alfa" pretendem englobar formas recombinantes de vários subtipos de IFN alfa, assim como preparações de ocorrência natural que compreendem proteínas IFN alfa, tais como IFN de leucócitos e IFN de linfoblastos.
Os termos "recetor-1 do interferão alfa", "IFNAR1" "IFNAR-1," e "antigénio IFNARl" são usados intercambiavelmente, e incluem variantes, isoformas, espécies homólogas ao IFNARl humano, e análogos possuindo pelo menos um epítopo comum com IFNARl. Concordantemente, anticorpos humanos aqui descritos podem reagir cruzadamente com IFNARl de espécies diferentes da humana, ou outras proteínas que são estruturalmente relacionadas com IFNARl humano (p.ex., homólogos de IFNARl humano). Alternativamente, os anticorpos podem ser completamente específicos para IFNARl humano e não exibirem espécies ou outros tipos de reatividade cruzada. A sequência completa de cDNA de IFNARl humano apresenta o número de acesso da GenBank NM_000629.
Como aqui usado, o termo "modificações em sequências conservadas" pretende incluir modificações aminoacídicas que não afetam ou alteram as características de ligação do anticorpo contendo a sequência aminoacídica. Tais modificações conservadas incluem substituições, adições e deleções aminoacídicas. As modificações podem ser introduzidas num anticorpo aqui descrito por técnicas estandardizadas que fazem parte do conhecimento do estado da técnica, tais como mutagénese direcionada e mutagénese mediada por PCR. Substituições aminoacídicas conservadas são aquelas em que o resíduo aminoacídico é substituído por um resíduo aminoacídico possuindo uma cadeia lateral semelhante. Por exemplo, um ou mais aminoácidos de uma polaridade semelhantes atuam como equivalentes funcionais e resultam numa alteração silenciosa na sequência aminoacídica do péptido. Substituições que são neutrais a nível de carga e que substituem um resíduo por um resíduo de menores dimensões podem também ser consideradas "substituições conservadas" mesmo se os resíduos se encontrarem em diferentes grupos (p.ex., substituição de fenilalanina com isoleucina de menores dimensões). Famílias de resíduos aminoacídicos possuindo cadeias laterais similares foram definidas no estado da técnica. Vários exemplos não-limitantes de famílias de substituições aminoacídicas conservadas estão representados na Tabela 1.
Tabela 1: Famílias de substituições aminoacídicas conservadas.
5. DESCRIÇÃO DETALHADA
Em contraste com ensinamentos anteriores, os inventores descobriram que anticorpos anti-IFNARl com função executora reduzida ou eliminada são desejados para o tratamento de doenças inflamatórias e/ou autoimunes crónicas. Previamente, anticorpos dirigidos contra IFNAR1 foram desenvolvidos com o conhecimento de que a função executora iria desempenhar um papel na mediação do tratamento ou pelo menos na moderação de um estado de doença inflamatória e/ou autoimune crónica (ver, por exemplo publicação U.S. No. 20060029601 ou publicação PCT No. W006002177). Dentro deste conceito, muitos dos ensinamentos anteriores conduziram o artesão à identificação de anticorpos anti-IFNARl com forte função executora e adicionalmente a potenciação da função executora através do aumento da afinidade do anticorpo para recetores Fc (p.ex., FcRn, FcYRIIIa, FcyRIIb) e/ou a proteína do complemento Clq. Pensa-se que estes anticorpos anti-IFNARl resultantes com função executora aumentada são vantajosos no tratamento de estados de doença.
Em contraste com este conhecimento prévio, a presente invenção descreve anticorpos anti-IFNARl com função executora reduzida ou eliminada (tais como ADCC e/ou CDC). Através de estudos de reatividade cruzada com tecidos, foi surpreendentemente descoberto que anticorpos anti-IFNARl com função executora forte ou aumentada apresentavam uma propensão para toxicidade indesejada como verificado pela prevalência de marcação de anti-IFNARl em tecidos não-direcionados. Esta toxicidade resultaria da ativação inespecífica de ADCC e/ou CDC em locais inapropriados. Para reduzir ou eliminar esta toxicidade indesejada, os inventores reconheceram a necessidade para reduzir a função executora de polipéptidos compreendendo uma região Fc. A invenção fornece anticorpos monoclonais da classe IgG modificados que são específicos para IFNAR1, onde o referido anticorpo compreende na região Fc uma substituição aminoacídica de L234F, como numerado pelo índice EU classificado por Rabat e onde o referido anticorpo exibe uma afinidade reduzida para pelo menos um ligando Fc comparativamente com anticorpos não-modifiçados.
Preferencialmente, o referido anticorpo é um anticorpo da subclasse IgGl ou IgG4.
Um anticorpo aqui descrito pode adicionalmente compreender uma substituição aminoacidica de L235E e/ou P331S.
Um anticorpo aqui descrito pode compreender: a. uma região CDR1 variável da cadeia pesada humana compreendendo a Seq ID N°: 1, b. uma região CDR2 variável da cadeia pesada humana compreendendo a Seq ID N°: 2; c. uma região CDR3 variável da cadeia pesada humana compreendendo a Seq ID N°: 3; d. uma região CDR1 variável da cadeia leve humana compreendendo a Seq ID N°: 4; e. uma região CDR2 variável da cadeia leve humana compreendendo a Seq ID N°: 5; e f. uma região CDR3 variável da cadeia leve humana compreendendo a Seq ID N°: 6.
Um anticorpo aqui descrito pode compreender: a. uma região CDR1 variável da cadeia pesada humana compreendendo a Seq ID N°: 21; b. uma região CDR2 variável da cadeia pesada humana compreendendo a Seq ID N°: 22; c. uma região CDR3 variável da cadeia pesada humana compreendendo a Seq ID N°: 23; d. uma região CDR1 variável da cadeia leve humana compreendendo a Seq ID N°: 24; e. uma região CDR2 variável da cadeia leve humana compreendendo a Seq ID N°: 25; e f. uma região CDR3 variável da cadeia leve humana compreendendo a Seq ID N°: 26.
Um anticorpo aqui descrito pode compreender: a. uma região variável da cadeia pesada humana compreendendo a sequência aminoacidica da Seq ID N°: 38; e b. uma região variável da cadeia leve humana compreendendo a sequência aminoacidica da Seq N°: 40.
Um anticorpo aqui descrito pode compreender: a. uma região variável da cadeia pesada humana compreendendo a sequência aminoacidica da Seq ID N°: 18; e b. uma região variável da cadeia leve humana compreendendo a sequência aminoacidica da Seq ID N°: 20.
Um anticorpo aqui descrito pode compreender: a. uma região variável da cadeia pesada humana compreendendo a sequência aminoacidica da Seq ID N°: 28; e b. uma região variável da cadeia leve humana compreendendo a sequência aminoacidica da Seq ID N°: 30.
Um anticorpo aqui descrito pode compreender a sequência da região constante da cadeia leve da Seq ID N°: 41.
Um anticorpo aqui descrito pode compreender a sequência da região constante da cadeia pesada da Seq ID N°: 42.
Um anticorpo aqui descrito pode compreender a região constante da cadeia leve possuindo a sequência aminoacidica da Seq ID N°: 41 e a região constante da cadeia pesada possuindo a sequência aminoacidica da Seq ID N°: 42.
Um anticorpo aqui descrito pode compreender uma sequência aminoacidica da cadeia pesada compreendendo variação alélica, onde a referida variação alélica se encontra em pelo menos uma ou mais posições do grupo consistindo de 214, 221, 356 e 358 como definido pelo sistema de numeração do indice EU. A invenção adicionalmente fornece um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência polinucleotídica codificando o anticorpo de qualquer uma das reivindicações anteriores. A invenção ainda fornece adicionalmente uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo aqui descrito, e um excipiente farmaceuticamente aceitável. A invenção também fornece uma composição farmacêutica aqui descrita para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio selecionado de doença de Grave, tiroidite de Hashimoto, doença de Crohn, psoriase, artrite psoriática, oftalmia simpática, ovarite autoimune, orquite autoimune, sindrome linfoproliferativa autoimune, sindrome dos anticorpos antifosfolipidicos, sindrome de Sjogren, esclerodermia, doença de Addison, poliendocrinopatia autoimune, sindrome de Guillain-Barre, púrpura trombocitopénica idiopática, anemia perniciosa, miastenia grave, cirrose biliar primária, doença mista do tecido conjuntivo, vitiligo, uveite autoimune, anemia hemolitica autoimune, trombocitopenia autoimune, doença celíaca, dermatite herpetiforme, hepatite autoimune, penfigo, penfigo vulgar, penfigo foliáceo, penfigóide bulhoso, miocardite autoimune, vasculite autoimune, alopecia areata, aterosclerose autoimune, doença de Behçet, mielopatia autoimune, hemofilia autoimune, cistite intersticial autoimune, diabetes insipidus autoimune, endometriose autoimune, policondrite recidivante, espondilite anquilosante, urticária autoimune, dermatomiosite, sindrome de Miller-Fisher, nefropatia IgA, sindrome de Goodpasture, e penfigóide gestacional.
Concordantemente, descrevemos anticorpos modificados ou outros polipéptidos compreendendo a região Fc de um anticorpo, compreendendo a adição, substituição, ou deleção de pelo menos um residuo aminoacídico para uma região Fc resultando em afinidade reduzida ou eliminada para pelo menos um ligando Fc (daqui em diante referidos como "anticorpos modificados"). A região Fc interage com um número de ligandos incluindo, mas não estando limitados a, recetores Fc (p.ex., FcRn, FcyRIIIa, FcyRIIb), a proteína do complemento Clq, e outras moléculas, tais como proteínas A e G. Estas interações são essenciais para uma variedade de funções executoras e eventos de sinalização a jusante incluindo, mas não estando limitados a, citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) e citotoxicidade dependente do complemento (CDC). Os anticorpos aqui descritos podem apresentar afinidade reduzida ou eliminada para um ligando Fc responsável por facilitar a função executora comparativamente com um anticorpo possuindo a mesma sequência aminoacídica mas não compreendendo a adição, substituição, ou deleção de pelo menos um resíduo aminoacídico para uma região Fc (daqui em diante também referidos como um "anticorpo não-modifiçado"). Anticorpos aqui descritos podem compreender pelo menos uma ou mais das seguintes propriedades: função executora reduzida ou eliminada (ADCC e/ou CDC), ligação reduzida ou eliminada a recetores Fc, ou toxicidades reduzidas ou eliminadas. Mais especificamente, descrevemos anticorpos anti-IFNARl com afinidade reduzida para recetores Fc (p.ex., FcRn, FcyRIIIa, FcyRIIb) e/ou a proteína do complemento Clq.
Anticorpos aqui descritos podem compreender uma região Fc compreendendo pelo menos uma adição, substituição, ou deleção de um resíduo aminoacídico selecionado das posições consistindo de: 234, 235, e 331, onde o sistema de numeração da região constante é o mesmo que o índice EU estabelecido em Rabat et al. (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, V A) . Anticorpos aqui descritos podem compreender uma região Fc compreendendo pelo menos uma substituição aminoacídica selecionada do grupo consistindo de: L234F, L235E, e P331S, onde a primeira letra e número representam o aminoácido não-modifiçado e a sua posição e a segunda letra representa o aminoácido substituído na preferida posição.
Anticorpos aqui descritos podem adicionalmente compreender uma região Fc compreendendo pelo menos uma adição, substituição, ou deleção de um residuo aminoacidico que se encontra correlacionado com uma estabilidade aumentada do anticorpo. A adição, substituição, ou deleção de um residuo aminoacidico pode ser na posição 228 da região Fc, onde o sistema de numeração da região constante é o mesmo que o indice EU estabelecido em Rabat et al. Anticorpos aqui descritos podem compreender uma região Fc compreendendo uma substituição aminoacídica na posição 228, onde a substituição é um resíduo de serina. Anticorpos do subtipo IgG4 podem compreender uma substituição aminoacídica de serina na posição 228 de uma região Fc. Anticorpos aqui descritos podem já compreender um resíduo de serina 228 de uma região Fc; nesses anticorpos, nenhuma modificação é requerida. Alternativamente, anticorpos aqui descritos podem não requerer modificação do resíduo 228 de uma região Fc ou podem já compreender serina na referida posição.
Anticorpos aqui descritos podem ser de qualquer classe (por exemplo, mas não estando limitados a IgG, IgM, e IgE) . Anticorpos aqui descritos são membros da classe IgG de anticorpos. Numa forma de realização específica, os anticorpos aqui descritos são da subclasse IgG 1. Noutra forma de realização específica, os anticorpos aqui descritos são da subclasse IgG 1 e compreendem as seguintes substituições aminoacídicas: 234F, 235E e 331S de uma região Fc. Em formas de realização alternativas, os anticorpos aqui descritos são da subclasse IgG4. Anticorpos aqui descritos da subclasse IgG4 podem compreender as seguintes substituições aminoacidicas: S228P e L235E de uma região Fc.
Anticorpos modificados podem ser produzidos através da combinação de um dominio variável, ou fragmento relacionado, com um dominio Fc compreendendo uma ou mais substituições aminoacidicas aqui divulgadas. Anticorpos modificados podem ser produzidos através da modificação de um dominio Fc contendo anticorpos através da introdução de um ou mais residuos de substituição aminoacidica no dominio Fc. 5.1 Ligação diminuída aos ligandos Fc
Qualquer pessoa habilitada no estado da técnica entenderá que anticorpos aqui descritos podem apresentar propriedades de ligação a FcyR e/ou Clq alteradas (relativamente a um anticorpo não-modifiçado) (exemplos de propriedades de ligação incluem mas não estão limitadas a, especificidade de ligação, constante de equilíbrio de dissociação (KD) , taxas de associação e dissociação (Kon e K0ff, respetivamente), afinidade e/ou avidez de ligação) e que certas alterações são mais ou menos desejáveis. É conhecido no estado da técnica que a constante de equilíbrio de dissociação (KD) é definida como K0ff/K0n. Qualquer pessoa habilitada no estado da técnica pode determinar qual parâmetro cinético é mais importante para uma dada aplicação de anticorpos. Por exemplo, uma modificação que reduz a ligação a um ou mais reguladores positivos (p.ex., FcyRIIIA) e/ou ligação aumentada a um recetor Fc inibidor (p.ex., FcyRIIB) seria adequada para a redução da atividade de ADCC. Concordantemente, o rácio das afinidades de ligação (p.ex., constantes de equilíbrio de dissociação (KD) ) pode indicar se a atividade ADCC de um anticorpo é aumentada ou diminuída. Adicionalmente, uma modificação que reduz a ligação a Clq seria desejável para reduzir ou eliminar a atividade CDC.
As afinidades e propriedades de ligação de uma região Fc para o seu ligando, podem ser determinadas por uma variedade de ensaios in vitro (ensaios bioquímicos ou imunológicos) conhecidos no estado da técnica para a determinação das interações Fc-FcyR, i.e., ligação específica de uma região Fc a um FcyR incluindo mas não estando limitados a, métodos de equilíbrio (p.ex., ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) ou radioimunoensaio (RIA)), ou cinética (p.ex., análise BIACORE0), e outros métodos tais como ensaios de ligação indireta, ensaios de inibição competitiva, transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), eletroforese em gel e cromatografia (p.ex., filtração em gel). Estes e outros métodos podem utilizar uma marcação em um ou mais dos componentes a serem examinados e/ou empregam uma variedade de métodos de deteção incluindo mas não estando limitados a, marcações cromogénicas, fluorescentes, luminescentes, ou isotópicas. Uma descrição detalhada das afinidades e cinéticas de ligação pode ser encontrada em Paul, W.E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999).
Anticorpos aqui descritos podem exibir afinidade de ligação reduzida para um ou mais recetores incluindo, mas não estando limitados a FcyRI (CD64) incluindo as isoformas FcyRIA, FcyRIE, e FcyRIC; FcyRII (CD32 incluindo as isoformas FcyRIIA, FcyRIIB, e FcyRIIC); e FcyRIII (CD16, incluindo as isoformas FcyRIIIA e FcyRIIB) comparativamente com um anticorpo não-modifiçado. Anticorpos aqui descritos podem não compreender um aumento concomitante na ligação do recetor FcyRIIB comparativamente com um anticorpo não-modificado (por exemplo, contendo uma região Fc wildtype)
Anticorpos aqui descritos podem exibir afinidades diminuídas de FcyRI relativamente a um anticorpo não-modif içado. Anticorpos aqui descritos podem exibir afinidades para o recetor FcyRI que são pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 7 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 20 vezes, ou pelo menos 30 vezes, ou pelo menos 40 vezes, ou pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 60 vezes, ou pelo menos 70 vezes, ou pelo menos 80 vezes, ou pelo menos 90 vezes, ou pelo menos 100 vezes, ou pelo menos 200 vezes inferiores às de um anticorpo não-modifiçado.
Anticorpos aqui descritos podem exibir uma afinidade para o recetor FcyRI que é pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, pelo menos 50%, pelo menos 40%, pelo menos 30%, pelo menos 20%, pelo menos 10%, ou pelo menos 5% inferior à de um anticorpo não-modifiçado.
Anticorpos aqui descritos podem apresentar uma afinidade diminuída para o recetor FcyRIIIA relativamente a um anticorpo não-modifiçado. Anticorpos aqui descritos podem exibir afinidades para o recetor FcyRIIIA que são pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 7 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 20 vezes, ou pelo menos 30 vezes, ou pelo menos 40 vezes, ou pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 60 vezes, ou pelo menos 70 vezes, ou pelo menos 80 vezes, ou pelo menos 90 vezes, ou pelo menos 100 vezes, ou pelo menos 200 vezes inferiores às de um anticorpo não-modifiçado.
Anticorpos aqui descritos podem exibir afinidades para o recetor FcyRIIIA que são pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, pelo menos 50%, pelo menos 40%, pelo menos 30%, pelo menos 20%, pelo menos 10%, ou pelo menos 5% inferior à de um anticorpo não-modifiçado. É entendido no estado da técnica que a variante alélica F158V do recetor FcyRIIIA apresenta características de ligação alteradas aos anticorpos. Anticorpos aqui descritos podem ligar-se com afinidade diminuídas a FcyRIIIA (F158V) relativamente a um anticorpo não-modifiçado. Anticorpos aqui descritos podem exibir afinidades para o recetor FcyRIIIA (F158V) que são pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 7 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 20 vezes, ou pelo menos 30 vezes, ou pelo menos 40 vezes, ou pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 60 vezes, ou pelo menos 70 vezes, ou pelo menos 80 vezes, ou pelo menos 90 vezes, ou pelo menos 100 vezes, ou pelo menos 200 vezes inferiores às apresentadas por um anticorpo não-modifiçado. Anticorpos aqui descritos podem exibir afinidades para o recetor FcyRIIIA(F158V) que são pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, pelo menos 50%, pelo menos 40%, pelo menos 30%, pelo menos 20%, pelo menos 10%, ou pelo menos 5% inferior à de um anticorpo não-modifiçado.
Anticorpos aqui descritos podem exibir afinidades aumentadas para o recetor FcyRIIB comparativamente com o anticorpo não-modifiçado. Anticorpos aqui descritos podem exibir afinidades para o recetor FcyRIIB que são inalteradas ou aumentadas em pelo menos pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 7 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 20 vezes, ou pelo menos 30 vezes, ou pelo menos 40 vezes, ou pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 60 vezes, ou pelo menos 70 vezes, ou pelo menos 80 vezes, ou pelo menos 90 vezes, ou pelo menos 100 vezes, ou pelo menos 200 vezes às apresentadas por um anticorpo não-modifiçado. Anticorpos aqui descritos podem exibir afinidades para o recetor FcyRIIB que são aumentadas em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% que as apresentadas por um anticorpo não-modif içado .
Anticorpos aqui descritos podem exibir afinidades para os recetores FcyRI, FcyRIIIA, ou FcyRIIIA (F158V) que se encontram entre cerca de 100 nM até cerca de 100 μΜ, ou desde cerca de 100 nM até cerca de 10 μΜ, ou desde cerca de 100 nM até cerca de 1 μΜ, ou desde cerca de 1 nM até cerca de 100 μΜ, ou desde cerca de cerca de 10 nM até cerca de 100 μΜ, ou desde cerca de 1 μΜ até cerca de 100 μΜ, ou desde cerca de 10 μΜ até cerca de 100 μΜ. Anticorpos aqui descritos podem exibir afinidades para os recetores FcyRI, FcyRIIIA, ou FcyRIIIA (F158V) que são maiores do que 1 μΜ, maiores do que 5 μΜ, maiores do que 10 μΜ, maiores do que 25 μΜ, maiores do que 50 μΜ, ou maiores do que 100 μΜ.
Anticorpos aqui descritos podem exibir afinidades para o recetor FcyRIIB que se encontram entre cerca de 100 nM até cerca de 100 μΜ, ou desde cerca de 100 nM até cerca de 10 μΜ, ou desde cerca de 100 nM até cerca de 1 μΜ, ou desde cerca de 1 nM até cerca de 100 μΜ, ou desde cerca de 10 nM até cerca de 100 μΜ, ou desde cerca de 1 μΜ até cerca de 100 μΜ, ou desde cerca de 10 μΜ até cerca de 100 μΜ. Anticorpos aqui descritos podem exibir afinidades para os recetores FcyRI, FcyRIIIA, ou FcyRIIIA (F158V) que são menores do que 100 μΜ, menores do que 50 μΜ, menores do que 10 μΜ, menores do que 5 μΜ, menores do que 2,5 μΜ, menores do que 1 μΜ, ou menores do que 100 nM, ou menores do que 10 nM.
Anticorpos aqui descritos podem exibir afinidades para o recetor FcyRIIB que se encontram entre cerca de 100 nM até cerca de 100 μΜ, ou desde cerca de 100 nM até cerca de 10 μΜ, ou desde cerca de 100 nM até cerca de 1 μΜ, ou desde cerca de 1 nM até cerca de 100 μΜ, ou desde cerca de 10 nM até cerca de 100 μΜ, ou desde cerca de 1 μΜ até cerca de 100 μΜ, ou desde cerca de 10 μΜ até cerca de 100 μΜ. Anticorpos aqui descritos podem exibir afinidades para os recetores FcyRI, FcyRIIIA, ou FcyRIIIA (F158V) que são menores do que 100 μΜ, menores do que 50 μΜ, menores do que 10 μΜ, menores do que 5 μΜ, menores do que 2,5 μΜ, menores do que 1 μΜ, ou menores do que 100 nM, ou menores do que 10 nM. 5.2 Atividade de ADCC reduzida É bem conhecido noe stado da técnica que os anticorpos são capazes de direcionar o ataque e a destruição do antigénio-alvo através de múltiplos processos coletivamente conhecidos no estado da técnica como funções executoras do anticorpo. Um desses processos, conhecido como "citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos" ou "ADCC" refere-se a uma forma de citotoxicidade em que a Ig segregada se iga aos recetores Fc (FcRs) presentes em certas células citotóxicas (p.ex., células Natural Killer (NK), neutrófilos, e macrófagos) permitindo a estas células executoras citotóxicas que se liguem especificamente a um alvo celular contendo o antigénio e subsequentemente eliminando a célula-alvo com citotoxinas. Anticorpos IgG específicos de elevada afinidade direcionados à superfície de células T-alvo "municiam" as células citotóxicas e são requeridos para essa eliminação. A lise da célula-alvo é extracelular, requerendo contacto direto célula-célula, e não envolve o complemento. Outro processo englobado pelo termo "função executora" é a citotoxicidade dependente do complemento (daqui em diante referida como "CDC") que se refere a um evento bioquímico da destruição de células-alvo mediada por anticorpos por ação do sistema do complemento. 0 sistema do complemento é um sistema complexo de proteínas encontradas no plasma sanguíneo normal que se combina com anticorpos para destruir bactérias patogênicas e outras células estranhas. A capacidade de um anticorpo particular para mediar a lise da célula-alvo por ADCC pode ser analisada. Para determinar a atividade ADCC num anticorpo de interesse é adicionado a células T-alvo em combinação com células executoras imunológicas, que podem ser atividades pelos complexos anticorpo/antigénio resultando na citólise da célula-alvo. A citólise é geralmente detetada através da libertação do marcado (p.ex., substratos radioativos, marcadores fluorescentes ou proteínas intracelulares naturais) das células lisadas. Células executoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células Natural Killer (NK) . Exemplos específicos de ensaios ADCC in vitro são descritos em Wisecarver et al. , 198579:277-282; Bruggemann et ai., 1987, J Exp Med 166:1351-1361; Wilkinson et al. , 2001, J Immunol Methods 258:183-191; Patel et al. , 1995 J Immunol Methods 184:29-38. Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade ADCC de um anticorpo de interesse pode ser determinada in vivo, p.ex., num modelo animais tal como os divulgados em Clynes et al., 1998, PNAS USA 95:652-656.
Entende-se que anticorpos aqui descritos são caracterizados por ensaios funcionais in vitro para a determinação de uma ou mais funções de células executoras mediadas por FcyR. Anticorpos aqui descritos podem apresentar propriedades de liqação smilares e funções de células executoras em modelos in vivo (tais como aqueles aqui descritos e aqui divulqados) à semelhança do que acontece em ensaios in vitro. Contudo, anticorpos aqui descritos que não exibem o fenótipo desejado em ensaios in vitro podem exibir o fenótipo desejado in vivo.
Anticorpos aqui descritos podem exibir atividades ADCC diminuídas comparativamente com um anticorpo não-modifiçado. Anticorpos aqui descritos podem exibir atividades ADCC que são pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 100 vezes inferiores às apresentadas por um anticorpo não-modifiçado. Ainda numa outra forma de realização, anticorpos aqui descritos podem exibir atividades ADCC que são reduzidas em pelo menos 10%, ou em pelo menos 20%, ou em pelo menos 30%, ou em pelo menos 40%, ou em pelo menos 50%, ou em pelo menos 60%, ou em pelo menos 70%, ou em pelo menos 80%, ou em pelo menos 90%, ou em pelo menos 100%, ou em pelo menos 200%, ou em pelo menos 300%, ou em pelo menos 400%, ou em pelo menos 500% relativamente a um anticorpo não-modifiçado. Anticorpos aqui descritos podem não apresentar qualquer atividade ADCC detetável. Em formas de realização específicas, a redução e/ou a ablação da atividade ADCC pode ser atribuída a uma afinidade reduzida que os anticorpos aqui descritos podem exibir para os ligandos e/ou recetores Fc. 5.3 Atividade CDC reduzida A via de ativação do complemento é iniciada através da ligação do primeiro componente do sistema do complemento (Clq) a uma molécula, um anticorpo por exemplo, complecado com um antigénio cognato. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio CDC, p.ex., como descrito em Gazzano-Santoro et al., 1996,1. Immunol. Methods, 202:163, pode ser realizado.
Anticorpos aqui descritos podem exibir afinidades diminuídas a Clq relativamente a um anticorpo não-modifiçado. Anticorpos aqui descritos podem exibir afinidades para o recetor Clq que são pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 7 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 20 vezes, ou pelo menos 30 vezes, ou pelo menos 40 vezes, ou pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 60 vezes, ou pelo menos 70 vezes, ou pelo menos 80 vezes, ou pelo menos 90 vezes, ou pelo menos 100 vezes, ou pelo menos 200 vezes inferiores às de um anticorpo não-modifiçado.
Anticorpos aqui descritos podem exibir afinidades para o Clq que são pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, pelo menos 50%, pelo menos 40%, pelo menos 30%, pelo menos 20%, pelo menos 10%, ou pelo menos 5% inferiores às de um anticorpo não-modifiçado.
Anticorpos aqui descritos podem exibir afinidades para o Clq que se encontram entre cerca de 100 nM até cerca de 100 μΜ, ou desde cerca de 100 nM até cerca de 10 μΜ, ou desde cerca de 100 nM até cerca de 1 μΜ, ou desde cerca de 1 nM até cerca de 100 μΜ, ou desde cerca de 10 nM até cerca de 100 μΜ, ou desde cerca de 1 μΜ até cerca de 100 μΜ, ou desde cerca de 10 μΜ até cerca de 100 μΜ. Anticorpos aqui descritos podem exibir afinidades para o Clq que são maiores do que 1 μΜ, maiores do que 5 μΜ, maiores do que 10 μΜ, maiores do que 25 μΜ, maiores do que 50 μΜ, ou maiores do que 100 μΜ.
Anticorpos aqui descritos podem exibir atividades CDC diminuídas comparativamente com um anticorpo não-modifiçado. Anticorpos aqui descritos podem exibir atividades CDC que são pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 100 vezes inferiores às apresentadas por um anticorpo não-modifiçado. Ainda numa outra forma de realização, anticorpos aqui descritos podem exibir atividades CDC que são reduzidas em pelo menos 10%, ou pelo menos 20%, ou em pelo menos 30%, ou em pelo menos 40%, ou em pelo menos 50%, ou em pelo menos 60%, ou em pelo menos 70%, ou em pelo menos 80%, ou em pelo menos 90%, ou em pelo menos 100%, ou em pelo menos 200%, ou em pelo menos 300%, ou em pelo menos 400%, ou em pelo menos 500% relativamente a um anticorpo não-modifiçado. Anticorpos aqui descritos podem exibir nenhuma atividade CDC detetável. Em formas de realização específicas, a redução e/ou a ablação da atividade CDC pode ser atribuída aos anticorpos aqui descritos que exibem afinidade reduzida para liqandos e/ou recetores Fc. 5.4 Toxicidade relacionada com anticorpos reduzida É entendido no estado da técnica que terapias biológicas podem apresentar problemas de toxicidade adversa associados com a natureza complexa de induzir o sistema imunológico a reconhecer e atacar células e/ou alvos indesejados. Quando o reconhecimento e/ou direcionamento para o ataque não tem lugar quando o tratamento é requerido, consequências tais como toxicidade adversa podem ocorrer. Por exemplo, a marcação de anticorpos em tecidos não-direcionados pode ser indicativa de potenciais problemas de toxicidade.
Anticorpos aqui descritos podem exibir marcação reduzida em tecidos não-direcionados comparativamente com um anticorpo não-modifiçado. Anticorpos aqui descritos podem exibir marcações reduzidas em tecidos não-direcionados que são pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 7 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 20 vezes, ou pelo menos 30 vezes, ou pelo menos 40 vezes, ou pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 60 vezes, ou pelo menos 70 vezes, ou pelo menos 80 vezes, ou pelo menos 90 vezes, ou pelo menos 100 vezes, ou pelo menos 200 vezes inferiores às apresentadas por um anticorpo não-modif içado. Anticorpos aqui descritos podem exibir marcações reduzidas em tecidos não-direcionados que são reduzidas em pelo menos 10%, ou em pelo menos 20%, ou em pelo menos 30%, ou em pelo menos 40%, ou em pelo menos 50%, ou em pelo menos 60-5, ou em pelo menos 70%, ou em pelo menos 80%, ou em pelo menos 90%, ou em pelo menos 100%, ou em pelo menos 200-s, ou em pelo menos 300%, ou em pelo menos 400%, ou em pelo menos 500% relativamente a um anticorpo não-modifiçado.
Anticorpos aqui descritos podem exibir uma toxicidade lecionada com anticorpos reduzida comparativamente com um anticorpo não-modifiçado. Anticorpos aqui descritos podem exibir toxicidades que são pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 7 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 20 vezes, ou menos 30 vezes, ou pelo menos 40 vezes, ou pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 60 vezes, ou pelo menos 70 vezes, ou pelo menos 80 vezes, ou pelo menos 90 vezes, ou pelo menos 100 vezes, ou pelo menos 200 vezes inferiores às apresentadas por um anticorpo não-modifiçado. Anticorpos aqui descritos podem exibir toxicidades que são reduzidas em pelo menos 10%, ou em pelo menos 20%, ou em pelo menos 30%, ou em pelo menos 40%, ou em pelo menos 50%, ou em pelo menos 60%, ou em pelo menos 70%, ou em pelo menos 80%, ou em pelo menos 90%, ou em pelo menos 100%, ou em pelo menos 200%, ou em pelo menos 300%, ou em pelo menos 400%, ou em pelo menos 500% relativamente a um anticorpo não-modif içado . 5.5 Anticorpos internalizados
Anticorpos aqui descritos podem ligar-se a antigénios da superfície celular que podem internalizar, adicionalmente transportar os anticorpos para a célula. Uma vez no interior da célula, os anticorpos podem ser libertados no citoplasma, sendo direcionados a um compartimento especifico, ou reciclados na superfície celular. Anticorpos aqui descritos podem ser reciclados na superfície celular ou periferia após internalização. Numa forma de realização específica, o anticorpo aqui descrito é especifico para IFNAR1. A internalização de anticorpos pode ser medida por técnicas aceites no estado da técnica atual tais como aqueles apresentados no Exemplo 34. A extensão da internalização pode ser representada como a percentagem de anticorpo total ligado às células. A extensão da internalização de anticorpo pode ser representada como uma comparação relativamente a um anticorpo de controlo não-específico. A extensão da internalização do anticorpo pode ser representada em comparação com um anticorpo que se liga a um antigénio da superfície celular que não é internalizado. A extensão da internalização do anticorpo pode ser correlacionada com a degradação do anticorpo. A extensão da internalização do anticorpo pode ser representada como o rácio de marcação citoplasmática versus marcação da superfície extracelular.
Os anticorpos aqui descritos uma vez ligados, podem ser internalizados pelas células onde a internalização é de pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 100%, pelo menos cerca de 110%, pelo menos cerca de 130%, pelo menos cerca de 140%, pelo menos cerca de 150%, pelo menos cerca de 160%, ou pelo menos cerca de 170% superior à do anticorpo de controlo inespecifico.
Os anticorpos aqui descritos uma vez ligados, podem ser internalizados pelas células onde a internalização é 1-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-100%, 100-110%, 110-120%, 120-130%, 130-140%, 140-150%, 150-160%, 160- 170% superior à do anticorpo de controlo inespecifico.
