BRPI0907735B1

BRPI0907735B1 - Anticorpo monoclonal de classe igg modificado específico para ifnar1, ácido nucleico isolado e composição farmacêutica

Info

Publication number: BRPI0907735B1
Application number: BRPI0907735-9A
Authority: BR
Inventors: Anthony Coyle; Peter Kiener; Herren Wu; Ricardo Cibotti
Original assignee: Astrazeneca Ab
Priority date: 2008-02-08
Filing date: 2009-02-06
Publication date: 2021-10-05
Also published as: PT2250279E; BRPI0907735A2; US20110059078A1; FR22C1019I2; EP2250279A4; CY1117827T1; KR20100117108A; US9988459B2; US20200172625A1; ES2581917T3; WO2009100309A3; EP2250279B1; NO2022016I1; BR122020023189B1; RU2556125C2; CA2713981C; MX2010008578A; FR22C1019I1; NL301175I2; HUE028958T2

Abstract

anticorpo, ácido nucleico isolado, célula hospedeira, composição farmacêutica, uso de um anticorpo, e, método para preparar o anticorpo.a invenção fornece anticorpos anti-ifnar1 com menor afinidade para receptores e/ou ligantes de fc e métodos de preparar e usar tais anticorpos.

Description

[001] Este pedido reivindica o benefício sob 35 U.S. C. § 119(e) dos pedidos provisórios U.S. 61/006.962 depositado em 8 de fevereiro de 2008, 61/034.618 depositado em 7 de março de 2007, e 61/049.970 depositado em 2 de maio de 2008, cujas revelações são aqui incorporadas pela referência.

1. CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção diz respeito a anticorpos isolados e composições específicas para o receptor do interferon alfa 1 (IFNAR1) com menor afinidade para ligantes de Fc. A invenção também compreende ácidos nucleicos que codificam tais anticorpos, ácidos nucleicos complementares, vetores, células hospedeiras, e métodos de preparar e usar estes, incluindo composições, formulações, administrações e dispositivos terapêuticos.

2. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO 2.1 Interferons:

[003] Interferons do tipo I (IFN) (IFNα, IFNβ, IFN©, IFNT) são uma família de citocinas estruturalmente relacionadas com efeitos antivirais, antitumor e imunomodulatórios (Hardy et al. (2001) Blood 97:473; Cutrone e Langer (2001) J. Biol. Chem. 276:17140). O locus de IFNα humano inclui duas subfamílias. A primeira subfamília consiste em 14 genes não alélicos e 4 pseudogenes com pelo menos 80 % de homologia. A segunda subfamília, toda ou omega (w), contém 5 pseudogenes e 1 gene funcional que exibe 70 % de homologia com os genes IFNα (Weissmann e Weber (1986) Prog. Nucl. Acid Res. MoI. Biol, 33:251-300). Os subtipos de IFNα apresentam diferentes atividades específicas, mas possuem o mesmo espectro biológico (Streuli et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2848) e apresentam o mesmo receptor celular (Agnet M. et al. em "Interferon 5" Ed. I. Gresser p. 1-22, Academic Press, London 1983). Subtipos de interferon alfa foram identificados com a nomenclatura a seguir: IFNα 1, 2a, 2b, 4, 4b, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17, e 21.

[004] O interferon β (IFNβ) é codificado por um gene único, que apresenta aproximadamente 50 % de homologia com os genes de IFNα.

[005] Interferon y, que é produzido por linfócitos ativados, não possui nenhuma homologia com os interferons alfa/beta e não reage com seu receptor. 2.1.1 Receptores de interferon:

[006] Todos os interferons humanos do tipo I ligam-se a um receptor de superfície celular (receptor de IFN alfa, IFNAR) que consistem de duas proteínas transmembranas, IFNAR1 e IFNAR2 (Uze et. al. (1990) Cell 60:225; Novick et al. (1994) Cell 77:391). IFNAR1 é essencial para ligação de alta afinidade e especificidade diferencial do complexo IFNAR (Cutrone et al. 2001 J. Bio Chem 276(20):17140-8) Embora diferenças funcionais para cada um dos subtipos de IFN tipo I não tenham sido identificadas, sabe-se que cada um pode exibir interações diferentes com os componentes do receptor IFNAR que levam a resultados de sinalização potencialmente diversos (Cook et al. (1996) J. Biol. Chem. 271 :13448). Em particular, estudos que utilizam formas mutantes de IFNAR1 e IFNAR2 sugeriram que interferons alfa e beta sinalizam diferentemente por meio do receptor interagindo de forma diferencial com as respectivas cadeias (Lewerenz et al. (1998) J. MoI. Biol. 282:585). 2.1.2 Função de interferons:

[007] Estudos anteriores de IFNs tipo I focaram na defesa inata contra infecção virais (Haller et al. (1981) J. Exp. Med. 154:199; Lindenmann et al. (1981) Methods Enzymol. 78:181). Estudos mais recentes, entretanto, implicam IFNs tipo I como potentes citocinas imunorregulatórias na resposta imune adaptativa. Especificamente, IFNs tipo I mostraram facilitar a diferenciação de células nativas T ao longo da via Th1 (Brinkmann et al. (1993) J. Exp. Med. 178:1655), melhorar produção de anticorpo (Finkelman et al. (1991) J. Exp. Med. 174: 1179) e auxiliar a atividade funcional e sobrevivência de células T de memória (Santini et al. (2000) J. Exp. Med. 191 :1777; Tough et al. (1996) Science 272:1947).

[008] Trabalho recente de inúmeros de grupos sugere que IFNα pode melhorar a maturação ou ativação de células dendríticas (DCs) (Santini, et al. (2000) J. Exp. Med. 191 :1777; Luft et al. (1998) J. Immunol. 161 :1947; Luft et al. (2002) Int. Immunol. 14:367; Radvanyi et al. (1999) Scand. J. Immunol. 50:499). Além do mais, maior expressão de interferons do tipo I foi descrita em numerosas doenças autoimunes (Foulis et al. (1987) Lancet 2:1423; Hooks et al. (1982) Arthritis Rheum. 25:396; Hertzog et al. (1988) Clin. Immunol. Immunopathol. 48:192; Hopkins e Meager (1988) Clin. Exp. Immunol. 73:88; Arvin e Miller (1984) Arthritis Rheum. 27:582). Os exemplos mais estudados destes são diabetes mellitus dependente de insulina (IDDM) (Foulis (1987)) e lúpus eritematoso sistêmico (SLE) (Hooks (1982)), que estão associados com níveis elevados de IFNα, e artrite reumatóide (RA) (Hertzog (1988), Hopkins e Meager (1988), Arvin e Miller (1984)) no qual IFNβ pode desempenhar um papel mais significativo.

[009] Além disso, relatou-se que a administração de interferon α exacerba doença de base em pacientes com psoríase e esclerose múltipla e induz uma síndrome do tipo SLE em pacientes sem um histórico prévio de doença autoimune. Observa-se também que o interferon α induz glomerulonefrite em camundongos normais e acelera o início da doença autoimune espontânea de camundongos NZB/W. Adicionalmente, terapia com IFNα mostrou, em alguns casos, levar a efeitos colaterais indesejados, incluindo febre e distúrbios neurológicos. Consequentemente, existem situações patológicas nas quais a inibição da atividade de IFN tipo I pode ser benéfica ao paciente e existe uma necessidade de agentes eficientes em inibir a atividade de IFN tipo I. 2.1.3 Funções efetoras do anticorpo:

[010] A região Fc de um anticorpo interage com inúmeros ligantes (também referido aqui como “ligantes de Fc” que inclui, mas sem limitação, agentes que se ligam especificamente à região Fc de anticorpos, tais como receptores Fc e Clq) incluindo receptores Fc e Clq, que transmitem um arranjo de recursos funcionais importantes referidos como funções efetoras. Os receptores Fc medeiam a comunicação entre anticorpos e o braço celular do sistema imune (Raghavan et al, 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ravetch et al, 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290). Em humanos, esta família de proteína inclui FCYRI (CD64), incluindo as isoformas FCYRIA, FCYRIB, e FCYRIC; FCYRII (CD32), incluindo as isoformas FCYRIIA, FCYRIIB, e FCYRIIC; e FCYRIII (CD 16), incluindo as isoformas FCYRIIIA e FCYRIIB (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65). Estes receptores apresentam tipicamente um domínio extracelular que medeia a ligação a Fc, uma membrana que percorre a região, e um domínio intracelular que pode mediar algum evento de sinalização na célula. Estes receptores são expressos em uma variedade de células imunes, incluindo monócitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, euosinófilos, mastócitos, plaquetas, células B, linfócitos granulares grandes, células de Langerhans, células exterminadoras naturais (NK) e células T. A formação do complexo FC/FCYR recruta estas células efetoras para os sítios de ligação de antígeno, resultando tipicamente em eventos de sinalização nas células e respostas imunes subsequentes importantes, tais como a liberação de mediadores de inflamação, ativação de célula B, endocitose, fagocitose, e ataque citotóxico. A capacidade de mediar funções efetoras citotóxicas e fagocíticas é um mecanismo potencial pelo qual anticorpos destroem células alvo. A reação mediada por célula, em que células citotóxicas não específicas que expressam FCYRS reconhecem a ligação do anticorpo em uma célula alvo e causam subsequentemente a lise da célula alvo, é referida como citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) (Raghavan et al, 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et al, 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290). A reação mediada por célula, em que células citotóxicas não específicas que expressam FCYRS reconhecem a ligação de anticorpo em uma célula alvo e subsequentemente causam fagocitose da célula alvo, é referida como fagocitose mediada por célula dependente de anticorpo (ADCP). Além do mais, um sítio que se sobrepõe na região Fc da molécula também controla a ativação de um função citotóxica independente de célula mediada por complemento, de outra forma conhecida como citotoxicidade dependente de complemento (CDC). 2.1.4 Os diferentes tipos de FCYR humano:

[011] FcyR humanos são divididos em três classes humanas: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD 16). FcyRI é um receptor de alta afinidade (Ka: 10-8-10-9 M-1) e se liga tanto a complexos imunes quanto a moléculas de IgG monoméricas, enquanto os receptores Fc, FCYRII e FCYRIII, exibem menos afinidades (<10-7 M-1 e 2-3 x l0-7, respectivamente) (Gessner J.E. et al., 1998, Annn Hematology 76:231-48). A sinalização por meio dos FCYRS é tanto por meio de um motivo de ativação de imunorreceptor a base de tirosina (ITAM), quanto de motivo inibitório de imunorreceptor a base de tirosina (ITIM), para todos os receptores transmembranas (Presta 2006, Adv Drug Deli Rev 58:640-656).

[012] A glicoproteína extracelular FCYRI DE 72 kDa é expressa principalmente em células mielóides tais como monócitos, macrófagos, células progenitoras CD4+, e pode elicitar as resposta de ADCC, endocitose, e fagocitose (Siberil et al. 2006, J Immunol Lett 106:111-118).

[013] O grupo FCYRII de 40 kDa de receptores (isoformas A, B e C) exibe domínios extracelulares, mas não contém domínios de transdução de sinal ativo. Estes receptores propagam sinais por meio de fosforilação de um domínio de cauda citoplasmática (Amigorena S. et al., 1992 Science. 256:1808-12). O FCYRIIA é expresso principalmente em monócitos, macrófagos, neutrófilos, e plaquetas, ao passo que o receptor FCYRIIC foi identificado apenas em células NK. Estes dois receptores mostraram iniciar ADCC, endocitose, fagocitose e liberação do mediador inflamatório (Cassel et al. 1993. MoI Immunol 30:451-60). Ao contrário, os receptores FCYRIIB (tipos Bl e B2) são expressos em células B, mastócitos, basófilos, monócitos, macrófagos e células dendríticas e mostraram regular negativamente a resposta imune ativada pelas isoformas A e C.

[014] O FCYRIIIA de 50 kDa, expresso em células NK, monócitos, macrófagos e um subconjunto de linfócitos T, onde ativa ADCC, fagocitose, endocitose e liberação de citocina (Gessner et al). As isoformas FCYRIIIB são um glicosil-fosfatidilinositol (GPI) ancorado em proteína de membrana periférica envolvida na desgranulação e a produção de intermediários de oxigênio reativo (Salmon J.E. et al. 1995 J Clin Inves 95:2877-85).

[015] As moléculas de IgG também exibem especificidade de isotipo diferencial para FCYRS. Moléculas de IgG3 se ligam fortemente a todas as isoformas FCYR. IgGl, a mais prevalente das isoformas no sangue, se liga a todos os FCYRS, embora com uma afinidade menor para as isoformas FCYRIIA/B. IgG4 é um aglutinante intermediário para FCYRI e um aglutinante fraco para FcyRIIB. Finalmente, IgG2 se liga apenas fracamente a uma forma alélica de FcyRIIA (FcyRIIA-H131) (Siberil et al. 2006, J Immunol Lett 106:111- 118). 2.1.5 Complemento

[016] A cascata inflamatória do complemento é uma parte da resposta imune inata e é fundamental para a capacidade de um indivíduo evitar a infecção. Um outro ligante de Fc importante é a proteína Clq do complemento. O Fc que se liga à Clq medeia um processo denominado citotoxicidade dependente de complemento (CDC) (revisado em Ward et al., 1995, Ther Immunol 2:77-94). Clq é capaz de se ligar a seis anticorpos, embora a ligação a duas IgGs seja suficiente para ativar a cascata de complemento. Clq forma um complexo com as serina proteases Clr e Cls para formar o complexo Cl da via do complemento. 2.1.6 Regiões e resíduos de aminoácido de IgG envolvidos na ligação de FCYR

[017] O mapeamento de sítios de ligação IgG humana para diferenciar FcyR foi estudado extensivamente. Estes estudos, que baseiam-se em moléculas de IgG geneticamente alteradas, identificaram um pequeno intervalo contínuo de resíduos de aminoácido (234-238) da parte N- terminal do domínio CH2 que está envolvido diretamente na ligação de todos os FcyRs. Adicionalmente, resíduos 268, 297, 327 e 329 podem afetar a ligação de um subconjunto de FCYRS. Também, resíduos múltiplos localizados nos domínios CH2 e CH3 também contribuem para a ligação de FCYR (Canfield SM. et al., 1991 J Exp Med 173:1483-91, Chappel MS. Et al. 1991, Proc Nat Acad Sci USA 888:9036-40, Gergely J. et al. 1990 FASEB J 4:3275-83). 2.2 Anticorpo terapêutico relacionado à toxicidade

[018] Em muitas circunstâncias, a ligação e estímulo de funções efetoras mediadas pela região Fc de imunoglobulinas são altamente benéficos, entretanto, em certos exemplos, pode ser mais vantajoso diminuir ou eliminar a função efetora. Isto é particularmente verdadeiro para aqueles anticorpos projetados para distribuir um medicamento (por exemplo, toxinas e isótopos) na célula alvo onde as funções efetoras mediadas por Fc/FcyR conduzem células imunes saudáveis na proximidade da virulência mortal, resultando na depleção de tecido linfóide normal junto com as célula alvos (Hutchins et al, 1995, PNAS USA 92:11980-11984; White et al, 2001, Annu Rev Med 52: 125-145). Nestes casos, o uso de anticorpos que recruta fracamente o complemento ou células efetoras seria de grande benefício (ver, por exemplo, Wu et al., 2000, Cell Immunol 200:16-26; Shields et al., 2001, J. Biol Chem 276:6591-6604; U.S. 6.194.551; U.S. 5.885.573 e publicação PCT WO 04/029207).

[019] Em outros exemplos, por exemplo, onde bloquear a interação de um receptor amplamente expresso com seu ligante cognato é o objetivo, seria vantajoso diminuir ou eliminar toda a função efetora do anticorpo para reduzir a toxicidade indesejada. Também, no exemplo onde um anticorpo terapêutico exibiu ligação inadequada através inúmeros tecidos humanos seria prudente limitar o alvejamento da função efetora a um conjunto diverso de tecidos para limitar a toxicidade. Embora existam certas subclasses de imunoglobulinas humanas que necessitam de funções efetoras específicas, não existem imunoglobulinas de ocorrência natural conhecidas que necessitam de todas as funções efetoras. Uma abordagem alternativa seria modificar por engenharia ou mutar os resíduos importantes na região Fc, que são responsáveis pela função efetora. Por exemplo, ver publicações PCT WO2006076594, WO199958572, US20060134709, WO2006047350, WO2006053301, e U.S. 5.624.821, cada uma das quais são aqui incorporadas pela referência e na sua íntegra.

[020] O uso de anticorpos monoclonais no tratamento de muitos estágios da doença foi bem documentado. Com a miríade de funções efetoras que um anticorpo pode ativar, uma das exigências dos anticorpos terapêuticos é que eles são alvejados especificamente para um alvo de interesse. Por exemplo, mas sem limitação, a especificidade de um tecido alvo é analisada examinando a imunoistoquímica (IHC) de um tecido de interesse. É importante que o terapêutico apenas se ligue aos tecidos que contém um alvo de interesse. Não fazer isso pode resultar em maior toxicidade do anticorpo terapêutico, em virtude da ativação inadequada da função efetora elicitada no sítio não alvejado. Se a função efetora puder ser diminuído ou removido, o perigo da ampla ligação do terapêutico poderia ser evitado. Com todas estas considerações, existe uma necessidade não apropriada de anticorpos com afinidade reduzida ou removida de pelo menos um ligante de Fc responsável por facilitar a função efetora. Tais anticorpos seriam de benefício particular para uso no tratamento de condições crônicas inflamatórias e autoimunes.

[021] A citação ou discussão de uma referência aqui pode não ser interpretada como uma admissão, de maneira tal que seja a técnica anterior da presente invenção.

3. DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS FIGURAS

[022] Com o propósito de ilustrar a invenção, são representadas nos desenhos certas modalidades da invenção. Entretanto, a invenção não é limitada aos arranjos e instrumentalidades das modalidades representadas nos desenhos.

[023] Figura 1A. Alinhamento de sequência de ácido nucleico (SEQ ID No:7) e aminoácido (SEQ ID No:8) de 3F11 VH com as regiões CDR é indicado pela linha acima.

[024] Figura 1B. Alinhamento de sequência de ácido nucleico (SEQ ID No:9) e aminoácido (SEQ ID No: 10) de 3F11 VK com as regiões CDR esboçadas é indicado pela linha acima.

[025] Figura 2A. Alinhamento de sequência de ácido nucleico (SEQ ID No : 17) e aminoácido (SEQ ID No : 18) de 4G5 VH com as regiões CDR esboçadas é indicado pela linha acima.

[026] Figura 2B. Alinhamento de sequência de ácido nucleico (SEQ ID No : 19) e aminoácido (SEQ ID No : 20) de 4G5 VK com as regiões CDR esboçadas é indicado pela linha acima.

[027] Figura 3A. Alinhamento de sequência de ácido nucleico (SEQ ID No:27) e aminoácido (SEQ ID No:28) de 11E2 VH com as regiões CDR esboçadas é indicado pela linha acima.

[028] Figura 3B. Alinhamento de sequência de ácido nucleico (SEQ ID No:29) e aminoácido (SEQ ID No:30) de 11E2 VK com as regiões CDR esboçadas é indicado pela linha acima.

[029] Figura 4A. Alinhamento de sequência de ácido nucleico (SEQ ID No: 37) e aminoácido (SEQ ID No: 38) de 9D4 VH com as regiões CDR esboçadas é indicado pela linha acima.

[030] Figura 4B. Alinhamento de sequência de ácido nucleico (SEQ ID No:39) e aminoácido (SEQ ID No:40) de 9D4 VK com as regiões CDR esboçadas é indicado pela linha acima.

[031] Figura 5. Alinhamento de sequência de aminoácido de regiões constantes de cadeia pesada para 9D4. As setas indicam substituições de aminoácidos (não modificados para modificados) para aumentar estabilidade e diminuir afinidade em pelo menos um ligante de Fc.

[032] Figura 6A. Perfil de coloração imunoistoquímica de tecido cerebral humano tratado com vários anticorpos anti-IFNAR1. O anticorpo 9D4 exibe um menor perfil de coloração quando incubado com tecido cerebral humano, comparado aos anticorpos 4G5 e MDX- 1333.

[033] Figura 6B. Perfil de coloração imunoistoquímica de monócitos humanos tratados com vários anticorpos anti-IFNAR1. Como um controle positivo, vários anticorpos anti-IFNAR1 foram testados para reatividade a monócitos humanos.

[034] Figura 7. O anticorpo 9D4 anti-IFNAR1 inibe a sinalização de IFNα em um ensaio de ativação STAT a base de célula. O tratamento com anticorpo 9D4 inibe a fosforilação em tirosina STAT 1/3/4 em resposta ao estímulo com interferon alfa, da maneira determinada por análise Western Blot com anticorpos STAT disponíveis comercialmente.

[035] Figura 8. Anticorpos anti-IFNAR1 bloqueiam a sinalização de várias concentrações de célula pDC derivada de IFNs tipo I. São apresentados os valores IC50 para anticorpo 9D4 que bloqueia a sinalização de IFN em um ensaio de gene repórter com luciferase, utilizando sobrenadantes de IFN tipo I purificados de 3 doadores independentes. São incluídas as quantidades relativas de IFNα, IFNβ, e IFNw em cada sobrenadante de interferon tipo I modificado.

[036] Figura 9 A, B, C. Anticorpos anti-IFNAR1 9D4, 9D4-DM (duplo mutante), e 9D4-TM (triplo mutante) exibem características de ligação similares. São apresentados dados que representam o anticorpo 9D4 não modificado ao longo de 2 anticorpos modificados, 9D4-DM e 9D4- TM. Os anticorpos modificados exibem características de ligação de IFNAR1 similares ao anticorpo não modificado.

[037] Figura 10A. O anticorpo 9D4 anti-IFNAR1 se liga ao receptor interferon alfa solúvel (sIFNαRl). São apresentados dados de ligação em equilíbrio que demonstram ligação dose dependente de 9D4 ao receptor interferon alfa solúvel.

[038] Figura 10B. Determinação do Kd de 9D4 on PBMCs de humanos. É apresentado a determinação da constante de dissociação de 9D4 medida pela ligação aos PBMCs de humanos.

[039] Figura 11. Anticorpos anti-IFNAR1 inibem a sinalização induzida por IFNα em um ensaio de gene repórter com luciferase. Anticorpos anti-IFNAR1, incluindo anticorpos modificados e não modificados, demonstram valores de IC50 similares para bloquear a sinalização de INF de leucócito em um sistema de ensaio de gene repórter com luciferase.

[040] Figura 12A. Determinação do ponto isoelétrico de anticorpos 9D4 (não modificado) e anticorpos 9D4 modificados. É apresentado um gel IEF que documenta os valores PI relativos para os anticorpos 9D4 WT (não modificados), 9D4-DM e 9D4-TM.

[041] Figura 12B. Determinação das temperaturas de fusão térmica de anticorpos 9D4 (não modificados) e anticorpos 9D4 modificados. É aqui apresentado é uma cura de fusão que documenta as temperaturas de fusão relativas (Tm) para os anticorpos 9D4, 9D4-DM, e 9D4-TM.

[042] Figura 13. Tratamento profilático com anticorpos anti-IFNAR bloqueia proteinúria induzida por Adv-IFNα. Os camundongos tratados com vetor controle, Adv-IFNα, Adv-IFNα + pré-tratamento isotipo controle, e pré-tratamento Adv-IFNα + anti-IFNAR foram analisados por proteinúria por 9 semanas. Os camundongos pré-tratados com anti-IFNAR não exibiram proteinúria após desafio com IFNα.

[043] Figura 14. Tratamento profilático com anticorpos anti-IFNAR bloqueia a regulação positiva de genes responsivos de IFNα (IFITl, IFI44, CXCLl 1, IFI202b, CXCL 19, CXCL9) no sangue. Os camundongos pré-tratados com anticorpos anti-IFNAR não exibem genes responsivos IFNα regulados positivamente selecionados mediante desafio com IFN alfa codificado por adenovírus, comparados aos camundongos pré- tratados com vírus controle, PBS, ou IgG isotipo controle. São apresentadas a expressão relativa de seis genes conhecidos por serem responsivos à IFNα em amostras de sangue obtidas de camundongos com 3 semanas após a indução com IFNα por infecção com Adv-IFNα

[044] Figura 15 A, B. Tratamento profilático com anticorpos anti-IFNAR bloqueia a produção de autoanticorpos induzidos por IFNα. Os camundongos pré-tratados com anticorpos anti-IFNAR não exibem elevada produção de autoanticorpo mediante desafio com IFNα codificado por adenovírus comparados aos camundongos pré-tratados com vírus controle, PBS ou IgG isotipo controle. São apresentadas as concentrações de anti-DNAds e anti-SSA/Ro em amostras de sangue obtidas de camundongos com 6 semanas após a indução com IFNα por infecção com Adv-IFNα.

[045] Figura 16 A, B. Tratamento profilático com anticorpos anti-IFNAR bloqueia a regulação positiva de citocinas no rim. Camundongos pré-tratados com anticorpos anti-IFNAR não exibem citocinas reguladas positivamente no rim mediante desafio com IFNα5 codificada por adenovírus, comparados aos camundongos pré-tratados com vírus controle, PBS ou IgG isotipo controle. São apresentadas as medições de níveis de IP- 10, e IL- 18 em amostras de rim obtidas de camundongos com 6 semanas após a indução com IFNα por infecção com Adv-IFNα5.

[046] Figura 17. Tratamento profilático com anticorpos anti-IFNAR bloqueia a produção de autoanticorpo de IFN. São aqui apresentados as titulações relativas de anticorpos de antígeno anti-nuclear (ANA) de soro de camundongo. Os camundongos pré-tratados com anticorpos anti-IFNAR exibiram menores títulos de ANA após desafio com IFN do que camundongos pré-tratados com vírus controle, PBS ou isotipo controle.

[047] Figura 18. Anticorpo mediou a inibição de desenvolvimento de célula dendrítica mediada por plasma de SLE. São apresentados os resultados de 5 experimentos individuais nos quais IFN derivados de pacientes com SLE foi incubado na presença de anticorpo 9D4 anti-IFNAR1, e subsequentemente adicionado a monócitos humanos. A presença de anticorpo 9D4 anti-IFNAR1 inibiu a capacidade de IFN derivado de pacientes com SLE para induzir os marcadores de célula dendrítica CD38 e CD 123 na diferenciação de monócitos.

[048] Figura 19. Anticorpos anti-IFNAR1 suprimem a expressão de CD38, CD123 e CD86 em monócitos estimulados com interferon de leucócito. Da maneira medida por supressão percentual de expressão controle estimulada, anticorpos anti-IFNAR1 9D4, 9D4-DM e 9D4-TM exibiram perfis de inibição similares para a expressão de CD38, CD123 e CD86 na diferenciação de monócitos.

[049] Figura 20. Anticorpos modificados anti-IFNAR1 exibem menor ligação ao receptor Fc FCYRI comparados aos anticorpos não modificados anti-IFNAR1. Anticorpos anti-IFNAR1 9D4 (não modificado), 9D4-DM (modificado) e 9D4-TM (modificado) foram analisados quanto a capacidade de se ligar ao FCYRI ligado em placa em um experimento de ELISA. Como um controle positivo para receptor de ligação Fc, um anticorpo não relacionado não modificado foi usado (anticorpo controle).

[050] Figura 21, A, B, C. Anticorpos modificados anti- IFNAR1 exibiram menor ligação ao receptor Fc FcyRIIIA comparados aos anticorpos anti-IFNAR1 não modificados. Placas ligadas ao anticorpo 9D4 anti-IFNAR1 não modificado (A) e anticorpos modificados anti-IFNAR1 9D4-DM (B) e 9D4-TM( C) foram analisadas quanto a capacidade de se ligar a FcyRIIIA livre em um formato experimental de ELISA.

[051] Figura 22, A, B, C. Anticorpos modificados anti- IFNAR1 exibiram menor ligação ao receptor Fc FcyRIIIA. O anticorpo 9D4 anti-IFNAR1 livre não modificado (A) e anticorpos modificados anti- IFNAR1 9D4-DM(B) e 9D4-TM(C) foram analisados quanto a capacidade de se ligar à placa ligada a FcyRIIIA em um formato experimental de ELISA.

[052] Figura 23 A-E. Neutralização de subtipos de IFN no soro de pacientes com SLE. Da maneira medida por ensaio repórter, anticorpos anti-IFNAR1 MDX-1333, 9D4-WT e 9D4-TM inibiram a sinalização mediada por IFN de α l0 (A), interferon de leucócito (B), α 2b (C), ® (D) e β (E).

[053] Figura 24. Anticorpos anti-IFNAR1 neutralizam interferon tipo I de pacientes com SLE. Por ensaio repórter, o anticorpo anti- IFNAR1 9D4 inibiu a sinalização mediada por interferon tipo I comparado a um anticorpo controle não relacionado.

[054] Figura 25 A-D. Anticorpos anti-IFNAR suprimem a população pDC induzida por IFNα em PBMCs. Anticorpos anti-IFNAR bloquearam a elevação de células pDC medidas por expressão de epítopo de superfície celular, induzida por expressão induzida por adenovírus ectópicos de interferon alfa no baço (A), linfonodos (B), sangue periférico (C) e medula óssea (D).

[055] Figura 26. A análise de ensaio de anticorpos anti- IFNAR1 9D4-WT, 9D4-DM, e 9D4-TM para o receptor Fc FCYRI foi determinada por análise BIACore. Resumidamente, os anticorpo anti- IFNAR1 foram imobilizados e FCYRI livre foi adicionado para medir afinidade. Da maneira demonstrada pela investigação, os anticorpos modificados, 9D4-DM e 9D4-TM, exibiram menores afinidades com o FcyRI livre comparado com o anticorpo 9D4-WT não modificado.

[056] Figura 27 A-C. Análise de ligação de anticorpos anti-IFNAR1 9D4-WT, 9D4-DM, e 9D4-TM com o receptor Fc FcyRI foi determinada por análise BiaCore. Resumidamente, anticorpos anti-IFNAR1 livres passaram por FcyRI imobilizado para medir a afinidade. Da maneira demonstrada pela investigação, os anticorpos modificados 9D4-DM (B), e 9D4-TM (C) exibiram menores afinidades com o FcyRI ligado comparado ao anticorpo 9D4-WT não modificado (A).

[057] Figura 28. Os anticorpos anti-IFNAR inibem a indução do gene responsivo a IFNα no rim. Resumidamente, no modelo de camundongo com lúpus acelerado, o tratamento com anticorpos anti-IFNAR bloqueia a indução no rim de seis genes (ICAMl, VCAMl, CXCL9, CXCLlO, e IFITl) mediada pela expressão ectopicamente de IFNα comparado aos camundongos controle, da maneira medida por um ensaio Taqman.

[058] Figura 29. Os anticorpos anti-IFNAR inibem a produção de anticorpos anti- DNAds no modelo de camundongo com lúpus acelerado. Resumidamente, os camundongos que expressam ectopicamente IFNα e são tratados com anticorpos anti-IFNAR não acumulam anticorpos anti-DNAds no mesmo nível dos camundongos similarmente infectados e tratados com um anticorpo IgG controle.

[059] Figura 30. Os anticorpos anti-IFNAR são capazes de reduzir proteinúria em um ajuste terapêutico do modelo de camundongo com lúpus acelerado. (A) Resumidamente, os camundongos que expressam ectopicamente IFNα desenvolveram sintomas semelhantes a lúpus, tal como proteinúria. Em um estudo terapêutico, os anticorpos anti-IFNAR foram administrados aos camundongos uma vez que uma classificação limite de proteinúria foi atingida. Os anticorpos anti- IFNAR, PBS ou IgG controle foram administrados semi-semanalmente por um período de 5 semanas. O grupo tratado com anticorpo anti-IFNAR exibiu menor gravidade de proteinúria durante o experimento, comparado aos grupos tratados com PBS sozinho ou com IgG.

[060] Figura 31. Os anticorpos anti-IFNAR são capazes de aumentar a sobrevivência em um ajuste terapêutico do modelo de lúpus acelerado. (A) Resumidamente, camundongos que expressam ectopicamente IFNα tiveram uma menor taxa de sobrevivência em cerca de 8 semanas após o desenvolvimento dos sintomas semelhantes a lúpus tal como proteinúria. No estudo terapêutico, os anticorpos anti-IFNAR foram administrados aos camundongos uma vez que uma classificação limite de proteinúria foi atingida. Os anticorpos anti-IFNAR, PBS, ou IgG controle foram administrados semi-semanalmente por um período de 5 semanas. Aos as cinco semanas, o tratamento com parou e a mortalidade identificada para todos os três grupos de tratamento. O grupo tratado com anticorpo anti- IFNAR exibiu uma taxa de mortalidade muito menor do que o PBS sozinho, ou grupos IgG controle, em que ambos exibiram mortalidade completa em 9 semanas.

[061] Figura 32. Representação dos conteúdos de unidade assimétrica dos cristais de Fc- TM que compreende mutações L234F/L235E/P331S. A mutação P331 é indicada em vermelho. Um íon de zinco é quelado por dois resíduos de histidina espacialmente próximos. Os resíduos de carboidrato anexados ao 297 foram modelados de acordo com sua densidade eletrônica.

[062] Figura 33. As imagens cinéticas demonstram a internalização de 9D4-TM. As células THP-I foram coradas com CFSE 1 μM em uma incubadora de CO2 a 37 °C por 10 minutos seguido por 1 μg/mL de Alexa647-9D4-TM no gelo por 1 hora. Após remoção dos componentes não ligados as células foram incubadas a 37 °C pelo tempo indicado (0, 15, 30 e 60 minutos) e as imagens de células foram obtidas.

[063] Figura 34. O anticorpo anti-IFNAR1, 9D4-TM não exibe atividade CDC em um ensaio in vitro. São apresentados neste painel os resultados de um ensaio CDC para determinar a capacidade do anticorpo 9D4-TM elicitar a atividade CDC. Da maneira apresentada, o anticorpo 9D4- TM não exibe nenhuma atividade CDC comparada ao anticorpo controle positivo. A atividade CDC também não foi detectável para um anticorpo controle não relacionado, R347. Resumidamente, as células que expressam antígeno IFNAR1 foram incubadas tanto com o anticorpo controle positivo, 9D4-TM, quanto R347. Após uma série de lavagens, soro humano preparado recentemente foi adicionado. A citotoxicidade dependente de complemento (CDC) foi medida usando um ensaio de liberação de LDH.

4. TERMINOLOGIA

[064] Pretende-se que os termos "interferon alfa", "IFNα", "IFNa", "IFNA" e "IFN alfa" sejam usados indiferentemente e refiram-se a proteínas de IFN alfa codificadas por um gene funcional do locus do gene interferon alfa com 75 % ou mais de identidade de sequência com IFN alfa 1 (número de acesso no GenBank NP 076918 ou proteína codificada pelo número de acesso no GenBank NM_024013). Exemplos de subtipos de IFN alfa incluem IFN alfa 1, alfa 2a, alfa 2b, alfa 4, alfa 4b alfa 5, alfa 6, alfa 7, alfa 8, alfa 10, alfa 13, alfa 14, alfa 16, alfa 17 e alfa 21. Pretende-se que os termos "interferon alfa", "IFNα" e "IFN alfa" incluam formas recombinantes dos vários subtipos de IFN alfa, bem como preparações de ocorrência natural que compreendem proteínas de IFN alfa, tais como IFN de leucócito e IFN de linfoblastóide.

[065] Os termos "Receptor 1 do interferon alfa", "IFNAR1", "IFNAR-I" e "antígeno de IFNAR-I" são usados indiferentemente e incluem variantes, isoformas, espécies homólogas de IFNAR-I de humanos, e análogos com pelo menos um epítopo comum à IFNAR-I. Dessa maneira, anticorpos humanos da invenção, em certas modalidades, podem reagir de maneira cruzada com IFNAR-I de espécies sem ser humana, ou outras proteínas que são estruturalmente relacionadas a IFNAR-I humano (por exemplo, homólogos de IFNAR-I humano). Em outras modalidades, os anticorpos podem ser completamente específicos para IFNAR-I humano e não exibem espécies ou outros tipos de reatividade cruzada. A sequência completa de cDNA de IFNAR-I humano apresenta o número de acesso no Genbank NM 000629.

[066] Da maneira aqui usada, pretende-se que o termo "modificações de sequência conservativa" inclua modificações de aminoácidos que não afetem alterem as características de ligação do anticorpo que contém a sequência de aminoácidos. Tais modificações conservativas incluem substituições, adições e deleções de aminoácidos. As modificações podem ser introduzidas em um anticorpo da invenção por técnicas padrões conhecidas na técnica, tais como mutagênese sítio direcionada e mutagênese mediada por PCR. As substituições conservativas de aminoácidos são aquelas nas quais o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral similar. Por exemplo, um ou mais aminoácidos de uma polaridade similar agem como equivalentes funcionais e resultam em uma alteração silenciosa na sequência de aminoácidos do peptídeo. Substituições que são de carga neutra e que substituem um resíduo por um resíduo menor também podem ser consideradas "substituições conservativas" mesmo se os resíduos estiverem em grupos diferentes (por exemplo, substituição de fenilalanina pela isoleucina menor). Famílias de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Vários exemplos não limitantes de famílias de substituições conservativas de aminoácidos são mostrados na tabela 1.

5.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[067] Ao contrário dos preceitos prévios, os inventores observaram que anticorpos anti-IFNAR1 com função efetora reduzida ou removida são desejáveis para o tratamento de doenças crônicas autoimunes e/ou inflamatórias. Previamente, anticorpos direcionados contra IFNAR1 foram desenvolvidos entendendo-se que a função efetora desempenharia um papel na mediação do tratamento ou pelo menos na moderação de um estado de doença crônica autoimune e/ou inflamatória (ver, por exemplo, publicação U.S. 20060029601 ou publicação PCT WO06002177). Com este conceito, muitos dos preceitos prévios direcionaram os versados na técnica a identificar anticorpos anti-IFNAR1 com função efetora forte e a melhorar adicionalmente a função efetora aumentando a afinidade do anticorpo para receptores Fc (por exemplo, FcRn, FcYRIIIa, FcYRIIb) e/ou a proteína Clq do complemento. Sabe-se que estes anticorpos anti-IFNAR1 melhorados por função efetora resultantes são vantajosos no tratamento do estado das doenças.

