TWI806873B - 特異性結合pd-1之抗體及使用方法 - Google Patents
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Abstract
特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段、編碼該等抗體或片段之多核苷酸、以及製造及使用上述者之方法可用於治療發炎性或免疫病症。
Description
本申請案含有序列表,其已經以ASCII格式藉由電子方式提交且其全文以引用方式併入本文中。該ASCII副本(建立於2018年5月30日)被命名為JBI5131WOPCT_ST25.txt且檔案大小為220千位元組。
本發明係關於特異性結合PD-1之抗體、編碼該等抗體或抗原結合片段之多核苷酸、以及製造及使用上述者之方法。
PD-1(計畫性死亡-1;PDCD1)為屬於CD28/CTLA-4家族之抑制性受體。PD-1為含有單個胞外域及胞質域之I型跨膜醣蛋白,該胞質域含有基於免疫受體酪胺酸之抑制性模體(ITIM)及基於免疫受體酪胺酸之轉換模體(ITSM)兩者。PD-1係在經活化之T細胞、B細胞、NK細胞、及胸腺細胞、以及在包括濾泡輔助性T細胞(TFH)及外周輔助性T細胞(TPH)之靜止記憶T細胞上表現。PD-1在由其配體PD-L1或PD-L2接合後會透過多種機制來抑制T細胞功能(Pauken & Wherry(2015)Trends in Immunology 36(4):265-276)。PD-1接合透 過與TCR共定位直接抑制T細胞受體(TCR)傳訊,且隨後誘導TCR近端信號分子的去磷酸化、抑制Ras/MEK/ERK路徑導致細胞週期進程及T細胞增生的抑制、透過抑制PI3K/AKT路徑抑制細胞生長及存活以及重編程T細胞代謝導致BATF轉錄因子的上調、及調節調控性T細胞(regulatory T cell)的發育、維持和功能。PD-1亦已被提出會增加T細胞移動性並限制T細胞與目標細胞之間的相互作用持續時間,從而減少T細胞活化的程度(Honda等人,(2014)Immunity 40(2):235-47)。
PD-1缺陷小鼠之研究已指示,此路徑對中央及周邊耐受性兩者係重要的。PD-1缺陷小鼠在C57Bl/6背景上可發展自發性自體免疫疾病症狀,包括自體抗體生產、腎小球性腎炎、及關節炎(Nishimura等人,Immunity 1999)。此等資料指示PD-1負調控免疫反應。
針對PD-1及PD-L1之單株抗體為用於治療癌症(諸如晚期黑色素瘤、晚期非小細胞肺癌、及典型霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma))之經核准療法。已發現PD-L1在許多不同的腫瘤類型上上調,且能夠抑制腫瘤浸潤性PD-1+ T細胞。拮抗劑PD-1或PD-L1單株抗體逆轉此抑制,從而使T細胞變得活化且攻擊腫瘤。因此,免疫檢查點阻斷提供增強抗腫瘤免疫反應之方式。
雖然生物抗炎治療劑係可用的,但仍需要經改善之抗炎藥物,該抗炎藥物可有效抑制發炎以治療各種免疫病症,例如很大部分患者仍未對療法有充分反應之類風溼性關節炎。
本發明提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:2、165、4、166、6、及7之重鏈互補決定區1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3、輕鏈互補決定區1(LCDR1)、LCDR2、及LCDR3。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:2、3、4、5、6、及7之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3;SEQ ID NO:8、9、或10之VH、及SEQ ID NO:14、15、或16之VL;及/或SEQ ID NO:20、21、或22之重鏈(HC)、及SEQ ID NO:26、27、或28之輕鏈(LC)。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:2、145、4、5、6、及7之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3;SEQ ID NO:140之VH、及SEQ ID NO:16之VL;及/或SEQ ID NO:150之HC、及SEQ ID NO:28之LC。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:2、146、4、5、6、及7之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3;SEQ ID NO:141之VH、及SEQ ID NO:16之VL;及/或SEQ ID NO:151之HC、及SEQ ID NO:28之LC。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或 其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:2、147、4、5、6、及7之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3;SEQ ID NO:142之VH、及SEQ ID NO:16之VL;及/或SEQ ID NO:152之HC、及SEQ ID NO:28之LC。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:2、3、4、148、6、及7之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3;SEQ ID NO:10之VH、及SEQ ID NO:143之VL;及/或SEQ ID NO:22之HC、及SEQ ID NO:153之LC。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:2、3、4、149、6、及7之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3;SEQ ID NO:10之VH、及SEQ ID NO:144之VL;及/或SEQ ID NO:22之HC、及SEQ ID NO:154之LC。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:2、145、4、148、6、及7之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3;SEQ ID NO:140之VH、及SEQ ID NO:143之VL;及/或SEQ ID NO:150之HC、及SEQ ID NO:153之LC。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:2、146、4、148、6、及7之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3; SEQ ID NO:141之VH、及SEQ ID NO:143之VL;及/或SEQ ID NO:151之HC、及SEQ ID NO:153之LC。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:2、147、4、148、6、及7之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3;SEQ ID NO:142之VH、及SEQ ID NO:143之VL;及/或SEQ ID NO:152之HC、及SEQ ID NO:153之LC。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:2、145、4、149、6、及7之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3;SEQ ID NO:140之VH、及SEQ ID NO:144之VL;及/或SEQ ID NO:150之HC、及SEQ ID NO:154之LC。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:2、146、4、149、6、及7之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3;SEQ ID NO:141之VH、及SEQ ID NO:144之VL;及/或SEQ ID NO:151之HC、及SEQ ID NO:154之LC。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:2、147、4、149、6、及7之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。SEQ ID NO:142之VH、及SEQ ID NO:144之VL;及/或SEQ ID NO:152之HC、及SEQ ID NO:154之LC。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:32、124、40、41、42、及43之重鏈互補決定區1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3、輕鏈互補決定區1(LCDR1)、LCDR2、及LCDR3。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:SEQ ID NO:32、33、40、41、42、及43之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3;SEQ ID NO:44或45之VH、及SEQ ID NO:60、61、或62之VL;及/或SEQ ID NO:66或67之HC、及SEQ ID NO:82、83、或84之LC。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:32、34、40、41、42、及43之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3;SEQ ID NO:46之VH、及SEQ ID NO:61之VL;及/或SEQ ID NO:68之HC、及SEQ ID NO:83之LC。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:32、35、40、41、42、及43之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3;SEQ ID NO:47之VH、及SEQ ID NO:61之VL;及/或SEQ ID NO:69之HC、及SEQ ID NO:83之LC。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:32、36、40、41、42、 及43之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3;SEQ ID NO:48之VH、及SEQ ID NO:61之VL;及/或SEQ ID NO:70之HC、及SEQ ID NO:83之LC。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:32、37、40、41、42、及43之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3;SEQ ID NO:49之VH、及SEQ ID NO:61之VL;及/或SEQ ID NO:71之HC、及SEQ ID NO:83之LC。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:32、38、40、41、42、及43之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3;SEQ ID NO:50之VH、及SEQ ID NO:61之VL;及/或SEQ ID NO:72之HC、及SEQ ID NO:83之LC。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:32、39、40、41、42、及43之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3;SEQ ID NO:51之VH、及SEQ ID NO:61之VL;及/或SEQ ID NO:73之HC、及SEQ ID NO:83之LC。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:88、89、90、91、92、及93之重鏈互補決定區1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3、輕鏈互補決定區1(LCDR1)、LCDR2、及LCDR3。
本發明提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段與本發明之抗體競爭結合至PD-1。
本發明提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段與本發明之抗體結合至相同的PD-1表位。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其中該抗體VH及該抗體VL、或該抗體HC及該抗體LC係由本文敘述之某些多核苷酸編碼。
本發明亦提供一種多核苷酸,其編碼本發明之抗體。
本發明亦提供一種載體,其包含至少一種本發明之多核苷酸
本發明亦提供一種宿主細胞,其包含本發明之載體。
本發明亦提供一種製造本發明之抗體或其抗原結合片段的方法,其包含在表現該抗體或其抗原結合片段之條件下培養本發明之宿主細胞、及單離該抗體或其抗原結合片段。
本發明亦提供一種醫藥組成物,其包含本發明之抗體或其抗原結合片段。
本發明亦提供一種套組,其包含本發明之抗體或其抗原結合片段。
本發明亦提供一種抑制個體中之PD-1表現T細胞之活化的方法,其包含向個體投予本發明之經單離之抗體或其抗原結合片 段,達足以抑制該PD-1表現T細胞之活化的時間。
本發明亦提供一種下調免疫反應之方法,其包含向有需要之個體投予治療有效量的本發明之經單離之抗體或其抗原結合片段,達足以下調該免疫反應之時間。
本發明亦提供一種治療免疫病症之方法,其包含向有需要之個體投予治療有效量的本發明之經單離之抗體或其抗原結合片段,達足以治療該免疫病症之時間。
本發明亦提供一種抗獨特型抗體,其特異性結合本發明之抗體或其抗原結合片段。
本發明亦提供一種免疫接合物,其包含接合至異源分子的本發明之抗體或抗原結合片段。
圖1A顯示所選產生的抗體以超過50%或更高之水準抑制CMV回憶檢定中之T細胞活化。CNTO3930:同型對照。PD1B199:拮抗性PD-1 mAb。
圖1B顯示所選產生的抗體以超過50%或更高之水準抑制CMV回憶檢定中之T細胞活化。CNTO3930:同型對照。PD1B199:拮抗性PD-1 mAb。
圖2A顯示PD1B505 mAb譜系VH區PD1H93(SEQ ID NO:8)PD1H384(SEQ ID NO:9)、PD1H405(SEQ ID NO:10)、PD1H585(SEQ ID NO:140)、PD1H586(SEQ ID NO:141)、及 PD1H587(SEQ ID NO:142)之比對。將CDR區加底線。VH鏈之SEQ ID NO:在圖中係示於鏈名稱之後(例如,PD1H93_8;_8指示SEQ ID NO:8)
圖2B顯示PD1B505 mAb譜系VL區PD1L30(SEQ ID NO:14)PD1L468(SEQ ID NO:15)、PD1L469(SEQ ID NO:16)、PD1L651(SEQ ID NO:143)、及PD1L652(SEQ ID NO:144)之比對。將CDR區加底線。VL鏈之SEQ ID NO:在圖中係示於鏈名稱之後(例如,PD1L30_14;_14指示SEQ ID NO:14)
圖3A顯示PD1B506 mAb譜系VH區PD1H90(SEQ ID NO:44)PD1H388(SEQ ID NO:45)、PD1H399(SEQ ID NO:46)、PD1H400(SEQ ID NO:47)、PD1H401(SEQ ID NO:48)、PD1H402(SEQ ID NO:49)、PD1H403(SEQ ID NO:50)、及PD1H404(SEQ ID NO:51)之比對。將CDR區加底線。
圖3B顯示PD1B506 mAb譜系VL區PD1L28(SEQ ID NO:60)PD1L470(SEQ ID NO:61)及PD1L471(SEQ ID NO:62)之比對。將CDR區加底線。
圖4A顯示PD1B512 mAb譜系VH區PD1H81(SEQ ID NO:94)及PD1H389(SEQ ID NO:95)之比對。將CDR區加底線。
圖4B顯示PD1B512 mAb譜系VL區PD1L43(SEQ ID NO:98)PD1L472(SEQ ID NO:99)及PD1L473(SEQ ID NO:100)之比對。將CDR區加底線。
圖5A顯示PD1B505及PD1B506抑制抗原特異性T細胞之活 化。該圖顯示CMV回憶檢定中之T細胞增生之平均抑制%及STDEV。IgG1:同型對照。
圖5B顯示PD1B743、PD1B750及PD1B756抑制抗原特異性T細胞之活化。該圖顯示CMV回憶檢定中之T細胞增生之平均抑制%及STDEV。IgG1:同型對照。
圖5C顯示PD1B878及PD1B849抑制CMV特異性回憶檢定中之抗原特異性T細胞之活化。該圖顯示CMV回憶檢定中之T細胞增生之平均抑制%及STDEV。IgG1:同型對照。
圖6A顯示在使用雙陽性事件百分比(%)作為叢聚之讀數來評估PD-1及PD-L1表現細胞在存在或不存在所指示之抗體的情況下之叢聚程度的檢定中,PD1B743及PD1B756未阻斷PD-L1結合至PD-1,而PD1B750阻斷該相互作用。陽性對照mAb阻斷PD-L1/PD-1相互作用。
圖6B顯示在使用雙陽性事件百分比(%)作為叢聚之讀數來評估PD-1及PD-L2表現細胞在存在或不存在所指示之抗體的情況下之叢聚程度的檢定中,PD1B743及PD1B756未阻斷PD-L2結合至PD-1,而PD1B750阻斷該相互作用。陽性對照mAb阻斷PD-L2/PD-1相互作用。
圖7顯示所產生的PD-1抗體之五個不同表位分級(epitope bin)之示意圖。分級5 mAb阻斷PD-L1/PD-1相互作用,而分級1至分級4內之mAb未阻斷。
圖8A顯示相較於用TT刺激之T細胞,CD4+ CD45RO+或CD8+ CD45RO+記憶T細胞上之PD-1表現較高(插圖,幾何平均螢光強度)。PD-1抗體:實線;同型對照:虛線。
圖8B顯示PD1B878及PD1B849抑制CMV特異性回憶檢定中之CMV特異性T細胞之活化。該圖顯示檢定中之T細胞增生之平均抑制百分比(%)及STDEV。
圖9A顯示PD1B849及PD1B878在存在NK細胞作為效應細胞之情況下誘發經活化之記憶T細胞的ADCC。低海藻糖(LF)型式之抗體(PD1B849-LF及PD1B878-LF)展現出增強的ADCC活性。
圖9B顯示PD1B849及PD1B878在存在PBMC作為效應細胞之情況下誘發經活化之記憶T細胞的ADCC。低海藻糖(LF)型式之抗體(PD1B849-LF及PD1B878-LF)展現出增強的ADCC活性。
圖10A顯示PD1B849及PD1B878之缺乏在存在NK細胞作為效應細胞之情況下介導表現低水準之PD1的靜止記憶T細胞中的ADCC。低海藻糖(LF)型式之抗體(PD1B849-LF及PD1B878-LF)介導一些ADCC。
圖10B顯示PD1B849及PD1B878之缺乏在存在PBMC作為效應細胞之情況下介導表現低水準之PD1的靜止記憶T細胞中的ADCC。低海藻糖(LF)型式之抗體(PD1B849-LF及PD1B878-LF)介導一些ADCC。
圖11顯示PD1B849及PD1B878未介導使用兔補體之經活化之T 細胞的可測量之CDC。OKT3:小鼠抗人類CD3抗體(陽性對照);huIgG1:同型對照,muIgG2a:同型對照。
圖12顯示PD1B878、PD1B1090、及PD1B1094未阻斷PD-L1結合至細胞上之PD1。
圖13A顯示PD1B505-mIgG2a及PD1B506-mIgG2a防止移植物抗宿主病(GvHD)小鼠模型中之疾病發展。在第0天、第4天、第7天、第11天、第14天、及第18天將抗體以10mg/kg i.p.給藥,且隨時間推移記錄臨床評分。
圖13B顯示PD1B505-mIgG2a及PD1B506-mIgG2a mAb(mIgG2a)防止GvHD小鼠模型中之體重減輕。在第0天、第4天、第7天、第11天、第14天、及第18天將抗體以10mg/kg i.p.給藥。
圖14A顯示PD1B849-mIgG2a及PD1B878-mIgG2a防止移植物抗宿主病(GvHD)小鼠模型中之疾病發展。在第0天、第4天、第7天、第11天、第14天、及第18天將抗體以10mg/kg i.p.給藥,且隨時間推移記錄臨床評分。
圖14B顯示PD1B849-mIgG2a及PD1B878-mIgG2a防止GvHD小鼠模型中之體重減輕。在第0天、第4天、第7天、第11天、第14天、及第18天將抗體以10mg/kg i.p.給藥。
圖15顯示PD1B849-mIgG2a及PD1B878-mIgG2a在GvHD小鼠模型中增加脾中之調控性T細胞(Treg)之頻率。
圖16顯示所選抗PD1抗體耗盡TFH/TPH群體。LF:低海藻糖。
所有在本說明中引用、包括但不限於專利及專利申請文件之發表文獻以引用方式全部併入本文中。
應瞭解到,本文中所使用的用語僅出於描述實施例之目的,且不意欲為限制性。除非另有定義,否則本文使用之所有技術及科學用語,均與具有本發明有關技藝之通常知識者所一般了解之意義相同。
雖然任何類似或等效於本文中所述者之方法及材料可用於測試本發明之實務中,本文中仍描述例示性材料及方法。在描述及請求本發明時,將使用下列用語。
本文及申請專利範圍中所使用之單數形式「一(a/an)」及「該(the)」皆包括複數指稱,除非上下文另有明確說明。
除非上下文清楚地作出其他要求,否則整篇說明書及申請專利範圍中之用字「包含(comprise/comprising)」及類似者應被解讀為涵括性意義,此係相對於排他性或窮舉性意義;亦即,「包括但不限於(including,but not limited to)」之意義。
「特異性結合(specifically bind/specific binding)」或「結合(bind)」係指抗體以比對其他抗原或表位更大的親和力結合至抗原或抗原內之表位。一般而言,抗體以下列平衡解離常數(KD)結合至抗原或抗原內之表位:約1×10-7M或更小,例如約1×10-8M或更小、約1×10-9M或更小、約1×10-10M或更小、約1×10-11M或更小、或約1×10-12M或更小,一般以小於其結合至非特異性抗原(例 如BSA、酪蛋白)之KD至少一百倍的KD結合。KD可使用標準程序來測量。然而,特異性結合至抗原或抗原內之表位的抗體可能對於其他相關抗原具有交叉反應性,例如對於來自其他物種(諸如人類或猴)的相同抗原(同源物(homolog))具有交叉反應性,該等猴例如食蟹獼猴(Macaca fascicularis(cynomolgus,cyno))、黑猩猩(Pan troglodytes(chimpanzee,chimp))、或狨(Callithrix jacchus(common marmoset,marmoset))。當單特異性抗體特異性結合一種抗原或一種表位時,雙特異性抗體特異性結合二種不同的抗原或二種不同的表位。
「促效劑(agonist)」或「促效性(agonistic)」係指在結合至PD-1時誘導由PD-1配體PD-L1誘導之至少一種生物活性的抗體。當該至少一種生物活性比起在該促效劑不存在下(即陰性對照)被誘導增加至少約20%、30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%時,或當該誘導相較於該促效劑不存在下的誘導為統計上顯著的時,該抗體為促效劑。由PD-L1結合至PD-1誘導之一般生物活性為抑制抗原特異性CD4+及/或CD8+ T細胞,導致免疫反應之抑制。
PD-1係指人類計畫性細胞死亡蛋白1(PD-1)。PD-1亦稱為CD279或PDCD1。成熟人類PD-1之胺基酸序列(無訊息序列)係顯示於SEQ ID NO:131。在SEQ ID NO:1中,胞外域涵蓋殘基1至150,跨膜域涵蓋殘基151至171,且胞質域涵蓋殘基172至268。在整篇說明書中,「人類PD-1之胞外域(the extracellular domain of human PD-1)」或「huPD1-ECD」係指具有SEQ ID NO:1之殘基1 至150之胺基酸序列的蛋白質。
「抗體(antibody)」係以廣義的方式意指,且包括免疫球蛋白分子,其屬於任何類別,IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM,或子類別IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4,且包括kappa(κ)及lambda(λ)輕鏈中任一者。「抗體(antibody)」包括單株抗體、全長抗體、抗原結合片段、雙特異性或多特異性抗體、二聚體、四聚體或多聚體抗體、單鏈抗體、域抗體、及任何其他包含具有所需特異性之抗原結合片段的免疫球蛋白分子之修飾組態。「全長抗體(full length antibody)」包含藉由雙硫鍵互連之兩條重鏈(HC)及兩條輕鏈(LC)以及其多聚體(例如IgM)。各重鏈包含重鏈可變區(VH)及重鏈恆定區(包含域CH1、鉸鏈、CH2、及CH3)。每條輕鏈包含輕鏈可變區(VL)及輕鏈恆定區(CL)。VH及VL可進一步細分成散佈於架構區(FR)的多個高變區,其被稱為互補決定區(CDR)。每個VH及VL由三個CDR及四個FR區段組成,按照下列順序從胺基末端到羧基末端排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及FR4。
「互補決定區(complementarity determining region,CDR)」為結合抗原之抗體區。VH中有三個CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3),且VL中有三個CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。CDR可使用各種描繪來定義,諸如Kabat(Wu等人(1970)J Exp Med 132:211-50)(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia(Chothia等人 (1987)J Mol Biol 196:901-17)、IMGT(Lefranc等人(2003)Dev Comp Immunol 27:55-77)、及AbM(Martin及Thornton J Bmol Biol 263:800-15,1996)。描述各種描繪與可變區編號之間之對應(參見,例如Lefranc等人(2003)Dev Comp Immunol 27:55-77;Honegger及Pluckthun,J Mol Biol(2001)309:657-70;國際免疫遺傳學(International ImMunoGeneTics,IMGT)資料庫;網路資源,http://www_imgt_org)。可用程式(諸如UCL Business PLC之abYsis)可用於描繪CDR。本文中所使用之用語「CDR」、「HCDR1」、「HCDR2」、「HCDR3」、「LCDR1」、「LCDR2」及「LCDR3」包括由上述Kabat、Chothia、IMGT、或AbM中的任何方法定義的CDR,除非在說明書中另有明確說明。
「抗原結合片段(antigen binding fragment)」係指結合抗原之免疫球蛋白分子之一部分。抗原結合片段可為合成的、可酶促獲得的、或經基因工程改造之多肽,且包括VH、VL、VH及VL、Fab、F(ab')2、Fd、及Fv片段、由一個VH域或一個VL域所組成之域抗體(dAb)、鯊可變IgNAR域(shark variable IgNAR domain)、駱駝化VH域、由模擬抗體之CDR(諸如FR3-CDR3-FR4部分、HCDR1、HCDR2、及/或HCDR3、以及LCDR1、LCDR2、及/或LCDR3)的胺基酸殘基所組成之最小識別單元。VH及VL域可經由合成連接子連接在一起以形成各種類型的單鏈抗體設計,其中VH/VL域可進行分子內配對,或者在VH及VL域係由分開之單鏈抗體建構體所表現之情況下可進行分子間配對,以形成單價抗原結合部位,諸 如單鏈Fv(scFv)或雙價抗體(diabody);其描述於例如國際專利公開號WO1998/44001、WO1988/01649、WO1994/13804、及WO1992/01047中。
「單株抗體(monoclonal antibody)」係指自實質上均一的抗體分子群體獲得之抗體,亦即,除了可能熟知之改變之外包含該群體之個別抗體係同一的,該等改變諸如從抗體重鏈移除C端離胺酸或轉譯後修飾,諸如胺基酸異構化或脫醯胺化、甲硫胺酸氧化或天冬醯胺酸或麩醯胺酸脫醯胺化。單株抗體一般結合一種抗原表位。雙特異性單株抗體會結合兩種不同的抗原表位。單株抗體在抗體群內可能有異源醣化。單株抗體可係單特異性或多特異性的(諸如雙特異性的)、單價、二價、或多價的。
「經單離(isolated)」係指已自製出該分子的系統(諸如重組細胞)的其他組分實質上分離及/或純化出之均一分子群體(諸如合成多核苷酸或蛋白質,諸如抗體)、以及已經受至少一次純化或單離步驟的蛋白質。「經單離之抗體(isolated antibody)」係指實質上不含其他細胞材料及/或化學物的抗體,且涵蓋經單離成更高純度的抗體,諸如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%純度。
「抗體(antibody)」包括使用各種技術產生之抗體,包括由經免疫動物(諸如小鼠、大鼠、兔或雞)產生或自如本文所述之噬菌體或哺乳動物展示庫識別出來之抗體。
「人源化抗體(humanized antibody)」係指至少一個CDR係衍生自非人類物種且至少一個架構係衍生自人類免疫球蛋白序列的抗體。人源化抗體可在架構中包括取代,所以該等架構可能不是所表現人類免疫球蛋白或人類免疫球蛋白生殖系基因序列的確切複製物。
「人類抗體(human antibody)」係指經最佳化以在投予至人類個體時具有最小免疫反應之抗體。人類抗體之可變區係衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列。若抗體含有恆定區或恆定區的一部分,則該恆定區亦衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列。
若抗體之可變區係獲自使用人類生殖系免疫球蛋白基因的系統,則人類抗體包含「衍生自(derived from)」人類生殖系免疫球蛋白序列的重或輕鏈可變區。此類例示性系統為經展示在噬菌體或哺乳動物細胞上的人類免疫球蛋白基因庫、及基因轉殖非人類動物,諸如帶有人類免疫球蛋白基因位點之小鼠、大鼠、或雞。當相較於人類中表現之免疫球蛋白時,「人類抗體」一般含有胺基酸差異,這是由於用於獲得抗體及人類免疫球蛋白基因位點之系統之間的差異、引入自然發生之體細胞突變、向架構或CDR中刻意引入取代。「人類抗體」在胺基酸序列上與由人類生殖系免疫球蛋白序列所編碼的胺基酸序列一般具有約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性。在一些情況中,「人類抗體」可含有衍生自人類架構序列分析之共有架構序列,例如如描述於(Knappik等人(2000) J Mol Biol 296:57-86)中,或併入展示於噬菌體上之人類免疫球蛋白基因庫的合成HCDR3,例如如描述於(Shi等人(2010)J Mol Biol 397:385-96)及國際專利公開號WO2009/085462中。CDR係衍生自非人類物種的抗體不包括在「人類抗體」的定義中。
「重組(recombinant)」係指藉由重組方式製備、表現、建立或單離的抗體及其他蛋白質。
「表位(epitope)」係指與抗體特異性結合的抗原部分。表位經常係由分子部分(諸如胺基酸或多醣側鏈)之化學活性(諸如極性、非極性、或疏水性)表面分群(grouping)所組成,且可具有特定三維結構特性、以及特定電荷特性。表位可包含形成構形空間單元之鄰接(contiguous)及/或不鄰接(discontiguous)胺基酸。關於不鄰接表位,來自抗原線性序列之相異部分的胺基酸會透過蛋白質分子的摺疊而在3維空間中緊密靠近。