Os anticorpos aqui descritos uma vez ligados, podem ser internalizados pelas células onde a internalização é 1-10%, 10-20%, 20-30%,30-40%,40-50%,50-60%,60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-100%,100-110%, 110-120%, 120-130%, 130-140%, 140-150%, 150-160%, 160- 170% superior à dos anticorpos de controlo como determinados pelo ensaio de internalização usando um anticorpo secundário. 5.6 Estrutura tridimensional de uma região Fc humana
Aqui descrevemos formas cristalinas de uma região Fc IgG humana, onde a região Fc humana, designada como Fc-TM, compreende substituições aminoacidicas de L234F, L235E e P331S como numeradas pelo indice EU como estabelecido em Rabat e exibe funções executoras reduzidas ou eliminadas (ADCC e/ou CDC), ligação reduzida ou eliminada a recetores Fc, e/ou toxicidade reduzida ou eliminada. Os cristais podem ser caracterizados por um grupo espacial ortorrômbico C2221 com dimensões de célula unitária de a=50,18, b=147,30 e c=75,47. Em certas formas de realização, os cristais apresentam qualidade de difração para permitir a determinação da estrutura tridimensional de raios-X dos polipéptidos cristalinos até a uma elevada resolução, preferencialmente uma resolução superior a cerca de 3 A, tipicamente na gama compreendida entre cerca de 2 A até cerca de 3 A.
Descrevemos as estruturas tridimensionais de alta resolução e as coordenadas de estrutura atómica dos cristais Fc-TM. Os métodos específicos usados para obter os cristais e as coordenadas das estruturas são fornecidos nos exemplos, infra.
As coordenadas da estrutura atómica da Fc-TM cristalina, obtidas a partir da forma C2221 do cristal a uma resolução de 2,3 Â, encontram-se listadas na Tabela 6. Todos os resíduos nas posições 236 a 445 poderiam ser rastreados na densidade de eletrões e nenhuma densidade de eletrões foi detetada para resíduos de charneira antes da posição 236, incluindo as mutações L234F e L235E. A densidade de eletrões na posição 331 correspondia à serina. A estrutura tridimensional global de Fc-TM revelou-se bastante similar às estruturas previamente reportadas de regiões Fc humanas não contendo ligandos (Deisenhofer, (1981). Biochemistry, 20, 2361-2370; Krapp et al., (2003). J. Mol. Biol. 325, 979-989; Matsumiya et al. , (2007). J. Mol. Biol. 368, 767-779; Oganesyan et al., (2007) Molecular Immunology, 11 de Dezembro, 2007, in press). Quando considerados individualmente, os dominios Fc-TM CH2 e CH3 apresentaram um elevado grau de conservação estrutural e rigidez comparativamente com outros dominios não contendo ligandos, de estruturas Fc humanas não-mutadas. A informação estrutural pode ser usada numa variedade de métodos de computação e de programação para rastrear, desenvolver ou identificar anticorpos anti-IFNAR que apresentam propriedades biológicas alteradas. Por exemplo, os cristais e coordenadas de estrutura dai obtidos podem ser usados para rastrear, desenvolver ou identificar adições, substituições ou deleções aminoacídicas na região Fc que resultam em ligação reduzida ou eliminada a recetores Fc, função executora reduzida ou eliminada (ADCC e/ou CDC), ou toxicidade reduzida ou eliminada.
Uma vez tendo sudo desenvolvido ou selecionado o anticorpo pelos métodos acima descritos, a sua função executora, ligação a recetores Fc, ou toxicidade podem ser testadas e otimizadas por quaisquer métodos fazendo parte do conhecimento daqueles habilitados no estado da técnica. Métodos exemplificativos são acima descritos nas secções 5.1-5.4.
Descrevemos aqui anticorpos anti-IFNARl que são desenvolvidos ou selecionados através do uso de uma informação estrutural de Fc-TM e que exibem as atividades biológicas desejadas. Tais anticorpos podem compreender uma região Fc com as mutações de L234F, L235E, e P331S. Tais anticorpos podem compreender uma região Fc com uma ou mais adição, substituição ou deleção de um residuo aminoacidico diferente dos resíduos aminoacídicos 234, 235, e 331. 5.7 Anticorpos anti-IFNARl
Anticorpos aqui descritos são específicos para (i.e., com ligação específica para) IFNAR1. Tais anticorpos podem também ser daqui em diante referidos como "anticorpos anti-IFNARl anticorpos aqui descritos". Anticorpos aqui descritos são específicos para IFNAR1 humano. Os anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem reagir cruzadamente com IFNAR1 de outras espécies que não a humana, ou outras proteínas que são estruturalmente relacionadas com o IFNAR1 humano (por exemplo, homólogos do IFNAR1 humano). Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem ser específicos para IFNAR1 humano apenas e não exibir espécies ou outros tipos de reatividade cruzada.
Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem exibir afinidades de ligação reduzidas para Ligandos Fc e possuir pelo menos uma das seguintes propriedades: função executora reduzida ou eliminada (ADCC e/ou CDC), ligação reduzida ou eliminada a Ligandos Fc, ou toxicidade reduzida ou eliminada comparativamente com um anticorpo não-modifiçado.
Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem compreender a adição, substituição ou deleção de pelo menos um resíduo aminoacidico selecionado do grupo consistindo de: L234F, L235E, e P331S. Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem compreender as substituições aminoacídicas: L234F, L235E, e P331S de uma região Fc. Um anticorpo anti-IFNARl aqui descrito pode ser um anticorpo IgG isotipico.
Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem ser da subclasse IgG4. Anticorpos anti-IFNARl IgG4 aqui descritos podem compreender a substituição aminoacidica L235E de uma região Fc. Anticorpos anti-IFNARl IgG4 aqui descritos podem também compreender uma mudança aminoacidica que está correlacionada com estabilidade aumentada. Anticorpos anti-IFNARl IgG4 aqui descritos podem adicionalmente compreender a substituição aminoacidica S228P de uma região Fc.
Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem exibir afinidades de ligação reduzidas ou eliminadas para recetores Fc (por exemplo, mas não estando limitados a FcyRI (CD64), incluindo as isoformas FcyRIA, FcyRIB, e FcyRIC; FcyRII (CD32), incluindo as isoformas FcyRIIA, FcyRIIB, e FcyRIIC; e FcyRIII (CD16), incluindo as isoformas FcyRIIIA e FcyRIIB) comparativamente com um anticorpo não-modifiçado. Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem exibir afinidades diminuidas para FcyRI relativamente a um anticorpo não-modifiçado. Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem exibir afinidades diminuidas para o recetor FcyRIIIA relativamente a um anticorpo não-modifiçado. Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem ligar-se com afinidades diminuidas para o alelo F158V de FcyRIIIA relativamente a um anticorpo não-modif içado .
Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem exibir afinidades de ligação reduzidas ou eliminadas para Clq comparativamente com um anticorpo não-modifiçado. Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem exibir afinidades diminuídas para FcyRI relativamente a um anticorpo não-modifiçado.
Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem exibir função executora reduzida ou eliminada. Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem exibir atividade ADCC e/ou CDC reduzida ou eliminada. Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem exibir toxicidade reduzida ou eliminada. 5.7.1. Sequências do Anticorpo anti-IFNARl
Sequências aminoacídicas das regiões variáveis da cadeia pesada e/ou regiões variáveis da cadeia leve de anticorpos anti-IFNARl aqui descritos são fornecidas nas Figuras IA,
2A, 3A, 4A e Figuras 1B, 2B, 3B, 4B, respetivamente. A sequência polinucleotídica codificando as regiões variáveis da cadeia pesada e as regiões variáveis da cadeia leve dos anticorpos anti-IFNARl aqui descritos são fornecidas nas Figuras IA, 2A, 3A, 4A e Figuras 1B, 2B, 3B, 4B, respetivamente.
Sequências selecionadas dos anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem ser encontradas na Patente U.S. No. 5,919,453, Pedidos de Patente U.S. Nos: 10/831,459, 101182,058, 111157,494, e 11/521,102. Sequências de anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem não compreender as sequências encontradas na Patente U.S. No. 5,919,453, Pedidos de Patente U.S. Nos: 10/831,459, 101182,058, 111157,494, e 11/521,102.
Anticorpos aqui descritos são divulgados nos Pedidos provisórios de Patentes U.S. Nos. 60/842,925, publicado a 8 de setembro, 2006, 60/866,917; publicado a 22 de novembro, 2006; 60/911,397, publicado a 12 de abril, 2007; 60/915,309, publicado a 22 de maio, 2007; Pedido de Patente U.S. No. 11/852,106, publicado a 7 de setembro, 2007; e Pedido de Patente PCT No. US2007 107791, publicado a 7 de setembro, 2007.
Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos também incluem anticorpos que compreendem uma sequência aminoacidica de uma região variável de uma cadeia pesada e/ou uma região variável da cadeia leve que é pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência aminoacidica da região variável da cadeia pesada e/ou região variável da cadeia leve dos anticorpos 3F11, 11E2, 4G5, e 9D4 (ver Figuras 1-4 para as sequências).
Será entendido que os resíduos das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) se encontram numerados como estipulado em Rabat et al., (1991, Publicação NIH 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA) . Especificamente, resíduos 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) e 89-97 (CDR3) no domínio variável da cadeia leve e 31-35 (CDR1), 50-65 (CDR2) e 95-102 (CDR3) nos domínios variáveis da cadeia pesada. De notar que CDRs variam consideravelmente de anticorpo para anticorpo (e por definição não apresentarão homologia com as sequências-consenso de Rabat). Alinhamento máximo dos resíduos da sequência frequentemente requere a inserção de resíduos "espaçadores" no sistema de numeração para serem usados na região "Fv". Será entendido que os CDRs aqui referidos são os mesmos que aqueles indicados por Rabat et al. supra. Adicionalmente, a identidade de certos resíduos individuais a um dado número local de Rabat podem variar de cadeia de anticorpo para cadeia de anticorpo devido à divergência entre-espécies ou alélica.
Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem compreender pelo menos uma CDR VH possuindo uma sequência aminoacidica de qualquer uma das CDRs VH listadas na Tabela 2. Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem compreender pelo menos uma CDR VL having uma sequência aminoacidica de qualquer uma das CDRs VL listadas na Tabela 2. Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem compreender uma ou mais das CDRs VH e uma ou mais das CDRs VL listadas na Tabela 2. Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem compreender qualquer combinação das CDRs VH e CDRs VL listadas na Tabela 2. Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem compreender pelo menos 1, ou pelo menos 2, ou pelo menos 3, ou pelo menos 4, ou pelo menos 5, ou pelo menos 6 CDRs selecionadas da Tabela 2. Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem compreender um dominio VH e/ou um domínio VL cada um compreendendo 1,2 ou 3 CDRs. Os anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem compreender um VH adicionalmente compreendendo 1, 2, ou 3 CDRs da cadeia pesada (CDRH#) listadas na Tabela 2. Os anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem compreender um VL adicionalmente compreendendo 1, 2, ou 3 CDRs da cadeia leve (CDR1#) listadas na Tabela 2.
Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem compreender as CDRs do anticorpo 3F11 (ver por exemplo Tabela 2). Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem compreender as CDRs do anticorpo 4G5 (ver por exemplo Tabela 2) . Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem compreender as CDRs do anticorpo 11E2 (ver por exemplo Tabela 2). Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos compreendem as CDRs do anticorpo 9D4 (ver por exemplo Tabela 2).
Tabela 2. Sequências CDRs do Anticorpo anti-IFNARl
Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem compreender uma sequência aminoacidica de uma região variável de uma cadeia pesada e/ou uma região variável da cadeia leve que compreende pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, ou pelo menos 20 substituições, adições, ou delecções aminoacídicas comparativamente com a região variável das cadeias pesadas e/ou cadeias leves representadas nas Figuras 1, 2, 3, ou 4. Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem compreender uma ou mais CDRs com pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, ou pelo menos 10 substituições, delecções, ou adições aminoacidicas de uma ou mais CDRs listadas na Tabela 2.
Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem compreender anticorpos codificados por uma sequência polinucleotidica que híbrida às sequências nucleotídicas representadas nas Figuras 1, 2, 3, ou 4 sob condições rigorosas. Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem compreender uma ou mais CDRs codificadas por uma sequência nucleotídica que híbrida sob condições rigorosas à sequência nucleotídica de uma ou mais CDRs listadas nas Figuras 1, 2, 3, ou 4. Condições de hibridização rigorosas incluem, mas não estão limitadas a, hibridização a DNA imobilizado na membrana em 6X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C seguida por uma ou mais lavagens em 0,2X SSC/0,1 % SDS a cerca de 50-65°C, condições altamente rigorosas tais como hibridização a DNA imobilizado na membrana em 6X SSC a cerca de 45°C seguida por uma ou mais lavagens em 0,1X SSC/0,2% SDS a cerca de 60°C, ou quaisquer outras condições rigorosas de hibridização do conhecimento daqueles habilitados no estado da técnica (ver, por exemplo, Ausubel, P.M. et al. , eds. 1989 Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley and Sons, Inc., NY nas páginas 6.3.1 a 6.3.6 e 2.10.3). Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos incluem, mas não estão limitados a, anticorpos codificados por uma sequência polinucleotidica que é pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência polinucleotídica codificando anticorpos 3F11, 11E2, 4G5, or 9D4 (ver Figuras 1-4) . 5.7.2 Afinidade de ligação Anti-IFNARl
Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem exibir uma elevada afinidade de ligação para IFNAR1. Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem exibir taxas de associação (Kon) de pelo menos 105 M'1 s'1, pelo menos 5x10s M'1 s'1, pelo menos 106 M"1 s”1, pelo menos 5xl06 M"1 s"1, pelo menos 107 M"1 s'1, pelo menos 5xl07 M'1 s'1, ou pelo menos 108 M'1 s"1.
Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem exibir um Kon de pelo menos 2xl05 M"1 s"1, pelo menos 5xl05 M"1 s"1, pelo menos 106 M"1 s"1, pelo menos 5xl06 M"1 s"1, pelo menos 107 M"1 s"1, pelo menos 5xl07 M"1 s"1, ou pelo menos 108 M"1 s"1.
Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem exibir uma taxa de dissociação (Koff) menor do que 10_1s-l, menor do que 5xlO_1S-I, menor do que IO"2 s"1, menor do que 5xl0"2 s"1, menor do que 10"3 s"1, menor do que 5x10-3 s"1, menor do que 10“4 s"1, menor do que 5xl0“4 s”1, menor do que 10"5 s”1, menor do que 5xl0"sS-I, menor do que 10"6 s"1, menor do que 5xl0"6 s"1, menor do que 10"7 s'1, menor do que 5xl0"7 s"1, menor do que IO"8 s'1 menor do que 5xl0"8 s"1, menor do que IO'9 s"1, menor do que 5xl0"9 s'1, ou menor do que IO"10 s'1. Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem exibir Koff menor do que 5xl0"4 s"1, menor do que 10'5 s"1, menor do que 5xl0'5 s"1, menor do que 10 6 s 1, menor do que 5x10-6 s"1, menor do que IO"7 s"1, menor do que 5xl0“7 s"1, menor do que 10“8 s"1, menor do que 5xl0"8 s"1, menor do que 10“9 s”1, menor do que 5xl0“9 s”1, ou menor do que IO”10 s"1.
Anticorpos anti IFNAR1 aqui descritos podem exibir uma constante de afinidade ou Ka (Kon/Koff) de pelo menos 102 M , pelo menos 5x10 M , pelo menos 103 M1, pelo menos 5xl03 M , pelo menos 10 M , pelo menos 5xl04 M 4, pelo menos 105 M'1, pelo menos 5x10s M"1, pelo menos 106 M_1, pelo menos 5xl06 M"1, pelo menos 107 M'1, pelo menos 5xl07 M"1, pelo menos 108 M'1, pelo menos 5xl08 M"1, pelo menos 109 M"1, pelo menos 5xl09 FT1, pelo menos IO10 M_1, pelo menos 5xl010 M_1, pelo menos 1011 M_1, pelo menos 5x1o11 M_1, pelo menos 1012 M" 1, pelo menos 5xl012 M"1, pelo menos 1013 M-1, pelo menos 5x1013 M"1, pelo menos 1014 M"1, pelo menos 5xl014 M"1, pelo menos 1015 Ff1, ou pelo menos 5xl015 Ff1.
Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem exibir uma constante de dissociação ou Kd (Koff/Kon) menor do que IO-2 M, menor do que 5x10-2 M, menor do que 10-3 M, menor do que 5x10 3 M, menor do que 10 4 M, menor do que 5x10"4 M, menor do que 10'5 M, menor do que 5xl0~5 M, menor do que 10"6 M, menor do que 5x10 6 M, menor do que 10~7 M, menor do que 5x10 7 M, menor do que 10"7 M, menor do que 5xl0-8 M, menor do que 10 9 M, menor do que 5xl0-9 M, menor do que 10"ltJM, menor do que 5x10-10 M, menor do que 10-11 M, menor do que 5x10-11 M, menor do que 10-12 M, menor do que 5xl0~12 M, menor do que 10 13 M, menor do que 5x10~13 M, menor do que 10 14 M, menor do que 5xl0~14 M, menor do que 10”15 M, ou menor do que 5xl0~15 M. 5.7.3 Especificidade do Subtipo Interferão alfa
Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem exibir a capacidade de bloquear a ligação a IFNAR1 e/ou neutralizar a atividade biológica de uma ou mais Interferões Tipo 1 (IFN) incluindo, mas não estando limitados a, IFNoí, IFNP, e IFN ω. Ligação dos subtipos IFNa pode ser determinada por ensaios de competição rotineiros tais como aqueles descritos em "Antibodies: A Laboratory Manual", CSHL. Os anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem exibir a capacidade de bloquear a ligação a IFNAR1 e/ou neutralizar a atividade biológica de IFNa, IFNp, e IFNco. Os anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem exibir a capacidade de bloquear a ligação a IFNAR1 e/ou neutralizar a atividade biológica de uma ou mais subtipos de IFNa incluindo, mas não estando limitados a, subtipos IFNa 1, 2a, 2b, 4, 4b, 5, 6, 7,8, 10, 14, 16, 17, e 21. Os anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem exibir a capacidade de bloquear a ligação a IFNAR1 e/ou neutralizar a atividade biológica de todos os subtipos de IFNa. Neste contexto, anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem exibir a capacidade de bloquear e/ou neutralizar a ligação a atividade biológica de subtipos IFNa 1, 2a, 2b, 4, 4b, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17, e 21. Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem não exibir a capacidade de bloquear a ligação a IFNAR1 e/ou neutralizar a atividade biológica de uma ou mais subtipos de IFNa incluindo, mas não estando limitados a, Subtipos IFNa 1, 2a, 2b, 4, 4b, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17, e 21. Numa forma de realização específica, anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem exibir a capacidade de bloquear a ligação a IFNAR1 e/ou neutralizar a atividade biológica de todos os subtipos IFNa exceto IFNa 21.
Os anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem exibir a capacidade de bloquear a ligação a IFNAR1 e/ou neutralizar a atividade biológica de pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, ou pelo menos 13 dos seguintes subtipos IFNa: 1, 2a, 2b, 4, 4b, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17, e 21. Numa forma de realização alternativa, os anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem não exibir a capacidade de bloquear a ligação a IFNAR1 e/ou neutralizar a atividade biológica de pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, ou pelo menos 13 dos seguintes Subtipos IFNoí: 1, 2a, 2b, 4, 4b, 5,6, 7,8, 10, 14, 16, 17, e 21.
Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem exibir a capacidade de bloquear a ligação a IFNAR1 e/ou neutralizar a atividade biológica de interferões semelhantes a Tipo 1 de ocorrência não-natural. Tais interferões semelhantes a Tipo 1 de ocorrência não-natural, ou interferões semelhantes a Tipo 1 híbridos representam moléculas que foram alteradas a partir das suas estruturas naturais por técnicas recombinantes ou sintéticas. Interferões híbridos, como descrito na Patente U.S. No. 7,232,563, representam um substituto molecular de vários segmentos de uma estrutura de interferão de ocorrência natural para criar uma molécula que apresenta uma potência aumentada e/ou toxicidade reduzida.
Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem exibir a capacidade de bloquear a ligação a IFNAR1 e/ou neutralizar a atividade biológica de interferões do Tipo 1 mutados. Interferões do Tipo 1 mutados são descritos nas Patentes U.S. Nos. 6,299,870 e 6,300,474.
Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem exibir a capacidade de bloquear a ligação a IFNAR1 e/ou neutralizar a atividade biológica de interferões semelhantes a Tipo 1 derivados de outras espécies animais. Tais interferões semelhantes a tipo 1 são isolados de galinha, gato, rato, coelho, cabra, cavalo ou outras espécies animais. Em formas de realização específicas, interferões do Tipo 1 humanos são isolados de células derivadas de galinha, gato, rato, coelho, cabra, cavalo ou outras espécies animais. Noutras formas de realização, interferões do Tipo 1 humanos compreendem diferentes padrões de glicosilação quando derivados de galinha, gato, rato, coelho, cabra, cavalo ou outras espécies animais. Adicionalmente discussão sobre interferões derivados de outras espécies animais pode ser encontrada na publicação WIPO No. W006099451A3.
Para o propósito da presente invenção, a capacidade dos anticorpos anti-IFNARl aqui descritos para neutralizar a atividade de IFNcx, pode ser monitorizada, por exemplo, num Ensaio de Ativação do Recetor Cinase (KIRA) como descrito em WO 95114930, publicado a 1 de junho, 1995, através da medição da capacidade dos anticorpos candidatos para reduzir a fosforilação da tirosina (resultando da ligação do ligando) do complexo do recetor IFNAR1/R2.
Alternativamente, ou opcionalmente, a capacidade dos anticorpos anti-IFNARl aqui descritos para neutralizar o surgimento de uma resposta celular por IFNa pode ser testado através da monitorização da neutralização da atividade antivírica de IFNa, como descrito por Kawade, J. Interferon Res. 1:61 70 (1980), ou Kawade and Watanabe, J. Interferon Res. 4:571 584 (1984), ou Yousefi, et al. , Am. J. Clin. Pathol. 83: 735 740 (1985), ou através do teste da capacidade dos anticorpos anti-IFNARl aqui descritos para neutralizar a capacidade de IFNa para ativar a ligação da molécula sinalizadora, fator 3 estimulado por interferão (ISGF3), a um oligonucleótido derivado do elemento de resposta estimulado por interferão (ISRE), num ensaio de alteração da mobilidade eletroforética, como descrito por Kurabayashi et al., Mol. Cell Biol., 15: 6386 (1995).
Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem exibir a capacidade de inibir pelo menos uma função mediada por IFNa do recetor IFNAR1. Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem inibir a atividade do recetor IFNAR1 em resposta a IFNa ou subtipos relacionados em pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 99%. Os anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem inibir a atividade do recetor IFNAR1 em resposta a IFNa ou subtipos relacionados como medido pelo ensaio KIRA acima descrito em pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 99%. Os anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem inibir a atividade do recetor IFNAR1 em resposta a IFNa ou subtipos relacionados como medido pela ligação da molécula sinalizadora, fator 3 estimulado por interferão (ISGF3) , a um oligonucleótido derivado do elemento de resposta estimulado por interferão (ISRE), num ensaio de alteração da mobilidade eletroforética, como descrito por Kurabayashi et al., Mol. Cell Biol., 15: 6386 (1995) em pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 99%. Os anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem inibir a atividade do recetor IFNAR1 em resposta a IFNa ou subtipos relacionados como medido por um ensaio conhecido do estado da técnica em pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 99%.
Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem exibir a capacidade de neutralizar as propriedades antiviricas de IFNa ou subtipos relacionados. Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem neutralizar pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 99% da atividade antivirica de IFNa ou subtipos relacionados, como determinado pelo ensaio antivirico de Kawade (1980), ou Yousefi (1985) . Numa forma de realização alternativa, anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem não neutralizar as propriedades antiviricas de IFNa ou subtipos relacionados. A capacidade dos anticorpos anti-IFNARl aqui descritos para bloquear a ligação de IFNa ou subtipos relacionados a IFNAR1 pode ser determinada por um ensaio de competição rotineiro tal como os descritos em "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988) . Anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem exibir a capacidade de bloquear ou inibir a ligação dos seguintes subtipos IFNa: 1, 2, 4, 5, 8, 10, e 21 a IFNAR1. Os anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem exibir a capacidade de bloquear ou inibir a ligação de: pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, ou pelo menos 7 dos seguintes Subtipos IFNa: 1, 2, 4, 5, 8, 10, e 21 a IFNAR1.
Anticorpos aqui descritos podem atuar em IFNAR para regular os genes responsivos IFN-1. Os genes responsivos IFN-1 foram identificados nos Pedidos de Patente U.S. intitulados "IFN alfa-induced Pharmacodynamic Markers" com as seguintes referências; 60/873,008, preenchida a 6 de dezembro, 2006; 60/907,762, preenchida a 16 de abril, 2007; 60/924, 584, preenchida a 21 de maio, 2007 e 60/960,187, preenchida a 19 de setembro, 2007. 5.7.4 Anticorpos
Anticorpos aqui descritos podem incluir anticorpos monoclonais, anticorpos multiespecificos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos camelizados, anticorpos quiméricos, Fvs de cadeia simples (scFv), Fvs liqados por pontes dissulfureto (sdFv), e anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id), e fragmentos de ligação ao epitopo de qualquer um daqueles acima mencionados. Em particular, anticorpos incluem moléculas de imunoglobulina e fragmentos imunologicamente ativos de moléculas de imunoglobulinas, i.e., moléculas que contêm um local de ligação ao antigénio, podendo estes fragmentos encontrar-se ou não fundidos a outro dominio de imunoglobulina incluindo mas não estando limitados a, uma região Fc ou fragmento relacionado. Como aqui sublinhado, os termos "anticorpo" e "anticorpos" especificamente incluem os anticorpos modificados aqui descritos. Moléculas de imunoglobulinas podem ser de qualquer tipo (p.ex., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (p.ex., IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAa e IgA2) ou subclasse. Anticorpos aqui descritos podem ser de qualquer isotipo. Anticorpos aqui descritos podem ser do isotipo IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4. Anticorpos aqui descritos anticorpos integrais compreendendo regiões variáveis e constantes, ou podem ser fragmentos de ligação ao antigénio relacionados, tais como um anticorpo de cadeia simples. O termo "fragmento de ligação ao antigénio" de um anticorpo (ou simplesmente "fragmento de anticorpo"), como aqui usado, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de efetuarem ligação especifica a um antigénio (p.ex., IFNAR1). Foi demonstrado que a função de ligação ao antigénio de um anticorpo pode ser realizada pou fragmentos de um anticorpo integral. Exemplos de fragmentos de ligação englobados no termo "fragmento de ligação ao antigénio" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo dos domínios VL, VH, CL e CHI; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfureto na região de charneira; (iii) um fragmento Fd consistindo dos domínios VH e CHI; (iv) um fragmento Fv consistindo dos domínios VL e VH de um único braço do anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste de um domínio VH; e (vi) uma região determinante de complementaridade (CDR) isolada. Adicionalmente, embora os dois domínios dos fragmentos Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser combinados, usando métodos recombinantes, através de um agente de ligação sintético que permite que sejam produzidos como uma cadeia proteica única na qual as regiões VL e VH emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fvs de cadeia simples (scFv); ver p.ex., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sei. USA 85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeia simples deverão também ser englobados no termo "fragmento de ligação ao antigénio" de um anticorpo. Esses fragmentos de anticorpo são obtidos usando técnicas convencionais conhecidas por aqueles habilitados no estado da técnica, e os fragmentos são rastreados quanto à sua utilidade do mesmo modo que o são para anticorpos intactos.
Descrevemos aqui proteínas de fusão (daqui em diante referidas como "proteínas de fusão aqui descritas") compreendendo uma região Fc modificada com afinidade reduzida ou eliminada para um ligando Fc responsável por facilitar a função executora comparativamente com uma região Fc possuindo a mesma sequência aminoacidica que as proteínas de fusão aqui descritas mas não compreendendo a adição, substituição, ou deleção de pelo menos um residuo aminoacidico de uma região Fc.
Proteínas de fusão aqui descritas podem compreender um péptido, polipéptido, uma proteina scaffold, scFv, dsFv, diacorpo, Tandab, ou um anticorpo mimético fundido a uma região Fc modificada. Proteínas de fusão aqui descritas podem compreender uma região de ligação ligando o péptido, polipéptido, proteina scaffold, scFv, dsFv, diacorpo, Tandab, ou um anticorpo mimético to à região Fc modificada. 0 uso de agentes de ligação de ocorrência natural, assim como de agentes de ligação artificiais, agentes de ligação peptidicos para ligar polipéptidos em novos polipéptidos de fusão ligados é bem conhecido na literatura (Hallewell et al., (1989), J. Biol. Chem. 264, 5260-5268; Alfthan et al., (1995), Protein Eng. 8,725-731; Robinson & Sauer (1996), Biochemistry 35,109-116; Khandekar et al., (1997), J. Biol. Chem. 272, 32190-32197; Fares et al., (1998), Endocrinology 139, 2459-2464; Smallshaw et al. , (1999), Protein Eng. 12,623-630; Pat. U.S. No. 5,856,456).
Proteínas de fusão aqui descritas podem compreender uma região Fc compreendendo pelo menos uma adição, substituição, ou deleção de um residuo aminoacidico selecionado do grupo consistindo de: 234, 235, e 331, onde o sistema de numeração da região constante é o mesmo que o indice EU estabelecido em Rabat et al. (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA) . Proteínas de fusão aqui descritas podem compreender uma região Fc compreendendo pelo menos um resíduo aminoacídico selecionado do grupo consistindo de: L234F, L235E, e P331S.
Proteínas de fusão aqui descritas podem adicionalmente compreender uma região Fc compreendendo pelo menos uma adição, substituição, ou deleção de um resíduo aminoacídico que está correlacionado com estabilidade aumentada da proteína de fusão. A adição, substituição, ou deleção de um resíduo aminoacídico pode ser na posição 228 de uma região Fc, onde o sistema de numeração da região constante é o mesmo que o índice EU estabelecido em Rabat et al. (supra). Proteínas de fusão aqui descritas podem compreender uma região Fc compreendendo uma substituição aminoacídica na posição 228, onde a substituição é um resíduo de serina.
Anticorpos ou proteínas de fusão podem compreender uma ou mais glicoformas desenvolvidas, i.e., uma composição de hidrato de carbono que se encontra covalentemente ligada a uma molécula compreendendo uma região Fc. Glicoformas desenvolvidas podem ser úteis para uma variedade de propósitos, incluindo, mas não estando limitados a, redução da função executora. Glicoformas desenvolvidas podem ser geradas por qualquer método conhecido no estado da técnica, por exemplos através do uso de estirpes de expressão desenvolvidas ou variantes, por coexpressão com uma ou mais enzimas, por exemplo Dl N-acetiglucosaminiltransferase III (GnTIll), através da expressão de uma molécula compreendendo uma região Fc em vários organismos ou linhas celulares de vários organismos, ou por modificação de hidratos de carbono após a molécula compreendendo a região Fc ser expressa. Métodos para a produção de glicoformas desenvolvidas são conhecidos do estado da técnica e incluem, mas não estão limitados a, aqueles descritos em Umana et al. , 1999, Nat. Biotechnoll7:176-180; Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, 1 Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, 1 Biol Chem 278:3466-3473) Pat. U.S. No. 6,602,684; U.S. Ser. No. 10/277,370; U.S. Ser. No. 101113, 929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; Potillegent™ technology (Biowa, Inc. Princeton, N.J.); GlycoMAb™ glicosilação engineering technology (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland); WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; Okazaki et al., 2004, 101MB, 336: 1239-49. 5.7.5 Conjugados de Anticorpos
Descrevemos aqui o uso de anticorpos ou fragmentos relacionados conjugados ou fundidos a uma ou mais frações, incluindo mas não estando limitados a, péptidos, polipéptidos, proteínas, proteínas de fusão, moléculas de ácidos nucleicos, moléculas pequenas, agentes miméticos, fármacos sintéticos, moléculas inorgânicas, e moléculas orgânicas.
Descrevemos aqui o uso de anticorpos ou fragmentos relacionados recombinantemente fundidos ou quimicamente conjugados (incluindo ambas as conjugações covalentes e não-covalentes) a uma proteína heteróloga ou polipéptido (ou fragmento relacionado, a um polipéptido de pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90 ou pelo menos 100 aminoácidos) para gerar proteínas de fusão. A fusão não precisa necessariamente de ser direta, mas pode ocorrer através de sequências de ligação. Por exemplo, anticorpos podem ser usados para direcionar polipéptidos heterólogos a tipos celulares particulares, seja in vitro ou in vivo, através da fusão ou conjugação de anticorpos a anticorpos específicos para recetores particulares da superfície celular. Anticorpos fundidos ou conjugados a polipéptidos heterólogos podem também ser usados em imunoensaios in vitro e métodos de purificação usando métodos conhecidos no estado da técnica. Ver p.ex., Publicação Internacional No. WO 93/21232; Patente Europeia No. EP 439,095; Naramura et al., 1994, Immunol. Lett. 39:91-99; Pat. U.S. No. 5,474, 981; Gillies et al. , 1992, PNAS 89:1428-1432; e Fell et al., 1991, J. Immunol. 146:2446-2452.