[068] Ao contrário deste entendimento prévio, a presente invenção descreve anticorpos anti-IFNAR1 com função efetora reduzida ou removida (tais como ADCC e/ou CDC). Por meio de estudos de reatividade cruzada de tecido, observou-se surpreendentemente que anticorpos anti- IFNAR1 com função efetora forte ou melhor exibiram uma tendência para toxicidade indesejada em virtude da prevalência da coloração de anti-IFNAR1 em tecidos não alvos. Esta toxicidade resultaria da ativação não específica de ADCC e/ou CDC em sítios não apropriados. Para reduzir ou eliminar esta toxicidade indesejada, o inventores reconheceram a necessidade de reduzir a função efetora de polipeptídeos compreendendo uma região Fc.

[069] Dessa maneira, um aspecto da invenção inclui anticorpos modificados ou outros polipeptídeos compreendendo a região Fc de um anticorpo, compreendendo a adição, substituição ou deleção de pelo menos um resíduo de aminoácido na região Fc que resulta na afinidade reduzida ou removida para pelo menos um ligante de Fc (aqui referido como "anticorpos modificados da invenção", "anticorpos modificados" ou "anticorpos da invenção"). A região Fc interage com inúmeros ligantes incluindo, mas sem limitação, receptores Fc (por exemplo, FcRn, FcYRIIIa, FcYRIIb), a proteína Clq do complemento e outras moléculas, tais como proteínas A e G. Estas interações são essenciais para uma variedade de funções efetoras e eventos de sinalização à jusante incluindo, mas sem limitação, citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Dessa maneira, em certas modalidades, os anticorpos modificados da invenção apresentam afinidade reduzida ou removida para um ligante de Fc responsável para facilitar a função efetora comparada a um anticorpo com a mesma sequência de aminoácidos como o anticorpo da invenção, mas sem compreender a adição, substituição ou deleção de pelo menos um resíduo de aminoácido na região Fc (também aqui referido como um "anticorpo não modificado"). Em certas modalidades, os anticorpos da invenção compreendem pelo menos uma ou mais das propriedades a seguir: função efetora reduzida ou removida (ADCC e/ou CDC), ligação reduzida ou removida dos receptores Fc, ou toxicidades reduzidas ou removidas. Mais especificamente, as modalidades da invenção fornecem anticorpos anti-IFNAR1 com menor afinidade para receptores Fc (por exemplo, FcRn, FcYRIIIa, FcYRIIb) e/ou a proteína Clq do complemento.

[070] Em uma modalidade, os anticorpos da invenção compreendem uma região Fc compreendendo pelo menos uma adição, substituição ou deleção de um resíduo de aminoácido selecionado das posições que consistem em: 234, 235, e 331, em que o sistema de numeração da região constante é aquele do índice EU da maneira apresentada em Kabat et al. (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA). Em uma modalidade específica, os anticorpos da invenção compreendem uma região Fc compreendendo pelo menos uma substituição de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: L234F, L235E, e P331S, em que a primeira letra e número representam o aminoácido não modificado e sua posição e a segunda letra representa o aminoácido substituído na dita posição.

[071] Em uma outra modalidade, os anticorpos da invenção compreendem adicionalmente uma região Fc compreendendo pelo menos uma adição, substituição ou deleção de um resíduo de aminoácido que está correlacionado com maior estabilidade do anticorpo. Em uma modalidade, a adição, substituição ou deleção de um resíduo de aminoácido está na posição 228 da região Fc, em que o sistema de numeração da região constante é aquele do índice EU da maneira apresentada em Kabat et al.. Em uma modalidade específica, os anticorpos da invenção compreendem uma região Fc compreendendo uma substituição de aminoácido na posição 228, em que a substituição é um resíduo de serina. Em uma outra modalidade específica, os anticorpos da invenção do subtipo IgG4 compreendem uma substituição de aminoácido de serina na posição 228 da região Fc. Em outras modalidades, os anticorpos da invenção já compreendem um resíduo de serina na posição 228 da região Fc; em tais modalidades, nenhuma modificação é exigida. Em modalidades alternativas, os anticorpos da invenção não exigem a modificação de resíduo 228 da região Fc ou já compreendem serina na dita posição.

[072] Em uma outra modalidade, os anticorpos da invenção podem ser de qualquer classe (por exemplo, mas sem limitação, IgG, IgM e IgE). Em certas modalidades, os anticorpos da invenção são elementos da classe IgG de anticorpos. Em uma modalidade específica, os anticorpos da invenção são da subclasse IgG1. Em uma outra modalidade específica, os anticorpos da invenção são da subclasse IgG1 e compreendem as seguintes substituições de aminoácidos: 234F, 235E e 33 IS da região Fc. Em modalidades de substituição, os anticorpos da invenção são da subclasse IgG4. Em uma modalidade específica, os anticorpos da invenção são da subclasse IgG4 e compreendem as seguintes substituições de aminoácidos: S228P e L235E da região Fc.

[073] Em certas modalidades, os anticorpos modificados da presente invenção podem ser produzidos combinando um domínio variável, ou fragmento deste, com um Fc domínio compreendendo uma ou mais das substituições de aminoácidos aqui reveladas. Em outras modalidades, anticorpos modificados da invenção podem ser produzidos modificando um anticorpo contendo domínio Fc pela introdução de uma ou mais das substituições de resíduos de aminoácidos no domínio Fc. 5.1 ligação reduzida para ligantes de Fc

[074] Os versados na técnica entenderão que anticorpos da invenção podem apresentar propriedades de ligação FCYR e/ou Clq alteradas (com relação a um anticorpo não modificado) (exemplos de propriedades de ligação incluem, mas sem limitação, especificidade de ligação, constante de dissociação de equilíbrio (KD), taxas de dissociação e associação (Koff e K0n respectivamente), afinidade e/ou avidez de ligação) e que certas alterações são mais ou menos desejáveis. É conhecido na técnica que a constante de dissociação de equilíbrio (KD) é definida como koff/kon. Os versados na técnica podem determinar qual parâmetro cinético é mais importante para uma dada aplicação de anticorpo. Por exemplo, uma modificação que reduz a ligação a um ou mais reguladores positivos (por exemplo, FCYRIIIA) e/ou melhora a ligação a um receptor Fc inibitório (por exemplo, FCYRIIB) seria adequada para reduzir atividade ADCC. Dessa maneira, a razão de afinidades de ligação (por exemplo, constantes de dissociação de equilíbrio (KD)) pode indicar se a atividade ADCC de um anticorpo da invenção é maior ou menor. Adicionalmente, uma modificação que reduz a ligação a Clq seria adequada para reduzir ou eliminar a atividade CDC.

[075] As afinidades e propriedades de ligação de uma região Fc com seu ligante podem ser determinadas por uma variedade de métodos de ensaio in vitro (ensaios que baseiam-se na bioquímica ou imunologia) conhecidos na técnica para determinar interações FC-FCYR, isto é, ligação específica de uma região Fc a um FCYR incluindo, mas sem limitação, métodos de equilíbrio (por exemplo, ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) ou radioimunoensaio (RIA)), ou cinética (por exemplo, análise BIACORE®) e outros métodos, tais como ensaios de ligação indireta, ensaios de inibição competitiva, transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET), eletroforese em gel e cromatografia (por exemplo, filtração em gel). Estes e outros métodos podem utilizar uma marca em um ou mais dos componentes que estão sendo examinados e/ou empregar uma variedade de métodos de detecção incluindo, mas sem limitação, marcas cromogênicas, fluorescentes, luminescentes ou isotópicas. Uma descrição detalhada de afinidades e cinética de ligação pode ser encontrada em Paul, W.E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999).

[076] Em uma modalidade, os anticorpos da invenção exibem menor afinidade de ligação com um ou mais receptores Fc incluindo, mas sem limitação, FCYRI (CD64), incluindo as isoformas FCYRIA, FCYRIB, e FCYRIC; FCYRII (CD32 incluindo as isoformas FCYRIIA, FCYRIIB, e FcyRIIC); e FcyRIII (CD 16, incluindo as isoformas FcyRIIIA e FcyRIIB) comparado a um anticorpo não modificado. Em certas modalidades, os anticorpos da invenção não compreendem um aumento concomitante na ligação do receptor FcyRIIB comparado a um anticorpo não modificado (por exemplo, contendo uma região Fc tipo selvagem).

[077] Em uma modalidade, os anticorpos da invenção exibem menos afinidades com FcyRI com relação a um anticorpo não modificado. Em uma outra modalidade, os anticorpos da invenção exibem afinidades com receptor FCYRI que são pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 7 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 20 vezes, ou pelo menos 30 vezes, ou pelo menos 40 vezes, ou pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 60 vezes, ou pelo menos 70 vezes, ou pelo menos 80 vezes, ou pelo menos 90 vezes, ou pelo menos 100 vezes, ou pelo menos 200 vezes menores do que com um anticorpo não modificado.

[078] Em uma outra modalidade, os anticorpos da invenção exibem afinidade com receptor FcyRI que são pelo menos 90 %, pelo menos 80 %, pelo menos 70 %, pelo menos 60 %, pelo menos 50 %, pelo menos 40 %, pelo menos 30 %, pelo menos 20 %, pelo menos 10 %, ou pelo menos 5 % menores do que com um anticorpo não modificado.

[079] Em uma modalidade, os anticorpos da invenção exibem menor afinidade com o receptor FcyRIIIA com relação a um anticorpo não modificado. Em uma outra modalidade, os anticorpos da invenção exibem afinidades com receptor FcyRIIIA que são pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 7 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 20 vezes, ou pelo menos 30 vezes, ou pelo menos 40 vezes, ou pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 60 vezes, ou pelo menos 70 vezes, ou pelo menos 80 vezes, ou pelo menos 90 vezes, ou pelo menos 100 vezes, ou pelo menos 200 vezes menores do que com um anticorpo não modificado.

[080] Em uma outra modalidade, os anticorpos da invenção exibem afinidades com receptor FcyRIIIA que são pelo menos 90 %, pelo menos 80 %, pelo menos 70 %, pelo menos 60 %, pelo menos 50 %, pelo menos 40 %, pelo menos 30 %, pelo menos 20 %, pelo menos 10 %, ou pelo menos 5 % menores do que com um anticorpo não modificado.

[081] Entende-se na técnica que o variante alélico F158V do receptor FCYRIIIA apresenta características de ligação alteradas para anticorpos. Em uma modalidade, os anticorpos da invenção se ligam com menores afinidades a FcyRIIIA (F158V) com relação a um anticorpo não modificado. Em uma outra modalidade, os anticorpos da invenção exibem afinidades com receptor FcyRIIIA (F158V) que são pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 7 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 20 vezes, ou pelo menos 30 vezes, ou pelo menos 40 vezes, ou pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 60 vezes, ou pelo menos 70 vezes, ou pelo menos 80 vezes, ou pelo menos 90 vezes, ou pelo menos 100 vezes, ou pelo menos 200 vezes menores do que com aquele de um anticorpo não modificado. Em uma outra modalidade, os anticorpos da invenção exibem afinidades com o receptor FcyRIIIA (Fl58V) que são pelo menos 90 %, pelo menos 80 %, pelo menos 70 %, pelo menos 60 %, pelo menos 50 %, pelo menos 40 %, pelo menos 30 %, pelo menos 20 %, pelo menos 10 %, ou pelo menos 5 % menores do que com um anticorpo não modificado.

[082] Em uma outra modalidade, os anticorpos da invenção exibem maiores afinidades com o receptor FcyRIIB comparadas ao anticorpo não modificado. Em uma outra modalidade, os anticorpos da invenção exibem afinidades com o receptor FcyRIIB que não são mudadas ou maiores em pelo menos pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 7 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 20 vezes, ou pelo menos 30 vezes, ou pelo menos 40 vezes, ou pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 60 vezes, ou pelo menos 70 vezes, ou pelo menos 80 vezes, ou pelo menos 90 vezes, ou pelo menos 100 vezes, ou pelo menos 200 vezes do que aquele de um anticorpo não modificado. Em uma outra modalidade, os anticorpos da invenção exibem afinidades com o receptor FCYRIIB que são maiores em pelo menos 5 %, pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, ou pelo menos 95 % do que um anticorpo não modificado.

[083] Em uma outra modalidade, os anticorpos da invenção exibem afinidades com os receptores FCYRI, FCYRIIIA, ou FCYRIIIA (F158V) que são entre cerca de 100 nM a cerca de 100 μM, ou cerca de 100 nM a cerca de 10 μM, ou cerca de 100 nM a cerca de 1 μM, ou cerca de 1 nM a cerca de 100 μM, ou cerca de cerca de 10 nM a cerca de 100 μM, ou cerca de 1 μM a cerca de 100 μM, ou cerca de 10 μM a cerca de 100 μM. Em certas modalidades, os anticorpos da invenção exibem afinidades com os receptores FcyRI, FcyRIIIA, ou FcyRIIIA (F158V) que são maiores do que 1 μM, maiores do que 5 μM, maiores do que 10 μM, maiores do que 25 μM, maiores do que 50 μM, ou maiores do que 100 μM.

[084] Em uma outra modalidade, os anticorpos da invenção exibem afinidades com o receptor FcyRIIB que são entre cerca de 100 nM a cerca de 100 μM, ou cerca de 100 nM a cerca de 10 μM, ou cerca de 100 nM a cerca de 1 μM, ou cerca de 1 nM a cerca de 100 μM, ou cerca de 10 nM a cerca de 100 μM, ou cerca de 1 μM a cerca de 100 μM, ou cerca de 10 μM a cerca de 100 μM. Em certas modalidades, os anticorpos da invenção exibem afinidades com os receptores FcyRI, FcyRIIIA, ou FcyRIIIA (F158V) que são menores do que 100 μM, menores do que 50 μM, menores do que 10 μM, menores do que 5 μM, menores do que 2,5 μM, menores do que 1 μM, ou menores do que 100 nM, ou menores do que 10 nM.

[085] Em uma outra modalidade, os anticorpos da invenção exibem afinidades com o receptor FCYRIIB que são entre cerca de 100 nM a cerca de 100 μM, ou cerca de 100 nM a cerca de 10 μM, ou cerca de 100 nM a cerca de 1 μM, ou cerca de 1 nM a cerca de 100 μM, ou cerca de 10 nM a cerca de 100 μM, ou cerca de 1 μM a cerca de 100 μM, ou cerca de 10 μM a cerca de 100 μM. Em certas modalidades, os anticorpos da invenção exibem afinidades com os receptores FCYRI, FCYRIIIA, ou FCYRIIIA (F158V) que são menores do que 100 μM, menores do que 50 μM, menores do que 10 μM, menores do que 5 μM, menores do que 2,5 μM, menores do que 1 μM, ou menores do que 100 nM, ou menores do que 10 nM. 5.2 Menor atividade ADCC

[086] É bem conhecido na técnica que anticorpos são capazes de direcionar o ataque e destruição de antígeno alvo por meio de processos múltiplos, conhecidos coletivamente na técnica como funções efetoras do anticorpo. Um destes processos, conhecido como "citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo" ou "ADCC", refere-se a uma forma de citotoxicidade na qual a Ig secretada ligada nos receptores Fc (FcRs) presentes em certas células citotóxicas (por exemplo, células exterminadoras naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) permite que estas células citotóxicas efetoras se liguem especificamente a uma célula alvo que carrega o antígeno e, subsequentemente, mate a célula alvo com citotoxinas. Anticorpos IgG específicos de alta afinidade direcionados na superfície de célula alvos "armam" as células citotóxicas e são exigidos para tal extermínio. A lise da célula alvo é extracelular, exige contato célula a célula direto e não envolve o complemento. Um outro processo incluído pelo termo função efetora é citotoxicidade dependente de complemento (daqui por diante referido como "CDC") que refere-se a um evento bioquímico de destruição de célula alvo mediada por anticorpo pelo sistema complemento. O sistema complemento é um sistema complexo de proteínas observado no plasma sanguíneo normal que combina com anticorpos para destruir bactérias patogênicas e outras células estrangeiras.

[087] A capacidade de qualquer anticorpo particular mediar a lise da célula alvo por ADCC pode ser ensaiada. Para avaliar a atividade ADCC, um anticorpo de interesse é adicionado à células alvo em combinação com células efetoras imunes, que podem ser ativadas pelos complexos antígeno-anticorpo que resultam em citólise da célula alvo. Citólise é em geral detectada pela liberação da marca (por exemplo, substratos radioativos, corantes fluorescentes ou proteínas intracelulares naturais) das células lisadas. As células efetoras usadas para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células exterminadoras naturais (NK). Exemplos específicos de ensaios de ADCC in vitro são descritos em Wisecarver et al, 1985 79:277-282; Bruggemann et al, 1987, J Exp Med 166:1351-1361; Wilkinson et al., 2001, J Immunol Methods 258:183-191; Patel et al., 1995 J Immunol Methods 184:29-38. Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade ADCC do anticorpo de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como aquele revelado em Clynes et al., 1998, PNAS USA 95:652-656.

[088] Observa-se que os anticorpos da invenção são caracterizados por ensaios funcionais in vitro para determinar uma ou mais funções celulares efetoras mediadas por FcyR. Em certas modalidades, os anticorpos da invenção apresentam propriedades de ligação similares e funções celulares efetoras em modelos in vivo (tais como aqueles aqui descritos e revelados) como aqueles em ensaios in vitro. Entretanto, a presente invenção não exclui anticorpos da invenção que não exibem o fenótipo desejado em ensaios in vitro, mas exibem o fenótipo desejado in vivo.

[089] Em uma modalidade, os anticorpos da invenção exibem menos atividades ADCC comparada a um anticorpo não modificado. Em uma outra modalidade, os anticorpos da invenção exibem atividades ADCC que são pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes ou pelo menos 10 vezes ou pelo menos 50 vezes ou pelo menos 100 vezes menores do que com aquele de um anticorpo não modificado. Ainda em uma outra modalidade, os anticorpos da invenção exibem atividades ADCC que são reduzidas em pelo menos 10 %, ou pelo menos 20 %, ou em pelo menos 30 %, ou em pelo menos 40 %, ou em pelo menos 50 %, ou em pelo menos 60 %, ou em pelo menos 70 %, ou em pelo menos 80 %, ou em pelo menos 90 %, ou em pelo menos 100 %, ou em pelo menos 200 %, ou em pelo menos 300 %, ou em pelo menos 400 %, ou em pelo menos 500 % com relação a um anticorpo não modificado. Em certas modalidades, os anticorpos da invenção não apresentam nenhuma atividade ADCC detectável. Em modalidades específicas, a redução e/ou remoção de atividade ADCC pode ser atribuída aos anticorpos de menor afinidade da invenção que exibem ligantes de e/ou receptores de Fc. 5.3 Menor atividade CDC

[090] A via de ativação do complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema complemento (Clq) a uma molécula, um anticorpo, por exemplo, complexado com um antígeno cognato. Para avaliar a ativação do complemento, pode ser realizado um ensaio CDC, por exemplo, como descrito em Gazzano-Santoro et al, 1996, J. Immunol. Methods, 202:163.

[091] Em uma modalidade, os anticorpos da invenção exibem menores afinidades com Clq com relação a um anticorpo não modificado. Em uma outra modalidade, os anticorpos da invenção exibem afinidades com receptor Clq que são pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 7 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 20 vezes, ou pelo menos 30 vezes, ou pelo menos 40 vezes, ou pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 60 vezes, ou pelo menos 70 vezes, ou pelo menos 80 vezes, ou pelo menos 90 vezes, ou pelo menos 100 vezes, ou pelo menos 200 vezes menores do que com um anticorpo não modificado.

[092] Em uma outra modalidade, os anticorpos da invenção exibem afinidades com Clq que são pelo menos 90 %, pelo menos 80 %, pelo menos 70 %, pelo menos 60 %, pelo menos 50 %, pelo menos 40 %, pelo menos 30 %, pelo menos 20 %, pelo menos 10 %, ou pelo menos 5 % menores do que com um anticorpo não modificado.

[093] Em uma outra modalidade, os anticorpos da invenção exibem afinidades com Clq que são entre cerca de 100 nM a cerca de 100 μM, ou cerca de 100 nM a cerca de 10 μM, ou cerca de 100 nM a cerca de 1 μM, ou cerca de 1 nM a cerca de 100 μM, ou cerca de 10 nM a cerca de 100 μM, ou cerca de 1 μM a cerca de 100 μM, ou cerca de 10 μM a cerca de 100 μM. Em certas modalidades, os anticorpos da invenção exibem afinidades com Clq que são maiores do que 1 μM, maiores do que 5 μM, maiores do que 10 μM, maiores do que 25 μM, maiores do que 50 μM, ou maiores do que 100 μM.

[094] Em uma modalidade, os anticorpos da invenção exibem menores atividades CDC comparadas a um anticorpo não modificado. Em uma outra modalidade, os anticorpos da invenção exibem atividades CDC que são pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes ou pelo menos 10 vezes ou pelo menos 50 vezes ou pelo menos 100 vezes menores do que com aquele de um anticorpo não modificado. Ainda em uma outra modalidade, os anticorpos da invenção exibem atividades CDC que são reduzidas em pelo menos 10 %, ou pelo menos 20 %, ou em pelo menos 30 %, ou em pelo menos 40 %, ou em pelo menos 50 %, ou em pelo menos 60 %, ou em pelo menos 70 %, ou em pelo menos 80 %, ou em pelo menos 90 %, ou em pelo menos 100 %, ou em pelo menos 200 %, ou em pelo menos 300 %, ou em pelo menos 400 %, ou em pelo menos 500 % com relação a um anticorpo não modificado. Em certas modalidades, os anticorpos da invenção não exibem atividades CDC detectáveis. Em modalidades específicas, a redução e/ou remoção de atividade CDC pode ser atribuída aos anticorpos de menor afinidade da invenção que exibem ligantes de e/ou receptores Fc. 5.4 Anticorpo relacionado à menor toxicidade

[095] Entende-se na técnica que terapias biológicas podem ter questões de toxicidade adversa associadas com a natureza do complexo de direcionar o sistema imune para reconhecer e atacar células e/ou alvos não desejados. Quando o reconhecimento e/ou o alvejamento para atacar não ocorre onde o tratamento é exigido, consequências tal como a toxicidade adversa podem ocorrer. Por exemplo, coloração de anticorpo de tecidos não alvejados pode ser indicativa de questões de toxicidade potencial.

[096] Em uma modalidade, os anticorpos da invenção exibem menos coloração de tecidos não alvejados comparado a um anticorpo não modificado. Em uma outra modalidade, os anticorpos da invenção exibem menos coloração de tecidos não alvejados que são pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 7 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 20 vezes, ou pelo menos 30 vezes, ou pelo menos 40 vezes, ou pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 60 vezes, ou pelo menos 70 vezes, ou pelo menos 80 vezes, ou pelo menos 90 vezes, ou pelo menos 100 vezes, ou pelo menos 200 vezes menos do que com aquele de um anticorpo não modificado. Em uma outra modalidade, os anticorpos da invenção exibem menos coloração de tecidos não alvejados que são menores em pelo menos 10 %, ou pelo menos 20 %, ou em pelo menos 30 %, ou em pelo menos 40 %, ou em pelo menos 50 %, ou em pelo menos 60 %, ou em pelo menos 70 %, ou em pelo menos 80 %, ou em pelo menos 90 %, ou em pelo menos 100 %, ou em pelo menos 200 %, ou em pelo menos 300 %, ou em pelo menos 400 %, ou em pelo menos 500 % com relação a um anticorpo não modificado.

[097] Em uma modalidade, os anticorpos da invenção exibem um anticorpo menor relacionado à toxicidade comparado a um anticorpo não modificado. Em uma outra modalidade, os anticorpos da invenção exibem toxicidades que são pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 7 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 20 vezes, ou pelo menos 30 vezes, ou pelo menos 40 vezes, ou pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 60 vezes, ou pelo menos 70 vezes, ou pelo menos 80 vezes, ou pelo menos 90 vezes, ou pelo menos 100 vezes, ou pelo menos 200 vezes menores do que com aquele de um anticorpo não modificado. Em uma outra modalidade, os anticorpos da invenção exibem toxicidades que são reduzidas em pelo menos 10 %, ou pelo menos 20 %, ou em pelo menos 30 %, ou em pelo menos 40 %, ou em pelo menos 50 %, ou em pelo menos 60 %, ou em pelo menos 70 %, ou em pelo menos 80 %, ou em pelo menos 90 %, ou em pelo menos 100 %, ou em pelo menos 200 %, ou em pelo menos 300 %, ou em pelo menos 400 %, ou em pelo menos 500 % com relação a um anticorpo não modificado. 5.5 Internalização de anticorpos

[098] Os anticorpos da invenção podem se ligar a antígenos de superfície celular que podem internalizar, carregando adicionalmente os anticorpos na célula. Uma vez dentro da célula, os anticorpos podem ser liberados no citoplasma, alvejados em um compartimento específico, ou reciclados na superfície celular. Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção se ligam a um antígeno de superfície celular que internaliza. Em outras modalidades, os anticorpos da invenção podem ser alvejados em organelas ou compartimentos específicos da célula. Ainda em outras modalidades, os anticorpos da invenção podem ser reciclados na superfície celular ou periférica após internalização. Em uma modalidade específica, o anticorpo da invenção é específica para IFNAR1 .

[099] A internalização de anticorpos pode ser medida por técnicas aceitas na tecnologia tais como aquelas apresentadas no exemplo 34. Em algumas modalidades, o grau de internalização é representado como um percentual de anticorpo total ligado nas células. Em outras modalidades, o grau de internalização de anticorpo é representado como uma comparação a um anticorpo controle não específico. Em outras modalidades, o grau de internalização de anticorpo é representado como uma comparação a um anticorpo que se liga a um antígeno de superfície celular que não internaliza. Ainda em outras modalidades, o grau de internalização de anticorpo está correlacionado à degradação do anticorpo. Ainda em outras modalidades, o grau de internalização de anticorpo é representado como uma razão de coloração citoplasmática versus superfície celular.

[0100] Em uma modalidade, os anticorpos da invenção, uma vez ligados, internalizam nas células em que a internalização é pelo menos cerca de 10 %, pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, ou pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 100 %, pelo menos cerca de 110 %, pelo menos cerca de 130 %, pelo menos cerca de 140 %, pelo menos cerca de 150 %, pelo menos cerca de 160 %, ou pelo menos cerca de 170 % maior que um anticorpo controle não específico.

[0101] Em uma outra modalidade, os anticorpos da invenção, uma vez ligados, internalizam nas células em que a internalização é 1-10 %, 10-20 %, 20 - 30 %, 30- 40 %,40- 50 %, 50-60 %, 60-70 %, 70-80 %, 80-90 %, 90-100 %, 100-110 %, 110-120 %, 120-130 %, 130-140 %, 140150 %, 150-160 %, 160-170 % maior que um anticorpo controle não específico.

[0102] Em uma outra modalidade, os anticorpos da invenção, uma vez ligados, internalizam nas células em que internalização é 1-10 %, 10-20 %, 20 - 30 %, 30- 40 %,40- 50 %, 50-60 %, 60-70 %, 70-80 %, 80-90 %, 90-100 %, 100-110 %, 110-120 %, 120-130 %, 130-140 %, 140150 %, 150-160 %, 160-170 % maior que anticorpos controle da maneira determinada pelo ensaio de internalização usando um anticorpo secundário. 5.6 Estrutura tridimensional de uma região Fc humana

[0103] A presente invenção também fornecem formas cristalinas de uma região Fc de IgG humana, em que a região Fc humana, designada como Fc-TM, compreende substituições de aminoácidos de L234F, L235E e P331S numeradas pelo índice EU da maneira apresentada em Kabat e exibe função efetora reduzida ou removida (ADCC e/ou CDC), ligação reduzida ou removida dos receptores Fc, e/ou toxicidades reduzidas ou removidas. Em certas modalidades, os cristais são caracterizados por um grupo espacial ortorrômbico C2221 com unidade celular de a=50,18, b=147,30 e c=75,47. Em certas modalidades, os cristais são de qualidade de difração para permitir a determinação da estrutura de difração de raios-X tridimensional do(s) polipeptídeo(s) cristalino(s) em alta resolução, preferivelmente em uma resolução maior do que cerca de 3 Â, tipicamente na faixa de cerca de 2 Â a cerca de 3 Â.

[0104] A presente invenção fornece adicionalmente as estruturas tri-dimensionais de alta resolução e as coordenadas da estrutura atômica dos cristais Fc-TM. Os métodos específicos usados para obter cristais e coordenadas de estrutura são fornecidos no exemplos, infra.

[0105] As coordenadas de estrutura atômica de Fc-TM cristalino, obtidas da forma C2221 do cristal na resolução 2,3 Â, são listadas na tabela 6. Todos os resíduos nas posições 236 a 445 podem ser rastreados na densidade eletrônica e nenhuma densidade eletrônica foi observada para resíduos de dobradiça antes da posição 236, incluindo as mutações L234F e L235E. A densidade eletrônica na posição 331 corresponde a serina.

[0106] A estrutura tridimensional completa de Fc-TM foi muito similar a estruturas previamente relatadas de regiões Fc humana não ligadas (Deisenhofer, (1981). Biochemistry, 20, 2361-2370; Krapp et al, (2003). J. MoI. Biol. 325, 979-989; Matsumiya et al, (2007). J. MoI. Biol. 368, 767-779; Oganesyan et al, (2007) Molecular Immunology, December 11, 2007, para impressão). Quando considerado individualmente, os domínios Fc- TM CH2 e CH3 mostraram melhor conservação e rigidez estrutural quando comparados com outras estruturas Fc humanas não ligadas, não mutadas.

[0107] A informação da estrutura pode ser usada em uma variedade de computação ou métodos que baseiam-se em computador para selecionar, projetar ou identificar anticorpos anti-IFNAR que alteram propriedades biológicas. Por exemplo, os cristais e coordenadas de estrutura obtidas destes podem ser usados para selecionar, projetar ou identificar adições, substituições ou deleções de aminoácido na região Fc que resultam em ligação reduzida ou removida dos receptores Fc, função efetora reduzida ou removida (ADCC e/ou CDC), ou toxicidades reduzidas ou removidas.

[0108] Uma vez que um anticorpo foi projetado ou selecionado pelos métodos anteriores, sua função efetora, ligação aos receptores Fc, ou toxicidades, podem ser testadas e otimizadas por quaisquer métodos conhecidos pelos versados na técnica. Os métodos exemplares são descritos nas seções 5.1-5.4 anteriores.

[0109] A presente invenção também inclui anticorpos anti- IFNAR1 que são projetados ou selecionados pelo uso da informação da estrutura de Fc-TM e que exibem as atividades biológicas desejadas. Em algumas modalidades, tais anticorpos compreendem uma região Fc com as mutações de L234F, L235E, e P331S. Em algumas modalidades, tais anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais adição, substituição ou deleção de um resíduo de aminoácido sem ser resíduos de aminoácidos 234, 235, e 331. 5.7 Anticorpos anti-IFNAR1

[0110] Em uma modalidade, os anticorpos da invenção são específicos para IFNAR1 (isto é, se ligam especificamente). Tais anticorpos também podem ser aqui referidos como "anticorpos anti-IFNAR1 da invenção". Em uma outra modalidade, os anticorpos da invenção são específicos para IFNAR1 humano. Em uma outra modalidade, os anticorpos anti-IFNAR1 da invenção podem reagir de maneira cruzada com IFNAR1 de espécies sem ser a espécie humana, ou outras proteínas que são estruturalmente relacionadas a IFNAR1 humano (por exemplo, homólogos de IFNAR1 humano). Em outras modalidades, os anticorpos anti-IFNAR1 da invenção podem ser específicos apenas para IFNAR1 humano e não exibem espécies ou outros tipos de reatividade cruzada.

[0111] Em uma modalidade, os anticorpos anti-IFNAR1 da invenção exibem menores afinidades de ligação com ligantes de Fc e apresentam pelo menos uma das propriedades a seguir: função efetora reduzida ou removida (ADCC e/ou CDC), ligação reduzida ou removida aos ligantes de Fc, ou toxicidades reduzidas ou removidas comparadas a um anticorpo não modificado.

[0112] Em uma modalidade, anticorpos anti-IFNAR1 da invenção compreendem a adição, substituição ou deleção de pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste em: L234F, L235E, e P331S. Em uma modalidade específica, os anticorpos anti-IFNAR1 da invenção compreendem as substituições de aminoácidos: L234F, L235E e P331S da região Fc. Em uma modalidade específica, um anticorpo anti- IFNAR1 da invenção é um anticorpo de isotipo IgG.

[0113] Em uma outra modalidade, anticorpos anti-IFNAR1 da invenção são da subclasse IgG4. Ainda em uma outra modalidade, anticorpos IgG4 anti-IFNAR1 da invenção compreendem a substituição de aminoácido L235E da região Fc. Em uma outra modalidade, os anticorpos IgG4 anti-IFNAR1 da invenção também compreendem uma mudança de aminoácido que está correlacionada com maior estabilidade. Em uma modalidade específica, anticorpos IgG4 anti-IFNAR1 da invenção compreendem adicionalmente a substituição de aminoácido S228P da região Fc.

[0114] Em uma outra modalidade, anticorpos anti-IFNAR1 da invenção exibem afinidades de ligação reduzidas ou removidas para receptores Fc (por exemplo, mas sem limitação, FCYRI (CD64), incluindo as isoformas FCYRIA, FCYRIB, e FCYRIC; FCYRII (CD32), incluindo as isoformas FcyRIIA, FcyRIIB, e FcyRIIC; e FcyRIII (CD 16), incluindo as isoformas FCYRIIIA e FCYRIIB) comparados a um anticorpo não modificado. Em uma modalidade específica, os anticorpos anti-IFNAR1 da invenção exibem menos afinidades com FcyRI com relação a um anticorpo não modificado. Em uma outra modalidade específica, os anticorpos anti-IFNAR1 da invenção exibem menores afinidades com o receptor FcyRIIIA com relação a um anticorpo não modificado. Em uma outra modalidade específica, os anticorpos anti-IFNAR1 da invenção se ligam com menores afinidades ao alelo F158V de FcyRIIIA com relação a um anticorpo não modificado.

[0115] Em uma outra modalidade, anticorpos anti-IFNAR1 da invenção exibem afinidades de ligação reduzidas ou removidas com Clq comparados a um anticorpo não modificado. Em uma modalidade específica, os anticorpos anti-IFNAR1 da invenção exibem menos afinidades com FcyRI com relação a um anticorpo não modificado.

[0116] Em uma modalidade, anticorpos anti-IFNAR1 da invenção exibem função efetora reduzida ou removida. Em uma modalidade específica, anticorpos anti-IFNAR1 da invenção exibem atividade ADCC e/ou CDC reduzida ou removida. Em uma outra modalidade específica, os anticorpos anti-IFNAR1 da invenção exibem toxicidade reduzida ou removida. 5.7.1 Sequências de anticorpo anti-IFNAR1

[0117] Em uma modalidade, as sequências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada e/ou regiões variáveis de cadeia leve dos anticorpos anti-IFNAR1 da invenção são aqui fornecidas como figuras IA, 2A, 3A, 4A e figuras IB, 2B, 3B, 4B, respectivamente. Em uma outra modalidade, a sequência de polinucleotídeos que codifica regiões variáveis de cadeia pesada e variáveis de cadeia leve dos anticorpos anti-IFNAR1 da invenção é aqui fornecida como figuras IA, 2A, 3A, 4A e figuras IB, 2B, 3B, 4B, respectivamente.

[0118] Em uma outra modalidade, sequências selecionadas de anticorpos anti-IFNAR1 da invenção podem ser observadas em patente U.S. 5.919.453, pedidos de patente U.S.: 10/831.459, 10/182.058, 11/157.494 e 11/521.102 cada um das quais são aqui incorporados pela referência e na sua íntegra para todos os propósitos. Em uma modalidade alternativa, as sequências dos anticorpos anti-IFNAR1 da invenção não compreendem as sequências observadas na patente U.S. 5.919.453, pedidos de patente U.S.: 10/831.459, 10/182.058, 11/157.494 e 11/521.102.

[0119] Em outras modalidades, os anticorpos da invenção são revelado nos pedidos de patente U.S. 60/842.925, depositado em 8 de setembro de 2006, 60/866.917; depositado em 22 de novembro de 2006; 60/911.397, depositado em 12 de abril de 2007; 60/915.309, depositado em 22 de maio de 2007; pedido de patente U.S. 11/852.106, depositado em 7 de setembro de 2007; e pedido PCT US2007/07791, depositado em 7 de setembro de 2007, cada um dos quais são aqui incorporados na sua íntegra para todos os propósitos.

[0120] Em uma modalidade, anticorpos anti-IFNAR1 da invenção também incluem anticorpos que compreendem uma sequência de aminoácidos de uma cadeia pesada variável e/ou cadeia leve variável que é pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou pelo menos 99 % idêntica à sequência de aminoácidos da cadeia pesada e/ou cadeia leve variáveis dos anticorpos 3F11, 11E2, 4G5 e 9D4s (ver figuras 1-4 para sequências).

[0121] Será entendido que a complementaridade que determina números de resíduos de regiões (CDRs) aqui referidos são aqueles de Kabat et al. (1991, publicação NIH 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA). Especificamente, resíduos 24-34 (CDRl), 50-56 (CDR2) e 89-97 (CDR3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (CDRl), 50-65 (CDR2) e 95-102 (CDR3) no domínio variável de cadeia pesada. Note que CDRs variam consideravelmente de anticorpo para anticorpo (e por definição não exibirão homologia com as sequências consensuais Kabat). O alinhamento máximo de resíduos de estrutura exige frequentemente a inserção de resíduos "espaçadores" no sistema de numeração a serem usados na região Fv. Será entendido que as CDRs aqui referidas são aquelas de Kabat et al. supra. Além do mais, a identidade de certos resíduos individuais em qualquer número do sítio Kabat dado pode variar de cadeia de anticorpo para cadeia de anticorpo em virtude das interespécies ou divergência alélica.

