BR112019025574A2 - Anticorpos que se ligam especificamente ao pd-1 e métodos de uso - Google Patents

Anticorpos que se ligam especificamente ao pd-1 e métodos de uso Download PDF

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Hitchcock Shannon
Suzanne Cole
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Abstract

A presente invenção refere-se a anticorpos que se ligam especificamente a PD-1 ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, polinucleotídeos que codificam os anticorpos ou os fragmentos, e métodos de produção e uso dos mesmos são úteis no tratamento de distúrbios inflamatórios ou imunes.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPOS QUE SE LIGAM ESPECIFICAMENTE A PD-1 E MÉTODOS DE USO".
LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[0001] O presente pedido contém uma listagem de sequências que foi submetida eletronicamente em formato ASCII e está aqui incorpo- rada a título de referência, em sua totalidade. A dita cópia em formato ASCII, criada em 30 de maio de 2018, foi nomeada como JBI5131WOPCT_ST25.txt e tem tamanho de 220 kB.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0002] A presente invenção se refere a anticorpos que se ligam especificamente a PD-1, a polinucleotídeos que codificam os anticor- pos ou os fragmentos de ligação ao antígeno, e a métodos para pro- duzir e usar os mesmos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0003] PD-1 (Morte programada-1; PDCD1) é um receptor inibitó- rio que pertence à família CD28/CTLA-4. PD-1 é uma glicoproteína transmembranar tipo I que contém um único domínio extracelular, e um domínio citoplasmático contendo tanto um motivo inibidor do imu- norreceptor baseado em tirosina (ITIM) quanto um motivo de troca do imunorreceptor baseado em tirosina (ITSM). A proteína PD-1 é ex- pressa em células T, células B, células NK ativadas, e timócitos, e em células T de memória de repousos incluindo células T auxiliares folicu- lares (TFH) e células T auxiliares periféricas (TPH). A PD-1, mediante o engate por seus ligantes PD-L1 ou PD-L2, suprime as funções da célu- la T através de múltiplos mecanismos (Pauken e Wherry (2015) Trends in Immunology 36(4): 265-276). O engate de PD-1 inibe dire- tamente a sinalização do receptor de células T (TCR) através da colo- calização com o TCR e a subsequente indução da desfosforilação das moléculas de sinalização proximal de TCR, inibição da via Ras/MEK/ERK que leva à inibição da progressão do ciclo celular e à proliferação de células T, inibição do crescimento e sobrevivência celu- lar e reprogramação do metabolismo das células T através da supres- são da via PI3K/AKT, levando à regulação positiva do fator de transcri- ção BATF e modulação do desenvolvimento, manutenção e função das células T reguladoras. Também foi proposto que PD-1 aumenta a motilidade das células T e limita a duração da interação entre as célu- las T e as células-alvo, reduzindo assim a extensão da ativação das células T (Honda et al., (2014) Immunity 40(2):235-47).
[0004] Estudos em camundongos deficientes em PD-1 indicaram que esta via é importante tanto para a tolerância central quanto perifé- rica. Camundongos deficientes em PD-1 em um fundo de C57Bl/6 po- dem desenvolver sintomas espontâneos de doença autoimune incluin- do produção de autoanticorpos, glomerulonefrite e artrite (Nishimura et al., Immunity 1999). Esses dados indicam que PD-1 está regulando negativamente as respostas imunológicas.
[0005] Os anticorpos monoclonais contra PD-1 e PD-L1 são tera- pias aprovadas para o tratamento de cânceres como melanoma avan- çado, câncer de pulmão de células não pequenas avançado e linfoma de Hodgkin clássico. Foi verificado que DP-L1 é regulado positivamen- te em muitos diferentes tipos de tumores, e é capaz de inibir as células PD-1+ T infiltradoras de tumores. Os anticorpos monoclonais PD-1 ou PD-L1 antagonistas revertem essa supressão, permitindo que as célu- las de T se tornem ativadas e ataquem o tumor. Dessa forma, o blo- queio de pontos de verificação imunes fornece uma maneira de melho- rar as respostas imune antitumorais.
[0006] Embora agentes terapêuticos anti-inflamatórios biológicos estejam disponíveis, existe uma necessidade por medicamentos anti- inflamatórios aprimorados que possam suprimir eficazmente a inflama-
ção para o tratamento de vários distúrbios imunológicos, por exemplo, artrite reumatoide, na qual uma porção significativa dos pacientes ain- da não responde adequadamente à terapia.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0007] A invenção fornece um anticorpo isolado que se liga especi- ficamente a PD-1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), uma HCDR2, uma HCDR3, uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 165, 4, 166, 6 e 7, respecti- vamente.
[0008] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 3, 4, 5, 6 e 7, respec- tivamente; a VH das SEQ ID Nºs: 8, 9 ou 10 e a VL das SEQ ID Nºs: 14, 15 ou 16; e/ou uma cadeia pesada (HC) da SEQ ID Nº: 20, 21 ou 22 e uma cadeia leve (LC) das SEQ ID Nºs: 26, 27 ou 28.
[0009] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 145, 4, 5, 6 e 7, res- pectivamente; a VH da SEQ ID Nº: 140 e a VL da SEQ ID Nº: 16; e/ou a HC da SEQ ID Nº: 150 e a LC da SEQ ID Nº: 28.
[0010] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 146, 4, 5, 6 e 7, res- pectivamente; a VH da SEQ ID Nº: 141 e a VL da SEQ ID Nº: 16; e/ou a HC da SEQ ID Nº: 151 e a LC da SEQ ID Nº: 28.
[0011] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 147, 4, 5, 6 e 7, res- pectivamente; a VH da SEQ ID Nº: 142 e a VL da SEQ ID Nº: 16; e/ou a HC da SEQ ID Nº: 152 e a LC da SEQ ID Nº: 28.
[0012] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 3, 4, 148, 6 e 7, res- pectivamente; a VH da SEQ ID Nº: 10 e a VL da SEQ ID Nº: 143; e/ou a HC da SEQ ID Nº: 22 e a LC da SEQ ID Nº: 153.
[0013] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 3, 4, 149, 6 e 7, res- pectivamente; a VH da SEQ ID Nº: 10 e a VL da SEQ ID Nº: 144; e/ou a HC da SEQ ID Nº: 22 e a LC da SEQ ID Nº: 154.
[0014] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 145, 4, 148, 6 e 7, respectivamente; a VH da SEQ ID Nº: 140 e a VL da SEQ ID Nº: 143; e/ou a HC da SEQ ID Nº: 150 e a LC da SEQ ID Nº: 153.
[0015] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 146, 4, 148, 6 e 7, respectivamente; a VH da SEQ ID Nº: 141 e a VL da SEQ ID Nº: 143; e/ou a HC da SEQ ID Nº: 151 e a LC da SEQ ID Nº: 153.
[0016] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 147, 4, 148, 6 e 7, respectivamente; a VH da SEQ ID Nº: 142 e a VL da SEQ ID Nº: 143; e/ou a HC da SEQ ID Nº: 152 e a LC da SEQ ID Nº: 153.
[0017] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 145, 4, 149, 6 e 7, respectivamente; a VH da SEQ ID Nº: 140 e a VL da SEQ ID Nº: 144; e/ou a HC da SEQ ID Nº: 150 e a LC da SEQ ID Nº: 154.
[0018] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 146, 4, 149, 6 e 7, respectivamente; a VH da SEQ ID Nº: 141 e a VL da SEQ ID Nº: 144; e/ou a HC da SEQ ID Nº: 151 e a LC da SEQ ID Nº: 154.
[0019] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 147, 4, 149, 6 e 7, respectivamente, a VH da SEQ ID Nº: 142 e a VL da SEQ ID Nº: 144; e/ou a HC da SEQ ID Nº: 152 e a LC da SEQ ID Nº: 154.
[0020] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende uma região determinante de complemen- taridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), uma HCDR2, uma HCDR3, uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID Nºs: 32, 124, 40, 41,
42 e 43, respectivamente.
[0021] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das: SEQ ID Nºs: 32, 33, 40, 41, 42 e 43, respectivamente; a VH das SEQ ID Nºs: 44 ou 45 e a VL das SEQ ID Nºs: 60, 61 ou 62; e/ou a HC das SEQ ID Nºs: 66 ou 67 e a LC das SEQ ID Nºs: 82, 83 ou 84.
[0022] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 32, 34, 40, 41, 42 e 43, respectivamente; a VH da SEQ ID Nº: 46 e a VL da SEQ ID Nº: 61; e/ou a HC da SEQ ID Nº: 68 e a LC da SEQ ID Nº: 83.
[0023] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 32, 35, 40, 41, 42 e 43, respectivamente; a VH da SEQ ID Nº: 47 e a VL da SEQ ID Nº: 61; e/ou a HC da SEQ ID Nº: 69 e a LC da SEQ ID Nº: 83.
[0024] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 32, 36, 40, 41, 42 e 43, respectivamente; a VH da SEQ ID Nº: 48 e a VL da SEQ ID Nº: 61; e/ou a HC da SEQ ID Nº: 70 e a LC da SEQ ID Nº: 83.
[0025] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 32, 37, 40, 41, 42 e 43,
respectivamente; a VH da SEQ ID Nº: 49 e a VL da SEQ ID Nº: 61; e/ou a HC da SEQ ID Nº: 71 e a LC da SEQ ID Nº: 83.
[0026] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 32, 38, 40, 41, 42 e 43, respectivamente; a VH da SEQ ID Nº: 50 e a VL da SEQ ID Nº: 61; e/ou a HC da SEQ ID Nº: 72 e a LC da SEQ ID Nº: 83.
[0027] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 32, 39, 40, 41, 42 e 43, respectivamente; a VH da SEQ ID Nº: 51 e a VL da SEQ ID Nº: 61; e/ou a HC da SEQ ID Nº: 73 e a LC da SEQ ID Nº: 83.
[0028] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou fragmento ligação ao antígeno do mesmo, que compreende uma região determinante de complementari- dade de cadeia pesada 1 (HCDR1), uma HCDR2, uma HCDR3, uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID Nºs: 88, 89, 90, 91, 92 e 93, respectivamente.
[0029] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, sendo que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo compete pela ligação a PD-1 com o anticorpo da in- venção.
[0030] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, sendo que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo se liga ao mesmo epítopo de PD-1 como o anticorpo da invenção.
[0031] A invenção também fornece um a anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, sendo que a VH do anticorpo e a VL do anticorpo ou a HC do anticorpo e a LC do anticorpo são codificadas por determinados polinucleotídeos aqui mencionados.
[0032] A invenção também fornece um polinucleotídeo que codifi- ca o anticorpo da invenção.
[0033] A invenção também fornece um vetor que compreende ao menos um polinucleotídeo da invenção.
[0034] A invenção também fornece uma célula hospedeira que compreende o vetor da invenção.
[0035] A invenção também fornece um método de produção de um anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende cultivar a célula hospedeira em condições nas quais o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é expres- so, e isolar o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[0036] A invenção também fornece uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno da invenção.
[0037] A invenção também fornece um kit que compreende o anti- corpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção.
[0038] A invenção também fornece um método de supressão da ativação de uma célula T que expressa PD-1 em um indivíduo, que compreende administrar a um indivíduo o anticorpo isolado ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção por um tempo suficiente para suprimir a ativação da célula T que expressa PD-1.
[0039] A invenção também fornece um método de modulação ne- gativa de uma resposta imunológica, que compreende administrar a um indivíduo que precisa do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção por um tempo suficiente para modular negativa- mente a resposta imunológica.
[0040] A invenção também fornece um método de tratamento de um distúrbio imunológico, que compreende administrar a um indivíduo que precisa do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção por um tempo suficiente para tratar o distúrbio imunológi- co.
[0041] A invenção também fornece um anticorpo anti-idiotípico que se liga especificamente ao anticorpo ou ao fragmento de ligação a an- tígeno do mesmo da invenção.
[0042] A invenção também fornece um imunoconjugado que com- preende o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno da inven- ção conjugado a uma molécula heteróloga.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0043] A Figura 1A mostra que os anticorpos gerados seleciona- dos inibiram a ativação de células T em ensaio de recuperação de CMV em um teor de acima de 50% ou mais. CNTO3930: controle de isótipo. PD1B199: um mAb de PD-1 antagonista.
[0044] A Figura 1B mostra que os anticorpos gerados seleciona- dos inibiram a ativação de células T em ensaio de recuperação de CMV em um teor de acima de 50% ou mais. CNTO3930: controle de isótipo. PD1B199: um mAb de PD-1 antagonista.
[0045] A Figura 2A mostra o alinhamento das regiões VH da linha- gem de mAb PD1B505 PD1H93 (SEQ ID Nº: 8), PD1H384 (SEQ ID Nº: 9), PD1H405 (SEQ ID Nº: 10), PD1H585 (SEQ ID Nº: 140), PD1H586 (SEQ ID Nº: 141) e PD1H587 (SEQ ID Nº: 142). As regiões CDR estão sublinhadas. As SEQ ID Nºs: das cadeias VH são mostra-
das após o nome de cadeia na Figura (por exemplo, PD1H93_8; _8 indica a SEQ ID Nº: 8)
[0046] A Figura 2A mostra o alinhamento das regiões VL da linha- gem de mAb PD1B505 PD1L30 (SEQ ID Nº: 14), PD1L468 (SEQ ID Nº: 15), PD1L469 (SEQ ID Nº: 16), PD1L651 (SEQ ID Nº: 143) e PD1L652 (SEQ ID Nº: 144). As regiões CDR estão sublinhadas. As SEQ ID Nºs: das cadeias VL são mostradas após o nome de cadeia na Figura (por exemplo, PD1L30_14; _14 indica a SEQ ID Nº: 14)
[0047] A Figura 3A mostra o alinhamento das regiões VH da linha- gem de mAb PD1B506 PD1H90 (SEQ ID Nº: 44) PD1H388 (SEQ ID Nº: 45), PD1H399 (SEQ ID Nº: 46), PD1H400 (SEQ ID Nº: 47), PD1H401 (SEQ ID Nº: 48), PD1H402 (SEQ ID Nº: 49), PD1H403 (SEQ ID Nº: 50) e PD1H404 (SEQ ID Nº: 51). As regiões CDR estão subli- nhadas.
[0048] A Figura 2A mostra o alinhamento das regiões VL da linha- gem de mAb PD1B506 PD1L28 (SEQ ID Nº: 60), PD1L470 (SEQ ID Nº: 61) e PD1L471 (SEQ ID Nº: 62). As regiões CDR estão sublinha- das.
[0049] A Figura 4A mostra o alinhamento das regiões VH da linha- gem de mAb PD1B512 PD1H81 (SEQ ID Nº: 94) e PD1H389 (SEQ ID Nº: 95). As regiões CDR estão sublinhadas.
[0050] A Figura 2A mostra o alinhamento das regiões VL da linha- gem de mAb PD1B512 PD1L43 (SEQ ID Nº: 98), PD1L472 (SEQ ID Nº: 99) e PD1L473 (SEQ ID Nº: 100). As regiões CDR estão sublinha- das.
[0051] A Figura 5A mostra que PD1B505 e PD1B506 inibiram a ativação de células T específicas para o antígeno. A Figura mostra a porcentagem de inibição média e o desvio padrão (STDEV) de prolife- ração de células T no ensaio de recuperação de CMV. IgG1: controle de isótipo.
[0052] A Figura 5B mostra que PD1B743, PD1B750 e PD1B756 inibiram a ativação de células T específicas para o antígeno. A Figura mostra a porcentagem de inibição média e o desvio padrão (STDEV) de proliferação de células T no ensaio de recuperação de CMV. IgG1: controle de isótipo.
[0053] A Figura 5C mostra que PD1B878 e PD1B849 inibiram a ativação de células T específicas para o antígeno em um ensaio de recuperação de CMV. A Figura mostra a porcentagem de inibição mé- dia e o desvio padrão (STDEV) de proliferação de células T no ensaio de recuperação de CMV. IgG1: controle de isótipo.
[0054] A Figura 6A mostra que PD1B743 e PD1B756 não bloquea- ram a ligação de PD-L1 a PD-1, enquanto que PD1B750 bloqueou a interação em um ensaio de avaliação do grau de agrupamento de cé- lulas que expressam PD-1 e PD-L1 na presença ou ausência dos anti- corpos indicados com o uso de eventos duplo positivos expressos em porcentagem (%) como leitura do agrupamento. Os mAb de controle positivo bloquearam a interação com PD-L1/PD-1.
[0055] A Figura 6B mostra que PD1B743 e PD1B756 não bloquea- ram a ligação de PD-L2 a PD-1, enquanto que PD1B750 bloqueou a interação em um ensaio de avaliação do grau de agrupamento de cé- lulas que expressam PD-1 e PD-L2 na presença ou ausência dos anti- corpos indicados com o uso de eventos duplo positivos expressos em porcentagem (%) como leitura do agrupamento. Os mAb de controle positivo bloquearam a interação com PD-L2/PD-1.
[0056] A Figura 7 mostra um desenho esquemático de cinco famí- lias ou "grupos" de epítopos distintos dos anticorpos de PD-1 gerados. Os mAbs do Bin5 bloquearam a interação PD-L1/PD-1, enquanto os mAbs nos grupos 1 a 4 não bloquearam.
[0057] A Figura 8A mostra que a expressão de PD-1 foi mais alta nas células T de memória CD4+ CD45RO+ ou CD8+ CD45RO+ estimu-
ladas com CMV em comparação com as células T estimuladas com TT (inserção, intensidade de fluorescência média geométrica). Anticorpo de PD-1: linhagens sólidas; controle de isótipo: linhas tracejadas.
[0058] A Figura 8B mostra que PD1B878 e PD1B849 inibiram a ativação de células T específicas para CMV em um ensaio de recupe- ração específico de CMV. A Figura mostra a porcentagem (%) de inibi- ção média e o desvio padrão de proliferação de células T no ensaio de recuperação de CMV.
[0059] A Figura 9A mostra que PD1B849 e PD1B878 provocaram ADCC de células T de memória ativada na presença de células NK como células efetoras. As versões de fucose baixa (LF) dos anticorpos (PD1B849-LF e PD1B878-LF) demonstraram atividade intensificada de ADCC.
[0060] A Figura 9B mostra que PD1B849 e PD1B878 provocaram ADCC de células T de memória ativada na presença de células PBMCs como células efetoras. As versões de fucose baixa (LF) dos anticorpos (PD1B849-LF e PD1B878-LF) demonstraram atividade in- tensificada de ADCC.
[0061] A Figura 10A mostra ausência de ADCC mediada por PD1B849 e PD1B878 em células T de memória em repouso que ex- pressam níveis baixos de PD1 na presença de células NK como célu- las efetoras. As versões de fucose baixa (LF) dos anticorpos (PD1B849-LF e PD1B878-LF) mediaram alguma ADCC.
[0062] A Figura 10B mostra ausência de ADCC mediada por PD1B849 e PD1B878 em células T de memória em repouso que ex- pressam níveis baixos de PD1 na presença de células PBMCs como células efetoras. As versões de fucose baixa (LF) dos anticorpos (PD1B849-LF e PD1B878-LF) mediaram alguma ADCC.
[0063] A Figura 11 mostra que PD1B849 e PD1B878 não media- ram CDC mensurável de células T ativadas com o uso de complemen-
to de coelho. OKT3: um anticorpo CD3 anti-humano de camundongo (made in) (controle positivo); huIgG1: controle de isótipo, muIgG2a: controle de isótipo.
[0064] A Figura 12 mostra que PD1B878, PD1B1090 e PD1B1094 não bloquearam a ligação de PD-L1 a PD1 nas células.
[0065] A Figura 13A mostra que PD1B505-mIgG2a e PD1B506- mIgG2a impediram o desenvolvimento de doença no modelo de ca- mundongo de doença de enxerto contra hospedeiro (DECH ou GVHD, "graft-versus-host disease"). Os anticorpos foram dosados a 10 mg/kg i.p. nos dias 0, 4, 7, 11, 14 e 18 e o escore clínico foi registrada no de- correr do tempo.
[0066] A Figura 13B mostra que os anticorpos PD1B505-mIgG2a e PD1B506-mIgG2a mAbs (mIgG2a) impediram a perda de peso no mo- delo de camundongo de GvHD. Os anticorpos foram dosados a 10 mg/kg i.p. nos dias 0, 4, 7, 11, 14 e 18.
[0067] A Figura 14A mostra que PD1B849-mIgG2a e PD1B878- mIgG2a impediram o desenvolvimento de doença no modelo de ca- mundongo de doença de enxerto contra hospedeiro (GVHD). Os anti- corpos foram dosados a 10 mg/kg i.p. nos dias 0, 4, 7, 11, 14 e 18 e o escore clínico foi registrada no decorrer do tempo.
[0068] A Figura 14B mostra que PD1B849-mIgG2a e PD1B878- mIgG2a impediram a perda de peso no modelo de camundongo de GvHD. Os anticorpos foram dosados a 10 mg/kg i.p. nos dias 0, 4, 7, 11, 14 e 18.
[0069] A Figura 15 mostra que PD1B849-mIgG2a e PD1B878- mIgG2a aumentaram a frequência de células T regulatórias (Tregs) em baços no modelo de camundongo de GvHD.
[0070] A Figura 16 mostra que anticorpos anti-PD1 selecionados esgotam as populações de TFH/TPH. BF: Fucose baixa.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0071] Todas as publicações, incluindo, mas não se limitando a, patentes e pedidos de patente, citadas neste relatório descritivo estão aqui incorporadas a título de referência como se fossem descritas na íntegra.
[0072] Deve-se entender que a terminologia usada na presente invenção tem o propósito de descrever modalidades apenas e não pre- tende ser limitadora. Exceto onde definido em contrário, todos os ter- mos técnicos e científicos usados na presente invenção têm o mesmo significado, conforme comumente compreendido pelo versado na téc- nica à qual a invenção pertence.
[0073] Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equiva- lentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática dos testes da presente invenção, são descritos aqui materiais e métodos exempli- ficadores. Na descrição e na reivindicação da presente invenção, a terminologia a seguir será usada.
[0074] Para uso na presente invenção e nas reivindicações, as formas singulares "um", "e", e "o" incluem referências no plural, a me- nos que o contexto claramente determine o contrário.
[0075] A menos que o contexto exija claramente de outro modo, ao longo da descrição e das reivindicações, as palavras "compreen- de(m)", "que compreende(m)", e similares devem ser interpretadas em um sentido inclusivo em oposição a um sentido exclusivo ou exaustivo; ou seja, no sentido de "incluindo, mas não se limitando a".
[0076] O termo "se liga especificamente", "ligação específica" ou "se liga", se refere a um anticorpo que se liga a um antígeno ou a um epítopo dentro do antígeno com maior afinidade para outros antígenos ou epítopos. Tipicamente, o anticorpo se liga ao antígeno ou ao epíto- po dentro do antígeno com uma constante de dissociação em equilí- brio (KD) de cerca de 1x10-7 M ou menos, por exemplo cerca de 1x10-8
M ou menos, cerca de 1x10-9 M ou menos, cerca de 1x10-10 M ou me- nos, ou cerca de 1x10-11 M ou menos, ou cerca de 1x10-12 M ou me- nos, tipicamente com a KD que é ao menos dez vezes menor que sua KD para ligação a um antígeno não específico (por exemplo, BSA, ca- seína). A KD pode ser medida com o uso de procedimentos-padrão. Os anticorpos que se ligam especificamente ao antígeno ou ao epítopo dentro do antígeno podem, no entanto, apresentar reatividade cruzada com outros antígenos relacionados, por exemplo, com o mesmo antí- geno de outras espécies (homólogas), como humanos ou macacos, por exemplo Macaca fascicularis (cinomolgo) ou Pan troglodytes (chimpanzé) ou Callithrix jacchus (sagui comum ou sagui-de-tufos- brancos). Enquanto um anticorpo monoespecífico se liga especifica- mente a um antígeno ou a um epítopo, um anticorpo biespecífico se liga especificamente a dois antígenos diferentes ou dois epítopos dis- tintos.
[0077] "Agonista" ou "agonístico" se refere a um anticorpo que, mediante a ligação a PD-1, induz pelo menos uma atividade biológica que é induzida pelo ligante PD-L1 de PD-1. O anticorpo é um agonista quando a ao menos uma atividade biológica é induzida em ao menos cerca de 20%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% mais que na ausência do agonista (por exemplo, controle negativo), ou quando a indução é estatistica- mente significativa quando comparada com a indução na ausência do agonista. Uma atividade biológica típica que é induzida pela ligação de PD-L1 a PD-1 é a inibição de células CD4+ e/ou CD8+ específicas para o antígeno, resultando em supressão das respostas imunológicas.
[0078] PD-1 se refere à proteína de morte celular programada 1 humana, PD-1. A PD-1 é também conhecida como CD279 ou PDCD1. A sequência de aminoácidos da PD-1 humana madura (sem a se- quência de sinal) é mostrada na SEQ ID Nº: 131. O domínio extracelu-
lar abrange os resíduos 1 a 150, o domínio transmembranar abrange os resíduos 151 a 171, e o domínio citoplasmático abrange os resí- duos 172 a 268 da SEQ ID Nº: 1. Ao longo do relatório descritivo, "o domínio extracelular de PD-1 humana" ou "huPD1-ECD", se refere à proteína que tem a sequência de aminoácidos dos resíduos 1 a 150 da SEQ ID Nº: 1.
[0079] "Anticorpos" significa em um sentido amplo e inclui molécu- las de imunoglobulina pertencentes a qualquer classe, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, ou sub-classe IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 e incluindo qualquer dentre a cadeia leve kappa (κ) e lambda (λ). Os anticorpos incluem anticorpos monoclonais, anticorpos de comprimento completo, fragmentos de ligação ao antígeno, anticorpos biespecíficos ou multi- específicos, anticorpos diméricos, tetraméricos ou multiméricos, anti- corpos de cadeia única, anticorpos de domínio e qualquer outra confi- guração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um fragmento de ligação ao antígeno da especificidade necessária. Os "anticorpos de comprimento completo" são compreendidos de duas cadeias pesadas (HC) e duas cadeias leves (LC) interconectadas por ligações de dissulfeto, bem como por multímeros das mesmas (por exemplo, IgM). Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável da cadeia pesada (VH) e uma região constante da cadeia pe- sada (compreendida dos domínios CH1, dobradiça CH2 e CH3). Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável da cadeia leve (VL) e uma região constante da cadeia leve (CL). A VH e a VL podem, ainda, ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, chamadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões de estrutura principal (FR). Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro segmentos FR, dispostos do amino-terminal para o carbóxi- terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4.
[0080] As "regiões determinantes de complementaridade (CDR)"
são as regiões do anticorpo que se ligam a um antígeno. Existem três CDRs na VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) e três CDRs na VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3). As CDRs podem ser definidas com o uso de várias delineações como Kabat (Wu et al. (1970) J Exp Med 132: 211-50) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª edição Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., EUA, 1991), Chothia (Chothia et al. (1987), J Mol Biol 196: 901- 17), IMGT (Lefranc et al. (2003) Dev Comp Immunol 27: 55-77) e AbM (Martin e Thornton J Bmol Biol 263: 800-15, 1996). A correspondência entre as várias delineações e a numeração de região variável são des- critas (consulte, por exemplo, Lefranc et al. (2003) Dev Comp Immunol 27: 55-77; Honegger e Pluckthun, J Mol Biol (2001) 309:657-70; base de dados do International ImMunoGeneTics (IMGT); recursos da Web, http://www_imgt_org). Programas disponíveis como abYsis junto à UCL Business PLC podem ser utilizados para delinear as CDRs. Os termos "CDR", "HCDR1", "HCDR2", "HCDR3", "LCDR1", "LCDR2" e "LCDR3", conforme utilizados aqui, incluem as CDRs definidas por qualquer um dentre os métodos descritos acima, Kabat, Chothia, IMGT ou IMGT, a menos que explicitamente indicado de outro modo no rela- tório descritivo.
[0081] "Fragmento de ligação ao antígeno" se refere a uma porção de uma molécula de imunoglobulina que se liga a um antígeno. Os fragmentos de ligação ao antígeno podem ser polipeptídeos sintéticos obteníveis enzimaticamente ou manipulados geneticamente e incluem a VH, a VL, a VH e a VL, Fab, F(ab')2, e fragmentos de Fd e Fv, anti- corpos de domínio (dAb) consistindo em um domínio VH ou um domí- nio VL, domínios variáveis de IgNAR de tubarão, domínios VH cameli- zados, unidades mínimas de reconhecimento consistindo nos resíduos de aminoácido que mimetizam as CDRs de um anticorpo, como as porções de FR3-CDR3-FR4, a HCDR1, a HCDR2 e/ou the HCDR3 e a
LCDR1, a LCDR2 e/ou a LCDR3. Os domínios VH e VL podem ser unidos por um conector sintético para formar diversos tipos de designs de anticorpo de cadeia única onde os domínios VH/VL podem empare- lhar de forma intramolecular ou intermolecular, nos casos em que os domínios VH e VL são expressos por construtos separados de anticor- po de cadeia única, para formar um sítio de ligação de antígeno mono- valente, como a cadeia única Fv (scFv) ou diacorpo; descrito, por exemplo, nas publicações de patente internacionais n°s WO1998/44001, WO1988/01649, WO1994/13804 e WO1992/01047.
[0082] "Anticorpo monoclonal" se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de moléculas de anticorpo, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a po- pulação são idênticos exceto quanto a possíveis alterações bem co- nhecidas, como remoção de lisina da terminação C da cadeia pesada do anticorpo ou modificações pós-traducionais como isomerização ou desamidação de aminoácidos, oxidação de metionina, ou dsamidação de asparagina ou glutamina. Os anticorpos monoclonais tipicamente se ligam a um epítopo antigênico. Os anticorpos monoclonais biespe- cíficos se ligam a dois epítopos antigênicos diferentes. Os anticorpos monoclonais podem ter glicosilação heterogênea dentro da população de anticorpo. O anticorpo monoclonal pode ser monoespecífico ou multiespecífico, como biespecífico, monovalente, bivalente ou multiva- lente.
[0083] "Isolado" se refere a uma população homogênea de molé- culas (como polinucleotídeos sintéticos ou uma proteína como um an- ticorpo) que foram substancialmente separadas e/ou purificadas na direção contrária a outros componentes do sistema que as moléculas são produzidas, como uma célula recombinante, bem como uma prote- ína que foi submetida a ao menos uma etapa de purificação ou isola- mento. "Anticorpo isolado" se refere a um anticorpo que é substanci-
almente isento de outro material celular e/ou produtos químicos e abrange anticorpos que são isolados a uma pureza mais alta, como 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de pureza.
[0084] Os "anticorpos" incluem anticorpos gerados com o uso de várias tecnologias, incluindo anticorpos gerados a partir de animais imunizados como camundongos, ratos, coelhos ou galinhas, ou identi- ficados a partir de bibliotecas de exibição de fago ou mamíferos con- forme descrito na presente invenção.
[0085] "Anticorpo humanizado" se refere a um anticorpo no qual ao menos uma CDR é derivada de espécies não humanas, e ao me- nos um estrutura principal ("estrutura") é derivado das sequências de imunoglobulinas humanas. O anticorpo humanizado pode incluir subs- tituições nas estruturas principais de modo que as estruturas principais podem não ser cópias exatas da imunoglobulina humana expressa ou das sequências gênicas da linhagem germinativa da imunoglobulina humana.
[0086] "Anticorpo humano" se refere a um anticorpo que é otimi- zado para ter o mínimo de resposta imunológica quando administrado a um indivíduo humano. Regiões variáveis de anticorpo humano são derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Se o anticorpo tiver uma região constante ou uma porção da região constante, a região constante também é derivada das sequên- cias de imunoglobulina de linhagem germinativa humana.
[0087] O anticorpo humano compreende regiões variáveis de ca- deia pesada ou leve que são "derivadas de" sequências de imunoglo- bulina de linhagem germinativa humana se as regiões variáveis do an- ticorpo são obtidas de um sistema que usa genes de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Esses sistemas exemplificadores são bibliotecas de genes de imunoglobulina humana, exibidas em fago ou células de mamíferos, e animais transgênicos não humanos, como camundongos ou ratos, galinhas carregando loci de imunoglobulina humana. "Anticorpo humano" tipicamente contém diferenças de ami- noácidos em comparação com as imunoglobulinas expressas em se- res humanos devido às diferenças entre os sistemas usados para ob- ter o anticorpo e loci de imunoglobulina humana, introdução de muta- ções somáticas de ocorrência natural, introdução intencional de substi- tuições na estrutura principal ou CDRs. A sequência de aminoácidos do "anticorpo humano" é tipicamente cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos codifi- cada por sequências da imunoglobulina de linhagem germinativa hu- mana. Em alguns casos, o "anticorpo humano" pode conter sequên- cias de estrutura principal de consenso derivadas de análises de se- quências de estrutura principal humano, por exemplo, conforme des- crito em (Knappik et al. (2000) J Mol Biol 296: 57-86), ou HCDR3 sinté- tica incorporada em bibliotecas de genes de imunoglobulina humana expostas em fago, por exemplo, conforme descrito em (Shi et al. (2010) J Mol Biol 397: 385-96), e na publicação de patente internacio- nal n° WO2009/085462. Anticorpos nos quais as CDRs são derivadas de uma espécie não humana não são incluídos na definição de "anti- corpo humano".
[0088] "Recombinante" se refere a anticorpos e outras proteínas que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recom- binantes.
[0089] "Epítopo" se refere a uma porção de um antígeno a qual um anticorpo se liga especificamente. Os epítopos normalmente consis- tem em agrupamentos de superfície quimicamente ativa (como polar, não polar ou hidrofóbica) de porções como aminoácidos ou cadeias laterais de polissacarídeos e podem ter características estruturais tri-
dimensionais específicas, assim como características de carga especí- ficas. Um epítopo pode ser composto por aminoácidos contíguos ou descontíguos que formam uma unidade espacial conformacional. Para um epítopo não contíguo, aminoácidos de porções diferentes da se- quência linear do antígeno ficam em estreita proximidade no espaço tridimensional por meio do enovelamento da molécula de proteína.
[0090] "Multiespecífico(a)" se refere a uma proteína, como um an- ticorpo que se liga especificamente a dois ou mais antígenos distintos ou a dois ou mais epítopos distintos no mesmo antígeno. A proteína multiespecífica pode ter reatividade cruzada com outros antígenos re- lacionados, por exemplo, com o mesmo antígeno de outras espécies (homólogos), como humanos ou macacos, por exemplo, Macaca fasci- cularis (cinomolgo, cino), Pan troglodytes (chimpanzé, chimp) ou Calli- thrix jacchus (sagui comum, sagui) ou pode ser ligar a um epítopo que é compartilhado entre dois ou mais antígenos distintos.
[0091] "Biespecífico(a)" se refere a uma proteína, como um anti- corpo, que se liga especificamente a dois antígenos distintos ou a dois epítopos distintos no mesmo antígeno. A proteína biespecífica pode ter reatividade cruzada com outros antígenos relacionados, por exemplo, com o mesmo antígeno de outras espécies (homólogos), como huma- nos ou macacos, por exemplo, Macaca fascicularis (cinomolgo, cino), Pan troglodytes (chimpanzé, chimp) ou Callithrix jacchus (sagui co- mum, sagui) ou pode ser ligar a um epítopo que é compartilhado entre dois ou mais antígenos distintos.
[0092] "Em combinação com" significa que os fármacos ou agen- tes terapêuticos são administrados a um indivíduo, como um ser hu- mano, juntos em uma mistura, simultaneamente como agentes únicos ou sequencialmente como agentes únicos em qualquer ordem.
[0093] Os termos "tratar" ou "tratamento" referem-se tanto ao tra- tamento terapêutico como ao profilático ou a medidas preventivas em que o objetivo é prevenir ou reduzir (diminuir) uma alteração ou distúr- bio fisiológico indesejado. Resultados clínicos benéficos ou desejados incluem o alívio dos sintomas, diminuição da extensão da doença, es- tado de doença estabilizada (ou seja, não piora), atraso ou abranda- mento da progressão da doença, melhora ou paliativo do estado de doença, e remissão (seja parcial ou total), detectável ou indetectável. "Tratamento" pode também significar prolongar a sobrevida em com- paração com a sobrevida esperada se um indivíduo não estava rece- bendo tratamento. Indivíduos que necessitam de tratamento incluem os que já apresentam a doença ou distúrbio, bem como aqueles pro- pensos a apresentar a condição ou distúrbio ou os indivíduos cuja condição ou distúrbio precisa ser prevenido.
[0094] "Quantidade terapeuticamente eficaz" se refere uma quan- tidade eficaz, em doses e durante os intervalos de tempo necessários, para obter o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeu- ticamente eficaz pode variar dependendo de fatores, como o estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo e da habilidade da terapia ou uma combinação de terapias, para induzir uma resposta desejada no indivíduo. Indicadores exemplificadores de uma terapêutica eficaz ou combinação de agentes terapêuticos que incluem, por exemplo, bem- estar aprimorado do paciente.
[0095] "Resposta imunológica" inclui respostas imunológicas me- diadas por células T e/ou mediadas por células B. As respostas imuno- lógicas exemplificadoras incluem respostas de célula T, por exemplo, produção de citocinas e citotoxicidade celular. Além disso, o termo resposta imunológica inclui respostas imunológicas que são indireta- mente afetadas pela ativação de células, por exemplo, a produção de anticorpos (respostas humorais) e pela ativação de células que res- pondem a citocinas, por exemplo, macrófagos.
[0096] "Modular negativamente" ou "modulação negativa" se refe-
re a uma redução detectável no nível de uma resposta imunológica em um indivíduo quando comparado com o nível de uma resposta no indi- víduo na ausência de um tratamento ou composto, e/ou em compara- ção com o nível de uma resposta em um indivíduo de outro modo idên- tico, mas não tratado.
[0097] "Distúrbio imunológico" se refere a qualquer doença, distúr- bio ou sintoma da doença causada por uma atividade do sistema imu- ne, incluindo doenças autoimunes, doenças inflamatórias e alergias.
[0098] "Indivíduo" inclui qualquer ser humano ou animal não- humano. "Animais não humanos" inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, como primatas não humanos, ovelhas, cães, gatos, cavalos, vacas, galinhas, anfíbios, répteis. Os termos "indivíduo" e "paciente" podem ser usados de maneira inter- cambiável na presente invenção.
[0099] O termo "vetor" significa um polinucleotídeo capaz de ser duplicado dentro de um sistema biológico ou que pode ser movido en- tre tais sistemas. Polinucleotídeos vetores contêm tipicamente elemen- tos, como as origens de replicação, sinais de poliadenilação ou mar- cadores de seleção, que funcionam para facilitar a duplicação ou ma- nutenção desses polinucleotídeos em um sistema biológico. Exemplos desses sistemas biológicos podem incluir uma célula, vírus, animal, planta, e sistemas biológicos reconstituídos que utilizam componentes biológicos capazes de duplicar um vetor. O polinucleotídeo que com- preende um vetor pode ser moléculas de DNA ou RNA ou um híbrido das mesmas.
[0100] O termo "vetor de expressão" significa um vetor que pode ser utilizado em um sistema biológico ou em um sistema biológico re- constituído para direcionar a tradução de um polipeptídeo codificado por uma sequência de polinucleotídeo presente no vetor de expressão.
[0101] "Polinucleotídeo" se refere a uma molécula sintética que compreende uma cadeia de nucleotídeos ligada covalentemente por uma cadeia principal de açúcar-fosfato ou outra ligação química cova- lente equivalente. O cDNA é um polinucleotídeo sintético exemplifica- dor.
[0102] O termo "polipeptídeo" ou "proteína" significa uma molécula que compreende ao menos dois resíduos de aminoácidos ligados por uma ligação peptídica para formar um polipeptídeo. Pequenos polipep- tídeos com menos de 50 aminoácidos podem ser chamados de "peptí- deos".
[0103] "Cerca de" significa dentro de uma faixa de erro aceitável para o valor específico conforme determinado pelo versado na técnica, que dependerá em parte de como o valor é medido ou determinado, isto é, as limitações do sistema de medição. Exceto onde explicitamen- te indicado em contrário dentro dos Exemplos ou em outro local do Re- latório Descritivo no contexto de um ensaio específico, resultado espe- cífico ou modalidade específica, "cerca de" significa dentro de um des- vio padrão por prática na técnica, ou uma faixa de até 5%, qualquer que for maior.
[0104] "Amostra" se refere a uma coleção de fluidos, células ou tecidos similares isolados de um indivíduo, bem como fluidos, células ou tecidos presentes em um indivíduo. Amostras exemplificadoras são fluidos biológicos como sangue, soro e fluidos serosos, plasma, linfa, urina, saliva, fluido cístico, gotas de lágrima, fezes, escarro, secreções mucosais dos tecidos e órgãos secretores, secreções vaginais, fluidos de ascite, fluidos das cavidades pleurais, pericardiais, peritoneais, ab- dominais e outras cavidades corporais, fluidos coletados por lavagem brônquica, fluido sinovial, soluções líquidas em contato com um indiví- duo ou fonte biológica, por exemplo, meio de cultura de célula ou de órgão incluindo meio condicionado de célula ou de órgão, fluidos de lavagem e similares, biópsias de tecido, aspirações de agulha fina, te-
cido ressecado cirurgicamente, culturas de órgãos ou culturas celula- res.
[0105] Códigos de aminoácidos de uma letra e de três letras con- vencionais são usados na presente invenção conforme mostrado na Tabela 1. Tabela 1. Código de uma Código de Código de Aminoácido Código de três letras Aminoácido letra três letras uma letra Alanina Ala A Leucina Leu L Arginina Arg R Lisina Lys K Asparagina Asn N Metionina Met M Aspartato Asp D Fenilalanina Phe F Cisteína Cys C Prolina Pro P Glutamato Gln E Serina Ser S Glutamina Glu Q Treonina Thr T Glicina Gly G Triptofano Trp W Histidina His H Tirosina Tyr Y Isoleucina Ile I Valina Val V Composições de Matéria
[0106] São aqui fornecidos anticorpos que se ligam especificamen- te a PD-1 ou a fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, polinu- cleotídeos que codificam os anticorpos aqui fornecidos, vetores, célu- las hospedeiras e métodos de preparo e uso dos anticorpos. Os anti- corpos ou os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos podem ser anticorpos agonísticos.
[0107] Alguns pacientes com câncer tratados com inibidores do ponto de checagem imune, incluindo antagonistas de PD-1, desenvol- vem eventos adversos relacionados a autoimunes, como sintomas de artrite, colite ou psoríase. Uma hipótese para explicar essa observação é que as células T autorreativas nestes pacientes estavam sendo ati- vamente suprimidas através de PD-1, e foram "liberadas" na presença de um antagonista de PD-1. Então é razoável inverter esta hipótese e acreditar que é provável que as células T "já liberadas" nos pacientes que tenham uma doença autoimune poderia ser suprimida através de ligação/agonismo de PD-1/.
[0108] Verificou-se que os SNPs no gene PD-1 de PDCD1 estão associados a uma variedade de doenças autoimunes, incluindo artrite reumatoide, lúpus e espondilite anquilosante (resumidas por Zamani et al., Cell Immunol 2016 310: 27-41). Embora ainda não foram elucida- das funções para o SNPs de PD-1, essas associações podem indicar que uma redução na atividade de PD-1 pode levar a uma redução na supressão de células T, o que pode aumentar a suscetibilidade à do- ença autoimune.
[0109] Existe uma necessidade de agentes terapêuticos para su- primir células T autorreativas nas doenças autoimunes. Células T de PD-1+ foram encontradas em tecidos de pacientes com doenças au- toimunes, incluindo artrite reumatoide e síndrome de Sjogren (Wan et al., Immunol 2006 177(12):8844-50.; Kobayashi et al., J Rheumatol 2005 32(11):2156-63). Um anticorpo capaz de agonizar PD-1 poderia ser usado para suprimir a proliferação de células T e a liberação de citocinas, para limitar os danos nos tecidos e restaurar a homeostase imune. Um anticorpo agonista de PD-1 seria direcionado a células ati- vadas em vez de células T puras (sem tratamento prévio) e de memó- ria em repouso e células B. Desta forma o agente terapêutico iria su- primir respostas imunológicas em relação a autoantígenos em pacien- tes com doenças autoimunes sem comprometer as respostas imunes de memória a patógenos. Dois tipos de célula T que expressam altos níveis de PD-1, TFH e TPH, promovem respostas de células B e produ- ção de anticorpo (Rao et al., Nature 2017; 542: 110-114). A frequência dessas células é aumentada em doenças autoimunes induzidas pela produção de autoanticorpos, incluindo artrite reumatoide, lúpus erite-
matoso sistêmico e síndrome de Sjogren (Rao et al., Nature 2017; 542: 110-114; He et al., Immunity 2013; 39: 770-781; Verstappen et al., Ar- thr e Rheum 2017; 69(9): 1850-1861). Os anticorpos da invenção, além de fornecerem supressão de células T ativadas podem esgotar seletivamente células que exibem alta expressão de PD-1, como célu- las TFH e TPH.
[0110] A invenção fornece um anticorpo isolado que se liga especi- ficamente a PD-1 ou a um fragmento de ligação ao antígeno do mes- mo.
[0111] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compreende uma região determinante de complemen- taridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), uma HCDR2, uma HCDR3, uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), uma LCDR2 e/ou uma LCDR3 de qualquer um dos anticor- pos PD1B505, PD1B742, PD1B743, PD1B878, PD1B506, PD1B750, PD1B751, PD1B845, PD1B846, PD1B847, PD1B848, PD1B849, PD1B850, PD1B512, PD1B756, PD1B757, PD1B1085, PD1B1086, PD1B1087, PD1B1088, PD1B1089, PD1B1090, PD1B1091, PD1B1092, PD1B1093, PD1B1094 ou PD1B1095.
[0112] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma estrutura principal de região variável de cadeia pesada (VH) e/ou uma estrutura principal de região variável de cadeia leve (VL) de qualquer um dos anticorpos PD1B505, PD1B742, PD1B743, PD1B878, PD1B506, PD1B750, PD1B751, PD1B845, PD1B846, PD1B847, PD1B848, PD1B849, PD1B850, PD1B512, PD1B756, PD1B757, PD1B1085, PD1B1086, PD1B1087, PD1B1088, PD1B1089, PD1B1090, PD1B1091, PD1B1092, PD1B1093, PD1B1094 ou PD1B1095.