[00175] Proteínas de fusão adicionais podem ser geradas através de técnicas de shuffling genético, shuffling de motivos, shuffling de exões, e/ou shuffling de codões (coletivamente referidos como "shuffling de DNA"). O shuffling de DNA pode ser empregado para alterar as atividades dos anticorpos aqui descritos ou fragmentos relacionados (p.ex., anticorpos ou fragmentos relacionados com afinidades elevadas e taxas de dissociação baixas). Ver, genericamente, Pat. U.S. Nos. 5, 605, 793; 5, 811,238; 5,830,721; 5,834,252; 3 5,837,458, e Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; e Lorenzo e Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308-313. Anticorpos ou fragmentos relacionados, ou os anticorpos codificados ou fragmentos relacionados, podem ser modificados ao serem sujeitados a mutagénese aleatória por PCR suscetível a erro, inserção aleatória de nucleótidos ou outros métodos antes da recombinação- Uma ou mais porções de um nucleótido codificando um anticorpo ou fragmento de anticorpo, cujas porções com ligação específica a IFNAR1 podem ser recombinadas com um ou mais componentes, motivos, secções, partes, domínios, fragmentos, etc., de uma ou mais moléculas heterólogas.
Adicionalmente, os anticorpos ou fragmentos relacionados podem ser fundidos com sequências marcadoras, tais como um péptido para facilitar a purificação. A sequência marcadora aminoacidica pode ser um péptido hexa-histidina, tal como uma sequência fornecida num vetor pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311), entre outros, muitos dos quais se encontram comercialmente disponíveis. Como descrito em Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:821-824, por exemplo, hexa-histidina permite a purificação conveniente da proteína de fusão. Outras sequências peptídicos úteis para purificação incluem, mas não estão limitadas a, sequência hemaglutinina "HA", que corresponde a um epítopo derivado da proteína hemaglutinina influenza (Wilson et al., 1984, Cell 37:767) e a sequência "Flag".
Anticorpos ou fragmentos, análogos ou derivados relacionados podem ser conjugados para um diagnóstico ou agente detetável. Tais anticorpos podem ser úteis para monitorização ou prognóstico do desenvolvimento ou progressão de um distúrbio inflamatório como parte de um procedimento de teste clínico, tais como a determinação da eficácia de uma terapia particular. Tal diagnóstico e deteção podem ser obtidos através do acoplamento do anticorpo a substâncias detetáveis incluindo, mas não estando limitado a, várias enzimas, tais como, mas não estando limitadas a, peroxidase da armorácia, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, ou acetilcolinesterase; grupos prostéticos, tais como, mas não estando limitados a, streptavidina/biotina e avidina/biotina; materiais fluorescentes, tais como, mas não estando limitados a, umbeliferona, fluoresceína, isocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansilo ou ficoeritrina; materiais luminescentes, tais como, mas não estando limitados a, luminol; materiais bioluminescentes, tais como, mas não estando limitados a, luciferase, luciferina, e aequorina; materiais radioativos, tais como, mas não estando limitados a, iodo (131I, 125I, I231j 121I), carbono (14C) , enxofre (35S) , tritio (3H) , indio (115In, 113In, 112In, lllln) e tecnécio 99Tc), tálio (2o1Ti) ' gálio (68Ga, 67Ga) , paládio (103Pd) , molibdénio (99Mo) , xénon (133Xe) , flúor (18F) , 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, e 117Tin; materiais emissores de positrões usando várias tomografias de emissão de positrões, iões metálicos paramagnéticos não-radioativos, e moléculas que são marcadas radiologicamente ou conjugadas com radioisótopos específicos. Técnicas para a conjugação de frações terapêuticas a anticorpos são bem conhecidas, ver, p.ex., Amon et al. , "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer
Therapy, Reisfeld et al. (eds.), PP- 243-56. (Alan R. Liss,
Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987);
Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475- 506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of
The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibodies In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62: 119-58.
Alternativamente, um anticorpo pode ser conjugado a um segundo anticorpo para formar um heteroconjugado de anticorpo como descrito por Segal na Pat. U.S. No. 4,676,980. A fração terapêutica ou fármaco conjugado a um anticorpo ou fragmento relacionado que se liga especificamente a IFNAR1 deverá ser selecionada para alcançar o efeito terapêutico ou profilático desejado para um distúrbio particular num sujeito. Um profissional clinico de saúde ou outro pessoal médico deverá considerar o seguinte quando decidindo qual fração ou fármaco terapêutico a conjugar a um anticorpo ou fragmento relacionado que se liga especificamente a IFNAR1: a natureza da doença, a gravidade da doença, e a condição do sujeito. 5.7.6 Métodos de Produção de Anticorpos
Os anticorpos ou fragmentos relacionados podem ser produzidos por qualquer método conhecido no estado da técnica para a sintese de anticorpos, em particular, por técnicas de sintese quimica ou por expressão recombinante.
Anticorpos monoclonais podem ser preparados usando uma ampla variedade de técnicas conhecidas do estado da técnica incluindo o uso de tecnologias hibridoma, recombinante, e fágica, ou uma combinação relacionada. Por exemplo, anticorpos monoclonais podem ser produzidos usando técnicas hibridoma incluindo arques conhecidas no estado da técnica e ensinadas, por exemplo, em Harlow et al., "Antibodies: A Laboratory Manual", (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981) . 0 termo "anticorpo monoclonal" como aqui usado não se encontra limitado a anticorpos produzidas através da tecnologia hibridoma. 0 termo "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo que é derivado de um clone único, incluindo qualquer clone eucariótico, procariótico, ou fágico, e não o método através do qual é produzido. Métodos para a produção e rastreio de anticorpos específicos usando tecnologia hibridoma são rotineiros e conhecidos do estado da técnica. Sucintamente, ratinhos podem ser imunizados com IFNAR1 e uma vez tendo sido detetada a resposta imunológica, p.ex., anticorpos específicos para IFNAR1 são detetados no soro murino, o baço murino é recolhido e os esplenócitos são isolados. Os esplenócitos são então fundidos por tecnologias bem conhecidas a quaisquer células do mieloma adequadas, por exemplo, células da linha celular SP20 disponível da ATCC. Os hibridomas são selecionados e clonados por diluição limitada. Os clones de hibridoma são então ensaiados por métodos conhecidos no estado da técnica para células que segregam anticorpos capazes de ligar um polipéptido como aqui descrito. Os fluídos associados a ascite, que geralmente contêm elevados níveis de anticorpos, podem ser produzidos através da imunização de ratinhos com clones de hibridoma positivos.
Concordantemente, anticorpos monoclonais podem ser gerados através do cultivo de uma célula de hibridoma segregando um anticorpo aqui descrito, onde o hibridoma é gerado através da fusão de esplenócitos isolados de um ratinho imunizado com IFNAR1 com células de mieloma e depois rastreado para hibridomas resultantes da fusão para clones de hibridoma que segregam um anticorpo capaz de se ligar a IFNAR1.
Fragmentos de anticorpos que reconhecem epítopos IFNAR1 específicos podem ser gerados por qualquer técnica conhecida por aqueles habilitados no estado da técnica. Por exemplo, fragmentos Fab e F(ab')s aqui descritos podem ser produzidos por divagem proteolítica de moléculas de imunoglobulinas, usando enzimas tais como a papaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos F(ab')2). Fragmentos F(ab')2 contêm a região variável, a região constante da cadeia leve e o domínio CHI da cadeia pesada. Adicionalmente, anticorpos podem também ser gerados usando vários métodos fágicos do conhecimento do estado da técnica.
Em métodos fágicos, os domínios funcionais de anticorpo encontram-se expressos nas superfícies das partículas de fagos que transportam as sequências polinucleotídicas codificantes. Em particular, sequências de DNA sequences codificando os domínios VH e VL são amplificadas a partir de bibliotecas de cDNA animal (p.ex., bibliotecas de cDNA humano ou murino de tecidos linfoides). 0 DNA codificando os domínios VH e VL domains é recombinado conjuntamente com um agente de ligação scFv por PCR e clonado num vetor fágico (p.ex., pCANTAB6 ou pComb3HSS). 0 vetor é eletroporado em E. coli e E. coli é infetado com o fago adjuvante. Os fagos usados nestes métodos são tipicamente fagos filamentosos incluindo Fd e M13 e os domínios VH e VL são usualmente fundidos via recombinação aos genes fágicos III ou VIII. A expressão fágica de um domínio de ligação ao antigénio que se liga ao epítopo IFNAR1 de interesse pode ser selecionada ou identificada com o antigénio, p.ex., usando um antigénio marcado ou um antigénio ligado ou imobilizado numa superfície sólida ou esfera metálica. Exemplos de métodos fágicos que podem ser usados para produzir os anticorpos da presente invenção incluem aqueles descritos em Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al. , 1997, Gene 187:9-18; Burton et al. , 1994, Advances in Immunology 57: 191-280; International Application No. PCT/GB91/01134; Publicação Internacional Nos. WO 90102809, WO 91110737, WO 92/01047, WO 92118619, WO 93111236, WO 95115982, WO 95/20401, and W097113844; e Pat. U.S. Nos. 5,698,426, 5,223,409, 5,403,484, 5,580,717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821,047, 5,571,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, 5,658,727, 5,733,743 e 5,969,108.
Como descrito nas referência acima citadas, após seleção fágica, as regiões codificantes do anticorpo provenientes do fago podem ser isoladas e usadas para produzir anticorpos integrais, incluindo anticorpos humanos, ou qualquer outro fragmento de ligação ao antigénio desejado, e expressos em qualquer hospedeiro desejado, incluindo células mamíferas, céluls de insetos, células de plantas, leveduras, e bactérias, p.ex., como abaixo descrito. Técnicas para recombinantemente produzir fragmentos Fab, Fab' e F(ab')2 podem também ser empregadas usando métodos conhecidos do estado da técnica tais como aqueles descritos na publicação internacional No. WO 92/22324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12 ( 6) : 864-869; Sawai et al., 1995, AJRI 34:26-34; e Better et al., 1988, Science 240:1041-1043.
Para gerar anticorpos integrais, primers de PCR incluindo sequências nucleotidicas de VH e VL, um local de restrição, e uma sequência falnqueadora para proteger o local de restrição podem ser usadas para amplificar as sequências VH ou VL nos clones scFv. Utilizando técnicas de clonagem conhecidas por aqueles habilitados no estado da técnica, os domínios VH amplificados por PCR podem ser clonados em vetores expressando uma região constante VH, p.ex., regiões constantes kappa e lambda humanas. Em certas formas de realização, os vetores para expressão dos domínios VH ou VL compreendem um promotor EF-1 alfa, um indicador de secreção, um local de clonagem para o domínio variável, domínios constantes, e um marcador de seleção como neomicina. Os domínios VH e VL domains podem também ser clonados num vetor expressando as regiões constantes necessárias. Os vetores de conversão da cadeia pesada e da cadeia leve são então cotransfetados em linhas celulares para produzir linhas celulares estáveis ou transientes que expressam os anticorpos integrais, p.ex., IgG, usando técnicas conhecidas por aqueles habilitados no estado da técnica.
Para alguns usos, incluindo o uso in vivo de anticorpos em humanos e ensaios de deteção in vitro, pode ser vantajoso o uso de anticorpos humanos ou quiméricos. Anticorpos totalmente humanos são particularmente desejados para tratamento terapêuticos de sujeitos humanos. Anticorpos humanos podem ser produzidos por uma variedade de métodos conhecidos no estado da técnica incluindo os métodos fágicos acima descritos usando bibliotecas de anticorpos derivadas de sequências de imunoglobulinas humanas. Ver também as Pat. U.S. Nos. 4,444,887 e 4,716,111; e as Publicações Internacionais Nos. WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, W098116654, WO 96/34096, WO 96/33735, e WO 91110741.
Um anticorpo quimérico é uma molécula que que diferentes porções do anticorpo são derivadas de diferentes moléculas de imunoglobulinas. Métodos para a produção de anticorpos quiméricos são bem conhecidos do estado da técnica. Ver, p.ex., Morrison, 1985, Science 229: 1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202; e Pat. U.S. Nos. 5,807,715, 4,816,567, 4,816,397, r 6,311,415.
Um anticorpo humanizado é um anticorpo ou fragmento relacionado que é capaz de se ligar a um antigénio pré-determinado e que compreender uma região da sequência possuindo substancialmente a sequência imunoacidica de uma imunoglobulina humano e uma CDR possuindo substancialmente a sequência aminoacidica de uma imunoglobulina não-humana. Um anticorpo humanizado compreende substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, dominios variáveis Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv) nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem aquelas de uma imunoglobulina não-humana (i.e., anticorpo doador) e todos ou substancialmente todas das regiões da sequência são aquelas de uma sequência consenso de uma imunoglobulina humana. Em certas circunstâncias, um anticorpo humanizado também compreende pelo menos uma porção de uma região constante da imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Rotineiramente, o anticorpo irá conter tanto a cadeia leve assim como pelo menos o dominio variável da cadeia pesada. Os anticorpos também podem incluir as regiões CHI, charneira, CH2, CH3, e CH4 da cadeia pesada. O anticorpo humanizado pode ser selecionado de qualquer subclasse de imunoglobulinas, incluindo IgM, IgG, IgD; IgA e IgE, e qualquer isotipo, incluindo IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Usualmente o dominio constante é um dominio constante de fixação do complemente onde é desejado que o anticorpo humanizado exiba: atividade citotóxica e a classe é tipicamente IgGl. Em circunstância onde tal atividade citotóxica não é desejada, o dominio constante pode ser o da classe IgG2. O anticorpo humanizado pode compreender sequências de mais do que uma classe ou isotipo, e selecionando dominios constantes particulares para otimizar as funções executoras desejadas encontra-se dentro das capacidades daqueles habilitados no estado da técnica. As regiões framework e CDR de um anticorpo humanizado não necessitam de corresponder precisamente às sequências parentais, p.ex., a CDR dadora ou a framework consenso podem ser mutagenizadas através da substituição, inserção ou deleção de pelo menos um residuo de forma a qe a CDR ou a framework do residuo no local não corresponda a a nenhum dos anticorpos consenso ou importado. Tais mutações, contudo, não serão extensas. Usualmente, pelo menos 75% dos residuos do anticorpo corresponderão às sequências dos residuos da região framework parental (FR) e CDR, mais usualmente 90%, e possivelmente superiores a 95%. O anticorpo humanizado pode ser produzido usando uma variedade de técnicas conhecidas no estado da técnica, incluindo mas não estando limitados a, transplante de CDRs (Patente Europeia No. EP 239,400; Publicação Internacional No. WO 91/09967; e Pat. U.S. Nos. 5,225,539, 5,530,101, e 5,585,089), revestimento ou repavimentação (Patentes Europeias Nos. EP 592,106 e EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28 (4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7 (6) :805-814; e Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-973), shuffling de cadeias (Pat. U.S. No. 5,565,332), e técnicas divulgadas em, p.ex., Pat. U.S. Nos. 6,407,213, 5,766,886, WO 9317105, Tan et al., J. Immunol. 169: 1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng. 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem. 272(16): 10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s- 5977s (1995), Couto et al., Cancer Res. 55(8):1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene 150(2):409- 10 (1994), e Pedersen et al., J. Mol. Biol. 235(3):959-73 (1994). Muitas vezes, os resíduos framework nas regiões framework serão substituídos com o resíduo correspondente da CDR do anticorpo doador para alterar ou melhorar a ligação ao antigénio. Estas substituições framework são identificadas por métodos conhecidos no estado da técnica, p.ex., através da modelação das interações da CDR e os resíduos framework para identificar os resíduos framework importantes para a ligação ao antigénio e a comparação de sequências para identificar os resíduos framework invulgares em posições particulares (ver, p.ex., Queen et ai., Pat. U.S. No. 5, 585, 089; e Riechmann et al., 1988, Nature 332:323. 5.7.7 Polinucleótidos Codificando um Anticorpo
Descrevemos aqui polinucleótidos que hibridizam sob condições de baixo, moderado ou elevado rigor, p.ex., como acima definidos, a polinucleótidos que codificam um anticorpo aqui descrito.
Os polinucleótidos podem ser obtidos, e a sequência nicleotídica dos polinucleótidos determinada, por quaisquer métodos conhecido no estado da técnica. Uma vez que as sequências aminoacídicas dos anticorpos são conhecidas, as sequências nucleotídicas codificando esses anticorpos podem ser determinadas usando métodos conhecidos no estado da técnica, i.e.f codões nucleotídicos conhecidos por codificarem aminoácidos particulares são montados de tal forma para produzirem um ácido nucleico que codifique o anticorpo ou fragmento relacionado aqui descritos. Tal polinucleótido codificando o anticorpo pode ser montado a partir de oligonucleótidos quimicamente sintetizados (p.ex., como descrito em Kutmejer et al. , 1994, BioTechniques 17:242), que, sucintamente, envolve a síntese de oligonucleótidos sobreponíveis contendo porções da sequência codificando o anticorpo, annealing e ligação desses oligonucleótidos, e depois amplificação dos oligonucleótidos ligados por PCR.
Alternativamente, um polinucleótido codificando um anticorpo pode ser produzido a partir de ácidos nucleicos de uma fonte adequada. Se um clone contendo um ácido nucleico codificando um anticorpo articular não está disponível, mas a sequência da molécula do anticorpo é conhecida, o ácido nucleico codificando a imunoglobulina pode ser quimicamente sintetizado ou obtido a partir de uma fonte adequada (p.ex., uma biblioteca de cDNA de anticorpos, ou uma biblioteca de cDNA produzida a partir de, ou ácido nucleico, usualmente poli A+RNA, isolado de, qualquer tecido ou células expressando o anticorpo, tal como células do hibridoma selecionadas para expressar um anticorpo como os aqui descritos) por amplificação via PCR usando primers sintéticos hibridizáveis nos terminais 3' e 5' da sequência ou por clonagem usando uma sonda oligonucleotidica para a sequencia genética particular a identificar, p.ex., um clone de cDNA de uma biblioteca de cDNA que codifica o anticorpo. Ácidos nucleicos amplificados produzidos por PCR podem então ser clonados em vetores de clonagem replicáveis usando qualquer método conhecido do estado da técnica.
Uma vez a sequência nucleotidica do anticorpo tiver sido determinada, a sequência nucleotidica do anticorpo pode ser manipulada usando métodos conhecidos no estado da técnica para a manipulação das sequências nucleotidicas, p.ex., técnicas de DNA recombinante, mutagénese direcionada, PCR, etc. (ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al. , 1990, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2d
Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. e Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, para gerar anticorpos possuindo uma sequência aminoacídica diferente, por exemplo para criar substituições, deleções, e/ou inserções aminoacidicas.
Numa forma de realização especifica, uma ou mais das CDRs é inserida em regiões framework usando técnicas de DNA recombinante rotineiras. As regiões framework podem ser de ocorrência natural ou regiões framework consenso, e em certas circunstâncias, regiões framework humanas (ver, p.ex.r Chothia et al. , 1998, J. Mol. Biol. 278: 457-479 para uma listagem de regiões framework humanas). Opcionalmente, o polinucleótido gerado pela combinação de regiões framework e CDRs codifica um anticorpo com ligação especifica para IFNARl. Opcionalmente, uma ou mais substituições aminoacidicas podem ser feitas nas regiões framework, e, em certas circunstâncias, as substituições aminoacidicas melhoram a ligação do anticorpo ao seu antigénio. Adicionalmente, tais métodos podem ser usados para realizar substituições aminoacidicas ou deleções aminoacidicas de um ou mais resíduos de cisteína da região variável participando na ligação dissulfureto intracadeia para gerar moléculas de anticorpo carecendo de uma ou mais ligações intrassulfureto intracadeia. Outras alterações ao polinucleótido são englobadas pela presente invenção e encontram-se dentro das capacidades daqueles habilitados no estado da técnica.
Em formas de realização específicas, anticorpos aqui descritos são codificados por sequências polinucleotídicas exemplificadas nas Figuras 1-4. Noutras formas de realização específicas, polinucleótidos aqui descritos codificam anticorpos compreendendo regiões constantes das cadeias pesadas e cadeias leves correspondendo às SEQ ID Nos: 41 e 42 respetivamente. Ainda noutras formas de realização especificas, polinucleótidos aqui descritos codificam anticorpos compreendendo regiões constantes da cadeia pesada correspondendo à SEQ ID N°: 42 com uma permissividade à variação alélica onde a variação é pelo menos um ou mais resíduos selecionados do grupo consistindo das posições 214, 221, 356, e 358 como definidas pelo sistema de numeração do índice EU. 5.7.8 Expressão recombinante de um anticorpo
Expressão recombinante de um anticorpo aqui descrito, derivado, análogo ou fragmento relacionado, (p.ex., uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo aqui descrito ou uma porção relacionada ou uma cadeia simples de anticorpo aqui descritas), requer a construção de um vetor de expressão contendo um polinucleótido que codifica o anticorpo. Uma vez um polinucleótido codificando uma molécula de anticorpo ou uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo, ou porção relacionada (mas não necessariamente contendo o domínio variável da cadeia pesada ou cadeia leve), aqui descritos tiver sido obtida, o vetor para a produção da molécula de anticorpo pode ser produzida por tecnologia de DNA recombinante usando técnicas conhecidas no estado da técnica. Assim, métodos para a preparação de uma proteína através da expressão de um polinucleótido contendo um anticorpo codificando a sequência nucleotídica são aqui descritos. Métodos que são que são bem conhecidos pro aqueles habilitados no estado da técnica podem ser usados para construir vetores de expressão contendo sequências codificantes de anticorpos e sinais de controlo tranacripcionais e translacionais apropriados. Estes métodos incluem, por exemplo, técnicas in vitro de DNA recombinante, técnicas sintéticas, e recombinação genética in vivo. Assim descrevemos aqui vetores replicáveis compreendendo a sequência nucleotidica codificando uma molécula de anticorpo aqui descrita, uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo, um domínio variável de uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo ou uma porção relacionada, ou uma CDR de uma cadeia pesada ou leve, ligada operacionalmente a um promotor. Tais vetores podem incluir a sequência nucleotidica codificando a região constante da molécula de anticorpo (ver, p.ex., Publicação Internacional No. WO 86/05807; Publicação Internacional No. WO 89/01036; e Pat. U.S. No. 5,122,464) e o domínio variável do anticorpo pode ser eventualmente clonado em tal vetor para a expressão da cadeia pesada integral, a cadeia leve integral, ou ambas as cadeias leve e pesada. 0 vetor de expressão é transferido para uma célula hospedeira por técnicas convencionais e as células tranfetadas são então cultivadas por técnicas convencionais para produzir um anticorpo como os aqui descritos. Assim, descrevemos aqui células hospedeiras contendo um polinucleótido codificando um anticorpo aqui descrito ou fragmentos relacionados, ou uma cadeia pesada ou leve relacionada, ou porção relacionada, ou uma cadeia simples de anticorpo aqui descrito, operacionalmente ligada a um promotor heterólogo. Para a expressão de anticorpos de cadeia dupla, vetores codificando ambas as cadeias pesada e leve podem ser coexpressos na célula hospedeira para a expressão da molécula de imunoglobulina integral, como abaixo detalhado.
Uma variedade de sistemas de vetores hospedeiros de expressão podem ser utilizados para expressar as moléculas de anticorpo aqui descritas (ver, p.ex., Pat. U.S. No. 5,807,715). Tais sistemas de expressão hospedeiros representam veículos através dos quais as sequências codificantes de interesse podem ser produzidas e subsequentemente purificadas, mas também representam células que podem, quando transformadas ou transfetadas com as sequências nucleotídicas codificantes de interesse, expressam uma molécula de anticorpo como aqui descrita in situ. Estes incluem mas não estão limitados a microorganismos tais como bactérias (p.ex., E. coli e B. subtilis) transformadas com DNA de bacteriófago recombinante, DNA plasmídico ou vetores de DNA cosmídico de expressão contendo sequências codificantes de anticorpos; leveduras (p.ex., Saccharomyces e Pichia) transformadas com vetores de expressão de leveduras recombinantes contendo sequências codificantes de anticorpos; sistemas de células de insetos infetadas com recombinant virus vetores de expressão víricos recombinantes (p.ex., baculovirus) contendo sequências codificantes de anticorpos; sistemas de células de plantas infetados com vetores de expressão víricos recombinantes (p.ex., vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; vírus do mosaico da planta do tabaco, TMV) ou transformadas com vetores de expressão plasmídicos recombinantes (p.ex. plasmídeo Ti) contendo sequências codificantes de anticorpos; ou sistemas de células mamíferas (p.ex., células COS, CHO, BHK, 293, NSO, e 3T3) construções recombinantes de expressão contendo promotores derivados do genoma de células mamíferas (p.ex., promotor da metalotioneína) ou de vírus de mamíferos (p.ex., o promotor tardio adenovírico; o promotor do vírus vaccinia 7,5K). Células bacterinas tais como Escherichia coli, e noutras alternativas, células eucarióticas, especialmente para a expressão da molécula recombinante integral do anticorpo, podem ser usados para a expressão de uma molécula recombinante de anticorpo. Por exemplo, células mamíferas tais como células do ovário de hamster chinês (CHO) , em conjugação com um vetor tal como o principal elemento intermediário do promotor genético precoce de citomegalovírus humanos é um sistema eficaz de expressão para anticorpos (Foecking et al., 1986, Gene 45:101; e Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2). Numa forma de realização específica, a expressão das sequências nucleotídicas codificando anticorpos ou fragmentos relacionados com ligação específica para IFNAR1 é regulada por um promotor constitutivo, promotor induzível ou promotor específico tecidular.
Em sistemas bacterianos, um número de vetores de expressão pode ser vantajosamente selecionado dependendo do uso pretendido para a molécula de anticorpo a ser expressa. Por exemplo, quando é desejado que uma grande quantidade da seja produzida, para a produção de composições farmacêuticas de uma molécula de anticorpo, vetores que dirigem a expressão de altos níveis dos produtos da proteína de fusão que são prontamente purificados podem ser desejados. Tais vetores incluem, mas não estão limitados a, o vetor de expressão de E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO 12: 1791), na qual a sequência codificante de anticorpo pode ser ligada individualmente ao vetor no enquadramento com a região codificante lac Z de forma a permitir que uma proteína de fusão seja produzida; vetores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); e semelhantes. Vetores pGEX podem também ser usados para expressar polipéptidos externos como proteínas de fusão com glutationa 5-transferase (GST). No geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem facilmente ser purificadas a partir de células lisadas por adsorção e ligação to esferas de agarose com matriz de glutationa seguida por eluição na presença de glutationa livre. Os vetores pGEX vectors são desenvolvidos para incluir locais de clivagem para a protease Xa fator ou trombina de forma a que o produto genético alvo clonado possa ser libertado da fração GST.
Em células hospedeiras mamíferas, um número de sistemas de expressão baseados em virus podem ser utilizados. Em casos em que o adenovirus é usado como um vetor de expressão, a sequência codificante de anticorpo de interesse pode ser ligada a um complexo de controlo transcrição/tradução adenovirico, p.ex., o promotor tardio e a sequência lider tripartida. Este gene quimérico pode então ser inserido no genoma adenovirico por recombinação in vitro ou in vivo. Inserção numa região não-essencial do genoma virico (p.ex., região El ou E3) irá resultar num virus recombinante que é viável e capaz de expressar a molécula de anticorpo em hospedeiros infetados (p.ex., ver Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8 1:355-359). Sinais de iniciação específicos podem também ser requeridos para uma tradução eficiente de sequências codificantes inseridas de anticorpos. Estes sinais incluem o codão de iniciação ATG e sequência adjacentes. Adicionalmente, o codão de iniciação deverá encontra-se em fase com a fase de leitura da sequência codificante desejada para assegurar a tradução da inserção completa. Estes sinais de controlo de tradução exógenos e codões de iniciação podem ser de uma variedade de origens, tanto natural como sintética. A eficiência de expressão pode ser aumentada através da inclusão de elementos promotores de transcrição adequados, terminadores de transcrição, etc (ver, p.ex., Bittner et al. , 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544).
Adicionalmente, uma estirpe de célula hospedeira pode ser escolhida modulando a expressão das sequências inseridas, ou modificando e processo o produto genético de um modo especifico desejado. Tais modificações (p.ex., glicosilação) e processamento (p.ex., divagem) de produtos de proteínas pode ser importante para a função da proteína. Diferentes células hospedeiras possuem mecanismos característicos e específicos para o processamento pós-tradução e modificação de proteínas e produtos proteicos. Linhas celulares apropriadas ou sistemas hospedeiros podem ser escolhidos para assegurar a correta modificação e processamento da proteína exterior processada. Para este fim, células hospedeiras eucarióticas que possuem a maquinaria celular para o adequado processamento do transcrito primário, glicosilação, e fosforilação do produto genético podem ser usadas. Tais células hospedeiras mamíferas incluem mas não estão limitadas a células CHO, VERY, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 e T47D, NSO (uma linha celular murina de mieloma que não produz endogenamente quaisquer cadeias de imunoglobulinas), CRL7030 e HsS78Bst.
Para produção de elevado título, de longo termo, de proteínas recombinantes, uma expressão estável é desejada. Por exemplo, linhas celulares que estávelmente expressam a molécula de anticorpo podem ser desenvolvidas. Em vez de usar vetores de expressão que contêm origem de replicação de natureza vírica, células hospedeiras podem ser transformadas com DNA controlado por elementos de controlo de expressão apropriados (p.ex., promotor, intensificador, sequências, terminadores de transcrição, locais de poliadenilação, etc.), e um marcador seletivo. Após a introdução do DNA exterior, células modificadas podem ser permitidas crescerem durante 1-2 dias num meio de cultura enriquecido, e depois são mudadas para um meio seletivo. 0 marcador seletivo no plasmideo recombinante confere resistência à seleção e permite que as células integrando estavelmente o plasmideo nos seus cromossomas oir crescer para formar loci que por sua vez podem ser clonados e expandidos em linhas celulares. Este método pode vantajosamente ser usado para desenvolver linhas celulares que expressam a molécula de anticorpo. Tais linhas celulares modificadas podem ser particularmente úteis no rastreio e avaliação de composições que interagem diretamente ou indiretamente com a molécula de anticorpo.
Um número de sistemas de seleção podem ser usados, incluindo mas não estando limitados a, genes da timidina cinases de virus herpes simplex (Wigler et al., 1977, Cell 11:223), hipoxantinaguanina fosforibosiltransferase (Szybalska & Szybalski, 1992, Proc.Natl. Acad. Sei. USA 48:202), e adenina fosforibosiltransferase (Lowy et al., 1980, Cell 22:8-17) que podem ser empregados em células tk, hgprt- ou aprt-, respetivamente. Também, a resistência antimetabolitos pode ser usada como a base de seleção para os seguintes genes: dhfr, que confere resistência a metotrexato (Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sei. USA 77:357; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:1527); gpt, que confere resistência a ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); neo, que confere resistência ao aminoglicosideo G-418 (Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; e Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; May, 1993, TIB TECH 11(5): 155-2 15) ; e hygro, que confere resistência a higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30:147). Métodos comumente conhecidos no estado da técnica da tecnologia de DNA recombinante podem ser rotineiramente aplicados para selecionado o clone recombinante desejado, e tais métodos são descritos, por exemplo, em Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); e nos Capítulos 12 e 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1, que são aqui incorporados na sua totalidade para efeitos de referência.
Os níveis de expressão de uma molécula de anticorpo podem ser aumentados por amplificação do vetor (para uma revisão, ver Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol,3. (Academic Press, New York, 1987)). Quando um marcador no sistema de vetores expressando o anticorpo é amplificável, o aumento no nível do inibidor presente na cultura da célula hospedeira irá aumentar o número de cópias do gene marcador. Uma vez que a região amplificada é associada com o gene do anticorpo, a produção do anticorpo irá também aumentar (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257). A célula hospedeira pode ser cotransfetada com dois vetores de expressão aqui descritos, o primeiro vetor codificando um polipéptido derivado da cadeia pesada e o segundo vetor codificando um polipéptido derivado da cadeia leve. Os dois vetores podem conter marcadores de seleção idênticos que permitem uma expressão igual dos polipéptidos de cadeia leve e cadeia pesada. Alternativamente, um único vetor codificante pode ser usado, e é capaz de expressar os polipéptidos tanto da cadeia leve como da cadeia pesada. Em certas situações, a cadeia leve deverá ser colocada antes da cadeia pesada para evitar um excesso de toxicidade proveniente da cadeia pesada livre (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; e Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:2 197) . As sequências codificantes para as edeias leve e podem compreender cDNA ou DNA genómico.
Uma vez a molécula de anticorpo aqui descrita tiver sido produzida por expressão recombinante, ela pode ser purificada por qualquer método conhecido no estado da técnica para a purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, por cromatografia (p.ex., troca iónica, afinidade, particularmente por afinidade para o antigénio especifico após a Proteína A, e cromatografia de coluna dimensionável), centrifugação, solubilidade diferencial, ou por qualquer outra técnica estandardizada para a purificação de proteínas. Adicionalmente, os anticorpos aqui descritos ou fragmentos relacionados podem ser fundidos a sequências polipeptídicas heterólogas aqui descritas ou de outra forma conhecidas no estado da técnica para facilitar a purificação. 5.8 Produção Escalável de Anticorpos
Num esforço para obter grandes quantidades, os anticorpos aqui descritos podem ser produzidos por um processo dimensionável (daqui em diante referido como "processo escalável aqui descrito"). Em algumas formas de realização, anticorpos podem ser produzidos por um processo escalável aqui descrito no laboratório de investigação que pode ser escalável para produzir os anticorpos aqui descritos em bioreatores à escala analítica (por exemplo, mas não estando limitados a biorreatores de 5L, 10L, 15L, 30L, ou 50L). Noutras formas de realização, os anticorpos podem ser produzidos por um processo escalável aqui descrito num laboratório de investigação que pode ser escalável para produzir os anticorpos aqui descritos em biorreatores à escala de produção (por exemplo, mas não estando limitados a biorreatores de 75L, 100L, 150L, 300L, ou 500L). Em algumas formas de realização, o processo escalável aqui descrito resulta numa pequena ou mesmo nenhuma diminuição na eficiência de produção comparativamente com o processo de produção realizado num laboratório de investigação. Noutras formas de realização, o processo escalável aqui descrito produz anticorpos a uma eficiência de produção de cerca de 10 mg/L, cerca de 20 mg/L, cerca de 30 mg/L, cerca de 50 mg/L, cerca de 75 mg/L, cerca de 100 mg/ L, cerca de 125 mg/L, cerca de 150 mg/L, cerca de 175 mg/L, cerca de 200 mg/L, cerca de 250 mg/L, cerca de 300 mg/L ou mais elevada. Noutras formas de realização, proteínas de fusão podem ser produzidas pelos processos escaláveis aqui descritos.