[0122] Em uma modalidade, os anticorpos anti-IFNAR1 da invenção compreendem pelo menos uma CDR VH com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRs VH listadas na tabela 2. Em uma outra modalidade, os anticorpos anti-IFNAR1 da invenção compreendem pelo menos uma CDR VL com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRs VL listadas na tabela 2. Em outras modalidades, os anticorpos anti- IFNAR1 da invenção compreendem uma ou mais das CDRs VH e uma ou mais das CDRs VL listadas na tabela 2. Ainda em outras modalidades, os anticorpos anti-IFNAR1 da invenção compreendem qualquer combinação das CDRs VH e CDRs VL listadas na tabela 2. Em uma outra modalidade, os anticorpos anti-IFNAR1 da invenção podem compreender pelo menos 1, ou pelo menos 2, ou pelo menos 3, ou pelo menos 4, ou pelo menos 5, ou pelo menos 6 CDRs selecionadas da tabela 2. Em uma outra modalidade, anticorpos anti-IFNAR1 da invenção podem compreender um domínio VH e/ou um domínio VL, cada um compreendendo 1, 2 ou 3 CDRs. Em uma outra modalidade, os anticorpos anti-IFNAR1 da invenção podem compreender um VH que compreendem adicionalmente 1, 2, ou 3 CDRs de cadeia pesada (CDRH#) listadas na tabela 2. Em uma outra modalidade, os anticorpos anti-IFNAR1 da invenção podem compreender um VL que compreende adicionalmente 1, 2, ou 3 CDRs de cadeia leve (CDRL#) listadas na tabela 2.

[0123] Em uma modalidade específica, os anticorpos anti- IFNAR1 da invenção compreendem as CDRs de anticorpo 3F11 (ver, por exemplo, tabela 2). Em uma outra modalidade específica, os anticorpos anti- IFNAR1 da invenção compreendem as CDRs de anticorpo 4G5 (ver, por exemplo, tabela 2). Em uma outra modalidade específica, os anticorpos anti- IFNAR1 da invenção compreendem as CDRs de anticorpo 11E2 (ver, por exemplo, tabela 2). Ainda em uma outra modalidade específica, os anticorpos anti-IFNAR1 da invenção compreendem as CDRs de anticorpo 9D4 (ver, por exemplo, tabela 2).

[0124] Em uma modalidade, anticorpos anti-IFNAR1 da invenção compreendem uma sequência de aminoácidos de uma cadeia pesada variável e/ou cadeia leve variável que compreende pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, ou pelo menos 20 substituições, adições, ou deleções de aminoácidos comparados à variáveis de cadeia pesada e/ou cadeia leve representadas nas figuras 1, 2, 3 ou 4. Em uma outra modalidade, anticorpos anti-IFNAR1 da invenção compreendem uma ou mais CDRs com pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, ou pelo menos 10 substituições, deleções, ou adições de aminoácidos de uma ou mais CDRs listadas na tabela 2.

[0125] Em uma outra modalidade, anticorpos anti-IFNAR1 da invenção compreendem anticorpos codificados por uma sequência de polinucleotídeos que hibridiza a sequência de nucleotídeos representada nas figuras 1, 2, 3, ou 4 em condições severas. Em uma outra modalidade, anticorpos anti-IFNAR1 da invenção compreendem uma ou mais CDRs codificadas por uma sequência de nucleotídeos que hibridiza em condições severas a sequência de nucleotídeos de uma ou mais CDRs listadas nas figuras 1, 2, 3, ou 4. Condições severas de hibridização incluem, mas sem limitação, hibridização de DNA ligado em filtro em cloreto de sódio/citrato de sódio 6X (SSC) em cerca de 45 °C após uma ou mais lavagens em SSC/SDS a 0,1 % 0,2X em cerca de 50-65 °C, condições altamente severas tal como hibridização de DNA ligado em filtro em SSC 6X em cerca de 45 °C após uma ou mais lavagens em SSC/SDS a 0,2 % 0,1X em cerca de 60 °C, ou quaisquer outras condições severas de hibridização conhecidas pelos versados na técnica (ver, por exemplo, Ausubel, F. M. et al, eds. 1989 Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, Green Publishing Associates, Inc. e John Wiley e Sons, Inc., NY at pages 6.3.1 to 6.3.6 e 2.10.3). Em uma outra modalidade, anticorpos anti-IFNAR1 da invenção incluem, mas sem limitação, anticorpos codificados por uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % idêntica a uma sequência de polinucleotídeos que codifica anticorpos 3F11, 11E2, 4G5 ou 9D4 (ver figuras 1-4). 5.7.2 Afinidade de ligação de anti-IFNAR1

[0126] Em certas modalidades, os anticorpos anti-IFNAR1 da invenção exibem uma alta afinidade de ligação com IFNAR1. Em uma modalidade específica, anticorpos anti-IFNAR1 da invenção exibem taxa de 5 -1 -1 5 -1 -1 associação (kon) de pelo menos 10 M s , pelo menos 5x10 M s , pelo menos 106M-1s-1 elo menos 5x106M-1s-1 elo menos 107M-1s-1 elo menos s , pe o e os x s , pe o e os s , pe o e os 7 -1 -1 8 -1 -1 5x10 M s , ou pelo menos 10 M s . Em uma outra modalidade, anticorpos anti-IFNAR1 da invenção exibem uma kon de pelo menos 2x 105M-1s-1, pelo menos 5x105M-1s-1 elo menos 106M-1s-1 elo menos 5x106M-1s-1 elo e os x s , pe o e os s , pe o e os x s , pe o menos 107M-1s-1 elo menos 5x106M-1s-1 ou elo menos 108M-1s-1 ,p p .

[0127] Em uma outra modalidade, anticorpos anti-IFNAR1 da invenção exibem uma taxa de dissociação (koff) menor do que 10-1s-1, -1 -1 -2 -1 -2 -1 menor o que x s , menor o que s , menor o que x s , menor -3 -1 -3 -1 -4 -1 - o que s , menor o que x s , menor o que s , menor o que 4 -1 -5 -1 -5 -1 -6 -1 s , menor o que s , menor o que x s , menor o que s , -6 -1 -7 -1 -7 -1 menor o que x s , menor o que s , menor o que x s , menor -8 -1 -8 -1 -9 -1 o que s , menor o que x s , menor o que s , menor o que x 10-9s-1, ou menor do que 10-10-1s-1. Em uma outra modalidade, anticorpos anti- IFNAR1 da invenção exibem uma k0ff, menor do que 5x10-4s-1, menor do que 10-5 -1 -5 -1 -6 -1 -6 -1 s , menor o que x s , menor o que s , menor o que x s , -7 -1 -7 -1 -8 -1 menor que s , menor o que x s , menor o que s , menor o que 5x 10-8s-1, menor do que 10-9s-1, menor do que 5x10-9s-1 ou menor do que 10-10s-1.

[0128] Em uma outra modalidade, anticorpos anti-IFNAR1 da invenção exibem uma constante de afinidade ou Ka (kon/koff) de pelo menos 102M-1 elo menos 5x102M-1 elo menos 103M-1 elo menos 5x103M-1 elo , pe o e os x , pe o e os , pe o e os x , pe o menos 104M-1 elo menos 5x104M-1 elo menos 105M-1 elo menos 5x ,p ,p ,p 10 5M-1 elo menos 106M-1 elo menos 5x 106M-1 elo menos 107M-1 elo , pe o e os , pe o e os x , pe o e os , pe o menos 5x 107M-1 elo menos 108M-1 elo menos 5x 108M-1 elo menos e os x , pe o e os , pe o e os x , pe o e os 109 -1 9 -1 10 -1 10 -1 M , pelo menos 5x 10 M , pelo menos 10 M , pelo menos 5X10 M , 11 -1 11 -1 12 -1 pelo menos 10 M , pelo menos 5X10 M , pelo menos 10 M , pelo menos 5x1012M-1 elo menos 1013M-1 elo menos 5x1013M-1 elo menos 1014M-1 x , pe o e os , pe o e os x , pe o e os , pelo menos 5x1014M-1, pelo menos 1015M-1 ou pelo menos 5x1015M-1.

[0129] Em uma outra modalidade, anticorpos anti-IFNAR1 da invenção exibem uma constante de dissociação ou Kd(koff/kon) menor do que 10-2M, menor do que 5x10 -2M, menor do que 10-3M, menor do que 5x - 3M, menor do que 10-4M, menor do que 5x -4M, menor do que 10-5M, menor do que 5x10-5M, menor do que 10-6M, menor do que 5xl0-6M, menor do que 10-7M, menor do que 5xl0-7M, menor do que 10-8M, menor do que 5xl0-8M, menor do que 10-9M, menor do que 5xl0-9M, menor do que 10 -10M, menor do que 5xl0-10M, menor do que 10-11M, menor do que 5Xl0-11M, menor do que 10-12M, menor do que 5xl0-12M, menor do que 10-13M, menor do que 5xl0- 13M, menor do que 10-14M, menor do que 5xl0-14M, menor do que 10-15M ou menor que 5x10-15M. 5.7.3 Especificidade do subtipo interferon alfa

[0130] Em uma modalidade, os anticorpos anti-IFNAR1 da invenção exibem a capacidade de bloquear a ligação a IFNAR1 e/ou neutralizar a atividade biológica de um ou mais interferon tipo I (IFN) incluindo, mas sem limitação, IFNα, IFNβ, e IFNw. A ligação de subtipos de IFNα pode ser determinada por ensaios de competição de rotina, tal como aquele descrito em Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL. Em uma outra modalidade, os anticorpos anti-IFNAR1 da invenção exibem a capacidade de bloquear a ligação a IFNAR1 e/ou neutralizar a atividade biológica, incluindo, mas sem limitação, de IFNα, IFNβ, e IFNco. Em uma outra modalidade, os anticorpos anti-IFNAR1 da invenção exibem a capacidade de bloquear a ligação a IFNAR1 e/ou neutralizar a atividade biológica de um ou mais subtipos de IFNα incluindo, mas sem limitação, subtipos de IFNα 1, 2a, 2b, 4, 4b, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17, e 21. Em uma outra modalidade, os anticorpos anti-IFNAR1 da invenção exibem a capacidade de bloquear a ligação a IFNAR1 e/ou neutralizar a atividade biológica de todos os subtipos de IFNα. Neste contexto, anticorpos anti-IFNAR1 da invenção exibem a capacidade de bloquear a ligação e/ou neutralizar a atividade biológica de IFNα de subtipos IFNα 1, 2a, 2b, 4, 4b, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17, e 21. Em uma modalidade, anticorpos anti-IFNAR1 da invenção não exibem a capacidade de bloquear a ligação a IFNAR1 e/ou neutralizar a atividade biológica de um ou mais subtipos de IFNα incluindo, mas sem limitação, subtipos de IFNα 1, 2a, 2b, 4, 4b, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17, e 21. Em uma modalidade específica, anticorpos anti-IFNAR1 da invenção exibem a capacidade de bloquear a ligação a IFNAR1 e/ou neutralizar a atividade biológica de todos os subtipos de IFNα, exceto IFNα21.

[0131] Em uma outra modalidade, os anticorpos anti- IFNAR1 da invenção exibem a capacidade de bloquear a ligação a IFNAR1 e/ou neutralizar a atividade biológica de pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, ou pelo menos 13 dos seguintes subtipos de IFNα: 1, 2a, 2b, 4, 4b, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17, e 21. Em uma modalidade alternativa, os anticorpos anti-IFNAR1 da invenção não exibem a capacidade de bloquear a ligação a IFNAR1 e/ou neutralizar a atividade biológica de pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, ou pelo menos 13 dos seguintes subtipos de IFNα: 1, 2a, 2b, 4, 4b, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17, e 21.

[0132] Em outras modalidades, os anticorpos anti-IFNAR1 da invenção exibem a capacidade de bloquear a ligação a IFNAR1 e/ou neutralizar a atividade biológica de interferons como os do tipo I de ocorrência não natural. Tais interferons como os do tipo I de ocorrência não natural, ou interferons como os do tipo I híbridos representam moléculas que foram alteradas de suas estruturas de ocorrência natural por técnicas recombinantes ou sintéticas. Interferons híbridos, da maneira descrita em patente U.S. 7.232.563, representam uma substituição molecular de vários segmentos de uma estrutura de interferon de ocorrência natural para criar uma molécula que tem maior eficácia e/ou menor toxicidade.

[0133] Em outras modalidades, os anticorpos anti-IFNAR1 da invenção exibem a capacidade de bloquear a ligação a IFNAR1 e/ou neutralizar a atividade biológica de interferons do tipo I mutados. Interferons do tipo I mutados são descritos em patentes U.S. 6.299.870 e 6.300.474 que são incorporadas pela referência na sua íntegra.

[0134] Ainda em outras modalidades, os anticorpos anti- IFNAR1 da invenção exibem a capacidade de bloquear a ligação a IFNAR1 e/ou neutralizar a atividade biológica de interferons como os do tipo I derivado de outra espécie animal. Tais interferons como os do tipo I são isolados de galinha, gato, camundongo, rato, coelho, ovelha, cavalo ou outra espécie animal. Em modalidades específicas, interferons humanos do tipo I são isolados de células derivadas de galinha, gato, camundongo, rato, coelho, ovelha, cavalo ou outra espécie animal. Em outras modalidades, interferons humanos do tipo I transmitem diferentes padrões de glicosilação quando derivados de galinha, gato, camundongo, rato, coelho, ovelha, cavalo ou outra espécie animal. Discussão adicional de interferons de outra espécie animal pode ser encontrada em publicação WIPO WO06099451 A3, que é aqui incorporada pela referência.

[0135] Com o propósito da presente invenção, a capacidade de anticorpos anti-IFNAR1 da invenção neutralizarem a atividade de IFNα pode ser monitorada, por exemplo, em um ensaio de ativação do receptor quinase (KIRA), da maneira descrita em WO 95/14930, publicado em 1 de junho de 1995, medindo a capacidade de um anticorpo candidato reduzir a fosforilação de tirosina (resultante da ligação do ligante) do complexo do receptor IFNAR1/R2.

[0136] Alternativamente, ou opcionalmente, com o propósito da presente invenção, a capacidade de anticorpos anti-IFNAR1 da invenção neutralizarem a elicitação de uma resposta celular por IFNα pode ser testada monitorando a neutralização da atividade antiviral de IFNα, da maneira descrita por Kawade, J. Interferon Res. 1 :61 70 (1980), ou Kawade e Watanabe, J. Interferon Res. 4:571 584 (1984), ou Yousefi, et al, Am. J. Clin. Pathol. 83: 735 740 (1985), ou testando a capacidade de anticorpos anti- IFNAR1 da invenção neutralizarem a capacidade de IFNα ativar a ligação da molécula de sinalização, fator 3 estimulado por interferon (ISGF3) para um oligonucleotídeo derivado do elemento de resposta estimulada por interferon (ISRE), em um ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética, da maneira descrita por Kurabayashi et al., MoI. Cell Biol, 15: 6386 (1995).

[0137] Em uma modalidade, anticorpos anti-IFNAR1 da invenção exibem a capacidade de inibir pelo menos uma função mediada por IFNα do receptor IFNAR1. Em uma modalidade, os anticorpos anti-IFNAR1 da invenção inibem a atividade do receptor IFNAR1 em resposta a IFNα ou subtipos deste em pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, ou pelo menos cerca de 99 %. Em uma outra modalidade, os anticorpos anti-IFNAR1 da invenção inibem a atividade do receptor IFNAR1 em resposta a IFNα ou subtipos deste, da maneira medida pelo ensaio KIRA descrito anteriormente, em pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, ou pelo menos cerca de 99 %. Em uma outra modalidade, os anticorpos anti-IFNAR1 da invenção inibem a atividade do receptor IFNAR1 em resposta a IFNα ou subtipos deste da maneira medida pela ligação da molécula de sinalização, fator 3 estimulado por interferon (ISGF3) para um oligonucleotídeo derivado do elemento de resposta estimulada por interferon (ISRE), em um ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética, da maneira descrita por Kurabayashi et al., MoI. Cell Biol, 15: 6386 (1995), em pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, ou pelo menos cerca de 99 %. Em uma outra modalidade, os anticorpos anti-IFNAR1 da invenção inibem a atividade do receptor IFNAR1 em resposta a IFNα ou subtipos deste da maneira medida por um ensaio conhecido na técnica em pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, ou pelo menos cerca de 99 %.

[0138] Em uma outra modalidade, anticorpos anti-IFNAR1 da invenção exibem a capacidade de neutralizar as propriedades antivirais de IFNα ou subtipos deste. Em uma modalidade, os anticorpos anti-IFNAR1 da invenção neutralizam pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, ou pelo menos cerca de 99 % da atividade antiviral de IFNα ou subtipos deste, da maneira determinada pelo ensaio antiviral de Kawade (1980), ou Yousefi (1985). Em uma modalidade alternativa, anticorpos anti-IFNAR1 da invenção não neutralizam as propriedades antivirais de IFNα ou subtipos deste.

[0139] Com o propósito da presente invenção, a capacidade de anticorpos anti-IFNAR1 da invenção para bloquear a ligação de IFNα ou subtipos deste com IFNAR1 pode ser determinada por um ensaio de competição de rotina tal como aquele descrito em Anticorpos: UM Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988). Em uma modalidade, os anticorpos anti-IFNAR1 da invenção exibem a capacidade de bloquear ou inibir a ligação dos seguintes subtipos de IFNα: 1, 2, 4, 5, 8, 10, e 21 to IFNAR1. Em uma outra modalidade, os anticorpos anti- IFNAR1 da invenção exibem a capacidade de bloquear inibir a ligação de: pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, ou pelo menos 7 dos seguintes subtipos de IFNα: 1, 2, 4, 5, 8, 10, e 21 to IFNAR1.

[0140] Anticorpos da invenção pode agir em IFNAR para regular genes responsivos de IFN-I. Genes responsivos de IFN-I foram identificados em pedidos de patente U.S. intitulado "IFN alfa-induced Pharmacodynamic Markers" com os seguintes números de série: 60/873.008, depositado em 6 de dezembro de 2006; 60/907.762, depositado em 16 de abril de 2007; 60/924.584, depositado em 21 de maio de 2007; 60/960.187, depositado em 19 de setembro de 2007; 60/966.176, depositado em 5 de novembro de 2007 e pedido PCT número de série PCT/US2007/02494, depositado em 6 de dezembro de 2007, cada um das quais são aqui incorporados pela referência e na sua íntegra. 5.7.4 Anticorpos

[0141] Anticorpos da invenção podem incluir anticorpos monoclonais, anticorpos multiespecíficos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos camelizados, anticorpos quiméricos, Fvs de cadeia única (scFv), Fvs ligado a dissulfeto (sdFv), e anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id), e fragmentos de ligação de epítopo de quaisquer dos anteriores. Em particular, anticorpos incluem moléculas de imunoglobulina e fragmentos imunologicamente ativos de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm um sítio de ligação de antígeno, estes fragmentos podem ou não estar fundidos a um outro domínio de imunoglobulina, incluindo mas sem limitação, uma região Fc ou fragmento deste. Da maneira aqui definida, as palavras "anticorpo" e "anticorpos" incluem especificamente anticorpos modificados aqui descritos. Moléculas de imunoglobulina podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) ou subclasse. Anticorpos da invenção podem ser de qualquer isotipo. Em uma modalidade, os anticorpos da invenção são do isotipo IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4. Anticorpos da invenção podem ser anticorpos de comprimento total que compreendem regiões variáveis e constantes, ou podem ser fragmentos de ligação de antígeno destes, tal como um anticorpo de cadeia única.

[0142] O termo "fragmento de ligação de antígeno" de um anticorpo (ou simplesmente "fragmento de anticorpo"), da maneira aqui usada, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que mantém a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno (por exemplo, IFNAR1). Observa-se que a função de ligação do antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento total. Exemplos de fragmentos de ligação incluídos no termo "fragmento de ligação de antígeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CHI domínios; (ii) um fragmento F(ab’)2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região da dobradiça; (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CHI; (iv) um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um braço único de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341 :544-546), que consiste em um domínio VH; e (vi) uma região de determinação de complementaridade isolada (CDR). Além do mais, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligador sintético que capacita-os a serem preparados como uma cadeia protéica única, na qual as regiões VL e VH pareiam para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv); ver, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883;. Pretende-se também que tais anticorpos de cadeia única estejam incluídos no termo "fragmento de ligação de antígeno" de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos usando técnicas convencionais conhecidas pelos versados na técnica, e os fragmentos são selecionados por utilidade da mesma maneira como são os anticorpos intactos.

[0143] Em outras modalidades, a invenção fornece proteínas de fusão (daqui por diante referidas como "proteínas de fusão da invenção") que compreendem uma região Fc modificada com afinidade reduzida ou removida com um ligante de Fc responsável para facilitar a função efetora, comparada a uma região Fc com a mesma sequência de aminoácidos como a proteína de fusão da invenção, mas que não compreendem a adição, substituição ou deleção de pelo menos um resíduo de aminoácido na região Fc.

[0144] Em algumas modalidades, proteínas de fusão da invenção podem compreender um peptídeo, polipeptídeo, andaime de proteína, scFv, dsFv, diacorpo, Tandab, ou um anticorpo mimético fundido a uma região Fc modificada. Em algumas modalidades, proteínas de fusão da invenção compreendem uma região ligadora que conecta o peptídeo, polipeptídeo, andaime de proteína, scFv, dsFv, diacorpo, Tandab, ou um anticorpo mimético à região Fc modificada. O uso de ligadores de peptídeo de ocorrência natural, bem como artificiais para conectar polipeptídeos nos polipeptídeos de fusão ligados inéditos é bem conhecido na literatura (Hallewell et al. (1989), J. Biol. Chem. 264, 5260-5268; Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8, 725-731; Robinson & Sauer (1996), Biochemistry 35, 109116; Khandekar et al. (1997), J. Biol. Chem. 272, 32190-32197; Fares et al. (1998), Endocrinology 139, 2459-2464; Smallshaw et al. (1999), Protein Eng. 12, 623-630; patente U.S. 5.856.456).

[0145] Em uma modalidade, proteínas de fusão da invenção compreendem uma região Fc compreendendo pelo menos uma adição, substituição ou deleção de um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste em: 234, 235, e 331, em que o sistema de numeração da região constante é aquele do índice EU da maneira apresentada em Kabat et al. (1991, NIH Publication 91- 3242, National Technical Information Service, Springfield, VA). Em uma modalidade específica, proteínas de fusão da invenção compreendem uma região Fc compreendendo pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste em: L234F, L235E, e P331S.

[0146] Em uma outra modalidade, proteínas de fusão da invenção compreendem adicionalmente uma região Fc compreendendo pelo menos uma adição, substituição ou deleção de um resíduo de aminoácido que está correlacionado com maior estabilidade da proteína de fusão. Em uma modalidade, a adição, substituição ou deleção de um resíduo de aminoácido está na posição 228 da região Fc, em que o sistema de numeração da região constante é aquele do índice EU da maneira apresentada em Kabat et al. (supra). Em uma modalidade específica, proteínas de fusão da invenção compreendem uma região Fc compreendendo uma substituição de aminoácido na posição 228, em que a substituição é um resíduo de serina.

[0147] Em algumas modalidades, os anticorpos ou proteínas de fusão da presente invenção compreendem um ou mais glicoformas modificadas por engenharia, isto é, uma composição de carboidrato que é covalentemente anexada a uma molécula compreendendo uma região Fc. Glicoformas modificadas por engenharia podem ser usadas para uma variedade de propósitos incluindo, mas sem limitação, reduzir a função efetora. Glicoformas modificadas por engenharia podem ser geradas por qualquer método conhecido pelos versados na técnica, por exemplo, usando modificadas por engenharia ou variantes, co-expressando com uma ou mais enzimas, por exemplo DI N-acetilglicosaminiltransferase III (GnTIl 1), expressando uma molécula compreendendo uma região Fc em vários organismos ou linhagens celulares de vários organismos, ou modificando carboidrato(s) após a molécula que compreende região Fc ter sido expressa. Métodos para gerar glicoformas modificadas por engenharia são conhecidos na técnica e incluem, mas sem limitação, aqueles descritos em Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies et al, 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473) patente U.S. 6.602.684; U.S. Ser. No. 10/277.370; U.S. Ser. No. 10/113.929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140Al; PCT WO 02/30954A1; tecnologia Potillegent™ (Biowa, Inc. Princeton, N. J.); tecnologia geneticamente modificada de glicosilação Glyco MAb™ (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Suíça); cada um dos quais é aqui incorporado pela referência na sua íntegra. Ver, por exemplo, WO 00061739; EA01229125; U.S. 20030115614; Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239- 49 cada um dos quais é aqui incorporado pela referência na sua íntegra. 5.7.5 Conjugados de anticorpo

[0148] A presente invenção inclui o uso de anticorpos, ou fragmentos destes, conjugados ou fundidos a uma ou mais frações incluindo, mas sem limitação, peptídeos, polipeptídeos, proteínas, proteínas de fusão, ácido nucleico moléculas, moléculas pequenas, agentes miméticos, medicamentos sintéticos, moléculas inorgânicas e moléculas orgânicas.

[0149] A presente invenção inclui o uso de anticorpos, ou fragmentos destes, fundidos recombinantemente ou conjugados quimicamente (incluindo tanto conjugações covalentes quanto não covalentes) a uma proteína ou polipeptídeo heterólogos (ou fragmento deste, a um polipeptídeo com pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90 ou pelo menos 100 aminoácidos) para gerar proteínas de fusão. A fusão não necessariamente precisa ser direta, mas pode ocorrer por meio de sequências ligadoras. Por exemplo, anticorpos podem ser usados para alvejar polipeptídeos heterólogos parátipos celulares particulares, tanto in vitro quanto in vivo, fundindo ou conjugando os anticorpos nos anticorpos específicos para receptores de superfície celular e particulares. Anticorpos fundidos ou conjugados aos polipeptídeos heterólogos também podem ser usados em imunoensaios e métodos de purificação in vitro usando métodos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, publicação internacional WO 93/21232; patente Européia EP 439,095; Naramura et al., 1994, Immunol. Lett. 39:91-99; patente U.S. 5.474.981; Gillies et al., 1992, PNAS 89:14281432; e Fell et al., 1991, J. Immunol. 146:2446-2452, que são incorporadas pela referência na sua íntegra.

[0150] Proteínas de fusão adicionais podem ser geradas por meio de técnicas de embaralhamento de gene, embaralhamento de motivo, embaralhamento de exon, e/ou embaralhamento de códon (coletivamente referidos como "Embaralhamento de DNA"). Embaralhamento de DNA pode ser empregado para alterar as atividades de anticorpos da invenção ou fragmentos destes (por exemplo, anticorpos, ou fragmentos destes, com maiores afinidades e menores taxas de dissociação). Ver, em geral, patentes U.S. 5.605.793; 5.811.238; 5.,830.721; 5.834.252; e 5.837.458, e Patten et al, 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson, et al., 1999, J. MoI. Biol. 287:265-76; e Lorenzo e Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308-313 (cada uma destas patentes e publicações são aqui incorporadas pela referência na sua íntegra). Anticorpos, ou fragmentos destes, ou os anticorpos codificados, ou fragmentos destes, podem ser modificados sendo submetidos a mutagênese aleatória por PCR tendendo ao erro, inserção aleatória de nucleotídeo ou outros métodos anteriores de recombinação. Uma ou mais porções de um polinucleotídeo que codifica um anticorpo ou fragmento de anticorpo, cujas porções se ligam especificamente à IFNAR1, podem ser recombinadas com um ou mais componentes, motivos, seções, partes, domínios, fragmentos, etc. de uma ou mais moléculas heterólogas.

[0151] Além disso, os anticorpos, ou fragmentos destes, podem ser fundidos às sequências marcadoras, tal como um peptídeo para facilitar a purificação. Em outras modalidades, a sequência marcadora de aminoácidos é um peptídeo hexa-histidina, tal como a etiqueta fornecida em um vetor pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif, 91311), entre outros, muitos dos quais são comercialmente disponíveis. Da maneira descrita em Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824, por exemplo, hexa-histidina fornece purificação conveniente da proteína de fusão. Outras etiquetas de peptídeo usadas para a purificação incluem, mas sem limitação, a etiqueta hemaglutinina "HA", que corresponde a um epítopo derivado da proteína hemaglutinina de influenza (Wilson et al., 1984, Cell 37:767) e a etiqueta "Flag".

[0152] Em outras modalidades, anticorpos da presente invenção ou fragmentos, análogos ou derivados destes, conjugaram em um agente diagnóstico ou detectável. Tais anticorpos podem ser usados para monitorar ou diagnosticar o desenvolvimento ou progressão de um distúrbio inflamatório como parte de um procedimento de teste clínico, tal como determinar a eficácia de uma terapia particular. Tal diagnóstico e detecção podem ser realizados acoplando o anticorpo às substâncias detectáveis incluindo, mas sem limitação, várias enzimas, tais como, mas sem limitação, peroxidase do rábano silvestre, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, ou acetilcolinesterase; grupos prostéticos tais como, mas sem limitação, estreptavidina/biotina e avidina/biotina; materiais fluorescentes tais como, mas sem limitação, umbeliferona, fluoresceína, isotiocinato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila ou ficoeritrina; materiais luminescentes tal como, mas sem limitação, luminol; materiais bioluminescentes tais como, mas sem limitação, luciferase, luciferina e aequorina; materiais radioativos tais como, mas sem limitação, 131 125 123 121 14 35 3 115 iodo ( I, I, I, I), carbono ( C), enxofre ( S), trítio ( H), índio ( In, 113 112 111 99 201 68 67 11 -J I -r» 1 111 I TI i & t ■'■' I r* 1 i"Q 11 I Z,'J 1 I 1 i rràhr\ t uoi TQ 'J ' ( TQ \ T>Q I ó /i 1 In, In, In,), e tecnécio ( Tc), tálio ( Ti), gálio ( Ga, Ga), paládio 103 99 133 18 153 177 159 ( Pd), molibdênio ( Mo), xenônio ( Xe), flúor ( F), Sm, Lu, Gd, 149 140 175 166 90 47 186 188 142 105 97 68 Pm, La, Yb, Ho, Y, Sc, Re, Re, Pr, Rh, Ru, Ge, 57 65 85 32 153 169 51 54 75 113 117 Co, Zn, Sr, P, Gd, Yb, Cr, Mn, Se, Sn, e Tin; metais que emitem pósitron usando várias tomagrafias de emissão de pósitron, íons metálicos paramagnéticos não radioativos, e moléculas que são radiomarcadas ou conjugadas em radioisótopos específicos.

[0153] Técnicas para conjugar frações terapêuticas dos anticorpos são bem conhecias, ver, por exemplo, Arnon et al, "Monoclonal Antibodies Form Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 24356. (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), e Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58.

[0154] Alternativamente, um anticorpo pode ser conjugado em um segundo anticorpo para formar um anticorpo heteroconjugado da maneira descrita por Segal na patente U.S. 4,676,980, que é aqui incorporada pela referência na sua íntegra.

[0155] A fração terapêutica ou medicamento conjugado a um anticorpo, ou fragmento deste que se liga especificamente a IFNAR1, pode ser escolhido para atingir o(s) efeito(s) profilático(s) ou terapêutico(s) desejado(s) para um distúrbio particular em um indivíduo. Um clínico ou outro médico pode considerar o seguinte quando decidir qual fração terapêutica ou medicamento para conjugar a um anticorpo ou fragmento deste que se liga especificamente a IFNAR1: a natureza da doença, a gravidade da doença e a condição do indivíduo. 5.7.6 Métodos de produzir Anticorpos

[0156] Os anticorpos, ou fragmentos destes, podem ser produzidos por qualquer método conhecido na técnica para a síntese de anticorpos, em particular, por síntese química ou por técnicas de expressão recombinante.

[0157] Anticorpos monoclonais podem ser preparados usando uma ampla variedade de técnicas conhecidas na tecnologia, incluindo o uso de tecnologias de hibridoma, recombinante e de exibição de fago, ou uma combinação destas. Por exemplo, anticorpos monoclonais podem ser produzidos usando técnicas de hibridoma incluindo aquelas conhecidas na técnica e preceituadas, por exemplo, em Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al., em: Monoclonal Antibodie e T-CeIl Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981) (as ditas referências aqui incorporadas pela referência nas suas íntegras). O termo "anticorpo monoclonal", da maneira aqui usada, não é limitado aos anticorpos produzidos por meio de tecnologia de hibridoma. O termo "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo que deriva-se de um clone único, incluindo qualquer clone eucariótico, procariótico ou de fago, e não do método pelo qual é produzido.

[0158] Métodos para produzir e selecionar anticorpos específicos usando tecnologia de hibridoma são de rotina e conhecidos na tecnologia. Resumidamente, os camundongos podem ser imunizados com IFNAR1 e, uma vez que uma resposta imune é detectada, por exemplo, anticorpos específicos para IFNAR1 são detectados no soro do camundongo, o baço do camundongo é colhido e esplenócitos isolados. Os esplenócitos são então fundidos por técnicas bem conhecidas para quaisquer células de mieloma adequadas, por exemplo, células da linhagem celular SP20 disponível da ATCC. Hibridomas são selecionado e clonados por diluição limitada. Os clones de hibridoma são então ensaiados por métodos conhecidos na técnica para células que secretam anticorpos capazes de se ligar a um polipeptídeo da invenção. O fluido de ascite, que em geral contém altos níveis de anticorpos, pode ser gerado imunizando camundongos com clones de hibridoma positivos.

[0159] Dessa maneira, anticorpos monoclonais podem ser gerados cultivando uma célula de hibridoma que secreta um anticorpo da invenção, em que o hibridoma é gerado fundindo esplenócitos isolados de um camundongo imunizado com IFNAR1, com células de mieloma e então selecionando os hibridomas resultantes da fusão para clones de hibridoma que secretam um anticorpo capaz de se ligar a IFNAR1.

[0160] Fragmentos de anticorpo que reconhecem epítopos de IFNAR1 específicos podem ser gerados por qualquer técnica conhecida pelos versados na tecnologia. Por exemplo, fragmentos Fab e F(ab’)2 da invenção podem ser produzidos por clivagem proteolítica de moléculas de imunoglobulina, usando enzimas tal como papaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos F(ab’)2). Os fragmentos F(ab’)2 contêm a região variável, a região constante de cadeia leve e o domínio CHl da cadeia pesada. Adicionalmente, os anticorpos da presente invenção também podem ser gerados usando vários métodos de exibição de fago conhecidos na técnica.

[0161] Nos métodos de exibição de fago, domínios de anticorpo funcional são exibidos na superfície de partículas de fago que carregam a sequência de polinucleotídeos que codifica-os. Em particular, sequências de DNA que codificam domínios VH e VL são amplificadas das bibliotecas de cDNA animal (por exemplo, bibliotecas de cDNA de tecido linfóide humano ou mutino). O DNA que codifica os domínios VH e VL é recombinado junto com um ligador de scFv por PCR e clonado em um vetor fagemídeo (por exemplo, p CANTAB 6 ou pComb 3 HSS). O vetor é eletroporado em E. coli e a E. coli é infectada com fago auxiliar. O fago usado nestes métodos são tipicamente fago filamentoso incluindo fd e M 13 e os domínios VH e VL são em geral fundidos recombinantemente tanto no gene III quanto no gene VIII do fago. O fago que expressa um domínio de ligação de antígeno que se liga ao epítopo IFNAR1 de interesse pode ser selecionado identificado com antígeno, por exemplo, usando antígeno marcado ou antígeno ligado ou capturado em uma superfície sólida ou microesférica. Exemplos de métodos de exibição de fago que podem ser usados para preparar os anticorpos da presente invenção incluem aqueles revelados em Brinkman et al, 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al., 1997, Gene 187:9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57: 191-280; pedido internacional PCT/GB91/01134; pedidos internacionais WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, WO 95/20401, e W097/13844; e patentes U.S. 5.698.426, 5.223.409, 5.403.484, 5.580.717, 5.427.908, 5.750.753, 5.821.047, 5.571.698, 5.427.908, 5.516.637, 5.780.225, 5.658.727, 5.733.743 e 5.969.108; cada um dos quais é aqui incorporado pela referência na sua íntegra.

[0162] Da maneira descrita nas referências anteriores, após a seleção do fago, o anticorpo que codifica regiões do fago pode ser isolado e usado para gerar todos os anticorpos, incluindo anticorpos humanos, ou qualquer outro fragmento de ligação de antígeno desejado e expresso em qualquer hospedeiro desejado, incluindo células de mamífero, células de inseto, células de planta, levedura e bactérias, por exemplo, da maneira descrita a seguir. Técnicas para produzir recombinantemente fragmentos Fab, Fab' e fragmento F(ab’)2 também podem ser empregadas usando métodos conhecidos na técnica, tais como aqueles revelados em publicação internacional WO 92/22324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12(6):864- 869; Sawai et al., 1995, AJRI 34:26-34; e Better et al., 1988, Science 240:1041-1043 (as ditas referências aqui incorporadas pela referência na sua íntegra).

[0163] Para gerar anticorpos completos, oligoiniciadores de PCR incluindo sequências VH ou VL de nucleotídeos, um sítio de restrição e uma sequência que flanqueia para proteger o sítio de restrição podem ser usados para amplificar as sequências VH ou VL nos clones scFv. Utilizando de técnicas de clonagem conhecidas pelos versados na tecnologia, os domínios VH amplificados por PCR podem ser clonados nos vetores que expressam uma região constante VH, por exemplo, a região constante 4 gama humana, e os domínios VL amplificados por PCR podem ser clonados em vetores que expressam uma região constante VL, por exemplo, regiões constantes kapa ou lambda humanas. Em certas modalidades, os vetores para expressar os domínios VH ou VL compreendem um promotor alfa EF-I, um sinal de secreção, um sítio de clonagem para o domínio variável, domínios constantes, e um marcador de seleção, tal como neomicina. Os domínios VH e VL também podem ser clonados em um vetor que expressa as regiões constantes necessárias. Os vetores de conversão de cadeia pesada e vetores de conversão de cadeia leve são então co-transfectados em linhagens celulares para gerar linhagens celulares estáveis ou transientes que expressam anticorpos de comprimento total, por exemplo, IgG, usando técnicas conhecidas pelos versados na tecnologia.