「多特異性(multispecific)」係指特異性結合二或更多種不同抗原或相同抗原內二或更多個不同表位之蛋白質,諸如抗體。多特異性蛋白質可以與其他相關抗原具有交叉反應性,例如對於來自其他物種(諸如人類或猴)的相同抗原(同源物(homolog))具有交叉反應性,該等猴例如食蟹獼猴(Macaca fascicularis(cynomolgus,cyno))、黑猩猩(Pan troglodytes(chimpanzee,chimp))、或狨(Callithrix jacchus(common marmoset,marmoset)),或者可以結合在二或更多種不同抗原之間共有的表位。
「雙特異性(bispecific)」係指特異性結合兩種不同抗原 或相同抗原內兩個不同表位之蛋白質,諸如抗體。雙特異性蛋白質可以與其他相關抗原具有交叉反應性,例如對於來自其他物種(諸如人類或猴)的相同抗原(同源物(homolog))具有交叉反應性,該等猴例如食蟹獼猴(Macaca fascicularis(cynomolgus,cyno))、黑猩猩(Pan troglodytes(chimpanzee,chimp))、或狨(Callithrix jacchus(common marmoset,marmoset)),或者可以結合在二或更多種不同抗原之間共有的表位。
「與...組合(in combination with)」意指將藥物或治療劑一起以混合物形式投予至個體(諸如人類),其係同時以單劑投予或以任何順序以單劑依序投予。
「治療(treat/treatment)」係指治療性處理及疾病預防性或防治性措施兩者,其中目標係預防或減緩(減輕)非所欲的生理變化或病症。有益或所欲之臨床成果包括緩解症狀、減小疾病程度、使疾病進入穩定化(即不惡化)狀態、延緩或減慢疾病進程、改善或緩和疾病狀態、及緩解(無論部分或完全),無論可偵測或不可偵測。「治療」亦可意指相較於未接受治療之個體之預期存活而延長存活。該等有治療需要的包括該等已具有狀況或病症的,以及該等易患有狀況或病症的,或者該等要防治狀況或病症的。
「治療有效量(therapeutically effective amount)」係指有效達成所欲治療成果所需之劑量及時間段的量。治療有效量可依不同因素而異,諸如個體之疾病狀態、年齡、性別、及體重、以及治療劑或治療劑的組合在個體中誘發所欲反應的能力。有效的治療劑或治 療劑組合之例示性指標包括例如患者之幸福感改善。
「免疫反應(immune response)」包括T細胞介導及/或B細胞介導之免疫反應。例示性免疫反應包括T細胞反應,例如細胞介素生產及細胞毒性。此外,用語免疫反應包括受T細胞活化間接影響之免疫反應,例如抗體生產(體液反應)及細胞介素反應性細胞(例如巨噬細胞)之活化。
「下調(downmodulate/downmodulating)」係指相較於在治療或化合物不存在下之個體中之反應水準、及/或相較於其他相同但未經治療之個體中之反應水準,個體中之免疫反應水準具有可偵測的降低。
「免疫病症(immune disorder)」係指由免疫系統之活性引起的任何疾病、病症、或疾病症狀,包括自體免疫疾病、發炎性疾病、及過敏。
「個體(subject)」包括任何人類或非人類動物。「非人類動物(nonhuman animal)」包括所有脊椎動物,例如哺乳動物及非哺乳動物,諸如非人類靈長類、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬蟲動物等。用語「個體」與「患者(patient)」在本文中可互換使用。
「載體(vector)」意指在生物系統內能夠被複製或者可在此等系統之間移動的多核苷酸。載體多核苷酸一般含有作用為促進這些多核苷酸在生物系統中的複製或維持的元素,諸如複製源、多腺核苷酸化信號或選擇標記。此等生物系統的實例可包括細胞、病毒、 動物、植物、及利用能夠複製載體之生物組件的重構生物系統(reconstituted biological system)。包含載體之多核苷酸可為DNA或RNA分子或這些分子的雜交物。
「表現載體(expression vector)」意指可在生物系統或重構生物系統中用以指引多肽轉譯的載體,該多肽係由存在於該表現載體中之多核苷酸序列所編碼。
「多核苷酸(polynucleotide)」係指包含藉由糖-磷酸主鏈或其他等效共價化學共價連接之核苷酸鏈的合成分子。cDNA係例示性合成多核苷酸。
「多肽(polypeptide)」或「蛋白質(protein)」意指包含至少二個以肽鍵連接之胺基酸殘基以形成多肽的分子。少於50個胺基酸的小型多肽可稱為「肽(peptide)」。
「約(about)」意指在特定值的可接受誤差範圍內,如所屬技術領域中具有通常知識者所判定,其將部分地取決於該值是如何測量或判定的,即測量系統的限制。除非在實例或說明書中的其他地方在一特定檢定、結果或實施例的上下文中另有明確說明,「約(about)」意指根據本領域的實務在一個標準偏差內,或者至多5%的範圍,以較大者為準。
「樣本(sample)」係指自個體單離出的類似流體、細胞、或組織的集合,以及存在於個體內的流體、細胞、或組織。例示性樣本係生物流體(諸如血液、血清及漿膜液(serosal fluid)、血漿、淋巴液、尿液、唾液、囊液(cystic fluid)、淚滴、糞便、痰、分泌組織 及器官的黏膜分泌物、陰道分泌物)、腹水、胸膜腔、圍心腔、腹膜腔(peritoneal)、腹腔(abdominal)及其他體腔的流體、藉由支氣管灌洗(bronchial lavage)收集的流體、滑液、與個體或生物來源接觸的液體溶液(例如細胞及器官培養基,其包括細胞或器官條件培養基(conditioned medium)、灌洗液、及類似者)、組織活檢、細針穿刺、手術切除的組織、器官培養物、或細胞培養物。
習用一字母及三字母胺基酸代碼係於本文中使用且如表1所示。
本文提供特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段、編碼本文提供之抗體之多核苷酸、載體、宿主細胞、以及製造及使用抗體之方法。抗體或其抗原結合片段可為促效性抗體。
一些用免疫檢查點抑制劑(包括PD-1拮抗劑)治療之癌症患者發展出自體免疫相關之不良事件,諸如關節炎、結腸炎、或牛皮癬之症狀。解釋此觀察之一個假設為,此等患者中之自反應性T細胞透過PD-1被積極抑制,且在PD-1拮抗劑存在下被「解放(unleashed)」。接著逆轉此假設是合理的,且認為在患有自體免疫疾病之患者中之「已解放之(already-unleashed)」T細胞很可能可透過PD-1連接/促效作用來抑制。
已發現PD-1基因PDCD1中之SNP與多種自體免疫疾病相關,該等自體免疫疾病包括類風溼性關節炎、狼瘡、及僵直性背椎炎(由Zamani等人,Cell Immunol 2016 310:27-41概述)。雖然尚未闡明PD-1 SNP之功能,但此等關聯可指示PD-1活性減少可導致T細胞抑制減少,這可增加自體免疫疾病之易感性。
需要抑制自體免疫疾病中之自體反應性T細胞的治療劑。PD-1+ T細胞已見於患有自體免疫疾病之患者之組織中,該等自體免疫疾病包括類風溼性關節炎及休格倫氏症候群(Sjogren’s Syndrome)(Wan等人,J Immunol 2006 177(12):8844-50。;Kobayashi等人,J Rheumatol 2005 32(11):2156-63)。能夠促效PD-1之抗體可用於抑制T細胞增生及細胞介素釋放,以限制組織內之損傷且恢復免疫穩態。PD-1促效劑mAb將靶向經活化之初始(naïve)及記憶T細胞及B細胞而非靜止初始及記憶T細胞及B細胞。以此方式,治療劑將抑制針對患有自體免疫疾病之患者中之自身抗原的免疫反應,而不損害對病原體之免疫記憶反應。兩種表現高水準之PD-1、 TFH、及TPH的T細胞類型促進B細胞反應及抗體生產(Rao等人,Nature 2017;542:110-114)。此等細胞之頻率在由自體抗體生產驅動之自體免疫疾病中增加,該等自體免疫疾病包括類風溼性關節炎、全身性紅斑性狼瘡、及休格倫氏症候群(Rao等人,Nature 2017;542:110-114;He等人,Immunity 2013;39:770-781;Verstappen等人,Arthr & Rheum 2017;69(9):1850-1861)。除了提供對經活化之T細胞之抑制,本發明之抗體可選擇性地耗盡展現高PD-1表現之細胞,諸如TFH及TPH細胞。
本發明提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含抗體PD1B505、PD1B742、PD1B743、PD1B878、PD1B506、PD1B750、PD1B751、PD1B845、PD1B846、PD1B847、PD1B848、PD1B849、PD1B850、PD1B512、PD1B756、PD1B757、PD1B1085、PD1B1086、PD1B1087、PD1B1088、PD1B1089、PD1B1090、PD1B1091、PD1B1092、PD1B1093、PD1B1094、或PD1B1095中之任一者之重鏈互補決定區1(HCDR1)、HCDR2、及LCDR3、輕鏈互補決定區1(LCDR1)、LCDR2、及/或LCDR3。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含抗體PD1B505、PD1B742、PD1B743、PD1B878、PD1B506、PD1B750、PD1B751、PD1B845、 PD1B846、PD1B847、PD1B848、PD1B849、PD1B850、PD1B512、PD1B756、PD1B757、PD1B1085、PD1B1086、PD1B1087、PD1B1088、PD1B1089、PD1B1090、PD1B1091、PD1B1092、PD1B1093、PD1B1094、或PD1B1095中之任一者之重鏈可變區(VH)架構及/或輕鏈可變區(VL)架構。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含抗體PD1B505、PD1B742、PD1B743、PD1B878、PD1B506、PD1B750、PD1B751、PD1B845、PD1B846、PD1B847、PD1B848、PD1B849、PD1B850、PD1B512、PD1B756、PD1B757、PD1B1085、PD1B1086、PD1B1087、PD1B1088、PD1B1089、PD1B1090、PD1B1091、PD1B1092、PD1B1093、PD1B1094、或PD1B1095中之任一者之VH及/或VL。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段為促效性抗體。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段介導PD-1表現細胞之ADCC。
在一些實施例中,PD-1表現細胞為經活化之記憶T細胞、濾泡輔助性T細胞(TFH)、或外周輔助性T細胞(TPH)、或其任何組合。TFH細胞可被識別為:活,CD19-CD56-/CD4+CD45RO+/HLADR+/CXCR5+/ICOS+PD1+;TPH細胞可被識別為:活,CD19-CD56- /CD4+CD45RO+/HLADR+/CXCR5-/ICOS+PD1+;TFH/TPH細胞之組合可被識別為:活,CD19-CD56-/CD4+CD45RO+/HLADR+/ICOS+PD1+。記憶T細胞可被識別為CD4+ CD45RO+或CD8+ CD45RO+。
mAb PD1B505、PD1B742、PD1B743、PD1B878、PD1B1085、PD1B1086、PD1B1087、PD1B1088、PD1B1089、PD1B1090、PD1B1091、PD1B1092、PD1B1093、PD1B1094、或PD1B1095為PD1B505 mAb譜系之例示性抗體。此等mAb具有相同的CDR區,除了一些抗體在HCDR2中具有一個胺基酸差異且在LCDR1中具有一或兩個胺基酸差異。VH區同一性係介於82至100%之間,且VL區同一性係介於78至100%之間。PD1B505譜系mAb為配體非阻斷性的。
譜系之特徵在於分別為SEQ ID NO:2、165、4、166、6、及7之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3,及在於SEQ ID NO:118之VH屬序列、及SEQ ID NO:119之VL屬序列。
SEQ ID NO:165(HCDR2屬)WINIETGXPT;其中X為E、Y、H、或W。
SEQ ID NO:166(LCDR1屬)TASSSX1X2SSYLH;其中X1為V或F;且X2為S或P。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:2、165、4、166、6、及7之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
在一些實施例中,特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO:3、145、146、或147之HCDR2及/或SEQ ID NO:5、148、或149之LCDR1。
在一些實施例中,該抗體或其抗原結合片段具有下列性質之一、二、三、四、或五者:不阻斷PD-L1結合至PD-1,其中阻斷之缺乏係如實例1中所述藉由該抗體不能抑制PD-L1表現細胞及PD-1表現細胞之叢聚來測量;以約5×10-8M或更小之平衡解離常數(KD)結合PD-1,其中該KD係使用ProteOn XPR36系統在+25℃測量;以約3×104 1/Ms或更大之締合常數(ka)結合PD-1,其中該ka係使用ProteOn XPR36系統在+25℃測量;以約3×10-3 1/s或更小之解離常數(kd)結合PD-1,其中該kd係使用ProteOn XPR36系統在+25℃測量;或 抑制抗原特異性T細胞之增生;其中增生係在CMV-PBMC檢定中評定。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段包含衍生自IGHV7-4-1*1之VH架構(SEQ ID NO:125)。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段包含衍生自IGKV3D-20*1之VL架構(SEQ ID NO:126)。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段包含衍生自IGHV7-4-1*1之VH架構(SEQ ID NO:125)、及衍生自IGKV3D-20*1之VL架構(SEQ ID NO:126)。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含SEQ ID NO:118之重鏈可變區(VH)。SEQ ID NO:118為PD1B505譜系mAb之VH屬序列。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或 其抗原結合片段,其包含SEQ ID NO:119之輕鏈可變區(VL)。SEQ ID NO:118為PD1B505譜系mAb之VL屬序列。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含SEQ ID NO:118之VH、及SEQ ID NO:119之VL。CDR係以粗體顯示於SEQ ID NO:118及SEQ ID NO:119中。
SEQ ID NO:118(PD1B505譜系VH屬) ;其中 X1為D或Q;X2為Q或V;X3為E或Q;X4為P或S;X5為E或A;X6為T或S;X7為I或V;X8為K或R;X9為K或Q;X10為K或E; X11為E、Y、H、或W;X12為D或Q;X13為D或G;X14為K或T;X15為A或V;X16為E或D;X17為A或V;X18為N、C、或S;X19為N或S;X20為N或A;X21為T或V;X22為T或L;或X23為L或V。
SEQ ID NO:119(PD1B505譜系VL屬) ;其 中X1為Q或E;X2為I或T;X3為M或L; X4為A或L;X5為L或P;X6為V或A;X7為M或L;X8為T或S;X9為V或F;X10為S或P;X11為S或L;X12為S或A;X13為K或R;X14為W或L;X15為V或I;X16為A或D;X17為S或D;X18為Y或F;X19為S或T;X20為S或R;X21為M或L;X22為A或P;X23為A或F;X24為T或V;X25為A或Q;且 X26為L或I。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO:8、9、10、140、141、或142之VH。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO:14、15、16、143、或144之VL。在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO:8、9、10、140、141、或142之VH、及SEQ ID NO:14、15、16、143、或144之VL。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:2、3、4、5、6、及7之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:8、9、或10之VH、及SEQ ID NO:14、15、或16之VL。
在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:20、21、或22之重鏈(HC)、及SEQ ID NO:26、27、或28之輕鏈(LC)。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:2、145、4、5、6、及7之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:140之VH、及SEQ ID NO:16之VL。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:150之HC、及SEQ ID NO:28之LC。亦提供該抗體以在療法中使用,諸如在治療免疫病症、類風溼性關節炎、狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、或移植物抗宿 主病中使用。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:2、146、4、5、6、及7之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:141之VH、及SEQ ID NO:16之VL。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:151之HC、及SEQ ID NO:28之LC。亦提供該抗體以在療法中使用,諸如在治療免疫病症、類風溼性關節炎、狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、或移植物抗宿主病中使用。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:2、147、4、5、6、及7之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:142之VH、及SEQ ID NO:16之VL。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:152之HC、及SEQ ID NO:28之LC。亦提供該抗體以在療法中使用,諸如在治療免疫病症、類風溼性關節炎、狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、或移植物抗宿主病中使用。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:2、3、4、148、6、及7之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:10之VH、及SEQ ID NO:143之VL。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:22之HC、及 SEQ ID NO:153之LC。亦提供該抗體以在療法中使用,諸如在治療免疫病症、類風溼性關節炎、狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、或移植物抗宿主病中使用。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:2、3、4、149、6、及7之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:10之VH、及SEQ ID NO:144之VL。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:22之HC、及SEQ ID NO:154之LC。亦提供該抗體以在療法中使用,諸如在治療免疫病症、類風溼性關節炎、狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、或移植物抗宿主病中使用。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:2、145、4、148、6、及7之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:140之VH、及SEQ ID NO:143之VL。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:150之HC、及SEQ ID NO:153之LC。亦提供該抗體以在療法中使用,諸如在治療免疫病症、類風溼性關節炎、狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、或移植物抗宿主病中使用。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:2、146、4、148、6、及7之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。 在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:141之VH、及SEQ ID NO:143之VL。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:151之HC、及SEQ ID NO:153之LC。亦提供該抗體以在療法中使用,諸如在治療免疫病症、類風溼性關節炎、狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、或移植物抗宿主病中使用。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:2、147、4、148、6、及7之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:142之VH、及SEQ ID NO:143之VL。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:152之HC、及SEQ ID NO:153之LC。亦提供該抗體以在療法中使用,諸如在治療免疫病症、類風溼性關節炎、狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、或移植物抗宿主病中使用。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:2、145、4、149、6、及7之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:140之VH、及SEQ ID NO:144之VL。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:150之HC、及SEQ ID NO:154之LC。亦提供該抗體以在療法中使用,諸如在治療免疫病症、類風溼性關節炎、狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、或移植物抗宿主病中使用。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或 其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:2、146、4、149、6、及7之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:141之VH、及SEQ ID NO:144之VL。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:151之HC、及SEQ ID NO:154之LC。亦提供該抗體以在療法中使用,諸如在治療免疫病症、類風溼性關節炎、狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、或移植物抗宿主病中使用。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:2、147、4、149、6、及7之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:142之VH、及SEQ ID NO:144之VL。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:152之HC、及SEQ ID NO:154之LC。亦提供該抗體以在療法中使用,諸如在治療免疫病症、類風溼性關節炎、狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、或移植物抗宿主病中使用。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段為促效性抗體。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其中該抗體與包含下列之抗體或抗原結合片段競爭結合至PD-1:SEQ ID NO:8之VH、及SEQ ID NO:14之VL;SEQ ID NO:9之VH、及SEQ ID NO:15之VL; SEQ ID NO:9之VH、及SEQ ID NO:16之VL;SEQ ID NO:10之VH、及SEQ ID NO:16之VL;SEQ ID NO:140之VH、及SEQ ID NO:16之VL;SEQ ID NO:141之VH、及SEQ ID NO:16之VL;SEQ ID NO:142之VH、及SEQ ID NO:16之VL;SEQ ID NO:10之VH、及SEQ ID NO:143之VL;SEQ ID NO:10之VH、及SEQ ID NO:144之VL;SEQ ID NO:140之VH、及SEQ ID NO:143之VL;SEQ ID NO:141之VH、及SEQ ID NO:143之VL;SEQ ID NO:142之VH、及SEQ ID NO:143之VL;SEQ ID NO:140之VH、及SEQ ID NO:144之VL;SEQ ID NO:141之VH、及SEQ ID NO:144之VL;或SEQ ID NO:142之VH、及SEQ ID NO:144之VL。
本發明亦在本文中提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其中該抗體結合由包含下列之抗體結合之相同表位:SEQ ID NO:8之VH、及SEQ ID NO:14之VL;SEQ ID NO:9之VH、及SEQ ID NO:15之VL;SEQ ID NO:9之VH、及SEQ ID NO:16之VL;SEQ ID NO:10之VH、及SEQ ID NO:16之VL;SEQ ID NO:140之VH、及SEQ ID NO:16之VL;SEQ ID NO:141之VH、及SEQ ID NO:16之VL; SEQ ID NO:142之VH、及SEQ ID NO:16之VL;SEQ ID NO:10之VH、及SEQ ID NO:143之VL;SEQ ID NO:10之VH、及SEQ ID NO:144之VL;SEQ ID NO:140之VH、及SEQ ID NO:143之VL;SEQ ID NO:141之VH、及SEQ ID NO:143之VL;SEQ ID NO:142之VH、及SEQ ID NO:143之VL;SEQ ID NO:140之VH、及SEQ ID NO:144之VL;SEQ ID NO:141之VH、及SEQ ID NO:144之VL;或SEQ ID NO:142之VH、及SEQ ID NO:144之VL。
在一些實施例中,本文提供之特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段的VH及VL、或HC及LC係由包含下列多核苷酸序列之多核苷酸編碼:分別為SEQ ID NO:11及17;分別為SEQ ID NO:12及18;分別為SEQ ID NO:12及19;分別為SEQ ID NO:13及19;分別為SEQ ID NO:23及29;分別為SEQ ID NO:24及30;分別為SEQ ID NO:24及31;分別為SEQ ID NO:25及31;分別為SEQ ID NO:132及133;或分別為SEQ ID NO:134及135; 分別為SEQ ID NO:155及19;分別為SEQ ID NO:156及19;分別為SEQ ID NO:157及19;分別為SEQ ID NO:13及158;分別為SEQ ID NO:13及159;分別為SEQ ID NO:155及158;分別為SEQ ID NO:156及158;分別為SEQ ID NO:157及158;分別為SEQ ID NO:155及159;分別為SEQ ID NO:156及159;分別為SEQ ID NO:157及159;分別為SEQ ID NO:160及31;分別為SEQ ID NO:161及31;分別為SEQ ID NO:162及31;分別為SEQ ID NO:25及163;分別為SEQ ID NO:25及164;分別為SEQ ID NO:160及163;分別為SEQ ID NO:161及163;分別為SEQ ID NO:162及163;分別為SEQ ID NO:160及164;分別為SEQ ID NO:161及164;或分別為SEQ ID NO:162及164。
mAb PD1B506、PD1B750、PD1B751、PD1B845、PD1B846、PD1B847、PD1B848、PD1B849、及PD1B850為PD1B506 mAb譜系之例示性抗體。此等mAb具有相同的HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3、以及變異體HCDR2。VH區同一性係介於80至100%之間,且VL區同一性為約98%。PD1B506譜系mAb為配體阻斷性的。譜系之特徵在於分別為SEQ ID NO:32、124、40、41、42、及43之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3,及在於SEQ ID NO:120之VH屬序列、及SEQ ID NO:121之VL屬序列。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:32、124、40、41、42、及43之HCDR1、HCDR2、及HCDR3。
SEQ ID NO:124(PD1B506譜系HCDR2屬)EINPNX1X2GIN;其中X1為N、D、Q、K、或E;且X2為G、A、或I。
在一些實施例中,特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO:33、34、35、36、37、38、或39之HCDR2。