Noutras formas de realização, o processo escalável aqui descrito produz anticorpos a uma eficiência de produção de pelo menos cerca de 10 mg/L, pelo menos cerca de 20 mg/L, pelo menos cerca de 30 mg/L, pelo menos cerca de 50 mg/L, pelo menos cerca de 75 mg/L, pelo menos cerca de 100 mg/L, pelo menos cerca de 125 mg/L, pelo menos cerca de 150 mg/L, pelo menos cerca de 175 mg/L, pelo menos cerca de 200 mg/L, pelo menos cerca de 250 mg/L, pelo menos cerca de 300 mg/L ou superior.
Noutras formas de realização, o processo escalável aqui descrito produz anticorpos a uma eficiência de produção desde cerca de 10 mg/L até cerca de 300 mg/L, desde cerca de 10 mg/L até cerca de 250 mg/L, desde cerca de 10 mg/L até cerca de 200 mg/L, desde cerca de 10 mg/L até cerca de 175 mg/L, desde cerca de 10 mg/L até cerca de 150 mg/L, desde cerca de 10 mg/L até cerca de 100 mg/L, desde cerca de 20 mg/L até cerca de 300 mg/L, desde cerca de 20 mg/L até cerca de 250 mg/L, desde cerca de 20 mg/L até cerca de 200 mg/L, desde cerca de 20 mg/L até cerca de 175 mg/L, desde cerca de 20 mg/L até cerca de 150 mg/L, desde cerca de 2 0 mg/L até cerca de 125 mg/L, desde cerca de 2 0 mg/L até cerca de 100 mg/L, desde cerca de 30 mg/L até cerca de 300 mg/L, desde cerca de 30 mg/L até cerca de 250 mg/L, desde cerca de 30 mg/L até cerca de 200 mg/L, desde cerca de 30 mg/L até cerca de 175 mg/L, desde cerca de 30 mg/L até cerca de 150 mg/L, desde cerca de 30 mg/L até cerca de 125 mg/L, desde cerca de 30 mg/L até cerca de 100 mg/L, desde cerca de 50 mg/L até cerca de 300 mg/L, desde cerca de 50 mg/L até cerca de 250 mg/L, desde cerca de 50 mg/L até cerca de 200 mg/L, desde cerca de 50 mg/L até cerca de 175 mg/L, desde cerca de 50 mg/L até cerca de 150 mg/L, desde cerca de 50 mg/L até cerca de 125 mg/L, ou desde cerca de 50 mg/L até cerca de 100 mg/L. 5.8.1 Métodos Adicionais de Produção de Anticorpos
Uma região Fc charneira de um anticorpo aqui descrito pode ser mutada para diminuir o tempo biológico de meia-vida do anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações aminoacidicas podem ser introduzidas no dominio CH2-CH3 da região de interface do fragmento Fc de charneira de tal forma que o anticorpo apresenta uma ligação limitada da proteina A de Stafilococos (SpA) relativamente à ligação SpA do dominio Fc de charneira nativo. Esta abordagem é adicionalmente descrita em detalhe na Patente U.S. No. 6,165,745 por Ward et al.
Um anticorpo pode ser modificado para aumentar o seu tempo de meia-vida biológico. Várias abordagens são possíveis. Por exemplo, uma ou mais das seguintes mutações podem ser introduzidas: T252L, T254S, T256F, como descrito na Patente U.S. No. 6,277,375. Noutra forma de realização, uma ou mais das seguintes mutações podem ser introduzidas: M252Y, S254T, T256E, como descrito na Patente U.S. No. 7,083,784. Alternativamente, para aumentar o tempo de meia-vida biológico, o anticorpo pode ser modificado na região CHI ou CL para conter um epitopo de ligação ao recetor salvado retirado de dois anéis de um dominio CH2 de uma região Fc de uma IgG, como descrito nas Patentes U.S. Nos. 5,869,046 e 6,121,022 por Presta et al.
Uma região Fc pode ser modificada através da substituição de pelo menos um residuo aminoacídico com um resíduo aminoacidico diferente para reduzir as funções executoras do anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoácidos selecionadas dos resíduos aminoacídicos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 e 322 podem ser substituídos com um resíduo aminoacídico diferente de tal forma que o anticorpo apresenta afinidade reduzida para um ligando executor mas retém a capacidade de ligação ao antigénio do anticorpo parental. O ligando executor cuja afinidade é reduzida pode ser, por exemplo, um recetor Fc ou a componente Cl do complemento. Esta abordagem é descrita em detalhe adicional nas Patentes U.S. Nos. 5,624,821 e 5,648,260, ambas da autoria de Winter et al.
Num outro exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados dos resíduos aminoacídicos 329, 331 e 322 podem ser substituídos com um resíduo aminoacídico diferente de tal forma que o anticorpo apresenta ligação Clq reduzida e/ou citotoxicidade dependente do complemento (CDC) reduzida ou eliminada. Esta abordagem é descrita em detalhe adicional nas Patentes U.S. Nos. 6,194,551 por Idusogie et al.
Num outro exemplo, um ou mais resíduos aminoacidicos nas posições aminoacidicas 231 e 239 são modificadas para desta forma reduzir a capacidade dos anticorpos para fixar o complemento. Esta abordagem é adicionalmente descrita na publicação PCT WO 94/29351 por Bodmer et al.
Uma região Fc de um anticorpo aqui descrito pode ser adicionalmente modificada para diminuir a capacidade do anticorpo para mediar citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou decrescer a afinidade do anticorpo para um recetor Fey através da modificação de um ou mais aminoácidos nas seguintes posições: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ou 439. Esta abordagem é adicionalmente descrita na publicação PCT WO 00/42072 por Presta.
Outra modificação de anticorpos aqui compreendida é aquela contemplada pela modificação com PEG. Um anticorpo pode ser modificado com PEG PARA, por exemplo, aumentar o tempo de meia-vida biológico (p.ex., em soro) do anticorpo. Para modificar com PEG um anticorpo, o anticorpo, ou fragmento relacionado, tipicamente é reagido com polietilenoglicol (PEG) , tais como um éster reativo ou um derivado aldeído de PEG, sob condições nas quais um ou mais grupos PEG ficam ligados ao anticorpo ou fragmento de anticorpo. Em certas circunstâncias, a modificação por PEG é realizada via uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula de PEG reativa (ou um polímero reativo solúvel em água análogo). Como aqui usado, o termo "polietilenoglicol" pretende englobar qualquer uma das formas de PEG que foram usadas para derivatizar outras proteínas, tais como mono (C1-C10)alcóxi- ou arilóxi-polietilenoglicol ou polietilenoglicol-maleimida. Em certas formas de realização, o anticorpo a ser modificado com PEG é um anticorpo glicosilado. Métodos para modificação com PEG de proteínas são conhecidos no estado da técnica e podem ser aplicados nos anticorpos aqui descritos. Ver por exemplo, EP 0 154316 by Nishimura et al. e EP 0 401 384 by Ishikawa et al.
Assim, num outro aspeto aqui descrito, as propriedades estruturais de anticorpos anti-IFNARl, por exemplo, mas não estando limitadas a 3F11, 4G5, 11E2, e 9D4, são usados para criar anticorpos anti-IFNARl estruturalmente relacionados que retêm pelo menos uma propriedade funcional de anticorpos aqui descritos, tais como a ligação a IFNAR1. Por exemplo, uma ou mais regiões CDR de 3F11, 4G5, 11E2, ou 9D4, ou mutações relacionadas, podem ser combinadas recombinantemente com regiões framework conhecidas e/ou outras CDRs para criar outros anticorpos anti-IFNARl adicionais recombinantemente produzidos, aqui descritos, como acima discutido. Outros tipos de modificações incluem aquelas descritas na secção anterior. O material inicial para o método de produção é uma ou mais das sequência VH e/ou VL aqui fornecidas, ou uma ou mais regiões CDR relacionadas. Para criar o anticorpo modificado, não é realmente necessário preparar (i.e., expressar como proteína) um anticorpo possuindo uma ou mais das sequências VH e/ou VL aqui fornecidas, ou uma ou mais regiões CDR relacionadas. Em vez disso, a informação contida nas sequências é usada como o material inicial para criar uma sequência de "segunda geração" derivada da sequência original e depois a sequência de "segunda geração" é preparada e expressa como uma proteína. 5.9 Composições
Num outro aspeto, descrevemos aqui composições contendo uma ou mais combinação de anticorpos monoclonais, ou proteínas de fusão compreendendo uma região Fc relacionada, como aqui descritas, formulada conjuntamente com um veículo. Tais composições podem incluir uma ou a combinação de (p.ex., dois ou mais) anticorpos diferentes, proteínas de fusão, immunoconjugados ou moléculas biespecíficas aqui descritos. Em algumas formas de realização, tais composições são fisiologicamente aceitáveis e como tal são adequadas para administração a um sujeito (também referidas como "composições farmacêuticas aqui descritas". Por exemplo, composições farmacêuticas aqui descritas podem compreender uma combinação de anticorpos (ou imunoconjugados ou biespecíficos) que se ligam a diferentes epítopos no antigénio alvo ou que apresentam atividades complementares.
Noutra forma de realização, composições aqui descritas podem incluir uma ou mais sais f armaceuticamente aceitáveis. Exemplos de tais sais incluem sais de adição ácidos e sais de adição alcalinos. Sais de adição ácidos incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos não-tóxicos, tais como ácido clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, brómico, iodídico, fosforos e semelhantes, assim como ácidos orgânicos não-tóxicos tais como ácidos alifáticos mono- e dicarboxílicos, ácidos alcanóicos fenil-substituídos, ácidos alcanóicos hidroxilo, ácidos aromáticos, alifáticos e ácidos sulfónicos aromáticos e semelhantes. Sais de adição alcalinos incluem aqueles derivados de metais alcalinoterrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e semelhantes, assim como de aminas orgânicas não-tóxicas, tais como N,N'-dibenziletilenediamina, N-metilglucamina, cloroprocaina, colina, dietanolamina, etilenediamina, procaína e semelhantes.
Composições aqui descritas podem também incluir um antioxidante farmaceuticamente aceitável. Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, hidrocloreto de cisterna, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e semelhantes; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como ascorbil palmitato, hidroxianisolo butilado (BHA), hidróxitolueno butilado (BHT), lecitinan, propilgalato, alfa-tocoferol, e semelhantes; e (3) agentes quelantes metálicos, tais como ácido citrico, ácido etilenediaminatetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, e semelhantes.
Exemplos de veiculos aquosos e não-aquoso adequados que podem ser empregados nas composições contempladas aqui descritas incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol, e semelhantes), e misturas adequadas relacionadas, óleos vegetais, tais como azeite, e ésteres orgânicos injetáveis, tais como etil oleato. Uma fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, através do uso de materiais de revestimento, tais como lecitina, mantendo o tamanho de partícula requerido no caso de dispersões, e através do uso de surfatantes.
Composições aqui descritas podem também conter adjuvantes tais como preservativos, agentes hidratantes, agentes emulsionantes e agentes dispersantes. Prevenção da presença de micro-organismos pode ser assegurada tanto por procedimentos de esterilização como por inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, e semelhantes. Pode também ser desejável a inclusão de agentes isotónicos, tais como açúcares, cloreto de sódio, e semelhantes nas composições. Adicionalmente, absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser feita através da inclusão de agentes que retardam a absorção tais como monoestearato de alumínio e gelatina.
Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções aquosas esterilizadas ou dispersões e pós esterilizados para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis esterilizadas. 0 uso de tais meios e agentes para substancias farmaceuticamente ativas é conhecido no estado da técnica. Exceto quando qualquer meio ou agente convencional for incompatível com o composto ativo, o uso relacionado em composições farmacêuticas aqui descritas está contemplado. Compostos ativos suplementares podem também ser incorporados nas composições. Composições terapêuticas deverão ser tipicamente estéreis e estáveis sob as condições de produção e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossomas, ou outras estruturas ordenadas adequadas para uma elevada concentração de fármaco. 0 veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, e polietilenoglicol liquido, e semelhantes), e misturas relacionadas adequadas. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, através do uso de de um revestimento tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e através do uso de surfatantes. Em muitos casos, será adequado a inclusão de agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. Absorção prolongada das composições injetáveis pode ser obtida através da inclusão na composição de um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.
Soluções injetáveis esterilizadas podem ser preparadas através da incorporação do composto ativo na quantidade desejada num solvente apropriado com uma ou mais combinação de ingredientes acima enumerados, como requerido, seguida por esterilização via microfiltração. Geralmente, dispersões são preparadas através da incorporação do composto ativo num veiculo esterilizado que contém um meio de dispersão básico e outros ingredientes requeridos daqueles acima enunciados. No caso de pós esterilizados para a preparação de soluções injetáveis esterilizadas, os métodos preferenciais de preparação são a secagem por vácuo e a secagem por congelamento (liofilização) que produz um pó do ingrediente ativo além de outro qualquer ingrediente desejado adicional de uma solução esterilizada previamente filtrada.
Numa forma de realização, composições (p.ex., formulações liquidas) aqui descritas são formulações apirogénicas que se encontram substancialmente desprovidas de endotoxinas e/ou substâncias pirogénicas relacionas. Endotoxinsa incluem toxinas que são confinadas no interior de um microorganismo e são libertadas quando os micro-organismos morrem ou são degradados. Substâncias pirogénicas também incluem substâncias indutoras de febre, termoestáveis (glicoproteinas) da membrana exterior de bactérias e outros micro-organismos. Ambas essas substâncias causam febre, hipotensão e choque se administradas a humanos. Devido aos potenciais efeitos prejudiciais, é vantajoso remover até pequenas quantidades de endotoxinas de soluções de fármacos administradas intravenosamente. A "Food & Drug Administration" ("FDA") definiu um limite superior de 5 unidades de endotoxinas (EU) por dose por quilograma de peso corporal num periodo de uma hora para aplicações de fármacos intravenosas (The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000)). Quando proteínas terapêuticas são administradas em quantidades de várias centenas ou milhares de miligramas por quilograma de peso corporal, como pode ser o caso com anticorpos monoclonais, é vantajosa a remoção até de vestígios de endotoxina. Os níveis de endotoxinas e substâncias pirogénicas na composição são preferencialmente menores do que 10 EU/mg, ou menores do que 5 EU/mg, ou menores do que 1 EU/mg, ou menores do que 0,1 EU/mg, ou menores do que 0,01 EU/mg, ou menores do que 0,001 EU/mg. Os níveis de endotoxinas e substâncias pirogénicas na composição podem ser menores do que cerca de 10 EU/mg, ou menores do que cerca de 5 EU/mg, ou menores do que cerca de 1 EU/mg, ou menores do que cerca de 0,1 EU/mg, ou menores do que cerca de 0,01 EU/mg, ou menores do que cerca de 0,001 EU/mg. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material veículo para produzir uma única forma de dosagem irá variar dependendo do sujeito a ser tratado, e o modo particular de administração. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com o material veículo para produzir uma única forma de dosagem irá geralmente ser a quantidade da composição que produz um efeito terapêutico. Geralmente, dentro de uma centena por cento, esta quantidade irá variar desde cerca de 0,01 por cento até cerca de noventa e nove por cento de ingrediente ativo, também desde cerca de 0,1 por cento até cerca de 70 por cento, também desde cerca de 1 por cento até cerca de 30 percentagem de ingrediente ativo em combinação com um veiculo farmaceuticamente aceitável.
Regimes de dosagem são ajustados para fornecer uma resposta ótima desejada (p.ex., uma resposta terapêutica). Por exemplo, um bolo único pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso a formulação de composições parentéricas em formas de dosagem unitárias para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma de dosagem unitária como aqui usada refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os sujeitos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade pré-determinada de composto ativo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veiculo farmaceuticamente aceitável. A especificação para as formas de dosagem unitárias aqui descritas são ditadas por e diretamente dependentes de (a) as características únicas do composto ativo e o efeito terapêutico particular a ser atingido, e (b) as limitações inerentes ao estado da técnica de formulação de um composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.
Para administração de um anticorpo, a dose varia desde cerca de 0,0001 al00 mg/kg, e mais usualmente de 0,01 a 5 mg/kg, do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo as dosagens podem ser de 0,3 mg/kg peso corporal, 1 mg/kg peso corporal, 3 mg/kg peso corporal, 5 mg/kg peso corporal ou 10 mg/kg peso corporal ou encontrando-se na gama de 1-10 mg/kg. Um regime de tratamento pode implicar a administração uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada 4 semanas, uma vez por mês, uma vez a cada 3 meses ou uma vez a cada 3 a 6 meses. Os regimes de dosagem para um anticorpo anti-IFNARl aqui descritos incluem 1 mg/kg peso corporal ou 3 mg/kg peso corporal via administração intravenosa, com o anticorpo a ser fornecido usando um dos seguintes regimes de dosagem: (i) a cada 4 semanas para 6 dosagens, depois a cada 3 meses; (ii) a cada 3 semanas; (iii) 3 mg/kg peso corporal uma vez seguida por 1 mg/kg peso corporal a cada 3 semanas.
Alternativamente, um anticorpo ou proteina de fusão pode ser administrada como uma formulação de libertação controlada, no caso de uma administração menos frequente ser requerida. A dosagem e frequência de dosagem variam consoante o tempo de meia-vida do anticorpo no paciente. Em geral, anticorpos humanos apresenta o tempo de meia-vida mais longo, seguidos por anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, e anticorpos não-humanos. A dosagem e frequência de administração podem variar dependendo se o tratamento é profilático ou terapêutico. Para aplicações profiláticas, uma dosagem relativamente baixa é administrada a intervalos relativamente pouco frequentes durante um longo periodo de tempo. Alguns pacientes continuam a receber tratamento para o resto das suas vidas. Para aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente elevada a intervalos relativamente curtos é algumas vezes requerida até que a progressão da doença seja reduzida ou terminada, e usualmente até que p paciente apresente uma melhoria parcial ou completa dos sintomas da doença. Imediatamente depois, o paciente pode ser administrado num regime profilático. Níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas aqui descritas pode ser variado de forma a obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz no alcance da resposta terapêutica desejada para um paciente particular, composição, e modo de administração, sem ser tóxica para o paciente. 0 nivel de dosagem selecionado irá depender de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a atividade das composições particulares empregadas, ou do éster, sal ou amida relacionada, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular a ser empregado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares empregadas, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e historial médico anterior do paciente a ser tratado, e fatores semelhantes bem conhecidos do estado da técnica médica.
Uma dose terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-IFNAR1 aqui descrito resulta num decréscimo da gravidade dos sintomas da doença, um aumento na frequência e duração dos períodos livre de sintomas da doença, ou uma prevenção da limitação ou incapacidade devidas ao sofrimento da doença. No caso de, por exemplo, Lúpus Eritematoso Sistémico (SLE), uma dose terapeuticamente eficaz pode prevenir adicionalmente a deterioração dos sintomas físicos associados com SLE tais como, por exemplo, dor, fadiga ou fraqueza. Uma dose terapeuticamente eficaz pode também prevenir ou retardar o início de SLE, tal como pode ser desejado quando sinais precoces ou preliminares da doença estão presentes. Da mesma forma inclui o retardamento da progressão crónica associada com SLE. Testes de laboratório utilizados no diagnóstico de SLE incluem testes quimicos, hematológicos, serológicos e radiológicos. Concordantemente, qualquer ensaio clínico ou bioquímico monitoriza se um tratamento particular é uma dose terapeuticamente eficaz para o tratamento de SLE. Qualquer pessoa rotineiramente habilitada no estado da técnica será capaz de determinar tais quantidades com base em tais fatores como o tamanho do sujeito, a gravidade dos sintomas do sujeito, e a composição particular ou a via de administração selecionada. A composição aqui descrita pode ser administrada via uma ou mais vias de administração usando uma ou mais métodos conhecidos no estado da técnica. Como será apreciado por alguém habilitado no estado da técnica, a via e/ou modo de administração irá variar dependendo dos resultados desejados. Vias de administração selecionadas para anticorpos aqui descritos incluem a via intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutânea, espinal ou outras vias de administração parentéricas, por exemplo por injeção ou infusão. Administração parentérica pode representar modos de administração diferentes que a administração entérica e tópica, usualmente por injeção, e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaraquinóide, intraespinal, epidural e intrasternal.
Alternativamente, um anticorpo aqui descrito pode ser administrado via uma via não-parentérica, tais como a via de administração tópica, epidérmica ou mucosal, por exemplo, intranasalmente, oralmente, vaginalmente, rectalmente, sublingualmente ou topicamente.
Os compostos ativos podem ser preparados com veículos que protegem o composto contra uma libertação rápida, tais como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes, pensos transdérmicos, e sistemas de entrega microencapsulados. Polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser usados tais como etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres, e ácido poliláctico. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são patenteados ou geralmente conhecidos por aqueles habilitados no estado da técnica. Ver, p.ex., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
Composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, uma composição terapêutica aqui descrita pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmico sem agulha, tal como os dispositivos divulgados nas Patentes U.S. Nos. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; ou 4,596,556. Exemplos de implantes bem-conhecidos e módulos úteis na presente invenção incluem: Patente U.S. No. 4,487,603, que divulga uma bomba de micro-infusão implantável para dispensa de medicação a uma velocidade controlada; Patente U.S. No. 4,486,194, que divulga um dispositivo terapêutico para a administração de medicamentos através da pele; Patente U.S. No. 4,447,233, que divulga uma bomba de infusão de medicação para a entrega de medicação a uma velocidade de infusão precisa; Patente U.S. No. 4,447,224, que divulga um aparelho de infusão implantável com fluxo variável para a entrega contínua de fármaco; Patente U.S. No. 4,439,196, que divulga um sistema de entrega de fármaco osmótico possuindo compartimentos multicâmara; e Patente U.S. No. 4,475,196, que divulga um sistema de entrega de fármaco osmótico. Muitos outros implantes, sistemas de libertação, e módulos são conhecidos por aqueles habilitados no estado da técnica.
Anticorpos aqui descritos podem ser formulados para assegurar uma distribuição apropriada in vivo. Por exemplo, a barreira hematoencefálica (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrofilicos. Para assegurar que os compostos terapêuticos aqui descritos atravessam a BBB (se desejado), eles podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para métodos de produção de lipossomas, ver, p.ex., Patentes U. S. 4,522,811; 5,374,548; e 5,399,331. Os lipossomas podem compreender uma ou mais frações que são seletivamente transportadas para células ou órgãos específicos, assim aumentando a entrega do direcionada do fármaco (ver, p.ex., V. V. Ranade (1989) 1. Clin. Pharmacol. 29:685). Frações de direcionamento exemplificativas incluem folato ou biotina (ver, p.ex., Patente U.S. 5,416,016 a Low et al.); manosídeos (Umezawa et al. , (1988) Biochem. Biophys. Res.
Commun. 153:1038); anticorpos (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); recetor A proteína surfactante (Briscoe et ai. (1995) Am. 1. Physiol. 1233:134); pl20 (Schreier et al. (1994) 1. Biol. Chem. 269:9090); ver também K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Lmmunomethods 4:273. 5.10 Usos para Diagnóstico
Noutras formas de realização, os anticorpos aqui descritos possuem utilidades in vitro e in vivo de diagnóstico e terapêuticas. Por exemplo, estas moléculas podem ser administradas a células em cultura, p.ex. in vitro ou ex vivo, ou num sujeito, p.ex., in vivo, para tratar, prevenir ou diagnosticar uma variedade de distúrbios.
Anticorpos aqui descritos podem ser usados para detetar niveis de IFNAR1, ou níveis de células que expressam IFNAR1. Isto pode ser conseguido, por exemplo, através do contacto de uma amostra (tal como uma amostra in vitro) e uma amostra de controlo com o anticorpo anti-IFNARl sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo e IFNAR1. Quaisquer complexos formados entre o anticorpo e IFNAR1 são detetados e comparados na amostra e no controlo. Por exemplo, métodos de deteção estandardizados, bem conhecidos do estado da técnica, tais como ELISA e ensaios citométricos de fluxo, podem ser realizados usando as composições aqui descritas.
Concordantemente, descrevemos aqui métodos para a deteção da presença de IFNAR1 (p.ex., antigénio IFNAR1 humano) numa amostra, ou medição da quantidade de IFNAR1, compreendendo o contacto da amostra, e uma amostra de controlo, com anticorpos aqui descritos, ou uma porção de ligação ao antigénio relacionada, com ligação especifica para IFNAR1, sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo ou porção relacionada e IFNAR1. A formação de um complexo é então detetada, onde a diferença na formação de complexo entre a amostra comparativamente com a amostra de controlo é indicativa da presença de IFNAR1 na amostra. 5.11 Aplicações Terapêuticas IFNAR1 faz parte do recetor celular para Interferões do Tipo 1, e Interferões do Tipo 1 são conhecidos por serem citocinas imunoreguladoras que estão envolvidas na diferenciação de células T, produção de anticorpos e sobrevivência de células T de memória. Adicionalmente, a expressão aumentada de Interferões do Tipo 1 foi descrita em numerosas doenças autoimunes, na infeção HIV, na rejeição de transplantes e na doença de enxerto versus hospedeiro (GVHD). Concordantemente, os anticorpos anti-IFNAR1 aqui descritos ou fragmentos relacionados, que inibem a atividade funcional de Interferões do Tipo 1, podem ser usados numa variedade de indicações clinicas envolvendo atividade aberrante e indesejada de Interferão Tipo 1. Descrevemos aqui métodos de prevenção, tratamento, manutenção, melhoramento, ou inibição de uma doença ou distúrbio mediados por Interferão Tipo 1, onde os métodos compreendem a administração de anticorpos, ou porções de ligação ao antigénio relacionadas, como aqui descritos.
Exemplos específicos de condições autoimunes nas quais os anticorpos aqui descritos podem ser usados incluem, mas não estão limitadas a, aos seguintes: lúpus eritematoso sistémico (SLE), diabetes mellitus dependente de insulina (IDDM), doença inflamatória do intestino (IBD) (incluindo doença de Crohn, Colite ulcerosa e Doença celíaca), esclerose múltipla (MS), psoríase, tiroidite autoimune, artrite reumatoide (RA) e glomerulonefrite. Adicionalmente, as composições de anticorpo aqui descritas podem ser usadas para inibição ou prevenção da rejeição a transplantes ou no tratamento de doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD) ou no tratamento de infeção HIV/SIDA.
Elevados níveis de IFNa foram observados no soro de pacientes com lúpus eritematoso sistémico (SLE) (ver p.ex., Kim et al. (1987) Clin. Exp. Immunol. 70:562-569). Adicionalmente, administração de IFNa, por exemplo no tratamento de cancro ou infeções víricas, foi demonstrado como induzindo SLE (Garcia-Porrua et al. (1998) Clin. Exp.
Rheumatol. 16:107- 108). Concordantemente, os anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem ser usados no tratamento de SLE através da administração do anticorpo a um sujeito com sua necessidade do tratamento.
Outros métodos de tratamento de SLE são descritos nos Pedidos de Patente U.S. intitulados "Métodos de tratamento de SLE" com os seguintes números de referência; 60/907,767, preenchida a 16 de abril, 2007 e 60/966,174, preenchida a 5 de novembro, 2007. IFNa tem sido também implicado na patologia de diabetes Tipo 1. Por exemplo, a presença de IFNa imunoreativo em células beta pancreáticas de pacientes de diabetes Tipo 1 foi reportada (Foulis et al. (1987) Lancet 2: 1423-1427). Uso prolongado de IFNa em terapia antivirica foi também demonstrada como induzindo diabetes Tipo 1 (Waguri et al. (1994) Diabetes Res. Clin. Pract. 23:33-36). Concordantemente, os anticorpos anti-IFNARl ou fragmentos relacionados aqui descritos podem ser usados no tratamento de Diabetes Tipo 1 através da administração do anticorpo a um sujeito com sua necessidade do tratamento. O anticorpo pode ser usado isoladamente ou em combinação com outros agentes antidiabéticos, tais como insulina.
Anticorpos para IFNAR1 foram demonstrados como sendo eficazes num modelo animal da doença inflamatória do intestino (ver Pedido de Patente U.S. 60/465,155). Assim, os anticorpos anti-IFNARl ou fragmentos relacionados aqui descritos podem ser usados no tratamento de doença inflamatória do intestino (IBD), incluindo Colite ulcerosa e doença de Crohn, através da administração do anticorpo a um sujeito com sua necessidade do tratamento.
Tratamento com IFNa foi também observado como induzindo tiroidite autoimune (Monzani et al. (2004) Clin. Exp. Med. 3:199-210; Prummel and Laurberg (2003) Thyroid 13:547-551). Concordantemente, os anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem ser usados no tratamento de doenças da tiroide autoimunes, incluindo hipotiroidismo primário autoimune, Doença de Graves, tiroidite de Hashimoto e tiroidite destrutiva com hipotiroidismo, através da administração de um anticorpo aqui descrito a um sujeito com sua necessidade do tratamento. Anticorpos aqui descritos podem ser usados isoladamente ou em combinação com outros agents ou tratamentos, tais como fármacos antitiroide, iodo radioativo e tiroidectomia subtotal.
Elevados niveis de IFNa foram também observados na circulação sanguínea de pacientes com infeção HIV e a sua presença é um indicador previdente da progressão de SIDA (DeStefano et al. (1982) 1. Infec. Disease 146:451; Vadhan-Raj et al. (1986) Cancer Res. 46:417). Assim, anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem ser usados no tratamento de Infeção HIV ou SIDA através da administração do anticorpo aqui descrito a um sujeito com sua necessidade do tratamento. Anticorpos aqui descritos podem ser usados isoladamente ou em combinação com outros agentes anti-HIV, tais como inibidores da transcriptase reversa de nucleósidos, inibidores da transcriptase reversa de não-nucleósidos, inibidores da protease e inibidores de fusão.
Anticorpos para IFNAR1 foram demonstrados como sendo eficazes na inibição da rejeição de aloenxertos e o prolongamento da sobrevivência de aloenxertos (ver p.ex., Tovey et al. (1996) 1. Leukoc. Biol. 59:512-517; Benizri et al. (1998) 1. Interferon Cytokine Res. 18:273-284). Concordantemente, os anticorpos anti-IFNARl aqui descritos podem também ser usados em recetores de transplante para inibir a rejeição de aloenxertos e/ou prolongamento da sobrevivência de aloenxertos. Descrevemos aqui um método de inibição da rejeição a transplantes através da administração de anticorpos anti-IFNARl aqui descritos a um recetor de transplante com sua necessidade de tratamento. Exemplos de transplantes tecidulares que podem ser tratados incluem, mas não estão limitados a, figado, pulmão, rim, cabeça, intestino delgado, 4 células dos ilhéus pancreáticos, assim como o tratamento de doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD). Anticorpos aqui descritos podem ser usados isoladamente ou em combinação com outros agentes para a inibição da rejeição a transplantes, tais como agentes imunosupressores (p.ex., ciclosporina, azatioprina, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, micofenolato mofetil, sirilimus, rapamicina, tacrolimus), agentes anti-infeciosos (p.ex., aciclovir, clotrimazolo, ganciclovir, nistatina, trimetoprimsulfametoxazolo) , diuréticos (p.ex., bumetanida, furosemida, metolazona) e medicações para úlceras (p.ex., cimetidina, famotidina, lansoprazolo, omeprazolo, ranitidina, sucralfato).
Descrevemos aqui métodos de administração e usando composições e anticorpos aqui descritos para tratar e prevenir uma grande gama de condições inflamatórias incluindo condições crónicas e agudas, tais como, mas não estando limitadas a, apendicite, úlceras pépticas, gástricas e duodenais, peritonite, pancreatite, colite ulcerativa, pseudomembranosa, aguda e isquémica, diverticulite, epiglotitr, acalasia, colangite, colecistite, hepatite, doença de Crohn, enterite, doença de Whipple, asma, alergia, choque anafilático, doença do complexo imunológico, isquémia de órgãos, lesão provocada por reperfusão, necrose de órgãos, febre do feno, sepsia, septicémia, choque endotóxico, caquéxia, hiperpirexia, granuloma esosinófilico, granulomatose, sarcoidose, aborto séptico, epididimite, vaginite, prostatite, uretrite, bronchite, enfisema, rinite, fibrose cística, pneumonite, pneumoultramicroscopicosilicovolcanoconiose, alveolite, bronquiolite, faringite, pleurisia, sinusite, influenza, infeção vírica sincitial respiratória, infeção pelo vírus herpes, Infeção HIV, infeção pelo vírus da hepatite B, infeção pelo vírus da hepatite C, bacteriemia disseminada, febre de Dengue, candidíase, malária, filariase, amebiase, Equinococose, queimaduras, dermatite, dermatomiosite, queimadura solar, urticária, verrugas, alergia, vasulite, angite, endocardite, arterite, aterosclerose, tromboflebite, pericardite, miocardite, isquemia miocardíaca, periarterite nodosa, febre reumática, doença de Alzheimer', doença celíaca, insuficiência cardíaca congestiva, restenose, COPD, síndrome do desconforto respiratório do adulto, meningite, encefalite, esclerose múltipla, enfarte cerebral, embolismo cerebral, síndrome de Guillain-Barre, neurite, neuralgia, lesão na espinal medula, paralisia, uveite, artrite, artralgia, osteomielite, fascite, doença de Paget, gota, doença periodontal, artrite reumatoide, sinovite, miastenia grave, tiroidite, lúpus eritematoso sistémico, síndrome de Goodpasture, síndrome de Behçet, rejeição alográfica, doença enxerto versus hospedeiro, Diabetes Tipo 1, espondilite anquilosante, doença de Berger, doença de Retier, e doença de Hodgkin.