[0164] Para alguns usos, incluindo uso in vivo de anticorpos em humanos e ensaios de detecção in vitro, pode ser vantajoso usar anticorpos humanos ou quiméricos. Anticorpos completamente humanos são particularmente desejáveis para tratamento terapêutico de indivíduos humanos. Anticorpos humanos podem ser preparados por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, incluindo métodos de exibição de fago descritos anteriormente usando bibliotecas de anticorpo derivadas de sequências de imunoglobulina humana. Ver também patentes U.S. 4.444.887 e 4.716.111; e publicações internacionais WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, e WO 91/10741; cada uma das quais é aqui incorporada pela referência na sua íntegra.

[0165] Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual porções diferentes do anticorpo são derivadas de diferentes moléculas de imunoglobulina. Métodos para produzir anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Morrison, 1985, Science 229:1202; Oi et al, 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202; e patentes U.S. 5.807.715, 4.816.567, 4.816.397, e 6.311.415, que são aqui incorporadas pela referência na sua íntegra.

[0166] Um anticorpo humanizado é um anticorpo, ou fragmento deste, que é capaz de se ligar a um antígeno pré-determinado e que compreende uma região do arcabouço substancialmente com a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e uma CDR substancialmente com a sequência de aminoácidos de um imunoglobulina não humana. Um anticorpo humanizado compreende substancialmente todos de pelo menos um e, tipicamente, dois domínios variáveis (Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv) em que todas, ou substancialmente todas, as regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana (isto é, anticorpo doador) e todas, ou substancialmente todas, as regiões do arcabouço são aquelas de uma sequência consensual de imunoglobulina humana. Em certos exemplos, um anticorpo humanizado também compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. De maneira geral, o anticorpo conterá tanto a cadeia leve, bem como pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada. O anticorpo também pode incluir as regiões de dobradiça CH1, CH2, CH3, e CH4 da cadeia pesada. O anticorpo humanizado pode ser selecionado de qualquer classe de imunoglobulinas, incluindo IgM, IgG, IgD; IgA e IgE, e qualquer isotipo, incluindo IgGl, IgG2, IgG3 e lgG4. Em geral, o domínio constante é um complemento que se fixa ao domínio constante onde é desejável que o anticorpo humanizado exiba: atividade citotóxica e a classe é tipicamente IgG1. Onde tal atividade citotóxica não é desejável, o domínio constante pode ser da classe IgG2. O anticorpo humanizado pode compreender sequências de mais de uma classe ou isotipo, e os versados na técnica sabem selecionar domínio constantes particulares para otimizar funções efetoras desejadas. As regiões do arcabouço e CDR de um anticorpo humanizado não precisam corresponder precisamente às sequências parentais, por exemplo, a CDR do doador ou o arcabouço consensual podem ser mutagenizados por substituição, inserção ou deleção de pelo menos um resíduo, de maneira tal que o resíduo de CDR ou do arcabouço neste sítio não corresponda nem ao consensual nem ao anticorpo indicado. Tais mutações, entretanto, não serão extensivas. Em geral, pelo menos 75 % dos resíduos do anticorpo humanizado corresponderão àqueles da região mãe do arcabouço (FR) e sequências de CDR, mais frequentemente 90 %, e possivelmente maior do que 95 %. O anticorpo humanizado pode ser produzido usando uma variedade de técnicas conhecidas na tecnologia incluindo, mas sem limitação, enxerto de CDR (patente Européia EP 239.400; publicação internacional WO 91/09967; e patentes U.S. 5.225.539, 5.530.101, e 5.585.089), embutir ou recompor a superfície (patentes Européias EP 592.106 e EP 519.596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al, 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; e Roguska et al., 1994, PNAS 91 :969-973), embaralhamento de cadeia (patente U.S. 5.565.332), e técnicas reveladas em, por exemplo, patentes U.S. 6.407.213, 5.766.886, WO 9317105, Tan et al., J. Immunol. 169:1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng. 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem. 272(16): 10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s- 5977s (1995), Couto et al., Cancer Res. 55(8): 1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene 150(2):409- 10 (1994), e Pedersen et al., J. MoI. Biol. 235(3):959-73 (1994). Frequentemente, os resíduos de estrutura nas regiões do arcabouço serão substituídas pelo resíduo correspondente do anticorpo do doador de CDR anticorpo para alterar ou melhorar a ligação de antígeno. Estas substituições do arcabouço são identificadas por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, modelando as interações da CDR e resíduos de estrutura para identificar resíduos de estrutura importantes para ligação de antígeno, e comparação de sequência para identificar resíduos incomuns de estrutura em posições particulares. (Ver, por exemplo, Queen et al, patente U.S. 5.585.089; e Riechmann et al, 1988, Nature 332:323, que são aqui incorporadas pela referência na sua íntegra.) 5.7.7 Polinucleotídeos que codificam um Anticorpo

[0167] A invenção também inclui polinucleotídeos que hibridizam, em condições de hibridização de alta, intermediária ou baixa severidade, por exemplo, da maneira definida anteriormente, polinucleotídeos que codificam um anticorpo da invenção.

[0168] Os polinucleotídeos podem ser obtidos, e a sequência de nucleotídeos dos polinucleotídeos determinada, por qualquer método conhecido na técnica. Uma vez que as sequências de aminoácidos dos anticorpos são conhecidas, as sequências de nucleotídeos que codificam estes anticorpos podem ser determinadas usando métodos conhecidos na técnica, isto é, códons de nucleotídeo conhecido para codificar aminoácidos particulares são montados de maneira uma tal para gerar um ácido nucleico que codifica o anticorpo ou fragmento deste da invenção. Um polinucleotídeo como este que codifica o anticorpo pode ser montado de oligonucleotídeos sintetizados quimicamente (por exemplo, da maneira descrita em Kutmejer et al., 1994, BioTechniques 17:242) que, resumidamente, envolve a síntese de sobreposição de oligonucleotídeos contendo porções da sequência que codificam o anticorpo, anelamento e ligação destes oligonucleotídeos, e a seguir amplificação dos oligonucleotídeos ligados por PCR.

[0169] Alternativamente, um polinucleotídeo que codifica um anticorpo pode ser gerado de ácido nucleico de uma fonte adequada. Se um clone contendo um ácido nucleico que codifica um anticorpo particular não estiver disponível, mas a sequência da molécula do anticorpo for conhecida, um ácido nucleico que codifica a imunoglobulina pode ser quimicamente sintetizado ou obtido de uma fonte adequada (por exemplo, uma biblioteca de cDNA de anticorpo, ou uma biblioteca de cDNA gerada deste, ou ácido nucleico, em geral poli A+RNA, isolado de qualquer tecido ou células que expressam o anticorpo, tais como células de hibridoma selecionadas para expressar um anticorpo da invenção) por amplificação de PCR usando oligoiniciadores sintéticos hibridizáveis nas extremidades 3' e 5' da sequência, ou por clonagem usando uma sonda de oligonucleotídeo específica para a sequência de gene particular para identificar, por exemplo, um clone de cDNA de uma biblioteca de cDNA que codifica o anticorpo. Os ácidos nucleicos amplificados gerados por PCR podem então ser clonados em vetores de clonagem replicáveis, usando qualquer método conhecido na técnica.

[0170] Uma vez que a sequência de nucleotídeos do anticorpo é determinada, a sequência de nucleotídeos do anticorpo pode ser manipulada usando métodos conhecidos na técnica para a manipulação de sequências de nucleotídeos, por exemplo, técnicas do DNA recombinante, mutagênese sítio direcionada, PCR, etc. (ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al, 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. e Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols em Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, que são ambas aqui incorporadas pela referência na sua íntegra) para gerar anticorpos com uma sequência diferente de aminoácidos, por exemplo, para criar substituições, deleções, e/ou inserções de aminoácidos.

[0171] Em uma modalidade específica, uma ou mais das CDRs são inseridas nas regiões do arcabouço usando técnicas de DNA recombinante de rotina. As regiões do arcabouço podem ser de ocorrência natural ou regiões do arcabouço consensuais e, em certos exemplos, regiões do arcabouço de humanos (ver, por exemplo, Chothia et al., 1998, J. MoI. Biol. 278: 457-479 para uma listagem de regiões do arcabouço de humanos). Opcionalmente, o polinucleotídeo gerado pela combinação das regiões do arcabouço e CDRs codifica um anticorpo que se liga especificamente a IFNAR1. Opcionalmente, uma ou mais substituições de aminoácidos podem ser preparadas nas regiões do arcabouço e, em certos exemplos, as substituições de aminoácidos melhoram a ligação do anticorpo com seu antígeno. Adicionalmente, tais métodos podem ser usados para preparar substituições ou deleções de aminoácidos de um ou mais resíduos de cisteína de região variável que participam de uma ligação de dissulfeto entre cadeias para gerar moléculas do anticorpo que precisam de uma ou mais ligações de dissulfeto entre cadeias. Outras alterações no polinucleotídeo são incluídas pela presente invenção e pelos versados na técnica.

[0172] Em modalidades específicas, os anticorpos da invenção são codificados por sequências de polinucleotídeos exemplificadas nas figuras 1-4. Em outras modalidades específicas, polinucleotídeos da invenção codificam anticorpos que compreendem regiões constantes de cadeia leve e de cadeia pesada, que correspondem a SEQ ID Nos: 41 e 42 respectivamente. Ainda em outras modalidades específicas, os polinucleotídeos da invenção codificam anticorpos que compreendem regiões constantes de cadeia pesada que correspondem a SEQ ID No: 42 com uma tolerância para variação alélica, em que a variação tem pelo menos um ou mais resíduos selecionados do grupo que consiste em posições 214, 221, 356, e 358 da maneira definida pelo sistema de numeração de índice EU. 5.7.8 Expressão recombinante de um anticorpo

[0173] A expressão recombinante de um anticorpo da invenção, derivado, análogo ou fragmento deste, (por exemplo, uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo da invenção, ou uma porção deste, ou um anticorpo de cadeia única da invenção) exige a construção de um vetor de expressão contendo um polinucleotídeo que codifica o anticorpo. Uma vez que o polinucleotídeo que codifica uma molécula do anticorpo ou uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo, ou porção deste, (mas não necessariamente contendo o domínio variável de cadeia pesada ou leve) da invenção foi obtido, o vetor para a produção da molécula do anticorpo pode ser produzido por tecnologia do DNA recombinante usando técnicas conhecidas na tecnologia. Assim, métodos para preparar uma proteína que expressa um polinucleotídeo contendo um anticorpo que codifica sequência de nucleotídeos são aqui descritos. Métodos que são bem conhecidos pelos versados na técnica podem ser usados para construir vetores de expressão contendo sequências que codificam anticorpo e sinais de controle transcricionais e translacionais apropriados. Estes métodos incluem, por exemplo, técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação genética in vivo. Assim, a invenção fornece vetores replicáveis que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula do anticorpo da invenção, uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo, um domínio variável de cadeia pesada ou leve de um anticorpo ou uma porção deste, ou uma CDR de cadeia pesada ou leve, ligados operavelmente a um promotor. Tais vetores podem incluir a sequência de nucleotídeos que codifica a região constante da molécula do anticorpo (ver, por exemplo, publicação internacional WO 86/05807; publicação internacional WO 89/01036; e patente U.S. 5.122.464) e o domínio variável do anticorpo pode ser clonado em um vetor como este para a expressão de toda a cadeia pesada, de toda a cadeia leve, ou tanto das cadeias pesadas quanto leves.

[0174] O vetor de expressão é transferido para uma célula hospedeira por técnicas convencionais e as células transfectadas são então cultivadas por técnicas convencionais para produzir um anticorpo da invenção. Assim, a invenção inclui células hospedeiras contendo um polinucleotídeo que codifica um anticorpo da invenção ou fragmentos deste, ou uma cadeia pesada ou leve deste, ou porção deste, ou um anticorpo de cadeia única da invenção, ligado operavelmente a um promotor heterólogo. Em outras modalidades, para a expressão de anticorpos de cadeia dupla, os vetores que codificam tanto as cadeias leves quanto as pesadas podem ser co- expressos na célula hospedeira para a expressão da molécula inteira de imunoglobulina, da maneira detalhada a seguir.

[0175] Uma variedade de sistemas de vetor de expressão no hospedeiro pode ser utilizada para expressar as moléculas do anticorpo da invenção (ver, por exemplo, patente U.S. 5.807.715). Tais sistemas de expressão no hospedeiro representam veículos pelos quais as sequências codificantes de interesse podem ser produzidas e, subsequentemente, purificadas, mas também representam células que, quando transformadas ou transfectadas com o nucleotídeo apropriado que codifica as sequências, podem expressar uma molécula do anticorpo da invenção in situ. Estes incluem, mas sem limitação, microrganismos tais como bactérias (por exemplo, E. coli e B. subtilis) transformadas com DNA de bacteriófago recombinante, vetores de expressão de DNA plasmidial ou DNA cosmidial contendo sequências que codificam anticorpo; levedura (por exemplo, Saccharomyces e Pichia) transformadas com vetores de expressão de levedura recombinante contendo sequências que codificam anticorpo; sistemas de célula de inseto infectadas com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, baculovírus) contendo sequências que codificam anticorpo; sistemas de célula de planta infectada com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, vírus do mosaico da couve flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformadas com vetores de expressão de plasmídeo recombinante (por exemplo, plasmídeo Ti) contendo sequências que codificam anticorpo; ou sistemas de célula de mamífero (por exemplo, células COS, CHO, BHK, 293, NSO, e 3T3) que carregam constructos de expressão recombinante contendo promotores derivados do genoma de células de mamífero (por exemplo, promotor metalotioneína) ou de vírus de mamífero (por exemplo, o promotor tardio de adenovírus; o promotor 7,5 K do vírus vaccinia). Em certas modalidades, células bacterianas, tal como Escherichia coli e, em outras modalidades, células eucarióticas, especialmente para a expressão de toda a molécula recombinante do anticorpo, são usadas para a expressão de uma molécula recombinante do anticorpo. Por exemplo, células de mamífero, tais como células de ovário de hamster chinês (CHO), junto com um vetor tal como o elemento promotor de gene precoce intermediário principal do citomegalovírus humano, é um sistema de expressão eficiente para anticorpos (Foecking et al, 1986, Gene 45:101; e Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2). Em uma modalidade específica, a expressão de sequências de nucleotídeos que codificam anticorpos, ou fragmentos destes, que se ligam especificamente ao IFNAR1, é regulada por um promotor constitutivo, promotor indutível ou promotor específico de tecido.

[0176] Em sistemas bacterianos, inúmeros vetores de expressão podem ser vantajosamente selecionados dependendo do uso pretendido para a molécula do anticorpo que está sendo expressa. Por exemplo, quando uma grande quantidade de uma proteína como esta deve ser produzida, para a geração de composições farmacêuticas de uma molécula do anticorpo, vetores que direcionam a expressão de altos níveis de produtos de proteína de fusão que são facilmente purificados podem ser desejáveis. Tais vetores incluem, mas sem limitação, o vetor de expressão pUR278 de E. coli (Ruther et al., 1983, EMBO 12:1791), no qual a sequência que codifica o anticorpo pode estar ligada individualmente no vetor em sequência com a região que codifica lac Z, de maneira tal que uma proteína de fusão seja produzida; vetores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:31013109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509) e vetores pGEX similares também podem ser usados para expressar polipeptídeos estrangeiros como proteínas de fusão com glutationa 5-transferase (GST). Em general, tais proteínas de fusão são solúveis e podem facilmente ser purificadas de células lisadas por adsorção e ligação na matriz de microesferas de agarose glutationa seguido pela eluição na presença de glutationa livre. Os vetores pGEX são projetados para incluir trombina ou sítios de clivagem de fator Xa protease, de maneira tal que o produto de gene alvo clonado possa ser liberado da fração GST.

[0177] Em células hospedeiras de mamífero, inúmeros sistemas de expressão a base de vírus podem ser utilizados. Em casos onde um adenovírus é usado como um vetor de expressão, a sequência que codifica o anticorpo de interesse pode estar ligada a um complexo controle de transcrição/tradução de adenovírus, por exemplo, o promotor tardio e sequência líder tripartida. Este gene quimérico pode ser então inserido no genoma de adenovírus por recombinação in vitro ou in vivo. A inserção em uma região não essencial do genoma viral (por exemplo, região El ou E3) resultará em um vírus recombinante que é viável e capaz de expressar a molécula do anticorpo em hospedeiros infectados (por exemplo, ver Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1 :355-359). Sinais de iniciação específicos também podem ser exigidos para tradução eficiente de sequência inserida que codifica os anticorpos. Estes sinais incluem o códon de início ATG e sequências adjacentes. Além do mais, o códon de início não tem que estar em fase com o quadro de leitura da sequência codificante desejada para assegurar a tradução do inserto completo. Estes sinais de controle translacionais exógenos e códons de início podem ser de uma variedade de origens, tanto natural quanto sintética. A eficácia da expressão pode ser melhorada pela inclusão de elementos melhoradores de transcrição apropriados, terminadores de transcrição, etc. (ver, por exemplo, Bittner et al, 1987, Methods in Enzymol. 153:516- 544).

[0178] Além do mais, uma cepa de célula hospedeira que pode ser escolhida modula a expressão das sequências inseridas, ou modifica e processa o produto do gene da maneira específica desejada. Tais modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) de produtos protéicos podem ser importantes para a função da proteína. Diferentes células hospedeiras apresentam mecanismos característicos e específicos para o processamento e modificação pós- translacional de produtos de proteínas e gene. As linhagens celulares ou sistemas hospedeiros adequados podem ser escolhidos para assegurar a modificação e processamento corretos da proteína estrangeira expressa. Para esta finalidade, células eucarióticas hospedeiras que possuem a maquinaria celular para processamento próprio do transcrito primário, glicosilação e fosforilação do produto do gene podem ser usadas. Tais células hospedeiras de mamífero incluem, mas sem limitação células CHO, VERY, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O e T47D, NSO (uma linhagem celular de mieloma de murino que não produz endogenamente nenhuma cadeia de imunoglobulina), CRL7O3O e HsS78Bst.

[0179] Para produção a longo prazo e de alto rendimento de proteínas recombinantes, a expressão estável é preferida. Por exemplo, linhagens celulares que expressam estavelmente a molécula do anticorpo podem ser geneticamente modificadas. Em vez de usar vetores de expressão que contêm origens virais de replicação, as células hospedeiras podem ser transformadas com DNA controlado por elementos controle de expressão apropriados (por exemplo, promotor, melhorador, sequências, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, etc.), e um marcador selecionável. Seguindo a instrução do DNA estrangeiro, as células geneticamente modificadas podem crescer naturalmente por 1-2 dias em um meio enriquecido, e então são trocadas para um meio seletivo. O marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência para a seleção e permite que as células se integrem estavelmente no plasmídeo em seus cromossomos e cresça para formar focus que, por sua vez, podem ser clonados e expandidos em linhagens celulares. Este método pode ser vantajosamente usado em linhagens celulares geneticamente modificadas que expressam a molécula do anticorpo. Tais linhagens celulares geneticamente modificadas podem ser usadas particularmente na seleção e avaliação de composições que interagem direta ou indiretamente com a molécula do anticorpo.

[0180] Inúmeros sistemas de seleção podem ser usados incluindo, mas sem limitação, os genes timidina quinase do vírus herpes simplex (Wigler et al, 1977, Cell 11 :223), hipoxantineguanina fosforribosiltransferase (Szybalska & Szybalski, 1992, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 48:202) e adenina fosforribosiltransferase (Lo wy et al., 1980, Cell 22:8-17) que podem ser empregados em células tk, hgprt ou aprt, respectivamente. Também, a resistência a antimetabólito pode ser usada como a base de seleção para os genes a seguir: dhfr, que confere resistência a metotrexato (Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:357; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt, que confere resistência a ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); neo, que confere resistência ao aminoglicosídeo G-418 (Wu e Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; e Morgan e Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; May, 1993, TIB TECH 11(5): 155-2 15); e hygro, que confere resistência a higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147). Os métodos comumente conhecidos na técnica da tecnologia do DNA recombinante podem ser aplicados rotineiramente para selecionar o clone recombinante desejado, e tais métodos são descritos, por exemplo, em Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); e nos capítulos 12 e 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., 1981, J. MoI. Biol. 150: 1, que são aqui incorporados pela referência na sua íntegra.

[0181] Os níveis de expressão de uma molécula do anticorpo podem ser aumentados por amplificação de vetor (para uma revisão, ver Bebbington e Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol.3. (Academic Press, New York, 1987)). Quando um marcador no sistema de vetor que expressa o anticorpo é amplificável, o aumento no nível de inibidor presente em cultura de célula hospedeira aumentará o número de cópias do gene marcador. Uma vez que a região amplificada está associada ao gene do anticorpo, a produção do anticorpo também aumentará (Crouse et al, 1983, MoI. Cell. Biol. 3:257).

[0182] A célula hospedeira pode ser co-transfectada com dois vetores de expressão da invenção, o primeiro vetor que codifica um polipeptídeo de cadeia pesada e o segundo vetor que codifica um polipeptídeo de cadeia leve. Os dois vetores podem conter marcadores selecionáveis idênticos que possibilitam a expressão igual de polipeptídeos de cadeia pesada e leve. Alternativamente, um vetor único que pode ser usado codifica, e é capaz de expressar, tanto polipeptídeos de cadeia pesada quanto leve. Em tais situações, a cadeia leve pode ser substituída antes da cadeia pesada para evitar um excesso de cadeia pesada livre tóxica (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; e Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2 197). As sequências codificantes para as cadeias pesadas e leves podem compreender cDNA ou DNA genômico.

[0183] Uma vez que uma molécula do anticorpo da invenção foi produzido por expressão recombinante, ela pode ser purificada por qualquer método conhecido na técnica para purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, cromatografia de troca iônica, por afinidade, particularmente por afinidade com o antígeno específico após a proteína A, e tamanho de coluna), centrifugação, solubilidade diferencial, ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. Adicionalmente, os anticorpos da presente invenção, ou fragmentos destes, podem ser fundidos nas sequências de polipeptídeos heterólogos aqui descritas ou conhecidas de outra forma na técnica para facilitar a purificação. 5.8 Produção escalonável de anticorpos

[0184] Na tentativa de obter grandes quantidades, os anticorpos da invenção podem ser produzidos por um processo escalonável (daqui por diante referido como "processo escalonável da invenção"). Em algumas modalidades, os anticorpos podem ser produzidos por um processo escalonável da invenção no laboratório de pesquisa, que pode ser ampliado para produzir os anticorpos da invenção em biorreatores de escala analítica (por exemplo, mas sem limitação, biorreatores de 5L, 10L, 15L, 30L, ou 50L). Em outras modalidades, os anticorpos podem ser produzidos por um processo escalonável da invenção no laboratório de pesquisa, que pode ser ampliado para produzir os anticorpos da invenção em biorreatores em escala de produção (por exemplo, mas sem limitação, 75L, 100L, 150L, 300L, ou 500L). Em algumas modalidades, o processo escalonável da invenção resulta em menos ou nenhuma redução na eficácia da produção comparada ao processo de produção realizado no laboratório de pesquisa. Em outras modalidades, o processo escalonável da invenção produz anticorpos em eficácia de produção de cerca de 10 mg/L, cerca de 20 m/L, cerca de 30 mg/L, cerca de 50 mg/L, cerca de 75 mg/L, cerca de 100 mg/ L, cerca de 125 mg/L, cerca de 150 mg/L, cerca de 175 mg/L, cerca de 200 mg/L, cerca de 250 mg/L, cerca de 300 mg/L ou mais. Em outras modalidades, as proteínas de fusão podem ser produzidas por processos escalonáveis da invenção.

[0185] Em outras modalidades, o processo escalonável da invenção produz anticorpos em eficácia de produção de pelo menos cerca de 10 mg/L, pelo menos cerca de 20 m/L, pelo menos cerca de 30 mg/L, pelo menos cerca de 50 mg/L, pelo menos cerca de 75 mg/L, pelo menos cerca de 100 mg/L, pelo menos cerca de 125 mg/L, pelo menos cerca de 150 mg/L, pelo menos cerca de 175 mg/L, pelo menos cerca de 200 mg/L, pelo menos cerca de 250 mg/L, pelo menos cerca de 300 mg/L ou mais.

[0186] Em outras modalidades, o processo escalonável da invenção produz anticorpos em eficácia de produção de cerca de 10 mg/L a cerca de 300 mg/L, de cerca de 10 mg/L a cerca de 250 mg/L, de cerca de 10 mg/L a cerca de 200 mg/L, de cerca de 10 mg/L a cerca de 175 mg/L, de cerca de 10 mg/L a cerca de 150 mg/L, de cerca de 10 mg/L a cerca de 100 mg/L, de cerca de 20 mg/L a cerca de 300 mg/L, de cerca de 20 mg/L a cerca de 250 mg/L, de cerca de 20 mg/L a cerca de 200 mg/L, de 20 mg/L a cerca de 175 mg/L, de cerca de 20 mg/L a cerca de 150 mg/L, de cerca de 20 mg/L a cerca de 125 mg/L, de cerca de 20 mg/L a cerca de 100 mg/L, de cerca de 30 mg/L a cerca de 300 mg/L, de cerca de 30 mg/L a cerca de 250 mg/L, de cerca de 30 mg/L a cerca de 200 mg/L, de cerca de 30 mg/L a cerca de 175 mg/L, de cerca de 30 mg/L a cerca de 150 mg/L, de cerca de 30 mg/L a cerca de 125 mg/L, de cerca de 30 mg/L a cerca de 100 mg/L, de cerca de 50 mg/L a cerca de 300 mg/L, de cerca de 50 mg/L a cerca de 250 mg/L, de cerca de 50 mg/L a cerca de 200 mg/L, de 50 mg/L a cerca de 175 mg/L, de cerca de 50 mg/L a cerca de 150 mg/L, de cerca de 50 mg/L a cerca de 125 mg/L, ou de cerca de 50 mg/L a cerca de 100 mg/L. 5.8.1 Métodos adicionais de modificar anticorpos geneticamente

[0187] Em uma outra modalidade, uma região Fc da dobradiça de um anticorpo da invenção é mutada para diminuir a meia vida biológica do anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoácido são introduzidas na região de interface do domínio CH2-CH3 do fragmento da dobradiça Fc, de maneira tal que o anticorpo tenha danificado a ligação da proteína A estafilocócica (SpA) com relação à ligação de SpA do domínio da dobradiça de Fc nativo. Esta abordagem é descrita com mais detalhes na patente U.S. 6.165.745 por Ward et al.

[0188] Em uma outra modalidade, um anticorpo é modificado para aumentar sua meia vida biológica. Várias abordagens são possíveis. Por exemplo, uma ou mais das seguintes mutações podem ser introduzidas: T252L, T254S, T256F, da maneira descrita na patente U.S. 6.277.375. Em uma outra modalidade, uma ou mais das seguintes mutações pode ser introduzida: M252Y, S254T, T256E, da maneira descrita na patente U.S. 7.083.784. Alternativamente, para aumentar a meia vida biológica, o anticorpo pode ser modificado na região CHl ou CL para conter um epítopo de ligação do receptor liberado obtido de duas espirais de um domínio CH2 de uma região Fc de uma IgG, da maneira descrita nas patentes U.S. 5.869.046 e 6.121.022 por Presta et al.

[0189] Em outras modalidades, uma região Fc é modificada substituindo pelo menos um resíduo de aminoácido por um resíduo diferente de aminoácido para reduzir a(s) função(s) efetora(s) do anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados de resíduos de aminoácido 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 e 322 podem ser substituídos por um resíduo diferente de aminoácido, de maneira tal que o anticorpo tenha menor afinidade com um ligante efetor, mas mantenha a capacidade de ligação de antígeno do anticorpo pai. O ligante efetor, no qual a afinidade é reduzida, pode ser, por exemplo, um receptor Fc ou o componente C1 do complemento. Esta abordagem é descrita com mais detalhes nas patentes U.S. 5.624.821 e 5.648.260, ambas por Winter et al.

[0190] Em um outro exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados de resíduos de aminoácido 329, 331 e 322 podem ser substituídos por um resíduo diferente de aminoácido, de maneira tal que o anticorpo tenham menos ligação Clq e/ou menor ou nenhuma citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Esta abordagem é descrita com mais detalhes na patente U.S. 6.194.551 por Idusogie et al.

[0191] Em um outro exemplo, um ou mais resíduos de aminoácido nas posições de aminoácido 231 e 239 são modificados para reduzir por meio disso a capacidade do anticorpo fixar o complemento. Esta abordagem é descrita com mais detalhes na publicação PCT WO 94/29351 por Bodmer et al.

[0192] Ainda em uma outra modalidade, uma região Fc de um anticorpo da invenção é modificada adicionalmente para diminuir a capacidade do anticorpo mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou para aumentar a afinidade do anticorpo com um receptor FCY modificando um ou mais aminoácidos nas seguintes posições: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ou 439. Esta abordagem é descrita com mais detalhes na publicação PCT WO 00/42072 por Presta.

[0193] Uma outra modificação dos anticorpos aqui, que é contemplada pela invenção é peguilação. Um anticorpo pode ser peguilado, por exemplo, para aumentar a meia vida biológica (por exemplo, soro) do anticorpo. Para peguilar um anticorpo, o anticorpo, ou fragmento deste, é tipicamente reagido com polietileno glicol (PEG), tal como um éster reativo ou derivado de aldeído de PEG, em condições nas quais um ou mais grupos PEG se tornam anexados ao anticorpo ou fragmento de anticorpo. Em certos exemplos, a peguilação é realizada por meio de uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula reativa de PEG (ou um polímero solúvel em água reativo análogo). Da maneira aqui usada, pretende-se que o termo "polietileno glicol" é inclua quaisquer das formas de PEG que foram usadas para derivar outras proteínas, tal como mono (Cl-Cl0) alcóxi ou arilóxi-polietileno glicol ou polietileno glicol-maleimida. Em certas modalidades, o anticorpo a ser peguilado é um anticorpo aglicosilado. Métodos para peguilar proteínas são conhecidos na técnica e podem ser aplicados aos anticorpos da invenção. Ver, por exemplo, EP 0 154 316 por Nishimura et al. e EP 0 401 384 por Ishikawa et al.

[0194] Assim, em um outro aspecto da invenção, as características estruturais de anticorpos anti-IFNAR1, por exemplo, mas sem limitação, 3F11, 4G5, 11E2, e 9D4, são usadas para criar anticorpos anti- IFNAR1 estruturalmente relacionados que mantêm pelo menos uma propriedade funcional de anticorpos da invenção, tal como ligação ao IFNAR1. Por exemplo, uma ou mais regiões CDR de 3F11, 4G5, 11E2, ou 9D4, ou mutações destas, podem ser combinadas de maneira recombinante com regiões conhecidas do arcabouço e/ou outras CDRs para criar anticorpos anti-IFNAR1 adicionais geneticamente modificados da invenção, da maneira discutida anteriormente. Outros tipos de modificações incluem aquelas descritas na seção anterior. O material de partida para o método geneticamente modificado é uma ou mais das sequências VH e/ou VL aqui fornecidas, ou uma ou mais CDR regiões destas. Para criar o anticorpo geneticamente modificado, não é necessário preparar realmente (isto é, expresso como uma proteína) um anticorpo com uma ou mais das sequências VH e/ou VL aqui fornecidas, ou uma ou mais regiões CDR destas. Particularmente, a informação contida na(s) sequência(s) é usada como o material de partida para criar uma "segunda geração" de sequência(s) derivada(s) da(s) sequência(s) original(s) e então a "segunda geração" da(s) sequência(s) é preparada e expressa como uma proteína. 5.9 Composições

[0195] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece composições contendo uma ou alguma combinação de anticorpos monoclonais, ou proteínas de fusão compreendendo uma região Fc destes, da maneira aqui descrita, formuladas junto com um carreador. Tais composições podem incluir uma ou alguma combinação de (por exemplo, dois ou mais diferentes) anticorpos, proteínas de fusão, imunoconjugados ou moléculas biespecíficas da invenção. Em algumas modalidades, tais composições são fisiologicamente toleráveis e, como tal, são adequadas para administração a um indivíduo (também referida como uma "composição farmacêutica da invenção". Por exemplo, composições farmacêuticas da invenção podem compreender uma combinação de anticorpos (ou imunoconjugados ou biespecíficos) que se liga a diferentes epítopos no antígeno alvo ou que apresentam atividades de complementaridade.

[0196] Em uma outra modalidade, composições da invenção podem incluir um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos de tais sais incluem sais de adição ácida e sais de adição básica. Sais de adição ácida incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como ácido clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, hidrobrômico, hidroiôdico, fosforoso e similares, bem como de ácidos orgânicos não tóxicos tais como ácidos alifáticos mono- e dicarboxílicos, ácidos alcanóicos substituídos por fenila, ácidos hidróxi alcanóicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos e similares. Sais de adição básica incluem aqueles derivados de metais alcalinos terrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e similares, bem como de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N,N'-dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e similares.

[0197] Em uma outra modalidade, composições da invenção também podem incluir um antioxidante farmaceuticamente aceitável. Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e similares; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propila, alfa-tocoferol e similares; e (3) agentes quelantes metálicos, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiamina tetra-acético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e similares.

[0198] Exemplos de carreadores aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregados nas composições contempladas da invenção incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol e similares) e misturas adequadas destes, óleos vegetais, tal como óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tal como oleato de etila. A própria fluidez pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tal como lecitina, para a manutenção do tamanho de partícula exigido no caso de dispersões, e pelo uso de agentes tensoativos.

[0199] Em uma outra modalidade, composições da invenção também podem conter adjuvantes tais como conservantes, agentes de umectação, agentes de emulsificação e agentes de dispersão. A prevenção da presença de microrganismos pode ser assegurada tanto por procedimentos de esterilização quanto pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico e similares. É também desejável incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio e similares nas composições. Além do mais, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode resultar da inclusão de agentes que retardam absorção, tais como monoestearato de alumínio e gelatina.

[0200] Carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação improvisada de soluções ou dispersão injetáveis estéreis. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto que na medida que quaisquer meios ou agente convencionais são incompatíveis com o composto ativo, o uso destes nas composições farmacêuticas da invenção é contemplado. Compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições. Composições terapêuticas têm que ser tipicamente estéreis e estáveis nas condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma, ou outra estrutura ordenada adequada para concentração elevada de medicamento. O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido e similares), e misturas adequadas destes. A própria fluidez pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, para a manutenção do tamanho da partícula exigido no caso de dispersão e pelo uso de agentes tensoativos. Em muitos casos, será adequado incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode resultar incluindo na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

[0201] Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando o composto ativo na quantidade exigida em um solvente apropriado com uma ou alguma combinação de ingredientes enumerados anteriormente, da maneira exigida, após esterilização por microfiltração. Em geral, dispersões são preparadas incorporando o composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes exigidos daqueles enumerados anteriormente. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem à vácuo e secagem e congelamento (liofilização) que produz um pó do ingrediente ativo e qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução filtrada previamente estéril deste.

[0202] Em uma modalidade, composições (por exemplo, formulações líquidas) da invenção são formulações sem pirogênio que são substancialmente livres de endotoxinas e/ou relacionadas à substâncias pirogênicas. As endotoxinas incluem toxinas que são confinadas dentro de um microrganismo e são liberadas quando os microrganismos são rompidos ou morrem. Substâncias pirogênicas também incluem substâncias termoestáveis que induzem febre (glicoproteínas) da membrana externa de bactérias e outros microrganismos. Ambas estas substâncias podem causar febre, hipotensão e choque se administradas aos humanos. Em virtude dos potenciais efeitos prejudiciais, é vantajoso remover mesmo pequenas quantidades de endotoxinas das soluções de medicamento farmacêutico administradas intravenosamente. O Food & Drug Administration ("FDA") ajustou um limite máximo de 5 unidades de endotoxina (EU) por dose por quilograma de peso corporal em um período de uma única hora para aplicações de medicamento intravenoso (The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000)). Quando proteínas terapêuticas são administradas em quantidades de várias centenas ou milhares de miligramas por quilograma de peso corporal, como pode ser o caso de anticorpos monoclonais, é vantajoso remover mesmo quantidades traço de endotoxina. Em uma modalidade, os níveis de endotoxina e pirogênio na composição são menores do que 10 EU/mg, ou menores do que 5 EU/mg, ou menores do que 1 EU/mg, ou menores do que 0,1 EU/mg, ou menores do que 0,01 EU/mg, ou menores do que 0,001 EU/mg. Em uma outra modalidade, os níveis de endotoxina e pirogênio na composição são menores do que cerca de 10 EU/mg, ou menores do que cerca de 5 EU/mg, ou menores do que cerca de 1 EU/mg, ou menores do que cerca de 0,1 EU/mg, ou menores do que cerca de 0,01 EU/mg, ou menores do que cerca de 0,001 EU/mg.

[0203] A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material carreador para produzir uma forma de dosagem única variará dependendo do indivíduo a ser tratado, e do modo particular de administração. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material carreador para produzir uma forma de dosagem única será em geral aquela quantidade da composição que produz um efeito terapêutico. Em geral, fora dos cem porcento, esta quantidade variará de cerca de 0,01 porcento a cerca de noventa e nove porcento de ingrediente ativo, também de cerca de 0,1 porcento a cerca de 70 porcento, também de cerca de 1 porcento a cerca de 30 porcento de ingrediente ativo em combinação com um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0204] Os regimes de dosagem são ajustados para fornecer a resposta desejada ideal (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um bolo único pode ser administrado, várias dose divididas podem ser administradas com o tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada da maneira indicada pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais na forma de dosagem única para facilidade de administração e uniformidade da dosagem. A forma de dosagem única, da maneira aqui usada, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade pré- determinada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o carreador farmacêutico exigido. A especificação para a forma de dosagens únicas da invenção é ditada e depende diretamente (a) das características exclusivas do composto ativo e do efeito terapêutico particular a ser atingido, e (b) das limitações inerentes na técnica de compor, tal como composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.