在一些實施例中,本文提供之抗體或其抗原結合片段具有下列性質之一、二、三、四、或五者:阻斷PD-L1結合至PD-1,其中阻斷係如實例1中所述藉由該抗體抑制PD-L1表現細胞及PD-1表現細胞之叢聚之能力來測量;以約5×10-8M或更小之平衡解離常數(KD)結合PD-1,其中該KD係使用ProteOn XPR36系統在+25℃測量;以約4×105 1/Ms或更大之締合常數(ka)結合PD-1,其中該ka係使用ProteOn XPR36系統在+25℃測量;以約1×10-2 1/s或更小之解離常數(kd)結合PD-1,其中該kd係使用ProteOn XPR36系統在+25℃測量;或抑制抗原特異性T細胞之增生;其中增生係如實例1中所述在CMV-PBMC檢定中評定。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段包含衍生自IGHV1-2*02之VH架構(SEQ ID NO:127)。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段包含衍生自IGKV1D-16*1之VL架構(SEQ ID NO:128)。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段包含衍生自IGHV1-2*02之VH架構(SEQ ID NO:127)、及衍生自IG IGKV1D-16*1之VL架構(SEQ ID NO:128)。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含SEQ ID NO:120之重鏈可變區(VH)。SEQ ID NO:120為PD1B506譜系mAb之VH屬序列。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含SEQ ID NO:121之輕鏈可變區(VL)。SEQ ID NO:121為PD1B506譜系mAb之VL屬序列。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含SEQ ID NO:120之VH、及SEQ ID NO:121之VL。CDR在SEQ ID NO:120及SEQ ID NO:121中為粗體。
SEQ ID NO:120(PD1B506譜系VH屬) ;其中 X1為Q或V; X2為S或P;X3為L或V;X4為V或K;X5為L或V;X6為K或R;X7為R或A;X8為I或M;X9為N、D、Q、K、或E;X10為G、A、或I;X11為N或A;X12為E或Q;X13為K或Q;X14為K或G;X15為K或R X16為A或V;X17為S或I;X18為Q或E;X19為S或R;X20為T或R;X21為E或D;X22為S或T;X23為T或L;且 X24為L或V。
SEQ ID NO:121(PD1B506譜系VL屬) ;其中 X1為V或Q;X2為Q或P;X3為K或S;X4為F或S;X5為M或L;X6為T或A;X7為R或G;X8為S或T;X9為V或I;X10為G或E;X11為Q或K;X12為S或A;X13為A或S;X14為D或S;X15為T或S;X16為T或S; X17為N或S;X18為V或L;X19為S或P;X20為L或F;X21為E或T;X22為F或Y;X23為S或Q;且X24為M或I。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO:44、45、46、47、48、49、50、或51之VH。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO:60、61、或62之VL。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO:44、45、46、47、48、49、50、或51之VH、及SEQ ID NO:60、61、或62之VL。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:32、33、40、41、42、及43之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:44或45之VH、及SEQ ID NO:60、61、或62之VL。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:66或67之HC、及SEQ ID NO:82、83、或84 之LC。亦提供該抗體以在療法中使用,諸如在治療免疫病症、類風溼性關節炎、狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、或移植物抗宿主病中使用。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:32、34、40、41、42、及43之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:46之VH、及SEQ ID NO:61之VL。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:68之HC、及SEQ ID NO:83之LC。亦提供該抗體以在療法中使用,諸如在治療免疫病症、類風溼性關節炎、狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、或移植物抗宿主病中使用。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:32、35、40、41、42、及43之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:47之VH、及SEQ ID NO:61之VL。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:69之HC、及SEQ ID NO:83之LC。亦提供該抗體以在療法中使用,諸如在治療免疫病症、類風溼性關節炎、狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、或移植物抗宿主病中使用。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:32、36、40、41、42、及43之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:48之VH、及 SEQ ID NO:61之VL。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:70之HC、及SEQ ID NO:83之LC。亦提供該抗體以在療法中使用,諸如在治療免疫病症、類風溼性關節炎、狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、或移植物抗宿主病中使用。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:32、37、40、41、42、及43之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:49之VH、及SEQ ID NO:61之VL。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:71之HC、及SEQ ID NO:83之LC。亦提供該抗體以在療法中使用,諸如在治療免疫病症、類風溼性關節炎、狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、或移植物抗宿主病中使用。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:32、38、40、41、42、及43之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:50之VH、及SEQ ID NO:61之VL。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:72之HC、及SEQ ID NO:83之LC。亦提供該抗體以在療法中使用,諸如在治療免疫病症、類風溼性關節炎、狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、或移植物抗宿主病中使用。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:32、39、40、41、42、 及43之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:51之VH、及SEQ ID NO:61之VL。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:73之HC、及SEQ ID NO:83之LC。亦提供該抗體以在療法中使用,諸如在治療免疫病症、類風溼性關節炎、狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、或移植物抗宿主病中使用。
在一些實施例中,抗體為促效性抗體。
本發明亦在本文中提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其中該抗體與包含下列之抗體或抗原結合片段競爭結合至PD-1:SEQ ID NO:44之VH、及SEQ ID NO:60之VL;SEQ ID NO:45之VH、及SEQ ID NO:61之VL;SEQ ID NO:45之VH、及SEQ ID NO:62之VL;SEQ ID NO:46之VH、及SEQ ID NO:61之VL;SEQ ID NO:47之VH、及SEQ ID NO:61之VL;SEQ ID NO:48之VH、及SEQ ID NO:61之VL;SEQ ID NO:49之VH、及SEQ ID NO:61之VL;SEQ ID NO:50之VH、及SEQ ID NO:61之VL;或SEQ ID NO:51之VH、及SEQ ID NO:61之VL。
本發明亦在本文中提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其中該抗體結合由包含下列之抗體結合之相同表位: SEQ ID NO:44之VH、及SEQ ID NO:60之VL;SEQ ID NO:45之VH、及SEQ ID NO:61之VL;SEQ ID NO:45之VH、及SEQ ID NO:62之VL;SEQ ID NO:46之VH、及SEQ ID NO:61之VL;SEQ ID NO:47之VH、及SEQ ID NO:61之VL;SEQ ID NO:48之VH、及SEQ ID NO:61之VL;SEQ ID NO:49之VH、及SEQ ID NO:61之VL;SEQ ID NO:50之VH、及SEQ ID NO:61之VL;或SEQ ID NO:51之VH、及SEQ ID NO:61之VL。
在一些實施例中,本文提供之特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段之VH及VL、或HC及LC係由包含下列多核苷酸序列之多核苷酸編碼:分別為SEQ ID NO:52及63;分別為SEQ ID NO:53及64;分別為SEQ ID NO:53及65;分別為SEQ ID NO:54及64;分別為SEQ ID NO:55及64;分別為SEQ ID NO:56及64;分別為SEQ ID NO:57及64;分別為SEQ ID NO:58及64;分別為SEQ ID NO:59及64;分別為SEQ ID NO:74及85; 分別為SEQ ID NO:75及86;分別為SEQ ID NO:75及87;分別為SEQ ID NO:76及86;分別為SEQ ID NO:77及86;分別為SEQ ID NO:78及86;分別為SEQ ID NO:79及86;分別為SEQ ID NO:80及86;分別為SEQ ID NO:81及86;分別為SEQ ID NO:136及137;或分別為SEQ ID NO:138及139。
mAb PD1B505、PD1B756、及PD1B757為PD1B512 mAb譜系之例示性抗體。此等mAb具有相同的CDR區,其中VH區同一性為約84%,且VL區同一性介於90至99%之間。PD1B512譜系mAb為配體非阻斷性的。譜系之特徵在於分別為SEQ ID NO:88、89、90、91、92、及93之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3,及在於SEQ ID NO:122之VH屬序列、及SEQ ID NO:123之VL屬序列。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:88、89、90、91、92、及93之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及 LCDR3。
在一些實施例中,該抗體或其抗原結合片段不阻斷PD-L1結合至PD-1,其中阻斷之缺乏係如實例1中所述藉由該抗體不能抑制PD-L1表現細胞及PD-1表現細胞之叢聚來測量。
在一些實施例中,本文提供之特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段包含衍生自IGHV2-5*04之VH架構(SEQ ID NO:129)。
在一些實施例中,本文提供之特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段包含衍生自IGKV2-28*01之VL架構(SEQ ID NO:130)。
在一些實施例中,本文提供之特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段包含衍生自IGHV2-5*04之VH架構(SEQ ID NO:129)、及衍生自IGKV2-28*01之VL架構(SEQ ID NO:130)。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含SEQ ID NO:122之重鏈可變區(VH)。SEQ ID NO:122為PD1B512譜系mAb之VH屬序列。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含SEQ ID NO:123之輕鏈可變區(VL)。SEQ ID NO:123為PD1B512譜系mAb之VL屬序列。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含SEQ ID NO:122之VH、及SEQ ID NO:123之VL。CDR在SEQ ID NO:122及SEQ ID NO:123中為粗體。
SEQ ID NO:122(PD1B112譜系VH屬) ,其中 X1為V或I;X2為G或T;X3為L或V;X4為Q或K;X5為S或T;X6為S或T; X7為S或T;X8為S或P;X9為G或A;X10為N或S;X11為S或T;X12為S或K;X13為F或V;X14為K或T;X15為I或M;X16為S或N;X17為V或M;X18為T或P;X19為A或V;且X20為T或L。
SEQ ID NO:123(PD1B112譜系VL屬) ,其中 X1為A或S;X2為A或P;X3為N或L; X4為L或P;X5為T或E;X6為S或P;X7為S或G;X8為R或K;X9為S或G;X10為L或V;且X11為M或I。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO:94或95之VH。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO:98、99、或100之VL。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含SEQ ID NO:94或95之VH、及SEQ ID NO:98、99、或100之VL。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含SEQ ID NO:94之VH、及SEQ ID NO:98之VL。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:104之HC、及SEQ ID NO:108之LC。亦提供該抗體以在療法中使用,諸如在治療免疫病症、類風溼性關節炎、狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、或移植物抗宿主病中使用。
在一些實施例中,本文提供之特異性結合PD-1之抗體 或其抗原結合片段包含SEQ ID NO:95之VH、及SEQ ID NO:99之VL。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:105之HC、及SEQ ID NO:109之LC。亦提供該抗體以在療法中使用,諸如在治療免疫病症、類風溼性關節炎、狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、或移植物抗宿主病中使用。
在一些實施例中,本文提供之特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO:95之VH、及SEQ ID NO:100之VL。在一些實施例中,該抗體包含SEQ ID NO:105之HC、及SEQ ID NO:110之LC。亦提供該抗體以在療法中使用,諸如在治療免疫病症、類風溼性關節炎、狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、或移植物抗宿主病中使用。
在一些實施例中,抗體為促效性抗體。
本發明亦在本文中提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其中該抗體與包含下列之抗體或抗原結合片段競爭結合至PD-1:SEQ ID NO:94之VH、及SEQ ID NO:98之VL;SEQ ID NO:95之VH、及SEQ ID NO:99之VL;或SEQ ID NO:95之VH、及SEQ ID NO:100之VL。
本發明亦在本文中提供一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其中該抗體結合由包含下列之抗體結合之相同表位:SEQ ID NO:94之VH、及SEQ ID NO:98之VL; SEQ ID NO:95之VH、及SEQ ID NO:99之VL;或SEQ ID NO:95之VH、及SEQ ID NO:100之VL。
在一些實施例中,本文提供之特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段的VH及VL、或HC及LC係由包含下列多核苷酸序列之多核苷酸編碼:分別為SEQ ID NO:96及101;分別為SEQ ID NO:97及102;分別為SEQ ID NO:97及103;分別為SEQ ID NO:106及111;分別為SEQ ID NO:107及112;或分別為SEQ ID NO:107及113。
本文提供之特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段之變異體係在本發明之範疇內。例如,變異體可在VH及/或VL中包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、或29個胺基酸取代,只要當相較於親本抗體時該等變異體抗體保持或改善功能性質。在一些實施例中,與本發明之VH及/或VL胺基酸序列之序列同一性可為約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%。在一些實施例中,變異係在架構區中。在一些實施例 中,變異體係由保守取代產生。
例如,PD1B505譜系抗體可包含VH殘基位置1、5、6、9、16、17、20、38、43、46、57、62、63、65、69、73、76、84、85、88、93、116、及/或117(根據SEQ ID NO:8之殘基編號)處及VL殘基位置1、10、11、13、15、19、21、22、29、30、43、44、46、48、59、61、71、72、73、78、79、81、84、86、101、及/或107(根據SEQ ID NO:14之殘基編號)處之取代。PD1B506譜系抗體可包含VH殘基位置5、7、11、12、20、38、40、48、55、56、61、62、65、66、67、68、76、82、85、87、89、91、112、及/或113(根據SEQ ID NO:44之殘基編號)處及VL殘基位置3、8、9、10、11、13、16、20、21、41、42、43、46、60、63、76、77、78、80、83、85、87、100、及/或106(根據SEQ ID NO:60之殘基編號)處之取代。PD1B512譜系抗體可包含VH殘基位置2、10、12、13、15、19、23、43、46、62、72、77、81、83、84、86、87、89、90、及/或117處及VL殘基位置7、8、11、15、17、18、69、79、105、109、及/或111處之取代。保守取代可在任何指示位置處進行,且在本文所述之檢定中測試所得變異體抗體之所欲特性。替代地,一種譜系mAb中之取代可在指示位置處藉由用存在於該譜系內之其他抗體中之特定位置處的對應胺基酸取代來進行。
亦提供特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段,其包含與下列具有至少80%同一性之VH就及VL:SEQ ID NO:8之VH、及SEQ ID NO:14之VL; SEQ ID NO:9之VH、及SEQ ID NO:15之VL;SEQ ID NO:9之VH、及SEQ ID NO:16之VL;SEQ ID NO:10之VH、及SEQ ID NO:16之VL;SEQ ID NO:140之VH、及SEQ ID NO:16之VL;SEQ ID NO:141之VH、及SEQ ID NO:16之VL;SEQ ID NO:142之VH、及SEQ ID NO:16之VL;SEQ ID NO:10之VH、及SEQ ID NO:143之VL;SEQ ID NO:10之VH、及SEQ ID NO:144之VL;SEQ ID NO:140之VH、及SEQ ID NO:143之VL;SEQ ID NO:141之VH、及SEQ ID NO:143之VL;SEQ ID NO:142之VH、及SEQ ID NO:143之VL;SEQ ID NO:140之VH、及SEQ ID NO:144之VL;SEQ ID NO:141之VH、及SEQ ID NO:144之VL;SEQ ID NO:142之VH、及SEQ ID NO:144之VL;SEQ ID NO:44之VH、及SEQ ID NO:60之VL;SEQ ID NO:45之VH、及SEQ ID NO:61之VL;SEQ ID NO:45之VH、及SEQ ID NO:62之VL;SEQ ID NO:46之VH、及SEQ ID NO:61之VL;SEQ ID NO:47之VH、及SEQ ID NO:61之VL;SEQ ID NO:48之VH、及SEQ ID NO:61之VL;SEQ ID NO:49之VH、及SEQ ID NO:61之VL;SEQ ID NO:50之VH、及SEQ ID NO:61之VL; SEQ ID NO:51之VH、及SEQ ID NO:61之VL;SEQ ID NO:94之VH、及SEQ ID NO:98之VL;SEQ ID NO:95之VH、及SEQ ID NO:99之VL;或SEQ ID NO:95之VH、及SEQ ID NO:100之VL。
在一些實施例中,同一性為85%。在一些實施例中,同一性為90%。在一些實施例中,同一性為91%。在一些實施例中,同一性為91%。在一些實施例中,同一性為92%。在一些實施例中,同一性為93%。在一些實施例中,同一性為94%。在一些實施例中,同一性為94%。在一些實施例中,同一性為96%。在一些實施例中,同一性為97%。在一些實施例中,同一性為98%。在一些實施例中,同一性為99%。
兩個序列間之同一性百分比係該等序列所共有之相同位置數目的函數(即同一性%=相同位置數目/總位置數目×100),並且將需要被引入以最佳比對這兩個序列之缺口(gap)數目及各缺口長度納入考慮。
兩個胺基酸序列之間的同一性百分比可以使用已被併入ALIGN程式(版本2.0)中的E.Meyers及W.Miller的演算法(Comput Appl Biosci 4:11-17(1988))來判定,其使用PAM120權重殘基表(weight residue table),缺口長度罰分(gap length penalty)為12且缺口罰分(gap penalty)為4。此外,兩個胺基酸序列之間的同一性百分比可以使用已被併入GCG軟體套件(可在http_//_www_gcg_com取得)中之GAP程式的Needleman及Wunsch(J Mol Biol 48:444-453 (1970))演算法來判定,其使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣,且缺口權重(gap weight)為16、14、12、10、8、6、或4且長度權重(length weight)為1、2、3、4、5、或6。
在一些實施例中,變異體抗體包含CDR區之任一者中之一或兩個保守取代,其中該抗體保持親本抗體之所欲功能性質。
「保守修飾(conservative modification)」係指不會顯著影響或改變含有胺基酸修飾之抗體之結合特性的胺基酸修飾。保守修飾包括胺基酸取代、添加(addition)及缺失(deletion)。保守胺基酸取代為胺基酸被具有相似側鏈之胺基酸殘基置換的取代。具有相似側鏈之胺基酸殘基的家族已有明確界定,且包括具有以下者之胺基酸:酸性側鏈(如天冬胺酸、麩胺酸)、鹼性側鏈(如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、非極性側鏈(如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、不帶電極性側鏈(如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、色胺酸)、芳族側鏈(如苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸、酪胺酸)、脂族側鏈(如甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸)、醯胺(如天冬醯胺酸、麩醯胺酸)、β分支側鏈(如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)、及含硫側鏈(半胱胺酸、甲硫胺酸)。此外,多肽中的任何天然殘基亦可經丙胺酸取代,如先前已針對丙胺酸掃描式突變誘發(alanine scanning mutagenesis)所描述者(MacLennan等人,(1988)Acta Physiol Scand Suppl 643:55-67;Sasaki等人,(1988)Adv Biophys 35:1-24)。本發明之抗體的胺基酸取代可藉由已知方法進 行,例如藉由PCR誘變(美國專利第4,683,195號)。替代地,可產生變異體庫,例如使用隨機(NNK)或非隨機密碼子(例如DVK密碼子),其編碼11種胺基酸(Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、Lys、Asn、Arg、Ser、Tyr、Trp)。所得抗體變異體可使用本文中所述之檢定來測試其特性。
本文提供之特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段可進一步經工程改造以產生當相較於親本抗體時具有相似或改變性質之經修飾抗體。本發明之抗體中之VH、VL、VH及VL、恆定區、重鏈架構、輕鏈架構、或任一者或全部六個CDR可經工程改造。
特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段可藉由CDR移植來工程改造。可將本發明之抗體的一或多個CDR序列移植至不同的架構序列。CDR移植可使用本文所述之方法及習知方法進行。
可使用之架構序列可自包括生殖系抗體基因序列的公共DNA資料庫或公開之參考文獻獲得。例如,生殖系DNA及人類重鏈及輕鏈可變域基因所編碼之蛋白質序列可見於IMGT®(the international ImMunoGeneTics information system® http_//_www-imgt_org)。可用於置換本發明之抗體中現有架構序列的架構序列可為在VH或VL之整個長度上或在FR1、FR2、FR3及FR4之長度上與親本可變域顯示最高同一性百分比(%)的架構序列。此外,可基於VH及VL、CDR1及CDR2長度或相同的LCDR1、LCDR2、LCDR3、 HCDR1及HCDR2正則結構(canonical structure)進一步選擇合適的架構。可使用已知方法來選擇合適的架構,諸如美國專利第8,748,356號中描述的人類架構調適或美國專利第7,709,226號中描述的超人源化(superhumanization)。
親本抗體及經工程改造之抗體的架構序列可經進一步修飾,例如藉由回復突變(backmutation)以恢復及/或改善所產生之抗體與抗原的結合,如例如美國專利第6,180,370號中所述。親本抗體或經工程改造之抗體的架構序列可進一步藉由突變架構區內(或替代地一或多個CDR區內)的一或多個殘基來修飾,以移除T細胞表位,從而降低抗體的潛在免疫原性(immunogenicity)。此方法亦稱為「去免疫化(deimmunization)」且係進一步詳細描述於美國專利公開號US20070014796中。
本文提供之抗體或其抗原結合片段之CDR殘基可經突變以改善抗體對PD-1之親和力。
本文提供之抗體或其抗原結合片段之CDR殘基可經突變以最小化轉譯後修飾之風險。用於脫胺(NS)、酸催化水解(DP)、異構化(DS)、或氧化(W)的推定模體(putative motif)的胺基酸殘基可被任何天然存在的胺基酸取代以誘變(mutagenize)該等模體,並且可使用本文所述之方法測試所生成之抗體的功能性及穩定性。
經修飾以改善穩定性、選擇性、交叉反應性、親和力、免疫原性或其他所欲生物或生物物理性質的本文提供之特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段係在本發明之範疇內。抗體穩定性會受 多種因素影響,包括(1)影響抗體固有穩定性之個別域的核心堆積(core packing)、(2)對HC及LC配對具有影響的蛋白質/蛋白質界面相互作用、(3)極性及帶電荷殘基之埋藏、(4)極性及帶電荷殘基之H鏈結網絡;及(5)在其他分子內及分子間力中之表面電荷及極性殘基分布(Worn等人,(2001)J Mol Biol 305:989-1010)。可能使結構不穩定的殘基可基於該抗體之晶體結構或者在某些情況下可藉由分子模擬來識別出來,並且殘基對於抗體穩定性之效應可藉由產生並評估在所識別之殘基中含有突變之變異體來測試。提高抗體穩定性的其中一個方式是提升熱轉移中點(thermal transition midpoint,Tm),如由微差掃描熱量法(DSC)所測得者。通常,蛋白質之Tm與其穩定性相關,且與其對於在溶液中之展開(unfolding)及變性的易感性及取決於蛋白質展開之傾向的降解過程反相關(Remmele等人,(2000)Biopharm 13:36-46)。多個研究已發現配方物理穩定性(以DSC測得為熱穩定性)之排序(ranking)與以其他方法測得之物理穩定性間有關聯性(Gupta等人,(2003)AAPS PharmSci 5E8;Zhang等人,(2004)J Pharm Sci 93:3076-89;Maa等人,(1996)Int J Pharm 140:155-68;Bedu-Addo等人,(2004)Pharm Res 21:1353-61;Remmele等人,(1997)Pharm Res 15:200-8)。配方研究顯示Fab之Tm具有對於一相應mAb之長期物理穩定性的涵示。
本文提供之特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段 可屬於具有野生型或經工程改造之Fc的任何已知同型或同種異型。
在一些實施例中,本文提供之特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段為IgG1同型。
在一些實施例中,本文提供之特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段為IgG2同型。
在一些實施例中,本文提供之特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段為IgG3同型。
在一些實施例中,本文提供之特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段為IgG4同型。
可藉由血流中的內源性循環羧肽酶從注射的抗體中除去C-末端離胺酸(CTL)(Cai et al.,(2011)Biotechnol Bioeng 108:404-412)。在製造期間,藉由控制胞外Zn2+、EDTA或EDTA-Fe3+的濃度可將CTL移除控制在小於最大水準,如美國專利公開號US20140273092中所述。抗體中之CTL含量可使用已知方法測量。