[0113] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende a VH e/ou a VL de qualquer um dos anticor- pos PD1B505, PD1B742, PD1B743, PD1B878, PD1B506, PD1B750, PD1B751, PD1B845, PD1B846, PD1B847, PD1B848, PD1B849, PD1B850, PD1B512, PD1B756, PD1B757, PD1B1085, PD1B1086, PD1B1087, PD1B1088, PD1B1089, PD1B1090, PD1B1091, PD1B1092, PD1B1093, PD1B1094 ou PD1B1095.
[0114] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo é um anticorpo agonístico.
[0115] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo me- deia ADCC de células que expressam PD-1.
[0116] Em algumas modalidades, as células que expressam PD-1 são células T de memória ativadas, células T helper foliculares (TFH) ou células T helper periféricas (TPH), ou qualquer combinação das mesmas. As células T FH podem ser identificadas como: vivas, CD19- CD56-/CD4+CD45RO+/HLADR+/CXCR5+/ICOS+PD1+; As células TPH podem ser identificadas como: vivas, CD19-CD56- /CD4+CD45RO+/HLADR+/CXCR5-/ICOS+PD1+; A combinação de células TFH/TPH podem ser identificados como: vivas, CD19-CD56- /CD4+CD45RO+/HLADR+/ICOS+PD1. As células T de memória po- dem ser identificadas como CD4+ CD45RO+ ou CD8+ CD45RO+. Anticorpos da linhagem de PD1B505
[0117] Os mAbs PD1B505, PD1B742, PD1B743, PD1B878, PD1B1085, PD1B1086, PD1B1087, PD1B1088, PD1B1089, PD1B1090, PD1B1091, PD1B1092, PD1B1093, PD1B1094 ou PD1B1095 são anticorpos exemplificadores da linhagem de mAb PD1B505. Estes mAbs têm regiões CDR regiões idênticas, exceto que alguns anticorpos têm uma diferença de aminoácidos na HCDR2 e uma ou duas diferenças de aminoácidos na LCDR1. A identidade da região VH é de entre 82 a 100% e a identidade da região VL entre 78 a 100%. Os mAbs da linhagem PD1B505 são ligantes de não bloqueio.
[0118] A linhagem é caracterizada pela HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 165, 4, 166, 6 e 7, respectivamente, e pela sequência gênica de VH da SEQ ID Nº: 118 e a sequência gênica de VL da SEQ ID Nº: 119. SEQ ID Nº: 165 (HCDR2 genus) WINIETGXPT; sendo que a X é E, Y, H ou W. SEQ ID Nº: 166 (LCDR1 genus) TASSSX1X2SSYLH; em que: X1 é V ou F; e X2 é S ou P.
[0119] A invenção também fornece um anticorpo antagonista que se liga especificamente a PD-1, ou uma sua porção de ligação ao an- tígeno, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 165, 4, 166, 6 e 7, respectiva- mente.
[0120] Em algumas modalidades, o anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende a HCDR2 das SEQ ID NOs 3, 145, 146 ou 147 e/ou a LCDR1 das SEQ ID Nºs: 5, 148 ou 149.
[0121] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo tem uma, duas, três, quatro ou cinco das seguintes propriedades: não bloqueia a ligação de PD-L1 a PD-1, sendo que a falta de bloqueio é medida pela incapacidade do anticorpo de inibir o agru-
pamento de células que expressam PD-L1 e que expressam PD-1 conforme descrito no Exemplo 1; se liga a PD-1 com uma constante de dissociação em equi- líbrio (KD) de cerca de 5x10-8 M ou menos, sendo que a KD é medida com o uso de um sistema ProteOn XPR36 a +25°C; se liga a PD-1 com uma constante de associação (ka) de cerca de 3x104 1/Ms ou mais, sendo que a ka é medida com o uso de um sistema ProteOn XPR36 C a +25°C; se liga a PD-1 com uma constante de dissociação (kd) de cerca de 3x10-3 1/s ou menos, sendo que a kd é medida com o uso de um sistema ProteOn XPR36 a +25°C; ou inibe a proliferação de células T específicas de antígeno; sendo que a proliferação é avaliada em um ensaio de CMV-PBMC.
[0122] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1, ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo do mesmo, compreende a estrutura principal de VH derivado de IIGHV7- 4-1*1 (SEQ ID Nº: 125).
[0123] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1, ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo do mesmo, compreende a estrutura principal de VL derivado de IGKV3D- 20*1 (SEQ ID Nº: 126).
[0124] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1, ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo do mesmo, compreende a estrutura principal de VH derivado de IIGHV7- 4-1*1 (SEQ ID Nº: 125) e a estrutura principal da VL derivado de IGKV3D-20*1 (SEQ ID Nº: 126). SEQ ID Nº: 125 IGHV7-4-1*1
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGL EWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQICSLKAEDTA VYYCAR
SEQ ID Nº: 126 IGKV3D-20*1
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCGASQSVSSSYLAWYQQKPGLAPRL LIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSS P
[0125] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a região variável da cadeia pesada (VH) da SEQ ID Nº: 118. SEQ ID Nº: 118 é uma sequência do gênero VH de mABs da linhagem PD1B505.
[0126] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a região variável da cadeia leve (VL) da SEQ ID Nº: 119. SEQ ID Nº: 118 é uma sequência do gênero VL de mABs da linhagem PD1B505.
[0127] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a VH da SEQ ID Nº: 118 e a VL da SEQ ID Nº: 119. As CDRs são mostradas em negrito na SEQ ID Nº: 118 e SEQ ID Nº: 119. SEQ ID Nº: 118 (PD1B505 Linhagem VH gênero) X1VQLX2X3SGX4ELKKPGX5X6VKX7SCKASGYTFTDYSMHWVX8QAP GX9GLX10WMGWINIETGX11PTYAX12X13FX14GRFX15FSLX16TSX17STA YLQIX18X19LKX20EDTAX21YFCARDYYGTYFYAMDYWGQGTX22X23TV SS; em que: X1 é D ou Q; X2 é Q ou V; X3 é E ou Q; X4 é P ou S; X5 é E ou A; X6 é T ou S;
X7 é I ou V; X8 é K ou R; X9 é K ou Q; X10 é K ou E; X11 é E, Y, H ou W; X12 é D ou Q; X13 é D ou G; X14 é K ou T; X15 é A ou V; X16 é E ou D; X17 é A ou V; X18 é F, N ou S; X19 é F, N ou S; X20 é N ou S; X21 é T ou V; X22 é T ou L; ou X23 é L ou V.
SEQ ID Nº: 119 (gênero VL da linhagem PD1B505) X1IVLTQSPAX2X3SX4SX5GERX6TX7X8CTASSSX9X10SSYLHWYQQKP GX11X12PX13LX14IYSTSNLASGX15PX16RFSGSGSGTX17X18X19LTISX20 X21EX22EDX23AX24YYCH QYHRSPLTFGX25GTKLEX26K; em que: X1 é Q ou E; X2 é I ou T; X3 é M ou L; X4 é A ou L; X5 é L ou P; X6 é V ou A; X7 é M ou L; X8 é T ou S; X9 é V ou F;
X10 é S ou P; X11 é S ou L; X12 é S ou A; X13 é K ou R; X14 é W ou L; X15 é V ou I; X16 é A ou D; X17 é S ou D; X18 é Y ou F; X19 é S ou T; X20 é S ou R; X21 é M ou L; X22 é A ou P; X23 é A ou F; X24 é T ou V; X25 é A ou Q; e X26 é L ou I.
[0128] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende a VH das SEQ ID Nºs: 8, 9, 10, 140, 141 ou 142.
[0129] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende a VL das SEQ ID Nºs: 14, 15, 16, 143 ou 144.
[0130] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende a VH das SEQ ID Nºs: 8, 9, 10, 140, 141 ou 142 e a VL das SEQ ID Nºs: 14, 15, 16, 143 ou 144.
[0131] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a
LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 3, 4, 5, 6 e 7, respec- tivamente.
[0132] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID Nº: 8, 9 ou 10 e a VL das SEQ ID Nºs: 14, 15 ou 16.
[0133] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada (HC) da SEQ ID Nº: 20, 21 ou 22 e uma cadeia leve (LC) das SEQ ID Nºs: 26, 27 ou 28.
[0134] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 145, 4, 5, 6 e 7, res- pectivamente. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID Nº: 140 e a VL da SEQ ID Nº: 16. Em algumas modali- dades, o anticorpo compreende a HC da SEQ ID Nº: 150 e a LC da SEQ ID Nº: 28. O anticorpo é também fornecido para uso em terapia, como no tratamento de um distúrbio imunológico, artrite reumatoide, lúpus, lúpus eritematoso sistêmico ou doença de enxerto contra hos- pedeiro.
[0135] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 146, 4, 5, 6 e 7, res- pectivamente. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID Nº: 141 e a VL da SEQ ID Nº: 16. Em algumas modali- dades, o anticorpo compreende a HC da SEQ ID Nº: 151 e a LC da SEQ ID Nº: 28. O anticorpo é também fornecido para uso em terapia, como no tratamento de um distúrbio imunológico, artrite reumatoide, lúpus, lúpus eritematoso sistêmico ou doença de enxerto contra hos- pedeiro.
[0136] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 147, 4, 5, 6 e 7, res- pectivamente. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID Nº: 142 e a VL da SEQ ID Nº: 16. Em algumas modali- dades, o anticorpo compreende a HC da SEQ ID Nº: 152 e a LC da SEQ ID Nº: 28. O anticorpo é também fornecido para uso em terapia, como no tratamento de um distúrbio imunológico, artrite reumatoide, lúpus, lúpus eritematoso sistêmico ou doença de enxerto contra hos- pedeiro.
[0137] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 3, 4, 148, 6 e 7, res- pectivamente. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID Nº: 10 e a VL da SEQ ID Nº: 143. Em algumas modali- dades, o anticorpo compreende a HC da SEQ ID Nº: 22 e a LC da SEQ ID Nº: 153. O anticorpo é também fornecido para uso em terapia, como no tratamento de um distúrbio imunológico, artrite reumatoide, lúpus, lúpus eritematoso sistêmico ou doença de enxerto contra hos- pedeiro.
[0138] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 3, 4, 149, 6 e 7, respectivamente. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID Nº: 10 e a VL da SEQ ID Nº: 144. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a HC da SEQ ID Nº: 22 e a LC da SEQ ID Nº: 154. O anti- corpo é também fornecido para uso em terapia, como no tratamento de um distúrbio imunológico, artrite reumatoide, lúpus, lúpus eritematoso sistêmico ou doença de enxerto contra hospedeiro.
[0139] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 145, 4, 148, 6 e 7, respectivamente. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID Nº: 140 e a VL da SEQ ID Nº: 143. Em algumas moda- lidades, o anticorpo compreende a HC da SEQ ID Nº: 150 e a LC da SEQ ID Nº: 153. O anticorpo é também fornecido para uso em terapia, como no tratamento de um distúrbio imunológico, artrite reumatoide, lúpus, lúpus eritematoso sistêmico ou doença de enxerto contra hos- pedeiro.
[0140] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 146, 4, 148, 6 e 7, respectivamente. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID Nº: 141 e a VL da SEQ ID Nº: 143. Em algumas moda- lidades, o anticorpo compreende a HC da SEQ ID Nº: 151 e a LC da SEQ ID Nº: 153. O anticorpo é também fornecido para uso em terapia, como no tratamento de um distúrbio imunológico, artrite reumatoide, lúpus, lúpus eritematoso sistêmico ou doença de enxerto contra hos- pedeiro.
[0141] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 147, 4, 148, 6 e 7, respectivamente. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID Nº: 142 e a VL da SEQ ID Nº: 143. Em algumas moda- lidades, o anticorpo compreende a HC da SEQ ID Nº: 152 e a LC da
SEQ ID Nº: 153. O anticorpo é também fornecido para uso em terapia, como no tratamento de um distúrbio imunológico, artrite reumatoide, lúpus, lúpus eritematoso sistêmico ou doença de enxerto contra hos- pedeiro.
[0142] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 145, 4, 149, 6 e 7, respectivamente. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID Nº: 140 e a VL da SEQ ID Nº: 144. Em algumas moda- lidades, o anticorpo compreende a HC da SEQ ID Nº: 150 e a LC da SEQ ID Nº: 154. O anticorpo é também fornecido para uso em terapia, como no tratamento de um distúrbio imunológico, artrite reumatoide, lúpus, lúpus eritematoso sistêmico ou doença de enxerto contra hos- pedeiro.
[0143] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 146, 4, 149, 6 e 7, respectivamente. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID Nº: 141 e a VL da SEQ ID Nº: 144. Em algumas moda- lidades, o anticorpo compreende a HC da SEQ ID Nº: 151 e a LC da SEQ ID Nº: 154. O anticorpo é também fornecido para uso em terapia, como no tratamento de um distúrbio imunológico, artrite reumatoide, lúpus, lúpus eritematoso sistêmico ou doença de enxerto contra hos- pedeiro.
[0144] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 147, 4, 149, 6 e 7,
respectivamente. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID Nº: 142 e a VL da SEQ ID Nº: 144. Em algumas moda- lidades, o anticorpo compreende a HC da SEQ ID Nº: 152 e a LC da SEQ ID Nº: 154. O anticorpo é também fornecido para uso em terapia, como no tratamento de um distúrbio imunológico, artrite reumatoide, lúpus, lúpus eritematoso sistêmico ou doença de enxerto contra hos- pedeiro.
[0145] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo é um anticorpo agonístico.
[0146] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, sendo o anticorpo compete pela ligação a PD-1 com o anti- corpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compre- ende a VH da SEQ ID Nº: 8 e a VL da SEQ ID Nº: 14; a VH da SEQ ID Nº: 9 e a VL da SEQ ID Nº: 15; a VH da SEQ ID Nº: 9 e a VL da SEQ ID Nº: 16; a VH da SEQ ID Nº: 10 e a VL da SEQ ID Nº: 16; a VH da SEQ ID Nº: 140 e a VL da SEQ ID Nº: 16; a VH da SEQ ID Nº: 141 e a VL da SEQ ID Nº: 16; a VH da SEQ ID Nº: 142 e a VL da SEQ ID Nº: 16; a VH da SEQ ID Nº: 10 e a VL da SEQ ID Nº: 143; a VH da SEQ ID Nº: 10 e a VL da SEQ ID Nº: 144; a VH da SEQ ID Nº: 140 e a VL da SEQ ID Nº: 143; a VH da SEQ ID Nº: 141 e a VL da SEQ ID Nº: 143; a VH da SEQ ID Nº: 142 e a VL da SEQ ID Nº: 143; a VH da SEQ ID Nº: 140 e a VL da SEQ ID Nº: 144; a VH da SEQ ID Nº: 141 e a VL da SEQ ID Nº: 144; ou a VH da SEQ ID Nº: 142 e a VL da SEQ ID Nº: 144.
[0147] A invenção também fornece na presente invenção um anti- corpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, sendo que o anticorpo se liga ao mes- mo epítopo que é ligado pelo anticorpo que compreende a VH da SEQ ID Nº: 8 e a VL da SEQ ID Nº: 14; a VH da SEQ ID Nº: 9 e a VL da SEQ ID Nº: 15; a VH da SEQ ID Nº: 9 e a VL da SEQ ID Nº: 16; a VH da SEQ ID Nº: 10 e a VL da SEQ ID Nº: 16; a VH da SEQ ID Nº: 140 e a VL da SEQ ID Nº: 16; a VH da SEQ ID Nº: 141 e a VL da SEQ ID Nº: 16; a VH da SEQ ID Nº: 142 e a VL da SEQ ID Nº: 16; a VH da SEQ ID Nº: 10 e a VL da SEQ ID Nº: 143; a VH da SEQ ID Nº: 10 e a VL da SEQ ID Nº: 144; a VH da SEQ ID Nº: 140 e a VL da SEQ ID Nº: 143; a VH da SEQ ID Nº: 141 e a VL da SEQ ID Nº: 143; a VH da SEQ ID Nº: 142 e a VL da SEQ ID Nº: 143; a VH da SEQ ID Nº: 140 e a VL da SEQ ID Nº: 144; a VH da SEQ ID Nº: 141 e a VL da SEQ ID Nº: 144; ou a VH da SEQ ID Nº: 142 e a VL da SEQ ID Nº: 144.
[0148] Em algumas modalidades, a VH e a VL ou a HC e a LC do anticorpo que se liga especificamente a PD-1 ou o fragmento de liga- ção a antígeno dos mesmos são aqui fornecidos codificado por um po- linucleotídeo compreendendo a sequência de polinucleotídeo das SEQ ID Nºs: 11 e 17, respectivamente; SEQ ID Nºs: 12 e 18, respectivamente; SEQ ID Nºs: 12 e 19, respectivamente; SEQ ID Nºs: 13 e 19, respectivamente; SEQ ID Nºs: 23 e 29, respectivamente; SEQ ID Nºs: 24 e 30, respectivamente; SEQ ID Nºs: 24 e 31, respectivamente;
SEQ ID Nºs: 25 e 31, respectivamente; SEQ ID Nºs: 132 e 133, respectivamente; ou SEQ ID Nºs: 134 e 135, respectivamente; SEQ ID Nºs: 155 e 19, respectivamente; SEQ ID Nºs: 156 e 19, respectivamente; SEQ ID Nºs: 157 e 19, respectivamente; SEQ ID Nºs: 13 e 158, respectivamente; SEQ ID Nºs: 13 e 159, respectivamente; SEQ ID Nºs: 155 e 158, respectivamente; SEQ ID Nºs: 156 e 158, respectivamente; SEQ ID Nºs: 157 e 158, respectivamente; SEQ ID Nºs: 155 e 159, respectivamente; SEQ ID Nºs: 156 e 159, respectivamente; SEQ ID Nºs: 157 e 159, respectivamente; SEQ ID Nºs: 160 e 31, respectivamente; SEQ ID Nºs: 161 e 31, respectivamente; SEQ ID Nºs: 162 e 31, respectivamente; SEQ ID Nºs: 25 e 163, respectivamente; SEQ ID Nºs: 25 e 164, respectivamente; SEQ ID Nºs: 160 e 163, respectivamente; SEQ ID Nºs: 161 e 163, respectivamente; SEQ ID Nºs: 162 e 163, respectivamente; SEQ ID Nºs: 160 e 164, respectivamente; SEQ ID Nºs: 161 e 164, respectivamente; ou SEQ ID Nºs: 162 e 164, respectivamente. Anticorpos da Linhagem de PD1B506
[0149] Os mAbs PD1B506, PD1B750, PD1B751, PD1B845, PD1B846, PD1B847, PD1B848, PD1B849 e PD1B850 são anticorpos exemplificadores da linhagem de mAb PD1B506. Esses mAbs têm HCDR1, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 idênticas, e uma variante de HCDR2. A identidade da região VH é de entre 80 a 100% e a iden- tidade da região VL cerca de 98%. Os mAbs da linhagem PD1B506 são bloqueantes de ligante. A linhagem é caracterizada pela HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 32, 124, 40, 41, 42 e 43, respectivamente, e pela sequência do gênero VH de SEQ ID Nº: 120 e a sequência do gênero da SEQ ID Nº: 121.
[0150] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou um fragmento que se liga ao antígeno do mesmo que compreende a HCDR1, a HCDR2 e a HCDR3 das SEQ ID Nºs: 32, 124, 40, 41, 42 e 43, respectivamente. SEQ ID Nº: 124 (gênero HCDR2 da linhagem PD1B506) EINPNX1X2GIN; em que: X1 é N, D, Q, K ou E; e X2 é G, A ou I.
[0151] Em algumas modalidades, o anticorpo isolado que se liga es- pecificamente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende a HCDR2 das SEQ ID NOs 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39.
[0152] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo fornecido na presente invenção tem uma, duas, três, quatro ou cinco das seguintes propriedades: bloqueia a ligação de PD-L1 a PD-1, sendo que o bloqueio é medido pela capacidade do anticorpo de inibir o agrupamento de cé- lulas que expressam PD-L1 e que expressam PD-1 conforme descrito no Exemplo 1; se liga a PD-1 com uma constante de dissociação em equi- líbrio (KD) de cerca de 5x10-8 M ou menos, sendo que a KD é medida com o uso de um sistema ProteOn XPR36 a +25°C; se liga a PD-1 com uma constante de associação (ka) de cerca de 4x105 1/Ms ou mais, sendo que a ka é medida com o uso de um sistema ProteOn XPR36 C a +25°C;
se liga a PD-1 com uma constante de dissociação (kd) de cerca de 1x10-2 1/s ou menos, sendo que a kd é medida com o uso de um sistema ProteOn XPR36 a +25°C; ou inibe a proliferação de células T específicas de antígeno; sendo que a proliferação é avaliada em um ensaio de CMV-PBMC conforme descrito no Exemplo 1.
[0153] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1, ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo do mesmo, compreende a estrutura principal de VH derivado de IGHV1- 2*02 (SEQ ID Nº: 127).
[0154] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1, ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo do mesmo, compreende a estrutura principal de VL derivado de IGKV 1D- 16*1 (SEQ ID Nº: 128).
[0155] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1, ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo do mesmo, compreende a estrutura principal de VH derivado de IGHV1- 2*02 (SEQ ID Nº: 127) e a estrutura principal da VL derivado de IGKV1D-16*1 (SEQ ID Nº: 128). SEQ ID Nº: 127 IGHV1-2*02
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGL EWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDT
AVYYCAR SEQ ID Nº: 128 IGKV1D-16*1
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSL IYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSY P
[0156] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a região variável da cadeia pesada (VH)
da SEQ ID Nº: 120. SEQ ID Nº: 120 é uma sequência do gênero VH de mABs da linhagem de PD1B506.
[0157] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a região variável da cadeia leve (VL) da SEQ ID Nº: 121. SEQ ID Nº: 121 é uma sequência do gênero VL de mABs da linhagem de PD1B506.
[0158] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a VH da SEQ ID Nº: 120 e a VL da SEQ ID Nº: 121. As CDRs estão em negrito na SEQ ID Nº: 120 e SEQ ID Nº: 121. SEQ ID Nº: 120 (gênero VH da linhagem de PD1B506) QVQLX1QX2GAEX3X4KPGASVKX5SCKASGYTFTTYWMHWVX6QX7P GQGLEWX8GEINPNX9X10GINY X11X12KFX13X14X15X16TLTVDKSX17STAYMX18LSX19LX20SX21D X22AVYYCTIDYYDYGGYWGQGTX23X24TVSS; em que: X1 é Q ou V; X2 é S ou P; X3 é L ou V; X4 é V ou K; X5 é L ou V; X6 é K ou R; X7 é R ou A; X8 é I ou M; X9 é N, D, Q, K ou E; X10 é G, A ou I; X11 é N ou A; X12 é E ou Q; X13 é K ou Q;
X14 é K ou G; X15 é K ou R X16 é A ou V; X17 é S ou I; X18 é Q ou E; X19 é S ou R; X20 é T ou R; X21 é E ou D; X22 é S ou T; X23 é T ou L; e X24 é L ou V.
SEQ ID Nº: 121 (gênero VL da linhagem PD1B506) DIX1MTQSX2X3X4X5SX6SVX7DRVX8X9TCKASQNVGTNVAWYQQKPX 10X11X12PKX13LIYSASYRYSGVPX14RFX15GSGSGTDFTLTIX16X17X18Q
X19EDX20AX21YX22CQQYNIYPYTFGX23GTKLEX24K; em que: X1 é V ou Q; X2 é Q ou P; X3 é K ou S; X4 é F ou S; X5 é M ou L; X6 é T ou A; X7 é R ou G; X8 é S ou T; X9 é V ou I; X10 é G ou E; X11 é Q ou K; X12 é S ou A; X13 é A ou S; X14 é D ou S; X15 é T ou S;
X16 é T ou S; X17 é N ou S; X18 é V ou L; X19 é S ou P; X20 é L ou F; X21 é E ou T; X22 é F ou Y; X23 é S ou Q; e X24 é M ou I.
[0159] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifica- mente a PD-1 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compre- ende a VH das SEQ ID Nºs: 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ou 51.
[0160] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende a VL das SEQ ID Nºs: 60, 61 ou 62.
[0161] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende a VH das SEQ ID Nºs: 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ou 51 e a VL das SEQ ID Nºs: 60, 61 ou 62.
[0162] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 32, 33, 40, 41, 42 e 43, respectivamente. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID Nº: 44 ou 45 e a VL das SEQ ID Nºs: 60, 61 ou 62. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID Nº: 66 ou 67 e a LC das SEQ ID Nºs: 82, 83 ou 84. O anticorpo é também fornecido para uso em terapia, como no tratamento de um distúrbio imunológico, artrite reumatoide, lúpus, lúpus eritematoso sistêmico ou doença de enxerto contra hospedeiro.
[0163] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 32, 34, 40, 41, 42 e 43, respectivamente. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID Nº: 46 e a VL da SEQ ID Nº: 61. Em algumas modali- dades, o anticorpo compreende a HC da SEQ ID Nº: 68 e a LC da SEQ ID Nº: 83. O anticorpo é também fornecido para uso em terapia, como no tratamento de um distúrbio imunológico, artrite reumatoide, lúpus, lúpus eritematoso sistêmico ou doença de enxerto contra hos- pedeiro.
[0164] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 32, 35, 40, 41, 42 e 43, respectivamente. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID Nº: 47 e a VL da SEQ ID Nº: 61. Em algumas modali- dades, o anticorpo compreende a HC da SEQ ID Nº: 69 e a LC da SEQ ID Nº: 83. O anticorpo é também fornecido para uso em terapia, como no tratamento de um distúrbio imunológico, artrite reumatoide, lúpus, lúpus eritematoso sistêmico ou doença de enxerto contra hos- pedeiro.
[0165] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 32, 36, 40, 41, 42 e 43, respectiva- mente. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID Nº: 48 e a VL da SEQ ID Nº: 61. Em algumas modalidades, o anticor- po compreende a HC da SEQ ID Nº: 70 e a LC da SEQ ID Nº: 83. O anti- corpo é também fornecido para uso em terapia, como no tratamento de um distúrbio imunológico, artrite reumatoide, lúpus, lúpus eritematoso sistêmico ou doença de enxerto contra hospedeiro.
[0166] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 32, 37, 40, 41, 42 e 43, respectivamente. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID Nº: 49 e a VL da SEQ ID Nº: 61. Em algumas modali- dades, o anticorpo compreende a HC da SEQ ID Nº: 71 e a LC da SEQ ID Nº: 83. O anticorpo é também fornecido para uso em terapia, como no tratamento de um distúrbio imunológico, artrite reumatoide, lúpus, lúpus eritematoso sistêmico ou doença de enxerto contra hos- pedeiro.
[0167] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 32, 38, 40, 41, 42 e 43, respectivamente. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID Nº: 50 e a VL da SEQ ID Nº: 61. Em algumas modali- dades, o anticorpo compreende a HC da SEQ ID Nº: 72 e a LC da SEQ ID Nº: 83. O anticorpo é também fornecido para uso em terapia, como no tratamento de um distúrbio imunológico, artrite reumatoide, lúpus, lúpus eritematoso sistêmico ou doença de enxerto contra hos- pedeiro.
[0168] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 32, 39, 40, 41, 42 e 43, respectivamente. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a VH da SEQ ID Nº: 51 e a VL da SEQ ID Nº: 61. Em algumas modali-
dades, o anticorpo compreende a HC da SEQ ID Nº: 73 e a LC da SEQ ID Nº: 83. O anticorpo é também fornecido para uso em terapia, como no tratamento de um distúrbio imunológico, artrite reumatoide, lúpus, lúpus eritematoso sistêmico ou doença de enxerto contra hos- pedeiro.
[0169] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo ago- nístico.
[0170] A invenção também fornece aqui um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou um fragmento de ligação ao antíge- no do mesmo, sendo que o anticorpo compete pela ligação a PD-1 com o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende: a VH da SEQ ID Nº: 44 e a VL da SEQ ID Nº: 60; a VH da SEQ ID Nº: 45 e a VL da SEQ ID Nº: 61; a VH da SEQ ID Nº: 45 e a VL da SEQ ID Nº: 62; a VH da SEQ ID Nº: 46 e a VL da SEQ ID Nº: 61; a VH da SEQ ID Nº: 47 e a VL da SEQ ID Nº: 61; a VH da SEQ ID Nº: 48 e a VL da SEQ ID Nº: 61; a VH da SEQ ID Nº: 49 e a VL da SEQ ID Nº: 61; a VH da SEQ ID Nº: 50 e a VL da SEQ ID Nº: 61; ou a VH da SEQ ID Nº: 51 e a VL da SEQ ID Nº: 61.
[0171] A invenção também fornece na presente invenção um anti- corpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, sendo que o anticorpo se liga ao mes- mo epítopo que é ligado pelo anticorpo que compreende a VH da SEQ ID Nº: 44 e a VL da SEQ ID Nº: 60; a VH da SEQ ID Nº: 45 e a VL da SEQ ID Nº: 61; a VH da SEQ ID Nº: 45 e a VL da SEQ ID Nº: 62; a VH da SEQ ID Nº: 46 e a VL da SEQ ID Nº: 61; a VH da SEQ ID Nº: 47 e a VL da SEQ ID Nº: 61;
a VH da SEQ ID Nº: 48 e a VL da SEQ ID Nº: 61; a VH da SEQ ID Nº: 49 e a VL da SEQ ID Nº: 61; a VH da SEQ ID Nº: 50 e a VL da SEQ ID Nº: 61; ou a VH da SEQ ID Nº: 51 e a VL da SEQ ID Nº: 61.
[0172] Em algumas modalidades, a VH e a VL ou a HC e a LC do anticorpo que se liga especificamente a PD-1 ou ao fragmento de liga- ção a antígeno dos mesmos são aqui fornecidos codificado por um po- linucleotídeo compreendendo a sequência de polinucleotídeo das SEQ ID Nºs: 52 e 63, respectivamente; SEQ ID Nºs: 53 e 64, respectivamente; SEQ ID Nºs: 53 e 65, respectivamente; SEQ ID Nºs: 54 e 64, respectivamente; SEQ ID Nºs: 55 e 64, respectivamente; SEQ ID Nºs: 56 e 64, respectivamente; SEQ ID Nºs: 57 e 64, respectivamente; SEQ ID Nºs: 58 e 64, respectivamente; SEQ ID Nºs: 59 e 64, respectivamente; SEQ ID Nºs: 74 e 85, respectivamente; SEQ ID Nºs: 75 e 86, respectivamente; SEQ ID Nºs: 75 e 87, respectivamente; SEQ ID Nºs: 76 e 86, respectivamente; SEQ ID Nºs: 77 e 86, respectivamente; SEQ ID Nºs: 78 e 86, respectivamente; SEQ ID Nºs: 79 e 86, respectivamente; SEQ ID Nºs: 80 e 86, respectivamente; SEQ ID Nºs: 81 e 86, respectivamente; SEQ ID Nºs: 136 e 137, respectivamente; ou SEQ ID Nºs: 138 e 139, respectivamente. Anticorpos da linhagem de PD1B512
[0173] As mAbs PD1B505, PD1B756 e PD1B757 são anticorpos exemplificadores da linhagem de mAb PD1B512. Esses mAbs têm re- giões CDR idênticas com a identidade da região VH de cerca de 84% e a identidade da região VL entre 90 a 99%. Os mAbs da linhagem PD1B512 são ligantes de não bloqueio. A linhagem é caracterizada pela HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 88, 89, 90, 91, 92 e 93, respectivamente, e pela se- quência gênica de VH da SEQ ID Nº: 122 e a sequência gênica de VL da SEQ ID Nº: 123.
[0174] A invenção também fornece um anticorpo antagonista que se liga especificamente a PD-1, ou uma sua porção de ligação ao an- tígeno, que compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 88, 89, 90, 91, 92 e 93, respecti- vamente.
[0175] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não bloqueia a ligação de PD-L1 a PD- 1, sendo que a falta de bloqueio é medida pela incapacidade do anti- corpo de inibir o agrupamento de células que expressam PD-L1 e que expressam PD-1, conforme descrito no Exemplo 1.
[0176] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1, ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo do mesmo fornecido aqui compreende a estrutura principal de VH deriva- do de IIGHV2-5*04 (SEQ ID Nº: 129).
[0177] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1, ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo do mesmo, fornecido aqui compreende a estrutura principal de VL deriva- do de IGKV2-28*01 (SEQ ID Nº: 130).
[0178] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1, ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo do mesmo fornecido aqui compreende a estrutura principal de VH deriva- do de IIGHV2-5*04 (SEQ ID Nº: 129 e a estrutura principal da VL deri-
vado de IGKV2-28*01 (SEQ ID Nº: 130). SEQ ID Nº: 129 IGHV2-5*04
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGVGVGWIRQPPGKALE WLALIYWNDDKRYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTGTY
YCV SEQ ID Nº: 130 IGKV2-28*01
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQ SPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCM QALQTP
[0179] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a região variável da cadeia pesada (VH) da SEQ ID Nº: 122. SEQ ID Nº: 122 é uma sequência do gênero VH de mABs da linhagem de PD1B512.
[0180] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a região variável da cadeia leve (VL) da SEQ ID Nº: 123. SEQ ID Nº: 123 é uma sequência do gênero VL de mABs da linhagem de PD1B512.
[0181] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a VH da SEQ ID Nº: 122 e a VL da SEQ ID Nº: 123. As CDRs estão em negrito na SEQ ID Nº: 122 e SEQ ID Nº: 123. SEQ ID Nº: 122 (gênero VH da linhagem de PD1B112) QX1TLKESGPX2LX3X4PX5QTLX6LTCX7FSGFSLSTSGMGVSWIRQPX 8GKX9LEWLAHIYWDDDKRYX10PSLKSRLTIX11KDTSX12NQVX13LX14X 15TX16X17DX18X19DTGTYYCVRKGYYDYGYVMDYWGQGTX20VTVSS, em que X1 é V ou I;
X2 é G ou T; X3 é L ou V; X4 é Q ou K; X5 é S ou T; X6 é S ou T; X7 é S ou T; X8 é S ou P; X9 é G ou A; X10 é N ou S; X11 é S ou T; X12 é S ou K; X13 é F ou V; X14 é K ou T; X15 é I ou M; X16 é S ou N; X17 é V ou M; X18 é T ou P; X19 é A ou V; e X20 é T ou L.
SEQ ID Nº: 123 (gênero VL da linhagem PD1B112) DIVMTQX1X2LSX3PVTX4GX5X6ASISCRSSKSLLHSNGITYLNWYLQK PGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSX7SGSGTDFTLX8ISRVEAEDVGV YYCAQNLELPLTFGX9GTKX10EX11K, em que X1 é A ou S; X2 é A ou P; X3 é N ou L; X4 é L ou P; X5 é T ou E; X6 é S ou P; X7 é S ou G;
X8 é R ou K; X9 é S ou G; X10 é L ou V; e X11 é M ou I.
[0182] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende a VH das SEQ ID Nºs: 94 ou 95.
[0183] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende a VL das SEQ ID Nºs: 98, 99 ou 100.
[0184] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a VH da sSEQ ID Nºs: 94 ou 95 e a VL das SEQ ID Nºs: 98, 99 ou 100.
[0185] A invenção também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a VH da SEQ ID Nº: 94 e a VL da SEQ ID Nº: 98. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a HC da SEQ ID Nº: 104 e a LC da SEQ ID Nº: 108. O anticorpo é também for- necido para uso em terapia, como no tratamento de um distúrbio imu- nológico, artrite reumatoide, lúpus, lúpus eritematoso sistêmico ou do- ença de enxerto contra hospedeiro.
[0186] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende a VH da SEQ ID Nº: 95 e a VL da SEQ ID Nº: 99. Em al- gumas modalidades, o anticorpo compreende a HC da SEQ ID Nº: 105 e a LC da SEQ ID Nº: 109. O anticorpo é também fornecido para uso em terapia, como no tratamento de um distúrbio imunológico, artrite reumatoide, lúpus, lúpus eritematoso sistêmico ou doença de enxerto contra hospedeiro.
[0187] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo for- necido aqui compreende a VH da SEQ ID Nº: 95 e a VL da SEQ ID Nº:
100. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a HC da SEQ ID Nº: 105 e a LC da SEQ ID Nº: 110. O anticorpo é também fornecido para uso em terapia, como no tratamento de um distúrbio imunológico, artrite reumatoide, lúpus, lúpus eritematoso sistêmico ou doença de enxerto contra hospedeiro.
[0188] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo ago- nístico.
[0189] A invenção também fornece aqui um anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou um fragmento de ligação ao antíge- no do mesmo, sendo que o anticorpo compete pela ligação a PD-1 com o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende: a VH da SEQ ID Nº: 94 e a VL da SEQ ID Nº: 98; a VH da SEQ ID Nº: 95 e a VL da SEQ ID Nº: 99; ou a VH da SEQ ID Nº: 95 e a VL da SEQ ID Nº: 100.
[0190] A invenção também fornece na presente invenção um anti- corpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, sendo que o anticorpo se liga ao mes- mo epítopo que é ligado pelo anticorpo que compreende a VH da SEQ ID Nº: 94 e a VL da SEQ ID Nº: 98; a VH da SEQ ID Nº: 95 e a VL da SEQ ID Nº: 99; ou a VH da SEQ ID Nº: 95 e a VL da SEQ ID Nº: 100.
[0191] Em algumas modalidades, a VH e a VL ou a HC e a LC do anticorpo que se liga especificamente a PD-1 ou o fragmento de liga- ção a antígeno dos mesmos são aqui fornecidos codificado por um po- linucleotídeo compreendendo a sequência de polinucleotídeo das SEQ ID Nºs: 96 e 101, respectivamente;
SEQ ID Nºs: 97 e 102, respectivamente; SEQ ID Nºs: 97 e 103, respectivamente; SEQ ID Nºs: 106 e 111, respectivamente; SEQ ID Nºs: 107 e 112, respectivamente; ou SEQ ID Nºs: 107 e 113, respectivamente. Anticorpos homólogos e anticorpos com mutações conservativas
[0192] Variantes dos anticorpos que se ligam especificamente a PD-1 ou os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos aqui forne- cidos estão dentro do escopo da invenção. Por exemplo, as variantes podem compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ou 29 substituições de aminoácidos na VH e/ou na VL desde que os anticorpos variantes re- tenham ou tenham propriedades funcionais melhoradas quando com- parados com os anticorpos parentais. Em algumas modalidades, a identidade de sequência pode ser cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com a sequência de aminoácido da VH e/ou da VL da invenção. Em algumas modalidades, a variação está nas re- giões de estrutura principal. Em algumas modalidades, as variantes são geradas por substituições conservativas.
[0193] Por exemplo, os anticorpos da linhagem de PD1B505 po- dem compreender substituições nas posições de resíduo da VH 1, 5, 6, 9, 16, 17, 20, 38, 43, 46, 57, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 84, 85, 88, 93, 116 e/ou 117 (numeração de resíduos de acordo com a SEQ ID Nº: 8) e nas posições de resíduo da VL 1, 10, 11, 13, 15, 19, 21, 22, 29, 30, 43, 44, 46, 48, 59, 61, 71, 72, 73, 78, 79, 81, 84, 86, 101 e/ou 107 (numeração dos resíduos de acordo com a SEQ ID Nº: 14). Os anti- corpos da linhagem de PD1B506 podem compreender substituições nas posições de resíduo da VH 5, 7, 11, 12, 20, 38, 40, 48, 55, 56, 61, 62, 65, 66, 67, 68, 76, 82, 85, 87, 89, 91, 112 e/ou 113 (numeração de resíduos de acordo com a SEQ ID Nº: 44) e nas posições de resíduo da VL 3, 8, 9, 10, 11, 13, 16, 20, 21, 41, 42, 43, 46, 60, 63, 76, 77, 78, 80, 83, 85, 87, 100 e/ou 106 (numeração dos resíduos de acordo com a SEQ ID Nº: 60). Os anticorpos da linhagem de PD1B512 podem compreender substituições nas posições de resíduo da VL 2, 10, 12, 13, 15, 19, 23, 43, 46, 62, 72, 77, 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90 e/ou 117 e nas posições de resíduo da VL 7, 8, 11, 15, 17, 18, 69, 79, 105, 109 e/ou 111. Substituição conservativas podem ser feitas em quaisquer posições indicadas e os anticorpos variantes resultantes testados quanto a suas características desejadas nos ensaios aqui descritos. Alternativamente, as substituições em um mAb da linhagem podem ser feitas nas posições indicadas pela substituição com o aminoácido cor- respondente na posição específica presente nos outros anticorpos dentro da linhagem.
[0194] Também são fornecidos anticorpos que se ligam especifi- camente a PD-1 ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que compreendem a VH e a VL que são ao menos 80% idênticas a a VH da SEQ ID Nº: 8 e a VL da SEQ ID Nº: 14; a VH da SEQ ID Nº: 9 e a VL da SEQ ID Nº: 15; a VH da SEQ ID Nº: 9 e a VL da SEQ ID Nº: 16; a VH da SEQ ID Nº: 10 e a VL da SEQ ID Nº: 16; a VH da SEQ ID Nº: 140 e a VL da SEQ ID Nº: 16; a VH da SEQ ID Nº: 141 e a VL da SEQ ID Nº: 16; a VH da SEQ ID Nº: 142 e a VL da SEQ ID Nº: 16; a VH da SEQ ID Nº: 10 e a VL da SEQ ID Nº: 143; a VH da SEQ ID Nº: 10 e a VL da SEQ ID Nº: 144; a VH da SEQ ID Nº: 140 e a VL da SEQ ID Nº: 143; a VH da SEQ ID Nº: 141 e a VL da SEQ ID Nº: 143; a VH da SEQ ID Nº: 142 e a VL da SEQ ID Nº: 143; a VH da SEQ ID Nº: 140 e a VL da SEQ ID Nº: 144;
a VH da SEQ ID Nº: 141 e a VL da SEQ ID Nº: 144; a VH da SEQ ID Nº: 142 e a VL da SEQ ID Nº: 144; a VH da SEQ ID Nº: 44 e a VL da SEQ ID Nº: 60; a VH da SEQ ID Nº: 45 e a VL da SEQ ID Nº: 61; a VH da SEQ ID Nº: 45 e a VL da SEQ ID Nº: 62; a VH da SEQ ID Nº: 46 e a VL da SEQ ID Nº: 61; a VH da SEQ ID Nº: 47 e a VL da SEQ ID Nº: 61; a VH da SEQ ID Nº: 48 e a VL da SEQ ID Nº: 61; a VH da SEQ ID Nº: 49 e a VL da SEQ ID Nº: 61; a VH da SEQ ID Nº: 50 e a VL da SEQ ID Nº: 61; a VH da SEQ ID Nº: 51 e a VL da SEQ ID Nº: 61; a VH da SEQ ID Nº: 94 e a VL da SEQ ID Nº: 98; a VH da SEQ ID Nº: 95 e a VL da SEQ ID Nº: 99; ou a VH da SEQ ID Nº: 95 e a VL da SEQ ID Nº: 100.
[0195] Em algumas modalidades, a identidade é 85%. Em algu- mas modalidades, a identidade é 90%. Em algumas modalidades, a identidade é 91%. Em algumas modalidades, a identidade é 91%. Em algumas modalidades, a identidade é 92%. Em algumas modalidades, a identidade é 93%. Em algumas modalidades, a identidade é 94%. Em algumas modalidades, a identidade é 94%. Em algumas modali- dades, a identidade é 96%. Em algumas modalidades, a identidade é 97%. Em algumas modalidades, a identidade é 98%. Em algumas mo- dalidades, a identidade é 99%.
[0196] A identidade percentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas se- quências (isto é, % de identidade= n° de posições idênticas/n° total de posições x 100), levando em consideração o número de lacunas e o comprimento de cada lacuna, as quais precisam ser introduzidas para o alinhamento ideal das duas sequências.
[0197] A porcentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada com o uso do algoritmo de E. Me- yers e W. Miller (Comput Appl Biosci 4:11-17 (1988)), que foi incorpo- rado no programa ALIGN (versão 2.0) com o uso de uma tabela de resíduos de peso PAM120, uma penalidade por comprimento de lacu- na de 12 e uma penalidade por lacuna de 4. Além disso, a identidade porcentual entre duas sequências de aminoácido pode ser determina- da usando-se o algoritmo de Needleman e Wunsch (J Mol Biol 48:444- 453 (1970)) que foi incorporado ao programa GAP no pacote de sof- tware GCG (disponível em http://_www_gcg_com), com o uso de uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso por lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso por comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
[0198] Em algumas modalidades, os anticorpos variantes compre- endem uma ou duas substituições conservativas em qualquer das re- giões CDR, sendo que os anticorpos retêm as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos parentais.
[0199] "Modificações conservadoras" se referem a modificações de aminoácido que não afetam ou alteram significativamente as carac- terísticas de ligação do anticorpo contendo as modificações de amino- ácidos. Modificações conservativas incluem substituições, adições e deleções de aminoácidos. Substituições conservativas de aminoácidos são aquelas em que o aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. As famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais similares são bem definidos e incluem aminoácidos com cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais básicas (por exemplo, lisi- na, arginina, histidina), cadeias laterais não polares (por exemplo, ala- nina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), ca- deias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagi- na, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina, triptofano), cadeias laterais aromáticas (por exemplo, fenilalanina, triptofano, histidina, tiro- sina), cadeias laterais alifáticas (por exemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina), amida (por exemplo, asparagina, glutamina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina), e cadeias laterais contendo enxofre (cisteína, meti- onina). Além disso, qualquer resíduo nativo no polipeptídeo pode tam- bém ser substituído por alanina, conforme foi previamente descrito pa- ra mutagênese por varredura de alanina (MacLennan et al., (1988) Ac- ta Physiol Scand Suppl 643:55 a 67; Sasaki et al., (1988) Adv Biophys 35:1 a 24). As substituições de aminoácidos aos anticorpos da inven- ção podem ser realizadas por meio de métodos conhecidos, por exemplo, pela mutagênese por PCR (patente US n° 4.683.195). Alter- nativamente, as bibliotecas de variantes podem ser geradas, por exemplo, usando códons aleatórios (NNK) ou não aleatórios, por exemplo, códons DVK, que codificam 11 aminoácidos (Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Asn, Arg, Ser, Tyr, Trp). As variantes de anticorpo resul- tantes podem ser avaliadas quanto as suas características usando-se os ensaios aqui descritos. Anticorpos Manipulados e Modificados
[0200] Os anticorpos que especificamente se ligam a PD-1 ou os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da invenção aqui for- necidos podem ainda ser manipulados para gerar anticorpos modifica- dos com propriedades similares ou alteradas em comparação com os anticorpos parentais. A VH, a VL, a VH e a VL, as regiões constantes, a estrutura principal de cadeia pesada, a estrutura principal de cadeia leve ou qualquer ou todas as seis CDRs podem ser manipuladas nos anticorpos da invenção.