[0205] Para administração de um anticorpo, a dosagem varia de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg e, mais usualmente, 0,01 a 5 mg/kg, do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou na faixa de 1-10 mg/kg. Um regime de tratamento exemplar obriga a administração uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez no mês, uma vez a cada 3 meses ou uma vez a cada três a 6 meses. Regimes de dosagem para um anticorpo anti- IFNAR1 da invenção incluem 1 mg/kg de peso corporal ou 3 mg/kg de peso corporal por meio de administração intravenosa, com o anticorpo que está sendo fornecido usando um dos programas de dosagem a seguir: (i) a cada quatro semanas para seis dosagens, então a cada três meses; (ii) a cada três semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal uma vez seguido por 1 mg/kg de peso corporal a cada três semanas.

[0206] Alternativamente, um anticorpo de proteína de fusão pode ser administrado como uma formulação de liberação prolongada, na qual o caso de administração menos freqüente é exigido. A dosagem e frequência variam dependendo da meia vida do anticorpo no paciente. Em geral, anticorpos humanos mostram a meia vida mais longa, seguido por anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e anticorpos não humanos. A dosagem e frequência de administração podem variar dependendo se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em aplicações profiláticas, uma dosagem relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente infrequentes por um longo período de tempo. Alguns pacientes continuam a receber tratamento pelo resto de suas vidas. Em aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente alta em intervalos relativamente curtos é algumas vezes exigida até que a progressão da doença seja reduzida ou finalizada e em geral até que o paciente mostre melhora parcial ou completa dos sintomas da doença. Posteriormente, ao paciente pode ser administrado um regime profilático.

[0207] Níveis de dosagem atuais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados, de maneira a obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para atingir a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição e modo de administração particular, sem ser tóxico ao paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos, incluindo a atividade das composições particulares da presente invenção empregada, ou o éster, sal ou amido destas, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular que está sendo empregada, a duração do tratamento, outros medicamentos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares empregadas, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e história médica anterior do paciente que está sendo tratado e fatores similares bem conhecidos pelos versados na medicina.

[0208] Uma dosagem terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-IFNAR1 da invenção resulta em uma diminuição na gravidade dos sintomas da doença, um aumento na frequência e duração dos períodos em sintomas da doença, ou uma prevenção de deficiência ou incapacidade em virtude da aflição da doença. No caso de, por exemplo, Lúpus eritematoso sistêmico (SLE), uma dose terapeuticamente eficaz pode prevenir deterioração adicional de sintomas físicos associados com SLE, tais como, por exemplo, dor, fadiga ou fraqueza. Uma dose terapeuticamente eficaz também pode prevenir ou atraso no início de SLE, tal como pode ser desejado quando sinais precoces ou preliminares da doença estão presentes. Do mesmo modo, inclui atraso na progressão crônica associada a SLE. Testes de laboratório utilizados no diagnóstico de SLE incluem testes químicos, hematologia, sorologia e radiologia. Dessa maneira, qualquer ensaio clínico ou bioquímico que monitora quaisquer dos precedentes pode ser usado para determinar se um tratamento particular é uma dose terapeuticamente eficaz para tratar SLE. Os versados na técnica são capazes de determinar tais quantidades que baseiam-se em tais fatores como o tamanho do indivíduo, a gravidade dos sintomas do indivíduo, e a composição particular ou via de administração selecionada.

[0209] Uma composição da presente invenção pode ser administrada por meio uma ou mais vias de administração usando um ou mais de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Da maneira percebida pelos versados na técnica, a via e/ou modo de administração variarão dependendo dos resultados desejados. As vias de administração selecionadas para anticorpos da invenção incluem administração intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutânea, espinhal ou outra via parenteral de administração, por exemplo, por injeção ou infusão. A administração parenteral pode representar modos de administração sem ser administração enteral e tópica, em geral por injeção e, inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnóide, intraespinhal, epidural e intrasternal.

[0210] Alternativamente, um anticorpo da invenção pode ser administrado por meio de uma via não parenteal, tais como uma via de administração tópica, epidérmica ou mucosa, por exemplo, intranasalmente, oralmente, vaginalmente, retalmente, sublingualmente ou topicamente.

[0211] Os compostos ativos podem ser preparados com carreadores que protegerão o composto contra liberação rápida, tal como uma formulação controlada de liberação, incluindo implantes, adesivos transdérmico e sistemas de distribuição microencapsulada. Polímeros biodegradáveis biocompatíveis podem ser usados, tais como acetato de etileno de vinila, polianidretos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido polilático. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são patenteados ou em geral conhecidos pelos versados na técnica. Ver, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

[0212] Composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma outra modalidade, uma composição terapêutica da invenção pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, tais como os dispositivos revelados nas patentes U.S. 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824 ou 4.596.556. Exemplos de implantes e módulos bem conhecidos usados na presente invenção incluem: patente U.S. 4.487.603, que revela uma bomba de microinfusão implantável para dispensar medicação em uma taxa controlada; patente U.S. 4.486.194, que revela um dispositivo terapêutico para administrar medicamentos através da pele; patente U.S. 4.447.233, que revela uma bomba de infusão de medicação para distribuir medicação em uma taxa de infusão precisa; patente U.S. 4.447.224, que revela um aparelho de infusão implantável de fluxo variável pra distribuição contínua de medicamento; patente U.S. 4.439.196, que revela um sistema de distribuição de medicamento osmótico com compartimentos multi- câmaras; e patente U.S. 4.475.196, que revela um sistema de distribuição de medicamento osmótico. Estas patentes são aqui incorporadas pela referência. Muitos outros tais implantes, sistemas de distribuição e módulos são conhecidos na técnica e pelos versados na tecnologia.

[0213] Em certas modalidades, os anticorpos da invenção podem ser formulados para assegurar distribuição própria in vivo. Por exemplo, a barreira hemato-encefálica (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrofílicos. Para assegurar que os compostos terapêuticos da invenção atravessem a BBB (se desejado), eles podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para métodos de fabricar lipossomas, ver, por exemplo, patentes U.S. 4.522.811; 5.374.548 e 5.399.331. Os lipossomas podem compreender uma ou mais frações que são seletivamente transportadas em células ou órgãos específicos, melhorando assim a distribuição do medicamento alvejado (ver, por exemplo, V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Frações de alvejamento exemplares incluem folato ou biotina (ver, por exemplo, patente U.S. 5.416.016 de Low et al ); manosídeos (Umezawa et al, (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticorpos (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor de proteína A do agente tensoativo (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); pl20 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); ver também K. Keinanen; MX. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273. 5.10 Usos diagnósticos

[0214] Em outras modalidades, anticorpos da presente invenção apresentam utilidades terapêuticas e de diagnóstico in vitro e in vivo. Por exemplo, estas moléculas podem ser administradas nas células em cultura, por exemplo, in vitro ou ex vivo, ou em um indivíduo, por exemplo, in vivo, para tratar, prevenir ou diagnosticar uma variedade de distúrbios.

[0215] Em uma modalidade, os anticorpos da invenção podem ser usados para detectar níveis de IFNAR1, ou níveis de células que expressam IFNAR1. Isto pode ser atingido, por exemplo, colocando uma amostra (tal como uma amostra in vitro) e uma amostra controle em contato com o anticorpo anti-IFNAR1 em condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo e IFNAR1. Quaisquer complexos formados entre o anticorpo e IFNAR1 são detectados e comparados na amostra e com o controle. Por exemplo, métodos padrões de detecção, bem conhecidos na técnica, tais como ELISA e ensaios de citometria de fluxo, podem ser realizados usando as composições da invenção.

[0216] Dessa maneira, em um aspecto, a invenção fornece adicionalmente métodos para detectar a presença de IFNAR1 (por exemplo, antígeno de IFNAR1 humano) em uma amostra, ou medir a quantidade de IFNAR1, que compreende colocar a amostra, e uma amostra controle, em contato com anticorpos da invenção, ou uma porção de ligação de antígeno deste, que se liga especificamente à IFNAR1, em condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo, ou porção deste, e IFNAR1. A formação de um complexo é então detectada, em que uma diferença na formação do complexo entre a amostra comparada com a amostra controle é indicativa da presença de IFNAR1 na amostra. 5.11 Aplicações terapêuticas

[0217] IFNAR1 é parte do receptor celular para interferons do tipo I, e sabe-se que interferons do tipo I são citocinas imunorregulatórias que estão envolvidas na diferenciação de célula T, produção de anticorpo e atividade e sobrevivência de células T de memória. Além disso, maior expressão de interferons do tipo I foi descrita em numerosas doenças autoimunes, em infecção de HIV, em rejeição de transplante e em doença de enxerto contra hospedeiro (GVHD). Dessa maneira, os anticorpos anti- IFNAR1 da invenção, ou fragmentos destes, que inibem a atividade funcional de interferons do tipo I podem ser usados em uma variedade de indicações clínicas aberrantes ou atividade de interferon tipo I indesejada. A invenção inclui métodos de prevenir, tratar, manter, melhorar, ou inibir uma doença ou distúrbio mediado por interferon tipo I, em que os métodos compreendem administrar anticorpos, ou porções de ligação de antígeno destes, da invenção.

[0218] Exemplos específicos de condições autoimunes em que anticorpos da invenção podem ser usados incluem, mas sem limitação, as seguintes: lúpus eritematoso sistêmico (SLE), diabetes mellitus dependente de insulina (IDDM), doença intestinal inflamatória (IBD) (incluindo doença de Crohn, colite ulcerativa e doença celíaca), esclerose múltipla (MS), psoríase, tiroidite autoimune, artrite reumatóide (RA) e glomerulonefrite. Além do mais, as composições de anticorpo da invenção podem ser usadas para inibir ou preservar a rejeição de transplante ou no tratamento de doença de enxerto contra hospedeiro(GVHD) ou no tratamento de infecção por HIV /AIDS.

[0219] Níveis elevados de IFNα foram observados no soro de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico (SLE) (ver, por exemplo, Kim et al. (1987) Clin. Exp. Immunol. 70:562-569). Além disso, a administração de IFNα, por exemplo, no tratamento de câncer ou infecções virais, mostrou induzir SLE (Garcia-Porrua et al. (1998) Clin. Exp. Rheumatol. 16:107- 108). Dessa maneira, em uma outra modalidade, anticorpos anti-IFNAR1 da invenção podem ser usados no tratamento de SLE administrando o anticorpo a um indivíduo que necessita de tratamento.

[0220] Outros métodos de tratar SLE são descritos no pedido de patente U.S. intitulado "Methods of treating SLE" com os números de série a seguir; 60/907.767, depositado em 16 de abril de 2007; 60/966,174, depositado em 5 de novembro de 2007 e pedido PCT número de série PCT/US2007/02494, depositado em 9 de dezembro de 2007, cada um dos quais são aqui incorporados pela referência e na sua íntegra.

[0221] IFNα também foi implicado na patologia do diabetes tipo I. Por exemplo, a presença de IFNα imunorreativo em células beta pancreática de pacientes com diabetes tipo I foi relatada (Foulis et al. (1987) Lancet 2: 1423-1427). O uso prolongado de IFNα em terapia antiviral também mostrou induzir diabetes tipo I (Waguri et al. (1994) Diabetes Res. Clin. Pract. 23:33-36). Dessa maneira, em uma outra modalidade, os anticorpos anti-IFNAR1, ou fragmentos destes, da invenção podem ser usados no tratamento de diabetes tipo I administrando o anticorpo a um indivíduo que necessita de tratamento. O anticorpo pode ser usado sozinho ou em combinação com outros agentes anti-diabéticos, tal como insulina.

[0222] Anticorpos para IFNAR1 mostraram ser efetivos em um modelo animal com doença intestinal inflamatória (ver pedido de patente U.S. 60/465.155). Assim, os anticorpos anti-IFNAR1, ou fragmentos destes, da invenção podem ser usados no tratamento de doença intestinal inflamatória (IBD), incluindo colite ulcerativa e doença de Crohn, administrando o anticorpo a um indivíduo que necessita de tratamento.

[0223] Observou-se também que o tratamento com IFNα induz tiroidite autoimune (Monzani et al. (2004) Clin. Exp. Med. 3:199-210; Prummel e Laurberg (2003) Thyroid 13:547-551). Dessa maneira, em uma outra modalidade, anticorpos anti-IFNAR1 da invenção podem ser usados no tratamento de doença tiroidite autoimune, incluindo hipotiroidismo primário autoimune, doença de Graves, tiroidite de Hashimoto e tiroidite destrutiva com hipotiroidismo, administrando um anticorpo da invenção a um indivíduo que necessita de tratamento. Anticorpos da invenção podem ser usados sozinhos ou em combinação com outros agentes ou tratamentos, tais como medicamentos anti-tireóide, iodo radioativo e tiroidectomia subtotal.

[0224] Níveis elevados de IFNα também foram observados na circulação de pacientes com infecção por HIV e sua presença é um marcador preditivo de progressão da AIDS (DeStefano et al. (1982; J. Infec. Disease 146:451; Vadhan-Raj et al. (1986) Cancer Res. 46:417). Assim, em uma outra modalidade, anticorpos anti-IFNAR1 da invenção podem ser usados no tratamento de infecção por HIV ou AIDS administrando o anticorpo da invenção a um indivíduo que necessita de tratamento. Em uma outra modalidade, os anticorpos da invenção podem ser usados sozinhos ou em combinação com outros agentes anti-HIV, tais como inibidores de transcriptase reversa de nucleosídeo, inibidores de transcriptase reversa de não nucleosídeo, inibidores de protease e inibidores de fusão.

[0225] Anticorpos de IFNAR1 demonstraram ser efetivos em inibir rejeição a aloenxerto e prolongar a sobrevivência de aloenxerto (ver, por exemplo, Tovey et al. (1996) J. Leukoc. Biol. 59:512-517; Benizri et al. (1998) J. Interferon Cytokine Res. 18:273-284). Dessa maneira, os anticorpos anti-IFNAR1 da invenção também podem ser usados em receptores de transplante para inibir a rejeição a aloenxerto e/ou prolongar a sobrevivência a aloenxerto. A invenção fornece um método de inibir rejeição a transplante administrando anticorpos anti-IFNAR1 da invenção a um receptor de transplante que necessita de tratamento. Exemplos de transplantes de tecido que podem ser tratados incluem, mas sem limitação, fígado, pulmão, rim, coração, intestino delgado e ilhotas pancreáticas, bem como o tratamento de doença de enxerto contra hospedeiro(GVHD). Anticorpos da invenção podem ser usados sozinhos ou em combinação com outros agentes para inibir a rejeição de transplante, tais como agentes imunossupressores (por exemplo, ciclosporina, azatioprina, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, micofenolato de mofetila, sirolimus, rapamicina, tacrolimus), agentes anti- infectivos (por exemplo, aciclovir, clotrimazol, ganciclovir, nistatina, trimetoprimsulfametoxazol), diuréticos (por exemplo, bumetanida, furosemida, metolazona) e medicações para úlcera (por exemplo, cimetidina, famotidina, lansoprazol, omeprazol, ranitidina, sucralfato).

[0226] Em outras modalidades específicas, a invenção fornece métodos de administrar e usar composições e anticorpos da invenção para tratar e prevenir uma ampla faixa de condições inflamatórias incluindo tanto condições crônicas quanto agudas, tais como, mas sem limitação, apendicite, úlceras pépticas, gástricas e duodenais, peritonite, pancreatite, colite ulcerativa, pseudomembranosa, aguda e isquêmica, diverticulite, epiglotite, acalásia, colangite, colecistite, hepatite, doença de Crohn, enterite, doença de Whipple, asma, alergia, choque anafilático, doença de complexo imune, isquemia de órgão, lesão por reperfusão, necrose de órgão, febre de feno, sepse, septicemia, choque endotóxico, caquexia, hiperpirexia, granuloma eosinofílico, granulomatose, sarcoidose, aborto séptico, epididimite, vaginite, prostatite, uretrite, bronquite, enfisema, rinite, fibrose cística, pneumonite, pneumoultramicroscopicsilicovolcanoconiose, alvealite, bronquiolite, faringite, pleurisia, sinusite, influenza, infecção por vírus sinsicial respiratório, infecção por herpes, infecção por HIV, infecção por vírus de hepatite B, infecção por vírus de hepatite C, bacteremia disseminada, febre do Dengue, candidíase, malária, fúaríase, amebíase, cisto hidático, queimaduras, dermatite, dermatomiosite, queimadura de sol, urticária, verrugas, urticária, vasulite, angiite, endocardite, arterite, aterosclerose, tromboflebite, pericardite, miocardite, isquemia do miocárdio, periartrite nodosa, febre reumática, mal de Alzheimer, doença celíaca, insuficiência cardíaca congestiva, restenose, síndrome da angústia respiratória do adulto COPD, meningite, encefalite, esclerose múltipla, infarte cerebral, embolia cerebral, síndrome de Guillame-Barre, neurite, neuralgia, lesão da coluna espinhal, paralisia, uveíte, artrite, artralgias, osteomielite, fasciite, doença de Paget, gota, doença periodontal, artrite reumatóide, sinovite, miastenia grave, trioidite, lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de Goodpasture, síndrome de Behcets, rejeição a aloenxerto, doença de enxerto contra hospedeiro, diabetes tipo I, espondilite anquilosante, doença de Berger, doença de Retier e doença de Hodgkins.

[0227] Em uma outra modalidade, métodos de administração e composições de anticorpos da invenção podem ser usados na prevenção, tratamento, melhora dos sintomas associados com as condições ou estado de doenças a seguir: doença de Graves, tiroidite de Hashimoto, doença de Crohn, psoríase, artrite psoriática, oftalmite simpática, ooforite autoimune, orquite autoimune, síndrome linfoproliferativa autoimune, síndrome antifosfolipídica, síndrome de Sjogren, escleroderma, doença de Addison, síndrome de deficiência poliendócrina, síndrome de Guillan-Barre, púrpura trombocitopênica imune, anemia perniciosa, miastenia grave, cirrose biliar primária, doença do tecido conectivo misto, vitiligo, uveíte autoimune, anemia hemolítica autoimune, trombopocitopenia autoimune, doença celíaca, dermatite herpetiforme, hepatite autoimune, pênfigo, pênfigo vulgar, pênfigo foliáceo, penfigóide bolhoso, miocardite autoimune, vasculite autoimune, alopécia areata, arterosclerose autoimune, doença de Behcet, mielopatia autoimune, hemofilia autoimune, cistite intersticial autoimune, diabetes isípido autoimune, endometriose autoimune, policondrite recorrente, espondilite anquilosante, urticária autoimune, dermatomiosite, síndrome de Miller-Fisher, nefropatia de IgA, síndrome de Goodpastures e herpes gestacional.

[0228] Em uma outra modalidade, métodos de administração e composições de anticorpos da invenção podem ser usados na prevenção, tratamento, melhora de sintomas associados à síndrome de Sjogren. A síndrome de Sjogren's é um distúrbio autoimune em que células imunes atacam e destroem as glândulas exócrinas que produzem lágrimas e saliva. Foi nomeada em homenagem ao oftalmologista sueco Henrik Sjogren (1899-1986), que descreveu-a primeiro. A síndrome de Sjogren é também associada a distúrbios reumáticos, tal como artrite reumatóide, e o fatos reumatóide é positivo em 90 porcento dos casos. Os principais sintomas do distúrbio são boca seca e olhos secos. Além do mais, a síndrome de Sjogren pode causar secura na pele, nariz e vagina, e pode afetar outros órgãos do corpo, incluindo os rins, vasos sanguíneos, pulmões, fígado, pâncreas e cérebro. Nove entre dez pacientes com Sjogren são mulheres e a média de idade de início é acima dos 40 anos, embora Sjogren ocorra em todas os grupos, tanto em mulheres quanto em homens. Estima-se que atinge tanto quanto 4 milhões de pessoas apenas nos Estados Unidos, tornando-a a segunda doença reumática autoimune mais comum.

[0229] Miosite é uma condição geral caracterizada por inflamação de músculos esquelético ou músculo voluntário. A inflamação do músculo pode ser causada por uma reação alérgica, exposição a uma substância ou medicamento tóxico, uma outra doença tal como câncer ou condições reumatóides, ou um vírus ou outro agente infeccioso. As miopatias inflamatórias crônicas são idiopáticas, o que significa que não apresentam nenhuma causa. Entende-se que são distúrbios autoimunes, nos quais as células brancas do sangue (que em geral combatem doença) atacam vasos sanguíneos, fibras musculares normais e tecido conectivo em órgãos, ossos e articulações.

[0230] Polimiosite afeta músculos esqueléticos (envolvido com a realização do movimento) em ambos os lados do corpo. É raramente observada em pessoas abaixo de 18; a maioria dos casos são em pacientes entre as idades de 31 e 60. Além dos sintomas listados anteriormente, a fraqueza muscular progressiva leva a dificuldades na deglutição, fala, originando a partir de uma posição sentada, subindo escadas, levantando objetos ou movimentando a cabeça. Pacientes com polimiosite também podem experimentar artrite, falta de ar e arritmia cardíaca.

[0231] Dermatomiosite é caracterizada por um exantema na pele que precede ou acompanha fraqueza muscular progressiva. O exantema parece irregular, com colorações roxo azulada ou vermelha, e caracteristicamente desenvolve-se nas pálpebras e nos músculos usados para estender ou arrumar as juntas, incluindo articulações, cotovelos, calcanhares e dedos. Exantemas vermelhas também podem ocorrer na face, pescoço, ombros, tórax superior, costas e outros locais, e pode existir inchaço nas áreas afetadas. O exantema ocorre algumas vezes sem envolvimento óbvio do músculo. Adultos com dermatomiosite podem ter perda de peso ou uma febre baixa, apresentar pulmões inflamados e ser sensível à luz. A dermatomiosite no adulto, ao contrário de polimiosite, pode acompanhar tumores de mama, pulmão, genitália feminina ou intestino. Crianças e adultos com dermatomiosite podem desenvolver depósitos de cálcio, que aparecem como protuberâncias graves na pele ou no músculo (denominadas calcinose). A calcinose ocorre mais frequentemente 1-3 anos após o início da doença, mas pode ocorrer muitos anos mais tarde. Estes depósitos são mais observados com frequência em dermatomiosite da infância do que em dermatomiosite que inicia-se em adultos. A dermatomiosite pode estar associada a doenças do grupo colágeno-vascular ou autoimunes.

[0232] Miosite com corpos de inclusão (IBM) é caracterizada por fraqueza muscular progressiva e prejudicial. IBM é similar à polimiosite, mas apresenta suas próprias características distintivas. O início da fraqueza muscular é em geral gradual (por meses ou anos) e afeta tanto músculos proximais quanto distais. A fraqueza muscular pode afetar apenas um lado do corpo. Pequenas cavernas denominadas vacúolos são observadas nas células de fibras musculares afetadas. Queda e tropeço são em geral o primeiro sintoma notável de IBM. Para alguns pacientes, o distúrbio começa com fraqueza nos pulsos e dedos, o que causa dificuldade em beliscar, abotoar e segurar objetos. Existe fraqueza dos músculos dos pulsos e dedos e atrofia (redução ou perda de massa muscular) dos músculos do antebraço e músculos quadríceps nas pernas. Dificuldades na deglutição ocorre em aproximadamente metade dos casos de IBM. Os sintomas da doença em geral iniciam após os 50 anos, embora a doença possa ocorrer mais cedo. Ao contrário da polimiosite e dermatomiosite, IBM ocorre mais frequentemente em homens do que em mulheres.

[0233] A miosite juvenil apresenta algumas similaridades com a dermatomiosite e polimiosite do adulto. Afeta tipicamente crianças com idade de 2 a 15 anos, com sintomas que incluem fraqueza muscular proximal e inflamação, edema (uma coleção anormal de fluidos nos tecidos corporais que causa inchaço), dor muscular, fadiga, exantemas na pele, dor abdominal, febre e contraturas (encurtamento crônico de músculos ou tendões ao redor das juntas, causado por inflamação nos tendões musculares, que impede as juntas moverem livremente). Crianças com miosite juvenil também podem ter dificuldade de deglutição e respiração, e o coração pode ser afetado. Aproximadamente 20 a 30 porcento de crianças com dermatomiosite juvenil desenvolvem calcinose. Os pacientes juvenis podem não apresentar níveis maiores do que os normais da enzima creatina quinase muscular em seu sangue, mas apresentam níveis maiores do que o normal de outras enzimas musculares.

[0234] Dessa maneira, em outras modalidades, os anticorpos da invenção podem ser usados na prevenção, tratamento ou melhora de miosite, miosite inflamatória, miosite idiopática, polimiosite, dermatomiosite, miosite com corpos de inclusão (IBM), miosite juvenil ou sintomas associados a estas condições.

[0235] Em uma outra modalidade, os anticorpos da invenção podem ser usados na prevenção, tratamento ou melhora de sintomas associados a vasculite.

[0236] Anticorpos da invenção podem ser usados para o tratamento de escleroderma. Métodos de tratar escleroderma são descritos em um pedido de patente U.S. intitulado "Methods of Treating Scleroderma" com um pedido número de série de 60/996,175, depositado em 5 de novembro de 2007 e pedido PCT PCT/US2008/82481, que são incorporados pela referência na sua íntegra com todos os propósitos.

[0237] Em uma outra modalidade, os anticorpos da invenção podem ser usados na prevenção, tratamento ou melhora de sintomas associados com sarcoidose. A sarcoidose (também denominada sarcóide ou doença de Besnier-Boeck) é um distúrbio do sistema imune caracterizado por granulomas não necrotizantes (pequenos nódulos inflamatórios). Virtualmente, qualquer órgão pode ser afetado; entretanto, granulomas mais frequentes aparecem nos pulmões ou nos linfonodos. Ocasionalmente, os sintomas podem aparecer de maneira súbita, mas em geral aparecem gradualmente. Quando observa-se raios-X dos pulmões, a sarcoidose pode ter a aparência de tuberculose ou linfoma.

[0238] Estão também no escopo da invenção estojos que compreendem as composições (por exemplo, anticorpos anti-IFNAR1) da invenção e instruções para uso. O estojo pode conter adicionalmente pelo menos um reagente adicional, ou um ou mais anticorpos adicionais da invenção (por exemplo, um anticorpo com uma atividade de complementaridade que se liga a um epítopo no antígeno alvo distinto do primeiro anticorpo). Os estojos incluem tipicamente uma marca que indica o uso pretendido dos conteúdos do estojo. O termo marca inclui qualquer material escrito ou registrado fornecido no estojo ou junto com este, ou que de outra forma acompanha o estojo. 5.12 Combinações

[0239] As composições da invenção também podem ser administradas em terapia de combinação, tal como combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir um anticorpo anti-IFNAR1 da presente invenção combinado com pelo menos um outro imunossupressor.

[0240] Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais com diferentes especificidades de ligação são administrados simultaneamente, no caso da dosagem de cada anticorpo administrado estar na faixa indicada. O anticorpo é em geral administrado em ocasiões múltiplas. Os intervalos entre as dosagens únicas podem ser, por exemplo, semanalmente, mensalmente, a cada três meses ou anualmente. Os intervalos também podem ser irregulares da maneira indicada medindo níveis sanguíneos de anticorpo para o antígeno alvo no paciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para atingir uma concentração de anticorpo no plasma de cerca de 1-1.000 μg /mL e, em alguns métodos, cerca de 25-300 μg /mL.

[0241] Quandos os anticorpos para IFNAR1 são administrados juntos com um outro agente, os dois podem ser administrados em tanto em ordem quanto ou simultaneamente. Por exemplo, um anticorpo anti-IFNAR1 da invenção pode ser usado em combinação com um ou mais dos agentes a seguir: medicamentos contendo mesalamina (incluindo sulfasalazina e outros agentes contendo ácido 5- aminossalicílico (5-ASA), tais como olsalazina e balsalazida), medicamentos anti-inflamatórios não esteroidais (NSAIDs), analgésicos, corticosteróides (por exemplo, predinisona, hidrocortisona), inibidores de TNF (incluindo adalimumab (HUMIRA®), etanercept (ENBREL®) e infliximab (REMICADE®)), imunossupressores (tais como 6-mercaptopurina, azatioprina e ciclosporina A) e antibióticos, anticorpo anti-IFNα, anticorpo do receptor anti-IFNY, e receptor IFNY solúvel. Além do mais, um anticorpo anti-IFNAR1 de invenção pode ser usado em combinação com um antagonista do ligante Flt3 (ver, por exemplo, pedido U.S. 2002/0160974).

[0242] Em outras modalidades, as composições da invenção também podem incluir agentes usados no tratamento de SLE. Tais agentes incluem analgésicos, corticosteróides (por exemplo, predinisona, hidrocortisona), imunossupressores (tais como ciclofosfamida, azatioprina e metotrexato), antimalariais (tal como hidroxicloroquina) e medicamentos biológicos que inibem a produção de anticorpos de DNAds (por exemplo, LJP 394). 5.13 Equivalentes

[0243] Os versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar, usando não mais do que experimentos de rotina, muitos equivalentes das modalidades da invenção aqui descritas.

[0244] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes mencionados nesta especificação são aqui incorporados pela referência na especificação com a mesma extensão, já que cada publicação, patente ou pedido de patente individual foi especifica e individualmente indicado para ser aqui incorporado pela referência.

[0245] Além do mais, os seguintes pedidos provisórios de patentes dos Estados Unidos: 61/006.962 depositado em 8 de fevereiro de 2008, 61/034.618 depositado em 7 de março de 2007, e 61/049.970 depositado em 2 de maio de 2008 são aqui incorporados pela referência na sua íntegra, com todos os propósitos. 5.14 Modalidades específicas

[0246] 1. Um anticorpo monoclonal de classe IgG modificado específico para IFNAR1, em que o dito anticorpo compreende na região Fc pelo menos uma substituição de aminoácido selecionada do grupo que consiste em L234F, L235E, e P331S, numeradas pelo índice EU da maneira apresentada em Kabat, e em que o dito anticorpo exibe menor afinidade com pelo menos um ligante de Fc comparado a um anticorpo não modificado.

[0247] 2. O anticorpo da modalidade 1, em que o dito anticorpo é um da subclasse IgGl ou IgG4.

[0248] 3. O anticorpo da modalidade 2, em que o dito anticorpo é uma molécula da classe IgG1.

[0249] 4. O anticorpo da modalidade 3, em que o dito anticorpo compreende uma substituição de aminoácido de P33 IS.

[0250] 5. O anticorpo da modalidade 3, em que o dito anticorpo compreende as substituições de aminoácidos: L234F e L235E.

[0251] 6. O anticorpo da modalidade 3, em que o dito anticorpo compreende as substituições de aminoácidos: L234F, L235E e P331S.

[0252] 7. O anticorpo da modalidade 3 em que, o dito anticorpo é uma molécula da classe IgG4.

[0253] 8. O anticorpo da modalidade 7, em que o dito anticorpo compreende uma substituição de aminoácido de L235E da região Fc.

[0254] 9. O anticorpo da modalidade 7, em que o dito anticorpo compreende adicionalmente na região Fc substituição de aminoácido S228P.

[0255] 10. O anticorpo de quaisquer das modalidades 1-9, em que o dito anticorpo compreende pelo menos uma região de determinação de complementaridade (CDR) selecionada da tabela 2.

[0256] 11. O anticorpo de quaisquer das modalidades 1-10, em que, o dito anticorpo compreende: a. uma CDR1 de região variável de cadeia pesada humana compreendendo Seq ID NO: 31; b. uma CDR2 de região variável de cadeia pesada humana compreendendo Seq ID NO: 32; c. uma CDR3 de região variável de cadeia pesada humana compreendendo Seq ID NO: 33; d. uma CDR1 de região variável de cadeia leve humana compreendendo Seq ID NO: 34; e. uma CDR2 de região variável de cadeia leve humana compreendendo Seq ID NO: 35; e f. uma CDR3 de região variável de cadeia leve humana compreendendo Seq ID NO: 36.

[0257] 12. O anticorpo de quaisquer das modalidades 1-10, em que o dito anticorpo compreende: a. uma CDR1 de região variável de cadeia pesada humana compreendendo Seq ID NO: 1; b. uma CDR2 de região variável de cadeia pesada humana compreendendo Seq ID NO: 2; c. uma CDR3 de região variável de cadeia pesada humana compreendendo Seq ID NO: 3; d. uma CDR1 de região variável de cadeia leve humana compreendendo Seq ID NO: 4; e. uma CDR2 de região variável de cadeia leve humana compreendendo Seq ID NO: 5; e f. uma CDR3 de região variável de cadeia leve humana compreendendo Seq ID NO: 6.

[0258] 13. O anticorpo de quaisquer das modalidades 1-10, em que o dito anticorpo compreende: a. uma CDR1 de região variável de cadeia pesada humana compreendendo Seq ID NO: 11; b. uma CDR2 de região variável de cadeia pesada humana compreendendo Seq ID NO: 12; c. uma CDR3 de região variável de cadeia pesada humana compreendendo Seq ID NO: 13; d. uma CDR1 de região variável de cadeia leve humana compreendendo Seq ID NO: 14; e. uma CDR2 de região variável de cadeia leve humana compreendendo Seq ID NO: 15; e f. uma CDR3 de região variável de cadeia leve humana compreendendo Seq ID NO: 16.

[0259] 14. O anticorpo de quaisquer das modalidades 1-10, em que o dito anticorpo compreende: a. uma CDR1 de região variável de cadeia pesada humana compreendendo Seq ID NO: 21; b. uma CDR2 de região variável de cadeia pesada humana compreendendo Seq ID NO: 22; c. uma CDR3 de região variável de cadeia pesada humana compreendendo Seq ID NO: 23; d. uma CDR1 de região variável de cadeia leve humana compreendendo Seq ID NO: 24; e. uma CDR2 de região variável de cadeia leve humana compreendendo Seq ID NO: 25; e f. uma CDR3 de região variável de cadeia leve humana compreendendo Seq ID NO: 26.

[0260] 15. O anticorpo de quaisquer das modalidades 1-10, em que o dito anticorpo compreende: a. uma região variável de cadeia pesada humana compreendendo a sequência de aminoácidos de Seq ID No: 38; e b. uma região variável de cadeia leve humana compreendendo a sequência de aminoácidos de Seq ID No: 40.

[0261] 16. O anticorpo de quaisquer das modalidades 1-10, em que o dito anticorpo compreende: a. uma região variável de cadeia pesada humana compreendendo a sequência de aminoácidos de Seq ID No: 8; e b. uma região variável de cadeia leve humana compreendendo a sequência de aminoácidos de Seq ID No: 10.

[0262] 17. O anticorpo de quaisquer das modalidades 1-10, em que o dito anticorpo compreende: a. uma região variável de cadeia pesada humana compreendendo a sequência de aminoácidos de Seq ID No: 18; e b. uma região variável de cadeia leve humana compreendendo a sequência de aminoácidos de Seq ID No: 20.

[0263] 18. O anticorpo de quaisquer das modalidades 1-10, em que o dito anticorpo compreende: a. uma região variável de cadeia pesada humana compreendendo a sequência de aminoácidos de Seq ID No: 28; e b. uma região variável de cadeia leve humana compreendendo a sequência de aminoácidos de Seq ID No: 30.

[0264] 19. O anticorpo de quaisquer das modalidades 1-18, em que, o dito anticorpo compreende a sequência de região constante de cadeia leve de Seq ID No: 41.

[0265] 20. O anticorpo de quaisquer das modalidades 1-18, em que o dito anticorpo compreende a região constante de cadeia pesada de Seq ID No: 42.

[0266] 21. O anticorpo de quaisquer das modalidades 1-18, em que, o dito anticorpo compreende a região constante de cadeia leve com a sequência de aminoácidos de SEQ ID No:41 e a região constante de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos de Seq ID No: 42.

[0267] 22. O anticorpo de quaisquer das modalidades 19 21, em que o dito anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada compreendendo variação alélica, em que a dita variação alélica tem pelo menos uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em 214, 221, 356 e 358 da maneira definida pelo sistema de numeração de índice EU.

[0268] 23. O anticorpo de quaisquer das modalidades precedentes, em que o dito anticorpo é selecionado do grupo que consiste em: anticorpo humano, anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, intracorpo e um anticorpo sintético.

[0269] 24. Um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codificam o anticorpo de quaisquer das modalidades precedentes.

[0270] 25. O ácido nucleico da modalidade 24, em que o dito ácido nucleico é um vetor replicável.

[0271] 26. O ácido nucleico da modalidade 25, em que a dita sequência de polinucleotídeos é operavelmente ligada a um promotor.

[0272] 27. Uma célula hospedeira que compreende ou é transformada com o vetor da modalidade 25 ou 26.

[0273] 28. Um camundongo transgênico compreendendo transgenes de cadeia pesada e leve de imunoglobulina humana, em que o camundongo expressa o anticorpo de quaisquer das modalidades 1-23.

[0274] 29. Um hibridoma preparado a partir do camundongo da modalidade 28, em que o hibridoma produz o dito anticorpo.

[0275] 30. Uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo de quaisquer das modalidades 1-23, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0276] 31. Um método para tratar uma condição ou uma doença associada a um distúrbio imune, compreendendo administrar a um indivíduo que necessita uma quantidade eficaz da composição da modalidade 30.

[0277] 32. O método da modalidade 31, em que a dita doença é uma doença mediada por interferon tipo I.

[0278] 33. O método da modalidade 32, em que o dito interferon tipo I é interferon alfa.

[0279] 34. O método da modalidade 33, em que a dita doença mediada por interferon tipo I é associada ao receptor do interferon tipo I.

[0280] 35. O método da modalidade 31, em que a dita doença ou distúrbio é infecção por HIV de AIDS.

[0281] 36. O método da modalidade 31, em que a dita doença ou distúrbio é lúpus eritematoso sistêmico.

[0282] 37. O método da modalidade 31, em que a dita doença ou distúrbio é a síndrome de Sjogren.

[0283] 38. O método da modalidade 31, em que a dita doença ou distúrbio é miosite.

