CN116249714A - 包含cd3抗原结合结构域的蛋白质及其用途 - Google Patents

包含cd3抗原结合结构域的蛋白质及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN116249714A
CN116249714A CN202180038437.2A CN202180038437A CN116249714A CN 116249714 A CN116249714 A CN 116249714A CN 202180038437 A CN202180038437 A CN 202180038437A CN 116249714 A CN116249714 A CN 116249714A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
isolated protein
epsilon
protein
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180038437.2A
Other languages
English (en)
Inventor
J·罗
R·布里廷汉
F·伊
S·R·布罗德
R·甘尼桑
J·胡佛
S·A·雅各布斯
C·M·凯恩
S·辛格
A·兹沃拉克
T·K·巴特
M·D·费尔德坎普
S·L·拉波特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Janssen Biotech Inc
Original Assignee
Janssen Biotech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Janssen Biotech Inc filed Critical Janssen Biotech Inc
Publication of CN116249714A publication Critical patent/CN116249714A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
    • C07K16/4258—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig
    • C07K16/4266—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig against anti-tumor receptor Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand

Abstract

本发明提供了结合分化簇3(CD3)的抗原结合结构域、包含该结合CD3ε的抗原结合结构域的蛋白质、编码它们的多核苷酸、载体、宿主细胞、制备和使用它们的方法。

Description

包含CD3抗原结合结构域的蛋白质及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年5月27日提交的美国临时申请序列号63/030,448、2020年7月29日提交的美国临时申请序列号63/057,958和2020年10月22日提交的美国临时申请序号63/094,931的优先权。上述申请中的每一者的公开内容全文以引用方式并入本文。
序列表
本申请包含已经以ASCII格式电子递交的序列表，并且据此全文以引用方式并入。所述ASCII副本创建于2021年5月11日，命名为JBI6316WOPCT1_SL.txt，并且大小为1,061字节。
技术领域
本公开提供了结合分化簇3(CD3)蛋白质的抗原结合结构域、包含结合CD3的抗原结合结构域的蛋白质、编码它们的多核苷酸、载体、宿主细胞、制备和使用它们的方法。
背景技术
已经探索了双特异性抗体和抗体片段作为募集溶细胞性T细胞以杀死肿瘤细胞的手段。然而，许多募集T细胞的双特异性抗体的临床用途受到挑战的限制，这些挑战包括不利的毒性、潜在的免疫原性和制造问题。因此，非常需要募集溶细胞性T细胞以杀死包括例如降低的毒性和有利的制造特征的肿瘤细胞的改进的双特异性抗体。
人CD3 T细胞抗原受体蛋白复合物由六条不同的链组成：一条CD3γ链(SwissProtP09693)、一条CD3δ链(SwissProt P04234)、两条CD3ε链(SwissProt P07766)和一条CD3ζ链同源二聚体(SwissProt P20963)(εγ:εδ:ζζ)，该同源二聚体与T细胞受体α和β链缔合。该复合物在将抗原识别偶联到几种胞内信号转导途径中起重要作用。CD3复合物介导信号转导，从而导致T细胞活化和增殖。CD3是免疫应答所需的。
重定向细胞毒性T细胞以杀死肿瘤细胞已经成为许多肿瘤适应症的重要治疗机理(Labrijn,A.F.，Janmaat,M.L.，Reichert,J.M.和Parren,P.，Bispecific antibodies:amechanistic review of the pipeline.Nat Rev Drug Discov 18,585-608,doi:10.1038/s41573-019-0028-1(2019))。T细胞活化遵循双信号假说，其中第一信号通过T细胞受体(TCR)复合物与其同源肽MHC复合物在抗原呈递细胞(APC)上的接合来提供，并且第二信号可以是共刺激的或共抑制的(Chen,L.和Flies,D.B.，Molecular mechanisms of Tcell co-stimulation and co-inhibition.Nat Rev Immunol 13,227-242,doi:10.1038/nri3405(2013))。肿瘤通常不能呈递足够的非自身抗原以诱导基于T细胞的免疫应答，而接合T细胞的BsAbs(bsTCE)可通过在没有TCR-pMHC相互作用的情况下诱导T细胞活化来克服这一挑战。T细胞受体信号传导通过TCR的CD3亚基的胞质区中的ITAM基序发生(Chen,D.S.和Meleman,I.，Oncology meets immunology:cancer-immunity cycle.Immunity 39,1-10,doi:10.1016/j.immuni.2013.07.012(2013))。具体地，CD3ε亚基以每个TCR复合物两个拷贝的形式存在，并且表示用于T细胞接合的有吸引力的抗原。事实上，许多靶向CD3的bsTCEε在mAb失效的情况下显示出临床抗肿瘤功效，并且正在针对几种肿瘤靶标进行重大的药物开发工作(Labrijn,A.F.等人，2019)。bsTCE临床开发的三个主要挑战是：1)与经由全身或非肿瘤T细胞活化的细胞因子释放相关的快速并且严重的毒性的可能性，2)具有高效力和强烈治疗指数的bsTCE的制剂和给药的实际挑战，以及3)再活化诱导的T细胞死亡的可能性，其中肿瘤浸润性T细胞(TILS)响应于bsTCE的过度活化而经历细胞凋亡(Wu，Z.Wu和Cheung,N.V.，T cell engaging bispecific antibody(T-BsAb):From technology totherapeutics.Pharmacol Ther 182,161-175,doi:10.1016/j.pharmthera.2017.08.005(2018))。
总之，这些观察表明本领域需要更有利并且可用于治疗癌症的新型CD3特异性结合蛋白质。
发明内容
例如，通过提供对肿瘤抗原具有高亲和力并且对T细胞具有弱亲和力的新型CD3ε特异性结合蛋白质，本公开满足了这一需求。本公开的包含结合CD3ε的抗原结合结构域的蛋白质表现出高热稳定性、减小的脱酰胺风险和降低的免疫原性。
在某些实施方案中，本公开提供了一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含结合分化簇3ε(CD3ε)的抗原结合结构域，其中该结合CD3ε的抗原结合结构域包含：
a.SEQ ID NO:23的重链可变区(VH)的重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:24的轻链可变区(VL)的轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3；
b.SEQ ID NO:23的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:27的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
c.SEQ ID NO:23的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:28的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
d.SEQ ID NO:23的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:29的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者
e.SEQ ID NO:23的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:30的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他实施方案中，该分离的蛋白质包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：
a.分别为SEQ ID NO:6、7、8、9、10和11；
b.分别为SEQ ID NO:12、13、14、15、16和17；或者
c.分别为SEQ ID NO:18、19、20、21、16和22。
在其他实施方案中，结合CD3ε的抗原结合结构域是scFv、(scFv)2、Fv、Fab、F(ab')2、Fd、dAb或VHH。
在其他实施方案中，结合CD3ε的抗原结合结构域是Fab。
在其他实施方案中，结合CD3ε的抗原结合结构域是VHH。
在其他实施方案中，结合CD3ε的抗原结合结构域是scFv。
在其他实施方案中，该scFv从N端到C端包含VH、第一接头(L1)和VL(VH-L1-VL)或者包含该VL、该L1和该VH(VL-L1-VH)。
在某些实施方案中，该L1包含：
a.约5至50个氨基酸；
b.约5至40个氨基酸；
c.约10至30个氨基酸；或者
d.约10至20个氨基酸。
在某些实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63或64的氨基酸序列。
在某些实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:31、37或64的氨基酸序列。
在其他实施方案中，结合CD3ε的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:23的VH以及SEQID NO:24、27、28、29或30的VL。
在其他实施方案中，结合CD3ε的抗原结合结构域包含：
a.SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:24的VL；
b.SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:27的VL；
c.SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:28的VL；
d.SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:29的VL；或者
e.SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:30的VL。
在其他实施方案中，结合CD3ε的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:65、66、67、68、69、70、71、72、73或74的氨基酸序列。
本公开提供了一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含结合CD3ε的抗原结合结构域，其中该结合CD3ε的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:23的重链可变区(VH)和SEQ ID NO:103的轻链可变区(VL)。在其他实施方案中，结合CD3ε的抗原结合结构域是scFv、(scFv)2、Fv、Fab、F(ab')2、Fd、dAb或VHH。在其他实施方案中，该scFv从N端到C端包含VH、第一接头(L1)和VL(VH-L1-VL)或者包含该VL、该L1和该VH(VL-L1-VH)。在其他实施方案中，该L1包含a.约5至50个氨基酸；b.约5至40个氨基酸；c.约10至30个氨基酸；或者d.约10至20个氨基酸。在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63或64的氨基酸序列。在其他实施方案中，结合CD3ε的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:23的VH以及SEQ ID NO:24、27、28、29或30的VL。在各种实施方案中，结合CD3ε的抗原结合结构域包含：SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:24的VL；SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:27的VL；SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:28的VL；SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:29的VL；或者SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:30的VL。
在其他实施方案中，该分离的蛋白质是单特异性蛋白质。在其他实施方案中，该分离的蛋白质是多特异性蛋白质。在其他实施方案中，该多特异性蛋白质是双特异性蛋白质。在其他实施方案中，该多特异性蛋白质是三特异性蛋白质。
在其他实施方案中，该蛋白质缀合至半衰期延长部分。
在其他实施方案中，该半衰期延长部分是免疫球蛋白(Ig)、该Ig的片段、Ig恒定区、该Ig恒定区的片段、Fc区、转铁蛋白、白蛋白、白蛋白结合结构域或聚乙二醇。
在其他实施方案中，该分离的蛋白质还包含免疫球蛋白(Ig)恒定区或该Ig恒定区的片段。
在其他实施方案中，该Ig恒定区的片段包含Fc区。
在其他实施方案中，该Ig恒定区的片段包含CH2结构域。
在其他实施方案中，该Ig恒定区的片段包含CH3结构域。
在其他实施方案中，该Ig恒定区的片段包含CH2结构域和CH3结构域。
在其他实施方案中，该Ig恒定区的片段包含铰链的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域。
在其他实施方案中，该Ig恒定区的片段包含铰链、CH2结构域和CH3结构域。
在其他实施方案中，结合CD3ε的抗原结合结构域缀合至Ig恒定区或Ig恒定区的片段的N端。
在其他实施方案中，结合CD3ε的抗原结合结构域缀合至Ig恒定区或Ig恒定区的片段的C端。
在其他实施方案中，结合CD3ε的抗原结合结构域经由第二接头(L2)缀合至Ig恒定区或Ig恒定区的片段。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63或64的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该多特异性蛋白质包含结合除CD3ε以外的抗原的抗原结合结构域。
在其他实施方案中，该细胞抗原是肿瘤相关抗原。在其他实施方案中，该肿瘤相关抗原是激肽释放酶相关肽酶2(hK2)蛋白。在其他实施方案中，该肿瘤相关抗原是人白细胞抗原G(HLA-G)。在其他实施方案中，该肿瘤相关抗原是前列腺特异性膜抗原(PSMA)。在其他实施方案中，该肿瘤相关抗原是δ样蛋白3(DLL3)。在其他实施方案中，Ig恒定区或Ig恒定区的片段是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
在其他实施方案中，Ig恒定区或Ig恒定区的片段包含导致蛋白质与Fcγ受体(FcγR)的结合减少的至少一个突变。在其他实施方案中，导致蛋白质与FcγR的结合减少的该至少一个突变选自由以下项组成的组：F234A/L235A、L234A/L235A、L234A/L235A/D265S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、F234A/L235A、S228P/F234A/L235A、N297A、V234A/G237A、K214T/E233P/L234V/L235A/G236-缺失/A327G/P331A/D365E/L358M、H268Q/V309L/A330S/P331S、S267E/L328F、L234F/L235E/D265A、L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、S228P/F234A/L235A/G237A/P238S和S228P/F234A/L235A/G236-缺失/G237A/P238S，其中根据EU索引进行残基编号。
在其他实施方案中，Ig恒定区或Ig恒定区的片段包含导致蛋白质与FcγR的结合增强的至少一个突变。
在其他实施方案中，导致蛋白质与FcγR的结合增强的该至少一个突变选自由以下项组成的组：S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L和G236A/S239D/I332E，其中根据EU索引进行残基编号。
在其他实施方案中，FcγR是FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB或FcγRIII或它们的任何组合。
在其他实施方案中，该Ig恒定区或Ig恒定区的片段包含调节蛋白质的半衰期的至少一个突变。
在其他实施方案中，调节蛋白质的半衰期的该至少一个突变选自由以下项组成的组：H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A和H435R，其中根据EU索引进行残基编号。
在其他实施方案中，该蛋白质在Ig恒定区的CH3结构域中包含至少一个突变。
在其他实施方案中，该Ig恒定区的CH3结构域中的该至少一个突变选自由以下项组成的组：T350V、L351Y、F405A、Y407V、T366Y、T366W、T366L、F405W、K392L、T394W、T394S、Y407T、Y407A、T366S/L368A/Y407V、L351Y/F405A/Y407V、T366I/K392M/T394W、T366L/K392L/T394W、F405A/Y407V、T366L/K392M/T394W、L351Y/Y407A、T366A/K409F、L351Y/Y407A、L351Y/Y407V、T366V/K409F、T366A/K409F、T350V/L351Y/F405A/Y407V和T350V/T366L/K392L/T394W，其中根据EU索引进行残基编号。
本公开还提供了一种药物组合物，该药物组合物包含分离的蛋白质和药学上可接受的载体，该分离的蛋白质包含本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域。
本公开还提供了一种多核苷酸，该多核苷酸编码包含本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域的蛋白质。
本公开还提供了一种载体，该载体包含编码包含本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域的蛋白质的多核苷酸。
本公开还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含载体，该载体包含编码包含本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域的蛋白质的多核苷酸。
本公开还提供了一种产生本公开的分离的蛋白质的方法，该方法包括在使该蛋白质表达的条件下培养本公开的宿主细胞，以及回收由该宿主细胞产生的蛋白质。
本公开还提供了一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的组合物以治疗该癌症，该组合物包含含有结合CD3ε的抗原结合结构域的分离的抗体。在其他实施方案中，该癌症是实体瘤或血液系统恶性肿瘤。在其他实施方案中，该实体瘤是前列腺癌、结直肠癌、胃癌、肾透明细胞癌、膀胱癌、肺癌、鳞状细胞癌、胶质瘤、乳腺癌、肾脏癌、新生血管疾病、肾透明细胞癌(CCRCC)、胰腺癌、肾癌、尿道上皮癌或肝脏转移性腺癌。在其他实施方案中，该血液系统恶性肿瘤是急性髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性髓性白血病(CML)或母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤(DPDCN)。在其他实施方案中，该抗体与第二治疗剂联合施用。
本公开还提供了一种抗独特型抗体，该抗独特型抗体与包含本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域的分离的蛋白质结合。
本公开还提供了一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含与CD3ε(SEQ ID NO:1)上的表位结合的抗原结合结构域，其中该表位是包含SEQ ID NO:100、101和102的氨基酸序列的不连续表位。
本公开还提供了一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:747、748、77、78、749、750、751、752、753和754。
在一个实施方案中，本公开提供了一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQID NO:747的氨基酸序列。在一个实施方案中，本公开提供了一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:748的氨基酸序列。在一个实施方案中，本公开提供了一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。在一个实施方案中，本公开提供了一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列。在一个实施方案中，本公开提供了一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:749的氨基酸序列。在一个实施方案中，本公开提供了一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:750的氨基酸序列。在一个实施方案中，本公开提供了一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQID NO:751的氨基酸序列。在一个实施方案中，本公开提供了一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:752的氨基酸序列。在一个实施方案中，本公开提供了一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:753的氨基酸序列。在一个实施方案中，本公开提供了一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:754的氨基酸序列。
本公开还提供了一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:85和86的氨基酸序列。
本公开还提供了一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:85和88的氨基酸序列。
本公开还提供了一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:85和90的氨基酸序列。
本公开还提供了一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:85和92的氨基酸序列。
本公开还提供了一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:85和94的氨基酸序列。
附图说明
当结合附图阅读时，进一步理解发明内容以及下文的具体实施方式。出于示出本公开的抗体和方法的目的，附图中所示的是抗体和方法的示例性实施方案；然而，抗体和方法不限于所公开的具体实施方案。在附图中：
图1A和图1B示出了杂交瘤细胞上清液与原代人T细胞的结合。克隆UCHT1用作阳性对照(图1B)；小鼠IgG1同种型(mIgG1)用作阴性对照。
图2示出了在大肠杆菌(E.coli)中表达的抗CD3 scFv变体与CD3的结合。
图3示出了CD3B815(SEQ ID NO:119)、CD3W244(SEQ ID NO:27)、CD3W245(SEQ IDNO:28)、CD3W246(SEQ ID NO:24)、CD3W247(SEQ ID NO:29)和CD3W248(SEQ ID NO:30)的VL区的比对。
图4示出了使用氢-氘交换质谱(HDX-MS)测定的CD3W245与人CD3ε结合的复合物(CD3ε:CD3W245)或OKT3与人CD3ε结合的复合物(CD3ε:OKT3)所确定的氢-氘交换速率(示出了SEQ ID NO:99，其是SEQ ID NO:5的片段)。单下划线表示在抗体的存在下与单独的CD3ε相比氘化水平降低10％-30％的片段，并且双下划线表示氘化水平降低>30％的片段。
图5示出了mu11B6、hu11B6、KL2B357、KL2B358、KL2B359、KL2B360、HCF3和HCG5的VH结构域的序列比对。图5分别以外观顺序公开了SEQ ID NO:126、124、132、134、136、132、128和130。
图6示出了mu11B6、hu11B6、KL2B357、KL2B358、KL2B359、KL2B360、LDC6和LCB7的VL结构域的序列比对。图6分别以外观顺序公开了SEQ ID NO:127、125、133、135、135、135、129和131。
图7示出了定位到hK2抗原序列上的所选hK2抗体的结合表位。图7分别以外观顺序公开了SEQ ID NO:745、741、741、741、741和741。
图8A示出了通过实时incuCyte成像系统测量的KL2B×CD3双特异性分子的体外靶细胞毒性，以用于定量靶细胞死亡。
图8B示出了通过用于测量由靶细胞死亡产生的凋亡信号的荧光半胱天冬酶3/7试剂测量的KL2B×CD3双特异性分子的体外靶细胞毒性。
图9A通过显示在不同剂量下的CD25阳性细胞的频率示出了由KLK2×CD3双特异性抗体引起的体外T细胞活化和增殖。
图9B通过显示细胞进入增殖门的频率示出了由KLK2×CD3双特异性抗体引起的体外T细胞活化和增殖。
图10A示出了由KLK2×CD3双特异性抗体引起的体外T细胞INF-γ释放。
图10B示出了由KLK2×CD3双特异性抗体引起的体外T细胞INF-α释放。
图11(图11A至图11F)示出了所选抗hK2抗体和所选抗hK2/CD3双特异性抗体的结合互补位。带下划线的序列指示CDR区，并且突出显示的序列指示互补位区。图11A分别以外观顺序公开了SEQ ID NO:219-220。图11B分别以外观顺序公开了SEQ ID NO:213和224。图11C分别以外观顺序公开了SEQ ID NO:208和215。图11D分别以外观顺序公开了SEQ ID NO:742和743。图11E分别以外观顺序公开了SEQ ID NO:327和221。图11F分别以外观顺序公开了SEQ ID NO:329和222。
图12示出了当格式化为scFv时，v区在热处理后结合重组HLA-G的能力。
图13示出了使用基于氢-氘交换的LC-MS的所选抗体在HLA-G(SEQ ID NO:691)上的表位定位。示出的序列是SEQ ID NO:691的片段，其中氨基酸残基编号从成熟HLA-G的第一个残基开始(示出了残基183-274)。图13分别以外观顺序公开了SEQ ID NO:746、746、744和744。
图14A至图14B示出了通过在IgG1(MHGB665)或IgG4(MHGB523)上工程化的MHGB665来源的可变区增强K562-HLA-G细胞的NK细胞介导的细胞毒性。图14A示出了NKL细胞介导的细胞毒性；图14B示出了NK-92细胞介导的细胞毒性。
图15A至图15B示出了通过在IgG1(MHGB669)或IgG4(MHGB526)上工程化的MHGB669来源的可变区增强K562-HLA-G细胞的NK细胞介导的细胞毒性。图15A示出了NKL细胞介导的细胞毒性；图15B示出了NK-92细胞介导的细胞毒性。
图16A至图16B示出了通过在IgG1(MHGB688)或IgG4(MHGB596)上工程化的MHGB688来源的可变区增强K562-HLA-G细胞的NK细胞介导的细胞毒性。图16A示出了NKL细胞介导的细胞毒性；图16B示出了NK-92细胞介导的细胞毒性。
图17A至图17B示出了通过在IgG1(MHGB694)或IgG4(MHGB616)上工程化的MHGB694来源的可变区增强K562-HLA-G细胞的NK细胞介导的细胞毒性。图17A示出了NKL细胞介导的细胞毒性；图17B示出了NK-92细胞介导的细胞毒性。
图18A至图18B示出了通过在IgG1(MHGB687)或IgG4(MHGB585)上工程化的MHGB687来源的可变区增强K562-HLA-G细胞的NK细胞介导的细胞毒性。图18A示出了NKL细胞介导的细胞毒性；图18B示出了NK-92细胞介导的细胞毒性。
图19A至图19B示出了通过在IgG1(MHGB672)或IgG4(MHGB508)上工程化的MHGB672来源的可变区增强K562-HLA-G细胞的NK细胞介导的细胞毒性。图19A示出了NKL细胞介导的细胞毒性；图19B示出了NK-92细胞介导的细胞毒性。
图20示出了由所选抗体MHGB665(“B665”)、MHGB669(“B669”)、MHGB672(“B672”)、MHGB682(“B682”)、MHGB687(“B687”)和MHGB688(“B688”)介导的针对JEG-3细胞的ADCC活性。
图21A至图21B示出了所选抗体的ADCC活性。
图21C至图21D示出了所选抗体的CDC活性。
图22A至22B示出了HC3B125针对表达HLA-G的肿瘤细胞HUP-T3的细胞毒性和T细胞活化％。
图22C至22D示出了HC3B125针对表达HLA-G的肿瘤细胞RERF-LC-Ad-1的细胞毒性和T细胞活化％。
图23示出了HC3B258和HC3B125针对RERF-LC-Ad-1细胞的细胞毒性；效应细胞(T细胞):靶细胞(RERF-LC-Ad1)比率为1:3、1:1或3:1，如所指出的那样。
图24A至24B示出了用对照(HLA-G×空白)或HCB125处理的CD34+细胞人源化NSG-SGM3小鼠中建立的胰腺PDX在第27天的组平均肿瘤体积(17A)和个体肿瘤体积。
图25示出了用对照(CD3×空白)或HCB125处理的T细胞人源化NSG小鼠中建立的Hup-T3异种移植物的组平均肿瘤体积。
图26A和图26B示出了双特异性抗DLL3×CD3抗体与DLL3+肿瘤细胞系的细胞结合。图26A示出了双特异性抗DLL3×CD3抗体与DLL3+肿瘤细胞系SHP77细胞的细胞结合。图26B示出了双特异性抗DLL3×CD3抗体与DLL3+肿瘤细胞系HCC1833细胞的细胞结合。
图27示出了使用FACS的双特异性抗DLL3×CD3抗体在人泛T细胞上的结合。
图28A和图28B示出了通过incuCyte成像系统实时测量的双特异性抗DLL3×CD3抗体的体外靶细胞毒性，以用于定量靶细胞死亡。图28A示出了通过incuCyte成像系统实时测量的抗DLL3×CD3双特异性分子的体外靶细胞毒性，以用于定量靶细胞死亡。将分离的泛T细胞与DLL3+SHP77细胞在双特异性抗DLL3×CD3抗体的存在下共温育120小时。图28B示出了通过incuCyte成像系统实时测量的抗DLL3×CD3双特异性分子的体外靶细胞毒性，以用于定量靶细胞死亡。将分离的泛T细胞与DLL3-HEK293细胞在双特异性抗DLL3×CD3抗体的存在下共温育120小时。
图29示出了由双特异性抗DLL3×CD3抗体引起的体外T细胞IFN-γ释放。测量在指定时间点收集的上清液中的IFN-γ浓度。
图30A至图30C示出了由双特异性抗DLL3×CD3抗体介导的针对PBMC中的DLL3+靶细胞系的细胞毒性。图30A示出了由双特异性抗DLL3×CD3抗体介导的针对PBMC中的DLL3+靶细胞系的细胞毒性，其中E:T比率为10:1。图30B示出了由双特异性抗DLL3×CD3抗体介导的针对PBMC中的DLL3+靶细胞系的细胞毒性，其中E:T比率为5:1。图30C示出了由双特异性抗DLL3×CD3抗体介导的针对PBMC中的DLL3+靶细胞系的细胞毒性，其中E:T比率为1:1。
图31示出了在全PBMC细胞毒性测定中CD3+T细胞响应于双特异性抗DLL3×CD3抗体的增殖。
图32A至图32C示出了T细胞响应于双特异性抗DLL3×CD3抗体的活化。图32A示出了T细胞响应于双特异性抗DLL3×CD3抗体的活化(％CD25+细胞)。图32B示出了T细胞响应于双特异性抗DLL3×CD3抗体的活化(％CD69+细胞)。图32C示出了T细胞响应于双特异性抗DLL3×CD3抗体的活化(％CD71+细胞)。
图33A至图33B示出了优化的双特异性抗DLL3×CD3抗体的特征。图33A示出了在基于IncuCyte的细胞毒性测定中评价的具有和不具有优化的抗DLL3序列的抗DLL3×CD3双特异性抗体的肿瘤细胞溶解。图33B示出了分离的泛T细胞与DLL3+SHP77细胞在双特异性DLL3/T细胞重定向抗体的存在下共温育120小时。
具体实施方式
本说明书中所引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请均以引用方式并入本文，如同在本文中完整给出。
应当了解，本文所用的术语只是为了描述具体实施方案的目的，并非旨在进行限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。
虽然与本文所述的那些方法和材料相似或等效的任意方法和材料都可以用于检验本发明的实践中，然而本文中描述示例性材料和方法。在描述和要求保护本发明时，将使用以下术语。
当提供一个列表时，除非另行指出，否则应当理解，该列表中的每个单独元素和该列表的每种组合都是单独的实施方案。例如，作为“A、B或C”呈现的实施方案的列表将被理解为包括实施方案“A”、“B”、“C”、“A或B”、“A或C”、“B或C”或者“A、B或C”。
如本说明书和所附权利要求中所用，除非内容另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代。因此，例如，对“一个细胞”的提及包括两个或更多个细胞的组合等等。
过渡术语“包括”、“基本上由……组成”和“由……组成”旨在暗示它们在专利用语中的公认含义；即，(i)“包括”与“包含”、“含有”或“其特征在于”同义，并且是包括端值在内或末端开放的，并且不排除附加的、未列出的要素或方法步骤；(ii)“由……组成”排除权利要求书未指定的任何要素、步骤或成分；以及(iii)“基本上由……组成”将权利要求的范围限制于指定的材料或步骤“以及本质上不影响受权利要求书保护的发明的基本及新颖特征的材料或步骤”。还提供了以短语“包括”(或其等同形式)描述的实施方案，如以“由……组成”和“基本上由……组成”独立描述的那些实施方案。
“约”是指处于如本领域的普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围之内，其将部分取决于该值是如何测量或测定的，即测量系统的限制。在特定测定、结果或实施方案的上下文中，除非实施例或说明书其他地方内另有明确说明，否则“约”意指在根据本领域惯例的一个标准偏差之内或多至5％的范围(取较大者)。
“活化”或“刺激”或“活化的”“刺激的”是指诱导细胞的生物状态的变化，从而导致活化标志物的表达、细胞因子产生、增殖或介导靶细胞的细胞毒性。细胞可以受主要刺激信号活化。共刺激信号可以放大初级信号的幅度并阻抑初始刺激后的细胞死亡，从而产生更持久的活化状态并因此产生更高的细胞毒性能力。“共刺激信号”是指与初级信号(诸如TCR/CD3连接)组合，导致T细胞和/或NK细胞增殖和/或关键分子的上调或下调的信号。
“替代支架”是指包含与高构象耐受性可变结构域相关的结构化核心的单链蛋白质框架。可变结构域耐受待引入的变化而会不损害支架完整性，因此可工程化和选择可变结构域以与特异性抗原结合。
“抗体依赖性细胞的细胞毒性”、“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指诱导细胞死亡的机制，该机制依赖于抗体包被的靶细胞与具有溶解活性的效应细胞(诸如自然杀伤细胞(NK)、单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞)经由效应细胞上表达的Fcγ受体(FcγR)发生的相互作用。
“抗体依赖性细胞吞噬作用”或ADCP是指通过吞噬细胞(诸如巨噬细胞或树突状细胞)的内化作用消除抗体包被的靶细胞的机制。
“抗原”是指能够由抗原结合结构域或能够介导免疫应答的T细胞受体结合的任何分子(例如，蛋白质、肽、多糖、糖蛋白、糖脂、核酸、它们的部分或它们的组合)。示例性免疫应答包括抗体产生和免疫细胞诸如T细胞、B细胞或NK细胞的活化。抗原可以是基因表达的、合成的或从生物样本(诸如组织样本、肿瘤样本、细胞或具有其他生物组分的流体、生物体、蛋白质/抗原的亚基、杀伤或灭活的全细胞或溶解产物)中纯化的。
“抗原结合片段”或“抗原结合结构域”是指蛋白质的结合抗原的部分。抗原结合结构域可以是合成的、可酶促获得的或经遗传工程化的多肽，并且包括免疫球蛋白的结合抗原的部分，诸如VH、VL、VH和VL、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd和Fv片段；由一个VH结构域或一个VL结构域组成的结构域抗体(dAb)；鲨鱼可变IgNAR结构域；驼峰化VH结构域；VHH结构域；由模拟抗体的CDR诸如FR3-CDR3-FR4部分、HCDR1、HCDR2和/或HCDR3以及LCDR1、LCDR2和/或LCDR3的氨基酸残基组成的最小识别单元；结合抗原的替代支架；以及包含抗原结合片段的多特异性蛋白质。抗原结合片段(诸如VH和VL)可经由合成接头连接在一起以形成各种类型的单抗体设计，其中在VH结构域和VL结构域由单独的单链表达的那些情况下，VH/VL结构域可在分子内或分子间配对，以形成单价抗原结合结构域，诸如单链Fv(scFv)或双链抗体。抗原结合片段也可以缀合至其他抗体、蛋白质、抗原结合片段或替代支架缀合，这些替代支架可以是单特异性或多特异性的以工程化双特异性和多特异性蛋白质。
“抗体”广义上是指并包括免疫球蛋白分子，具体包括单克隆抗体(包括鼠科动物单克隆抗体、人单克隆抗体、人源化单克隆抗体和嵌合单克隆抗体)，抗原结合片段，多特异性抗体(诸如双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体等)，二聚、四聚或多聚抗体，单链抗体、结构域抗体，以及包含具有所需特异性的抗原结合位点的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰构型。“全长抗体”包含由二硫键互连的两条重链(HC)与两条轻链(LC)以及它们的多聚体(例如IgM)。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(由结构域CH1、铰链、CH2和CH3构成)构成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)构成。VH区和VL区可进一步细分为超变区，该超变区称为互补决定区(CDR)并间插有框架区(FR)。各个VH和VL由三个CDR和四个FR片段构成，并按以下顺序从氨基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。免疫球蛋白可根据重链恒定结构域氨基酸序列被指定为五种主要种类，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步亚分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。基于其恒定域的氨基酸序列，可将任何脊椎物种的抗体轻链指定为两种完全不同的类型即κ和λ中的一种。
“双特异性”是指特异性结合两个不同抗原或同一抗原内的两个不同表位的分子(诸如蛋白质或抗体)。双特异性分子可能对其他相关的抗原具有交叉反应性，例如，对来自其他物种(同源)(诸如人或猴，例如食蟹猕猴(Macaca cynomolgus)(cynomolgus，cyno)或黑猩猩(Pan troglodytes))的相同抗原具有交叉反应性，或者可结合两个或更多个不同抗原之间所共享的表位。
“双特异性抗hK2/抗CD3抗体”、“hk2/CD3抗体”、“hk2×CD3抗体”、“抗hK2/抗CD3蛋白质”等是指结合hk2和CD3并且包含特异性结合hK2的至少一个结合结构域和特异性结合CD3的至少一个结合结构域的抗体。特异性结合hK2和CD3的结构域通常为VH/VL对。双特异性抗hk2×CD3抗体就其与hk2或CD3的结合而言可以是单价的。
“双特异性抗HLA-G/抗CD3抗体”、“HLA-G/CD3抗体”、“HLA-G×CD3抗体”、“抗HLA-G/抗CD3蛋白质”等是指结合HLA-G和CD3并且包含特异性结合HLA-G的至少一个结合结构域和特异性结合CD3的至少一个结合结构域的抗体。特异性结合HLA-G和CD3的结构域通常为VH/VL对。双特异性抗HLA-G×CD3抗体就其与HLA-G或CD3的结合而言可以是一价的。
“双特异性抗DLL3/抗CD3抗体”、“抗DLL3×CD3”、“DLL3/CD3抗体”、“DLL3×CD3抗体”、“抗DLL3/抗CD3蛋白”等是指结合DLL3和CD3并且包含特异性结合DLL3的至少一个结合结构域和特异性结合CD3的至少一个结合结构域的抗体。特异性结合DLL3和CD3的结构域通常为VH/VL对。双特异性抗DLL3×CD3抗体就其与DLL3或CD3的结合而言可以是单价的。
“癌症”是指广泛的各种疾病，其特征在于身体中异常细胞的不受控制的生长。未受控制的细胞分裂和生长导致形成侵入相邻组织的恶性肿瘤，并且还可通过淋巴系统或血流转移到身体的远侧部分。“癌症”或“癌症组织”可包括肿瘤。
“分化簇3ε”或“CD3ε”是指也称为“T细胞表面糖蛋白CD3ε链”、或“T3E”的已知蛋白质。CD3ε与CD3-γ、CD3-δ和CD3-ζ以及T细胞受体α/β和γ/δ异源二聚体一起形成T细胞受体-CD3复合物。该复合物在将抗原识别偶联到几种胞内信号转导途径中起重要作用。CD3复合物介导信号转导，从而导致T细胞活化和增殖。CD3是免疫应答所需的。全长CD3ε的氨基酸序列示于SEQ ID NO:1中。CD3ε的胞外结构域(ECD)的氨基酸序列示于SEQ ID NO:2中。在整个说明书中，“CD3ε特异性”或“特异性结合CD3ε”或“抗CD3抗体”是指与CD3ε多肽(SEQ IDNO:1)特异性结合的抗体，包括与CD3ε胞外结构域(ECD)(SEQ ID NO:2)特异性结合的抗体。
SEQ ID NO:1(人CD3ε)
MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI
SEQ ID NO:2(人CD3ε胞外结构域)
DGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMD
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指诱导细胞死亡的机制，其中靶结合蛋白质的Fc效应结构域结合并活化补体成分C1q，该补体成分继而活化补体级联，从而导致靶细胞死亡。补体的活化也可导致补体成分沉积在靶细胞表面上，这些补体成分通过结合白细胞上的补体受体(例如，CR3)来促进CDC。
“互补决定区”(CDR)是结合抗原的抗体区。VH中存在三个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)并且VL中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。CDR可使用各种描绘来定义，诸如Kabat(Wu等人，(1970)J Exp Med 132:211-50；Kabat等人，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.,1991)、Chothia(Chothia等人，(1987)J Mol Biol 196:901-17)、IMGT(Lefranc等人，(2003)Dev Comp Immunol 27:55-77)和AbM(Martin和Thornton，JBmol Biol 263:800-15,1996)。描述了各种描绘和可变区编号之间的对应关系(参见例如Lefranc等人,(2003)Dev Comp Immunol,27:55-77；Honegger和Pluckthun，J Mol Biol(2001)309:657-70；国际免疫遗传学(IMGT)数据库；网络资源(例如，可以从互联网<URL:http://www.imgt.org>检索)。可用程序(诸如UCL Business PLC的abYsis)可用于描绘CDR。除非说明书中另有明确地说明，否则如本文所用，术语“CDR”、“HCDR1”、“HCDR2”、“HCDR3”、“LCDR1”、“LCDR2”和“LCDR3”包括由任何上述方法(Kabat、Chothia、IMGT或AbM)定义的CDR。
“降低”、“使……下降”、“减轻”、“减少”或“减弱”通常是指当与由对照或媒介物介导的应答相比时，测试分子介导减少的应答(即，下游效应)的能力。示例性应答是T细胞扩增、T细胞活化或T细胞介导的肿瘤细胞杀伤或蛋白质与其抗原或受体的结合，增强的与Fcγ的结合或增强的Fc效应子功能，诸如增强的ADCC、CDC和/或ADCP。下降可以是在测试分子与对照(或媒介物)之间测量的应答的统计学上显著的差异，或是测量的应答的下降，诸如下降约1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或30倍或更多，诸如500、600、700、800、900或1000倍或更多(包括介于之间且高于1的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)。
“分化”是指降低细胞的效能或增殖或者使细胞进入发育更受限状态的方法。
“δ样蛋白3”或“DLL3”是指也称为δ样3、δ3或果蝇δ同系物3的已知蛋白质。除非另有说明，否则本文所用的DLL3是指人DLL3。所有DLL3同种型和变体均涵盖在“DLL3”中。各种同种型的氨基酸序列可从NCBI登录号NP_058637.1(同种型1前体，618个氨基酸)和NP_982353.1(同种型2前体，587个氨基酸)检索。全长DLL3的氨基酸序列示于SEQ ID NO:255中。DLL3的序列包括DSL结构域(残基176-215)、EGF-1结构域(残基216-249)、EGF-2结构域(残基274-310)、EGF-3结构域(残基312-351)、EGF-4结构域(残基353-389)、EGF-5结构域(残基391-427)和EGF-6结构域(残基429-465)。
>SEQ ID NO:716(NP_058637.1δ样蛋白3同种型1前体[智人])MVSPRMSGLLSQTVILALIFLPQTRPAGVFELQIHSFGPGPGPGAPRSPCSARLPCRLFFRVCLKPGLSEEAAESPCALGAALSARGPVYTEQPGAPAPDLPLPDGLLQVPFRDAWPGTFSFIIETWREELGDQIGGPAWSLLARVAGRRRLAAGGPWARDIQRAGAWELRFSYRARCEPPAVGTACTRLCRPRSAPSRCGPGLRPCAPLEDECEAPLVCRAGCSPEHGFCEQPGECRCLEGWTGPLCTVPVSTSSCLSPRGPSSATTGCLVPGPGPCDGNPCANGGSCSETPRSFECTCPRGFYGLRCEVSGVTCADGPCFNGGLCVGGADPDSAYICHCPPGFQGSNCEKRVDRCSLQPCRNGGLCLDLGHALRCRCRAGFAGPRCEHDLDDCAGRACANGGTCVEGGGAHRCSCALGFGGRDCRERADPCAARPCAHGGRCYAHFSGLVCACAPGYMGARCEFPVHPDGASALPAAPPGLRPGDPQRYLLPPALGLLVAAGVAGAALLLVHVRRRGHSQDAGSRLLAGTPEPSVHALPDALNNLRTQEGSGDGPSSSVDWNRPEDVDPQGIYVISAPSIYAREVATPLFPPLHTGRAGQRQHLLFPYPSSILSVK
“编码”是指多核苷酸(诸如基因、cDNA或mRNA)中的特定核苷酸序列的用于在生物过程中充当合成其他聚合物和大分子的模板的固有性质，这些聚合物和大分子具有限定的核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列和由此产生的生物学性质。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因、cDNA或RNA编码该蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同)和非编码链(其用作基因或cDNA转录的模板)均可以称为编码该蛋白质，或者该基因或cDNA的其他产物。
“增强”、“促进”、“增加”、“扩增”或“改善”通常是指当与由对照或媒介物介导的应答相比时，测试分子介导更强应答(即，下游效应)的能力。示例性应答是T细胞扩增、T细胞活化或T细胞介导的肿瘤细胞杀伤或蛋白质与其抗原或受体的结合，增强的与Fcγ的结合或增强的Fc效应子功能，诸如增强的ADCC、CDC和/或ADCP。增强可以是在测试分子与对照(或媒介物)之间测量的应答的统计学上显著的差异，或是测量的应答的增加，诸如增加约1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或30倍或更多，诸如500、600、700、800、900或1000倍或更多(包括介于之间且高于1的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)。
“表位”是指抗体或其抗原结合部分特异性结合的抗原的部分。表位通常由部分诸如氨基酸或多糖侧链的化学活性(诸如，极性、非极性或疏水性)表面基团组成，并且可具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。表位可由形成构象空间单元的连续和/或不连续氨基酸构成。对于不连续表位，来自抗原的线性序列的不同部分的氨基酸因蛋白质分子的折叠而在三维空间上靠近。抗体“表位”取决于用来鉴定表位的方法。
“扩增”是指细胞分裂和细胞死亡的结果。
“表达”是指在细胞中或体外发生的熟知的转录和翻译。表达产物(例如蛋白质)是由细胞表达的或体外表达的，并且可以是胞内蛋白质、胞外蛋白质或跨膜蛋白质。
“表达载体”是指可用于生物系统或再造生物系统中以指导由存在于表达载体中的多核苷酸序列所编码的多肽进行翻译的载体。
“dAb”或“dAb片段”是指由VH结构域构成的抗体片段(Ward等人，Nature 341:544546(1989))。
“Fab”或“Fab片段”是指由VH、CH1、VL和CL结构域构成的抗体片段。
“F(ab')2”或“F(ab')2片段”是指含有通过铰链区中的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。
“Fd”或“Fd片段”是指由VH和CH1结构域构成的抗体片段。
“Fv”或“Fv片段”是指由来自抗体的单臂的VH结构域和VL结构域构成的抗体片段。
“全长抗体”包含通过二硫键互连的两条重链(HC)与两条轻链(LC)以及它们的多聚体(例如IgM)。每条重链由重链可变结构域(VH)和重链恒定结构域构成，重链恒定结构域由亚结构域CH1、铰链、CH2和CH3构成。每条轻链由轻链可变结构域(VL)和轻链恒定结构域(CL)构成。VH和VL可被进一步细分成称作互补决定区(CDR)的超变区、散布其间的框架区(FR)。各个VH和VL由三个CDR和四个FR片段构成，并按以下顺序从氨基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
“基因修饰”是指将“外来”(即外来的或胞外的)基因、DNA或RNA序列引入宿主细胞中，使得宿主细胞将表达引入的基因或序列以产生所需物质，通常是由引入的基因或序列编码的蛋白质或酶。引入的基因或序列也可以称为“克隆”或“外来”基因或序列，可以包括可操作地连接到编码嵌合抗原受体的多核苷酸的调控序列或控制序列，诸如起始、终止、启动子、信号、分泌或细胞的遗传机制使用的其他序列。基因或序列可以包括非功能性序列或无功能的序列。接受和表达引入的DNA或RNA的宿主细胞已经被“基因工程化”。引入宿主细胞中的DNA或RNA可以来自任何来源，包括与宿主细胞相同的属或物种的细胞，或来自不同的属或物种。
“异源”是指在自然界中彼此没有相同关系的两种或更多种多核苷酸或者两种或更多种多肽。
“异源多核苷酸”是指编码如本文所述的两种或更多种新抗原的非天然存在的多核苷酸。
“异源多肽”是指包含如本文所述的两种或更多种新抗原多肽的非天然存在的多肽。
“宿主细胞”是指含有异源核酸的任何细胞。示例性异源核酸是载体(例如，表达载体)。
“人抗体”是指当施用于人受试者时被优化以具有最小限度的免疫应答的抗体。人抗体的可变区源自人免疫球蛋白序列。如果人抗体包含恒定区或恒定区的一部分，则该恒定区也源自人免疫球蛋白序列。如果人抗体的可变区由使用人种系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因的系统获得，则该人抗体包含“源自”人起源序列的重链可变区和轻链可变区。此类示例性系统为在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库，以及转基因非人动物，诸如携带人免疫球蛋白基因座的小鼠或大鼠。因为用于获得人抗体和人免疫球蛋白基因座的系统之间的差异，所以体细胞突变的引入或有意将取代引入框架或CDR中或两者，因此“人抗体”与在人中表达的免疫球蛋白相比通常包含氨基酸差异。通常，“人抗体”的氨基酸序列与由人种系免疫球蛋白基因或重排免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些情况下，“人抗体”可以包含由人框架序列分析得出的共有框架序列(例如，如Knappik等人，(2000)J Mol Biol 296:57-86所述)，或结合到展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库中的合成HCDR3(例如，如Shi等人，(2010)JMolBiol 397:385-96和国际专利公开号WO2009/085462所述)。“人抗体”的定义中不包括至少一个CDR源自非人物种的抗体。
“人源化抗体”是指其中至少一个CDR源自非人物种并且至少一个框架源自人免疫球蛋白序列的抗体。人源化抗体在框架中可包含取代，使得该框架可能不是表达的人免疫球蛋白或人免疫球蛋白种系基因序列的精确拷贝。
“与……组合”意指将两种或更多种治疗剂以混合物一起、作为单一药剂同时或作为单一药剂以任何顺序依次施用于受试者。
“胞内信号传导结构域”或“胞质信号传导结构域”是指分子的胞内部分。该蛋白质的功能性部分通过在细胞内传递信息起作用，以通过产生第二信使经由限定的信号传导通路调节细胞活性，或者通过响应于此类信使而起到效应子的作用。胞内信号传导结构域产生促进含有CAR的细胞(例如，CAR-T细胞)的免疫效应子功能的信号。
“分离的”是指已从产生分子的系统(诸如重组细胞)的其他组分中基本上分离和/或纯化出来的分子(诸如合成多核苷酸或多肽)的同质群体，以及已经受至少一个纯化或分离步骤的蛋白质。“分离的”是指基本上不含其他细胞材料和/或化学物质的分子，并且涵盖分离至更高纯度(诸如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯度)的分子。
“激肽释放酶相关肽酶2”或“hK2”是指也称为激肽释放酶2、腺激肽释放酶2或HK2的已知蛋白质。hK2作为前原蛋白产生并且在蛋白质水解期间溶解以生成活性蛋白酶。所有hK2同种型和变体均涵盖在“hK2”中。可从GenBank登录号NP_005542.1、NP_001002231.1和NP_001243009检索各种同种型的氨基酸序列。全长hK2的氨基酸序列示于SEQ ID NO:98中。该序列包括信号肽(残基1-18)和前肽区(残基19-24)。
SEQ ID NO:98
MWDLVLSIALSVGCTGAVPLIQSRIVGGWECEKHSQPWQVAVYSHGWAHCGGVLVHPQWVLTAAHCLKKNSQVWLGRHNLFEPEDTGQRVPVSHSFPHPLYNMSLLKHQSLRPDEDSSHDLMLLRLSEPAKITDVVKVLGLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLRPRSLQCVSLHLLSNDMCARAYSEKVTEFMLCAGLWTGGKDTCGGDSGGPLVCNGVLQGITSWGPEPCALPEKPAVYTKVVHYRKWIKDTIAANP
“人白细胞抗原G”或“HLA-G”是指也称为“HLA I类组织相容性抗原α链G”或“MHC I类抗原G”的已知蛋白质。所有HLA-G同种型和变体都涵盖在“HLA-G”中。可从Uniprot IDP17693-1至P17693-7检索各种同种型的氨基酸序列。SEQ ID NO:691表示称为HLA-G1的示例性HLA-G同种型。
HLA-G1(信号序列：斜体)，SEQ ID NO:691：
MVVMAPRTLFLLLSGALTLTETWAGSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEPRAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGYYNQSEASSHTLQWMIGCDLGSDGRLLRGYEQYAYDGKDYLALNEDLRSWTAADTAAQISKRKCEAANVAEQRRAYLEGTCVEWLHRYLENGKEMLQRADPPKTHVTHHPVFDYEATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQDVELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRWKQSSLPTIPIMGIVAGLVVLAAVVTGAAVAAVLWRKKSSD
“调节”是指当与由对照或媒介物介导的应答相比时，测试分子介导增强或减少的应答(即，下游效应)的增强或降低的能力。
“单克隆抗体”是指从抗体分子的基本上同质群体获得的抗体，即包含该群体的各个抗体是相同的，不同的是可能的熟知改变，诸如从抗体重链移除C末端赖氨酸或翻译后修饰诸如氨基酸异构化或脱酰胺基、甲硫氨酸氧化或天冬酰胺或谷氨酰胺脱酰胺基。单克隆抗体通常结合一个抗原表位。双特异性单克隆抗体结合两个不同的抗原表位。单克隆抗体可在抗体群内具有异质糖基化。单克隆抗体可以是单特异性的或多特异性的，诸如双特异性的、单价的、二价的或多价的。
“多特异性”是指特异性结合两个或更多个不同抗原或同一抗原内的两个或更多个不同表位的分子，诸如抗体。多特异性分子可能对其他相关的抗原具有交叉反应性，例如，对来自其他物种(同源)(诸如人或猴，例如食蟹猕猴(cynomolgus，cyno)或黑猩猩)的相同抗原具有交叉反应性，或者可结合两个或更多个不同抗原之间所共享的表位。
“自然杀伤细胞”和“NK细胞”在本文中可互换使用并且在本文中同义使用。NK细胞是指具有CD16+CD56+和/或CD57+TCR-表型的分化淋巴细胞。NK细胞的特征在于其能够给通过活化特异性溶细胞酶来结合并杀死不能表达“自身”MHC/HLA抗原的细胞，能够杀死表达NK活化受体的配体的肿瘤细胞或其他患病细胞，并且能够释放称为刺激或抑制免疫应答的细胞因子的蛋白质分子。
“操作性连接”和类似短语在用于核酸或氨基酸时，分别是指彼此处于功能关系中的核酸序列或氨基酸序列的操作性连接。例如，操作性连接的启动子、增强子元件、开放阅读框、5'和3'UTR和终止子序列导致核酸分子(例如，RNA)的准确产生，并且在一些情况下导致多肽的产生(即，开放阅读框的表达)。操作性连接的肽是指其中肽的功能结构域彼此相距适当距离放置以赋予每个结构域的预期功能的肽。
术语“互补位”是指抗体分子的涉及抗原结合并且包含与抗原相互作用的残基的区域或区。互补位可由形成构象空间单元的连续和/或不连续氨基酸构成。可以使用各种实验和计算方法以不同的细节水平定义和表征给定抗体的互补位。实验方法包括氢/氘交换质谱(HX-MS)。根据所采用的定位方法，互补位将被不同地定义。
“药物组合物”是指一起或单独施用的两种或更多种活性成分的组合。
“药物组合物”是指由活性成分和药学上可接受的载体组合而成的组合物。
“药学上可接受的载体”或“赋形剂”是指药物组合物中除活性成分之外的成分，该成分对受试者无毒。示例性的药学上可接受的载体是缓冲液、稳定剂或防腐剂。
“多核苷酸”或“核酸”是指包含磷酸糖类主链共价连接的核苷酸链或其他等同共价化学物的合成分子。cDNA是多核苷酸的典型示例。多核苷酸可以是DNA或RNA分子。
“预防”疾病或病症意指预防受试者中出现病症。
“增殖”是指细胞分裂(细胞的对称或不对称分裂)的增加。
“启动子”是指起始转录所需的最小序列。启动子还可以包括分别增强或阻抑转录的增强子或阻遏子元件。
“蛋白质”或“多肽”在本文中可互换使用，并且是指包含一个或多个多肽的分子，每个多肽各自包含由肽键连接的至少两个氨基酸残基。蛋白质可以是单体，或者可以是两个或更多个亚基的蛋白质复合物，所述亚基是相同的或不同的。少于50个氨基酸的小多肽可以称作“肽”。蛋白质可以是异源融合蛋白、糖蛋白或通过翻译后修饰进行修饰的蛋白质，这些翻译后修饰诸如磷酸化、乙酰化、肉豆蔻酰化、棕榈酰化、糖基化、氧化、甲酰化、酰胺化、瓜氨酸化、聚谷氨酰化、ADP-核糖基化、聚乙二醇化或生物素化。蛋白质可以是抗体或可以包含抗体的抗原结合片段。蛋白质可以是重组表达的。
“重组”是指通过重组手段制备、表达、创建或分离的多核苷酸、多肽、载体、病毒和其他大分子。
“调控元件”是指控制核酸序列表达的一些方面的任何顺式或反式作用基因元件。
“复发”是指在先前用治疗剂治疗之后改善一段时间之后疾病或疾病的迹象和症状的再现。
“难治性”是指对治疗无应答的疾病。难治性疾病可在治疗之前或开始时对治疗具有抗性，或者难治性疾病可在治疗期间变得具有抗性。
“单链Fv”或“scFv”是指包含含有轻链可变区(VL)的至少一个抗体片段和含有重链可变区(VH)的至少一个抗体片段的融合蛋白，其中VL和VH经由多肽接头连续连接，并且能够表达为单链多肽。除非另外指明，否则如本文所用，scFv可以具有任一顺序的VL可变区和VH可变区，例如，相对于多肽的N末端和C末端，该scFv可以包含VL-接头-VH或可以包含VH-接头-VL。
“(scFv)2”或“串联scFv”或“双scFv”片段是指包含两个轻链可变区(VL)和两个重链可变区(VH)的融合蛋白，其中两个VL和两个VH经由多肽接头连续连接，并且能够表达为单链多肽。两个VL和两个VH通过肽接头融合以形成二价分子VLA-接头-VHA-接头-VLB-接头-VHB，以形成能够同时结合两个不同抗原或表位的两个结合位点。
“特异性结合”或“结合”是指蛋白质类分子以比对其他抗原更大的亲和力与抗原或抗原内的表位结合。通常，蛋白质分子与抗原或抗原内的表位结合，平衡解离常数(KD)为约1×10-7M或更低，例如约5×10-8M或更低、约1×10-8M或更低、约1×10-9M或更低、约1×10-10M或更低、约1×10-11M或更低或约1×10-12M或更低，通常KD比它与非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)结合的KD低至少一百倍。在本文所述的前列腺新抗原的上下文中，“特异性结合”是指蛋白质类分子与前列腺新抗原的结合，而没有与新抗原为其变体的野生型蛋白质的可检测结合。
“受试者”包括任何人或非人动物。“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。术语“受试者”和“患者”在本文中可以互换使用。
“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中是可互换的，并且在本文中同义使用。T细胞包括胸腺细胞、初始T淋巴细胞、记忆T细胞、未成熟T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或活化T淋巴细胞。T细胞可以是T辅助性(Th)细胞，例如T辅助性1(Th1)或T辅助性2(Th2)细胞。T细胞可以是辅助性T细胞(HTL；CD4+T细胞)、CD4+T细胞、细胞毒性T细胞(CTL；CD8+T细胞)、肿瘤浸润性细胞毒性T细胞(TIL；CD8+T细胞)、CD4+CD8+T细胞或T细胞的任何其他亚群。还包括“NKT细胞”，是指表达半不变αβT细胞受体但也表达通常与NK细胞相关联的多种分子标志物(诸如NK1.1)的特化T细胞群。NKT细胞包括NK1.1+细胞和NK1.1-细胞，以及CD4+细胞、CD4-细胞、CD8+细胞和CD8-细胞。NKT细胞上的TCR的独特之处在于它识别由MHC I样分子CDId递呈的糖脂抗原。由于NKT细胞能够产生促进炎症或免疫耐受的细胞因子，因此它们可具有保护作用或有害作用。还包括“γ-δT细胞(γδT细胞)”，是指特化的群体，即在其表面上具有独特TCR的T细胞的小子集，并且与其中TCR由被命名为α-TCR链和β-TCR链的两种糖蛋白链组成的大多数T细胞不同，γδT细胞中的TCR由γ-链和δ-链组成。γδT细胞可以在免疫监视和免疫调节中起作用，并且被发现是IL-17的重要来源且诱导强烈的CD8+细胞毒性T细胞应答。还包括“调节性T细胞”或“Treg”，其是指抑制异常或过度免疫应答并在免疫耐受中起作用的T细胞。Treg通常是转录因子Foxp3-阳性CD4+T细胞，并且还可包括转录因子Foxp3-阴性调节性T细胞，它们是产生IL-10的CD4+T细胞。
“治疗有效量”或“有效量”在本文中互换使用，是指在所需剂量和时间段有效实现期望的治疗结果的量。治疗有效量可根据以下因素变化：诸如个体的疾病状态、年龄、性别和重量，以及治疗剂或治疗剂组合在个体中引发期望的应答的能力。有效治疗剂或治疗剂组合的示例性指标包括，例如：患者健康状况的改善、肿瘤负荷的减少、肿瘤生长的遏止或减慢和/或癌细胞没有向身体其他部位转移的情况。
“转导”是指使用病毒载体将外来核酸引入细胞中。
疾病或病症诸如癌症的“治疗”是指实现以下项中的一者或多者：降低病症的严重程度和/或减少其持续时间，抑制所治疗病症的特征性症状的恶化，限制或防止先前患有病症的受试者中病症的复发，或者限制或防止先前有病症的症状的受试者中症状的复发。
“肿瘤细胞”或“癌细胞”是指在体内、离体或组织培养物中的癌性、癌前或转化的细胞，这些细胞具有自发或诱导的表型变化。这些变化未必涉及新遗传物质的摄取。然而转化可由感染转化病毒以及结合新基因组核酸、摄取外源核酸而发生，或者其也可自发地发生或在暴露于致癌物之后发生，从而使内源基因突变。转化/癌症示例为合适的动物宿主(诸如裸小鼠等)中体外、体内和离体的形态变化、细胞永生、异常生长控制、病灶形成、增殖、恶性肿瘤、肿瘤特异性标志物水平调节、侵入、肿瘤生长。
“变体”、“突变体”或“改变的”是指因一处或多处修饰(例如，一个或多个取代、插入或缺失)而不同于参考多肽或参考多核苷酸的多肽或多核苷酸。
除非另有明确说明，否则在整个说明书中，根据EU索引进行抗体恒定区中的氨基酸残基的编号，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)所述。
Ig恒定区中的突变称为如下：L351Y_F405A_Y407V，是指一个免疫球蛋白恒定区中的L351Y、F405A和Y407V突变。L351Y_F405A_Y407V/T394W是指一种多聚体蛋白质中存在的第一Ig恒定区中的L351Y、F405A和Y407V突变和第二Ig恒定区中的T394W突变。
“VHH”是指单结构域抗体或纳米抗体，其仅由重链同源二聚体构成。VHH单结构域抗体缺少常规Fab区的轻链和重链CH1结构域。
除非另有说明，否则任何数值，例如本文所述的浓度或浓度范围，应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，数值通常包括所述值的±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。除非上下文另有明确指示，否则如本文所用，使用的数值范围明确地包括所有可能的子范围、该范围之内的所有单个数值，包括此类范围之内的整数和该范围之内的分数。
除非另有明确说明，否则在整个说明书中，根据EU索引进行抗体恒定区中的氨基酸残基的编号，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)所述。
表1.本文使用的常规单字母和三字母氨基酸代码
Figure BDA0003963650430000281
/>
Figure BDA0003963650430000291
结合CD3ε的抗原结合结构域。
本公开提供了结合CD3ε的抗原结合结构域、包含结合CD3ε的抗原结合结构域的单特异性蛋白质和多特异性蛋白质、编码前述各项的多核苷酸、载体、宿主细胞、制备和使用前述各项的方法。本文鉴定的结合CD3ε的抗原结合结构域在高热稳定性、减小的脱酰胺风险和降低的免疫原性方面表现出有利的特性。
本公开还提供了一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含结合CD3ε的抗原结合结构域，其中该结合CD3ε的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:23的重链可变区(VH)和SEQ IDNO:103的轻链可变区(VL)。SEQ ID NO:103表示VL属氨基酸序列，其涵盖表现出改善的性质(包括高热稳定性、减小的脱酰胺风险和降低的免疫原性)的变体。例如，经工程化以赋予减小的脱酰胺风险的位置是VL中的残基N92(根据Kabat编号(Kabat等人，“Sequences ofProteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md,1991)，使用SEQ ID NO:24的CD3B815 VL序列进行残基编号)，并且经工程化以赋予降低的免疫原性的位置是在残基Y49和/或L78(根据Kabat，使用SEQ ID NO:24的CD3B815 VL进行残基编号)处的人至小鼠回复突变。残基N92处的工程化位置在LCDR3内。即使在该位置处具有突变，抗体仍保留结合抗原的能力。
本公开提供了一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含结合CD3ε的抗原结合结构域，其中该结合CD3ε的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:23的重链可变区(VH)的重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:24的轻链可变区(VL)的轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3。
本公开提供了一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含结合CD3ε的抗原结合结构域，其中该结合CD3ε的抗原结合结构域包含以下序列的HCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：
分别为SEQ ID NO:6、7、8、9、10和11；
分别为SEQ ID NO:12、13、14、15、16和17；或者
分别为SEQ ID NO:18、19、20、21、16和22。