Noutra forma de realização, métodos de administração e composições de anticorpos aqui descritos podem ser úteis na prevenção, tratamento, melhoramento de sintomas associados com as seguintes condições ou estádios de doenças: doença de Graves, tiroidite de Hashimoto, doença de Crohn, psoríase, artrite psoriática, oftalmia simpática, ovarite autoimune, orquite autoimune, síndrome linfoproliferativa autoimune, síndrome dos anticorpos antifosfolipídicos, síndrome de Sjogren, esclerodermia, doença de Addison, poliendocrinopatia autoimune, síndrome de Guillain-Barre, púrpura trombocitopénica idiopática, anemia perniciosa, miastenia grave, cirrose biliar primária, doença mista do tecido conjuntivo, vitiligo, uveíte autoimune, anemia hemolítica autoimune, trombocitopenia autoimune, doença celíaca, dermatite herpetiforme, hepatite autoimune, penfigo, penfigo vulgar, penfigo foliáceo, penfigóide bulhoso, miocardite autoimune, vasculite autoimune, alopecia areata, aterosclerose autoimune, doença de Behçet, mielopatia autoimune, hemofilia autoimune, cistite intersticial autoimune, diabetes insipidus autoimune, endometriose autoimune, policondrite recidivante, espondilite anquilosante, urticária autoimune, dermatomiosite, síndrome de Miller-Fisher, nefropatia IgA, síndrome de Goodpasture, e penfigóide gestacional.
Noutra forma de realização, métodos de administração e composições de anticorpos aqui descritos podem ser úteis na prevenção, tratamento, melhoramento de sintomas associados com síndrome de Sjogren. 0 síndrome de Sjogren é um distúrbio autoimune no qual células imunitárias ataquam e destroem as glândulas exócrinas que produzem lágrima e saliva. 0 seu nome provém do oftalmologista sueco Henrik Sjogren (1899-1986), que primeiramente descobriu a doença. 0 síndrome de Sjogren encontra-se também associado com distúrbios reumáticos tais como artrite reumatoide, e é um fator positivo da presença de artrite reumatoide em 90 por cento dos casos. Os sintomas característicos do distúrbio são a boca seca e os olhos secos. Adicionalmente, o síndrome de Sjogren pode causar secura epidérmica, nasal e vaginal, e pode afetar outros órgãos do corpo, incluindo os rins, vasos sanguíneos, pulmões, fígado, pâncreas e cérebro. Nove em cada dez pacientes de síndrome de Sjogren são mulheres e a idade média de inicio da doença é nos 40s tardios, embora o sindrome de Sjogren ocorre em todos os grupos etários tanto em mulheres como em homens. É estimado que ataque tanto quanto 4 milhões de pessoas nos Estados Unidos apenas tornando-a a segunda doença reumática autoimune mais comum.
Miosite é uma condição geral caracterizada por inflamação do músculo esquelético ou músculo voluntário. AA inflamação do músculo pode ser causada por uma reação alérgica, exposição a uma substância tóxica ou medicamente, outras doenças tais como condições de cancro ou reumatismo, ou um virus ou outro agente infecioso. As miopatias inflamatórias crónicas são idiopáticas, significando que não possuem nenhuma causa conhecida. Elas são entendidas como distúrbios autoimunes, nos quais os glóbulos brancos do organismo (que normalmente combatem a doença) atacam os vasos sanguíneos, fibras musculares normais, e tecido conjuntivo em órgãos, ossos e articulações.
Polimiosite afeta os músculos esqueléticos (envolvidos na produção de movimento) em ambos os lados do organismo. É raramente observada em pessoas com idade inferior a 18 anos; a maioria dos casos encontra-se em pacientes com idades compreendidas entre os 31 e 60. Adicionalmente aos sintomas acima listados, a progressiva fraqueza muscular leva a dificuldades em engolir, falar, erguer-se de uma posição sentada, subir escadas, levantar objetos, ou chegar a alvos acima da cabeça. Pacientes como polimiosite podem também experienciar artrite, respiração ofegante, e arritmias cardíacas.
Dermatomiosite é caracterizada por uma erupção cutânea que precede ou acompanha uma progressiva fraqueza muscular. A erupção aparenta ser irregular, com descolorações azuis-violeta ou vermelhas, e caracteristicamente desenvolve-se nas pálpebras e em músculos usados para estender ou fortalecer articulações, incluindo as articulações da mão, ombros, calcanhares, e articulações dos pés. Erupções cutâneas de cor vermelha podem também ocorrer na face, pescoço, ombros, peito superior, costas, e outras localizações, e pode significar uma inflamação nas áreas afetadas. A erupção cutânea algumas vezes ocorre sem envolvimento muscular óbvio. Adultos com dermatomiosite podem experienciar perda de peso ou febre de baixo grau, apresentam pulmões inflamados, e são sensíveis à luz. Dermatomiosite adulta, ao contrário de polimiosite, pode acompanhar tumores no peito, pulmão, genitália feminina, ou intestino. Crianças e adultos com dermatomiosite podem desenvolver depósitos de cálcio, que aparecem sob a forma de calosidades duras sob a pele ou no músculo (também chamada de calcinose). A calcinose muitas vezes ocorre 1-3 anos após o início da doença mas pode ocorrer muitos anos depois. Estes depósitos são vistos mais usualmente em dermatomiosite juvenil do que em dermatomiosite que se inicia na vida adulta. A dermatomiosite pode ser associada com doenças colagénio-vasculares ou autoimunes.
Miosite por corpúsculos de inclusão (IBM) é caracterizada por progressiva fraqueza muscular e desperdício. IBM é semelhante a polimiosite mas apresenta as suas propriedades distintivas próprias. 0 início da fraqueza muscular é geralmente gradual (ao longo de meses ou anos) e afeta ambos os músculos proximal e distai. A fraqueza muscular pode afetar apenas um lado do corpo. Pequenos orifícios chamados vacúolos são visíveis nas células de fibras musculares afetadas. As quedas e tropeções são usualmente os primeiros sintomas visiveis de IBM. Para alguns pacientes, o distúrbio inicia-se com a fraqueza nos pulos e dedos que causa dificuldades em apertar, abotoar e agarrar objetos. Pode ocorrer fraqueza do pulso e dos músculos dos dedos da mão e sua atrofia (estreitamente ou perda de massa muscular) dos músculos dos antebraços e dos músculos do quadriceps nas pernas. A dificuldade em engolir ocorre em aproximadamente metade dos casos de IBM. Sintomas da doença usualmente iniciam-se após a idade de 50 anos, embora a doença possa ocorrer mais precocemente. Ao contrário de polimiosite e dermatomiosite, IBM ocorre mais frequentemente em homens. A miosite juvenil apresenta algumas semelhanças com a dermatiomiosite e polimiosite adulta. Tipicamente afeta crianças com idades compreendidas entre os 2 e 15 anos, com sintomas que incluem fraqueza e inflamação muscular proximal, edema (um conjunto anormal de fluidos em tecidos corporais que causam inflamação), dor muscular, fadiga, erupções cutâneas, dor abdominal, febre e contracturas (encurtamento crónico de músculos e tendões em redor das articulações, causada por inflamação dos tendões dos músculos, que previne que as articulações se movam livremente). Crianças com miosite juvenil podem também apresentar dificuldade em engolir e respirar, e o coração pode ser afetado. Aproximadamente 20 a 30 percentagem de crianças com dermatomiosite juvenil desenvolvem calcinose. Pacientes juvenis podem apresentar níveis não mais elevados do que os normais da enzima muscular creatinina cinase no sangue mas apresentam níveis mais elevados de outras enzimas musculares.
Anticorpos aqui descritos podem ser úteis na prevenção, tratamento, ou melhoramento de miosite, miosite inflamatória, miosite idiopática, polimiosite, dermatomiosite, Miosite por corpúsculos de inclusão (IBM), miosite juvenil ou sintomas associados com essas condições.
Anticorpos aqui descritos podem ser úteis na prevenção, tratamento, ou melhoramento de sintomas associados com vasculite.
Anticorpos aqui descritos podem ser úteis para o tratamento de esclerodermia. Métodos de tratamento de esclerodermia são descritos no Pedido de Patente U.S. intitulado "Métodos de tratamento de esclerodermia" com o número de referência de 60/996,175, preenchida a 5 de novembro, 2007 e Pedido PCT No. PCT/US2008/82481 (WO 2009/061818).
Anticorpos aqui descritos podem ser úteis na prevenção, tratamento, ou melhoramento de sintomas associados com sarcoidose. Sarcoidose (também designada por sarcoide ou doença de Besnier-Boeck) é um distúrbio do sistema imunitário caracterizado por granulomas não-necrotizantes (pequenos nódulos inflamatórios). Virtualmente qualquer órgão pode ser afetado; contudo, granulomas muitas vezes aprecem nos pulmões ou nos nódulos linfáticos. Sintomas podem muitas vezes ocorrer nos pulmões ou nos nódulos linfáticos. Sintomas podem ocasionalmente aparecer subitamente mas usualmente aparecem gradualmente. Quando observado raios-X dos pulmões, a sarcoidose pode apresentar a aparência de tuberculose ou linfoma.
Também aqui descritos estão kits compreendendo as composições (p.ex., anticorpos anti-IFNARl) aqui descritos e instruções para uso. O kit pode adicionalmente conter pelo menos um reagente adicional, ou um ou mais anticorpos adicionais aqui descritos (p.ex., um anticorpo possuindo uma atividade complementar que se liga a um epítopo no antigénio-alvo diferente do primeiro anticorpo). Os kits tipicamente incluem uma marcação indicando o uso pretendido para os conteúdos do kit. 0 termo "marcação" inclui qualquer indicação escrita, ou material gravado suplementado com o kit, ou que de alguma forma acompanha o kit. 5,12 Combinações
Composições aqui descritas podem também ser administradas terapias de combinação, tais como, combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir um anticorpo anti-IFNARl aqui descritos combinado com pelo menos um outro imunosupressor.
Nalguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais com diferentes especificidades de ligação são administrados simultaneamente, nos quais a dosagem de cada anticorpo administrado se encontra dentro das gamas indicadas. 0 anticorpo é usualmente administrado em múltiplas ocasiões. Intervalos entre dosagens isoladas podem ser, por exemplo, semanais, mensais, trimestrais ou anuais. Os intervalos podem também ser irregulares como indicado pela medição dos niveis sanguíneos de anticorpos para o antigénio-alvo no paciente. Nalguns métodos, a dosagem é ajustada para alcançar uma concentração de anticorpo no plasma de cerca de 1-1000 ]ig/ml e nalguns métodos cerca de 25-300 pg/ml.
Quando os anticorpos para IFNAR1 são administrados conjuntamente com outro agente, os dois podem ser administrados em qualquer oidem ou simultaneamente. Por exemplo, um anticorpo anti-IFNARl aqui descrito pode ser usado em combinação com um ou mais dos seguintes agentes: fármacos contendo mesalamina (incluindo sulfasalazina e outros agentes contendo ácido 5-aminosalicílico (5-ASA), tais como olsalazina e balsalazida), fármacos anti-inflamatórios não-esteroides (NSSIDA), analgésicos, corticosteroides (p.ex., predinisona, hidrocortisona), inibidores de TNF (incluindo adalimumab (HUMIRA®), etanercept (ENBREL®) e infliximab (REMICADE®)), immunosuppressores (tais como 6-mercaptopurina, azatioprina e ciclosporina A), e antibióticos anticorpo anti-IFNa, anticorpo antirrecetor IFNy, recetor IFNy solúvel. Adicionalmente, um anticorpo anti-IFNARl pode ser usado em combinação com um antagonista do ligando FIt3 (ver p.ex., Pedido de Patente U.S. No. 2002/0160974).
As composições aqui descritas podem também incluir agentes úteis no tratamento de SLE. Tais agents incluem analgésicos, corticosteroides (p.ex., predinisona, hidrocortisona), immunosuppressores (tais como ciclofosfamida, azatioprina, e metotrexato), fármacos antimalária (tais como hidroxicloroquina) e fármacos biológicos que inibem a produção de anticorpos dsDNA (p.ex. , LJP 394) . 5.13 Equivalentes
Aqueles habilitados no estado da técnica reconhecerão que, ou serão capazes de discernir usando não mais do que experimentação rotineira, muitos equivalentes às propriedades aqui descritas. 5.14 Divulgações Especificas 1. Uma classe de IgG modificada de um anticorpo monoclonal especifico para IFNAR1, onde o referido anticorpo compreende uma região Fc com pelo menos uma substituição aminoacidica selecionada do grupo consistindo de L234F, L235E, e P331S, como numeradas pelo índice EU como estabelecido em Rabat e onde o referido anticorpo exibe afinidade reduzida para pelo menos um ligando Fc comparativamente com um anticorpo não-modifiçado. 2. 0 anticorpo da cláusula 1, onde, o referido anticorpo é uma subclasse IgGl ou IgG4. 3. 0 anticorpo da cláusula 2, onde o referido anticorpo é uma molécula da classe IgGl. 4. 0 anticorpo da cláusula 3, onde o referido anticorpo compreende uma substituição aminoacidica de P331S. 5. 0 anticorpo da cláusula 3, onde o referido anticorpo compreende as substituições aminoacídicas: L234F e L235E. 6. 0 anticorpo da cláusula 3, onde o referido anticorpo compreende as substituições aminoacídicas: L234F, L235E e P331S. 7. 0 anticorpo da cláusula 3 onde, o referido anticorpo é uma molécula da classe IgG4. 8. 0 anticorpo da cláusula 7 onde, o referido anticorpo compreende uma substituição aminoacidica de L235E de uma região Fc. 9. 0 anticorpo da cláusula 7, onde, o referido anticorpo adicionalmente compreende uma região Fc com uma substituição aminoacidica S228P. 10. O anticorpo de gualquer uma das cláusulas 1-9 onde, o referido anticorpo compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) selecionada da Tabela 2. 11. O anticorpo de qualquer uma das cláusulas 1-10, onde, o referido anticorpo compreende: a. uma região CDR1 variável da cadeia pesada humana compreendendo a Seq ID N°: 31; b. uma região CDR2 variável da cadeia pesada humana compreendendo a Seq ID N°: 32; c. uma região CDR3 variável da cadeia pesada humana compreendendo a Seq ID N°: 33; d. uma região CDR1 variável da cadeia leve humana compreendendo a Seq ID N°: 34; e. uma região CDR2 variável da cadeia leve humana compreendendo a Seq ID N°: 35; e f. uma região CDR3 variável da cadeia leve humana compreendendo a Seq ID N°: 36. 12. 0 anticorpo de qualquer uma das cláusulas 1-10, onde, o referido anticorpo compreende: a. uma região CDR1 variável da cadeia pesada humana compreendendo a Seq ID N°: 1; b. uma região CDR2 variável da cadeia pesada humana compreendendo a Seq ID N°: 2; c. uma região CDR3 variável da cadeia pesada humana compreendendo a Seq ID N°: 3; d. uma região CDR1 variável da cadeia leve humana compreendendo a Seq ID N°: 4; e. uma região CDR2 variável da cadeia leve humana compreendendo a Seq ID N°: 5; e f. uma região CDR3 variável da cadeia leve humana compreendendo a Seq ID N°: 6. 13. 0 anticorpo de qualquer uma das cláusulas 1-10, onde, o referido anticorpo compreende: a. uma região CDR1 variável da cadeia pesada humana compreendendo a Seq ID N°: 11; b. uma região CDR2 variável da cadeia pesada humana compreendendo a Seq ID N°: 12; c. uma região CDR3 variável da cadeia pesada humana compreendendo a Seq ID N°: 13; d. uma região CDR1 variável da cadeia leve humana compreendendo a Seq ID N°: 14; e. uma região CDR2 variável da cadeia leve humana compreendendo a Seq ID N°: 15; e f. uma região CDR3 variável da cadeia leve humana compreendendo a Seq ID N°: 16. 14. 0 anticorpo de qualquer uma das cláusulas 1-10, onde, o referido anticorpo compreende: a. uma região CDR1 variável da cadeia pesada humana compreendendo a Seq ID N°: 21; b. uma região CDR2 variável da cadeia pesada humana compreendendo a Seq ID N°: 22; c. uma região CDR3 variável da cadeia pesada humana compreendendo a Seq ID N°: 23; d. uma região CDR1 variável da cadeia leve humana compreendendo a Seq ID N°: 24; e. uma região CDR2 variável da cadeia leve humana compreendendo a Seq ID N°: 25; e f. uma região CDR3 variável da cadeia leve humana compreendendo a Seq ID N°: 26. 15. O anticorpo de qualquer uma das cláusulas 1-10, onde, o referido anticorpo compreende: a. uma região variável da cadeia pesada humana compreendendo a sequência aminoacidica da Seq ID N°: 38; e b. uma região variável da cadeia leve humana compreendendo a sequência aminoacidica da Seq ID N°: 40. 16. 0 anticorpo de qualquer uma das cláusulas 1-10, onde, o referido anticorpo compreende: a. uma região variável da cadeia pesada humana compreendendo a sequência aminoacidica da Seq ID N°: 8; e b. uma região variável da cadeia leve humana compreendendo a sequência aminoacidica da Seq ID N°: 10. 17. O anticorpo de qualquer uma das cláusulas 1-10, onde, o referido anticorpo compreende: a. uma região variável da cadeia pesada humana compreendendo a sequência aminoacidica da Seq ID N°: 18; e b. uma região variável da cadeia leve humana compreendendo a sequência aminoacidica da Seq ID N°: 20. 18. 0 anticorpo de qualquer uma das cláusulas 1-10, onde, o referido anticorpo compreende: a. uma região variável da cadeia pesada humana compreendendo a sequência aminoacidica da Seq ID N°: 28; e b. uma região variável da cadeia leve humana compreendendo a sequência aminoacidica da Seq ID N°: 30. 19. O anticorpo de qualquer uma das cláusulas 1-18, onde, o referido anticorpo compreende uma sequência da região constante da cadeia leve da Seq ID N°: 41. 20. O anticorpo de qualquer uma das cláusulas 1-18, onde, o referido anticorpo compreende uma sequência da região constante da cadeia pesada da Seq ID N°: 42. 21. O anticorpo de qualquer uma das cláusulas 1-18, onde, o referido anticorpo compreende uma região constante da cadeia leve possuindo a sequência aminoacidica da SEQ ID No: 41 e uma região constante da cadeia pesada possuindo a sequência aminoacidica da Seq ID N°: 42. 22. O anticorpo de qualquer uma das cláusulas 19-21, onde, o referido anticorpo compreende uma sequência aminoacidica da cadeia pesada compreendendo variação alélica, onde a referida variação alélica se encontra em pelo menos uma ou mais posições do grupo consistindo de 214, 221, 356 e 358 como definido pelo sistema de numeração do índice EU. 23. 0 anticorpo de qualquer uma das cláusulas precedentes onde, o referido anticorpo é selecionado do grupo consistindo de: anticorpo humano, anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, intracorpo, e um anticorpo sintético. 24. Um ácido nucleico isolado compreendendo a sequência polinucleotídica codificando o anticorpo de qualquer uma das cláusulas precedentes. 25. O ácido nucleico da cláusula 24 onde, o referido ácido nucleico é um vetor replicável. 26. 0 ácido nucleico da cláusula 25 onde, a referida sequência polinucleotidica se encontra operacionalmente ligada a um promotor. 27. Uma célula hospedeira compreendendo ou transformada com 0 vetor das cláusulas 25 ou 26. 28. Um rato transgénico compreendendo transgenes das cadeias pesada e leve de uma imunoglobulina humana, onde o referido rato expressa o anticorpo de qualquer uma das cláusulas 1-23. 29. Um hibridoma preparado a partir do rato da cláusula 28 onde o hibridoma produz o referido anticorpo. 30. Uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo de qualquer uma das cláusulas 1-23, e um excipiente farmaceuticamente aceitável. 31. Um método de tratamento de uma condição ou uma doença associada com um distúrbio imunológico, compreendendo a administração a um sujeito com sua necessidade relacionada de uma quantidade eficaz da composição da cláusula 30. 32. O método da cláusula 31 onde a referida doença é a uma doença mediada pelo Interferão Tipo 1. 33. O método da cláusula 32 onde o referido interferão Tipo 1 é o interferão alfa. 34. 0 método da cláusula 33 onde a referida doença mediada pelo Interferão Tipo 1 se encontra associada com o recetor do interferão Tipo 1. 35. O método da cláusula 31, onde a referida doença ou distúrbio é Infeção HIV ou SIDA. 36. O método da cláusula 31, onde a referida doença ou distúrbio é lúpus eritematoso sistémico. 37. O método da cláusula 31, onde a referida doença ou distúrbio é sindrome de Sjogren. 38. 0 método da cláusula 31, onde a referida doença ou distúrbio é miosite. 39. O método da cláusula 31, onde a referida doença ou distúrbio é miosite inflamatória. 40. O método da cláusula 31, onde a referida doença ou distúrbio é polimiosite. 41. 0 método da cláusula 31, onde a referida doença ou distúrbio é dermatomiosite. 42. O método da cláusula 31, onde a referida doença ou distúrbio é Miosite por corpúsculos de inclusão. 43. O método da cláusula 31, onde a referida doença ou distúrbio é miosite juvenil. 44. O método da cláusula 31, onde a referida doença ou distúrbio é miosite inflamatória idiopática. 45. O método da cláusula 31, onde a referida doença ou distúrbio é vasculite. 46. O método da cláusula 31, onde a referida doença ou distúrbio é sarcoidose. 47. O método da cláusula 31, onde a referida doença ou distúrbio é selecionado do grupo consistindo de: doença inflamatória do intestino, esclerose múltipla, tiroidite autoimune, artrite reumatoide, diabetes mellitus dependente de insulina, glomerulonefrite, e doença do enxerto versus hospedeiro. 48. O método da cláusula 31, onde a referida doença ou distúrbio é psoriase ou condições resultantes relacionadas. 49. O método da cláusula 31, onde a referida doença ou distúrbio é rejeição a transplantes ou doença do enxerto versus hospedeiro. 50. O método da cláusula 31 onde a referida doença ou distúrbio é selecionado do grupo consistindo de: doença de Grave, tiroidite de Hashimoto, doença de Crohn, psoriase, artrite psoriática, oftalmia simpática, ovarite autoimune, orquite autoimune, sindrome linfoproliferativa autoimune, sindrome dos anticorpos antifosfolipídicos, sindrome de Sjogren, esclerodermia, doença de Addison, poliendocrinopatia autoimune, sindrome de Guillain-Barre, púrpura trombocitopénica idiopática, anemia perniciosa, miastenia grave, cirrose biliar primária, doença mista do tecido conjuntivo, vitiligo, uveite autoimune, anemia hemolitica autoimune, trombocitopenia autoimune, doença celíaca, dermatite herpetiforme, hepatite autoimune, penfigo, penfigo vulgar, penfigo foliáceo, penfigóide bulhoso, miocardite autoimune, vasculite autoimune, alopecia areata, aterosclerose autoimune, doença de Behçet, mielopatia autoimune, hemofilia autoimune, cistite intersticial autoimune, diabetes insipidus autoimune, endometriose autoimune, policondrite recidivante, espondilite anquilosante, urticária autoimune, dermatomiosite, sindrome Miller-Fisher, nefropatia IgA, sindrome de Goodpasture, e penfigóide gestacional. 51. 0 método de qualquer uma das cláusulas 31-50, adicionalmente compreendendo a administração de pelo menos um agente selecionado do grupo consistindo de: fototherapia, corticosteroides, prednisona, NSSIDA, plasmaférese, immunosuppressores, metotrexato, ácido retinoico, tioguanina, micofenolato mofetil, ésteres fumáricos, ciclofosfamida, azatioprina, ciclosporina, e imunoglobulinas. 52. O método de qualquer uma das cláusulas 31-51 adicionalmente compreendendo a administração de pelo menos um agente selecionado do grupo consistindo de: alefacept (AMEVIVETM) , etanercept (ENBREL ®) , adalimumab (HUMIRA ®) , infliximab (REMICADE®), belimumab (LYMPHOSTATBTM), rituxumab (RITUXAN®), e efalizumab (RAPTIV A ®). 53. Um cristal compreendendo uma região Fc IgG humana, onde a região Fc IgG humana compreende pelo menos uma substituição aminoacidica selecionada do grupo consistindo de L234F, L235E, e P331S, como numeradas pelo indice EU como estabelecido em Rabat e onde o referido fragmento exibe afinidade reduzida para pelo menos um ligando Fc comparativamente com uma região Fc não-modifiçada. 54. 0 cristal da cláusula 53, onde a região Fc IgG humana compreende as substituições aminoacidicas L234F, L235E e P331S. 55. 0 cristal da cláusula 53, que apresenta qualidade de difração. 56. 0 cristal da cláusula 53, que é um cristal nativo. 57. 0 cristal da cláusula 53, que é caracterizado por uma dimensão de célula unitária de a=50.18±0,2 A, b=147,30±0,2 A, e c=75,47 ±0,2 A. 58. O cristal da cláusula 53, que apresenta um grupo espacial de C2221. 59. O anticorpo monoclonal modificado, onde o referido anticorpo compreende uma região Fc com as substituições aminoacidicas L234F, L235E, e P331S, como numeradas pelo indice EU como estabelecido em Rabat e onde o referido anticorpo exibe afinidade reduzida para pelo menos um ligando Fc comparativamente com um anticorpo não-modifiçado. 60. Uma proteína de fusão compreendendo uma região Fc modificada, onde a referida região Fc compreende as substituições aminoacidicas L234F, L235E, e P331S, como numeradas pelo índice EU como estabelecido em Rabat e onde a referida região Fc exibe afinidade reduzida para pelo menos um ligando Fc comparativamente a uma região Fc. 61. um método de produção de um anticorpo de qualquer uma das cláusulas 1-23 ou 59. 62. O anticorpo de qualquer uma das cláusulas 1-23 ou 59, onde o referido anticorpo é um anticorpo internalizado. 63. A proteína de fusão da cláusula 60, onde a referida proteína de fusão é uma proteína de fusão internalizada. 64. A proteína de fusão da cláusula 63, onde a referida proteína de fusão apresenta ligação específica para IFNAR1. 65. O anticorpo de qualquer uma das cláusulas 1-23,59, ou 62, onde o referido anticorpo exibe citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) reduzida ou eliminada comparativamente com o referido anticorpo não-modifiçado. 66. 0 anticorpo de qualquer uma das cláusulas 1-23, 59, ou 62, onde o referido anticorpo citotoxicidade mediada pelo complemento (CDC) reduzida ou eliminada comparativamente com o referido anticorpo não-modifiçado. 67. 0 anticorpo de qualquer uma das cláusulas 1-23,59, or 62, onde o referido anticorpo exhibits reduced or ablated ADCC and CDC comparativamente com o referido anticorpo não-modif icado. 5.15 Sequências
Região constante da cadeia leve (SEQ ID No :41)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ
DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Região constante da cadeia pesada (SEQ ID No:42)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFE GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
6. EXEMPLOS A invenção é agora descrita com referência aos seguintes exemplos. 6.1 Exemplo 1: Perfil IHC profile de Múltiplos Anticorpos anti-IFNARl
Objetivo: Avaliar o perfil IHC de anticorpos anti-IFNARl num conjunto diverso de tecidos. Métodos: Técnicas de imunohistoquímica para estudar as características de ligação ao anticorpo são prontamente conhecidas no estado da técnica e por exemplo, poderiam ser realizadas através do isolamento das células ou tecidos desejados e prepará-los para microscopia através de fixação estandardizada e técnicas de montagem.
Macrófagos Murinos: Uma suspensão celular foi invertida para formar um pellet solto. 0 pellet foi congelado em meio de congelamento OCT para formar um bloco. Secções finas foram cortadas com espessura de 5 microns, embebidas em acetona durante 10 minutos e permitidas secar num exsicador overnight. Antes do seu uso, as secções foram mergulhadas em formalina tamponizada neutral 10% durante 10 seg e lavadas 3X em solução-tampão (IX TBS com 0,01 % Tween20).
Monócitos humanos: Uma suspensão celular foi espalhada/disseminada diretamente nas lâminas. As lâminas foram permitidas secar overnight e depois embebidas em acetona durante 10 min e permitidas secar à temperatura ambiente. Antes do seu uso, as lâminas foram mergulhadas em formalina tamponizada neutral 10% durante 10 segs e lavadas 3X em solução-tampão (IX TBS com 0,01 % Tween20).
Tecido cardíaco e do cérebro humano: Amostras de tecido de dadores foram congeladas em Meio de congelamento OCT para formar um bloco. Secções finas foram cortadas com 5 microns de espessura, embebidas em acetona durante 10 minutos e permitidas secar num exsicador overnight. Antes do seu uso, as secções foram mergulhadas em formalina tamponizada neutral 10% durante 10 segs e lavadas 3X em solução-tampão (IX TBS com 0,01 % Tween 20).
Marcação de anticorpos: Anticorpos foram conjugados com biotina através do seguinte protocolo. Aproximadamente 500 pg de anticorpo foi misturado com um excesso de 20 vezes de biotina e incubado durante 2 horas no escuro a 4°C. Após a incubação de 2 horas, a mistura anticorpo/biotina foi aplicada numa coluna PD10 pré-equilibrada com IX PBS. Subsequentemente, os anticorpos conjugados com biotina foram concentrados á concentração desejada usando um Tubo de concentração YM-30 Centricon.
Coloração das lâminas: Após lavagem em solução-tampão, as lâminas foram tratadas para neutralizar as peroxidases endógenas por tratamento com uma solução de Glucose Oxidase (1 V/ml, Sigma G0543) , B-D ( +) Glucose (10 mM, Sigma G5250), Azida de Sódio (1 mM, Sigma, S8032) durante 1 hora à temperatura ambiente. As lâminas foram então lavadas com solução-tampão (IX TBS com 0,01 % Tween 20) . As lâminas foram colocadas numa solução bloqueadora de proteinas (lx PBS pH7,2, 0,5% caseina (N-Z amina, Sigma C0626), 1 % BSA (Sigma A7906), 1,5% Soro normal de cabra (Jackson Labs #005-000-001) durante 30 min à temperatura ambiente. O anticorpo bioatinilado (ver acima) foi aplicado nas lâminas por diluição na solução bloqueadora de proteinas. Incubação das lâminas com o anticorpo bioatinilado foi realizada à temperatura ambiente durante 2 horas. As lâminas foram lavadas 3X em solução-tampão de lavagem (IX TBS, 0,01 % Tween 20) . A deteção do anticorpo foi realizada usando um Kit Vectastain (Vetor Laboratories). As lâminas foram lavadas e marcadas com hematoxilina. As lâminas foram desidratadas e montadas com lamelas antes da sua observação.
Resultados: Apresentados na Fig. 6A estão os resultados de uma análise IHC de tecido de cérebro humano marcado com vários anti-IFNARl e anticorpos de controlo. Os anticorpos MDX-1333 (75 pg/ml) e 4G5 (50 pg/ml) exibiram forte marcação do tecido cerebral como exemplificado pela coloração castanha/escura visível nas amostras. Anticorpo 9D4 (50 pg/ml) não marcou a amostra de tecido de cérebro humano assim como MDX-1333 e 4G5 como demonstrado pela marcação castanha/escura na amostra. Um isotipo de controlo IgGl foi incluído para demonstrar a especificidade de ligação dos anticorpos individualmente.
Apresentados na Fig. 6B estão os resultados de uma análise IHC de monócitos marcados com vários anti-IFNARl e anticorpos de controlo. Os anticorpos MDX-1333 (50 e 20 pg/ml), 4G5 (50 pg/ml) e 9D4 (50 e 20 pg/ml) todos exibiram uma marcação proeminente em monócitos humanos como demonstrado pela marcação castanha/escura das amostras. O anticorpo de controlo isotípico R3-47 (50 pg/mlj não exibiu marcação proeminente dos monócitos humanos. Adicionalmente, MDX-1333(50 pg/mlj não marcou macrófagos murinos purificados.
Conclusões: Um estudo IHC do anticorpo anti-IFNARl 9D4 exibiu um nível mais baixo de marcação comparativamente com outros anticorpos anti-IFNARl tais como MDX-1333 e 4G5.
6.2 Exemplo 2: Produção do anticorpo 9D4-TM O anticorpo anti-IFNARl modificado designado "9D4-TM" foi produzido através do seguinte procedimento:
Fc γΐ humano foi clonado e produzido a partir de PBLs humanas primeiro isolando o RNA total, transcrevendo o cDNA, e amplificando via PCR as regiões constantes com primers genéticos específicos contendo locais de restrição Apa I e EcoRI para clonagem no vetor mamífero PEE6. 0 triplo mutante (TM) inclui três mudanças aminoacídicas no IgG humano para diminuir a função executora ADCC (L234F, L235E, E P331S) . TM foi produzido usando IgGl humano (KOL) como padrão, e utilizando mutagénese dirigida (QuickChange XL, Stratagene) para codificar três mudanças aminoacídicas no Fc. A sequência de primers mutagénicos usados para codificar as mudanças L234F/L235E/P331S foram as seguintes: MD1056 = 5'cgtgcccagcacctgaaTtcGAggggggaccgtcagtcttc 3' L234F, L235E normal (SEQ ID NO:43) MD1057 = 5' gaagactgacggtccccccTCgaAttcaggtgctgggcacg 3' L234F, L235E reverso (SEQ ID NO:44) MD1058 =
5' ccaacaaagccctcccagccTccatcgagaaaaccatctcc 3' P331S normal (SEQ ID NO:45) MD1059 =
5' ggagatggttttctcgatggAggctgggagggctttgttgg 3' P331S reverso (SEQ ID NO:46)
Clones codificando o anticorpo 9D4-TM foram sequenciados para confirmar as triplas mutações, e resolvidos num analisador genético ABI3100.