在一些實施例中,本文提供之特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段具有約10%至約90%之C端離胺酸含量。在一些實施例中,C端離胺酸含量為約20%至約80%。在一些實施例中,C端離胺酸含量為約40%至約70%。在一些實施例中,C端離胺酸含量為約55%至約70%。在一些實施例中,C端離胺酸含量為約60%。
治療性抗體的免疫原性與輸注反應(infusion reaction)的風險增加及治療反應的持續時間減少相關聯(Baert等人,(2003)N Engl J Med 348:602-08)。治療性抗體在宿主中誘導免疫反應的程度 可部分地由該抗體之同種異型決定(Stickler et al.,(2011)Genes及Immunity 12:213-21)。抗體同種異型與抗體恆定區序列中特定位置處的胺基酸序列變異相關。表2顯示所選之IgG1、IgG2、及IgG4同種異型。
在一些實施例中,本文提供之特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段為G2m(n)同種異型。
在一些實施例中,本文提供之特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段為G2m(n-)同種異型。
在一些實施例中,本文提供之特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段為G2m(n)/(n-)同種異型。
在一些實施例中,本文提供之特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段為nG4m(a)同種異型。
在一些實施例中,本文提供之特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段為G1m(17,1)同種異型。
可對本文提供之特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合 片段進行Fc突變,以調節抗體效應功能,諸如ADCC、ADCP、及/或ADCP,及/或藥物動力學性質。這可藉由將(多個)突變引入Fc中來達成,該(等)突變調節突變Fc與活化性FcγR(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIII)、抑制性FcγRIIb、及/或FcRn之結合。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段在抗體Fc中包含至少一個突變。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段在Fc中包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、或十五個突變。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段在Fc中包含至少一個突變,該至少一個突變調節抗體與FcRn之結合。
可經突變以調節抗體半衰期之Fc位置(例如,與FcRn之結合包括位置250、252、253、254、256、257、307、376、380、428、434、及435。可單獨或組合進行之例示性突變為突變T250Q、M252Y、I253A、S254T、T256E、P257I、T307A、D376V、E380A、M428L、H433K、N434S、N434A、N434H、N434F、H435A、及H435R。可進行以增加本文提供之抗體之半衰期的例示性單個或組合突變為突變M428L/N434S、M252Y/S254T/T256E、T250Q/M428L、N434A、及T307A/E380A/N434A。可進行以減少本文提供之抗體之半衰期的例示性單個或組合突變為突變H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、 M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A、及H435R。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段包含突變M252Y/S254T/T256E。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段在抗體Fc中包含至少一個突變,其減少該抗體與活化性Fcγ受體(FcγR)之結合、且/或降低Fc效應功能(諸如C1q結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、或吞噬作用(ADCP))。
可經突變以減少抗體與活化性FcγR之結合且因而降低效應功能之Fc位置包括位置214、233、234、235、236、237、238、265、267、268、270、295、297、309、327、328、329、330、331、及365。可單獨或組合進行之例示性突變為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中之突變K214T、E233P、L234V、L234A、G236缺失、V234A、F234A、L235A、G237A、P238A、P238S、D265A、S267E、H268A、H268Q、Q268A、N297A、A327Q、P329A、D270A、Q295A、V309L、A327S、L328F、A330S、及P331S。導致具有降低之ADCC之抗體的例示性組合突變為下列突變:IgG1上之L234A/L235A、IgG2上之V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、IgG4上之F234A/L235A、IgG4上之S228P/F234A/L235A、所有Ig同型上之N297A、IgG2上之V234A/G237A、IgG1上之K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失/A327G/P331A/D365E/L358M、IgG2上之 H268Q/V309L/A330S/P331S、IgG1上之S267E/L328F、IgG1上之L234F/L235E/D265A、IgG1上之L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、IgG4上之S228P/F234A/L235A/G237A/P238S、及IgG4上之S228P/F234A/L235A/G236缺失/G237A/P238S。亦可使用混成的IgG2/4 Fc域,諸如具有來自IgG2的殘基117至260及來自IgG4的殘基261至447的Fc。
導致具有降低之CDC之抗體的例示性突變為K322A突變。
可在IgG4抗體中進行熟知的S228P突變以增強IgG4穩定性。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段包含至少一個殘基位置214、233、234、235、236、237、238、265、267、268、270、295、297、309、322、327、328、329、330、331、或365中之突變。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段包含至少一個突變,其係選自由下列所組成之群組:K214T、E233P、L234V、L234A、G236缺失、V234A、F234A、L235A、G237A、P238A、P238S、D265A、S267E、H268A、H268Q、Q268A、N297A、A327Q、P329A、D270A、Q295A、V309L、A327S、L328F、K322、A330S、及P331S。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結 合片段包含至少一個殘基位置228、234、235、237、238、268、322、330、或331中之突變。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段包含K322A突變。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段包含S228P突變。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段在抗體Fc中包含至少一個突變,其增強該抗體與Fcγ受體(FcγR)之結合、且/或增強Fc效應功能(諸如C1q結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、及/或吞噬作用(ADCP))。
可經突變以增加抗體與活化性FcγR之結合且/或增強抗體效應功能之Fc位置包括位置236、239、243、256、290、292、298、300、305、312、326、330、332、333、334、345、360、339、378、396、或430(根據EU索引之殘基編號)。可單獨或組合進行之例示性突變為G236A突變、S239D突變、F243L突變、T256A突變、K290A突變、R292P突變、S298A突變、Y300L突變、V305L突變、K326A突變、A330K突變、I332E突變、E333A突變、K334A突變、A339T突變、及P396L突變。導致具有增加的ADCC或ADCP之抗體的例示性組合突變為IgG1上之S239D/I332E突變、S298A/E333A/K334A突變、F243L/R292P/Y300L突變、F243L/R292P/Y300L/P396L突變、 F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L突變、及G236A/S239D/I332E突變。
可經突變以增強抗體CDC之Fc位置包括位置267、268、324、326、333、345、及430。可單獨地或組合進行之例示性突變為S267E突變、F1268F突變、S324T突變、K326A突變、K326W突變、E333A突變、E345K突變、E345Q突變、E345R突變、E345Y突變、E430S突變、E430F突變、及E430T突變。導致具有增加的CDC之抗體的例示性組合突變為IgG1上之K326A/E333A突變、K326W/E333A突變、H268F/S324T突變、S267E/H268F突變、S267E/S324T突變、及S267E/H268F/S324T突變。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段在抗體Fc中包含至少一個突變,該至少一個突變增強抗體與FcγRIIb之結合。與FcγRIIb之結合增強可導致FcγRIIb+ B細胞之減弱,且/或導致抗體之叢聚及隨後之PD-1下游傳訊路徑之活化。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段包含S267E突變。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段包含S267D突變。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段包含S267E/I332E突變。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段包含S267E/L328F突變。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段包含G236D/S267E突變。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段包含P238D/E233D/G237D/H268D/P271G/A330R突變。
在一些實施例中,特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段包含P238D突變。
「抗體依賴性細胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity)」、「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)」、或「ADCC」是一種誘導細胞死亡的機制,其取決於抗體包覆的目標細胞與具有裂解活性的效應細胞(諸如自然殺手細胞(NK)、單核球、巨噬細胞及嗜中性球)之間經由表現在效應細胞上的Fcγ受體(FcγR)的相互作用。例如,NK細胞表現FcγRIIIa,而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIIIa。本文提供之抗體之ADCC活性可使用體外檢定使用PD-1表現細胞作為目標細胞及NK細胞作為效應細胞來評定。細胞裂解可透過從裂解細胞中釋放的標記(例如放射性基質、螢光染料或天然的細胞內蛋白)來檢測。在一例示性檢定中,目標細胞係以1個目標細胞對4個效應細胞之比率使用。將目標細胞用BATDA預標記,並與效應細胞及測試抗體組合。將樣本培養2小時,且藉由測量釋放至上清液中之BATDA來測量細胞裂解。將數據相對於使用0.67% Triton X-100(Sigma Aldrich)的最大細胞毒性及在沒有任何抗體的情況下由目標細胞自發釋放的BATDA所判定之最小對照值正規化。
「抗體依賴性細胞吞噬作用」(「ADCP」)係指一種透過吞噬細胞(諸如巨噬細胞或樹突細胞)內化(internalization)以消滅抗體包覆的目標細胞的機制。ADCP可藉由使用衍生自單核球的巨噬細胞作為效應細胞並使用道迪(Daudi)細胞(ATCC® CCL-213TM)或任何其他PD-1表現細胞作為目標細胞來評估,該等目標細胞經工程改造以表現GFP或其他標記分子。在一例示性檢定中,效應細胞:目標細胞比可為例如4:1。可將效應細胞與目標細胞在存在或不存在本發明之抗體的情況下一起培養4小時。培養後,使用細胞剝離液(accutase)將細胞分離。巨噬細胞可用偶接螢光標記的抗CD11b及抗CD14抗體來鑑定,且吞噬作用百分比可根據在該等CD11+CD14+巨噬細胞中的GFP螢光百分比使用標準方法判定。
「補體依賴性細胞毒性(complement-dependent cytotoxicity)」或「CDC」係指一種誘導細胞死亡的機制,其中與目標結合之抗體的Fc效應域結合並活化補體成分C1q,其轉而活化補體級聯反應而導致目標細胞死亡。補體之活化亦可造成補體成分沉積在該目標細胞表面上,其藉由結合白血球上的補體受體(例如,CR3)而促進CDC。細胞之CDC可藉由例如下列步驟來測量:將道迪細胞以1×105個細胞/孔(50μL/孔)種於RPMI-B(補充有1% BSA之RPMI)中、在孔中添加50μL測試抗體使最終濃度在0至100μg/mL之間、將反應在室溫下培養15min、在孔中添加11μL的匯集人類血清、及將反應在37℃下培養45min。裂解細胞百分比(%)可使用標準方法以FACS檢定中經碘化丙啶染色的細胞%來偵測。
抗體與FcγR或FcRn之結合可在經工程改造以表現各受體之細胞上使用流動式細胞測量術來評定。在一例示性結合檢定中,將每孔2×105個細胞接種於96孔盤中,且在4℃下在BSA染色緩衝液(BD Biosciences,San Jose,USA)中阻斷30min。將細胞與測試抗體在冰上在4℃下培養1.5小時。用BSA染色緩衝液洗滌兩次之後,將細胞與經R-PE標記之抗人類IgG二級抗體(Jackson Immunoresearch Laboratories)在4℃下培養45min。將細胞在染色緩衝液中洗滌兩次,且接著再懸浮於150μL含有1:200稀釋之DRAQ7活/死染色劑之染色緩衝液(Cell Signaling Technology,Danvers,USA)中。經染色細胞之PE及DRAQ7信號係藉由Miltenyi MACSQuant流式細胞儀(Miltenyi Biotec,Auburn,USA)分別使用B2及B4通道來偵測。以DRAQ7排除對活細胞進行閘控(gated),且判定收集之至少10,000個活事件之幾何平均螢光信號。將FlowJo軟體(Tree Star)用於分析。將數據繪製為抗體濃度之對數對平均螢光信號。執行非線性迴歸分析。
「增強(enhance/enhanced)」係指當相較於沒有突變之親本抗體時,本發明抗體的增強之效應功能(例如,ADCC、CDC、及/或ADCP)或增強之與Fcγ受體(FcγR)或FcRn之結合,本發明抗體在Fc區中具有至少一個突變。「增強」可為約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更多之增強、或統計上顯著的增強。
「降低(reduce/reduced)」係指當相較於沒有突變之親 本抗體時,本發明抗體的降低之效應功能(例如,ADCC、CDC、及/或ADCP)或降低之與Fcγ受體(FcγR)或FcRn之結合,本發明抗體在Fc區中具有至少一個突變。「降低」可為約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更多之降低、或統計上顯著的降低。
「調節(modulate)」係指當相較於沒有突變之親本抗體時,本發明抗體的增強或降低之效應功能(例如,ADCC、CDC、及/或ADCP)、或增強或降低之與Fcγ受體(FcγR)或FcRn之結合,本發明抗體在Fc區中具有至少一個突變。
單株抗體誘導ADCC之能力可藉由工程改造其寡醣組分來增強。人類IgG1或IgG3係在Asn297處經N-醣基化並且大部分聚醣係呈廣為周知之雙觸角(biantennary)G0、G0F、G1、G1F、G2或G2F形式。由未經工程改造之CHO細胞所生產之抗體典型具有約至少85%之聚醣海藻糖(glycan fucose)含量。自附接至Fc區之雙觸角複合型寡醣移除核心海藻糖經由改善FcγRIIIa結合且不改變抗原結合或CDC活性來增強抗體之ADCC。此等mAb可使用已報導會導致成功表現相對高量去海藻糖基化(defucosylated)抗體(帶有雙觸角複合型之Fc寡醣)的不同方法來達成,諸如控制培養滲透壓(Konno等人,Cytotechnology 64(:249-65,2012)、應用變異體CHO系Lec13作為宿主細胞系(Shields等人,J Biol Chem 277:26733-26740, 2002)、應用變異體CHO系EB66作為宿主細胞系(Olivier等人,MAbs;2(4):405-415,2010;PMID:20562582)、應用大鼠融合瘤細胞系YB2/0作為宿主細胞系(Shinkawa等人,J Biol Chem 278:3466-3473,2003)、引入特異性針對1,6-海藻糖基轉移酶(FUT8)基因的短小干擾RNA(Mori等人,Biotechnol Bioeng 88:901-908,2004)、或共表現β-1,4-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶III(β-1,4-N-acetylglucosaminyltransferase III)與高基氏α-甘露糖苷酶II(Golgi α-mannosidase II)或基夫鹼(kifunensine,一種強效α-甘露糖苷酶I抑制劑)(Ferrara等人,J Biol Chem 281:5032-5036,2006;Ferrara等人,Biotechnol Bioeng 93:851-861,2006;Xhou等人,Biotechnol Bioeng 99:652-65,2008)。
在本文所述之一些實施例中,本發明之抗體具有雙觸角聚醣結構,其海藻糖含量為約介於1%至約15%之間,例如約15%、14%、13%、12%、11% 10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、或1%。在一些實施例中,本發明之抗體具有聚醣結構,其海藻糖含量為約50%、40%、45%、40%、35%、30%、25%、或20%。
「海藻糖含量(Fucose content)」意指Asn297處糖鏈中海藻糖單醣的量。海藻糖的相對量係含海藻糖的結構相對於所有醣類結構的百分比。此等可藉由多種方法來表徵及定量,例如:1)使用經N-醣苷酶F(N-glycosidase F)處理之樣本(例如錯合、雜合及寡與高甘露糖(oligo-and high-mannose)結構)的MALDI-TOF,如在國際專利公開號WO2008/077546 2中所述);2)酶促釋放Asn297聚醣,隨 後衍生化並藉由HPLC(UPLC)以螢光檢測及/或HPLC-MS(UPLC-MS)來檢測/定量;3)天然或還原mAb的完整蛋白質分析,將Asn297聚醣以Endo S或其他會在第一與第二GlcNAc單醣之間切割而留下連接至第一GlcNAc的海藻糖的酶處理或不經處理;4)藉由酶消化法(enzymatic digestion)(例如胰蛋白酶或內肽酶Lys-C)將mAb消化成構成分肽(constituent peptide),且隨後藉由HPLC-MS(UPLC-MS)分離、偵測、及定量;5)藉由以PNGase F在Asn 297處進行特異性酶促去醣化(specific enzymatic deglycosylation)以將mAb寡醣自mAb蛋白分離。因此釋放之寡醣可用螢光團標記,藉由各種互補技術分離及識別,該等技術允許:藉由基質輔助雷射脫附游離(MALDI)質譜術比較實驗質量與理論質量以精細表徵聚醣結構、藉由離子交換HPLC(GlycoSep C)判定唾液酸化(sialylation)程度、藉由正相HPLC(GlycoSep N)根據親水性標準分離及定量寡醣形式、及藉由高效毛細管電泳-雷射誘導螢光(HPCE-LIF)分離及定量寡醣。
本文中所用之「低海藻糖(low fucose)」或「低海藻糖含量(low fucose content)」係指抗體之海藻糖含量為約介於1%至15%之間。
本文中所用之「正常海藻糖(Normal fucose)」或「正常海藻糖含量(normal fucose content)」係指抗體的海藻糖含量約超過50%,一般而言約超過80%或超過85%。
抗獨特型抗體為特異性結合至本文所揭示之特異性結合PD-1之抗體的抗體。
本發明亦提供一種特異性結合至本文提供之特異性結合PD-1之抗體的抗獨特型抗體。
本發明亦提供一種特異性結合至包含下列之抗體的抗獨特型抗體:SEQ ID NO:8之VH、及SEQ ID NO:14之VL;SEQ ID NO:9之VH、及SEQ ID NO:15之VL;SEQ ID NO:9之VH、及SEQ ID NO:16之VL;SEQ ID NO:10之VH、及SEQ ID NO:16之VL;SEQ ID NO:140之VH、及SEQ ID NO:16之VL;SEQ ID NO:141之VH、及SEQ ID NO:16之VL;SEQ ID NO:142之VH、及SEQ ID NO:16之VL;SEQ ID NO:10之VH、及SEQ ID NO:143之VL;SEQ ID NO:10之VH、及SEQ ID NO:144之VL;SEQ ID NO:140之VH、及SEQ ID NO:143之VL;SEQ ID NO:141之VH、及SEQ ID NO:143之VL;SEQ ID NO:142之VH、及SEQ ID NO:143之VL;SEQ ID NO:140之VH、及SEQ ID NO:144之VL;SEQ ID NO:141之VH、及SEQ ID NO:144之VL;SEQ ID NO:142之VH、及SEQ ID NO:144之VL;SEQ ID NO:44之VH、及SEQ ID NO:60之VL; SEQ ID NO:45之VH、及SEQ ID NO:61之VL;SEQ ID NO:45之VH、及SEQ ID NO:62之VL;SEQ ID NO:46之VH、及SEQ ID NO:61之VL;SEQ ID NO:47之VH、及SEQ ID NO:61之VL;SEQ ID NO:48之VH、及SEQ ID NO:61之VL;SEQ ID NO:49之VH、及SEQ ID NO:61之VL;SEQ ID NO:50之VH、及SEQ ID NO:61之VL;SEQ ID NO:51之VH、及SEQ ID NO:61之VL;SEQ ID NO:94之VH、及SEQ ID NO:98之VL;SEQ ID NO:95之VH、及SEQ ID NO:99之VL;或SEQ ID NO:95之VH、及SEQ ID NO:100之VL。
抗獨特型(Id)抗體係識別抗體之抗原決定位(例如互補位(paratope)或CDR)的抗體。Id抗體可為抗原阻斷或非阻斷的。抗原阻斷Id可用於偵測樣本中的游離抗體(例如本文中所述之本發明之抗PD-1抗體)。非阻斷Id可用於檢測樣本中的總抗體(游離的、部分結合抗原的、或完全結合抗原的)。Id抗體可藉由以正在製備抗Id的抗體免疫動物來製備。
抗獨特型抗體也可用作為「免疫原(immunogen)」,以在另一動物誘導免疫反應,產生所謂的抗-抗獨特型抗體(anti-anti-Id antibody)。抗-抗獨特型的表位可與誘導該抗獨特型的原始mAb之表位相同。因此,藉由使用抗mAb的獨特型決定子之抗體,可以識別表現具相同專一性之抗體的其它殖株。抗Id抗體可藉由任何合適的技術 來變化(從而產生抗Id抗體變異體)及/或衍生化,諸如本文別處關於特異性結合PD-1之抗體所述之技術。
本發明亦提供一種免疫接合物,其包含接合至異源分子之特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中,該異源分子為可偵測標記或細胞毒性劑。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段,其接合至可偵測標記。
本發明亦提供一種特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段,其接合至細胞毒性劑。
結合PD-1之抗體或其抗原結合片段可用於將治療劑指引至PD-1表現細胞。過表現PD-1之細胞(諸如經活化之T細胞)可用接合至細胞毒性劑之特異性結合PD-1之抗體來靶向,該細胞毒性劑在PD-1抗體內化後殺死細胞。替代地,PD-1表現細胞可用偶合至治療劑之PD-1抗體來靶向,該治療劑意欲在內化後修飾細胞功能。
在一些實施例中,可偵測標記亦為細胞毒性劑。
接合至可偵測標記之本文提供之特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段可用於評估多種樣本上PD-1之表現。
可偵測標記包括在接合至本文提供之特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段時使得該抗體或其抗原結合片段可 經由光譜學、光化學、生物化學、免疫化學、或化學手段來偵測的組合物。
例示性可偵測標記包括放射性同位素、磁珠、金屬珠、膠態粒子、螢光染料、電子緻密試劑、酶(例如,如通常用於ELISA中)、生物素、長葉毛地黃配質(digoxigenin)、半抗原、發光分子、化學發光分子、螢光染劑、螢光團、螢光淬熄劑、有色分子、放射性同位素、閃爍劑(scintillate)、卵白素、鏈黴親和素、蛋白A、蛋白G、抗體或其片段、多組胺酸、Ni2+、Flag標籤、myc標籤、重金屬、酶、鹼性磷酸酶、過氧化酶、螢光素酶、電子供體/受體、吖啶酯(acridinium ester)、及比色基質。
可偵測標記可自發地發射信號,諸如在可偵測標記為放射性同位素時。在其他情況下,可偵測標記由於外部場刺激而發射信號。
例示性放射性同位素可為γ發射性、鄂惹發射性(Auger-emitting)、β發射性、α發射性、或正電子發射性放射性同位素。例示性放射性同位素包括3H、11C、13C、15N、18F、19F、55Co、57Co、60Co、61Cu、62Cu、64Cu、67Cu、68Ga、72As、75Br、86Y、89Zr、90Sr、94mTc、99mTc、115In、123l、124l、125I、131l、211At、212Bi、213Bi、223Ra、226Ra、225Ac、及227Ac。
例示性金屬原子為原子序大於20之金屬,諸如鈣原子、鈧原子、鈦原子、釩原子、鉻原子、錳原子、鐵原子、鈷原子、鎳原子、銅原子、鋅原子、鎵原子、鍺原子、砷原子、硒原子、溴原 子、氪原子、銣原子、鍶原子、釔原子、鋯原子、鈮原子、鉬原子、鎝原子、釕原子、銠原子、鈀原子、銀原子、鎘原子、銦原子、錫原子、銻原子、碲原子、碘原子、氙原子、銫原子、鋇原子、鑭原子、鉿原子、鉭原子、鎢原子、錸原子、鋨原子、銥原子、鉑原子、金原子、汞原子、鉈原子、鉛原子、鉍原子、鍅原子、鐳原子、錒原子、鈰原子、鐠原子、釹原子、鉕原子、釤原子、銪原子、釓原子、鋱原子、鏑原子、鈥原子、鉺原子、銩原子、鐿原子、鎦原子、釷原子、鏷原子、鈾原子、錼原子、鈽原子、鋂原子、鋦原子、鉳原子、鉲原子、鑀原子、鐨原子、鍆原子、鍩原子、或鐒原子。
在一些實施例中,金屬原子可為原子序大於二十之鹼土金屬。
在一些實施例中,金屬原子可為鑭系元素。
在一些實施例中,金屬原子可為錒系元素。
在一些實施例中,金屬原子可為過渡金屬。
在一些實施例中,金屬原子可為貧金屬(poor metal)。
在一些實施例中,金屬原子可為金原子、鉍原子、鉭原子、及釓原子。
在一些實施例中,金屬原子可為原子序為53(即,碘)至83(即,鉍)之金屬。
在一些實施例中,金屬原子可為適用於磁共振成像之原子。
金屬原子可為呈+1、+2、或+3氧化態形式之金屬離 子,諸如Ba2+、Bi3+、Cs+、Ca2+、Cr2+、Cr3+、Cr6+、Co2+、Co3+、Cu+、Cu2+、Cu3+、Ga3+、Gd3+、Au+、Au3+、Fe2+、Fe3+、F3+、Pb2+、Mn2+、Mn3+、Mn4+、Mn7+、Hg2+、Ni2+、Ni3+、Ag+、Sr2+、Sn2+、Sn4+、及Zn2+。金屬原子可包含金屬氧化物,諸如氧化鐵、氧化錳、或氧化釓。
合適染料包括任何市售可得之染料,諸如例如5(6)-羧基螢光素、IRDye 680RD順丁烯二醯亞胺或IRDye 800CW、釕聚吡啶基染料、及類似者。
合適螢光團為螢光異硫氰酸鹽(FITC)、螢光素胺基硫脲(fluorescein thiosemicarbazide)、玫瑰紅(rhodamine)、德克薩斯紅(Texas Red)、CyDye(例如,Cy3、Cy5、Cy5.5),Alexa Fluor(例如,Alexa488、Alexa555、Alexa594;Alexa647)、近紅外(NIR)(700至900nm)螢光染料、及羰花青(carbocyanine)及胺基苯乙烯基染料。
接合至可偵測標記的本文提供之特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段可用作顯像劑。
在一些實施例中,本文提供之特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段係接合至細胞毒性劑。
在一些實施例中,細胞毒性劑為化學治療劑、藥物、生長抑制劑、毒素(例如細菌、真菌、植物、或動物來源之酶促活性毒素或其片段)、及/或放射性同位素(即放射接合物)。
在一些實施例中,細胞毒性劑為道諾黴素 (daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、胺甲喋呤(methotrexate)、長春地辛(vindesine)、細菌毒素諸如白喉毒素、蓖麻毒素、格爾德黴素(geldanamycin)、類美登素(maytansinoid)、或卡奇黴素(calicheamicin)。細胞毒性劑可藉由包括微管蛋白結合、DNA結合、或拓撲異構酶抑制之機制來誘發其細胞毒性效應及細胞生長抑制效應。
在一些實施例中,細胞毒性劑為酶促活性毒素,諸如白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、菌麻毒素A鏈、雞母珠毒蛋白A鏈、莫迪素(modeccin)A鏈、α-帚曲霉素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹(dianthin)蛋白、美洲商陸(Phytolacca americana)蛋白(PAPI、PAPII、及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、多花白樹毒蛋白(gelonin)、絲林黴素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)、及新月毒素(tricothecene)。
在一些實施例中,細胞毒性劑為放射性核種,諸如212Bi、131I、131In、90Y、及186Re。
在一些實施例中,細胞毒性劑為尾海兔素(dolastatin)或尾海兔素肽類似物及衍生物、阿里他汀(auristatin)或單甲基阿里他汀苯丙胺酸。例示性分子係揭示於美國專利第5,635,483號及第5,780,588號中。已顯示尾海兔素及阿里他汀干擾微管動力學、GTP水 解、以及核分裂及細胞分裂(Woyke等人(2001)Antimicrob Agents and Chemother.45(12):3580-3584),且具有抗癌及抗真菌活性。尾海兔素或阿里他汀藥物部分可透過肽藥物部分之N(胺基)端或C(羧基)端附接至本發明之抗體(WO02/088172),或經由任何半胱胺酸工程改造至抗體中。