本公开提供了一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含结合CD3ε的抗原结合结构域，其中该结合CD3ε的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:23的VH以及SEQ ID NO:24、27、28、29或30的VL。
本公开提供了一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含结合CD3ε的抗原结合结构域，其中该结合CD3ε的抗原结合结构域包含：
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:24的VL；
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:27的VL；
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:28的VL；
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:29的VL；或者
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:30的VL。
本公开提供了一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含结合CD3ε的抗原结合结构域，其中该结合CD3ε的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:25或26的氨基酸序列。在其他实施方案中，结合CD3ε的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:85或86的氨基酸序列。在其他实施方案中，结合CD3ε的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:85或88的氨基酸序列。在其他实施方案中，结合CD3ε的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:85或90的氨基酸序列。在其他实施方案中，结合CD3ε的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:85或92的氨基酸序列。在其他实施方案中，结合CD3ε的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:85或94的氨基酸序列。
在其他实施方案中，结合CD3ε的抗原结合结构域是scFv。
在其他实施方案中，结合CD3ε的抗原结合结构域是(scFv)2。
在其他实施方案中，结合CD3ε的抗原结合结构域是Fv。
在其他实施方案中，结合CD3ε的抗原结合结构域是Fab。
在其他实施方案中，结合CD3ε的抗原结合结构域是F(ab')2。
在其他实施方案中，结合CD3ε的抗原结合结构域是Fd。
在其他实施方案中，CD3ε抗原结合结构域是dAb。
在其他实施方案中，CD3ε抗原结合结构域是VHH。
结合CD3ε的scFv
本文鉴定的结合CD3ε的VH结构域和VL结构域中的任一个结构域都可以工程化为VH-接头-VL或VL-接头-VH取向的scFv格式。本文鉴定的VH结构域和VL结构域中的任一个结构域也可用于生成sc(Fv)2结构，诸如VH-接头-VL-接头-VL-接头-VH、VH-接头-VL-接头-VH-接头-VL。VH-接头-VH-接头-VL-接头-VL。VL-接头-VH-接头-VH-接头-VL。VL-接头-VH-接头-VL-接头-VH或VL-接头-VL-接头-VH-接头-VH。
本文鉴定的VH结构域和VL结构域可以并入到scFv格式中，并且可以使用已知方法评估所得scFv与CD3ε的结合和热稳定性。可以使用本领域技术人员已知的ProteOn XPR36、Biacore 3000或KinExA仪器、ELISA或竞争结合测定法评估结合。可以使用纯化的scFv或含有表达的scFv的大肠杆菌上清液或溶解细胞来评价结合。如果在不同的条件(例如，同渗容摩、pH)下测量，则测量的测试scFv对CD3ε的亲和力可变化。因此，亲和力和其他结合参数(例如KD、Kon和Koff)的测量通常用标准化条件和标准化缓冲液进行。可以通过在升高的温度(诸如50℃、55℃或60℃)下加热测试scFv一段时间(诸如5分钟(min)、10min、15min、20min、25min或30min)以及测量测试scFv与CD3ε的结合来评价热稳定性。当与未加热的scFv样品相比时，scFv保持与CD3ε同等结合称为热稳定的。
在重组表达系统中，接头是肽接头并且可以包含任何天然存在的氨基酸。可以被包含到接头中的示例性氨基酸为Gly、Ser、Pro、Thr、Glu、Lys、Arg、Ile、Leu、His和The。该接头的长度应当足以使VH和VL以相对于彼此形成正确构象，从而使得它们保持期望的活性(诸如与CD3ε结合)的方式连接。
接头的长度可以为约5至50个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为约10至40个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为约10至35个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为约10至30个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为约10至25个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为约10至20个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为约15至20个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为约16至19个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为6个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为7个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为8个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为9个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为10个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为11个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为12个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为13个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为14个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为15个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为16个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为17个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为18个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为19个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为20个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为21个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为22个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为23个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为24个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为25个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为26个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为27个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为28个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为29个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为30个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为31个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为32个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为33个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为34个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为35个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为36个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为37个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为38个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为39个氨基酸。在其他实施方案中，接头的长度为40个氨基酸。可以使用的示例性接头为富含Gly的接头、含有Gly和Ser的接头、含有Gly和Ala的接头、含有Ala和Ser的接头，以及其他柔性接头。
其他接头序列可以包括源自任何免疫球蛋白重链或轻链同种型的免疫球蛋白铰链区、CL或CH1的部分。可替代地，多种非蛋白质聚合物，包括聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物可用作接头。可使用的示例性接头示于表2中。附加的接头描述于例如国际专利公布号WO2019/060695中。
表2.接头
接头名称 氨基酸序列 SEQ ID NO:
接头1 GGSEGKSSGSGSESKSTGGS 31
接头2 GGGSGGGS 32
接头3 GGGSGGGSGGGS 33
接头4 GGGSGGGSGGGSGGGS 34
接头5 GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS 35
接头6 GGGGSGGGGSGGGGS 36
接头7 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 37
接头8 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 38
接头9 GSTSGSGKPGSGEGSTKG 39
接头10 IRPRAIGGSKPRVA 40
接头11 GKGGSGKGGSGKGGS 41
接头12 GGKGSGGKGSGGKGS 42
接头13 GGGKSGGGKSGGGKS 43
接头14 GKGKSGKGKSGKGKS 44
接头15 GGGKSGGKGSGKGGS 45
接头16 GKPGSGKPGSGKPGS 46
接头17 GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS 47
接头18 GKGKSGKGKSGKGKSGKGKS 48
接头19 STAGDTHLGGEDFD 49
接头20 GEGGSGEGGSGEGGS 50
接头21 GGEGSGGEGSGGEGS 51
接头22 GEGESGEGESGEGES 52
接头23 GGGESGGEGSGEGGS 53
接头24 GEGESGEGESGEGESGEGES 54
接头25 GSTSGSGKPGSGEGSTKG 55
接头26 PRGASKSGSASQTGSAPGS 56
接头27 GTAAAGAGAAGGAAAGAAG 57
接头28 GTSGSSGSGSGGSGSGGGG 58
接头29 GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS 59
接头30 GSGS 60
接头31 APAPAPAPAP 61
接头32 APAPAPAPAPAPAPAPAPAP 62
接头33 AEAAAKEAAAKEAAAAKEAAAAKEAAAAKAAA 63
接头34 GTEGKSSGSGSESKST 64
在其他实施方案中，该scFv从N端到C端包含VH、第一接头(L1)和VL(VH-L1-VL)。
在其他实施方案中，该scFv从N端到C端包含VL、L1和VH(VL-L1-VH)。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该scFv包含：
SEQ ID NO:23的重链可变区(VH)的重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:24的轻链可变区(VL)的轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3。
在其他实施方案中，该scFv包含以下序列的HCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：
分别为SEQ ID NO:6、7、8、9、10和11；或者
分别为SEQ ID NO:12、13、14、15、16和17；或者
分别为SEQ ID NO:18、19、20、21、16和22。
在其他实施方案中，该scFv包含分别为SEQ ID NO:6、7、8、9、10和11的HCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他实施方案中，该scFv包含分别为SEQ ID NO:12、13、14、15、16和17的HCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他实施方案中，该scFv包含分别为SEQ ID NO:18、19、20、21、16和22的HCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他实施方案中，该scFv包含SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:24的VL。
在其他实施方案中，该scFv包含SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:27的VL。
在其他实施方案中，该scFv包含SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:28的VL。
在其他实施方案中，该scFv包含SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:29的VL。
在其他实施方案中，该scFv包含SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:30的VL。
在其他实施方案中，该scFv包含SEQ ID NO:65、66、67、68、69、70、71、72、73或74的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该scFv包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该scFv包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该scFv包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该scFv包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该scFv包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该scFv包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该scFv包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该scFv包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该scFv包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该scFv包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。
结合CD3ε的其他抗原结合结构域
本文鉴定的结合CD3ε的VH结构域和VL结构域中的任一个结构域也可工程化为Fab、F(ab')2、Fd或Fv格式并且它们与CD3ε的结合和热稳定性可使用本文所述的测定法来评估。
在其他实施方案中，该Fab包含：
SEQ ID NO:23的重链可变区(VH)的重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:24的轻链可变区(VL)的轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3。
在其他实施方案中，该Fab包含以下序列的HCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：
分别为SEQ ID NO:6、7、8、9、10和11；
分别为SEQ ID NO:12、13、14、15、16和17；或者
分别为SEQ ID NO:18、19、20、21、16和22。
在其他实施方案中，该Fab包含分别为SEQ ID NO:6、7、8、9、10和11的HCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他实施方案中，该Fab包含分别为SEQ ID NO:12、13、14、15、16和17的HCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他实施方案中，该Fab包含分别为SEQ ID NO:18、19、20、21、16和22的HCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他实施方案中，该Fab包含SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:24的VL。
在其他实施方案中，该Fab包含SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:27的VL。
在其他实施方案中，该Fab包含SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:28的VL。
在其他实施方案中，该Fab包含SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:29的VL。
在其他实施方案中，该Fab包含SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:30的VL。
在其他实施方案中，该Fab包含SEQ ID NO:23的VH以及SEQ ID NO:24、27、28、29或30的VL。
在其他实施方案中，该F(ab')2包含：
SEQ ID NO:23的重链可变区(VH)的重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:24的轻链可变区(VL)的轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3。
在其他实施方案中，该F(ab')2包含以下序列的HCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：
分别为SEQ ID NO:6、7、8、9、10和11；
分别为SEQ ID NO:12、13、14、15、16和17；或者
分别为SEQ ID NO:18、19、20、21、16和22。
在其他实施方案中，该F(ab')2包含分别为SEQ ID NO:6、7、8、9、10和11的HCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他实施方案中，该F(ab')2包含分别为SEQ ID NO:12、13、14、15、16和17的HCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他实施方案中，该F(ab')2包含分别为SEQ ID NO:18、19、20、21、16和22的HCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他实施方案中，该F(ab')2包含SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:24的VL。
在其他实施方案中，该F(ab')2包含SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:27的VL。
在其他实施方案中，该F(ab')2包含SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:28的VL。
在其他实施方案中，该F(ab')2包含SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:29的VL。
在其他实施方案中，该F(ab')2包含SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:30的VL。
在其他实施方案中，该F(ab')2包含SEQ ID NO:23的VH以及SEQ ID NO:24、27、28、29或30的VL。
在其他实施方案中，该Fv包含：
SEQ ID NO:23的重链可变区(VH)的重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:24的轻链可变区(VL)的轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3。
在其他实施方案中，该Fv包含以下序列的HCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：
分别为SEQ ID NO:6、7、8、9、10和11；
分别为SEQ ID NO:12、13、14、15、16和17；或者
分别为SEQ ID NO:18、19、20、21、16和22。
在其他实施方案中，该Fv包含分别为SEQ ID NO:6、7、8、9、10和11的HCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他实施方案中，该Fv包含分别为SEQ ID NO:12、13、14、15、16和17的HCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他实施方案中，该Fv包含分别为SEQ ID NO:18、19、20、21、16和22的HCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在其他实施方案中，该Fv包含SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:24的VL。
在其他实施方案中，该Fv包含SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:27的VL。
在其他实施方案中，该Fv包含SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:28的VL。
在其他实施方案中，该Fv包含SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:29的VL。
在其他实施方案中，该Fv包含SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:30的VL。
在其他实施方案中，该Fv包含SEQ ID NO:23的VH以及SEQ ID NO:24、27、28、29或30的VL。
在其他实施方案中，该Fd包含：
SEQ ID NO:23的重链可变区(VH)的重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3。
在其他实施方案中，该Fd包含分别为SEQ ID NO:6、7和8的HCDR1、HCDR1和HCDR3。
在其他实施方案中，该Fd包含分别为SEQ ID NO:12、13和14的HCDR1、HCDR1和HCDR3。
在其他实施方案中，该Fd包含分别为SEQ ID NO:18、19和20的HCDR1、HCDR1和HCDR3。
在其他实施方案中，该Fd包含SEQ ID NO:23的VH。
同源抗原结合结构域和具有保守性取代的抗原结合结构域
结合CD3ε的抗原结合结构域的变体在本公开的范围内。例如，变体可以在结合CD3ε的抗原结合结构域中包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个氨基酸取代，只要它们与亲本抗原结合结构域相比保留或具有改善的功能特性即可。在其他实施方案中，与本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域的序列同一性可为约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在其他实施方案中，变异处于框架区中。在其他实施方案中，变体通过保守性取代生成。
例如，结合CD3ε的抗原结合结构域可在VL中的残基位置Y49、L78或N92(根据Kabat进行残基编号)处包含取代。可以在任何指定位置进行保守性取代，并且在本文所述的测定法中测试了结合CD3ε的所得变体抗原结合结构域的期望特征。
还提供了包含VH和VL的结合CD3ε的抗原结合结构域，该VH和VL与以下VH和VL有至少80％同一性：
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:24的VL；
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:27的VL；
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:28的VL；
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:29的VL；或者
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:30的VL。
在其他实施方案中，同一性为85％。在其他实施方案中，同一性为90％。在其他实施方案中，同一性为91％。在其他实施方案中，同一性为91％。在其他实施方案中，同一性为92％。在其他实施方案中，同一性为93％。在其他实施方案中，同一性为94％。在其他实施方案中，同一性为94％。在其他实施方案中，同一性为95％。在其他实施方案中，同一性为96％。在其他实施方案中，同一性为97％。在其他实施方案中，同一性为98％。在其他实施方案中，同一性为99％。
两个序列之间的百分比同一性是序列所共有的相同位置数目的函数(即，同一性％＝相同位置的数目/位置总数×100)，考虑到空位的数目和每个空位的长度，需要引入这些参数用于两个序列的最佳比对。
两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以采用E.Meyers和W.Miller(ComputAppl Biosci 4:11-17(1988))的算法(该算法已经并入ALIGN程序(版本2.0)中)，使用PAM120加权残基表、空位长度罚分12和空位罚分4来确定。另外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用Needleman和Wunsch(J Mol Biol 48:444-453(1970))算法(该算法已并入GCG软件包(可从互联网<URL:http://www.gcg.com>检索)的GAP程序中)、使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6、或4的空位权重和1、2、3、4、5、或6的长度权重来确定。
在其他实施方案中，结合CD3ε的变体抗原结合结构域在CDR区中的任一个CDR区中包含一个或两个保守性取代，同时保持结合CD3ε的亲本抗原结合片段的所需功能特性。
“保守修饰”是指不会显著影响或改变含有氨基酸修饰的抗体的结合特征的氨基酸修饰。保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸被具有相似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族是明确定义的，包括具有如下侧链的氨基酸：酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸)、芳族侧链(例如，苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸)、脂族侧链(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸)、酰胺(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及含硫侧链(半胱氨酸、甲硫氨酸)。此外，多肽中的任何天然残基还可被丙氨酸取代，如先前针对丙氨酸扫描诱变所述(MacLennan等人，(1988)Acta Physiol Scand Suppl 643:55-67；Sasaki等人，(1988)Adv Biophys 35:1-24)。对本发明的抗体的氨基酸取代可通过已知的方法进行，例如通过PCR诱变(美国专利号4,683,195)进行。可替代地，可例如使用随机(NNK)或非随机密码子(例如DVK密码子，其编码11个氨基酸(Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、Lys、Asn、Arg、Ser、Tyr、Trp))来产生变体文库。可使用本文所述的测定法来测试所得变体的特征。
生成结合CD3ε的抗原结合片段的方法
可以使用各种技术生成本公开中的提供的结合CD3ε的抗原结合结构域。例如，Kohler和Milstein的杂交瘤方法可以用于鉴定结合CD3ε的VH/VL对。在杂交瘤方法中，用人和/或cyno CD3ε来免疫小鼠或其他宿主动物(诸如仓鼠、大鼠或鸡)，随后使用标准方法将来自免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞。可筛选出由单个永生化杂交瘤细胞产生的菌落，用以产生具有所需特性(诸如结合特异性、交叉反应性或缺乏结合特异性、缺乏交叉反应性、抗原的亲和力以及任何所需功能性)的含有结合CD3ε的抗原结合结构域的抗体。
通过使非人动物免疫生成的结合CD3ε的抗原结合结构域可以是人源化的。包括选择人受体框架的示例性人源化技术包括CDR接枝(美国专利号5,225,539)、SDR接枝(美国专利号6,818,749)、表面重塑(Padlan,(1991)Mol Immunol 28:489-499)、特异性决定残基表面重塑(美国专利公布号2010/0261620)、人框架改型(美国专利号8,748,356)或超人源化(美国专利号7,709,226)。在这些方法中，亲本抗体的CDR或CDR残基的子集被转移到人框架上，该人框架可基于其与亲本框架的总体同源性，基于CDR长度的相似性或规范结构同一性，或它们的组合进行选择。
可通过如下过程进一步优化人源化抗原结合结构域以改善其对所需抗原的选择性或亲和力：通过采用诸如国际专利公布号WO1090/007861和WO1992/22653中所述的技术，并入改变的框架支持残基来保持结合亲和力(回复突变)，或者通过在任何CDR处引入变异例如来改善抗原结合结构域的亲和力。
基因组中携带人免疫球蛋白(Ig)基因座的转基因动物(诸如小鼠、大鼠或鸡)可用于生成结合CD3ε的抗原结合片段并且描述于例如美国专利号6,150,584、国际专利公布号WO1999/45962、国际专利公布号WO2002/066630、WO2002/43478、WO2002/043478和WO1990/04036中。可破坏此类动物中的内源性免疫球蛋白基因座或使该基因座缺失，并且可使用转染色体或微小基因，通过同源或非同源重组将至少一种完整或部分的人免疫球蛋白基因座插入动物的基因组中。可邀请诸如Regeneron(<URL:http://www.regeneron.com>)、Harbour Antibodies(http://www.harbourantibodies.com)、Open MonoclonalTechnology,Inc.(OMT)(<URL:http://www.omtinc.net>)、KyMab(<URL:http://www.kymab.com>)、Trianni(<URL:http://www.trianni.com>)和Ablexis(<URL:http://www.ablexis.com>)等公司使用如上所述的技术以提供针对所选抗原的人抗体。
结合CD3ε的抗原结合结构域可选自噬菌体展示文库，其中噬菌体被工程化以表达人免疫球蛋白或其部分，诸如Fab、单链抗体(scFv)或者未配对或配对抗体可变区。可例如用噬菌体pIX外壳蛋白从将抗体重链可变区和轻链可变区表达为融合蛋白的噬菌体展示文库中分离出结合CD3ε的抗原结合结构域，如Shi等人，(2010)J Mol Biol 397:385-96和国际专利公布号WO09/085462所述。可从文库中筛选与人和/或cyno CD3ε结合的噬菌体，并可进一步表征所获得的阳性克隆，从克隆溶解产物中分离Fab，并将其转化为scFv或抗原结合片段的其他构型。
免疫源性抗原的制备以及本公开的抗原结合结构域的产生可用任何合适的技术诸如重组蛋白产生来进行。免疫原性抗原能够以纯化蛋白质或蛋白质混合物(包括全细胞或者细胞或组织提取物)的形式施用于动物，或者该抗原可以在动物体内由编码所述抗原或其部分的核酸从头形成。
缀合至半衰期延长部分
本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域可以缀合至半衰期延长部分。示例性的半衰期延长部分是白蛋白、白蛋白变体、白蛋白结合蛋白和/或结构域、转铁蛋白及其片段和类似物、免疫球蛋白(Ig)或其片段(诸如Fc区)。前述半衰期延长部分的氨基酸序列是已知的。Ig或其片段包括所有同种型(即IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE)。
可缀合至本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域的附加半衰期延长部分包括例如聚乙二醇(PEG)分子，诸如PEG5000或PEG20,000；不同链长的脂肪酸和脂肪酸酯，例如月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、硬脂酸酯、花生酸酯、二十二烷酸酯、油酸酯、花生四烯酸、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等、聚赖氨酸、辛烷、碳水化合物(右旋糖酐、纤维素、低聚糖或多糖)，以便获得所需特性。这些部分可与本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域直接融合并且可通过标准的克隆和表达技术生成。可替代地，熟知的化学偶联方法可以用于将这些部分附接到本公开的结合CD3ε的重组产生的抗原结合结构域。
可以例如通过将半胱氨酸残基并入到本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域的C端或将半胱氨酸工程化到背离CD3ε结合位点的残基位置中并且使用熟知的方法将聚乙二醇基团附接到半胱氨酸上，将聚乙二醇部分缀合至本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域上。
在其他实施方案中，结合CD3ε的抗原结合片段缀合至半衰期延长部分。
在其他实施方案中，该半衰期延长部分是免疫球蛋白(Ig)、该Ig的片段、Ig恒定区、该Ig恒定区的片段、Fc区、转铁蛋白、白蛋白、白蛋白结合结构域或聚乙二醇。在其他实施方案中，该半衰期延长部分是Ig恒定区。
在其他实施方案中，该半衰期延长部分是Ig。
在其他实施方案中，该半衰期延长部分是Ig的片段。
在其他实施方案中，该半衰期延长部分是Ig恒定区。
在其他实施方案中，该半衰期延长部分是Ig恒定区的片段。
在其他实施方案中，该半衰期延长部分是Fc区。
在其他实施方案中，该半衰期延长部分是白蛋白。
在其他实施方案中，该半衰期延长部分是白蛋白结合结构域。
在其他实施方案中，该半衰期延长部分是转铁蛋白。
在其他实施方案中，该半衰期延长部分是聚乙二醇。
可利用已知的体内模型来评价缀合至半衰期延长部分的结合CD3ε的抗原结合结构域的药代动力学特性。
缀合至免疫球蛋白(Ig)恒定区或Ig恒定区的片段
本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域可以缀合至Ig恒定区或Ig恒定区的片段以赋予抗体样特性，包括Fc效应子功能即C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的吞噬作用或下调。Ig恒定区或Ig恒定区的片段也起到如本文所讨论的半衰期延长部分的作用。可以使用标准方法将本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域工程化到常规全长抗体中。包含结合CD3ε的抗原结合结构域的全长抗体可以进一步如本文所述进行工程化。
免疫球蛋白重链恒定区由亚结构域CH1、铰链、CH2和CH3构成。CH1结构域跨越重链上的残基A118-V215、CH2结构域残基A231-K340和CH3结构域残基G341-K447，根据EU索引进行残基编号。在一些情况下，G341称为CH2结构域残基。铰链通常定义为包括E216并且终止于人IgG1的P230。Ig Fc区至少包含Ig恒定区的CH2和CH3结构域，并因此至少包含Ig重链恒定区约A231至K447的区域。
本发明还提供了一种缀合至免疫球蛋白(Ig)恒定区或Ig恒定区的片段的结合CD3ε的抗原结合结构域。
在其他实施方案中，该Ig恒定区是重链恒定区。
在其他实施方案中，该Ig恒定区是轻链恒定区。
在其他实施方案中，该Ig恒定区的片段包含Fc区。
在其他实施方案中，该Ig恒定区的片段包含CH2结构域。
在其他实施方案中，该Ig恒定区的片段包含CH3结构域。
在其他实施方案中，该Ig恒定区的片段包含CH2结构域和CH3结构域。
在其他实施方案中，该Ig恒定区的片段包含铰链的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域。铰链的一部分是指Ig铰链的一个或多个氨基酸残基。
在其他实施方案中，该Ig恒定区的片段包含铰链、CH2结构域和CH3结构域。
在其他实施方案中，结合CD3ε的抗原结合结构域缀合至Ig恒定区或Ig恒定区的片段的N端。
在其他实施方案中，结合CD3ε的抗原结合结构域缀合至Ig恒定区或Ig恒定区的片段的C端。
在其他实施方案中，结合CD3ε的抗原结合结构域经由第二接头(L2)缀合至Ig恒定区或Ig恒定区的片段。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63或64的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列。
可使用几种已知的测定法评估缀合至Ig恒定区或Ig恒定区的片段的本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域。可以使用本文所述的方法评估与CD3ε的结合。可在Fc受体结合测定法中使用受体的可溶性形式诸如FcγRI、FcγRII、FcγRIII或FcRn受体，或使用测量例如ADCC、CDC或ADCP的基于细胞的测定法来测定Ig恒定结构域或Ig恒定区的片段(诸如Fc区)所赋予的改变的特性。
可使用体外测定法，使用表达CD3ε的细胞作为靶细胞并且使用NK细胞作为效应细胞来评估ADCC。根据从溶解的细胞中释放的标记物(例如放射性底物、荧光染料或天然胞内蛋白)来检测细胞溶解。在示例性测定中，可以按1个靶细胞与4个效应细胞的比率使用靶细胞。将靶细胞用BATDA预标记并与效应细胞和测试抗体混合。将样本温育2小时，并且通过测量释放到上清液中的BATDA来测量细胞溶解率。使数据针对使用0.67％Triton X-100(Sigma Aldrich)的最大细胞毒性和通过在不存在任何抗体的情况下来自靶细胞的BATDA自发释放测定的最小对照标准化。
可以通过使用单核细胞来源的巨噬细胞作为效应细胞和任何表达CD3ε的细胞作为靶细胞来评价ADCP，这些细胞被工程化以表达GFP或其他标记分子。在示例性测定中，效应细胞:靶细胞比率可为例如4:1。可在含或不含本发明抗体的情况下，将效应细胞与靶细胞一起温育4小时。在温育后，可使用细胞消化液(accutase)分离细胞。可使用偶联至荧光标记物的抗CD11b抗体和抗CD14抗体鉴定巨噬细胞，并且可使用标准方法基于CD11+CD14+巨噬细胞中的GFP荧光％确定吞噬百分比。
可例如通过如下方式测量细胞的CDC：将Daudi细胞以1×105个细胞/孔(50μL/孔)接种到RPMI-B(补充有1％BSA的RPMI)中，将50μL的测试蛋白质以0μg/mL至100μg/mL的最终浓度添加到孔中，将反应在室温下温育15min，将11μL的混合人血清添加到孔中，然后将反应在37℃下温育45min。可使用标准方法在FACS测定法中检测碘化丙啶染色细胞％作为溶解细胞百分比(％)。
包含本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域的蛋白质
可以使用标准方法将本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域工程化到各种设计的单特异性或多特异性蛋白质中。
本公开还提供了一种单特异性蛋白质，该单特异性蛋白质包含本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域。
在其他实施方案中，该单特异性蛋白质是抗体。
本公开还提供了一种多特异性蛋白质，该多特异性蛋白质包含本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域。
在其他实施方案中，该多特异性蛋白质是双特异性的。
在其他实施方案中，该多特异性蛋白质是三特异性的。
在其他实施方案中，该多特异性蛋白质是四特异性的。
在其他实施方案中，该多特异性蛋白质对于与CD3ε结合是单价的。
在其他实施方案中，该多特异性蛋白质对于与CD3ε结合是二价的。
本公开还提供了一种分离的多特异性蛋白质，该分离的多特异性蛋白质包含结合CD3ε的第一抗原结合结构域和结合肿瘤抗原的第二抗原结合结构域。
在其他实施方案中，该肿瘤抗原是hK2抗原。在其他实施方案中，该肿瘤抗原是HLA-G抗原。在其他实施方案中，该肿瘤抗原是DLL3抗原。
在其他实施方案中，结合CD3ε的第一抗原结合结构域和/或结合肿瘤抗原的第二抗原结合结构域包含scFv、(scFv)2、Fv、Fab、F(ab')2、Fd、dAb或VHH。
在其他实施方案中，结合CD3ε的第一抗原结合结构域和/或结合肿瘤抗原的第二抗原结合结构域包含Fab。
在其他实施方案中，结合CD3ε的第一抗原结合结构域和/或结合肿瘤抗原的第二抗原结合结构域包含F(ab')2。
在其他实施方案中，结合CD3ε的第一抗原结合结构域和/或结合肿瘤抗原的第二抗原结合结构域包含VHH。
在其他实施方案中，结合CD3ε的第一抗原结合结构域和/或结合肿瘤抗原的第二抗原结合结构域包含Fv。
在其他实施方案中，结合CD3ε的第一抗原结合结构域和/或结合肿瘤抗原的第二抗原结合结构域包含Fd。
在其他实施方案中，结合CD3ε的第一抗原结合结构域和/或结合肿瘤抗原的第二抗原结合结构域包含scFv。
在其他实施方案中，该scFv从N端到C端包含VH、第一接头(L1)和VL(VH-L1-VL)或者包含该VL、该L1和该VH(VL-L1-VH)。
在其他实施方案中，该L1包含约5至50个氨基酸。
在其他实施方案中，该L1包含约5至40个氨基酸。
在其他实施方案中，该L1包含约10至30个氨基酸。
在其他实施方案中，该L1包含约10至20个氨基酸。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63或64的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。
在其他实施方案中，该L1包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列。
在其他实施方案中，结合CD3ε的第一抗原结合结构域包含：SEQ ID NO:6、12或18的HCDR1；SEQ ID NO:7、13或19的HCDR2；SEQ ID NO:8、14或20的HCDR3；SEQ ID NO:9、15或21的LCDR1；SEQ ID NO:10或16的LCDR2；以及SEQ ID NO:11、17或22的LCDR3。
在其他实施方案中，结合CD3ε的第一抗原结合结构域包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：
分别为SEQ ID NO:6、7、8、9、10和11；
分别为SEQ ID NO:12、13、14、15、16和17；或者
分别为SEQ ID NO:18、19、20、21、16和22。
在其他实施方案中，结合CD3ε的第一抗原结合结构域包含SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:24的VL。
在其他实施方案中，结合CD3ε的第一抗原结合结构域包含SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:27的VL。
在其他实施方案中，结合CD3ε的第一抗原结合结构域包含SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:28的VL。
在其他实施方案中，结合CD3ε的第一抗原结合结构域包含SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:29的VL。
在其他实施方案中，结合CD3ε的第一抗原结合结构域包含SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:30的VL。
在其他实施方案中，结合CD3ε的第一抗原结合结构域包含SEQ ID NO:23的VH以及SEQ ID NO:24、27、28、29或30的VL。
在其他实施方案中，结合CD3ε的第一抗原结合结构域包含SEQ ID NO:65、66、67、68、69、60、71、72、73或74的氨基酸序列。
在其他实施方案中，结合CD3ε的第一抗原结合结构域包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列。
在其他实施方案中，结合CD3ε的第一抗原结合结构域包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。
在其他实施方案中，结合CD3ε的第一抗原结合结构域包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
在其他实施方案中，结合CD3ε的第一抗原结合结构域包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列。
在其他实施方案中，结合CD3ε的第一抗原结合结构域包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列。
在其他实施方案中，结合CD3ε的第一抗原结合结构域包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列。
在其他实施方案中，结合CD3ε的第一抗原结合结构域包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。
在其他实施方案中，结合CD3ε的第一抗原结合结构域包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。
在其他实施方案中，结合CD3ε的第一抗原结合结构域包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。
在其他实施方案中，结合CD3ε的第一抗原结合结构域包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。
在其他实施方案中，结合肿瘤抗原的第二抗原结合结构域包含：
SEQ ID NO:149的HCDR1、SEQ ID NO:150的HCDR2、SEQ ID NO:151的HCDR3、SEQ IDNO:171的LCDR1、SEQ ID NO:172的LCDR2和SEQ ID NO:173的LCDR3；或者
SEQ ID NO:126的VH和SEQ ID NO:127的VL。
在其他实施方案中，结合肿瘤抗原的第二抗原结合结构域包含：
SEQ ID NO:149的HCDR1、SEQ ID NO:152的HCDR2、SEQ ID NO:151的HCDR3、SEQ IDNO:174的LCDR1、SEQ ID NO:175的LCDR2和SEQ ID NO:173的LCDR3；或者
SEQ ID NO:124的VH和SEQ ID NO:125的VL。
在其他实施方案中，结合肿瘤抗原的第二抗原结合结构域包含：
SEQ ID NO:149的HCDR1、SEQ ID NO:152的HCDR2、SEQ ID NO:151的HCDR3、SEQ IDNO:174的LCDR1、SEQ ID NO:175的LCDR2和SEQ ID NO:173的LCDR3；或者
SEQ ID NO:128的VH和SEQ ID NO:129的VL。
在其他实施方案中，结合肿瘤抗原的第二抗原结合结构域包含：
SEQ ID NO:149的HCDR1、SEQ ID NO:152的HCDR2、SEQ ID NO:151的HCDR3、SEQ IDNO:174的LCDR1、SEQ ID NO:175的LCDR2和SEQ ID NO:173的LCDR3；或者
SEQ ID NO:130的VH和SEQ ID NO:131的VL。
在其他实施方案中，结合肿瘤抗原的第二抗原结合结构域包含：
SEQ ID NO:149的HCDR1、SEQ ID NO:152的HCDR2、SEQ ID NO:151的HCDR3、SEQ IDNO:171的LCDR1、SEQ ID NO:172的LCDR2和SEQ ID NO:173的LCDR3；或者
SEQ ID NO:132的VH和SEQ ID NO:133的VL。
在其他实施方案中，结合肿瘤抗原的第二抗原结合结构域包含：
SEQ ID NO:149的HCDR1、SEQ ID NO:152的HCDR2、SEQ ID NO:151的HCDR3、SEQ IDNO:171的LCDR1、SEQ ID NO:172的LCDR2和SEQ ID NO:173的LCDR3；或者
SEQ ID NO:134的VH和SEQ ID NO:135的VL。
在其他实施方案中，结合肿瘤抗原的第二抗原结合结构域包含：
SEQ ID NO:149的HCDR1、SEQ ID NO:152的HCDR2、SEQ ID NO:151的HCDR3、SEQ IDNO:171的LCDR1、SEQ ID NO:172的LCDR2和SEQ ID NO:173的LCDR3；或者
SEQ ID NO:136的VH和SEQ ID NO:135的VL。
在其他实施方案中，结合肿瘤抗原的第二抗原结合结构域包含：
SEQ ID NO:149的HCDR1、SEQ ID NO:152的HCDR2、SEQ ID NO:151的HCDR3、SEQ IDNO:171的LCDR1、SEQ ID NO:172的LCDR2和SEQ ID NO:173的LCDR3；或者
SEQ ID NO:132的VH和SEQ ID NO:135的VL。
在其他实施方案中，结合肿瘤抗原的第二抗原结合结构域包含：
SEQ ID NO:153的HCDR1、SEQ ID NO:154的HCDR2、SEQ ID NO:155的HCDR3、SEQ IDNO:176的LCDR1、SEQ ID NO:177的LCDR2和SEQ ID NO:178的LCDR3；或者
SEQ ID NO:137的VH和SEQ ID NO:138的VL。
在其他实施方案中，结合肿瘤抗原的第二抗原结合结构域包含：
SEQ ID NO:156的HCDR1、SEQ ID NO:157的HCDR2、SEQ ID NO:158的HCDR3、SEQ IDNO:182的LCDR1、SEQ ID NO:183的LCDR2和SEQ ID NO:184的LCDR3；或者
SEQ ID NO:139的VH和SEQ ID NO:140的VL。
在其他实施方案中，结合肿瘤抗原的第二抗原结合结构域包含：
SEQ ID NO:159的HCDR1、SEQ ID NO:160的HCDR2、SEQ ID NO:161的HCDR3、SEQ IDNO:179的LCDR1、SEQ ID NO:180的LCDR2和SEQ ID NO:181的LCDR3；或者
SEQ ID NO:141的VH和SEQ ID NO:142的VL。
在其他实施方案中，结合肿瘤抗原的第二抗原结合结构域包含：
SEQ ID NO:162的HCDR1、SEQ ID NO:163的HCDR2、SEQ ID NO:164的HCDR3、SEQ IDNO:185的LCDR1、SEQ ID NO:186的LCDR2和SEQ ID NO:187的LCDR3；或者
SEQ ID NO:143的VH和SEQ ID NO:144的VL。
在其他实施方案中，结合肿瘤抗原的第二抗原结合结构域包含：
SEQ ID NO:165的HCDR1、SEQ ID NO:166的HCDR2、SEQ ID NO:167的HCDR3、SEQ IDNO:191的LCDR1、SEQ ID NO:192的LCDR2和SEQ ID NO:193的LCDR3；或者
SEQ ID NO:145的VH和SEQ ID NO:146的VL。
在其他实施方案中，结合肿瘤抗原的第二抗原结合结构域包含：
SEQ ID NO:168的HCDR1、SEQ ID NO:169的HCDR2、SEQ ID NO:170的HCDR3、SEQ IDNO:191的LCDR1、SEQ ID NO:192的LCDR2和SEQ ID NO:188的LCDR3；或者
SEQ ID NO:147的VH和SEQ ID NO:148的VL。
在其他实施方案中，结合肿瘤抗原的第二抗原结合结构域包含SEQ ID NO:143的VH和SEQ ID NO:358的VL。
在其他实施方案中，结合CD3ε的第一抗原结合结构域缀合至第一免疫球蛋白(Ig)恒定区或第一Ig恒定区的片段，并且/或者结合肿瘤抗原的第二抗原结合结构域缀合至第二免疫球蛋白(Ig)恒定区或第二Ig恒定区的片段。
在其他实施方案中，第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区的片段包含Fc区。
在其他实施方案中，第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区的片段包含CH2结构域。
在其他实施方案中，第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区的片段包含CH3结构域。
在其他实施方案中，第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区的片段包含CH2结构域和CH3结构域。
在其他实施方案中，第一Ig恒定区的片段和/或第二Ig恒定区的片段包含铰链的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域。
在其他实施方案中，该Ig恒定区的片段包含铰链、CH2结构域和CH3结构域。
在其他实施方案中，多特异性蛋白质还包含在第一抗原结合结构域与第二抗原结合结构域之间的第二接头(L2)，该第一抗原结合结构域结合CD3ε和第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段，该第二抗原结合结构域结合肿瘤抗原和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段。
在其他实施方案中，该L2包含SEQ ID NO:31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63或64的氨基酸序列。
在其他实施方案中，第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段是IgG1、IgG2和IgG3或IgG4同种型。
在其他实施方案中，第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段是IgG1同种型。
在其他实施方案中，第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段是IgG2同种型。
在其他实施方案中，第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段是IgG3同种型。
在其他实施方案中，第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段是IgG4同种型。
第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段可如本文所述进一步工程化。
在其他实施方案中，第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含至少一个突变，该至少一个突变导致多特异性蛋白质与FcγR的结合减少。
在其他实施方案中，导致多特异性蛋白质与FcγR的结合减少的该至少一个突变选自由以下项组成的组：F234A/L235A、L234A/L235A、L234A/L235A/D265S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、F234A/L235A、S228P/F234A/L235A、N297A、V234A/G237A、K214T/E233P/L234V/L235A/G236-缺失/A327G/P331A/D365E/L358M、H268Q/V309L/A330S/P331S、S267E/L328F、L234F/L235E/D265A、L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、S228P/F234A/L235A/G237A/P238S和S228P/F234A/L235A/G236-缺失/G237A/P238S，其中根据EU索引进行残基编号。
在其他实施方案中，第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含至少一个突变，该至少一个突变导致多特异性蛋白质与Fcγ受体(FcγR)的结合增强。
在其他实施方案中，导致多特异性蛋白质与FcγR的结合增强的该至少一个突变选自由以下项组成的组：S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L和G236A/S239D/I332E，其中根据EU索引进行残基编号。
在其他实施方案中，FcγR是FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB或FcγRIII或它们的任何组合。
在其他实施方案中，第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含调节多特异性蛋白质的半衰期的至少一个突变。
在其他实施方案中，调节多特异性蛋白质的半衰期的该至少一个突变选自由以下项组成的组：H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A和H435R，其中根据EU索引进行残基编号。
在其他实施方案中，该多特异性蛋白质在第一Ig恒定区的CH3结构域中或在第一Ig恒定区的片段的CH3结构域中包含至少一个突变，并且/或者在第二Ig恒定区的CH3结构域中或在第二Ig恒定区的片段的CH3结构域中包含至少一个突变。
在其他实施方案中，在第一Ig恒定区的CH3结构域中或在第一Ig恒定区的片段的CH3结构域中的该至少一个突变以及/或者在第二Ig恒定区的CH3结构域中或在第二Ig恒定区的片段的CH3结构域中的该至少一个突变选自由以下项组成的组：T350V、L351Y、F405A、Y407V、T366Y、T366W、T366L、F405W、K392L、T394W、T394S、Y407T、Y407A、T366S/L368A/Y407V、L351Y/F405A/Y407V、T366I/K392M/T394W、T366L/K392L/T394W、F405A/Y407V、T366L/K392M/T394W、L351Y/Y407A、L351Y/Y407V、T366A/K409F、L351Y/Y407A、T366V/K409F、T366A/K409F、T350V/L351Y/F405A/Y407V和T350V/T366L/K392L/T394W，其中根据EU索引进行残基编号。
在其他实施方案中，第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段包含以下突变：
第一Ig恒定区中的L235A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V和第二Ig恒定区中的L235A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W；或者
第一Ig恒定区中的L235A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W和第二Ig恒定区中的L235A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V。
包含结合CD3ε的抗原结合片段的多特异性蛋白质的生成。
本公开的结合CD3ε的抗原结合片段可以工程化到多特异性抗体中，这些多特异性抗体也涵盖在本发明范围内。
可以将结合CD3ε的抗原结合片段工程化到使用Fab臂交换生成的全长多特异性抗体中，其中将取代引入Ig恒定区CH3结构域内促进Fab臂体外交换的两个单特异性二价抗体中。在所述方法中，两种单特异性二价抗体被工程化为在CH3结构域处具有促进异源二聚体稳定性的某些取代；将这些抗体在足以使铰链区中的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下一起温育；从而通过Fab臂交换生成双特异性抗体。温育条件最理想地可恢复到非还原条件。可使用的示例性还原剂为2-巯基乙胺(2-MEA)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、谷胱甘肽、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱氨酸和β-巯基乙醇，优选地为选自由2-巯基乙胺、二硫苏糖醇和三(2-羧乙基)膦组成的组的还原剂。例如，可使用如下条件：在至少25mM 2-MEA的存在下或至少0.5mM二硫苏糖醇的存在下，在5-8的pH例如pH7.0或pH7.4，至少20℃的温度下，温育至少90分钟。
可使用的CH3突变包括诸如旋钮空穴突变(Genentech)、静电匹配突变(Chugai,Amgen,NovoNordisk,Oncomed)、链交换工程化结构域主体(SEEDbody)(EMD Serono)、
Figure BDA0003963650430000561
突变(Genmab)以及其他非对称突变(例如Zymeworks)的技术。
旋钮空穴突变公开于例如WO1996/027011中，并且包括CH3区域的界面上的突变，其中具有小侧链(空穴)的氨基酸被引入第一CH3区域，而具有大侧链(旋钮)的氨基酸被引入第二CH3区域，导致第一CH3区域和第二CH3区域之间的优先相互作用。形成旋钮和空穴的示例性CH3区域突变是T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S和T366W/T366S_L368A_Y407V。
重链异源二聚体的形成可通过使用静电相互作用，通过取代第一CH3区上的带正电残基和第二CH3区上的带负电残基来促进，如US2010/0015133、US2009/0182127、US2010/028637或US2011/0123532所述。
可用于促进重链异源二聚化的其他非对称突变是L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F或T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如US2012/0149876或US2013/0195849(Zymeworks)所述。
SEEDbody突变涉及用IgA残基取代所选IgG残基以促进重链异源二聚化，如US20070287170所述。
可使用的其他示例性突变是R409D_K370E/D399K_E357K、S354C_T366W/Y349C_T366S_L368A_Y407V、Y349C_T366W/S354C_T366S_L368A_Y407V、T366K/L351D、L351K/Y349E、L351K/Y349D、L351K/L368E、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、K392D/D399K、K392D/E356K、K253E_D282K_K322D/D239K_E240K_K292D、K392D_K409D/D356K_D399K，如WO2007/147901、WO 2011/143545、WO2013157954、WO2013096291和US2018/0118849所述。
Figure BDA0003963650430000571
突变(Genmab)公开于例如US9150663和US2014/0303356中，并且包括突变F405L/K409R、野生型/F405L_R409K、T350I_K370T_F405L/K409R、K370W/K409R、D399AFGHILMNRSTVWY/K409R、T366ADEFGHILMQVY/K409R、L368ADEGHNRSTVQ/K409AGRH、D399FHKRQ/K409AGRH、F405IKLSTVW/K409AGRH和Y407LWQ/K409AGRH。
可将结合CD3ε的抗原结合结构域并入其中的另外的双特异性或多特异性结构包括双可变结构域免疫球蛋白(DVD)(国际专利公布号WO2009/134776；DVD是全长抗体，其包含具有VH1-接头-VH2-CH结构的重链和具有VL1-接头-VL2-CL结构的轻链；接头是任选的)、包括多种二聚化结构域以连接具有不同特异性的两个抗体臂的结构诸如亮氨酸拉链或胶原二聚化结构域(国际专利公布号WO2012/022811、美国专利号5,932,448和美国专利号6,833,441)、缀合在一起的两个或更多个结构域抗体(dAb)、双价抗体、仅重链抗体诸如骆驼科抗体和工程化骆驼科抗体、双重靶向(DT)-Ig(GSK/Domantis)、二合一抗体(Genentech)、交联Mab(Karmanos Cancer Center)、mAb2(F-Star)和CovX-主体(CovX/Pfizer)、IgG样双特异性抗体(InnClone/Eli Lilly)、Ts2Ab(MedImmune/AZ)和BsAb(Zymogenetics)、HERCULES(Biogen Idec)和TvAb(Roche)、ScFv/Fc融合体(Academic Institution)、SCORPION(Emergent BioSolutions/Trubion，Zymogenetics/BMS)、双亲和重靶向技术(Fc-DART)(MacroGenics)和双(ScFv)2-Fab(National Research Center for AntibodyMedicine--China)、双功能或Bis-Fab(Genentech)、对接锁定(DNL)(ImmunoMedics)、二价双特异性(Biotecnol)和Fab-Fv(UCB-Celltech)。基于ScFv的、基于双价抗体的结构域抗体包括但不限于双特异性T细胞衔接器(BiTE)(Micromet)、串联双价抗体(Tandab)(Affimed)、双亲和重靶向技术(DART)(MacroGenics)、单链双价抗体(Academic)、TCR样抗体(AIT，ReceptorLogics)、人血清白蛋白ScFv融合体(Merrimack)和COMBODY(EpigenBiotech)、双重靶向纳米抗体(Ablynx)、双重靶向仅重链结构域抗体。
本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域也可以工程化到包含三条多肽链的多特异性蛋白质中。在此类设计中，至少一个抗原结合结构域呈scFv的形式。示例性设计包括(其中“1”指示第一抗原结合结构域，“2”指示第二抗原结合结构域，并且“3”指示第三抗原结合结构域：
设计1：A链)scFv1-CH2-CH3；B链)VL2-CL；C链)VH2-CH1-铰链-CH2-CH3
设计2：A链)scFv1-铰链-CH2-CH3；B链)VL2-CL；C链)VH2-CH1-铰链-CH2-CH3
设计3：A链)scFv1-CH1-铰链-CH2-CH3；B链)VL2-CL；C链)VH2-CH1-铰链-CH2-CH3
设计4：A链)CH2-CH3-scFv1；B链)VL2-CL；C链)VH2-CH1-铰链-CH2-CH3
可以将CH3工程化并入设计1-4中，诸如突变L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F或T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如US2012/0149876或US2013/0195849(Zymeworks)所述。
同种型、同种异型和Fc工程化
Ig恒定区或Ig恒定区的片段，诸如本公开的蛋白质中存在的Fc区可以是任何同种异型或同种型的。
在其他实施方案中，Ig恒定区或Ig恒定区的片段是IgG1同种型。
在其他实施方案中，Ig恒定区或Ig恒定区的片段是IgG2同种型。
在其他实施方案中，Ig恒定区或Ig恒定区的片段是IgG3同种型。
在其他实施方案中，Ig恒定区或Ig恒定区的片段是IgG4同种型。
Ig恒定区或Ig恒定区的片段可以是任何同种异型的。预期同种异型对Ig恒定区的特性诸如结合或Fc介导的效应子功能没有影响。包含Ig恒定区或其片段的治疗性蛋白质的免疫原性与增大的输注反应风险和减少的治疗应答持续时间相关(Baert等人，(2003)NEngl J Med 348:602-08)。包含Ig恒定区或其片段的治疗性蛋白质在宿主中诱导免疫应答的程度可部分地由Ig恒定区的同种异型确定(Stickler等人，(2011)Genes and Immunity12:213-21)。Ig恒定区同种异型与抗体的恒定区序列中特定位置的氨基酸序列变异有关。表3示出了所选的IgG1、IgG2和IgG4同种异型。
表3.