6.3 Exemplo 3: Produção do anticorpo 9D4-DM 0 anticorpo anti-IFNARl modificado designado "9D4-DM" foi produzido através do seguinte procedimento;
Fc γ4 Humano foi clonado e produzido a partir de PBLs humanas primeiro isolando o RNA total, transcrevendo o cDNA, e amplificando via PCR as regiões constantes com primers genéticos específicos contendo locais de restrição Apa I e EcoRI para clonagem no vetor mamífero PEE6. 0 duplo mutante (DM) consiste de duas mutações no Fc IgG humano 4: S228P e L235E. Primers mutagénicos para codificação de DM incluem: MD1060 = 5' ggtcccccatgcccaCcatgcccagcacctg 3' charneira S228P normal (SEQ ID NO:47) MD1061 = 5' caggtgctgggcatgGtgggcatgggggacc 3' charneira S228P reverso (SEQ ID NO:48) MD1062 = 5' ccagcacctgagttcGAggggggaccatcagtc 3'IgG4 L234F, L235E normal (SEQ ID NO:49) MD1063 = 5' gactgatggtccccccTCgaactcaggtgctgg 3' IgG4 L234F, L235E reverso (SEQ ID NO:50)
Clones codificando o anticorpo 9D4-DM foram seguenciados para confirmar as duplas mutações, e resolvidos num analisador genético ABI3100. 6.4 Exemplo 4 Anticorpos anti-IFNARl inibem a fosforilação STAT mediada por IFN.
Objetivo: Estabelecer a capacidade dos anticorpos anti-IFNARl 9D4-TM para inibirem a fosforilação STAT mediada por IFN em células mononucleadas do sangue periférico. Métodos: Células mononucleadas do sangue periférico foram purificadas a partir de dadores humanos saudáveis usando Meio LSM (MP Biomedical, Solon OH). PBMCs foram quantificados e plaqueados a 106 células por condição por poço. Anticorpos foram adicionados a 10 pg/ml nos poços apropriados e incubados a 37°C, 5% CO2 durante 10 minutos. Após preincubação com anticorpos, IFN humano recombinante a2a (PBL Biomedical, Piscataway NJ) ou IFN derivado de célula dendritica plasmacitóide humana (ver abaixo para produção de sobrenadantes de IFN do Tipo 1 derivados de PDCs) foi adicionado nos poços apropriados a 100 ou 500 IU/mL durante 20 minutos. Células foram centrifugadas a 1200rpm durante 5 minutos e lavadas com IX PBS esterilizado. Após um ciclo de centrifugação adicional, PBS foi removido e as células foram lisadas usando reagente de extração de proteínas mamíferas (Pierce, Rockford IL) suplementado com 300 pL de lx cocktails de inibidor da fosfatase 1 e 2 (Sigma, St. Louis MO) e IX inibidor da protease (Roche Biomedical, Nutley NJ) . Os lisados foram incubados durante 10 minutos num agitador orbital para assegurar lise completa, transferido para tubos de microcentrífuga e centrifugados a 14000 rpm para remover o debris celular. A solução-tampão da amostra NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad CA) e dTT (Sigma, St. Louis MO) foram adicionados aos lisados para uma concentração final de IX e todas as amostras foram desnaturadas num bloco de aquecimento a 100°C durante aproximadamente 10 minutos. 15 pL de cada amostra foram adicionados a gel de poliacrilamida Bis-tris NuPage 10% (Invitrogen, Carlsbad CA) em tampão de eluição MÊS SDS NuPAGE suplementado com tampão de antioxidante IX NuPAGE. As amostras foram processadas a 180V durante 30 minutos para separação das bandas proteicas. As proteínas foram então transferidas para uma membrana de nitrocelulose e as bandas foram bloqueadas com IX PBS (Gibco BRL, Carlsbad CA) contendo 5% BSA (Sigma, St. Louis MO) overnight A 4°C. O meio bloqueador foi subsequentemente removido e 0,2 pg/mL anti-STAT1, anti-STATl pY701, ou uma diluição 1:1000 de anticorpos β-Actina (Cell Signaling Technology, Danvers MA) foram adicionados às bandas correspondentes e incubados overnight a 4°C. As bandas foram lavadas 3x em IX TBS com 0,05% Tween20 (Sigma, St. Louis MO), diluidas 1:2500, anticorpo secundário anticoelho conjugado HRP foi adicionado às bandas e incubado durante lh à temperatura ambiente. As bandas foram lavadas como anteriormente descrito e 3mL de uma mistura 1:1 de reagente Pico Supersignal West (Pierce, Rockford IL) foi adicionado a cada banda durante 1 minuto. As bandas foram drenadas, o excesso de reagente foi removido e as bandas foram visualizada usando um Processador Kodak Xomat 1000A.
Resultados: Apresentados na Fig. 7 estão os resultados de um ensaio de ativação STAT no qual as células estimuladas com IFN de leucócitos na presença ou ausência de anticorpos anti-IFNARl. Na ausência de anticorpos, interferão do leucócito estimula a fosforilação das isoformas STAT 1, 3 e 5. Incubação das células com o anticorpo 9D4-TM inibe a fosforilação mediada pelo tratamento com interferão do leucócito. Células tratadas com o anticorpo de controlo isotipico R3-47 não exibiram inibição da fosforilação STAT em resposta à estimulação com interferão do leucócito.
Conclusões: Os resultados na Fig. 7 demonstram que 9D4-TM é capaz de inibir respostas a IFNoí tais como a indução da fosforilação STAT em células mononucleadas do sangue periférico. 6.5 Exemplo 5: Anticorpos anti-IFNARl inibem a Sinalização de IFN Tipo 1.
Objetivo: usando IFN Tipo purificado de células pDC, um ensaio repórter foi usado para testar a capacidade dos anticorpos anti-IFNARl para bloquearem a sinalização de IFN Tipo 1. Métodos: Células dendriticas plasmacitóides (PDCs) foram isoladas de sangue completo de dados saudáveis usando o meio de separação de linfócitos (MP Biomedical, Solon OH) seguida por seleção positiva usando CD304 (BDCA-4/Neuropilin-l) MicroBead Kit (Milteny Biotec, Auburn CA) . As PDCs purificadas foram então cultivadas a lxlO6 células/mL em meio RPMI 1640 suplementado com 10% FBS (Oibco BRL) E 6 pg/ml CpOA (InVivogen, San Diego CA) . Os sobrenadantes foram recolhidos e clarificados após 20 horas em cultura e o IFN Tipo 1 foi quantificado usando uma linha celular repórter HEK293-ISRE transfetada contra uma curva padrão de IFN de leucócitos humano (PBL Biomedical, Piscataway NJ). pDCs de três dadores humanos saudáveis foram usadas para produzir sobrenadantes de interferão Tipo 1 derivados de pDCs, como acima descrito. As células HEK293 (ATCC, Manassas VA) foram estavelmente cotransfetadas com o plasmideo repórter pHTS-ISRE (Biomyx Technology, San Diego CA) e foram mantidas em meio DMEM suplementado com 10% FBS, lx NEAA, e 700 pg/ml G418 (Invitrogen, Carlsbad CA) . As células foram plaqueadas a uma concentração de 80,000 células por poço em microplacas Optilix brancas/transparentes de 96 poços (VWR, West Chester PA). Concentrações apropriadas de anticorpos (611 - 0,00004nM) foram adicionadas a cada poço seguido pela adição de concentrações apropriadas de sobrenadantes contendo interferão Tipo 1 derivados de pDCs humanos. As células, IFN, e anticorpos foram incubados overnight a 37°C, 5% C02 e amplificação da proteína luciferase foi avaliada através da lise das células com o reagente de Lise Celular e visualização usando o Sistema de Ensaio da Luciferase (Promega, Madison WI) . O sinal foi medido em "cps" e os valores de IC50 foram obtidos.
Resultados: Sobrenadantes contendo IFN Tipo 1 foram recolhidos de células pDCs derivadas de três dadores individuais. Num ensaio com o gene repórter da luciferase, a incubação de anticorpos anti-IFNARl inibiu a capacidade de sinalização a várias concentrações de IFN Tipo 1 no sobrenadante (Figura 8).
Conclusões: Estes resultados demonstram que anticorpos anti-IFNARl são capazes de inibir a sinalização mediada por Interferões Tipo q como medido no ensaio de atividade com o gene repórter. 6,6 Exemplo 6: Anticorpos anti-IFNARl modificados exibem características de ligação similares ao anticorpo parental não-modificado.
Objetivo: Para investigar as caracerísticas de ligação de IFNAR1 de anticorpos modificados comparativamente com versões parentais não-modifiçadas. Representados na Figura 9 aestão as curvas de afinidade de ligação para os anticorpos 9D4, 9D4DM, e 9D4-TM. As constantes de ligação (Kd) para os anticorpos anti-IFNARl 9D4, 9D4DM, e 9D4-TM foram determinadas a partir das curvas de ligação. Métodos: 200 000 células HER 293F foram plaqueadas em cada poço de uma microplaca de 96 poços usando 50 pL de meio RPMI 1640 suplementado com 10% FBS. 9D4-TM marcado com európio foi preparado sob contrato com a empresa PerkinElmer Life and Analytical Sciences. Para medir o sinal de európio não-especif ico, 25 pL de um excesso de 100X de anticorpos anti-IFNARl não marcados, diluidos serialmente, foram adicionados nos poços apropriados da microplaca de 96-poços durante 5-10 minutos antes da adição de anticorpos marcados 9D4-TM. 25 pL de anticorpos diluidos serialmente, conjugados com európio foram então adicionados nos poços apropriados e as células e anticorpos foram agitadas gentilmente à temperatura ambiente durante 1-2 horas. Após incubação para ligação, 150 pL do meio de cultura foi adicionado a todos os poços e as placas foram centrifugadas a 1200 rpm durante 5 minutos à temperatura ambiente. As microplacas foram rapidamente decantadas e 250 pL do meio de cultura foi adicionado a todos os poços. As centrifugações e lavagens foram repetidas por um total de 3 lavagens. As células foram então ressuspendidas em 100 pL de meio de cultura. 50 pl das células ressuspendidas foram transferidas para 200 pL de solução de revelação DELPHIA (PerkinElmer) num microplaca amarela DELPHIA e a emissão de európio foi medida num leitor Victor2 Multilabel (PerkinElmer). O sinal foi medido em cps e os valores de Kd e os valores Bmax foram gerados usando o software de análise Graphpad Prism 4.
Resultados: Os dados representados na Figura 9 demonstram que os anticorpos modificados 9D4-TM e 9D4-DM exibem afinidades de ligação similares para IFNAR1 (9D4 = 0,06 +/-0,02 nM, 9D4-DM = 0,06 + /- 0,02 nM, 9D4-TM = 0,03 +/- 0,01 nM) comparativamente com o anticorpo parental não-modifiçado.
Conclusões: Os dados apresentados neste exemplo demonstram que os anticorpos modificados partilham características de ligação a IFNAR1 semelhantes com as dos anticorpos parentais não-modifiçados. 6,7 Exemplo 7: Dados do Ensaio de Equilíbrio de Ligação para 9D4-TM vs. sIFNARl
Objetivo: Determinar os dados de equilíbrio de ligação para 9D4-TM usando IFNAR1 solúvel (srIFNARI) Métodos: O ligando srIFNARI foi utilizado para revestir esferas UltraLink® Biosupport (PIERCE, Rockford, IL) a concentrações de 5 pg/ml e 50 pg/ml em solução-tampão de revestimento (50mM solução-tampão de carbonato de sódio, pH9) por um periodo de 1-2 dias a 4°C. As esferas revestidas foram então separadas (breve centrifugação) da solução de ligandos não reagidos, e gentilmente agitada numa solução-tampão bloqueadora (lmL 1M Tris, pH8, contendo BSA at lOmg/mL) durante cerca de 15 min à temperatura ambiente (RT). Após este passo, a lama contendo esferas foi novamente centrifugada para remover a solução bloqueadora, e depois o passo de bloqueio foi repetido durante cerca de 2 horas à temperatura ambiente usando uma alíquota fresca de solução-tampão bloqueadora. Após o passo de bloqueio, as esferas revestidas foram armazenadas a 4°C antes do seu uso. Antes do seu uso, as esferas revestidas com srlFNARl-foram transferidas para um frasco, ressuspendidas em 27mLs do tampão de eluição (PBS, pH7,4 - 0,02% NaN3), e depois acopladas a um instrumento KinExA 3000.
Todas as constantes de equilíbrio de ligação (KD) foram obtidas a partir de medições efetuadas num instrumento KinExA 3000 (Sapidyne Instruments, Boise, ID) . Sucintamente, 9D4-TM IgG foi preparado a lpM, 10pM e 50pM e dispensado em três séries de tubos. Esta gama de concentrações de IgG foi desenhada para permitir que medições pudessem ser feitas em condições controladas para o recetor e para KD. Duas diluições seriais do ligando srlFNARl foram então tituladas através dessas soluções IgG, a concentrações variando entre 19,5fM - lnM. Com base das simulações das curvas teóricas, fornecidas pelo fabricante, disponíveis através do software (Sapidyne Instruments, Boise, Idaho), estas misturas de equilibração foram incubadas por períodos entre 2-6 dias à RT. No final deste período, experiências de teste de sinal foram conduzidas para determinar as condições de análise apropriadas. A deteção do anticorpo livre foi tornada possível usando um reagente para anticorpo secundário marcado com Cy5, especifico para a espécie (Cy5 AffiniPure Fragmento F(ab')2 de cabra Anti-Humano IgG, Part # 109-176-097, Jackson ImmunoResearch Laboratories), empregado a 0,1, 1,0 ou 2,0 pg/ml de PBS, pH7,4 - 0,02% NaN3 contendo BSA a lmg/mL. Dados obtidos a partir de experiências foram então simultaneamente ajustados usando o software com a funcionalidade de análise de curva nele fornecida para obter a constante de ligação (KD).
Resultados: Representados na Fig 10A estão as curvas de ligação para três concentrações de 9D4-TM (1 pM, 10 pM, e 50 pM) com sIFNARl. Dados obtidos de pelo menos três experiências independentes foram ajustados a uma curva de ligação derivada pelo software estabelecendo um KD relativo para 9D4-TM. 0 KD de 9D4-TM neste ensaio de ligação foi determinado como sendo 1,1 pM com um intervalo de confiança 95% de 0, 603 pM - 1,8 pM. O erro em percentagem da determinação de KD a 1,1 pM foi de 1,96%. Os valores de Kon e Koff para 9D4-TM foram também determinados como sendo 7 x 106 +/- 1, 3 X 106 S_1 e 7,7 x 10'6 +/- 1,57 xl0~6 1/Ms, respetivamente (dados não mostrados).
Conclusões: Os anticorpos anti-IFNARl modificados 9D4-TM exibem um KD muito baixo de aproximadamente 1,1 pM, para sIFNARl como determinado pelo ensaio KinExa. 6.8 Exemplo 8: Determinação da afinidade de ligação de 9D4-TM em PBMCs Humanas
Objetivo: Dterminar a afinidade de ligação em PBMCs humanas. Métodos: Células mononucleadas do sangue periférico foram purificadas a partir de dadores humanos saudáveis usando Meio LSM (MP Biomedical, Solon OH). As células foram contadas e 200 000 foram plaqueadas numa microplaca de 96poços usando 50 pL de meio RPMI 1640 suplementado com 10% FBS. 9D4-TM marcado com európio foi preparado sob contrato com a empresa PerkinElmer Life and Analytical Sciences. Para medir o sinal de európio não-especifico, 25 pL de 9D4-TM não-marcado diluído serialmente com um excesso 100-vezes foi adicionado nos poços apropriados da microplaca de 96-poços antes da adição de 9D4-TM marcado. 25 pL de 9D4-TM conjugado com európio, serialmente diluído foi então adicionado nos poços apropriados e as células e anticorpos foram agitados gentilmente à temperatura ambiente durante 1-2 horas. Após incubação para ligação, 150 pL do meio de cultura foi adicionado a todos os poços e as placas foram centrifugadas a 1200rpm durante 5 minutos à temperatura ambiente. As placas foram rapidamente decantadas e 250 pL meio de cultura foi adicionado a todos os poços. Centrifugações e lavagens foram repetidas por um total de 3 lavagens. As células foram então ressuspendidas em 100 pL de meio de cultura. 50 pL de células ressuspendidas foram transferidas para 200 pL de solução de revelação DELPHIA (PerkinElmer) numa microplaca amarela DELPHIA e a emissão de európio foi medida num leitor Victor2 Multilabel (PerkinElmer). O sinal foi medido em cps e os valores de KD e os valores de Bmax foram gerados usando o software de análise GraphPad Prism 4.
Resultados: Usando as medições de afinidade documentadas na Figura 10B, foi determinado que o Kd para a ligação de 9D4-TM a PBMCs humanas foi de 0,29 nM + /- 0,11 nM com o número de locais de ligação determinados a ser de 1448 +/ - 447, usando uma abordagem similar, a constante de afinidade de ligação para o IFNAR de macaco cinomolgo foi determinada como sendo 0, 65 + /- 0,42 nM com o número de locais de ligação determinados a ser 648 +/-204 (dados não mostrados).
Conclusões: Os resultados apresentados na Figura 10B demonstram que 9D4-TM se liga especificamente e com elevada afinidade a PBMCs humanos. 6.9 Exemplo 9: Os anticorpos anti-IFNARl modificados exibem potência similar à do anticorpo parental não-modificado.
Objetivo: Demonstrar que anticorpos anti-IFNAR2 modificados (i.e. anticorpos anti-IFNARl com reduzida afinidade de ligação a Fc) exibem uma potência semelhante à de anticorpos parentais não-modifiçados. Métodos: 0 ensaio com o sistema de gene repórter da luciferase usado neste exemplo foi já previamente descrito acima (ver Exemplo 3) . Anticorpos para IFNAR1 usado neste exemplo incluem 9D4, 9D4-DM, 9D4-TM, MDX-1333. Incluido está o anticorpo de controlo R3-47.
Resultados: usando o sistema repórter da luciferase, os valores de IC50 são produzidos para os vários anticorpos anti-IFNARl acima descritos (ver Figura 11A) . 0 anticorpo anti-IFNARl 9D4 (0,01 nM) e os anticorpos modificados, tais como 9D4-DM (0,01 nM) e 9D4- TM (0,02 nM) cada um gerem um valor de IC50 similar no ensaio repórter demonstrando que eles exibem uma potência semelhante. Outro anticorpo anti-IFNARl, MDX1333 (0,04 nM) também exibe uma potência similar à do anticorpo 9D4 não-modifiçado. O controlo isotípico não inibe A sinalização mediada por IFN Tipo 1 neste 4nsaio com o gene repórter da luciferase.
Conclusões: Anticorpos anti-IFNARl modificados partilham potências semelhantes às versões não-modifiçadas como demonstrado pelos valores de IC50 gerados num ensaio com o sistema de gene repórter da luciferase desenhado para quantificar eventos de sinalização de IFN. 6.10 Exemplo 10: 9D4-TM inibe a atividade de múltiplas isoformas alfa de interferão Tipo 1
Objetivo: Demonstrar que 9D4-TM inibe a sinalização atribuída a isoformas alfa de interferão específicas e múltiplas. Métodos: 0 ensaio com o sistema de gene repórter da luciferase usado neste exemplo foi já previamente descrito acima (ver Exemplo 5) .
Resultados: Os valores de IC50 para a inibição da atividade de Interferão Tipo 1 mediada por 9D4-TM estão apresentados na Tabela 4.
Tabela 4: Valores de IC50 para a inibição da atividade de Interferão Tipo 1 Mediada por 9D4-TM
Como mostrado, 9D4-TM exibe valores de IC50 na gama sub-nanomolar para múltiplas isoformas de interferão alfa, interferão do leucócito, e interferon omega.
Conclusões: Os anticorpos anti-IFNARl modificados 9D4-TM demonstram a capacidade de inibir a sinalização atribuída a múltiplos subtipos específicos de Interferão alfas assim como o interferão do leucócito alfa num ensaio repórter
6.11 Exemplo 11: Determinação do ponto isoelétrico de 9D4, 9D4DM e 9D4-TM
Objetivo: Avaliar as características biofísicas do anticorpo parental não-modificado 9D4 em comparação com os anticorpos modificados 9D4-DM e 9D4-TM. Métodos: Análise Eletroforética em Gel de Poliacrilamida para a Determinação do Ponto Isoelétrico (IEFPAGE) foi realizada como se segue: Géis de anfolina pré-fabricados (Amersham Biosciences, gama pi 3,5-9,5) foram carregados com 8 pg de proteina. Amostras proteicas foram dializadas em 10 mM Histidina pH-6 antes de serem carregadas no gel. Uma ampla gama de padrões de marcação pl (Amersham, pl range 3-10, 8 ilL) foi usada para determinar o pl relativo para Mabs. A eletroforese foi realizada a 1500 V, 50 mA durante 105 minutos. O gel foi fixado durante 45 minutos usando uma solução de fixação Sigma (5x) diluída com água ultrapura para IX. A marcação foi realizada overnight à temperatura ambiente usando corante Simply Blue (Invitrogen). A descoloração foi realizada com uma solução consistindo de 25% de etanol, 8% ácido acético e 67% água ultrapura. Os pontos isoelétricos foram determinados usando um densitómetro Bio-Rad OS-800 com o sofware Quantity One Imaging.
Resultados: Representado na Figura 12A está a Determinação do Ponto Isoelétrico (pi) para os anticorpos 9D4WT, 9D4DM, e 9D4-TM. Amostras dos anticorpos foram analisadas de acordo com métodos acima descritos e exibiram as seguintes características: 0 anticorpo 9D4-WT exibiu bandas proteicas proeminentes correspondendo 8,2, 8,35 e 8,51. 0 anticorpo 9D4-DM exibiu uma única banda proteica proeminente correspondendo a 7,13. 0 anticorpo 9D4-TM exibiu bandas proteicas proeminentes a 8,09 e 8,18.
Conclusões: Como apresentado neste Exemplo, os anticorpos modificados 9D4-DM e 9D4-TM características biofísicas muito similares (pi) às do anticorpo parental não-modificado 9D4.
6.12 Exemplo 12: Termoestabilidade de 9D4, 9D4-DM e 9D4-TM
Objetivo: Avaliar as características biofísicas do anticorpo parental não-modificado 9D4 comparativamente com os anticorpos modificados 9D4-DM e 9D4-TM. Métodos: Calorimetria Diferencial de Varrimento foi realizada como se segue: as temperaturas de fusão (Tm) foram medidas com um aparelho VP-DSC (MicroCal, LLC) usando a uma velocidade de rastreio de l,0°C/min e uma gama de temperaturas de 20-110°C. Um filtro-período de 8 minutos foi usado conjuntamente com um pré-rastreio de 15 minutos. As amostras foram preparadas por diálise em 10 mM Histidina-HCl, pH 6 usando cassetes de diálise Pierce (3,5 kD) . As concentrações de Mab foram 0,14 mg/ml, 0,79 mg/ml, e 0,64 mg/ml como determinado por A280. As temperaturas de fusão foram determinadas seguindo os procedimentos do fabricante usando software Origin fornecido pelo sistema. Sucintamente, múltiplas linhas de base foram realizadas com solução-tampão tanto para a amostra como para a célula de referência para estabelecer o equilíbrio térmico. Após a linha de base ser subtraída do termograma da amostra, os dados foram normalizados para a concentração.
Resultados: Os anticorpos 9D4, 9D4-DM, 9D4-TM foram sujeitos a Calorimetria Diferencial de Varrimento como acima detalhado com os resultados apresentados na Figura 12B. Cada um dos anticorpos estudados apresentaram temperaturas de fusão similares no ensaio. Especificamente, os anticorpos apresentaram as seguintes temperaturas de fusão: 9D4-WT = 70,41 °C, 9D4-DM = 70,41 °C, e 9D4-TM = 70,88 °C.
Conclusões: Como apresentado neste Exemplo, os anticorpos modificados 9D4-DM e 9D4-TM exibem características biofísicas muito similares (Tm) às do anticorpo parental não-modificado 9D4. 6.13 Exemplo 13: Anticorpos anti-IFNAR substitutos protegem ratinhos de proteinuria induzida por IFNa
Objetivo: Demonstrar que anticorpos anti-IFNAR protegem ratinhos de proteinuria induzida num modelo de SLE. Métodos: Ratinhos NZB/W F1 fêmea foram adquiridos de Jackson Labs e colocados em instalações seladas apirogénicas. O vetor adenovírico recombinante contendo o IFNa murino, subtipo 5 cDNA sob o controlo do promotor/intensificador CMV (AdvmIFNa,5) foi usado para induzir precocemente lúpus nestes ratinhos. Ratinhos (8 ratinhos/grupo) foram tratados à semana 8-11 de idade com uma única injeção i.v. de 0,3xl010 partículas víricas (vp) Adv-mIFNa,5. Os controlos receberam a mesma quantidade de partículas Adv de controlo. Nalgumas experiências, os ratinhos foram injetados com doses graduais de Adv-mIFNa,5 variando de Ο,ΟΙχΙΟ10 a Ι,ΟχΙΟ10 vp/ratinho. Para testar a eficácia de anti-IFNARl, os ratinhos foram tratados com 5 doses diárias i.p. sucessivas de anticorpo a 10 mg/kg começando a partir do momento em que ocorreu a administração de Adv. Para proteinúria, a urina foi testada usando uma sonda (Chemstrip 2 OP; Roche Diagnostics) . Proteinuria foi avaliada como 1 para níveis de 30 mg/dl, 2 para 100 mg/dl, e 3 para níveis > 500 mg/dl. Ratinhos foram considerados como possuindo proteinúria se duas amostras consecutivas de urina fossem avaliadas em 2 ou mais elevado.
Resultados: Os resultados dos ratinhos infetados com adenovirus tratados com anticorpos anti-IFNARl estão apresentados na Figura 13. Ratinhos infetados com Adv-mIFNa, 5 exibem proteinuria com um início da doença a cerca de 3 semanas. Ratinhos infetados tratados com o anticorpo IgO murino de controlo não são protegidos do início de proteinuria ao longo do curso da experiência como demonstrados por um início de proteinuria registado para cerca de 4 semanas. Ratinhos tratados com anticorpos anti-IFNAR não mostram evidência de proteinúria ao longo do período de 8 semanas. Ratinhos tratados com o controlo adenovírico não mostram proteinúria ao longo do curso da experiência.
Conclusões: Tidos conjuntamente, os dados neste Exemplo demonstram que a presença de anticorpos anti-IFNAR é protetora contra proteinúria induzida por adv-IFN num modelo murino in vivo. 6.14 Exemplo 14: Anticorpos antl-IFNAR bloqueiam a regulação genética induzida por IFN Tipo 1
Objetivo: Demonstrar que anticorpos anti-IFNARl inibem ou reduzem a regulação genética do Interferão Tipo 1 num modelo murino de SLE. Métodos: Ratinhos de procedimentos experimentais descritos no Exemplo 13 também forneceram amostras para análise neste Exemplo. 0 RNA foi preparado a partir de tecidos usando Solução-tampão de lise RLT (Qiagen). Para tecidos sólidos (rim, baço, derme) , não mais do que 50 mg de tecido foi usado para o processamento de RNA de cada vez. As amostras foram colocadas em solução-tampão de lise e matriz de lise A (Qbiogene), e processados durante 3 segundos a 4,5 m/s usando um instrument homogeneizador Fastprep24 (Thermo Electron Corporation, Waltham, MA). Para PBMCs, as amostras de sangue total foram centrigfugadas e o pellet foi lisado em tampão RLT. Após a lise, as amostras foram prontamente congeladas a -80°C até serem adicionalmente processadas. Para isolar o DNA, os lisados tecidulares foram primeiro processados usando colunas de extração Qiashredder, depois volumes iguais de etanol a 70% foram adicionados aos lisados tecidulares e o RNA foi purificado usando o kit de minicolunas de extração Rneasy de acordo com as indicações do fabricante. cDNA foi gerado a partir de 3 pg de RNA usando Transcriptase reversa Superscript III e oligo d(T) como descrito no protocolo do fabricante (Invitrogen, Corp. Carlsbad, CA). As amostras de cDNA foram dilu+idas em água livre de nuclease e armazenadas até -80°C.
Os níveis de expressão de genes selecionados foram medidos por PCR de Análise de PCR quantitativo em tempo real TaqMan® usando o sistema ABI 7900HT de PCR quantitativo em tempo real (Applied Biosystems, Foster City, CA) . Como padrão, o gene β-actina foi usado como controlo endógeno. As misturas de reação apresentavam um volume final de 20 μΐ consistindo de Ιμΐ de cDNA, 2 μΐ de primers 20x e sondas (TaqMan® Gene Expression Assays, Applied Biosystems) e 18 μΐ da mistura diluída de TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix. As condições de amplificação foram: 20 segundos a 95°C, 50 ciclos de 1 segundo a 95 °C e 20 segundos a 60°C. Os valores de CT variam entre 0 e 50, com o último número a representar a ausência de produto formado. A quantificação da expressão genética foi realizada usando o método CT comparativo (Sequence Detetor User Bulletin 2; Applied Biosystems) e reportado como a diferença relativamente ao gene "padrão".
Resultados: Interferão Tipo 1 ectopicamente expresso em ratinhos (ver exemplo 13) leva à indução de um número de genes. Apresentados na Figura 14 estão as mudanças em seis genes responsivos do Interferão Tipo 1 em diferentes populações de ratinhos usados nesta experiência. Especificamente, os genes IFIT1, IFI44, IFI202b, CXCL9, CXCL10, e CXCL11 são todos induzíveis em ratinhos expressando ectopicamente IFNcx e tratados com IgG murino inespecífico. Ratinhos expressando ectopicamente IFNa e tratados com anticorpos anti-IFNAR não apresentam qualquer indução nos seis genes responsivos de Interferão Tipo 1. Como um controlo para demonstrar a especificidade do IFNa codificado adenoviricamente, ratinhos tratados com PBS, ou adenovirus de controlo não apresentam qualquer indução nesses 6 genes. Estes resultados demonstram que a administração de anticorpos anti-IFNAR pode bloquear a resposta de indução genética a IFN alfa num modelo murino in vivo.
Conclusões: Anticorpos anti-IFNAR podem bloquear a regulação de genes responsivos do Interferão Tipo 1 no no modelo murino de SLE. 6.15 Exemplo 15: Anticorpos antl-IFNAR bloqueiam a produção de anticorpos AntidsDNA e Anti-SSA/Ro (antigénio antinuclear) induzidos por Interferão Tipo 1
Objetivo: Demonstrar a capacidade dos anticorpos anti-IFNAR para bloquearem a produção de anticorpos antinucleares, tais como anticorpos antidsDNA e anti-SSa/Ro induzidos por Interferão Tipo 1 num modelo murino deSLE. Métodos: Ratinhos foram preparados e tratados como decsrito no Exemplo 13. Os niveis séricos de autoanticorpo antidsDNA foram avaliados por ELISA. Sucintamente, Placas ELISA tratadas com poli (L-lisina) (100 pg/mlj foram revestidas com DNA ativado de timo de bezerro (5 pg/ml em solução-tampão carbonato-bicarbonato) (SIGMA). Após incubação overnight a 4°C, as placas foram bloqueadas com PBS/10% FCS. Soro (diluição 1/200) foi incubado durante 30 minutos à temperatura ambiente. O IgG ligado foi detetado com IgG antimurino de cabra conjugado a peroxidase (1/4000) (KPL) adicionado às placas durante 30 min. A ligação foi medida através da adição de substrato TMB (KPL) e solução stop (KPL) , e a absorvância foi lida a 450 nm. Um padrão de IgG murino antidsDNA em soro foi corrido em diluição serial (de 625 ng/ml) (Alpha Diagnostic) em cada placa para permitir estandardização. Os niveis séricos de autoanticorpo anti-SSA/Ro foram medidos por ELISA (Alpha Diagnostic) seguindo as instruções do fabricante.
Resultados: Interferão Tipo 1 ectopicamente expresso em ratinhos (ver Exemplo 13) leva à acumulação de anticorpos antidsDNA e anti-SSA/Ro. Apresentados na Fig. 15 estão as quantidades relativas de anticorpos antidsDNA (A) e anti-SSA/Ro (B) em diferentes populações de ratinhos (adenovirus de controlo, Adv-IFNa + PBS, Adv-IFNa + MulgG, e Adv-IFNa + Anti-IFNAR) como medido por ELISA. Ratinhos infetados com adenovirus de controlo mostram pouca acumulação de anticorpos antidsDNA ou anti-SSA/Ro nesta experiência. Ratinhos infetados com adenovirus codificando IFNoí e tratados com PBS acumulam anticorpos antidsDNA e antiSSA/Ro. Ratinhos infetados com Adv-IFNa e tratados com anticorpos anti-IFNAR adquirem menos anticorpos antidsDNA e anti-SSA/Ro do que ratinhos infetados com Adv-IFNa e tratados com IgG inespecifico. Estes resultados demonstram que o tratamento com anticorpos anti-IFNAR inibe a acumulação de anticorpos antidsDNA e anti-SSA/Ro em resposta a IFN Tipo 1 ectopicamente expresso. 6.16 Exemplo 16: Anticorpos anti-IFNAR bloqueiam a produção de IP-10 e IL-18 induzidos por Interferão Tipo 1
Objetivo: Demonstrar a capacidade dos anticorpos anti-IFNAR para bloquear a acumulação de citocinas induzidas por IFNa num modelo murino de SLE. Métodos: Ratinhos de procedimentos experimentais descritos no Exemplo 13 também forneceram amostras para análise neste Exemplo. Os niveis séricos de citocinas foram medidos por ELISA (R&D systems) seguindo as instruções do fabricante.