[0201] Os anticorpos que se ligam especificamente a PD-1 ou os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos podem ser manipula- dos por enxertia de CDR. Uma ou mais sequências de CDR dos anti-
corpos da invenção podem ser enxertados a uma diferente sequência do arcabouço. A enxertia de CDR pode ser feita usando-se os méto- dos conhecidos e os métodos aqui descritos.
[0202] As sequências de estrutura a serem usadas podem ser ob- tidas junto às bases de dados públicas de DNA ou referências publica- das que incluem sequências de genes de anticorpos de linhagem ger- minativa. Por exemplo, o DNA da linhagem germinativa e as sequên- cias de proteínas codificadas para genes de domínios variáveis de ca- deia pesada e leve podem ser encontrados em IMGT®, o sistema in- ternacional de informação ImMunoGeneTics® http://_www-imgt_org. As sequências de estrutura que podem ser usadas para substituir as se- quências de estrutura existentes dos anticorpos da invenção podem ser aquelas que mostram a porcentagem mais alta (%) de identidade para os domínios variáveis parentais ao longo de todo o comprimento da VH ou da VL, ou ao longo do comprimento da FR1, FR2, FR3 e FR4. Além disso, estruturas adequadas podem, ainda, ser seleciona- das com base nos comprimentos de CDR1 e CDR2 do VH e do VL ou estrutura canônica idêntica de LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1 e HCDR2. Estruturas adequadas podem ser selecionadas com o uso de métodos conhecidos, como a adaptação da estrutura humana descrita na patente U.S. n° 8.748.356 ou super-humanização descrita na pa- tente U.S. N° 7.709.226.
[0203] As sequências da estrutura dos anticorpos parentais e ma- nipulados podem ser adicionalmente modificadas, por exemplo, por retromutações para restaurar e/ou melhorar a ligação dos anticorpos gerados ao antígeno, conforme descrito, por exemplo, na patente U.S. n° 6.180.370. As sequências da estrutura dos anticorpos parentais e manipulados podem ser adicionalmente modificadas por mutação de um ou mais resíduos dentro da região da estrutura (ou alternativamen- te dentro de uma ou mais regiões CDR) para remover os epítopos de células T para assim reduzir a imunogenicidade potencial do anticorpo. Essa abordagem é também chamada de "desimunização" e está des- crita em maiores detalhes na publicação de patente U.S. No. US20070014796.
[0204] Os resíduos de CDR dos anticorpos ou dos fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui fornecidos podem ser mutados para melhorar a afinidade dos anticorpos a PD-1.
[0205] Os resíduos de CDR dos anticorpos ou dos fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui fornecidos podem ser mutados para minimizar o risco de modificações pós-traducionais. Os resíduos de aminoácidos de motivos putativos para a desaminação (NS), hidró- lise catalisada por ácido (DP), isomerização (DS), ou oxidação (W) po- dem ser substituídos com qualquer um dos aminoácidos de ocorrência natural para mutagenizar os motivos, e os anticorpos resultantes po- dem ser testados quanto à sua funcionalidade e estabilidade com o uso dos métodos aqui descritos.
[0206] Os anticorpos que especificamente se ligam a PD-1 ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, fornecidos aqui que são modificados para melhorar a estabilidade, a seletividade, a reativi- dade cruzada, a afinidade, a imunogenicidade ou outras propriedades biológicas ou biofísicas desejadas estão dentro do escopo da inven- ção. A estabilidade de um anticorpo é influenciada por inúmeros fato- res, incluindo (1) o empacotamento do núcleo dos domínios individuais que afetam sua estabilidade intrínseca, (2) as interações de interface proteína/proteína que têm impacto no pareamento de HC e LC, (3) a disposição de resíduos polares e carregados, (4) a rede de ligação H a resíduos polares e carregados; e (5) a distribuição dos resíduos pola- res e carregados na superfície entre outras forças intra e intermolecu- lares (Worn et al., (2001) J Mol Biol 305:989-1010). Resíduos com o potencial para desestabilizar estruturas podem ser identificados com base na estrutura cristalina do anticorpo ou através de modelagem molecular em determinados casos, e o efeito dos resíduos sobre a es- tabilidade do anticorpo pode ser testado através da geração e da ava- liação de variantes que abrigam mutações nos resíduos identificados. Uma das maneiras de aumentar a estabilidade do anticorpo é aumen- tar a temperatura de transição de ponto médio (T m) conforme medida por Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC). De modo geral, a Tm da proteína está correlacionada com sua estabilidade e inversamente correlacionada com sua suscetibilidade ao desdobramento e desnatu- ração em solução e aos processos de degradação que dependem da tendência da proteína a se desdobrar (Remmele et al., (2000) Bi- opharm 13:36-46). Inúmeros estudos revelaram a correlação entre a classificação da estabilidade física das formulações medida como es- tabilidade térmica por calorimetria de varredura diferencial (CVD) e a estabilidade física medida por outros métodos (Gupta et al., (2003) AAPS PharmSci 5E8; Zhang et al., (2004) J Pharm Sci 93:3076-89; Maa et al., (1996) Int J Pharm 140:155-68; Bedu-Addo et al., (2004) Pharm Res 21:1353-61; Remmele et al., (1997) Pharm Res 15:200-8). Os estudos de formulação sugerem que uma Tm de Fab implica na es- tabilidade física de longo prazo de um mAb correspondente. Isótipos de anticorpo, alótipos e anticorpos contendo Fc manipulado
[0207] Os anticorpos que se ligam especificamente a PD-1 ou os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos aqui fornecidos podem ser de qualquer isótipo ou alótipo conhecido com Fc de tipo selvagem ou manipulado.
[0208] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo aqui fornecido é um isótipo IgG1.
[0209] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo aqui fornecido é um isótipo IgG2.
[0210] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo aqui fornecido é um isótipo IgG3.
[0211] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo aqui fornecido é um isótipo IgG4.
[0212] Lisina do terminal C (CTL) pode ser removida de anticorpos injetados por carboxipeptidases endógenas que circulam na corrente sanguínea (Cai et al., (2011) Biotechnol Bioeng 108:404-412). Durante a fabricação, a remoção de CTL pode ser controlada para menos do que o nível máximo pelo controle de concentração de Zn2+ extracelu- lar, EDTA ou EDTA – Fe3+ conforme descrito na publicação de patente U.S. No. US20140273092. O teor de CTL nos anticorpos pode ser medido com o uso de métodos conhecidos.
[0213] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antígeno dos mesmos aqui fornecido tem um teor de lisina na terminação C de cerca de 10% a cerca de 90%. Em algumas modalidades, o teor de lisina na termina- ção C é de cerca de 20% a cerca de 80%. Em algumas modalidades, o teor de lisina na terminação C é de cerca de 40% a cerca de 70%. Em algumas modalidades, o teor de lisina na terminação C é de cerca de 55% a cerca de 70%. Em algumas modalidades, o teor de lisina na terminação C é de cerca de 60%.
[0214] A imunogenicidade de anticorpos terapêuticos está associ- ada a um risco aumentado de reações de infusão e diminuição da du- ração de resposta terapêutica (Baert et al., (2003) N Engl J Med 348:602-08). A extensão na qual os anticorpos terapêuticos induzem uma resposta imune no hospedeiro pode ser determinada em parte pelo alótipo do anticorpo (Stickler et al., (2011) Genes and Immunity
12:213-21). O alótipo de anticorpo está relacionado às variações de sequência de aminoácidos em locais específicos nas sequências da região constante do anticorpo. A Tabela 2 mostra os alótipos de IgG1, IgG2 e IgG4 selecionados.
[0215] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo aqui fornecido é um alótipo G2m(n).
[0216] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo aqui fornecido é um alótipo G2m(n-).
[0217] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo aqui fornecido é um alótipo G2m(n)/(n-).
[0218] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo aqui fornecido é um alótipo nG4m(a).
[0219] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo aqui fornecido é um alótipo G1m(17,1). Tabela 2. Resíduo de aminoácido na posição de diversidade (numeração de Alótipo resíduo: Índice EU) IgG2 IgG4 IgG1 189 282 309 422 214 356 358 431 G2m(n) T M G2m(n-) P V G2m(n)/(n-) T V nG4m(a) L R G1m(17) K E M A G1m(17,1) K D L A
[0220] As mutações de Fc podem ser feitas aos anticorpos que se ligam especificamente a PD-1 ou aos fragmentos de ligação a antíge- no dos mesmos aqui fornecidos para modular funções efetoras de an-
ticorpo como ADCC, ADCP e/ou ADCP e/ou propriedades farmacoci- néticas. Isso pode ser obtido mediante a introdução de mutação(ões) no Fc que modulam a ligação do Fc mutado ao FcγRs de ativação (FcγRI, FcγRIIa, FcγrIII), FcγRIIb inibitório e/ou a FcRn.
[0221] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende ao menos uma mutação no anticorpo Fc.
[0222] Em algumas modalidades, os anticorpos que se ligam es- pecificamente a PD-1 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mes- mo compreendem uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze mutações no fragmento Fc.
[0223] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende ao menos uma mutação no Fc que modula a ligação do anticorpo ao FcRn.
[0224] As posições de Fc que podem ser mutadas para modular a meia-vida dos anticorpos (por exemplo, a ligação de FcRn incluem as posições 250, 252, 253, 254, 256, 257, 307, 376, 380, 428, 434 e 435. As mutações exemplificadoras que podem ser feitas singularmente ou em combinação são as substituições T250Q, M252Y, I253A, S254T, T256E, P257I, T307A, D376V, E380A, M428L, H433K, N434S, N434A, N434H, N434F, H435A e H435R Exemplos de mutações singulares ou em combinação que podem ser feitas para aumentar a meia-vida dos anticorpos aqui fornecidos são as mutações M428L/N434S, M252Y/S254T/T256E, T250Q/M428L, N434A e T307A/E380A/N434A. Exemplos de mutações singulares ou em combinação que podem ser feitas para reduzir a meia-vida dos anticorpos aqui fornecidos são as mutações H435A, P257I/N434H, D376V/N434H, M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T308P/N434A e H435R.
[0225] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi-
camente a PD-1 ou o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma mutação M252Y/S254T/T256E.
[0226] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende ao menos uma mutação no Fc do anticorpo que reduz a ligação do anticorpo a um receptor Fcγ (FcγR) de ativação e/ou reduz as funções efetoras de Fc como a ligação de C1q, a citotoxicidade de- pendente de complemento (CDC), a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) ou a fagocitose (ADCP).
[0227] As posições de Fc que podem ser mutadas para reduzir a ligação do anticorpo ao FcγR de ativação R e subsequentemente para reduzir a função efetora incluem as posições 214, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 265, 267, 268, 270, 295, 297, 309, 327, 328, 329, 330, 331 e
365. As mutações exemplificadoras que podem ser feitas singularmen- te ou em combinação são substituições K214T, E233P, L234V, L234A, deleção de G236, V234A, F234A, L235A, G237A, P238A, P238S, D265A, S267E, H268A, H268Q, Q268A, N297A, A327Q, P329A, D270A, Q295A, V309L, A327S, L328F, A330S e P331S em IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. As mutações em combinações exemplificadoras que resultam nos anticorpos com ADCC reduzida são as mutações L234A/L235A em IgG1, V234A/G237A/ P238S/H268A/V309L/A330S/P331S em IgG2, F234A/L235A em IgG4, S228P/F234A/ L235A em IgG4, N297A em todos os isótipos, V234A/G237A em IgG2, K214T/E233P/ L234V/L235A/G236- deletado/A327G/P331A/D365E/L358M em IgG1, H268Q/V309L/A330S/P331S em IgG2, S267E/L328F em IgG1, L234F/L235E/D265A em IgG1, L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S em IgG1, S228P/F234A/L235A/G237A/P238S em IgG4, e S228P/F234A/L235A/G236-deletado/G237A/P238S em IgG4. Também podem ser usados domínios Fc IgG2/4 híbridos, como Fc com resí- duos 117a 260 a partir de IgG2 e os resíduos 261 a 447, de IgG4.
[0228] A mutação exemplificadora que resulta em anticorpos com CDC reduzido é uma mutação K322A reduzida.
[0229] Uma mutação S228P bem conhecida pode ser feita em an- ticorpos IgG4 para melhorar a estabilidade de IgG4.
[0230] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma mutação em ao menos uma posição de resíduo 214, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 265, 267, 268, 270, 295, 297, 309, 322, 327, 328, 329, 330, 331 ou 365.
[0231] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende ao menos uma mutação selecionada do grupo que con- siste em K214T, E233P, L234V, L234A, deleção de G236, V234A, F234A, L235A, G237A, P238A, P238S, D265A, S267E, H268A, H268Q, Q268A, N297A, A327Q, P329A, D270A, Q295A, V309L, A327S, L328F, K322, A330S e P331S.
[0232] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreende uma mutação em ao menos uma posição de resíduo 228, 234, 235, 237, 238, 268, 322, 330 ou 331.
[0233] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma mutação K322A.
[0234] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma mutação S228P.
[0235] Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção com- preendem ao menos uma substituição em uma região Fc do anticorpo que acentua a ligação do anticorpo a um receptor Fcγ (FcγR) e/ou acentua as funções efetoras de Fc como a ligação a C1q, citotoxicida- de dependente do complemento (CDC), citotoxicidade celular depen- dente de anticorpo (ADCC) e/ou fagocitose celular dependente de an- ticorpo (ADCP).
[0236] As posições de Fc que podem ser mutadas para aumentar a ligação do anticorpo ao FcγR e/ou acentuar as funções efetoras de anticorpo incluem as posições 236, 239, 243, 256, 290, 292, 298, 300, 305, 312, 326, 330, 332, 333, 334, 345, 360, 339, 378, 396 ou 430 (a numeração do resíduo de acordo com o índice EU). As mutações exemplificadoras que podem ser realizadas individualmente ou em combinação são uma mutação G236A, uma mutação S239D, uma mu- tação F243L, uma mutação T256A, uma mutação K290A, uma muta- ção R292P, uma mutação S298A, uma mutação Y300L, uma mutação V305L, uma mutação K326A, uma mutação A330K, uma mutação I332E, uma mutação E333A, uma mutação K334A, uma mutação A339T e uma mutação P396L. As substituições em combinação exemplificadoras que resultam em anticorpos com ADCC ou ADCP aumentada são uma mutação S239D/I332E, uma mutação S298A/E333A/K334A, uma mutação F243L/R292P/Y300L, uma muta- ção F243L/R292P/Y300L/P396L, uma mutação F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L e uma mutação G236A/S239D/I332E em IgGl.
[0237] As posições Fc que podem ser mutadas para melhorar a CDC do anticorpo incluem as posições 267, 268, 324, 326, 333, 345 e
430. As mutações exemplificadoras que podem ser realizadas indivi- dualmente ou em combinação são uma mutação S267E, uma mutação F1268F, uma mutação S324T, uma mutação K326A, uma mutação K326W, uma mutação E333A, uma mutação E345K, uma mutação E345Q, uma mutação E345R, uma mutação E345Y, uma mutação
E430S, uma mutação E430F e uma mutação E430T. As mutações em combinação exemplificadoras que resultam em anticorpos com CDC aumentada são uma mutação K326A/E333A, uma mutação K326W/E333A, uma mutação H268F/S324T, uma mutação S267E/H268F, uma mutação S267E/S324T e uma mutação S267E/H268F/S324T em IgGl.
[0238] Em algumas modalidades, o anticorpo que especificamente se liga a PD-1 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com- preende ao menos uma mutação na região Fc que intensifica a ligação do anticorpo ao FcγRIIb. A ligação intensificada a FcγRIIb pode resul- tar na atenuação das células B FcγRIIb+, e/ou resultar no agrupamen- to do anticorpo e na subsequente ativação de PD-1 nas vias de sinali- zação a jusante.
[0239] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma mutação S267E.
[0240] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma mutação S267D.
[0241] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma mutação S267E/I332E.
[0242] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma mutação S267E/L328F.
[0243] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma mutação G236D/S267E.
[0244] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma mutação P238D/E233D/G237D/H268D/P271G/A330R.
[0245] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma mutação P238D.
[0246] A "citotoxicidade celular dependente de anticorpo", "citoto- xicidade mediada por célula dependente de anticorpo" ou "CCDA" é um mecanismo para induzir morte celular que depende da interação das células-alvo revestidas com anticorpo com células efetoras que possuem atividade lítica, como células natural killer (NK), monócitos, macrófagos e neutrófilos através de receptores gama Fc (FcγR) ex- pressos sobre as células efetoras. Por exemplo, células NK expressam FcγRIIIa, enquanto que os monócitos expressam FcγRI, FcγRII e FcγRIIIa. A atividade de ADCC dos anticorpos aqui fornecidos pode ser avaliada com o uso de um ensaio in vitro com o uso de células que expressam a PD-1 como células-alvo e células NK como células efeto- ras. A citólise pode ser detectada pela liberação do marcador (por exemplo, substratos radioativos, corantes fluorescentes ou proteínas intracelulares naturais) proveniente das células lisadas. Em um ensaio exemplificador, as células-alvo são usadas com uma razão entre célu- las-alvo e células efetoras de 1:4. As células-alvo são pré-identificadas com BATDA e combinada com células efetoras e o anticorpo de teste. As amostras são incubadas durante 2 horas e a lise celular medida pela medição de BATDA liberado no sobrenadante. Os dados são normalizados para citotoxicidade máxima com 0,67% de Triton X-100 (Sigma Aldrich) e controle mínimo determinado pela liberação espon- tânea de BATDA das células-alvo na ausência de qualquer anticorpo.
[0247] A "fagocitose celular dependente de anticorpo" ("FCDA") se refere a um mecanismo de eliminação das células-alvo revestidas com anticorpo por internalização por células fagocíticas, como macrófagos ou células dendríticas. A ADCP pode ser avaliada pelo uso de macró- fagos derivados de monócito como células efetoras e células Daudi (ATCC® CCL-213™) ou quaisquer outras células que expressam PD-1 como células-alvo manipuladas para expressar GFP ou outra molécula marcada. Em um ensaio exemplificador, razão entre células efeto- ras:células-alvo pode ser, por exemplo, 4:1. As células efetoras podem ser incubadas com as células alvo por 4 horas com ou sem o anticorpo da invenção. Após a incubação, as células podem ser separadas usando acutase. Os macrófagos podem ser identificados com anticor- pos anti-CD11b e anti-CD14 unidos a uma etiqueta fluorescente, e o percentual de fagocitose pode ser determinado com base na % de flu- orescência de GFP nos macrófagos CD11+CD14+ usando métodos- padrão.
[0248] "Citotoxidade dependente de complemento", ou "CDC", se refere a um mecanismo de indução da morte celular no qual o domínio efetor Fc de um anticorpo limitado por alvo se liga e ativa o componen- te do complemento C1q, que por sua vez ativa a cascata de comple- mento levando à morte da célula-alvo. A ativação do complemento po- de também resultar em deposição de componentes de complemento na superfície das células alvo que facilitam a CDC pela ligação de re- ceptores de complemento (por exemplo, CR3) em leucócitos. A CDC de células pode ser medida, por exemplo, por plaqueamento de célu- las Daudi a 1x105 células/poço (50 µL/poço) em RPMI-B (RPMI su- plementado com 1% de BSA), adição de 50 µL de anticorpos aos po- ços em uma concentração final entre 0 a 100 µg/mL, incubação da re- ação durante 15 minutos à temperatura ambiente, adição de 11 µL de "pool" de soro humano aos poços e incubação da reação durante 45 min a 37°C. A porcentagem (%) de células lisadas pode ser detectada como % de células marcadas com iodeto de propídio no ensaio FACS com o uso de métodos-padrão.
[0249] A ligação do anticorpo ao FcγR ou FcRn pode ser avaliada em células manipuladas para expressarem cada receptor com o uso de citometria de fluxo. Em um ensaio de ligação exemplificador, 2x105 célu- las por poço são semeadas em placa de 96 poços e bloqueadas em Tampão de Coloração Suplementado com BSA ("Bovine Serum Albu- min", albumina de soro bovino) ("BSA Stain Buffer", BD Biosciences, San Jose, EUA) durante 30 min a 4°C. As células são incubadas com um an- ticorpo de teste em gelo durante 1,5 horas a 4°C. Após serem lavadas duas vezes com o tampão de coloração suplementado com BSA, as cé- lulas são incubadas com anticorpo secundário anti-IgG humana marcado com R-PE (R-Phycoerythrin, R-Ficoeritrina) (Jackson Immunoresearch Laboratories) durante 45 minutos a 4°C. As células são lavadas duas ve- zes em tampão de coloração e então ressuspensas em 150 µL de tam- pão de coloração contendo corante "DRAQ7 live/dead" diluído 1:200 (Cell Signaling Technology, Danvers, EUA). Sinais de PE e de DRAQ7 das células coradas são detectados por citômetro de fluxo "Miltenyi MA- CSQuant" (Miltenyi Biotec, Auburn, EUA) com o uso os canais B2 e B4 respectivamente. As células vivas são agrupadas em janela de análise na exclusão DRAQ7 e os sinais de fluorescência média geométrica são determinados para ao menos 10.000 eventos vivos coletados. O softwa- re FlowJo (Tree Star) é usado para a análise. Os dados são plotados como o logaritmo da concentração dos anticorpos em função dos sinais de fluorescência média. A análise de regressão não linear é realizada.
[0250] "Intensificar" ou "intensificado" se refere à função efetora intensificada (por exemplo, ADCC, CDC e/ou ADCP) ou à ligação in- tensificada a um receptor Fcγ (FcγR) ou um FcRn do anticorpo da in- venção que tem pelo menos uma mutação na região Fc quando com- parada à do anticorpo parental sem a mutação. "Intensificado" pode ser uma intensificação de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais, ou uma intensificação estatisticamen-
te significativa.
[0251] "Reduzir" ou "reduzido" se refere à função efetora reduzida (por exemplo, ADCC, CDC e/ou ADCP) ou à ligação reduzida a um receptor Fcγ (FcγR) ou um FcRn do anticorpo da invenção que tem pelo menos uma mutação na região Fc quando comparada à do anti- corpo parental sem a mutação. "Reduzido" pode ser uma redução de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais, ou uma redução estatisticamente significativa.
[0252] "Modular" se refere à função efetora intensificada ou redu- zida (por exemplo, ADCC, CDC e/ou ADCP) ou à ligação intensificada ou reduzida a um receptor Fcγ (FcγR) ou um FcRn do anticorpo da invenção que tem pelo menos uma mutação na região Fc quando comparada à do anticorpo parental sem a mutação. Anticorpos Glicomanipulados
[0253] A capacidade dos anticorpos monoclonais de induzir ADCC pode ser intensificada por manipulação de seu componente oligossa- carídeo. A IgG1 e a IgG3 humanas são N-glicosiladas em Asn297 com a maior parte dos glicanos nas formas biantenárias G0, G0F, G1, G1F, G2 ou G2F bem conhecidas. Anticorpos produzidos pelas células CHO não projetadas normalmente possuem um teor de glicano fucose de ao menos 85%. A remoção da fucose de núcleo dos oligossacarídeos do tipo biantenário complexo ligados às regiões Fc aumenta o CCDA de anticorpos através da ligação FcγRIIIa melhorada sem alterar a ligação do antígeno ou atividade do CDC. Tais mAbs podem ser obtidos com o uso de diferentes métodos relatados por levar à expressão bem- sucedida de anticorpos relativamente altamente desfucosilados por- tando o tipo de complexo biantenário de Fc-oligossacarídeos como controle da osmolalidade da cultura (Konno et al., Cytotechnology 64:249 a 265, 2012), aplicação de uma linhagem variante de CHO, Lec13, como a linhagem celular hospedeira (Shields et al., J Biol
Chem 277:26733-26740, 2002), aplicação de uma linhagem variante de CHO, EB66, como a linhagem celular hospedeira Olivier et al., MAbs; 2(4): 405-415, 2010; PMID:20562582), aplicação de uma linha- gem celular de hibridoma de rato YB2/0 como a linhagem celular hos- pedeira (Shinkawa et al., J Biol Chem 278:3.466 a 3.473, 2003), intro- dução de pequeno RNA de interferência especificamente contra o ge- ne de 1,6-fucosiltrasferase (FUT8) (Mori et al., Biotechnol Bioeng 88:901 a 908, 2004), ou coexpressão de β-1,4-N- acetilglicosaminiltransferase III e α-manosidase de Golgi II ou um po- tente inibidor de alfa-manosidase I, cifunensina (Ferrara et al., J Biol Chem 281:5.032 a 5.036, 2006, Ferrara et al., Biotechnol Bioeng 93:851 a 861, 2006; Xhou et al., Biotechnol Bioeng 99:652-65, 2008).
[0254] Em algumas modalidades aqui descritas, os anticorpos da invenção têm uma estrutura de glicano biantenária com teor de fucose de entre cerca de 1% e cerca de 15%, por exemplo, 15%, 14%, 13%, 12%, 11% 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ou 1%. Em algu- mas modalidades, os anticorpos da invenção têm uma estrutura de glicano com teor de fucose de cerca de 50%, 40%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, ou 20%.
[0255] "Teor de fucose" se refere à quantidade do monossacarí- deo de fucose dentro da cadeia de açúcar em Asn297. A quantidade relativa de fucose é a porcentagem de estruturas contendo fucose re- lacionadas às todas glicoestruturas. Estas podem ser caracterizadas e quantificadas por vários métodos, por exemplo: 1) usando MALDI-TOF de amostra tratada com N-glicosidase F (por exemplo, estruturas de manose complexa, híbrida, oligo e alta), conforme descrito na Patente Internacional n°. WO2008/077546 2); 2) pela liberação enzimática dos glicanos Asn297 com derivatização subsequente e detecção/quantifi- cação por HPLC (UPLC) com detecção de fluorescência e/ou HPLC- MS (UPLC-MS); 3) análise de proteína intacta de mAb nativa ou redu-
zida, com ou sem tratamento dos glicanos Asn297 com Endo S ou ou- tra enzima que cliva entre os primeiros e os segundos monossacarí- deos GlcNAc, deixando a fucose unida ao primeiro GlcNAc; 4) diges- tão de mAb em péptideos constituintes pela digestão enzimática (por exemplo, tripsina ou endopeptidase Lys-C), e posterior separação, de- tecção e quantificação por HPLC-MS (UPLC-MS); Separação dos oli- gossacarídeos mAb a partir da proteína mAb pela desglicosilação en- zimática específica com PNGase F em Asn 297. Os oligossacarídeos liberados podem ser marcados com um fluoróforo, separados e identi- ficados por diversas técnicas complementares que permitem: ótima caracterização das estruturas de glicano por espectrometria de massa com ionização e dessorção a laser assistida por matriz (MALDI) por comparação das massas experimentais com as massas teóricas, de- terminação do grau de sialilação por HPLC de troca iônica (GlycoSep C), separação e quantificação das formas de oligossacarídeo de acor- do com critérios de hidrofilicidade por HPLC em fase normal (Glyco- Sep N), e separação e quantificação dos oligossacarídeos por eletrofo- rese capilar de alta eficiência-fluorescência induzida por laser (HPCE- LIF).
[0256] "Fucose baixa" ou "baixo teor de fucose" como usado aqui se refere aos anticorpos com teor de fucose de cerca de 0% a 15%.
[0257] "Fucose normal" ou "teor normal de fucose" como usado na presente invenção, se refere aos anticorpos com teor de fucose supe- rior a cerca de 50%, tipicamente, superior a cerca de 80% ou superior a 85%. Anticorpos anti-idiotípicos
[0258] Os anticorpos anti-idiotípicos são anticorpos que se ligam especificamente aos anticorpos que se ligam especificamente a PD-1 aqui revelados.
[0259] A invenção também fornece um anticorpo anti-idiotípico que se liga especificamente aos anticorpos que se ligam especificamente a PD-1 aqui fornecido.
[0260] A invenção também fornece um anticorpo anti-idiotípico que se liga especificamente ao anticorpo que compreende a VH da SEQ ID Nº: 8 e a VL da SEQ ID Nº: 14; a VH da SEQ ID Nº: 9 e a VL da SEQ ID Nº: 15; a VH da SEQ ID Nº: 9 e a VL da SEQ ID Nº: 16; a VH da SEQ ID Nº: 10 e a VL da SEQ ID Nº: 16; a VH da SEQ ID Nº: 140 e a VL da SEQ ID Nº: 16; a VH da SEQ ID Nº: 141 e a VL da SEQ ID Nº: 16; a VH da SEQ ID Nº: 142 e a VL da SEQ ID Nº: 16; a VH da SEQ ID Nº: 10 e a VL da SEQ ID Nº: 143; a VH da SEQ ID Nº: 10 e a VL da SEQ ID Nº: 144; a VH da SEQ ID Nº: 140 e a VL da SEQ ID Nº: 143; a VH da SEQ ID Nº: 141 e a VL da SEQ ID Nº: 143; a VH da SEQ ID Nº: 142 e a VL da SEQ ID Nº: 143; a VH da SEQ ID Nº: 140 e a VL da SEQ ID Nº: 144; a VH da SEQ ID Nº: 141 e a VL da SEQ ID Nº: 144; a VH da SEQ ID Nº: 142 e a VL da SEQ ID Nº: 144; a VH da SEQ ID Nº: 44 e a VL da SEQ ID Nº: 60; a VH da SEQ ID Nº: 45 e a VL da SEQ ID Nº: 61; a VH da SEQ ID Nº: 45 e a VL da SEQ ID Nº: 62; a VH da SEQ ID Nº: 46 e a VL da SEQ ID Nº: 61; a VH da SEQ ID Nº: 47 e a VL da SEQ ID Nº: 61; a VH da SEQ ID Nº: 48 e a VL da SEQ ID Nº: 61; a VH da SEQ ID Nº: 49 e a VL da SEQ ID Nº: 61; a VH da SEQ ID Nº: 50 e a VL da SEQ ID Nº: 61; a VH da SEQ ID Nº: 51 e a VL da SEQ ID Nº: 61; a VH da SEQ ID Nº: 94 e a VL da SEQ ID Nº: 98; a VH da SEQ ID Nº: 95 e a VL da SEQ ID Nº: 99; ou a VH da SEQ ID Nº: 95 e a VL da SEQ ID Nº: 100.
[0261] Um anticorpo anti-idiotípico (Id) é um anticorpo que reco- nhece os determinantes antigênicos (por exemplo, o parátopo ou CDRs) do anticorpo. O anticorpo Id pode ser bloqueador ou não blo- queador de antígeno. O Id bloqueador de antígeno pode ser usado pa- ra detectar o anticorpo livre em uma amostra (por exemplo, anticorpo anti-PD-1 da invenção aqui descrito). O Id não bloqueador pode ser usado para detectar o anticorpo total (livre, parcialmente ligado ao an- tígeno, ou totalmente ligado ao antígeno) em uma amostra. Um anti- corpo Id pode ser preparado por imunização de um animal com um anticorpo ao qual um anti-Id está sendo preparado.
[0262] Um anticorpo anti-Id pode também ser usado como um "imunógeno" para induzir uma resposta imunológica em ainda um outro animal, produzindo um chamado anticorpo anti-anti-Id. Um anti-anti-Id pode ser epitopicamente idêntico ao mAb original que induziu o anti-Id. Dessa forma, por meio do uso dos anticorpos para os determinantes idiotípicos de um mAb, é possível identificar outros clones idênticos que expressam anticorpos de especificidade idêntica. Os anticorpos anti-ID podem ser variados (produzindo deste modo variantes de anticorpo an- ti-ID) e/ou derivatizados por qualquer técnica adequada, como aquelas descritas em outro lugar na presente invenção com relação aos anticor- pos que se ligam especificamente a PD-1. Conjugados dos anticorpos que se ligam especificamente a PD-1 aqui fornecidos
[0263] A invenção também fornece um imunoconjugado que com- preende um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a PD-1 conjugado a uma molé- cula(s) heteróloga(s).
[0264] Em algumas modalidades, a molécula heteróloga é um marcador detectável ou um agente citotóxico.
[0265] A invenção também fornece um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a PD-1 conjugado a um marcador detectável.
[0266] A invenção também fornece um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a PD-1 conjugado a um agente citotóxico.
[0267] Os anticorpos ou os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que se ligam a PD-1 podem ser usados para direcionar os agentes terapêuticos às células que expressam PD-1. Células como as células T ativadas que superexpressam PD-1 podem ser direciona- das com um anticorpo que se liga especificamente a PD-1 conjugado a um agente citotóxico que mata a célula mediante a internalização do anticorpo PD-1. Alternativamente, as células que expressam PD-1 po- deriam ser direcionadas com um anticorpo PD-1 acoplado a um agen- te terapêutico destinado a modificar a função celular uma vez internali- zado.
[0268] Em algumas modalidades, o marcador detectável é também um agente citotóxico.
[0269] O anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui fornecido conjuga- do a um marcador detectável pode ser usado para avaliar a expressão de PD-1 em uma variedade de amostras.
[0270] O marcador detectável inclui composições que, quando conjugadas ao anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou ao fragmento de ligação a antígeno do mesmo aqui fornecido tor- nam este último detectável através de meios espectroscópicos, foto- químicos, bioquímicos, imunoquímicos ou químicos.
[0271] Marcadores detectáveis exemplificadores incluem isótopos radioativos, microesferas magnéticas, microesferas metálicas, partícu- las coloidais, corantes fluorescentes, reagentes densos em elétrons,
enzimas (por exemplo, como comumente usado em um ELISA), bioti- na, digoxigenina, haptenos, moléculas luminescentes, moléculas quemiluminescentes, fluorocromos, fluoróforos, agentes de arrefeci- mento brusco fluorescente, moléculas coloridas, isótopos radioativos, cintilatos, avidina, estreptavidina, proteína A, proteína G, anticorpos ou fragmentos dos mesmos, poli-histidina, Ni2+, marcadores Flag, marca- dores myc, metais pesados, enzimas, fosfatase alcalina, peroxidase, luciferase, doadores/receptores de elétrons, ésteres de acridínio e substratos colorimétricos.
[0272] Um marcador detectável pode emitir um sinal espontanea- mente, como quando o marcador detectável é um isótopo radioativo. Em outros casos, o marcador detectável emite um sinal como um re- sultado de ser estimulado por um campo externo.
[0273] Os isótopos radioativos exemplificadores podem ser emis- sores de γ, emissores de Auger, emissores de β, um emissor alfa ou isótopo radioativo emissor de pósitron. Isótopos radioativos exemplifi- cadores incluem 3H, 11C, 13C, 15N, 18F, 19F, 55Co, 57Co, 60Co, 61Cu, 62Cu, 64 67 Cu, Cu, 68Ga, 72As, 75Br, 86 Y, 89 Zr, 90 Sr, 94mTc, 99mTc, 115In, 1231, 1241, 125 I, 1311, 211At, 212Bi, 213Bi, 223Ra, 226Ra, 225Ac e 227Ac.
[0274] Átomos de metal exemplificadores são metais com um nú- mero atômico maior que 20, como átomos de cálcio, átomos de es- cândio, átomos de titânio, átomos de vanádio, átomos de cromo, áto- mos de manganês, átomos de ferro, átomos de cobalto, átomos de níquel, átomos de cobre, átomos de zinco, átomos de gálio, átomos de germânio, átomos de arsênico, átomos de selênio, átomos de bromo, átomos de criptônio, átomos de rubídio, átomos de estrôncio, átomos de ítrio, átomos de zircônio, átomos de nióbio, átomos de molibdênio, átomos de tecnécio, átomos de rutênio, átomos de ródio, átomos de paládio, átomos de prata, átomos de cádmio, átomos de índio, átomos de estanho, átomos de antimônio, átomos de telúrio, átomos de iodo,
átomos de xenônio, átomos de césio, átomos de bário, átomos de lan- tânio, átomos de háfnio, átomos de tântalo, átomos de tungstênio, átomos de rênio, átomos de ósmio, átomos de irídio, átomos de plati- na, átomos de ouro, átomos de mercúrio, átomos de tálio, átomos de chumbo, átomos de bismuto, átomos de frâncio, átomos de rádio, áto- mos de actínio, átomos de cério, átomos de praseodímio átomos, áto- mos de neodímio, átomos de promécio, átomos de samário, átomos de európio, átomos de gadolínio, átomos de térbio, átomos de disprósio, átomos de hólmio, átomos de érbio, átomos de túlio, átomos de itérbio, átomos de lutécio, átomos de tório, átomos de protactínio, átomos de urânio, átomos de neptúnio, átomos de plutônio, átomos de amerício, átomos de cúrio, átomos de berquélio, átomos de califórnio, átomos de einstênio, átomos de férmio, átomos de mendelévio, átomos de nobé- lio ou átomos de laurêncio.
[0275] Em algumas modalidades, os átomos de metal podem ser metais alcalino-terrosos com um número atômico maior que vinte.
[0276] Em algumas modalidades, os átomos de metal podem ser lantanídeos.
[0277] Em algumas modalidades, os átomos de metal podem ser actinídeos.
[0278] Em algumas modalidades, os átomos de metal podem ser metais de transição.
[0279] Em algumas modalidades, os átomos de metal podem ser metais pobres.
[0280] Em algumas modalidades, os átomos de metal podem ser átomos de ouro, átomos de bismuto, átomos de tântalo e átomos de gadolínio.
[0281] Em algumas modalidades, os átomos de metal podem ser metais com um número atômico de 53 (isto é, iodo) a 83 (isto é, bismu- to).
[0282] Em algumas modalidades, os átomos de metal podem ser átomos adequados para imageamento por ressonância magnética.
[0283] Os átomos de metal podem ser íons metálicos na forma de estados de oxidação +1, +2, ou +3, como Ba2+, Bi3+, Cs+, Ca2+, Cr2+, Cr3+, Cr6+, Co2+, Co3+, Cu+, Cu2+, Cu3+, Ga3+, Gd3+, Au+, Au3+, Fe2+, Fe3+, F3+, Pb2+, Mn2+, Mn3+, Mn4+, Mn7+, Hg2+, Ni2+, Ni3+, Ag+, Sr2+, Sn2+, Sn4+ e Zn2+. Os átomos de metal podem compreender um óxido metálico, como óxido de ferro, óxido de manganês ou óxido de gadolínio.
[0284] Corantes adequados incluem quaisquer corantes comerci- almente disponíveis, como, por exemplo, 5(6)-carboxifluoresceína, IRDye 680RD maleimida ou IRDye 800CW, corantes de polipiridil rutê- nio e similares.
[0285] Os fluoróforos adequados são isocianato de fluoresceína (FITC), fluoresceína tiosemicarbazida, rodamina, Texas Red, Corantes Cy (por exemplo, Cy3, Cy5, Cy5.5), Alexa Fluors (por exemplo, Ale- xa488, Alexa555, Alexa594; Alexa647), corantes fluorescentes de in- fravermelho próximo (NIR) (700 - 900 nm), e corantes de carbocianina e aminoestirila.
[0286] O anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo aqui fornecido conjugado a um marcador detectável pode ser usado como um agente de image- amento.
[0287] Em algumas modalidades, o anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo aqui fornecido é conjugado a um agente citotóxico.
[0288] Em algumas modalidades, o agente citotóxico é um agente quimioterápico, um fármaco, um agente inibidor do crescimento, uma toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bac- teriana, fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos dos mesmos), ou um isótopo radioativo (isto é, um radioconjugado).
[0289] Em algumas modalidades, o agente citotóxico é daunomici- na, doxorrubicina, metotrexato, vindesina, toxinas bacterianas, como a toxina diftérica, ricina, geldanamicina, maitansinoides ou caliqueamici- na. O agente citotóxico pode desencadear seus efeitos citotóxicos e citostáticos através de mecanismos que incluem ligação à tubulina, ligação ao DNA ou inibição de topoisomerase.
[0290] Em algumas modalidades, o agente citotóxico é uma toxina enzimaticamente ativa, como a cadeia A de difteria, fragmentos ativos não ligantes de toxina de difteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudo- monas aeruginosa), cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaona- ria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos.
[0291] Em algumas modalidades, o agente citotóxico é um radio- nuclídeo, como 212Bi, 131I, 131In, 90Y e 186Re.
[0292] Em algumas modalidades, o agente citotóxico é dolastatina ou análogos e derivados peptídicos de dolastatina, auristatina ou mo- nometil auristatina fenilalanina. Moléculas exemplificadoras são reve- ladas nas patentes US n° 5.635.483 e 5.780.588. As dolastatinas e as auristatinas demostraram interferir com a dinâmica de microtúbulos, com a hidrólise de GTP e com a divisão nuclear e celular (Woyke et al (2001) Antimicrob Agents and Chemother. 45 (12): 3580-3584) e têm atividade anticancerígena e antifúngica. A porção de fármaco de dolas- tatina ou de auristatina pode ser ligada ao anticorpo da invenção atra- vés do N-terminal (amino) ou do C-terminal (carboxila) da porção de fármaco peptídico (WO02/088172), ou através de qualquer cisteína manipulada no anticorpo.
[0293] O anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo aqui fornecido pode ser conjugado a um marcador detectável com o uso de métodos conheci- dos.
[0294] Em algumas modalidades, o marcador detectável é com- plexado com um agente quelante.
[0295] Em algumas modalidades, o marcador detectável é conju- gado ao anticorpo que se liga especificamente a PD-1, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo aqui fornecido, por meio de um ligan- te.
[0296] O marcador detectável ou a porção citotóxica pode ser liga- do direta ou indiretamente ao anticorpo que se liga especificamente a PD-1, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo aqui fornecido, com o uso de métodos conhecidos. Os ligantes adequados são co- nhecidos na técnica e incluem, por exemplo, grupos prostéticos, ligan- tes não fenólicos (derivados de N-succimidil-benzoatos; dodecabora- to), porções quelantes de ambos os quelantes macrocíclicos e acícli- cos, como derivados de ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-1,4,7, 10, triacético (DOTA), derivados de ácido dietilenotriaminapenta- acético (DTPA), derivados de ácido S-2-(4-Isotiocianatobenzil)-1,4,7- triazaciclononano-1,4,7-triacético (NOTA) e derivados de ácido 1,4,8,11-tetra-azaciclodocedan-1,4,8,11-tetra-acético (TETA), N- succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), deri- vados bifuncionais de imidoésteres (como adipimidato de dimetila HCl), ésteres ativos (como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (como glutaraldeido), compostos bis-azido (como bis (p azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (como bis-(p- diazôniobenzoil)-etilenodiamina), di-isocianatos (como 2,6-di- isocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-ativos (como 1,5- difluoro 2,4-dinitrobenzeno) e outras porções quelantes. Os ligantes de peptídeo adequados são bem conhecidos.
[0297] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo que aqui fornecido são removidos do sangue por meio de depuração renal. Kits
[0298] A invenção também fornece um kit que compreende o anti- corpo que se liga especificamente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo aqui revelado.
[0299] O kit pode ser usado para usos terapêuticos e como kits de diagnóstico.
[0300] O kit pode ser usado para detectar a presença de PD-1 em uma amostra.
[0301] Em algumas modalidades, o kit compreende o anticorpo que se liga especificamente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antí- geno do mesmo da invenção e reagentes para a detecção do anticor- po. O kit pode incluir um ou mais outros elementos incluindo: instru- ções de uso; outros reagentes, por exemplo, um marcador, um agente terapêutico, ou um agente útil para quelação, ou para acoplar de outro modo, um anticorpo a um marcador ou a um agente terapêutico, ou uma composição radioprotetora; dispositivos ou outros materiais para preparar o anticorpo para administração; carreadores farmaceutica- mente aceitáveis; e dispositivos ou outros materiais para administra- ção a um indivíduo.
[0302] Em algumas modalidades, o kit compreende o anticorpo que se liga especificamente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antí- geno do mesmo da invenção em um recipiente e instruções para uso do kit.
[0303] Em algumas modalidades, o anticorpo no kit está marcado.
[0304] Em algumas modalidades, o anticorpo antagonista que se liga especificamente a PD-1 ou a uma porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende a VH da SEQ ID Nº: 8 e a VL da SEQ ID Nº: 14; a VH da SEQ ID Nº: 9 e a VL da SEQ ID Nº: 15; a VH da SEQ ID Nº: 9 e a VL da SEQ ID Nº: 16; a VH da SEQ ID Nº: 10 e a VL da SEQ ID Nº: 16; a VH da SEQ ID Nº: 140 e a VL da SEQ ID Nº: 16; a VH da SEQ ID Nº: 141 e a VL da SEQ ID Nº: 16; a VH da SEQ ID Nº: 142 e a VL da SEQ ID Nº: 16; a VH da SEQ ID Nº: 10 e a VL da SEQ ID Nº: 143; a VH da SEQ ID Nº: 10 e a VL da SEQ ID Nº: 144; a VH da SEQ ID Nº: 140 e a VL da SEQ ID Nº: 143; a VH da SEQ ID Nº: 141 e a VL da SEQ ID Nº: 143; a VH da SEQ ID Nº: 142 e a VL da SEQ ID Nº: 143; a VH da SEQ ID Nº: 140 e a VL da SEQ ID Nº: 144; a VH da SEQ ID Nº: 141 e a VL da SEQ ID Nº: 144; a VH da SEQ ID Nº: 142 e a VL da SEQ ID Nº: 144; a VH da SEQ ID Nº: 44 e a VL da SEQ ID Nº: 60; a VH da SEQ ID Nº: 45 e a VL da SEQ ID Nº: 61; a VH da SEQ ID Nº: 45 e a VL da SEQ ID Nº: 62; a VH da SEQ ID Nº: 46 e a VL da SEQ ID Nº: 61; a VH da SEQ ID Nº: 47 e a VL da SEQ ID Nº: 61; a VH da SEQ ID Nº: 48 e a VL da SEQ ID Nº: 61; a VH da SEQ ID Nº: 49 e a VL da SEQ ID Nº: 61; a VH da SEQ ID Nº: 50 e a VL da SEQ ID Nº: 61; a VH da SEQ ID Nº: 51 e a VL da SEQ ID Nº: 61; a VH da SEQ ID Nº: 94 e a VL da SEQ ID Nº: 98; a VH da SEQ ID Nº: 95 e a VL da SEQ ID Nº: 99; ou a VH da SEQ ID Nº: 95 e a VL da SEQ ID Nº: 100. Métodos de detecção de PD-1
[0305] A invenção também fornece um método para detectar PD-1 em uma amostra, que compreende obter a amostra, colocar a amostra em contato com o anticorpo que se liga especificamente a PD-1 ou o fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da invenção, e detec- tar o anticorpo ligado a PD-1 na amostra.