[0284] 39. O método da modalidade 31, em que a dita doença ou distúrbio é miosite inflamatória.

[0285] 40. O método da modalidade 31, em que a dita doença ou distúrbio é polimiosite.

[0286] 41. O método da modalidade 31, em que a dita doença ou distúrbio é dermatomiosite.

[0287] 42. O método da modalidade 31, em que a dita doença ou distúrbio é miosite com corpos de inclusão.

[0288] 43. O método da modalidade 31, em que a dita doença ou distúrbio é miosite juvenil.

[0289] 44. O método da modalidade 31, em que a dita doença ou distúrbio é miosite idiopática inflamatória.

[0290] 45. O método da modalidade 31, em que a dita doença ou distúrbio é vasculite.

[0291] 46. O método da modalidade 31, em que a dita doença ou distúrbio é sarcoidose.

[0292] 47. O método da modalidade 31 , em que a dita doença ou distúrbio é selecionado do grupo que consiste em: doença intestinal inflamatória, esclerose múltipla, tiroidite autoimune, artrite reumatóide, diabetes mellitus dependente de insulina, glomerulonefrite, e doença de enxerto contra hospedeiro.

[0293] 48. O método da modalidade 31, em que a dita doença ou distúrbio é psoríase ou condições resultantes desta.

[0294] 49. O método da modalidade 31, em que a dita doença ou distúrbio é rejeição de transplante ou doença de enxerto contra hospedeiro.

[0295] 50. O método da modalidade 31 em que a dita doença ou distúrbio é selecionado do grupo que consiste em: doença de Grave, tiroidite de Hashimoto, doença de Crohn, psoríase, artrite psoriática, oftalmite simpática, ooforite autoimune, orquite autoimune, síndrome linfoproliferativa autoimune, síndrome antifosfolipídica, síndrome de Sjogren, escleroderma, doença de Addison, síndrome de deficiência poliendócrina, síndrome de Guillan-Barre, púrpura trombocitopênica imune, anemia perniciosa, miastenia grave, cirrose biliar primário, doença do tecido conectivo misto, vitiligo, uveíte autoimune, anemia hemolítica autoimune, trombopocitopenia autoimune, doença celíaca, dermatite herpetiforme, hepatite autoimune, pênfigo, pênfigo vulgar, pênfigo foliáceo, penfigóide bolhoso, miocardite autoimune, vasculite autoimune, alopécia areata, arterosclerose autoimune, doença de Behcet, mielopatia autoimune, hemofilia autoimune, cistite intersticial autoimune, diabetes isípido autoimune, endometriose autoimune, policondrite recorrente, espondilite anquilosante, urticária autoimune, dermatomiosite, síndrome Miller-Fisher, nefropatia de IgA, síndrome de Goodpastures e herpes gestacional.

[0296] 51. O método de quaisquer das modalidades 31-50, compreendendo adicionalmente administrar pelo menos um agente selecionado do grupo que consiste em: fototerapia, corticosteróide, prednisona, NSAIDS, plasmaferese, imunossupressores, metotrexato, ácido retinóico, tioguanina, micofenolata de mofetila, ésteres fumáricos, ciclofosfamida, azatioprina, ciclosporina e imunoglobulinas.

[0297] 52. O método de quaisquer das modalidades 31-51 compreendendo adicionalmente administrar pelo menos um agente selecionado do grupo que consiste em: alefacept (AMEVIVE™), etanercept (ENBREL®), adalimumab (HUMIRA®), infliximab (REMICADE®), belimumab (LYMPHOSTATB™), rituxumab (RITUXAN®), e efalizumab (RAPTIV UM®).

[0298] 53. Um cristal compreendendo uma região Fc de IgG humana, em que a região Fc de IgG humana compreende pelo menos uma substituição de aminoácido selecionada do grupo que consiste em L234F, L235E, e P331S, numerados pelo índice EU da maneira apresentada em Kabat, e em que o dito fragmento exibe menor afinidade com pelo menos um ligante de Fc comparado a uma região Fc não modificada.

[0299] 54. O cristal da modalidade 53, em que a região Fc de IgG humana compreende as substituições de aminoácidos L234F, L235E e P331S.

[0300] 55. O cristal da modalidade 53, que é qualidade de difração.

[0301] 56. O cristal da modalidade 53, que é um cristal nativo.

[0302] 57. O cristal da modalidade 53, que é caracterizado por uma unidade celular ortorrômbica de a=50,l8±0,2 A, b=l47,30±0,2 A, e c=75,47 ±0,2 A.

[0303] 58. O cristal da modalidade 53, que apresenta um grupo espacial de C2221.

[0304] 59. Um anticorpo monoclonal modificado, em que o dito anticorpo compreende na região Fc as substituições de aminoácidos L234F, L235E, e P331S, numeradas pelo índice EU da maneira apresentada em Kabat, e em que o dito anticorpo exibe menor afinidade com pelo menos um ligante de Fc, comparado a um anticorpo não modificado.

[0305] 60. Uma proteína de fusão compreendendo uma região Fc modificada, em que a dita região Fc compreende as substituições de aminoácidos L234F, L235E, e P331S, numeradas pelo índice EU da maneira apresentada em Kabat, e em que a dita região Fc exibe menor afinidade com pelo menos um ligante de Fc, comparado a uma região Fc.

[0306] 61. Um método de preparar o anticorpo de quaisquer das modalidades 1-23 ou 59.

[0307] 62. O anticorpo de quaisquer das modalidades 1-23 ou 59, em que o dito anticorpo é um anticorpo que internaliza.

[0308] 63. A proteína de fusão da modalidade 60, em que a dita proteína de fusão é uma proteína de fusão que internaliza.

[0309] 64. A proteína de fusão da modalidade 63, em que a dita proteína de fusão se liga especificamente a IFNAR1.

[0310] 65. O anticorpo de quaisquer das modalidades 1-23, 59, ou 62, em que o dito anticorpo exibe citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo reduzida ou removida (ADCC), comparado ao dito anticorpo não modificado.

[0311] 66. O anticorpo de quaisquer das modalidades 1-23, 60, ou 62, em que o dito anticorpo exibe citotoxicidade mediada por complemento reduzida ou removida (CDC), comparado ao dito anticorpo não modificado.

[0312] 67. O anticorpo de quaisquer das modalidades 1-23, 61, ou 62, em que o dito anticorpo exibe ADCC e CDC reduzida ou removida, comparado ao dito anticorpo não modificado. 62, 5 Sequências

[0313] Região constante de cadeia leve (SEQ ID No :41) RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[0314] Região constante de cadeia pesada (SEQ ID No :42) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGK 6. EXEMPLOS

[0315] A invenção é agora descrita com referência aos exemplos a seguir. Estes exemplos são fornecidos com o propósito apenas de ilustração e a invenção não pode ser de nenhuma maneira interpretada como sendo limitante, mas de preferência pode ser interpretada para incluir toda e qualquer variação que se torna evidente como um resultado dos preceitos aqui fornecidos. 6.1 Exemplo 1: perfil de IHC de múltiplos anticorpos anti-IFNAR1

[0316] Propósito: Avaliar o perfil de IHC de anticorpos anti-IFNAR1 em um conjunto diverso de tecidos.

[0317] Métodos: Técnicas imunohistoquímicas para estudar características de ligação de anticorpo são facilmente conhecidas na técnica e, por exemplo, podem ser realizadas isolando as células ou tecidos desejados e preparando-os para microscopia por técnicas de montagem e fixação padrões.

[0318] Macrófagos de camundongo: Uma suspensão celular foi centrifugada para formar um precipitado livre. O precipitado foi congelado em meio de congelamento OCT para formar um bloco. Seções laminares foram cortadas em espessura de 5 mícrons, banhadas em acetona por 10 minutos e secas naturalmente com dissecante por toda a noite. Antes do uso, as lâminas foram mergulhadas em formalina tamponada neutra a 10 % por 10 segundos e lavadas em tampão 3X (TBS IX com Tween 20 a 0,01 %).

[0319] Monócitos humanos: Uma suspensão celular foi borrada/manchada diretamente nas lâminas. As lâminas secaram naturalmente por toda a noite e foram então banhadas em acetona por 10 minutos e secas naturalmente no ambiente. Antes do uso, as lâminas foram mergulhadas em formalina tamponada neutra a 10 % por 10 segundos e lavadas em tampão 3X (TBS IX com Tween 20 a 0,01 %).

[0320] Tecido cardíaco e de cérebro humano: Amostras de tecido de doadores foram congeladas em meio de congelamento OCT para formar um bloco. As seções de lâminas foram cortadas em espessuras de 5 mícron, banhadas em acetona por 10 minutos e secas naturalmente com dissecante por toda a noite. Antes do uso, as lâminas foram mergulhadas em formalina tamponada neutra a 10 % por 10 segundos e lavadas em tampão 3X (TBS IX com Tween 20 a 0,01 %).

[0321] Marcação de anticorpo: Os anticorpos foram conjugados com biotina pelo protocolo a seguir. Aproximadamente 500 μg de anticorpo foram misturados com um excesso de 20 vezes de biotina e incubados por 2 horas no escuro a 4 °C. Após as 2 horas de incubação, a mistura anticorpo/biotina foi aplicada em uma coluna PDl0 pré-equilibrada com PBS IX. Subsequentemente, os anticorpos conjugados com biotina foram concentrados em uma concentração desejada usando um tubo de concentração YM-30 Centricon.

[0322] Coloração de lâmina: Após lavagem em tampão, as lâminas foram tratadas para finalizar peroxidases endógenas por tratamento com uma solução de glicose oxidase (1 U/mL, Sigma G0543), B-D(+) Glicose (10 mM, Sigma G5250), azida sódica (1 mM, Sigma, S8032) por 1 hora em temperatura ambiente. As lâminas foram então rinsadas em tampão de lavagem (TBS IX com Tween 20 a 0,01 %). As lâminas foram colocadas em uma solução que bloqueia proteína (PBS IX pH 7,2, caseína a 0,5 % (N-Z amina, Sigma C0626), BSA a 1 % (Sigma A7906), soro de ovelha normal a 1,5 % (Jackson Labs #005-000-001) por 30 minutos à temperatura ambiente. Anticorpo biotinilado (ver anterior) foi aplicado nas lâminas por diluição na solução que bloqueia proteína. A incubação das lâminas com o anticorpo biotinilado foi realizada a temperatura ambiente por 2 horas. As lâminas foram rinsadas 3X em tampão de lavagem (TBS IX, Tween 20 a 0,01 %). A detecção de anticorpo foi realizada usando um estojo de vectastaina (Vector Laboratories). As lâminas foram lavadas e contracoradas com hematoxilina. As lâminas foram desidratadas e montadas com lamínulas antes da visualização.

[0323] Resultados: São apresentados na figura 6A os resultados de uma análise IHC de tecido cerebral humano corado com vários anticorpos anti-IFNAR1 e controle. Os anticorpos MDX- 1333 (75 μg/mL) e 4G5 (50 μg/mL) exibiram forte coloração do tecido cerebral da maneira exemplificada pala coloração marron/negro observada em todas as amostras. O anticorpo 9D4 (50 μg/mL) não cora a amostra de tecido cerebral humano, bem como MDX- 1333 e 4G5, da maneira demonstrada pela coloração marrom/negra reduzida em toda a amostra. Um isotipo IgGl controle foi incluído para demonstrar que a especificidade de ligação dos anticorpos individuais.

[0324] São apresentados na figura 6B os resultados de uma análise IHC de monócitos corados com vários anticorpos anti-IFNAR1 e controle. Os anticorpos MDX- 1333 (50 e 20 μg/mL), 4G5 (50 μg/mL) e 9D4 (50 e 20 μg/mL) exibiram todos coloração proeminente em monócitos humanos da maneira demonstrada pela coloração marron/negra das amostras. O isotipo controle do anticorpo R3-47 (50 μg/mL) não exibiu coloração proeminente em monócitos humanos. Além do mais, MDX- 1333(50 μg/mL) não coraram macrófagos de camundongo modificados.

[0325] Conclusões: Em estudo de IHC o anticorpo 9D4 anti-IFNAR1 exibiu um menor nível de coloração comparado a outros anticorpos anti-IFNAR1, tais como MDX- 1333 e 4G5. 6.2 Exemplo 2: Geração de anticorpo 9D4 TM

[0326] O anticorpo anti-IFNAR1 modificado designado "9D4-TM" foi gerado por meio do seguinte procedimento;

[0327] Fc Y1 humano foi clonado e modificado geneticamente a partir de PBLs humanas isolando primeiro o RNA total, transcrevendo cDNA e amplificando por PCR as regiões constantes com oligoiniciadores de genes específicos contendo sítios de restrição Apa I e EcoRI para clonagem no vetor PEE6 de mamífero. O mutante triplo (TM) inclui três mudanças de aminoácido em IgG humana para diminuir a função efetora de ADCC (L234F, L235E, e P331S). O TM foi modificado geneticamente usando IgGl humana (KOL) com um molde, e utilizando mutagênese sítio direcionada (QuickChange XL, Stratagene) para codificar três mudanças de resíduo no Fc. As sequências dos oligoiniciadores mutagênicos usada para codificar as mudanças em L234F/L235E/P331S foram da maneira a seguir: MD 1056 = 5' cgtgcccagcacctgaaTtcGAggggggaccgtcagtcttc 3'L234F, L235E sentido (SEQ ID NO:43) MD 1057 = 5' gaagactgacggtccccccTCgaAttcaggtgctgggcacg 3' L234F, L235E antissentido (SEQ ID NO:44) MD 1058 = 5' ccaacaaagccctcccagccTccatcgagaaaaccatctcc 3' P331S sentido (SEQ ID NO:45) MD 1059 = 5 ' ggagatggttttctcgatggAggctgggagggctttgttgg 3 ' P331 S antissentido (SEQ ID NO:46)

[0328] Os clones que codificam o anticorpo 9D4-TM foram sequenciados para confirmar as mutações triplas, e separados no analisador genético ABI3100. 6.3 Exemplo 3: Geração de anticorpo 9D4 DM

[0329] O anticorpo anti-IFNAR1 modificado designado "9D4-DM" foi gerado por meio do seguinte procedimento;

[0330] O Fc Y4 humano foi clonado e modificado por engenharia a partir de PBLs humanos isolando primeiro o RNA total, transcrevendo o cDNA, e amplificando por PCR as regiões constantes com oligoiniciadores de genes específicos contendo sítios de restrição Apa I e EcoRI para clonagem no vetor PEE6 de mamífero.

[0331] O mutante duplo (DM) consiste em duas mutações em Fc de IgG4 humana: S228P e L235E. Oligoiniciadores mutagênicos para codificar DM incluem: MD 1060 = 5' ggtcccccatgcccaCcatgcccagcacctg 3' dobradiça S228P sentido (SEQ ID NO:47) MD 1061 = 5' caggtgctgggcatgGtgggcatgggggacc 3' dobradiça S228P antissentido (SEQ ID NO:48) MD 1062 = 5 ' ccagcacctgagttcGAggggggaccatcagtc 3 'IgG4 L234F, L235E sentido (SEQ ID NO:49) MD 1063 = 5' gactgatggtccccccTCgaactcaggtgctgg 3' IgG4 L234F, L235E antissentido (SEQ ID NO:50)

[0332] Os clones que codificam o anticorpo 9D4-DM foram sequenciados para confirmar as mudanças codificadas, e separados no analisador genético ABI3100. 6.4 Exemplo 4 Anticorpos anti-IFNAR1 inibem fosforilação STAT mediada por IFN.

[0333] Propósito: Estabelecer a capacidade do anticorpo anti-IFNAR1 9D4-TM de inibir a fosforilação STAT mediada por IFN em células mononucleares do sangue periférico.

[0334] Métodos: Células mononucleares do sangue periférico foram purificadas a partir de doadores humanos saudáveis usando meio LSM (MP Biomedical, Solon OH). PBMCs foram quantificados e semeados em 106 células por condição por poço. Anticorpos foram adicionados em 10 μg/mL aos poços apropriados e incubados a 37 °C, CO2 a 5 % por 10 minutos. Após a pré-incubação com anticorpos, IFN α2a humano recombinante (PBL Biomedical, Piscataway NJ) ou IFN derivado de célula dendrítica plasmacitóide humana (ver a seguir para geração de sobrenadantes de IFN tipo I derivados de PDCs) foi adicionado aos poços apropriados em 100 ou 500IU/mL por 20 minutos. As células foram centrifugadas a 1.200 rpm por 5 minutos e lavadas com PBS IX estéril. Após uma centrifugação adicional, PBS foi removido e as células foram lisadas usando reagente de extração de proteína de mamífero (Pierce, Rockford IL) suplementado com 300 μL de coquetéis de inibidor de fosfatase IX 1 e 2 (Sigma, St. Louis MO) e inibidor de protease IX (Roche Biomedical, Nutley NJ). Os lisados foram incubados por 10 minutos em um agitador orbital para assegurar a lise completa, transferidos para tubos do microfugue e centrifugados a 14.000 rpm para remover restos celulares. O tampão de amostra NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad CA) e dTT (Sigma, St. Louis MO) foram adicionados aos lisados para uma concentração final de Ix e todas as amostras foram desnaturadas em um bloco aquecido a 100 °C por aproximadamente 10 minutos. 15 μL de cada amostra foram adicionados ao gel de poliacrilamida Bis-tris a 10 % NuPage (Invitrogen, Carlsbad CA) em tampão de corrida NuPAGE MES SDS suplementado com tampão antioxidante NuPAGE Ix. As amostras correram a 180V por 30 minutos para separação de bandas de proteína. As proteínas foram então transferidas para uma membrana de nitrocelulose e as manchas foram bloqueadas com PBS Ix (Gibco BRL, Carlsbad CA) contendo BSA a 5 % (Sigma, St. Louis MO) por toda a noite a 4 °C. O meio de bloqueio foi subsequentemente removido e 0,2 μg/mL de anticorpos anti-STATl, anti- STATl pY701, ou diluição 1 :1.000 de β-actina (Cell Signaling Technology, Danvers MA) foi adicionado às manchas apropriadas e incubado por toda a noite a 4 °C. As manchas foram lavadas 3 vezes em TBS IX com Tween20 a 0,05 % (Sigma, St. Louis MO). Anticorpo secundário anti-coelho conjugado com HRP diluído 1:2.500 foi adicionado às manchas e incubado por 1 hora a temperatura ambiente. As manchas foram lavadas da maneira descrita anteriormente e 3mL de uma mistura 1:1 de reagente Pico Supersignal West (Pierce, Rockford IL) foram adicionados a cada mancha por 1 minuto. As manchas foram drenadas, o excesso de reagente foi removido e bandas foram visualizadas usando um Kodak X- omat 1000A Processor.

[0335] Resultados: São apresentados na figura 7 os resultados de um ensaio de ativação STAT no qual as células estimularam IFN de leucócito na presença ou ausência de anticorpos anti-IFNAR1. Na ausência de anticorpos, interferon de leucócito estimula a fosforilação de STAT isoformas 1, 3 e 5. A incubação de células com anticorpo 9D4-TM anticorpo inibe a fosforilação mediada por tratamento com interferon de leucócito. Células tratadas com o anticorpo R3-47 isotipo controle não exibem inibição de fosforilação de STAT em resposta ao estímulo com interferon de leucócito.

[0336] Conclusões: Os resultados na figura 7 demonstram que 9D4-TM é capaz de inibir respostas a IFNα, tal como a indução de fosforilação STAT em células mononucleares do sangue periférico. 6.5 Exemplo 5: Anticorpos anti-IFNAR1 inibem a sinalização de IFN tipo I.

[0337] Propósito: Usando IFN tipo I purificado de células pDC, um ensaio repórter foi usado para testar a capacidade de anticorpos anti- IFNAR1 bloqueares a sinalização IFN tipo I.

[0338] Métodos: Células dendríticas plasmocitóides (PDCs) foram isoladas do sangue total de doadores saudáveis usando um meio de separação de linfócito (MP Biomedical, Solon OH) seguido por seleção positiva usando CD304 (BDCA-4/Neuropilina-l) estojo MicroBead (Milteny Biotec, Auburn CA). As PDCs purificadas foram então cultivas em 1x106 células/mL em RPMI 1640 suplementado com FBS a 10 % (Gibco BRL) e 6 μg/mL de CpGA (InVivogen, San Diego CA). Os sobrenadantes foram colhidos e clarificados após 20 horas em cultura e o IFN tipo I foi quantificado usando uma linhagem celular repórter HEK293-ISRE estavelmente transfectada contra uma curva padrão de IFN de leucócito humano (PBL Biomedical, Piscataway NJ).

[0339] As pDCs de três doadores humanos saudáveis foram usadas para gerar sobrenadantes de interferon tipo I derivado de pDC humana, da maneira descrita anteriormente. Células HEK293 (ATCC, Manassas VA) foram transfectadas estavelmente com plasmídeo relatado pHTS-ISRE (Biomyx Technology, San Diego CA) e foram mantidas em DMEM suplementado com FBS a 10 %, NEAA Ix, e 700 μg/mL de G418 (Invitrogen, Carlsbad CA). As células foram semeadas em uma concentração de 80.,000 células por poço em placas de 96 poços brancos/claros Optilix (VWR, West Chester PA). As concentrações apropriadas de anticorpos (611 - 0,00004nM) foram adicionadas a cada poço seguido por adição de concentrações apropriadas de sobrenadantes de interferon tipo I derivado de PDC humana. As células, IFN e anticorpos foram incubados por toda a noite a 37 °C, CO2 a 5 % e a amplificação da proteína luciferase foi avaliada lisando as células com reagente de lise de cultura celular e a visualização ocorreu usando o sistema de ensaio da luciferase (Promega, Madison WI). O sinal foi medido em cps e os valores IC50 foram gerados.

[0340] Resultados: os sobrenadantes de IFN tipo I foram colhidos das células pDC derivadas de três doadores individuais. Em um ensaio de gene repórter com luciferase a incubação de anticorpos anti- IFNAR1 inibiu a capacidade de sinalização de várias concentrações do sobrenadante de IFN tipo I (Figura 8).

[0341] Conclusões: Estes resultados demonstram que anticorpos anti-IFNAR1 são capazes de inibir sinalização mediada por IFN tipo I, da maneira medida por atividade de ensaio repórter. 6.6 Exemplo 6: Anticorpos modificados anti-IFNARl exibem características de ligação similares ao anticorpo não modificado parental.

[0342] Propósito: Investigar as características de ligação de IFNAR1 de anticorpos modificados, comparado às versões parentais não modificadas. São representadas na figura 9 as curvas de afinidade de a ligação para 9D4, 9D4DM, e 9D4TM. As constantes de ligação (Kd) para os anticorpos 9D4, 9D4DM, e 9D4TM anti-IFNAR1 foram determinadas a partir das curvas de ligação.

[0343] Métodos: 200.000 células HEK 293F foram semeadas em uma placa de 96 poços de fundo redondo usando 50 μL de meio RPMI 1640 suplementado com FBS a 10 %. 9D4-TM marcado com európio foi preparado por contrato coma PerkinElmer Life e Analytical Sciences. Para medir o sinal não específico de európio, 25 μL de anticorpos anti-IFNAR1 diluídos em série não marcados em excesso 100 vezes foram adicionados aos poços apropriados das placas de 96 poços por 5-10 minutos antes da adição de 9D4-TM marcado. 25 μL de anticorpo diluído em série conjugado com európio foram então adicionados aos poços apropriados e células e anticorpos foram agitados gentilmente à temperatura ambiente por 1-2 horas. Após incubação de ligação, 150 μL de meio celular foram adicionados a todos os poços e as placas foram centrifugadas a 1.200 rpm por 5 minutos a temperatura ambiente. As placas decantaram rapidamente e 250 μL de meio celular foram adicionados a todos os poços. Centrifugações e lavagens foram repetidas para um total de 3 lavagens. As células foram então ressuspensas em 100 μL de meio celular. 50 μL de células ressuspensas foram transferidas para 200 μL de solução de melhoria DELPHIA (PerkinElmer) em uma placa microtitulada DELPHIA amarela e a emissão de európio foi medida em um leitor Victor2 Multilabel (PerkinElmer). O sinal foi medido em cps e valores Kd e valores Bmax foram gerados usando software de análise GraphPad Prism 4.

[0344] Resultados: Os dados representados na figura 9 demonstram que os anticorpos modificados 9D4-TM e 9D4-DM exibem afinidades de ligação similares para IFNAR1 (9D4 = 0,06 +/- 0,02 nM, 9D4-DM = 0,06 +/- 0,02 nM, 9D4-TM = 0,03 +/- 0,01 nM) com o anticorpo parental não modificado.

[0345] Conclusões: Os dados apresentados neste exemplo demonstram que os anticorpos modificados compartilham características de ligação de IFNAR1 similares com os anticorpos parentais não modificados. 6.7 Exemplo 7: Dados de ensaio de ligação de equilíbrio para 9D4-TM vs. sIFNαRI

[0346] Propósito: Determinar dados de ligação em equilíbrio para 9D4-TM usando IFNAR1 solúvel (srIFNARl).

[0347] Métodos: O ligante de srIFNARl foi revestido em microesferas UltraLink® Biosupport (PIERCE, Rockford, IL) em concentrações de 5 μg/mL e 50 μg/mL em tampão revestimento (tampão de carbonato de sódio 50 mM, pH 9) por um período de 1-2 dias a 4 °C. As microesferas revestidas foram então separadas (rápida centrifugação) da solução de ligante não reagido, e balançadas gentilmente em tampão de bloqueio (1 mL de Tris IM, pH8, contendo BSA a l0 mg/mL) por cerca de 15 minutos à temperatura ambiente (RT). Após isto, a lama da microesfera foi novamente centrifugada para remover a solução de bloqueio, e então a etapa de bloqueio foi repetida por cerca de 2 horas em temperatura ambiente usando uma alíquota fresca de tampão de bloqueio. Após a etapa de bloqueio, as microesferas revestidas foram armazenadas a 4 °C até serem usadas. Antes do uso, as microesferas revestidas com srIFNARl foram transferidas para uma garrafa de microesferas, ressuspensas em 27 mL de tampão de corrida do instrumento (PBS, pH 7,4 -NaN3 0,02 %), e então anexadas ao instrumento KinExA 3000.

[0348] Todas as constantes de ligação de equilíbrio (KD) foram obtidas de medições realizadas em um instrumento KinExA 3000 (Sapidyne Instruments, Boise, ID). Resumidamente, IgG 9D4-TM foi preparada em 1pM, l0pM e 50pM e dispensada em três séries de tubos. Esta variação de concentrações IgG foi projetada para permitir que medições sejam feitas tanto em condições receptoras quanto em condições controladas de KD. Diluições em série de duas vezes de ligante de srIFNARl foram então tituladas através destas soluções de IgG, em concentrações que variam de 19,5fM - 1nM. Com base no que foi fornecido pelo fabricante em simulações teóricas de curva disponíveis através do software (Sapidyne Instruments, Boise, Idaho), estas misturas de equilíbrio foram incubadas em qualquer lugar por 2-6 dias em temperatura ambiente. No final deste período, os experimentos que testam sinais foram conduzidos para determinar as condições de corrida apropriadas. A detecção de anticorpo livre foi possível usando um reagente de anticorpo secundário marcado com Cy5 espécie- específico (Cy5 AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Part #109-176-097, Jackson Immuno Research Laboratories) empregado em 0,1, 1,0 ou 2,0 μg/mL de PBS, pH 7,4 -NaN3 0,02 % contendo BSA em 1 mg/mL. Os dados obtidos dos experimentos foram então simultaneamente ajustados usando o software fornecido de características de análise de n- curva para obter a constante de ligação (KD) relatada.

[0349] Resultados: São representadas na figura 10A as curvas de ligação para três concentrações de 9D4-TM (1 pM, 10 pM, e 50 pM) com sIFNαRI. Os dados obtidos de pelo menos três experimentos independentes foram ajustados em um software derivado da curva de ligação para estabelecer uma KD relativa para 9D4-TM. Determinou-se que a KD de 9D4-TM neste ensaio de ligação é 1,1 pM com um intervalo de confiança de 95 % de 0,603 pM - 1,8 pM. O erro percentual da determinação da KD de 1,1 pM foi 1,96 %. Também determinou-se que a Kon e Koff para 9D4-TM é 7 x 106 +/- 1,3 x 106 S-1 e 7,7 x 10-6 +/- 1,57 x l0-6 1/Ms respectivamente (dados não mostrados).

[0350] Conclusões: O anticorpo anti-IFNAR1 9D4=TM modificado exibe uma KD muito baixa de aproximadamente 1,1 pM, para sIFNARl da maneira determinada pelo ensaio KinExa. 6.8 Exemplo 8: Determinação de afinidade de ligação de 9D4-TM em PBMCs de humanos

[0351] Propósito: Determinar a afinidade de ligação em PBMCs de humanos.

[0352] Métodos: Células mononucleares do sangue periférico foram purificadas de doadores humanos saudáveis usando meio LSM (MP Biomedical, Solon OH). As células foram contadas e 200.000 células foram semeadas em uma placa de 96 poços de fundo redondo usando 50 μL de meio RPMI 1640 suplementado com FBS a 10 %. 9D4-TM marcado com európio foi preparado por contrato com PerkinElmer Life e Analytical Sciences. Para medir o sinal de európio não específico, 25 μL de 9D4-TM diluído em série não marcado em excesso 100 vezes foram adicionados aos poços apropriados da placa de 96 poções por 5-10 minutos antes da adição de 9D4-TM marcado. 25 μL de 9D4-TM diluído em série conjugado com európio foram então adicionados aos poços apropriados e células e anticorpos foram agitados gentilmente à temperatura ambiente por 1-2 horas. Após incubação de ligação, 150 μL de meio celular foram adicionados a todos os poços e as placas foram centrifugadas a 1.200 rpm por 5 minutos à temperatura ambiente. As placas decantaram rapidamente e 250 μL meio celular foram adicionados a todos os poços. Centrifugações e lavagens foram repetidas por um total de 3 lavagens. As células foram então ressuspensas em 100 μL de meio celular. 50 μL de células ressuspensas foram transferidas para 200 μL de solução de melhoria DELPHIA (PerkinElmer) em uma placa de microtitulação amarela DELPHIA e a emissão de európio foi medida em um leitor Victor2 Multilabel (PerkinElmer). O sinal foi medido em cps e valores Kd e valores Bmax foram gerados usando software de análise GraphPad Prism 4.

[0353] Resultados: Usando as medições de afinidade documentadas na figura 10B determinou-se que a Kd para ligação de 9D4- TM a PBMCs de humanos foi 0,29 nM +/- 0,11 nM com o número de sítios de ligação determinado como 1.448 +/- 447. Usando uma abordagem similar, determinou-se que a constante de ligação de afinidade para IFNAR de macaco cinomolgo é 0,65 +/- 0,42 nM com a determinação de que número de sítios de ligação é 648 +/-204 (dados não mostrados).

[0354] Conclusões: Os resultados que são apresentados na figura 10B demonstram que 9D4-TM se liga especificamente e com alta afinidade a PBMCs de humanos. 6.9 Exemplo 9: Os anticorpos modificados anti-IFNAR1 exibem eficácia similar com o anticorpo parental não modificado.

[0355] Propósito: Demonstrar que anticorpos anti-IFNAR2 modificados (isto é anticorpos anti-IFNAR1 com menor afinidade ao ligante de Fc) exibem eficácia similar com os anticorpos parentais não modificados.

[0356] Métodos: O sistema de ensaio de gene repórter com luciferase usado neste exemplo foi previamente descrito (Ver exemplo 3). Os anticorpos de IFNAR1 usados neste exemplo incluem 9D4, 9D4-DM, 9D4- TM, MDX- 1333. É incluído um anticorpo controle R3-47.

[0357] Resultados: Usando o sistema repórter da luciferase, os valores IC50 foram gerados para os vários anticorpos anti-IFNAR1 descritos anteriormente (Ver figura 1 IA). O anticorpo 9D4 anti-IFNAR1 (0,01 nM) e os anticorpos modificados, tais como 9D4-DM (0,01 nM) e 9D4- TM (0.02 nM), elicitaram cada qual um valor IC50 similar no ensaio repórter, demonstrando que exibem uma eficácia similar. Um outro anticorpo anti- IFNAR1, MDXl 333 (0,04 nM) também exibe uma eficácia similar com o anticorpo não modificado 9D4. O isotipo controle não inibe a sinalização mediada por IFN tipo I neste ensaio de gene repórter com luciferase.

[0358] Conclusões: Anticorpos modificados anti-IFNAR1 compartilham eficácias similar às versões não modificadas, como demonstrado para valores IC50 gerados em um sistema de ensaio de gene repórter com luciferase projetado para quantificar eventos de sinalização de IFN. 6.10 Exemplo 10: 9D4-TM inibe a atividade de múltiplas isoformas de interferon tipo I alfa

[0359] Propósito: Demonstrar que 9D4-TM inibe a sinalização atribuída a isoformas específicas e múltiplas de interferon alfa.

[0360] Métodos: O sistema de ensaio de gene repórter com luciferase usado neste exemplo foi previamente descrito (Ver exemplo 5).

[0361] Resultados: Os valores IC50 para a inibição mediada por 9D4-TM da atividade de interferon tipo I são apresentados na tabela 4. Tabela 4: Valores IC50 para inibição mediada por 9D4-TM da atividade de interferon tipo I

[0362] Como mostrado, 9D4-TM exibe valores IC50 na faixa sub-nanomolar para isoformas múltiplas de interferon alfa, interferon de leucócito e interferon omega.

[0363] Conclusões: O anticorpo anti-IFNAR1 9D4-TM modificado demonstrada a capacidade de inibir o sinalização atribuída a subtipos múltiplos de específicos de interferon alfa, bem como interferon alfa de leucócito em um ensaio repórter. 6.11 Exemplo 11: Determinação de ponto isoelétrico de 9D4, 9D4DM e 9D4TM

[0364] Propósito: Avaliar as características biofísicas do anticorpo 9D4 não modificado parental em comparação aos anticorpos 9D4DM e 9D4-TM modificados.

[0365] Métodos: Análise de eletroforese em gel de poliacrilamida que foca em isoelétrico nativo (IEF-PAGE) foi realizada da maneira a seguir: géis com anfolina pré moldados (Amersham Bio sciences, pI na faixa de 3,5-9,5) foram carregados com 8 μg de proteína. Amostras de proteína foram dializadas em histidina 10 mM pH-6 antes de carregar no gel. Os padrões marcadores de ampla faixa de pI (Amersham, pI na faixa de 3-10 8, μL) foram usados para determinar pI relativo para Mabs. A eletroforese foi realizada em 1.500 V, 50 mA por 105 minutos. O gel foi fixado por 45 minutos usando uma solução de fixação Sigma (5x) diluída com água purificada para obter Ix. A coloração foi realizada por toda a noite a temperatura ambiente usando corante simplesmente azul (Invitrogen). A descoloração foi realizada com uma solução que consistia em 25 % de etanol, 8 % de ácido acético e 67 % de água purificada. Pontos isoelétricos foram determinados usando um densitômetro Bio-Rad GS-800 com software Quantity One Imaging.

[0366] Resultados: É representado na figura 12A a determinação do ponto isoelétrico (pI) para anticorpos 9D4WT, 9D4DM e 9D4TM. Amostras dos anticorpos correram de acordo com os métodos anteriores e exibiram as seguintes características. O anticorpo 9D4 WT exibiu bandas de proteína proeminentes que correspondem a 8,2, 8,35 e 8,51. O anticorpo 9D4 DM exibiu uma banda de proteína proeminente única que corresponde a 7,13. O anticorpo 9D4 TM exibiu bandas de proteína proeminentes que correspondem a 8,09 e 8,18.

[0367] Conclusões: Da maneira apresentada neste exemplo, os anticorpos 9D4-DM e 9D4-TM modificados exibem características biofísicas muito similares (pI) ao anticorpo 9D4 não modificado parental. 6.12 Exemplo 12: Termoestabilidade de 9D4, 9D4-DM e 9D4-TM

[0368] Propósito: Avaliar as características biofísicas do anticorpo 9D4 não modificado parental em comparação aos anticorpos 9D4DM e 9D4-TM modificados.

[0369] Métodos: Calorimetria de varredura diferencial foi realizada da maneira a seguir: as temperaturas de fusão térmica (Tm) foram medidas com um VP-DSC (MicroCal, LLC) usando uma taxa de varredura de 1,0 °C/min e uma faixa de temperatura de 20 - 110 °C. Um período de filtragem de 8 segundos foi usado junto com uma pré-varredura de 15 minutos. As amostras foram preparadas por diálise em histidina- HCl 10 mM pH 6 usando cassetes para diálise da Pierce (3,5 kD). Concentrações de Mab foram 0,14 mg/mL, 0.79 mg/mL e 0,64 mg/mL da maneira determinada por A280. Temperaturas de fusão foram determinadas seguido procedimentos do fabricante, usando software original fornecido pelo sistema. Resumidamente, linhas de base múltiplas correram com tampão tanto na célula da amostra quanto na de referência para estabelecer equilíbrio térmico. Após a linha de base ter sido subtraída do termograma da amostra, os dados tiveram concentração normalizada.

[0370] Resultados: Os anticorpos 9D4, 9D4-DM, 9D4-TM foram submetidos a calorimetria de varredura diferencial, da maneira detalhada anteriormente, com os resultados apresentados na figura 12B. Cada um dos anticorpos estudados exibiu temperaturas de fusão similares no ensaio. Especificamente, os anticorpos exibiram as seguintes temperaturas de fusão; 9D4 WT = 70,41 °C, 9D4-DM = 70,41 °C e 9D4-TM = 70,88 °C.

[0371] Conclusões: Da maneira apresentada neste exemplo, os anticorpos 9D4-DM e 9D4-TM modificados exibem características biofísicas muito similares (Tm) ao anticorpo 9D4 não modificado parental. 6.13 Exemplo 13: Anticorpos anti-IFNAR substitutos protegem camundongos de proteinúria induzida por IFNα.

[0372] Propósito: Demonstrar que anticorpos anti-IFNAR protegem camundongos da proteinúria induzida em um modelo de SLE.