Resultados: Interferão Tipo 1 ectopicamente expresso em ratinhos (ver Exemplo 13) leva à acumulação de citocinas IP-10 e IL-18. Apresentados na Figura 16 estão as quantidades relativas de IP-10 (A) e IL-18 (B) em diferentes populações de ratinhos (PBS, adenovirus de controlo, Adv-IFNa+MulgG, e Adv-IFNa + Anti-IFNAR) como medido por ELISA. Interferão Tipo 1 ectopicamente expresso em ratinhos (ver Exemplo 12) leva à acumulação das citocinas, IP-10 e IL-18. Ratinhos infetados com adenovirus de controlo mostram pouca acumulação de citocinas IP-10 (A) ou IL-18 (B) nesta experiência. Ratinhos infetados com Adv-IFNa tratados com anticorpos anti-IFNAR acumulam menos citocinas IP-10 e IL-18 do que ratinhos infetados com Adv-IFNa tratados com IgG inespecifico. Estes resultados demonstram que o tratamento com anticorpos anti-IFNAR inibe a acumulação de citocinas IP-10 e IL-18 em resposta a IFN Tipo 1 ectopicamente expresso.
Conclusões: Anticorpos anti-IFNAR são capazes de bloquear a acumulação de Citocinas induzidas por IFNa num modelo murino de SLE. 6.17 Exemplo 17: Anticorpos anti-IFNAR bloqueiam a produção de ANA (Anticorpos antinucleares) induzidos por Interferão Tipo 1
Objetivo: Demonstrar a capacidade dos anticorpos anti-IFNAR para bloquear a acumulação de Anticorpos antinucleares induzidos por IFNa num modelo murino de SLE. Métodos: Ratinhos de procedimentos experimentais descritos no Exemplo 13 também forneceram amostras para análise neste Exemplo. Os niveis de anticorpo antinuclear (ANA foram medidos pelo kit de teste ANA (Anticorpos Incorporated) com substrato estabilizado Hep-2 e figuras mitóticas seguindo as instruções do fabricante. Soro foi diluido serialmente e incubado com Células Hep-2 em lâminas e o anticorpo antinuclear ligado foi detetado por Hi-FITC com IgG antimurino de cabra marcado (H+L) (Anticorpos Incorporated) . 0 titulo de ANA é definido como o fator de diluição sérico onde o ANA não é mais detetável.
Resultados: Interferão Tipo 1 ectopicamente expresso em ratinhos (ver Exemplo 13) leva à acumulação de anticorpos anti-ANA. Apresentadas na Figura 17 está o titulo sérico de anticorpos anti-ANA em diferentes populações de ratinhos (ausência de virus, adenovirus de controlo, Adv-IFNa + PBS, Adv-IFNa+MulgG, e Adv-IFNa + Anti-IFNAR) como medido coloração com diluição serial em células HEP2. Ratinhos infetados com adenovirus de controlo mostram pouca acumulação de anticorpos anti-ANA nesta experiência. Ratinhos infetados com adenovirus codificando IFNa e tratados com PBS acumulam anticorpos anti-ANA. Ratinhos infetados com Adv-IFNa tratados com anticorpos anti-IFNAR adquirem menos anticorpos anti-ANA do que ratinhos infetados com Adv-IFNa tratados com IgG inespecífico. Estes resultados demonstram que o tratamento com anticorpos anti-IFNAR inibe a acumulação de anticorpos anti-ANA em resposta a IFN Tipo 1 ectopicamente expresso.
Conclusões: Anticorpos anti-IFNAR são capazes de bloquear a acumulação de anticorpos antinucleares induzidos por IFNa num modelo murino de SLE.
6.18 Exemplo 18: Inibição via Anticorpos do Desenvolvimento de Células Dendriticas Mediado por Plasma SLE
Objetivo: 0 plasma SLE induz o desenvolvimento de células dendriticas a partir de monócitos humanos normais. Neste Exemplo, o anticorpo monoclonal purificado 9D4-TM foi testado para a inibição do desenvolvimento de células dendriticas, como determinado pela capacidade dos anticorpos para inibir a indução de marcadores da superfície celular CD38, e CD123 por ação do plasma SLE. Métodos: Os métodos foram previamente descritos no Pedido de Patente U.S. No. 2006/0029601. Essencialmente, as experiências foram conduzidas como se segue: 25 ml da camada leuco-plaquetária foi diluida quatro vezes com solução-tampão fostato salina (PBS). A amostra foi separada em tubos cónicos 4x50 ml, e 15 ml do meio de separação de linfocitos (ICN Biomedicals) foi colocado por debaixo. Após uma centrifugação de 30 min a 500 g, a camada leuco-plaquetária contendo as células mononucleadas do sangue periférico (PBMCs) foi removida e lavada com PBS. As células foram ressuspendidas em meio de cultura contendo 1 % soro humano inativado por temperatura a 4xl06 células/mL. Monócitos foram isolados através da incubação de PBMCs (2,0xl07 células/5 ml/25 cm2 flask) durante 1,5 horas a 37°C em meio de cultura e depois removidas por lavagem as células não-aderentes. Para indução da maturação de monócitos, as células foram incubadas com meio contendo 25% de plasma humano de voluntários saudáveis ou de pacientes com SLE. Estudos de bloqueio de anticorpo foram conduzidos através da adição de 30 pg/ml de anticorpo anti-IFNARl ou controlo isotípico, IgGl, à cultura. As células foram incubadas durante 4 dias, lavadas com PBS, e tratadas com Verseno 1:5000 durante 10 minutos a 37°C. Quando necessário, as células eram destacadas por raspagem celular leve antes de serem lavadas e analisadas. Cada cultura foi ressuspendida em meio de coloração (Solução salina de Hank com 0,2% bicarbonato de sódio, 0,01 % Azida de Sódio, 0,1 mM EDTA, 20 mM HEPES, e 2% soro fetal de bezerro) e separada equitativamente em seis poços de uma microplaca de 96-poços com fundo em V. As células foram centrifugadas a 2100 rpm numa centrífuga Sorvall RTH-750, e ressuspendidas em 25 pL de meio de coloração. Um micrograma de anticorpo específico conjugado com ficoeritrina foi adicionado a cada poço e incubado em gelo durante 45 minutos. As células foram lavadas três vezes, ressuspendidas em 200 pL de paraformaldeido em PBS 2%, são analisadas por citometria de fluxo com o aparelho Becton Dickinson FACScalibur. As escalas foram traçadas no lado V normal do gráfico de dispersão para remover células contaminantes da análise
Resultados: Nesta experiência, a diferenciação de monócitos humanos em células dendríticas em resposta a IFN derivado do plasma de pacientes de SLE foi bloqueada através do tratamento com 9D4-TM como medido por expressão à superfície de dois marcadores de células dendríticas, CD38 e CD123. Na Figura 18, múltiplas amostras de soro de pacientes de SLE falharam em aumentar a expressão à superfície de CD38 e CD123 na presença de 9D4-TM. Os valores de IC50 para 9D4-TM variaram de 0,02 nM a 0,06 nM para ambos CD38 e CD123.
Conclusões: O anticorpo anti-IFNARl 9D4-TM foi capaz de bloquear a capacidade dos IFNcx derivados de pacientes de SLE para induzir a maturação de pDC como medido por expressão de marcadores da superfície celular. 6.19 Exemplo 19: Anticorpos anti-IFNAR suprimem a expressão de CD38, CD123 e CD86 em monócitos estimulados com IFN-Leucócito.
Objetivo: Neste Exemplo, os anticorpos 9D4, 9D4-DM e 9D4-TM foram testados para a inibição do desenvolvimento de células dendríticas, como determinado pela capacidade dos anticorpos para inibirem a indução de marcadores da superficie celular CD38, e CD123 por IFN de leucócitos. Métodos: Monócitos foram isolados de sangue total de dadores saudáveis usando um meio de separação de linfócitos (MP Biomedical, Solon OR) seguido por seleção positiva usando 0 kit de isolamento de Monócitos II (Milteny Biotec, Auburn CA) . Monócitos purificados foram então cultivados a lxlO6 células/mL em meio RPMI 1640 suplementado com 10% FBS (Gibco BRL) . Anticorpos diluidos serialmente foram preparados às concentrações finais de 3 pg/ml - 20 pg/mL em meio e foram adicionados nos poços apropriados das células. Após preincubação de aproximadamente 5 minutos, 100 IU/mL de IFN humano de leucócitos (PBL Biomedical, Piscataway NJ) foi adicionado nos poços apropriados e as culturas foram incubadas a 37 °C, 5% C02 durante 48 horas após o que a expressão à superficie de CD38 r CD123 foi avaliada. Sucintamente, células foram concentradas por centrifugação a 2200rpm durante 5 minutos e o meio de cultura foi removido das monocamadas por aspiração seguida por uma lavagem lx com PBS esterilizado. O PBS foi removido e lmL tampão de dissociação celular esterilizado (Gibco BRL, Carlsbad CA) ou tripsina 0,05% (Invitrogen, Carlsbad CA) foi adicionada aos poços para remover as células da monocamada. Após 5 minutos e uma breve agitação, volumes iguais de meio RPMI 1640 suplementado com 10% FBS foi adicionado a cada poço, seguida por duas séries de centrifugações e lavagens com PBS esterilizado. 50 pL de lx PBS suplementado com 5% BSA (Sigma, St. Louis MO) e 10 pg/ml de IgG humano completo (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove PA) foi adicionado a cada poço para bloqueio da ligação ao anticorpo Fc inespecifica e incubado durante 10 minutos à temperatura ambiente. 50 pL de lx PBS suplementado com 5% BSA e anticorpos CD123 anti- PE humano e CD38 anti-FITC humanos (Becton Dickinson, Franklin Lakes NJ) foram adicionados nos poços apropriados e incubados durante 30 minutes em gelo. As células foram lavadas uma vez em lx PBS suplementado com 5% BSA e a expressão de proteínas à superfície foi medida num aparelho BD LSRII (Becton Dickinson, Franklin Lakes NJ).
Resultados: Apresentados na Figura 19 estão as curvas de supressão de expressão de CD38 (A), CD 123 (B), e CD86(C) exibidas por PBMCs estimulados por IFN-leucócitos incubados com anticorpos anti-IFNAR 9D4, 9D4DM, e 9D4-TM. Para cada molécula CD, os anticorpos anti-IFNAR produziram curvas de supressão similares que foram utilizadas para gerar os valores de IC50. Para a expressão de CD38 em PBMCs estimulados com IFN-leucócitos (A) , os anticorpos anti-IFNAR produziram valores de IC50 como se segue: 9D4=4,3 ng/ml, 9D4DM=40 ng/ml, 9D4-TM=25 ng/ml. Para a expressão de CD123 em PBMCs estimulados com IFN-leucócitos (B), os anticorpos anti-IFNAR produziram valores de IC50 como se segue: 9D4=7 ng/ml, 9D4DM=21 ng/ml, 9D4-TM=10 ng/ml. Para a expressão de CD86 em PBMCs estimulados com IFN-leucócitos (C), os anticorpos anti-IFNAR produziram valores de IC50 como se segue: 9D4=20 ng/ml, 9D4DM=20 ng/ml, 9D4-TM=26 ng/ml.
Conclusões: Os resultados neste Exemplo demonstram que anticorpos 9D4-DM e 9D4-TM exibem curvas de supressão similares de Indução via IFN em marcadores de superfície celulares em pDC comparativamente com o anticorpo parental 9D4 . 6.20 Exemplo 20: Anticorpos anti-IFNARl modificados exibem ligação diminuída ao recetor Fc FcrRI.
Objetivo: Demonstrar a ligação diminuída do recetor Fc específico para anticorpos anti-IFNARl modificados. Métodos: A atividade de ligação de anticorpos modificados 9D4-DM e 9D4-TM a FcyRI humano (CD64) foi avaliada por ELISA. FcyRI em PBS (pH7,4) foi revestido a 25 μΐ/poço numa microplaca (Costar cat. 3690) à concentração de 20 pg/ml overnight a 4°C. Após lavagem e bloqueio com 4% leite lhr à temperatura ambiente, os 9D4, 9D4-TM, e 9D4DM bioatinilados e anticorpos de controlo foram adicionados na placa previamente bloqueada e incubados a 37 °C por uma hora, começando a 500 pg/ml e depois na diluição serial de duas vezes. A placa foi lavada com PBS (pH7,4) contendo 0,05 % de Tween 20 e 25 pL de avidina conjugada com HRP foi adicionada a cada poço. Após uma hora de incubação a 37°C, as placas foram lavadas novamente e 50 μΐ/poço do substrato SureBlue TMB peroxidase (KPL cat. 52-00-03) foi adicionado. A reação foi parada com 50 μΐ de 0,2M H2SO4 após desenvolvimento de 5-10 minutos. O sinal de ELISA foi lido a 450 nm.
Resultados: Num ensaio de ligação baseado em ELISA (Figura 20), Anticorpos anti-IFNARl modificados 9D4DM E 9D4-TM exibiram afinidades de ligação mais baixas a FcyRI do que anticorpos 9D4-WT não-anticorpos modificados assim como o anticorpo de controlo.
Conclusões: Estes resultados demonstram que os anticorpos anti-IFNARl modificados 9D4-DM r 9D4-TM produzem uma afinidade mais baixa para o recetor Fc FcyRI
comparativamente com o anticorpo não-modifiçado 9D4. A afinidade mais baixa para o recetor FcyRI levaria a uma menor indução de ADCC. 6.21 Exemplo 21: O recetor Fc FcyRIIIA exibe ligação reduzida aos anticorpos anti-IFNARl modificados.
Objetivo: Demonstrar a ligação diminuída do recetor Fc específico para os anticorpos anti-IFNARl modificados 9D4-DM e 9D4-TM comparativamente com os anticorpos anti-IFNARl 9D4 não-modifiçados.
Métodos: 50 pg/ml de anticorpos 9D4, 9D4-TM, e 9D4DM diluídos em PBS foram revestidos numa microplaca Immunlon IV overnight a 4°C. Após lavagem e blogueio com 4% leite lhr à temperatura ambiente, as variantes FcyRIIIA 158F (baixa afinidade) e 158V (elevada afinidade) com sequência Flag foram adicionados aos poços da placa bloqueada, começando a 50 pg/ml e depois numa diluição serial de duas-vezes. A placa foi lavada uma hora depois e incubada com anticorpo anti-Flag conjugado com biotina (Sigma) a 2 pg/ml. Após lavagem, 25pL de Avidina conjugada com HRP foi adicionada a cada poço. Os materiais não ligados foram removidos por lavagem 1 hora após incubação. O sinal de ligação foi detetado com o substrato TMB.
Resultados: Os resultados de um ensaio de ligação baseado em ELISA entre anticorpos anti-IFNARl (9D4WT, 9D4DM, e 9D4-TM) e a alta e baixa afinidade do recetor Fc FcyRIIIA são apresentados na Fig. 21 (A, B, C) . Na Fig 21 (A) anticorpos 9D4WT revestidos na placa ELISA eficientemente ligam-se com elevada afinidade Ao recetor FcyRIIIA a concentrações maiores do que 3 ng/ml onde existe uma ligação limitada ao recetor de baixa afinidade FcyRIIIA a todas as concentrações testadas. Na Fig. 21(B) anticorpos 9D4DM modificados revestidos na placa ELISA não se ligam eficientemente com elevada ou baixa afinidade aos recetores FcyRIIIA a nenhuma das concentrações testadas. Similarmente, na Fig 21 (C) anticorpos 9D4-TM modificados revestidos na placa ELISA não se ligam eficientemente com elevada ou baixa afinidade aos recetores FcyRIIIA a nenhuma das concentrações testadas.
Conclusões: Estes resultados sugerem que os anticorpos anti-IFNARl modificados 9D4-DM e 9D4-TM apresentam uma afinidade diminuída para o recetor FcyRIIIA comparativamente com os anticorpos anti-IFNARl 9D4 não-modifiçados. Adicionalmente, a afinidade diminuída para o recetor Fc específico poderia levar a uma diminuição na Função executora ADCC. 6.22 Exemplo 22: Os anticorpos modificados 9D4DM e 9D4-TM exibem ligação reduzida para o recetor Fc FcyRIIIA.
Objetivo: Demonstrar a ligação diminuída do recetor Fc específico para anticorpos modificados 9D4DM e 9D4-TM. Métodos: 50 pg/ml das variantes FcyRIIIA (FcyRIIIA-10 158F e FcyRIIIA-10 158V) em PBS foram revestidas em microplacas Immunlon IV overnight a 4°C. Após lavagem e bloqueio com 4% leite lhr à temperatura ambiente anticorpos 9D4, 9D4-TM, e 9D4DM bioatinilados foram adicionados aos poços da placa bloqueada a 100 pg/ml. A placa foi lavada uma hora depois e incubada com Avidina conjugada com HRP. Os materiais não-ligados foram removidos por lavagem 1 hora após incubação. O sinal de ligação foi detetado com o substrato TMB.
Resultados: Os resultados de um ensaio de ligação baseado em ELISA entre os recetores de alta e baixa afinidade Fc
FcyRIIIA e anticorpos anti-IFNARl (9D4WT, 9D4DM, e 9D4-TM) são apresentados na Figura 22 (A, B, C) . Na Figura 22 (A) , os anticorpos anti-IFNARl 9D4 não-modifiçados, a concentrações maiores do que 3 ng/ml, eficientemente ligam-se ao recetor de elevada afinidade FcyRIIIA imobilizado na placa ELISA, enquanto os anticorpos demonstram ligação limitada ao ao recetor imobilizado de baixa afinidade FcyRIIIA a todas as concentrações testadas. Na Figura 22(B) os anticorpos anti-IFNARl modificados 9D4DM não se ligam eficientemente com recetores imobilizados de alta ou baixa afinidade FcyRIIIA a nenhuma das concentrações testadas comparativamente com o anticorpo 9D4WT anti-IFNARl não-modif içado. Similarmente, na Figura 22(C) os anticorpos anti-IFNARl modificados 9D4-TM não se ligam eficientemente aos recetores imobilizados de alta ou baixa afinidade FcyRIIIA a nenhuma das concentrações testadas comparativamente com o anticorpo 9D4WT anti-IFNARl não-modif içado .
Conclusões: Este Exemplo demonstra que os anticorpos modificados 9D4DM e 9D4-TM, exibem afinidade diminuida para o recetor Fc, FcyRIIIA comparativamente com o anticorpo parental 9D4 não-modifiçado. Esta afinidade reduzida poderia levar a uma diminuição na Função executora ADCC mediada por FcyRIIIA comparativamente com o anticorpo parental. 6.23 Exemplo 23: Neutralização dos Subtipos IFNot por anticorpos anti-IFNARl.
Objetivo: Demonstrar a capacidade dos anticorpos anti-IFNARl MDX-1333, 9D4WT, e 9D4-TM para neutralizar subtipos específicos IFNcx num ensaio repórter. Métodos: Ensaios repórter para a neutralização de IFNoí encontram-se bem documentos no estado da técnica. Neste Exemplo, A neutralização de IFNa é medida por um ensaio repórter baseado em HiL3. Um exemplo de um ensaio de neutralização de IFNa usando células HiL3 como repórteres é como se segue: Uma linha celular de hepatomas humanos HiL3 foi transfetada com um plasmideo contendo um elemento de resposta-luciferase estimulado por IFNa (ISRE-Luc), e um gene resistente a neomicina. Estas células foram gentilmente fornecidas por Dr Michael Tovey (CNRS, Paris, France). Hil3, 30,000 células/poço, foram cultivadas em microplacas de 96-poços brancas para medições óticas (DYNEX Microlite) e crescidas overnight em meio Eagle modificado por Dulbecco contendo 10% soro fetal bovino e 1 mg/ml G418 (+penicilina/estreptomicina/L-glutamina). Após esta incubação, várias formas de interferão foram adicionadas as placas foram cultivadas durante 18 horas. A reação foi terminada através da adição de 10 ml de solução-tampão de lise ao frasco com substrato luciferase (Luc Lite Plus kit, Perkin-Elmer); 100 pL desta solução de substrato foi adicionada a cada poço e lida num aparelho Top Count durante 10 minutos (10 minutos de incubação no escuro, depois 1 segundo de leitura/poço). As contagens por segundo (cps) a cada concentração de IFN foram determinadas e a concentração de IFN ou cps em cada amostra foi calculada a partir da curva de titulação de IFN usando software GraphPad Prism (San Diego, CA) com parâmetros de regressão linear.
Resultados: A capacidade de neutralização para anticorpos anti-IFNARl para várias espécies IFN num ensaio repórter HiL3 está apresentada na Figura 23 (A-E) . Os anticorpos anti-IFNARl MDX-1333, 9D4WT e 9D4-TM inibem múltiplos subtipos de Interferão Tipo 1 com potência similar. Os anticorpos anti-IFNARl MDX-1333, 9D4WT e 9D4-TM neutralizam IFNalO (A) com valores de IC50 de 0,09880 pg/ml, 0,008345 pg/ml, e 0,004287 pg/ml respetivamente. Os anticorpos anti-IFNAR1 MDX-1333, 9D4WT e 9D4-TM neutralizam o IFN de leucócitos humano (B) com valores de IC50 de 1,121 pg/ml, 0,02104 pg/ml, e 0,02120 pg/ml respetivamente. Os anticorpos anti-IFNARl MDX-1333, 9D4WT e 9D4-TM neutralizam o IFNcx 2b (C) com valores de IC50 de 0,0006462 pg/ml, 0. 002789 pg/ml, e 0,0008279 pg/ml respetivamente. Os anticorpos anti-IFNARl MDX-1333, 9D4WT e 9D4-TM neutralizam o IFNoo (D) com valores de IC50 de 5, 323 pg/ml, 0,01015 pg/ml, e 0,01423 pg/ml respetivamente. Os anticorpos anti-IFNAR1 MDX-1333, 9D4WT e 9D4-TM neutralizam ο ΙΡΝβ (E) com valores de IC50 de 18,97 pg/ml, 0,7403 pg/ml, e 0,2611 pg/ml respetivamente.
Conclusões: Estes resultados indicam que os anticorpos anti-IFNARl MDX-1333, 9D4WT (não-modifiçados) e 9D4-TM (modificados) possuem capacidade e especificidade de neutralização similares para múltiplos Interferões do Tipo 1.
6.24 Exemplo 24: Anticorpos anti-IFNARl neutralizam o IFN Tipo 1 em plasma de pacientes SLE
Objetivo: Demonstrar a capacidade dos anticorpos anti-IFNARl para neutralizar o IFN Tipo 1 em plasma isolado de pacientes com SLE como medido por um ensaio repórter. Métodos: Células PIL-5 ISRE estavelmente transfetadas foram mantidas em meio RPMI 1640 + IX Pen-strep-glutamina + 10% FBS e plaqueadas a 100,000 células por poço em microplacas de 96 poços brancas com propriedades óticas in Optilix (VWR, West Chester PA). Anticorpos foram titulados e adicionados nos poços apropriados para uma concetração final variando entre 90 pg/ml - 60pg/mL. Amostras séricas positivas para Interferão Tipo 1 de pacientes com SLE foram adicionados a cada poço para uma percentagem sérica final de 50% por poço. As células, IFN, e anticorpos foram incubados overnight a 37°C, 5% CCp. Após a incubação overnight, as células foram concentradas rapidamente por centrifugação a 1200 rpm durante 5 minutos e amplificação da proteína luciferase foi avaliada por lise das células com reagente de lise celular e a visualização usando o Sistema de Ensaio Luciferase (Promega, Madison WI). O sinal foi medido em cps e as curvas de IC50 foram geradas usando o software de análise GraphPad Prism 4.
Resultados: 9D4-TM neutralizam os Interferões do Tipo 1 em plasma de pacientes de SLE. Os resultados de um ensaio de neutralização de Interferões do Tipo 1 em plasma de pacientes de SLE estão apresentados na Figura 24. Neutralização dos Interferões Tipo 1 contidos na amostra de plasma dos pacientes de SLE é especificamente neutralizada com 9D4-TM versus um controlo isotípico a concentrações crescentes de anticorpo. Especificamente, 9D4-TM exibe um IC50 de 0,04 nM para a neutralização dos Interferões do Tipo 1 nesta amostra de plasma retirada de um paciente de SLE.
Conclusões: Este resultado sugere que os anticorpos anti-IFNAR1 modificados 9D4-TM apresentam a capacidade para efetivamente neutralizar o Interferão Tipo 1 em pacientes de SLE. 6.25 Exemplo 25: Anticorpos anti-IFNAR suprimem a população de pDCs induzida por IFNa em PBMCs
Objetivo: Demonstrar a capacidade dos anticorpos anti-IFNAR para suprimir a acumulação de células pDC no sangue periférico de ratinhos de um modelo de SLE. Métodos: Ratinhos de procedimentos experimentais descritos no Exemplo 13 também forneceram amostras para análise neste Exemplo. PBMCs foram isolados do baço, nódulos linfáticos, medula óssea e sangue periférico usando técnicas de isolamento estandardizadas e coradas para os marcadores de superfície B220 e Ly6C. As PBMCs isoladas foram analisadas por FACS e células duplamente positivas (B220 e Ly6C) foram registadas como células pDC e as populações relativas são representadas na Fig. 25.
Resultados: Os resultados apresentados na Figura 25, expressão exctópica de IFNa despoleta um aumento nas células pDC nas PBMCs isoladas do baço (A), nódulos linfáticos (B), sangue (C), e medula óssea (D) na presença de PBS ou IgG murino inespecifico. Ratinhos tratados com anticorpos anti-IFNAR não acumulam células pDC em resposta a IFN-alfa. Ratinhos tratados com adenovirus de controlo não acumulam pDCs na população de PBMCs.
Conclusões: Estes resultados sugerem que anticorpos anti-IFNAR especificamente bloqueiam sobrerregulação de células pDC mediada por IFNa. 6.26 Exemplo 26: Anticorpos anti-IFNARl modificados exibem afinidades de ligação reduzidas a recetores Fc.
Objetivo: Avaliar as afinidades de ligação relativas dos anticorpos anti-IFNARl modificados 9D4-DM e 9D4-TM com o anticorpo parental não-modificado 9D4 a vários recetores Fc. Métodos: Todas as experiências foram realizadas num instrumento BIAcore 3000 (BIAcore, Inc., Uppsala, Sweden). Numa experiência típica, soluções 1 μΜ de IgGs 9D4 foram usadas para imobilizar desde cerca de -7000 RUs - -11,000 RUs de proteína em superfícies de chips sensores CM5 usando um protocolo de acoplamento aminoacídico estandardizado (BIAcore, Inc.). Separadamente, uma superfície livre foi também preparada em cada chip usando um protocolo idêntico, menos a proteína. Esta superfície branca foi usada como uma célula de referência ao longo da experiência, e serviu para corrigir artefactos resultantes de ligação inespecífica e até de certas limitações da técnica. Para as experiências de ligação de teste, FcyRI foi preparado a 20nM em solução-tampão HBS-EP (BIAcore, Inc., consistindo dos seguintes elementos: lOmM Tampão HEPES, pH7,4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, e 0,005% P20. Entre injeções FcyRI, a superfície de IgG foi regenerada com uma injeção de 1 min de 5mM HC1. As sobreposições do sensor foram geradas usando o software de avaliação BIAevaluation 4,1 (BIAcore, Inc, Uppsala, Sweden).
Resultados: O anticorpo anti-IFNARl 9D4 e anticorpos anti-IFNARl modificados 9D4-TM e 9D4-DM foram testados para a afinidade de ligação a proteína imobilizada FcyRI num formato de ensaio BIAcore. Como representado na Figura 26, o anticorpo anti-IFNARl 9D4 exibe uma elevada afinidade para o FcrRI imobilizado. A ligação do anticorpo anti-IFNAR1 9D4 a FcyRI é especifica uma vez que o ensaio similar com ovalbumina exibe muito pouca afinidade para o recetor imobilizado. Os anticorpos anti-IFNARl modificados 9D4-TM e 9D4-DM exibem uma afinidade mais baixa do recetor imobilizado FcyRI comparativamente com o anticorpo anti-IFNARl não-modifiçado.
Conclusões: As baixas afinidades resultantes para FcyRI exibidas pelos anticorpos anti-IFNARl modificados 9D4-TM e 9D4-DM sugerem que esses anticorpos teriam uma capacidade diminuída para ativarem ADCC in vivo. 6.27 Exemplo 27: Recetores Fc exibem afinidades de ligação reduzidas para anticorpos anti-IFNARl modificados.
Objetivo: Avaliar as afinidades de ligação relativas de vários recetores Fc aos anticorpos anti-IFNARl modificados 9D4-DM e 9D4-TM e o anticorpo parental anti-IFNARl não-modif içado . Métodos: Medições de ressonância plasmónica de superfície
Todas as experiências foram realizadas num instrumento BIAcore 3000 (BIAcore, Inc., Uppsala, Sweden). Numa experiência típica, uma solução 1 μΜ de FcyRI foi usada para imobilizar aproximadamente -7000 RUs - ~ 11,000 RUs de proteína em superfícies de chips sensores CM5 usando um protocolo de acoplamento aminoacídico estandardizado (BIAcore, Inc.). Separadamente, uma superfície livre foi também preparada em cada chip usando um protocolo idêntico, menos a proteína. Esta superfície branca foi usada como uma célula de referência ao longo da experiência, e serviu para corrigir artefactos resultantes de ligação inespecífica e até de certas limitações da técnica. Para as experiências de ligação de teste, anticorpos foram preparados a 333nM em tampão HBS-EP (BIAcore, Inc., consistindo dos seguintes elementos: lOmM Tampão HEPES, pH7,4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, e 0,005% P20. Entre injeções de anticorpo, a superfície FcyRI foi regenerada com uma injeção de lmin de 3M MgC12. As sobreposições do sensor foram geradas usando o software de avaliação BIAevaluation 4,1 (BIAcore, Inc, Uppsala, Sweden).
Resultados: Os anticorpos anti-IFNARl 9D4, 9D4-TM e 9D4-DM foram imobilizados e incubados com FcrRI solúvel. A afinidade de ligação do recetor FcyRI solúvel para cada um dos anticorpos anti-IFNARl foi medida num ensaio BIAcore e os resultados estão representados na Figura 27 A, B, C. O FcyRI liga-se ao anticorpo imobilizado anti-IFNARl 9D4 com elevada afinidade e os resultados estão apresentados na Figura 27A. Esta interação foi altamente específica uma vez que ovalbumina solúvel não apresentou qualquer ligação ao anticorpo imobilizado anti-IFNARl 9D4. Os anticorpos modificados 9D4-TM e 9D4-DM não se ligaram a FcyRI tão fortemente como aos anticorpos 9D4 não-modifiçados nativos. Na Fig. 27B, os anticorpos anti-IFNARl modificados 9D4-DM foram imobilizados e incubados com FcyRI solúvel ou ovalbumina. 0 FcyRI exibiu uma baixa afinidade de ligação para o anticorpo 9D4-DM imobilizado. Esta afinidade ligação é similar à da interação inespecífica com ovalbumina solúvel. Na Fig. 27C, os anticorpos anti-IFNARl modificados 9D4-TM foram imobilizados e incubados com FcyRI solúvel ou ovalbumina. O FcyRI exibiu uma baixa afinidade de ligação para o anticorpo imobilizado 9D4-TM. Esta afinidade ligação é similar à da interação inespecífica com ovalbumina solúvel.
Conclusões: As afinidades reduzidas exibidas pelo recetor Fc FcyRI para os anticorpos imobilizados anti-IFNARl modificados 9D4-DM e 9D4-TM comparativamente com os anticorpos anti-IFNARl 9D4 não-modifiçados sugere que os anticorpos modificados exibiriam uma capacidade mais baixa de despoletar uma resposta ADCC. 6.28 Exemplo 28: Anticorpos anti-IFNAR bloqueiam a indução de genes responsivos IFNot
Objetivo: Demonstrar a capacidade dos anticorpos anti-IFNAR para bloquear a indução de genes responsivos IFNa num modelo murino de SLE. Métodos: Ratinhos de procedimentos experimentais descritos no Exemplo 13 também forneceram amostras para análise neste Exemplo. Após 8 semanas na experiência, os ratinhos foram sacrificados e o tecido renal foi removido. Não mais do que 50 mg de tecido foi usado para extração de RNA usando Solução-tampão de lise RLT (Qiagen) . As amostras foram colocadas numa solução-tampão de lise e matriz A de lise (Qbiogene), e processadas durante 30 seg a 4,5m/s usando um instrumento homogeneizador Fastprep24 (Thermo Electron Corporation, Waltham, MA). Para isolar o RNA, lisados tecidulares foram primeiramente processados usando colunas de extração Qiashredder, depois volumes equivalentes de etanol 70% foram adicionados aos lisados tecidulares e o RNA foi purificado usando Kits com colunas de extração Rneasy de acordo com as instruções do fabricante. cDNA foi produzido a partir de 3 pg de RNA usando Transcriptase reversa Superscript III e oligo d(T) como descrito no protocolo do fabricante (Invitrogen, Corp. Carlsbad, CA). Amostras de cDNA em água livre de nucleases e armazenadas a -80 °C.
Os níveis de expressão de genes selecionados foram medidos por Análise de PCR quantitativo em tempo real TaqMan® usando o sistema de PCR quantitativo em tempo real ABI 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA). 0 padrão do gene β-actina foi usado como controlo endógeno. As misturas de reação apresentavam um volume final de 20 μΐ consistindo de 1 μΐ de cDNA, 2 μΐ de primers e sondas 20x (TaqMan® Gene Expression Assays, Applied Biosystems) e 18 μΐ da mistura diluída TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix. Condições de amplificação foram as seguintes: 20 segundos a 95°C, 50 ciclos de 1 segundo a 95 °c e 20 segundos a 60°C. Os valores de CT variam entre 0 a 50, com o último número a representar a ausência de produto formado. A quantificação da expressão genética foi realizada usando o método CT comparativo (Sequence Detetor User Bulletin 2; Applied Biosystems) e reportado como a diferença relativamente ao gene "padrão".