可使用已知方法將本文提供之特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段接合至可偵測標記。
在一些實施例中,可偵測標記與螯合劑錯合。
在一些實施例中,可偵測標記係經由連接子接合至本文提供之特異性結合PD-1抗體或其抗原結合片段。
可使用已知方法將可偵測標記或細胞毒性部分直接或間接地連接至本文提供之特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段。合適連接子為所屬技術領域中已知的,且包括例如輔基、非酚連接子(N-琥珀醯亞胺基苯甲酸酯;十二硼酸酯之衍生物)、大環及非環狀螯合劑兩者之螯合部分,諸如1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10,四乙酸(DOTA)之衍生物、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)之衍生物、S-2-(4-異硫氰基苄基)-1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)之衍生物、及1,4,8,11-四氮雜環十二烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)之衍生物、N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亞胺基硫烷鹽(IT)、亞胺酯之雙官能衍生物(諸如己二亞胺二甲酯鹽酸鹽(dimethyl adipimidate HCl))、活性酯(諸如雙琥珀醯亞胺辛二酸酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對疊氮苯甲醯基)己二胺)、雙 重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲醯基)乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)、及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)、及其他螯合部分。合適肽連接子為熟知的。
在一些實施例中,本文提供之特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段經由腎清除而自血液移除。
本發明亦提供一種套組,其包含本文所揭示之特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段。
該套組可用於治療用途及用作為診斷套組。
該套組可用於偵測樣本中PD-1之存在。
在一些實施例中,該套組包含本文提供之特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段、及用於偵測該抗體之試劑。該套組可包括一或多種其他元件,包括:使用說明書;其他試劑,例如標記、治療劑、或用於將抗體與標記或治療劑或放射防護組合物螯合(或偶合)的試劑;用於製備投予用抗體的裝置或其他材料;醫藥上可接受的載劑;及用於投予至個體的裝置或其他材料。
在一些實施例中,該套組包含於容器中之本文提供之特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段、及該套組之使用說明書。
在一些實施例中,該套組中的抗體被標記。
在一些實施例中,該套組包含特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段,其包含 SEQ ID NO:8之VH、及SEQ ID NO:14之VL;SEQ ID NO:9之VH、及SEQ ID NO:15之VL;SEQ ID NO:9之VH、及SEQ ID NO:16之VL;SEQ ID NO:10之VH、及SEQ ID NO:16之VL;SEQ ID NO:140之VH、及SEQ ID NO:16之VL;SEQ ID NO:141之VH、及SEQ ID NO:16之VL;SEQ ID NO:142之VH、及SEQ ID NO:16之VL;SEQ ID NO:10之VH、及SEQ ID NO:143之VL;SEQ ID NO:10之VH、及SEQ ID NO:144之VL;SEQ ID NO:140之VH、及SEQ ID NO:143之VL;SEQ ID NO:141之VH、及SEQ ID NO:143之VL;SEQ ID NO:142之VH、及SEQ ID NO:143之VL;SEQ ID NO:140之VH、及SEQ ID NO:144之VL;SEQ ID NO:141之VH、及SEQ ID NO:144之VL;SEQ ID NO:142之VH、及SEQ ID NO:144之VL;SEQ ID NO:44之VH、及SEQ ID NO:60之VL;SEQ ID NO:45之VH、及SEQ ID NO:61之VL;SEQ ID NO:45之VH、及SEQ ID NO:62之VL;SEQ ID NO:46之VH、及SEQ ID NO:61之VL;SEQ ID NO:47之VH、及SEQ ID NO:61之VL;SEQ ID NO:48之VH、及SEQ ID NO:61之VL;SEQ ID NO:49之VH、及SEQ ID NO:61之VL; SEQ ID NO:50之VH、及SEQ ID NO:61之VL;SEQ ID NO:51之VH、及SEQ ID NO:61之VL;SEQ ID NO:94之VH、及SEQ ID NO:98之VL;SEQ ID NO:95之VH、及SEQ ID NO:99之VL;或SEQ ID NO:95之VH、及SEQ ID NO:100之VL。
本發明亦提供一種偵測樣本中之PD-1之方法,其包含獲得該樣本、使該樣本與本文提供之特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段接觸、及偵測該樣本中結合至PD-1的抗體。
在一些實施例中,該樣本可衍生自尿液、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、滑液、循環細胞、非為組織相關聯之細胞(即游離細胞)、組織(例如手術切除之組織、活體組織切片(包括細針穿刺))、組織標本、及類似者。
可使用已知方法偵測結合至PD-1之本發明抗體或其抗原結合片段。例示性方法包括使用螢光或化學發光標記或放射性標記直接標記該抗體,或將本發明之抗體附接至易於偵測的部分,諸如生物素、酶、或表位標籤。例示性標記及部分係釕、111In-DOTA、111In-二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、山葵過氧化酶、鹼性磷酸酶及β-半乳糖苷酶、多組胺酸(HIS標籤)、吖啶染料、花青(cyanine)染料、螢光酮(fluorone)染料、(oxazin)染料、啡啶染料、玫瑰紅染料及Alexafluor®染料。
本發明之抗體可在多種檢定中使用以偵測樣本中之PD-1。例示性檢定係西方墨點分析、放射免疫檢定、表面電漿共振、免疫沉澱法、平衡透析、免疫擴散法、電致化學發光(ECL)免疫檢定、免疫組織化學法、螢光活化細胞分選(FACS)或ELISA檢定。
本文提供之特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合片段可使用各種技術來產生。例如,Kohler及Milstein之融合瘤法可用來產生單株抗體。在該融合瘤法中,將小鼠或其他宿主動物(諸如倉鼠、大鼠、或雞)用人類及/或食蟹獼猴PD-1抗原(諸如PD-1之胞外域)來免疫,接著使用標準方法將來自經免疫動物之脾細胞與骨髓瘤細胞融合以形成融合瘤細胞。可對從單一永生化融合瘤細胞而來的群落進行篩選以生產具有所欲性質的抗體,該等所欲性質諸如結合特異性、交叉反應性或缺乏交叉反應性、抗原親和力、及功能性,諸如促效性活性。
例示性人源化技術(包括人類受體架構選擇)包括CDR移植(美國專利第5,225,539號)、SDR移植(美國專利第6,818,749號)、表面重塑(Resurfacing)(Padlan,(1991)Mol Immunol 28:489-499)、特異性決定殘基表面重塑(Specificity Determining Residues Resurfacing)(美國專利公開號2010/0261620)、人類架構調適(美國專利第8,748,356號)、或超人源化(美國專利第7,709,226號)。在此等方法中,親本抗體之CDR或CDR殘基子集被轉移 至人類架構上,該人類架構可基於彼等與親本架構的整體同源性、基於CDR長度的相似性、或正則結構(canonical structure)同一性、或其組合來選擇。
可將人源化抗體進一步最佳化以改善其對所欲抗原的選擇性或親和力,此係由諸如在國際專利公開號WO1090/007861及WO1992/22653中所述之技術藉由併入經修改之架構支撐殘基以保存結合親和力(回復突變(backmutation)),或藉由在例如任何CDR引入變異以改善抗體之親和力。
在其基因體中帶有人體免疫球蛋白(Ig)基因位點之轉基因動物(諸如,小鼠、大鼠、或雞)可用於產生針對PD-1之抗體,且係描述於例如美國專利第6,150,584號、國際專利公開號WO1999/45962、國際專利公開號WO2002/066630、WO2002/43478、WO2002/043478、及WO1990/04036中。可將此等動物中之內源性免疫球蛋白基因位點破壞或刪除,且可使用同源或非同源重組、使用轉染色體(transchromosome)、或使用袖珍基因(minigene)將至少一個完整或部分人類免疫球蛋白基因位點插入該動物基因體中。可聘用諸如Regeneron(http://_www_regeneron_com)、Harbour Antibodies(http://_www_harbourantibodies_com)、Open Monoclonal Technology,Inc.(OMT)(http://_www_omtinc_net)、KyMab(http://_www_kymab_com)、Trianni(http://_www.trianni_com)及Ablexis(http://_www_ablexis_com)等公司來使用如上所述之技術提供針對所選抗原的人類抗體。
抗體可選自噬菌體展示庫,其中噬菌體經工程改造以表現人類免疫球蛋白或其部分,諸如Fab、單鏈抗體(scFv)、或未配對或配對抗體可變區。本發明之抗體可例如從噬菌體展示庫(表現抗體重鏈及輕鏈可變區)單離為具有噬菌體pIX外殼蛋白的融合蛋白質,如在Shi等人,(2010)J Mol Biol 397:385-96及國際專利申請案公開號WO09/085462中所述)。該等庫可篩選出結合至人類及/或食蟹獼猴PD-1之噬菌體,且所得之陽性殖株可經進一步表徵,將Fab從殖株溶解產物(lysate)單離出來,且表現為全長IgG。
免疫性抗原(immunogenic antigen)之製備及單株抗體生產可使用任何合適技術來執行,諸如重組蛋白質生產。免疫性抗原可用經純化的蛋白質或包括全細胞或細胞或組織抽出物的蛋白質混合物之形式來投予給動物,或者抗原可由編碼前述抗原或其之一部分的核酸於該動物體內重新地(de novo)形成。
在一些實施例中,本發明之特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合部分為雙特異性抗體。
在一些實施例中,本發明之抗體或其抗原結合部分為多特異性抗體。
本文提供之特異性結合PD-1之單特異性抗體可經工程改造成雙特異性抗體,其亦涵蓋於本發明之範疇內。
全長雙特異性抗體可例如使用在兩個單特異性二價抗體之間的Fab臂交換(例如半分子交換,交換一重鏈-輕鏈對)來產生,其係藉由在各半分子中的重鏈CH3界面引入取代以利於在體外無細胞 環境中或使用共表現使具有不同特異性的兩種抗體半分子形成異二聚體。該Fab臂交換反應係雙硫鍵異構化反應及CH3域之解離-締合的結果。親本單特異性抗體的鉸鏈區中的重鏈雙硫鍵被還原。其中一個親本單特異性抗體所生成之游離半胱胺酸與第二親本單特異性抗體分子的半胱胺酸殘基形成重鏈間雙硫鍵,同時該等親本抗體的CH3域藉由解離-締合而釋出及重新形成。該等Fab臂之CH3域可經工程改造以利於異二聚化而非同二聚化。所得產物係具有兩個Fab臂或半分子之雙特異性抗體,這兩個Fab臂或半分子各自結合不同表位。
雙特異性抗體也可使用諸如下列的設計來產生:Triomab/Quadroma(Trion Pharma/Fresenius Biotech)、鈕扣結構(Knob-in-Hole)(Genentech)、CrossMAb(Roche)、及靜電誘導之CH3相互作用(Chugai,Amgen,NovoNordisk,Oncomed)、LUZ-Y(Genentech)、鏈交換域工程改造之域體(SEEDbody)(EMD Serono)、Biclonic(Merus)、及作為DuoBody®產物(Genmab A/S)。
Triomab quadroma技術可用於產生全長雙特異性抗體。Triomab技術促進兩種親本嵌合抗體之間的Fab臂交換,一個親本mAb具有IgG2a,且第二親本mAb具有大鼠IgG2b恆定區,從而產出嵌合雙特異性抗體。
「鈕扣結構(knob-in-hole)」策略可用於產生全長雙特異性抗體。簡言之,在人類IgG中形成CH3域界面之選定胺基酸可在影響CH3域交互作用的位置處突變,以促進異二聚體形成。將具有小側鏈之胺基酸(孔)引入特異性結合第一抗原之抗體的重鏈中,並將 具有大側鏈之胺基酸(鈕)引入特異性結合第二抗原之抗體的重鏈中。在共表現這兩個抗體之後,具有「孔」之重鏈與具有「鈕」之重鏈優先交互作用而導致異二聚體形成。形成鈕和孔之例示性CH3取代對係(表現為第一重鏈之第一CH3域中的經修飾位置/第二重鏈之第二CH3域中的經修飾位置):T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S及T366W/T366S_L368A_Y407V。
CrossMAb技術可用於產生全長雙特異性抗體。CrossMAb除了利用「鈕扣結構」策略來促進Fab臂交換之外,尚使半臂之一中的CH1與CL域交換,以確保所生成之雙特異性抗體有正確的輕鏈配對(見例如美國專利第8,242,247號)。
可使用其他的交換(cross-over)策略,藉由在雙特異性抗體中之一個或兩個臂中的重鏈與輕鏈之間或在重鏈內交換可變或恆定域(或兩者)來產生全長雙特異性抗體。此等交換包括例如VH-CH1與VL-CL、VH與VL、CH3與CL、及CH3與CH1,如國際專利公開號WO2009/080254、2009/080251、WO2009/018386、及WO2009/080252中所述。
可使用其他策略,諸如使用靜電相互作用促進重鏈異二聚化,其取代一個CH3表面之帶正電荷殘基及第二CH3表面之帶負電荷殘基,如在美國專利公開號US2010/0015133;美國專利公開號US2009/0182127;美國專利公開號US2010/028637、或美國專利公開號US2011/0123532中所述。在其他策略中,異二聚化可藉由下列取 代來促進(表現為第一重鏈之第一CH3域中的經修飾位置/第二重鏈之第二CH3域中的經修飾位置):L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F、或T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W,如在美國專利公開號2012/0149876或美國專利公開號US2013/0195849中所述。
LUZ-Y技術可用於產生雙特異性抗體。在此技術中,將白胺酸拉鍊添加至CH3域的C末端以驅動來自親本mAb的異二聚體組裝,其會在純化後被移除。
SEEDbody技術可用於產生雙特異性抗體。SEEDbody在其恆定域中挑選經IgA殘基取代的IgG殘基以促進異二聚化,如在美國專利第US20070287170號中所述。
雙特異性抗體可在無細胞環境中體外產生,此係藉由在兩個單特異性同二聚體抗體之CH3區中引入非對稱突變,且在還原條件中(以讓雙硫鍵異構化)自兩個親本單特異性同二聚體抗體形成該雙特異性異二聚體抗體,其係根據描述於下列文獻中之方法:國際專利公開號WO2011/131746。在該等方法中,第一單特異性雙價抗體及第二單特異性雙價抗體係經工程改造以在CH3域具有某些促進異二聚體穩定性之取代;該等抗體係在足以讓絞鏈區中之半胱胺酸進行雙硫 鍵異構化的還原條件下一起培養;從而藉由Fab臂交換來產生該雙特異性抗體。可使用之取代為IgG1抗體中一條重鏈中之F405L、及另一條重鏈中之K409R。在IgG4抗體中,一條重鏈可為在位置405處具有F且在位置409處具有R之野生型IgG4,且另一條重鏈可具有F405L及R409K取代。培養條件可最佳地被回復為非還原性(non-reducing)。可使用之例示性還原劑係2-巰基乙胺(2-MEA)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)、二硫赤蘚醇(dithioerythritol,DTE)、麩胱甘肽、參(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱胺酸及β-巰基乙醇。舉例而言,可使用在至少20℃之溫度且有至少25mM之2-MEA存在下或於至少0.5mM之二硫蘇糖醇存在且在5至8之pH下(例如在7.0之pH下或在7.4之pH下)培養至少90min。
在一些實施例中,雙特異性抗體包括重組類IgG雙靶向分子,其中該分子之兩側各含有至少兩種不同抗體之Fab片段或該Fab片段的一部分;IgG融合分子,其中全長IgG抗體係融合至額外Fab片段或Fab片段之部分;Fc融合分子,其中單鏈Fv分子或穩定化雙價抗體係融合至重鏈恆定域、Fc區或其部分;Fab融合分子,其中不同之Fab片段係融合在一起;基於ScFv之抗體及基於雙價抗體之抗體及重鏈抗體(例如,域抗體、奈米抗體),其中不同單鏈Fv分子或不同雙價抗體或不同重鏈抗體(例如,域抗體、奈米抗體)係融合至彼此或融合至另一個蛋白質或載劑分子。
一般會使用標準方法在DNA水準對諸如抗體之恆定域的分子進行取代。
本發明之抗體可經工程改造成各種熟知的抗體形式。
例如,雙特異性PD-1/CD3抗體可使用本文所述之PD-1抗體之VH/VL域及公開之抗CD3抗體之任何VH/VL區來產生。
本發明之另一實施例為雙特異性抗體,其包含結合PD-1之第一域及結合CD3之第二域。
由本文提供之促效性抗體誘導之一般生物活性為抑制(inhibition)(例如,抑制(suppression))抗原特異性CD4+或CD8+ T細胞。可使用各種讀數以評定本文提供之抗體之促效作用,諸如抗原特異性CD4+或CD8+ T細胞增生降低或其干擾素γ(IFN-γ)、IL-17 IL-2、IL-6、IL-22、IL-23、或GM-CSF之生產降低。在例示性檢定中,使用抗體對來自正常供體且由同種異體樹突細胞或特定抗原(諸如破傷風類毒素或CMV)刺激之T細胞的作用。在該設置中,可藉由測量上清液細胞介素水平或T細胞活化標記來檢測用抗體治療的T細胞功能的變化。在一例示性檢定中,將經判定對CMV抗原為反應性之PBMC用作抗原特異性CD4+或CD8+ T細胞之來源。將1.5×106個細胞/mL或2×106個細胞/mL之CMV反應性PBMC種於培養盤上,且將0.1至0.2μg/mL CMV肽添加至培養物中。CMV肽可例如購自JPT Technologies。將測試抗體以10μg/mL之單劑量添加,將盤培養6天,且藉由添加1μCi/孔甲基-3H-胸苷(PerkinElmer)達6小 時來評定細胞增生,且在各樣本中測量放射活性。替代地,使用ELISA或已知多重檢定測量細胞之細胞介素生產。
本文提供之本發明抗體(諸如特異性結合PD-1之促效性抗體)可為配體阻斷性或非阻斷性的。可使用競爭檢定(諸如細胞叢聚檢定)來評定本文提供之促效性抗體阻斷配體(例如PD-L1或PD-L2或兩者)之能力。
在例示性檢定中,將過表現PD-1或PD-L1(或PD-L2)之差異標記之HEK細胞以1:1比率混合,且定量抗體抑制PD-1及PD-L1、或PD-1及PD-L2表現細胞之叢聚的能力。可將過表現人類PD-1之細胞用Violet Cell Trace染色劑來標記,且可將過表現PD-L1或PD-L2之細胞用Far Red Cell Trace染色劑(Life Technologies)來標記。將PD-1表現細胞與測試抗體混合,且在短暫培養後將PD-L1表現細胞添加至混合物中。將混合物培養一小時,且使用流動式細胞測量術評估雙陽性事件(例如,在Violet Cell Trace染色劑及Far Rd Cell Trace染色劑之情況下為陽性的細胞團簇)之百分比。叢聚水準係由雙陽性事件之百分比來測量,且將測試抗體存在下之叢聚百分比與陽性及陰性同型對照抗體進行比較。當相較於同型對照時,使用p值0.01作為顯著性量度,在抗體以統計上顯著方式抑制PD-1及PD-L1(或PD-L2)表現細胞之雙陽性事件時,本文提供之抗體阻斷PD-L1(或PD-L2)結合至PD-1。當抗體以統計上不顯著方式(例如 p>0.01)抑制PD-1及PD-L1(或PD-L2)之雙陽性事件時,本文提供之抗體不阻斷PD-L1(或PD-L2)結合至PD-1。
抗體對人類或非人類(諸如食蟹獼猴)PD-1之親和力可使用任何合適方法來實驗判定。此類方法可利用ProteOn XPR36、Biacore 3000或KinExA儀器設備、ELISA或所屬領域中具有通常知識者已知的競爭性結合檢定。如果在不同條件(例如滲透性、pH)下測量,則所測得之特定抗體/PD-1交互作用的親和力可能會有所變化。因此,親和力及其他結合參數(例如KD、Kon、Koff)之測量一般係以標準化條件及標準化緩衝液進行,諸如本文在實例1中所述之緩衝液。所屬領域中具有通常知識者將理解,在一般偵測極限內,親和力測量(例如使用Biacore 3000或ProteOn進行)的內部誤差(測量為標準偏差(SD))一般可在測量結果的5至33%內。因此,在KD上下文中之用語「約(about)」反映檢定中之一般標準偏差。例如,1×10-9M之KD的一般SD係至多±0.33×10-9M。
可在體外在Octet Red384平台(Forte Bio)上檢定與包含某些VH及VL序列之本發明抗體(例如,參考抗體)結合至PD-1之間的競爭。將組胺酸標記之PD1抗原裝載至HIS感測器上,且使感測 器暴露於20μg/mL參考抗PD1抗體,隨後暴露於相同濃度之測試抗PD1抗體。在用參考抗體飽和後,測試抗體之額外結合指示兩種抗體與PD-1之同時結合,從而指示參考抗體及測試抗體不競爭結合至PD-1。替代地,沒有測試抗體之額外結合指示兩種抗體競爭結合至PD-1。
與參考抗體競爭結合至PD-1之抗體可藉由下列產生:使用噬菌體展示庫單離特異性結合PD-1之抗體、及篩選所產生抗體與前述參考抗體競爭結合至PD-1之能力。
當測試抗體在參考抗體之飽和濃度下結合PD-1時,測試抗體與參考抗體競爭結合至PD-1。可使用生物層干涉技術(諸如Octet),藉由記錄由於所結合抗體隨著時間推移而增加生物感測器尖端之光密度所引起之波長偏移來偵測結合。
本發明抗體所結合之PD-1表位可使用例如氫/氘交換(H/D交換)或藉由分析與PD-1錯合的抗體之晶體結構來解析。當由透過H/D交換之氘化水準為至少5%差異之抗體保護之約70%或更多PD-1胺基酸殘基在兩種抗體之間係相同時,或當經判定以抗體及PD-1之錯合物之晶體結構結合抗體之70%或更多PD-1表面暴露之胺基酸殘基在兩種抗體之間係相同時,兩種PD-1抗體「結合PD-1上之同一表位(bind the same epitope on PD-1)」。在該抗體與PD-1之錯合物的晶體結構中,表位殘基係位於距任何抗體CDR殘基4Å距離或 更短距離內的PD-1殘基。
在H/D交換檢定中,將PD-1蛋白在抗體存在或不存在下在氘化水中培養預定時間,導致在可交換的氫原子處(未被抗體保護)摻入氘,隨後以蛋白酶消化蛋白質並使用LC-MS分析肽片段。在一例示性檢定中,將5μL測試抗體(10μg)或5μL PD-1與測試抗體的錯合物(分別為10及7.35μg)以120μL氧化氘標記緩衝液(50mM磷酸鹽、100mM氯化鈉,pH 7.4)培養0秒、60秒、300秒、1800秒、7200秒、及14400秒。藉由添加63μL的5M胍鹽酸鹽淬熄氘交換且最終pH係2.5。將被淬熄終止反應的樣本進行管柱上(on-column)胃蛋白酶/XIII型蛋白酶消化及LC-MS分析。關於胃蛋白酶/XIII型蛋白酶消化,將於125μL對照緩衝液(50mM磷酸鹽、100mM氯化鈉,pH 7.4)中的5μg樣本藉由添加63μL的5M胍鹽酸鹽(最終pH係2.5)並將混合物培養3分鐘來變性。接著,使混合物經受管柱上胃蛋白酶/XIII型蛋白酶消化,並將所生成的肽使用包含與Q ExactiveTM Hybrid Quadrupole-Orbitrap質譜儀(Thermo)偶合之Waters Acquity UPLC的UPLC-MS系統分析。使用HDX WorkBench(用於分析H/D交換MS數據的軟體)處理原始MS數據。使用氘化肽與其天然形式(t0)之間的平均質量差計算氘水準。透過用Mascot針對PD-1序列搜索MS/MS數據來進行肽識別。前驅物及產物離子的質量公差分別為20ppm及0.05Da。
關於X射線結晶學,使用標準方案表現和純化PD-1及測試抗體。將PD-1/測試抗體錯合物在4℃下培養整夜,濃縮,並使用 粒徑排阻層析法從未錯合的物質中分離。將錯合物藉由蒸氣擴散法從各種已知的測試溶液(例如含有PEG3350、檸檬酸銨及2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)的溶液)結晶。
作為參考抗體之結合PD-1上相同表位之抗體可藉由下列產生:使用噬菌體展示庫單離結合PD-1之抗體、選擇與參考抗體100%競爭結合至PD-1之抗體、及藉由H/D交換或藉由X射線結晶學來識別抗體表位。
替代地,可使用涵蓋表位殘基之肽來免疫小鼠或兔,且可評估所產生抗體在所敘述區內之結合。
本發明亦提供一種經單離之多核苷酸,其編碼本發明之任何抗體。
本發明亦提供一種經單離之多核苷酸,其編碼本發明之任何抗體重鏈可變區、任何抗體輕鏈可變區、或任何抗體重鏈、及/或抗體輕鏈。
本發明亦提供一種經單離之多核苷酸,其編碼SEQ ID NO:8、9、10、140、141、或142之VH。
本發明亦提供一種經單離之多核苷酸,其編碼SEQ ID NO:14、15、16、143、或144之VL。
本發明亦提供一種經單離之多核苷酸,其編碼SEQ ID NO:8、9、10、140、141、或142之VH、及SEQ ID NO:14、15、 16、143、或144之VL。
本發明亦提供一種經單離之多核苷酸,其編碼SEQ ID NO:20、21、22、150、151、或152之重鏈(HC)。
本發明亦提供一種經單離之多核苷酸,其編碼SEQ ID NO:26、27、28、153、或154之輕鏈(LC)。
本發明亦提供一種經單離之多核苷酸,其編碼SEQ ID NO:20、21、22、150、151、或152之HC、及SEQ ID NO:26、27、28、153、或154之LC。
本發明亦提供一種經單離之多核苷酸,其包含SEQ ID NO:11、12、13、17、18、19、23、24、25、29、30、31、132、133、134、135、155、156、157、158、159、160、161、162、163、或164之多核苷酸序列。
本發明亦提供一種經單離之多核苷酸,其編碼SEQ ID NO:44、45、46、47、48、49、50、或51之VH。
本發明亦提供一種經單離之多核苷酸,其編碼SEQ ID NO:60、61、或62之VL。
本發明亦提供一種經單離之多核苷酸,其編碼SEQ ID NO:44、45、46、47、48、49、50、或51之VH、及SEQ ID NO:60、61、或62之VL。
本發明亦提供一種經單離之多核苷酸,其編碼SEQ ID NO:66、67、68、69、70、71、72、或73之重鏈。
本發明亦提供一種經單離之多核苷酸,其編碼SEQ ID NO:82、83、或84之輕鏈。
本發明亦提供一種經單離之多核苷酸,其編碼SEQ ID NO:66、67、68、69、70、71、72、或73之HC、及SEQ ID NO:82、83、或84之LC。
本發明亦提供一種經單離之多核苷酸,包含SEQ ID NO:52、53、54、55、56、57、58、59、63、64、65、74、75、76、77、78、79、80、81、85、86、87、136、137、138、或139之多核苷酸序列。
本發明亦提供一種經單離之多核苷酸,其編碼SEQ ID NO:94或95之VH。
本發明亦提供一種經單離之多核苷酸,其編碼SEQ ID NO:98、99、或100之VL。
本發明亦提供一種經單離之多核苷酸,其編碼SEQ ID NO:94或95之VH、及SEQ ID NO:98、99、或100之VL。
本發明亦提供一種經單離之多核苷酸,其編碼SEQ ID NO:104或105之HC。
本發明亦提供一種經單離之多核苷酸,其編碼SEQ ID NO:108、109、或110之LC。
本發明亦提供一種經單離之多核苷酸,其編碼SEQ ID NO:104或105之HC、及SEQ ID NO:108、109、或110之LC。
本發明亦提供一種經單離之多核苷酸,其包含SEQ ID NO:96、97、101、102、103、106、107、111、112、或113之多核 苷酸序列。
編碼本發明抗體之VH及/或VL或其抗原結合片段、或本發明抗體之重鏈及/或輕鏈的多核苷酸序列可係可操作地連接至一或多個調控元件(諸如啟動子或增強子),以允許該核苷酸序列在所意欲之宿主細胞中表現。多核苷酸可為cDNA。