Figure BDA0003963650430000591
Figure BDA0003963650430000601
可通过血流中的内源性循环羧肽酶从Ig恒定区中去除C端赖氨酸(CTL)(Cai等人，(2011)Biotechnol Bioeng 108:404-412)。在制备期间，可通过控制胞外Zn2+、EDTA或EDTA-Fe3+的浓度，将CTL去除控制到小于最大水平，如美国专利公布号US20140273092所述的那些。蛋白质中的CTL含量可使用已知方法测定。
在其他实施方案中，缀合至Ig恒定区的结合CD3ε的抗原结合片段具有约10％至约90％的C端赖氨酸含量。在其他实施方案中，C端赖氨酸含量为约20％至约80％。在其他实施方案中，C端赖氨酸含量为约40％至约70％。在其他实施方案中，C端赖氨酸含量为约55％至约70％。在其他实施方案中，C端赖氨酸含量为约60％。
可以对缀合至Ig恒定区或Ig恒定区的片段的结合CD3ε的抗原结合结构域产生Fc区突变，以调节其效应子功能，诸如ADCC、ADCP和/或ADCP和/或药代动力学特性。这可以通过将突变引入Fc来实现，该突变调节突变的Fc与活化FcγR(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIII)、抑制性FcγRIIb和/或FcRn的结合。
在其他实施方案中，缀合至Ig恒定区或Ig恒定区的片段的结合CD3ε的抗原结合结构域在Ig恒定区中或Ig恒定区的片段中包含至少一个突变。
在其他实施方案中，该至少一个突变处于Fc区中。
在其他实施方案中，缀合至Ig恒定区或Ig恒定区的片段的结合CD3ε的抗原结合结构域在Fc区中包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个或十五个突变。
在其他实施方案中，缀合至Ig恒定区或Ig恒定区的片段的结合CD3ε的抗原结合结构域在Fc区中包含至少一个突变，该至少一个突变调节抗体与FcRn的结合。
可以突变以调节半衰期(例如与FcRn的结合)的Fc位置包括位置250、252、253、254、256、257、307、376、380、428、434和435。可单独地或组合产生的示例性突变为突变T250Q、M252Y、I253A、S254T、T256E、P257I、T307A、D376V、E380A、M428L、H433K、N434S、N434A、N434H、N434F、H435A和H435R。可产生以增加半衰期的示例性单突变或组合突变为突变M428L/N434S、M252Y/S254T/T256E、T250Q/M428L、N434A和T307A/E380A/N434A。可产生以减小半衰期的示例性单突变或组合突变为突变H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A和H435R。
在其他实施方案中，缀合至Ig恒定区或Ig恒定区的片段的结合CD3ε的抗原结合结构域包含M252Y/S254T/T256E突变。
在其他实施方案中，缀合至Ig恒定区或Ig恒定区的片段的结合CD3ε的抗原结合结构域在Fc区中包含至少一个突变，该至少一个突变减少蛋白质与活化Fcγ受体(FcγR)的结合并且/或者降低Fc效应子功能，诸如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或吞噬作用(ADCP)。
可以突变以减少蛋白质与活化FcγR的结合并随后降低效应子功能的Fc位置包括位置214、233、234、235、236、237、238、265、267、268、270、295、297、309、327、328、329、330、331和365。可单独地或组合产生的示例性突变为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的突变K214T、E233P、L234V、L234A、G236缺失、V234A、F234A、L235A、G237A、P238A、P238S、D265A、S267E、H268A、H268Q、Q268A、N297A、A327Q、P329A、D270A、Q295A、V309L、A327S、L328F、A330S和P331S。产生具有降低的ADCC的蛋白质的示例性组合图表为IgG1上的突变L234A/L235A、IgG1上的突变L234A/L235A/D265S、IgG2上的突变V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、IgG4上的突变F234A/L235A、IgG4上的突变S228P/F234A/L235A、所有Ig同种型上的N297A、IgG2上的突变V234A/G237A、IgG1上的突变K214T/E233P/L234V/L235A/G236-缺失/A327G/P331A/D365E/L358M、IgG2上的突变H268Q/V309L/A330S/P331S、IgG1上的突变S267E/L328F、IgG1上的突变L234F/L235E/D265A、IgG1上的突变L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、IgG4上的突变S228P/F234A/L235A/G237A/P238S、以及IgG4上的突变S228P/F234A/L235A/G236-缺失/G237A/P238S。还可使用杂合IgG2/4Fc域，例如具有来自IgG2的残基117-260和来自IgG4的残基261-447的Fc。
产生具有降低的CDC的蛋白质的示例性突变是K322A突变。
熟知的S228P突变可在IgG4抗体中产生，以增强IgG4稳定性。
在其他实施方案中，缀合至Ig恒定区或Ig恒定区的片段的结合CD3ε的抗原结合结构域包含选自由以下项组成的组的至少一个突变：K214T、E233P、L234V、L234A、G236缺失、V234A、F234A、L235A、G237A、P238A、P238S、D265A、S267E、H268A、H268Q、Q268A、N297A、A327Q、P329A、D270A、Q295A、V309L、A327S、L328F、K322、A330S和P331S。
在其他实施方案中，缀合至Ig恒定区或Ig恒定区的片段的结合CD3ε的抗原结合结构域包含L234A/L235A/D265S突变。
在其他实施方案中，缀合至Ig恒定区或Ig恒定区的片段的结合CD3ε的抗原结合结构域包含L234A/L235A突变。
在其他实施方案中，缀合至Ig恒定区或Ig恒定区的片段的结合CD3ε的抗原结合结构域在Fc区中包含至少一个突变，该至少一个突变增强蛋白质与Fcγ受体(FcγR)的结合并且/或者增强Fc效应子功能，诸如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或吞噬作用(ADCP)。
可以突变以增加蛋白质与活化FcγR的结合并且/或者增强Fc效应子功能的Fc位置包括位置236、239、243、256、290、292、298、300、305、312、326、330、332、333、334、345、360、339、378、396或430(根据EU索引进行残基编号)。可单独地或组合进行的示例性突变为G236A、S239D、F243L、T256A、K290A、R292P、S298A、Y300L、V305L、K326A、A330K、I332E、E333A、K334A、A339T和P396L。产生具有增加的ADCC或ADCP的蛋白质的示例性组合突变为S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L和G236A/S239D/I332E。
可以突变以增强CDC的Fc位置包括位置267、268、324、326、333、345和430。可单独地或组合产生的示例性突变为S267E、F1268F、S324T、K326A、K326W、E333A、E345K、E345Q、E345R、E345Y、E430S、E430F和E430T。产生具有增加的CDC的蛋白质的示例性组合突变为K326A/E333A、K326W/E333A、H268F/S324T、S267E/H268F、S267E/S324T和S267E/H268F/S324T。
本文所述的特定突变是相比于分别为SEQ ID NO:95、96和97的IgG1、IgG2和IgG4野生型氨基酸序列时的突变。
SEQ ID NO:95，野生型IgG1
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:96；野生型IgG2
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:97；野生型IgG4
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
可使用流式细胞术在经工程化以表达每个受体的细胞上评估抗体与FcγR或FcRn的结合。在示例性结合测定中，将2×105个细胞/孔接种到96孔板中并在BSA染色缓冲液(BDBiosciences，San Jose，USA)中在4℃下封闭30min。将细胞与测试抗体在冰上在4℃下温育1.5小时。在用BSA染色缓冲液洗涤两次之后，将细胞与R-PE标记的抗人IgG二级抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories)在4℃下一起温育45分钟。将细胞在染色缓冲液中洗涤两次，然后重悬于150μL的含有1:200稀释的DRAQ7活/死染色剂的染色缓冲液(CellSignaling Technology,Danvers,USA)中。分别使用B2和B4通道，通过Miltenyi MACSQuant流式细胞仪(Miltenyi Biotec,Auburn,USA)检测经染色细胞的PE和DRAQ7信号。活细胞根据DRAQ7排除法进行门控，并且测定所收集的至少10,000个活事件的几何平均荧光信号。使用FlowJo软件(Tree Star)进行分析。数据绘制为抗体浓度对数相对于平均荧光信号。进行非线性回归分析。
糖工程
缀合至Ig恒定区或Ig恒定区的片段的结合CD3ε的抗原结合结构域介导ADCC的能力可以通过工程化Ig恒定区或Ig恒定区片段的低聚糖组分而增强。人IgG1或IgG3在Asn297处被熟知的双分枝G0、G0F、G1、G1F、G2或G2F形式的大多数聚糖N-糖基化。未工程化的CHO细胞可产生含Ig恒定区的蛋白质，该蛋白质通常具有约至少85％的聚糖岩藻糖含量。从附接到缀合至Ig恒定区或Ig恒定区的片段的结合CD3ε的抗原结合结构域的双天线复合型低聚糖中去除核心岩藻糖经由改善的FcγRIIIa结合增强了蛋白质的ADCC而不改变抗原结合或CDC活性。此类蛋白质可以使用据报道会引起具有双分枝复合物型Fc低聚糖的相对较高去岩藻糖基化免疫球蛋白的成功表达的不同方法来实现，这些方法诸如控制培养物渗透压(Konno等人，Cytotechnology,64:249-65,2012)、应用变体CHO系Lec13作为宿主细胞系(Shields等人，J Biol Chem277:26733-26740,2002)、应用变体CHO系EB66作为宿主细胞系(Olivier等人，MAbs；2(4):405-415,2010；PMID:20562582)、应用大鼠杂交瘤细胞系YB2/0作为宿主细胞系(Shinkawa等人，J Biol Chem 278:3466-3473,2003)、引入特异性针对1,6-岩藻糖基转移酶(FUT8)基因的小干扰RNA(Mori等人，Biotechnol Bioeng 88:901-908,2004)，或共表达β-1,4-N-乙酰葡糖胺基转移酶III和高尔基体α-甘露糖苷酶II或强效α-甘露糖苷酶I抑制剂几夫碱(Ferrara等人，J Biol Chem 281:5032-5036,2006，Ferrara等人，Biotechnol Bioeng 93:851-861,2006；Xhou等人，Biotechnol Bioeng 99:652-65,2008)。
在其他实施方案中，本公开的缀合至Ig恒定区或Ig恒定区的片段的结合CD3ε的抗原结合结构域具有双天线聚糖结构，其岩藻糖含量为约1％至约15％，例如约15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。在其他实施方案中，缀合至Ig恒定区或Ig恒定区的片段的结合CD3ε的抗原结合结构域具有聚糖结构，其岩藻糖含量为约50％、40％、45％、40％、35％、30％、25％或20％。
“岩藻糖含量”意指Asn297处糖链内的岩藻糖单糖的量。岩藻糖的相对量为含岩藻糖的结构相对于所有糖结构的百分比。这些可通过多种方法进行表征和定量，例如：1)使用经N-糖苷酶F处理的样品(例如，复合结构、混合结构及低聚甘露糖结构和高甘露糖结构)的MALDI-TOF，如国际专利公布号WO2008/077546 2所述；2)通过酶促释放Asn297聚糖，随后衍生化并通过具有荧光检测的HPLC(UPLC)和/或HPLC-MS(UPLC-MS)进行检测/定量；3)在用或不用Endo S或其他酶处理Asn297聚糖的情况下，对天然或还原后的mAb进行完整蛋白分析，所述其他酶在第一GlcNAc单糖和第二GlcNAc单糖之间进行溶解，留下连接至第一GlcNAc的岩藻糖；4)通过酶消化(例如，胰蛋白酶或肽链内切酶Lys-C)将mAb消化为成分肽，随后通过HPLC-MS(UPLC-MS)进行分离、检测和定量；5)通过用PNGase F在Asn 297处进行特异性酶促去糖基化将mAb低聚糖与mAb蛋白质分离。可通过各种互补技术对由此释放的低聚糖进行荧光团标记、分离并鉴定，这些技术允许：采用基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱法，通过比较实验质量与理论质量来对聚糖结构进行精细表征；通过离子交换HPLC(GlycoSep C)确定唾液酸化程度；通过正相HPLC(GlycoSep N)，根据亲水性标准分离和定量低聚糖形式；以及通过高效毛细管电泳激光诱导荧光(HPCE-LIF)分离和定量低聚糖。
如本文所用，“低岩藻糖”或“低岩藻糖含量”是指缀合至Ig恒定区或Ig恒定区的片段的结合CD3ε的抗原结合结构域具有约1％至15％的岩藻糖含量。
如本文所用，“正常岩藻糖”或“正常岩藻糖含量”是指缀合至Ig恒定区或Ig恒定区的片段的结合CD3ε的抗原结合结构域具有约50％以上，通常约80％以上或85％以上的岩藻糖含量。
抗独特型抗体
抗独特型抗体是与本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域特异性结合的抗体。
本发明还提供了一种与本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域特异性结合的抗独特型抗体。
本发明还提供了一种与结合CD3ε的抗原结合结构域特异性结合的抗独特型抗体，该抗原结合结构域包含：
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:24的VL；
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:27的VL；
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:28的VL；
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:29的VL；或者
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:30的VL。
抗独特型(Id)抗体是识别抗体的抗原决定簇(例如互补位或CDR)的抗体。Id抗体可为抗原封闭性或非封闭性的。抗原阻断Id可用于检测样品中的游离抗原结合结构域(例如本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域)。非封闭性Id可用于检测样品中的总抗体(游离，部分结合于抗原，或完全结合于抗原的抗体)。Id抗体可通过用抗体对正在制备抗Id的动物免疫来制备。
抗Id抗体还可以用作免疫原以在另一动物中诱导免疫应答，从而产生所谓的抗-抗Id抗体。抗-抗Id可在表位上与诱导抗Id的原始抗原结合结构域有同一性。因此，通过使用针对抗原结合结构域的独特型决定簇的抗体，可以鉴定出表达相同特异性的抗原结合结构域的其他克隆。抗Id抗体可通过任何合适的技术改变(从而产生抗Id抗体变体)和/或衍生，例如本文别处所述的那些。
免疫缀合物
本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域、包含结合CD3ε的抗原结合结构域的蛋白质或包含结合CD3ε的抗原结合结构域的多特异性蛋白质(在本文中统称为CD3ε结合蛋白)可以缀合至异源分子。
在其他实施方案中，该异源分子是可检测标记或细胞毒性剂。
本发明还提供了一种缀合至可检测标记的结合CD3ε的抗原结合结构域。
本发明还提供了一种蛋白质，该蛋白质包含缀合至可检测标记的结合CD3ε的抗原结合结构域。
本发明还提供了一种多特异性蛋白质，该多特异性蛋白质包含缀合至可检测标记的结合CD3ε的抗原结合结构域。
本发明还提供了一种缀合至细胞毒性剂的结合CD3ε的抗原结合结构域。
本发明还提供了一种蛋白质，该蛋白质包含缀合至细胞毒性剂的结合CD3ε的抗原结合结构域。
本发明还提供了一种多特异性蛋白质，该多特异性蛋白质包含缀合至细胞毒性剂的结合CD3ε的抗原结合结构域。
本公开的CD3ε结合蛋白可用于将治疗剂引导至表达肿瘤抗原的细胞。可替代地，可用本公开的CD3ε结合蛋白靶向表达CD3ε的细胞，该CD3ε结合蛋白与旨在一旦内化就修饰细胞功能的治疗剂偶联。
在其他实施方案中，可检测标记也是细胞毒性剂。
缀合至可检测标记的本公开的CD3ε结合蛋白可用于评价CD3ε在多种样品上的表达。
可检测标记包括当缀合至本公开的CD3ε结合蛋白时使得本公开的CD3ε结合蛋白可经由光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测的组合物。
示例性的可检测标记包括放射性同位素、磁珠、金属珠、胶体颗粒、荧光染料、电子高密度试剂、酶(例如，如ELISA中常用的)、生物素、地高辛、半抗原、发光分子、化学发光分子、荧光染料、荧光团、荧光淬灭剂、有色分子、放射性同位素、闪烁体、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、蛋白质A、蛋白质G、抗体或其片段、多组氨酸、Ni2+、Flag标签、myc标签、重金属、酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶、荧光素酶、电子供体/受体、吖啶酯和比色底物。
可检测标记可自发地发出信号，例如当可检测标记为放射性同位素时。在其他情况下，可检测标记由于受到外场的刺激而发出信号。
示例性放射性同位素可以是发出γ、发出Auger、发出β、发出α或发出正电子的放射性同位素。示例性放射性同位素包括3H、11C、13C、15N、18F、19F、55Co、57Co、60Co、61Cu、62Cu、64Cu、67Cu、68Ga、72As、75Br、86Y、89Zr、90Sr、94mTc、99mTc、115In、1231、1241、125I、1311、211At、212Bi、213Bi、223Ra、226Ra、225Ac和227Ac。
示例性金属原子为原子序数大于20的金属，诸如钙原子、钪原子、钛原子、钒原子、铬原子、锰原子、铁原子、钴原子、镍原子、铜原子、锌原子、镓原子、锗原子、砷原子、硒原子、溴原子、氪原子、铷原子、锶原子、钇原子、锆原子、铌原子、钼原子、锝原子、钌原子、铑原子、钯原子、银原子、镉原子、铟原子、锡原子、锑原子、碲原子、碘原子、氙原子、铯原子、钡原子、镧原子、铪原子、钽原子、钨原子、铼原子、锇原子、铱原子、铂原子、金原子、汞原子、铊原子、铅原子、铋原子、钫原子、镭原子、锕原子、铈原子、镨原子、钕原子、钷原子、钐原子、铕原子、钆原子、铽原子、镝原子、钬原子、铒原子、铥原子、镱原子、镥原子、钍原子、镤原子、铀原子、镎原子、钚原子、镅原子、锔原子、锫原子、锎原子、锿原子、镄原子、钔原子、锘原子或铹原子。
在其他实施方案中，金属原子可以是原子序数大于二十的碱土金属。
在其他实施方案中，金属原子可以是镧系元素。
在其他实施方案中，金属原子可以是锕系元素。
在其他实施方案中，金属原子可以是过渡金属。
在其他实施方案中，金属原子可以是贫金属。
在其他实施方案中，金属原子可以是金原子、铋原子、钽原子和钆原子。
在其他实施方案中，金属原子可以是原子序数为53(即碘)至83(即铋)的金属。
在其他实施方案中，金属原子可以是适用于磁共振成像的原子。
金属原子可以是+1、+2或+3氧化态形式的金属离子，诸如Ba2+、Bi3+、Cs+、Ca2+、Cr2+、Cr3+、Cr6+、Co2+、Co3+、Cu+、Cu2+、Cu3+、Ga3+、Gd3+、Au+、Au3+、Fe2+、Fe3+、F3+、Pb2+、Mn2+、Mn3+、Mn4+、Mn7+、Hg2+、Ni2+、Ni3+、Ag+、Sr2+、Sn2+、Sn4+和Zn2+。金属原子可包括金属氧化物，诸如氧化铁、氧化锰或氧化钆。
合适的染料包括任何可商购染料，诸如5(6)-羧基荧光素、IRDye 680RD马来酰亚胺或IRDye 800CW、钌多吡啶染料等。
合适的荧光团是异硫氰酸荧光素(FITC)、氨基硫脲荧光素、罗丹明、得克萨斯红、CyDye(例如，Cy3、Cy5、Cy5.5)、Alexa Fluor(例如，Alexa488、Alexa555、Alexa594；Alexa647)、近红外线(NIR)(700nm至900nm)荧光染料以及羰花青和氨基苯乙烯基染料。
缀合至可检测标记的结合CD3ε的抗原结合结构域可以用作成像剂。
包含缀合至可检测标记的结合CD3ε的抗原结合结构域的蛋白质可以用作成像剂。
包含缀合至可检测标记的结合CD3ε的抗原结合结构域的多特异性蛋白质可以用作成像剂。
在其他实施方案中，细胞毒性剂是化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或它们的片段)或放射性同位素(即，放射性缀合物)。
在其他实施方案中，细胞毒性剂是道诺霉素、阿霉素、甲氨蝶呤、长春地辛、细菌毒素(诸如，白喉毒素)、蓖麻毒素、格尔德霉素、美登木素生物碱或卡里奇霉素。细胞毒性剂可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制在内的机制引发其细胞毒性和细胞抑制效应。
在其他实施方案中，细胞毒性剂是酶促活性毒素，诸如白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白质、石竹素蛋白质、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白质(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制剂、麻疯树毒素、巴豆毒素、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、迈托毒素、局限曲霉素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯族化合物。
在其他实施方案中，细胞毒性剂是放射性核素，诸如212Bi、131I、131In、90Y和186Re。
在其他实施方案中，细胞毒性剂是多拉司他汀或多拉司他汀肽类似物和衍生物、奥瑞司他汀或单甲基奥瑞司他汀苯丙氨酸。示例性分子在美国专利号5,635,483和5,780,588中公开。多拉司他汀和奥瑞司他汀已被证实可干扰微管动力学、GTP水解以及细胞核和细胞分裂(Woyke等人，(2001)Antimicrob Agents and Chemother.45(12):3580-3584)，并且具有抗癌和抗真菌活性。多拉司他汀或奥瑞司他汀药物部分可通过肽药物部分的N(氨基)末端或C(羧基)末端(WO02/088172)或经由工程化到抗体中的任何半胱氨酸附接到本发明的抗体。
本公开的CD3ε结合蛋白可以使用已知方法缀合至可检测标记。
在其他实施方案中，可检测标记与螯合剂复合。
在其他实施方案中，可检测标记经由接头缀合至本公开的CD3ε结合蛋白。
可检测标记或细胞毒性部分可以使用已知方法直接或间接连接到本公开的CD3ε结合蛋白。合适的接头是本领域已知的，包括例如辅基、非酚类接头(N-琥珀酰亚胺基-苯甲酸酯的衍生物；十二硼酸酯)、大环螯合剂和无环螯合剂两者的螯合部分，诸如1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)的衍生物、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)的衍生物、S-2-(4-异硫氰酸基苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)的衍生物和1,4,8,11-四氮杂环十二烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)的衍生物、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亚氨基噻吩(IT)、亚胺酸酯的双官能衍生物(诸如己二亚胺酸二甲酯HCl)、活性酯(诸如双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)以及其他螯合部分。合适的肽接头是熟知的。
在其他实施方案中，本公开的CD3ε结合蛋白经由肾清除从血液中去除。
试剂盒
本发明还提供了一种包含结合CD3ε的抗原结合结构域的试剂盒。
本发明还提供了一种包含蛋白质的试剂盒，该蛋白质包含结合CD3ε的抗原结合结构域。
本发明还提供了一种包含多特异性蛋白质的试剂盒，该多特异性蛋白质包含结合CD3ε的抗原结合结构域。
试剂盒可用于治疗用途并用作诊断试剂盒。
试剂盒可用于检测样品中CD3ε的存在。
在其他实施方案中，试剂盒包含本公开的CD3ε结合蛋白和用于检测CD3ε结合蛋白的试剂。试剂盒可包含一个或多个其他元件，包括：使用说明；其他试剂，例如标记、治疗剂、或者可用于使抗体与标记或治疗剂螯合或以其他方式偶联的药剂、或辐射防护组合物；用于准备施用抗体的装置或其他材料；药学上可接受的载体；以及用于向受试者施用的装置或其他材料。
在其他实施方案中，试剂盒包含在容器中的结合CD3ε的抗原结合结构域和试剂盒的使用说明。
在其他实施方案中，试剂盒包含在容器中的包含结合CD3ε的抗原结合结构域的蛋白质和试剂盒的使用说明。
在其他实施方案中，试剂盒包含在容器中的多特异性蛋白质和试剂盒的使用说明，该多特异性蛋白质包含结合CD3ε的抗原结合结构域。
在其他实施方案中，试剂盒中结合CD3ε的抗原结合结构域是标记的。
在其他实施方案中，试剂盒中包含结合CD3ε的抗原结合结构域的蛋白质是标记的。
在其他实施方案中，试剂盒中包含结合CD3ε的抗原结合结构域的多特异性蛋白质是标记的。
在其他实施方案中，试剂盒包含结合CD3ε的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含：
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:24的VL；
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:27的VL；
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:28的VL；
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:29的VL；或者
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:30的VL。
在其他实施方案中，试剂盒包含结合CD3ε的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含SEQ ID NO:65、66、67、68、69、70、71、72、73或74。
检测CD3ε的方法
本发明还提供了一种检测样品中的CD3ε的方法，该方法包括获得样品，使样品与本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域接触，以及检测样品中结合的CD3ε。
在其他实施方案中，样品可源自尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、滑液、循环细胞、非组织缔合的细胞(即游离细胞)、组织(例如手术切除的组织、活体组织切片，包括细针抽吸组织)、组织学制备物等。
可以使用已知方法检测本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域。示例性方法包括使用荧光或化学发光标记、或放射标记物直接标记抗体，或者使易于检测的部分(诸如生物素、酶或表位标签)连接到本发明的抗体上。示例性的标记和部分为钌、111In-DOTA、111In-二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶、聚组氨酸(HIS标签)、吖啶染料、花青染料、荧光酮染料、噁嗪染料、菲啶染料、罗丹明染料和
Figure BDA0003963650430000721
染料。
本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域可以用于多种测定法中以检测样品中的CD3ε。示例性的测定法为蛋白质印迹分析、放射性免疫测定、表面等离子体共振、免疫沉淀、平衡透析、免疫扩散、电化学发光(ECL)免疫测定、免疫组织化学、荧光激活细胞分选(FACS)或ELISA测定。
多核苷酸、载体、宿主细胞
本公开还提供了一种分离的多核苷酸，该分离的核苷酸编码本公开的任何CD3ε结合蛋白。CD3ε结合蛋白包括结合CD3ε的抗原结合结构域、包含结合CD3ε的抗原结合结构域的蛋白质以及包含本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域的多特异性蛋白质。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，该分离的核苷酸编码任何CD3ε结合蛋白或其片段。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，该分离的核苷酸编码SEQ ID NO:23的VH。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，该分离的核苷酸编码SEQ ID NO:24、27、28、29或30的VL。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，该分离的核苷酸编码SEQ ID NO:24的VL。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，该分离的核苷酸编码SEQ ID NO:27的VL。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，该分离的核苷酸编码SEQ ID NO:28的VL。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，该分离的核苷酸编码SEQ ID NO:29的VL。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，该分离的核苷酸编码SEQ ID NO:30的VL。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，该分离的核苷酸编码SEQ ID NO:23的VH以及SEQ ID NO:24、27、28、29或30的VL。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸编码：
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:24的VL；
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:27的VL；
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:28的VL；
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:29的VL；或者
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:30的VL。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，该分离的核苷酸编码SEQ ID NO:65、66、67、68、69、70、71、72、73或74的多肽。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，该分离的核苷酸编码SEQ ID NO:65的多肽。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，该分离的核苷酸编码SEQ ID NO:66的多肽。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，该分离的核苷酸编码SEQ ID NO:67的多肽。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，该分离的核苷酸编码SEQ ID NO:68的多肽。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，该分离的核苷酸编码SEQ ID NO:69的多肽。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，该分离的核苷酸编码SEQ ID NO:70的多肽。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，该分离的核苷酸编码SEQ ID NO:71的多肽。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，该分离的核苷酸编码SEQ ID NO:72的多肽。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，该分离的核苷酸编码SEQ ID NO:73的多肽。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，该分离的核苷酸编码SEQ ID NO:74的多肽。
本公开的一些实施方案还提供了一种分离或纯化的核酸，该分离或纯化的核酸包含与编码本公开的CD3ε结合蛋白的多核苷酸互补的多核苷酸或在严格条件下与编码本公开的CD3ε结合蛋白的多核苷酸杂交的多核苷酸。
在严格条件下杂交的多核苷酸序列可以在高严格条件下杂交。所谓“高严格条件”，意味着多核苷酸以可检测到的比非特异性杂交更强的量与靶序列(本文所述的任何核酸的核苷酸序列)特异性杂交。高严格条件包括将具有精确互补序列的多核苷酸，或仅含有少量分散错配的多核苷酸与恰好具有与该核苷酸序列匹配的少量小区域(例如3至12个碱基)的随机序列区分开的条件。这种小的互补区域比14至17个或更多个碱基的全长互补序列更容易解链，并且高严格杂交使得它们能够容易区分。相对高严格条件将包括例如低盐条件和/或高温条件，诸如在约50℃至70℃的温度下由约0.02M至0.1M的NaCl或等同物提供的条件。此类高严格条件在核苷酸序列与模板或靶链之间容许极少错配(如果有的话)。一般认为，通过添加增量的甲酰胺可以使条件更严格。
本公开的多核苷酸序列可操作地连接至一种或多种调节元件，诸如允许核苷酸序列在预期宿主细胞中表达的启动子或增强子。多核苷酸可以是cDNA。启动子可以是强启动子、弱启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子或发育特异性启动子。可以使用的示例性启动子是次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、腺苷脱氨酶、丙酮酸激酶、β-肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸等。此外，许多病毒启动子在真核细胞中组成性地发挥功能，并适合与所述实施方案一起使用。此类病毒启动子包括细胞巨化病毒(CMV)立即早期启动子、SV40的早期和晚期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、马罗尼白血病病毒的长末端重复序列(LTR)、人免疫缺陷病毒(HIV)、EB病毒(EBV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)和其他逆转录病毒，以及单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子。也可以使用诱导型启动子诸如金属硫蛋白启动子、四环素诱导型启动子、强力霉素诱导型启动子、含有一种或多种干扰素刺激的应答元件(ISRE)的启动子，这些应答元件诸如蛋白激酶R 2',5'-寡聚腺苷酸合成酶、Mx基因、ADAR1等。
本发明还提供了一种包含本发明的多核苷酸的载体。本公开还提供了一种包含本发明的多核苷酸的表达载体。此类载体可以是质粒载体、病毒载体、用于杆状病毒表达的载体、基于转座子的载体或任何其他适于通过任何手段将本发明的合成多核苷酸引入给定生物体或遗传背景的载体。编码本公开的CD3ε结合蛋白的多核苷酸可以可操作地连接到表达载体中确保CD3ε结合蛋白的表达的控制序列。此类调节元件可包含转录启动子、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译的终止的序列。表达载体还可包含一个或多个非转录元件，诸如复制起点、连接到待表达的基因的合适启动子和增强子、其他5'或3'侧翼非转录序列、5'或3'非翻译序列(诸如必需的核糖体结合位点)、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点或转录终止序列。也可并入赋予在宿主中复制能力的复制起点。
所述表达载体可以包含天然存在的或非天然存在的核苷酸间键，或这两种类型的键。非天然存在的或改变的核苷酸或核苷酸间键不妨碍载体的转录或复制。
载体一旦并入到适当的宿主中，就将宿主保持在适于由并入的多核苷酸编码的本公开的CD3ε结合蛋白质的高水平表达的条件下。用于转化脊椎动物细胞的表达载体中的转录和翻译控制序列可由病毒源提供。示例性载体可如Okayama和Berg，3Mol.Cell.Biol.280(1983)所述进行构建。
本公开的载体也可含有一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)。IRES序列包含在融合载体中可能有利于增强一些蛋白质的表达。在其他实施方案中，载体系统将包括一个或多个聚腺苷酸化位点(例如，SV40)，这些位点可在任何上述核酸序列的上游或下游。载体组分可连续地连接，或以提供用于表达基因产物的最佳间距的方式(即通过在ORF之间引入“间隔区”核苷酸)排列，或以另一种方式定位。调控元件诸如IRES基序也可被布置成提供用于表达的最佳间距。
本公开的载体可以是圆形的或线性的。可将它们制备成包含在原核或真核宿主细胞中起作用的复制系统。复制系统可源自例如ColE1、SV40、2μ质粒、λ、牛乳头状瘤病毒等。
可将重组表达载体设计用于瞬时表达、用于稳定表达或用于两者。而且，可将重组表达载体制备用于组成型表达或用于诱导型表达。
另外，可以将重组表达载体制备成包括自杀基因。如本文所用，术语“自杀基因”是指导致表达自杀基因的细胞死亡的基因。自杀基因可以是赋予表达该基因的细胞对试剂例如药物敏感并且在细胞与试剂接触或暴露于试剂时导致细胞死亡的基因。自杀基因是本领域已知的，并且包括例如单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶和硝基还原酶。载体还可以包含选择标记，其是本领域熟知的。选择标记包括阳性和阴性选择标记。标记基因包括杀生物剂抗性(例如对抗生素、重金属等的抗性)、营养缺陷型宿主中提供原养型的互补作用等等。示例性标记基因包括抗生素抗性基因(例如新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因、青霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、组氨醇x抗性基因)、谷氨酰胺合酶基因、HSV-TK、用于更昔洛韦选择的HSV-TK衍生物或用于6-甲基嘌呤选择的细菌嘌呤核苷磷酸化酶基因(Gadi等人，7Gene Ther.1738-1743(2000))。编码选择标记或克隆位点的核酸序列可在编码感兴趣的多肽或克隆位点的核酸序列的上游或下游。
可使用的示例性载体为细菌：pBs、phagescript、PsiX174、pBluescriptSK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene,La Jolla,Calif.,USA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540和pRIT5(Pharmacia,Uppsala,Sweden)。真核：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)、pEE6.4(Lonza)和pEE12.4(Lonza)。另外的载体包括pUC系列(Fermentas Life Sciences,Glen Burnie,Md.)、pBluescript系列(Stratagene,LaJolla,Calif.)、pET系列(Novagen,Madison,Wis.)、pGEX系列(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)和pEX系列(Clontech,Palo Alto,Calif.)。可以使用噬菌体载体，诸如λGT10、λGT11、λEMBL4和λNM1149、λZapII(Stratagene)。示例性的植物表达载体包括pBI01、pBI01.2、pBI121、pBI101.3和pBIN19(Clontech)。示例性的动物表达载体包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。表达载体可以是病毒载体，例如逆转录病毒载体，例如γ逆转录病毒载体。
在其他实施方案中，该载体包含编码SEQ ID NO:23的VH的多核苷酸。
在其他实施方案中，该载体包含编码SEQ ID NO:24、27、28、29或30的VL的多核苷酸。
在其他实施方案中，该载体包含编码SEQ ID NO:24的VL的多核苷酸。
在其他实施方案中，该载体包含编码SEQ ID NO:27的VL的多核苷酸。
在其他实施方案中，该载体包含编码SEQ ID NO:28的VL的多核苷酸。
在其他实施方案中，该载体包含编码SEQ ID NO:29的VL的多核苷酸。
在其他实施方案中，该载体包含编码SEQ ID NO:30的VL的多核苷酸。
在其他实施方案中，该载体包含编码SEQ ID NO:23的VH以及SEQ ID NO:24、27、28、29或30的VL的多核苷酸。
在其他实施方案中，该载体包含编码以下的多核苷酸：
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:24的VL；
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:27的VL；
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:28的VL；
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:29的VL；或者
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:30的VL。
在其他实施方案中，该载体包含编码SEQ ID NO:65、66、67、68、69、70、71、72、73或74的多肽的多核苷酸。
在其他实施方案中，该载体包含编码SEQ ID NO:65的多肽的多核苷酸。
在其他实施方案中，该载体包含编码SEQ ID NO:66的多肽的多核苷酸。
在其他实施方案中，该载体包含编码SEQ ID NO:67的多肽的多核苷酸。
在其他实施方案中，该载体包含编码SEQ ID NO:68的多肽的多核苷酸。
在其他实施方案中，该载体包含编码SEQ ID NO:69的多肽的多核苷酸。
在其他实施方案中，该载体包含编码SEQ ID NO:70的多肽的多核苷酸。
在其他实施方案中，该载体包含编码SEQ ID NO:71的多肽的多核苷酸。
在其他实施方案中，该载体包含编码SEQ ID NO:72的多肽的多核苷酸。
在其他实施方案中，该载体包含编码SEQ ID NO:73的多肽的多核苷酸。
在其他实施方案中，该载体包含编码SEQ ID NO:74的多肽的多核苷酸。
本发明还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含本发明的一个或多个载体。“宿主细胞”是指已引入载体的细胞。应该理解，术语宿主细胞不仅旨在指特定的主体细胞，还指此类细胞的子代，并且也指特定主体细胞所产生的稳定细胞系。因为由于突变或者由于环境影响，在后代中可发生某些修饰，因此这种子代可与母体细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。此类宿主细胞可以是真核细胞、原核细胞、植物细胞或古菌细胞。原核宿主细胞的示例是大肠杆菌(Escherichia coli)、杆菌属(bacilli)(诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)(诸如沙门氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)))以及各种假单胞菌属(Pseudomonas)菌种。其他微生物诸如酵母也可用于表达。酵母属(Saccharomyces)(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae))和毕赤酵母是合适的酵母宿主细胞的示例。示例性真核细胞可以是哺乳动物、昆虫、禽类或其他动物来源。哺乳动物真核细胞包括永生细胞系，诸如杂交瘤或骨髓瘤细胞系，诸如SP2/0(美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas,VA,CRL-1581)、NS0(欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)，Salisbury,Wiltshire,UK,ECACC No.85110503)、FO(ATCC CRL-1646)和Ag653(ATCC CRL-1580)鼠科细胞系。一种示例性人骨髓瘤细胞系是U266(ATTC CRL-TIB-196)。其他可用的细胞系包括衍生自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的那些细胞系，诸如CHO-K1SV(LonzaBiologics,Walkersville,MD)、CHO-K1(ATCC CRL-61)或DG44。
本公开还提供了一种产生本公开的CD3ε结合蛋白的方法，该方法包括在使该CD3ε结合蛋白表达的条件下培养本公开的宿主细胞，以及回收由该宿主细胞产生的CD3ε结合蛋白。制备蛋白质和纯化蛋白质的方法是已知的。一旦被合成(以化学方式或重组方式)，就可根据标准程序纯化CD3ε结合蛋白，包括硫酸铵沉淀、亲和色谱柱、柱层析法、高效液相色谱(HPLC)纯化、凝胶电泳等等(一般参见Scopes，Protein Purification(Springer-Verlag,N.Y.,(1982))。受试者蛋白可以基本上是纯净的，例如，至少约80％至85％纯净、至少约85％至90％纯净、至少约90％至95％纯净、或者至少约98％至99％纯净，或者更加纯净，例如，不含污染物，诸如细胞碎片、除受试者蛋白之外的大分子等。
可以使用标准分子生物方法将编码本公开的CD3ε结合蛋白的多核苷酸并入到载体中。使用熟知的方法完成宿主细胞转化、培养、抗体表达和纯化。
经修饰的核苷酸可以用于生成本公开的多核苷酸。示例性的经修饰核苷酸是5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧羟甲基)尿嘧啶、羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、N6-取代的腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基喹啉、5″-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷、β-D-半乳糖基辫苷、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。
药物组合物/施用
本公开还提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本公开的CD3ε结合蛋白和药学上可接受的载体。
本公开还提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域和药学上可接受的载体。
本公开还提供了一种药物组合物，该药物组合物包含蛋白质和药学上可接受的载体，该蛋白质包含本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域。
本公开还提供了一种药物组合物，该药物组合物包含多特异性蛋白质和药学上可接受的载体，该多特异性蛋白质包含本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域。
本公开还提供了一种药物组合物，该药物组合物包含多特异性蛋白质和药学上可接受的载体，该多特异性蛋白质包含本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域和结合肿瘤抗原的抗原结合结构域。
就治疗性用途而言，可以药物组合物形式制备本公开的CD3ε结合蛋白，这些药物组合物含有有效量的抗体作为药学上可接受的载体中的活性成分。这些溶液是无菌的，并且通常不含颗粒物。它们可通过常规的公知灭菌技术(例如过滤)进行灭菌。这些组合物可含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，诸如pH调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。
如本文关于药物组合物所用的术语“药学上可接受的”，意味着由联邦或州政府的监管机构批准的或者在美国药典或其他公认的药典中列出的用于在动物和/或人类中使用的物质。
治疗方法和用途
本公开还提供了用于治疗的双特异性蛋白质或多特异性蛋白质，该双特异性蛋白质或多特异性蛋白质包含特异性结合CD3ε的第一抗原结合结构域和特异性结合本公开的第二抗原的第二抗原结合结构域。
本公开还提供了用于治疗细胞增殖性病症的双特异性蛋白质或多特异性蛋白质，该双特异性蛋白质或多特异性蛋白质包含特异性结合CD3ε的第一抗原结合结构域和特异性结合本公开的第二抗原的第二抗原结合结构域。
本公开还提供了用于治疗癌症的双特异性蛋白质或多特异性蛋白质，该双特异性蛋白质或多特异性蛋白质包含特异性结合CD3ε的第一抗原结合结构域和特异性结合本公开的第二抗原的第二抗原结合结构域。
本公开还提供了用于制备治疗癌症的药物的双特异性蛋白质或多特异性蛋白质，该双特异性蛋白质或多特异性蛋白质包含特异性结合CD3ε的第一抗原结合结构域和特异性结合本公开的第二抗原的第二抗原结合结构域。
在一个方面，本公开整体涉及对有发展癌症的风险的受试者的治疗。本发明还包括治疗以下恶性肿瘤：其中化学疗法和/或免疫疗法在受试者中导致显著的免疫抑制，从而增加了受试者发展癌症的风险。
本公开还提供了一种治疗有发展癌性病状的风险的受试者中的非癌性病状的方法，该方法包括向受试者施用本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域以治疗非癌性病状。
本公开还提供了一种治疗有发展癌性病状的风险的受试者中的非癌性病状的方法，该方法包括向受试者施用包含本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域的蛋白质以治疗非癌性病状。
本公开还提供了一种治疗有发展癌性病状的风险的受试者中的非癌性病状的方法，该方法包括向受试者施用包含本公开的结合CD3ε的抗原结合结构域的多特异性蛋白质以治疗非癌性病状。
本公开还提供了一种治疗有发展癌性病状的风险的受试者中的非癌性病状的方法，该方法包括向受试者施用本公开的免疫缀合物以治疗非癌性病状。
本公开还提供了一种治疗有发展癌性病状的风险的受试者中的非癌性病状的方法，该方法包括向受试者施用本公开的药物组合物以治疗非癌性病状。
本公开还提供了一种治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的包含结合CD3ε的抗原结合结构域的多特异性蛋白质以治疗癌症，其中该结合CD3ε的抗原结合结构域包含：
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:24的VL；
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:27的VL；
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:28的VL；
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:29的VL；或者
SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:30的VL。
本公开还提供了一种治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的包含结合CD3ε的抗原结合结构域的多特异性蛋白质以治疗癌症，其中该结合CD3ε的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:65、66、67、68、69、70、71、72、73或74的氨基酸序列。
本公开的另一个方面是一种治疗有需要的受试者中的细胞增殖性病症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的双特异性蛋白质或多特异性蛋白质，该双特异性蛋白质或多特异性蛋白质包含特异性结合CD3ε的第一抗原结合结构域和特异性结合本公开的第二抗原的第二抗原结合结构域。在其他实施方案中，向受试者施用包含特异性结合CD3ε的第一抗原结合结构域和特异性结合本公开的第二抗原的第二抗原结合结构域的双特异性蛋白质或多特异性蛋白质。
在任何前述用途或方法中，该细胞增殖性病症是癌症。在其他实施方案中，该癌症选自由以下项组成的组：食道癌、胃癌、小肠癌、大肠癌、结直肠癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、多发性骨髓瘤、肾癌、前列腺癌、肝癌、头颈癌、黑素瘤、卵巢癌、间皮瘤、胶质母细胞瘤、生发中心B细胞样(GCB)DLBCL、活化B细胞样(ABC)DLBCL、滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴性白血病(CLL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、小淋巴细胞白血病(SLL)、淋巴浆细胞性淋巴瘤(LL)、华氏巨球蛋白血症(WM)、中枢神经系统淋巴瘤(CNSL)、伯基特淋巴瘤(BL)、B细胞前淋巴细胞白血病、脾边缘区淋巴瘤、毛细胞白血病、脾淋巴瘤/白血病、未分类的脾弥漫性红髓小B细胞淋巴瘤、变异型毛细胞白血病、华氏巨球蛋白血症、重链疾病、浆细胞骨髓瘤、骨孤立性浆细胞瘤、骨外浆细胞瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴结外边缘区淋巴瘤(MALT淋巴瘤)、淋巴结边缘区淋巴瘤、儿童结内边缘区淋巴瘤、儿童滤泡性淋巴瘤、原发性皮肤滤泡中心淋巴瘤、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统DLBCL、原发性皮肤DLBCL-腿型、老年人EBV阳性DLBCL、慢性炎症相关性DLBCL、淋巴瘤样肉芽肿病、原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤。血管内大B细胞淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、HHV8相关多中心性Castleman病引起的大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤：特征介于弥漫性大B细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤之间的未分类B细胞淋巴瘤，以及特征介于弥漫性大B细胞淋巴瘤、经典霍奇金淋巴瘤和轻链淀粉样变性之间的未分类B细胞淋巴瘤。
在其他实施方案中，该癌症是食道癌。在其他实施方案中，该癌症是腺癌，例如转移性腺癌(例如，结直肠腺癌、胃腺癌或胰腺癌)。
在另一方面，本公开的特征在于一种试剂盒，该试剂盒包含：(a)包含前述双特异性蛋白质或多特异性蛋白质中的任一者的组合物，该双特异性蛋白质或多特异性蛋白质包含特异性结合CD3ε的第一抗原结合结构域和特异性结合本公开的第二抗原的第二抗原结合结构域，以及(b)包装说明书，该包装说明书包括用于将组合物施用于受试者以治疗细胞增殖性病症或延缓细胞增殖性病症进展的使用说明。
在任何前述用途或方法中，该受试者可以是人。
联合疗法
本公开的CD3ε结合蛋白可以与至少一种附加治疗剂组合施用。
在其他实施方案中，一种治疗的递送在第二种治疗的递送开始时仍在进行，使得在施用方面存在重叠。这在本文中有时称为“同时”或“同时递送”。在其他实施方案中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一种情况的一些实施方案中，由于组合施用，治疗更有效。例如，与在不存在第一种治疗的情况下施用第二种治疗时、或者在使用第一种治疗时观察到的类似情况相比，第二治疗更有效，例如，在使用较少的第二种治疗时观察到等同的效果，或者第二种治疗更大程度地减轻了症状。在其他实施方案中，递送使得症状减轻或与病症相关的其他参数减小的程度大于在递送一种治疗而不存在另一种治疗的情况下将观察到的减轻或减小的程度。所述递送可以使得递送的第一种治疗的效果在递送第二种治疗时仍然是可检测的。
本文所述的CD3ε结合蛋白和至少一种附加治疗剂可以同时施用、在相同或分开的组合物中施用，或依次施用。对于依次施用，可以首先施用本文所述的CD3ε结合蛋白，其次可以施用附加的药剂，或者可以颠倒施用次序。
实施方案：
本发明提供了以下非限制性实施方案。
1.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含结合分化簇3ε(CD3ε)的抗原结合结构域，其中该结合CD3ε的抗原结合结构域包含：
a.SEQ ID NO:23的重链可变区(VH)的重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:24的轻链可变区(VL)的轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3；
b.SEQ ID NO:23的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:27的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
c.SEQ ID NO:23的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:28的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
d.SEQ ID NO:23的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:29的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者
e.SEQ ID NO:23的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:30的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
2.根据实施方案1所述的分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：
a.分别为SEQ ID NO:6、7、8、9、10和11；
b.分别为SEQ ID NO:12、13、14、15、16和17；或者
c.分别为SEQ ID NO:18、19、20、21、16和22。
3.根据实施方案1或2所述的分离的蛋白质，其中该结合CD3ε的抗原结合结构域是scFv、(scFv)2、Fv、Fab、F(ab')2、Fd、dAb或VHH。
4.根据实施方案3所述的分离的蛋白质，其中该结合CD3ε的抗原结合结构域是Fab。
5.根据实施方案3所述的分离的蛋白质，其中该结合CD3ε的抗原结合结构域是VHH。
6.根据实施方案3所述的分离的蛋白质，其中该结合CD3ε的抗原结合结构域是scFv。
7.根据实施方案6所述的分离的蛋白质，其中该scFv从N端到C端包含VH、第一接头(L1)和VL(VH-L1-VL)或者包含该VL、该L1和该VH(VL-L1-VH)。
8.根据实施方案7所述的分离的蛋白质，其中该L1包含：
a.约5至50个氨基酸；
b.约5至40个氨基酸；
c.约10至30个氨基酸；或者
d.约10至20个氨基酸。
9.根据实施方案7所述的分离的蛋白质，其中该L1包含SEQ ID NO:31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63或64的氨基酸序列。
10.根据实施方案9所述的分离的蛋白质，其中该L1包含SEQ ID NO:31、37或64的氨基酸序列。
11.根据实施方案1至10中任一项所述的分离的蛋白质，其中该结合CD3ε的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:23的VH以及SEQ ID NO:24、27、28、29或30的VL。
12.根据实施方案11所述的分离的蛋白质，其中该结合CD3ε的抗原
结合结构域包含：
a.SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:24的VL；
b.SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:27的VL；
c.SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:28的VL；
d.SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:29的VL；或者
e.SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:30的VL。
13.根据实施方案1至12中任一项所述的分离的蛋白质，其中该结合CD3ε的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:65、66、67、68、69、70、71、72、73或74的氨基酸序列。
14.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含结合CD3ε的抗原结合结构域，其中该结合CD3ε的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:23的重链可变区(VH)和SEQ ID NO:103的轻链可变区(VL)。
15.根据实施方案14所述的分离的蛋白质，其中该结合CD3ε的抗原结合结构域是scFv、(scFv)2、Fv、Fab、F(ab')2、Fd、dAb或VHH。