Resultados: Apresentados na Figura 28 estão resultados de uma análise de expressão comparativa no rim de 6 genes induzidos por Interferão alfa após 8 semanas num modelo murino de lúpus. Ratinhos expressando ectopicamente interferão alfa foram tratados com IgG murino ou anticorpos anti-IFNAR. Após 8 semanas, os ratinhos tratados com IgG de controlo demonstraram uma forte indução de Genes responsivos IFNoí nomeadamente ICAM1, VCAM1, CXCL9, CXCL10, e IFIT1. Ratinhos tratados com anticorpos anti-IFNAR não apresentaram indução de genes responsivos IFNoí após 8 semanas.
Conclusões: No modelo murino de lúpus acelerado, tratamento com anticorpos anti-IFNAR bloqueia a indução no rim de seis genes (ICAM1, VCAM1, CXCL9, CXCL10, e IFIT1) mediada pela expressão ectópica de IFN-alfa comparativamente com ratinhos de controlo como medido por um ensaio Taqman. Estes resultados demonstram que anticorpos anti-IFNAR são capazes de bloquear a sinalização mediada por IFNa num modelo murino de SLE. 6.29 Exemplo 29: Anticorpos anti-IFNAR inibem a acumulação de autoanticorpos no soro
Objetivo: Demonstrar a capacidade dos anticorpos anti-IFNAR para inibirem a acumulação de autoanticorpos no soro de ratinhos num modelo SLE. Métodos: Ratinhos de procedimentos experimentais descritos no Exemplo 13 também forneceram amostras para análise neste Exemplo. Amostras de sangue total foram retiradas em intervalos de 1 semanas nas semanas 2-7 do regime. Os niveis séricos de autoanticorpo antidsDNA foram avaliados por ELISA. Sucintamente, placas ELISA tratadas com poli (L-lisina) (100 pg/ml) foram revestidas com DNA ativado de timo de bezerro (5 pg/ml em solução-tampão carbonato-bicarbonato) (SIGMA). Após incubação overnight a 4°C, as placas foram bloqueadas com PBS/10% FCS. Soro (diluição 1/200) foi incubado durante 30 minutos à temperatura ambiente. O IgG ligado foi detetado com IgG antimurino de cabra conjugado a peroxidase (1/4000) (KPL) adicionado às placas durante 30 min. A ligação foi medida através da adição de substrato TMB (KPL) e solução stop (KPL), e a absorvância foi lida a 450 nm. Um padrão de IgG murino antidsDNA em soro foi corrido em diluição serial (de 625 ng/ml) (Alpha Diagnostic) em cada placa para permitir estandardização.
Resultados: Apresentados na Figura 29 estão os resultados de uma análise baseada em ELISA dos niveis de anticorpos antidsDNA em soro murino durante o curso temporal de um modelo murino de lúpus acelerado. Ratinhos expressando ectopicamente IFNa foram tratados com anticorpos anti-IFNAR ou anticorpos IgG murinos de controlo durante um regime de 7 semanas. Os ratinhos tratados com anticorpos anti-IFNAR não acumularam anticorpos antidsDNA à mesma velocidade ou com a mesma extensão de ratinhos tratados com anticorpos IgG de controlo. Ratinhos infetados com adenovirus de controlo não desenvolveram anticorpos antidsDNA ao longo do curso da experiência.
Conclusões: Estes resultados demonstram que anticorpos anti-IFNAR reduzem a acumulação de anticorpos antidsDNA em resposta a niveis elevados de IFN alfa. 6.30 Exemplo 30: Anticorpos anti-IFNAR reduzem proteinuria no modelo murino de lúpus acelerado.
Objetivo: Demonstrar a capacidade dos anticorpos anti-IFNAR para reduzir proteinuria estabelecida (configuração terapêutica) num modelo murino de SLE. Métodos: Ratinhos de procedimentos experimentais descritos no Exemplo 13 também forneceram amostras para análise neste Exemplo. Contudo, numa abordagem terapêutica, ratinhos foram permitidos desenvolver proteinuria como um sintoma de Lupus antes da aplicação de anticorpos. Especificamente, ratinhos foram permitidos desenvolver uma avaliação de proteinúria de 2,0 - 2,5 como previamente descrito. Uma vez o nivel limite de proteinúria ter sido atingido, um regime de tratamento com doses semissemanais de PBS, IgG de controlo ou anticorpos anti-IFNAR foi conduzida por 5 semanas adicionais. Em intervalos semissemanais, amostras de urina foram testadas e dadas uma avaliação de proteinúria.
Resultados: Apresentados na Figura 30A estão os resultados de um estudo terapêutico de anticorpos anti-IFNAR reduzindo a avaliação de proteinuria de ratinhos de um modelo de lúpus acelerado. Sucintamente, ratinhos foram permitidos desenvolver proteinuria no momento em que, ao coorte foi dado PBS, IgG de controlo ou anticorpos anti-IFNAR como forma de tratamento. Como documentado na figura, a avaliação de proteinúria decresceu apenas para o grupo recebendo anticorpos anti-IFNAR. Os ratinhos recebendo PBS ou IgG de controlo como tratamento continuaram a aumentar a avaliação de proteinúria ao longo do tempo. (B) Uma análise da área sob a curve para os resultados ao longo de 5 semanas determinou que o grupo de tratamento com os anticorpos anti-IFNAR diferia dos grupos PBS ou IgG de controlo sozinhos, sendo que estes eram bastante similares entre si.
Conclusões: Estes resultados demonstram que anticorpos anti-IFNAR poderiam ser usados numa configuração terapêutica de SLE. 6.31 Exemplo 31: Anticorpos anti-IFNAR reduzem a mortalidade no modelo murino de lúpus acelerado.
Objetivo: Demonstrar a capacidade dos anticorpos anti-IFNAR para reduzir a mortalidade numa configuração terapêutica no modelo murino de lúpus SLE. Métodos: Ratinhos de procedimentos experimentais descritos no Exemplo 30 também forneceram amostras para análise neste Exemplo. Numa abordagem terapêutica, ratinhos foram permitidos desenvolver proteinuria como um sintoma de lúpus antes da aplicação de anticorpos. Especificamente, ratinhos foram permitidos desenvolver uma avaliação de proteinúria de 2,0 - 2,5 como previamente descrito. Uma vez tendo sido ultrapassado o limite de proteinúria, um regime de tratamento de doses semissemanais de PBS, IgG de controlo ou anticorpos anti-IFNAR foi conduzido durante 5 semanas adicionais. A mortalidade total foi seguida por 4 semanas adicionais.
Resultados: Apresentados na Figura 31 estão as taxas de mortalidade de um estudo terapêutico de anticorpos anti-IFNAR num modelo de lúpus acelerado. Sucintamente, ratinhos foram permitidos desenvolver proteinuria no momento em que, ao coorte foi dado PBS, IgG de controlo ou anticorpos anti-IFNAR como tratamento. Ratinhos tratados com anticorpos anti-IFNAR não exibiram nenhuma mortalidade à semana 5, enquanto ratinhos tratados com PBS ou IgG de controlo exibiram taxas de moralidade de 87,5% e 62,5% respetivamente. Adicionalmente, ao longo do estudo de 9 semanas, animais tratados com anticorpos anti-IFNAR apresentaram uma taxa de sobrevivência comparável aos animais tratados com PBS ou IgG de controlo.
Conclusões: Os resultados neste Exemplo demonstram que anticorpos anti-IFNAR podem diminuir a mortalidade associada com lúpus. 6.32 Exemplo 32: Ausência de atividade ADCC mediada por 9D4-TM.
Objetivo: Para verificar que 9D4-TM é incapaz de induzir atividade ADCC, devido à sua pobre capacidade de ligação a FcyRI e FcyRIIIA, uma série de experiências foi conduzida. Métodos: células-alvo 293F foram marcados com o marcador celular DiO (Invitrogen, experiências I & II) e combinados com executores não-marcados PBMCs (durante 4h a 37°C, na ausência ou presença de 10 pg/ml de 9D4-TM, controlo negativo isotipico IgGl humano R3-47, anticorpo 9D4-WT ou anti-EphA2 usados como controlo positivo. Lise de células-alvo foi avaliada através da medição de DÍO+/PI+ (iodeto de propidio) marcação dupla positiva. Rácio alvo/executor= 50-1, percentagem de lise foi calculada de acordo com a fórmula: [(percentagem de marcação dupla positiva na presença de anticorpos - percentagem de marcação dupla positiva no meio sozinho) / (percentagem de marcação dupla positiva na presença de solução-tampão de lise percentagem de marcação dupla positiva no meio sozinho)]. 100% de lise foi conseguida com a adição de solução-tampão de lise (Promega).
Alternativamente, células-alvo 293FT foram incubadas com células de uma linha celular transgénica NK estavelmente expressando FcyRIIIA (experiência III) durante 4h a 37°C, na ausência ou presença de 10 pg/ml de 9D4-TM, controlo negativo isotipico IgGl humano R3-47, anticorpos 9D4-wt ou anti-EphA2 usados como controlo positivo. Rácio alvo/executor = 4/1 e percentagem de lise foi calculada de acordo com a fórmula: 100 x (Experimental - Executora Espontânea - Alvo Espontânea) / (Alvo Máximo-Alvo Espontâneo).
Nas experiências I & II (rácio PBMCs-293H = 50-1), a percentagem de lise foi calculada de acordo com a fórmula: [(percentagem de marcação dupla positiva na presença de anticorpos - percentagem de marcação dupla positiva no meio sozinho) / (percentagem de marcação dupla positiva na presença de solução-tampão de lise - percentagem de marcação dupla positiva no meio sozinho)]. Na experiência III (Linha celular transgénica NK expressando um rácio FcyIIIA-293H = 4/1), percentagem de lise foi calculada de acordo com a fórmula: 100 x (Experimental- Executora Espontânea - Alvo Espontânea) /(Alvo Máximo-Alvo Espontânea).
Resultados: O anticorpos modificado 9D4-TM ou o anticorpo não-modificado 9D4-WT não exibiram nenhuma atividade ADCC detetável em células 293F superior à observada com o anticorpo R3-47, (Tabela 4) . Por contraste, o anticorpo de controlo positivo, um anticorpo anti-EphA2, provocou um aumento de duas-vezes na citotoxicidade relativamente ao nivel basal. Estes resultados confirmam que 9D4-TM não pode mediar ADCC em alvos expressando IFNAR1.
Tabela 5: Avaliação da atividade ADCC de Anticorpos anti-IFNAR1.
Exp .I/11/111: experiências I/II/III. ND: não realizado
Conclusões: Estes resultados demonstram que anticorpos modificados anti-IFNARl 9D4-TM não estimulam nenhuma atividade ADCC detetável dirigida a células-alvo expressando IFNAR1. 6.33 Exemplo 33: Estruturas tridimensionais de uma região Fc Humana Compreendendo as Mutações L234F/L235E/P331S.
Objetivo: Para determinar as estruturas tridimensionais da região Fc IgGl humana compreendendo as mutações L234F/L235E/P331S (Fc-TM). Métodos:
Purificação de Fc-TM: 0 fragmento Fc/TM humano foi obtido a partir da clivagem enzimática 9D4-TM. A digestão foi realizada usando ficina imobilizada de acordo com as instruções do fabricante (Pierce). A purificação foi primeiramente realizada em colunas HiTrap Proteína A de acordo com as instruções do fabricante (GE Healthcare, Piscataway, NJ) . Após diálise em 50 mM NaOAc/pH 5,2, a solução proteica foi aplicada numa coluna HiTrap SP HP (GE Healthcare) e recolhida após a eluição. A fração eluída foi colocada numa coluna HiTrap Q (GE Healthcare) e eluída com um gradiente de NaCl para produzir uma preparação homogénea Fc/TM, como avaliado por SDS PAGE redutora e não-redutora. O perfil SDS-PAGE de Fc-TM mostrou a presença de apenas uma banda próxima de 25 kDa ou 50 kDa sob condições redutoras ou não-redutoras, respetivamente. Esta observação claramente demonstra a presença de pelo menos uma ligação dissulfureto intracadeias nas posições C226 e/ou C229. Consequentemente, os resíduos mutados 'a jusante' F234 e E235 estavam presentes na cadeia polipeptídica compreendendo o cristal.
Cristalização de Fc-TM: Fc-TM purificado foi concentrado até cerca de 5 mg/ml usando um concentrador Centricon (Millipore, Billerica MA,30 KDa cutoff). As condições de cristalização foram identificadas usando os padrões comerciais de rastreio de Hampton Research (Hampton Research, Aliso Viejo, CA), Emerald BioSystems (Emerald BioSystems, Inc., Bainbridge Island, W A) and Molecular Dimensions (Molecular Dimensions Inc., Apopka, FL) . Cada rastreio produziu várias condições de cristalização potencialmente úteis. Após otimização, cristais com qualidade de difração foram obtidos de 0,2 M acetato de zinco, 0,1 M imidazolo-Malato, pH 8,0, 5% PEG 3350, 5% glicerol à concentração proteica de 2,0 mg/ml. Sob essas condições, cristais bem definidos com três dimensões variando de 0,1 a 0,2 mm cresceram em 2- 3 dias.
Coleção de Dados: Os dados de difração foram recolhidos de um único cristal no Centro para Investigação Avançada em Biotecnologia (CARB, Universidade de Maryland Biotechnology Institute, Rockville, MD) um gerador de ânodo rotativo Rigaku MicroMax™ 007 com uma placa gráfica R-AXIS IV++ (Rigaku/MSC, The Woodlands, TX). Antes do arrefecimento, o cristal foi mantido por alguns minutos numa solução de crescimento suplementada com 20% glicerol. O cristal foi então arrefecido a 105 kelvins com um aparelho de criogenação X-stream 2000 Cryogenic cooler. Difração de até 2,3 Â foi conseguida após um ciclo de annealing como descrito (Oganesyan et al., 2007). Os dados de difração compreendendo 234 imagens foram recolhidos usando uma gama de oscilação de 0,5°, uma distância cristal/detetor de 200 mm e um tempo de exposição de 600 s. Os dados foram integrados e escalados usando o software HKL 2000 (Otwinowski & Minor, 1997).
Determinação da Estrutura: Os cálculos de substituição molecular, refinamento molecular, e de densidade de eletrões foram realizados usando a suite computacional CCP4 (Collaborative Computational Project). 0 cristal ortorrômbico com face-C apresentava um conteúdo com 58% de solvente e um VM de 2,9, assumindo um polipéptido Fc na unidade assimétrica da célula. A estrutura do cristal de Fc/TM foi determinada por substituição molecular e refinada até uma resolução de 2,3A. A estrutura Fc humana correspondente ao PDB ID number 2DTQ (Matsumiya et al. , (2007) J. Mol. Biol. 368:767-779) foi usada como modelo devido à sua elevada resolução e estado não-ligado. Em particular, os dominios CH2 e CH3 foram considerados separadamente para minimizar qualquer artefacto em termos de conformação relativa dos dominios. Dados até 3,0A foram usados para o problema de substituição molecular usando Phaser (McCoy et al., (2005) Ata Cryst. D61, 458-464). Após refinamento das soluções, o ganho final-LL e a pontuação-Z foram de 1192 e 31, respetivamente. A densidade de eletrões ponderada calculada com FWT/PHWT a 3,0 A mostrou uma boa correspondência com o modelo com exceção de alguns loops nos dominios CH2 e CH3. Uma forte diferença da densidade de eletrões calculada com DELFWT/PHDELWT foi visivel no lugar expectável de residuos de hidratos de carbono N-ligados a N297. Não se observou qualquer densidade de eletrões presente para qualquer residuo de charneira anterior à posição 236, um resultado presumivelmente atribuível à elevada flexibilidade nesta região. De notar que apenas as duas estruturas Fc humanas não-ligadas previamente descritas puderam revelar as posições 234 e 235 (2DTQ/2DTS; Matsumiya et al., (2007) J. Mol. Biol. 368:767-779). Similarmente, residuos nas posições 446 e 447 não puderam ser visualizados. O residuo na posição 331 foi primeiramente modelado como uma alanina. Vários ciclos alternativos de refinamento com 'Refmac 5' (Murshudov et al. , (1997) Ata Cryst. D53, 240-255) e construção manual usando o software gráfico "0" (Jones et al. , (1991) Ata Cryst. A47, 110-119) convergiram com um fator-R de 21,6 e o fator R livre de 27,5 para dados com uma resolução até 2,3A. Após o primeiro ciclo de refinamento, a densidade de eletrões permitiu a colocação dos hidratos de carbono assim como a substituição por um residuo de serina 331. Em estádios mais avançados do refinamento, o modelo foi analisado usando o programa TLS Motion Determination (TLSMD) em execução no seu servidor de internet (Painter et al. (2006). J. Appl. Cryst. 39, 109- 111; Painter et al. (2006) Ata Cryst. D62, 439-450). Adicionalmente o refinamento foi depois realizado com Refmac 5 em TLS e o modo de refinamento restrito usando cinco grupos distintos de resíduos (236-324, 325-341, 342- 358, 359-403 e 404-445). Iões de zinco presentes no tampão de cristalização foram detetados na densidade de eletrões e modelados quando a esfera e a distância de cálculo assim o permitissem. Em particular, um ião de zinco foi encontrado como estando coordenado po H310 e H435. Outro foi coordenado por H285 e H268 da simetria relacionada com o polipéptido. Os dois outros encontraram-se ligados a E318 e E345. Em todos os casos, moléculas de água completaram a esfera de coordenação tetraédrica dos iões de zinco. A fração de hidrato de carbono foi modelada de acordo com a sua densidade de eletrões e o modelo final continha nove resíduos de açúcares, essencialmente tal como por nós descrito no contexto de outra estrutura Fc humana (Oganesyan et al., (2007) Molecular Immunology, December 11,2007, in press). O modelo final continha 75 moléculas de solvente. Os dados cristalográficos e as estatísticas de refinamento são dadas na Tabela 6.
Tabela 6. Coleção dos dados de Raios-X e estatísticas de refinamento do modelo.
* Valores em parênteses correspondem à camada de resolução mais elevada
Resultados: Fc-TM cristalizado no grupo espacial C2221 com um polipéptido na unidade assimétrica (Figura 32). 0 cristal difratado a uma resolução de 2,3 A, and exibiu uma mosaicidade média relativamente elevada de 1,26 0. Esta elevada mosaicidade aparenta ser uma propriedade de ambos os cristais arrefecidos e não-arrefecidos. Todos os resíduos nas posições 236 a 445 poderiam ser rastreados na densidade de eletrões e nenhuma densidade de eletrões foi detetada para resíduos de charneira antes da posição 236, assim tornado as mutações L234F e L235E invisíveis. A densidade de eletrões na posição 331 correspondia à serina.
As coordenadas atómicas e os fatores experimentais da estrutura de Fc-TM foram depositados na Protein Data Bank sob o número de acesso de 3C2S. A estrutura tridimensional global de Fc-TM revelou-se bastante similar às estruturas previamente reportadas de regiões Fc humanas não contendo ligandos (Deisenhofer, (1981). Biochemistry, 20: 2361-2370; Krapp et al. , (2003). J. Mol. Biol. 325, 979-989; Matsumiya et al., (2007). J. Mol. Biol. 368:767-779; Oganesyan et al., (2007) Molecular Immunology, 11 de dezembro, 2007, in press) . Mais precisamente, as estruturas Fc humanas corresponderam a PDB ID números 1H3W (Krapp et al., (2003). J. Mol. Biol. 325:979-989) e 2QL1 (Oganesyan et al., (2007) Molecular Immunology, 11 de dezembro,2007, In the press) revelaram-se os mais próximos de Fc-TM em termos de parâmetros celulares, conteúdo de unidade assimétrica, grupo espacial e empacotamento. Quando considerados individualmente, Fc-TM CH2 e CH3 apresentaram um elevado grau de conservação estrutural e rigidez comparativamente com outros domínios não contendo ligandos, de estruturas Fc humanas não-mutadas. Por exemplo, as deslocalizações de coordenadas rms de átomos Ca foram de 0,6 e 0,4A para os domínios CH2 e CH3, respetivamente, quando sobrepondo Fc-TM com a cadeia A de PDB ID number 2DTQ (Matsumiya et al., (2007) . J. Mol. Biol. 368, 767-779). A Tabela 7 que se segue abaixo, fornece as coordenadas da estrutura atómica de Fc-TM. As seguintes abreviaturas são usadas na Tabela 7 "Atom Type" refere-se a um elemento cujas coordenadas são fornecidas. A primeira letra na coluna define o elemento. "A.A." refere-se a aminoácido. "X, Y e Z" fornecem as coordenadas cartesianas do elemento. "B" é um fator térmico que mede o movimento do átomo em torno do seu centro atómico. "OCC" refere-se à ocupação, e representa a percentagem de tempo que o tipo de átomo ocupa numa coordenada particular. Os valores de OCC variam de 0 a 1, onde 1 é 100%.
Tabela 7.: As coordenadas da estrutura atómica de Fc-TM
Conclusão: A estrutura tridimensional de Fc/TM foi descoberta como sendo similar à da região Fc humana não-mutada e não-ligada. Os efeitos funcionais dramáticos, de larga-escala do conjunto TM de substituições não foram causados por rearranjos estruturais na estrutura Fc, mas antes através da perda localizada de algumas interações nos locais de mutação. 6.34 Exemplo 34: Internalização de anticorpos anti-IFNARl
Objetivo: Investigar a capacidade dos anticorpos anti- IFNARl para serem internalizados em células. Métodos: Células THP-1 foram cultivadas em meio RPMI-1640 contendo 2-mercaptoetanol 0,05 mM e 10% soro fetal bovino numa incubadora a 37 °C com 5% C02. Células THP-1 foram plaqueadas a 2 x 105 células/mL em meio de cultura fresco um dia antes das experiências. No dia da experiências, as células foram lavadas, contadas e ressuspendidas em PBS a 3 x 106 células/mL. As células foram coradas com 1 μΜ CFSE numa incubadora a 37°C e 5% C02 durante 10 min. Após duas lavagens adicionais com PBS, as células foram colocadas em gelo e incubadas com solução bloqueador de Fcr usando 20 μΐ por cada 106 células em gelo durante 5 min e depois coradas com 1 pg/ml de Alexa647-9D4-TM ou Alexa 647-R347 (anticorpo de controlo inespecifico) em gelo durante 1 h. Após remoção do marcador não-ligado mAb com 3 lavagens com PBS, as células foram ressuspendidas em PBS contendo 2% BSA e Azida de Sódio. A internalização foi iniciada através da transferência de células para uma câmara ambientalmente controlada a 37°C, 5% CO2 e 70% humidade a cinética de internalização de Alexa647-9D4-TM foi registada ao longo do tempo ao visualizar a fluorescência das células.
As imagens de fluorescência das células foram analisadas usando um algoritmo. O algoritmo usado para o corante citosólico CFSE para identificar a fronteira entre a célula e a região membranar. O algoritmo quantificou a fluorescência associada a 9D4-TM dentro das células assim como ao nivel da membrana. A taxa de fluorescência acumulada dentro das células foi calculada por ajuste do modelo aos dados usando software SAAMII.
Resultados: Alexa647-9D4-TM ligado a Células THP-1. Nenhuma ligação de Alexa647- R347, o controlo isotipico de 9D4-TM, foi observado nas mesmas células. Este resultado demonstrou a ligação específica a células THP-1 por 9D4-TM (Figura 33). A 4°C, a ligação 9D4-TM estava predominantemente localizada na superfície celular (0 min - Figura 33) . Uma vez células foram incubadas a 37°C, o sinal de fluorescência para a marcação 9D4-TM foi significativamente diminuída na superfície celular e acumulada no citoplasma com a aparência de pontos. As imagens cinéticas gravadas ao longo de 60 min indicaram a migração gradual de fluorescência da superfície celular para o citosol (pontos temporais de 15, 30 e 50 min, Figura 33) . O resultado claramente demonstra a internalização de 9D4-TM em Células THP-1.
6.35 Exemplo 35: Ausência de Atividade CDC mediada por 9D4-TM
Objetivo: Determinar se 9D4-TM é incapaz de induzir
Atividade CDC numa série de experiências Métodos: Sangue humano fresco retirado de dadores humanos saudáveis foi recolhido (aproximadamente 100 mL) e centrifugado durante 10 minutos a 30000 para separar o soro das células. Δ fração sérica foi separada em dois tubos. 0 primeiro tubo foi diluido com meio RPMI 1640 livre de fenol a uma concentração final de 10% de soro (não-inativado por calor ou NHI). O segundo tubo foi colocado num banho a 56°C durante 30 minutos para inativar via calor as componentes do complemento. Subsequentemente, o segundo tubo foi diluído com meio RPMI-1640 livre de fenol a uma concentração final de 10% de soro humano não-inativado por calor. Células B Daudi foram usadas como células-alvo uma vez que expressam CD20 (alvo para o anticorpo de controlo positivo) e IFNAR1. Células-alvo foram lavadas e ressuspendidas em meio RPMI media livre de fenol com 10% soro não-inativado por calor ou em meio RPMI livre de fenol com 10% soro inativado por calor a uma concentração final de 0,4xl06 células/mL. As soluções de anticorpo foram preparadas através de uma série de 3 diluições com as concentrações a variarem entre 50 \iq/mL - l,3xl0“6 pg/ml. Preparações réplicas de diluições de anticorpo foram feitas nos dois meios com soro inativado por calor e não-inativado por calor. O ensaio CDC foi preparado através da adição de 50 pL de meio NHI ou Hl nos poços apropriados de uma microplaca de 96-poços. 50pL das séries de diluições de anticorpo foram adicionadas aos poços apropriados.
Subsequentemente, 50pL da preparação de células-alvo foi adicionada aos poços, incluindo poços extra com células-alvo sozinhas para os controlos. As placas foram incubadas a 37°C durante 4 horas em 5% C02. Após 3,5 horas de incubação, 20pL de solução-tampão de lise foi adicionada aos poços de controlo apropriados designados designados para a determinação do sinal máximo de lise. 0 ensaio de libertação da LDH Quantitate™ foi realizado usando protocolos definidos no ensaio de citotoxicidade não-radioativa Promega, #01780. A absorvância foi medida a 490nM e os valores de Kd foram produzidos usando o software de análise GraphPad Prism 4.
Resultados: Apresentados na Figura 34 estão os resultados do ensaio CDC realizado como acima descrito. Os anticorpos anti-IFNARl modificados, 9D4-TM não exibiram nenhuma atividade CDC detetável em Células B Daudi alvo superior à observada para o anticorpo R347. Por contraste, o anticorpo de controlo positivo, que se liga a CD20 expresso em Células B Daudi, causou um aumento dependente de dosagem na citotoxicidade relativamente aos niveis basais. Estes resultados confirmam que 9D4-TM não medeia a atividade CDC em células-alvo expressando IFNAR1. 6.36 Exemplo 36: Os anticorpos anti-IFNARl 9D4-TM modificados não apresentam qualquer toxicidade adversa
Objetivo: Estabelecer que 9D4-TM não produz qualquer toxicidade adversa, através de um estudo de toxicidade com dosagem única em macacos cinomolgos. Métodos: Neste estudo, 4 grupos de 10 animais cada (5/sexo/grupo) receberam uma dosagem única de 0, 5, 30, ou 100 mg/kg de 9D4-TM no Dia 1. Após dosagem, 2 animais/sexo/grupo foram identificados para necrose no dia 3 com todos os animais remanescentes monitorizados até ao dia 70 a serem depois removidos do estudo sem presença de necrose. A toxicidade foi avaliada com base na mortalidade, sinais clínicos (incluindo menstruação) , imunofenotipagem, pesos corporais, exames físicos (incluindo ritmo cardíaco, taxa respiratória, e temperatura corporal) , patologia clinica, pesos dos órgãos e dados microscópicos.
Resultados: Sob as condições acima referidas, não foram detetadas quaisquer mudanças adversas relacionadas com 9D4-TM na mortalidade, sinais clínicos (incluindo menstruação), imunofenotipagem, pesos corporais, exames físicos (incluindo ritmo cardíaco, taxa respiratória, e temperatura corporal), patologia clinica, pesos dos órgãos e dados microscópicos. Estes resultados sugerem que os anticorpos anti-IFNARl 9D4-TM modificados, não produzem qualquer toxicidade adversa.
LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Medlmmune LLC.
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<210> 48 <211> 31 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Construção sintética <400> 48 caggtgctgg gcatggtggg catgggggac c 31
<210> 49 <211> 33 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Construção sintética <400> 49 ccagcacctg agttcgaggg gggaccatca gtc 33
<210> 50 <211> 33 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Construção sintética <400> 50 gactgatggt cccccctcga actcaggtgc tgg 33 Lisboa,30 de maio de 2016

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES
1. Uma classe de IgG modificada de um anticorpo monoclonal especifico para IFNAR1, onde o referido anticorpo compreende uma região Fc com uma substituição aminoacidica de L234F, como numeradas pelo indice EU como estabelecido em Rabat e onde o referido anticorpo exibe afinidade reduzida para pelo menos um ligando Fc comparativamente com um anticorpo não-modifiçado.
2. 0 anticorpo da reivindicação 1, onde o referido anticorpo é um anticorpo da subclasse IgGl ou IgG4.
3. 0 anticorpo da reivindicação 1 ou reivindicação 2, onde o anticorpo adicionalmente compreende uma substituição aminoacidica de L235E e/ou P331S.
4. 0 anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-3, onde o referido anticorpo compreende: a. uma região variável CDR1 da cadeia pesada humana compreendendo a Seq 10 N°: 1, b. uma região variável CDR2 da cadeia pesada humana compreendendo a Seq 10 N°: 2; c. uma região variável CDR3 da cadeia pesada humana compreendendo a Seq 10 N°: 3; d. uma região variável CDR1 da cadeia leve humana compreendendo a Seq 10 N°: 4; e. uma região variável CDR2 da cadeia leve humana compreendendo a Seq 10 N°: 5; e f. uma região variável CDR3 da cadeia leve humana compreendendo a Seq 10 N°: 6.
5. 0 anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-3, onde o referido anticorpo compreende: a. uma região variável CDR1 da cadeia pesada humana compreendendo a Seq 10 N°: 21; b. uma região variável CDR2cda cadeia pesada humana compreendendo a Seq 10 N°: 22; c. uma região variável CDR3 da cadeia pesada humana compreendendo a Seq 10 N°: 23; d. uma região variável CDR1 da cadeia leve humana compreendendo a Seq 10 N°: 24; e. uma região variável CDR2 da cadeia leve humana compreendendo a Seq 10 N°: 25; e f. uma região variável CDR3 da cadeia leve humana compreendendo a Seq 10 N°: 26.
6. O anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-3, onde o referido anticorpo compreende: a. uma região variável da cadeia pesada humana compreendendo a sequência aminoacidica da Seq 10 N°: 38; e b. uma região variável da cadeia leve humana compreendendo a sequência aminoacidica da Seq N°: 40.
7. O anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-3, onde o referido anticorpo compreende: a. uma região variável da cadeia pesada humana compreendendo a sequência aminoacidica da Seq 10 N°: 18; e b. uma região variável da cadeia leve humana compreendendo a sequência aminoacidica da Seq 10 N°: 20.
8.0 anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-3, onde o referido anticorpo compreende: a. uma região variável da cadeia pesada humana compreendendo a sequência aminoacidica da Seq 10 N° : 28; e b. uma região variável da cadeia leve humana compreendendo a sequência aminoacidica da Seq 10 N°: 30.
9. O anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-8, onde o referido anticorpo compreende uma sequência da região constante da cadeia leve da Seq 10 N°: 41.
10. O anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-8, onde o referido anticorpo compreende uma sequência da região constante da cadeia pesada da Seq 10 N°: 42.
11. O anticorpo de qualquer uma das reivindicações Ι-ΙΟ, onde o referido anticorpo compreende uma região constante da cadeia leve possuindo a sequência aminoacidica da Seq 10 N°: 41 e uma região constante da cadeia pesada possuindo a sequência aminoacidica da Seq 10 N°: 42.
12. O anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-11, onde, o referido anticorpo compreende uma sequência aminoacidica da cadeia pesada compreendendo variação alélica, onde a referida variação alélica se encontra em pelo menos uma ou mais posições do grupo consistindo de 214, 221, 356 e 358 como definido pelo sistema de numeração do indice EU.
13. Um ácido nucleico isolado compreendendo a sequência polinucleotídica codificando o anticorpo de qualquer uma das reivindicações precedentes.
14. Uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-12, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
15. A composição farmacêutica da reivindicação 14 para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio selecionada do grupo de doença de Grave, tiroidite de Hashimoto, doença de Crohn, psoriase, artrite psoriática, oftalmia simpática, ovarite autoimune, orquite autoimune, sindrome linfoproliferativo autoimune, sindrome dos anticorpos antifosfolipidicos, sindrome de Sjogren, esclerodermia, doença de Addison, poliendocrinopatia autoimune, sindrome de Guillain-Barre, púrpura trombocitopénica idiopática, anemia perniciosa, miastenia grave, cirrose biliar primária, doença mista do tecido conjuntivo, vitiligo, uveite autoimune, anemia hemolitica autoimune, trombocitopenia autoimune, doença celíaca, dermatite herpetiforme, hepatite autoimune, penfigo, penfigo vulgar, penfigo foliáceo, penfigóide bulhoso, miocardite autoimune, vasculite autoimune, alopecia areata, aterosclerose autoimune, doença de Behçet, mielopatia autoimune, hemofilia autoimune, cistite intersticial autoimune, diabetes insipidus autoimune, endometriose autoimune, policondrite recidivante, espondilite anquilosante, urticária autoimune, dermatomiosite, sindrome de Miller-Fisher, nefropatia IgA, sindrome de Goodpasture, e herpes gestacional.
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