本發明亦提供一種載體,其包含本發明之多核苷酸。此類載體可為質體載體、病毒載體、用於桿狀病毒表現之載體、基於轉位子(transposon)之載體、或者任何其他適用於以任何手段將本發明之多核苷酸引入至給定生物或基因背景中的載體。舉例而言,將編碼本發明之抗體之輕鏈及/或重鏈可變區的多核苷酸(可選用地連接至恆定區)插入至表現載體中。輕鏈及/或重鏈可選殖於相同或不同的表現載體。編碼VH、VL、HC、及/或LC或其抗原結合片段之DNA區段可係可操作地連接至(多個)表現載體中之控制序列,該等控制序列確保多肽之表現。此等控制序列包括訊息序列、啟動子(例如天然關聯或異源性啟動子)、增強子元件、及轉錄終止序列,並且經選擇以與選擇用來表現抗體之宿主細胞相容。一旦載體已併入到適當的宿主中,即將宿主維持在合適條件下以高度表現由該併入多核苷酸所編碼的蛋白質。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:11之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:17之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:12之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:18之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:12之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:19之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:13之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:19之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:52之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:63之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:53之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:64之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:53之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:65之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:54之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:64之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:55之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:64之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:56之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:64之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:57之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:64之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:58之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:64之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:59之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:64之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:96之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:101之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:97之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:102之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:97之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:103之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:132之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:133之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:134之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:135之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:136之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:137之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:138之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:139之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:155之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:19之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:156之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:19之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:157之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:19之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:13之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:158之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:13之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:159之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:155之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:158之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:156之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:158之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:157之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:158之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:155之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:159之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:156之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:159之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:157之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:159之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:160之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:31之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:161之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:31之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:162之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:31之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:25之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:163之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:25之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:164之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:160之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:163之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:161之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:163之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:162之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:163之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:160之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:164之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:161之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:164之多核苷酸。
在一些實施例中,該載體包含SEQ ID NO:162之多核苷酸、及/或SEQ ID NO:164之多核苷酸。
合適之表現載體一般在宿主生物中可複製作為游離基因體(episome)或宿主染色體DNA的整體部分。常見的是,表現載體含有選擇標記(selection marker),諸如安比西林抗性、潮黴素抗性、四環素抗性、康黴素(kanamycin)抗性或新黴素抗性,以允許偵測經所欲DNA序列轉形的該些細胞。麩醯胺酸合成酶係可用於在細胞中表現重組蛋白質,諸如抗體。
合適啟動子及增強子元件在所屬技術領域中為習知者。關於真核細胞中的表現,例示性啟動子包括輕鏈及/或重鏈免疫球蛋白 基因啟動子和增強子元件;巨細胞病毒立即早期啟動子(cytomegalovirus immediate early promoter);單純疱疹病毒胸苷激酶啟動子;早期及晚期SV40啟動子;存在於反轉錄病毒之長末端重複的啟動子;小鼠金屬硫蛋白-I啟動子;及各種該領域已知的組織特異性啟動子。適當載體及啟動子之選擇落於所屬技術領域中之通常知識水準內。
大量的合適載體及啟動子係所屬技術領域中具有通常知識者所習知;許多可在市面購得以用於產製重組建構體。提供下列載體作為示例。細菌:pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene,La Jolla,Calif.,USA);pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、及pRIT5(Pharmacia,Uppsala,Sweden)。真核:pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG及pSVL(Pharmacia)、及pEE6.1及pEE14.1(Lonza)。
本發明亦提供一種宿主細胞,其包含本發明之一或多個載體。「宿主細胞(host cell)」係指經引入載體的細胞。應瞭解到,用語宿主細胞不只意欲指特定個體細胞,亦意欲指此細胞之後裔,並且亦意欲指從該特定個體細胞產生之穩定細胞株。由於某些修飾可能會因為突變或環境影響之任一者而發生於後繼之代中,使得後裔可能與親系細胞不同,但仍涵括於本文中所用之用語「宿主細胞」的範疇中。此類宿主細胞可為真核細胞、原核細胞、植物細胞或古菌(archeal)細胞。
大腸桿菌(Escherichia coli)、桿菌(諸如枯草桿菌(Bacillus subtilis)、及其他腸桿菌(enterobacteriaceae)(諸如沙門桿菌(Salmonella)、鋸桿菌(Serratia)))、及各式假單胞菌(Pseudomonas)菌種皆為原核宿主細胞之實例。其他微生物(諸如酵母菌)對於表現亦為有用者。酵母菌(Saccharomyces)(例如釀酒酵母菌(S.cerevisiae))及畢赤酵母菌(Pichia)皆為合適酵母菌宿主細胞之實例。例示性真核細胞可以是哺乳動物、昆蟲、鳥類或其它動物來源。哺乳動物真核細胞包括永生化細胞系(immortalized cell line)如融合瘤或骨髓瘤細胞系,諸如SP2/0(American Type Culture Collection(ATCC),Manassas,VA,CRL-1581)、NS0(European Collection of Cell Cultures(ECACC),Salisbury,Wiltshire,UK,ECACC No.85110503)、FO(ATCC CRL-1646)及Ag653(ATCC CRL-1580)鼠類細胞系。例示性人類骨髓瘤細胞系為U266(ATTC CRL-TIB-196)。其他有用之細胞系包括衍生自中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary,CHO)細胞者,諸如CHO-K1SV(Lonza Biologics,Walkersville,MD)、CHO-K1(ATCC CRL-61)或DG44。
本發明亦提供一種生產本發明之抗體的方法,其包含在使該抗體表現之條件下培養本發明之宿主細胞、及回收由該宿主細胞所生產之抗體。製造抗體及純化該等抗體之方法為已知的。一旦(以化學或重組方式)經合成,整個抗體、其等之二聚體、個別輕鏈及/或重鏈、或其他抗體片段(諸如VH及/或VL)可依據標準程序來純化,包括硫酸銨沉澱、親和管柱、管柱層析、高效液相層析(HPLC)純 化、凝膠電泳、及類似者(一般資訊請參見Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,N.Y.,(1982))。個體抗體可為實質上純,例如至少約80%至85%純、至少約85%至90%純、至少約90%至95%純、或至少約98%至99%純、或更純,例如除個體抗體外不含汙染物(諸如細胞碎屑、巨分子等)。
本發明亦提供一種用於生產特異性結合PD-1之抗體的方法,其包含:將編碼該抗體之該VH的第一多核苷酸及編碼該抗體之該VL的第二多核苷酸合併到一表現載體中;以該表現載體轉形一宿主細胞;在培養基中在該VL及該VH係經表現且形成該抗體之條件下培養該宿主細胞;及從該宿主細胞或培養基中回收抗體。
可使用標準分子生物方法將編碼本發明之某些VH或VL序列的多核苷酸併入載體中。宿主細胞轉形、培養、抗體表現及純化皆使用廣為人知的方法來進行。
本發明亦提供醫藥組成物,其包含本發明之抗體或其抗原結合片段、及醫藥上可接受之載劑。關於治療用途,本發明之抗體可被製備成醫藥組成物,其在醫藥上可接受之載劑中含有有效量的該抗體作為活性成分。「載劑」係指與本發明之抗體一起投予的稀釋 劑、佐劑、賦形劑、或媒劑。此等媒劑可為液體如水及油,包括來自石油、動物、蔬菜或合成來源者,諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及類似者。舉例而言,可使用0.4%鹽水及0.3%甘胺酸。這些溶液係無菌且通常不含顆粒物質。它們可藉由習用、廣為人知的滅菌技術(例如過濾)來滅菌。該等組成物可含有如用以接近生理條件所需之醫藥上可接受的輔助物質,諸如pH調整及緩衝劑、穩定、增稠、潤滑及著色劑等。在此類醫藥配方中本發明之抗體或其抗原結合片段之濃度可能會有所不同,從小於約0.5重量%,常達至少約1重量%至多達15或20重量%,且可主要基於所需劑量、流體體積、黏度等,根據所選擇之特定投予模式來選擇。合適的媒劑及調配物(包含其他的人類蛋白質,例如人類血清白蛋白),舉例而言,係被描述於例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition,Troy,D.B.ed.,Lipincott Williams and Wilkins,Philadelphia,PA 2006,Part 5,Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092中,請特別參見第958至989頁。
本發明之抗體或其抗原結合片段的治療性使用的投予模式可以是將抗體遞送至個體的任何合適路徑,例如使用於片劑、膠囊、溶液、粉末、凝膠、粒子中的配方於腸胃外投予,例如皮內、肌內、腹膜內、靜脈內或皮下、肺部、經黏膜(口服、鼻內、陰道內、直腸);並且被包含在注射器、植入裝置、滲透泵、藥筒、微型泵中;或所屬技術領域中具有通常知識者理解的其他方式,如在所屬技術領域中所習知者。特定點投予(site specific administration)可藉由例 如腫瘤內、關節內、支氣管內、腹腔內、囊內、軟骨內、腔內、體腔內、小腦內、側腦室內、結腸內、子宮頸內、胃內、肝內、心內、骨內、骨盆內、心包腔內、腹膜內、胸腔內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、椎管內、滑膜腔內、胸腔內、子宮內、血管內、膀胱內、病灶內、陰道、直腸、口腔、舌下、鼻內、或透皮遞送來達成。
本發明之抗體或其抗原結合片段亦可預防性地投予,以降低發展自體免疫疾病之風險及/或延緩症狀之發作。
本發明之抗體或其抗原結合片段可凍乾儲存,且在使用前於合適的載劑中重構。此技術已顯示對於習用蛋白質製劑為有效者並且可使用廣為人知之凍乾及重構技術。
本發明之抗體或其抗原結合片段具有體外及體內診斷效用、以及治療性及疾病預防性效用。例如,本發明之抗體或其抗原結合片段可投予至培養物、體外或離體(ex vivo)之細胞,或投予至個體以治療、預防、及/或診斷多種疾病,諸如免疫病症或希望減弱PD-1表現T細胞活性及/或下調免疫反應之任何病狀。
本發明亦提供一種抑制個體中之PD-1表現T細胞之活化的方法,其包含向該個體投予本發明之經單離之抗體或其抗原結合片段,達足以抑制該PD-1表現T細胞之活化的時間。
在一些實施例中,PD-1表現T細胞為抗原特異性CD4+ T細胞。
在一些實施例中,PD-1表現T細胞為抗原特異性CD8+ T細胞。
「抑制活化(suppress activation)」係指本文提供之抗體抑制PD-1表現T細胞之活化,例如抑制抗原特異性CD4+及/或CD8+ T細胞之增生或其IFN-γ生產之能力。當該抗體比起在該抗體不存在下(例如陰性對照)將抗原特異性CD4+及/或CD8+ T細胞之增生或其IFN-γ生產多抑制20%、30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%時,或當該抑制相較於該抗體不存在下的抑制為統計上顯著的時,該抗體抑制PD-1表現T細胞之活化。
PD-1表現T細胞可位於不適當炎性反應附近。本發明之抗體或其抗原結合片段可藉由下列來抑制PD-1表現T細胞之活化:擴大PD-1下游傳訊,從而導致抑制TCR傳訊且抑制T細胞活化、增生、及/或存活。本發明之抗體可替代地藉由抗體介導之效應功能ADCC、ADCP、及/或CDC來介導PD-1陽性T細胞之殺傷。
亦提供一種下調免疫反應之方法,其包含向有需要之個體投予治療有效量的本發明之經單離之抗體或其抗原結合片段,以下調該免疫反應。
亦提供一種治療免疫病症之方法,其包含向有需要之個體投予治療有效量的本發明之經單離之抗體或其抗原結合片段,以治療該免疫病症。
免疫病症可為慢性或急性的,諸如慢性炎性疾病或急性炎性疾病。
在一些實施例中,免疫病症為關節炎、類風溼性關節炎、氣喘、COPD、骨盆腔發炎性疾病、阿茲海默症(Alzheimer's Disease)、發炎性腸病、克隆氏病(Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎、佩羅尼氏病(Peyronie's Disease)、乳糜瀉(coeliac disease)、膽囊疾病、藏毛疾病(Pilonidal disease)、腹膜炎、牛皮癬、乾癬性關節炎、血管炎、手術沾黏、中風、第I型糖尿病、萊姆病、腦膜腦炎、自體免疫性葡萄膜炎、多發性硬化症、狼瘡(諸如全身性紅斑性狼瘡)、格巴二氏症候群(Guillain-Barr syndrome)、異位性皮膚炎、自體免疫性肝炎、纖維性肺泡炎、葛瑞夫茲氏病(Grave's disease)、IgA腎病、特發性血小板減少性紫癜、梅尼爾氏症(Meniere's disease)、天皰瘡、原發性膽汁性肝硬化、類肉瘤病、硬皮症、韋格納氏肉芽腫病(Wegener's granulomatosis)、其他自體免疫病症、胰臟炎、外傷(手術)、移植物抗宿主病、移植排斥、包括缺血性疾病諸如心肌梗塞之心臟病、以及動脈粥樣硬化、血管內凝血、骨再吸收、骨質疏鬆症、骨關節炎、牙周病、及胃酸過少症、與缺乏胎兒母體耐受有關之不孕症、休格倫氏症候群(Sjogren’s Syndrome)、白斑症、重症肌無力、或全身性硬化症。
在一些實施例中,免疫病症為類風溼性關節炎。
在一些實施例中,免疫病症為移植物抗宿主病。
在一些實施例中,免疫病症為關節炎。
在一些實施例中,免疫病症為氣喘。
在一些實施例中,免疫病症為COPD。
在一些實施例中,免疫病症為骨盆腔發炎性疾病。
在一些實施例中,免疫病症為阿茲海默症。
在一些實施例中,免疫病症為發炎性腸疾。
在一些實施例中,免疫病症為克隆氏病。
在一些實施例中,免疫病症為潰瘍性結腸炎。
在一些實施例中,免疫病症為佩羅尼氏病。
在一些實施例中,免疫病症為乳糜瀉。
在一些實施例中,免疫病症為膽囊疾病。
在一些實施例中,免疫病症為藏毛疾病。
在一些實施例中,免疫病症為腹膜炎。
在一些實施例中,免疫病症為牛皮癬。
在一些實施例中,免疫病症為乾癬性關節炎。
在一些實施例中,免疫病症為血管炎。
在一些實施例中,免疫病症為手術沾黏。
在一些實施例中,免疫病症為中風。
在一些實施例中,免疫病症為第I型糖尿病。
在一些實施例中,免疫病症為萊姆病。
在一些實施例中,免疫病症為腦膜腦炎。
在一些實施例中,免疫病症是自體免疫性葡萄膜炎。
在一些實施例中,免疫病症為多發性硬化症。
在一些實施例中,免疫病症為狼瘡。
在一些實施例中,免疫病症為全身性紅斑性狼瘡。
在一些實施例中,免疫病症為格巴二氏症候群。
在一些實施例中,免疫病症為異位性皮膚炎。
在一些實施例中,免疫病症為自體免疫性肝炎。
在一些實施例中,免疫病症為纖維性肺泡炎。
在一些實施例中,免疫病症為葛瑞夫茲氏病。
在一些實施例中,免疫病症為IgA腎病。
在一些實施例中,免疫病症為特發性血小板減少性紫癜。
在一些實施例中,免疫病症為梅尼爾氏症。
在一些實施例中,免疫病症為天皰瘡。
在一些實施例中,免疫病症為原發性膽汁性肝硬化。
在一些實施例中,免疫病症為類肉瘤病。
在一些實施例中,免疫病症為硬皮症。
在一些實施例中,免疫病症為韋格納氏肉芽腫病。
在一些實施例中,免疫病症為胰臟炎。
在一些實施例中,免疫病症為移植排斥。
在一些實施例中,免疫病症為心臟病,包括缺血性疾病,諸如心肌梗塞。
在一些實施例中,免疫病症為動脈粥樣硬化。
在一些實施例中,免疫病症為血管內凝血。
在一些實施例中,免疫病症為骨再吸收。
在一些實施例中,免疫病症為骨質疏鬆症。
在一些實施例中,免疫病症為骨關節炎。
在一些實施例中,免疫病症為牙周病。
在一些實施例中,免疫病症為胃酸過少症。
在一些實施例中,免疫病症為休格倫氏症候群。
在一些實施例中,免疫病症為白斑症。
在一些實施例中,免疫病症為重症肌無力。
在一些實施例中,免疫病症為全身性硬化症。
亦提供一種治療與發炎相關之疼痛的方法,其包含向有需要之個體投予治療有效量的本發明之經單離之抗體或其抗原結合片段,以治療與發炎相關之疼痛。
本發明亦提供本發明之特異性結合PD-1之抗體,其用於在療法中使用。
本發明亦提供本發明之特異性結合PD-1之抗體,其用於治療免疫病症。
本發明亦提供本發明之特異性結合PD-1之抗體,其用於治療類風溼性關節炎。
本發明亦提供本發明之特異性結合PD-1之抗體,其用於治療狼瘡,諸如全身性紅斑性狼瘡。
本發明亦提供本發明之特異性結合PD-1之抗體,其用於治療移植物抗宿主病。
本發明亦提供本發明之特異性結合PD-1之抗體在製造用於治療或預防免疫病症之藥劑中的用途。
本文提供之抗體可與第二治療劑組合投予。
第二治療劑可為用於免疫病症諸如自體免疫性或炎性疾病之任何已知療法,包括任何已知可用於或已用於或目前正用於治療此等疾病之藥劑或藥劑組合。此類療法及治療劑包括手術或手術程序(例如,脾切除術、淋巴結切除術、甲狀腺切除術、血漿去除法、白血球去除法、細胞、組織、或器官移植、腸程序、器官灌注、及類似者)、放射療法、諸如類固醇及非類固醇療法之療法、激素療法、細胞介素療法、使用皮膚病學藥劑(例如,用於治療皮膚病狀諸如過敏、接觸性皮炎、及牛皮癬之局部藥劑)之療法、免疫抑制療法、及其他抗炎單株抗體療法。
第二治療劑可為皮質類固醇、抗瘧疾藥、免疫抑制劑、細胞毒性藥物、或B細胞調節劑。
在一些實施例中,該第二治療劑為潑尼松(prednisone)、潑尼松龍(prednisolone)、甲基潑尼松龍(methylprednisolone)、地夫可特(deflazcort)、羥氯奎寧(hydroxychloroquine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、胺甲喋呤(methotrexate)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、黴酚酸酯(mycophenolate mofetil、MMF)、黴酚酸鈉(mycophenolate sodium)、 環孢靈素(cyclosporine)、來氟米特(leflunomide)、他克莫司(tacrolimus)、RITUXAN®(利妥昔單抗)、或BENLYSTA®(貝利單抗)。
在一些實施例中,本發明之抗體係與第二治療劑組合投予。例示性第二治療劑為皮質類固醇、非類固醇抗炎藥物(NSAID)、水楊酸鹽、羥化氯喹、柳氮磺胺吡啶、細胞毒性藥物、免疫抑制藥物免疫調節抗體、胺甲喋呤、環磷醯胺、咪唑立賓(mizoribine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、環孢黴素、他克莫司(FK506;ProGrafrM)、黴酚酸酯、及咪唑硫嘌呤(6-巰嘌呤)、西羅莫司(sirolimus)(雷帕黴素(rapamycin))、去氧精胍菌素(deoxyspergualin)、來氟米特(leflunomide)、及其丙二腈醯胺(malononitriloamide)類似物;抗CTLA4抗體及Ig融合物、抗B淋巴球刺激因子抗體(例如,LYMPHOSTAT-BTM)及CTLA4-Ig融合蛋白(BLyS-lg)、抗CD80抗體、抗T細胞抗體諸如抗CD3(OKT3)、抗CD4、皮質類固醇諸如例如氯倍他索(clobetasol)、鹵倍他索(halobetasol)、氫化可的松(hydrocortisone)、曲安西龍(triamcinolone)、倍他米松(betamethasone)、氟輕鬆(fluocinole)、氟輕鬆醋酸酯(fluocinonide)、潑尼松(prednisone)、潑尼松龍(prednisolone)、甲基潑尼松龍(methylprednisolone);非類固醇抗炎藥(NSAID),諸如例如柳氮磺胺吡啶、含有美沙拉嗪之藥物(稱為5-ASA劑)、塞來昔布(celecoxib)、雙氯芬酸(diclofenac)、依託度酸(etodolac)、非諾洛芬(fenprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、布洛芬(ibuprofen)、酮洛芬 (ketoprofen)、甲氯芬酯(meclofamate)、美洛昔康(meloxicam)、萘丁美酮(nabumetone)、萘普生(naproxen)、奧沙普秦(oxaprozin)、吡羅昔康(piroxicam)、羅非考昔(rofecoxib)、水楊酸鹽、舒林酸(sulindac)、及托美丁(tolmetin);磷酸二酯酶-4抑制劑、抗TNFα抗體REMICADE®(英夫利昔單抗)、SIMPONI®(格里木單抗)、及HUMIRA®(阿達木單抗)、沙利度胺或其類似物諸如來那度胺。
本發明之抗體可與第二治療劑同時、依序、或單獨組合投予。
Ra之治療效力可使用如藉由美國風濕病學會標準、歐洲風溼病學會標準、或任何其他標準所定義之臨床反應測量之效力來評定。參見,例如Felson等人(1995)Arthritis Rheum.38:727-35及van Gestel等人(1996)Arthritis Rheum.39:34-40。
雖然已用一般用語描述了本發明,但本發明之實施例將進一步揭露於下列實例中,且其不應被解讀為限制申請專利範圍之範疇。
使用ProteOn XPR36系統(BioRad)執行親和力測量。生物感測器表面係藉由使用胺偶合化學之製造商說明書,將抗人類IgG Fc(Jackson cat#109-005-098)偶合至GLC晶片(BioRad、Cat#176-5011)之經修飾藻酸鹽聚合物層表面而製備。將大約5000 Ru (反應單位)之mAb固定化。在25℃於電泳緩衝液(DPBS+0.01% P20+100μg/mL BSA)執行動力學實驗。為了執行動力學實驗,捕獲200RU mAb,隨後注射濃度範圍為1.563nM至400nM(以4倍連續稀釋)之分析物(人類及食蟹獼猴PD-1)。以50μL/min監測締合相3分鐘,隨後進行10或15分鐘緩衝液流(解離相)。晶片表面係用兩個18秒的100mM H3PO4(Sigma,Cat#7961)以100μL/min的脈衝而再生。
將所收集之數據使用ProteOn Manager軟體處理。首先,用間點將數據針對背景校正。接著,數據之雙參考減法係藉由使用緩衝液注射用於分析物注射來執行。使用Langmuir 1:1結合模型執行數據之動力學分析。各mAb之結果以ka(結合速率)、kd(解離速率)、及KD(平衡解離常數)之格式報告。
將利用CMV特異性回憶反應之檢定用於評定所產生抗體抑制T細胞活化之能力,該能力藉由在用CMV肽混合物(JPT Technologies)處理CMV反應性供體的PBMC後抑制細胞增生來測量。
將PBMC(Astarte Biologics,Hemacare,Precision for Medicine)判定為對相應供應商之CMV抗原有反應。冷凍小瓶之PBMC購自供應商且保持在液氮中。在實驗當天,解凍冷凍PBMC之 等分試樣,且將細胞再懸浮於10ml檢定培養基(RPMI-1640/Glutamax/HEPES,其包含1%青黴素/鏈黴素、1%丙酮酸鈉,1%非必需胺基酸(NEAA)溶液、10%熱滅活胎牛血清(全部購自Thermo Fisher Scientific)中。將細胞在室溫下進行200g離心達15分鐘。離心後,丟棄上清液,將細胞再懸浮於10ml檢定培養基中,且以250g自旋沉降10分鐘。離心後,將細胞再懸浮於10ml檢定培養基中,使其穿過70μm濾器且進行計數。將細胞濃度調整為1.5×106個細胞/ml或2×106個細胞/mL,且使用經組織培養處理之圓底96孔盤(Corning)以100μl/孔接種細胞。接種細胞密度為供體特異性的,且在初步實驗中經預定以最大化檢定窗口。根據製造商說明書製備CMV肽混合物。簡言之,將40μL二甲亞碸(Sigma)添加至含有25μg CMV肽混合物凍乾粉末之小瓶中,且輕輕吸取以溶解試劑。將CMV肽混合物之DMSO儲液稀釋於PBS中以製備50μg/mL溶液,並置於室溫下10min。以4x最終濃度對檢定培養基進行進一步稀釋製備,且將50μL之CMV肽溶液添加至各經刺激之孔中;而未經刺激之對照孔接受未經補充之培養基。在初步實驗中最佳化特異性供體PBMC之最終濃度(0.1至0.2μg/mL)。以10μg/mL之以4x最終濃度連續稀釋於檢定培養基中之單劑量添加抗PD-1抗體,且將50μL之抗體稀釋液添加至各孔中,而「無抗體(no antibody)」對照孔將接受50μl培養基。將盤在37℃/5% CO2下培養6天。培養後,將100μL自各孔收集之上清液、及100μL含有1μCi/孔甲基-3H-胸苷(PerkinElmer)之檢定培養基添加至各孔中,且將盤在37℃/5% CO2下 培養6小時。將細胞收獲至Unifilter-96,GF/C盤(PerkinElmer)上,使其在室溫下乾燥整夜。將50μL之Microscint-20(PerkinElmer)添加至各孔中。將盤密封並使用TopCount NXT(PerkinElmer)計數。
將利用過表現PD-1(PD-1-HEK細胞)或PD-1配體PD-L1(PD-L1-HEK細胞)、或PD-L2(PD-L2-HEK細胞)之人類胚腎(HEK)細胞之1:1混合物進行的檢定用於評定所產生抗體抑制基於細胞之情形下之受體:配體相互作用之能力,該能力藉由如由流動式細胞測量術所定量之細胞叢聚之抑制來測量。
用Violet Cell Trace染色劑(Life Technologies)標記過表現人類PD1之HEK細胞(Crown Bio)。用Far Red Cell Trace染色劑(Life technologies)標記過表現食蟹獼猴PD-L1或PD-L2之HEK細胞。簡言之,將染料溶解於20μL DMSO中,以製造5mM儲液,接著將5μL稀釋到10mL PBS中以製造2.5μM溶液。對細胞進行計數,且將50×106個細胞在室溫下以1000rpm離心5分鐘。將細胞在PBS中洗滌一次,且將1×106個細胞留出作為未經染色之對照。在重複離心後,丟棄上清液,將細胞再懸浮於上述適當的染料溶液中,且在室溫下培養15分鐘。接著添加4mL冰冷胎牛血清(FBS)且再培養5分鐘。接著如上將細胞離心,在檢定緩衝液(PBS,10% FBS,1mM EDTA)中洗滌一次,再次離心且抽吸上清液,接著將各細胞類型以3×106個細胞/mL重懸浮於檢定緩衝液中。將測試抗體稀釋至檢定緩衝 液之最終所欲濃度(60μg/mL)之三倍。為了製備最終細胞/抗體樣本(三重複),將100μL PD-1-HEK細胞與100μL抗體混合。在10小時培養後,添加100μL PD-L1-HEK或PD-L2-HEK細胞,且將最終混合樣本在冰上最少培養一小時。最後,添加5μL碘化丙啶,且將樣本輕輕混合,轉移至聚苯乙烯圓底管中,並在LSRII流式細胞儀(BD Biosciences)上分析。在活細胞上閘控事件後,使用Flowjo軟體判定用於太平洋藍及APC通道之雙陽性事件之百分比,且在GraphPad Prism 6中作圖。將如由抗PD-1 mAb之雙陽性事件之百分比所測量之叢聚水準與陽性及陰性同型對照抗體進行比較。