16.根据实施方案15所述的分离的蛋白质，其中该结合CD3ε的抗原结合结构域是Fab。
17.根据实施方案15所述的分离的蛋白质，其中该结合CD3ε的抗原结合结构域是VHH。
18.根据实施方案15所述的分离的蛋白质，其中该结合CD3ε的抗原结合结构域是scFv。
19.根据实施方案18所述的分离的蛋白质，其中该scFv从N端到C端包含VH、第一接头(L1)和VL(VH-L1-VL)或者包含该VL、该L1和该VH(VL-L1-VH)。
20.根据实施方案19所述的分离的蛋白质，其中该L1包含：
a.约5至50个氨基酸；
b.约5至40个氨基酸；
c.约10至30个氨基酸；或者
d.约10至20个氨基酸。
21.根据实施方案20所述的分离的蛋白质，其中该L1包含SEQ ID NO:31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63或64的氨基酸序列。
22.根据实施方案21所述的分离的蛋白质，其中该L1包含SEQ ID NO:31、37或64的氨基酸序列。
23.根据实施方案14至22所述的分离的蛋白质，其中该结合CD3ε的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:23的VH以及SEQ ID NO:24、27、28、29或30的VL。
24.根据实施方案23所述的分离的蛋白质，其中该结合CD3ε的抗原结合结构域包含：
a.SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:24的VL；
b.SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:27的VL；
c.SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:28的VL；
d.SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:29的VL；或者
e.SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:30的VL。
25.根据实施方案1至24中任一项所述的分离的蛋白质，其中该分离的蛋白质是多特异性蛋白质。
26.根据实施方案25所述的分离的蛋白质，其中该多特异性蛋白质是双特异性蛋白质。
27.根据实施方案25所述的分离的蛋白质，其中该多特异性蛋白质是三特异性蛋白质。
28.根据实施方案1至27中任一项所述的分离的蛋白质，该分离的蛋白质还包含免疫球蛋白(Ig)恒定区或该Ig恒定区的片段。
29.根据实施方案28所述的分离的蛋白质，其中该Ig恒定区的该片段包含Fc区。
30.根据实施方案28所述的分离的蛋白质，其中该Ig恒定区的该片段包含CH2结构域。
31.根据实施方案28所述的分离的蛋白质，其中该Ig恒定区的该片段包含CH3结构域。
32.根据实施方案28所述的分离的蛋白质，其中该Ig恒定区的该片段包含该CH2结构域和该CH3结构域。
33.根据实施方案28所述的分离的蛋白质，其中该Ig恒定区的该片段包含铰链的至少一部分、该CH2结构域和该CH3结构域。
34.根据实施方案28所述的分离的蛋白质，其中该Ig恒定区的该片段包含铰链、该CH2结构域和该CH3结构域。
35.根据实施方案28至34中任一项所述的分离的蛋白质，其中该结合CD3ε的抗原结合结构域缀合至该Ig恒定区或该Ig恒定区的该片段的N端。
36.根据实施方案28至34中任一项所述的分离的蛋白质，其中该结合CD3ε的抗原结合结构域缀合至该Ig恒定区或该Ig恒定区的该片段的C端。
37.根据实施方案28至36中任一项所述的分离的蛋白质，其中该结合CD3ε的抗原结合结构域经由第二接头(L2)缀合至该Ig恒定区或该Ig恒定区的该片段。
38.根据实施方案37所述的分离的蛋白质，其中该L2包含SEQ IDNO:31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63或64的氨基酸序列。
39.根据实施方案28至38中任一项所述的分离的蛋白质，其中该多特异性蛋白质包含结合除CD3ε以外的抗原的抗原结合结构域。
40.根据实施方案39所述的多特异性抗体，其中该细胞抗原是肿瘤相关抗原。
41.根据实施方案39至40中任一项所述的多特异性抗体，其中该细胞抗原选自由以下项组成的组：激肽释放酶相关肽酶2(hK2)、人白细胞抗原G(HLA-G)和δ样蛋白3(DLL3)。
42.根据实施方案28至41中任一项所述的分离的蛋白质，其中该Ig恒定区或该Ig恒定区的该片段是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
43.根据实施方案28至42中任一项所述的分离的蛋白质，其中该Ig恒定区或该Ig恒定区的该片段包含导致该蛋白质与Fcγ受体(FcγR)的结合减少的至少一个突变。
44.根据实施方案43所述的分离的蛋白质，其中导致该蛋白质与该FcγR的结合减少的该至少一个突变选自由以下项组成的组：F234A/L235A、L234A/L235A、L234A/L235A/D265S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、F234A/L235A、S228P/F234A/L235A、N297A、V234A/G237A、K214T/E233P/L234V/L235A/G236-缺失/A327G/P331A/D365E/L358M、H268Q/V309L/A330S/P331S、S267E/L328F、L234F/L235E/D265A、L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、S228P/F234A/L235A/G237A/P238S和S228P/F234A/L235A/G236-缺失/G237A/P238S，其中根据EU索引进行残基编号。
45.根据实施方案28至42中任一项所述的分离的蛋白质，其中该Ig恒定区或该Ig恒定区的该片段包含导致该蛋白质与该FcγR的结合增强的至少一个突变。
46.根据实施方案45所述的分离的蛋白质，其中导致该蛋白质与该FcγR的结合增强的该至少一个突变选自由以下项组成的组：S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L和G236A/S239D/I332E，其中根据EU索引进行残基编号。
47.根据实施方案43至46中任一项所述的分离的蛋白质，其中该FcγR是FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB或FcγRIII或它们的任何组合。
48.根据实施方案28至47中任一项所述的分离的蛋白质，其中该Ig恒定区或该Ig恒定区的该片段包含调节该蛋白质的半衰期的至少一个突变。
49.根据实施方案48所述的分离的蛋白质，其中调节该蛋白质的该半衰期的该至少一个突变选自由以下项组成的组：H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A和H435R，其中根据EU索引进行残基编号。
50.根据实施方案28至49中任一项所述的分离的蛋白质，其中该蛋白质在该Ig恒定区的CH3结构域中包含至少一个突变。
51.根据实施方案40所述的分离的蛋白质，其中该Ig恒定区的该CH3结构域中的该至少一个突变选自由以下项组成的组：T350V、L351Y、F405A、Y407V、T366Y、T366W、T366L、F405W、K392L、T394W、T394S、Y407T、Y407A、T366S/L368A/Y407V、L351Y/F405A/Y407V、T366I/K392M/T394W、F405A/Y407V、T366L/K392M/T394W、T366L/K392L/T394W、L351Y/Y407A、T366A/K409F、L351Y/Y407A、L351Y/Y407V、T366V/K409F、T366A/K409F、T350V/L351Y/F405A/Y407V和T350V/T366L/K392L/T394W，其中根据EU索引进行残基编号。
52.一种药物组合物，该药物组合物包含根据实施方案1至51中任一项所述的分离的蛋白质以及药学上可接受的载体。
53.一种多核苷酸，该多核苷酸编码根据实施方案1至51中任一项所述的分离的蛋白质。
54.一种载体，该载体包含根据实施方案53所述的多核苷酸。
55.一种宿主细胞，该宿主细胞包含根据实施方案54所述的载体。
56.一种产生根据实施方案1至51中任一项所述的分离的蛋白质的方法，该方法包括：在使该蛋白质表达的条件下培养根据实施方案55所述的宿主细胞，以及回收由该宿主细胞产生的蛋白质。
57.一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据实施方案1至51中任一项所述的分离的抗体以治疗该癌症。
58.根据实施方案57所述的方法，其中该癌症是实体瘤或血液系统恶性肿瘤。
59.根据实施方案58所述的方法，其中该实体瘤是前列腺癌、结直肠癌、胃癌、肾透明细胞癌、膀胱癌、肺癌、鳞状细胞癌、胶质瘤、乳腺癌、肾脏癌、新生血管疾病、肾透明细胞癌(CCRCC)、胰腺癌、肾癌、尿道上皮癌或肝脏转移性腺癌。
60.根据实施方案58所述的方法，其中该血液系统恶性肿瘤是急性髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性髓性白血病(CML)或母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤(DPDCN)。
61.根据实施方案57至60中任一项所述的方法，其中该抗体与第二治疗剂联合施用。
62.一种抗独特型抗体，该抗独特型抗体与根据实施方案1至51中任一项所述的分离的蛋白质结合。
63.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含与CD3ε(SEQ ID NO:1)上的表位结合的抗原结合结构域，其中该表位是包含SEQ ID NO:100、101和102的氨基酸序列的不连续表位。
64.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:75、76、717、718、79、80、81、82、83和84。
65.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:747、748、77、78、749、750、751、752、753和754。
66.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列。
67.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列。
68.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:717的氨基酸序列。
69.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:718的氨基酸序列。
70.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列。
71.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列。
72.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列。
73.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列。
74.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列。
75.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列。
76.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:747的氨基酸序列。
77.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:748的氨基酸序列。
78.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。
79.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列。
80.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:749的氨基酸序列。
81.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:750的氨基酸序列。
82.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:751的氨基酸序列。
83.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:752的氨基酸序列。
84.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:753的氨基酸序列。
85.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:754的氨基酸序列。
86.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:85和86的氨基酸序列。
87.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:85和88的氨基酸序列。
88.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:85和90的氨基酸序列。
89.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:85和92的氨基酸序列。
90.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:85和94的氨基酸序列。
91.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:719和86的氨基酸序列。
92.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:719和88的氨基酸序列。
93.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:719和90的氨基酸序列。
94.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:719和92的氨基酸序列。
95.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质包含SEQ ID NO:719和94的氨基酸序列。
提供以下实施例以进一步描述本文所公开的实施方案中的一些。这些实施例旨在说明而非限制本发明所公开的实施方案。
实施例
实施例1.抗CD3 mAb的生成和表征
使用
Figure BDA0003963650430000921
转基因小鼠平台生成抗CD3抗体。/>
Figure BDA0003963650430000922
小鼠生成具有与人CH1和CL结构域连接的人可变结构域、嵌合人/小鼠铰链区和小鼠Fc区的抗体。称为/>
Figure BDA0003963650430000931
κ小鼠和λ小鼠品系的两个特定品系缺乏特定的小鼠序列，并且描述于WO11/123708和WO2003000737中。
用TRCW5(SEQ ID NO:3)对Ablexis小鼠(包括13只κ小鼠和12只λ小鼠)进行免疫。TRCW5由CD3δ的胞外区通过26个氨基酸接头融合到CD3ε的胞外区而组成，如Kim等人,JMB(2000)302(4):899-916所报道的。该多肽在其C末端具有人IgG1 Fc结构域，其具有用于位点特异性生物素化的C末端Avi标签(Fairhead和Howarth,Methods Mol Biol(2015)；1266:171-184)。
TRCW5(SEQ ID NO:3)：
FKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMGSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGSDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVSPPSPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGLNDIFEAQKIEWHE
小鼠每周两次免疫，持续7周。在第42天，小鼠通过遍布8个位点施用50μg TRCW5和50μg CD40 mAb，包括6次皮下注射和2次皮内注射而加强以进行杂交瘤细胞融合。对于最终加强，小鼠接受20μL的4.74×107个细胞/mL的Jurkat细胞注射，Jurkat细胞是内源性表达T细胞受体复合物(包括CD3ε(Schneider等人(1977)Int.J.Cancer,19(5):621-6))的T细胞系。
从小鼠中提取淋巴结和脾脏并按队列进行融合。对淋巴结细胞进行计数并以1:1的比率与FO骨髓瘤细胞(ATCC(CRL-1646))合并，并在抗体筛选之前在37℃下温育10天。然后使用非特异性固定在板上的TRCW5(ELISA，Thermo目录号34022)或通过链霉亲和素与生物素化TRCW5(SPARCL ELISA，Lumigen)的缀合，根据制造商的说明通过ELISA测定杂交瘤融合细胞的上清液与TRCW5的结合。通过用0.5ug/mL TRCW5和0.5ug/mL HVEM-Fc(R&D目录号365-HV)在4℃下将板包被过夜进行ELISA测定。在4℃下，通过在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中添加0.4％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)将板封闭过夜。将板用补充有0.02％(v/v)吐温20 的1XPBS洗涤。向每个孔中施加50uL杂交瘤细胞上清液并在室温下温育1小时。通过添加在封闭缓冲液中1:10,000稀释的与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG Fc(Jackson目录号115-036-071)，在封闭缓冲液中以1:10,000稀释，随后在室温下温育30min来检测结合的抗体。以25μL/孔添加3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物缓冲液(Thermo目录号34022)并于暗处温育10min。通过添加25uL/孔的4M H2SO4终止反应。使用
Figure BDA0003963650430000941
Epoch2酶标仪在450nm下读取发光。选择具有为背景的至少3倍的信号的命中。
两种测定格式产生426个命中(来自ELISA的264个命中，来自SPARCL ELISA的194个命中，在两项测定中鉴定70个命中)。在这426个初始命中中，确认49个ELISA命中和32个SPARCL ELISA命中。将对应于阳性结合剂的杂交瘤融合物重新加料并使用流式细胞术测试其结合Jurkat细胞的能力。结果表明，基于平均荧光指数(MFI，参见表4)，包括克隆003_F12、克隆036_E10和克隆065_D03在内的三种抗体显示出与内源性表达CD3的Jurkat细胞显著结合。虽然通过ELISA确认克隆003_F12和036_E10(来自人κ小鼠)对于人κ轻链呈阳性，但是克隆065_D03(来自人λ小鼠)对于人λ呈阴性。然后对这三个克隆的可变基因进行测序。
表4.所选克隆与Jurkat细胞结合的平均荧光指数(MFI)
克隆ID MFI(任意单位)
003_F12 176147
036_E10 43133
065_D03 136269
无Ab 2075.61
10nM UCHT1 89214.29
接下来，针对结合原代人T细胞和食蟹猴T细胞的能力对这三个克隆进行筛选。简言之，将原代人T细胞和食蟹猴pan T细胞以1×106个细胞/mL重悬于流动染色缓冲液中并以50,000个细胞/孔接种细胞。向每个孔中添加50μL杂交瘤细胞上清液，并将混合物在冰上温育30min。温育后，添加200μL染色缓冲液并且通过300×g离心5min使细胞沉淀。将缀合至Alexa-647的抗小鼠IgG以2μg/mL添加到染色缓冲液中，总体积为50μL并且在冰上温育30min。添加150μL染色缓冲液并且通过300×g离心5min使细胞沉淀。将细胞重悬于30μL含有1:1,000稀释的Sytox绿色死细胞染剂的运行缓冲液中并且在iQue Screener上运行。在FCS对比SCS上对细胞进行门控以消除碎片。在SCS-A对比SCS-H上对单峰进行门控，并且使用对于Sytox绿为低阴性的BL1通道从单峰群体中选择活细胞。通过将测试品与阴性对照比较，通过RL1(Alexa-647)几何平均值来评估CD3结合。在该测定法中，克隆065_D03显示最高的细胞结合信号(图1A至图1B)。
因此，将克隆065_D03的可变区克隆到IgG1主链中，产生称为CD3B815的抗体(序列示于表5中)。再次针对与Jurkat细胞的结合筛选CD3B815并且显示出与Jurkat细胞的阳性结合。
表5.CD3B815氨基酸序列
Figure BDA0003963650430000951
CD3结合结构域的人源化和scFv格式化
CD3B815的v区的轻链(LC)以scFv格式人源化。简言之，将来自CD3B815的LC接枝到人IGHV3-21*04种系上，并且鉴定出人到小鼠回复突变的两个位置(Y49K和L78V，根据Kabat编号系统)。这样产生具有Y49K、L78V或Y49K和L78V两者的变体。来自CD3B815的LC还含有NS基序，该基序呈现在位置92-93处脱酰胺的风险。因此，生成的若干变体还含有N92G。这些变体和相关突变描述于表6中，并且VH和VL的氨基酸和核酸序列示于表7和表8中。CDR序列示于表9至表11中。
表6.根据Kabat编号系统定义的人源化scFv变体中的突变。
scFv鉴定 描述 VL突变
CD3W234 CD3B815-HL-scFV含有小鼠VL 无
CD3W238 CD3B815的CDR接枝到IGKV1D-39*01中 无
CD3W241 CD3B815的CDR接枝到IGKV1D-39*01中 L78V
CD3W242 CD3B815的CDR接枝到IGKV1D-39*01中 Y49K
CD3W243 CD3B815的CDR接枝到IGKV1D-39*01中 Y49K、L78V
CD3W244 CD3B815的CDR接枝到IGKV1D-39*01中 L78V、N92G
CD3W245 CD3B815的CDR接枝到IGKV1D-39*01中 Y49K、N92G
CD3W246 CD3B815的CDR接枝到IGKV1D-39*01中 Y49K、L78V、N92G
CD3W247 CD3B815的CDR接枝到IGKV1D-39*01中 N92G
CD3W248 CD3B815-HL-scFV含有小鼠VL N92G
表7.人源化scFv变体的VH和VL氨基酸序列。
Figure BDA0003963650430000961
Figure BDA0003963650430000971
表8.人源化scFv变体的VH和VL核酸序列。
Figure BDA0003963650430000972
/>
Figure BDA0003963650430000981
/>
Figure BDA0003963650430000991
/>
Figure BDA0003963650430001001
表9.使用Kabat定义测定CDR序列。
Figure BDA0003963650430001002
Figure BDA0003963650430001011
/>
表10.使用Chothia定义测定CDR序列。
Figure BDA0003963650430001012
表11.使用IMGT定义测定CDR序列。
Figure BDA0003963650430001013
Figure BDA0003963650430001021
图3示出了CD3B815、CD3W244、CD3W245、CD3W246和CD3W247的VL区的比对。针对VL区测定SEQ ID NO:103的共有氨基酸序列，并且CDR残基带下划线。
SEQ ID NO:103
DIQX1TQSPX2X3LSX4SX5GX6RVX7X8X9 CRARQSIGTAIHWYQQKX10X11X12X13PX14LLIX15 YASESISGX16PSRFSGSGSGTDFTLTIX17SX18QX19EDX20AX21YYCQQSX22SWPYTFGX23GTKLEIK
其中，X1是L或M；X2是G或S；X3是I或S；X4是V或A；X5是P或V；X6是E或D；X7是S或T；X8是F或I；X9是S或T；X10是T或P；X11是N或G；X12是G或K；X13是S或A；X14是R或K；X15是K或Y；X16是I或V；X17是N或S；X18是V或L；X19是S或P；X20是I或F；X21是D或T；X22是N或G；或者X23是G或Q。
在热休克后人源化抗CD3 scFv变体与CD3的结合。
接下来使用接头GTEGKSSGSGSESKST(SEQ ID No:64)(表12)将来自CD3B815的可变区格式化为VH-VL取向的scFv，用于在大肠杆菌中表达，然后筛选与重组CD3(CD3W147，SEQID NO:4)的结合、与T细胞的结合和热稳定性。
表12.scFv-HL-大肠杆菌氨基酸序列。
Figure BDA0003963650430001022
/>
Figure BDA0003963650430001031
CD3W147(SEQ ID NO:4)：
QDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVGSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGSQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMGSGSLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTFPPSQEEMTKNQVSLRCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTKPVLDSDGSFRLESRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSGGHHHHHH
测定了在大肠杆菌中表达的抗CD3 scFv变体(表7)与CD3的结合。简言之，将scFv编码序列克隆到具有用于分泌的PelB前导序列的pADLTM-22c载体(Antibody Design Labs，San Diego，CA)中。用质粒转化大肠杆菌细胞，并使其在补充有100μg/mL羧苄青霉素的2xYT微生物生长培养基中于37℃生长过夜。过夜培养物用于接种5mL表达培养物，并在37℃生长直至OD600为约2.0。通过添加1mM IPTG诱导蛋白质表达，并使培养物生长过夜。表达后，通过2,200×g离心5min使细胞沉淀并收集上清液并且通过ELISA分析直接测试。
对于ELISA分析，将生物素化CD3W147(同源二聚体CD3εγ-Fc，SEQ ID NO:4)以0.039ug/mL至2.5ug/mL的浓度范围经2倍稀释固定在板上，随后在室温下温育45min。用补充有3％乳的1X PBS-Tween封闭板。用1XPBS-Tween洗涤板。将大肠杆菌上清液加热至60℃，然后冷却至室温以评估它们的热稳定性。将上清液添加到每个板中，并在室温下温育45min。使用1:1,000稀释的鸡抗-HA-辣根过氧化物酶以50μL/孔来检测结合的scFv，然后用化学发光亚态(Sigma目录号11582950001)检测。所有测试的scFv分子源自CD3B815结合的CD3ε(图2)。
然后使用流式细胞术测试scFv分子结合T细胞的能力。简言之，将人T细胞解冻并以1×10^6个细胞/mL重悬于流动染色缓冲液中并以50,000个细胞/孔接种。阳性对照CD3W36由格式化为LH-scFv的抗CD3抗体SP34组成，并且阴性对照B23(靶向针对来自呼吸道合胞病毒的F-糖蛋白的scFv)用于比较结合。以150μL/孔添加大肠杆菌上清液并且在4℃下温育1小时。温育后，将板用染色缓冲液洗涤并且用在染色缓冲液中以1:100稀释的缀合至Alexa-647的抗His抗体进行检测，其中在4℃下温育30min。温育后，将200μL的IntelliCyt运行缓冲液添加到混合物中，并将细胞重悬于30μL含有1:1,000Sytox绿色死细胞染剂的运行缓冲液中并且在iQue筛选仪上进行分析。如上所述进行门控和分析。所有源自CD3B815的scFv分子显示出与T细胞结合一致的平均荧光指数(表13)。
表13.人源化scFv分子的基于T细胞的结合。
蛋白质 MFI(n＝2)
CD3W245-HL-大肠杆菌 178140.0
CD3W244-HL-大肠杆菌 165631.0
CD3W246-HL-大肠杆菌 153895.8
CD3W238-HL-大肠杆菌 137380.4
CD3W242-HL-大肠杆菌 126105.9
CD3W243-HL-大肠杆菌 111347.6
CD3W241-HL-大肠杆菌 120793.8
CD3W247-HL-大肠杆菌 110932.3
CD3W248-HL-大肠杆菌 60437.1
CD3W234-HL-大肠杆菌 66790.3
B23 51.8
CD3W36 99451.6
表位鉴定
通过氢-氘交换质谱法(HDX-MS)确定CD3上的表位。抗体克隆OKT3用作HDX实验的对照，因为它在CD3ε上的表位从晶体结构(PDB ID 1SY6)(Kjer-Nielsen,L.等人；ProcNatl Acad Sci U S A.101,7675-7680)中已知。
HDX-MS的交换实验.通过在含或不含1.2摩尔过量的配体和30μL的H2O或氘化缓冲液(20mM MES、pH 6.4、150mM NaCl的95％D2O溶液或20mM Tris、pH 8.4、150mM NaCl的95％D2O溶液)的情况下，将10μL的10μM CD3W220(SEQ ID NO:5)(由与融合到血清白蛋白结构域上的26-aa接头区融合的CD3εγ组成)混合来引发交换反应。将反应混合物在1.2℃下温育15秒、50秒、150秒、500秒或1,500秒。通过添加冷却的40μL 8M尿素、1M TCEP(pH 3.0)淬灭经交换的溶液并立即进行分析。
CD3W220(CD3εγ-HSA-6xHis)(SEQ ID NO:5)：QDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVGSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGSQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGSHHHHHHHH
HDX-MS数据采集的一般程序。用自动化HDx系统(LEAP Technologies,Morrisville,NC)进行HDX-MS样品制备。柱和泵为；蛋白酶，XIII型蛋白酶(来自佐氏曲霉的蛋白酶，XIII型)/胃蛋白酶柱(w/w，1:1；2.1mm×30mm)(NovaBioAssays Inc.,Woburn,MA)；阱柱，ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard前置柱(2.1mm×5mm)(Waters,Milford,MA)；分析柱，Accucore C18(2.1mm×100mm)(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)；和LC泵，VH-P10-A(Thermo Fisher Scientific)。将装载泵(从蛋白酶柱到阱柱)设置为600μL/min，具有99％水、1％乙腈、0.1％甲酸。将梯度泵(从阱柱到分析柱)设置为在20min内以100μL/min在0.1％甲酸水溶液中从8％到28％乙腈。
MS数据采集。使用LTQTM Orbitrap Fusion Lumos质谱仪(Thermo FisherScientific)进行质谱分析，其中毛细管温度为275℃、分辨率为150,000并且质量范围(m/z)为300至1,800。
HDX-MS数据提取.使用BioPharma Finder 3.0(Thermo Fisher Scientific)在HDX实验之前进行非氘化样品的肽鉴定。使用HDExaminer 2.5版(Sierra Analytics,Modesto,CA)从HDX实验的MS原始数据文件中提取质心值。
HDX-MS数据分析.在Excel中进一步分析提取的HDX-MS数据。所有交换时间点(在pH 6.4或pH 8.4下在1.2℃下)转化为在pH 7.4和23℃下的等效时间点(例如，在pH 6.4下在1.2℃下的15秒等效于在pH 7.4下在23℃下的0.15秒；表14)。
表14.HDX反应条件和交换时间对比校正为pH7.4和23℃的交换时间。
Figure BDA0003963650430001071
结果.温育KLCB91(包含作为抗CD3臂(描述于实施例3中)的CD3W245的双特异性抗体)与重组CD3εδ(SEQ ID NO:5)在抗原的特定片段处产生不同的整体保护模式以及保护程度。KLCB91和OKT3两者均保护表示构象不相同的表位的非连续片段(图4)。将受到保护的片段定位到CD3ε的晶体结构(PDB 1SY6)上以三维可视化结合表位。
与结合到CD3ε的OKT3的晶体结构(Uniprot ID P07766)一致，发现OKT3的表位由覆盖CD3ε(SEQ ID NO:5和图4)的跨越残基29-37、79-84和87-89的肽组成。CD3W245结合到与OKT3部分重叠的表位，并且包括CD3ε(SEQ ID NO:5和图4)的氨基酸残基29-37(PQYPGSEIL，SEQ ID NO:100)、55-63(GSDEDHLSL，SEQ ID NO:101)和79-84(PRGSKP，SEQ IDNO:102)。
实施例2.抗激肽释放酶相关肽酶2(hK2)抗体和scFv的生成
从亲本m11B6抗体人源化生成抗体。
亲本小鼠抗激肽释放酶相关肽酶2(hK2)抗体m11B6已经描述于
Figure BDA0003963650430001081
等人(Clinical Chemistry 50:9,1607–1617(2004))中。人源化11B6(本文中称为hu11B6)已经生成并且描述于美国专利号9,345,782和美国专利号10,100,125中。
启动hu11B6的工程化以生成具有改善特性(诸如改善的热稳定性)的另外的抗HK2抗体。鉴定hu11B6框架中可以潜在地使用建模来改变以改善hu11B6的热稳定性的残基位置。所鉴定的位置是VH中的残基P41、I49、M70和A88以及VL中的残基S80、L82、A88和Y91(根据SEQ ID NO:124的hu11B6_VH和SEQ ID NO:125的hu11B6_VL的氨基酸序列进行残基编号)。
以VH-接头-VL的取向生成二元组合scFv文库，其中可变区中的一个可变区表示组合文库，第二个可变区是亲本hu11B6 VH或VL。使用GGSEGKSSGSGSESKSTGGS(SEQ ID NO:31)的接头序列来缀合VH/VL区。使工程化scFv在大肠杆菌(E.coli)中表达并且通过ELISA测试上清液中产生的scFv与人hK2的结合，并且与hu11B6的结合进行比较。将表现出与hu11B6的结合相当的结合的任何新变体合并，并在55℃、60℃和65℃将上清液温育10分钟后进一步测试与人hK2的结合。在55℃、60℃和65℃温育后保持与hu11B6相当的结合并且提高热稳定性的分子以两个取向(VH-接头-VL；VL-接头-VH)矩阵化并且转化为哺乳动物scFv以进一步表征。
另外，亲本小鼠11B6的另一种人源化按照Singh等人(MAbs.2015年，7(4):778-91)概述的方法进行，对变体进行广泛的种系变异和仔细筛选以获得增强的热稳定性。基于序列保守，选择人重链种系IGHV4-30和轻链种系IGKV3D-11用于框架适应。用包含所选组的体细胞超突变位点和小鼠/人种系变异的残基构建二元scFv文库。如上所述克隆变体并在大肠杆菌中表达。在单点ELISA中在不同温度下筛选上清液，以获得增强的热稳定性。将小鼠/人嵌合11B6 scFv用作亲本对照。将保持与鼠11B6相似的结合活性并且Tm值为67℃的克隆KL2B359转化为scFv-Fc以进行另外的分析。通过SPR测量的KL2B359对hK2的亲和力(KD)为约0.7nM至1nM。还由该活动产生HCF3-LCD6、HCG5-LCB7、KL2B357、KL2B358和KL2B360并且进一步表征其功能性。
使用表达人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠
Figure BDA0003963650430001091
和转基因大鼠
Figure BDA0003963650430001092
生成抗体。
Figure BDA0003963650430001093
含有嵌合人/大鼠IgH基因座(包含22个人VH，以天然构型连接至大鼠CH基因座的全部的人D片段和人JH片段)连同完全人IgL基因座(连接至Jκ-Cκ的12个Vκ和连接至Jλ-Cλ的16个Vλ)。(参见例如Osborn等人，(2013)J Immunol 190(4):1481-1490)。因此，大鼠表现出大鼠免疫球蛋白的表达降低，并且响应于免疫，引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以生成具有完全人可变区的高亲和力嵌合人/大鼠IgG单克隆抗体。/>
Figure BDA0003963650430001094
的制备和用途以及由这些大鼠携带的基因组修饰描述于WO14/093908中。
用可溶性全长KLK2蛋白质(人激肽释放酶-2 6-His蛋白质)对
Figure BDA0003963650430001095
小鼠(描述于实施例1中)和/>
Figure BDA0003963650430001096
大鼠进行免疫。
人激肽释放酶-2 6-His蛋白质(SEQ ID NO:355)：
VPLIEGRIVGGWECEKHSQPWQVAVYSHGWAHCGGVLVHPQWVLTAAHCLKKNSQVWLGRHNLFEPEDTGQRVPVSHSFPHPLYNMSLLKHQSLRPDEDSSHDLMLLRLSEPAKITDVVKVLGLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLRPRSLQCVSLHYSEKVTEFMLCAGLWTGGKDTCGGDSGGPLVCNGVLQGITSWGPEPCALPEKPAVYTKVVHYRKWIKDTIAANPHHHHHH
从淋巴结中提取Ablexis小鼠和OniRat大鼠的淋巴细胞并按队列进行融合。合并细胞并针对CD138表达进行分选。使用可溶性hK2抗原以高通量微型化MSD格式进行杂交瘤筛选。将大约>300份样品鉴定为hK2结合剂。通过Biacore 8K SPR，通过单循环动力学方法测量>300份抗hKLK2上清液样品与人KLK2蛋白质的结合。另外，还测试了上清液样品与人KLK3蛋白质的结合。并行地，还通过流式细胞术测试上清液与表达KLK2的细胞系VCap和阴性细胞系DU145的结合。如上所述，在VH-VL和VL/VH取向和热稳定性测试中，将所选细胞结合剂转向到scFv转化。由Ablexis小鼠免疫活动产生KL2B413、KL2B30、KL2B53和KL2B242。由OmniRat免疫活动产生KL2B467和KL2B494。
通过上述各种免疫和人源化活动生成的抗体以Fab格式、mAb格式、VH-接头-VL取向的scFv格式或VL-接头-VH取向的scFv格式表达，并且如下所述进一步分析。使用上述SEQID NO:31的接头序列缀合VH/VL区。
抗KLK2抗体的结构表征
本文提供了在胞内测定中显示出最高性能的抗体可变结构域和scFv抗体片段的序列。可变结构域以Fab格式、VH-接头-VL取向的scFv格式或VL-接头-VH取向的scFv格式表达。
可变结构域VH、VL和CDR
表15示出了所选抗hK2抗体的VH和VL氨基酸序列。表16示出了所选抗hK2选择抗体的Kabat HCDR1、HCDR2和HCDR3。表17示出了所选抗hK2抗体的Kabat LCDR1、LCDR2和LCDR3。表18示出了所选抗hK2抗体的AbM HCDR1、HCDR2和HCDR3。表19示出了抗hK2的AbM LCDR1、LCDR2和LCDR3。表20汇总了所选hK2抗体的可变结构域序列和SEQ ID NO。表21示出了VH和VL区的蛋白质和DNA SEQ ID NO。
表15.所选抗hK2抗体的VH和VL氨基酸序列。
Figure BDA0003963650430001101
/>
Figure BDA0003963650430001111
/>
Figure BDA0003963650430001121
/>
Figure BDA0003963650430001131
/>
Figure BDA0003963650430001141
表16.所选抗KLK2抗体的Kabat HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列。
Figure BDA0003963650430001142
Figure BDA0003963650430001151
/>
表17.所选抗hK2抗体的Kabat LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
Figure BDA0003963650430001152
表18.所选抗hK2抗体的AbM HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列。
Figure BDA0003963650430001161
表19.所选抗hK2抗体的AbM LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
Figure BDA0003963650430001162
/>
Figure BDA0003963650430001171
表20.所选抗hK2抗体的可变结构域的氨基酸序列
Figure BDA0003963650430001172
/>
Figure BDA0003963650430001181
/>
Figure BDA0003963650430001191
/>
Figure BDA0003963650430001201
/>
Figure BDA0003963650430001211
表21.所选hK2抗体的VH和VL结构域的蛋白质和DNA序列的SEQ ID NO。
Figure BDA0003963650430001221
SEQ ID NO:225(m11B6 VH cDNA)
GATGTGCAGCTTCAGGAGTCTGGACCCGGACTTGTTAAACCAAGTCAGTCTCTGTCCCTGACCTGTACCGTCACCGGCAACAGCATCACAAGCGATTACGCATGGAACTGGATCAGGCAGTTCCCTGGAAATCGACTCGAATGGATGGGCTACATTTCATACTCCGGTTCAACCACTTACTCTCCATCCTTGAAATCTAGGTTCAGCATCACCCGTGATACCTCAAAGAACCAATTTTTTCTGCAACTGAATAGCGTAACTCCAGAGGACACAGCCACATATTTCTGCGCCACTGGGTATTACTATGGCTCAGGTTTCTGGGGTCAGGGCACTCTCGTCACCGTCAGCAGC
SEQ ID NO:226(hu11B6 VH cDNA)
CAGGTCCAACTGCAAGAGAGCGGACCGGGCCTGGTAAAGCCATCCGACACATTGTCCCTGACGTGTGCGGTAAGTGGAAACTCTATCACTAGCGACTATGCGTGGAATTGGATAAGACAACCGCCGGGCAAGGGGCTGGAATGGATAGGATATATCAGCTATTCCGGTTCTACGACATACAATCCTTCCCTGAAAAGCAGAGTCACTATGTCACGCGACACGTCCAAGAATCAGTTCTCATTGAAATTGTCATCCGTAACGGCCGTTGACACTGCGGTTTATTATTGCGCAACCGGATATTACTACGGCTCTGGTTTTTGGGGACAGGGAACACTTGTTACTGTTAGTTCA
SEQ ID:NO 227(HCF3-LCD6 VH cDNA)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCAGGCCTGGTGAAGCCAAGCGACACCCTGAGCCTGACCTGCGCCGTGAGCGGCAACAGCATCACCAGCGACTACGCCTGGAACTGGATCCGCCAGTTCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAGCTACAGCGGCAGCACCACCTACAACCCAAGCCTGAAGAGCCGCGTCACCATCAGCCGCGACACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCCCTGTGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCACCGGCTACTACTACGGCAGCGGCTTCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
SEQ ID NO:228(HCG5-LCB7 VH cDNA)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCAGGCCTGGTGAAGCCAAGCGACACCCTGAGCCTGACCTGCGCCGTGAGCGGCAACAGCATCACCAGCGACTACGCCTGGAACTGGATCCGCCAGTTCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGATGGGCTACATCAGCTACAGCGGCAGCACCACCTACAACCCAAGCCTGAAGAGCCGCGTCACCATCAGCCGCGACACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCCCTGTGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCACCGGCTACTACTACGGCAGCGGCTTCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
SEQ ID NO:229(KL2B357、KL2B360 VH cDNA)
CAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGACCAGGCCTGGTCAAGCCCTCTCAGACCCTGTCTCTGACCTGTACCGTGTCCGGCAACTCCATCACCTCTGACTACGCCTGGAACTGGATTCGGCAGTTCCCTGGCAAGGGCCTTGAGTGGATCGGCTACATCTCCTACTCCGGTTCCACCACCTACAACCCCAGCCTGAAGTCCCGGGTCACCATCTCCCGCGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGTCCTCCGTGACCGCTGCTGATACCGCCGTGTACTACTGTGCCACCGGCTACTACTACGGCTCCGGCTTTTGGGGACAGGGCACACTGGTTACCGTGTCTAGT
SEQ ID NO:230(KL2B358 VH cDNA)
CAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGACCAGGCCTGGTCAAGCCCTCTCAGACCCTGTCTCTGACCTGTACCGTGTCCGGCAACTCCATCACCTCTGACTACGCCTGGAACTGGATTCGGCAGCCACCTGGCAAGGGCCTTGAGTGGATCGGCTACATCTCCTACTCCGGTTCCACCACCTACAACCCCAGCCTGAAGTCCCGGGTCACCATCTCCCGCGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGTCCTCCGTGACCGCTGCTGATACCGCCGTGTACTACTGTGCCACCGGCTACTACTACGGCTCCGGCTTTTGGGGACAGGGCACACTGGTTACCGTGTCTAGT
SEQ ID NO:231(KL2B359 VH cDNA)
CAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGACCAGGCCTGGTCAAGCCCTCTCAGACCCTGTCTCTGACCTGTACCGTGTCCGGCAACTCCATCACCTCTGACTACGCCTGGAACTGGATTCGGCAGTTCCCTGGCAAGCGCCTTGAGTGGATCGGCTACATCTCCTACTCCGGTTCCACCACCTACAACCCCAGCCTGAAGTCCCGGGTCACCATCTCCCGCGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGTCCTCCGTGACCGCTGCTGATACCGCCGTGTACTACTGTGCCACCGGCTACTACTACGGCTCCGGCTTTTGGGGACAGGGCACACTGGTTACCGTGTCTAGT
SEQ ID NO:232(KL2B413 VH cDNA)
GAGGTGCAACTTGTGGAGAGCGGCGGAGGTCTGGTCCAACCCGGAGGAAGTCTCCGTCTCTCCTGTGCTGCTAGTGGCTTCACTTTCAGCTCATATTGGATGACATGGGTGAGACAAGCCCCAGGAAAGGGGCTCGAGTGGGTAGCTAACATTAAACAGGACGGCTCCGAACGGTACTATGTTGATTCTGTGAAGGGACGGTTCACTATATCCAGGGATAATGCAAAAAATTCACTCTATCTTCAAATGAACTCACTCAGAGCAGAGGACACTGCCGTGTATTATTGCGCCAGGGATCAAAATTATGACATACTGACCGGTCATTATGGAATGGATGTTTGGGGCCAGGGAACAACCGTTACCGTCTCAAGT
SEQ ID NO:233(KL2B30 VH cDNA)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTTACTATTGGAGCTGGCTCCGGCAGCCCGCCGGGTCGGGACTGGAGTGGATTGGGCGTTTATATGTCAGTGGGTTCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCTTGTCACTAGACCCGTCCAGGAACCAGTTGTCCCTGAAACTGAGTTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTATATTATTGTGCGGGAGATAGTGGGAACTACTGGGGTTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:234(KL2B53 VH cDNA)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGACATACACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAATTATTTCATATGATGGAAGTAAAAAAGACTATACAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGGACAGCCTGAGAGTTGAGGACTCGGCTGTGTATTCCTGTGCGAGAGAAAGTGGCTGGTCCCACTACTACTATTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA
SEQ ID NO:361(KL2B242 VH cDNA)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTTACTATTGGAGCTGGCTCCGGCAGCCCGCCGGGTCGGGACTGGAGTGGATTGGGCGTTTATATGTCAGTGGGTTCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCTTGTCACTAGACCCGTCCAGGAACCAGTTGTCCCTGAAACTGAGTTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTATATTATTGTGCGGGAGATAGTGGGAACTACTGGGGTTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:724(KL2B467 VH cDNA)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTTACTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCATTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCCCACCTCCCTTATAGTGGGAGCTACTGGGCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCAGGTCACCGTCTCTTCA
SEQ ID NO:235(KL2B494 VH cDNA)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTCATTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTGGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAACCTCATATTGTAATGGTGACTGCTCTTCTCTACGACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:237(m11B6 VL cDNA)
GACATTGTGCTGACACAGAGTCCAGCATCCTTGGCAGTATCTTTGGGGCAGCGGGCAACAATTTCATGCCGTGCATCTGAAAGTGTGGAGTATTTTGGAACTTCTCTTATGCACTGGTATCGCCAGAAGCCTGGGCAGCCTCCCAAACTCCTTATATATGCCGCTTCCAACGTGGAGTCCGGAGTACCAGCACGCTTTTCCGGCTCTGGGTCCGGCACAGACTTTTCCCTCAATATCCAACCTGTTGAAGAAGACGATTTTTCCATGTATTTTTGCCAACAGACACGCAAGGTTCCATATACATTCGGCGGCGGCACTAAACTTGAGATCAAA
SEQ ID NO:238(hu11B6 VL cDNA)
GACATAGTCTTGACTCAGAGCCCGGATTCCCTTGCTGTGTCTCTGGGAGAACGAGCTACGATCAACTGCAAGGCAAGTGAATCCGTAGAATACTTCGGGACATCATTGATGCATTGGTATCAACAGAAACCGGGGCAACCGCCCAAATTGCTGATATATGCGGCTAGTAATAGAGAATCAGGAGTACCGGATAGGTTTAGTGGTTCAGGATCAGGTACAGATTTCACCCTGACAATAAGTAGCTTGCAAGCCGAAGACGTAGCAGTGTATTACTGCCAACAAACCCGAAAGGTGCCATATACGTTTGGACAGGGTACAAAGTTGGAAATCAAA
SEQ ID NO:239(HCF3-LCD6 VL cDNA)
GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGACAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAGCGCGCCACCATCAACTGCAAGGCCAGCGAGAGCGTGGAGTACTTCGGCACCAGCCTGATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGCCACCAAAGCTGCTGATCTACGCTGCCAGCAACCGCGAGAGCGGCGTGCCAGACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCCAGAGCGTGCAGGCCGAGGACGTCTCCGTGTACTTCTGCCAGCAGACCCGCAAGGTGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG
SEQ ID NO:240(HCG5-LCB7 VL cDNA)
GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGACAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAGCGCGCCACCATCAACTGCAAGGCCAGCGAGAGCGTGGAGTACTTCGGCACCAGCCTGATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGCCACCAAAGCTGCTGATCTACGCTGCCAGCAACCGCGAGAGCGGCGTGCCAGACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCGTGCAGGCCGAGGACGTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGACCCGCAAGGTGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG
SEQ ID NO:241(KL2B357 VL cDNA)
GACATCGTGCTGACCCAGTCTCCAGACTCTCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGAGCCACCATCAACTGCAGAGCCTCCGAGTCCGTGGAATACTTCGGCACCTCTCTGATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCAACGTGGAATCTGGCGTGCCCGATAGATTTTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAGCTCTCTGCAGGCCGAGGATGTGGCCGTGTACTTCTGTCAGCAGACCCGGAAGGTGCCCTACACATTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAAATCAAG
SEQ ID NO:242(KL2B358、KL2B359、KL2B360 VL cDNA)
GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCTGCCACACTGTCACTGTCTCCAGGCGAGAGAGCCACCCTCTCTTGTAGAGCCTCCGAGTCCGTGGAATACTTCGGCACCTCTCTGATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAGACTGCTGATCTACGCCGCCTCCAACGTCGAATCTGGCATCCCCGCTAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACAGACTTTACCCTGACCATCTCCTCCGTGGAACCCGAGGATTTCGCTGTGTACTTTTGCCAGCAGACCCGGAAGGTGCCCTACACATTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAAATCAAG
SEQ ID NO:243(KL2B413 VL cDNA)
GAAATCGTACTGACCCAGTCCCCTTCTTTCTTGAGTGCATCAGTTGGGGATAGAGTGACCATTACTTGTAGAGCATCTCAAGGTATTTCTTCATACTTGTCTTGGTATCAACAAAAACCTGGCAAGGCACCCAAACTCTTGATCTACGCCACCTCTACATTGCAAAGTGGGGTTCCTTCTAGGTTTTCAGGCTCCGGCTCTGGTACCGAGTTCACCCTCACTATAAGCAGTCTCCAACCTGAAGATTTCGCTACTTATTATTGTCAGCAGCTTAATTCTTATCCCCGAACCTTTGGTCAAGGAACTAAGGTCGAGATCAAA
SEQ ID NO:244(KL2B30 VL cDNA)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTTCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGGGCATTAGCAGTTATTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGTTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGCTTAATAGTTACCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
SEQ ID NO:245(KL2B53 VL cDNA)
GACATCGTGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCGAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGTTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCACTCTGGGGTCCCATCTCGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAAAAGTATAACAGTGCCCCGTACACTTTTGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA
SEQ ID NO:246(KL2B242 VL cDNA)
TCCTATGAGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCCGTGTCCCCAGGAGAGACAGCCAGCATCACCTGCTCTGGAGATCAATTGGGGGAAAATTATGCTTGCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCTGTGTTGGTCATCTATCAAGATAGTAAGCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACAGCCACTCTGACCATCAGCGGGACCCAGGCTCTGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGGGACAACAGTATTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