[0306] Em algumas modalidades, a amostra pode ser derivada de urina, sangue, soro, plasma, saliva, ascite, células circulantes, células de tumor circulantes, células sinoviais, células que não estão associa- das a tecidos (isto é, células livres), tecidos (por exemplo, tecido de cirurgicamente removido, biópsias, incluindo aspiração por agulha fi- na), preparações histológicas e similares.
[0307] Os anticorpos ou os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da invenção ligados a PD-1 podem ser detectados com o uso de métodos conhecidos. Métodos exemplificadores incluem marcação direta dos anticorpos com o uso de marcadores fluorescentes ou qui- mioluminescentes, ou radiomarcadores, ou fixação aos anticorpos da invenção de uma porção que é prontamente detectável, como biotina, enzimas ou etiquetas de epítopo. Marcadores e porções exemplifica- 111 111 dores são rutênio, In-DOTA, In-ácido dietilenotriaminapenta- acético (DTPA), peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina e beta- galactosidase, poli-histidina (etiqueta HIS), corantes de acridina, co- rantes de cianina, corantes de fluorona, corantes de oxazina, corantes de fenantridina, corantes de rodamina, corantes Alexa Fluor®.
[0308] Os anticorpos da invenção podem ser usados em uma vari- edade de ensaios para detectar PD-1 na amostra. Ensaios exemplifi- cadores são análise por transferência de Western (Western blot), ra- dioimunoensaio, ressonância de plasmon de superfície, imunoprecipi- tação, diálise de equilíbrio, imunodifusão, imunoensaio de eletroquimi- oluminescência (ECL), imuno-histoquímica, separação de células ati- vadas por fluorescência (FACS) ou ensaio ELISA. Métodos para gerar anticorpos
[0309] Os anticorpos que se ligam especificamente a PD-1 ou os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos aqui fornecidos podem ser gerados com o uso de várias tecnologias. Por exemplo, o método do hibridoma de Kohler e Milstein pode ser usado para gerar anticor- pos monoclonais. No método de hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro, como um hamster, rato ou galinha, é imunizado com antígenos de PD-1 humana e/ou de cino, como o domínio extra- celular de PD-1, seguido pela fusão de células de baço dos animais imunizados com células de mieloma com o uso de métodos-padrão para formar células de hibridoma. As colônias produzidas a partir de células de hibridoma únicas imortalizadas podem ser selecionadas quanto à produção de anticorpos com propriedades desejáveis, como especificidade de ligação, reatividade cruzada ou falta da mesma, afi- nidade para o antígeno, e funcionalidade como atividade agonística;
[0310] As técnicas de humanização exemplificadoras, incluindo a seleção de estruturas do receptor humano, incluem enxerto de CDR (patente U.S. n° 5.225.539), enxerto de SDR (patente U.S. n°
6.818.749), Recomposição de superfícies (Padlan, Mol Immunol 28:489 a 499, 1991), Recomposição de superfícies de resíduos deter- minates de especificidade (publicação de patente U.S. n° 2010/0261620), adaptação da estrutura humana (patente U.S. n°
8.748.356) ou super-humanização (patente U.S. n° 7.709, 226). Nes- ses métodos, as CDRs ou um subconjunto de resíduos de CDR de an- ticorpos parentais são transferidas para estrutura principal humanas que podem ser selecionadas com base em sua homologia total para as estruturas principais parentais, com base na similaridade do com- primento da CDR, na identidade da estrutura canônica ou uma combi- nação dos mesmos.
[0311] Os anticorpos humanizados podem ser adicionalmente oti- mizados para melhorar sua seletividade ou afinidade para um antígeno desejado através da incorporação dos resíduos de suporte de estrutu-
ra alterada para preservar a afinidade da ligação (retromutações) por técnicas, como aquelas descritas nas publicações de patentes interna- cionais n°s. WO1090/007861 e WO1992/22653, ou pela introdução de variação em qualquer uma das CDRs, por exemplo, para melhorar a afinidade do anticorpo.
[0312] Animais transgênicos, como camundongos, ratos, ou gali- nhas carregando loci da imunoglobulina (Ig) humana no seu genoma podem ser usados para gerar anticorpos contra PD-1 e são descritos, por exemplo, na patente US N° 6.150.584, na publicação de patente internacional N° WO1999/45962, nas publicações de patentes interna- cionais N° WO2002/066630, WO2002/43478, WO2002/043478 e WO1990/04036. Os loci de imunoglobulina endógena nesses animais podem ser interrompidos ou deletados, e ao menos um locus de imu- noglobulina humana completo ou parcial pode ser inserido no genoma do animal usando recombinação homóloga ou não homóloga, usando transcromossomos ou usando minigenes. Empresas, como Regeneron (http://_www_regeneron_com), Harbour Antibodies (http://_www_harbourantibodies_com), Open Monoclonal Technology, Inc. (OMT) (http://_www_omtinc_net), KyMab (http://_www_kymab_com), Trianni (http://_www.trianni_com) e Ablexis (http://_www_ablexis_com) podem ser encarregadas de fornecer anti- corpos humanos direcionados contra um antígeno selecionado usando tecnologias como descritas acima.
[0313] Os anticorpos podem ser selecionados de uma biblioteca de exposição de fago, em que o fago é manipulado para expressar imunoglobulinas humanas ou porções das mesmas, como Fabs, anti- corpos de cadeia única (scFv) ou regiões variáveis de anticorpo não pareadas ou pareadas. Os anticorpos da invenção podem ser isola- dos, por exemplo, da biblioteca de apresentação em fago expressando as regiões variáveis de cadeia pesada e leve do anticorpo, como pro-
teínas de fusão, com a proteína de revestimento do bacteriófago pIX, conforme descrito em Shi et al., (2010) J Mol Biol 397:385-96, e na publicação de patente internacional n° WO09/085462). As bibliotecas podem ser triadas para a ligação de fago a PD-1 humana e/ou de cino e os clones positivos obtidos podem ser adicionalmente caracteriza- dos, os Fabs são isolados dos lisados do clone, e expressos como IgGs de comprimento total.
[0314] A preparação de antígenos imunogênicos e a produção de anticorpos monoclonais podem ser realizadas com o uso de qualquer técnica adequada, como produção de proteína recombinante. Os antí- genos imunogênicos podem ser administrados a um animal na forma de proteína purificada, ou misturas de proteína incluindo células totais ou extratos de células ou tecidos, ou o antígeno pode ser formado de novo no corpo do animal a partir de ácidos nucléicos que codificam o dito antígeno ou uma porção do mesmo.
[0315] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especifi- camente a PD-1 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo da invenção é um anticorpo biespecífico.
[0316] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo da invenção é um anticorpo multiespecí- fico.
[0317] Os anticorpos monoespecíficos que se ligam especifica- mente a PD-1 da invenção aqui fornecidos podem ser manipulados em anticorpos biespecíficos que são também abrangidos no escopo da invenção.
[0318] Os anticorpos biespecíficos de comprimento total podem ser gerados, por exemplo, com o uso de troca de braço Fab (ou troca de meia-molécula, trocando um par cadeia pesada - cadeia leve) entre dois anticorpos bivalentes monoespecíficos pela introdução de substi- tuições na interface CH3 da cadeia pesada em cada meia-molécula para favorecer a formação de heterodímero de duas meias-moléculas do anticorpo tendo especificidade diferente in vitro no ambiente isento de células ou com o uso de coexpressão. A reação de troca do braço Fab é o resultado de uma reação de isomerização de ponte dissulfeto e dissociação-associação de domínios CH3. As pontes dissulfetos de cadeia pesada nas regiões de dobradiça dos anticorpos monoespecífi- cos parentais são reduzidas. As cisteínas livres resultantes de um dos anticorpos monoespecíficos parentais formam uma ponte de dissulfeto intercadeias-pesadas com resíduos de cisteína de uma segunda molé- cula de anticorpo monoespecífico parental, e, simultaneamente, domí- nios CH3 dos anticorpos parentais liberam e reformam por dissocia- ção-associação. Os domínios CH3 dos braços Fab podem ser manipu- lados para favorecer a heterodimerização em relação à homodimeriza- ção. O produto resultante é um anticorpo biespecífico tendo dois bra- ços Fab ou meias-moléculas que, se ligam, cada um(a), a um epítopo diferente.
[0319] Anticorpos biespecíficos podem também ser gerados com o uso de designs como o "Triomab/Quadroma" (Trion Pharma/Fresenius Biotech), Knob-in-Hole ("botão no orifício", Genentech), "CrossMAbs" (Roche) e a interação de CH3 eletrostaticamente induzida ("electrosta- tically-induced CH3 interaction" (Chugai, Amgen, NovoNordisk, Onco- med), o "LUZ-Y" (Genentech), o "Strand Exchange Engineered Do- main body" (SEEDbody) (EMD Serono), o "Biclonic" (Merus) e os pro- dutos "DuoBody®" (Genmab A/S).
[0320] A tecnologia quadroma Triomab pode ser usada para gerar anticorpos biespecíficos de comprimento total. A tecnologia Triomab promove a troca de braço Fab entre dois anticorpos quiméricos paren- tais, um mAb parental tendo IgG2a e o segundo mAb parental tendo regiões constantes de IgG2b de rato, produzindo anticorpos biespecífi- cos quiméricos.
[0321] A estratégia "knob-in-hole" ("protuberância -em-cavidade") pode ser usada para gerar anticorpos biespecíficos de comprimento total. Resumidamente, os aminoácidos selecionados que formam a interface dos domínios CH3 na IgG humana podem ser mutados em posições que afetam as interações do domínio CH3 para promover a formação de heterodímero. Um aminoácido com uma cadeia lateral (orifício) é introduzido em uma cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um primeiro antígeno e um aminoácido com uma cadeia lateral grande (botão) é introduzido em uma cadeia pesa- da de um anticorpo que se liga especificamente a um segundo antíge- no. Após a coexpressão dos dois anticorpos, um heterodímero é for- mado como resultado da interação preferencial da cadeia pesada com uma "hole" (cavidade) com a cadeia pesada com uma "knob" (protube- rância). Pares de substituição de CH3 exemplificadores que formam uma "knob" (protuberância) e uma "hole" (cavidade) são (expressos como posição modificada no primeiro domínio CH3 da primeira cadeia pesada/posição modificada no segundo domínio CH3 da segunda ca- deia pesada): T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S e T366W/T366S_L368A_Y407V.
[0322] A tecnologia CrossMAb pode ser usada para gerar anticor- pos biespecíficos de comprimento. CrossMAbs, em adição ao uso da estratégia de "knob-in-hole" para favorecer a troca de braço Fab, têm em um dos meios-braços o domínio CH1 e o domínio CL trocados pa- ra assegurar o correto emparelhamento das cadeias leves do anticor- po biespecífico resultante (consulte por exemplo a patente US n°
8.242.247).
[0323] Outras estratégias de entrecruzamento ("cross-over") po- dem ser usadas para gerar anticorpos biespecíficos de comprimento total pela troca de domínios variáveis ou constantes, ou de ambos os domínios, entre a cadeia pesada e a cadeia leve ou dentro da cadeia pesada dos anticorpos biespecíficos, em um braço ou em ambos os braços. Estas trocas incluem por exemplo VH-CH1 com VL-CL, VH com VL, CH3 com CL e CH3 com CH1 conforme descrito nas publica- ções de patente internacional n° WO2009/080254, WO2009/080251, WO2009/018386 e WO2009/080252.
[0324] Podem ser utilizadas outras estratégias, como favorecimen- to da heterodimerização da cadeia pesada com o uso de interações eletrostáticas pela substituição de resíduos positivamente carregados em uma superfície CH3 e de resíduos negativamente carregados em uma segunda superfície CH3, conforme descrito na publicação de pa- tente US n° US2010/0015133; publicação de patente US n° US2009/0182127; publicação de patente US n° US2010/028637, ou publicação de patente US n° US2011/0123532. Em outras estratégias, a heterodimerização pode ser favorecida pelas seguintes substituições (expressas como posição modificada no primeiro domínio CH3 da pri- meira posição da cadeia pesada/posição modificada no segundo do- mínio CH3 da segunda cadeia pesada): L351Y_F405A_Y407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V_K409F, Y407A/T366A_K409F, ou T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W confor- me descrito na publicação de patente US n° US2012/0149876 ou pu- blicação de patente US n° US2013/0195849.
[0325] A tecnologia LUZ-Y pode ser utilizada para gerar anticorpos biespecíficos. Nesta tecnologia, um zíper de leucina é adicionado ao terminal C dos domínios CH3 para direcionar a montagem do hetero- dímero a partir dos mAbs parentais, que é removido após a purifica- ção.
[0326] A tecnologia SEEDbody pode ser utilizada para gerar anti-
corpos biespecíficos. SEEDbodies têm, em seus domínios constantes, resíduos de IgG selecionados substituídos por resíduos de IgA para favorecer a heterodimerização conforme descrito no pedido de patente US n° 20070287170.
[0327] Os anticorpos biespecíficos podem ser gerados in vitro em um ambiente livre de células através da introdução de mutações assi- métricas nas regiões de CH3 de dois anticorpos homodiméricos mo- noespecíficos e da formação do anticorpo heterodimérico biespecífico de dois anticorpos homodiméricos monoespecíficos parentais em con- dições redutoras para permitir a isomerização da ligação de dissulfeto de acordo com os métodos descritos na publicação de patente inter- nacional n° WO2011/131746. Nos métodos, o primeiro anticorpo biva- lente monoespecífico e o segundo anticorpo bivalente monoespecífico são manipulados para terem determinadas substituições no domínio de CH3 que favorece a estabilidade de heterodímero; os anticorpos são incubados juntos sob condições redutoras suficientes para permitir que as cisteínas na região da dobradiça sofram isomerização da liga- ção de dissulfeto; gerando, assim, o anticorpo biespecífico pela troca do braço do Fab. As substituições que podem ser usadas são F405L em uma cadeia pesada e K409R na outra cadeia pesada em anticor- pos IgG1. Em anticorpos IgG4, uma cadeia pesada pode ser uma IgG4 de tipo selvagem tendo F na posição 405 e R na posição 409 e a outra cadeia pesada pode ter substituições F405L e R409K. As condições de incubação param ser idealmente restauradas para não redutoras. Agentes redutores exemplificadores que podem ser usados são 2- mercaptoetilamina (2-MEA), ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), gluta- tiona, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), L-cisteína e beta- mercaptoetanol. Por exemplo, a incubação durante pelo menos 90 min, a uma temperatura de pelo menos 20°C na presença de 25 mM de 2-MEA ou na presença de pelo menos 0,5 mM de ditiotreitol a um pH 5-8, por exemplo pH 7,0 ou pH 7,4, pode ser usada.
[0328] Em algumas modalidades, os anticorpos biespecíficos in- cluem moléculas de direcionamento dual do tipo IgG recombinantes, nas quais cada um dos dois lados da molécula, contém o fragmento Fab ou parte do fragmento Fab de ao menos dois anticorpos diferen- tes; moléculas de fusão com IgG, sendo que os anticorpos IgG de comprimento total são integrados a um fragmento Fab extra ou partes do fragmento Fab; moléculas de fusão Fc, em que as moléculas Fv de cadeia única ou diacorpos estabilizados são fusionados a domínios constantes de cadeia pesada, regiões Fc ou partes das mesmas; mo- léculas de fusão Fab, sendo que diferentes fragmentos Fab são fusio- nados juntos; anticorpos com base em ScFv e diacorpos e de cadeia pesada (por exemplo, anticorpos de domínio, nanocorpos) em que di- ferentes moléculas Fv de cadeia única ou diferentes diacorpos ou dife- rentes anticorpos de cadeia pesada (por exemplo, anticorpos de domí- nio, nanocorpos) são fusionados entre si ou a uma outra proteína ou molécula carreadora.
[0329] As substituições são tipicamente feitas ao nível de DNA em uma molécula como o domínio constante do anticorpo com o uso de métodos-padrão.
[0330] Os anticorpos da invenção podem ser manipulados em vá- rias formas de anticorpo bem conhecidas.
[0331] Por exemplo, um anticorpo biespecífico para PD-1/CD3 po- de ser gerado com o uso dos domínios VH/VL dos anticorpos PD-1 aqui descritos e de quaisquer regiões VH/VL de anticorpos anti-CD3 publicados.
[0332] Uma outra modalidade da invenção é um anticorpo biespe- cífico que compreende um primeiro domínio que se liga a PD-1 e um segundo domínio que se liga ao CD3. Métodos de Caracterização de Anticorpos
Anticorpos Agonísticos
[0333] Uma atividade biológica típica induzida pelos anticorpos agonísticos aqui fornecidos é a inibição (por exemplo, supressão) de células T CD4+ ou CD8+ específicas para o antígeno Várias leituras podem ser usadas para avaliar o agonismo dos anticorpos aqui forne- cidos, como proliferação reduzida ou produção reduzida de interferon- γ (IFN -γ), IL-17 IL-2, IL-6, IL-22, IL-23 ou GM-CSF por células TCD4+ ou CD8+ específicas para o antígeno. Em um ensaio exemplificador, o efeito dos anticorpos sobre as células T de doador normal que são es- timuladas por células dendríticas alogênicas ou antígenos específicos, como o toxoide tetânico ou CMV são usados. Nesta configuração, as alterações na função das células T com tratamento com anticorpos podem ser detectadas mediante a medição dos níveis de citocina ou marcadores de ativação de células Tno sobrenadante. Em um ensaio exemplificador, as PBMCs determinadas como reativas a antígenos CMV são usadas como fonte de células T CD4+ ou CD8+ específicas para o antígeno. 1,5 x 106 células/mL ou 2 x 106 células/mL de PBMCs reativas a CMV são plaqueadas sobre placas de cultura e 0,1 a 0,2 µg/mL de peptídeos de CMV adicionados às culturas. Os peptídeos de CMV podem ser adquiridos, por exemplo, junto à JPT Tecnologias. Os anticorpos de teste são adicionados em dose única de 10 µg/mL, as placas incubadas durante 6 dias, e a proliferação celular avaliada pela adição de 1 µCi/poço de metil-3H-timidina (PerkinElmer) durante 6 ho- ras e a radioatividade medida em cada amostra. Alternativamente, a produção de citocina pelas células é medida com o uso de ELISA ou ensaios multiplex conhecidos. Anticorpos que bloqueiam a ligação de PD-L1 e/ou PD-L2 a PD-1
[0334] Os anticorpos da invenção aqui fornecidos (como anticor- pos agonísticos que se ligam especificamente a PD-1) podem ser blo- queios ou não bloqueios de ligante. A capacidade dos anticorpos ago-
nísticos aqui fornecidos pode ser avaliada por sua capacidade de blo- quear o ligante, por exemplo, PD-L1 ou PD-L2 ou ambos com o uso de ensaios de competição como o ensaio de agrupamento celular.
[0335] Em um ensaio exemplificador, as células HEK diferencial- mente identificadas que superexpressam PD-1 ou PD-L1 (ou PD-L2) são misturadas em uma razão de 1:1, e a capacidade dos anticorpos de inibir o agrupamento de células que expressam PD-1 e PD-L1 ou PD-1 e PD-L°2 é quantificada. As células que superexpressam PD-1 humana podem ser marcadas com corante Cll Trace Violet e as célu- las que superexpressam PD-L1 ou PD-L2 podem ser marcadas com o corante Far Red Cell Trace (Life Technologies). As células que ex- pressam PD-1 são misturadas com o anticorpo de teste e após uma breve incubação, as células que expressam PD-L1 são adicionadas à mistura. A mistura é incubada durante uma hora, e a porcentagem de eventos duplo-positivos (por exemplo, agrupamentos de células positi- vas com corante Violet Cell Trace e corante Far Red Cell Trace) é ava- liada com o uso de citometria de fluxo. O nível do agrupamento é me- dido pela porcentagem de eventos duplo-positivos, e a porcentagem de agrupamento na presença dos anticorpos de teste é comparada à dos anticorpos de isótipo de controle positivo e negativo. O anticorpo aqui fornecido bloqueia a ligação de PD-L1 (ou PD-L2) a PD-1 quando o anticorpo inibe eventos duplo-positivos de células que expressam PD-1 e PD-L1 (ou PD-L2) de uma maneira estatisticamente significati- va quando comparado ao controle de isótipo com o uso de um valor p de ≤0,01 como uma medida de significância. O anticorpo aqui forneci- do não bloqueia a ligação de PD-L1 (ou PD-L2) a PD-1 quando o anti- corpo inibe eventos duplo-positivos de PD-1 e PD-L1 (ou PD-L2) de uma maneira estatisticamente insignificante, por exemplo, p>0,01. Medições de Afinidade do Anticorpo
[0336] A afinidade de um anticorpo a PD-1 humana ou não huma-
na, como PD-1 de cinomolgo, pode ser determinada experimentalmen- te com o uso de qualquer método adequado. Tais métodos podem usar a instrumentação ProteOn XPR36, Biacore 3000 ou KinExA, ELISA ou testes de ligação competitiva conhecidos pelos versados na técnica. A afinidade medida de uma interação entre um anticorpo es- pecífico/ PD-1 pode variar se medida sob diferentes condições (por exemplo, osmolaridade, pH). Dessa forma, as medições de afinidade e outros parâmetros de ligação (por exemplo, KD, Klig, Kdesl) são, tipica- mente, realizadas sob condições padronizadas e um tampão padroni- zado, como o tampão aqui descrito no Exemplo 1. O versado na técni- ca vai entender que o erro interno das medições de afinidade, por exemplo, usando Biacore 3000 ou ProteOn (medido como desvio pa- drão, DP) pode tipicamente estar dentro de 5 a 33% para as medições dentro dos limites de detecção típicos. Portanto, o termo "cerca de" no contexto de KD reflete o desvio padrão típico no ensaio. Por exemplo, o DP típico para uma KD de 1x10-9 M é de até ± 0,33x10-9 M. Anticorpos que competem pela ligação a PD-1 com um anticorpo de referência
[0337] A concorrência entre ligação a PD-1 com anticorpos da in- venção (por exemplo, anticorpos de referência) que compreende cer- tas sequências VH e VL pode ser testada in vitro sobre uma platafor- ma Octet Red384 (Forte Bio). O antígeno PD1 marcado com histidina é carregado em seus sensores e os sensores são expostos a 20 µg/mL de anticorpo anti-PD1 de referência, seguido de exposição a uma concentração igual de um anticorpo anti-PD1 de teste. A ligação adicional pelo anticorpo de teste após saturação com o anticorpo de referência indica ligação simultânea dos dois anticorpos a PD-1, indi- cando que a referência e o anticorpo de teste não competem pela liga- ção a PD-1. Alternativamente, nenhuma ligação adicional do anticorpo de teste indica que os dois anticorpos competem pela ligação a PD-1.
[0338] Os anticorpos que competem pela ligação com PD-1 com um anticorpo de referência podem ser gerados pelo isolamento dos anticorpos que se ligam especificamente a PD-1 com o uso de biblio- tecas de apresentação em fago, e triagem dos anticorpos gerados por sua capacidade de competir pela ligação a PD-1 com os anticorpos de referência anteriormente mencionados.
[0339] O anticorpo de teste compete com a ligação a PD-1 com o anticorpo de referência quando o anticorpo de teste se liga a PD-1 na concentração de saturação do anticorpo de referência. A ligação pode ser detectada com o uso de interferometria de biocamada (como Oc- tet) pelo registro de um deslocamento do comprimento de onda devido ao anticorpo ligado aumentar a densidade óptica da ponta do biossen- sor ao longo do tempo. Epítopo do Anticorpo
[0340] O epítopo de PD-1 ao qual o anticorpo da invenção se liga pode ser resolvido, por exemplo, com o uso de troca de hidrogê- nio/deutério (troca H/D) ou pela análise de uma estrutura cristalina do anticorpo em complexo com PD-1. Dois anticorpos PD-1 "se ligam ao mesmo epítopo no PD-1" quando cerca de 70% ou mais resíduos de aminoácido de PD-1 protegidos pelo anticorpo em ao menos 5% de diferença em níveis de deuteração através de troca H/D são idênticos entre os dois anticorpos, ou quando 70% ou mais dos resíduos de aminoácido expostos na superfície de PD-1 determinados para ligar o anticorpo em uma estrutura cristalina de um complexo do anticorpo e PD-1 são idênticos entre os dois anticorpos. Na estrutura cristalina de um complexo do anticorpo e PD-1, os resíduos de epítopo são aqueles resíduos de PD-1 que residem dentro da distância de 4 Å ou menos a partir de qualquer um dentre os resíduos de CDR de anticorpo.
[0341] Em um ensaio de troca H/D, a proteína PD-1 é incubada na presença ou ausência do anticorpo em água deuterada durante tem-
pos predeterminados resultando na incorporação de deutério em áto- mos de hidrogênio permutáveis que não estão protegidos pelo anticor- po, seguido pelas digestão por protease da proteína e análises dos fragmentos peptídicos com o uso de LC-MS. Em um ensaio exemplifi- cador, 5 µL do anticorpo de teste (10 µg) ou 5 µL do complexo de PD- 1 e o anticorpo de teste (10 µg e 7,35 µg, respectivamente) são incu- bados com 120 µL de tampão para marcação com óxido de deutério (fosfato 50 mM, cloreto de sódio 100 mM em pH 7,4) durante 0 s, 60 s, 300 s, 1.800 s, 7.200 s, e 14.400 s. A troca de deutério é interrompida pela adição de 63 µL de cloridrato de guanidina 5 M e o pH final é 2,5. A amostra interrompida é submetida à digestão em coluna de pepsi- na/protease tipo XIII e à análise por LC-MS. Para digestão por pepsi- na/protease tipo XIII, 5 µg das amostras em 125 µL de tampão de con- trole (fosfato 50 mM, cloreto de sódio 100 mM em pH 7,4) são desna- turados pela adição de 63 µL de cloridrato de guanidina 5 M (pH final é 2,5) e pela incubação da mistura durante 3 min. Então, a mistura é submetida a uma digestão em coluna de pepsina/protease tipo XIII e os peptídeos resultantes são analisados com o uso de um sistema UPLC-MS compreendido de um Waters Acquity UPLC acoplado a um espectrômetro de massa Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer (Thermo). Os dados de MS brutos são processa- dos com o uso de HDX WorkBench, software para a análise de dados de MS de troca H/D. Os níveis de deutério são calculados com o uso da diferença média de massa entre o peptídeo deuterado e sua forma nativa (t0). A identificação de peptídeo é feita através de busca de da- dos de MS/MS, com Mascot, em comparação com a sequência de PD-
1. A tolerância de massa para os íons de produto e precursor é 0,05 Da e 20 ppm, respectivamente.
[0342] Para cristalografia de raios X, PD-1 e o anticorpo de teste são expressos e purificados com o uso de protocolos-padrão. O com-
plexo de PD-1/anticorpo de teste é incubado de um dia para o outro a 4°C, concentrado, e separado das espécies não complexadas com o uso de cromatografia de exclusão por tamanho. O complexo é cristali- zado pelo método de difusão de vapor a partir de várias soluções de teste conhecidas por exemplo soluções contendo PEG3350, citrato de amônio e ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico (MES).
[0343] Os anticorpos que ligam o mesmo epítopo em PD-1 como um anticorpo de referência podem ser gerados pelo isolamento de an- ticorpos que ligam PD-1 com o uso de bibliotecas de apresentação em fago, seleção dos anticorpos que competem com o anticorpo de refe- rência para a ligação a PD-1 em 100%, e identificação do epítopo do anticorpo por meio de troca H/D ou por cristalografia de raios X.
[0344] Alternativamente, camundongos ou coelhos podem ser imunizados com o uso de peptídeos que abrangem os resíduos de epí- topo, e os anticorpos gerados podem ser avaliados por sua ligação dentro da região mencionada. Polinucleotídeos, Vetores, Células Hospedeiras
[0345] A invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que codifica qualquer dos anticorpos da invenção.
[0346] A invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que codifica qualquer das regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo, qualquer das regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo, qualquer das cadeias pesadas de anticorpo e/ou as cadeias leves de anticorpo da invenção.
[0347] A invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que codifica a VH das SEQ ID Nºs: 8, 9, 10, 140, 141 ou 142.
[0348] A invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que codifica a VL das SEQ ID Nºs: 14, 15, 16, 143 ou 144.
[0349] A invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que codifica a VH das SEQ ID Nºs: 9, 10, 140, 141 ou 142 e a VL das SEQ
ID Nºs: 14, 15, 16, 143 ou 144.
[0350] A invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que codifica a cadeia pesada (HC) das SEQ ID Nºs: 20, 21, 22, 150, 151 ou
152.
[0351] A invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que codifica a cadeia leve (LC) das SEQ ID Nºs: 26, 27, 28, 153 ou 154.
[0352] A invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que codifica a HC das SEQ ID Nºs: 20, 21, 22, 150, 151 ou 152 e a LC das SEQ ID Nºs: 26, 27, 28, 153 ou 154.
[0353] A invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que compreende a sequência de polinucleotídeo das SEQ ID Nºs: 11, 12, 13, 17, 18, 19, 23, 24, 25, 29, 30, 31, 132, 133, 134, 135, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163 ou 164.
[0354] A invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que codifica a VH das SEQ ID Nºs: 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ou 51.
[0355] A invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que codifica a VL das SEQ ID Nºs: 60, 61 ou 62.
[0356] A invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que codifica a VH das SEQ ID Nºs: 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ou 51 e a VL das SEQ ID Nºs: 60, 61 ou 62.
[0357] A invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que codifica a cadeia pesada das SEQ ID Nºs: 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 ou 73.
[0358] A invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que codifica a cadeia leve das SEQ ID Nºs: 82, 83 ou 84.
[0359] A invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que codifica a HC das SEQ ID Nºs: 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 ou 73 e a LC das SEQ ID Nºs: 82, 83 ou 84.
[0360] A invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que compreende a sequência de polinucleotídeo das SEQ ID Nºs: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 63, 64, 65, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 85, 86,
87, 136, 137, 138 ou 139.
[0361] A invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que codifica a VH das SEQ ID Nºs: 94 ou 95.
[0362] A invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que codifica a VL das SEQ ID Nºs: 98, 99 ou 100.
[0363] A invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que codifica a VH das SEQ ID Nºs: 94 ou 95 e a VL das SEQ ID Nºs: 98, 99 ou 100.
[0364] A invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que codifica a HC das SEQ ID Nºs: 104 ou 105.
[0365] A invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que codifica a LC das SEQ ID Nºs: 108, 109 ou 110.
[0366] A invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que codifica a HC das SEQ ID Nºs: 104 ou 105 e a LC das SEQ ID Nºs: 108, 109 ou 110.
[0367] A invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que compreende a sequência de polinucleotídeo das SEQ ID Nºs: 96, 97, 101, 102, 103, 106, 107, 111, 112 ou 113.
[0368] As sequências de polinucleotídeos que codificam a VH ou a VL ou fragmentos de ligação ao antígeno das mesmas dos anticorpos da invenção, ou a cadeia pesada e/ou a cadeia leve dos anticorpos da invenção, podem ser funcionalmente ligadas a um ou mais elementos reguladores, como um promotor ou um intensificador, que permitem a expressão da sequência de nucleotídeos na célula hospedeira deseja- da. O polinucleotídeo pode ser um cDNA.
[0369] A invenção também fornece um vetor que compreende o polinucleotídeo da invenção. Tais vetores podem ser vetores plasmidi- ais, vetores virais, vetores para expressão de baculovírus, vetores de transposon ou quaisquer outros vetores adequados para a introdução do polinucleotídeo da invenção em um dado organismo ou anteceden-
te genético por quaisquer meios. Por exemplo, os polinucleotídeos que codificam as regiões variáveis de cadeia pesada e/ou leve dos anticor- pos da invenção, opcionalmente ligados a regiões constantes, são in- seridos em vetores de expressão. As cadeias pesadas e/ou leves po- dem ser clonadas nos mesmos vetores de expressão ou em diferen- tes. Os segmentos de DNA que codificam a VH, a VL, a HC e/ou a LC ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos podem ser opera- cionalmente ligados a sequências de controle nos vetores de expres- são que asseguram a expressão de polipeptídeos. Essas sequências de controle incluem sequências de sinalização, promotores (por exem- plo, promotores associados naturalmente ou heterólogos), elementos de acentuador e sequência de terminação da transcrição e são esco- lhidas por serem compatíveis com a células hospedeira escolhida para expressar o anticorpo. Depois que o vetor for incorporado no hospe- deiro adequado, o hospedeiro é mantido sob condições adequadas para expressão de alto nível das proteínas codificadas pelos polinu- cleotídeos incorporados.
[0370] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 11 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 17.
[0371] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 12 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 18.
[0372] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 12 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 19.
[0373] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 13 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 19.
[0374] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 52 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 63.
[0375] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 53 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 64.
[0376] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle-
otídeo da SEQ ID Nº: 53 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 65.
[0377] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 54 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 64.
[0378] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 55 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 64.
[0379] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 56 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 64.
[0380] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 57 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 64.
[0381] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 58 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 64.
[0382] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 59 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 64.
[0383] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 96 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 101.
[0384] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 97 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 102.
[0385] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 97 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 103.
[0386] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 132 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 133.
[0387] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 134 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 135.
[0388] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 136 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 137.
[0389] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 138 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 139.
[0390] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 155 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 19.
[0391] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle-
otídeo da SEQ ID Nº: 156 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 19.
[0392] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 157 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 19.
[0393] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 13 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 158.
[0394] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 13 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 159.
[0395] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 155 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 158.
[0396] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 156 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 158.
[0397] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 157 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 158.
[0398] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 155 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 159.
[0399] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 156 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 159.
[0400] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 157 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 159.
[0401] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 160 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 31.
[0402] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 161 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 31.
[0403] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 162 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 31.
[0404] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 25 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 163.
[0405] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 25 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 164.
[0406] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle-
otídeo da SEQ ID Nº: 160 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 163.
[0407] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 161 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 163.
[0408] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 162 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 163.
[0409] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 160 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 164.
[0410] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 161 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 164.
[0411] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID Nº: 162 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID Nº: 164.
[0412] Os vetores de expressão adequados são tipicamente repli- cáveis nos organismos hospedeiros ou como epissomas ou como uma parte integrada do DNA cromossômico hospedeiro. Comumente, os vetores de expressão contêm marcadores de seleção, como resistên- cia à ampicilina, resistência à higromicina, resistência à tetraciclina, resistência à canamicina ou resistência à neomicina para permitir a detecção dessas células transformadas com as sequências de DNA desejadas. O sistema de glutamina sintetase pode ser usado para ex- pressar proteínas recombinantes como anticorpos em células.
[0413] Elementos do promotor e acentuador adequados são co- nhecidos na técnica. Para expressão em uma célula eucariote, promo- tores exemplificadores incluem elementos do promotor e acentuador do gene da imunoglobulina de cadeia leve e/ou pesada; promotor ini- cial imediato de citomegalovírus; promotor da timidina quinase do vírus da herpes simples; promotores SV40 iniciais e tardios; promotor pre- sente em longas repetições terminais de um retrovírus; promotor da metalotioneína-I do camundongo e vários promotores específicos para tecido conhecidos na técnica. A seleção do vetor e promotor adequa- dos está dentro do nível do versado na técnica.
[0414] Grandes números de vetores e promotores adequados são conhecidos dos versados na técnica; muitos estão comercialmente disponíveis para gerar construtos recombinantes. Os vetores a seguir são fornecidos a título de exemplo. Bacterianos: pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene, La Jolla, Califórnia, EUA); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 e pRIT5 (Pharmacia, Uppsala, Suécia). Eucarióticos: pWL- neo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG e pSVL (Pharmacia), e pEE6.1 e pEE14.1 (Lonza).
[0415] A invenção também fornece uma célula hospedeira que compreende um ou mais vetores da invenção. O termo "célula hospe- deira" se refere a uma célula na qual um vetor foi introduzido. Entende- se que o termo célula hospedeira se refere não apenas à célula do es- pecífica em questão, mas à progênie desta célula, e também a uma linhagem celular estável gerada da célula do específica em questão. Uma vez que certas modificações podem ocorrer em gerações suces- sivas devido a mutações ou influências ambientais, tal progênie pode não ser idêntica à célula progenitora, mas ainda assim ser incluída no escopo do termo "células hospedeira" para uso na presente invenção. Tais células hospedeiras podem ser células eucarióticas, células bac- terianas, células vegetais ou células de arquea.
[0416] Escherichia coli, bacilos, como Bacillus subtilis, e outras Enterobacteriaceae, como Salmonella, Serratia, e várias espécies de Pseudomonas, são exemplos de células hospedeiras procarióticas. Outros micróbios, como leveduras, também são úteis para a expres- são. Saccharomyces (por exemplo, S. cerevisiae) e Pichia são exem- plos de células hospedeiras de levedura adequadas. As células euca- rióticas exemplificadoras podem ser de origem de mamífero, de inseto, de aves ou de outra origem animal. As células eucarióticas de mamífe- ro incluem linhagens celulares imortalizadas, como linhagens celulares de hibridoma ou mieloma, como linhagens celulares de murino SP2/0 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, EUA CRL- 1581), NS0 (European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, Reino Unido, ECACC n° 85110503), FO (ATCC CRL-1646) e Ag653 (ATCC CRL-1580). Uma linhagem celular de mieloma humana exemplificadora é U266 (ATTC CRL-TIB-196). Outras linhagens celula- res úteis incluem aquelas derivadas de células de ovário de hamster chinesa (CHO) como CHO-K1SV (Lonza Biologics, Walkersville, MD, EUA), CHO-K1 (ATCC CRL-61) ou DG44.
[0417] A invenção também fornece um método de produção do anticorpo da invenção, que compreende o cultivo da célula hospedeira da invenção em condições nas quais o anticorpo é expresso, e a recu- peração do anticorpo produzido pela célula hospedeira. Os métodos de produção de anticorpos e de purificação dos mesmos são conheci- dos. Depois de sintetizados (ou quimicamente ou por recombinação), os anticorpos inteiros, seus dímeros, cadeias individuais leves e/ou pesadas, ou outros fragmentos de anticorpo, como VH e/ou VL, podem ser purificados de acordo com procedimentos convencionais, incluindo precipitação por sulfato de amônio, colunas de afinidade, cromatogra- fia em coluna, purificação por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), eletroforese em gel e similares (consulte, em geral, Scopes, Protein Purification (Springer- Verlag, N.Y., (1982)). Um anticorpo em questão pode ser substancialmente puro, por exemplo, com ao menos cerca de 80% a 85% de pureza, com ao menos cerca de 85% a 90% de pureza, com ao menos cerca de 90% a 95% de pureza, ou com ao menos cerca de 98% a 99%, ou mais, de pureza, por exemplo, isento de contaminantes, como resíduos celulares, macromoléculas, etc. que não sejam o anticorpo em questão.
[0418] A invenção também fornece um método para a produção de um anticorpo de que se liga especificamente a PD-1, que compreende:
incorporar do primeiro polinucleotídeo que codifica a VH do anticorpo e o segundo polinucleotídeo que codifica a VL do anticorpo em um vetor de expressão; transformar uma célula hospedeira com o vetor de expres- são; cultivar a célula hospedeira em um meio de cultura sob condições em que a VL e VH do anticorpo são expressas e formam o anticorpo; e recuperar o anticorpo a partir da célula hospedeira ou meio de cultura.
[0419] Os polinucleotídeos que codificam certas sequências de VH ou VL da invenção podem ser incorporados nos vetores com o uso de métodos-padrão de biologia molecular. A transformação na célula hospedeira, cultura, expressão e purificação do anticorpo são feitos usando métodos bem conhecidos. Composições farmacêuticas/administração
[0420] A invenção também fornece composições farmacêuticas que compreendem os anticorpos ou o fragmento de ligação a antígeno dos mesmos da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Para uso terapêutico, os anticorpos da invenção podem ser prepara- dos na forma de composições farmacêuticas contendo uma quantida- de eficaz dos anticorpos como um ingrediente ativo em um veículo farmaceuticamente aceitável. O termo "veículo" se refere a um diluen- te, adjuvante, excipiente ou carreador com o qual o anticorpo da in- venção é administrado. Tais veículos podem ser líquidos, como água e óleos, incluindo aqueles de origem de petróleo, animal, vegetal ou sin- tética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares. Por exemplo, solução salina a 0,4% e glicina a 0,3% podem ser usadas. Estas soluções são estéreis e, em geral, isentas de matéria particulada. As mesmas podem ser esterilizadas através de técnicas de esterilização convencionais bem conhecidas (por exemplo, filtração). As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis conforme exigido para apro- ximá-las das condições fisiológicas, como agentes de tamponamento e de ajuste de pH, estabilizantes, espessantes, lubrificantes e agentes corantes, etc. A concentração dos anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da invenção em tal formulação farmacêutica pode variar de menos de cerca de 0,5%, usualmente a ao menos cer- ca de 1%, até 15 ou 20%, em peso, e pode ser selecionada primaria- mente com base na dose necessária, volumes do fluido, viscosidades, etc., de acordo com o modo específico de administração selecionado. Veículos adequados e formulações adequadas, inclusive de outras proteínas humanas, por exemplo, albumina sérica humana, são descri- tos, por exemplo, em "Remington: The Science and Practice of Phar- macy", 21a Edição, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Phi- ladelphia, PA 2006, EUA, Parte 5, "Pharmaceutical Manufacturing" pá- ginas 691 a 1092, consulte especialmente as páginas 958 a 989.
[0421] O modo de administração para uso terapêutico dos anticor- pos ou dos fragmentos de ligação a antígeno do mesmo da invenção pode ser qualquer rota adequada que forneça o anticorpo a um indiví- duo, como administração parenteral, por exemplo, intradérmica, intra- muscular, intraperitoneal, intravenosa ou subcutânea, pulmonar, transmucosal (oral, intranasal, intravaginal, retal), com o uso de uma formulação em um comprimido, cápsula, solução, pó, gel, partícula; e contida dentro de uma seringa, um dispositivo implantado, uma bomba osmótica, um cartucho, uma microbomba; ou outro meio reconhecido pela pessoa versada na técnica, como é bem conhecido na técnica. A administração sítio-específica pode ser realizada, por exemplo, por aplicação intratumoral, intra-articular, intrabronquial, intra-abdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitária, intracelial, intracerebe-
lar, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intra- hepática, intracardíaca, intraosteal, intrapélvica, intrapericardíaca, in- traperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarretal, in- trarrenal, intrarretinal, intraespinhal, intrassinovial, intratorácica, intrau- terina, intravascular, intravesical, intralesional, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal ou transdérmica.
[0422] Os anticorpos ou os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da invenção podem também ser administrados profilatica- mente para reduzir o risco de desenvolver uma doença autoimune e/ou atrasar o início dos sintomas.
[0423] Os anticorpos ou os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da invenção podem ser liofilizados para armazenamento e reconstituídos em um veículo adequado antes do uso. Esta técnica mostrou-se eficaz com preparações de proteínas convencionais e as técnicas de reconstituição e de liofilização bem conhecidas na técnica podem ser utilizadas. Métodos e usos
[0424] Os anticorpos ou os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da invenção têm utilidades diagnósticas in vitro e in vivo, e também utilidades terapêuticas e profiláticas. Por exemplo, os anticor- pos ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da inven- ção podem ser administrados às células em cultura, in vitro ou ex vivo, ou a um indivíduo para tratar, evitar e/ou diagnosticar uma variedade de doenças, como distúrbio imunológico ou quaisquer condições nas quais atenuação da atividade de células T que expressam PD-1 e/ou modulação negativa da resposta imune são desejadas.
[0425] A invenção também fornece um método de supressão da ativação de uma célula T que expressa PD-1 em um indivíduo, que compreende administrar a um indivíduo o anticorpo isolado ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção por um tempo suficiente para suprimir a ativação da célula T que expressa PD-L1.
[0426] Em algumas modalidades, a célula de T que expressa PD-1 é uma célula T CD4+ específica para o antígeno.
[0427] Em algumas modalidades, a célula de T que expressa PD-1 é uma célula T CD8+ específica para o antígeno.
[0428] "Suprimir a ativação" se refere à capacidade dos anticorpos aqui fornecidos de inibir a ativação de células T que expressam PD-1, por exemplo inibir a proliferação ou a produção de IFN-γ por células T CD4+ e/ou CD8+ específicas para o antígeno. O anticorpo suprime a ativação de células T que expressam PD-1 quando o anticorpo inibe a proliferação ou a produção de IFN-γ por células T CD4+ e/ou CD8+ es- pecíficas para o antígeno em 20%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% maior que na ausên- cia do anticorpo (por exemplo, controle negativo), ou quando a inibição é estatisticamente significativa quando comparada à inibição na au- sência do anticorpo.
[0429] A célula T que expressa PD-1 pode estar situada próximo a uma resposta inflamatória inadequada. Os anticorpos ou os fragmen- tos de ligação a antígeno dos mesmos da invenção pode suprimir a ativação a célula T que expressa PD-1 por aumento de sinalização a jusante de PD-1 resultando na inibição da sinalização de TCR e na inibição da ativação, proliferação e/ou sobrevivência das células T. Os anticorpos da invenção podem, alternativamente, mediar a morte das células de T positivas para PD-1 por funções efetoras mediadas por anticorpo ADCC, ADCP e/ou CDC.
[0430] É também fornecido um método de modulação negativa de uma resposta imunológica que compreende administrar a um indivíduo que precisa do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção para modular negativamente a resposta imune.
[0431] É também fornecido um método de tratamento de um dis- túrbio imunológico que compreende administrar a um indivíduo que precisa do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anti- corpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção para tratar o distúrbio imunológico.
[0432] O distúrbio imune pode ser crônico ou agudo, como doença inflamatória crônica ou doença inflamatória aguda.