[0373] Métodos: Camundongos F1 NZB/W fêmeas foram comprados de Jackson Labs e alojados em instalação de barreiras sem patógeno. O vetor de adenovírus recombinante contendo o IFNα de camundongo subtipo 5 cDNA no controle do promotor/melhorador de CMV (Adv- mIFNα5) foi usado para induzir lúpus precoce nestes camundongos. Camundongos (8 camundongos/grupo) foram tratados com 8-11 semanas com uma injeção intravenosa única de 0,3 x 1010 de partículas virais de Adv- mIFNα5 (vp). O controle recebeu a mesma quantidade de partículas Adv controle. Em alguns experimentos, os camundongos foram injetados com doses graduais de Adv-mIFNα5 que variam de 0,01 x l010 a 1,0 x 1010 vp/camundongo. Para restar a eficiência de anti-IFNAR1, os camundongos foram tratados com dosagem intraperitoneal por 5 dias sucessivos de anticorpo a 10 mg/kg iniciando ao mesmo tempo da distribuição de Adv. Para proteinúria, a urina foi testada usando uma vareta de nível (Chemstrip 2 GP; Roche Diagnostics). A proteinúria foi classificada como 1 para níveis de 30 mg/dL, 2 para 100 mg/dL e 3 para níveis > 500 mg/dL. Considerou-se que os camundongos têm proteinúria se duas amostras de urina consecutivas são classificadas como 2 ou mais.

[0374] Resultados: Os resultados dos camundongos infectados por adenovírus tratados com anticorpos anti-IFNAR1 são apresentados na figura 13. Os camundongos infectados com Adv-mIFNα5 exibem proteinúria com um início de cerca de 3 semanas. Os camundongos infectados tratados com anticorpo IgG de camundongo controle não são protegidos do início da proteinúria com relação ao curso do experimento da maneira demonstrada por um início de proteinúria de cerca de 4 semanas. Os camundongos tratados com anticorpos anti-IFNAR não mostram evidência de proteinúria durante o curso das 8 semanas. Os camundongos tratados com um adenovírus controle não mostram nenhuma proteinúria com relação ao curso de tempo experimental.

[0375] Conclusões: Obtidos juntos, os dados neste exemplo demonstram que a presença de anticorpos anti-IFNAR é protetora contra proteinúria induzida por adv-IFN em um modelo de camundongo in vivo. 6.14 Exemplo 14: Anticorpos anti-IFNAR bloqueiam regulação de gene induzido por IFN tipo I

[0376] Propósito: Demonstrar que anticorpos anti-IFNAR1 inibem ou reduzem regulação de gene por interferon tipo I em um modelo de camundongo de SLE.

[0377] Métodos: Camundongos dos procedimentos experimentais descritos no exemplo 13 também forneceram amostras para análise neste exemplo. RNA foi preparado de tecidos usando tampão de lise RLT (Qiagen). Para tecidos sólidos (rim, baço, pele), não mais que 50 mg de tecido foram usados para cada período de processamento de RNA. As amostras foram colocadas em tampão de lise e matriz de lise A (Qbiogene), e processadas por 30 segundos a 4,5 m/s usando instrumento homogeneizador Fastprep24 (Thermo Electron Corporation, Waltham, MA). Para PBMC, todas as amostras sanguíneas foram centrifugadas e o precipitado foi lisado em tampão RLT. Mediante lise, as amostras foram congeladas a -80 °C até processamento adicional. Para isolar o RNA, lisados de tecidos descongelados foram primeiro processados usando colunas de centrifugação Qiashredder, a seguir volumes iguais de etanol 70 % foram adicionados aos lisados de tecido e RNA foi purificado usando estojos de coluna de centrifugação Rneasy mini de acordo com as instruções do fabricante.

[0378] O cDNA foi gerado a partir de 3 μg de RNA usando transcriptase antissentido Superscript III e oligo d(T) da maneira descrita no protocolo do fabricante (Invitrogen, Corp. Carlsbad, CA). Amostras de cDNA foram diluídas em água sem nuclease e armazenadas a -80 °C.

[0379] Níveis de expressão de genes selecionados foram medidos por análise de TaqMan® em PCR em tempo real usando o sistema de PCR em tempo real ABI 7900HT Fast (Applied Biosystems, Foster City, CA). B-actina de gene regulador foi usada para controle endógeno. As misturas de reação tiveram um volume final de 20 μL consistindo em 1 μL de cDNA, 2 μL de oligoiniciadores 20x e sondas (TaqMan® Gene Expressão Assays, Applied Biosystems) e 18 μL de mistura mestra de PCR universal rápido diluído TaqMan®. As condições de amplificação foram: 20 segundos a 95 °C, 50 ciclos de 1 segundo a 95 °C e 20 segundos a 60 °C. Os valores CT variam de 0 a 50, com o último número assumido para não representar nenhuma formação de produto. A quantificação de expressão de gene foi realizada usando o método CT comparativo (Sequences Detector User Bulletin 2; Applied Biosystems) e relatadas como as quantas são as diferenças com relação ao gene regulador.

[0380] Resultados: O interferon tipo I expresso ectopicamente em camundongos (Ver exemplo 13) leva à indução de inúmeros genes. São apresentados na figura 14 quantas mudanças de seis genes responsivos de interferon tipo I nas diferentes populações de camundongos são usadas neste experimento. Especificamente, genes IFITl, IFI44, IFI202b, CXCL9, CXCLlO, e CXCLI l são todos induzidos nos camundongos que expressam ectopicamente IFNα e são tratados com IgG de camundongo não específico. Os camundongos que expressam ectopicamente IFNα e são tratados com anticorpos anti-IFNAR não mostram nenhuma indução dos seis genes responsivos de interferon tipo I. Como um controle para demonstrar a especificidade do IFNα codificado pelo adenovírus, os camundongos tratados com PBS ou adenovírus controle não mostram nenhuma indução destes 6 genes. Estes resultados demonstram que a administração de anticorpos anti-IFNAR podem bloquear a resposta de indução de gene indução em IFN alfa em um modelo camundongo in vivo.

[0381] Conclusões: Anticorpos anti-IFNAR podem bloquear a regulação de genes responsivos tipo I em modelo de camundongo SLE. 6.15 Exemplo 15: Anticorpos anti-IFNAR bloqueiam a produção de anticorpos Anti-DNAds e Anti-SSA/Ro (antígeno anti-nuclear) induzidos por interferon tipo I

[0382] Propósito: Demonstrar a capacidade de anticorpos anti-IFNAR bloquearem a produção de anticorpos anti-nucleares, tais como anti-dsDNA e anti-SSa/Ro induzido por interferon tipo I em um modelo camundongo de SLE.

[0383] Métodos: Camundongos foram preparados e tratados da maneira descrita no exemplo 13. Os níveis séricos de autoanticorpos anti-DNAds foram avaliados por ELISA. Resumidamente, placas de ELISA pré-tratadas com poli (L-lisina) (100 μg/mL) foram revestidas com DNA ativado com timo de bezerro (5 μg/mL em tampão de carbonato-bicarbonato) (SIGMA). Após incubação por toda a noite a 4 °C, as placas foram bloqueadas com PBS/ FCS 10 %. Os soros (diluição 1/200) foram incubados por 30 minutos à temperatura ambiente. IgG ligada foi detectada com IgG anti-camundongo ovelha conjugada com peroxidase (1/4.000) (KPL) adicionada às placas por 30 minutos. A ligação foi medida adicionando substrato TMB (KPL) e solução de parada (KPL), e a OD foi lida a 450 nm. Uma IgG de anti-DNAds de camundongo padrão em soro foi corrida em diluição seriada (de 625 ng/mL) (Alfa Diagnostic) em cada placa para permitir a padronização. Os níveis séricos de autoanticorpo anti-SSA/Ro foram medidos por ELISA (Alfa Diagnostic) seguindo as instruções do fabricante.

[0384] Resultados: O interferon tipo I expresso ectopicamente em camundongos (Ver Exemplo 13) leva ao acúmulo de anticorpos anti-DNAds e anti-SSA/Ros. São apresentados na figura 15 as quantidades relativas de anticorpos anti-DNAds (A) e anti-SSA/Ro (B) nas diferentes populações de camundongos (adenovírus controle, Adv-IFNα + PBS, Adv-IFNα+MuIgG, e Adv- IFNα + Anti-IFNAR) da maneira medida por ELISA. Camundongos infectados por adenovírus controle mostram pouco acúmulo de anticorpos anti-DNAds ou anti-SSA/Ros neste experimento. Os camundongos infectados com adenovírus que codificam IFNα e tratados com PBS acumulam anticorpos anti-DNAds e anti- SSA/Ros. Camundongos infectados com adv-IFNα tratados com anticorpos anti-IFNAR adquirem menos anticorpos anti-DNAds e anti-SSA/Ros do que os camundongos infectados com adv-IFNα tratados com IgG não específica. Estes resultados demonstram que tratamento com anticorpos anti-IFNAR inibe o acúmulo de anticorpos anti-DNAds e anti-SSA/Ros em resposta a IFN tipo I expresso ectopicamente. 6.16 Exemplo 16 : Anticorpos anti-IFNAR bloqueiam a produção de IP- 10 e IL- 18 induzidas por interferon tipo I

[0385] Propósito: Demonstrar a capacidade de anticorpos anti-IFNAR bloquearem o acúmulo de citocinas induzidas por IFNα em um modelo de camundongo de SLE.

[0386] Métodos: Os camundongos dos procedimentos experimentais descritos no exemplo 13 também forneceram amostras para análise neste exemplo. Os níveis séricos de citocinas foram medidos por ELISA (R&D sistemas) seguindo as instruções do fabricante.

[0387] Resultados: O interferon tipo I expresso ectopicamente em camundongos (Ver Exemplo 13) leva ao acúmulo de citocinas IP-10 e IL- 18. São apresentados na figura 16 as quantidades relativas de IP-10 (A) e IL-18 (B) nas diferentes populações de camundongos (PBS, adenovírus controle, Adv-IFNα+MuIgG, e Adv-IFNα + Anti-IFNAR) da maneira medida por ELISA. O interferon tipo I expresso ectopicamente em camundongos (Ver Exemplo 12) leva ao acúmulo das citocinas, IP-10 e IL- 18. Camundongos infectados por adenovírus controle mostram pouco acúmulo de citocinas IP-10 (A) ou IL-18 (B) neste experimento. Os camundongos infectados por Adv-IFNα tratados com anticorpos anti-IFNAR acumulam menos citocinas IP-10 e IL-18 do que os camundongos infectados por Adv-IFNα tratados com IgG não específica. Estes resultados demonstram que tratamento com anticorpos anti- IFNAR inibem o acúmulo das citocinas IP-10 e IL-18 em resposta ao IFN tipo I expresso ectopicamente.

[0388] Conclusões: Anticorpos anti-IFNAR são capazes de bloquear o acúmulo de citocinas induzidas por IFNα em um modelo de camundongo de SLE. 6.17 Exemplo 17: Anticorpos anti-IFNAR bloqueiam a produção de ANA (anticorpos anti-nucleares) induzidos por interferon tipo I

[0389] Propósito: Para demonstrar a capacidade de anticorpos anti-IFNAR bloquearem o acúmulo de anticorpos anti-nucleares induzidos por IFNα em um modelo de camundongo de SLE.

[0390] Métodos: Os camundongos dos procedimentos experimentais descritos no exemplo 13 também forneceram amostras para análise neste exemplo. Níveis de anticorpo antinuclear (ANA) foram medidos por estojo de teste ANA (Antibodies Incorporated) com substrato estabilizado Hep-2 e figuras mitóticas seguindo a instrução do fabricante. O soro foi diluído em série e incubado com as células Hep-2 em lâminas e o anticorpo antinuclear ligado foi detectado por IgG anti-camundongo ovelha marcada com Hi-FITC (H+L) (Antibodies Incorporated). O título de ANA é definido como o fator de diluição do soro, onde o ANA não é mais detectável.

[0391] Resultados: O interferon tipo I expresso ectopicamente em camundongos (Ver Exemplo 13) leva ao acúmulo de anticorpos anti-ANA. É apresentada na figura 17 a titulação sérica de anticorpos anti- ANA nas diferentes populações de camundongos (sem vírus, adenovírus controle, Adv-IFNα + PBS, Adv-IFNα+MuIgG, e Adv-IFNα + Anti-IFNAR) da maneira medida por coloração de diluição seriada em células HEP2. Os camundongos infectados por adenovírus controle mostram pouco acúmulo de anticorpos anti- ANA neste experimento. Os camundongos infectados com adenovírus que codificam IFNα e tratados com PBS acumulam anticorpos anti-ANA. Os camundongos infectados por Adv-IFNα tratados com anticorpos anti-IFNAR adquirem menos anticorpos anti-ANA do que os camundongos infectados por Adv-IFNα tratados com IgG não específica. Estes resultados demonstram que tratamento com anticorpos anti- IFNAR inibe o acúmulo de anticorpos anti-ANA em resposta ao IFN tipo I expresso ectopicamente.

[0392] Conclusões: Anticorpos anti-IFNAR são capazes de bloquear o acúmulo de anticorpos anti- nucleares induzidos por IFNα em um modelo de camundongo de SLE. 6.18 Exemplo 18: Inibição de anticorpo do desenvolvimento de célula dendrítica mediada por plasma de SLE

[0393] Propósito: O plasma de SLE induz o desenvolvimento de célula dendrítica de monócitos humanos normais. Neste exemplo, o anticorpo monoclonal 9D4-TM purificado foi testado para a inibição do desenvolvimento de célula dendrítica, da maneira avaliada pela capacidade dos anticorpos inibirem a indução dos marcadores celulares superficiais CD38 e CD123 por plasma de SLE.

[0394] Métodos: Os métodos foram previamente descritos em pedido de patente U.S. 20006/0029601 que é aqui incorporado pela referência na sua íntegra. Essencialmente, os experimentos foram conduzidos da maneira a seguir: 25 mL de uma camada de células brancas foram diluídos quatro vezes com salina tamponada fosfatada (PBS). A amostra foi separada em tubos cônicos de 4x50 mL, e 15 mL de meio de separação de linfócito (ICN Biomedicals) foram dispostos em camadas. Após uma centrifugação de 30 minutos 500 g, a camada de células brancas contendo as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foi removida e lavada com PBS. As células foram ressuspensas em meios de cultura contendo soro humano ativado pelo calor a 1 % em 4x l06 células/mL. Os monócitos foram isolados incubando PBMCs (2,0 x 107 células/5 mL/frasco de 25 cm2) por 1,5 hora a 37 °C em meios de cultura, e a seguir lavando as células não aderentes duas vezes. Para indução de maturação de monócito, as células foram incubadas com meio contendo 25 % de plasma humano de voluntários saudáveis ou de pacientes com SLE. Estudos de bloqueio de anticorpo foram conduzidos adicionando 30 μg/mL de anticorpo anti-IFNAR1 ou isotipo controle, IgGl, à cultura. As células foram incubadas por 4 dias, lavadas com PBS, e tratadas com 1:5.000 de Versene por 10 minutos a 37 °C. Quando necessário, as células foram isoladas fragmentando suavemente as células antes de serem lavadas e analisadas. Cada cultura foi ressuspensa em meio de coloração (solução de sal balanceada de Hanks com 0,2 % de bicarbonato de sódio, 0,01 % de azida sódica, EDTA 0,1 mM, HEPES 20 mM, e 2 % de soro fetal bovino) e separada igualmente em seis poços de uma placa V de 96 poços. As células foram centrifugadas a 2.100 rpm em um rotor Sorvall RTH- 750, e ressuspensas em 25 μL de meio de coloração. Um micrograma de anticorpo conjugado com ficoeritrina específica foi adicionado a cada poço e incubado em gelo por 45 minutos. As células foram lavadas três vezes, ressuspensas em 200 μL de 2 % de para-formaldeído em PBS, e analisadas por citometria de fluxo com o FACScalibur da Becton Dickinson. Canais de entrada foram atraídas no gráfico de dispersão v sentido para remover células contaminantes a partir da análise.

[0395] Resultados: Neste experimento, a diferenciação de monócitos humanos em células dendríticas em resposta a IFN derivado do plasma de SLE pacientes bloqueado por tratamento com 9D4-TM foi medida por expressão superficial de dois marcadores de células dendríticas, CD38 e CD123. Na figura 18, amostras múltiplas de soro de pacientes com SLE não aumentaram a expressão superficial de CD38 e CD123 na presença de 9D4- TM. Os valores IC50 para 9D4-TM variaram de 0,02 nM a 0,06 nM tanto para CD38 quanto para CD123.

[0396] Conclusões: O anticorpo anti-IFNAR1 9D4-TM foi capaz de bloquear a capacidade de IFNα derivado de pacientes com SLE para induzir a maturação de pDC da maneira medida por expressão de marcador de superfície celular. 6.19 Exemplo 19: Anticorpos anti-IFNAR suprimem a expressão de CD38, CD123 e CD86 em monócitos estimulados com IFN de leucócitos.

[0397] Propósito: Neste exemplo, os anticorpos 9D4, 9D4DM e 9D4 TM foram testados para a inibição do desenvolvimento de célula dendrítica, da maneira avaliada pela capacidade dos anticorpos inibirem a indução dos marcadores celulares superficiais CD38 e CD123 por IFN de leucócito.

[0398] Métodos: Os monócitos foram isolados do sangue total de doadores saudáveis usando um meio de separação de linfócito (MP Biomedical, Solon OH) seguido por seleção positiva usando estojo de isolamento de monócito II (Milteny Biotec, Auburn CA). Os monócitos purificados foram então cultivados a 1X 106 células/mL em RPMI 1640 suplementado com FBS a 10 % (Gibco BRL). Anticorpos diluídos em série foram preparados em concentrações finais de 3 μg/mL - 20pg/mL nos meios e foram adicionados aos poços apropriados de células. Após pré-incubação de aproximadamente 5 minutos, l00IU/mL de IFN de leucócito humano (PBL Biomedical, Piscataway NJ) foram adicionados aos poços apropriados e as culturas foram incubadas a 37 °C, CO2 5 % por 48 horas após o que a expressão superficial de CD38 e CD 123 foi avaliada. Resumidamente, as células foram precipitadas em 1.200 rpm por 5 minutos e os meios de cultura foram removidos das monocamadas por aspiração seguido por uma lavagem 1x com PBS estéril. O PBS foi removido e 1 mL tampão de dissociação celular estéril (Gibco BRL, Carlsbad CA) ou tripsina a 0,05 % (Invitrogen, Carlsbad CA) foi adicionado aos poços para remover as células das monocamadas. Após 5 minutos e breve agitação, volumes iguais de RPMI 1640 suplementado com FBS a 10 % foram adicionados a cada poço, seguido por duas séries de centrifugação e lavagens com PBS estéril. 50 μL de PBS 1X suplementado com BSA 5 % (Sigma, St. Louis MO) e 10 μg/mL IgG humana total (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove PA) foram adicionados a cada poço para bloquear anticorpo de ligação Fc não específica e incubados por 10 minutos a temperatura ambiente. 50 μL de PBS 1X suplementado com BSA 5 % e anticorpos PE-anti-humano CD123 e FITC-anti-humano CD38 (Becton Dickinson, Franklin Lakes NJ) foram adicionados aos poços apropriados e incubados por 30 minutos no gelo. As células foram lavadas uma vez em PBS 1X suplementado com BSA 5 % e expressão protéica superficial foi medida em um BD LSRII (Becton Dickinson, Franklin Lakes NJ).

[0399] Resultados: São apresentadas na figura 19 as curvas de supressão de expressão de CD38 (A), CD 123 (B), e CD86(C) exibidas por PBMCs estimuladas por IFN de leucócito incubado com anticorpos anti- IFNAR 9D4, 9D4DM, e 9D4TM. Para cada molécula CD, os anticorpos anti- IFNAR elicitaram curvas de supressão similares que foram utilizadas para gerar valores IC50. Para a expressão de CD38 em PBMCs estimuladas com IFN de leucócito (A), os anticorpos anti-IFNAR elicitaram valores IC50 da maneira a seguir: 9D4=4,3 ng/mL, 9D4DM=40 ng/mL, 9D4TM=25 ng/mL. Para a expressão de CD 123 em PBMCs estimuladas com IFN de leucócito (B), os anticorpos anti- IFNAR elicitaram valores IC50 da maneira a seguir: 9D4=7 ng/mL, 9D4DM=21 ng/mL, 9D4TM=10 ng/mL. Para a expressão de CD86 em PBMCs estimuladas com IFN de leucócitos (C), os anticorpos anti- IFNAR elicitaram valores IC50 da maneira a seguir: 9D4=20 ng/mL, 9D4DM=20 ng/mL, 9D4TM=26 ng/mL.

[0400] Conclusões: Os resultados neste exemplo demonstram que anticorpos da invenção, 9D4-DM e 9D4-TM exibem curvas de supressão similares de indução de IFN de marcadores celulares superficiais de pDC comparado ao anticorpo 9D4 parental. 6.20 Exemplo 20: Anticorpos anti-IFNAR1 modificados exibem menor ligação ao receptor Fc de FCYRI.

[0401] Propósito: Demonstrar a menor ligação de um receptor específico Fc aos anticorpos modificados anti-IFNAR1.

[0402] Métodos: A atividade de ligação de anticorpos 9D4DM e 9D4-TM modificados em FCYRI humano (CD64) foi avaliada por ELISA. FCYRI em PBS (pH7.4) foi revestido em 25 μL/poço em uma placa de microtítulo (Costar cat. 3690) na concentração de 20 μg/mL por toda a noite a 4 °C. Após a lavagem e bloqueio com leite a 4 % por 1 hora a temperatura ambiente, os anticorpo 9D4, 9D4TM, 9D4DM biotinilados e controle foram adicionados na placa previamente bloqueada e incubados a 37 °C por uma hora, iniciando a 500 μg/mL e a seguir em diluição em série de duas vezes.

[0403] A placa foi lavada com PBS (pH 7,4) contendo 0,05 % de Tween 20 e 25μl de HRP conjugado com avidina foram adicionados a cada poço. Após uma fora de incubação a 37 °C, as placas foram lavadas novamente e 50 μL/poço de substrato - SureBlue TMB peroxidase (KPL cat. 52-00-03) foram adicionados. A reação foi parada com 50 μL de 0,2 M H2SO4 após 5-10 minutos de desenvolvimento. O sinal de ELISA foi lido em 450nM.

[0404] Resultados: Em um ensaio de ligação a base de ELISA (Figura 20), os anticorpos modificados anti-IFNAR1 9D4DM e 9D4TM exibiram menores afinidades de ligação com o FcyRI que não modificou o anticorpo 9D4WT, bem como o anticorpo controle.

[0405] Conclusões: Estes resultados demonstram que os anticorpos modificados anti-IFNAR1 9D4-DM e 9D4-TM elicitam uma menor afinidade com o receptor Fc FcyRI comparado ao anticorpo não modificado 9D4. A menor afinidade com o receptor FCYRI levaria a uma menor indução de ADCC. 6.21 Exemplo 21: O receptor Fc FCYRIIIA exibe ligação reduzida aos anticorpos anti-IFNAR1 modificados.

[0406] Propósito: Demonstrar a ligação reduzida de um receptor Fc específico com os anticorpos modificados anti-IFNAR1 9D4-DM e 9D4-TM, da maneira comparada com o anticorpo não modificado 9D4 anti- IFNAR1.

[0407] Métodos: Cinquenta μg/mL de anticorpos 9D4, 9D4TM, e 9D4DM diluídos em PBS foram revestidos em uma placa de microtitulação Immunlon IV por toda a noite a 4 °C. Após a lavagem e bloqueio com leite a 4 % por 1 hora a temperatura ambiente, variantes de FcyRIIIA 158F (baixa afinidade) e 158V(alta afinidade) com etiqueta Flag foram adicionados aos poços da placa bloqueada, iniciando a 50 μg/mL a seguir em diluição seriada duas vezes. A placa foi lavada por mais uma hora e incubada com anticorpo anti-Flag conjugado com biotina (Sigma) em 2 μg/mL. Após a lavagem, 25 μL de avidina conjugada com HRP foram adicionados a cada poço. Os materiais não ligados foram removidos lavando uma hora após a incubação. O sinal de ligação foi detectado com o substrato TMB.

[0408] Resultados: Os resultados de um ensaio de ligação a base de ELISA entre anticorpos anti-IFNAR1 (9D4WT, 9D4DM, e 9D4TM) e o receptor Fc FcyRIIIA de alta e baixa afinidade são apresentados na figura 21 (A, B, C). Na figura 21(A) os anticorpos revestidos 9D4WT na placa de ELISA se ligaram eficientemente ao receptor FcyRIIIA de alta afinidade em concentrações maiores do que 3 ng/mL, embora exista ligação limitada do receptor FcyRIIIA de baixa afinidade em todas as concentrações testadas. Na figura 21(B), os anticorpos 9D4DM modificados revestidos na placa de ELISA não se ligam eficientemente aos receptores FCYRIIIA de baixa e alta afinidade em quaisquer das concentrações testadas. Ao contrário, na figura 21(C), os anticorpos 9D4TM modificados revestidos na placa de ELISA não se ligam eficientemente aos receptores FcyRIIIA de baixa e alta afinidade em quaisquer concentrações testadas.

[0409] Conclusões: Estes resultados sugerem que os anticorpos modificados anti-IFNAR1 9D4-DM e 9D4-TM apresentam uma menor afinidade com o receptor FcyRIIIA comparado ao anticorpo não modificado 9D4 anti-IFNAR1. Adicionalmente, a menor afinidade com o receptor Fc específico pode levar a uma diminuição na função efetora ADCC. 6.22 Exemplo 22: Os anticorpos modificados 9D4DM e 9D4TM exibem menor ligação com o receptor Fc FCYRIIIA.

[0410] Propósito: Demonstrar a menor ligação de um receptor Fc específico nos anticorpos modificados 9D4DM e 9D4TM.

[0411] Métodos: Cinquenta μg/mL de variantes de FcyRIIIA (FcyRIIIA-10 158F e FcyRIIIA-10 158V) em PBS foram revestidos em placa de microtitulação Immunlon IV por toda a noite a 4 °C. Após a lavagem e bloqueio com leite a 4 % por 1 hora a temperatura ambiente, os anticorpos 9D4, 9D4TM, e 9D4DM biotinilados foram adicionados aos poços da placa bloqueada a 100 μg/mL. A placa foi lavada por mais 1 hora e incubada com avidida conjugada com HRP. Os materiais não ligados foram removidos lavando uma hora após a incubação. O sinal de ligação foi detectado com o substrato TMB.

[0412] Resultados: Os resultados de um ensaio de ligação a base de ELISA entre os receptores Fc FcyRIIIA de alta e baixa afinidade e anticorpos anti-IFNAR1 (9D4WT, 9D4DM, e 9D4TM) são apresentados na figura 22 (A, B, C). Na figura 22 (A), o anticorpo não modificado 9D4 anti- IFNAR1, em concentrações maiores do que 3 ng/mL, se liga eficientemente ao receptor FCYRIIIA de alta afinidade imobilizado na placa de ELISA, ao passo que o anticorpo demonstra ligação limitada com o receptor FCYRIIIA imobilizado de baixa afinidade em todas as concentrações testadas. Na figura 22(B) o anticorpo 9D4DM anti-IFNARl modificado não se liga eficientemente aos receptores FcyRIIIA imobilizados de alta ou baixa afinidade em quaisquer concentrações testadas, comparado ao anticorpo 9D4WT anti-IFNAR1 modificado. Ao contrário, na figura 22 (C), o anticorpo 9D4TM anti-IFNARl modificado não se liga eficientemente aos receptores FcyRIIIA imobilizados de alta ou baixa afinidade em quaisquer concentrações testadas comparado ao anticorpo 9D4WT anti- IFNAR1 modificado.

[0413] Conclusões: Este exemplo demonstra que os anticorpos modificados, 9D4DM e 9D4TM, exibem menor afinidade com o receptor Fc, FcyRIIIA, comparado ao anticorpo 9D4 não modificado parental. Esta menor afinidade pode levar a uma diminuição na função efetora ADCC mediada por FcyRIIIA, comparado ao anticorpo parental. 6.23 Exemplo 23: Neutralização de subtipos de IFNα por anticorpos anti- IFNAR1.

[0414] Propósito: Demonstrar a capacidade dos anticorpos anti-IFNAR1 MDX-1333, 9D4WT, e 9D4TM neutralizarem subtipos específicos de IFNα em um ensaio repórter

[0415] Métodos: Ensaios repórteres para neutralização de IFNα foram bem documentados na técnica. Neste exemplo, a neutralização de IFNα é medida por um ensaio repórter a base de HiL3. Um exemplo de como um ensaio de neutralização de IFNα usa células HiL3 como um repórter é da maneira a seguir: Uma linhagem celular de hepatoma humano HiL3 foi transfectada com um plasmídeo contendo um elemento de resposta estimulado por IFNα - luciferase (ISRE-Luc) e um gene de resistência de neomicina. Estas células foram gentilmente fornecidas pelo Dr Michael Tovey (CNRS, Paris, França). HiB, 30.000 células/poço, foi cultivada em placas de 96 poços brancas refletivas (DYNEX Micro lite) e crescidas por toda a noite em meio de Eagle modificado por Dulbecco contendo 10 % de soro fetal bovino e 1 mg/mL de G418 (+penicilina/estreptomicina/L- glutamina). Após esta incubação, várias formas de interferon foram adicionadas e as placas foram cultivadas por 18 horas. A reação terminou adicionando 10 mL de tampão de lise à garrafa de substrato luciferase (Luc Lite Plus kit, Perkin-Elmer); 100 μL desta solução de substrato foram adicionados a cada poço e lidos em Top Count por 10 minutos (10 minutos esperando no escuro, a seguir 1 segundo leitura/poço). As contagens por segundo (cps) em cada concentração de IFN foram determinadas e a concentração de IFN ou cps em cada amostra foi calculada da curva de titulação de IFN usando software Prism (San Diego, CA) com parâmetros de regressão linear.

[0416] Resultados: A capacidade de neutralização de anticorpos anti-IFNAR1 para várias espécies de IFN em um ensaio repórter de HiL3 é apresentada na figura 23 (A-E). Os anticorpos anti-IFNAR1 MDX1333, 9D4WT e 9D4TM inibem subtipos múltiplos de interferon tipo I com similar eficácia. Os anticorpos anti-IFNAR1 MDX-1333, 9D4WT e 9D4TM neutralizam IFNαl0 (UM) com valores IC50 de 0,09880 μg/mL, 0,008345 μg/mL e 0,004287 μg/mL respectivamente. Os anticorpos anti-IFNAR1 MDX-1333, 9D4WT e 9D4TM neutralizam IFN de leucócito humano (B) com valores IC50 de 1,121 μg/mL, 0,02104 μg/mL e 0,02120 μg/mL respectivamente. Os anticorpos anti-IFNAR1 MDX-1333, 9D4WT e 9D4TM neutralizam IFNα 2b (C) com valores IC50 de 0,0006462 μg/mL, 0,002789 μg/mL e 0,0008279 μg/mL respectivamente. Os anticorpos anti-IFNAR1 MDX-1333, 9D4WT e 9D4TM neutralizam IFNo (D) com valores IC50 de 5,323 μg/mL, 0,01015 μg/mL e 0,01423 μg/mL respectivamente. Os anticorpos anti-IFNAR1 MDX-1333, 9D4WT e 9D4TM neutralizam IFNβ (E) com valores IC50 de 18,97 μg/mL, 0,7403 μg/mL e 0,2611 μg/mL respectivamente.

[0417] Conclusões: Estes resultados indicam que os anticorpos anti-IFNAR1 MDX-1333, 9D4WT (não modificado) e 9D4TM (modificado) exibem especificidade de neutralização similar e capacidade de multiplicar interferons do tipo I. 6.24 Exemplo 24: Anticorpos anti-IFNAR1 neutralizam IFN tipo I em plasma de pacientes com SLE

[0418] Propósito: Demonstrar a capacidade de anticorpos anti-IFNAR1 neutralizarem IFN tipo I em plasma isolado de pacientes de SLE da maneira medida por um ensaio repórter.

[0419] Métodos: Células PIL-5 ISRE estavelmente transfectadas foram mantidas em RPMI 1640 + IX Penicilina-estreptomicina- glutamina + FBS a 10 % e semeadas a 100.000 células por poço em placas de 96 poços branco/claro Optilix (VWR, West Chester PA). Os anticorpos foram titulados e adicionados aos poços apropriados por uma concentração final variando de 90 μg/mL - 60pg/mL. Amostras de interferon tipo I positivo humanos de soro de paciente com SLE foram adicionadas a cada poço para um percentual sérico final de 50 % por poço. Células, IFN e anticorpos foram incubados por toda a noite a 37 °C, CO2 5 %. Após incubação por toda a noite, as células foram precipitadas resumidamente em 1.200 rpm por 5 minutos e amplificação da proteína luciferase foi avaliada lisando as células com reagente de lise de cultura celular e a visualização foi feita usando o sistema de ensaio de luciferase (Promega, Madison WI). O sinal foi medido em cps e valores IC50 foram gerados usando software de análise GraphPad Prism 4.

[0420] Resultados: 9D4-TM neutraliza interferons do tipo I no plasma de paciente com SLE. Os resultados de um ensaio de neutralização de interferons do tipo I no plasma de paciente com SLE paciente são apresentados na figura 24. A neutralização de interferon tipo I contido na amostra de paciente com SLE é especificamente neutralizada com 9D4-TM versus um isotipo controle no aumento das concentrações de anticorpo. Especificamente, 9D4-TM exibe um IC50 de 0,04 nM para neutralização de interferons do tipo I nesta amostra de plasma obtida de um paciente com SLE.

[0421] Conclusões: Este resultado sugere que o anticorpo 9D4-TM anti-IFNAR1 modificado apresenta a capacidade de neutralizar especificamente interferon tipo I em pacientes com SLE. 6.25 Exemplo 25: Anticorpos anti-IFNAR suprimem as populações de pDC induzidas por IFNα em PBMCs

[0422] Propósito: Demonstrar a capacidade de anticorpos anti-IFNAR suprimirem o acúmulo de células pDC no sangue periférico de camundongos de um modelo de SLE.

[0423] Métodos: Camundongos dos procedimentos experimentais descritos no exemplo 13 também forneceram amostras para análise neste exemplo. PBMCs foram isoladas do baço, linfonodos, medula óssea e sangue periférico usando técnicas de isolamento padrão técnicas e coradas com os marcadores superficiais B220 e Ly6C. PBMCs isoladas foram analisadas por FACS e as duas células positivas (B220 e Ly6C) forram classificadas como células pDC e as populações relativas são representadas na figura 25.

[0424] Resultados: Da maneira representada na figura 25, a expressão ectópica de IFNα ativa um aumento em células pDC nas PBMCs isoladas de baço (A), linfonodos (B), sangue (C) e medula óssea (D) na presença de PBS ou IgG de camundongo não específica. Os camundongos tratados com anticorpos anti-IFNAR não acumulam células pDC em resposta a IFN-alfa. Os camundongos tratados com adenovírus controle não acumulam pDCs na população PBMC.

[0425] Conclusões: Estes resultados sugerem que anticorpos anti-IFNAR bloqueiam especificamente a regulação positiva de células pDC induzidas por IFNα. 6.26 Exemplo 26: Anticorpos modificados anti-IFNAR1 exibem menores afinidade de ligação com receptores Fc.

[0426] Propósito: Avaliar as afinidades de ligação relativas dos anticorpos modificados anti-IFNAR1 9D4-DM e 9D4-TM com o anticorpo 9D4 não modificado parental a vários receptores Fc.

[0427] Métodos: Todo os experimentos foram realizados em um instrumento BIAcore 3000 (BIAcore, Inc., Uppsala, Suécia). Em um experimento típico, soluções l μM de IgGs 9D4 foram usadas para imobilizar qualquer parte de ~ 7.000 RUs - ~ 11.000 RUs de proteína nas superfícies do chip sensor CM5 usando um protocolo de acoplamento de amino padrão (BIAcore, Inc.). Separadamente, uma superfície em branco também foi preparada em cada chip usando o protocolo idêntico, menos a proteína. Esta superfície em branco foi usada como uma célula de referência em todo o experimento e serviu para corrigir tanto a ligação não específica quanto os certos artefatos de manutenção. Para os experimentos de ligação teste, FCYRI foi preparado em tampão HBS-EP 20nM (BIAcore, Inc., consistindo no seguinte: tampão HEPES 10mM, pH7,4, NaCl 150mM, EDTA 3mM, e 0,005 % de P20. Entre as injeções FCYRI, a superfície de IgG foi regenerada com uma injeção de 1 minuto de HCl 5mM. Sobrecamadas no sensorgrama foram geradas usando o software BIAevaluation 4.1 (BIAcore, Inc, Uppsala, Suécia).

[0428] Resultados: O anticorpo 9D4 anti-IFNAR1 e anticorpos modificados anti-IFNAR1, 9D4-TM e 9D4-DM, foram testados quanto a afinidade de ligação com proteína FcyRI imobilizada em um formato de ensaio BIAcore. Da maneira descrita na figura 26, o anticorpo 9D4 anti- IFNAR1 exibe uma alta afinidade com o FcyRI imobilizado. A ligação do anticorpo 9D4 anti-IFNAR1 com FcyRI é específica, já que o ensaio que corre similar com ovalbumina exibe afinidade muito pequena com o receptor imobilizado. Os anticorpos modificados anti-IFNAR1 9D4-TM e 9D4-DM exibem uma menor afinidade do receptor FcyRI imobilizado comparado ao anticorpo 9D4 anti- IFNAR1 não modificado.

[0429] Conclusões: As menores afinidades resultantes com FcyRI exibidas pelos anticorpos modificados anti-IFNAR1 9D4-TM e 9D4DM sugerem que estes anticorpos teriam uma menor capacidade de ativar ADCC in vivo. 6.27 Exemplo 27: receptores Fc exibem menores afinidades de ligação com os anticorpos anti-IFNAR1 modificados.