SEQ ID NO:247(KL2B467 VL cDNA)
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCCGGGCAGACGGCCAGTATTACCTGTGGGGGAGACAACATTGGAAGTAAAAGTGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCTATGATAATAGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGACCACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGTAGTAGTGATCATCCTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGGTCACCGTCCTA
SEQ ID:235(KLK2B494_VH DNA)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTCATTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTGGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAACCTCATATTGTAATGGTGACTGCTCTTCTCTACGACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID:236(KLK2B494_VL DNA)
TCTTCTGAGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGACAGACGGCCAGGATTACCTGTGGGGGAAACAACATTGGAAGTAAAAGTGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCTATGATGATAGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGTAGTAGTGATCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
共有VH和VL序列
图5示出了mu11B6、hu11B6、KL2B357、KL2B358、KL2B359、KL2B360、HCF3和HCG5的VH结构域的序列比对。图6示出了mu11B6、hu11B6、KL2B357、KL2B358、KL2B359、KL2B360、LDC6和LCB7的VL结构域的序列比对。分别针对VH和VL结构域测定SEQ ID NO:356和SEQ ID NO:357的共有氨基酸序列。HCDR和LCDR残基带下划线。
SEQ ID NO:356
QVQLQESGPGLVKPSX1TLSLTCX2VSGNSITSDYAWNWIRQX3PGKX4LEWX5GYISYSGSTT
YNPSLKSRVTX6SRDTSKNQFSLKLSSVTX7X8DTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS
其中X1是D或Q；X2是A或T；X3是P或F；X4是G或R；X5是I或M；X6是I或M；X7是A或P；或者X8是V或A。
SEQ ID NO:357
X1IVLTQSPX2X3LX4X5SX6GERATX7X8CX9ASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPX10LLIYAASNX11
ESGX12PX13RFSGSGSGTDFTLTIX14SX15X16QX17EDX18X19VYX20CQQTRKVPYTFGX21GTKX22EIK
其中，X1是D或E；X2是D或A；X3是S或T；X4是A或S；X5是V或L；X6是L或P；X7是I或L；X8是N或S；X9是R或K；X10是K或R；X11是V或R；X12是V或I；X13是A或D；X14是Q或S；X15是L或V；X16是Q或E；X17是P或A；X18是F或V；X19是A或S，X20是Y或F；X21是Q或G；并且X22是L或V。
Fab-Fc和scFv
将hK2特异性VH/VL区工程化为VH-CH1-接头CH2-CH3和VL-CL，并且表达为IgG2或IgG4，或工程化为VH-接头-VL或VL-接头-VH取向中的scFv。scFv中使用的接头是如上所述的SEQ ID NO:31的接头。如实施例3所述，使用scFv生成双特异性抗体。
表22示出了mAb格式的所选抗hK2抗体的HC氨基酸序列。表23示出了mAb格式的所选抗hK2抗体的LC氨基酸序列。表24汇总了mAb格式的所选抗hK2抗体的HC和LC DNA SEQ IDNO。表25示出了VH-接头-VL或VL-接头-VH取向的所选scFv的氨基酸序列。
表22.mAb格式的所选抗hK2抗体的HC(VH-CH1-接头CH2-CH3)的氨基酸序列。
Figure BDA0003963650430001311
/>
Figure BDA0003963650430001321
/>
Figure BDA0003963650430001331
表23.mAb(Fab-Fc)格式的所选抗hK2抗体的LC(VL-CL)的氨基酸序列。
Figure BDA0003963650430001332
/>
Figure BDA0003963650430001341
表24.所选hK2抗体的HC和LC的cDNA序列的SEQ ID NO
Figure BDA0003963650430001342
Figure BDA0003963650430001351
SEQ ID NO:248(m11B6 HC cDNA)
GATGTGCAGCTTCAGGAGTCTGGACCCGGACTTGTTAAACCAAGTCAGTCTCTGTCCCTGACCTGTACCGTCACCGGCAACAGCATCACAAGCGATTACGCATGGAACTGGATCAGGCAGTTCCCTGGAAATCGACTCGAATGGATGGGCTACATTTCATACTCCGGTTCAACCACTTACTCTCCATCCTTGAAATCTAGGTTCAGCATCACCCGTGATACCTCAAAGAACCAATTTTTTCTGCAACTGAATAGCGTAACTCCAGAGGACACAGCCACATATTTCTGCGCCACTGGGTATTACTATGGCTCAGGTTTCTGGGGTCAGGGCACTCTCGTCACCGTCAGCAGCGCCAAAACAACAGCACCAAGTGTCTATCCACTGGCCCCTGTGTGTGGAGATACAACTGGCTCCTCGGTGACTCTAGGATGCCTGGTCAAGGGTTATTTCCCTGAGCCAGTGACCTTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGTGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACCCTCAGCAGCTCAGTGACTGTAACCTCGAGCACCTGGCCCAGCCAGTCCATCACCTGCAATGTGGCCCACCCGGCAAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACCGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:249(hu11B6 HC cDNA)
CAGGTCCAACTGCAAGAGAGCGGACCGGGCCTGGTAAAGCCATCCGACACATTGTCCCTGACGTGTGCGGTAAGTGGAAACTCTATCACTAGCGACTATGCGTGGAATTGGATAAGACAACCGCCGGGCAAGGGGCTGGAATGGATAGGATATATCAGCTATTCCGGTTCTACGACATACAATCCTTCCCTGAAAAGCAGAGTCACTATGTCACGCGACACGTCCAAGAATCAGTTCTCATTGAAATTGTCATCCGTAACGGCCGTTGACACTGCGGTTTATTATTGCGCAACCGGATATTACTACGGCTCTGGTTTTTGGGGACAGGGAACACTTGTTACTGTTAGTTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:250(KL2B30 HC cDNA)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGATATATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGGGGACTACGATTTTTGGAGTGGTTACCCCCAACTTCTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAAACCTACACTTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA
SEQ ID NO:251(KL2B53 HC cDNA)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGACATACACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAATTATTTCATATGATGGAAGTAAAAAAGACTATACAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGGACAGCCTGAGAGTTGAGGACTCGGCTGTGTATTCCTGTGCGAGAGAAAGTGGCTGGTCCCACTACTACTATTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAAACCTACACTTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA
SEQ ID NO:252(KL2B242 HC cDNA)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTTACTATTGGAGCTGGCTCCGGCAGCCCGCCGGGTCGGGACTGGAGTGGATTGGGCGTTTATATGTCAGTGGGTTCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCTTGTCACTAGACCCGTCCAGGAACCAGTTGTCCCTGAAACTGAGTTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTATATTATTGTGCGGGAGATAGTGGGAACTACTGGGGTTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAAACCTACACTTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA
SEQ ID NO:253(KL2B467 HC cDNA)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTTACTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCATTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCCCACCTCCCTTATAGTGGGAGCTACTGGGCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCAGGTCACCGTCTCTTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCCGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:254(KL2B494 HC cDNA)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTCATTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTGGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAACCTCATATTGTAATGGTGACTGCTCTTCTCTACGACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCCGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:255(mu11B6 LC cDNA)
GACATTGTGCTGACACAGAGTCCAGCATCCTTGGCAGTATCTTTGGGGCAGCGGGCAACAATTTCATGCCGTGCATCTGAAAGTGTGGAGTATTTTGGAACTTCTCTTATGCACTGGTATCGCCAGAAGCCTGGGCAGCCTCCCAAACTCCTTATATATGCCGCTTCCAACGTGGAGTCCGGAGTACCAGCACGCTTTTCCGGCTCTGGGTCCGGCACAGACTTTTCCCTCAATATCCAACCTGTTGAAGAAGACGATTTTTCCATGTATTTTTGCCAACAGACACGCAAGGTTCCATATACATTCGGCGGCGGCACTAAACTTGAGATCAAACGGGCTGATGCTGCACCGACTGTGTCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGT
SEQ ID NO:256(hu11B6 LC cDNA)
GACATAGTCTTGACTCAGAGCCCGGATTCCCTTGCTGTGTCTCTGGGAGAACGAGCTACGATCAACTGCAAGGCAAGTGAATCCGTAGAATACTTCGGGACATCATTGATGCATTGGTATCAACAGAAACCGGGGCAACCGCCCAAATTGCTGATATATGCGGCTAGTAATAGAGAATCAGGAGTACCGGATAGGTTTAGTGGTTCAGGATCAGGTACAGATTTCACCCTGACAATAAGTAGCTTGCAAGCCGAAGACGTAGCAGTGTATTACTGCCAACAAACCCGAAAGGTGCCATATACGTTTGGACAGGGTACAAAGTTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO:257(KL2B30 LC cDNA)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTTCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGGGCATTAGCAGTTATTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGTTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGCTTAATAGTTACCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO:258(KL2B53 LC cDNA)
GACATCGTGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCGAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGTTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCACTCTGGGGTCCCATCTCGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAAAAGTATAACAGTGCCCCGTACACTTTTGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO:259(KL2B242 LC cDNA)
TCCTATGAGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCCGTGTCCCCAGGAGAGACAGCCAGCATCACCTGCTCTGGAGATCAATTGGGGGAAAATTATGCTTGCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCTGTGTTGGTCATCTATCAAGATAGTAAGCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACAGCCACTCTGACCATCAGCGGGACCCAGGCTCTGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGGGACAACAGTATTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCACCCAGTGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCCGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA
SEQ ID NO:260(KL2B467 LC cDNA)
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCCGGGCAGACGGCCAGTATTACCTGTGGGGGAGACAACATTGGAAGTAAAAGTGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCTATGATAATAGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGACCACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGTAGTAGTGATCATCCTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGGTCACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCACCCAGTGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCCGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA
SEQ ID NO:261(KL2B494 LC cDNA)
TCTTCTGAGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGACAGACGGCCAGGATTACCTGTGGGGGAAACAACATTGGAAGTAAAAGTGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCTATGATGATAGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGTAGTAGTGATCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCACCCAGTGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCCGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA
表25.VH-接头-VL(HL)或VL-接头-VH(LH)格式的所选抗hK2 scFv抗体的可变结构 域的氨基酸序列。
Figure BDA0003963650430001451
/>
Figure BDA0003963650430001461
/>
Figure BDA0003963650430001471
/>
Figure BDA0003963650430001481
/>
Figure BDA0003963650430001491
/>
Figure BDA0003963650430001501
/>
Figure BDA0003963650430001511
/>
Figure BDA0003963650430001521
抗hK2抗体的生物物理学表征
抗hK2抗体的亲和力和热稳定性。
通过表面等离子体共振(SPR)测量所选hK2抗体对可溶性hK2的亲和力。SPR是一种无标记技术，用于通过测量复合物形成和解离时的质量变化来研究两个结合配偶体之间的相互作用的强度。在涂覆有抗Fc抗体的传感器芯片上捕获抗体，随后以各种浓度以及指定的缔合和解离时间注射可溶性hK2。解离后，用适当的溶液再生表面以准备进行下一相互作用。通过将传感器图拟合到1:1Langmuir模型来提取动力学信息(结合速率和解离速率常数)。将结合亲和力(KD)报告为速率常数比率(koff/kon)。所选hK2抗体的KD值列于表26中。
使用自动Prometheus仪器，通过差示扫描荧光测定法(NanoDSF)测定热稳定性。使用NanoDSF测量浓度为0.5mg/mL的磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)中的分子的Tm。通过将样品从384孔样品板装载到24孔毛细管中来进行测量。对每个样品进行重复运行。热扫描范围为20℃至95℃，速率为1.0℃/分钟。在330nm和350nm的发射波长下监测固有色氨酸和酪氨酸荧光，并且将F350nm/F330nm比率相对于温度绘图以生成拆解曲线。测量的Tm值列于表26中。
表26.所选分子的KD和Tm
Figure BDA0003963650430001531
由Ablexis免疫活动生成的KL2B413 scFv具有如通过Nano DSF测量的为67℃的热稳定性(Tm)以及对人hK2为约34nM的结合亲和力(KD)。将获得的用于再人源化活动的且已经保持与鼠11B6相似的结合亲和力的克隆KL2B359转化为scFv-Fc和CAR-T以进行另外的分析。KL2B359 scFv显示出为67℃的Tm以及对hK2为约0.7nM至1nM的结合亲和力(KD)。KL2B30、KL2B242、KL2B53、KL2B467和KL2B494 Fab显示出低于0.5nM的结合亲和力以及高于70℃的Tm值。
表位和互补位定位
通过氢-氘交换质谱法(HDX-MS)确定所选hK2抗体上的表位和互补位。人KLK2抗原用于表位和互补位定位实验。
简言之，纯化的KLK2抗原在氧化氘标记缓冲液中与和不与抗hK2抗体一起温育。在不同时间点通过添加8M尿素、1M TCEP(pH 3.0)淬灭氢-氘交换(HDX)混合物。在室温下使淬灭的样品通过用缓冲液A(1％乙腈、0.1％FA的H2O溶液)平衡的600μL/min的固定胃蛋白酶/FPXIII柱。将胃蛋白酶片段装载到具有缓冲液A的600μL/min的反相阱柱上并且脱盐1分钟(600μL缓冲液A)。将脱盐片段通过C18柱在20分钟内以8％至35％缓冲液B(95％乙腈、5％H2O、0.0025％TFA)的线性梯度，以100μL/min分离，并且通过质谱法分析。使用LTQTMOrbitrap Fusion Lumos质谱仪(Thermo Fisher Scientific)进行质谱分析，其中毛细管温度为275℃、分辨率为150,000并且质量范围(m/z)为300至1,800。使用BioPharma Finder3.0(Thermo Fisher Scientific)在HDX实验之前进行非氘化样品的肽鉴定。使用HDExaminer 2.5版(Sierra Analytics,Modesto,CA)从HDX实验的MS原始数据文件中提取质心值。
将hK2抗体即hu11B6、KL2B494、KL2B467、KL2B30、KL2B413和KL2B53与可溶性hK2蛋白质一起温育产生氢交换和整体保护的不同模式。将受到保护的片段定位到hK2抗原的序列上以可视化结合表位(图7)。将KL2B494、KL2B467和KL2B30结合到以下残基的共同序列：(i)残基173-178(SEQ ID NO:209，KVTEF)(例如，KL2B494、KL2B467和KL2B30结合SEQ IDNO:209的残基中的至少三个残基，即173-175处的KVT残基)；和(ii)残基230-234(SEQ IDNO:216，HYRKW)(例如，KL2B494、KL2B467和KL2B30结合SEQ ID NO:216的残基中的至少三个残基，即230-232处的HYR残基)。KL2B413还结合SEQ ID NO:209的所有残基和SEQ ID NO:216的KW残基，如图7所示。本发明的实施方案提供了包含结合hK2的抗原结合结构域的分离的蛋白质，其中所述抗原结合结构域结合具有SEQ ID NO:209和SEQ ID NO:216的序列的表位内的hK2；例如，所述抗原结合结构域结合到SEQ ID NO:209的所有残基、或至少四个残基、或至少三个残基，并且结合到SEQ ID NO:216的所有残基、或至少四个残基、或至少三个残基。
KL2B53显示出不同的保护模式，并且结合到由残基27-32(SEQ ID NO:217，SHGWAH)、60-75(SEQ ID NO:218，RHNLFEPEDTGQRVP)和138-147(SEQ ID NO:292，GWGSIEPEE)组成的序列。
根据实施方案，分离的抗hK2/抗CD3蛋白质(例如，hu11B6、KL2B494、KL2B467、KL2B30、KL2B413或KL2B53)包含与hK2的不连续表位特异性结合的hk2特异性抗原结合结构域(即，其残基在序列中放置较远的表位)，该不连续表位包含选自由SEQ ID NO:209、216、217、218和292组成的组的一个或多个氨基酸序列。
基于来自HDExaminer残基突变的氘摄取的显著差异，鉴定抗hK2抗体hu11B6、KL2B494、KL2B467、KL2B413和抗hK2/CD3双特异性抗体KLCB113和KLCB80的互补位。KL2BB494包含三个互补位区，其中两个互补位区位于KL2B494重链可变结构域(GFTFSH(SEQID NO:729)和TAVYYCAKPHIVMVTAL(SEQ ID NO:730))中，并且单个互补位区位于轻链可变结构域(YDDSDRPSGIPER(SEQ ID NO:731))内。KL2B467包含三个互补位区，其中两个互补位区位于KL2B467重链可变结构域(FTFSY(SEQ ID NO:732)和GSYWAFDY(SEQ ID NO:733))中，并且单个互补位区位于轻链可变结构域(DNSD(SEQ ID NO:734))内。Hu11B6包含位于重链(GNSITSDYA(SEQ ID NO:735))中的单个表位区。KL2B413包含位于重链可变结构域(GFTF(SEQ ID NO:736)和ARDQNYDIL(SEQ ID NO:737))中的两个互补位区。双特异性KLCB80的KL2B30包含位于重链(包含氨基酸残基TIF和VTPNF(SEQ ID NO:738))中的互补位区和位于轻链(YAASTLQSG(SEQ ID NO:739))中的互补位区。双特异性KLCB113的KL2B53包含位于重链(包含氨基酸残基ESGWSHY(SEQ ID NO:740))中的单个互补位区。图11(11A至11F)示出了这些抗hK2抗体和抗hK2/CD3双特异性抗体的结合互补位(带下划线的序列指示CDR区，并且突出显示的序列指示互补位区)。
实施例3.双特异性抗hK2×抗CD3抗体的生成
将实施例2中生成的抗hK2抗体的VH/VL区以及实施例1的抗CD3抗体的VH/VL区工程化为双特异性格式并且表达为IgG1。
用于hK2/CD3双特异性生成的CD3 scFv的工程化
使用SEQ ID NO:31的接头(表27)以VH-接头-VL或VL-接头-VH取向将CD3 VH/VL工程化为scFv。将结合CD3的VH-接头-VL或VL-接头-VH scFv分子进一步工程化为scFv-铰链-CH2-CH3格式(也称为scFv-Fc)，该格式包含Fc沉默突变(L234A/L235A/D265S)和设计成促进选择性异源二聚化的T350V/L351Y/F405A/Y407V突变(表28)。将SEQ ID NO:293的多肽用作恒定结构域铰链-CH2-CH3。将结合CD3的scFv-铰链-CH2-CH3蛋白工程化为在CH3结构域中具有或缺乏C末端溶素(表28)。scFv格式和scFv-铰链-CH2-CH3格式的抗CD3分子的DNA序列示于表29中。
SEQ ID NO:293(huIgG1_G1m(17)-铰链-Fc_C220S_AAS_ZWA)EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
表27.CD3特异性scFv序列。
Figure BDA0003963650430001561
/>
Figure BDA0003963650430001571
表28.CD3特异性scFv-Fc(scFv-铰链CH2-CH3)臂。
Figure BDA0003963650430001572
/>
Figure BDA0003963650430001581
/>
Figure BDA0003963650430001591
/>
Figure BDA0003963650430001601
/>
Figure BDA0003963650430001611
表29.抗CD3scFv和scFv-铰链-CH2-CH3(scFv-Fc)的DNASEQ ID NO
Figure BDA0003963650430001612
SEQ ID NO:294(CD3W244_HL)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGTGGCGGTCTGGTGAAGCCAGGTGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGTTTCACCTTCAGCCGCTACAACATGAACTGGGTGCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCAGCATCAGCACCAGCAGCAACTACATCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCTTCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTGGACCTGCAGATGAGCGGTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCACCCGCGGTTGGGGCCCATTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGATCTGAGGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGAAAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCGTGCCCGCCAGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTACTACGCCAGCGAGAGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCGTGCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCGGCAGCTGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG
SEQ ID NO:295(CD3W244_LH)
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCGTGCCCGCCAGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTACTACGCCAGCGAGAGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCGTGCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCGGCAGCTGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCGGATCTGAGGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGAAAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGTGGCGGTCTGGTGAAGCCAGGTGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGTTTCACCTTCAGCCGCTACAACATGAACTGGGTGCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCAGCATCAGCACCAGCAGCAACTACATCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCTTCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTGGACCTGCAGATGAGCGGTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCACCCGCGGTTGGGGCCCATTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
SEQ ID NO:296(CD3W245_HL)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGTGGCGGTCTGGTGAAGCCAGGTGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGTTTCACCTTCAGCCGCTACAACATGAACTGGGTGCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCAGCATCAGCACCAGCAGCAACTACATCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCTTCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTGGACCTGCAGATGAGCGGTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCACCCGCGGTTGGGGCCCATTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGATCTGAGGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGAAAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCGTGCCCGCCAGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCAAGTACGCCAGCGAGAGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCGGCAGCTGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG
SEQ ID NO:297(CD3W245_LH)
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCGTGCCCGCCAGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCAAGTACGCCAGCGAGAGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCGGCAGCTGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCGGATCTGAGGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGAAAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGTGGCGGTCTGGTGAAGCCAGGTGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGTTTCACCTTCAGCCGCTACAACATGAACTGGGTGCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCAGCATCAGCACCAGCAGCAACTACATCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCTTCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTGGACCTGCAGATGAGCGGTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCACCCGCGGTTGGGGCCCATTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
SEQ ID NO:298(CD3W246_HL)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGTGGCGGTCTGGTGAAGCCAGGTGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGTTTCACCTTCAGCCGCTACAACATGAACTGGGTGCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCAGCATCAGCACCAGCAGCAACTACATCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCTTCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTGGACCTGCAGATGAGCGGTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCACCCGCGGTTGGGGCCCATTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGATCTGAGGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGAAAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCGTGCCCGCCAGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCAAGTACGCCAGCGAGAGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCGTGCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCGGCAGCTGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG
SEQ ID NO:299(CD3W246_LH)
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCGTGCCCGCCAGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCAAGTACGCCAGCGAGAGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCGTGCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCGGCAGCTGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCGGATCTGAGGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGAAAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGTGGCGGTCTGGTGAAGCCAGGTGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGTTTCACCTTCAGCCGCTACAACATGAACTGGGTGCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCAGCATCAGCACCAGCAGCAACTACATCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCTTCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTGGACCTGCAGATGAGCGGTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCACCCGCGGTTGGGGCCCATTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
SEQ ID NO:300(CD3W247_HL)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGTGGCGGTCTGGTGAAGCCAGGTGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGTTTCACCTTCAGCCGCTACAACATGAACTGGGTGCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCAGCATCAGCACCAGCAGCAACTACATCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCTTCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTGGACCTGCAGATGAGCGGTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCACCCGCGGTTGGGGCCCATTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGATCTGAGGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGAAAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCGTGCCCGCCAGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTACTACGCCAGCGAGAGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCGGCAGCTGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG
SEQ ID NO:301(CD3W247_LH)
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCGTGCCCGCCAGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTACTACGCCAGCGAGAGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCGGCAGCTGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCGGATCTGAGGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGAAAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGTGGCGGTCTGGTGAAGCCAGGTGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGTTTCACCTTCAGCCGCTACAACATGAACTGGGTGCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCAGCATCAGCACCAGCAGCAACTACATCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCTTCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTGGACCTGCAGATGAGCGGTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCACCCGCGGTTGGGGCCCATTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
SEQ ID NO:302(CD3W248_HL)
GAGGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGATATAACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTACTAGTAGTAATTACATATACTACGCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCTTCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGGATCTGCAAATGAGCGGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTATTTATTACTGTACGAGAGGCTGGGGGCCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGCGGATCTGAGGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGAAAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGACATCTTGCTGACTCAGTCTCCAGGCATCCTGTCTGTGAGTCCAGGAGAAAGAGTCAGTTTCTCCTGCAGGGCCAGACAGAGCATTGGCACAGCCATACACTGGTATCAGCAAAGAACAAATGGTTCTCCAAGGCTTCTCATAAAGTATGCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTTAGCGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTACCATCAACAGTGTGGAGTCTGAAGATATTGCAGATTATTACTGTCAACAAAGTGGGAGCTGGCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
SEQ ID NO:303(CD3W248_LH)
GACATCTTGCTGACTCAGTCTCCAGGCATCCTGTCTGTGAGTCCAGGAGAAAGAGTCAGTTTCTCCTGCAGGGCCAGACAGAGCATTGGCACAGCCATACACTGGTATCAGCAAAGAACAAATGGTTCTCCAAGGCTTCTCATAAAGTATGCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTTAGCGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTACCATCAACAGTGTGGAGTCTGAAGATATTGCAGATTATTACTGTCAACAAAGTGGGAGCTGGCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAAGGCGGATCTGAGGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGAAAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGAGGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGATATAACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTACTAGTAGTAATTACATATACTACGCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCTTCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGGATCTGCAAATGAGCGGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTATTTATTACTGTACGAGAGGCTGGGGGCCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:304(CD3W244_HL-scFv-Fc)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGTGGCGGTCTGGTGAAGCCAGGTGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGTTTCACCTTCAGCCGCTACAACATGAACTGGGTGCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCAGCATCAGCACCAGCAGCAACTACATCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCTTCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTGGACCTGCAGATGAGCGGTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCACCCGCGGTTGGGGCCCATTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGATCTGAGGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGAAAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCGTGCCCGCCAGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTACTACGCCAGCGAGAGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCGTGCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCGGCAGCTGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:305(CD3W244_LH-scFv-Fc)
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCGTGCCCGCCAGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTACTACGCCAGCGAGAGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCGTGCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCGGCAGCTGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCGGATCTGAGGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGAAAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGTGGCGGTCTGGTGAAGCCAGGTGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGTTTCACCTTCAGCCGCTACAACATGAACTGGGTGCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCAGCATCAGCACCAGCAGCAACTACATCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCTTCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTGGACCTGCAGATGAGCGGTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCACCCGCGGTTGGGGCCCATTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:306(CD3W245_HL-scFv-Fc)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGTGGCGGTCTGGTGAAGCCAGGTGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGTTTCACCTTCAGCCGCTACAACATGAACTGGGTGCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCAGCATCAGCACCAGCAGCAACTACATCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCTTCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTGGACCTGCAGATGAGCGGTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCACCCGCGGTTGGGGCCCATTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGATCTGAGGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGAAAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCGTGCCCGCCAGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCAAGTACGCCAGCGAGAGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCGGCAGCTGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:307(CD3W245_LH-scFv-Fc)
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCGTGCCCGCCAGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCAAGTACGCCAGCGAGAGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCGGCAGCTGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCGGATCTGAGGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGAAAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGTGGCGGTCTGGTGAAGCCAGGTGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGTTTCACCTTCAGCCGCTACAACATGAACTGGGTGCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCAGCATCAGCACCAGCAGCAACTACATCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCTTCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTGGACCTGCAGATGAGCGGTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCACCCGCGGTTGGGGCCCATTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:308(CD3W246_HL-scFv-Fc)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGTGGCGGTCTGGTGAAGCCAGGTGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGTTTCACCTTCAGCCGCTACAACATGAACTGGGTGCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCAGCATCAGCACCAGCAGCAACTACATCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCTTCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTGGACCTGCAGATGAGCGGTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCACCCGCGGTTGGGGCCCATTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGATCTGAGGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGAAAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCGTGCCCGCCAGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCAAGTACGCCAGCGAGAGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCGTGCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCGGCAGCTGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:309(CD3W246_LH-scFv-Fc)
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCGTGCCCGCCAGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCAAGTACGCCAGCGAGAGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCGTGCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCGGCAGCTGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCGGATCTGAGGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGAAAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGTGGCGGTCTGGTGAAGCCAGGTGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGTTTCACCTTCAGCCGCTACAACATGAACTGGGTGCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCAGCATCAGCACCAGCAGCAACTACATCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCTTCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTGGACCTGCAGATGAGCGGTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCACCCGCGGTTGGGGCCCATTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:310(CD3W247_HL-scFv-Fc)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGTGGCGGTCTGGTGAAGCCAGGTGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGTTTCACCTTCAGCCGCTACAACATGAACTGGGTGCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCAGCATCAGCACCAGCAGCAACTACATCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCTTCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTGGACCTGCAGATGAGCGGTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCACCCGCGGTTGGGGCCCATTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGATCTGAGGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGAAAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCGTGCCCGCCAGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTACTACGCCAGCGAGAGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCGGCAGCTGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:311(CD3W247_LH-scFv-Fc)