[0433] Em algumas modalidades, o distúrbio imunológico é lúpus, lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de Sjogren, artrite, artrite reu- matoide, asma, DPOC, doença inflamatória pélvica, doença de Al- zheimer, doença inflamatória intestinal, doença de Crohn, colite ulcera- tiva, doença de Peyronie, doença celíaca, doença da vesícula biliar, doença pilonidal, peritonite, psoríase, artrite psoriática, vasculite, ade- sões cirúrgicas, acidente vascular cerebral, diabetes tipo I, doença de Lyme, meningoencefalite, uveíte autoimune, esclerose múltipla, lúpus (como, lúpus eritematoso sistêmico), síndrome de Guillain-Barr, der- matite atópica, hepatite autoimune, alveolitef ibrosante, doença de Grave, nefropatia IgA, púrpura trombocitopênica idiopática, doença de Ménière, pênfigo, cirrose biliar primária, sarcoidose, esclerodermia, granulomatose de Wegener, outras doenças autoimunes, pancreatite, traumas (cirurgia), doença de enxerto contra hospedeiro, rejeição de transplante, doença cardíaca incluindo doenças isquêmicas como en- farte do miocárdio bem como ateroesclerose, coagulação intravascu- lar, reabsorção óssea, osteoporose, osteoartrite, periodontite e hipo- cloridria, infertilidade relacionada com a falta de tolerância materna ao feto, síndrome de Sjogren, vitiligo, miastenia gravis ou esclerose sis- têmica.
[0434] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é artrite reu- matoide.
[0435] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é doença de enxerto contra hospedeiro.
[0436] Em algumas modalidades, a doença autoimune é artrite.
[0437] Em algumas modalidades, o distúrbio imunológico é asma.
[0438] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é COPD.
[0439] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é doença in- flamatória pélvica.
[0440] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é doença de Alzheimer.
[0441] Em algumas modalidades, a doença autoimune é doença inflamatória intestinal.
[0442] Em algumas modalidades, a doença inflamatória intestinal é doença de Crohn.
[0443] Em algumas modalidades, a doença inflamatória intestinal é colite ulcerativa.
[0444] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é doença de Peyronie.
[0445] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é doença celí- aca.
[0446] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é doença de vesícula biliar.
[0447] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é doença Pilo- nidal.
[0448] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é peritonite.
[0449] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é psoríase.
[0450] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é artrite psoriá- tica.
[0451] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é vasculite.
[0452] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é adesão ci- rúrgica.
[0453] Em algumas modalidades, o distúrbio imunológico é aciden-
te vascular cerebral.
[0454] Em algumas modalidades, a doença autoimune é diabetes tipo 1.
[0455] Em algumas modalidades, o distúrbio imunológico é doença de lyme.
[0456] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é meningoen- cefalite.
[0457] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é uveíte au- toimune.
[0458] Em algumas modalidades, a doença autoimune é esclerose múltipla.
[0459] Em algumas modalidades, a doença autoimune é lúpus.
[0460] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é lúpus erite- matoso sistêmico.
[0461] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é síndrome de Guillain-Barr.
[0462] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é dermatite atópica.
[0463] Em algumas modalidades, o distúrbio imunológico é hepati- te autoimune.
[0464] Em algumas modalidades, o distúrbio imunológico é alveoli- te fibrosante.
[0465] Em algumas modalidades, a doença inflamatória intestinal é doença de Grave.
[0466] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é nefropatia por IgA.
[0467] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é púrpura trombocitopénica idiopática.
[0468] Em algumas modalidades, a doença imune é doença de Meniere.
[0469] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é pênfigo.
[0470] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é cirrose biliar primária.
[0471] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é sarcoidose.
[0472] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é escleroder- mia.
[0473] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é granuloma- tose de Wegener.
[0474] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é pancreatite.
[0475] Em algumas modalidades, o distúrbio imunológico é rejei- ção de transplante.
[0476] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é doença car- díaca incluindo doenças isquêmicas como infarto do miocárdio.
[0477] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é aterosclero- se.
[0478] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é coagulação intravascular.
[0479] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é reabsorção óssea.
[0480] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é osteoporose.
[0481] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é osteoartrite.
[0482] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é periodontite.
[0483] Em algumas modalidades, a doença autoimune é hipoclori- dria.
[0484] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é Síndrome de Sjogren.
[0485] Em algumas modalidades, o distúrbio imune é vitiligo.
[0486] Em algumas modalidades, a doença autoimune é miastenia gravis.
[0487] Em algumas modalidades, a doença autoimune é esclerose múltipla.
[0488] Também é fornecido um método de tratamento de dor as- sociado com inflamação, que compreende administrar a um indivíduo que precisa do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno da inven- ção para tratar a dor associada com inflamação.
[0489] A invenção também fornece o anticorpo que se liga especi- ficamente a PD-1 da invenção para uso em terapia.
[0490] A invenção também fornece o anticorpo que se liga especi- ficamente a PD-1 da invenção para uso no tratamento de um distúrbio imunológico.
[0491] A invenção também fornece o anticorpo que se liga especi- ficamente a PD-1 da invenção para uso no tratamento de artrite reu- matoide.
[0492] A invenção também fornece o anticorpo que se liga especi- ficamente a PD-1 da invenção para uso no tratamento de lúpus, como lúpus eritematoso sistêmico.
[0493] A invenção também fornece o anticorpo que se liga especi- ficamente a PD-1 da invenção para uso no tratamento de doença de enxerto contra hospedeiro.
[0494] A invenção também fornece o uso do anticorpo que se liga especificamente a PD-1 da invenção na fabricação de um medicamen- to para o tratamento ou profilaxia de um distúrbio imunológico. Terapias de Combinação
[0495] Os anticorpos aqui fornecidos podem ser administrados em combinação com um segundo agente terapêutico.
[0496] O segundo agente terapêutico pode ser qualquer terapia conhecida para um distúrbio imunológico, como doenças autoimunes ou inflamatórias, incluindo qualquer agente ou combinação de agentes que são conhecidos por serem úteis, ou que foram ou estão atualmen-
te em uso, para o tratamento dessas doenças. Tais terapias e agentes terapêuticos incluem cirurgia ou procedimentos cirúrgicos (por exem- plo, esplenectomia, linfadenectomia, tiroidectomia, plasmaforese, leu- kophoresis, célula, tecido, ou órgão transplantados, procedimentos in- testinais, órgão de perfusão, e similares), radioterapia, terapias como terapia com terapia esteroidal e terapia não esteroidal, terapia hormo- nal, terapia com citocina, terapia com agentes dermatológicos (por exemplo, os agentes tópicos usados para tratar condições da pele co- mo alergias, dermatite de contato, e psoríase), terapia imunossupres- sora, e outra terapia anti-inflamatória de anticorpo monoclonal anti- inflamatórios.
[0497] O segundo agente terapêutico pode ser um corticosteroide, um medicamento antimalárico, um imunossupressor, um medicamento citotóxico ou um modulador de célula B.
[0498] Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico é prednisona, prednisolona, metilprednisolona, deflazacorte, hidroxicloro- quina, azatioprina, metotrexato, ciclofosfamida, micofenolato de mofetila (MMF), micofenolato sódico, ciclosporina, leflunomida, tacrolimus, RITUXAN® (rituximabe), ou BENLYSTA® (belimumabe).
[0499] Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção são administrados em combinação com um segundo agente terapêutico. Exemplos de segundos agentes terapêuticos são corticosteroides, fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs), salicilatos, hidro- xicloroquina, sulfassalazina, fármacos citotóxicos, fármacos imunossu- pressores, anticorpos imunomoduladores, metotrexato, ciclofosfamida, mizoribina, clorambucil, ciclosporina, tacrolimus (FK506; ProGrafrM), micofenolato mofetila, azatioprina (6-mercaptopurina), sirolimus (ra- pamicina), deoxispergualina, leflunomida e seus análogos malononitri- loamida; anticorpos anti-CTLA4 e fusões Ig, anticorpos anti-B estimu- ladores de linfócito (por exemplo, LYMPHOSTAT-BTM) e fusões
CTLA4-Ig (BLyS-Lg), anticorpos anti-CD80, anticorpos anti-célula T como anti-CD3 (OKT3), anti-CD4, corticoesteroides como, por exem- plo, clobetasol, halobetasol, hidrocortisona, triancinolona, betametaso- na, fluocinol, fluocinonida, prednisona, prednisolona, metilprednisolo- na; fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (NSAIDs) como, por exemplo, sulfadiazina, medicamentos contendo mesalamina (conheci- dos como agentes 5 -ASA), celecoxibe, diclofenaco, etodolaco, fenpro- feno, flurbiprofeno, ibuprofeno, cetoprofeno, meclofamato, meloxica- ma, nabumetona, naproxeno, oxaprozina, piroxicama, rofecoxibe, sali- cilatos, sulindaco e tolmetina; inibidores de fosfodiesterase-4, anticor- pos anti-TNF REMICADE® (infliximabe), SIMPONI® (golimumabe) e HUMIRA® (adalimumabe), talidomida ou seus análogos como lenali- domida.
[0500] Os anticorpos da invenção podem ser administrados em combinação com um segundo agente terapêutico, de forma simultâ- nea, sequencial ou separada.
[0501] A eficácia de tratamento ou RA pode ser determinada com o uso de eficácia como medido por respostas clínicas definidas pelos critérios do American College of Rheumatology, os critérios do Euro- pean League of Rheumatism, ou quaisquer outros critérios. Consulte, por exemplo, Felson et al. (1995) Arthritis Rheum. 38: 727-35 e van Gestel et al. (1996) Arthritis Rheum. 39: 34-40.
[0502] Embora a invenção tenha sido descrita em termos gerais, as modalidades da invenção serão descritas adicionalmente nos exemplos a seguir, que não devem ser interpretados como limitadores do escopo das reivindicações. Exemplo 1. Métodos Medições de afinidade com o uso de ressonância de plásmon de su- perfície (SPR)
[0503] As medições de afinidade foram realizadas com o uso de um sistema ProteOn XPR36T (BioRad). A superfície do biossensor foi preparada acoplando-se o Fc de IgG anti-humano (Jackson cat#109- 005-098) à superfície da camada de polímero de alginato modificado de um chip GLC (BioRad, Cat#176-5011) segundo as instruções do fabricante para a química de acoplamento de amina. Aproximadamen- te 5.000 UR (unidades de resposta) de mAbs de foram imobilizadas. Os experimentos cinéticos foram realizados a 25°C em tampão de cor- rida (DPBS+0,01% P20+100 µg/mL de BSA). Para realizar os experi- mentos cinéticos, 200 UR de mAbs foram capturadas seguido por inje- ções de analitos (PD-1 cino ou humano) em 400 concentrações na fai- xa de 1,563 nM a 400 nM (em uma diluição em série de 4 vezes). A fase de associação foi monitorada durante 3 minutos a 50 µL/min, se- guida de 10 ou 15 minutos de fluxo de tampão (fase de dissociação). A superfície do chip foi regenerada com dois pulsos de 18 segundos de 100 mM H3PO4 (Sigma, n° de catálogo 7961) a 100 µL/min.
[0504] Os dados coletados foram processados usando-se o sof- tware ProteOn Manager. Primeiro, os dados foram corrigidos para o fundo (background) com o uso de inter-pontos (inter-spots). Então, a subtração dos dados de referência dupla foi realizada usando a inje- ção de tampão para injeções de analito. A análise cinética dos dados foi realizada como uso de um modelo de ligação 1:1 de Langmuir. O resultado para cada mAb foi registrado no formato de ka (taxa de as- sociação), kd (taxa de dissociação) e KD(constante de dissociação em equilíbrio). Inibição de células T específicas de antígeno: Ensaio de ativação de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) induzidas por ci- tomegalovírus (CMV) ("CMV-PBMC")
[0505] Um ensaio que utiliza resposta de recuperação específica para CMV foi usado para avaliar a capacidade dos anticorpos gerados para inibir a ativação de células T medido pela inibição da proliferação celular mediante o tratamento de doadores de PBMC reativos a CMV com mistura de peptídeos de CMV (JPT Tecnologias).
[0506] As PBMC (Astarte Biologics, Hemacare, Precision for Medi- cine) foram determinadas como sendo reativas a antígenos CMV pelos respectivos fornecedores. Frascos congelados de PBMC foram adqui- ridos junto aos fornecedores e mantidos em nitrogênio líquido. No dia do experimento, uma alíquota de PBMC congeladas foi descongelada e as células foram ressuspensas em 10 mL de meio de ensaio (RPMI- 1640/Glutamax/HEPES contendo solução de 1% de penicili- na/estreptomicina, 1% de piruvato de sódio, 1% de aminoácidos não essenciais (NEAA), 10% de soro fetal bovino inativado por calor (todos adquiridos junto àThermo Fisher Scientific). As células foram centrifu- gadas, 200 g durante 15 minutos à temperatura ambiente. Após a cen- trifugação, o sobrenadante foi descartado, as células foram ressus- pensas em meio de ensaio de 10 mL e centrifugadas a 250 g durante 10 minutos. Após a centrifugação, as células foram ressuspensas em 10 mL de meio de ensaio, passadas através de uma peneira de 70 µmetros, e contadas. A concentração das células foi ajustada para 1,5 x 106 células/mL ou 2 x 106 células/mL de, e as células foram coloca- das em placas a 100 µlitros/poço com o uso de placas de 96 poços de fundo redondo tratadas com cultura de tecido (Corning). A densidade celular de plaqueamento foi específica para o doador e predetermina- da em experimentos preliminares para maximizar a janela de ensaio. A mistura peptídica de CMV foi preparada de acordo com as instruções do fabricante. Brevemente, 40 µL de sulfóxido de dimetila (Sigma) fo- ram adicionados a um frasco contendo 25 µg de mistura peptídica de CMV em pó liofilizado e pipetados suavemente para dissolver o rea- gente. O estoque de DMSO da mistura peptídica de CMV foi diluído em PBS para preparar uma solução de 50 µg/mL que foi deixada à temperatura ambiente durante 10 minutos. Diluição adicional foi prepa-
rada em um meio de ensaio a uma concentração final 4x, e 50 µL da solução peptídica de CMV foram adicionados em cada poço estimula- dos; enquanto que os poços de controle não estimulados receberam meio não suplementado. A concentração final foi otimizada para uma PBMC específica para o doador em experimentos preliminares (0,1 a 0,2 µg/mL). O anticorpo anti PD-1 foi adicionado em dose única de 10 µg/mL diluída em série no meio de ensaio a uma concentração final 4x, e 50 µL da diluição de anticorpo foram adicionados a cada poço, enquanto os poços de controle "nenhum anticorpo" receberam 50 µL de meio. As placas foram incubadas a 37°C, sob 5% de CO2 durante 6 horas. Após a incubação, 100 µL do sobrenadante foi coletado de ca- da poço, e 100 µL de meio de ensaio contendo 1 µCi/poço de metil- 3H- timidina PerkinElmer) foram adicionados em cada poço, e as pla- cas foram incubadas durante 6 horas a 37°C/5% de CO 2. As células foram colhidas em placas Unifilter-96, GF/C (Perkin Elmer), que foram deixadas secar de um dia para o outro à temperatura ambiente. Cin- quenta µL de Microscint-20 (PerkinElmer) foram adicionados em cada poço. As placas foram vedadas e contadas com o uso do TopCount NXT (PerkinElmer). Inibição do agrupamento celular para determinar a capacidade de blo- queio do ligante-receptor dos anticorpos
[0507] Um ensaio com o uso de uma mistura 1:1 de células renais embrionárias humanas (HEK) que superexpressam PD-1 (células PD- 1-HEK) ou ligante de PD-1 (células PD-L1-HEK) ou PD-L2 (células PD-L2-HEK) foi usado para avaliar a capacidade dos anticorpos gera- dos para inibir a interação receptor:ligante em um contexto à base de células, medida pela inibição do agrupamento celular conforme quanti- ficado por citometria de fluxo.
[0508] As células HEK que superexpressam PD1 humano (Crown Bio) foram marcadas com corante Violet Cell Trace (Life Technologi-
es). Células HEK que superexpressam PD-L1 ou PD-L2 de macaco cinomolgo foram marcadas com corante Far Red Cell Trace Stain (Life technologies). Brevemente, os corantes foram solubilizados em 20 µL de DMSO para fazer um estoque de 5 mM, então 5 µL foram diluídos em 10 mL de PBS para fazer uma solução 2,5 µM.
As células foram contadas e 50x106 células foram centrifugadas a 1.000 rpm durante 5 minutos à temperatura ambiente.
As células foram lavadas uma vez em PBS, e 1x106 células foram colocadas de lado como controles não manchados.
Após a repetição da centrifugação o sobrenadante foi descartado, e as células foram ressuspensas nas soluções de corante adequadas descritas acima e incubadas durante 15 minutos à tempe- ratura ambiente.
A seguir, 4 mL de soro fetal bovino (FBS) em banho de gelo foram adicionados em incubados durante mais 5 minutos.
As células foram então centrifugadas como acima, lavadas uma vez em tampão de ensaio (PBS, 10% de FBS, 1 mM de EDTA), centrifugadas novamente e o sobrenadante aspirado, então cada tipo de célula foi ressuspenso em tampão de ensaio em 3x106 células/mL.
Os anticor- pos de teste foram diluídos três vezes até a concentração final deseja- da (60 µg/mL) no tampão de ensaio.
Para preparar as amostras finais de célula/anticorpo (em triplicata), 100 µL de células PD-1-HEK foram misturadas com 100 µL de anticorpo.
Após 10 minutos de incubação, 100 µL de células de PD-L1-HEK ou PD-L2-HEK foram adicionados e as amostras finais misturadas foram incubadas em gelo durante um mínimo de uma hora.
Finalmente, 5 µL de iodeto de propídio foram adicionados e as amostras foram misturadas gentilmente, transferidas para tubos de fundo redondo de poliestireno e analisadas em um citô- metro de fluxo LSRII (BD Biosciences). Após os eventos de "gating" nas células vivas, a porcentagem de eventos duplo-positivos, para os canais Pacific Blue e APC, foi determinados com o uso de software Flowjo e representada graficamente em GraphPad Prism 6. O nível de agrupamento, conforme medido pela porcentagem de eventos duplo- positivos, para os mAbs anti-PD-1 foi comparado aos anticorpos de controle de isótipos positivos e negativos. Binagem de epítopo em octet
[0509] A binagem de epítopo dos anticorpos com um ensaio de ligação por competição foi realizada em uma plataforma Octet Red384 (Forte Bio), que se baseia na interferometria de biocamada. Esta téc- nica mede a ligação de um anticorpo inicial ao biossensor revestido com PD-1 como um deslocamento do comprimento de onda devido ao anticorpo ligado aumentar a densidade óptica da ponta do biossensor ao longo do tempo. Resumidamente, o antígeno PD-1 marcado com histidina foi carregado em seus sensores HIS. Os sensores foram en- tão expostos a 20 µg/mL de anticorpo anti-PD-1 primário, seguido de exposição a uma concentração igual de um segundo anticorpo anti- PD-1. Os dados foram processados com o uso do software de análise de dados ForteBio. A ligação adicional pelo segundo anticorpo após a saturação com o primeiro anticorpo indica a ligação simultânea dos dois anticorpos que necessariamente têm epítopos únicos não sobre- postos. Alternativamente, nenhuma ligação adicional indica que os dois anticorpos competem pela ligação ao antígeno PD-1. Citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) A ativação de células T de memória humanas (células-alvo):
[0510] Alíquotas congeladas de células T de memória humanas (AllCells LLC) foram descongeladas em banho de água a 37°C e no- vamente suspenso em 40 mL de meio de cultura (RPMI + 10% de FBS ou 5% de HuSAB + 50 µM βME (1:1000). + 1% de GlutaMax + 10 mM de Hepes. As placas foram centrifugadas, 250 g durante 15 minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, o sobrenadante foi des- cartado, as células foram ressuspensas em meio de cultura de 10 mL e centrifugadas a 250 g durante 10 minutos. Após a centrifugação, as células foram ressuspensas em meio de ensaio de 10 mL, e contadas. A concentração das células foi ajustada para 1,0 x 106 células/mL e 10 mL da suspensão de células foi transferida para placas de cultura de tecido pré-revestidas com anticorpo anti-CD3 (eBioscience, 5 ug/mL em PBS, uma hora a 37°C). O meio de cultura foi suplementado com 2 µg/mL de anticorpo anti-CD28 (eBioscience) e um coquetel de citoci- nas IL-2, IL-15 e IL-7 (R&D Systems and Peprotech) a 100 ng/mL conc. Os experimentos preliminares demonstraram que a expressão de PD-1 atingiu um pico no dia 5 após a ativação e, portanto, esse ponto no tempo foi escolhido para o ensaio. As células T de memória em repouso recentemente isoladas (não ativadas por estimulação de CD3/CD28) também foram incluídas na análise como um controle, porque elas expressam níveis baixos de PD-1. Preparação de células efetoras (NK92.CD16 e PBMCs):
[0511] Células NK-92 foram cultivadas em frascos de cultura de tecido armazenados na vertical e mantidos a uma densidade de 0,5 a 1,0 x 106 células/mL em meio de 6 mL (Myelocult 40 (Stemcell Techno- logies), piruvato de sódio 1X/ aminoácidos não essenciais/Pen Strep (Invitrogen), Hidrocortisona 4 µM (StemCell Technologies), 100 ng/mL de rhIL-2 (R&D Systems)). As células PBMC (Hemacare) congeladas foram descongeladas um dia antes do experimento e ressuspensas em meio XVIVO-10 (Lonza), 10% de FBS (Nitrocelulose) e 100 ng/mL de IL2 (R&D Systems). As placas foram centrifugadas, 250 g durante 15 minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, o sobrena- dante foi descartado, as células foram ressuspensas em meio de cultu- ra de 10 mL e centrifugadas a 250 g durante 10 minutos. Após a cen- trifugação, as células foram ressuspensas em 10 mL de meio de cultu- ra e contadas. A concentração celular foi ajustada para 1,0 x 106 célu- las/mL e o número necessário de células foi plaqueado em placa TC.
[0512] No dia da análise, as células PBMCs e NK foram colhidas e ressuspensas a 1x107 células/mL e 4x106 células/mL respectivamente em meio de ensaio (RPMI, 10% de FBS, 1 mM de piruvato de sódio, 0,1 mM de NEAA). As células T de memória foram lavadas uma vez, resssuspensas em 1x106 células/mL e marcadas com 6 µL de BATDA (Perkin Elmer por mL de células a 37°C por 30 min.
Células marcadas com BATDA foram lavadas três vezes com meio de ensaio frio, em excesso e suas densidades ajustadas para 0,2x106 células/mL.
Dilui- ções seriais dos Abs de teste começando a 20 µg/mL preparadas no meio de ensaio foram liberadas (100 µL, concentração final 2x) para se obter placas de ensaio de fundo em U de 96 poços.
Células-alvo mar- cadas com BATDA (50 µL) foram adicionadas a 0,2 x 106 células/mL e incubadas com mAbs de teste.
PBMC(50 µl) foram adicionadas em 1 x 107 células/mL em uma razão entre células efetoras:células-alvo de 50:1, enquanto que células NK (50 µL) foram adicionadas a 4 x 106 células/mL em uma razão entre células efetoras e células-alvo de 20:1. Poços de controle de lise máximo contendo células-alvo marcadas e 20 µL de 2% de Triton X-100 foram montados em triplicata.
Os poços de controle (liberação de BATDA no fundo) contendo células-alvo mar- cadas em meio de ensaio foram também montados em triplicata.
O volume final em todas os poços de placas de ensaio foi de 200 µL.
Os conteúdos dos poços foram misturados suavemente por pipeta.
As placas foram centrifugadas brevemente e incubadas a 37°C em uma incubadora com 5% de CO2 durante 2,5 horas.
Após a incubação, as células foram centrifugadas a 1200 rpm durante 5 minutos.
Os sobre- nadantes (30 µL) foram transferidos para placas Nunc brancas opacas (ThermoFisher, 136101) contendo 200 µL de solução de európio (Per- kinElmer, C135-100). As placas foram cobertas para proteger contra a luz e misturadas durante 15 minutos em um agitador.
As amostras fo- ram lidas em um leitor Envision MultiLabel (PerkinElmer). A porcenta- gem de lise foi calculada da seguinte forma: 100*(Liberação experi-
mental - liberação de fundo)/(liberação máxima - liberação de fundo). Citotoxicidade dependente de complemento (CDC)
[0513] Alíquotas congeladas de células Pan T humanas (Biological Specialty, LSII 49301C) foram descongeladas em banho-maria a 37°C e ressuspensas em 40 mL de RPMI 1640 + Glutamax + 25 mM HEPES pré-aquecida (Life Technologies, Cat# 72400-047) + 10% FBS (Gibco, 160000-36). As células foram centrifugadas a 250 g durante 5 minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, o sobrenadan- te foi descartado, as células foram ressuspensas em meio de 10 mL a 20 mL e contadas. As células Pan-T humanas (Biological Specialty, LSII 49301C) foram ativadas por 5 a 6 dias antes do ensaio de CDC com o uso do ativador-T humano CD3/CD28 Dynabeads™ (Life Technologies, Cat #11132D). Brevemente, 75 µL de Dynabeads pré- lavadas foram misturados com 6,0 x 106 células/frasco de células T, adicionados a T175 em 10 a 20 mL de meio e incubadas durante 6 di- as em um incubador a 37°C/5% em CO2. Após 6 dias, as microesferas foram removidas da mistura com o uso de magnetos EasySep™ (STEMCELL Tecnologias, 18000).
[0514] Em preparação para os ensaios de CDC, as células foram centrifugadas a 250 g durante 5 minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, o sobrenadante foi descartado, as células foram ressuspensas em 10 mL de meio de cultura isento de soro, e conta- das. A concentração celular foi ajustada para 1,6 x 106 células/mL em meio isento de soro e 50 µL/poço foram plaqueados em placas de fun- do redondo de 96 poços (Falcon 353077). Os anticorpos de teste fo- ram diluídos em série 1:3 até onze pontos em meio isento de soro, começando em 25 µg/mL (3x). 50 µL/poço de anticorpos de teste fo- ram adicionados aos poços de células-alvo adequados. 50 µL/poço de meio isento de soro foram adicionados aos poços de controle de fundo e de lise. As placas foram cobertas e incubadas durante 1 hora à tem-
peratura ambiente (rt). 50 µL/poço de 10% de complemento de coelho (3x) (Invitrogen, 31038-100) diluído em um meio isento de soro foram adicionados aos poços de teste. 50 µL/poço de meio isento de soro foram adicionados aos poços de controle de fundo. 50 µL/poço de 2% de Triton-X em meio isento de soro foram adicionados aos poços de controle de lise. As placas foram incubadas a 37°C, sob 5% de CO 2 durante 60 horas. As células foram centrifugadas a 250 g durante 5 minutos. 50 µL/poço de sobrenadante foram removidos e transferidos para placas UV-Vis de fundo plano de 96 poços (Corning, 3635). 50 µL/poço de reagente de detecção de LDH (Roche, 11-644-793-001) foram adicionados a cada amostra; as placas foram cobertas e incu- badas durante 15 minutos à temperatura ambiente. A absorbância a 490 e 650 nm foi registrada em um SpectraMax Plus M5 (Molecular Devices). As análises estatísticas foram realizadas com o uso do Mi- crosoft Excel e GraphPad Prism 6. A absorbância a 650 nm foi subtra- ída daquela a 490 nm para normalizar quanto à turvação. A porcenta- gem (%) de citotoxicidade foi determinado para cada amostra com o uso da seguinte fórmula: (Valor experimental - controle baixo)/(controle alto - controle baixo) × 100
[0515] Sendo que o controle alto é a média dos poços de controle de lise de Triton X, e o controle baixo é a média dos poços de controle de fundo 'meio apenas'. Um modelo de ajuste de curva logística de quatro parâmetros, [log(agonista) vs. resposta - coeficiente angular variável (quatro parâmetros), foi aplicado no GraphPad Prism ao log10 da concentração de Ab em relação à citotoxicidade % calculada. As amostras foram executadas em duplicata, e o ensaio foi realizado duas vezes.
[0516] Para confirmar a expressão do alvo, os níveis de PD-1 em células de Pan-T humanas ativadas foram medidos por citometria de fluxo no dia 5 ou no dia 6 após a ativação. Brevemente, as células T foram centrifugadas a 250 g durante 5 minutos, e ressuspensas em 1 x 106 células/mL em tampão de corante com BSA (BD Biosciences, 554657). 100 a 200K foram incubadas em 100 µL de volume total com concentrações saturantes de Ab PE-PD-1 (Biolegend, 329906). As cé- lulas foram lavadas 2x com tampão de corante com BSA, e ressus- pensas em um volume igual de tampão contendo corante DRAQ7 vi- vo/morto mancha (Cell Signaling Technology, 7406S). A intensidade fluorescente média foi registrada para eventos de 5K de células vivas em um citômetro de fluxo MACSQuant Analisador 10. Os níveis do re- ceptor foram determinados com o uso de uma curva-padrão gerada com o uso de microesferas PE Quantibrite™ (BD, 340495) e expres- sos como anticorpos ligados por célula. Exemplo 2. Geração de anticorpos agonísticos que se ligam especifi- camente a PD-1 e sua caracterização estrutural
[0517] Três camundongos Balb/c e três camundongos C3H foram imunizados com domínio extracelular (ECD) de PD-1 humana (SEQ ID Nº: 1) conjugado a Fc (huPD-1-Fc) e os hibridomas gerados com o uso de protocolos-padrão. Os hibridomas foram triados por ELISA para li- gação a PD-1 recombinante (ECD). Acertos ("hits") foram definidos como amostras dando um sinal ELISA maior que cinco vezes a média de controle negativo. Os clones positivos foram submetidos a triagem cruzada contra uma proteína de fusão Fc irrelevante e para ligação ao PD-1 de camundongo. Os sobrenadantes de hibridomas clonados de célula única foram testados quanto à ligação à proteína PD-1 humana e de cino. Os acertos foram definidos como sinal maior que a média + 3 D.P. dos controles negativos.
[0518] Os anticorpos de camundongo selecionados foram clona- dos como mAbs quiméricos na IgG1 humana e testados quanto à sua capacidade de inibir a ativação da célula T específicas para antígeno no ensaio de recuperação de CMV de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 1 (ensaio CMV-PBMC). A Figura 1A e a Figura 1B mos- tram que a maioria dos anticorpos testados inibiram a proliferação de células T em um nível de cerca de 50% ou mais. PD1B199 é um mAb anti-PD1 antagonístico. CNTO3930: controle de isótipo. SEQ ID Nº: 1 PD-1 ECD
PGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLN WYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVV RARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPS
PRPAGQFQTLV SEQ ID Nº: 131 FL de PD-1 madura
PGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLN WYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVV RARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPS PRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTG QPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVF
PSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL Exemplo 3. Humanização de anticorpos anti-PD-1
[0519] Vários anticorpos parentais incluindo PD1B505, PD1B506 e PD1B512 foram humanizados. Para encontrar a melhor combinação de VH e VL humanizadas, uma ou mais sequências de linhagem ger- minativa humana da região V pesada e leve humana foram seleciona- das para cada um dos anticorpos. Segmentos J humanos para VL e VH de cada anticorpo parental foram escolhidos pela comparação da sequência de segmento J parental com as sequências de segmento J humano para maximizar a identidade de sequência. Todos os pares de VH/VL humanizados foram feitos e testados em matriz como sobrena- dantes brutos para a ligação do antígeno e a expressão de proteína. Com base nesses dados, os anticorpos que demonstram ligação de PD-1 comparável ou aprimorada à do anticorpo de camundongo pa-
rental foram purificados e testados quanto à sua eficácia no ensaio de CMV-PBMC.
[0520] Os anticorpos gerados foram analisados quanto a possíveis riscos de modificação pós-traducional indesejados. Motivos de desa- midação de alto risco localizados nas CDRs e cisteínas livres em qual- quer lugar no anticorpo foram removidos por mutagênese e os anticor- pos resultantes testados quanto à sua ligação a PD-1 e eficácia no en- saio CMV-PBMC.
[0521] Os anticorpos humanizados e suas variantes foram clona- dos como IgG1.
[0522] A Tabela 3 mostra os anticorpos gerados. A Tabela 4 mos- tra as SEQ ID Nºs: das sequências de aminoácidos da VH, da VL, da HC e da LC dos anticorpos. A Tabela 5 mostra as SEQ ID Nºs: das se- quências de polinucleotídeos que codificam a VH, a VL, a HC e a LC dos anticorpos. A Tabela 6 mostra as SEQ ID Nºs: das sequências de aminoácidos da HCDR1, da HCDR2, da HCDR3, da LCDR1, da LCDR2 e da LCDR3 dos anticorpos. A Tabela 7 mostra as sequências de aminoácidos de HCDR1 e de HCDR3 dos anticorpos. A Tabela 8 mostra as sequências de aminoácidos da LCDR1 e da LCDR3 dos an- ticorpos. A Tabela 9 mostra as sequências de aminoácidos da aVH e da VL dos anticorpos. A Tabela 10 mostra as sequências de polinu- cleotídeos que codificam a VH dos anticorpos. A Tabela 11 mostra as sequências de polinucleotídeo que codificam a VL dos anticorpos. A Tabela 12 mostra as sequências de aminoácidos da HC. A Tabela 13 mostra as sequências de aminoácidos da LC. A Tabela 14 mostra as sequências de polinucleotídeo que codificam a HC dos anticorpos. A Tabela 15 mostra as sequências de polinucleotídeo que codificas a LC dos anticorpos.
Tabela 3. mAb Origem do anticorpo Nome de VH Nome de VL PD1B505 Parental PD1H93 PD1L30 PD1B742 PD1B505 humanizado PD1H384 PD1L468 PD1B743 PD1B505 humanizado PD1H384 PD1L469 PD1B878 Variante C84S de PD1B743 PD1H405 PD1L469 PD1B506 Parental PD1H90 PD1L28 PD1B750 PD1B506 humanizado PD1H388 PD1L470 PD1B751 PD1B506 humanizado PD1H388 PD1L471 PD1B845 Variante G56A de PD1B750 PD1H399 PD1L470 PD1B846 Variante N55D, G56A de PD1B750 PD1H400 PD1L470 PD1B847 Variante N55Q de PD1B750 PD1H401 PD1L470 PD1B848 Variante N55K de PD1B750 PD1H402 PD1L470 PD1B849 Variante N55E de PD1B750 PD1H403 PD1L470 PD1B850 Variante G56I de PD1B750 PD1H404 PD1L470 PD1B512 Parental PD1H81 PD1L43 PD1B756 PD1B512 humanizado PD1H389 PD1L472 PD1B757 PD1B512 humanizado PD1H389 PD1L473 Tabela 4.
A sequência de aminoácidos SEQ ID Nºs: mAb Nome de VH Nome de VL
VH VL HC LC PD1B505 PD1H93 PD1L30 8 14 20 26 PD1B742 PD1H384 PD1L468 9 15 21 27 PD1B743 PD1H384 PD1L469 9 16 21 28 PD1B878 PD1H405 PD1L469 10 16 22 28 PD1B506 PD1H90 PD1L28 44 60 66 82 PD1B750 PD1H388 PD1L470 45 61 67 83 PD1B751 PD1H388 PD1L471 45 62 67 84 PD1B845 PD1H399 PD1L470 46 61 68 83 PD1B846 PD1H400 PD1L470 47 61 69 83 PD1B847 PD1H401 PD1L470 48 61 70 83 PD1B848 PD1H402 PD1L470 49 61 71 83 PD1B849 PD1H403 PD1L470 50 61 72 83 PD1B850 PD1H404 PD1L470 51 61 73 83 PD1B512 PD1H81 PD1L43 94 98 104 108 PD1B756 PD1H389 PD1L472 95 99 105 109 PD1B757 PD1H389 PD1L473 95 100 105 110
Tabela 5.