在Octet Red384平台(Forte Bio)上執行抗體之表位分級與競爭結合檢定,其係基於生物層干涉技術。此技術將初始抗體與PD-1塗佈之生物感測器之結合測量為由於所結合抗體隨著時間推移而增加生物感測器尖端之光密度所引起之波長偏移。簡言之,將組胺酸標記之PD-1抗原裝載至HIS感測器上。接著使感測器暴露於20μg/mL一級抗PD-1抗體,隨後暴露於相同濃度之第二抗PD-1抗體。使用ForteBio數據分析軟體處理數據。在用第一抗體飽和後,第二抗體之額外結合指示兩種抗體之同時結合,這必然具有獨特的非重疊表位。替代地,沒有額外結合指示兩種抗體競爭結合至PD-1抗原。
將人類記憶T細胞(AllCells LLC)之冷凍等分試樣在37℃水浴中解凍,且再懸浮於40ml培養基(RPMI+10% FBS或5%HuSAB+50μM βME(1:1000).+1% GlutaMax+10mM Hepes中。將細胞在室溫下在250g下離心15分鐘。離心後,丟棄上清液,將細胞再懸浮於10ml培養基中,且以250g自旋沉降10分鐘。離心後,將細胞再懸浮於10ml檢定培養基中,且進行計數。將細胞濃度調整至1.0×106個細胞/ml,且將10ml細胞懸浮液轉移至用抗CD3抗體(eBioscience,5ug/ml於PBS中,在37℃下1hr)預塗佈之組織培養盤。將培養基用2μg/mL抗CD28抗體(eBioscience)及100ng/ml濃度之IL-2、IL-15、及IL-7細胞介素(R&D Systems and Peprotech)之混合物補充。初步實驗展現PD-1表現在活化後第5天達到峰值,因此選擇此時間點以進行檢定。亦將新鮮單離之靜止記憶T細胞(未藉由CD3/CD28刺激來活化)作為對照包括在分析中,因為其表現低水準之PD-1。
使NK-92細胞在直立儲存在組織培養瓶中生長,且以0.5至1.0×106個細胞/mL之密度保持在40mL培養基(Myelocult H5100(StemCell Technologies),1X丙酮酸鈉/非必需胺基酸/青黴素鏈黴素(Invitrogen),4μM氫化可的松(StemCell Technologies),100ng/ml rhIL-2(R&D Systems))中。在實驗前一天冷凍PBMC細胞 (Hemacare)解凍,且再懸浮於XVIVO-10培養基(Lonza)、10% HI FBS(Invitrogen)、及100ng/ml IL2(R&D Systems)中。將細胞在室溫下在250g下離心15分鐘。離心後,丟棄上清液,將細胞再懸浮於10mL培養基中,且以250g自旋沉降10分鐘。離心後,將細胞再懸浮於10ml培養基中,且進行計數。將細胞濃度調整至1.0×106個細胞/mL,且將所需數目之細胞種於TC培養皿中。
檢定當天,將PBMC及NK細胞收穫且分別以1×107個細胞/mL及4×106個細胞/mL再懸浮於檢定培養基(RPMI,10% FBS,1mM丙酮酸鈉,0.1mM NEAA)中。將記憶T細胞洗滌一次,以1×106個細胞/ml再懸浮,且在37℃將每毫升細胞用6μL BATDA(Perkin Elmer)標記30min。將經BATDA標記之細胞用過量的冷檢定培養基洗滌三次,且將其密度調整至0.2×106個細胞/mL。在檢定培養基中製備以20μg/mL起始之測試抗體之連續稀釋液,將其遞送(100μL,2x最終濃度)至U底96孔檢定盤中。以0.2×106個細胞/mL添加經BATDA標記之目標細胞(50μL),且用測試mAb培養。以1×107個細胞/mL添加PBMC(50μL)以達到50:1效應細胞:目標細胞比率,而以4×106個細胞/mL添加NK細胞(50μL)以達到20:1效應細胞:目標細胞比率。以三重複形成含有經標記之目標細胞及20μL 2% Triton X-100的最大裂解對照孔。亦以三重複形成在檢定培養基中含有經標記之目標細胞的最小(背景BATDA釋放)對照孔。所有檢定盤孔中之最終體積為200μL。藉由移液管輕輕混合孔內容物。將盤短暫自旋沉降且在37℃在5% CO2培養箱中培養2.5小 時。培養後,將細胞以1200rpm自旋5分鐘。將上清液(30μL)轉移至含有200μL Europium溶液(PerkinElmer,C135-100)之96孔白色不透明Nunc盤(ThermoFisher,136101)。覆蓋盤以避光,且在搖動器上混合15min。在Envision多標記讀取器(PerkinElmer)上讀取樣本。裂解百分比係計算如下:100*(實驗釋放-背景釋放)/(最大釋放-背景釋放)。
將人類Pan T細胞(Biological Specialty,LSII 49301C)之冷凍等分試樣在37℃水浴中解凍,且再懸浮於40ml預溫熱之RPMI 1640+Glutamax+25mM HEPES(Life Technologies,Cat# 72400-047)+10% FBS(Gibco,160000-36)中。將細胞在室溫下以250g離心5分鐘。離心後,丟棄上清液,將細胞再懸浮於10mL至20mL培養基中,且進行計數。將人類Pan T細胞(Biological Specialty,LSII 49301C)培養5至6天,之後使用人類T-活化劑CD3/CD28 DynabeadsTM(Life Technologies,Cat# 11132D)進行CDC檢定。簡言之,將75μL預洗滌Dynabead與6.0×106個細胞/燒瓶之T細胞混合,添加至10至20mL培養基中之T175,且在37℃/5% CO2培養箱中培養6天。6天后,使用EasySepTM磁體(STEMCELL Technologies,18000)從混合物中移除小珠。
為準備CDC檢定將細胞,將細胞在室溫下以250g離心5分鐘。離心後,丟棄上清液,將細胞再懸浮於10ml無血清培養 基中,且進行計數。在無血清培養基中將細胞濃度調整至1.6×106個細胞/mL,且將50μL/孔接種於96孔U底盤(Falcon,353077)中。以25μg/mL(3x)起始,將測試抗體以1:3連續稀釋透過無血清培養基中之十一個點。將50μL/孔之測試抗體添加至適當靶細胞孔中。將50μL/孔之無血清培養基添加至背景對照孔及裂解對照孔中。將盤覆蓋且在室溫(RT)培養1小時。將50μL/孔之無血清培養基中稀釋之10%(3x)兔補體(Invitrogen,31038-100)添加至測試孔中。將50μL/孔之無血清培養基添加至背景對照孔中。將50μL/孔之無血清培養基中之2% Triton-X添加至裂解對照孔中。將盤在37℃/5% CO2下培養60分鐘。將細胞以250g自旋沉降5分鐘。將50μL/孔之上清液移除且轉移至96孔平底UV-Vis盤(Corning,3635)。將50μL/孔之LDH偵測試劑(Roche,11-644-793-001)添加至各樣本中;將盤覆蓋且在室溫下培養15分鐘。在SpectraMax Plus M5(Molecular Devices)上記錄490及650nm處之吸光度。使用Microsoft Excel及GraphPad Prism 6執行統計分析。從490nm處之吸光度中減去650nm處之吸光度以對濁度進行正規化。使用下式判定各樣本之細胞毒性百分比(%):(實驗值-低對照)/(高對照-低對照)×100其中,高對照為Triton x裂解對照孔之平均值,且低對照為『僅培養基』背景對照孔之平均值。將四參數對數曲線擬合模型,[log(促效劑)對反應-可變斜率(四個參數)]在GraphPad Prism中應用於log10之抗體濃度對經計算之細胞毒性%。以重複兩次運行樣本,且執 行檢定兩次。
為了確認目標表現,在活化後第5天或第6天藉由流動式細胞測量術測量經活化之人類Pan T細胞上之PD-1水準。簡言之,將T細胞以250g離心5分鐘,且以1×106個細胞/mL再懸浮於BSA染色劑緩衝液(BD Biosciences,554657)中。將100000至200000個細胞以100μL總體積用飽和濃度之PE-PD-1抗體(Biolegend,329906)培養。將細胞用2x w/BSA染色劑緩衝液洗滌,且再懸浮於含有DRAQ7活/死染色劑(Cell Signaling Technology,7406S)之等添加緩衝液中。在MACSQuant分析儀10流式細胞儀上記錄5000個活細胞事件之中值螢光強度。使用用QuantibriteTM PE小珠(BD,340495)產生之標準曲線判定受體水準,且表示為每個細胞所結合之抗體。
用接合至Fc(huPD-1-Fc)之人類PD-1(SEQ ID NO:1)之胞外域(ECD)免疫三隻Balb/c及三隻C3H小鼠,且使用標準方案產生融合瘤。藉由ELISA篩選融合瘤與重組PD-1(ECD)之結合。命中(hit)被定義為樣本與陰性對照平均值相比產生五倍大的ELISA信號。將陽性殖株用不相關之Fc融合蛋白來交叉篩選,且交叉篩選與小鼠PD-1之結合。測試來自單細胞選殖之融合瘤之上清液與人類及食蟹獼猴PD-1蛋白之結合。命中被定義為信號大於陰性對照之平均值+3 S.D.。
將所選小鼠抗體作為嵌合mAb殖株至人類IgG1中,且 根據實例1中所述之方案(CMV-PBMC檢定)測試其抑制CMV回憶檢定中之抗原特異性T細胞活化之能力。圖1A及圖1B顯示大多數測試抗體以超過50%或更多之水準抑制T細胞增生。PD1B199為拮抗性抗PD1 mAb。CNTO3930:同型對照。
將包括PD1B505、PD1B506、及PD1B512之幾種親本抗體人源化。為了尋找人源化VH及VL之最佳組合,將一或多種人類生殖系重鏈及輕鏈V區序列選擇用於各抗體。藉由將親本J區段序 列與人類J區段序列比較來選擇各親本抗體之VL及VH的人類J區段,以使序列同一性最大化。在作為用於抗原結合及蛋白質表現之粗上清液的基質中製備且測試各抗體之所有VH/VL人源化對。基於此等數據,純化與親本小鼠抗體相比展現可比或改善之PD-1結合的抗體,且測試其在CMV-PBMC檢定中之功效。
分析所產生抗體之可能的非所要翻譯後修飾風險。藉由誘變移除位於CDR中之高風險脫醯胺化模體及抗體中任何位置之游離半胱胺酸,且測試所得抗體與PD-1之結合以及在CM-PBMC檢定中之功效。
將人源化抗體及其變異體選殖為IgG1。
表3顯示所產生之抗體。表4顯示抗體之VH、VL、HC、及LC胺基酸序列之SEQ ID NO:。表5顯示編碼抗體之VH、VL、HC、及LC的多核苷酸序列之SEQ ID NO:。表6顯示抗體之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3胺基酸序列之SEQ ID NO:。表7顯示抗體之HCDR1、HCDR2、及HCDR3胺基酸序列。表8顯示抗體之LCDR1、LCDR2、及LCDR3胺基酸序列。表9顯示抗體之VH及VL胺基酸序列。表10顯示編碼抗體之VH之多核苷酸序列。表11顯示編碼抗體之VL之多核苷酸序列。表12顯示HC胺基酸序列。表13顯示LC胺基酸序列。表14顯示編碼抗體之HC之多核苷酸序列。表15顯示編碼抗體之LC之多核苷酸序列。
本文提供之編碼抗體VH、VL、HC、及LC之cDNA序列可經密碼子最佳化以在各種細胞中表現,例如以在HEK或CHO細胞中表現。下文顯示可用於編碼及表現PD1B878及PD1B849 VH、VL、HC、及LC之額外cDNA序列。
圖2A及圖2B分別顯示PD1B505譜系mAb之VH及VL胺基酸序列之比對。
圖3A及圖3B分別顯示PD1B506譜系mAb之VL及VL胺基酸序列之比對。
圖4A及圖4B分別顯示PD1B512譜系mAb之VH及 VL胺基酸序列之比對。
所選人源化抗體之特徵在於其抑制CMV特異性回憶檢定(實例1中所述之CMV-PBMC檢定)中之經活化之T細胞的能力。如表16所示,親本抗體PD1B505及PD1B506展現幾個單獨實驗中三個不同供體間評定之經活化之T細胞的穩健抑制,其中該等結果顯示為10μg/ml mAb下的T細胞增生抑制百分比(%)。圖5A顯示PD1B505(57.8%±9.5%)及PD1B506(77.0% +/- 7.8%)在相較於同型對照(人類IgG1)(-9.5%±28.8%)時的平均抑制%及STDEV。如表17作為10μg/ml下的抑制%所示,人源化抗體PD1B743、PD1B750、及PD1B756亦抑制T細胞活化。圖5B顯示PD1B743(58.0%±11.3%)PD1B750(65.9%±13.2%)、PD1B756(36.7%±15.5%)在相較於同型對照(人類IgG1)(3.5%±25.6%)時的平均抑制%及STDEV。從分析中排除展現超過25% STDEV之檢定。如表18所示,經工程改造之抗體PD1B878及PD1B849類似地抑制經活化之T細胞。圖5C顯示PD1B878(78.3%±18.1%)及PD1B849(69.0%±4.0%)在相較於同型對照(人類IgG1)(4.1%±28.7%)時的平均抑制%及STDEV。
使用SPR如實例1中所述測量親本及人源化抗體對PD-1之親和力。
表19顯示親和力測量之結果。抗體結合PD-1之KD介 於5.2×10-8M與2.1×10-8M之間。
藉由使用實例1中所述之方案評估抗體對過表現PD-1或PD-1配體(PD-L1或PD-L2)之細胞之叢聚的作用來評定配體阻斷。較低的記錄之雙陽性事件之百分比(%)指示經測試mAb阻斷PD-1結合至經測試配體。
圖6A顯示在用PD1B743、PD1B750、或PD1B756處理細胞之後保持的PD-1-HEK及PD-L1-HEK細胞團簇%。PD1B743及PD1B756未阻斷PD-L1結合至PD-1,而PD1B750會阻斷。類似地,PD1B743及PD1B756未阻斷PD-L2結合至PD-1,而PD1B750會阻斷(圖6B)。將已知的抗PD-1配體阻斷mAb用作實驗中之陽性 對照。
在初始矩陣檢定中使用嵌合抗體遵循實例1中所述之方案來識別五個不同的表位分級。分級4及分級5不與任何其他分級交叉競爭。分級1、分級2、及分級3部分重疊;分級1與分級2及分級3競爭,且分級2及分級3與分級1競爭。分級1、分級2、分級3、及分級4不阻斷PD-L1結合至PD-1,而分級5確實阻斷PD-L1/PD-1相互作用。圖7顯示不同表位分級及各分級內之抗體。
進行使用同型對照作為所添加之第一抗體的對照實驗,以展現第二抗體如何單獨結合至人類PD-1。接著在競爭實驗中,在此步驟起始後180秒時獲取第二抗體之締合信號(nm)。將各潛在競爭抗體之信號與來自3次運行的在同型對照後添加之相同抗體之信號之平均值進行比較。判定此等信號之比率。若比率低於0.7,則判定第二抗體不能結合至人類PD-1,且該兩種抗體共享同一表位。若比率大於0.7,則判定第二抗體可在存在第一抗體之情況下結合,且因此該兩種抗體結合至非競爭性表位。
預期人源化及PTM工程改造不會導致表位之偏移,因此預期PD1B743、PD1B742、及PD1B878與親本嵌合分級1 PD1B505結合同一表位。相似地,預期PD1B750、PD1B751、及PD1B849與親本嵌合分級5 PD1B506結合同一表位,且預期PD1B756與親本嵌合分級2 PD1B512結合同一表位。
PD1B503包含分別為SEQ ID NO:114及115之VH及VL。
PD1B517包含分別為SEQ ID NO:116及117之VH及VL。
為了改善PD1B878之結合親和力,在重鏈及輕鏈兩者上執行CDR掃描。設計非組合庫以使所有六個CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3)之每個位置多樣化。簡言之,如WO2009/085462、Shi等人,J Mol Biol 397:385-396(2010)、及Tornetta等人J Immunol Methods 360:39-46(2010)中所述,且對限制酶切點稍加修飾,在pIX噬菌體Fab展示系統中建構Fab庫。此等庫係針對生物素化的人類PD-1/PDCD1(Acro Biosystems.Cat# PD1-H82E4),根據所屬技術領域中已知的淘選方案,如WO2009/085462及Shi等人,J Mol Biol 397:385-396(2010)中所述者進行淘選。藉由輔助性噬菌體感染產生噬菌體。藉由添加小珠擷取黏合劑以形成小珠/抗原/噬菌體錯合物。在最終洗滌之後,藉由感染指數生長的TG-1大腸桿菌細胞來援救噬菌體。
為了追蹤篩選,自TG-1大腸桿菌細胞之整夜培養製備質體DNA,且藉由NheI/SpeI消化切除pIX基因。連接後,將DNA轉形入TG-1細胞且在LB/瓊脂盤上生長整夜。第二天,挑取群落,生長整夜,且將培養物用於(i)V區之群落測序,及(ii)Fab生產之誘導。為了Fab生產,將整夜培養物在新培養基中稀釋100倍,且在37℃條件下生長5至6小時。藉由添加含有IPTG之新鮮培養基誘導Fab 生產且培養物在30℃生長整夜。第二天,將培養物自旋沉降,且使用包含可溶性Fab蛋白之上清液進行Fab ELISA。對於ELISA,藉由多株抗Fd(CH1)抗體將可溶性Fab蛋白捕獲至盤上。洗滌及阻斷後,加入5nM濃度之生物素化的人類PD-1/PDCD1。該濃度能夠進行Fab變異體之排序,其經定義為相對於親本之倍數變化,其中親本Fab作為所有盤之對照存在,經定義為100%結合。藉由HRP接合之鏈黴親和素偵測生物素化的人類PD-1,且在盤讀取器中測量化學發光。根據該標準,選擇相對於親本Fab以10倍或更高倍數結合人PD-1的3個重鏈及2個輕鏈。
表20顯示在VH之HCDR2中之位置57處及VL之LCDR1中之位置29或30處具有取代的變異體。表21顯示該等抗體之CDR之SEQ ID NO。表22顯示VH、VL、HC、及LC胺基酸序列之SEQ ID NO。表23顯示編碼抗體之VH、VL、HC、及LC之多核苷酸之SEQ ID NO。表24顯示HCDR1、HCDR2、及HCDR3胺基酸序列。表25顯示LCDR1、LCDR2、及LCDR3胺基酸序列。表26顯示VH胺基酸序列。表27顯示VL胺基酸序列。親和力成熟之變異體經預期將與親本抗體PD1B878一樣結合PD-1上的相同表位。
使用如實例1中所述之SPR測量抗體對人類及食蟹獼猴PD-1之親和力。抗體結合人類PD-1之KD介於1×10-8M至10×10-10M之間(表28)且結合食蟹獼猴PD-1之KD介於7×10-8M至1×10-9M之間(表26)。當與親本抗體比較時,大多數親和力成熟之PD1B878變異體之親和力改善約100倍。
對於PD1B1086、PD1B1090、及PD1B1094,表徵其抑制CMV特異性回憶檢定(實例1中所述之CMV-PBMC檢定)中之經活化T細胞的能力。表30顯示在一個實驗中兩個供體之間的平均抑制百分比。所有測試抗體抑制CMV特異性回憶檢定之程度為70%或更高。
已發現PD-1主要表現在記憶T細胞(CD45RO+細胞)上,而不表現在初始T細胞上,且發現T細胞活化時該表現上調。在經CMV勝肽刺激之記憶T細胞上,PD-1表現增加(圖8A)。
對於抗體PD1B849及PD1B878,利用CMV活化之PBMC測試其抑制活化之記憶CD4+或CD8+ T細胞增生之能力。 PD1B849及PD1B878兩者均抑制CMV-PBMC回憶檢定中之CMV特異性活化PBMC之增生(圖8B)。
對於PD1B849及PD1B878,使用NK細胞或PBMC作為效應細胞測試其介導經活化記憶T細胞或靜止記憶T細胞之ADCC之能力。當與靜止記憶T細胞比較時,識別出經活化記憶T細胞具有更高的PD-1表現。根據實例1中所述之方案進行實驗。PD1B849及PD1B878係表現在兩個單獨CHO細胞係中,一個細胞系產生具有正常CHO抗體醣化特徵之抗體,而另一個細胞系產生具有降低之碳水化合物海藻糖基含量之抗體(例如,低海藻糖(LF)細胞係)。經表現在低海藻糖細胞系中之抗體具有約1-15%之海藻糖基含量。
PD1B849及PD1B878在NK(圖9A,左圖)細胞及PBMC(圖9A,右圖)效應細胞存在下均誘發經活化記憶T細胞之ADCC。具有低海藻糖含量之抗體(PD1B849-LF及PD1B878-LF)展現出對記憶T細胞之較強的ADCC活性。PD1B849及PD1B878在NK細胞(圖10A,左圖)及PBMC(圖10B,右圖)效應細胞存在下均不能在表現低水準PD-1之靜止記憶T細胞中誘發可偵測之ADCC。PD1B849-LF及PD1B878-LF在NK細胞或PBMC存在下觸發低水準ADCC。
對於PD1B849及PD1B878,使用所添加的兔補體測試其介導經活化pan T細胞之CDC之能力。當與靜止T細胞比較時,經活化之T細胞具有更高的PD-1表現。根據實例1中所述之方案進行實驗。在所測試之濃度下,PD1B849及PD1B878未誘發經活化T細胞之CDC(圖11)。陽性對照OKT3在補體存在時展現出對經活化T細胞之CDC活性,但在補體不存在時未展現對經活化T細胞之CDC活性。
對於所選抗體,測試其阻斷經dextramer化之(dextramerized)PD-L1-Fc結合至表現Jurkat細胞之PD-1之能力。根據下文所述之方案進行實驗。在所測試之濃度下,PD1B878、PD1B1090、及PD1B1094未阻斷PD-L1之結合(圖12)。作為陽性對照,已顯示一種已知的拮抗劑抗體以劑量依賴性方式與PD-L1競爭結合至PD-1。
方法:以4x濃度製備生物素化的PD-L1-Fc(Acro Biosystems)及SA & APC接合之Dextramer(Immudex),且以100nM:10nM之比率混合於染色緩衝液中。以與陰性或非特異性結合對照相同的方式製備生物素化的IgG1-Fc與Dextramer及Dextramer與單獨培養基之混合物。將該混合物用箔覆蓋且在準備實驗之其餘部分的同時在冰上培養一小時。在染色劑緩衝液中以20nM、2nM、及 0.2nM之2x濃度製備測試抗體之連續稀釋液。在檢定當天收穫過表現PD-1之Jurkat細胞,且用染色劑緩衝液(BD Pharmingen)洗滌一次,該洗滌係藉由將細胞在4℃以300g離心5分鐘。計數細胞,檢查活力,且以2×106個細胞/毫升再懸浮於染色劑緩衝液中。將細胞以25微升/孔(50000個細胞/孔)添加至U形底之96孔檢定盤,隨後以50微升(μL)/孔加入所製備之測試抗體。帶有抗體之細胞在冰上培養15分鐘。以25μL/孔加入生物素化PD-L1-Fc:Dextramer、生物素化IgG1-Fc:Dextramer、及Dextramer:緩衝液之預混合錯合物。將細胞、抗體、及經結合至Dextramer之PD-L1之該混合物在冰上培養1小時,且用箔覆蓋。
藉由添加150μL染色劑緩衝液洗滌細胞兩次,以300g離心細胞5分鐘使細胞成團,且輕彈盤以移除上清液。將最終洗滌後之細胞團塊再懸浮於40μL之IntelliCyt電泳緩衝液(補充有1mM EDTA及0.1%普朗尼克酸(Pluronic acid)之BD染色劑緩衝液)中,該電泳緩衝液包含Sytox green活/死細胞活力染色劑(ThermoFisher)之1:1000稀釋液。檢定中的最終抗體濃度為10nM、1nM、及0.1nM。最終生物素化PD-L1-Fc配體蛋白濃度為25nM。最終Dextramer濃度為2.5nM。
將盤在iQue Screener(IntelliCyt)上電泳。簡言之,在FCS v.SCS上閘控細胞以消除碎屑。在SCS-A vs SCS-H上閘控單態細胞(singlet)且將來自單態細胞群體之活細胞在低BL1通道上閘控,Sytox green活力染色劑呈陰性。結合至PD-L1-Fc-Dextramer之陽性 活細胞百分比藉由RL1/APC通道中之幾何均值(Geomean)評估,且與陰性對照,即單獨Fc-Dex結合相比較。使用ForeCyt(來自IntelliCyt之軟體程式)中之高階度量(advanced metrics),將PD-L1陽性群體計算為活群體之百分比(%)。特異性PD-L1結合之百分比計算如下:=(mAb陽性%-IgG1-Fc生物素dextramer陽性%)/(同型對照陽性%-IgG1-Fc生物素dextramer陽性%) * 100。最終結果在excel中製表且在prism中作圖,其顯示在抗PD-1 mAb存在下之PD-L1配體結合%。
為研究PD-1促效劑mAb對活體內致病性T細胞之作用,藉由將人類周邊血單核細胞(PBMC)過繼轉移至免疫受損之NOD-scid IL-2Rγnull(NSG)小鼠中來開發異種移植物抗宿主病(Xeno-GVHD)模型。自Jackson Labs獲得雌性NSG小鼠(7至9週齡)。將小鼠在動物園設施中隔離一週,之後使用。自AllCells,Alameda,CA獲得自膚色血球層單離之冷凍人類PBMC。在注射之前,將冷凍細胞在37℃下在水浴中快速解凍,且用無菌磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌3次,在室溫下以500g下離心5min。將細胞懸浮於冷PBS中以獲得50×106/mL之最終細胞濃度。
將動物藉由體重隨機化,且細分成各種處理組(N=10/組)。隨機化後,使用Gammacell® 3000 Elan照射器(9.72戈瑞/分 鐘)使有意識且自由移動之小鼠接受100拉德(1戈瑞)之全身照射。將小鼠放置回其棲息籠中。
各小鼠以靜脈內方式接受500μl體積中之25×106個人類PBMC。每日根據表31記錄各動物之臨床評分及體重。將損失20%體重之小鼠處死,且根據機構IACUC指導方針記錄其終點時之臨床評分。在第21天將所所有動物安樂死。收集脾以進行FACS分析。收集皮膚及結腸組織以進行組織學分析。
將小鼠以Q4d/Q3d方案(在第0天、第4天、第7天、第11天、第14天、及第18天給藥)用10mg/kg選殖為嵌合mIgG2a抗體之PD1B505、PD1B506、PD1B849、及PD1B878 mAb以及PD-1拮抗劑mAb(小鼠效應子沉默Fc上之PD1B786)以腹膜內方式注射。將用作對照之CTLA-4-Ig以Q3d給藥方案(第0天、第3天、第6天、第9天、第12天、第15天、及第18天)以腹膜內方式給藥10mg/kg。
在研究終止時,將脾移除至冷RPMI1640培養基。在透 過70μM過濾器壓碎脾及藉由在4℃下以1200rpm離心5分鐘來使細胞成團後,將紅血球在ACK裂解緩衝液(Lonza)中在冰上裂解5分鐘,且在FACS緩衝液(PBS/0.5% BSA/2mM EDTA)中洗滌多次。藉由用ef506活力染料(eBioscience)根據製造商說明書將細胞染色評定脾細胞之活力。將脾細胞用人類及小鼠Fc段(BD Biosciences)在冰上培養15min,接著用最佳濃度之螢光團接合mAb(1×106個細胞於100μl亮染色劑緩衝液(Brilliant Stain buffer)中)在U形微量滴定盤中在4℃染色30分鐘,且用固定緩衝液(BD Biosciences)固定。將計數Brite小珠(Thermofisher)添加至各樣本中。將FMO(螢光-1)對照製備作為各螢光團之陰性對照。在LSRll儀器(BD Biosciences)上分析樣本。將下列mAb用於調控性T細胞分析:抗hCD45多甲藻素葉綠素α蛋白(PCP,殖株2D1)、抗FoxP3別藻藍蛋白(APC,殖株pCH101)、抗hCD3別藻藍蛋白-花菁7(APC-Cy7,殖株HIT3a)、抗hCD4亮紫羅蘭605(BV605,殖株OKT4)、及抗hCD25亮紫羅蘭650(BV650,殖株M-A251)。將調控性T細胞定義為hCD45+hCD3+hCD4+,Foxp3+CD25+。
圖13A顯示用PD1B505-mIgG2a及PD1B506-mIgG2a進行之處理防止GvHD小鼠模型中之疾病發展。圖13B顯示用PD1B505-mIgG2a及PD1B506-mIgG2a進行之處理防止GvHD小鼠模型中之體重減輕。圖14A顯示用PD1B849-mIgG2a及PD1B878-mIgG2a進行之處理防止GvHD小鼠模型中之疾病發展。圖14B顯示用PD1B849-mIgG2a及PD1B878-mIgG2a進行之處理防止GvHD小 鼠模型中之體重減輕。體重減輕之抑制及臨床評分與脾中之調控性T細胞增加相關。圖15顯示用PD1B849-mIgG2a或PD1B878-mIgG2a處理之動物脾中之Treg頻率。
將人類PBMC自液氮冷凍儲存中擷取,且在37℃水浴快速解凍直至剛剛解凍。將小瓶內容物轉移至無菌的50ml錐形管(各供體使用單獨的管)中,且將完全RPMI培養基(10% FBS,1x青黴素/鏈黴素,1x丙酮酸鈉)滴加至各管中直至總體積為15ml。將細胞在室溫下以250×g離心10min,接著丟棄上清液,且將細胞再懸浮於5至10ml完全培養基中,且使用台盼藍排除來計數。將細胞以2.5×106個細胞/ml再懸浮,並以三重複以2.5×105個細胞/孔(=100μl/孔)接種於96孔無菌U底聚苯乙烯盤中。將PD-1 mAb或人類IgG1同型對照稀釋至4x最終濃度,且將50μl/孔添加至適當孔中。抗體添加後,將正常人類血清添加至5%最終濃度。各孔中之總體積為200μl,且將細胞在37℃、5% CO2下培養96小時。除了樣本之外,亦接種幾個孔之額外細胞,接受5%人類血清,且與待用作為流動式細胞測量術染色對照之經處理之樣本一起培養。
培養後,將盤以350×g離心5min,且將上清液抽真空。將細胞再懸浮於200μl PBS中,在所述的下,將複製孔匯集,接著轉移至新的96孔U底盤來染色以進行流動式細胞測量術。將匯集 細胞以350×g離心5min,將上清液抽真空,且將螢光抗體混合物添加至各樣本孔中(參見下表之所用抗體)。用FMO混合物對保存用於對照之額外細胞的關鍵標記進行染色,該等關鍵標記諸如待在用於界定閘控之分析中使用的PD-1、CXCR5、ICOS、及其他標記。將細胞在黑暗中在室溫下染色25min,接著以350×g離心5min。將細胞在200μl PBS中洗滌兩次,接著將100μl之4%多聚甲醛添加至各孔中以固定細胞。將細胞在黑暗中在4℃固定10min,接著用PBS+1% BSA洗滌一次,之後再懸浮於200μl PBS+1% BSA中。將計數小珠(Invitrogen)以5μl/孔(5000個小珠)添加用於各樣本,之後在BD LSRII流式細胞儀上獲取樣本。使用FlowJo軟體分析流動式細胞測量術數據。如下將樣本計數正規化為小珠計數:樣本中之細胞數=(計數之細胞數*添加之5000個小珠)/(計數之小珠數)。如下將樣本正規化為huIgG1同型對照:(小珠正規化細胞計數「樣本」/小珠正規化細胞計數「同型」)*100,且表示為百分比(%)。使用GraphPad Prism v7來對數據進行作圖。
在分析期間,描述下列細胞群體:濾泡輔助性T(Tfh):活,CD19-CD56-/CD4+CD45RO+/HLADR+/CXCR5+/ICOS+PD1+;外周輔助性T(Tph):活,CD19-CD56-/CD4+CD45RO+/HLADR+/CXCR5-/ICOS+PD1+;組合Tfh/Tph群體:活,CD19-CD56-/CD4+CD45RO+/HLADR+/ICOS+PD1+。
圖16顯示由PD1B878、PD1B878-FL(低海藻糖)、PD1B1090、及PD1B1094進行的組合THF/TPH群體之抗體介導之耗竭的劑量反應曲線。該數據表示為來自同型對照之TFH/TPH細胞數目的平均倍數變化%,使用n=8個細胞健康供體(對於PD1B1090,n=7)。PD1B878-FL最為有效地耗盡TFH/TPH群體。
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 聚核苷酸
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
<210> 28
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<223> 人工序列說明:合成 多肽
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
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<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
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<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
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<220>
<223> 人工序列說明:合成 聚核苷酸
<210> 97
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
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<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列說明:合成
<220> 聚核苷酸