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCGTGCCCGCCAGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTACTACGCCAGCGAGAGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCGGCAGCTGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCGGATCTGAGGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGAAAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGTGGCGGTCTGGTGAAGCCAGGTGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGTTTCACCTTCAGCCGCTACAACATGAACTGGGTGCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCAGCATCAGCACCAGCAGCAACTACATCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCTTCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTGGACCTGCAGATGAGCGGTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCACCCGCGGTTGGGGCCCATTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:312(CD3W248_HL-scFv-Fc)
GAGGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGATATAACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTACTAGTAGTAATTACATATACTACGCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCTTCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGGATCTGCAAATGAGCGGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTATTTATTACTGTACGAGAGGCTGGGGGCCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGCGGATCTGAGGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGAAAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGACATCTTGCTGACTCAGTCTCCAGGCATCCTGTCTGTGAGTCCAGGAGAAAGAGTCAGTTTCTCCTGCAGGGCCAGACAGAGCATTGGCACAGCCATACACTGGTATCAGCAAAGAACAAATGGTTCTCCAAGGCTTCTCATAAAGTATGCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTTAGCGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTACCATCAACAGTGTGGAGTCTGAAGATATTGCAGATTATTACTGTCAACAAAGTGGGAGCTGGCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAAGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:313(CD3W248_LH-scFv-Fc)
GACATCTTGCTGACTCAGTCTCCAGGCATCCTGTCTGTGAGTCCAGGAGAAAGAGTCAGTTTCTCCTGCAGGGCCAGACAGAGCATTGGCACAGCCATACACTGGTATCAGCAAAGAACAAATGGTTCTCCAAGGCTTCTCATAAAGTATGCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTTAGCGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTACCATCAACAGTGTGGAGTCTGAAGATATTGCAGATTATTACTGTCAACAAAGTGGGAGCTGGCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAAGGCGGATCTGAGGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGAAAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGAGGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGATATAACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTACTAGTAGTAATTACATATACTACGCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCTTCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGGATCTGCAAATGAGCGGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTATTTATTACTGTACGAGAGGCTGGGGGCCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
用于hK2/CD3双特异性生成的CD3 Fab的工程化
CD3特异性VH和VL区分别以VH-CH1-接头-CH2-CH3和VL-CL格式进行工程化并且表达为IgG1。使用包含Fc沉默突变L234A/L235A/D265S和设计成促进选择性异源二聚化的CH3突变T350V/L351Y/F405A/Y407V的SEQ ID NO:314的多肽生成CD3特异性VH-CH1-接头-CH2-CH3(表30)。将VH-CH1-接头-CH2-CH3重链工程化为在CH3结构域中具有或缺乏C末端溶素。缺乏C末端溶素的VH-CH1-接头-CH2-CH3重链示于SEQ ID NO:85中。
SEQ ID NO:314(huIgG1_G1m(17)_AAS_ZWA)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
使用SEQ ID NO:363或364的多肽生成CD3特异性VL-CL(表31)。
SEQ ID NO:363(人κ轻链)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:364(人λ轻链)
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
抗CD3分子如VH-CH1-接头-CH2-CH 3格式的HC和VL-CL格式的LC的DNA序列示于表32中。
表30.双特异性抗体的抗CD3抗体臂VH-CH1-接头-CH2-CH3的氨基酸序列。
Figure BDA0003963650430001791
表31.双特异性抗体的抗CD3抗体轻链臂(VL-CL)的氨基酸序列
Figure BDA0003963650430001792
/>
Figure BDA0003963650430001801
表32.双特异性抗体VH-CH1-接头-CH2-CH3格式的HC和VL-CL格式的LC的抗CD3臂 的cDNA SEQ ID NO。
抗体 HC cDNA SEQ ID NO: LC cDNA SEQ ID NO:
CD3W244 315 316
CD3W245 315 317
CD3W246 315 318
CD3W247 315 319
CD3W248 315 320
CD3B376 351 352
SEQ ID NO:315(CD3W244、CDRW245、CD3W246、CD3W247、CD3W248 HC cDNA)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGTGGCGGTCTGGTGAAGCCAGGTGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGTTTCACCTTCAGCCGCTACAACATGAACTGGGTGCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCAGCATCAGCACCAGCAGCAACTACATCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCTTCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTGGACCTGCAGATGAGCGGTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCACCCGCGGTTGGGGCCCATTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:316(CD3W244 LC cDNA)
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCGTGCCCGCCAGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTACTACGCCAGCGAGAGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCGTGCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCGGCAGCTGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO:317(CD3W245 LC cDNA)
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCGTGCCCGCCAGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCAAGTACGCCAGCGAGAGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCGGCAGCTGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO:318(CD3W246 LC cDNA)
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCGTGCCCGCCAGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCAAGTACGCCAGCGAGAGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCGTGCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCGGCAGCTGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO:319(CD3W247 LC cDNA)
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCGTGCCCGCCAGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTACTACGCCAGCGAGAGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCGGCAGCTGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO:320(CD3W248 LC cDNA)
GACATCTTGCTGACTCAGTCTCCAGGCATCCTGTCTGTGAGTCCAGGAGAAAGAGTCAGTTTCTCCTGCAGGGCCAGACAGAGCATTGGCACAGCCATACACTGGTATCAGCAAAGAACAAATGGTTCTCCAAGGCTTCTCATAAAGTATGCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTTAGCGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTACCATCAACAGTGTGGAGTCTGAAGATATTGCAGATTATTACTGTCAACAAAGTGGGAGCTGGCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO:351(CD3B376 HC)
CAGGTGCAGCTCCAACAGAGTGGTCCCAGACTCGTGAGACCCTCTCAAACACTCAGTTTGACTTGTGCCATCTCAGGCGATTCAGTTTTCAACAACAATGCAGCTTGGAGCTGGATTAGGCAGTCACCTAGTCGCGGTCTTGAATGGCTTGGGCGTACATACTATCGCTCTAAATGGTTGTATGATTACGCTGTGTCCGTGAAGAGCCGAATCACCGTAAACCCTGATACCTCCAGGAATCAGTTCACATTGCAACTGAATAGTGTGACTCCCGAGGATACTGCACTCTATTATTGTGCCCGAGGATATAGCAGTAGCTTCGACTATTGGGGACAAGGGACACTCGTTACCGTTAGTTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
SEQ ID NO:352(CD3B376 LC)
CAGTCTGCTCTGACCCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGCTCTCCCGGCCAGTCCATCACCATCAGCTGTACCGGCACCTCCTCCAACATCGGCACCTACAAGTTCGTGTCCTGGTATCAGCAGCACCCCGACAAGGCCCCCAAAGTGCTGCTGTACGAGGTGTCCAAGCGGCCCTCTGGCGTGTCCTCCAGATTCTCCGGCTCCAAGTCTGGCAACACCGCCTCCCTGACCATCAGCGGACTGCAGGCTGAGGACCAGGCCGACTACCACTGTGTGTCCTACGCTGGCTCTGGCACCCTGCTGTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGACCGTGCTGGGTCAGCCCAAGGCTGCACCCAGTGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCCGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA
用于hK2/CD3双特异性生成的hK2 scFv-Fc的工程化
如实施例2所述，使用SEQ ID NO:31的接头(表2)将以VH-接头-VL或VL-接头-VH取向工程化为scFv的hK2 VH/VL区进一步工程化为包含Fc沉默突变(L234A/L235A/D265S)和设计成促进选择性异源二聚化的T350V/T366L/K392L/T394W突变的scFv-铰链-CH2-CH3格式并且表达为IgG1(表33)。将SEQ ID NO:321的多肽用作恒定结构域铰链-CH2-CH3(Fc)。
SEQ ID NO:321(huIgG1_G1m(17)-铰链-Fc_C220S_AAS_ZWB)EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVLPPSREEMTKNQVSLLCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYLTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
表33.用于hK2/CD3双特异性生成的抗hK2 scFv-Fc的氨基酸序列
Figure BDA0003963650430001861
/>
Figure BDA0003963650430001871
用于hK2/CD3双特异性生成的hK2 Fab-Fc的工程化
hK2特异性VH和VL区分别以VH-CH1-接头-CH2-CH3和VL-CL格式进行工程化。使用包含Fc沉默突变L234A/L235A/D265S和设计成促进选择性异源二聚化的CH3突变T350V/T366L/K392L/T394W的SEQ ID NO:326的多肽生成CD3特异性VH-CH1-接头-CH2-CH3。
SEQ ID NO:326(huIgG1_G1m(17)_AAS_ZWB)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVLPPSREEMTKNQVSLLCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYLTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
使用SEQ ID NO:363或364的多肽生成hK2特异性VL-CL。
SEQ ID NO:363(人κ轻链)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:364(人λ轻链)
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
hK2 Fab-Fc HC的氨基酸序列示于表34中。
表34.用于hK2/CD3双特异性生成的抗hK2 Fab-Fc的氨基酸序列
Figure BDA0003963650430001881
/>
Figure BDA0003963650430001891
hK2/CD3双特异性
使工程化为Fab的CD3W245和CD3B376抗CD3特异性臂以及以如上所述的HL和LH两个取向工程化为scFv的KL2B359、KL2B413、KL2B467和KL2B494的hK2 VH/VL区表达以生成双特异性抗体，得到具有呈scFv-铰链-CH2-CH3格式的hK2结合臂以及呈以下格式的CD3结合臂的hK2/CD3双特异性抗体：重链：VH-CH1-接头-CH2-CH3；和轻链：VL-CL。可替代地，使以LH-接头-VH取向工程化为scFv的抗CD3抗体CD3W245的VH/VL区以及如上所述工程化为Fab的抗hK2抗体KL2B30、KL2B242和KL2B53的VH/VL区表达以生成双特异性抗体，得到具有呈重链VH-CH1-接头-CH2-CH3和轻链VL-CL格式的hK2结合臂以及呈scFv-铰链-CH2-CH3格式的CD3结合臂的hK2/CD3双特异性抗体。用于生成抗scFv的接头是SEQ ID NO:31的接头。
如上所述将T350V_L351Y_F405A_Y407V CH3突变工程化到一条重链中并且将T350V_T366L_K392L_T394W CH3突变工程化到另一条重链中。另外，将HK2和CD3结合臂两者均工程化为含有如上所述的Fc效应子沉默突变L234A_L235A_D265S。
使工程化链表达并且使用标准方法纯化所得双特异性抗体。如实施例5所述表征双特异性抗体对hK2和CD3的结合及其细胞毒性。表35示出了所选抗hKL2/CD3双特异性抗体的CDR SEQ ID NO:。表36示出了所选抗hKL2/CD3双特异性抗体的VH、VL和scFv SEQ IDNO:。表37示出了所选抗hKL2/CD3双特异性抗体的HC1、HC2、LC1和LC2 SEQ ID NO。HC1和LC1是指hKL2结合臂的重链和轻链。可替代地，HC1还可以指hKl2结合臂的scFv-铰链-CH2-CH3。HC2和LC2是指CD3结合臂的重链和轻链。可替代地，HC2还可以指CD3结合臂的scFv-铰链-CH2-CH3。表38示出了HC1、LC1、HC2和LC2的氨基酸序列。表39示出了HC1、LC1、HC2和LC2的cDNA序列。
表35.双特异性hK2/CD3抗体的Kabat CDR SEQ ID NO
Figure BDA0003963650430001901
Figure BDA0003963650430001911
表36.所选KL2/CD3双特异性抗体的hKL2臂和CD3臂的可变区的SEQ ID NO。
Figure BDA0003963650430001912
Figure BDA0003963650430001921
表37.hK2/CD3双特异性抗体的HC和LC氨基酸SEQ ID NO
Figure BDA0003963650430001922
Figure BDA0003963650430001931
表38.双特异性HC1和HC2氨基酸序列
Figure BDA0003963650430001932
/>
Figure BDA0003963650430001941
/>
Figure BDA0003963650430001951
/>
Figure BDA0003963650430001961
表39.hK2/CD3双特异性抗体的HC和LC DNA SEQ ID NO
Figure BDA0003963650430001971
SEQ ID NO:332(KL2B359-LH-scFv-Fc)
GAGATTGTTCTCACCCAATCCCCAGCTACTCTCTCTCTTTCACCCGGTGAGCGGGCAACCCTCTCCTGTAGAGCCAGCGAGAGCGTGGAGTATTTTGGCACATCCCTGATGCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGACAACCCCCCAGACTCCTCATATATGCCGCCTCAAATGTCGAGAGTGGGATACCTGCACGGTTTTCAGGAAGCGGCAGCGGTACTGACTTCACATTGACTATATCCTCTGTAGAGCCAGAGGATTTTGCAGTCTACTTCTGCCAGCAAACTAGGAAGGTTCCATATACTTTTGGGGGCGGTACAAAAGTTGAGATAAAGGGCGGCTCCGAGGGCAAGAGCAGCGGCAGCGGCAGCGAGAGCAAGAGCACCGGCGGCAGCCAAGTACAGCTCCAGGAGTCAGGACCTGGGCTCGTCAAACCATCTCAGACATTGTCCCTGACATGCACAGTTTCCGGCAACAGTATTACTTCCGACTATGCTTGGAATTGGATCAGGCAATTCCCAGGAAAGCGGCTCGAGTGGATAGGTTATATTTCTTACTCTGGATCTACTACCTACAATCCCAGTTTGAAGTCTCGCGTGACAATTAGCCGGGACACATCAAAAAATCAATTCTCACTTAAACTTAGTTCTGTAACCGCTGCCGATACAGCCGTGTACTACTGCGCCACTGGTTATTATTATGGAAGCGGATTTTGGGGGCAAGGAACTTTGGTGACCGTCTCTTCCGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGCTGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACCTCACCTGGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
SEQ ID NO:333(KL2B413-LH-scFv-Fc)
GAGGTACAACTTGTCGAAAGTGGCGGTGGAGTCGTCCAGCCTGGGCGATCACTTCGCCTCTCCTGTGTAGCCTCTGGTTTCACTTTCTCATCTTACGACATACACTGGGTCCGCCAGGCACCTGGTAAGGGGCTGGAGTGGGTTGCCATCATTAGTTACGATGGCTCCAAAAAAGATTACACCGATAGCGTAAAGGGCAGATTTACCATTTCCAGGGATAATTCAAAGAACACCCTGTATCTGCAAATGGACAGCCTCCGCGTCGAAGACTCTGCAGTTTATAGCTGTGCCAGGGAGTCAGGCTGGTCCCATTATTACTATTATGGTATGGACGTTTGGGGCCAGGGAACCATGGTCACTGTTAGTTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGCTGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACCTCACCTGGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
SEQ ID NO:334(KL2B467-LH-scFv-Fc)
CAGAGCGTACTTACCCAGCCTCCCAGCGTGTCTGTAGCCCCAGGACAGACAGCCAGTATTACATGCGGTGGTGACAATATAGGTTCCAAATCCGTGCATTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGCAAGCTCCCGTGCTCGTGGTATATGATAATTCCGACCGCCCTTCCGGCATTCCCGAACGGTTTAGTGGTTCAAATTCAGGCACCACAGCAACTCTGACCATAAGCAGAGTCGAAGCTGGAGACGAAGCCGACTACTACTGTCAGGTATGGGACTCTAGTAGTGACCACCCTGTCGTCTTCGGTGGGGGAACCAAAGTGACCGTTCTGGGCGGCTCCGAGGGCAAGAGCAGCGGCAGCGGCAGCGAGAGCAAGAGCACCGGCGGCAGCCAGGTCCAGCTCGTAGAAAGTGGGGGCGGCGTAGTTCAGCCAGGCAGGAGTCTCCGGCTGAGTTGTGCAGCCAGCGGCTTTACTTTTTCCTACTATGGAATGCACTGGGTACGTCAGGCACCCGGCAAAGGTTTGGAGTGGGTCGCATTCATTTCTTATGATGGATCAAATAAGTATTATGCCGATAGTGTAAAGGGCAGATTTACAATAAGTCGAGACAACTCAAAGAACACTCTCTACCTCCAAATGAATAGTCTTCGGGCAGAGGATACTGCAGTGTACTATTGTGCTCATCTTCCTTATTCCGGTTCTTACTGGGCATTCGATTATTGGGGGCAAGGGACACAAGTTACCGTGTCTAGCGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGCTGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACCTCACCTGGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
SEQ ID NO:338(KL2B494-LH-scFv-Fc)
AGCAGCGAATTGACCCAACCACCTTCCGTCAGCGTCGCACCAGGGCAAACCGCCCGCATCACATGCGGTGGGAACAATATAGGAAGCAAATCTGTCCACTGGTACCAGCAAAAACCAGGACAAGCCCCTGTTCTGGTCGTCTATGATGACAGCGACAGACCAAGTGGTATTCCCGAGAGATTCTCCGGTAGCAACTCTGGAAATACAGCTACTTTGACCATCTCCAGAGTTGAGGCTGGTGACGAGGCAGATTACTATTGCCAGGTCTGGGACAGCTCCAGCGACCACGTCGTATTCGGTGGCGGGACCAAGCTGACTGTGCTGGGCGGCTCCGAGGGCAAGAGCAGCGGCAGCGGCAGCGAGAGCAAGAGCACCGGCGGCAGCCAGGTGCAGTTGGTAGAGTCAGGAGGGGGCCTCGTTCAACCTGGTGGCAGCCTCCGTTTGTCTTGTGCTGCCAGTGGATTTACTTTCAGTCACTACGCAATGAGCTGGGTGAGACAAGCACCTGGCAAGGGCCTTGAGTGGGTCTCCACTATCGGCGGTTCAGGGGGGAGCACTTACTACGCTGACTCTGTAAAAGGTCGCTTTACTATATCTAGAGATAACTCTAAAAACACACTCTACTTGCAGATGAACAGCCTGCGAGCCGAAGATACAGCCGTGTACTACTGCGCCAAGCCTCATATTGTAATGGTCACTGCCCTCTTGTATGATGGCATGGATGTTTGGGGCCAAGGGACAATGGTGACAGTCTCAAGCGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGCTGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACCTCACCTGGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
SEQ ID NO:335(KLK2B30 Fab HC cDNA)
CAGGTTCAACTTCAAGAATCCGGGCCAGGTCTGGTCAAGCCTTCAGAGACTTTGTCCCTTACTTGCACAGTGAGCGGTGGCTCTATCTCAAGTTACTACTGGTCATGGATACGGCAGCCCCCAGGAAAGGGGCTTGAGTGGATTGGGTACATTTATTACTCAGGGTCAACAAACTACAATCCCTCCCTCAAATCCCGAGTGACAATTAGTGTCGATACATCTAAAAACCAGTTTTCCCTGAAATTGAGCTCAGTCACCGCAGCTGATACTGCAGTCTATTATTGTGCTGGCACAACAATCTTCGGGGTAGTAACTCCAAACTTCTACTACGGGATGGACGTGTGGGGGCAAGGAACAACCGTAACAGTAAGTAGTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGCTGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACCTCACCTGGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
SEQ ID NO:722(KLK2B30 Fab LC cDNA)
GATATTCAAATGACCCAGTCACCATCATTCCTGTCCGCCTCAGTGGGAGATCGCGTCACTATTACTTGTCGTGCTAGCCAGGGGATATCATCATATTTGGCTTGGTATCAACAAAAGCCAGGAAAGGCCCCAAAATTCCTTATATATGCAGCTAGTACACTCCAGAGTGGTGTTCCTAGCCGGTTCTCTGGCAGCGGCTCAGGGACCGAGTTCACCCTGACAATCTCCAGCTTGCAGCCCGAAGACTTTGCAACCTACTATTGCCAGCAACTGAACTCCTATCCTCTGACTTTCGGGGGAGGAACCAAGGTTGAGATTAAACGGACAGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCACCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACAGCTTCTGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAAGAGTCTGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACAGCCTGTCCTCCACACTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCATCAGGGCCTGTCTAGCCCTGTGACCAAGTCTTTCAACCGGGGCGAGTGT
SEQ ID NO:337(KL2B53 Fab HC cDNA)
GAGGTACAACTTGTCGAAAGTGGCGGTGGAGTCGTCCAGCCTGGGCGATCACTTCGCCTCTCCTGTGTAGCCTCTGGTTTCACTTTCTCATCTTACGACATACACTGGGTCCGCCAGGCACCTGGTAAGGGGCTGGAGTGGGTTGCCATCATTAGTTACGATGGCTCCAAAAAAGATTACACCGATAGCGTAAAGGGCAGATTTACCATTTCCAGGGATAATTCAAAGAACACCCTGTATCTGCAAATGGACAGCCTCCGCGTCGAAGACTCTGCAGTTTATAGCTGTGCCAGGGAGTCAGGCTGGTCCCATTATTACTATTATGGTATGGACGTTTGGGGCCAGGGAACCATGGTCACTGTTAGTTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGCTGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACCTCACCTGGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
SEQ ID NO:723(KL2B53 Fab LC cDNA)
GATATTGTAATGACTCAGTCACCCTCTTCACTGAGTGCATCAGTAGGTGATCGCGTTACCATCACTTGCCGTGCCAGTCAAGACATTTCAAATTACCTTGCATGGTACCAACAAAAGCCCGGAAAAGTGCCAAAGTTTTTGATTTATGCCGCTTCAACACTCCATTCAGGAGTGCCCTCTCGTTTCAGTGGATCTGGCAGTGGCACCGATTTTACTCTCACAATAAGCAGTCTCCAGCCTGAGGATGTAGCCACCTATTATTGCCAAAAATATAATTCAGCCCCCTATACTTTTGGACAGGGCACACGCCTTGAGATTAAACGGACAGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCACCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACAGCTTCTGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAAGAGTCTGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACAGCCTGTCCTCCACACTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCATCAGGGCCTGTCTAGCCCTGTGACCAAGTCTTTCAACCGGGGCGAGTGT
SEQ ID NO:336(KLK2B242 Fab HC cDNA和KL2B242LC_C33S Fab HC)
CAAGTACAACTTCAAGAGTCTGGCCCTGGGCTTGTTAAGCCCTCAGAGACCTTGTCACTGACCTGTACCGTATCAGGCGGGTCAATTTCATCTTACTACTGGAGTTGGCTTCGTCAGCCTGCCGGATCTGGACTGGAGTGGATAGGTAGACTGTATGTTTCCGGCTTTACAAATTACAACCCATCTTTGAAAAGCCGTGTGACTCTCAGCCTCGACCCTTCTCGGAATCAACTTTCACTTAAATTGTCTTCTGTTACAGCTGCCGACACTGCAGTATATTATTGTGCAGGGGACTCAGGCAACTATTGGGGATGGTTTGATCCTTGGGGGCAGGGGACCCTGGTAACCGTGAGTTCTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGCTGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACCTCACCTGGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
SEQ ID NO:360(KLK2B242LC_C33S Fab LC cDNA)
AGTTATGAGCTGACTCAACCACCCAGTGTCAGCGTATCCCCAGGAGAAACTGCCTCTATAACATGCAGCGGAGACCAGTTGGGAGAAAATTACGCCTCCTGGTACCAACAGAAGCCTGGACAAAGTCCTGTCCTCGTTATTTATCAAGATTCTAAACGTCCCTCTGGGATCCCCGAACGATTCTCCGGCTCTAACTCTGGGAATACCGCTACCTTGACAATAAGTGGTACACAGGCACTTGATGAAGCTGATTATTACTGCCAGGCATGGGATAACAGCATTGTGGTTTTCGGGGGCGGCACCAAACTCACAGTTCTCGGTCAGCCCAAGGCTGCACCCAGTGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCCGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA
SEQ ID NO:339(KLK2B30 wK477 Fab HC cDNA)
CAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGCCCTGGCCTGGTCAAGCCTTCCGAGACACTGTCTCTGACCTGCACCGTGTCTGGCGGCTCCATCTCCTCCTACTACTGGTCCTGGATCAGACAGCCTCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGATCGGCTACATCTACTACTCCGGCTCCACCAACTACAACCCCAGCCTGAAGTCCAGAGTGACCATCTCCGTGGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGTCCTCCGTGACCGCTGCTGATACCGCCGTGTACTATTGTGCTGGCACCACCATCTTCGGCGTGGTCACCCCTAACTTCTACTACGGCATGGACGTGTGGGGCCAAGGCACAACAGTGACAGTCTCTTCTGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACTTGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGCTGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACCTCACCTGGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCTCTCTCCCTGTCTCCGGGAAAA
SEQ ID NO:353(CD3W245-LH-scFv-Fc cDNA)
GACATACAAATGACACAATCACCCTCTTCTCTTTCTGCAAGCGTTGGCGACCGTGTCACTATCACTTGTCGAGCCCGCCAGTCCATAGGTACTGCCATTCACTGGTATCAACAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAACTCCTGATTAAGTATGCCAGCGAGAGCATTTCCGGCGTACCTTCAAGATTTTCCGGCTCCGGTAGTGGGACAGATTTCACTCTCACTATATCTAGCCTCCAACCAGAAGATTTCGCCACTTACTACTGTCAACAATCAGGTTCATGGCCTTACACTTTCGGCCAGGGGACAAAATTGGAGATCAAGGGCGGCTCCGAGGGCAAGAGCAGCGGCAGCGGCAGCGAGAGCAAGAGCACCGGCGGCAGCGAGGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGATATAACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTACTAGTAGTAATTACATATACTACGCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCTTCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGGATCTGCAAATGAGCGGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTATTTATTACTGTACGAGAGGCTGGGGGCCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
SEQ ID NO:354(CD3W245-LH-scFv-Fc w/K447)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTCTGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATTACCTGCCGGGCCAGACAGTCTATCGGCACCGCTATCCACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATTAAGTACGCCTCCGAGTCCATCTCCGGCGTGCCCTCCAGATTTTCTGGCTCTGGATCTGGCACCGACTTTACCCTGACAATCTCCAGCCTGCAGCCTGAGGACTTCGCCACCTACTACTGTCAGCAGTCCGGCTCTTGGCCTTACACCTTTGGTCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGGGCGGATCTGAGGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGAAAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTAAGCCTGGCGGCTCTCTGAGACTGTCTTGTGCTGCTTCTGGCTTCACCTTCAGCCGGTACAACATGAACTGGGTCCGACAGGCTCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGTCCTCCATCTCCACCTCCAGCAACTACATCTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCAGATTCACCTTCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGGACCTGCAGATGTCTGGCCTGAGAGCTGAGGACACCGCTATCTACTACTGCACCAGAGGCTGGGGACCCTTCGATTATTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTGTCATCTGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACTTGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCTCTCTCCCTGTCTCCGGGAAAA
SEQ ID NO:725(CD3W245 Fab-HC-Fc)
GAGGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGATATAACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTACTAGTAGTAATTACATATACTACGCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCTTCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGGATCTGCAAATGAGCGGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTATTTATTACTGTACGAGAGGCTGGGGGCCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
SEQ ID NO:726(CD3W245 Fab-LC-Fc)
GACATACAAATGACACAATCACCCTCTTCTCTTTCTGCAAGCGTTGGCGACCGTGTCACTATCACTTGTCGAGCCCGCCAGTCCATAGGTACTGCCATTCACTGGTATCAACAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAACTCCTGATTAAGTATGCCAGCGAGAGCATTTCCGGCGTACCTTCAAGATTTTCCGGCTCCGGTAGTGGGACAGATTTCACTCTCACTATATCTAGCCTCCAACCAGAAGATTTCGCCACTTACTACTGTCAACAATCAGGTTCATGGCCTTACACTTTCGGCCAGGGGACAAAATTGGAGATCAAGCGGACAGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCACCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACAGCTTCTGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAAGAGTCTGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACAGCCTGTCCTCCACACTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCATCAGGGCCTGTCTAGCCCTGTGACCAAGTCTTTCAACCGGGGCGAGTGT
SEQ ID NO:351(CD3B376 Fab-HC-Fc)
CAGGTGCAGCTCCAACAGAGTGGTCCCAGACTCGTGAGACCCTCTCAAACACTCAGTTTGACTTGTGCCATCTCAGGCGATTCAGTTTTCAACAACAATGCAGCTTGGAGCTGGATTAGGCAGTCACCTAGTCGCGGTCTTGAATGGCTTGGGCGTACATACTATCGCTCTAAATGGTTGTATGATTACGCTGTGTCCGTGAAGAGCCGAATCACCGTAAACCCTGATACCTCCAGGAATCAGTTCACATTGCAACTGAATAGTGTGACTCCCGAGGATACTGCACTCTATTATTGTGCCCGAGGATATAGCAGTAGCTTCGACTATTGGGGACAAGGGACACTCGTTACCGTTAGTTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
SEQ ID NO:352(CD3B376 Fab-LC-Fc)
CAGTCTGCTCTGACCCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGCTCTCCCGGCCAGTCCATCACCATCAGCTGTACCGGCACCTCCTCCAACATCGGCACCTACAAGTTCGTGTCCTGGTATCAGCAGCACCCCGACAAGGCCCCCAAAGTGCTGCTGTACGAGGTGTCCAAGCGGCCCTCTGGCGTGTCCTCCAGATTCTCCGGCTCCAAGTCTGGCAACACCGCCTCCCTGACCATCAGCGGACTGCAGGCTGAGGACCAGGCCGACTACCACTGTGTGTCCTACGCTGGCTCTGGCACCCTGCTGTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGACCGTGCTGGGTCAGCCCAAGGCTGCACCCAGTGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCCGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA
实施例4：hK2×CD3双特异性抗体的生物物理学表征
所选hK2×CD3双特异性抗体的亲和力
通过表面等离子体共振(SPR)测量所选hK2×CD3双特异性抗体对hK2或人CD3的亲和力。SPR是一种无标记技术，用于通过测量复合物形成和解离时的质量变化来研究两个结合配偶体之间的相互作用的强度。在涂覆有抗Fc抗体的传感器芯片上捕获抗体，随后以各种浓度以及指定的缔合和解离时间来注射可溶性hK2(或可溶性重组人CD3)。解离后，用适当的溶液再生表面以准备进行下一相互作用。通过将传感器图拟合到1:1Langmuir模型来提取动力学信息(结合速率和解离速率常数)。将结合亲和力(KD)报告为速率常数比率(koff/kon)。所选hK2/CD3双特异性抗体的KD值列于表40中。
表40.所选hK2/CD3双特异性抗体对相应结合臂的KD值
KLK2臂 KD(nM)
KL2B467 Fab 0.09
KL2B494 Fab 0.06
KL2B359-LH-scFv 0.63
KL2B413-LH-scFv 16.4
CD3B376 Fab 20-40
CD3W245 Fab 0.14
CD3W245 LH scFv 20-30
KL2B30 Fab 2
KL2B53 Fab 0.1
KL2B242 Fab 0.14
所选hK2×CD3双特异性抗体的热稳定性
使用自动化Prometheus仪器通过NanoDSF方法测定双特异性抗体样品的热稳定性。通过将样品从384孔样品板装载到24孔毛细管中来进行测量。对每个样品进行重复运行。使用Prometheus NanoDSF用户界面(熔融扫描选项卡)设置运行的实验参数。样品的热扫描范围为20℃至95℃，速率为1.0℃/分钟。双UV技术监测在330nm和350nm发射波长下的固有色氨酸和酪氨酸荧光，并且将该比率(F350nm/F330nm)相对于温度进行绘图以生成拆解曲线。使用Nano DSF测量浓度为0.5mg/mL磷酸盐缓冲盐水(在pH7.4)中的所有分子的Tm。测量的Tm值列于表41中。
表41.所选hK2×CD3双特异性抗体的KLK2或CD3结合臂的Tm值。
Figure BDA0003963650430002131
Figure BDA0003963650430002141
通过AC-SINS(亲和捕获自相互作用纳米粒子光谱)测得的自缔合潜力
使用高通量筛选测定法来测量候选抗体自相互作用的倾向。自相互作用的倾向通常转化为不良抗体溶解度和下游抗体制造的挑战。在该测定法中，金纳米颗粒(AuNP)涂覆有山羊抗人IgG(H+L)捕获抗体，并且随后在多克隆山羊IgG的存在下与候选Ab一起温育。自缔合的任何候选Ab继而使AuNP靠近，导致纳米颗粒的等离子波长(λp)(也称为最大吸光度下的波长(λmax))的偏移。每种候选抗体的偏移大小(Δλmax)指示其自缔合的强度。在该测定法中使用显示无自缔合潜力到高自缔合潜力的适当对照抗体。在该测定法中测试的所有分子显示出无自缔合风险到低自缔合风险。
实施例5：双特异性hK2×CD3抗体的体外和体内表征。
hK2×CD3双特异性抗体的体外细胞毒性
在Incucyte平台上使用实时间隔成像，利用T--细胞介导的细胞毒性试验在体外测量生成的双特异性抗体的细胞毒性潜力。在hK2阳性细胞系VCaP中，在来自健康供体的分离的pan人CD3+T细胞的存在下以3:1的效应子:靶标比率(E:T比率)测试双特异性抗体。通过测量由靶VCaP细胞稳定表达的染料的荧光信号来监测细胞凋亡引起的细胞死亡。
将正常供体pan T细胞与KLK2+VCaP细胞共同温育。将KLK2×CD3双特异性抗体以0nM至100nM给药达96小时。使用3:1的效应子与靶标(ET)比率。(A)靶细胞稳定地表达红色核染料，通过IncuCyte成像系统实时测量该红色核染料，以定量靶细胞死亡。基于VCaP细胞的实时动力学杀伤曲线的AUC对整体肿瘤细胞溶解进行绘图(图8A)。使用绿色荧光半胱天冬酶3/7试剂测量来自靶细胞死亡的凋亡信号。基于实时半胱天冬酶3/7活性曲线的AUC对总半胱氨酸酶3/7活性进行绘图(图8B)。数据显示，所测试的双特异性hK2/CD3抗体促进了存活VCaP细胞的剂量依赖性随时间增加而减少，并且因此诱导T细胞介导的VCaP肿瘤细胞死亡。双特异性hK2×CD3抗体在介导T细胞活化方面是有效的并且显示剂量依赖性KLK2+肿瘤细胞杀伤。
hK2×CD3双特异性分子引起的体外T细胞活化和增殖
测试hK2×CD3双特异性抗体促进T细胞活化和增殖的能力。用CFSE(5uM)标记正常供体泛T细胞并与KLK2(+)VCap细胞共培养。将KLK2×CD3双特异性抗体以0nM至100nM给药达96小时。使用3:1的效应子与靶标(ET)比率。共温育96小时后，收集细胞并用CD25活/死染料染色。在带Flowjo软件的Fortessa流式细胞仪上进行流式细胞术分析。测定CTV染料稀释和活化标志物CD25的频率。使用不同剂量的CD25阳性细胞的频率对体外T活化进行绘图(图9A)。使用0nM处理组确定增殖门。使用进入增殖门的细胞的频率对体外T细胞增殖进行绘图(图9B)。数据证实通过各种KLK2×CD3双特异性抗体引起的T细胞的剂量依赖性活化和增殖。
hK2×CD3双特异性分子引起的体外T细胞细胞因子释放。
在体外测量抗hK2×CD3抗体对T细胞细胞因子释放的影响。从上述体外细胞毒性实验中收集上清液样品。进行13-plex细胞因子Luminex测定以定量hK2×CD3双特异性抗体在不同剂量下的IFN-和TNF-α浓度。图10A和图10B示出了由KLK2×CD3双特异性抗体以剂量依赖性方式触发的T细胞的功能性细胞因子释放。
双特异性hK2×CD3抗体在T细胞人源化小鼠中建立的皮下(SC)人前列腺异种移植 模型中的功效。
在人前列腺肿瘤VCaP皮下小鼠异种移植模型中评价KLK2×CD3双特异性的体内功效。在建立的SC人前列腺VCaP异种移植物中评价KLK2×CD3分子的抗肿瘤功效。使用完整的雄性NSG小鼠提供适合植入人肿瘤和人T细胞的宿主。人前列腺细胞系VCaP获自美国模式培养物保藏中心(ATCC)。在指数生长期间收集VCaP细胞，并且在右胁腹以0.2mL的体积向小鼠注射1×107个细胞。每只动物腹膜内注射20e6个人T细胞。以5倍递增评价三个剂量水平：0.2mg/kg、1mg/kg和5mg/kg。双特异性抗体经腹膜内每周给药两次。首次腹膜内给药后6小时对眼睛血液进行采样，并且使用基于Luminex的测定法来测量功能性细胞因子水平。在整个研究中每周两次收集肿瘤体积和体重测量。δ肿瘤生长抑制(ΔTGI)百分比被定义为治疗组与对照组平均肿瘤负荷之间的差异，计算为ΔTGI％＝([(TVc-TVc0)-(TVt-TVt0)]/(TVc-TVc0))×100，其中“TVc”是给定对照组的平均肿瘤负荷，“TVc0”是给定对照组的平均初始肿瘤负荷，“TVt”是治疗组的平均肿瘤负荷，并且“TVt0”是治疗组的平均初始肿瘤负荷。TGI％被定义为([TVc-TVt]/TVc)×100。
本发明的KLK2×CD3化合物显示出剂量依赖性抗肿瘤作用，即在1mg/kg显示出边缘肿瘤生长抑制，并且在5mg/kg显示出抗肿瘤作用。首次给药后6小时的细胞因子评估显示出活性KLK2×CD3化合物的功能细胞因子释放高于背景，这与体内功效一致。
实施例6.HLA-G细胞系的生成。
使用pCDH慢病毒载体转导缺乏所有HLA表达的K562慢性髓细胞系(ATCC，CCL-243)以表达白血病细胞慢病毒颗粒(Genecopoeia)中的HLA-G1-IRES(内部核糖体进入位点)-β-2-微球蛋白(β2M，LPP-CS-Z7412-I0035-02-200，Genecopoeia)或人HLA-G(C42S)-IRES-β2M(LPP-CS-Z7412-I0035-01-200，Genecopoeia)，并且培养于IMDM、10％FBS，该HLA包括MHC I类蛋白质：HLA-A(Uniprot P01892)、HLA-B(Uniprot P18464)、HLA-C(Uniprot P30508)和HLA-E(Uniprot P13747)(因此适于基于NK细胞的杀伤)。在第一代，用10μg/ml嘌呤霉素(Gibco，A1113803)进行选择以确保稳定的HLA-G表达。当密度达到约3×106个细胞/ml时，细胞以1:10分裂，大约每3天至4天分裂一次。
实施例7：HLA-G抗体的生成。
使用
Figure BDA0003963650430002161
转基因人源化大鼠生成抗HLA-G抗体。/>
Figure BDA0003963650430002162
含有嵌合人/大鼠IgH基因座(包含22个人VH，以天然构型连接至大鼠CH基因座的全部的人D片段和人JH片段)连同完全人IgL基因座(连接至Jκ-Cκ的12个Vκ和连接至Jλ-Cλ的16个Vλ)。(参见例如Osborn等人，(2013)J Immunol 190(4):1481-1490)。因此，大鼠表现出大鼠免疫球蛋白的表达降低，并且响应于免疫，引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以生成具有完全人可变区的高亲和力嵌合人/大鼠IgG单克隆抗体。/>
Figure BDA0003963650430002163
的制备和用途以及由这些大鼠携带的基因组修饰描述于WO14/093908中。
使用包含重组人HLA-G1或重组人HLA-G5的α亚基的构建体与以下融合来对
Figure BDA0003963650430002172
大鼠进行免疫：β2m亚基和组蛋白H2A、表达HLA-G1的K562细胞或编码具有C42S突变的HLA-G1胞外结构域的DNA(表42)，该重组人HLA-G1或该重组人HLA-G5是含有α1、α2和α3结构域但缺乏跨膜区的HLA-G的可溶性同种型。在一些情况下，将组蛋白H2A肽与抗原融合以增强稳定性。表42示出了抗原的序列。
表42.用于生成抗体的抗原的序列。
H2A肽带下划线。β2M亚基以粗体突出显示。His、Avi-和Gly-Ser标签为斜体。
Figure BDA0003963650430002171
/>
Figure BDA0003963650430002181
/>
Figure BDA0003963650430002191
/>
Figure BDA0003963650430002201
对于HYB:420，根据重复免疫多位点(RIMMS)方案，使用重组人HLA-G1、人HLA-G5和食蟹猴Mafa-AG(HLA-G1的同系物)蛋白质对OmniRat每周两次免疫，总共进行12次免疫加强。使用源自K562细胞(
Figure BDA0003963650430002211
CCL-243TM)的表达hHLA-G1 K562的细胞系进行最终的细胞加强。使用固相ELISA法，在板上包被免疫原，测定血清滴度。收集引流淋巴结，使淋巴细胞与FO骨髓瘤细胞(/>
Figure BDA0003963650430002212
CRL-1646TM)融合，以生成杂交瘤细胞。/>
对于HYB:423，用人HLA-G pDNA(pDR000057441(表3)；C>S变体)经由胫骨肌对OmniRat进行免疫，紧接着进行活体电穿孔多次。大鼠接受人和食蟹猴两者HLA-G过表达细胞的组合的最终加强。收集引流淋巴结并与FO骨髓瘤细胞融合以生成杂交瘤细胞。
对于HYB:421，用人HLA-G pDNA在每个胫骨肌处对OmniRat进行免疫，随后进行活体电穿孔。在第25天评估滴度，范围为0至800。让大鼠休息数月，然后用pDNA进一步免疫，随后用外源过表达人HLA-G的K562细胞进行最终加强。下引流淋巴结用于生成下游杂交瘤细胞。
为了选择用于下游筛选的抗体克隆，在结合能力方面对杂交瘤细胞上清液进行筛选，检测其是否仅结合表达人HLA-G的细胞，而不结合外源表达HLA-A、HLA-B和HLA-C的细胞或不表达细胞表面MHC I类抗原的野生型K562细胞方面。选择与K562-HLA-G的结合显示出高于20倍并且与K562-HLA-A/B/C的结合显示出低于10倍(与同种型对照相比)的上清液，以进行v区测序和克隆。单克隆抗体生成以下两种格式：缺乏效应子功能的沉默格式(IgG4PAA或IgG1 AAS，其中“PAA”表示EU编号中的P228S、L234A、L235A并且“AAS”表示EU编号中的L234A、L235A、D265S的突变)，和具有正常效应子功能的活性格式(IgG1)。抗体在来自CHO细胞的上清液中表达并通过蛋白质A亲和层析分离。然后再筛选(如上所述)重组抗体，以用于确保对表达HLA-G的细胞的选择性以及它们结合重组HLA-G(MHGW2)的能力。从这些分析中，鉴定了一组48个独特的v区，选择8个独特的v区以用于进一步分析。源自MHGB688和MHGB694的这8个v区中的两个v区经种系优化以分别产生MHGB738和MHGB737。
实施例8.抗HLA-G抗体的结构表征
所选抗HLA-G抗体的可变结构域以Fab格式、VH-接头-VL取向的scFv格式或VL-接头-VH取向的scFv格式表达。
可变结构域VH、VL和CDR
表43示出了所选抗HLA-G抗体的VH和VL氨基酸序列。表44示出了所选抗HLA-G抗体的Kabat HCDR1、HCDR2和HCDR3。表45示出了所选抗HLA-G抗体的Kabat LCDR1、LCDR2和LCDR3。表46示出了所选抗HLA-G抗体的Chothia HCDR1、HCDR2和HCDR3。表47示出了抗HLA-G的Chothia LCDR1、LCDR2和LCDR3。表48示出了所选抗HLA-G抗体的IMGT HCDR1、HCDR2和HCDR3。表49示出了抗HLA-G的IMGT LCDR1、LCDR2和LCDR3。表50示出了所选抗HLA-G抗体的AbM HCDR1、HCDR2和HCDR3。表51示出了抗HLA-G的AbM LCDR1、LCDR2和LCDR3。
表43.所选抗HLA-G抗体的可变区序列。
Figure BDA0003963650430002221
/>
Figure BDA0003963650430002231
表44.所选抗HLA-G选择抗体的Kabat HCDR1、HCDR2和HCDR3。
Figure BDA0003963650430002241
表45.所选抗HLA-G抗体的KabatLCDR1、LCDR2和LCDR3。
Figure BDA0003963650430002242
/>
Figure BDA0003963650430002251
表46.所选抗HLA-G抗体的ChothiaHCDR1、HCDR2和HCDR3。
Figure BDA0003963650430002252
表47.抗HLA-G抗体的Chothia LCDR1、LCDR2和LCDR3。
Figure BDA0003963650430002261
表48.所选抗HLA-G抗体的IMGT HCDR1、HCDR2和HCDR3。
Figure BDA0003963650430002262
Figure BDA0003963650430002271