Sequência de polinucleotídeos SEQ ID Nºs: mAb Nome de VH Nome de VL
VH VL HC LC PD1B505 PD1H93 PD1L30 11 17 23 29 PD1B742 PD1H384 PD1L468 12 18 24 30 PD1B743 PD1H384 PD1L469 12 19 24 31 PD1B878 PD1H405 PD1L469 13 19 25 31 PD1B506 PD1H90 PD1L28 52 63 74 85 PD1B750 PD1H388 PD1L470 53 64 75 86 PD1B751 PD1H388 PD1L471 53 65 75 87 PD1B845 PD1H399 PD1L470 54 64 76 86 PD1B846 PD1H400 PD1L470 55 64 77 86 PD1B847 PD1H401 PD1L470 56 64 78 86 PD1B848 PD1H402 PD1L470 57 64 79 86 PD1B849 PD1H403 PD1L470 58 64 80 86 PD1B850 PD1H404 PD1L470 59 64 81 86 PD1B512 PD1H81 PD1L43 96 101 106 111 PD1B756 PD1H389 PD1L472 97 102 107 112 PD1B757 PD1H389 PD1L473 97 103 107 113 Tabela 6. Anticorpo HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 PD1B505 2 3 4 5 6 7 PD1B742 2 3 4 5 6 7 PD1B743 2 3 4 5 6 7 PD1B878 2 3 4 5 6 7 PD1B506 32 33 40 41 42 43 PD1B750 32 33 40 41 42 43 PD1B751 32 33 40 41 42 43 PD1B845 32 34 40 41 42 43 PD1B846 32 35 40 41 42 43 PD1B847 32 36 40 41 42 43 PD1B848 32 37 40 41 42 43 PD1B849 32 38 40 41 42 43 PD1B850 32 39 40 41 42 43 PD1B512 88 89 90 91 92 93 PD1B756 88 89 90 91 92 93 PD1B757 88 89 90 91 92 93
Tabela 7. HCDR1 HCDR2 HCDR3 Anticorpo (SEQ ID Nº:) (SEQ ID Nº:) (SEQ ID Nº:) PD1B505 GYTFTDYSMH WINIETGEPT DYYGTYFYAMDY (SEQ ID Nº: 2) (SEQ ID Nº: 3) (SEQ ID Nº: 4) PD1B742 GYTFTDYSMH WINIETGEPT DYYGTYFYAMDY (SEQ ID Nº: 2) (SEQ ID Nº: 3) (SEQ ID Nº: 4) PD1B743 GYTFTDYSMH WINIETGEPT DYYGTYFYAMDY (SEQ ID Nº: 2) (SEQ ID Nº: 3) (SEQ ID Nº: 4) PD1B878 GYTFTDYSMH WINIETGEPT DYYGTYFYAMDY (SEQ ID Nº: 2) (SEQ ID Nº: 3) (SEQ ID Nº: 4) PD1B506 GYTFTTYWMH EINPNNGGIN DYYDYGGY (SEQ ID Nº: 32) (SEQ ID Nº: 33) (SEQ ID Nº: 40) PD1B750 GYTFTTYWMH EINPNNGGIN DYYDYGGY (SEQ ID Nº: 32) (SEQ ID Nº: 33) (SEQ ID Nº: 40) PD1B751 GYTFTTYWMH EINPNNGGIN DYYDYGGY (SEQ ID Nº: 32) (SEQ ID Nº: 33) (SEQ ID Nº: 40) PD1B845 GYTFTTYWMH EINPNNAGIN DYYDYGGY (SEQ ID Nº: 32) (SEQ ID Nº: 34 (SEQ ID Nº: 40) PD1B846 GYTFTTYWMH EINPNDAGIN DYYDYGGY (SEQ ID Nº: 32) (SEQ ID Nº: 35 (SEQ ID Nº: 40) PD1B847 GYTFTTYWMH EINPNQGGIN DYYDYGGY (SEQ ID Nº: 32) (SEQ ID Nº: 36 (SEQ ID Nº: 40) PD1B848 GYTFTTYWMH EINPNKGGIN DYYDYGGY (SEQ ID Nº: 32) (SEQ ID Nº: 37 (SEQ ID Nº: 40) PD1B849 GYTFTTYWMH EINPNEGGIN DYYDYGGY (SEQ ID Nº: 32) (SEQ ID Nº: 38) (SEQ ID Nº: 40) PD1B850 GYTFTTYWMH EINPNNIGIN DYYDYGGY (SEQ ID Nº: 32) (SEQ ID Nº: 39) (SEQ ID Nº: 40) PD1B512 GFSLSTSGMGVS HIYWDDDKR KGYYDYGYVMDY (SEQ ID Nº: 88) (SEQ ID Nº: 89) (SEQ ID Nº: 90) PD1B756 GFSLSTSGMGVS HIYWDDDKR KGYYDYGYVMDY (SEQ ID Nº: 88) (SEQ ID Nº: 89) (SEQ ID Nº: 90) PD1B757 GFSLSTSGMGVS HIYWDDDKR KGYYDYGYVMDY (SEQ ID Nº: 88) (SEQ ID Nº: 89) (SEQ ID Nº: 90)
Tabela 8. Anticorpo LCDR1 (SEQ ID Nº:) LCDR2 (SEQ ID Nº:) LCDR3 (SEQ ID Nº:) PD1B505 TASSSVSSSYLH STSNLAS HQYHRSPLT (SEQ ID Nº: 5) (SEQ ID Nº: 6) (SEQ ID Nº: 7) PD1B742 TASSSVSSSYLH STSNLAS HQYHRSPLT (SEQ ID Nº: 5) (SEQ ID Nº: 6) (SEQ ID Nº: 7) PD1B743 TASSSVSSSYLH STSNLAS HQYHRSPLT (SEQ ID Nº: 5) (SEQ ID Nº: 6) (SEQ ID Nº: 7) PD1B878 TASSSVSSSYLH STSNLAS HQYHRSPLT (SEQ ID Nº: 5) (SEQ ID Nº: 6) (SEQ ID Nº: 7) PD1B506 KASQNVGTNVA SASYRYS QQYNIYPYT (SEQ ID Nº: 41) (SEQ ID Nº: 42) (SEQ ID Nº: 43) PD1B750 KASQNVGTNVA SASYRYS QQYNIYPYT (SEQ ID Nº: 41) (SEQ ID Nº: 42) (SEQ ID Nº: 43) PD1B751 KASQNVGTNVA SASYRYS QQYNIYPYT (SEQ ID Nº: 41) (SEQ ID Nº: 42) (SEQ ID Nº: 43) PD1B845 KASQNVGTNVA SASYRYS QQYNIYPYT (SEQ ID Nº: 41) (SEQ ID Nº: 42) (SEQ ID Nº: 43) PD1B846 KASQNVGTNVA SASYRYS QQYNIYPYT (SEQ ID Nº: 41) (SEQ ID Nº: 42) (SEQ ID Nº: 43) PD1B847 KASQNVGTNVA SASYRYS QQYNIYPYT (SEQ ID Nº: 41) (SEQ ID Nº: 42) (SEQ ID Nº: 43) PD1B848 KASQNVGTNVA SASYRYS QQYNIYPYT (SEQ ID Nº: 41) (SEQ ID Nº: 42) (SEQ ID Nº: 43) PD1B849 KASQNVGTNVA SASYRYS QQYNIYPYT (SEQ ID Nº: 41) (SEQ ID Nº: 42) (SEQ ID Nº: 43) PD1B850 KASQNVGTNVA SASYRYS QQYNIYPYT (SEQ ID Nº: 41) (SEQ ID Nº: 42) (SEQ ID Nº: 43) PD1B512 RSSKSLLHSNGITYLN QMSNLAS AQNLELPLT (SEQ ID Nº: 91) (SEQ ID Nº: 92) (SEQ ID Nº: 93) PD1B756 RSSKSLLHSNGITYLN QMSNLAS AQNLELPLT (SEQ ID Nº: 91) (SEQ ID Nº: 92) (SEQ ID Nº: 93) PD1B757 RSSKSLLHSNGITYLN QMSNLAS AQNLELPLT (SEQ ID Nº: 91) (SEQ ID Nº: 92) (SEQ ID Nº: 93)
Tabela 9. Nome da cadeia VH ou Sequência de aminoácido VL (SEQ ID NO) PD1H93 DVQLQESGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSMHWVKQAPGKGLKW
MGWINIETGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFC (SEQ ID Nº: 8)
ARDYYGTYFYAMDYWGQGTTLTVSS PD1H384 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMHWVRQAPGQGLE
WMGWINIETGEPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQICSLKAEDTAVYF (SEQ ID Nº: 9)
CARDYYGTYFYAMDYWGQGTLVTVSS PD1H405 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMHWVRQAPGQGLE
WMGWINIETGEPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYF (SEQ ID Nº: 10)
CARDYYGTYFYAMDYWGQGTLVTVSS PD1H90 QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTTYWMHWVKQRPGQGLE
WIGEINPNNGGINYNEKFKKKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYY (SEQ ID Nº: 44)
CTIDYYDYGGYWGQGTTLTVSS PD1H388 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLE
WMGEINPNNGGINYAQKFQGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVY (SEQ ID Nº: 45)
YCTIDYYDYGGYWGQGTLVTVSS PD1H399 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLE
WMGEINPNNAGINYAQKFQGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYY (SEQ ID Nº: 46)
CTIDYYDYGGYWGQGTLVTVSS PD1H400 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLE
WMGEINPNDAGINYAQKFQGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYY (SEQ ID Nº: 47)
CTIDYYDYGGYWGQGTLVTVSS PD1H401 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLE
WMGEINPNQGGINYAQKFQGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVY (SEQ ID Nº: 48)
YCTIDYYDYGGYWGQGTLVTVSS PD1H402 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLE
WMGEINPNKGGINYAQKFQGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVY (SEQ ID Nº: 49)
YCTIDYYDYGGYWGQGTLVTVSS PD1H403 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLE
WMGEINPNEGGINYAQKFQGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVY (SEQ ID Nº: 50)
YCTIDYYDYGGYWGQGTLVTVSS PD1H404 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLE
WMGEINPNNIGINYAQKFQGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYY (SEQ ID Nº: 51)
CTIDYYDYGGYWGQGTLVTVSS
PD1H81 QVTLKESGPGLLQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLE
WLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITSVDTADTGTYYC (SEQ ID Nº: 94)
VRKGYYDYGYVMDYWGQGTTVTVSS PD1H389 QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEW
LAHIYWDDDKRYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTGTYYCV (SEQ ID Nº: 95)
RKGYYDYGYVMDYWGQGTLVTVSS PD1L30 QIVLTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWI
YSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQYHRSPL (SEQ ID Nº: 14)
TFGAGTKLELK PD1L468 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCTASSSVSSSYLHWYQQKPGLAPRLLIY
STSNLASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYHRSPLTF (SEQ ID Nº: 15)
GQGTKLEIK PD1L469 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCTASSSVSSSYLHWYQQKPGLAPRLLIY
STSNLASGIPDRFSGSGSGTDYTLTISRLEPEDFAVYYCHQYHRSPLTF (SEQ ID Nº: 16)
GQGTKLEIK PD1L28 DIVMTQSQKFMSTSVRDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKAL
IYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLAEYFCQQYNIYPY (SEQ ID Nº: 60)
TFGSGTKLEMK PD1L470 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTNVAWYQQKPEKAPKSLIY
SASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNIYPYTF (SEQ ID Nº: 61)
GQGTKLEIK PD1L471 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTNVAWYQQKPEKAPKALIY
SASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYNIYPYTF (SEQ ID Nº: 62)
GQGTKLEIK PD1L43 DIVMTQAALSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLNWYLQKPGQSP
QLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLE (SEQ ID Nº: 98)
LPLTFGSGTKLEMK PD1L472 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLNWYLQKPGQSP
QLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLE (SEQ ID Nº: 99)
LPLTFGGGTKVEIK PD1L473 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLNWYLQKPGQSP
QLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLE (SEQ ID Nº: 100)
LPLTFGGGTKVEIK
Tabela 10. Cadeia de VH (SEQ Sequência de polinucleotídeos ID Nº: de polinucleotí- deo) PD1H93 GATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGAGCTGAAGAAGCC (SEQ ID Nº: 11) TGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTATAC
CTTCACAGACTATTCAATGCACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGG AAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACATTGAGACTGG TGAGCCAACATATGCAGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTT CTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAA CAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGCTAG AGATTACTACGGTACTTACTTCTATGCTATGGACTACTGGGGT
CAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA PD1H384 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAAGCGAACTGAAGAAACC (SEQ ID Nº: 12) TGGAGCCTCTGTGAAAGTGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACA
CCTTCACCGACTACAGCATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCT GGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCTGGATCAACATCGAGAC CGGCGAGCCCACCTACGCCCAGGGCTTTACCGGACGGTTCG TGTTCAGCCTGGATACATCTGTGTCTACAGCCTATCTGCAGA TCTGCTCTCTGAAGGCCGAAGATACAGCCGTGTACTTCTGCG CCCGGGACTACTACGGCACCTACTTCTACGCCATGGACTACT
GGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCT PD1H405 CAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCAGCGAGCTGAAAAAACC (SEQ ID Nº: 13) TGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTAGCGGCTACA
CCTTTACCGACTACAGCATGCACTGGGTCCGACAGGCTCCA GGACAAGGCTTGGAATGGATGGGCTGGATCAACATCGAGAC AGGCGAGCCCACATACGCCCAGGGCTTTACCGGCAGATTCG TGTTCAGCCTGGACACCTCTGTGTCCACCGCCTACCTGCAGA TCAGCTCTCTGAAGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTTCTGC GCCAGAGACTACTACGGCACCTACTTCTACGCCATGGATTAC
TGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACCGTTTCTTCT PD1H90 CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAACTTGTGAAGCC (SEQ ID Nº: 52) TGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAC
CTTCACCACCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTG GACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCTAACAATG GTGGTATTAATTACAATGAGAAGTTCAAGAAGAAGGCCACAC TGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCA GCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAA TAGACTACTATGATTACGGGGGCTACTGGGGCCAAGGCACC ACTCTCACAGTCTCCTCA
PD1H388 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCCGAAGTGAAGAAACC (SEQ ID Nº: 53) TGGAGCCTCTGTGAAAGTGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACA
CCTTCACCACCTACTGGATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCT GGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCGAGATCAACCCCAACAA CGGCGGCATCAACTACGCCCAGAAATTTCAGGGACGGGTGA CCCTGACAGTGGATAAGAGCATCTCTACAGCCTACATGGAAC TGTCTCGGCTGCGGAGCGATGACACAGCCGTGTACTACTGC ACCATCGACTACTACGACTACGGCGGCTACTGGGGCCAGGG
AACACTGGTGACAGTGTCTTCT PD1H399 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCCGAAGTGAAGAAACC (SEQ ID Nº: 54) TGGAGCCTCTGTGAAAGTGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACA
CCTTCACCACCTACTGGATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCT GGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCGAGATCAACCCCAACAA CGCCGGCATCAACTACGCCCAGAAATTTCAGGGACGGGTGA CCCTGACAGTGGATAAGAGCATCTCTACAGCCTACATGGAAC TGTCTCGGCTGCGGAGCGATGACACAGCCGTGTACTACTGC ACCATCGACTACTACGACTACGGCGGCTACTGGGGCCAGGG
AACACTGGTGACAGTGTCTTCT PD1H400 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCCGAAGTGAAGAAACC (SEQ ID Nº: 55) TGGAGCCTCTGTGAAAGTGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACA
CCTTCACCACCTACTGGATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCT GGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCGAGATCAACCCCAACGA CGCCGGCATCAACTACGCCCAGAAATTTCAGGGACGGGTGA CCCTGACAGTGGATAAGAGCATCTCTACAGCCTACATGGAAC TGTCTCGGCTGCGGAGCGATGACACAGCCGTGTACTACTGC ACCATCGACTACTACGACTACGGCGGCTACTGGGGCCAGGG
AACACTGGTGACAGTGTCTTCT PD1H401 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCCGAAGTGAAGAAACC (SEQ ID Nº: 56) TGGAGCCTCTGTGAAAGTGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACA
CCTTCACCACCTACTGGATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCT GGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCGAGATCAACCCCAACCA GGGCGGCATCAACTACGCCCAGAAATTTCAGGGACGGGTGA CCCTGACAGTGGATAAGAGCATCTCTACAGCCTACATGGAAC TGTCTCGGCTGCGGAGCGATGACACAGCCGTGTACTACTGC ACCATCGACTACTACGACTACGGCGGCTACTGGGGCCAGGG
AACACTGGTGACAGTGTCTTCT PD1H402 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCCGAAGTGAAGAAACC (SEQ ID Nº: 57) TGGAGCCTCTGTGAAAGTGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACA
CCTTCACCACCTACTGGATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCT GGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCGAGATCAACCCCAACAA GGGCGGCATCAACTACGCCCAGAAATTTCAGGGACGGGTGA CCCTGACAGTGGATAAGAGCATCTCTACAGCCTACATGGAAC TGTCTCGGCTGCGGAGCGATGACACAGCCGTGTACTACTGC ACCATCGACTACTACGACTACGGCGGCTACTGGGGCCAGGG
AACACTGGTGACAGTGTCTTCT PD1H403 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCCGAAGTGAAGAAACC (SEQ ID Nº: 58) TGGAGCCTCTGTGAAAGTGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACA
CCTTCACCACCTACTGGATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCT GGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCGAGATCAACCCCAACGA GGGCGGCATCAACTACGCCCAGAAATTTCAGGGACGGGTGA CCCTGACAGTGGATAAGAGCATCTCTACAGCCTACATGGAAC TGTCTCGGCTGCGGAGCGATGACACAGCCGTGTACTACTGC ACCATCGACTACTACGACTACGGCGGCTACTGGGGCCAGGG
AACACTGGTGACAGTGTCTTCT PD1H404 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCCGAAGTGAAGAAACC (SEQ ID Nº: 59) TGGAGCCTCTGTGAAAGTGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACA
CCTTCACCACCTACTGGATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCT GGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCGAGATCAACCCCAACAA CATCGGCATCAACTACGCCCAGAAATTTCAGGGACGGGTGA CCCTGACAGTGGATAAGAGCATCTCTACAGCCTACATGGAAC TGTCTCGGCTGCGGAGCGATGACACAGCCGTGTACTACTGC ACCATCGACTACTACGACTACGGCGGCTACTGGGGCCAGGG
AACACTGGTGACAGTGTCTTCT PD1H81 CAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGTTATTGCAGCCC (SEQ ID Nº: 96) TCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCAC
TGAGCACTTCTGGTATGGGTGTGAGCTGGATTCGTCAGCCTT CAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGAT GATGACAAGCGCTATAACCCATCCCTGAAGAGCCGGCTCAC AATCTCCAAAGATACCTCCAGCAACCAGGTATTCCTCAAGAT CACCAGTGTGGACACTGCAGATACTGGCACATACTACTGTGT TCGAAAGGGCTACTATGATTACGGCTATGTAATGGACTACTG
GGGTCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA PD1H389 CAGATCACACTGAAAGAATCTGGACCTACACTGGTGAAACCT (SEQ ID Nº: 97) ACACAGACCCTGACACTGACCTGTACCTTCAGCGGCTTCAGC
CTGAGCACCAGCGGCATGGGCGTGAGCTGGATTCGGCAGC CTCCTGGAAAGGCCCTGGAATGGCTGGCCCACATCTACTGG GACGACGACAAGCGGTACAGCCCTAGCCTGAAGTCTCGGCT GACAATCACCAAGGATACCTCTAAGAACCAGGTGGTGCTGAC AATGACCAACATGGACCCTGTGGACACAGGCACCTACTACTG CGTGCGGAAGGGCTACTACGACTACGGCTACGTGATGGACT ACTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCT
Tabela 11. Nome da VL (SEQ ID cDNA de VL Nº: de polinucleotídeo) PD1L30 CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTC (SEQ ID Nº: 17) TAGGGGAACGGGTCACCATGACCTGCACTGCCAGCTCAAGT
GTAAGTTCCAGTTACTTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGA TCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAACCTGGCT TCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGAC CTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGC TGCCACTTATTACTGCCACCAGTATCATCGTTCCCCGCTCAC
GTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA PD1L468 GAGATCGTGCTGACACAGTCTCCTGCCACACTGTCTCTGTCT (SEQ ID Nº: 18) CCTGGAGAACGGGCCACACTGAGCTGCACCGCCAGCAGCA
GCGTGAGCAGCAGCTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAACCT GGACTGGCCCCTCGGCTGCTGATCTACAGCACCAGCAACCT GGCCAGCGGCATCCCTGATCGGTTTTCTGGCAGCGGATCTG GCACAGATTTTACACTGACCATCAGCCGGCTGGAACCTGAG GATTTTGCCGTGTACTACTGCCACCAGTACCACCGGAGCCCC
CTGACCTTCGGCCAGGGAACAAAGCTGGAAATCAAG PD1L469 GAGATCGTGCTGACACAGTCTCCTGCCACACTGTCTCTGTCT (SEQ ID Nº: 19) CCTGGAGAACGGGCCACACTGAGCTGCACCGCCAGCAGCA
GCGTGAGCAGCAGCTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAACCT GGACTGGCCCCTCGGCTGCTGATCTACAGCACCAGCAACCT GGCCAGCGGCATCCCTGATCGGTTTTCTGGCAGCGGATCTG GCACAGATTACACACTGACCATCAGCCGGCTGGAACCTGAG GATTTTGCCGTGTACTACTGCCACCAGTACCACCGGAGCCCC
CTGACCTTCGGCCAGGGAACAAAGCTGGAAATCAAG PD1L28 GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCA (SEQ ID Nº: 63) GTAAGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAA
TGTGGGCACTAATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCA ATCTCCTAAAGCACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACAG TGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAG ATTTCACTCTCACCATCACCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGG CAGAATATTTCTGTCAGCAATATAACATCTATCCGTACACGTT
CGGATCGGGGACCAAGCTGGAAATGAAA PD1L470 GACATCCAGATGACACAGTCTCCTAGCTCTCTGAGCGCCTCT (SEQ ID Nº: 64) GTGGGAGATCGGGTGACAATCACCTGCAAGGCCAGCCAGAA
CGTGGGCACCAACGTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGAAA AAGCCCCTAAGAGCCTGATCTACAGCGCCAGCTACCGGTAC AGCGGCGTGCCTTCTCGGTTTAGCGGCTCTGGAAGCGGAAC AGATTTCACACTGACCATCTCTAGCCTGCAGCCTGAAGATTTT GCCACATACTACTGCCAGCAGTACAACATCTACCCCTACACC
TTCGGCCAGGGAACAAAGCTGGAAATCAAG PD1L471 GACATCCAGATGACACAGTCTCCTAGCTCTCTGAGCGCCTCT (SEQ ID Nº: 65) GTGGGAGATCGGGTGACAATCACCTGCAAGGCCAGCCAGAA
CGTGGGCACCAACGTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGAAA AAGCCCCTAAGGCCCTGATCTACAGCGCCAGCTACCGGTAC AGCGGCGTGCCTTCTCGGTTTAGCGGCTCTGGAAGCGGAAC AGATTTCACACTGACCATCTCTAGCCTGCAGCCTGAAGATTTT GCCACATACTTTTGCCAGCAGTACAACATCTACCCCTACACC
TTCGGCCAGGGAACAAAGCTGGAAATCAAG PD1L43 GATATTGTGATGACTCAGGCTGCACTCTCCAATCCAGTCACT (SEQ ID Nº: 101) CTTGGAACATCAGCTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGT
CTCCTACATAGTAATGGCATCACTTATTTGAATTGGTATCTGC AGAAGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTATCAGATGT CCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTAGCAGT GGGTCAGGAACTGATTTCACACTGAGAATCAGCAGAGTGGA GGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTGCTCAAAATCTAGA ACTTCCGCTCACGTTCGGATCGGGGACCAAGCTGGAAATGA
AA PD1L472 GACATCGTGATGACACAGTCTCCTCTGTCTCTGCCTGTGACA (SEQ ID Nº: 102) CCTGGCGAACCTGCCTCTATCAGCTGCCGGAGCAGCAAGAG
CCTGCTGCACAGCAACGGCATCACCTACCTGAACTGGTACCT GCAGAAACCTGGACAGTCTCCTCAGCTGCTGATCTACCAGAT GAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCTGATCGGTTTAGCGGCT CTGGAAGCGGCACAGACTTCACACTGAAGATCTCTCGGGTG GAAGCCGAGGACGTGGGAGTGTACTACTGCGCCCAGAACCT GGAGCTGCCCCTGACCTTCGGAGGCGGAACAAAGGTGGAGA
TCAAG PD1L473 GACATCGTGATGACACAGTCTCCTCTGTCTCTGCCTGTGACA (SEQ ID Nº: 103) CCTGGCGAACCTGCCTCTATCAGCTGCCGGAGCAGCAAGAG
CCTGCTGCACAGCAACGGCATCACCTACCTGAACTGGTACCT GCAGAAACCTGGACAGTCTCCTCAGCTGCTGATCTACCAGAT GAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCTGATCGGTTTAGCAGCT CTGGAAGCGGCACAGACTTCACACTGAAGATCTCTCGGGTG GAAGCCGAGGACGTGGGAGTGTACTACTGCGCCCAGAACCT GGAGCTGCCCCTGACCTTCGGAGGCGGAACAAAGGTGGAGA TCAAG
Tabela 12.
mAb HC HC de PD1B505 DVQLQESGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSMHWVKQA
PGKGLKWMGWINIETGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYL (SEQ ID Nº: 20)
QINNLKNEDTATYFCARDYYGTYFYAMDYWGQGTTLTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT
QKSLSLSPGK PD1B742, HC de QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMHWVRQ PD1B743 APGQGLEWMGWINIETGEPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTA
YLQICSLKAEDTAVYFCARDYYGTYFYAMDYWGQGTLVTV (SEQ ID Nº: 21)
SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT
QKSLSLSPGK HC de PD1B878 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMHWVRQ
APGQGLEWMGWINIETGEPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTA (SEQ ID Nº: 22)
YLQISSLKAEDTAVYFCARDYYGTYFYAMDYWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT
QKSLSLSPGK HC de PD1B506 QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTTYWMHWVKQ
RPGQGLEWIGEINPNNGGINYNEKFKKKATLTVDKSSSTAY (SEQ ID Nº: 66)
MQLSSLTSEDSAVYYCTIDYYDYGGYWGQGTTLTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS
LSPGK PD1B750, HC de QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQ PD1B751 APGQGLEWMGEINPNNGGINYAQKFQGRVTLTVDKSISTA
YMELSRLRSDDTAVYYCTIDYYDYGGYWGQGTLVTVSSAS (SEQ ID Nº: 67)
TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGK
HC de PD1B845 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQ
APGQGLEWMGEINPNNAGINYAQKFQGRVTLTVDKSISTA (SEQ ID Nº: 68)
YMELSRLRSDDTAVYYCTIDYYDYGGYWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS
LSLSPGK HC de PD1B846 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQ
APGQGLEWMGEINPNDAGINYAQKFQGRVTLTVDKSISTA (SEQ ID Nº: 69)
YMELSRLRSDDTAVYYCTIDYYDYGGYWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS
LSLSPGK HC de PD1B847 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQ
APGQGLEWMGEINPNQGGINYAQKFQGRVTLTVDKSISTA (SEQ ID Nº: 70)
YMELSRLRSDDTAVYYCTIDYYDYGGYWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS
LSLSPGK HC de PD1B848 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQ
APGQGLEWMGEINPNKGGINYAQKFQGRVTLTVDKSISTA (SEQ ID Nº: 71)
YMELSRLRSDDTAVYYCTIDYYDYGGYWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS
LSLSPGK HC de PD1B849 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQ
APGQGLEWMGEINPNEGGINYAQKFQGRVTLTVDKSISTA (SEQ ID Nº: 72)
YMELSRLRSDDTAVYYCTIDYYDYGGYWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS
LSLSPGK HC de PD1B850 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQ
APGQGLEWMGEINPNNIGINYAQKFQGRVTLTVDKSISTAY (SEQ ID Nº: 73)
MELSRLRSDDTAVYYCTIDYYDYGGYWGQGTLVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS
LSPGK HC de PD1B512 QVTLKESGPGLLQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIR (SEQ ID Nº: 104) QPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSSNQV
FLKITSVDTADTGTYYCVRKGYYDYGYVMDYWGQGTTVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT
QKSLSLSPGK PD1B756, HC de QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQ PD1B757 PPGKALEWLAHIYWDDDKRYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVL
TMTNMDPVDTGTYYCVRKGYYDYGYVMDYWGQGTLVTV (SEQ ID Nº: 105)
SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK
Tabela 13.
mAb LC (SEQ ID Nº:) LC de PD1B505 QIVLTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKP
GSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAE (SEQ ID Nº: 26)
DAATYYCHQYHRSPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS
SPVTKSFNRGEC LC de PD1B742 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCTASSSVSSSYLHWYQQKP
GLAPRLLIYSTSNLASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPED (SEQ ID Nº: 27)
FAVYYCHQYHRSPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS
PVTKSFNRGEC PD1B743, LC de EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCTASSSVSSSYLHWYQQKP PD1B878 GLAPRLLIYSTSNLASGIPDRFSGSGSGTDYTLTISRLEPED
FAVYYCHQYHRSPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDE (SEQ ID Nº: 28)
QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS
PVTKSFNRGEC LC de PD1B506 DIVMTQSQKFMSTSVRDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQK
PGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQS (SEQ ID Nº: 82)
EDLAEYFCQQYNIYPYTFGSGTKLEMKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL
SSPVTKSFNRGEC PD1B750, DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTNVAWYQQKP PD1B845, EKAPKSLIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE PD1B846, DFATYYCQQYNIYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDE PD1B847, QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES PD1B848, VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS
PD1B849, LC de PVTKSFNRGEC PD1B850 (SEQ ID Nº: 83) LC de PD1B751 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTNVAWYQQKP
EKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE (SEQ ID Nº: 84)
DFATYFCQQYNIYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS
PVTKSFNRGEC LC de PD1B512 DIVMTQAALSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLNWYL
QKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRV (SEQ ID Nº: 108)
EAEDVGVYYCAQNLELPLTFGSGTKLEMKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN SQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH
QGLSSPVTKSFNRGEC LC de PD1B756 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLNWYL
QKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRV (SEQ ID Nº: 109)
EAEDVGVYYCAQNLELPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ
GLSSPVTKSFNRGEC LC de PD1B757 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLNWYL
QKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLKISRV (SEQ ID Nº: 110)
EAEDVGVYYCAQNLELPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC
Tabela 14.
cDNA de HC (SEQ ID Nº:) HC de PD1B505 (SEQ ID Nº: 23)
GATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGA TCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTATACCTTCACAGACTATTCAATGCACTGGGTGAAGCAG GCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACATTGAGACTGGTGAGCCAA CATATGCAGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACT GCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGCTAGA GATTACTACGGTACTTACTTCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGCACCACTCTCACA GTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGA GCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACC GGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGC TGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCA GCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGT GGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAG CACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACC CTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAG ACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGAC AAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTC CTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCC TCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACA GGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACC TGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGC AGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTT CCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCA TGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTC
TCCGGGTAAA PD1B742, HC de PD1B743 (SEQ ID Nº: 24)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAAGCGAACTGAAGAAACCTGGAGCCTCTGTGAAAG TGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACAGCATGCACTGGGTGCGGCA GGCCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCTGGATCAACATCGAGACCGGCGAGCC CACCTACGCCCAGGGCTTTACCGGACGGTTCGTGTTCAGCCTGGATACATCTGTGTCTA CAGCCTATCTGCAGATCTGCTCTCTGAAGGCCGAAGATACAGCCGTGTACTTCTGCGCC CGGGACTACTACGGCACCTACTTCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGAACACTGG TGACAGTGTCTTCTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCC AAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCG AACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCC GGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCC AGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAA GGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCC CAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGA CACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAC GAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCA AGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCAC CGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAA GCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAAC CACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCT GACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAAT GGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCT TCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTT CTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCC
TGTCTCCGGGTAAA HC de PD1B878 (SEQ ID Nº: 25)
CAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCAGCGAGCTGAAAAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGG TGTCCTGCAAGGCTAGCGGCTACACCTTTACCGACTACAGCATGCACTGGGTCCGACAG GCTCCAGGACAAGGCTTGGAATGGATGGGCTGGATCAACATCGAGACAGGCGAGCCCA CATACGCCCAGGGCTTTACCGGCAGATTCGTGTTCAGCCTGGACACCTCTGTGTCCACC GCCTACCTGCAGATCAGCTCTCTGAAGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTTCTGCGCCA GAGACTACTACGGCACCTACTTCTACGCCATGGATTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTT ACCGTTTCTTCTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAA GAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAA CCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCG GCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCA GCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAA GGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCC CAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGA CACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAC GAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCA AGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCAC CGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAA GCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAAC CACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCT GACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAAT GGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCT TCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTT CTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCC
TGTCTCCGGGTAAA HC de PD1B506 (SEQ ID Nº: 74)
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAACTTGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGT TGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCACCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAG AGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCTAACAATGGTGGTATTAA TTACAATGAGAAGTTCAAGAAGAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAG CCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAATA GACTACTATGATTACGGGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGC CTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGG GGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGT CGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTC CTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACC CAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGT TGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCC TGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCC CGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGG AGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGA CTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCC ATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCC TGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAA AGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAA CAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCA AGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGAT
GCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA PD1B750, HC de PD1B751 (SEQ ID Nº: 75)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCCGAAGTGAAGAAACCTGGAGCCTCTGTGAAAG TGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCACCTACTGGATGCACTGGGTGCGGCA GGCCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCGAGATCAACCCCAACAACGGCGGCAT CAACTACGCCCAGAAATTTCAGGGACGGGTGACCCTGACAGTGGATAAGAGCATCTCTA CAGCCTACATGGAACTGTCTCGGCTGCGGAGCGATGACACAGCCGTGTACTACTGCAC CATCGACTACTACGACTACGGCGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCT TCTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCT CTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGA CGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCT ACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTG GGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACA AGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCT GAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCT GAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGC CGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCA CCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCA GCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGT ACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCT GGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG GAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTA CAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCC GTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG
GTAAA HC de PD1B845 (SEQ ID Nº: 76)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCCGAAGTGAAGAAACCTGGAGCCTCTGTGAAAG TGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCACCTACTGGATGCACTGGGTGCGGCA GGCCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCGAGATCAACCCCAACAACGCCGGCAT CAACTACGCCCAGAAATTTCAGGGACGGGTGACCCTGACAGTGGATAAGAGCATCTCTA CAGCCTACATGGAACTGTCTCGGCTGCGGAGCGATGACACAGCCGTGTACTACTGCAC CATCGACTACTACGACTACGGCGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCT TCTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCT CTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGA CGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCT ACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTG GGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACA AGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCT GAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCT GAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGC CGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCA CCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCA GCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGT ACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCT GGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG GAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTA CAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCC GTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG GTAAA
HC de PD1B846 (SEQ ID Nº: 77)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCCGAAGTGAAGAAACCTGGAGCCTCTGTGAAAG TGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCACCTACTGGATGCACTGGGTGCGGCA GGCCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCGAGATCAACCCCAACGACGCCGGCAT CAACTACGCCCAGAAATTTCAGGGACGGGTGACCCTGACAGTGGATAAGAGCATCTCTA CAGCCTACATGGAACTGTCTCGGCTGCGGAGCGATGACACAGCCGTGTACTACTGCAC CATCGACTACTACGACTACGGCGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCT TCTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCT CTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGA CGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCT ACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTG GGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACA AGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCT GAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCT GAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGC CGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCA CCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCA GCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGT ACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCT GGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG GAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTA CAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCC GTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG
GTAAA HC de PD1B847 (SEQ ID Nº: 78)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCCGAAGTGAAGAAACCTGGAGCCTCTGTGAAAG TGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCACCTACTGGATGCACTGGGTGCGGCA GGCCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCGAGATCAACCCCAACCAGGGCGGCAT CAACTACGCCCAGAAATTTCAGGGACGGGTGACCCTGACAGTGGATAAGAGCATCTCTA CAGCCTACATGGAACTGTCTCGGCTGCGGAGCGATGACACAGCCGTGTACTACTGCAC CATCGACTACTACGACTACGGCGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCT TCTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCT CTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGA CGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCT ACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTG GGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACA AGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCT GAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCT GAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGC CGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCA CCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCA GCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGT ACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCT GGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG GAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTA CAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCC GTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG
GTAAA HC de PD1B848 (SEQ ID Nº: 79)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCCGAAGTGAAGAAACCTGGAGCCTCTGTGAAAG TGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCACCTACTGGATGCACTGGGTGCGGCA GGCCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCGAGATCAACCCCAACAAGGGCGGCAT CAACTACGCCCAGAAATTTCAGGGACGGGTGACCCTGACAGTGGATAAGAGCATCTCTA CAGCCTACATGGAACTGTCTCGGCTGCGGAGCGATGACACAGCCGTGTACTACTGCAC CATCGACTACTACGACTACGGCGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCT TCTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCT CTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGA CGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCT ACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTG GGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACA AGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCT GAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCT GAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGC CGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCA CCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCA GCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGT ACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCT GGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG GAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTA CAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCC GTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG
GTAAA PD1B849 (SEQ ID Nº: 80)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCCGAAGTGAAGAAACCTGGAGCCTCTGTGAAAG TGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCACCTACTGGATGCACTGGGTGCGGCA GGCCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCGAGATCAACCCCAACGAGGGCGGCAT CAACTACGCCCAGAAATTTCAGGGACGGGTGACCCTGACAGTGGATAAGAGCATCTCTA CAGCCTACATGGAACTGTCTCGGCTGCGGAGCGATGACACAGCCGTGTACTACTGCAC CATCGACTACTACGACTACGGCGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCT TCTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCT CTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGA CGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCT ACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTG GGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACA AGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCT GAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCT GAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGC CGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCA CCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCA GCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGT ACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCT GGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG GAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTA CAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCC GTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG
GTAAA HC de PD1B850 (SEQ ID Nº: 81)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCCGAAGTGAAGAAACCTGGAGCCTCTGTGAAAG TGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCACCTACTGGATGCACTGGGTGCGGCA GGCCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCGAGATCAACCCCAACAACATCGGCATC AACTACGCCCAGAAATTTCAGGGACGGGTGACCCTGACAGTGGATAAGAGCATCTCTAC AGCCTACATGGAACTGTCTCGGCTGCGGAGCGATGACACAGCCGTGTACTACTGCACC ATCGACTACTACGACTACGGCGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTT CTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTC TGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGAC GGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTA CAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGG GCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAA GAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTG AACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATG ATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTG AGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCC GCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCAC CAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAG CCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTA CACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTG GTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGG AGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTAC AGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCG TGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
AAA HC de PD1B512 (SEQ ID Nº: 106)
CAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGTTATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCT GACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTATGGGTGTGAGCTGGATTCG TCAGCCTTCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGATGATGACAAG CGCTATAACCCATCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAAGATACCTCCAGCAACCA GGTATTCCTCAAGATCACCAGTGTGGACACTGCAGATACTGGCACATACTACTGTGTTC GAAAGGGCTACTATGATTACGGCTATGTAATGGACTACTGGGGTCAAGGGACCACGGTC ACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAA GAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAA CCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCG GCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCA GCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAA GGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCC CAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGA CACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAC GAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCA AGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCAC CGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAA GCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAAC CACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCT GACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAAT GGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCT TCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTT CTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCC
TGTCTCCGGGTAAA PD1B756, HC de PD1B757 (SEQ ID Nº: 107)
CAGATCACACTGAAAGAATCTGGACCTACACTGGTGAAACCTACACAGACCCTGACACT GACCTGTACCTTCAGCGGCTTCAGCCTGAGCACCAGCGGCATGGGCGTGAGCTGGATT CGGCAGCCTCCTGGAAAGGCCCTGGAATGGCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACA AGCGGTACAGCCCTAGCCTGAAGTCTCGGCTGACAATCACCAAGGATACCTCTAAGAAC CAGGTGGTGCTGACAATGACCAACATGGACCCTGTGGACACAGGCACCTACTACTGCG TGCGGAAGGGCTACTACGACTACGGCTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGAACACT GGTGACAGTGTCTTCTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCT CCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCC CGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTC CCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCT CCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACAC CAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGT GCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAA GGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATG CCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCT CACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAAC AAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAG AACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAG CCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGC AATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCT CCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGT CTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCT
CCCTGTCTCCGGGTAAA Tabela 15.
cDNA de LC (SEQ ID Nº:) LC de PD1B505 (SEQ ID Nº: 29)
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAACGG GTCACCATGACCTGCACTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCCAGTTACTTGCACTGG TACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAAC CTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTA CTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCA CCAGTATCATCGTTCCCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGA AACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGT TGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAG AGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAG GAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCA CCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAA GTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGA
GTGT LC de PD1B742 (SEQ ID Nº: 30)
GAGATCGTGCTGACACAGTCTCCTGCCACACTGTCTCTGTCTCCTGGAGAACG GGCCACACTGAGCTGCACCGCCAGCAGCAGCGTGAGCAGCAGCTACCTGCAC TGGTACCAGCAGAAACCTGGACTGGCCCCTCGGCTGCTGATCTACAGCACCAG CAACCTGGCCAGCGGCATCCCTGATCGGTTTTCTGGCAGCGGATCTGGCACAG ATTTTACACTGACCATCAGCCGGCTGGAACCTGAGGATTTTGCCGTGTACTACT GCCACCAGTACCACCGGAGCCCCCTGACCTTCGGCCAGGGAACAAAGCTGGA AATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGA GCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCC CAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACT CCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAG CAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCT GCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGG
GGAGAGTGT PD1B743, LC de PD1B878 (SEQ ID Nº: 31)
GAGATCGTGCTGACACAGTCTCCCGCCACACTGTCACTGTCTCCAGGCGAAAG AGCCACACTGAGCTGTACCGCCAGCAGCTCTGTGTCCAGCAGCTACCTGCACT GGTATCAGCAGAAGCCTGGACTGGCCCCTCGGCTGCTGATCTACAGCACAAGC AATCTGGCCAGCGGCATCCCCGATAGATTTTCCGGCTCTGGAAGCGGCACCGA CTACACCCTGACAATCAGCAGACTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACT GCCACCAGTACCACAGAAGCCCTCTGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAA ATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAG CAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCC AGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTC CCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGC AGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTG CGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGG
GAGAGTGT LC de PD1B506 (SEQ ID Nº: 85)
GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAAGAGACAGG GTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGCACTAATGTAGCCTGGTA TCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAAGCACTGATTTACTCGGCATCCTACCG GTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCA CTCTCACCATCACCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAATATTTCTGTCAGC AATATAACATCTATCCGTACACGTTCGGATCGGGGACCAAGCTGGAAATGAAAC GTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGA AATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGG CCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAG AGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCT GACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCA
CCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT PD1B750, PD1B845, PD1B846, PD1B847, PD1B848, PD1B849, LC de PD1B850 (SEQ ID Nº: 86)
GACATCCAGATGACACAGTCTCCTAGCTCTCTGAGCGCCTCTGTGGGAGATCG GGTGACAATCACCTGCAAGGCCAGCCAGAACGTGGGCACCAACGTGGCCTGG TACCAGCAGAAACCTGAAAAAGCCCCTAAGAGCCTGATCTACAGCGCCAGCTA CCGGTACAGCGGCGTGCCTTCTCGGTTTAGCGGCTCTGGAAGCGGAACAGATT TCACACTGACCATCTCTAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCCACATACTACTGCC AGCAGTACAACATCTACCCCTACACCTTCGGCCAGGGAACAAAGCTGGAAATCA AGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGT TGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAG AGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAG GAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCA CCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAA GTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGA
GTGT LC de PD1B751 (SEQ ID Nº: 87)
GACATCCAGATGACACAGTCTCCTAGCTCTCTGAGCGCCTCTGTGGGAGATCG GGTGACAATCACCTGCAAGGCCAGCCAGAACGTGGGCACCAACGTGGCCTGG TACCAGCAGAAACCTGAAAAAGCCCCTAAGGCCCTGATCTACAGCGCCAGCTA CCGGTACAGCGGCGTGCCTTCTCGGTTTAGCGGCTCTGGAAGCGGAACAGATT TCACACTGACCATCTCTAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCCACATACTTTTGCC AGCAGTACAACATCTACCCCTACACCTTCGGCCAGGGAACAAAGCTGGAAATCA AGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGT TGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAG AGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAG GAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCA CCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAA GTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGA
GTGT LC de PD1B512 (SEQ ID Nº: 111)
GATATTGTGATGACTCAGGCTGCACTCTCCAATCCAGTCACTCTTGGAACATCA GCTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTACATAGTAATGGCATCACT TATTTGAATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTAT CAGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTAGCAGTGGGTC AGGAACTGATTTCACACTGAGAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTG TTTATTACTGTGCTCAAAATCTAGAACTTCCGCTCACGTTCGGATCGGGGACCA AGCTGGAAATGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCAT CTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACT TCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCG GGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAG CCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCT ACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTC
AACAGGGGAGAGTGT LC de PD1B756 (SEQ ID Nº: 112)
GACATCGTGATGACACAGTCTCCTCTGTCTCTGCCTGTGACACCTGGCGAACCT GCCTCTATCAGCTGCCGGAGCAGCAAGAGCCTGCTGCACAGCAACGGCATCAC CTACCTGAACTGGTACCTGCAGAAACCTGGACAGTCTCCTCAGCTGCTGATCTA CCAGATGAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCTGATCGGTTTAGCGGCTCTGGAA GCGGCACAGACTTCACACTGAAGATCTCTCGGGTGGAAGCCGAGGACGTGGG AGTGTACTACTGCGCCCAGAACCTGGAGCTGCCCCTGACCTTCGGAGGCGGAA CAAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCG CCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAAT AACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCA ATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCT ACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAA GTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAG
CTTCAACAGGGGAGAGTGT LC de PD1B757 (SEQ ID Nº: 113)
GACATCGTGATGACACAGTCTCCTCTGTCTCTGCCTGTGACACCTGGCGAACCT GCCTCTATCAGCTGCCGGAGCAGCAAGAGCCTGCTGCACAGCAACGGCATCAC CTACCTGAACTGGTACCTGCAGAAACCTGGACAGTCTCCTCAGCTGCTGATCTA CCAGATGAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCTGATCGGTTTAGCAGCTCTGGAA GCGGCACAGACTTCACACTGAAGATCTCTCGGGTGGAAGCCGAGGACGTGGG AGTGTACTACTGCGCCCAGAACCTGGAGCTGCCCCTGACCTTCGGAGGCGGAA CAAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCG CCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAAT AACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCA ATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCT ACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAA GTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAG CTTCAACAGGGGAGAGTGT
[0523] As sequências de cDNA que codificam a VH, VL, HC e LC do anticorpo aqui fornecidas podem ser otimizadas por códon para ex- pressão em várias células, por exemplo, para expressão em células HEK ou CHO. As sequências de cDNA adicionais que podem ser usa- das para codificar e expressar a VH, a VL, a HC e a LC de PD1B878 e PD1B849 são mostradas abaixo. SEQ ID Nº: 132 cDNA de VH de PD1B878
CAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCAGCGAGCTGAAAAAACCTGG CGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTAGCGGCTACACCTTTAC CGACTACAGCATGCACTGGGTCCGACAGGCTCCAGGACAAGGCT TGGAATGGATGGGCTGGATCAACATCGAGACAGGCGAGCCCACA TACGCCCAGGGCTTTACCGGCAGATTCGTGTTCAGCCTGGACACC TCTGTGTCCACCGCCTACCTGCAGATCAGCTCTCTGAAGGCCGAG GATACCGCCGTGTACTTCTGCGCCAGAGACTACTACGGCACCTAC TTCTACGCCATGGATTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACCGTT
TCTTCT SEQ ID Nº: 133 cDNA de VL de PD1B878
GAGATCGTGCTGACACAGTCTCCCGCCACACTGTCACTGTCTCCA GGCGAAAGAGCCACACTGAGCTGTACCGCCAGCAGCTCTGTGTC CAGCAGCTACCTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGACTGGCCC CTCGGCTGCTGATCTACAGCACAAGCAATCTGGCCAGCGGCATC CCCGATAGATTTTCCGGCTCTGGAAGCGGCACCGACTACACCCTG ACAATCAGCAGACTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGC CACCAGTACCACAGAAGCCCTCTGACCTTTGGCCAGGGCACCAA
GCTGGAAATCAAG SEQ ID Nº: 134 cDNA de HC de PD1B878
CAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCAGCGAGCTGAAAAAACCTGG CGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTAGCGGCTACACCTTTAC CGACTACAGCATGCACTGGGTCCGACAGGCTCCAGGACAAGGCT TGGAATGGATGGGCTGGATCAACATCGAGACAGGCGAGCCCACA TACGCCCAGGGCTTTACCGGCAGATTCGTGTTCAGCCTGGACACC TCTGTGTCCACCGCCTACCTGCAGATCAGCTCTCTGAAGGCCGAG GATACCGCCGTGTACTTCTGCGCCAGAGACTACTACGGCACCTAC TTCTACGCCATGGATTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACCGTT TCTTCTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCC TCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCT GGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACT CAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTA CAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCC CTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCA CAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAAT CTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAC TCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGG ACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTG GTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTA CGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGG AGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACC GTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAA GGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTC CAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGC CCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACC TGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTG GGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTC CCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCA CCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGC TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGC
CTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA SEQ ID Nº: 135 cDNA de LC de PD1B878
GAGATCGTGCTGACACAGTCTCCCGCCACACTGTCACTGTCTCCA GGCGAAAGAGCCACACTGAGCTGTACCGCCAGCAGCTCTGTGTC CAGCAGCTACCTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGACTGGCCC CTCGGCTGCTGATCTACAGCACAAGCAATCTGGCCAGCGGCATC CCCGATAGATTTTCCGGCTCTGGAAGCGGCACCGACTACACCCTG ACAATCAGCAGACTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGC CACCAGTACCACAGAAGCCCTCTGACCTTTGGCCAGGGCACCAA GCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTT CCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGT GTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTG GAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTG TCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGC ACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTAC GCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAA
GAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT SEQ ID Nº: 136 cDNA de VH de PD1B849
CAAGTGCAGCTGGTGCAATCTGGCGCCGAAGTGAAAAAGCCTGG CGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTTAC CACCTACTGGATGCACTGGGTCCGACAGGCTCCAGGACAAGGCT TGGAGTGGATGGGCGAGATCAACCCCAATGAAGGCGGCATCAAC TACGCCCAGAAATTCCAGGGCAGAGTGACCCTGACCGTGGACAA GAGCATCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCCGGCTGAGATCCG ATGACACCGCCGTGTACTACTGCACCATCGACTACTACGACTACG
GCGGCTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTTACAGTGTCCTCT SEQ ID Nº: 137 cDNA de VL de PD1B849
GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTG GGCGATAGAGTGACCATCACATGCAAGGCCAGCCAGAACGTGGG CACCAATGTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGAGAAGGCCCCTA AGAGCCTGATCTACAGCGCCAGCTACAGATACAGCGGCGTGCCA AGCAGATTTTCTGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAC AATTAGTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCA GCAGTACAACATCTACCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCT
GGAAATCAAG SEQ ID Nº: 138 cDNA de HC de PD1B849
CAAGTGCAGCTGGTGCAATCTGGCGCCGAAGTGAAAAAGCCTGG CGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTTAC CACCTACTGGATGCACTGGGTCCGACAGGCTCCAGGACAAGGCT TGGAGTGGATGGGCGAGATCAACCCCAATGAAGGCGGCATCAAC TACGCCCAGAAATTCCAGGGCAGAGTGACCCTGACCGTGGACAA GAGCATCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCCGGCTGAGATCCG ATGACACCGCCGTGTACTACTGCACCATCGACTACTACGACTACG GCGGCTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTTACAGTGTCCTCTGCC TCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAA GAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAG GACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGC CCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCT CAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGC AGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCC AGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAC AAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGG GGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCT CATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACG TGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGAC GGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCA GTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCA CCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCA ACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCA AAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCC CGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGT CAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA ATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTG GACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGAC AAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGAT GCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCT
GTCTCCGGGTAAA SEQ ID Nº: 139 cDNA de LC de PD1B849
GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTG GGCGATAGAGTGACCATCACATGCAAGGCCAGCCAGAACGTGGG CACCAATGTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGAGAAGGCCCCTA AGAGCCTGATCTACAGCGCCAGCTACAGATACAGCGGCGTGCCA AGCAGATTTTCTGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAC AATTAGTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCA GCAGTACAACATCTACCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCT GGAAATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCC GCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTG CCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAA GGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCA CAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCC TGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAG CTTCAACAGGGGAGAGTGT
[0524] A Figura 2A e a Figura 2B mostram o alinhamento das se- quências de aminoácidos VH e VL de mAbs da linhagem PD1B505, respectivamente.
[0525] A Figura 3A e a Figura 3B mostram o alinhamento das se- quências de aminoácidos VH e VL de mAbs da linhagem PD1B506, respectivamente.
[0526] A Figura 4A e a Figura 4B mostram o alinhamento das se- quências de aminoácidos VH e VL de mAbs da linhagem PD1B512, respectivamente. Exemplo 4. Anticorpos anti-PD-1 humanizados inibem células T espe- cíficas de antígeno
[0527] Os anticorpos humanizados selecionados foram caracteri- zados por sua capacidade de inibir células T ativadas em um ensaio de recuperação específico de CMV (ensaio CMV-PBMC descrito no Exemplo 1). Os anticorpos parentais PD1B505 e PD1B506 demonstra- ram inibição robusta de células T ativadas avaliadas através de três doadores diferentes em vários experimentos separados conforme mostrado na Tabela 16, em que os resultados são mostrados como porcentagem (%) de inibição da proliferação de células T em 10 µg/mL de mAb. A Figura 5A mostra a porcentagem de inibição média e o desvio padrão (STDEC) para PD1B505 (57,8% ± 9,5%) e PD1B506 (77,0% +/- 7,8%) quando comparada ao controle isotípico (IgG1 hu- mana) (-9,5% ± 28,8%). Os anticorpos humanizados PD1B743, PD1B750 e PD1B756 também inibiram a ativação de células T con- forme mostrado na Tabela 17 como % de inibição em 10 µg/mL. A Fi- gura 5B mostra a porcentagem de inibição média e o desvio padrão (STDEV) para PD1B743 (58,0% ± 11,3%) PD1B750 (65,9% ± 13,2%), PD1B756 (36,7% ± 15,5%) quando comparada ao controle isotípico (IgG1 humana) (3,5% ± 25,6%). Os ensaios que demostram acima de 25% de desvio padrão (STDEV) foram excluídos da análise. Os anti-
corpos manipulados PD1B878 E PD1B849 de modo similar inibiram as células T ativadas conforme mostrado na Tabela 18. A Figura 5C mos- tra a porcentagem de inibição média e o desvio padrão (STDEV) para PD1B878 (78,3% ± 18,1%) e PD1B849 (69,0% +/- 4,0%) quando com- parada ao controle isotípico (IgG1 humana) (4,1% ± 28,7%). Tabela 16.
PD1B505 PD1B506 Isótipo Doador Média STDEV Média STDEV Média STDEV D1 86,5 9,0 95,2 1,4 4,7 13,3 D2 74,8 0,8 100,1 3,3 13,2 12,9 D1 77 23,0 98 9,8 4,2 33,6 D2 87,7 3,7 100,0 5,8 -16,6 30,6 D3 0,7 8,3 49,5 11,4 6,1 5,7 D1 77,1 4,1 87,8 4,0 -33,1 59,1 D1 69,7 5,4 85,2 2,7 3,1 24,5 D3 63,4 4,9 101,4 8,7 -23,5 44,3 D1 84,5 7,2 86,4 6,5 -35,6 60,4 D1 76,6 2,5 103,1 5,2 -17,7 28,1 D1 49,8 12,7 64,2 11,5 -14,9 19,5 D1 -7,0 17,1 3,8 12,1 -20,0 29,3 D2 49,1 16,6 76,6 6,8 -0,9 28,1 D1 20,1 17,0 26,2 20,7 -2,0 14,2
Tabela 17.
PD1B743 PD1B750 PD1B756 Isótipo Doador Média STDEV Média STDEV Média STDEV Média STDEV D1 90,1 3,1 97,2 10,0 59,3 18,2 -17,7 28,1 D3 21,1 13,8 74,9 16,7 27,4 14,2 -6,6 17,7 D4 30,5 23,6 24,2 15,5 0,3 17,1 2,7 7,7 D5 64,0 5,9 75,0 9,9 69,3 12,8 14,1 35,6 D1 66,7 14,8 58,1 19,8 27,4 15,4 -13,1 45,2 D3 35,1 8,2 55,6 5,8 0,5 20,8 D1 84,2 2,2 72,1 18,8 43,1 17,5 D1 58,4 8,4 64,7 7,3 5,8 31,6 D1 72,1 21,4 71,6 14,8 2,5 25,9 Tabela 18.