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<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 聚核苷酸
<210> 103
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 聚核苷酸
<210> 104
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
<210> 105
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
<210> 106
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 聚核苷酸
<210> 107
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 聚核苷酸
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
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<211> 219
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
<210> 110
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 聚核苷酸
<210> 112
<211> 657
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列說明:合成 聚核苷酸
<210> 113
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 聚核苷酸
<210> 114
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
<210> 115
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
<210> 116
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
<210> 117
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
<210> 118
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
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<223> E或Q
<220>
<221> MOD_RES
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<221> MOD_RES
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<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
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<221> MOD_RES
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<223> K或Q
<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
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<223> E,Y,H或W
<220>
<221> MOD_RES
<222> (62)..(62)
<223> D或Q
<220>
<221> MOD_RES
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<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
<223> N,C或S
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<220>
<221> MOD_RES
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<223> N或S
<220>
<221> MOD_RES
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<223> N或A
<220>
<221> MOD_RES
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<223> T或V
<220>
<221> MOD_RES
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<223> T或L
<220>
<221> MOD_RES
<222> (117)..(117)
<223> L或V
<210> 119
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Q或E
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> I或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> M或L
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> A或L
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> L或P
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> V或A
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> M或L
<220>
<221> MOD_RES
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<223> T或S
<220>
<221> MOD_RES
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<223> V或F
<220>
<221> MOD_RES
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<223> S或P
<220>
<221> MOD_RES
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<223> S或L
<220>
<221> MOD_RES
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<223> S或A
<220>
<221> MOD_RES
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<223> K或R
<220>
<221> MOD_RES
<222> (48)..(48)
<223> W或L
<220>
<221> MOD_RES
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<223> V或I
<220>
<221> MOD_RES
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<223> A或D
<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
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<223> Y或F
<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
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<223> S或R
<220>
<221> MOD_RES
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<223> M或L
<220>
<221> MOD_RES
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<223> A或P
<220>
<221> MOD_RES
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<223> A或F
<220>
<221> MOD_RES
<223> T或V
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (101)..(101)
<223> A或Q
<220>
<221> MOD_RES
<223> L或I
<222> (107)..(107)
<210> 120
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Q或V
<220>
<221> MOD_RES
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<223> S或P
<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
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<223> V或K
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> L或V
<220>
<221> MOD_RES
<222> (38)..(38)
<223> K或R
<220>
<221> MOD_RES
<222> (40)..(40)
<223> R或A
<220>
<221> MOD_RES
<222> (48)..(48)
<223> I或M
<220>
<221> MOD_RES
<222> (55)..(55)
<223> N,D,Q,K或E
<220>
<221> MOD_RES
<222> (56)..(56)
<223> G,A或I
<220>
<221> MOD_RES
<222> (61)..(61)
<223> N或A
<220>
<221> MOD_RES
<222> (62)..(62)
<223> E或Q
<220>
<221> MOD_RES
<222> (65)..(65)
<223> K或Q
<220>
<221> MOD_RES
<222> (66)..(66)
<223> K或G
<220>
<221> MOD_RES
<222> (67)..(67)
<223> K或R
<220>
<221> MOD_RES
<222> (68)..(68)
<223> A或V
<220>
<221> MOD_RES
<222> (76)..(76)
<223> S或I
<220>
<221> MOD_RES
<222> (82)..(82)
<223> Q或E
<220>
<221> MOD_RES
<222> (85)..(85)
<223> S或R
<220>
<221> MOD_RES
<222> (87)..(87)
<223> T或R
<220>
<221> MOD_RES
<222> (89)..(89)
<223> E或D
<220>
<221> MOD_RES
<222> (91)..(91)
<223> S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (112)..(112)
<223> T或L
<220>
<221> MOD_RES
<222> (113)..(113)
<223> L或V
<210> 121
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> V或Q
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Q或P
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> K或S
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> F或S
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> M或L
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> T或A
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> R或G
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> V或I
<220>
<221> MOD_RES
<222> (41)..(41)
<223> G或E
<220>
<221> MOD_RES
<222> (42)..(42)
<223> Q或K
<220>
<221> MOD_RES
<222> (43)..(43)
<223> S或A
<220>
<221> MOD_RES
<222> (46)..(46)
<223> A或S
<220>
<221> MOD_RES
<222> (60)..(60)
<223> D或S
<220>
<221> MOD_RES
<222> (63)..(63)
<223> T或S
<220>
<221> MOD_RES
<222> (76)..(76)
<223> T或S
<220>
<221> MOD_RES
<222> (77)..(77)
<223> N或S
<220>
<221> MOD_RES
<222> (78)..(78)
<223> V或L
<220>
<221> MOD_RES
<222> (80)..(80)
<223> S或P
<220>
<221> MOD_RES
<222> (83)..(83)
<223> L或F
<220>
<221> MOD_RES
<222> (85)..(85)
<223> E或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (87)..(87)
<223> F或Y
<220>
<221> MOD_RES
<222> (100)..(100)
<223> S或Q
<220>
<221> MOD_RES
<222> (106)..(106)
<223> M或I
<210> 122
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> V或I
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> G或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> L或V
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> Q或K
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (43)..(43)
<223> S或P
<220>
<221> MOD_RES
<222> (46)..(46)
<223> G或A
<220>
<221> MOD_RES
<222> (62)..(62)
<223> N或S
<220>
<221> MOD_RES
<222> (72)..(72)
<223> S或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (77)..(77)
<223> S或K
<220>
<221> MOD_RES
<222> (81)..(81)
<223> F或V
<220>
<221> MOD_RES
<222> (83)..(83)
<223> K或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (84)..(84)
<223> I或M
<220>
<221> MOD_RES
<222> (86)..(86)
<223> S或N
<220>
<221> MOD_RES
<222> (87)..(87)
<223> V或M
<220>
<221> MOD_RES
<222> (89)..(89)
<223> T或P
<220>
<221> MOD_RES
<222> (90)..(90)
<223> A或V
<220>
<221> MOD_RES
<222> (117)..(117)
<223> T或L
<210> 123
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> A或S
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> A或P
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> N或L
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> L或P
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> T或E
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> S或P
<220>
<221> MOD_RES
<222> (69)..(69)
<223> S或G
<220>
<221> MOD_RES
<222> (79)..(79)
<223> R或K
<220>
<221> MOD_RES
<222> (105)..(105)
<223> S或G
<220>
<221> MOD_RES
<222> (109)..(109)
<223> L或V
<220>
<221> MOD_RES
<222> (111)..(111)
<223> M或I
<210> 124
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 胜肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> N,D,Q,K或E
<220>
<221> MOD_RES
<223> G,A或I
<222> (7)..(7)
<210> 125
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
<210> 126
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
<210> 127
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
<210> 128
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
<210> 129
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
<210> 130
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
<210> 131
<211> 268
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<210> 132
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 聚核苷酸
<210> 133
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 聚核苷酸
<210> 134
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 聚核苷酸
<210> 135
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 聚核苷酸
<210> 136
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 聚核苷酸
<210> 137
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 聚核苷酸
<210> 138
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 聚核苷酸
<210> 139
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 聚核苷酸
<210> 140
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
<210> 141
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
<210> 142
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
<210> 143
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
<210> 144
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
<210> 145
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 胜肽
<210> 146
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 胜肽
<210> 147
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 胜肽
<210> 148
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 胜肽
<210> 149
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 胜肽
<210> 150
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
<210> 151
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
<210> 152
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
<210> 153
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
<210> 154
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 多肽
<210> 155
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 聚核苷酸
<210> 156
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 聚核苷酸
<210> 157
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 聚核苷酸
<210> 158
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 聚核苷酸
<210> 159
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 聚核苷酸
<210> 160
<211> 1813
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 聚核苷酸
<210> 161
<211> 1813
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 聚核苷酸
<210> 162
<211> 1813
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 聚核苷酸
<210> 163
<211> 1105
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 聚核苷酸
<210> 164
<211> 1105
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 聚核苷酸
<210> 165
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 胜肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> E,Y,H或W
<210> 166
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明:合成 胜肽
<220>
<221> MOD_RES
<223> V或F
<222> (6)..(6)
<220>
<221> MOD_RES
<223> S或P
<222> (7)..(7)
Claims (25)
- 一種特異性結合PD-1的經單離之抗體或其抗原結合片段,其包含分別為SEQ ID NO:2、3、4、5、6及7之重鏈互補決定區1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3、輕鏈互補決定區1(LCDR1)、LCDR2及LCDR3。
- 如請求項1所述之抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段具有下列性質之一、二、三、四或五者:a)不阻斷PD-L1結合至PD-1;其中阻斷之缺乏係利用流式細胞儀藉由該抗體不能抑制PD-L1表現細胞及PD-1表現細胞之叢聚來測量;b)以約5×10-8M或更小之平衡解離常數(KD)結合PD-1,其中該KD係使用ProteOn XPR36系統在+25℃測量;c)以約3×104 1/Ms或更大之締合常數(ka)結合PD-1,其中該ka係使用ProteOn XPR36系統在+25℃測量;d)以約3×10-3 1/s或更小之解離常數(kd)結合PD-1,其中該kd係使用ProteOn XPR36系統在+25℃測量;或e)抑制抗原特異性T細胞之增生;其中增生係在CMV-PBMC檢定中評定。
- 如請求項1或2所述之抗體或其抗原結合片段,其包含a)衍生自IGHV7-4-1*1之重鏈可變區(VH)架構(SEQ ID NO:125);b)衍生自IGKV3D-20*1之輕鏈可變區(VL)架構(SEQ ID NO: 126);或c)衍生自IGHV7-4-1*1之VH架構(SEQ ID NO:125)以及衍生自IGKV3D-20*1之VL架構(SEQ ID NO:126)。
- 如請求項1或2所述之抗體或其抗原結合片段,其包含a)SEQ ID NO:10之重鏈可變區(VH);b)SEQ ID NO:16之輕鏈可變區(VL);或c)分別為SEQ ID NO:10及16之VH及VL。
- 如請求項1或2所述之抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段為PD-1之促效劑、或介導PD-1表現細胞之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、或兩者。
- 如請求項5所述之抗體或其抗原結合片段,其中該等PD-1表現細胞為經活化之記憶T細胞、濾泡輔助性T細胞(TFH)、或外周輔助性T細胞(TPH)、或其任何組合。
- 如請求項1或2所述之抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段為IgG1、IgG2、及IgG3或IgG4同型。
- 如請求項1或2所述之抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段在該抗體Fc中包含至少一個突變,該突變調節該抗體與Fc受體(FcR)之結合。
- 如請求項8所述之抗體或其抗原結合片段,其中該至少一個突變為a)S267E突變;b)S267D突變;c)S267E/I332E突變;d)S267E/L328F突變;e)G236D/S267E突變; f)P238D突變;或g)P238D/E233D/G237D/H268D/P271G/A330R突變。
- 如請求項1或2所述之抗體或其抗原結合片段,其中該抗體包含a)SEQ ID NO:22之重鏈(HC);b)SEQ ID NO:28之輕鏈(LC);c)SEQ ID NO:22之HC、及SEQ ID NO:28之LC。
- 如請求項1或2所述之抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段具有雙觸角聚醣結構,其海藻糖含量為約介於1%至約15%之間。
- 一種多核苷酸,其包含以下核酸序列:a)編碼SEQ ID NO:10之VH;b)編碼SEQ ID NO:16之VL;c)編碼SEQ ID NO:10之VH及SEQ ID NO:16之VL;d)編碼SEQ ID NO:22之HC;e)編碼SEQ ID NO:28之LC;f)編碼SEQ ID NO:22之HC及SEQ ID NO:28之LC;或g)包含SEQ ID NO:13、19、25或31之多核苷酸序列。
- 一種載體,其包含至少一種如請求項12所述之多核苷酸。
- 一種宿主細胞,其包含如請求項13所述之載體。
- 如請求項14所述之宿主細胞,其中該宿主細胞為真核細胞、原核細胞、CHO細胞、HEK293細胞或融合瘤。
- 一種製造如請求項1至11中任一項所述之抗體或其抗原結合片段的方法,其包含在表現該抗體或其抗原結合片段之條件下培養如請求項14所述之宿主細胞、及單離該抗體或其抗原結合片段。
- 一種醫藥組成物,其包含如請求項1至11中任一項所述之抗體或其抗原結合片段。
- 一種套組,其包含如請求項1至11中任一項所述之抗體或其抗原結合片段。
- 一種如請求項1至11中任一項所述之經單離之抗體或其抗原結合片段用於製造抑制個體中之PD-1表現T細胞之活化的藥劑之用途。
- 如請求項19所述之用途,其中該PD-1表現T細胞為抗原特異性CD4+ T細胞及/或抗原特異性CD8+ T細胞。
- 一種如請求項1至11中任一項所述之經單離之抗體或其抗原結合片段用於製造下調免疫反應的藥劑之用途。
- 一種如請求項1至11中任一項所述之經單離之抗體或其抗原結合片段用於製造治療免疫病症的藥劑之用途。
- 如請求項22所述之用途,其中該免疫病症為狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、休格倫氏症候群(Sjogren’s Syndrome)、關節炎、類風溼性關節炎、氣喘、COPD、骨盆腔發炎性疾病、阿茲海默症(Alzheimer's Disease)、發炎性腸病、克隆氏病(Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎、佩羅尼氏病(Peyronie's Disease)、乳糜瀉(coeliac disease)、膽囊疾病、藏毛疾病(Pilonidal disease)、腹膜炎、牛皮癬、乾癬性關節炎、血管炎、手術沾黏、中風、第I型糖尿病、萊姆病、腦膜腦炎、自體免疫性葡萄膜炎、多發性硬化症、格巴二氏症候群(Guillain-Barr syndrome)、異位性皮膚炎、自體免疫性肝炎、纖維性肺泡炎、葛瑞夫茲氏病(Grave's disease)、IgA腎病、特發性血小板減少性紫癜、梅尼爾氏症(Meniere's disease)、天皰 瘡、原發性膽汁性肝硬化、類肉瘤病、硬皮症、韋格納氏肉芽腫病(Wegener's granulomatosis)、其他自體免疫病症、胰臟炎、外傷、移植物抗宿主病、移植排斥、包括缺血性疾病之心臟病、血管內凝血、骨再吸收、骨質疏鬆症、骨關節炎、牙周病、及胃酸過少症、與缺乏胎兒母體耐受有關之不孕症、、白斑症、重症肌無力、或全身性硬化症。
- 如請求項19至23中任一項所述之用途,其中該抗體或其抗原結合片段係與第二治療劑組合投予。
- 一種免疫接合物,其包含接合至異源分子的如請求項1至11中任一項所述之抗體或抗原結合片段。
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