表49.抗HLA-G抗体的IMGT LCDR1、LCDR2和LCDR3。
Figure BDA0003963650430002272
表50.所选抗HLA-G抗体的AbMHCDR1、HCDR2和HCDR3。
Figure BDA0003963650430002273
Figure BDA0003963650430002281
表51.抗HLA-G抗体的AbMLCDR1、LCDR2和LCDR3。
Figure BDA0003963650430002282
Figure BDA0003963650430002291
种系优化
分析抗体的v区序列，以了解潜在翻译后修饰的风险、种系适应性、以及它们格式化为scFv的能力。两种抗体，MHGB694和MHGB688是种系优化的。MHGB694的v区含有两个种系突变(E46D和N77H)，因此通过将这些残基回复突变为这些位点处的种系序列来优化该v区，以通过VH结构域中的D46E和H77N突变生成MHGB737可变区。通过在VH结构域中E1Q、L5Q、E6Q和S71P的突变以及通过在VL中K30E、G66V的突变来类似地优化MHGB688的v区。我们发现MHGB688还在92-93位置处(Kabat)含有“NS”基序，该基序存在脱酰胺的风险。由于MHGB672的VL除了它在92-93位置处含有“HS”之外具有相同的LC-CDR，因此我们对N92H进行突变。这种变化的组合导致MHGB738。
Fab-Fc和scFv
HLA-G特异性VH/VL结构域经工程化以抗体格式、或作为scFv、或作为双特异性的臂(作为Fab-Fc或scFv-Fc)表达。抗体格式和Fab-Fc双特异性臂格式包括作为VH-CH1-铰链-CH2-CH3的重链以及作为VL-CL并表达为IgG2或IgG4的轻链。scFv-Fc格式包括VH-接头-VL-Fc或VL-接头-VH-Fc取向。scFv中使用的接头是如上所述的SEQ ID NO:31的接头。scFv-Fc和Fab-Fc用于生成双特异性抗体，如实施例14所述。
表52示出了所选抗HLA-G抗体的HC氨基酸序列。表53示出了所选抗HLA-G抗体的LC氨基酸序列。表54汇总了所选抗HLA-G抗体的HC和LC DNA SEQ ID NO。表55示出了VH-接头-VL或VL-接头-VH取向的所选scFv的氨基酸序列。表56示出了所选scFv-Fc的氨基酸序列。表57示出了scFv-Fc格式的所选抗HLA-G抗体的scFv和scFv-Fc DNA SEQ ID NO。
表52.mAb格式的所选抗HLA-G抗体的HC(VH-CH1-铰链-CH2-CH3)的氨基酸序列。
Figure BDA0003963650430002292
Figure BDA0003963650430002301
/>
Figure BDA0003963650430002311
/>
Figure BDA0003963650430002321
表53.mAb(Fab-Fc)格式的所选抗HLA-G抗体的LC(VL-CL)的氨基酸序列。
Figure BDA0003963650430002322
/>
Figure BDA0003963650430002331
/>
Figure BDA0003963650430002341
表54.所选HLA-G抗体的HC和LC的cDNA序列的SEQ ID NO
抗体 HC cDNA SEQ ID NO: LC cDNA SEQ ID NO:
MHGB665 557 558
MHGB668 559 560
MHGB669 561 562
MHGB672 563 564
MHGB687 565 566
MHGB688 567 568
MHGB689 569 570
MHGB694 571 572
MHGB732 573 574
MHGB737 575 576
MHGB738 577 578
SEQ ID NO:557
CAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCTGGACTGGTGAAGCCCAGCCAGACCCTGAGCCTGACCTGCGCTATCAGCGGCGATAGCGTGAGCTCCAACAGCGCCGCCTGGAACTGGATCAGGCAGAGCCCTAGCAGGGGCCTGGAATGGCTGGGCAGGACCTACTACAGGAGCAAGTGGTACAACGACTACGCCGTGTCCGTGAAGAGCAGGATCACCATCAACCCCGACACCAGCAAGAACCAGATCAGCCTGCAGCTGAACAGCGTGACCCCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCGGCGACAGAAGGTACGGCATCGTGGGCCTGCCTTTCGCCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:558
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCGATAGCCTGGCTGTGAGCCTGGGCGAGAGAGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGCTGCACAGCAGCAACAACAAGAACTACCTGACCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCTAGCACCAGAGAGTCCGGCGTGCCTGACAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCACCAGTACTACAGCACCCCCCCTACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO:559
CAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGACCCGGCCTGGTGAAACCCAGCCAGACCCTGAGCCTGACCTGCGCCATCAGCGGCGACAGCGTGAGCAACAACAGCGCCGCCTGGAACTGGATCAGGCAGAGCCCCAGCAGAGGCCTGGAATGGCTGGGCAGGACCTACTACAGGAGCAAGTGGTACAACGACTACGCCGTGAGCGTGAAGAGCAGGATCACCATCAACCCCGACACCTCCAAGAACCAGTTCAGCCTGCAGCTGAACAGCGTGACCCCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGTATGGCAGCGGCACCCTGCTGTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:560
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCGATAGCCTGGCTGTGAGCCTGGGAGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGCTGTACAGCAGCAAGAACAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACAAGGGAAAGCGGCGTGCCCGACAGATTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGATGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACTACAGCACCTTCCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO:561
CAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGACCCGGACTGGTGAGACCCAGCCAGACCCTGAGCGTGACCTGCGCCATCAGCGGCGACAGCGTGAGCAGCAACAGCGCCAGCTGGAACTGGATCAGGCAGAGCCCCAGCAGAGGCCTGGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGAGCGAGTGGTTCAACGACTACGCCGTGAGCGTGAAGAGCAGGGTGACCATCAACCCCGACACCAGCAAGAACCAGCTGAGCCTGCAGCTGAACAGCGTGATCCCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAGGCCAGAATCGGCGTGGCCGGCAAAGGCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:562
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCTGACTCCCTGGCTGTGAGCCTGGGCGAGAGAGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGCTGTTCAGGAGCAACAACAAGAACTACCTGGCCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAGAGCGGCGTGCCCGATAGATTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGGCCGAGGATGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACTACAGCACCCCCAGAACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO:563
CAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGACCTGGCCTGGTGAAGCCCAGCCAGACCCTGAGCCTGACATGCGCCATCAGCGGCGACAGCGTGAGCAGCAATAGGGCCGCCTGGAACTGGATCAGGCAGACCCCTAGCAGGGGCCTGGAATGGCTGGGCAGGACATACTACAGGAGCGAGTGGTACAACGACTACGCCGTGTCCGTGAAGAGCAGGATCACCATCAACCCCGACACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGCAGCTGAACAGCGTGACCCCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGTGAGAGCCGCCGTGCCTTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:564
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCGATAGCCTGGCTGTGAGCCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGCTGTTTTCCAGCAACAACAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCCAGCCCCCCAACCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAAAGCGGCGTGCCCGACAGGTTTAGCGGCAGCGTGAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCATCTACTACTGCCAGCAGTACCACAGCACCCCCTGGACATTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO:565
CAGCTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCTGGACTGGTGAAGCCCAGCGAGACCCTGAGCCTGATGTGCACCGTGAGCGGCGGCAGCATCACCAGCAGCAGCTACTACTGGGGATGGATCAGACAGCCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCAACATCTACTACAGCGGCACCACCTACTACAACCCCAGCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCAGCGTGGACACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCTGCCGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCGCCGGAGCCAGAGACTTCGACAGCTGGGGACAGGGCAGCCTGGTGACCGTGTCCAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:566
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCTGATAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGAGAGAGAGCCACCATCAACTGCAAGTCCTCCCAGAGCGTGCTGTACAGCTCCAGCAACAAGAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAGGCCCGGACAGCCTCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAGAGCGGCGTGCCTGACAGGTTTAGCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGATGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACTACAGCACCCCCAGGATGTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO:567
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGTCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGAGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCAGTATCTGTGAAAAGTCGAATAACCATCAATTCAGACACATCCAAGAACCAGATCTCCCTGCAGTTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGTGAGACCGGGGATCCCATTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCCGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:568
GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATTCAGCTCCAACAAAAAGAACTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCCCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATAATAGTACTCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO:569
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGTCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGAGCTGCCTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCAGTTTCTGTGAAAAGTCGAATAACCATCAATTCAGACACATCCAAGAACCAGATCTCCCTGCAGTTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGTGAGACCGGGGATCCCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:570
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCGAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATTCAGCTCCAACAAAAAGAACTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCCCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAACCGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATAATAGTACTCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO:571
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGCACTGGGTCCGCCAGGCCCCAGGGAAGGGGCTGGACTGGGTCTCAGGTATTAGTGGTAGTGGCTTTAGCACATACTATGTAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGCACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGATAATTTAGTGGCTGGTACCGTCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:572
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGTATTAGTAGCTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCGTCTAGTTTAGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAATAGTTATTCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGATATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO:573
CAAGTACAACTGCAACAAAGTGGTCCTGGGCTCGTGAAGCCTTCCCAGACTCTCAGCCTCACATGCGCTATAAGTGGGGATTCTGTTTCCTCAAATTCAGCAGCCTGGAATTGGATACGACAGTCTCCATCCCGTGGCCTTGAGTGGCTTGGTAGAACTTATTACCGATCCAAGTGGTACAATGATTACGCCGTTTCAGTGAAGTCCCGCATTACTATTAATCCCGACACATCTAAGAATCAAATTTCATTGCAACTGAATAGCGTAACACCCGAAGATACAGCAGTTTATTATTGTGCAGGTGATCGACGCTACGGCATAGTGGGACTTCCTTTCGCCTATTGGGGCCAAGGGACACTGGTCACTGTGTCATCCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTGCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
SEQ ID NO:574
GACATCGTAATGACACAGTCACCAGATTCATTGGCAGTTAGTCTGGGTGAAAGGGCAACAATCAACTGCAAGTCTTCTCAGAGTGTACTGCATAGTTCTAACAATAAGAACTACCTTACCTGGTTTCAACAGAAACCAGGTCAGCCCCCCAAGTTGCTGATTTACTGGGCAAGCACCCGCGAATCCGGCGTTCCCGATCGATTTTCAGGTTCCGGGAGTGGGACCGACTTTACCTTGACCATCTCTTCCTTGCAGGCCGAAGATGTAGCCGTCTATTACTGCCATCAGTATTACTCTACTCCCCCCACATTCGGTCAAGGTACAAAAGTTGAGATAAAACGGACAGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCACCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACAGCTTCTGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAAGAGTCTGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACAGCCTGTCCTCCACACTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCATCAGGGCCTGTCTAGCCCTGTGACCAAGTCTTTCAACCGGGGCGAGTGT
SEQ ID NO:575
GAGGTGCAACTCCTTGAATCAGGCGGAGGACTCGTCCAACCTGGAGGGAGTCTTAGGCTTAGCTGTGCAGCCAGTGGCTTTACTTTTAGCAGCTATGCAATGCACTGGGTCAGGCAGGCTCCTGGTAAGGGGCTCGAATGGGTCAGCGGCATATCCGGGTCAGGTTTCTCTACATATTATGTCGATTCTGTAAAAGGACGATTCACCATATCCAGAGACAATTCTAAAAATACCTTGTATCTCCAGATGAACAGCCTGAGAGCAGAAGATACCGCAGTTTATTACTGTGCAAAGGATAATCTGGTTGCCGGGACAGTTTTTGATTATTGGGGGCAAGGCACCCTCGTCACAGTATCCAGTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTGCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
SEQ ID NO:576
GATATTCAGATGACTCAATCACCTTCAACCCTTAGCGCCTCCGTTGGAGATCGCGTTACCATTACCTGCCGAGCCTCCCAAAGTATCAGCTCATGGTTGGCATGGTATCAACAGAAGCCTGGAAAGGCACCCAAACTTCTGATTTACAAAGCCAGCTCCTTGGAGTCAGGAGTCCCAAGCCGGTTCAGCGGATCTGGGTCAGGGACAGAATTTACCCTGACCATATCTTCCCTTCAGCCCGACGACTTCGCCACTTACTATTGTCAGCAATACAACTCCTATTCCCTGACTTTCGGCGGTGGCACAAAGGTTGACATCAAGCGGACAGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCACCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACAGCTTCTGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAAGAGTCTGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACAGCCTGTCCTCCACACTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCATCAGGGCCTGTCTAGCCCTGTGACCAAGTCTTTCAACCGGGGCGAGTGT
SEQ ID NO:577
CAGGTGCAGCTTCAACAGAGCGGACCTGGTCTGGTTAAGCCTTCCCAAACCCTGAGCCTGACTTGTGCTATTTCCGGGGATAGTGTTAGCTCCAATAGGGCAGCATGGAACTGGATCAGACAGTCCCCAAGCCGTGGACTTGAGTGGCTTGGACGTACTTATTACAGGAGTAAATGGTACAATGATTATGCCGTTTCTGTGAAGAGCCGTATTACTATAAACCCAGATACTTCTAAAAATCAAATTTCCCTTCAGCTCAACTCAGTTACACCAGAGGATACTGCAGTCTATTATTGCGCAAGAGTTCGACCTGGCATTCCCTTCGATTATTGGGGGCAGGGGACACCCGTTACTGTGTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTGCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
SEQ ID NO:578
GATATTGTTATGACACAGTCCCCAGATTCATTGGCAGTAAGCCTCGGTGAACGGGCTACTATTAACTGTAAGTCTTCCCAGAGTGTATTGTTCTCTTCAAATAACAAAAACTACCTGGCATGGTATCAGCAAAAGCCTGGTCAACCCCCTAAACTTCTCATATACTGGGCATCCACTCGGGAGAGCGGTGTGCCAGACCGTTTCTCAGGGAGTGTGTCAGGTACAGATTTTACACTCACAATTTCCAGCCTCCAAGCCGAAGACGTTGCAGTATATTATTGCCAACAATATCACTCTACACCTTGGACATTTGGTCAAGGTACTAAAGTCGAAATCAAACGGACAGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCACCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACAGCTTCTGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAAGAGTCTGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACAGCCTGTCCTCCACACTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCATCAGGGCCTGTCTAGCCCTGTGACCAAGTCTTTCAACCGGGGCGAGTGT
表55.VH-接头-VL(HL)或VL-接头-VH(LH)格式的抗HLA-G scFv的氨基酸序列。
Figure BDA0003963650430002511
/>
Figure BDA0003963650430002521
/>
Figure BDA0003963650430002531
/>
Figure BDA0003963650430002541
表56.scFv-Fc的氨基酸序列。
Figure BDA0003963650430002551
/>
Figure BDA0003963650430002561
/>
Figure BDA0003963650430002571
/>
Figure BDA0003963650430002581
/>
Figure BDA0003963650430002591
/>
Figure BDA0003963650430002601
/>
Figure BDA0003963650430002611
表57.抗HLA-G scFv和scFv-Fc的cDNA序列。
Figure BDA0003963650430002612
/>
Figure BDA0003963650430002621
/>
Figure BDA0003963650430002631
/>
Figure BDA0003963650430002641
/>
Figure BDA0003963650430002651
/>
Figure BDA0003963650430002661
/>
Figure BDA0003963650430002671
/>
Figure BDA0003963650430002681
/>
Figure BDA0003963650430002691
/>
Figure BDA0003963650430002701
/>
Figure BDA0003963650430002711
/>
Figure BDA0003963650430002721
/>
Figure BDA0003963650430002731
/>
Figure BDA0003963650430002741
/>
Figure BDA0003963650430002751
/>
Figure BDA0003963650430002761
/>
Figure BDA0003963650430002771
/>
Figure BDA0003963650430002781
/>
Figure BDA0003963650430002791
/>
Figure BDA0003963650430002801
/>
Figure BDA0003963650430002811
/>
Figure BDA0003963650430002821
实施例9.抗HLA-G抗体的生物物理学表征
抗HLA-G抗体的热稳定性。
以scFv格式对原始和种系优化的v区进行热稳定性筛选。简言之，将v区克隆成scFv格式并在大肠杆菌中表达。通过ELISA评估培养上清液结合重组HLA-G的能力。还在55℃、60℃或65℃下对上清液样品进行热休克，并且将热休克样品的结合与未加热样品进行比较。该分析提供了当格式化为scFv时对v区的热稳定性的估计。基于该分析，分别优选MHGB737和MHGB738，即MHGB694和MHGB688的种系优化版本。
图12和表58示出了当格式化为scFv时，v区在热处理后结合重组HLA-G的能力。v区在大肠杆菌的上清液中表达为scFv，并通过ELISA分析其结合重组HLA-G的能力。在室温下测试样品，或者在55℃、60℃或65℃下热处理10min后测试样品。B23是同种型对照。
表58.通过格式化为scFv的v区来分析热处理后的抗原结合。
Figure BDA0003963650430002822
Figure BDA0003963650430002831
结合特异性和亲和力
测试IgG1 mAb格式的v区特异性结合表达HLA-G但不表达其他MHC I类分子的细胞的能力(表59)。简言之，将1.5×107个细胞用1X PBS洗涤2次并重悬于7mL的1X PBS中并温育10min。温育后，加入8mL胎牛血清(FBS)，通过300×g离心5min洗涤细胞并以1×106个细胞/mL重悬于补充有10％FBS的DMEM中。然后通过300×g离心5min洗涤细胞，并重悬于补充有山羊抗人Fc A647(Jackson目录号109-606-098)的染色缓冲液中并在4℃下温育30min。温育后，加入150μL染色缓冲液，通过300×g离心5min洗涤细胞。将细胞重悬于200μL运行缓冲液(即补充有1mM EDTA、0.1％(v/v)普朗尼克酸的染色缓冲液)中并通过300×g离心5min进行洗涤。将细胞重悬于30mL运行缓冲液中，并通过流式细胞术分析抗体结合。
表59.抗HLA-G抗体的基于细胞的选择性。几何平均荧光信号报告结合的最大值。
Figure BDA0003963650430002832
接下来，使用表面等离子体共振(SPR)测试v区结合作为mAb的重组HLA-G的能力。SPR是一种无标记技术，用于通过测量复合物形成和解离时的质量变化来研究两个结合配偶体之间的相互作用的强度。简言之，将抗体固定在与山羊抗人Fc偶联的传感器芯片上。可溶性HLA-G1胞外结构域(MHGW8)流过固定化抗体，并监测缔合/解离反应。通过将传感器图拟合到1:1Langmuir模型来提取动力学信息(结合速率和解离速率常数)。将结合亲和力(KD)报告为速率常数比率(koff/kon)。抗体亲和力(Kd)范围为约77pM至2.6nM并且示于表60中。
表60.与HLA-G(MHGW8)结合的可变区的基于SPR的亲和力测量。
抗体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
MHGB665/MHGB732 5.18E+05 4.00E-05 7.71E-11
MHGB669 3.15E+05 4.53E-04 1.44E-09
MHGB672 3.25E+06 1.79E-03 5.50E-10
MHGB687 1.89E+05 1.53E-04 8.09E-10
MHGB688 6.58E+05 2.63E-04 4.00E-10
MHGB694 2.08E+06 2.40E-03 1.15E-09
MHGB737 1.996E+5 3.103E-4 2.555E-9
MHGB738 2.03E+10 2.83E+00 1.39E-10
实施例10.配体阻断
HLA-G在某些肿瘤类型上过表达，因此可用作肿瘤细胞的标志物。另外，HLA-G与配体ILT2和ILT4结合，这些配体在免疫效应细胞诸如NK细胞4,5上表达。HLA-G和ILT2/ILT4之间的相互作用导致抑制NK细胞活性。因此，我们假设与ILT2/4竞争结合HLA-G的抗体将阻止肿瘤细胞和NK细胞之间的抑制相互作用，并且导致增加的NK介导的肿瘤细胞杀伤。为了解决这种假设，我们首先使用竞争测定法测定抗体是否可以阻断HLA-G和ILT2/4之间的相互作用。HLA-G-dextramer复合物和外源表达ILT2或ILT4受体的HEK293T细胞之间的结合产生荧光信号。添加与HLA-G-dextramer和ILT-2/4细胞之间的相互作用竞争的mAb产生降低的荧光信号。荧光信号抑制的逆转与mAb的配体阻断抑制作用有关(表60)。简言之，重组生物素化HLA-G1(MHGW8)与链霉亲和素APC-dextramer(Immudex目录号DX01-APC)以大约4个HLA-G1蛋白/dextramer分子的最终比率结合。将dextramer-HLA-G复合物与外源表达ILT-2的HEK293T细胞或外源表达ILT-4的细胞混合，并在4℃下温育30min。添加每种浓度的抗HLA-G抗体，并与dextramer-HLA-G复合物在℃温育30分钟。添加细胞(25,000个细胞)并在4℃下温育30min。温育后，通过离心洗涤细胞和dextramer-HLA-G复合物的混合物，并将该混合物重悬于30μL运行缓冲液(Thermo BD目录号554657)中。使用
Figure BDA0003963650430002852
iQue ScreenerPlus通过流式细胞术分析重悬的混合物的荧光信号。首先对单峰细胞进行门控，然后使用SytoxTM蓝色死细胞染色(ThermoFisher)对活细胞进行门控，随后对表达ILT-2/4的细胞在GFP上进行门控，然后对结合的dextramer-HLA-G复合体在APC上进行门控。除了MHGB737之外的所有抗体都可以抑制HLA-G与ILT4的相互作用，并且除了MHGB737和MHGB687之外的所有抗体都可以抑制与ILT2的相互作用(表61)。这表明在这种活动中发现的抗体既可以靶向肿瘤也可以减轻肿瘤细胞的免疫抑制。
表61.抗体的配体阻断特性
Figure BDA0003963650430002851
实施例11.表位定位
然后我们思考配体结合的这种抑制是否归因于与ILT2/4直接竞争HLA-G上相同的结合位点。为了解决这种假设，我们使用基于氢-氘交换的LC-MS(描述于实施例9中)来鉴定ILT-2、ILT-4、MHGB732或MHGB738的HLA-G上的表位(图13)。MHGB732和MHGB738 Ab的结合有力地保护了α3结构域(成熟蛋白的氨基酸残基191-198，即序列HHPVFDYE(SEQ ID NO:667))中的相同肽，导致氘化水平的平均变化>30％。该肽在ILT2的存在下也受到保护，而在ILT4的存在下受到保护的程度较小。MHGB732和MHGB738抗体还显著保护(氘化水平的平均变化为10％至30％)由成熟蛋白的残基249-251(即序列VPS)组成的第二表位。将表位定位到HLA-G(PDB ID 1 YDP)6的晶体结构上，这表明MHGB732和MHGB738Ab的表位以及ILT2/4的表位位于α3结构域的膜近端区域。
实施例12.对基于NK细胞的细胞毒性的影响
然后我们思考是否可以通过基于NK细胞的细胞毒性介导抗肿瘤活性来抑制ILT-2/4与HLA-G的相互作用。为了解决这个问题，我们将每个可变区克隆到缺乏效应子功能的IgG1或沉默IgG4-PAA恒定区上。然后我们测试了每种抗体介导由表达Fc受体(NK-92)或缺乏Fc受体(NKL)的NK细胞介导的K562-HLA-G细胞的细胞毒性的能力。简言之，使用作为细胞增殖染料的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记过表达HLA-G细胞的K562细胞。根据图14A至图19B中的稀释度将抗体稀释到96孔板中。将K562-HLA-G细胞添加到抗体的每个孔中，并在4℃下温育1小时。以大约100,000个细胞/孔添加NKL细胞，并将混合物在IL2和NKp46(用于活化NKL细胞)的存在下在4℃温育过夜(NKL细胞)或温育4小时(NK-92细胞)。通过离心洗涤细胞并重悬于具有活/死染色剂的缓冲液中。将混合物重悬于130μL染色缓冲液中并使用FACS Forttessa细胞计数器通过流式细胞术分析。在不存在NK受体的情况下能够介导细胞毒性的抗体被认为通过阻断HLA-G和ILT-2/4之间的免疫检查点相互作用来介导这种相互作用(图14A至图19B)。我们发现，在24小时测定中，能够阻断ILT2的所有抗体(除了MHGB687之外的所有Ab)都能够增强NKL细胞介导的针对K562-HLA-G细胞的细胞毒性(图14A、图15A、图16A、图17A、图18A、图19A)，而仅基于IgG1的抗体能够增强Fc-受体介导的细胞毒性。这表明配体阻断可用作重要的抗肿瘤机制，即使在不存在Fc受体介导的效应功能的情况下。
实施例13.mAb的效应子功能
我们测试了抗体通过针对内源表达HLA-G的绒毛膜癌细胞系JEG-3(ATCC HTB-36)的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)进一步介导肿瘤细胞杀伤的能力(图20)。将抗体添加到用BATDA染料(Perkin Elmer目录号C136-100)标记的JEG-3细胞中。在细胞溶解时，染料被释放到含有铕的溶液中，铕与染料反应以形成荧光螯合物，可测量该荧光螯合物的荧光信号。以50:1的E:T比率将培养过夜的PBMC以5,000个细胞/孔添加到JEG-3细胞中，并将混合物在37℃下温育4小时。将细胞混合物以1:10添加到铕溶液中，在室温下温育15分钟，并监测610nm处的荧光以确定信号。使用含有与Triton-X 100洗涤剂混合的BADTA标记的靶细胞的孔来测定100％杀伤的荧光信号。
由于抗HLA-G Ab可在体外表现出ADCC，因此我们思考这种活性是否可被增强。若干项研究表明，由于与Fc受体的亲和力结合较高，因此具有小于10％的末端岩藻糖基化Fc的抗体表现出增强的效应子功能7。因此，我们在低岩藻糖CHO宿主中生成MHGB732和MHGB738以产生具有<10％末端岩藻糖(MHGB738.CLF)的抗体(表62，图21A至图21D)。作为阴性对照，我们生成具有不能结合Fc受体的Fc区的MHGB738的版本，并且该蛋白质被称为MHGB745。
测试正常岩藻糖抗体和低岩藻糖抗体针对抗JEG-3细胞(图21A)或针对抗RERF-LC-Ad-1细胞(人肺腺癌细胞系，JCRB1020)(图21B)诱导基于NK细胞的ADCC的能力。通过在以低水平天然表达岩藻糖基转移酶的CHO细胞中表达编码重链和轻链的构建体来生成低岩藻糖抗体，从而产生具有小于10％核心岩藻糖的抗体。效应细胞与靶细胞的比率示于该图中。该测定以与上述ADCC测定相同的方式进行。MHGB745和同种型对照两者都不在该测定中诱导ADCC。两种IgG1 Ab，即MHGB732和MHGB738可诱导ADCC，而具有低岩藻糖的Fc区的相同抗体显示出约10倍增强的ADCC活性。这表明，可通过使用低岩藻糖抗体来获得ADCC增强。
我们接下来测试了抗体介导补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力(图21C和图21D)。简言之，在含有10％FBS的DMEM(JEG-3)或RPMI(RERF-LC-Ad-1)中运行测定。将抗体添加到靶细胞中并在37℃下温育30分钟。温育后，将15％至20％(储备浓度)的兔补体(Cedarlane目录号CL3441-S)和热灭活补体分别以25μL的体积/孔添加到各孔中。将混合物在37℃下温育4小时至12小时。通过添加100μL CellTitre-Glo(Promega目录号G9242)试剂，随后在室温下温育10分钟以检测靶细胞溶解。使用Tecan酶标仪
Figure BDA0003963650430002871
监测发光。两种IgG1抗体，即MHGB732和MHGB738不介导CDC。由于IgG1 Ab不能介导CDC，因此我们将v区克隆到含有K248E、T437R(RE)突变的IgG1 Fc中，这些突变被证明能特异性增强CDC活性8。具有与其IgG1对应物相同的v区的这些Ab可介导CDC活性。我们思考RE Fc变体是否会影响低岩藻糖Ab中的ADCC活性增强，以及低岩藻糖Fc是否会影响RE Fc变体的CDC活性。在低岩藻糖宿主(具有<10％岩藻糖基化Fc)、MHGB752和MHGB758中产生的RE Ab具有与低岩藻糖IgG1 AbMHGB732和MHGB738相同的ADCC活性(图21A和图21B)。类似地，在低岩藻糖宿主中产生的REAb与在正常岩藻糖宿主中产生的RE Ab具有相同的CDC活性(图21C和图21D)。
表62.具有经修饰的恒定区的MHGB738变体的描述。
蛋白质名称 描述
MHGB732 IgG1
MHGB738 IgG1
MHGB745 L234A、L235A、D265S
MHGB752 IgG1、K248E、T437R(RE)
MHGB758 IgG1、K248E、T437R(RE)
MHGB732.CLF IgG1，低岩藻糖
MHGB738.CLF IgG1，低岩藻糖
MHGB758.CLF IgG1、K248E、T437R(RE)，低岩藻糖
MHGB758.CLF IgG1、K248E、T437R(RE)，低岩藻糖
实施例14：双特异性HLA-G×CD3抗体的生成
将实施例7至13中生成的抗HLA-G抗体的VH/VL区以及实施例1的抗CD3抗体的VH/VL区工程化为双特异性格式并且表达为IgG1。
用于HLA-G×CD3双特异性生成的CD3 scFv-Fc和CD3 Fab的工程化。
如实施例3所述生成CD3特异性scFv、scFv-Fc和Fab-Fc。另外，使用来自CD3B450(描述于US20200048349中)和CD3B219(源自SP34-2抗体(BD Biosciences 551916))的VH/VL区生成CD3特异性scFv、scFv-Fc和Fab-Fc。空白-scFv-Fc和B23B62-Fab-Fc用作阴性对照。
CD3B450-LH-scFv-Fc(SEQ ID NO:684)：
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSNIGTYKFVSWYQQHPGKAPKVMIYEVSKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCVSYAGSGTLLFGGGTKLTVLGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVFNNNAAWSWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWLYDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGYSSSFDYWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
CD3B219-LH-scFv-Fc(SEQ ID NO:685)：
QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
空白-scFv-Fc(SEQ ID NO:686)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGCAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIKGGGSGGSGGCPPCGGSGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYDGIYGELDFWGCGTLVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
B23B62-Fab-Fc臂重链(SEQ ID NO:687)：
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
B23B62-Fab-Fc臂轻链(SEQ ID NO:688)：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASQSVDYNGISYMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNPESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQIIEDPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
CD3B219-Fab-Fc臂重链(SEQ ID NO:689)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
CD3B219-Fab-Fc臂轻链(SEQ ID NO:690)：QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
用于HLA-G/CD3双特异性生成的HLA-G Fab-Fc的工程化
HLA-G特异性VH和VL区分别以VH-CH1-铰链-CH2-CH3和VL-CL格式进行工程化。使用包含Fc沉默突变L234A/L235A/D265S和设计成促进选择性异源二聚化的CH3突变T350V/T366L/K392L/T394W的SEQ ID NO:326的多肽生成HLA-G特异性VH-CH1-铰链-CH2-CH3。
使用SEQ ID NO:363或364的多肽生成HLA-G特异性VL-CL。
HLA-G Fab-Fc HC和LC的氨基酸序列分别示于表63和表64中。HLA-G Fab-Fc HC和LC的cDNA SEQ ID NO列于表65中。
表63示出了抗HLA-G Fab-Fc重链(HC)的氨基酸序列。
Figure BDA0003963650430002911
Figure BDA0003963650430002921
表64示出了抗HLA-G Fab-Fc轻链(LC)的氨基酸序列。
Figure BDA0003963650430002922
表65示出了抗HLA-G Fab-Fc轻链(LC)和重链(HC)的cDNA序列。
Figure BDA0003963650430002931
/>
Figure BDA0003963650430002941
/>
Figure BDA0003963650430002951
/>
Figure BDA0003963650430002961
用于HLA-G/CD3双特异性生成的HLA-G scFv-Fc的工程化
如实施例2所述，使用SEQ ID NO:31的接头(表2)将以VH-接头-VL或VL-接头-VH取向工程化为scFv的HLA-G VH/VL区进一步工程化为包含Fc沉默突变(L234A/L235A/D265S)和设计成促进选择性异源二聚化的T350V/T366L/K392L/T394W突变的scFv-铰链-CH2-CH3格式并且表达为IgG1。将SEQ ID NO:321的多肽用作恒定结构域铰链-CH2-CH3。
scFv-铰链-CH2-CH3格式(scFv-Fc)的抗HLA-G分子的氨基酸序列示于表66中。scFv-铰链-CH2-CH3格式(scFv-Fc)的抗HLA-G分子的cDNA序列列于表67中。
表66.抗HLA-G scFv-Fc双特异性臂的氨基酸序列。
Figure BDA0003963650430002962
/>
Figure BDA0003963650430002971
表67抗HLA-G scFv-Fc双特异性臂的cDNA序列。
Figure BDA0003963650430002972
/>
Figure BDA0003963650430002981
HLA-G×CD3双特异性
使以如上所述的HL和LH两个取向工程化为Fab-Fc的抗CD3抗体CD3B376、CD3B450、CD3B219和CD3W246的VH/VL区以及工程化为scFv-Fc的抗HLA-G抗体MHGB738、MHGB732和MHGB737的VH/VL区表达以生成双特异性抗体，得到具有呈scFv-铰链-CH2-CH3格式的HLA-G结合臂以及呈以下格式的CD3结合臂的HLA-G/CD3双特异性抗体：重链：VH-CH1-接头-CH2-CH3；和轻链：VL-CL(表68)。B23B62-Fab-Fc臂用作CD3-特异性臂的同种型对照。
可替代地，使以HL和/或LH取向(参见表68)工程化为scFv-Fc的抗CD3抗体CD3W246、CD3B450和CD3B219的VH/VL区以及如上所述工程化为Fab的抗HLA-G抗体MHGB738、MHGB732和MHGB737的VH/VL区表达以生成双特异性抗体，得到具有呈重链VH-CH1-接头-CH2-CH3和轻链VL-CL格式的HLA-G结合臂以及呈scFv-铰链-CH2-CH3格式的CD3结合臂的HLA-G/CD3双特异性抗体。用于产生抗scFv的接头是SEQ ID NO:31的接头(表68)。
如上所述将T350V_L351Y_F405A_Y407V CH3突变工程化到一条重链中并且将T350V_T366L_K392L_T394W CH3突变工程化到另一条重链中。另外，HK2和CD3结合臂都经工程化为含有如上所述的Fc效应子沉默突变L234A_L235A_D265S。
使工程化链表达并且使用标准方法纯化所得双特异性构建体。如实施例15至17所述，表征了这些双特异性抗体与HLA-G和CD3的结合、它们的体外细胞毒性、免疫检查点应答和体内功效。
表68.HLA-G×CD3双特异性抗体。
Figure BDA0003963650430002991
Figure BDA0003963650430003001
实施例15.BsAb格式化和体外测试
针对肿瘤细胞的T细胞重定向已经在临床中显示出广阔的前景，并且我们思考靶向HLA-G以及T细胞受体复合物的CD3亚基的双特异性抗体(BsAb)是否将针对表达HLA-G的肿瘤细胞显示出细胞毒性。导联v区被格式化为具有一系列CD3结合重定向臂的BsAb(表69)。简言之，将50000个细胞/孔的靶细胞(NCI-H2009-b2m)与浓度从10nM开始的抗体一起温育，并以半对数/孔连续温育。以3:1的比率添加纯化的原代T细胞，将混合物在37℃下温育72小时。在BD FACS染色缓冲液中添加1μL/10^6个细胞的LIVE/DEAD近红外染色剂(死细胞染色剂，L34976，Invitrogen)和5μL/10^6个细胞的Brilliant violet抗CD25(Biolegend目录号302630)来制备染色溶液。用Accutase解离细胞混合物，然后通过流式细胞术进行添加分析。在FSC-A对SSC-A以及CFSE(BL-1)对SSC-A上对细胞进行门控，并且通过CFSE(BL-1)对近红外活/死(RL2-H)门控的总肿瘤靶细胞群来鉴定非存活肿瘤细胞。使用ForeCyt(Sartorius)高级度量分析数据以计算肿瘤细胞毒性。当HLA-G结合v区与CD3结合臂配对时，所有BsAb显示出增强T细胞介导的细胞毒性的能力，其中EC50值与HLA-G靶向臂和CD3靶向臂两者的结合亲和力相关(表69)。
表69.BsAb设计和细胞毒性
Figure BDA0003963650430003011
进一步测试BsAb介导的T细胞活化以及针对其他细胞系(即Hup-T3和RERF-LC-Ad-1(图22A至图22D))的基于T细胞的细胞毒性的能力。图22A至图22D示出了由HC3B125介导的针对表达HLA-G的肿瘤细胞的细胞毒性。
两种BsAb，即HC3B125和HC3B258的区别仅在于在重链中表达C末端赖氨酸K447的密码子的存在(HC3B258)或不存在(HC3B125)。由于抗体的重链的C末端赖氨酸通常经蛋白水解处理，因此这两个Ab显示出相同的质谱(表70)。另外，它们显示出相同的生物物理学特性，诸如热稳定性以及对T细胞和K562-HLA-G细胞的结合亲和力。另外，HC3B258显示出与HC3B125相似的细胞毒性特性(图23)。
表70.HC3B125和HC3B258的生物物理学特性的比较。
Figure BDA0003963650430003021
实施例16.免疫检查点应答的观察
我们观察到抗HLA-G mAb的细胞毒性机制以效应子功能(例如ADCC)为特征，并且CD3×HLA-G BsAb可诱导所有表达HLA-G的细胞类型的杀伤。肿瘤通常通过上调可抑制免疫细胞的某些免疫检查点调节剂(诸如PD-L1或CTLA-49)来逃避免疫监视。因此，我们思考通过CD3×HLA-G BsAb靶向癌细胞进行T细胞介导的细胞毒性是否能够克服肿瘤细胞上免疫检查点调节剂的表达。我们测量了表达HLA-G的肿瘤细胞是否表达免疫检查点配体(表71)。简言之，如实施例11所述培养细胞，然后用靶向表71所示的受体的市售抗体染色。使用流式细胞术测量荧光以确定每种受体的相对表达水平。有趣的是，我们观察到RERF-LC-Ad1细胞以显著高于其他靶细胞的水平表达PD-L1，并且CD3×HLA-G BsAb仍可介导针对RERF-LC-Ad1细胞的基于T细胞的细胞毒性(图22A至图22D)。我们观察到，我们的靶向肿瘤细胞上的HLA-G的α3结构域的Ab具有基于T细胞的细胞毒性，可克服肿瘤细胞上的免疫检查点配体表达。
表71.对表达HLA-G的肿瘤细胞上的免疫检查点抗原表达的综合分析
Figure BDA0003963650430003022
/>
Figure BDA0003963650430003031
实施例17.体内功效
虽然已经针对大多数类型的癌症建立了患者的HLA-G表达和不良预后之间的相关性，但迄今HLA-G在体内肿瘤逃逸中的直接作用尚未得到证明。虽然不存在HLA-G的鼠同系物，但存在ILT-2，因此针对HLA-G的作用的研究需要异种移植模型和人源化小鼠。
在一系列小鼠研究中测试Ab和BsAb在体内介导抗肿瘤功效的能力。示于图24A至图24B、表72中的研究由以下组成：在来自Jackson实验室的人源化雌性hNSG-SGM3小鼠(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlTg(CMV-IL3，CSF2，KITLG)中皮下植入胰脏肿瘤模型PAXF1657(Charles River Discovery Research Services Germany GmbH)的功效实验。来自三个不同供体(#2595、#2597和#5867)的移植有人脐带血衍生的CD34+造血干细胞(HSC)的小鼠在移植后10周至11周由动物分销商检查HSC的移植程度是否充分(>25％人CD45+细胞)。PAXF 1657肿瘤在到达后18天植入，并在随机分组前2天再次检查移植程度。该实验包括八组10只或11只小鼠，每组携带一个PAXF 1657肿瘤。在随机分组当天用数字卡尺(S_Cal EVOBluetooth，Switzerland)通过二维测量测定绝对肿瘤体积(ATV)，然后每周测量两次。根据下式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝(l×w2)×0.5，其中l＝最大径，w＝肿瘤的宽度(垂直直径)(以mm计)。以46.7mm3至117.7mm3的肿瘤体积，将小鼠分布在八个组中，旨在具有可比较的组平均肿瘤体积和中值肿瘤体积，同时确保尽可能均匀地分布在用来自三个供体的HSC人源化的小鼠组中。每种抗体以两个或三个剂量水平进行评价，并在第0、3、7、10、14、17、21、24天施用(静脉内，2次/周)。使用媒介物对照组作为参照来评估所有组的抗肿瘤功效。在处理期结束时，通过比较试验组的肿瘤体积的变化相对于对照组的变化来测定肿瘤生长抑制(TGI)，并且表示为以百分比计的ΔTGI值(在文中表示为TGI)。根据下式使用绝对肿瘤体积计算TGI：ΔTGIx[％]＝(1-平均值(Tx-T0)/平均值(Cx-C0))×100，其中T0和C0是治疗开始时(即随机分组的当天)测试组和对照组中的绝对肿瘤体积，Tx和Cx是治疗期结束时相应的绝对肿瘤体积。在本研究中这是第25天。实验在第27天终止。HC3B125显著抑制了hNSG-SGM3小鼠中肿瘤模型PAXF 1657的生长。与媒介物对照组相比，肿瘤生长抑制对于所评价的所有三个剂量水平都是统计学上的显著的(Kruskal-Wallis检验与Dunn事后试验组合，表50)。在0.002mg HC3B125组的11只动物中有6只动物的肿瘤完全消退，在0.006mg HC3B125组的11只动物中有8只动物的肿瘤完全消退，并且在0.02mg HC3B125组的11只动物中有9只动物的肿瘤完全消退。在实验结束时，在0.002mg/0.006mg/0.02mg HC3B125组中分别有6只/7只/6只无肿瘤存活者。
HC3B128在测试的任一剂量水平下均不抑制肿瘤生长。尽管与对照组相比，在较高剂量的HC3B128下观察到组平均肿瘤体积有少量减少，但这种差异不是统计学上的显著的(表71)。
表72.胰腺PDX模型功效统计
Figure BDA0003963650430003041
Figure BDA0003963650430003051
n/a＝不适用；n.r.＝未达到(即组中值RTV总是<200％/400％)
抗体的媒介物：PBS
2根据肿瘤生长抑制部分中给出的公式，在施用最终2QW处理后的首个测量日(第25天)计算各组中的ΔTGI值；对于另外的TGI、T/C和肿瘤消退值，参见附录1。
3根据肿瘤消退部分测定部分(PR)和完全消退(CR)。TFS：无肿瘤存活者；Td，肿瘤双倍增时间；tq，肿瘤四倍增时间。
在HuP-T3细胞系衍生的异种移植(CDX)模型中，用HC3B125处理也可导致肿瘤生长抑制(图25，表73)。该研究包括在T细胞人源化NSG(Jackson Laboratories)小鼠中利用皮下植入的胰腺肿瘤模型HuP-T3(Sigma-Aldrich)(在50％Cultrex(R&D系统)中10e6个细胞/小鼠)的功效实验。该实验包括六组10只小鼠，每一组携带一个HuP-T3肿瘤。在第7天，以75mm3至150mm3的肿瘤体积，将小鼠随机分成六组，旨在具有可比较的组平均肿瘤体积和中值肿瘤体积。随机分组后，在随机分组的同一天，对小鼠腹膜内移植T细胞(20e6细胞/小鼠，0.2mL/动物；ALLCELLS 6093T细胞供体)。以五个剂量水平对HC3B125抗体进行评价。使用空白×CD3治疗组作为参照评估所有组的抗肿瘤功效。处理在T细胞移植后1天开始，并且在第8、11、14、17、21、24、28、31、35、38、42、48天进行(腹膜内，2次/周)。在处理期结束时，通过比较试验组的组平均肿瘤体积相对于空白×CD3处理对照组的组平均肿瘤体积的变化来测定肿瘤生长抑制，并表示为以百分比计的ΔTGI值(在本文中表示为TGI)。肿瘤植入后第42天用作TGI计算的最后一天。实验在第46天终止。HC3B125显著抑制了hNSG小鼠中肿瘤模型HuPT3的生长。与空白×CD3处理的对照组相比，肿瘤生长抑制对于所评价的所有五个给药水平都是统计学上的显著的(表73)。
表73.HuP-T3模型功效统计
Figure BDA0003963650430003061
参考文献
1Lee,N.et al.The membrane-bound and soluble forms of HLA-G bindidentical sets of endogenous peptides but differ with respect to TAPassociation.Immunity 3,591-600,doi:10.1016/1074-7613(95)90130-2(1995).
2Juch,H.et al.A novel sandwich ELISA for alpha1 domain baseddetection of soluble HLA-G heavy chains.J Immunol Methods 307,96-106,doi:10.1016/j.jim.2005.09.016(2005).
3Morales,P.J.,Pace,J.L.,Platt,J.S.,Langat,D.K.&Hunt,J.S.Synthesis ofbeta(2)-microglobulin-free,disulphide-linked HLA-G5 homodimers in humanplacental villous cytotrophoblast cells.Immunology 122,179-188,doi:10.1111/j.1365-2567.2007.02623.x(2007).
4Carosella,E.D.,Favier,B.,Rouas-Freiss,N.,Moreau,P.&Lemaoult,J.Beyondthe increasing complexity of the immunomodulatory HLA-G molecule.Blood 111,4862-4870,doi:10.1182/blood-2007-12-127662(2008).
5Carosella,E.D.,Rouas-Freiss,N.,Tronik-Le Roux,D.,Moreau,P.&LeMaoult,J.HLA-G:An Immune Checkpoint Molecule.Adv Immunol 127,33-144,doi:10.1016/bs.ai.2015.04.001(2015).
6Clements,C.S.et al.Crystal structure of HLA-G:a nonclassical MHCclass I molecule expressed at the fetal-maternal interface.Proc Natl Acad SciU S A 102,3360-3365,doi:10.1073/pnas.0409676102(2005).
7Shields,R.L.et al.Lack of fucose on human IgG1 N-linkedoligosaccharide improves binding to human Fcgamma RIII and antibody-dependentcellular toxicity.J Biol Chem 277,26733-26740,doi:10.1074/jbc.M202069200(2002).
8Zhang,D.et al.Functional optimization of agonistic antibodies toOX40 receptor with novel Fc mutations to promote antibodymultimerization.MAbs 9,1129-1142,doi:10.1080/19420862.2017.1358838(2017).
9Wilky,B.A.Immune checkpoint inhibitors:The linchpins of modernimmunotherapy.Immunol Rev 290,6-23,doi:10.1111/imr.12766(2019).