PD1B878 PD1B849 Isótipo Doador Média STDEV Média STDEV Média STDEV D1 64,3 2,5 5,8 31,6 D1 78,3 18,1 73,7 5,6 2,5 25,9 Exemplo 5. Anticorpos anti-PD-1 humanos se ligam a PD-1 com alta afinidade
[0528] A afinidade dos anticorpos parentais e humanizados com PD-1 foi medida com o uso de SPR, conforme descrito no Exemplo 1.
[0529] A Tabela 19 mostra os resultados dos experimentos de afi- nidade. Os anticorpos ligaram-se a PD-1 com uma KD na faixa de cer- ca de 5,2x10-8 M e 2,1x10-8 M.
Tabela 19.
mAb ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) PD1B505 8,11E+04 2,36E-03 2,91E-08 PD1B742 PD1B743 9,15E+04 3,00E-03 3,28E-08 PD1B878 5,98E+04 3,51E-03 5,89E-08 PD1B506 1,95E+05 1,02E-02 5,24E-08 PD1B750 3,59E+05 8,32E-03 2,32E-08 PD1B751 PD1B845* 3,51E+05 8,43E-03 2,40E-08 PD1B846* 3,49E+05 7,53E-03 2,16E-08 PD1B847* 3,03E+05 7,44E-03 2,46E-08 PD1B848* 2,53E+05 9,91E-03 3,92E-08 PD1B849 1,88E+05 8,83E-03 4,71E-08 PD1B850* 3,13E+05 7,19E-03 2,30E-08 PD1B512 PD1B756 1,18E+05 2,14E-03 1,81E-08 PD1B757 *A ligação foi avaliada como sobrenadantes brutos Exemplo 6. Anticorpos PD-1 bloqueiam diferencialmente a interação PD/ligante
[0530] O bloqueio de ligante foi avaliado mediante a avaliação do efeito dos anticorpos no agrupamento de células que superexpressam PD-1 ou ligante de PD-1 (PD-L1 ou PD-L2) com o uso do protocolo descrito no Exemplo 1. A porcentagem mais baixa (%) de eventos du-
plo-positivos registrada indicou que o mAb testado bloqueou a ligação de PD-1 ao ligante testado.
[0531] A Figura 6A mostra a porcentagem de agrupamentos de células PD-1-HEK e PD-L1-HEK que permaneceu após o tratamento das células com PD1B743, PD1B750 ou PD1B756. PD1B743 e PD1B756 não bloquearam a ligação de PD-L1 a PD-1, enquanto PD1B750 bloqueou. De modo similar, PD1B743 e PD1B756 não blo- quearam a ligação de PD-L2 a PD-1 ao passo que PD1B750 bloqueou (Figura 6B). O mAb bloqueador de ligante de PD-1 conhecido foi usa- do como um controle positivo nos experimentos. Exemplo 7. Binagem de epítopo de anticorpos
[0532] Grupos ("bins") de cinco epítopo distintos foram identifica- dos em ensaios iniciais de matriz com o uso de anticorpos quiméricos seguindo o protocolo descrito no Exemplo 1. Os grupos 4 e 5 não ti- veram competição cruzada com quaisquer outros grupos. Os grupos 1, 2 e 3 foram parcialmente sobrepostos; O grupo 1 competiu com os grupos 2 e 3, e os grupos 2 e 3 competiram com o grupo 1. Os gru- pos 1, 2, 3 e 4 não bloquearam a ligação de PD-L1 a PD-1, enquanto que o grupo 5 bloqueou a interação PD-L1/PD-1. A Figura 7 mostra os grupos de epítopos distintos e os anticorpos em cada grupo.
[0533] Um experimento de controle com controle isotípico como o primeiro anticorpo adicionado foi feito para demonstrar como o segun- do anticorpo se ligaria sozinho a PD-1 humana. Então no experimento de competição, o sinal (nm) da associação do segundo anticorpo foi tomado em 180 segundos após o início desta etapa. O sinal de cada anticorpo que competiu potencialmente foi comparado a uma média do sinal de 3 execuções do mesmo anticorpo adicionado após a controle de isótipo. Uma razão entre esses sinais foi determinada. Se a razão estava abaixo de 0,7, então foi determinado que o segundo anticorpo não poderia se ligar a PD-1 humana e os dois anticorpos compartilham o mesmo epítopo. Se a razão era maior que 0,7, foi determinado o se- gundo anticorpo poderia se ligar na presença do primeiro anticorpo e, portanto, os dois anticorpos ligaram-se aos epítopos que não competi- ram.
[0534] Não se espera que a humanização e a engenharia de PTM resulte em uma mudança no epítopo, portanto, espera-se que PD1B743, PD1B742 e PD1B878 se liguem ao mesmo epítopo como o grupo 1 quimérico parental PD1B505. De modo similar, espera-se PD1B750, PD1B751 e PD1B849 se liguem ao mesmo epítopo como o grupo 5 quimérico parental PD1B506, e espera-se que PD1B756 se ligue ao mesmo epítopo como o grupo 2 quimérico parental PD1B512.
[0535] PD1B503 compreende a VL e a VH das SEQ ID Nºs: 114 e 115, respectivamente.
[0536] PD1B517 que compreende a VL e a VH das SEQ ID Nºs: 116 e 117, respectivamente. SEQ ID Nº: 114 VH de PD1B503 (PD1H96)
QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYDINWVRQRPEQGLE WIGWIFPGDGSTKYNEKFKGKATLTTDKSSSTAYMQFSRLTSEDSAV
YFCARGGMRQLGRFVYWGQGTTLTVSS SEQ ID Nº: 115 VL da PD1B503 (PD1L32)
DIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQEISGYLSWLQQKPDGTIKRLIY AASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYASNPY
TFGGGTKLEIK SEQ ID Nº: 116 VH da PD1B517 (PD1H73)
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNVKDTYFHWVKQRPDQGL EWIGRIVSANGDTKYAPKLQDKATITTDTSSNTAYLQLSRLTSEDTAV
YYCVLIYYGFEEGDFWGQGTTLTVSS SEQ ID Nº: 117 VL da PD1B517 (PD1L34)
DIVMTQSPSSLSASLGDTITITCHASQNINVWLSWYQQKPGNVPKLLI YKASNLHTGVPSRFSGSGSGTGFTLNISSLQPEDIATYYCQQGQSFP
LTFGAGTKLELK Exemplo 8. Maturação de afinidade de PD1B878
[0537] Para melhorar a afinidade de ligação de PD1B878, foram realizadas varreduras de CDR em cadeias pesadas e cadeias leves. Bibliotecas não combinatórias foram projetadas para diversificar cada posição de todas as seis CDRs (HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3).
[0538] Resumidamente, as bibliotecas de Fab foram construídas em um sistema de apresentação de Fab de fago pIX, conforme des- crito em WO2009/085462, Shi et al., J Mol Biol 397: 385-396 (2010), and Tornetta et al. J Immunol Methods 360: 39-46 (2010) com peque- nas modificações nos sítios de enzima de restrição. Estas bibliotecas foram triadas ("panned") contra PD-1/PDCD1 humana biotinilada (Acro Biosystems. Cat # PD1-H82E4) de acordo com esquemas de triagem ("panning") conhecidos na técnica, como descrito em WO2009/085462 e em Shi et al., J Mol Biol 397: 385-396 (2010). O fago foi produzido por infecção de fago auxiliar. Os aglutinantes foram recuperados pela adição de esferas para formar um complexo de esfera/antígeno/fago. Após a lavagem final, o fago foi resgatado por infecção de células TG- 1 de Escherichia coli que cresceram exponencialmente.
[0539] Para a triagem de acompanhamento, o DNA plasmidial foi preparado a partir de cultura de um dia para o outro das células TG-1 de Escherichia coli e o gene pIX foi excisado pela digestão de NheI/SpeI. Após a ligação, o DNA foi transformado em células TG-1 e cultivado em placas LB/ágar de um dia para o outro. No dia seguinte, as colônias foram colhidas, cultivadas de um dia para outro, e as cultu- ras usadas para (i) sequenciamento de colônias das regiões V e (ii) indução da produção de Fab. Para a produção de Fab, a cultura de um dia foi diluída 100 vezes em meio novo e cultivadas durante 5 a 6 ho-
ras a 37°C. A produção de Fab foi induzida pela adição de meio fresco contendo IPTG e as culturas foram cultivadas de um dia para o outro a 30°C. No dia seguinte, as culturas foram centrifugadas e os sobrena- dantes, contendo as proteínas Fab solúveis, foram usados para ELISA Fab. Para o ELISA, as proteínas Fab solúveis foram capturadas nas placas por um anticorpo anti-Fd (CH1) policlonal. Após a lavagem e o bloqueio, PD-1/PDCD1 humano biotinilado foi adicionado a uma con- centração de 5 nM. Esta concentração permitiu a classificação das va- riantes de Fab, definido como a alteração em vezes em função do pa- rente, no qual o Fab parental, presente como um controle em todas as placas, é definido como 100% de ligação. A PD-1 humana biotinilada foi detectado por estreptavidina conjugada com HRP com quimiolumi- nescência medida em um leitor de placas. Por este critério, foram se- lecionadas 3 cadeias pesadas e duas cadeias leves que se ligam a PD-1 em 10 vezes ou mais em relação ao Fab parental.
[0540] A Tabela 20 mostra a variante com substituições na posi- ção 57 na HCDR2 da VH e na posição 29 ou 30 da LCDR1 of VL. A Tabela 21 mostra as SEQ ID Nºs: das CDRs dos anticorpos. A Tabela 22 mostra as SEQ ID Nºs: das sequências de aminoácidos da VH, da VL, da HC e da LC. A Tabela 23 mostra as SEQ ID Nºs: dos polinu- cleotídeos que codificam a VH, a VL, a HC e a LC dos anticorpos. A Tabela 24 mostra as sequências de aminoácidos do HCDR1, do HCDR2 e do HCDR3. A Tabela 25 mostra as sequências de aminoá- cidos da LCDR1, da LCDR2 e da LCDR3. A Tabela 26 mostra as se- quências de aminoácidos de VH. A Tabela 27 mostra as sequências de aminoácidos de VH. Espera-se que as variantes maturadas por afi- nidade se liguem ao mesmo epítopo em PD-1 como o anticorpo paren- tal PD1B878.
Tabela 20.
ID do mAb ID do peptídeo Mutação de VH em ID do peptídeo Mutação de VL em da VH comparação com o da VL comparação com a parental parental PD1B1085 PD1H585 E57Y PD1L469 PD1B1086 PD1H586 E57H PD1L469 PD1B1087 PD1H587 E57W PD1L469 PD1B1088 PD1H405 PD1L651 V29F PD1B1089 PD1H405 PD1L652 S30P PD1B1090 PD1H585 E57Y PD1L651 V29F PD1B1091 PD1H586 E57H PD1L651 V29F PD1B1092 PD1H587 E57W PD1L651 V29F PD1B1093 PD1H585 E57Y PD1L652 S30P PD1B1094 PD1H586 E57H PD1L652 S30P PD1B1095 PD1H587 E57W PD1L652 S30P Tabela 21. Anticorpo HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 PD1B1085 2 145 4 5 6 7 PD1B1086 2 146 4 5 6 7 PD1B1087 2 147 4 5 6 7 PD1B1088 2 3 4 148 6 7 PD1B1089 2 3 4 149 6 7 PD1B1090 2 145 4 148 6 7 PD1B1091 2 146 4 148 6 7 PD1B1092 2 147 4 148 6 7 PD1B1093 2 145 4 149 6 7 PD1B1094 2 146 4 149 6 7 PD1B1095 2 147 4 149 6 7
Tabela 22. ID do mAb ID do ID do VH SEQ VL SEQ HC SEQ LC SEQ peptídeo peptídeo ID Nº: ID Nº: ID Nº: ID Nº: da VH da VL PD1B1085 PD1H585 PD1L469 140 16 150 28 PD1B1086 PD1H586 PD1L469 141 16 151 28 PD1B1087 PD1H587 PD1L469 142 16 152 28 PD1B1088 PD1H405 PD1L651 10 143 22 153 PD1B1089 PD1H405 PD1L652 10 144 22 154 PD1B1090 PD1H585 PD1L651 140 143 150 153 PD1B1091 PD1H586 PD1L651 141 143 151 153 PD1B1092 PD1H587 PD1L651 142 143 152 153 PD1B1093 PD1H585 PD1L652 140 144 150 154 PD1B1094 PD1H586 PD1L652 141 144 151 154 PD1B1095 PD1H587 PD1L652 142 144 152 154 Tabela 23.
ID do mAb Nome do Nome do SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID peptídeo peptídeo Nº: de Nº: de Nº: de Nº: de de VH de VL cDNA de cDNA de cDNA de cDNA de
VH VL HC LC PD1B1085 PD1H585 PD1L469 155 19 160 31 PD1B1086 PD1H586 PD1L469 156 19 161 31 PD1B1087 PD1H587 PD1L469 157 19 162 31 PD1B1088 PD1H405 PD1L651 13 158 25 163 PD1B1089 PD1H405 PD1L652 13 159 25 164 PD1B1090 PD1H585 PD1L651 155 158 160 163 PD1B1091 PD1H586 PD1L651 156 158 161 163 PD1B1092 PD1H587 PD1L651 157 158 162 163 PD1B1093 PD1H585 PD1L652 155 159 160 164 PD1B1094 PD1H586 PD1L652 156 159 161 164 PD1B1095 PD1H587 PD1L652 157 159 162 164
Tabela 24.
HCDR1 HCDR2 HCDR3 Anticorpo (SEQ ID Nº:) (SEQ ID Nº:) (SEQ ID Nº:) PD1B1085 GYTFTDYSMH WINIETGYPT DYYGTYFYAMDY (SEQ ID Nº: 2) (SEQ ID Nº: 145) (SEQ ID Nº: 4) PD1B1086 GYTFTDYSMH WINIETGHPT DYYGTYFYAMDY (SEQ ID Nº: 2) (SEQ ID Nº: 146) (SEQ ID Nº: 4) PD1B1087 GYTFTDYSMH WINIETGWPT DYYGTYFYAMDY (SEQ ID Nº: 2) (SEQ ID Nº: 147) (SEQ ID Nº: 4) PD1B1088 GYTFTDYSMH WINIETGEPT DYYGTYFYAMDY (SEQ ID Nº: 2) (SEQ ID Nº: 3) (SEQ ID Nº: 4) PD1B1089 GYTFTDYSMH WINIETGEPT DYYGTYFYAMDY (SEQ ID Nº: 2) (SEQ ID Nº: 3) (SEQ ID Nº: 4) PD1B1090 GYTFTDYSMH WINIETGYPT DYYGTYFYAMDY (SEQ ID Nº: 2) (SEQ ID Nº: 145) (SEQ ID Nº: 4) PD1B1091 GYTFTDYSMH WINIETGHPT DYYGTYFYAMDY (SEQ ID Nº: 2) (SEQ ID Nº: 146) (SEQ ID Nº: 4) PD1B1092 GYTFTDYSMH WINIETGWPT DYYGTYFYAMDY (SEQ ID Nº: 2) (SEQ ID Nº: 147) (SEQ ID Nº: 4) PD1B1093 GYTFTDYSMH WINIETGYPT DYYGTYFYAMDY (SEQ ID Nº: 2) (SEQ ID Nº: 145) (SEQ ID Nº: 4) PD1B1094 GYTFTDYSMH WINIETGHPT DYYGTYFYAMDY (SEQ ID Nº: 2) (SEQ ID Nº: 146) (SEQ ID Nº: 4) PD1B1095 GYTFTDYSMH WINIETGWPT DYYGTYFYAMDY (SEQ ID Nº: 2) (SEQ ID Nº: 147) (SEQ ID Nº: 4)
Tabela 25.
LCDR1 LCDR2 LCDR3 Anticorpo (SEQ ID Nº:) (SEQ ID Nº:) (SEQ ID Nº:) PD1B1085 TASSSVSSSYLH STSNLAS HQYHRSPLT (SEQ ID Nº: 5) (SEQ ID Nº: 6) (SEQ ID Nº: 7) PD1B1086 TASSSVSSSYLH STSNLAS HQYHRSPLT (SEQ ID Nº: 5) (SEQ ID Nº: 6) (SEQ ID Nº: 7) PD1B1087 TASSSVSSSYLH STSNLAS HQYHRSPLT (SEQ ID Nº: 5) (SEQ ID Nº: 6) (SEQ ID Nº: 7) PD1B1088 TASSSFSSSYLH STSNLAS HQYHRSPLT (SEQ ID Nº: 148) (SEQ ID Nº: 6) (SEQ ID Nº: 7) PD1B1089 TASSSVPSSYLH STSNLAS HQYHRSPLT (SEQ ID Nº: 149) (SEQ ID Nº: 6) (SEQ ID Nº: 7) PD1B1090 TASSSFSSSYLH STSNLAS HQYHRSPLT (SEQ ID Nº: 148 (SEQ ID Nº: 6) (SEQ ID Nº: 7) PD1B1091 TASSSFSSSYLH STSNLAS HQYHRSPLT (SEQ ID Nº: 148) (SEQ ID Nº: 6) (SEQ ID Nº: 7) PD1B1092 TASSSFSSSYLH STSNLAS HQYHRSPLT (SEQ ID Nº: 148 (SEQ ID Nº: 6) (SEQ ID Nº: 7) PD1B1093 TASSSVPSSYLH STSNLAS HQYHRSPLT (SEQ ID Nº: 149) (SEQ ID Nº: 6) (SEQ ID Nº: 7) PD1B1094 TASSSVPSSYLH STSNLAS HQYHRSPLT (SEQ ID Nº: 149) (SEQ ID Nº: 6) (SEQ ID Nº: 7) PD1B1095 TASSSVPSSYLH STSNLAS HQYHRSPLT (SEQ ID Nº: 149) (SEQ ID Nº: 6) (SEQ ID Nº: 7)
Tabela 26. Nome do peptídeo Sequência de aminoácido de VH SEQ ID de VH Nº: PD1H585 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMHW 140
VRQAPGQGLEWMGWINIETGYPTYAQGFTGRFVFSL DTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARDYYGTYFYAMDY
WGQGTLVTVSS PD1H586 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMHW 141
VRQAPGQGLEWMGWINIETGHPTYAQGFTGRFVFSL DTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARDYYGTYFYAMDY
WGQGTLVTVSS PD1H587 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMHW 142
VRQAPGQGLEWMGWINIETGWPTYAQGFTGRFVFSL DTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARDYYGTYFYAMDY
WGQGTLVTVSS Tabela 27. Nome do peptídeo Sequência de aminoácido de VL SEQ ID de VL Nº: PD1L651 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCTASSSFSSSYLHWYQ 143
QKPGLAPRLLIYSTSNLASGIPDRFSGSGSGTDYTLTIS
RLEPEDFAVYYCHQYHRSPLTFGQGTKLEIK PD1L652 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCTASSSVPSSYLHWYQ 144
QKPGLAPRLLIYSTSNLASGIPDRFSGSGSGTDYTLTIS
RLEPEDFAVYYCHQYHRSPLTFGQGTKLEIK SEQ ID Nº: 150 PD1B1085, PD1B1090, HC de PD1B1093
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMHWVRQAPGQGL EWMGWINIETGYPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTA VYFCARDYYGTYFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID Nº: 151 PD1B1086, PD1B1091, HC de PD1B1094
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMHWVRQAPGQGL EWMGWINIETGHPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTA VYFCARDYYGTYFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD
KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID Nº: 152 PD1B1087, PD1B1092, HC de PD1B1095
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMHWVRQAPGQGL EWMGWINIETGWPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTA VYFCARDYYGTYFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD
KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID Nº: 153 PD1B1088, PD1B1090, PD1B1091, LC de PD1B1092
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCTASSSFSSSYLHWYQQKPGLAPRLL IYSTSNLASGIPDRFSGSGSGTDYTLTISRLEPEDFAVYYCHQYHRSP LTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH
KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID Nº: 154 PD1B1089, PD1B1093, PD1B1094, LC de PD1B1095
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCTASSSVPSSYLHWYQQKPGLAPRLL IYSTSNLASGIPDRFSGSGSGTDYTLTISRLEPEDFAVYYCHQYHRSP LTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH
KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID Nº: 155 cDNA de PD1H585
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAAGCGAACTGAAGAAACCTGG AGCCTCTGTGAAAGTGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACACCTTCAC CGACTACAGCATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAGGGC CTGGAATGGATGGGCTGGATCAACATCGAGACCGGCTATCCCAC CTACGCCCAGGGCTTTACCGGACGGTTCGTGTTCAGCCTGGATAC ATCTGTGTCTACAGCCTATCTGCAGATCAGCTCTCTGAAGGCCGA AGATACAGCCGTGTACTTCTGCGCCCGGGACTACTACGGCACCTA CTTCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAG
TGTCTTCT SEQ ID Nº: 156 cDNA de PD1H586
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAAGCGAACTGAAGAAACCTGG AGCCTCTGTGAAAGTGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACACCTTCAC CGACTACAGCATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAGGGC CTGGAATGGATGGGCTGGATCAACATCGAGACCGGCCATCCCAC CTACGCCCAGGGCTTTACCGGACGGTTCGTGTTCAGCCTGGATAC ATCTGTGTCTACAGCCTATCTGCAGATCAGCTCTCTGAAGGCCGA AGATACAGCCGTGTACTTCTGCGCCCGGGACTACTACGGCACCTA CTTCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAG
TGTCTTCT SEQ ID Nº: 157 cDNA de PD1H587
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAAGCGAACTGAAGAAACCTGG AGCCTCTGTGAAAGTGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACACCTTCAC CGACTACAGCATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAGGGC CTGGAATGGATGGGCTGGATCAACATCGAGACCGGCTGGCCCAC CTACGCCCAGGGCTTTACCGGACGGTTCGTGTTCAGCCTGGATAC ATCTGTGTCTACAGCCTATCTGCAGATCAGCTCTCTGAAGGCCGA AGATACAGCCGTGTACTTCTGCGCCCGGGACTACTACGGCACCTA CTTCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAG
TGTCTTCT SEQ ID Nº: 158 cDNA de PD1L651
GAGATCGTGCTGACACAGTCTCCTGCCACACTGTCTCTGTCTCCT GGAGAACGGGCCACACTGAGCTGCACCGCCAGCAGCAGCTTCAG CAGCAGCTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAACCTGGACTGGCCC CTCGGCTGCTGATCTACAGCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCATC CCTGATCGGTTTTCTGGCAGCGGATCTGGCACAGATTACACACTG ACCATCAGCCGGCTGGAACCTGAGGATTTTGCCGTGTACTACTGC CACCAGTACCACCGGAGCCCCCTGACCTTCGGCCAGGGAACAAA
GCTGGAAATCAAG SEQ ID Nº: 159 cDNA de PD1L652
GAGATCGTGCTGACACAGTCTCCTGCCACACTGTCTCTGTCTCCT GGAGAACGGGCCACACTGAGCTGCACCGCCAGCAGCAGCGTGC CAAGCAGCTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAACCTGGACTGGCC CCTCGGCTGCTGATCTACAGCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCAT CCCTGATCGGTTTTCTGGCAGCGGATCTGGCACAGATTACACACT GACCATCAGCCGGCTGGAACCTGAGGATTTTGCCGTGTACTACTG CCACCAGTACCACCGGAGCCCCCTGACCTTCGGCCAGGGAACAA
AGCTGGAAATCAAG SEQ ID Nº: 160 PD1B1085, PD1B1090, cDNA de HC de PD1B1093
TCTGATAAGAGTCAGAGGTAACTCCCGTTGCGGTGCTGTTAACGG TGGAGGGCAGTGTAGTCTGAGCAGTACTCGTTGCTGCCGCGCGC GCCACCAGACATAATAGCTGACAGACTAACAGACTGTTCCTTTCC ATGGGTCTTTTCTGCAGTCACCGTCCTTAGATCCACTAGTCCAGT GTGGTGAAGCTTGCCGCCACCATGGCTTGGGTGTGGACCTTGCT ATTCCTGATGGCAGCTGCCCAAAGTATACAGGCCCAGGTGCAGCT GGTGCAGTCTGGAAGCGAACTGAAGAAACCTGGAGCCTCTGTGA AAGTGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACAGCA TGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGAT GGGCTGGATCAACATCGAGACCGGCTATCCCACCTACGCCCAGG GCTTTACCGGACGGTTCGTGTTCAGCCTGGATACATCTGTGTCTA CAGCCTATCTGCAGATCAGCTCTCTGAAGGCCGAAGATACAGCCG TGTACTTCTGCGCCCGGGACTACTACGGCACCTACTTCTACGCCA TGGACTACTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCTGCC TCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAA GAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAG GACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGC CCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCT CAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGC AGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCC AGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAC AAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGG GGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCT CATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACG TGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGAC GGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCA GTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCA CCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCA ACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCA AAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCC CGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGT CAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA ATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTG GACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGAC AAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGAT GCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCT GTCTCCGGGTAAATGATAGTTCGAATTCCTAGAAGACATGATAAGA TACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAA AATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACC ATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTT
TATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGA SEQ ID Nº: 161 PD1B1086, PD1B1091, cDNAde HC de PD1B1094
TCTGATAAGAGTCAGAGGTAACTCCCGTTGCGGTGCTGTTAACGG TGGAGGGCAGTGTAGTCTGAGCAGTACTCGTTGCTGCCGCGCGC GCCACCAGACATAATAGCTGACAGACTAACAGACTGTTCCTTTCC ATGGGTCTTTTCTGCAGTCACCGTCCTTAGATCCACTAGTCCAGT GTGGTGAAGCTTGCCGCCACCATGGCTTGGGTGTGGACCTTGCT ATTCCTGATGGCAGCTGCCCAAAGTATACAGGCCCAGGTGCAGCT GGTGCAGTCTGGAAGCGAACTGAAGAAACCTGGAGCCTCTGTGA AAGTGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACAGCA TGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGAT GGGCTGGATCAACATCGAGACCGGCCATCCCACCTACGCCCAGG GCTTTACCGGACGGTTCGTGTTCAGCCTGGATACATCTGTGTCTA CAGCCTATCTGCAGATCAGCTCTCTGAAGGCCGAAGATACAGCCG TGTACTTCTGCGCCCGGGACTACTACGGCACCTACTTCTACGCCA TGGACTACTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCTGCC TCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAA GAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAG GACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGC CCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCT CAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGC AGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCC AGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAC AAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGG GGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCT CATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACG TGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGAC GGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCA GTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCA CCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCA ACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCA AAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCC CGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGT CAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA ATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTG GACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGAC AAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGAT GCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCT GTCTCCGGGTAAATGATAGTTCGAATTCCTAGAAGACATGATAAGA TACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAA AATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACC ATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTT
TATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGA SEQ ID Nº: 162 PD1B1087, PD1B1092, cDNAde HC de PD1B1095
TCTGATAAGAGTCAGAGGTAACTCCCGTTGCGGTGCTGTTAACGG TGGAGGGCAGTGTAGTCTGAGCAGTACTCGTTGCTGCCGCGCGC GCCACCAGACATAATAGCTGACAGACTAACAGACTGTTCCTTTCC ATGGGTCTTTTCTGCAGTCACCGTCCTTAGATCCACTAGTCCAGT GTGGTGAAGCTTGCCGCCACCATGGCTTGGGTGTGGACCTTGCT ATTCCTGATGGCAGCTGCCCAAAGTATACAGGCCCAGGTGCAGCT GGTGCAGTCTGGAAGCGAACTGAAGAAACCTGGAGCCTCTGTGA AAGTGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACAGCA TGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGAT GGGCTGGATCAACATCGAGACCGGCTGGCCCACCTACGCCCAGG GCTTTACCGGACGGTTCGTGTTCAGCCTGGATACATCTGTGTCTA CAGCCTATCTGCAGATCAGCTCTCTGAAGGCCGAAGATACAGCCG TGTACTTCTGCGCCCGGGACTACTACGGCACCTACTTCTACGCCA TGGACTACTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCTGCC TCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAA GAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAG GACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGC CCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCT CAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGC AGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCC AGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAC AAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGG GGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCT CATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACG TGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGAC GGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCA GTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCA CCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCA ACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCA AAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCC CGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGT CAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA ATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTG GACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGAC AAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGAT GCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCT GTCTCCGGGTAAATGATAGTTCGAATTCCTAGAAGACATGATAAGA TACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAA AATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACC ATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTT
TATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGA SEQ ID Nº: 163 PD1B1088, PD1B1090, PD1B1091, cDNA de LC PD1B1092
TCTGATAAGAGTCAGAGGTAACTCCCGTTGCGGTGCTGTTAACGG TGGAGGGCAGTGTAGTCTGAGCAGTACTCGTTGCTGCCGCGCGC GCCACCAGACATAATAGCTGACAGACTAACAGACTGTTCCTTTCC ATGGGTCTTTTCTGCAGTCACCGTCCTTAGATCCACTAGTCCAGT GTGGTGAAGCTTGCCGCCACCATGGCTTGGGTGTGGACCTTGCT ATTCCTGATGGCGGCCGCCCAAAGTATACAGGCCGAGATCGTGC TGACACAGTCTCCTGCCACACTGTCTCTGTCTCCTGGAGAACGGG CCACACTGAGCTGCACCGCCAGCAGCAGCTTCAGCAGCAGCTAC CTGCACTGGTACCAGCAGAAACCTGGACTGGCCCCTCGGCTGCT GATCTACAGCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCATCCCTGATCGGT TTTCTGGCAGCGGATCTGGCACAGATTACACACTGACCATCAGCC GGCTGGAACCTGAGGATTTTGCCGTGTACTACTGCCACCAGTACC ACCGGAGCCCCCTGACCTTCGGCCAGGGAACAAAGCTGGAAATC AAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCT GATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTG AATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGAT AACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCA GGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGC TGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAG TCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACA GGGGAGAGTGTTAGTGATTCGAATTCCTAGAAGACATGATAAGAT ACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAA ATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCA TTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTT
ATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGA SEQ ID Nº: 164 PD1B1089, PD1B1093, PD1B1094, cDNA de LC de PD1B1095
TCTGATAAGAGTCAGAGGTAACTCCCGTTGCGGTGCTGTTAACGGT GGAGGGCAGTGTAGTCTGAGCAGTACTCGTTGCTGCCGCGCGCGC CACCAGACATAATAGCTGACAGACTAACAGACTGTTCCTTTCCATGG GTCTTTTCTGCAGTCACCGTCCTTAGATCCACTAGTCCAGTGTGGT GAAGCTTGCCGCCACCATGGCTTGGGTGTGGACCTTGCTATTCCTG ATGGCGGCCGCCCAAAGTATACAGGCCGAGATCGTGCTGACACAG TCTCCTGCCACACTGTCTCTGTCTCCTGGAGAACGGGCCACACTGA GCTGCACCGCCAGCAGCAGCGTGCCAAGCAGCTACCTGCACTGGT ACCAGCAGAAACCTGGACTGGCCCCTCGGCTGCTGATCTACAGCA CCAGCAACCTGGCCAGCGGCATCCCTGATCGGTTTTCTGGCAGCG GATCTGGCACAGATTACACACTGACCATCAGCCGGCTGGAACCTGA GGATTTTGCCGTGTACTACTGCCACCAGTACCACCGGAGCCCCCTG ACCTTCGGCCAGGGAACAAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCT GCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATC TGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAG AGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTAC AGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAAC ACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCC CGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGTGATTCGAATTCC TAGAAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACT AGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATT GCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAAC AATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGA
[0541] A afinidade dos anticorpos com PD-1 humana e de cino foi medida com o uso de SPR, conforme descrito no Exemplo 1. Os anti- corpos ligados a PD-1 com uma KD na faixa entre 1x10-8 M e 10x10-10 M (Tabela 28) e a PD-1 de cino com uma KD na faixa entre 7x10-8 M e 1x10-9 M (Tabela 26). As afinidades da maior parte das variantes de PD1B878 maturadas por afinidade melhoraram cerca de 100 vezes em comparação com o anticorpo parental.
Tabela 28. mAb ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) PD1B1085 1,56E+05 1,42E-04 9,11E-10 PD1B1086 1,24E+05 3,94E-04 3,19E-09 PD1B1087 1,66E+05 2,39E-04 1,44E-09 PD1B1088 3,13E+04 3,41E-04 1,09E-08 PD1B1089 5,86E+04 4,74E-04 8,09E-09 PD1B1090 1,06E+05 2,37E-05 2,23E-10 PD1B1091 7,77E+04 6,44E-05 8,30E-10 PD1B1092 1,40E +05 3,00E-05 2,14E-10 PD1B1093 1,25E+05 4,36E-05 3,49E-10 PD1B1094 1,05E+05 9,16E-05 8,71E-10 PD1B1095 1,51E+05 7,12E-05 4,71E-10 Tabela 29. mAb ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) PD1B1085 2,00E+05 1,29E-03 6,45E-09 PD1B1086 1,71E+05 5,44E-03 3,18E-08 PD1B1087 2,12E+05 2,47E-03 1,16E-08 PD1B1088 6,61E+04 4,79E-03 7,24E-08 PD1B1089 9,32E+04 8,39E-03 9,00E-08 PD1B1090 1,30E+05 1,85E-04 1,43E-09 PD1B1091 9,91E+04 9,24E-04 9,32E-09 PD1B1092 1,29E+05 4,11E-04 3,18E-09 PD1B1093 1,69E+05 3,68E-04 2,18E-09 PD1B1094 1,35E+05 1,62E -03 1,20E-08 PD1B1095 1,85E+05 7,81E-04 4,23E-09
[0542] PD1B1086, PD1B1090 E PD1B1094 foram caracterizados por sua capacidade de inibir células T ativadas no ensaio de recupera- ção específico de CMV (ensaio CMV-PBMC descrito no Exemplo 1). A Tabela 30 mostra a porcentual médio de inibição em dois doadores em um experimento. Todos os anticorpos testados inibiram o ensaio de recuperação específico de CMV em um grau de 70% ou mais. Tabela 30.
PD1B1086 PD1B1090 PD1B1094 IgG1 % de inibição média 72,7 74,8 77,9 6,0 Exemplo 9. Anticorpos agonísticos de PD-1 seletivamente direcionam células T de memória cronicamente ativadas
[0543] Verificou-se que PD-1 é principalmente expressa em célu- las T de memória (células CD45RO+) e não em células T puras (sem tratamento prévio), e que a expressão é regulada positivamente medi- ante a ativação de células T. A expressão de PD-1 aumentou em célu- las T de memória estimuladas com peptídeos de CMV (Figura 8A).
[0544] Os anticorpos PD1B849 e PD1B878 foram testados por sua capacidade de inibir a proliferação de células T CD4+ ou CD8+ com o uso de PBMCs atividas com CMV. Tanto PD1B849 quanto PD1B878 inibiram a proliferação de PBMCs ativadas específicas para CMV no ensaio de recuperação de CMV-PBMC (Figura 8B). Exemplo 10. Anticorpos agonísticos de PD-1 que esgotam células T de memória ativadas, mas não em repouso, por ADCC
[0545] PD1B849 e PD1B878 foram testados por sua capacidade de mediar ADCC de células T de memória ativadas ou de células T de memória em repouso com o uso de células NK ou PBMCs como célu- las efetoras. As células T de memória ativadas foram identificadas co- mo tendo maior expressão de PD-1 quando comparadas com as célu- las T de memória em repouso. O experimento foi realizado de acordo com os protocolos descritos no Exemplo 1. PD1B849 e PD1B878 fo- ram expressos em duas linhagens celulares separadas de CHO, uma produzindo anticorpos com perfil de glicosilação de anticorpo de CHO normal e a outra produzindo anticorpos tendo teor reduzido de fucosila no carboidrato (por exemplo, linhagem celular de baixa fucose (LF). Os anticorpos expressos na linhagem celular de baixa fucose tem um teor de fucosila de cerca de 1 a 15%.
[0546] PD1B849 e PD1B878 induziram a ADCC de células T de memória ativadas tanto na presença de células NK (Figura 9A, painel esquerdo) quanto de células efetoras PBMC (Figura 9A, painel direi- to). Anticorpos com baixo teor de fucose (PD1B849-LF e PD1B878-LF) demonstraram maior atividade de ADCC em direção as células T de memória. PD1B849 e PD1B878 foram incapazes de induzir CCDA de- tectável em células T de memória em repouso, que expressam níveis baixos de PD-1 na presença de células NK (Figura 10A, painel es- querdo) ou na presença de células efetoras PBMCs (Figura 10B, pai- nel direito) células efetoras. PD1B849-LF e PD1B878-LF desencadea- ram ADCC de baixo nível na presença de células NK ou PBMCs. Exemplo 11. Anticorpos agonísticos de PD-1 não induzem CDC
[0547] PD1B849 e PD1B878 foram testados quanto por sua capa- cidade de mediar CDC de células Pan T ativadas com o uso de com- plemento de coelho adicionado. As células T ativadas têm maior ex- pressão de PD-1 quando comparadas com as células T em repouso. O experimento foi realizado de acordo com os protocolos descritos no Exemplo 1. PD1B849 e PD1B878 não induziram a CDC de células T ativadas nas concentrações testadas (Figura 11). O controle positivo OKT3 demonstrou atividade de CDC em direção às células T ativadas na presença, mas não na ausência de complemento. Exemplo 12. Anticorpos maturados por afinidade não bloqueiam a li- gação de PD-L1 a PD-1
[0548] Os anticorpos selecionados foram testados quanto à sua capacidade de bloquear a ligação de PD-L1-Fc dexamerizado a célu- las Jurkat que expressam PD-1. O experimento foi realizado de acordo com o protocolo descrito a seguir. PD1B878, PD1B1090 e PD1B1094 não bloquearam a ligação de PD-L1 nas concentrações testadas (Fi-
gura 12). Como controle positivo, foi demonstrado que um anticorpo antagonista conhecido compete com PD-L1 pela ligação a PD-1 em uma maneira dependente de dose.
[0549] Método: PD-L1-Fc biotinilado (Acro Biosystems) e dextrâ- meros SA & APC conjugados (Immudex) foram preparados a uma concentração 4x e foram misturados a uma razão de 100 nM:10 nM em tampão de coloração. Misturas de PD-L1-Fc biotinilado com dex- trâmeros e dextrâmeros com meio apenas foram preparadas da mes- ma maneira para controles negativos ou não específicos de ligação. Essa mistura foi coberta com folha laminada e incubada em gelo du- rante uma hora, enquanto o restante do experimento era preparado. Diluições em série de anticorpos de teste foram preparadas em tam- pão de coloração a uma concentração 2x de 20 nM, 2 nM e 0,2 nM. Células Jurkat que superexpressam PD-1 foram colhidas no dia do en- saio e lavadas uma vez com tampão de coloração (BD Pharmingen) por centrifuação das células a 300 g durante 5 minutos a 4°C. As célu- las foram contadas, verificadas quanto à viabilidade e ressuspensas a 2x106 células/mL em tampão de coloração. As células foram adiciona- das a 25 uL/poço (50.000 células/poço) em uma placa de ensaio de fundo em U de 95 poços, seguido pela adição de anticorpos de teste preparados em 50 µL/poço. As células com anticorpos foram incuba- das durante 15 minutos em gelo. Complexos pré-misturados de PD- L1-Fc:Dextrâmero biotinilado, IgG1-Fc:Dextrâmero e Dextrâmeros: tampão foram adicionados a 25 µL/poço. Essa mistura de células, an- ticorpos e PD-L1 ligados a dextrâmeros foi incubada por 1 hora e co- berta com uma folha laminada.
[0550] As células foram lavadas duas vezes pela adição de tam- pão corante 150 µL, centrifugação em 300 g durante 5 minutos para peletizar as células e sacudida das placas para remover os sobrena- dantes. O pélete de células após lavagem final foi ressuspenso em 40 µL de tampão de funcionamento IntelliCyt (tampão corante BD suple- mentado com 1 mM de EDTA e 0,1% de ácido plurônico) contendo uma diluição 1:1000 de corante Sytox Green para detecção de viabili- dade celular vivo/morto (ThermoFisher). As concentrações finais de anticorpos no ensaio foram de 10 nM, 1 nM e 0,1 nM. A concentração final de proteína ligante PD-L1-Fc biotinilada foi de 25 nM. A concen- tração final de dextrâmeros foi de 2,5 nM.
[0551] As placas foram executadas em iQue Screener (IntelliCyt). Brevemente, as células foram selecionadas em FCS v. SCS para eli- minar detritos. Os singletos foram selecionados em SCS-A versus SCS-H e da população de singletos, as células vivas foram seleciona- das no canal baixo BL1 para detecção de viabilidade negativa com co- rante de viabilidade Sytox Green. A porcentagem de células vivas po- sitivas que se ligam a PD-L1-Fc-Dextrâmeros foi avaliada por Geome- ans no canal RL1/APC e comparada ao controle negativo, ligação de Fc-Dex isolada. Com o uso de métricas avançadas em ForeCyt (pro- grama de software de processamento IntelliCyt), a população positiva de PD-L1 foi calculada como a % de população viva. A porcentagem específica de ligação de PD-L1 foi calculada da seguinte forma = (%positivo com mAb -%positivo com dextrâmero IgG1-Fc biotina) / (%positivo com controle de isótipo - %positivo com dextrâmero IgG1- Fc biotina) * 100. Os resultados finais são tabulados em Excel e repre- sentados graficamente em prisma mostrando a % de ligação de ligante PD-L1 na presença de mMb de anti-PD-1. Exemplo 13. Anticorpos agonísticos PD-1 são eficazes em um modelo de camundongo de doença de enxerto contra hospedeiro (GvHD)
[0552] Para Estudar o efeito dos mAbs agonistas de PD-1 sobre células T patogênicas in vivo, um modelo xenogênico de doença de enxerto contra hospedeiro (Xeno-GvHD) foi desenvolvido mediante transferência adotiva de células mononucleares do sangue periférico
(PBMCs) humanas em camundongos imunocomprometidos NOD-scid IL-2RγNull (NSG). Camundongos NSG fêmeas (7 a 9 semanas de ida- de) foram obtidos junto à Jackson Labs. Os camundongos foram colo- cados em quarentena nas gaiolas durante uma semana antes do uso. As PBMCs humanas congeladas isoladas do creme leucocitário foram obtidas junto à AllCells, Alameda, CA, EUA. Antes da injeção, as célu- las congeladas foram rapidamente descongeladas a 37°C em banho de água e lavadas 3 vezes em solução salina tamponada com dosfato estéril (PBS) por centrifugação a 500 g durante 5 min à temperatura ambiente. As células foram suspensas em PBS frio para obter uma concentração celular final de 50 x106/mL.
[0553] Os Animais foram randomizados por peso corporal e dividi- dos em vários grupos de tratamento (N=10/grupo). Após a randomiza- ção, os camundongos conscientes e com movimento livre receberam corporal total de irradiação 100 Rad (1 Gy) com o uso de Gammacell® 3000 Elan Irradiator (9,72 Gy/minuto). Os camundongos foram coloca- dos de volta em suas gaiolas.
[0554] Cada camundongo recebeu 25 x 106 PBMCs humanas em um volume de 500 µl intraperitoneal. Os escores clínicos e o peso cor- poral de cada animal foram registrados diariamente de acordo com a Tabela 31. Os camundongos que perderam ≥ 20% do seu peso corpo- ral foram sacrificados e seus escores clínicos no ponto final foram ano- tados, de acordo com as diretrizes institucionais do IACUC. Todos os animais foram sacrificados no dia 21. Os baços foram coletados para análise de FACS. O tecido da pele e do cólon foi coletado para análi- ses histológicas. Tabela 31. Descrição Escore clínico Alerta normal e reativo 0 Pelos arrepiados, atividade diminuída, descarga ocular 1
Postura reclinada, hipotermia ou hipertermia modera- 2 da, respiração ofegante durante a punção Respiração ofegante durante o repouso, ataxia, tre- 3 mor, hipotermia ou hipertermia Perda de capacidade de transitar com punção suave, 4 inconsciente Morte 5
[0555] Os camundongos foram injetados intraperitoneal com 10 mg/kg de mAbs de PD1B505, PD1B506, PD1B849 e PD1B878 que foram clonados como anticorpos quiméricos de mIgG2a, e também como mAb antagonista de PD-1 (PD1B786 em Fc silente de atuador de camundongo), em regime de Q4d/Q3d (dosagem nos dias 0, 4, 7, 11, 14 e 18). CTLA 4-Ig, usada como um controle, foi dosada em um regime de dosagem de Q3d (dia 0, 3, 6, 9, 12, 15 e 18) de 10 mg/kg intraperitoneal.
[0556] No término do estudo, os baços foram removidos ao meio RPMI1640 frio. Após esmagamento dos baços através de um filtro de 70 µM e peletização das células por centrifugação a 1200 rpm durante 5 minutos a 4°C, os eritrócitos foram lisados em tampão de lise ACK (Lonza) em gelo durante 5 minutos, e lavados múltiplas vezes em tampão FACS (PBS/0,5% BSA/2 mM EDTA). A viabilidade dos esple- nócitos foi avaliada por coloração de células com o corante de viabili- dade ef506 (eBioscience) de acordo com as instruções do fabricante. Os esplenócitos foram incubados com bloco Fc humano e camundon- go (BD Biosciences) durante 15 minutos em gelo e então corados com concentrações ótimas de mAbs conjugados com fluorocromo 1x10 6 células em 100 µl em placas de microtitulação com formato de U a 4°C durante 30 minutos, e fixados com tampão de fixação (BD Bioscien- ces). A contagem de microesferas de Brite (Thermofisher) foi adicio- nada a cada amostra. Controles de QBO (fluorescência de menos um)
foram preparados como controles negativos para cada fluorocromo. As amostras foram analisadas em um instrumento LSRll (BD Bioscien- ces). Os seguintes mAbs foram usados para a análise de células T re- gulatórias, anti-hCD45 peridinina-clorofila-alfa-proteína (PCP, clone 2D1), anti-FoxP3 aloficocianina (APC, clone pCH101), anti-hCD3 alofi- cocianina-cianina 7 (APC-Cy7, clone HIT3a), anti-hCD4 violeta brilha- ten 605 (BV605, clone OKT4), e anti-hCD25 violeta brilhante 650 (BV650, clone M-A251). As células T regulatórias foram definidas co- mo hCD45+ hCD3+ hCD4+, Foxp3+ CD25+.