[0430] Propósito: Avaliar as afinidades de ligação relativas de vários receptores Fc com os anticorpos modificados anti-IFNAR1 9D4DM e 9D4-TM e com o anticorpo anti- IFNAR1 9D4 parental não modificado.

[0431] Métodos: Medições de ressonância de plasma de superfície

[0432] Todos os experimentos foram realizados em um instrumento BIAcore 3000 (BIAcore, Inc., Uppsala, Suécia). Em um experimento típico, uma solução lμM de FCYRI foi usada para imobilizar qualquer parte de ~ 7.000 RUs - ~ 11.000 RUs de proteína nas superfícies do chip sensor CM5 usando um protocolo de acoplamento de amino padrão (BIAcore, Inc.). Separadamente, uma superfície em branco também foi preparada em cada chip usando o protocolo idêntico, menos a proteína. Esta superfície em branco foi usada como uma célula de referência em todo o experimento, e serviu para corrigir tanto a ligação não específica quanto os artefatos de manutenção. Para os experimentos de ligação teste, os anticorpos foram preparados em tampão HBS-EP 333nM (BIAcore, Inc., consistindo no seguinte: tampão HEPES 10mM, pH 7,4, NaCl 150mM, EDTA 3mM, e 0,005 % de P20. Entre as injeções de anticorpo, a superfície de FcyRI foi regenerada com uma injeção de 1 minuto de MgCl2 3M. As sobrecamadas do sensorgrama foram geradas usando o software BIAevaluation 4.1 (BIAcore, Inc, Uppsala, Suécia).

[0433] Resultados: Os anticorpos anti-IFNAR1 9D4, 9D4- TM e 9D4-DM, foram imobilizados e incubados com FcyRI solúvel. A afinidade de ligação do receptor FcyRI solúvel em cada um dos anticorpos anti-IFNAR1 foi medida em um ensaio BIAcore e os rastreamentos resultantes são representados na figura 27 A, B, C. O FcyRI ligou o anticorpo 9D4 anti-IFNAR1 imobilizado com uma alta afinidade, como são representados na figura 27A. Esta interação foi altamente específica, já que a ovalbumina solúvel não mostra nenhuma ligação com o anticorpo 9D4 anti- IFNAR1 imobilizado. Os anticorpos modificados 9D4-TM e 9D4-DM não se ligam ao FcyRI tão fortemente quanto o anticorpo 9D4 não modificado tipo selvagem. Na figura 27B, o anticorpo 9D4-DM anti-IFNAR1 modificado foi imobilizado e incubado tanto com FCYRI solúvel quanto com ovalbumina. O FCYRI exibiu uma baixa afinidade de ligação com o anticorpo 9D4- DM imobilizado. Esta afinidade de ligação é similar à interação não específica observada com ovalbumina solúvel. Na figura 27C, o anticorpo anti-IFNAR1 9D4-TM modificado foi imobilizado e incubado tanto com FcyRI solúvel quanto com ovalbumina. O FcyRI exibiu uma baixa afinidade de ligação para o anticorpo 9D4-TM imobilizado. Esta afinidade de ligação é similar à interação não específica observada com ovalbumina solúvel.

[0434] Conclusões: As menores afinidades exibidas pelo receptor Fc FcyRI com os anticorpos modificados anti-IFNAR1 9D4-DM e 9D4-TM imobilizados com relação ao anticorpo não modificado 9D4 anti- IFNAR1 sugerem que os anticorpos modificados exibiriam uma menor capacidade de elicitar uma resposta ADCC. 6.28 Exemplo 28: Anticorpos anti-IFNAR bloqueiam gene de indução responsivo a IFNα.

[0435] Propósito: Demonstrar a capacidade de anticorpos anti-IFNAR bloquearem a indução de genes responsivos a IFNα em um modelo de camundongo de SLE.

[0436] Métodos: Camundongos dos procedimentos experimentais descritos no exemplo 13 também forneceram amostras para análise neste exemplo. Após 8 semanas no experimento, os camundongos foram sacrificados e o tecido renal removido. Não mais que 50 mg de tecido foi usado para extração de RNA usando tampão de lise RLT (Qiagen). As amostras foram colocadas em tampão de lise e matriz de lise A (Qbiogene), e processadas por 30 segundos a 4,5m/s usando o instrumento homegeneizador Fastprep24 (Thermo Electron Corporation, Waltham, MA). Para isolar RNA, lisados descongelados de tecido foram primeiro processados usando colunas de centrifugação Qiashredder, a seguir volumes iguais de etanol 70 % foram adicionados aos lisados de tecido e o RNA foi purificado usando estojos de coluna de centrifugação Rneasy mini, de acordo com as instruções do fabricante. O cDNA foi gerado a partir de 3 μg de RNA usando transcriptase antissentido Superscript III e oligo d(T) da maneira descrita no protocolo do fabricante (Invitrogen, Corp. Carlsbad, CA). As amostras de cDNA foram diluídas em água sem nuclease e armazenadas a -80 °C.

[0437] Níveis de expressão de genes selecionados foram medidos por análise de TaqMan® em PCR em tempo real usando o sistema de PCR em tempo real ABI 7900HT Fast (Applied Biosystems, Foster City, CA). B-actina de gene regulador foi usada para controle endógeno. As misturas de reação tiveram um volume final de 20 μL consistindo em 1 μL de cDNA, 2 μL de oligoiniciadores 20x e sondas (TaqMan® ensaio de expressão de gene, Applied Biosystems) e 18 μL de mistura mestre de PCR universal TaqMan® Fast diluída. As condições de amplificação foram: 20 segundos a 95 °C, 50 ciclos de 1 segundo a 95 °C e 20 segundos a 60 °C. Os valores CT variam de 0 a 50, com o último número representado nenhuma formação de produto. A quantificação de expressão de gene foi realizada usando o método CT comparativo (Sequence Detector User Bulletin 2; Applied Biosystems) e relatada como a diferença de vezes com relação ao gene regulador.

[0438] Resultados: São apresentados na figura 28 os resultados de uma análise de expressão comparativa no rim de 6 genes induzidos por interferon alfa após 8 semanas em um modelo de camundongo de lúpus acelerado. Os camundongos que expressam ectopicamente interferon alfa foram tratados com IgG ou anticorpos anti-IFNAR de camundongo. Após 8 semanas, os camundongos tratados com IgG controle demonstraram uma alta indução de genes responsivos a IFNα denominados ICAMl, VCAMl, CXCL9, CXCLlO e IFITl. Os camundongos tratados com anticorpos anti- IFNAR não mostraram indução de genes responsivos a IFNα após 8 semanas.

[0439] Conclusões: No modelo de camundongo com lúpus acelerado, o tratamento com anticorpos anti-IFNAR bloqueia a indução no rim de seis genes (ICAMl, VCAMl, CXCL9, CXCLlO e IFITl) mediada pela expressão ectopicamente de IFN-alfa comparado aos camundongos controle, da maneira medida por um ensaio Taqman. Estes resultados demonstram que anticorpos anti-IFNAR são capazes de bloquear a sinalização mediada por IFNα em um modelo de camundongo com SLE. 6.29 Exemplo 29: Anticorpos anti-IFNAR inibem o acúmulo de autoanticorpos no soro.

[0440] Propósito: Demonstrar a capacidade de anticorpos anti-IFNAR para inibir o acúmulo de autoanticorpos no soro de camundongos em um modelo de SLE.

[0441] Métodos: Os camundongos dos procedimentos experimentais descritos no exemplo 13 também forneceram amostras para análise neste exemplo. As amostras totais de sangue foram obtidas em intervalos de 1 semana a partir do regime de 2-7 semanas. Níveis séricos de autoanticorpos anti-DNAds foram avaliados por ELISA. Resumidamente, placas de ELISA pré-tratadas com poli (L-lisina) (100 μg/mL) foram revestidas com DNA ativado com timo bovino (5 μg/mL em tampão carbonato-bicarbonato) (SIGMA). Após incubação por toda a noite a 4 °C, as placas foram bloqueadas com PBS/ FCS 10 %. Os soros (diluição 1/200) foram incubados por 30 minutos a temperatura ambiente. IgG ligada foi detectada com anti-camundongo ovelha conjugado com peroxidase IgG (1/4.000) (KPL) adicionada às placas por 30 minutos. A ligação foi medida por adição de substrato TMB (KPL) e solução de parada (KPL), e a OD foi lida a 450 nm. Uma IgG de DNA anti-ds de camundongo padrão em soro foi corrida em diluição seriada (de 625 ng/mL) (Alfa Diagnostic) em cada placa para permitir padronização.

[0442] Resultados: São apresentados na figura 29 os resultados da análise a base de ELISA dos níveis de anticorpos de DNA anti- ds do soro de camundongo durante um tempo de curso de modelo de camundongo com lúpus acelerado. Os camundongos que expressam ectopicamente IFNα foram tratados com anticorpos anti-IFNAR ou anticorpos IgG de camundongo controle durante um regime de 7 semanas. Os camundongos tratados com anticorpos anti-IFNAR não acumulam anticorpos anti-DNAds na mesma taxa ou na mesma extensão dos camundongos tratados com anticorpo IgG controle. Os camundongos infectados com adenovírus controle não desenvolvem anticorpos anti-ds DNA durante o tempo de curso.

[0443] Conclusões: Estes resultados demonstram que anticorpos anti-IFNAR reduziram o acúmulo de anticorpos anti-DNAds em resposta a níveis elevados de IFN alfa. 6.30 Exemplo 30: Anticorpos anti-IFNAR reduzem proteinúria no modelo de camundongo com lúpus acelerado.

[0444] Propósito: Demonstrar a capacidade de anticorpos anti-IFNAR reduzirem proteinúria estabelecida (ajuste terapêutico) no modelo de camundongo com SLE.

[0445] Métodos: Os camundongos dos procedimentos experimentais descritos no exemplo 13 também forneceram amostras para análise neste exemplo. Entretanto, em uma abordagem terapêutica, os camundongos desenvolveram naturalmente proteinúria como um sintoma de lúpus antes da aplicação dos anticorpos. Especificamente, os camundongos desenvolveram naturalmente uma classificação de proteinúria de 2,0 - 2,5, da maneira descrita previamente. Uma vez o nível limite de proteinúria ultrapassa, um regime de tratamento de doses semi-semanais de PBS, IgG controle ou anticorpos anti-IFNAR foi conduzido por mais 5 semanas. Em intervalos semi- semanais, amostras de urina foram testadas e forneceram uma classificação de proteinúria.

[0446] Resultados: São apresentados na figura 30A os resultados de um estudo terapêutico de anticorpo anti- IFNAR que reduz a classificação de proteinúria de camundongos a partir de modelo com lúpus acelerado. Resumidamente, os camundongos desenvolveram naturalmente proteinúria neste período, o grupo foi fornecido tanto com PBS, IgG controle quanto anticorpos anti-IFNAR como tratamento. Da maneira documentada na figura, a classificação de proteinúria diminuiu apenas para o grupo que recebeu anticorpos anti-IFNAR. O camundongos que recebem PBS ou IgG controle como tratamento continuaram a aumentar a classificação de proteinúria com o tempo. (B) Uma análise da área abaixo da curva para os resultados das cinco semanas determinou que o anticorpo anti-IFNAR do grupo tratado foi diferente dos grupos PBS sozinho ou IgG controle, ambos os quais foram muito similares.

[0447] Conclusões: Estes resultados demonstram que anticorpos anti-IFNAR podem ser usados em um ajuste terapêutico de SLE. 6.31 Exemplo 31: Anticorpos anti-IFNAR reduzem a mortalidade no modelo de camundongo com lúpus acelerado.

[0448] Propósito: Demonstrar a capacidade de anticorpos anti-IFNAR reduzirem a mortalidade em um ajuste terapêutico do modelo de camundongo com SLE lúpus.

[0449] Métodos: Os camundongos dos procedimentos experimentais descritos no exemplo 30 também forneceram amostras para análise neste exemplo. Em uma abordagem terapêutica, os camundongos desenvolveram naturalmente proteinúria como um sintoma de lúpus antes da aplicação dos anticorpos. Especificamente, os camundongos desenvolveram naturalmente uma classificação de proteinúria de 2,0 - 2,5, da maneira descrita anteriormente. Uma vez que o nível limite de proteinúria ultrapassa, um regime de tratamento de doses semi- semanais de PBS, IgG controle ou anticorpos anti-IFNAR foi conduzido por mais 5 semanas. A mortalidade completa foi monitorada por mais 4 semanas.

[0450] Resultados: São apresentados na figura 31 as taxas de mortalidade de um estudo terapêutico de anticorpos anti-IFNAR em um modelo de lúpus acelerado. Resumidamente, os camundongos desenvolveram naturalmente proteinúria neste período, o grupo forneceu tanto PBS, IgG controle quanto anticorpos anti-IFNAR como tratamento. Os camundongos tratados com anticorpos anti-IFNAR não exibiram nenhuma mortalidade na semana 5, ao passo que camundongos tratados com PBS ou IgG controle exibiram taxas de mortalidade de 87,5 % e 62,5 % respectivamente. Adicionalmente, durante o estudo de nove semanas, animais tratados com anti-IFNAR exibiram uma alta taxa de sobrevivência comparados a animais tratados com PBS ou IgG controle.

[0451] Conclusões: Os resultados neste exemplo demonstram que anticorpos anti-IFNAR podem diminuir a mortalidade associada com lúpus. 6.32 Exemplo 32: Ausência de atividade de ADCC mediada por 9D4-TM.

[0452] Propósito: Para verificar se 9D4-TM é incapaz de induzir a atividade ADCC, em virtude de sua pequena afinidade de ligação com FCYRI e FCYRIIIA, uma série de experimentos foram conduzidos.

[0453] Métodos: Células alvo 293F foram marcadas com célula de marca DiO (Invitrogen, experimentos I & II) e combinadas com efetores não marcados PBMCs (por 4 horas a 37 °C, na ausência ou presença de 10 μg/mL de 9D4-TM, IgGl humana isotipo negativo controle R3-47, 9D4- WT ou anticorpo anti-EphA2 usado como um controle positivo. A lise de células alvo foi avaliada medindo coloração positiva dupla DiO /PI+ (iodeto de propídio). Razão alvo efetora = 50-1, o percentual de lise foi calculado de acordo com a fórmula: [(percentual de coloração positiva dupla na presença de anticorpos - percentual de coloração positiva dupla em meios sozinhos) / (percentual de coloração positiva dupla na presença de tampão de lise - percentual de coloração positiva dupla em meios sozinhos)]. Cem por cento de lise foi atingido adicionando tampão de lise (Promega).

[0454] Alternativamente, células alvo 293F foram incubadas com células de uma linhagem celular NK transgênica que expressa estavelmente FCYRIIIA (experimento III) por 4 horas a 37 °C, na ausência ou presença de 10 μg/mL de 9D4-TM, IgGl humana isotipo negativo controle R3-47, 9D4-wt ou anticorpo anti- EphA2 usado como um controle positivo. Razão alvo efetora =4-1 e percentual de lise foi calculado de acordo com a fórmula : 100 x (Experimental - espontâneo efetor - espontâneo alvo) /(máximo alvo -espontâneo alvo).

[0455] Nos experimentos I & II (razão PBMCs-293H = 501), o percentual de lise foi calculado de acordo com a fórmula: [(percentual de coloração positiva dupla na presença de anticorpos - percentual de coloração positiva dupla em meios sozinhos) / (percentual de coloração positiva dupla na presença de tampão de lise - percentual de coloração positiva dupla em meios sozinhos)]. No experimento III (Razão de linhagem celular NK transgênica que expressa FcyIIIA-293H = 4-1), o percentual de lise foi calculado de acordo com a fórmula : 100 x (Experimental - espontâneo efetor - espontâneo alvo) /(máximo alvo -espontâneo alvo).

[0456] Resultados: O anticorpo 9D4-TM modificado ou o anticorpo 9D4-WT não modificado não exibiu nenhuma atividade de ADCC detectável em células 293F com relação àquela observada com o anticorpo R3-47 (Tabela 4). Ao contrário, o anticorpo controle positivo, um anticorpo anti-EphA2, causou um aumento de duas vezes na citotoxicidade com relação ao nível inferior. Estes resultados confirma que 9D4-TM não medeia alvos que expressam ADCC em IFNAR1. Tabela 5: Avaliação da atividade ADCC de anticorpos anti-IFNAR1.

[0457] Conclusões: Estes resultados demonstram que anticorpo anti-IFNAR1 9D4-TM modificado não estimula atividade ADCC detectável direcionada a células alvo que expressam IFNAR1. 6.33 Exemplo 33: Estruturas tridimensionais de região Fc humana compreendendo mutações L234F/L235E/P331S.

[0458] Propósito: Determinar as estruturas tridimensionais da região de Fc de IgGl humana compreendendo mutações L234F/L235E/P331S (Fc-TM). Métodos:

[0459] Purificação de Fc-TM: O fragmento Fc/TM humano foi obtido a partir da clivagem enzimática de 9D4-TM. A digestão foi realizada usando ficina imobilizada de acordo com as instruções do fabricante (Pierce). A purificação foi realizada primeiro em colunas de proteína A HiTrap de acordo com as instruções do fabricante (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Após diálise em NaOAc/pH 5,2 50 mM, a solução protéica foi aplicada em um coluna HiTrap SP HP (GE Healthcare) e coletada no fluxo passante. O fluxo passante foi carregado em uma coluna HiTrap Q (GE Healthcare) e eluído em um gradiente de NaCl para produzir uma preparação homogênea de Fc/TM, da maneira julgada reduzindo e não reduzindo SDS- PAGE. O perfil de Fc-TM SDS-PAGE mostrou a presença de apenas uma banda entre 25 kDa ou 50 kDa em condições de redução e não redução, respectivamente. Esta observação demonstrou claramente a presença de pelo menos um dissulfeto intercadeia ligado nas posições C226 e/ou C229. Consequentemente, resíduos mutados “à jusante” F234 e E235 estavam presentes na cadeia de polipeptídeo compreendendo o cristal.

[0460] Cristalização de Fc-TM: Fc-TM purificado foi concentrado em cerca de 5 mg/mL usando um concentrador Centricon (Millipore, Billerica MA,30 corte KDa). As condições de cristalização foram identificadas usando as seleções comerciais de pesquisa Hampton (Hampton Research, Aliso Viejo, CA), Emerald BioSystems (Emerald BioSystems, Inc., Bainbridge Island, WA) e dimensões moleculares (Molecular Dimensions Inc., Apopka, FL). Cada seleção produziu diversas condições de cristalização potencialmente usáveis. Mediante otimização, os cristais de qualidade de difração foram obtidos de acetato de zinco 0,2 M, malato de imidazol 0,1 M, pH 8,0, PEG 33505 %, glicerol 5 % em concentração protéica de 2,0 mg/mL. Nestas condições, os cristais bem moldados com três dimensões que variam de 0,1 a 0,2 mm cresceram em 2- 3 dias.

[0461] Coleção de dados: Os dados de difração foram coletados de um cristal único no Center for Advanced Research in Biotechnology (CARB, University of Maryland Biotechnology Institute, Rockville, MD) usando um gerador de anodo de rotação Rigaku MicroMax™ 007 com uma placa de formação de imagem R-AXIS IV++ (Rigaku/MSC, The Woodlands, TX). Antes do resfriamento, o cristal foi mantido por alguns minutos em sua solução de crescimento suplementada com 20 % de glicerol. O cristal foi então resfriado a -168,15 °C (105 kelvins) com um resfriador criogênico X-stream 2000 (Rigaku/MSC). A difração de até 2,3 Â foi atingida após um ciclo de anelamento da maneira descrita (Oganesyan et al., 2007). Os dados de difração compreendendo 234 imagens foram coletados usando uma faixa de oscilação de 0,5 °, uma distância do cristal/detector de 200 mm e um tempo de exposição de 600 s. os dados foram integrados e escalados usando o software HKL 2000 (Otwinowski & Minor, 1997).

[0462] Determinação de estrutura: O cálculo da substituição molecular, refinamento e densidade eletrônica foi realizado usando o programa adequado CCP4 (Projeto computacional colaborativo). O cristal ortorrômbico centrado na face C teve um conteúdo de solvente de 58 % e VM de 2,9, assumindo um polipeptídeo Fc na unidade assimétrica da célula. A estrutura de Fc/TM foi determinada por substituição molecular e refinada em resolução de 2,3Â. A estrutura Fc humana que corresponde ao número PDB ID 2DTQ (Matsumiya et al., (2007) J. MoI. Biol. 368:767-779) foi usada como o modelo em decorrência de sua alta resolução e estado não ligado. Em particular, os domínios CH2 e CH3 foram considerados separadamente para minimizar qualquer tendência em termos das conformações relativas de domínios. Os dados até 3,0 Â foram usados para o problema de substituição molecular usando software Phaser (McCoy et al., (2005) Acta Cryst. D61, 458-464). Após o refinamento das soluções, o ganho final LL e classificação Z foram 1192 e 31, respectivamente. A densidade eletrônica pesada calculada com FWT/PHWT em 3,0 Â mostrou uma boa combinação com o modelo, com a exceção de algumas alças nos domínios CH2 e CH3. A diferença da densidade eletrônica positiva forte calculada com DELFWT/PHDELWT foi visível no lugar esperado dos resíduos de carboidrato ligado em N anexado ao N297. Não existe nenhuma densidade presente para qualquer resíduo de dobradiça precedente naquela posição 236, um resultado presumidamente atribuível a alta flexibilidade desta região. Nota-se que apenas duas estruturas Fc humana não ligadas previamente descritas podem revelar as posições 234 e 235 (2DTQ/2DTS; Matsumiya et al, (2007) J. MoI. Biol. 368:767-779). Ao contrário, os resíduos nas posições 446 e 447 podem não ser visualizados. O resíduo na posição 331 foi modelado primeiro como uma alanina.

[0463] Diversos ciclos alternativos de refinamento com “Refmac 5” (Murshudov et al, (1997) Acta Cryst. D53, 240-255) e ligação manual usando o software gráfico "O" (Jones et al, (1991) Acta Cryst. A47, 110-119) convergiram com Rfator de 21,6 e Rfator livre de 27,5 para dados de resolução de até 2,3 Â. Após o primeiro ciclo de refinamento, a densidade eletrônica permitiu a localização dos carboidratos, bem como a substituição por um resíduo de serina na posição 331. Nos últimos estágios de refinamento, o modelo foi analisando usando o programa de determinação de movimento de TLS (TLSMD) que corre no seu servidos da rede (Painter et al. (2006). J. Appl. Cryst. 39, 109-111; Painter et al. (2006) Acta Cryst. D62, 439-450). O refinamento adicional foi então realizado com Refmac 5 em TLS e contido no modo de refinamento usando cinco grupos distintos de resíduos (236-324, 325-341, 342-358, 359-403 e 404-445). Os íons de zinco presentes no tampão de cristalização foram detectados na densidade eletrônica e modelados como tal, quando a esfera de coordenação e distância permitiram. Em particular, observou-se que um íon de zinco é coordenado por H310 e H435. Um outro foi coordenado por H285 e H268 do polipeptídeo de simetria relacionada. Dois outros foram ligados a E318 e E345. Em todos os casos, moléculas de água completaram a coordenação tetraédrica esperada da esfera dos íons de zinco. A fração de carboidrato foi modelada de acordo com sua densidade eletrônica e o modelo final continha nove resíduos de açúcar, essencialmente da maneira descrita por pelos inventores no contexto de uma outra estrutura de Fc humana (Oganesyan et al, (2007) Molecular Immunology, December 11, 2007, para impressão). O modelo final continha 75 moléculas de solvente. Os dados cristalográficos e estatísticas de refinamento são fornecidos na tabela 6.

[0464] Resultados: Fc-TM cristalizou em um grupo espacial C2221 com um polipeptídeo na unidade assimétrica (Figura 32). O cristal foi difratado em resolução de 2,3 Â e exibiu uma mosaicidade média relativamente alta de 1,26 °. Esta alta mosaicidade pareceu ser uma propriedade tanto de cristais resfriados e não resfriados. Todos os resíduos nas posições 236 a 445 podem ser investigados na densidade eletrônica e nenhuma densidade eletrônica foi observada para resíduos de dobradiça antes da posição 236, tornando assim as mutações L234F e L235E invisíveis. A densidade eletrônica na posição 331 correspondeu à serina.

[0465] As coordenadas atômicas e fatores de estruturas experimentais de Fc-TM foram depositadas no Protein Data Bank com o número de acesso 3C2S.

[0466] A estrutura tridimensional completa dede Fc-TM foi muito similar às estruturas previamente relatadas de regiões Fc humanas não ligadas (Deisenhofer, (1981). Biochemistry, 20: 2361-2370; Krapp et al, (2003). J. MoI. Biol. 325, 979-989; Matsumiya et al, (2007). J. MoI. Biol. 368:767-779; Oganesyan et al, (2007) Molecular Immunology, 11 de dezembro de 2007, para impressão). Mais precisamente, as estruturas Fc humanas que correspondem aos números PDB ID 1H3W (Krapp et al., (2003). J. MoI. Biol. 325:979-989) e 2QLl (Oganesyan et al., (2007) Molecular Immunology, 11 de dezembro de 2007, para impressão) foram próximas à Fc-TM em termos de parâmetros celulares, conteúdo de unidade assimétrica, grupo espacial e embalagem. Quando considerado individualmente, domínios Fc-TM CH2 e CH3 mostraram melhor conservação e rigidez estrutural quando comparados com outras estruturas Fc humanas não ligadas, não mutadas. Por exemplo, rms coordena substituições de átomos de Ca que foram 0,6 e 0,4 Â para os domínios CH2 e CH3, respectivamente, durante a sobreposição de Fc-TM com cadeia A de PDB ID número 2DTQ (Matsumiya et al., (2007). J. MoI. Biol. 368, 767-779).

[0467] A tabela 7 a seguir fornece as coordenadas de estrutura atômica de Fc-TM. As abreviações a seguir são usadas na tabela 7

[0468] “Tipo de átomo” refere-se ao elemento cujas coordenadas são fornecidas. A primeira letra na coluna define o elemento.

[0469] “A. A.” refere-se ao aminoácido.

[0470] “X, Y e Z” fornecem as coordenadas cartesianas do elemento.

[0471] “B” é um fator térmico que mede o movimento do átomo ao redor de seu centro atômico.

[0472] "OCC" refere-se a ocupação, e representa o percentual de tempo que o tipo de átomo ocupa na coordenada particular. Os valores OCC variam de 0 a 1, com 1 sendo 100 %.

[0473] Conclusão: Observou-se que a estrutura tridimensional de Fc/TM é muito similar àquela de outras regiões Fc humanas não ligadas não mutadas. Os efeitos consideráveis que variam amplamente do conjunto TM de substituições não foram causados por rearranjos estruturais principais na estrutura Fc, mas de preferência pela perda localizada de algumas interações nos sítios de mutação. 6.34 Exemplo 34: Internalização de anticorpos anti-IFNAR1

[0474] Propósito: Investigar a capacidade de anticorpos anti-IFNAR1 internalizarem em células.

[0475] Métodos: Células THP-I foram cultivadas em meio RPMI- 1640 contendo 2-mercaptoetanol 0,05 mM e 10 % de soro bovino fetal a 37 °C em incubadora de CO2 a 5 %. As células THP-I foram semeadas em 2 x 105 células/mL em meios de crescimento fresco um dia antes dos experimentos. No dia do experimento, as células foram lavadas, contadas e ressuspensas em PBS a 3 x 106 células/mL. As células foram coradas com CFSE 1 μM a 37 °C em incubadora de CO2 por 10 minutos. Após duas lavagens adicionais com PBS, as células foram colocadas no gelo e incubadas com bloco de FcR usando 20 μL por 106 células em gelo por 5 minutos e então coradas com 1 μg/mL de Alexa647-9D4-TM ou Alexa 647-R347 (anticorpo controle não específico) no gelo por 1 hora. Após a remoção de mAb não ligado por 3 lavagens com PBS, as células foram ressuspensas em PBS contendo BSA 2 % e azida sódica. A internalização iniciou transferindo as células em uma câmara com ambiente controlado a 37 °C, 5 % de CO2 e 70 % de umidade e a internalização cinética de Alexa647-9D4-TM foi recuperada com o tempo por formação de imagem da fluorescência das células.

[0476] As imagens fluorescentes das células foram analisadas usando um algoritmo. O algoritmo usou corante citossólico CFSE para identificar o limite de uma célula e uma região de membrana. O algoritmo quantificou o 9D4-TM associado á fluorescência dentro das células, bem como na membrana. A taxa de fluorescência acumulada dentro das células foi calculada ajustando o modelo dos dados usando o software SAAMII.

[0477] Resultados: Alexa647-9D4-TM ligou-se às células THP-I células. Na ligação de Alexa647- R347, o isotipo controle de 9D4-TM foi observado nas mesmas células. Este resultado demonstrou ligação específica em células THP-I com 9D4-TM (Figura 33). A 4 °C, a ligação de 9D4-TM localizou-se predominantemente na superfície celular ( 0 min - Figura 33). Uma vez que as células foram incubadas a 37 °C, o sinal de fluorescência para coloração de 9D4-TM diminuiu significativamente da superfície celular e acumulou no compartimento citossólico da maneira pontuada na mancha. Imagens cinéticas registradas por 60 minutos indicaram migração gradual de fluorescência da superfície celular para as manchas pontuadas localizadas no compartimento citossólico (15, 30 e 50 pontos de tempo em minutos, Figura 33). O resultado mostrou claramente a internalização de 9D4-TM em células THP-I. 6.35 Exemplo 35: Ausência de atividade CDC mediada por 9D4-TM

[0478] Propósito: Para determinar se 9D4-TM não é capaz de induzir a atividade CDC, uma série de experimentos foram conduzidos.

[0479] Métodos: Sangue humano, isolado recentemente de doadores humanos saudáveis, foi coletado (aproximadamente 100 mL) e centrifugado por 10 minutos a 3.000 g para separar as células do soro. A fração do soro foi separada em dois tubos. O primeiro tubo foi diluído com RPMI 1640 sem fenol em uma concentração final de soro a 10 % (não inativado pelo calor ou NHI). O segundo tubo foi colocado em um banho maria a 56 °C por 30 minutos para inativar pelo calor os componentes do complemento. Subsequentemente, o segundo tubo foi diluído com meio RPMI- 1640 sem fenol a uma concentração final de 10 % de soro humano inativado pelo calor (HI).

[0480] Células Daudi B foram usadas como células alvo já que expressam CD20 (alvo para anticorpo positivo controle) e IFNAR1. As células alvo foram lavadas e ressuspensas tanto em meio RPMI sem fenol com 10 % de soro não inativado pelo calor quanto em meio RPMI sem fenol com 10 % de soro inativado pelo calor em uma concentração final de 0,4 x l06 células/mL. As soluções de anticorpo foram preparadas como uma diluição em série 3x com as concentrações variando de 50ug/mL - 1,3x10 6 μg/mL. As preparações replicadas de diluições de anticorpo foram preparadas tanto em meio com soro humano inativado pelo calor quanto não inativado pelo calor. O ensaio CDC foi preparado adicionando 50μL de meio NHI ou HI aos poços apropriados de uma placa de 96 poços de fundo redondo. 50μL de diluição em série de anticorpo foram adicionados aos poços apropriados. Subsequentemente, 50μL da preparação da célula alvo preparação foram adicionados aos poços, incluindo poços extra com células alvo sozinhas para controle. As placas foram incubadas a 37 °C por 4 horas em CO2 5 %. Após 3,5 horas de incubação, 20uL tampão de lise foram adicionados aos poços controle apropriados projetados para determinação de sinal de lise máximo. O ensaio de liberação Quantitate™ LDH foi realizado usando protocolos definidos no ensaio de citotoxicidade não reativa da Promega, #G1780. A absorbância foi medida em 490nM e valores Kd foram gerados usando software de análise GraphPad Prism 4.

[0481] Resultados: São apresentados na figura 34 os resultados do CDC realizado da maneira descrita anteriormente. O anticorpo anti-IFNAR1 modificado, 9D4-TM, não exibiu nenhuma atividade CDC detectável nas células B Daudi alvo com relação aquela observada com o anticorpo R347. Ao contrário, o anticorpo controle positivo, que se liga a CD20 expresso em células B Daudi, causou um aumento dose dependente na citotoxicidade com relação aos níveis inferiores. Estes resultados confirmam que 9D4- TM não medeia CDC em células alvo que expressam IFNAR1. 6.36 Exemplo 36: O anticorpo anti-IFNAR1 modificado, 9D4-TM, não exibe nenhuma toxicidade adversa

[0482] Propósito: Para estabelecer que 9D4-TM não elicita nenhuma toxicidade adversa, um estudo de toxicidade de dose única foi realizado em macacos cinomolgos.

[0483] Métodos: Neste estudo, 4 grupos de 10 animais cada (5/sexo/grupo) receberam uma dose única de 0, 5, 30, ou 100 mg/kg de 9D4- TM no dia 1. Após a dosagem, 2 animais/sexo/grupo foram determinados para necrópsia no dia 3, com todos os outros animais monitorados até o dia 70, e então removidos do estudo sem necrópsia. A toxicidade foi avaliada com base na mortalidade, sinais clínicos (incluindo ciclo menstrual), imunofenotipagem, pesos corporais, exames físicos (incluindo taxa cardíaca, taxa respiratória e temperatura corporal), patologia clínica, peso dos órgãos e dados microscópicos.

[0484] Resultados: Nas condições anteriormente determinadas, não houve nenhuma mudança adversa relacionada a 9D4-TM na mortalidade, sinais clínicos (incluindo ciclos menstruais), peso corporal, exames físicos (taxa cardíaca, taxa respiratória e temperatura corporal), patologia clínica, peso dos órgãos e dados microscópicos. Estes resultados sugerem que o anticorpo anti-IFNAR1 modificado, 9D4-TM, não elicita nenhuma toxicidade adversa.

[0485] Ao passo que, modalidades particulares da invenção foram descritas anteriormente com propósitos de descrição, será interpretado pelos versados na técnica que inúmeras variações dos detalhes podem ser feitas sem fugir da invenção, da maneira descrita nas reivindicações em anexo.

[0486] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes mencionados nesta especificação são aqui incorporados pela referência na especificação na mesma extensão como se cada publicação individual, patente ou pedido de patente fosse especifica e individualmente indicado para ser incorporado aqui pele referência.

Claims

1. Anticorpo monoclonal de classe IgG modificado específico para IFNAR1, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo compreende na região Fc pelo menos uma substituição de aminoácido selecionada do grupo que consiste em L234F, numerada pelo índice EU da maneira apresentada em Kabat, e em que o dito anticorpo exibe afinidade reduzida com pelo menos um ligante de Fc comparado a um anticorpo não modificado.

2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo de subclasse IgG1 ou IgG4.

3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo compreende uma substituição de aminoácido da L235E e/ou P331S.

4. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo compreende: a. uma CDR1 de região variável de cadeia pesada humana compreendendo Seq ID NO: 1; b. uma CDR2 de região variável de cadeia pesada humana compreendendo Seq ID NO: 2; c. uma CDR3 de região variável de cadeia pesada humana compreendendo Seq ID NO: 3; d. uma CDR1 de região variável de cadeia leve humana compreendendo Seq ID NO: 4; e. uma CDR2 de região variável de cadeia leve humana compreendendo Seq ID NO: 5; e f. uma CDR3 de região variável de cadeia leve humana compreendendo Seq ID NO: 6.

5. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo compreende: a. uma CDR1 de região variável de cadeia pesada humana compreendendo SEQ ID NO: 21; b. uma CDR2 de região variável de cadeia pesada humana compreendendo SEQ ID NO: 22; c. uma CDR3 de região variável de cadeia pesada humana compreendendo SEQ ID NO: 23; d. uma CDR1 de região variável de cadeia leve humana compreendendo SEQ ID NO: 24; e. uma CDR2 de região variável de cadeia leve humana compreendendo SEQ ID NO: 25; e f. uma CDR3 de região variável de cadeia leve humana compreendendo SEQ ID NO: 26.

6. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo compreende: a. uma região variável de cadeia pesada humana compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 38; e b. uma região variável de cadeia leve humana compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 40.

7. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo compreende: a. uma região variável de cadeia pesada humana compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 18; e b. uma região variável de cadeia leve humana compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 20.

8. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo compreende: a. uma região variável de cadeia pesada humana compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 28; e b. uma região variável de cadeia leve humana compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 30.

9. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo compreende a sequência de regiões constantes de cadeia leve de SEQ ID No: 41.

10. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo compreende a região constante de cadeia pesada de SEQ ID No: 42.

11. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo compreende a região constante de cadeia leve com a sequência de aminoácidos de SEQ ID No:41 e a região constante de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 42.

12. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada compreendendo variação alélica, em que a dita variação alélica tem pelo menos uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em 214, 221, 356 e 358 da maneira definida pelo sistema de numeração de índice EU.

13. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que codifica o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que a sequência de polinucleotídeo compreende as sequências de ácido nucleicos SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 39.

14. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

15. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio escolhidos de doença de Grave, tiroidite de Hashimoto, doença de Crohn, psoríase, artrite psoriática, oftalmite simpática, ooforite autoimune, orquite autoimune, síndrome linfoproliferativa autoimune, síndrome antifosfolipídica, síndrome de Sjogren, escleroderma, doença de Addison, síndrome de deficiência poliendócrina, síndrome de Guillan-Barre, púrpura trombocitopênica imune, anemia perniciosa, miastenia grave, cirrose biliar primário, doença do tecido conectivo misto, vitiligo, uveíte autoimune, anemia hemolítica autoimune, trombopocitopenia autoimune, doença celíaca, dermatite herpetiforme, hepatite autoimune, pênfigo, pênfigo vulgar, pênfigo foliáceo, penfigóide bolhoso, miocardite autoimune, vasculite autoimune, alopécia areata, arterosclerose autoimune, doença de Behcet, mielopatia autoimune, hemofilia autoimune, cistite intersticial autoimune, diabetes isípido autoimune, endometriose autoimune, policondrite recorrente, espondilite anquilosante, urticária autoimune, dermatomiosite, síndrome Miller-Fisher, nefropatia de IgA, síndrome de Goodpastures e herpes gestacional.