[0557] A Figura 13A mostra que o tratamento com PD1B505- mIgG2a e PD1B506-mIgG2a impediu o desenvolvimento da doença no modelo de camundongo de GvHD. A Figura 13B mostra que o trata- mento com PD1B849-mIgG2a e PD1B878-mIgG2a impediu a perda de peso no modelo de camundongo de GvHD. A Figura 14B mostra que o tratamento com PD1B849-mIgG2a e PD1B878-mIgG2a impediu o de- senvolvimento da doença no modelo de camundongo de GvHD. A Fi- gura 14B mostra que o tratamento com PD1B849-mIgG2a e PD1B878-mIgG2a impediu a perda de peso no modelo de camundon- go de GvHD. A inibição da perda de peso e o escore clínico foram as- sociados com um aumento em células T regulatórias no baço. A Figura 15 mostra a frequência de Treg no baço dos animais tratados com PD1B849-mIgG2a ou PD1B878-mIgG2a. Exemplo 14. Anticorpos agonísticos de PD-1 esgotaram as células T auxiliares foliculares (TFH) e células T auxiliares periféricas (TPH)
[0558] PBMCs humanas foram recuperadas de cryostorage de ni- trogênio líquido e descongeladas rapidamente em banho de água a 37°C até estarem descongeladas. Os conteúdos do frasco foram trans- feridos para um tubo cônico de 50 mL estéril (tubos separados para cada doador usado) e meio RPMI completo (10% FBS, 1x penicili- na/estreptomicina, 1x piruvato de sódio) foi adicionado a cada tubo por gotejamento a um volume total de 15 mL. As células foram centrifuga- das a 250 xg durante 10 minutos à temperatura ambiente, a seguir o sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspensas em 5 a 10 mL de meio completo e contadas com o uso de exclusão com azul de tripano. As células foram ressuspensas a 2,5x106 células/mL e pla- queadas a 2,5x105 células/poço (=100 µl/poço) em triplicate em uma placa de poliesterino estéril de fundo em U de 96 poços. Os mAbs de PD-1 ou controle de isótipo de IgG1 humana foram diluídos para con- centrações finais 4x e 50 µL/poço foram adicionados aos poços ade- quados. Após a adição dos anticorpos, soro humano normal foi adicio- nado a uma concentração final de 5%. O volume total em cada poço foi dei 200 µL e as células foram incubadas durante 96 horas a 37°C, 5% de CO2. Em adição às amostras, vários poços de células extra go- ram colocadas em placas, receberam 5% de soro humano, e foram incubados juntamente com as amostras tratadas para serem usados como controles de coloração por citometria de fluxo.
[0559] Após a incubação, as placas foram centrifugadas a 350xg e os sobrenadantes foram evacuados. As células foram ressuspensas em 200 µL de PBS e poços réplicas foram agrupados então transferi- dos para uma nova placa de fundo em U de 96 poços para coloração por citometria de fluxo. As células foram centrifugadas a 350xg acumu- lada durante 5 minutos, os sobrenadantes evacuado e um coquetel de anticorpos fluorescente foi adicionado a cada poço de amostra (a tabe- la abaixo para mostra os anticorpos usados). Células adicionais salvas para controles foram coradas com coquetéis FMO para marcadores críticos, como PD-1, CXCR5, ICOS, entre outros, a serem usados na análise para definir as portas. As células foram coradas por 25 min no escuro à temperatura ambiente e então centrifugadas a 350xg durante 5 minutos. As células foram lavadas duas vezes em 200 µL de PBS, então 100 µl de 4% de paraformaldeído foi adicionado a cada poço para fixar as células. As células foram fixadas durante 10 minutos no escuro a 4°C então lavadas uma vez com PBS+1% de BSA antes de serem ressuspensas em 200 µL de PBS+1% de BSA. A contagem de microesferas (Invitrogem) foi adicionada a 5 µL/poço/(5.000 esferas) para cada amostra antes da aquisição de amostras no citômetro de fluxo BD LSRII. Os dados de citometria de fluxo foram analisados com o uso do software FlowJo. As contagens das amostras foram normali- zadas às contagens das esferas da seguinte maneira: # células na amostra = (# células contadas*5.000 microesferas adicionadas)/(# mi- croesferas contadas). As amostras foram normalizadas parao controle de isótipo huIgG1 como: (contagens de células normalizadas por mi- croesfera "amostra"/contagem de células normalizadas por microesfe- ra "isótipo")*100 e representadas como uma porcentagem (%). Os da- dos foram analisados com o uso de GraphPad Prism v7.
[0560] Durante a análise, as seguintes populações de células fo- ram descritas: Auxiliares foliculares T (Tfh): vivas, CD19-CD56- /CD4+CD45RO+/HLADR+/CXCR5+/ICOS+PD1+; Auxiliares periféricas (Tph): vivas, CD19-CD56- /CD4+CD45RO+/HLADR+/CXCR5-/ICOS+PD1+; Combinação da população Tfh/Tph: vivas, CD19-CD56- /CD4+CD45RO+/HLADR+/ICOS+PD1+.
[0561] A Figura 16 mostra a curva de resposta à dosagem de de- pleção mediada por anticorpos da população de THF/TPH combinada por PD1B878, PD1B878-FL (fucose baixa), PD1B1090 e PD1B1094. Os dados foram representados como a média de alteração % no nú- mero de células TFH/TPH do controle de isótipo com o uso de doadores humanos saudáveis n=8 (n=7 para PD1B1090). Os PD1B878-FL fo- ram mais eficazes em esgotar a população de TFH/TPH.

Claims (110)

REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou fragmento ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender uma região determinante de complementaridade de ca- deia pesada 1 (HCDR), uma HCDR2, uma HCDR3, uma região deter- minante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 165, 4, 166, 6 e 7, respecti- vamente.
2. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mes- mo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o an- ticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ter uma, du- as, três, quatro ou cinco das seguintes propriedades: a) não bloqueia a ligação de PD-L1 a PD-1; sendo que a falta de bloqueio é medida pela incapacidade do anticorpo de inibir o agrupamento de células que expressam PD-L1 e que expressam PD-1 como descrito no Exemplo 1; b) se liga a PD-1 com uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) de cerca de 5x10-8 M ou menos, sendo que a KD é me- dida com o uso de um sistema ProteOn XPR36 a +25°C; c) se liga a PD-1 com uma associação constante (ka) de cerca de 3x104 1/Ms ou mais, sendo que a ka é medida com o uso de um sistema de ProteOn XPR36 C a +25°C; d) se liga PD-1 com uma constante de dissociação (kd) de cerca de 3x10-3 1/s ou menos, sendo que a kd é medida com o uso de um sistema ProteOn XPR36 a +25°C; ou e) inibe a proliferação de células T específicas de antíge- no; sendo que a proliferação é avaliada em um ensaio de CMV-PBMC como descrito no Exemplo 1.
3. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mes-
mo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de compreender: a) um framework da região variável de cadeia pesada (VH) derivado de IGHV7-4-1*1 (SEQ ID Nº: 125); b) um framework da região variável de cadeia leve (VL) derivado de IGKV3D-20*1 (SEQ ID Nº: 126); ou c) o framework da VH derivado de IGHV7-4-1*1 (SEQ ID Nº: 125) e o framework da VL derivado de IGKV3D-20*1 (SEQ ID Nº: 126).
4. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mes- mo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracteri- zado pelo fato de compreender a HCDR2 das SEQ ID Nºs: 3, 145, 146 ou 147 e/ou a LCDR1 das SEQ ID Nºs: 5, 148 ou 149.
5. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mes- mo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracteri- zado pelo fato de compreender a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das a) SEQ ID Nºs: 2, 3, 4, 5, 6 e 7, respectivamente; b) SEQ ID Nºs: 2, 145, 4, 5, 6 e 7, respectivamente; c) SEQ ID Nºs: 2, 146, 4, 5, 6 e 7, respectivamente; d) SEQ ID Nºs: 2, 147, 4, 5, 6 e 7, respectivamente; e) SEQ ID Nºs: 2, 3, 4, 148, 6 e 7, respectivamente; f) SEQ ID Nºs: 2, 3, 4, 149, 6 e 7, respectivamente; g) SEQ ID Nºs: 2, 145, 4, 148, 6 e 7, respectivamente; h) SEQ ID Nºs: 2, 146, 4, 148, 6 e 7, respectivamente; i) SEQ ID Nºs: 2, 147, 4, 148, 6 e 7, respectivamente; j) SEQ ID Nºs: 2, 145, 4, 149, 6 e 7, respectivamente; k) SEQ ID Nºs: 2, 146, 4, 149, 6 e 7, respectivamente; ou l) SEQ ID Nºs: 2, 147, 4, 149, 6 e 7, respectivamente.
6. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mes-
mo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracteri- zado pelo fato de compreender: a) uma região variável de cadeia pesada (VH) da SEQ ID Nº: 118; b) uma região variável de cadeia leve (VL) da SEQ ID Nº: 119; ou c) a VH e a VL das SEQ ID Nºs: 118 e 119, respectiva- mente.
7. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mes- mo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracteri- zado pelo fato de compreender: a) a VH das SEQ ID Nºs: 8, 9, 10, 140, 141 ou 142; b) a VL das SEQ ID Nºs: 14, 15, 16, 143 ou 144; c) a VH da SEQ ID Nº: 8 e a VL da SEQ ID Nº: 14; d) a VH da SEQ ID Nº: 9 e a VL da SEQ ID Nº: 15; e) a VH da SEQ ID Nº: 9 e a VL da SEQ ID Nº: 16; f) a VH da SEQ ID Nº: 10 e a VL da SEQ ID Nº: 16; g) a VH da SEQ ID Nº: 140 e a VL da SEQ ID Nº: 16; h) a VH da SEQ ID Nº: 141 e a VL da SEQ ID Nº: 16; i) a VH da SEQ ID Nº: 142 e a VL da SEQ ID Nº: 16; j) a VH da SEQ ID Nº: 10 e a VL da SEQ ID Nº: 143; k) a VH da SEQ ID Nº: 10 e a VL da SEQ ID Nº: 144; l) a VH da SEQ ID Nº: 140 e a VL da SEQ ID Nº: 143; m) a VH da SEQ ID Nº: 141 e a VL da SEQ ID Nº: 143; n) a VH da SEQ ID Nº: 142 e a VL da SEQ ID Nº: 143; o) a VH da SEQ ID Nº: 140 e a VL da SEQ ID Nº: 144; p) a VH da SEQ ID Nº: 141 e a VL da SEQ ID Nº: 144; ou q) a VH da SEQ ID Nº: 142 e a VL da SEQ ID Nº: 144.
8. Anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com- petir pela ligação a PD-1 com o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido na reivindicação 7.
9. Anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender a) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 3, 4, 5, 6 e 7, respectivamente; b) a VL das SEQ ID Nºs: 8, 9 ou 10 e a VL das SEQ ID Nºs: 14, 15 ou 16; e/ou c) uma cadeia pesada (HC) da SEQ ID Nº: 20, 21 ou 22 e uma cadeia leve (LC) das SEQ ID Nºs: 26, 27 ou 28.
10. Anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender a) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 145, 4, 5, 6 e 7, respectivamente; b) a VH da SEQ ID Nº: 140 e a VL da SEQ ID Nº: 16; e/ou c) a HC da SEQ ID Nº: 150 e a LC da SEQ ID Nº: 28.
11. Anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender a) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 146, 4, 5, 6 e 7, respectivamente; b) a VH da SEQ ID Nº: 141 e a VL da SEQ ID Nº: 16; e/ou c) a HC da SEQ ID Nº: 151 e a LC da SEQ ID Nº: 28.
12. Anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender a) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 147, 4, 5, 6 e 7, respectivamente; b) a VH da SEQ ID Nº: 142 e a VL da SEQ ID Nº: 16; e/ou c) a HC da SEQ ID Nº: 152 e a LC da SEQ ID Nº: 28.
13. Anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender a) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 3, 4, 148, 6 e 7, respectivamente; b) a VH da SEQ ID Nº: 10 e a VL da SEQ ID Nº: 143; e/ou c) a HC da SEQ ID Nº: 22 e a LC da SEQ ID Nº: 153.
14. Anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender a) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 3, 4, 149, 6 e 7, respectivamente; b) a VH da SEQ ID Nº: 10 e a VL da SEQ ID Nº: 144; e/ou c) a HC da SEQ ID Nº: 22 e a LC da SEQ ID Nº: 154.
15. Anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender a) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 145, 4, 148, 6 e 7, respectivamente; b) a VH da SEQ ID Nº: 140 e a VL da SEQ ID Nº: 143; e/ou c) a HC da SEQ ID Nº: 150 e a LC da SEQ ID Nº: 153.
16. Anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender a) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 146, 4, 148, 6 e 7, respectivamente; b) a VH da SEQ ID Nº: 141 e a VL da SEQ ID Nº: 143; e/ou c) a HC da SEQ ID Nº: 151 e a LC da SEQ ID Nº: 153.
17. Anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender a) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 147, 4, 148, 6 e 7, respectivamente; b) a VH da SEQ ID Nº: 142 e a VL da SEQ ID Nº: 143; e/ou c) a HC da SEQ ID Nº: 152 e a LC da SEQ ID Nº: 153.
18. Anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender a) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 145, 4, 149, 6 e 7, respectivamente; b) a VH da SEQ ID Nº: 140 e a VL da SEQ ID Nº: 144; e/ou c) a HC da SEQ ID Nº: 150 e a LC da SEQ ID Nº: 154.
19. Anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender a) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 146, 4, 149, 6 e 7, respectivamente;
b) a VH da SEQ ID Nº: 141 e a VL da SEQ ID Nº: 144; e/ou c) a HC da SEQ ID Nº: 151 e a LC da SEQ ID Nº: 154.
20. Anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender a) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 2, 147, 4, 149, 6 e 7, respectivamente. b) a VH da SEQ ID Nº: 142 e a VL da SEQ ID Nº: 144; e/ou c) a HC da SEQ ID Nº: 152 e a LC da SEQ ID Nº: 154.
21. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, ca- racterizado pelo fato de o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo ser um agonista de PD-1 ou por mediar a citotoxicida- de celular dependente de anticorpo (ADCC) de células que expressam PD-1, ou ambos.
22. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de as células que expressam PD-1 serem células T de memória ativada, células T auxiliares foliculares (TFH) ou células auxiliares periféricas (TPH), ou qualquer combinação das mesmas.
23. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, ca- racterizado pelo fato de o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo ser um isotipo IgG1, um isotipo IgG2, e um isotipo IgG3 ou um isotipo IgG4.
24. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, ca- racterizado pelo fato de o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antí-
geno do mesmo compreender ao menos uma mutação no anticorpo Fc que modula a ligação do anticorpo a um receptor Fc (FcR).
25. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de a ao menos uma mutação ser: a) uma mutação S267E; b) uma mutação S267D; c) uma mutação S267E/I332E; d) uma mutação S267E/L328F; e) uma mutação G236D/S267E; f) uma mutação P238D; ou g) uma mutação P238D/E233D/G237D/H268D/P271G/A330R.
26. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, carac- terizado pelo fato de o anticorpo compreender: a) uma cadeia pesada (HC) das SEQ ID Nºs: 20, 21, 22, 150, 151 ou 152; b) uma cadeia leve (LC) das SEQ ID Nºs: 26, 27, 28, 153 ou 154; c) a HC das SEQ ID Nºs: 20, 21, 22, 150, 151 ou 152 e a LC das SEQ ID Nºs: 26, 27, 28, 153 ou 154; d) a HC da SEQ ID Nº: 20 e a LC da SEQ ID Nº: 26; e) a HC da SEQ ID Nº: 21 e a LC da SEQ ID Nº: 27; f) a HC da SEQ ID Nº: 21 e a LC da SEQ ID Nº: 28; g) a HC da SEQ ID Nº: 22 e a LC da SEQ ID Nº: 28; h) a HC da SEQ ID Nº: 150 e a LC da SEQ ID Nº: 28; i) a HC da SEQ ID Nº: 151 e a LC da SEQ ID Nº: 28; j) a HC da SEQ ID Nº: 152 e a LC da SEQ ID Nº: 28; k) a HC da SEQ ID Nº: 22 e a LC da SEQ ID Nº: 153; l) a HC da SEQ ID Nº: 22 e a LC da SEQ ID Nº: 154;
m) a HC da SEQ ID Nº: 150 e a LC da SEQ ID Nº: 153; n) o HC da SEQ ID Nº: 151 e a LC da SEQ ID Nº: 153; o) a HC da SEQ ID Nº: 152 e a LC da SEQ ID Nº: 153; p) a HC da SEQ ID Nº: 150 e a LC da SEQ ID Nº: 154; q) s HC da SEQ ID Nº: 151 e a LC da SEQ ID Nº: 154; ou r) a HC da SEQ ID Nº: 152 e a LC da SEQ ID Nº: 154.
27. Anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de a VH do anticorpo e a VL do anticorpo ou a HC do anticorpo e a LC do anticorpo serem codificadas por um polinucleotídeo que com- preende a sequência de polinucleotídeo de: a) SEQ ID Nºs: 11 e 17, respectivamente; b) SEQ ID Nºs: 12 e 18, respectivamente; c) SEQ ID Nºs: 12 e 19, respectivamente; d) SEQ ID Nºs: 13 e 19, respectivamente; e) SEQ ID Nºs: 23 e 29, respectivamente; f) SEQ ID Nºs: 24 e 30, respectivamente; g) SEQ ID Nºs: 24 e 31, respectivamente; h) SEQ ID Nºs: 25 e 31, respectivamente; i) SEQ ID Nºs: 132 e 133, respectivamente; j) SEQ ID Nºs: 134 e 135, respectivamente; k) SEQ ID Nºs: 155 e 19, respectivamente; l) SEQ ID Nºs: 156 e 19, respectivamente; m) SEQ ID Nºs: 157 e 19, respectivamente; n) SEQ ID Nºs: 13 e 158, respectivamente; o) SEQ ID Nºs: 13 e 159, respectivamente; p) SEQ ID Nºs: 155 e 158, respectivamente; q) SEQ ID Nºs: 156 e 158, respectivamente; r) SEQ ID Nºs: 157 e 158, respectivamente; s) SEQ ID Nºs: 155 e 159, respectivamente;
t) SEQ ID Nºs: 156 e 159, respectivamente; u) SEQ ID Nºs: 157 e 159, respectivamente; v) SEQ ID Nºs: 160 e 31, respectivamente; w) SEQ ID Nºs: 161 e 31, respectivamente; x) SEQ ID Nºs: 162 e 31, respectivamente; y) SEQ ID Nºs: 25 e 163, respectivamente; z) SEQ ID Nºs: 25 e 164, respectivamente; aa) SEQ ID Nºs: 160 e 163, respectivamente; bb) SEQ ID Nºs: 161 e 163, respectivamente; cc) SEQ ID Nºs: 162 e 163, respectivamente; dd) SEQ ID Nºs: 160 e 164, respectivamente; ee) SEQ ID Nºs: 161 e 164, respectivamente; ou ff) SEQ ID Nºs: 162 e 164, respectivamente.
28. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, ca- racterizado pelo fato de o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo ter uma estrutura de glicano biantenária com um teor de fucose de cerca de entre 1% e cerca de 15%.
29. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de a) codificar a VH das SEQ ID Nºs: 118, 8, 9, 10, 140, 141 ou 142; b) codificar a VL das SEQ ID Nºs: 119, 14, 15, 16, 143 ou 144; c) codificar a VH das SEQ ID Nºs: 118, 8, 9, 10, 140, 141 ou 142, e a VL das SEQ ID Nºs: 119, 14, 15, 16, 143 ou 144; d) codificar a HC das SEQ ID Nºs: 20, 21, 22, 150, 151 ou 152; e) codificar a LC das SEQ ID Nºs: 26, 27, 28, 153 ou 154; f) codificar a HC das SEQ ID Nºs: 20, 21, 22, 150, 151 ou 152 e a LC das SEQ ID Nºs: 26, 27, 28, 153 ou 154; ou g) compreender a sequência de polinucleotídeo das SEQ ID Nºs: 11, 12, 13, 17, 18, 19, 23, 24, 25, 29, 30, 31, 132, 133, 134, 135, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163 ou 164.
30. Vetor caracterizado pelo fato de compreender ao menos um polinucleotídeo como definido na reivindicação 29.
31. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de compre- ender o vetor como definido na reivindicação 30.
32. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de a célula hospedeira ser uma célula eucarió- tica, uma célula procariótica, uma célula CHO, uma célula HEK293 ou um hibridoma.
33. Método de produção do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de compreender cultivar a célula hospedeira, como definida na reivindicação 31, em condições nas quais o anticorpo é expresso, e isolar o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
34. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28.
35. Kit, caracterizado pelo fato de compreender o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28.
36. Método de supressão da ativação de uma célula T que expressa PD-1 em um indivíduo, caracterizado pelo fato de compreen- der administrar a um indivíduo o anticorpo isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28, por um tempo suficiente para suprimir a ativação da célula T que expressa PD-1.
37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracteriza-
do pelo fato de a célula T que expressa PD-1 ser uma célula T CD4+ específica de antígeno e/ou uma célula T CD8+ específica de antígeno.
38. Método de modulação negativa de uma resposta imuno- lógica, caracterizado pelo fato de compreender administrar a um indi- víduo que precisa do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mes- mo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28, para modular negativamente a resposta imunológica.
39. Método de tratamento de um distúrbio imunológico, ca- racterizado pelo fato de compreender administrar a um indivíduo que precisa do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anti- corpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, co- mo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28, para tratar o distúrbio imunológico.
40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracteriza- do pelo fato de o distúrbio imunológico ser lúpus, lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de Sjogren, artrite, artrite reumatoide, asma, DPOC, doença inflamatória pélvica, doença de Alzheimer, doença in- flamatória intestinal, doença de Crohn, colite ulcerativa, doença de Peyronie, doença celíaca, doença da vesícula biliar, doença pilonidal, peritonite, psoríase, artrite psoriática, vasculite, adesões cirúrgicas, acidente vascular cerebral, diabetes tipo I, doença de Lyme, meningo- encefalite, uveíte autoimune, esclerose múltipla, síndrome de Guillain de Barr, dermatite atópica, hepatite autoimune, fibrosante alveolite, doença de Grave, nefropatia IgA, púrpura trombocitopênica idiopática, doença de Ménière, pênfigo, cirrose biliar primária, sarcoidose, escle- rodermia, granulomatose de Wegener, outras doenças autoimunes, pancreatite, traumas (cirurgia), doença de enxerto versus hospedeiro, rejeição de transplante, doença cardíaca incluindo doenças isquêmi- cas como enfarte do miocárdio bem como ateroesclerose, coagulação intravascular, reabsorção óssea, osteoporose, osteoartrite, periodontite e hipocloridria, infertilidade relacionada com a falta de tolerância ma- terna ao feto, síndrome de Sjogren, vitiligo, miastenia gravis ou escle- rose sistêmica.
41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 36 a 40, caracterizado pelo fato de o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ser administrado em combinação com um segundo agente terapêutico.
42. Anticorpo anti-idiotípico, caracterizado pelo fato de se ligar especificamente ao anticorpo ou ao fragmento de ligação ao antí- geno como definido na reivindicação 7.
43. Imunoconjugado caracterizado pelo fato de compreen- der o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28, conjugado a uma molécu- la heteróloga.
44. Anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de uma região determinante de complementaridade de cadeia pe- sada 1 (HCDR1), uma HCDR2, uma HCDR3, uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID Nºs: 32, 124, 40, 41, 42 e 43, respectivamente.
45. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ter uma, duas, três, quatro ou cinco das seguintes propriedades: a) bloqueia a ligação de PD-L1 ao PD-1, sendo que a fal- ta de bloqueio é medida pela incapacidade do anticorpo de inibir o agrupamento de células que expressam PD-L1 e que expressam PD-1 como descrito no Exemplo 1; b) se liga a PD-1 com uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) de cerca de 5x10-8 M ou menos, sendo que a KD é me- dida com o uso de um sistema ProteOn XPR36 a +25°C; c) se liga a PD-1 com uma associação constante (ka) de cerca de 4x105 1/Ms ou mais, sendo que a ka é medida com o uso de um sistema de ProteOn XPR36 C a +25°C; d) se liga a PD-1 com uma constante de dissociação de -2 cerca de 1x10 (seringa kd) 1/s ou menos, sendo que a seringa kd é medida usando um sistema de ProteOn XPR36 C a +25°C; ou e) inibe a proliferação de células T específicas de antíge- no; sendo que a proliferação é avaliada em um ensaio de CMV-PBMC como descrito no Exemplo 1.
46. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 44 ou 45, caracterizado pelo fato de: a) um framework da região variável de cadeia pesada (VH) derivado de IGHV1-2*02 (SEQ ID Nº: 127); b) um framework da região variável de cadeia leve (VL) derivado de IGKV1D-16*1 (SEQ ID Nº: 128); ou c) e o framework da VL derivado de IGHV1-2*02 (SEQ ID Nº: 127) e o framework da VL derivado de IGKV1D-16*1 (SEQ ID Nº: 128).
47. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 46, ca- racterizado pelo fato de compreender a HCDR2 das SEQ ID Nºs: 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39.
48. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 47, ca- racterizado pelo fato de compreender a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das a) SEQ ID Nºs: 32, 33, 40, 41, 42 e 43, respectivamente;
b) SEQ ID Nºs: 32, 34, 40, 41, 42 e 43, respectivamente; c) SEQ ID Nºs: 32, 35, 40, 41, 42 e 43, respectivamente; d) SEQ ID Nºs: 32, 36, 40, 41, 42 e 43, respectivamente; e) SEQ ID Nºs: 32, 37, 40, 41, 42 e 43, respectivamente; f) SEQ ID Nºs: 32, 38, 40, 41, 42 e 43, respectivamente; ou g) SEQ ID Nºs: 32, 39, 40, 41, 42 e 43, respectivamente.
49. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 48, ca- racterizado pelo fato de compreender a) uma região variável de cadeia pesada (VH) da SEQ ID Nº: 120; b) uma região variável de cadeia leve (VL) da SEQ ID Nº: 121; ou c) a VH e a VL das SEQ ID Nºs: 120 e 121, respectiva- mente.
50. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 49, ca- racterizado pelo fato de compreender: a) a VH das SEQ ID Nºs: 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ou 51; b) a VL das SEQ ID Nºs: 60, 61 ou 62; c) a VH das SEQ ID Nºs: 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ou 51 e a VL das SEQ ID Nºs: 60, 61 ou 62; d) a VH da SEQ ID Nº: 44 e a VL da SEQ ID Nº: 60; e) a VH da SEQ ID Nº: 45 e a VL da SEQ ID Nº: 61; f) a VH da SEQ ID Nº: 45 e a VL da SEQ ID Nº: 62; g) a VH da SEQ ID Nº: 46 e a VL da SEQ ID Nº: 61; h) a VH da SEQ ID Nº: 47 e a VL da SEQ ID Nº: 61; i) a VH da SEQ ID Nº: 48 e a VL da SEQ ID Nº: 61; j) a VH da SEQ ID Nº: 49 e a VL da SEQ ID Nº: 61;
k) a VH da SEQ ID Nº: 50 e a VL da SEQ ID Nº: 61; ou l) a VH da SEQ ID Nº: 51 e a VL da SEQ ID Nº: 61.
51. Anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo competir pela ligação a PD-1 com o anticorpo ou o fragmento de liga- ção ao antígeno do mesmo como definido na reivindicação 50.
52. Anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender a) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: SEQ ID Nºs: 32, 33, 40, 41, 42 e 43, respec- tivamente; b) a VL das SEQ ID Nºs: 44 ou 45 e a VL das SEQ ID Nºs: 60, 61 ou 62; e/ou c) a HC das SEQ ID Nºs: 66 ou 67 e a LC das SEQ ID Nºs: 82, 83 ou 84.
53. Anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender a) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 32, 34, 40, 41, 42 e 43, respectivamente; b) a VH da SEQ ID Nº: 46 e a VL da SEQ ID Nº: 61; e/ou c) a HC da SEQ ID Nº: 68 e a LC da SEQ ID Nº: 83.
54. Anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender a) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 32, 35, 40, 41, 42 e 43, respectivamente; b) a VH da SEQ ID Nº: 47 e a VL da SEQ ID Nº: 61; e/ou c) a HC da SEQ ID Nº: 69 e a LC da SEQ ID Nº: 83.
55. Anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender a) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 32, 36, 40, 41, 42 e 43, respectivamente; b) a VH da SEQ ID Nº: 48 e a VL da SEQ ID Nº: 61; e/ou c) a HC da SEQ ID Nº: 70 e a LC da SEQ ID Nº: 83.
56. Anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender a) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 32, 37, 40, 41, 42 e 43, respectivamente; b) a VH da SEQ ID Nº: 49 e a VL da SEQ ID Nº: 61; e/ou c) a HC da SEQ ID Nº: 71 e a LC da SEQ ID Nº: 83.
57. Anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender a) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 32, 38, 40, 41, 42 e 43, respectivamente; b) a VH da SEQ ID Nº: 50 e a VL da SEQ ID Nº: 61; e/ou c) a HC da SEQ ID Nº: 72 e a LC da SEQ ID Nº: 83.
58. Anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender a) a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID Nºs: 32, 39, 40, 41, 42 e 43, respectivamente; b) a VH da SEQ ID Nº: 51 e a VL da SEQ ID Nº: 61; e/ou c) a HC da SEQ ID Nº: 73 e a LC da SEQ ID Nº: 83.
59. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 58, ca- racterizado pelo fato de o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo ser um agonista de PD-1 ou por mediar a citotoxicida- de celular dependente de anticorpo (ADCC) de células que expressam PD-1, ou ambos.
60. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de as células que expressam PD-1 serem células T de memória ativada, células T auxiliares foliculares (TFH) ou células auxiliares periféricas (TPH), ou qualquer combinação das mesmas.
61. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 60, ca- racterizado pelo fato de o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo ser um isotipo IgG1, um isotipo IgG2, e um isotipo IgG3 ou um isotipo IgG4.
62. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 61, ca- racterizado pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende ao menos uma mutação no anticorpo Fc que modula a ligação do anticorpo a um receptor Fc (FcR).
63. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de a ao menos uma mutação ser: a) uma mutação S267E; b) uma mutação S267D; c) uma mutação S267E/I332E; d) uma mutação S267E/L328F; e) uma mutação G236D/S267E; f) uma mutação P238D; ou g) uma mutação P238D/E233D/G237D/H268D/P271G/A330R.
64. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 50, ca- racterizado pelo fato de o anticorpo compreender: a) uma cadeia pesada (HC) das SEQ ID Nºs: 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 ou 73; b) uma cadeia leve (LC) das SEQ ID Nºs: 82, 83 ou 84; c) a HC das SEQ ID Nºs: 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 ou 73 e a LC das SEQ ID Nºs: 82, 83 ou 84; d) a HC da SEQ ID Nº: 66 e a LC da SEQ ID Nº: 82; i) a HC da SEQ ID Nº: 67 e a LC da SEQ ID Nº: 83; e) a HC da SEQ ID Nº: 67 e a LC da SEQ ID Nº: 84; f) a HC da SEQ ID Nº: 68 e a LC da SEQ ID Nº: 83; g) a HC da SEQ ID Nº: 69 e a LC da SEQ ID Nº: 83; h) a HC da SEQ ID Nº: 70 e a LC da SEQ ID Nº: 83; i) a HC da SEQ ID Nº: 71 e a LC da SEQ ID Nº: 83; j) a HC da SEQ ID Nº: 72 e a LC da SEQ ID Nº: 83; ou k) a HC da SEQ ID Nº: 73 e a LC da SEQ ID Nº: 83.
65. Anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especifi- camente a PD-1, caracterizado pelo fato de a VH do anticorpo e a VL do anticorpo ou a HC do anticorpo e a LC do anticorpo serem codifica- das por um polinucleotídeo que compreende a sequência de polinu- cleotídeo de: a) SEQ ID Nºs: 52 e 63, respectivamente; b) SEQ ID Nºs: 53 e 64, respectivamente; c) SEQ ID Nºs: 53 e 65, respectivamente; d) SEQ ID Nºs: 54 e 64, respectivamente; e) SEQ ID Nºs: 55 e 64, respectivamente; f) SEQ ID Nºs: 56 e 64, respectivamente; g) SEQ ID Nºs: 57 e 64, respectivamente;
h) SEQ ID Nºs: 58 e 64, respectivamente; i) SEQ ID Nºs: 59 e 64, respectivamente; j) SEQ ID Nºs: 74 e 85, respectivamente; k) SEQ ID Nºs: 75 e 86, respectivamente; l) SEQ ID Nºs: 75 e 87, respectivamente; m) SEQ ID Nºs: 76 e 86, respectivamente; n) SEQ ID Nºs: 77 e 86, respectivamente; o) SEQ ID Nºs: 78 e 86, respectivamente; p) SEQ ID Nºs: 79 e 86, respectivamente; q) SEQ ID Nºs: 80 e 86, respectivamente; r) SEQ ID Nºs: 81 e 86, respectivamente; s) SEQ ID Nºs: 136 e 137, respectivamente; ou t) SEQ ID Nºs: 138 e 139, respectivamente.
66. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 65, ca- racterizado pelo fato de o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo ter uma estrutura de glicano biantenária com um teor de fucose de cerca de entre 1% e cerca de 15%.
67. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de a) codificar a VH das SEQ ID Nºs: 120, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ou 51; b) codificar a VL das SEQ ID Nºs: 121, 60, 61 ou 62; c) codificar a VH das SEQ ID Nºs: 120, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ou 51, e a VL das SEQ ID Nºs: 121, 60, 61 ou 62; d) codificar a HC das SEQ ID Nºs: 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 ou 73; e) codificar a LC das SEQ ID Nºs: 82, 83 ou 84; f) codificar a HC das SEQ ID Nºs: 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 ou 73 e a LC das SEQ ID Nºs: 82, 83 ou 84; ou g) compreender a sequência de polinucleotídeo das SEQ
ID Nºs: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 63, 64, 65, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 85, 86, 87, 136, 137, 138 ou 139.
68. Vetor, caracterizado pelo fato de compreender ao me- nos um polinucleotídeo como definido na reivindicação 67.
69. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de compre- ender o vetor como definido na reivindicação 68.
70. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 69, caracterizada pelo fato de a célula hospedeira ser uma célula eucarió- tica, uma célula procariótica, uma célula CHO, uma célula HEK293 ou um hibridoma.
71. Método de produção de um anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido na reivindicação 44, caracterizado pelo fato de compreender cultivar a célula hospedeira, como definido na reivindicação 69, em condições nas quais o anticor- po ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é expresso, e isolar o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
72. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 44 a 66.
73. Kit, caracterizado pelo fato de compreender o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 44 a 66.
74. Método de supressão da ativação de uma célula T que expressa PD-1 em um indivíduo, caracterizado pelo fato de compreen- der administrar ao indivíduo o anticorpo isolado ou o fragmento de li- gação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 44 a 46, por um tempo suficiente para suprimir a ativa- ção da célula T que expressa PD-1.
75. Método, de acordo com a reivindicação 74, caracteriza- do pelo fato de a célula T que expressa PD-1 ser uma célula T CD4+ específica de antígeno e/ou uma célula T CD8+ específica de antígeno.
76. Método de modulação negativa de uma resposta imuno- lógica, caracterizado pelo fato de compreender administrar a um indi- víduo que precisa do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mes- mo, como definido em qualquer uma das reivindicações 44 a 66, para modular negativamente a resposta imunológica.
77. Método de tratamento de um distúrbio imunológico, ca- racterizado pelo fato de compreender administrar a um indivíduo que precisa do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anti- corpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, co- mo definido em qualquer uma das reivindicações 44 a 66, para tratar o distúrbio imunológico.
78. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracteriza- do pelo fato de o distúrbio imunológico ser lúpus, lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de Sjogren, artrite, artrite reumatoide, asma, DPOC, doença inflamatória pélvica, doença de Alzheimer, doença in- flamatória intestinal, doença de Crohn, colite ulcerativa, doença de Peyronie, doença celíaca, doença da vesícula biliar, doença pilonidal, peritonite, psoríase, artrite psoriática, vasculite, adesões cirúrgicas, acidente vascular cerebral, diabetes tipo I, doença de Lyme, meningo- encefalite, uveíte autoimune, esclerose múltipla, síndrome de Guillain de Barr, dermatite atópica, hepatite autoimune, fibrosante alveolite, doença de Grave, nefropatia IgA, púrpura trombocitopênica idiopática, doença de Ménière, pênfigo, cirrose biliar primária, sarcoidose, escle- rodermia, granulomatose de Wegener, outras doenças autoimunes, pancreatite, traumas (cirurgia), doença de enxerto versus hospedeiro, rejeição de transplante, doença cardíaca incluindo doenças isquêmi- cas como enfarte do miocárdio bem como ateroesclerose, coagulação intravascular, reabsorção óssea, osteoporose, osteoartrite, periodontite e hipocloridria, infertilidade relacionada com a falta de tolerância ma- terna ao feto, síndrome de Sjogren, vitiligo, miastenia gravis ou escle- rose sistêmica.
79. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 74 a 78, caracterizado pelo fato de o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ser administrado em combinação com um segundo agente terapêutico.
80. Anticorpo anti-idiotípico caracterizado pelo fato de se li- gar ao anticorpo ou ao fragmento de ligação ao antígeno como defini- do em qualquer uma das reivindicações 52 a 58.
81. Imunoconjugado, caracterizado pelo fato de compreen- der o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, co- mo definido em qualquer uma das reivindicações 44 a 66, conjugado a um agente de imageamento ou a um agente citotóxico.
82. Anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou fragmento que se liga ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de uma região determinante de complementaridade de cadeia pe- sada 1 (HCDR1), uma HCDR2, uma HCDR3, uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID Nºs: 88, 89, 90, 91, 92 e 93, respectivamente.
83. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 82, pelo fato de o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo caracterizada não blo- quear a ligação de PD L1 a PD-1, sendo que a falta de bloqueio é me- dida pela incapacidade do anticorpo de inibir o agrupamento de células que expressam PD-L1 e que expressam PD-1, como descrito no Exemplo 1.
84. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de: a) um framework da região variável de cadeia pesada
(VH) derivado de IGHV2-5*04 (SEQ ID Nº: 129); b) um framework da região variável de cadeia leve (VL) derivado de IGKV2-28*01 (SEQ ID Nº: 130); ou c) o framework da VH derivado de IGHV2-5*04 (SEQ ID Nº: 129 e o framework da VL derivado de IGKV2-28*01 (SEQ ID Nº: 130).
85. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 82 a 84, ca- racterizado pelo fato de compreender a) uma região variável de cadeia pesada (VH) da SEQ ID Nº: 122; b) uma região variável de cadeia leve (VL) da SEQ ID Nº: 123; ou c) a VH e a VL das SEQ ID Nºs: 122 e 123, respectiva- mente.
86. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 82 a 85, ca- racterizado pelo fato de compreender a) a VH das SEQ ID Nºs: 94 ou 95; b) a VL das SEQ ID Nºs: 98, 99 ou 100; c) a VH das SEQ ID Nºs: 94 ou 95 e a VL das SEQ ID Nºs: 98, 99 ou 100; d) a VH da SEQ ID Nº: 94 e a VL da SEQ ID Nº: 98; e) a VH da SEQ ID Nº: 95 e a VL da SEQ ID Nº: 99; ou f) a VH da SEQ ID Nº: 95 e a VL da SEQ ID Nº: 100.
87. Anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de o anticorpo competir pela ligação a PD-1 com o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido na reivin- dicação 86.
88. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mes- mo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 82 a 87, ca- racterizado pelo fato de o anticorpo ser um anticorpo agonístico ou por mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) de células que expressam PD-1, ou ambos.
89. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fato de as células que expressam PD-1 serem células T de memória ativada, células T auxiliares foliculares (TFH) ou células auxiliares periféricas (TPH), ou qualquer combinação das mesmas.
90. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 82 a 89, ca- racterizado pelo fato de o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo ser um isotipo IgG1, um isotipo IgG2, e um isotipo IgG3 ou um isotipo IgG4.
91. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 82 a 90, ca- racterizado pelo fato de o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo compreender ao menos uma mutação no anticorpo Fc que modula a ligação do anticorpo a um receptor Fc.
92. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de a ao menos uma mutação ser: a) uma mutação S267E; b) uma mutação S267D; c) uma mutação S267E/I332E; d) uma mutação S267E/L328F; e) uma mutação G236D/S267E; f) uma mutação P238D; ou g) uma mutação P238D/E233D/G237D/H268D/P271G/A330R.
93. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 82 a 92, ca- racterizado pelo fato de compreender a) uma cadeia pesada (HC) das SEQ ID Nºs:104 ou 105; b) uma cadeia leve (LC) das SEQ ID Nºs: 108, 109 ou 110; c) a HC das SEQ ID Nºs: 104 ou 105 e a LC das SEQ ID Nºs: 108, 109 ou 110; d) a HC da SEQ ID Nº: 104 e a LC da SEQ ID Nº: 108; e) a HC da SEQ ID Nº: 105 e a LC da SEQ ID Nº: 109; ou f) a HC da SEQ ID Nº: 105 e a LC da SEQ ID Nº: 110.
94. Anticorpo isolado que se liga especificamente a PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de a VH do anticorpo e a VL do anticorpo ou a HC do anticorpo e a LC do anticorpo serem codificadas por um polinucleotídeo que com- preende a sequência de polinucleotídeo de: a) SEQ ID Nºs: 96 e 101, respectivamente; b) SEQ ID Nºs: 97 e 102, respectivamente; c) SEQ ID Nºs: 97 e 103, respectivamente; d) SEQ ID Nºs: 106 e 111, respectivamente; e) SEQ ID Nºs: 107 e 112, respectivamente; ou f) SEQ ID Nºs: 107 e 113, respectivamente.
95. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 82 a 94, ca- racterizado pelo fato de o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo ter uma estrutura de glicano biantenária com um teor de fucose de cerca de entre 1% e cerca de 15%.
96. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de a) codificar a VH das SEQ ID Nºs: 122, 94 ou 95; b) codificar a VL das SEQ ID Nºs: 123, 98, 99 ou 100;
c) codificar a VH das SEQ ID Nºs: 122, 94 ou 95 e a VL das SEQ ID Nºs: 123, 98, 99 ou 100; d) codificar a HC das SEQ ID Nºs:104 ou 105; e) codificar a LC das SEQ ID Nºs: 108, 109 ou 110; f) codificar a HC das SEQ ID Nºs: 104 ou 105 e a LC das SEQ ID Nºs:108, 109 ou 110; ou g) compreender a sequência de polinucleotídeo das SEQ ID Nºs: 96, 97, 101, 102, 103, 106, 107, 111, 112 ou 113.
97. Vetor, caracterizado pelo fato de compreender ao me- nos um polinucleotídeo como definido na reivindicação 96.
98. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de compre- ender o vetor como definido na reivindicação 97.
99. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 98, caracterizada pelo fato de a célula hospedeira ser uma célula eucarió- tica, uma célula procariótica, uma célula CHO, uma célula HEK293 ou um hibridoma.
100. Método de produção do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com as reivindicações 82 a 95, caracterizado pelo fato de compreender cultivar a célula hospedei- ra, como definido na reivindicação 98, em condições nas quais o anti- corpo é expresso, e isolar o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
101. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 82 a 95.
102. Kit, caracterizado pelo fato de compreender o anticor- po ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 82 a 95.
103. Método de supressão da ativação de uma célula T que expressa PD-1 em um indivíduo, caracterizado pelo fato de compreen-
der administrar ao indivíduo o anticorpo isolado ou o fragmento de li- gação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 82 a 95, por um tempo suficiente para suprimir a ativa- ção da célula T que expressa PD-1.
104. Método, de acordo com a reivindicação 103, caracteri- zado pelo fato de a célula T que expressa PD-1 ser uma célula T CD4+ específica de antígeno e/ou uma célula T CD8+ específica de antígeno.
105. Método de modulação negativa de uma resposta imu- nológica, caracterizado pelo fato de compreender administrar a um in- divíduo que precisa do mesmo uma quantidade terapeuticamente efi- caz do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 82 a 95, para modular negativamente a resposta imunológica.
106. Método de tratamento de um distúrbio imunológico, ca- racterizado pelo fato de compreender administrar a um indivíduo que precisa do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anti- corpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, co- mo definido em qualquer uma das reivindicações 82 a 95, para tratar o distúrbio imunológico.
107. Método, de acordo com a reivindicação 106, caracteri- zado pelo fato de o distúrbio imunológico ser lúpus, lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de Sjogren, artrite, artrite reumatoide, asma, DPOC, doença inflamatória pélvica, doença de Alzheimer, doença in- flamatória intestinal, doença de Crohn, colite ulcerativa, doença de Peyronie, doença celíaca, doença da vesícula biliar, doença pilonidal, peritonite, psoríase, artrite psoriática, vasculite, adesões cirúrgicas, acidente vascular cerebral, diabetes tipo I, doença de Lyme, meningo- encefalite, uveíte autoimune, esclerose múltipla, síndrome de Guillain de Barr, dermatite atópica, hepatite autoimune, fibrosante alveolite, doença de Grave, nefropatia IgA, púrpura trombocitopênica idiopática,
doença de Ménière, pênfigo, cirrose biliar primária, sarcoidose, escle- rodermia, granulomatose de Wegener, outras doenças autoimunes, pancreatite, traumas (cirurgia), doença de enxerto versus hospedeiro, rejeição de transplante, doença cardíaca incluindo doenças isquêmi- cas como enfarte do miocárdio bem como ateroesclerose, coagulação intravascular, reabsorção óssea, osteoporose, osteoartrite, periodontite e hipocloridria, infertilidade relacionada com a falta de tolerância ma- terna ao feto, síndrome de Sjogren, vitiligo, miastenia gravis ou escle- rose sistêmica.
108. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 103 a 177, caracterizado pelo fato de o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ser administrado em combinação com um segundo agente terapêutico.
109. Anticorpo anti-idiotípico, caracterizado pelo fato de se ligar especificamente ao anticorpo ou ao fragmento de ligação ao antí- geno como definido na reivindicação 64.
110. Imunoconjugado, caracterizado pelo fato de compre- ender o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 82 a 96, conjugado a um agente de imageamento ou a um agente citotóxico.
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