实施例18.双特异性DLL3×CD3的生成
将使用转基因小鼠
Figure BDA0003963650430003071
生成的抗δ样配体3(DLL3)抗体的VH/VL区以及实施例1的抗CD3抗体的VH/VL区工程化为双特异性格式并且表达为IgG1。另外，使用描述于US20200048349中的CD3特异性抗体CD3B376和CD3B450的VH/VL区。
将设计的重链分子合成为gblock(IDT；Coralville，IA)，其在5'和3'末端含有15bp重叠，用于使用InFusion方法(ClonTech)进行连接独立克隆。将所有轻链构建体插入含有BswiI和HindIII限制性位点的pLonza载体中以用于框内连接到人κ恒定结构域。编码鼠IgH信号肽以允许mAb有效分泌到培养上清液中。根据制造商方案，将所有gblock在无菌水中重构并在50℃下温育10分钟。将pLonza载体(Lonza；Basel，Switzerland)使用EcoRI和HindIII线性化，随后进行凝胶提取和纯化。使用质量比为2:1的线性化载体与插入序列，随后在50℃下热脉冲15分钟。将infusion反应物转化到Stellar感受态细胞(ClonTech)中，并将所得菌落刮下以用于小量制备。使用无内毒素大量提取制备试剂盒(Qiagen；Hilden,Germany)对所有构建体进行序列验证和放大。
用于双特异性DLL3×CD3生成的CD3和DLL3 scFv的工程化
使用SEQ ID NO:31的接头(表2)以VH-接头-VL或VL-接头-VH取向将CD3 VH/VL工程化为scFv。将结合CD3的VH-接头-VL或VL-接头-VH scFv分子进一步工程化为scFv-铰链-CH2-CH3格式，该格式包含Fc沉默突变(L234A/L235A/D265S)和二聚化突变，以允许DLL3和CD3重链的异源二聚化。
使用与上述SEQ ID NO:31(表2)的CD3 scFv生成相同的接头，以VL-接头-VH取向将DLL3 VH/VL区工程化为scFv。将结合DLL3的VL-接头-VH scFv分子进一步工程化为包含Fc沉默突变(L234A/L235A/D265S)的scFv-铰链-CH2-CH3格式。设计成用于促进Fc结构域的选择性异源二聚化的突变也在Fc结构域中被工程化。
用于DLL3/CD3双特异性生成的CD3和DLL3 Fab的工程化
CD3和DLL3特异性VH和VL区分别以VH-CH1-铰链-CH2-CH3和VL-CL格式进行工程化并且表达为IgG1。将Fc沉默突变L234A/L235A/D265S引入Fc区。设计成用于促进Fc结构域的选择性异源二聚化的突变也在Fc结构域中被工程化。
双特异性DLL3×CD3抗体的表达
根据制造商的建议，通过用纯化的质粒DNA瞬时转染，在ExpiCHO-STM细胞中表达双特异性抗体。简言之，在设定为37℃、8％CO2和125RPM的回转振荡温育箱中使ExpiCHO-STM细胞在ExpiCHO-STM表达培养基(ThermoFisher Scientific，目录号A29100)中保持悬浮。，在转染至6.0×106个细胞/ml之前，将细胞传代并稀释，从而将细胞活力保持在99.0％或更高。使用ExpiFectamineTMCHO转染试剂盒(ThermoFisher Scientific，目录号A29131)进行瞬时转染。对于每毫升待转染的稀释细胞，使用0.5微克每种编码DNA的双特异性抗体(比率为HC1:LC1:HC2＝1:2:2)和0.5微克pAdVAntage DNA(Promega，目录号E1711)，并稀释到OptiPROTMSFM络合介质中。对于每升细胞，将2.56mL ExpiFectamineTMCHO试剂稀释到8mLOptiPROTM中。将所稀释的DNA与转染试剂合并一分钟，允许DNA/脂质复合物形成，然后添加到细胞中。在温育过夜后，根据制造商的标准方案将ExpiCHOTM进料和ExpiFectamineTM CHO增强子添加到细胞中。在收获培养液之前，将细胞在37℃下回转振荡(125rpm)温育七天。通过离心(30min，3000rpm)澄清来自瞬时转染的ExpiCHO-STM细胞的培养上清液，随后进行过滤(0.2μm PES膜，Corning；Corning,NY)，收获瞬时转染的ExpiCHO-STM细胞的培养上清液。
双特异性DLL3×CD3抗体的纯化
使用AKTA Avant 150层析系统将所过滤的细胞培养上清液装载到预平衡的(1xDPBS，pH 7.2)HiTrap MabSelect SuRe蛋白质A柱(GE Healthcare)上。装载后，用5个柱体积的1x DPBS(pH 7.2)洗涤柱。用8个柱体积的0.1M乙酸钠(Na)(pH 3.5)洗脱蛋白质。通过添加2.5M的Tris HCl(pH 7.2)至最终体积的15％(v/v)来完全中和蛋白级分，并进行注射器过滤(0.2μm)。将所中和的蛋白质溶液装载到2x 5mL预包装的CaptureSelectTM IgG-CH1亲和基质(Thermo Fisher Scientific)上。用10个柱体积的1x DPBS(pH 7.2)洗涤柱。用10个柱体积的0.1M乙酸钠(Na)(pH 3.5)洗脱蛋白质。通过添加2.5M的Tris HCl(pH 7.2)至最终体积的15％(v/v)来完全中和蛋白质级分。将主峰级分合并，在1x DPBS(pH 7.2)中透析，总共3次透析变化，并过滤(0.2μm)。
表74至表77示出了所选DLL3/CD3双特异性抗体的序列信息。
表74.DLL3/CD3双特异性抗体的HC和LC氨基酸SEQ ID NO
Figure BDA0003963650430003101
表75：所选双特异性抗体的氨基酸序列
Figure BDA0003963650430003102
/>
Figure BDA0003963650430003111
/>
Figure BDA0003963650430003121
/>
Figure BDA0003963650430003131
/>
Figure BDA0003963650430003141
表76.双特异性DLL3/CD3抗体的Kabat CDR SEQ ID NO
Figure BDA0003963650430003142
/>
Figure BDA0003963650430003151
表77.DLL3/CD3双特异性抗体的HC和LC DNA SEQ ID NO
Figure BDA0003963650430003152
/>
Figure BDA0003963650430003161
>SEQ ID NO:705(DL3B582和DL3B583中DL3B279-Fab-Fc HC1 cDNA)CAGGTTCAGTTGGTCCAGAGTGGTGCCGAAGTAAAGAAGCCCGGAGCATCCGTAAAGGTGTCCTGTAAAGCCAGTGGCAATACTTTCACTAACTATTACATCCATTGGGTCCGACAAGCCCCCGGACAAGGATTGGAGTGGATGGGTATTATCAACCCCTCCGGTGGGTCTACTTCTTACGCTCAAAAACTCCAGGGCCGAATGACAATGACACGCGACACCTCAACTTCAACCGTTTACATGGAGCTTAGCAGTCTTCGATCTGAGGACACTGCTGTTTACTTTTGCGCTAGGCAGGGGCCTTTCATAGGAGACGCTTTTGACATCTGGGGGCAAGGAACAATGGTCACTGTCAGTTCCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGCTGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACCTCACCTGGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
>SEQ ID NO:706(DL3B582和DL3B583中的DL3B279-Fab-Fc LC1 cDNA)
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTCTTTAAGCGCTAGCGTGGGCGATCGTGTGACCATCACTTGTCGTGCCAGCCAAGGTATCAGCAACTATTTAGCTTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCCAAGTCTTTAATCTATGCCGCTAGCTCTTTACAGAGCGGAGTGCCCAGCAAGTTTAGCGGCAGCGGTAGCGGAACCGACTTCACTTTAACCATCAGCTCTCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAACAGCTACCCCTACACCTTCGCCCAAGGTACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
>SEQ ID NO:707(DL3B585和DL3B587中的DL3B279 LH scFv-Fc cDNA)
GATATTCAGATGACACAGTCTCCATCCAGCTTGTCAGCAAGCGTGGGTGATAGGGTTACCATCACTTGTCGCGCAAGTCAAGGAATTAGTAACTATTTGGCATGGTTTCAGCAGAAACCCGGTAAGGCTCCAAAATCACTCATATATGCAGCATCCTCCCTCCAGTCTGGTGTTCCAAGTAAGTTTTCCGGGAGCGGTTCCGGCACCGATTTCACTCTCACAATCTCTAGCCTTCAACCCGAGGACTTCGCTACCTATTATTGCCAACAGTATAATAGCTACCCATACACTTTTGCTCAAGGGACCAAACTCGAGATCAAAGGCGGCTCCGAGGGCAAGAGCAGCGGCAGCGGCAGCGAGAGCAAGAGCACCGGCGGCAGCCAGGTTCAGTTGGTCCAGAGTGGTGCCGAAGTAAAGAAGCCCGGAGCATCCGTAAAGGTGTCCTGTAAAGCCAGTGGCAATACTTTCACTAACTATTACATCCATTGGGTCCGACAAGCCCCCGGACAAGGATTGGAGTGGATGGGTATTATCAACCCCTCCGGTGGGTCTACTTCTTACGCTCAAAAACTCCAGGGCCGAATGACAATGACACGCGACACCTCAACTTCAACCGTTTACATGGAGCTTAGCAGTCTTCGATCTGAGGACACTGCTGTTTACTTTTGCGCTAGGCAGGGGCCTTTCATAGGAGACGCTTTTGACATCTGGGGGCAAGGAACAATGGTCACTGTCAGTTCCGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGCTGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACCTCACCTGGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
>SEQ ID NO:708(DL3B279 LH scFv变体-Fc cDNA)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTCTGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCTCTCAGGGCATCTCCAACTACCTGGCCTGGTTCCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGAGCCTGATCTACGCTGCTTCCAGTCTGCAGTCTGGCGTGCCCTCTAAGTTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTTACCCTGACAATCTCCAGCCTGCAGCCTGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAACAGCTACCCCTACACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGGGCGGCTCCGAGGGCAAGAGCAGCGGCAGCGGCAGCGAGAGCAAGAGCACCGGCGGCAGCCAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCTGGACAGACCTTCACCAACTACTACATCCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGACAAGGATTGGAGTGGATGGGCATCATCAACCCTTCCGGCGGCTCTACCTCTTACGCCCAGAAACTGCAGGGCAGAATGACCATGACCAGAGACACCTCCACCAGCACCGTGTACATGGAACTGTCCAGCCTGAGATCCGAGGATACCGCCGTGTACTTCTGTGCCAGACAGGGACCTTTTATCGGCGACGCCTTCGACATCTGGGGCCAGGGAACAACAGTGACCGTGTCCTCTGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACTTGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGCTGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACCTCACCTGGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCTCTCTCCCTGTCTCCGGGAAAA
>SEQ ID NO:709(DL3B279 scFv-Fc变体KIH cDNA)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTCTGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCTCTCAGGGCATCTCCAACTACCTGGCCTGGTTCCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGAGCCTGATCTACGCTGCTTCCAGTCTGCAGTCTGGCGTGCCCTCTAAGTTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTTACCCTGACAATCTCCAGCCTGCAGCCTGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAACAGCTACCCCTACACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGGGCGGCTCCGAGGGCAAGAGCAGCGGCAGCGGCAGCGAGAGCAAGAGCACCGGCGGCAGCCAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCTGGACAGACCTTCACCAACTACTACATCCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGACAAGGATTGGAGTGGATGGGCATCATCAACCCTTCCGGCGGCTCTACCTCTTACGCCCAGAAACTGCAGGGCAGAATGACCATGACCAGAGACACCTCCACCAGCACCGTGTACATGGAACTGTCCAGCCTGAGATCCGAGGATACCGCCGTGTACTTCTGTGCCAGACAGGGACCTTTTATCGGCGACGCCTTCGACATCTGGGGCCAGGGAACAACAGTGACCGTGTCCTCTGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
>SEQ ID NO:710(CD3W245 LH scFv-Fc cDNA)
GACATACAAATGACACAATCACCCTCTTCTCTTTCTGCAAGCGTTGGCGACCGTGTCACTATCACTTGTCGAGCCCGCCAGTCCATAGGTACTGCCATTCACTGGTATCAACAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAACTCCTGATTAAGTATGCCAGCGAGAGCATTTCCGGCGTACCTTCAAGATTTTCCGGCTCCGGTAGTGGGACAGATTTCACTCTCACTATATCTAGCCTCCAACCAGAAGATTTCGCCACTTACTACTGTCAACAATCAGGTTCATGGCCTTACACTTTCGGCCAGGGGACAAAATTGGAGATCAAGGGCGGCTCCGAGGGCAAGAGCAGCGGCAGCGGCAGCGAGAGCAAGAGCACCGGCGGCAGCGAGGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGATATAACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTACTAGTAGTAATTACATATACTACGCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCTTCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGGATCTGCAAATGAGCGGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTATTTATTACTGTACGAGAGGCTGGGGGCCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
>SEQ ID NO:711(CD3W245 HL scFv-Fc cDNA)
GAGGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGATATAACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTACTAGTAGTAATTACATATACTACGCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCTTCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGGATCTGCAAATGAGCGGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTATTTATTACTGTACGAGAGGCTGGGGGCCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGCGGCTCCGAGGGCAAGAGCAGCGGCAGCGGCAGCGAGAGCAAGAGCACCGGCGGCAGCGACATACAAATGACACAATCACCCTCTTCTCTTTCTGCAAGCGTTGGCGACCGTGTCACTATCACTTGTCGAGCCCGCCAGTCCATAGGTACTGCCATTCACTGGTATCAACAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAACTCCTGATTAAGTATGCCAGCGAGAGCATTTCCGGCGTACCTTCAAGATTTTCCGGCTCCGGTAGTGGGACAGATTTCACTCTCACTATATCTAGCCTCCAACCAGAAGATTTCGCCACTTACTACTGTCAACAATCAGGTTCATGGCCTTACACTTTCGGCCAGGGGACAAAATTGGAGATCAAGGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
>SEQ ID NO:712(CD3W245 Fab-Fc HC2 cDNA)
GAGGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGATATAACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTACTAGTAGTAATTACATATACTACGCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCTTCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGGATCTGCAAATGAGCGGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTATTTATTACTGTACGAGAGGCTGGGGGCCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
>SEQ ID NO:713(CD3W245 Fab-Fc LC2 cDNA)
GACATACAAATGACACAATCACCCTCTTCTCTTTCTGCAAGCGTTGGCGACCGTGTCACTATCACTTGTCGAGCCCGCCAGTCCATAGGTACTGCCATTCACTGGTATCAACAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAACTCCTGATTAAGTATGCCAGCGAGAGCATTTCCGGCGTACCTTCAAGATTTTCCGGCTCCGGTAGTGGGACAGATTTCACTCTCACTATATCTAGCCTCCAACCAGAAGATTTCGCCACTTACTACTGTCAACAATCAGGTTCATGGCCTTACACTTTCGGCCAGGGGACAAAATTGGAGATCAAGCGGACAGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCACCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACAGCTTCTGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAAGAGTCTGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACAGCCTGTCCTCCACACTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCATCAGGGCCTGTCTAGCCCTGTGACCAAGTCTTTCAACCGGGGCGAGTGT
>SEQ ID NO:714(CD3B376 Fab-Fc HC2 KIH cDNA)
CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCCCTAGACTCGTGCGGCCTTCCCAGACCCTGTCTCTGACCTGTGCCATCTCCGGCGACTCCGTGTTCAACAACAACGCCGCCTGGTCCTGGATCCGGCAGTCTCCATCTCGCGGTCTGGAGTGGCTCGGTCGCACCTACTACCGCTCTAAATGGCTGTACGACTACGCCGTGTCCGTGAAGTCCCGGATCACCGTGAACCCTGACACCTCCCGGAACCAGTTCACCCTGCAGCTGAACTCCGTGACCCCTGAGGACACCGCCCTGTACTACTGCGCCAGAGGCTACTCCTCCTCCTTCGACTATTGGGGCCAAGGCACCCTCGTGACCGTGTCCTCTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCCGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCGAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTCCTGCGCCGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGGTTCACGCAGAAGTCTCTCTCCCTGTCTCCGGGAAAA
>SEQ ID NO:715(CD3B376 Fab-Fc LC KIH cDNA)
CAGTCTGCTCTGACCCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGCTCTCCCGGCCAGTCCATCACCATCAGCTGTACCGGCACCTCCTCCAACATCGGCACCTACAAGTTCGTGTCCTGGTATCAGCAGCACCCCGACAAGGCCCCCAAAGTGCTGCTGTACGAGGTGTCCAAGCGGCCCTCTGGCGTGTCCTCCAGATTCTCCGGCTCCAAGTCTGGCAACACCGCCTCCCTGACCATCAGCGGACTGCAGGCTGAGGACCAGGCCGACTACCACTGTGTGTCCTACGCTGGCTCTGGCACCCTGCTGTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGACCGTGCTGGGTCAGCCCAAGGCTGCACCCAGTGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCCGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA
实施例19.双特异性DLL3×CD3抗体的表征
DLL3表位对双特异性DLL3×CD3介导的细胞毒性的影响
为了测定DLL3表位对双特异性DLL3×CD3介导的对DLL3+靶细胞的杀伤的影响，使用人泛T细胞作为效应子以及SHP-77细胞作为靶标以3:1的比率进行T细胞重定向72小时。将等体积(100μl)的2X测试样品从20nM(最终从10nM开始)以1/2对数稀释液添加到50000个CSFE标记的SHP-77细胞中，在最终体积为200μl的RPMI、10％FBS中，将其与150000个泛T细胞在37℃下混合72小时。72小时后，用PBS洗涤板1次，在染色缓冲液中与近红外L/D染色剂和BV421标记的抗CD25抗体温育20分钟。用染色缓冲液洗涤细胞两次，将这些细胞重悬于25μl的Accutase中达10分钟，然后添加25μl的QSol缓冲液。在IQue plus上读板，在CSFE阳性细胞群(肿瘤细胞)和CSFE阴性细胞(T细胞)上对细胞进行门控，随后在活/死染色剂上对两个细胞群进行。在CD25染色上对活T细胞进行进一步门控。计算的输出为肿瘤杀伤％、CD25T细胞活化％和T细胞存活力。将红宝石红色染色的对照组(模拟100％死亡)和仅T细胞/仅SHP-77用于对含有来自碎片的细胞的细胞核进行门控，然后对单个细胞群进行门控。在GeneData Screenr中使用4个参数曲线拟合来分析数据。下表示出了对于与各种CD3臂配对的每种DLL3结合物，在72小时结束时观察到的SHP-77细胞的最大溶解百分比。结果表明，肿瘤杀伤％取决于DLL3上的结合表位，该结合表位离膜越远，则细胞溶解越小(表78至表80)。当DLL3结合表位变得更接近膜时，肿瘤杀伤％得到改善。当DLL3结合物与3种不同的CD3配对时，这种趋势是相对一致的。
本发明人出乎意料地发现，当DLL3内的结合结构域向一级序列中的C末端或肿瘤膜的近端移动时，每个结构域中的最大杀伤增加，呈现了令人感兴趣的趋势。特别地，当测试抗体结合位于EGF-6结构域或更接近C末端时，最大杀伤效率从EGF2提高到EGF6并达到最高百分比。
表78：SHP-77在与人泛T细胞和双特异性抗DLL3×CD3W245抗体以3:1的ET比率 (CD3:靶细胞)共培养后第3天的溶解％。
Figure BDA0003963650430003271
表79：SHP-77在与人泛T细胞和双特异性抗DLL3×CD3B376抗体以3:1的ET比率 (CD3:靶细胞)共培养后第3天的溶解％。
Figure BDA0003963650430003272
表80：SHP-77在与人泛T细胞和双特异性抗DLL3×CD3B219抗体以3:1的ET比率 (CD3:靶细胞)共培养后第3天的溶解％。
Figure BDA0003963650430003281
双特异性抗DLL3×CD3抗体对DLL3的结合亲和力
使用Biacore T200仪器通过表面等离子体共振(SPR)测定抗DLL3×CD3抗体对重组人DLL3的结合亲和力。在山羊抗Fc抗体修饰的C1芯片上捕获抗体，并用浓度范围为90nM至1.1nM的DLL3抗原的3倍系列稀释液进行滴定。使用100μL/min的流速，监测缔合2分钟并监测解离5分钟或60分钟。通过从空白中减去分析物结合信号来参考原始结合数据，并且使用1:1Langmuir结合模型使用Biacore Insight评估软件来分析原始结合数据，以获得用于计算结合亲和力的动力学。抗DLL3×CD3抗体对重组人DLL3的结合亲和力汇总于表81中。
表81：通过Biacore(SPR)方法获得的抗DLL3×CD3双特异性抗体与人DLL3的相互 作用的亲和力(KD)。使用抗人Fc抗体捕获抗体并将抗原注射到溶液中。
名称 描述 kD(pM)
DL3B582 CD3W245-LH-scFv；DL3B279-Fab 16
DL3B583 CD3W245-HL-scFv；DL3B279-Fab 16
DL3B585 CD3B376-Fab；DL3B279-LH-scFv 24
DL3B587 CD3W245-Fab；DL3B279-LH-scFv 31
双特异性抗DLL3×CD3抗体的热稳定性
使用自动化Prometheus仪器通过NanoDSF方法测定双特异性抗DLL3×CD3抗体的热稳定性(构象稳定性)。通过将样品从384孔样品板装载到24孔毛细管中来进行测量。进行重复运行。热扫描范围为20℃至95℃，速率为1.0℃/min。对数据进行处理，以获得330nm、350nm、比率330/350的积分导数和一阶导数分析，并且从中获得热转变、解折叠开始、Tm和Tagg的离散数据。
结果表明，这些双特异性抗DLL3×CD3抗体具有高于59℃的第一转变(Tm1)。结果还表明，除了DL3B585之外，大多数蛋白质具有较低的聚集潜力，其Tagg高于70℃并且比Tm1高5度或更多(表82)。
表82：使用NanoDSF仪器获得的双特异性抗DLL3×CD3抗体的热稳定性数据。
Figure BDA0003963650430003291
双特异性抗DLL3×CD3抗体在DLL3+肿瘤细胞上的结合
我们测定了双特异性抗DLL3×CD3抗体对DLL3+人肿瘤细胞系(HCC1833和SHP-77)的细胞结合谱。用DPBS洗涤粘附的SCLC HCC1833细胞，并添加0.25％胰蛋白酶以使细胞分离。添加培养基以中和胰蛋白酶，并将细胞转移到15mL锥形管中。将SCLC SHP77细胞悬浮液转移到15mL锥形管中，并以1200rpm离心3分钟。吸出培养基，用DPBS将细胞再洗涤一次。使用Vi-cell XR细胞活力分析仪对细胞进行计数，并以100K/孔接种在100uL DPBS中。将板以1200rpm离心3分钟，并用DPBS洗涤2次。用Violet Live/Dead染色剂(Thermo-Fisher)对细胞进行染色，并在室温下于暗处温育25min。将细胞离心并用FACS染色缓冲液(BDPharmingen)洗涤2次。
将测试抗体在FACS染色缓冲液中稀释至最终起始浓度为100nM，并且从起始浓度制备3倍系列稀释液，总共10个稀释点。将系列稀释的测试抗体(100uL/孔)添加到细胞中，并在37℃下温育30分钟。用FACS染色缓冲液洗涤细胞2次，添加AlexaFluor 647缀合的驴抗人二抗(Jackson Immunoresearch)，并使其与细胞在4℃下温育30min。然后用FACS染色缓冲液洗涤细胞2次，并重悬于100uL FACS缓冲液中。在BD Celesta上使用FACS Diva软件运行细胞，并使用FlowJo软件分析。如图26A和图26B所示，DLL3-Fab臂(DL3B582和DL3B583)和与DLL3-scFv臂(DL3B585和DL3B587)之间的结合谱略有不同。
双特异性抗DLL3×CD3抗体在泛T细胞上的结合
还评价了双特异性抗DLL3×CD3抗体对正常人T细胞的细胞结合谱。将人泛T细胞(Biological Specialty Corporation，Colmar，PA)解冻并转移到具有DPBS(杜氏磷酸缓冲盐溶液)的15mL锥形管中。将细胞以1300rpm离心5分钟。吸出DPBS并将细胞重悬于DPBS中。使用Vi-cell XR细胞活力分析仪对细胞进行计数，并以100K/孔接种在100uL DPBS中。将板以1200rpm离心3分钟，并用DPBS洗涤2次。用Violet Live/Dead染色剂(Thermo-Fisher)对细胞进行染色，并在室温下于暗处温育25min。将细胞离心并用FACS染色缓冲液(BDPharmingen)洗涤2次。将测试抗体在FACS染色缓冲液中稀释至最终起始浓度为100nM，并且从起始浓度制备3倍系列稀释液，总共10个稀释点。将系列稀释的测试抗体(100uL/孔)添加到细胞中，并在37℃下温育30分钟。用FACS染色缓冲液洗涤细胞2次，添加AlexaFluor 647缀合的驴抗人二抗(Jackson Immunoresearch)，并使其与细胞于4℃温育30min。用FACS染色缓冲液洗涤细胞2次，并重悬于100uL FACS缓冲液中。在BD Celesta上使用FACS Diva软件运行细胞，并使用FlowJo软件分析。如图27所示，不同CD3臂中的细胞结合谱是不同的。
双特异性DLL3×CD3介导的针对泛T细胞中的DLL3+靶细胞系的细胞毒性
我们评价了双特异性抗DLL3×CD3抗体在DLL3+和DLL3-细胞系中的T细胞介导的杀伤潜力。生成了稳定表达红色核染料的DLL3+SHP77和DLL3-HEK293，以用于基于IncuCyte的细胞毒性测定。将健康供体T细胞(Biological Specialty Corporation，Colmar，PA)的冷冻小瓶在37℃水浴中解冻，转移到15mL锥形管中，并用5mL不含酚红的RPMI/10％HI FBS培养基洗涤一次。使用Viacell XR细胞活力分析仪对细胞进行计数，并将T细胞与靶细胞以5:1的最终效应T细胞与靶细胞(E:T)比率进行合并。将细胞混合物(100uL/孔)合并于50mL锥形管中，并添加到透明的96孔平底板中。然后，将测试抗体在不含酚红的RPMI/10％HI FBS培养基中稀释至最终起始浓度为60nM，并且从起始浓度制备3倍系列稀释液，总共11个稀释点。将系列稀释的测试抗体(100uL/孔)添加到合并的细胞中。在37℃下将板置于含5％CO2的
Figure BDA0003963650430003311
Zoom或IncuCyte />
Figure BDA0003963650430003312
(Essen)中达120小时。靶细胞系稳定表达用于跟踪靶细胞溶解的动力学的红色核染料。细胞生长抑制百分比(％)＝(初始存活靶细胞数-当前存活靶细胞数)/初始存活细胞数*100％。如图28A和图28B所示，T细胞细胞毒性测定结果证明所有双特异性抗DLL3×CD3抗体都能够在5天内实现>95％肿瘤溶解。
由双特异性DLL3×CD3抗体介导的泛T细胞中的细胞因子诱导
我们评价了双特异性抗DLL3×CD3抗体在DLL3+人肿瘤细胞系中的细胞因子释放谱。使用人促炎板I组织培养试剂盒(Meso Scale Discovery)分析上清液，并在湿冰上解冻，在4℃以1500rpm旋转5分钟，然后置于冰上。根据制造商的方案对MULT-SPOT测定板进行预洗涤。通过在MSD稀释剂1中系列稀释所提供的校准物来制备标准曲线。将标准品和测试抗体样品(25uL/孔)添加到预洗涤的板中。在SECTOR成像仪6000上读取测定板。如图29所示，细胞因子谱实验的结果证明IFN-γ产生与双特异性抗DLL3×CD3抗体的CD3亲和力相关。
双特异性DLL3×CD3介导的针对PBMC中的DLL3+靶细胞系的细胞毒性
为了测试双特异性针对具有不同抗原表达水平的DLL3+靶细胞的功效，在细胞毒性测定中测试了DLL3高表达细胞系(SHP-77和HCC1833)和DLL3低表达细胞系(G361)。SHP-77和HCC1833分别是肺上皮细胞系和肺腺癌细胞系。G361细胞源自恶性皮肤黑素瘤。在细胞毒性测定中使用稳定表达核限制性NucLight红(NLR)蛋白的DLL3+SHP-77细胞系。在测定当天，将SHP-77-NLR细胞收集到50ml离心管中并以1300rpm离心5min。然后将细胞沉淀重悬于改良的RPMI 1640培养基+10％FBS(完全培养基)中，并使用台盼蓝活死标志物使用血球计数板估计细胞数目。然后将SHP-77-NLR细胞以10,000个细胞/孔/90μl完全培养基接种到胶原包被的96孔板上。通过轻微搅拌使细胞均匀分布，使其在5％CO2培养箱中沉降1小时。就HCC1833和G361靶细胞系而言，在添加PBMC前一天，将3000个细胞/孔/90μl完全培养基接种在96孔平底组织培养板中。
将冷冻自健康供体(Clinigene)的PBMC小瓶在37℃水浴中快速解冻，转移到15mL锥形管中，并用10mL完全培养基洗涤一次。将细胞用抗人CD3抗体染色并通过流式细胞仪分析以确定PBMC内的CD3％。使用台盼蓝活死标志物使用血球计数板对来自每个供体的PBMC进行计数，并且将获得所需效应物与靶(ET)比率(CD3:靶细胞)所需的PBMC数目添加到接种在90μl完全培养基中的靶细胞中。然后将测试抗体制备成在完全培养基中的10倍储备液，并制备3倍系列稀释液。以20μl/孔向PBMC-肿瘤共培养物中添加系列稀释的测试抗体，使得抗体的最终浓度变为1倍。不含抗体的孔(NBS)用作基础细胞毒性的对照。在37℃下将板置于含5％CO2的IncuCyte
Figure BDA0003963650430003322
(Essen BioScience)中达5天。红色信号的增加对应于靶细胞增殖，并且信号的减少对应于靶细胞死亡。结果汇总于表83中。溶解％计算为＝{100-(抗体在特定时间点的红色信号强度/NBS孔中该时间点的红色信号强度)*100}。
表83：SHP-77、HCC1833和G361细胞在与全PBMC和双特异性抗DLL3×CD3抗体以指 定的浓度使用1:1的ET比率(CD3:靶细胞)共培养后第5天的溶解％。NA是指未测试。
Figure BDA0003963650430003321
在不同来源和抗原密度的细胞系中利用双特异性DLL3×CD3抗体观察到有效的肿瘤细胞溶解。为了比较高亲和力CD3双特异性(DL3B583)与低亲和力CD3双特异性(DL3B585)的功效，以各种ET比率测试针对高表达DLL3的SHP-77细胞的细胞毒性。在双特异性DLL3×CD3抗体的存在下，将来自3个供体的全PBMC与DLL3+SHP-77-NLR细胞以指定的ET比率(CD3:SHP-77)一起培养。含有PBMC和靶细胞但不含抗体的孔用作基础细胞毒性的对照。在37℃下在含5％CO2培养箱中的IncuCyte
Figure BDA0003963650430003331
(Essen BioScience)中对板进行扫描长达120小时。溶解％计算为＝{100-(抗体在特定时间点的红色信号强度/NBS孔中该时间点的红色信号强度)*100}。图上的每个点表示3个供体的平均值。如图30A至图30C所示，具有高亲和力CD3(DL3B583)臂和低亲和力CD3(DL3B585)臂两者的双特异性DLL3×CD3抗体显示出针对SHP-77细胞的增强细胞毒性。在90nM和30nM抗体浓度下，靶细胞溶解在ET比率为10:1的高亲和力和低亲和力CD3抗体之间是相似的。
在全PBMC细胞毒性测定中，CD3+T细胞响应于双特异性DLL3×CD3抗体的增殖
为了测试双特异性DLL3×CD3抗体与CD8+T细胞的结合是否可以诱导CD8+T细胞的增殖和扩增，进行了CD8+T细胞增殖的时程分析。DLL3+SHP-77细胞用于测定。在测定当天，将SHP-77细胞收集到50ml离心管中并以1300rpm离心5min。然后将细胞沉淀重悬于1ml改良的RPMI 1640培养基+10％FBS(完全培养基)中，并使用台盼蓝活死标志物使用血球计数板估计细胞数目。然后将SHP77细胞以10,000个细胞/孔/90μl完全培养基接种在U底96孔板中。
将冷冻自健康供体(Clinigene)的PBMC小瓶在37℃水浴中快速解冻，转移到15mL锥形管中，并用10mL完全培养基洗涤一次。将细胞用抗人CD3抗体染色并通过流式细胞仪分析以确定PBMC内的CD3％。用Cell Trace Violet染料(C34571，Thermo FisherScientific)对PBMC染色。使用台盼蓝活死标志物使用血球计数板对来自每个供体的PBMC进行计数，并且将获得效应物与靶(ET)比率10:1(CD3:靶细胞)所需的PBMC数目添加到接种在90μl完全培养基中的靶细胞中。
然后将测试抗体制备成在完全培养基中的10倍储备液，并且从起始浓度制备3倍系列稀释液，总共3个稀释点。以20μl/孔向PBMC-肿瘤共培养物中添加系列稀释的测试抗体，使得抗体的最终浓度变为1倍。不含抗体的孔(NBS)用作基础细胞毒性的对照。将板在5％CO2培养箱中温育指定的时间段。在温育期结束时，将细胞悬浮液转移到v底板并以1500rpm离心5分钟。将沉淀重悬于100μl的DPBS中。取10μl的菌体悬浮液，使用台盼蓝使用血球计数板测定每种抗体浓度下的总细胞数目。剩余的死细胞悬浮液用LIVE/DEADTM可固定的近红外死细胞染色试剂盒(L10119)处理并在冰上温育20min。使用FACS缓冲液将活力染色剂灭活，并以1500rpm离心5min。细胞用BD Fc块(564220，BD Pharmingen)染色10min，随后用CD3和CD8抗体染色，并在流式细胞仪上采集。对CD8 T细胞进行门控以评估细胞毒性CD8 T细胞群在CD3 T细胞内的扩增。如图31所示，双特异性DLL3×CD3抗体与T细胞的结合有效地介导了细胞毒性CD8 T细胞的扩增。
在全PBMC测定中，双特异性DLL3×CD3抗体对CD8 T细胞的活化谱
为了观察细胞毒性CD8 T细胞群响应于DLL3×CD3双特异性的结合的活化状态，进行了CD25、CD69和CD71标志物的动力学分析。DLL3+SHP-77细胞用于测定。将SHP-77细胞收集到50ml离心管中并以1300rpm离心5min。然后将细胞沉淀重悬于1ml改良的RPMI 1640培养基+10％FBS(完全培养基)中，并使用台盼蓝活死标志物使用血球计数板估计细胞数目。然后将SHP-77细胞以10,000个细胞/孔/90μl完全培养基接种在U底96孔板中。
将冷冻自健康供体(Clinigene)的PBMC小瓶在37℃水浴中快速解冻，转移到15mL锥形管中，并用10mL完全培养基洗涤一次。将细胞用抗人CD3抗体染色并通过流式细胞仪分析以确定PBMC内的CD3％。使用台盼蓝活死标志物使用血球计数板对来自每个供体的PBMC进行计数，并且将获得效应物与靶(ET)比率10:1(CD3:靶细胞)所需的PBMC数目添加到接种在90μl完全培养基中的靶细胞中。
然后将测试抗体制备成在完全培养基中的10倍储备液，并且从起始浓度制备3倍系列稀释液，总共3个稀释点。以20μl/孔向PBMC-肿瘤共培养物中添加系列稀释的测试抗体，使得抗体的最终浓度变为1倍。不含抗体的孔(NBS)用作基础细胞毒性的对照。将板在5％CO2培养箱中温育指定的时间段。在温育期结束时，将细胞悬浮液转移到v底板并以1500rpm离心5分钟。将沉淀重悬于100μl的DPBS中。取10μl的菌体悬浮液，使用台盼蓝使用血球计数板测定每种抗体浓度下的总细胞数目。
剩余的死细胞悬浮液用LIVE/DEADTM可固定的近红外死细胞染色试剂盒(L10119)处理并在冰上温育20min。使用FACS缓冲液将活力染色剂灭活，并以1500rpm离心5min。细胞用BD Fc块(564220，BD Pharmingen)染色10min，随后用CD3、CD8、CD25、CD69和CD71抗体染色，并在流式细胞仪上采集。如图32A至图32C所示，用双特异性DLL3×CD3抗体观察到细胞毒性CD8 T细胞的有效活化，如通过CD8 T细胞表面上CD25、CD69和CD71表达的上调所指示的。
在全PBMC测定中，由双特异性DLL3×CD3抗体介导的细胞因子诱导
由于诱导细胞因子释放综合征，因此T细胞重定向双特异性抗体可导致毒性。这些细胞因子可由T细胞自身或骨髓细胞产生，并且导致更多细胞因子产生的反馈回路。为了理解添加DLL3×CD3双特异性后，细胞因子诸如IL-6、TNF-α、IL-10、GMCSF和其他T细胞因子的释放，测试了来自细胞毒性测定的培养上清液中这些细胞因子的水平。DLL3+SHP-77细胞用于测定。将SHP-77细胞收集到50ml离心管中并以1300rpm离心5min。然后将细胞沉淀重悬于1ml改良的RPMI 1640培养基+10％FBS(完全培养基)中，并使用台盼蓝活死标志物使用血球计数板估计细胞数目。然后将SHP-77细胞以10,000个细胞/孔/90μl完全培养基接种在U底96孔板中。
将冷冻自健康供体(Clinigene)的PBMC小瓶在37℃水浴中快速解冻，转移到15mL锥形管中，并用10mL完全培养基洗涤一次。将细胞用抗人CD3抗体染色并通过流式细胞仪分析以确定PBMC内的CD3％。使用台盼蓝活死标志物使用血球计数板对来自每个供体的PBMC进行计数，并且将获得效应物与靶(ET)比率10:1(CD3:靶细胞)所需的PBMC数目添加到接种在90μl完全培养基中的靶细胞中。
将测试抗体制备成在完全培养基中的10倍储备液，并以20μl/孔添加到PBMC-肿瘤共培养物中，使得抗体的最终浓度变为1倍。不含抗体的孔(NBS)用作基础细胞毒性的对照。将板在5％CO2培养箱中温育指定的时间段。在温育期结束时，将细胞悬浮液转移到v底板并以1500rpm离心5min。收集上清液并储存在-20℃，以使用MILLIPLEX MAP人CD8+T细胞磁珠板(HCD8MAG-15K，Millipore)进行Luminex。使用具有eXPONENT软件的MAGPIX对板进行分析。结果汇总于表84中。
表84：在全PBMC细胞毒性测定中，由双特异性DLL3×CD3抗体介导的细胞因子释 放：在存在DL3B582和DL3B583浓度为30nM并且DL3B585浓度为90nM的CD3XDLL3抗体的情况下，将来自3个供体的全PBMC与DLL3+SHP-77细胞以10:1的ET比率(CD3:SHP-77)培养。在指定的时间点收集上清液并使用Luminex分析细胞因子释放。图上的每个点是3个供体的平均值。
Figure BDA0003963650430003361
与具有较高亲和力CD3臂(DL3B585和DL3B582)的双特异性DLL3×CD3抗体相比，使用具有较低亲和力CD3的双特异性DLL3×CD3抗体(DL3B583)观察到低水平的细胞因子(特别是IL-10、IL-6、IL-2和IL-4)释放，而这些双特异性DLL3×CD3的细胞毒性效力是相当的。
实施例20.具有优化的抗DLL3抗体序列的双特异性抗DLL3×CD3抗体的表征
双特异性抗DLL3变体×CD3抗体对DLL3的结合亲和力
为了确保DL3B279变体的HCDR1区(或接近HCDR1区，取决于所使用的描绘)中的N至Q突变不会导致与DLL3结合的发生变化(如实施例1所述)，使用Biacore T200仪器通过表面等离子体共振(SPR)测定DL3B279变体与重组人DLL3的结合亲和力，并且与亲本DL3B279比较。在山羊抗Fc抗体修饰的C1芯片上捕获抗体，并用浓度范围为90nM至1.1nM的人和食蟹猴DLL3抗原的3倍系列稀释液进行滴定。使用50μL/min的流速，监测缔合3分钟并且监测解离60分钟。通过从空白中减去分析物结合信号来参考原始结合数据，并且使用1:1Langmuir结合模型使用Biacore Insight评估软件来分析原始结合数据，以获得用于计算结合亲和力的动力学。结果(表85)表明，含有DL3B279变体(DL3B279-VL-A99G-VH-N27Q_M105T-LH-scFV)的DLL3×CD3双特异性(C3C3B80)的结合亲和力与含有原始DL3B279-LH-scFv分子(DL3B585:24pM)的原始DLL3×CD3双特异性(DL3B585)的结合亲和力相当。
表85：通过Biacore(SPR)方法获得的双特异性抗DLL3×CD3抗体与人DLL3的相互 作用的亲和力(KD)。使用抗人Fc抗体捕获抗DLL3抗体并将抗原注射到溶液中。
Figure BDA0003963650430003371
通过DSF测定的双特异性抗DLL3变体×CD3抗体的构象稳定性
使用自动Prometheus仪器通过NanoDSF法测定含有DL3B279变体(D3C3B80)的新DL3B279序列的双特异性抗DLL3 CD3抗体的热稳定性(构象稳定性)。通过将样品从384孔样品板装载到24孔毛细管中来进行测量。进行重复运行。热扫描范围为20℃至95℃，速率为1.0℃/分钟。对数据进行处理，以获得330nm、350nm、比率330/350的积分导数和一阶导数，并且从中获得热转变、解折叠开始、Tm1和Tagg的离散数据。结果(表86)显示具有DL3B279-VL-A99G-VH-N27Q_M105T-LH-scFV变体(D3C3B80)的双特异性DLL3×CD3抗体的热稳定性与具有原始DL3B279-LH-scFv序列(DL3B585:Tagg＝62.7，Tm1＝60.8示于表86中)的原始双特异性分子中的热稳定性相当。
表86：使用NanoDSF仪器获得的抗DLL3抗体的热稳定性数据。
Figure BDA0003963650430003372
Figure BDA0003963650430003381
双特异性抗DLL3变体×CD3抗体在T细胞上的结合
将人泛T细胞(Biological Specialty Corporation，Colmar，PA)解冻并转移到具有DPBS的15mL锥体中。将细胞以1300rpm离心5分钟。吸出DPBS并将细胞重悬于DPBS中。使用Vi-cell XR细胞活力分析仪对细胞进行计数，并以100K/孔接种在100uL DPBS中。将板以1200rpm离心3分钟，并用DPBS洗涤2次。用Violet Live/Dead染色剂(Thermo-Fisher)对细胞进行染色，并在室温下于暗处温育25min。将细胞离心并用FACS染色缓冲液(BDPharmingen)洗涤2次。将测试抗体在FACS染色缓冲液中稀释至最终起始浓度为100nM，并且从起始浓度制备3倍系列稀释液，总共10个稀释点。将系列稀释的测试抗体(100uL/孔)添加到细胞中，并在37℃下温育30分钟。用FACS染色缓冲液洗涤细胞2次，添加AlexaFluor 647缀合的驴抗人二抗(Jackson Immunoresearch)，并使其与细胞于4℃温育30min。用FACS染色缓冲液洗涤细胞2次，并重悬于100uL FACS缓冲液中。在BD Celesta上使用FACS Diva软件运行细胞，并使用FlowJo软件分析。如图33A所示，具有DL3B279-VL-A99G-VH-N27Q_M105T-LH-scFV变体(D3C3B80)的双特异性DLL3×CD3抗体在T细胞上的结合与具有原始DL3B279-LH-scFv序列(DL3B585)的原始双特异性分子相当。
双特异性抗DLL3变体×CD3通过IncuCyte介导针对泛T细胞中的DLL3+靶细胞系的 细胞毒性
生成稳定表达红色核染料的DLL3+SHP77，以用于基于IncuCyte的细胞毒性测定。将健康供体T细胞(Biological Specialty Corporation，Colmar，PA)的冷冻小瓶在37℃水浴中解冻，转移到15mL锥形管中，并用5mL不含酚红的RPMI/10％HI FBS培养基洗涤一次。使用Viacell XR细胞活力分析仪对细胞进行计数，并将T细胞与靶细胞以5:1的最终效应T细胞与靶细胞(E:T)比率进行合并。将细胞混合物合并在50mL锥形管中。将细胞混合物(100uL/孔)添加到透明的96孔平底板中。接下来，将测试抗体在不含酚红的RPMI/10％HIFBS培养基中稀释至最终起始浓度为60nM，并且从起始浓度制备3倍系列稀释液，总共11个稀释点。将系列稀释的测试抗体(100uL/孔)添加到合并的细胞中。在37℃下将板置于含5％CO2的
Figure BDA0003963650430003391
Zoom或IncuCyte />
Figure BDA0003963650430003392
(Essen)中达120小时。靶细胞系稳定表达用于跟踪靶细胞溶解的动力学的红色核染料。细胞生长抑制百分比等于初始可变靶细胞数和当前存活靶细胞数之间的差值除以初始存活细胞数。如图33B所示，具有DL3B279-VL-A99G-VH-N27Q_M105T-LH-scFV变体(D3C3B80)的双特异性DLL3×CD3抗体的细胞生长抑制与具有原始DL3B279-LH-scFv序列(DL3B585)的原始双特异性分子相当。
本示例证明本文所公开的分离的多特异性蛋白质在介导T细胞介导的细胞毒性、促进T细胞活化和增殖、增加T细胞细胞因子释放和/或展示增加的抗肿瘤功效时特别有效。这些活性放映了靶向靶细胞上的DLL3和T细胞上的CD3的抗原结合结构域的组合。本领域技术人员将理解，此类活性可通过将结合结构域组装到双特异性抗体中来预期，而不论组装双特异性抗体的机制如何。

Claims (68)

1.一种分离的蛋白质，所述分离的蛋白质包含结合分化簇3ε(CD3ε)的抗原结合结构域，其中所述结合CD3ε的抗原结合结构域包含：
a.SEQ ID NO:23的重链可变区(VH)的重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3以及SEQID NO:24的轻链可变区(VL)的轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3；
b.SEQ ID NO:23的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及SEQID NO:27的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
c.SEQ ID NO:23的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及SEQID NO:28的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
d.SEQ ID NO:23的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及SEQID NO:29的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者
e.SEQ ID NO:23的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及SEQID NO:30的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
2.根据权利要求1所述的分离的蛋白质，所述分离的蛋白质包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：
a.分别为SEQ ID NO:6、7、8、9、10和11；
b.分别为SEQ ID NO:12、13、14、15、16和17；或者
c.分别为SEQ ID NO:18、19、20、21、16和22。
3.根据权利要求1或2所述的分离的蛋白质，其中所述结合CD3ε的抗原结合结构域是scFv、(scFv)2、Fv、Fab、F(ab')2、Fd、dAb或VHH。
4.根据权利要求3所述的分离的蛋白质，其中所述结合CD3ε的抗原结合结构域是所述Fab。
5.根据权利要求3所述的分离的蛋白质，其中所述结合CD3ε的抗原结合结构域是所述scFv。
6.根据权利要求5所述的分离的蛋白质，其中所述scFv从N末端到C末端包含VH、第一接头(L1)和VL(VH-L1-VL)或所述VL、所述L1和所述VH(VL-L1-VH)。
7.根据权利要求6所述的分离的蛋白质，其中所述L1包含：
a.约5至50个氨基酸；
b.约5至40个氨基酸；
c.约10至30个氨基酸；或者
d.约10至20个氨基酸。
8.根据权利要求6所述的分离的蛋白质，其中所述L1包含SEQ ID NO:31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63或64的氨基酸序列。
9.根据权利要求8所述的分离的蛋白质，其中所述L1包含SEQ ID NO:31,37或64的氨基酸序列。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的分离的蛋白质，其中所述结合CD3ε的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:23的VH以及SEQ ID NO:24、27、28、29或30的VL。
11.根据权利要求10所述的分离的蛋白质，其中所述结合CD3ε的抗原结合结构域包含：
a.SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:24的VL；
b.SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:27的VL；
c.SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:28的VL；
d.SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:29的VL；或者
e.SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:30的VL。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的分离的蛋白质，其中所述结合CD3ε的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:65、66、67、68、69、70、
71、72、73或74的氨基酸序列。
13.一种分离的蛋白质，所述分离的蛋白质包含结合CD3ε的抗原结合结构域，其中所述结合CD3ε的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:23的重链可变区(VH)和SEQ ID NO:103的轻链可变区(VL)。
14.根据权利要求13所述的分离的蛋白质，其中所述结合CD3ε的抗原结合结构域是scFv、(scFv)2、Fv、Fab、F(ab')2、Fd、dAb或VHH。
15.根据权利要求14所述的分离的蛋白质，其中所述结合CD3ε的抗原结合结构域是所述Fab。
16.根据权利要求14所述的分离的蛋白质，其中所述结合CD3ε的抗原结合结构域是所述scFv。
17.根据权利要求16所述的分离的蛋白质，其中所述scFv从N末端到C末端包含VH、第一接头(L1)和VL(VH-L1-VL)或所述VL、所述L1和所述VH(VL-L1-VH)。
18.根据权利要求17所述的分离的蛋白质，其中所述L1包含：
a.约5至50个氨基酸；
b.约5至40个氨基酸；
c.约10至30个氨基酸；或者
d.约10至20个氨基酸。
19.根据权利要求18所述的分离的蛋白质，其中所述L1包含SEQ ID NO:31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63或64的氨基酸序列。
20.根据权利要求19所述的分离的蛋白质，其中所述L1包含SEQ ID NO:31、37或64的氨基酸序列。
21.根据权利要求13至20所述的分离的蛋白质，其中所述结合CD3ε的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:23的VH以及SEQ ID NO:24、27、28、29或30的VL。
22.根据权利要求21所述的分离的蛋白质，其中所述结合CD3ε的抗原结合结构域包含：
a.SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:24的VL；
b.SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:27的VL；
c.SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:28的VL；
d.SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:29的VL；或者
e.SEQ ID NO:23的VH和SEQ ID NO:30的VL。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的分离的蛋白质，其中所述分离的蛋白质是多特异性蛋白质。
24.根据权利要求23所述的分离的蛋白质，其中所述多特异性蛋白质是双特异性蛋白质。
25.根据权利要求23所述的分离的蛋白质，其中所述多特异性蛋白质是三特异性蛋白质。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的分离的蛋白质，所述分离的蛋白质还包含免疫球蛋白(Ig)恒定区或其所述Ig恒定区的片段。
27.根据权利要求26所述的分离的蛋白质，其中所述Ig恒定区的所述片段包含Fc区。
28.根据权利要求26所述的分离的蛋白质，其中所述Ig恒定区的所述片段包含CH2结构域。
29.根据权利要求26所述的分离的蛋白质，其中所述Ig恒定区的所述片段包含CH3结构域。
30.根据权利要求26所述的分离的蛋白质，其中所述Ig恒定区的所述片段包含CH2结构域和CH3结构域。
31.根据权利要求26所述的分离的蛋白质，其中所述Ig恒定区的所述片段包含铰链的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域。
32.根据权利要求26所述的分离的蛋白质，其中所述Ig恒定区的所述片段包含铰链、CH2结构域和CH3结构域。
33.根据权利要求26至32中任一项所述的分离的蛋白质，其中所述结合CD3ε的抗原结合结构域缀合至所述Ig恒定区的N末端或所述Ig恒定区的所述片段的N末端。
34.根据权利要求26至32中任一项所述的分离的蛋白质，其中所述结合CD3ε的抗原结合结构域缀合至所述Ig恒定区的C末端或所述Ig恒定区的所述片段的C末端。
35.根据权利要求26至32中任一项所述的分离的蛋白质，其中所述结合CD3ε的抗原结合结构域经由第二接头(L2)缀合至所述Ig恒定区或所述Ig恒定区的所述片段。
36.根据权利要求35所述的分离的蛋白质，其中所述L2包含SEQ ID NO:31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63或64的氨基酸序列。
37.根据权利要求23至36中任一项所述的分离的蛋白质，其中所述多特异性蛋白质包含结合除CD3ε以外的抗原的抗原结合结构域。
38.根据权利要求37所述的多特异性抗体，其中所述细胞抗原是肿瘤相关抗原。
39.根据权利要求26至38中任一项所述的分离的蛋白质，其中所述Ig恒定区或所述Ig恒定区的所述片段是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
40.根据权利要求26至39中任一项所述的分离的蛋白质，其中所述Ig恒定区或所述Ig恒定区的所述片段包含导致所述蛋白质与Fcγ受体(FcγR)的结合减少的至少一个突变。
41.根据权利要求40所述的分离的蛋白质，其中导致所述蛋白质与所述
FcγR的结合减少的所述至少一个突变选自由以下项组成的组：
F234A/L235A、L234A/L235A、L234A/L235A/D265S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、F234A/L235A、S228P/F234A/L235A、N297A、V234A/G237A、K214T/E233P/L234V/L235A/G236-缺失/A327G/P331A/D365E/L358M、H268Q/V309L/A330S/P331S、S267E/L328F、L234F/L235E/D265A、L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、S228P/F234A/L235A/G237A/P238S和S228P/F234A/L235A/G236-缺失/G237A/P238S，其中根据EU索引进行残基编号。
42.根据权利要求40至41中任一项所述的分离的蛋白，其中所述FcγR是FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB或FcγRIII，或它们的任何组合。
43.根据权利要求26至42中任一项所述的分离的蛋白质，其中所述蛋白质在所述Ig恒定区的CH3结构域中包含至少一个突变。
44.根据权利要求38所述的分离的蛋白质，其中所述Ig恒定区的所述CH3结构域中的所述至少一个突变选自由以下项组成的组：T350V、L351Y、F405A、Y407V、T366Y、T366W、T366L、F405W、T394W、K392L、T394S、Y407T、Y407A、T366S/L368A/Y407V、L351Y/F405A/Y407V、T366I/K392M/T394W、F405A/Y407V、T366L/K392M/T394W、T366L/K392L/T394W、L351Y/Y407A、L351Y/Y407V、T366A/K409F、T366V/K409F、T366A/K409F、T350V/L351Y/F405A/Y407V和T350V/T366L/K392L/T394W，其中根据EU索引进行残基编号。
45.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至44中任一项所述的分离的蛋白质以及药学上可接受的载体。
46.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求1至44中任一项所述的分离的蛋白质。
47.一种载体，所述载体包含根据权利要求46所述的多核苷酸。
48.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求47所述的载体。
49.一种产生根据权利要求1至44中任一项所述的分离的蛋白质的方法，所述方法包括：在使所述蛋白质表达的条件下培养根据权利要求48所述的宿主细胞，以及回收由所述宿主细胞产生的所述蛋白质。
50.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至44中任一项所述的分离的抗体以治疗所述癌症。
51.一种抗独特型抗体，所述抗独特型抗体与根据权利要求1至50中任一项所述的分离的蛋白质结合。
52.一种分离的蛋白质，所述分离的蛋白质包含与CD3ε(SEQ ID NO:1)上的表位结合的抗原结合结构域，其中所述表位是包含SEQ ID NO:100、101和102的氨基酸序列的不连续表位。
53.根据权利要求1所述的分离的蛋白质，所述分离的蛋白质包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:747、748、77、78、749、750、751、752、753和754。
54.根据权利要求1所述的分离的蛋白质，所述分离的蛋白质包含SEQ IDNO:747的氨基酸序列。
55.根据权利要求1所述的分离的蛋白质，所述分离的蛋白质包含SEQ IDNO:748的氨基酸序列。
56.根据权利要求1所述的分离的蛋白质，所述分离的蛋白质包含SEQ IDNO:77的氨基酸序列。
57.根据权利要求1所述的分离的蛋白质，所述分离的蛋白质包含SEQ IDNO:78的氨基酸序列。
58.根据权利要求1所述的分离的蛋白质，所述分离的蛋白质包含SEQ IDNO:749的氨基酸序列。
59.根据权利要求1所述的分离的蛋白质，所述分离的蛋白质包含SEQ IDNO:750的氨基酸序列。
60.根据权利要求1所述的分离的蛋白质，所述分离的蛋白质包含SEQ IDNO:751的氨基酸序列。
61.根据权利要求1所述的分离的蛋白质，所述分离的蛋白质包含SEQ IDNO:752的氨基酸序列。
62.根据权利要求1所述的分离的蛋白质，所述分离的蛋白质包含SEQ IDNO:753的氨基酸序列。
63.根据权利要求1所述的分离的蛋白质，所述分离的蛋白质包含SEQ IDNO:754的氨基酸序列。
64.根据权利要求1所述的分离的蛋白质，所述分离的蛋白质包含SEQ IDNO:85和86的氨基酸序列。
65.根据权利要求1所述的分离的蛋白质，所述分离的蛋白质包含SEQ IDNO:85和88的氨基酸序列。
66.根据权利要求1所述的分离的蛋白质，所述分离的蛋白质包含SEQ IDNO:85和90的氨基酸序列。
67.根据权利要求1所述的分离的蛋白质，所述分离的蛋白质包含SEQ IDNO:85和92的氨基酸序列。
68.根据权利要求1所述的分离的蛋白质，所述分离的蛋白质包含SEQ IDNO:85和94的氨基酸序列。
CN202180038437.2A 2020-05-27 2021-05-26 包含cd3抗原结合结构域的蛋白质及其用途 Pending CN116249714A (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063030448P 2020-05-27 2020-05-27
US63/030448 2020-05-27
US202063057958P 2020-07-29 2020-07-29
US63/057958 2020-07-29
US202063094931P 2020-10-22 2020-10-22
US63/094931 2020-10-22
PCT/IB2021/054582 WO2021240388A1 (en) 2020-05-27 2021-05-26 Proteins comprising cd3 antigen binding domains and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116249714A true CN116249714A (zh) 2023-06-09

Family

ID=76269770

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180038437.2A Pending CN116249714A (zh) 2020-05-27 2021-05-26 包含cd3抗原结合结构域的蛋白质及其用途

Country Status (18)

Country Link
US (1) US20220411504A1 (zh)
EP (1) EP4157459A1 (zh)
JP (1) JP2023528350A (zh)
KR (1) KR20230017841A (zh)
CN (1) CN116249714A (zh)
AU (1) AU2021281134A1 (zh)
BR (1) BR112022023978A2 (zh)
CA (1) CA3184189A1 (zh)
CL (1) CL2022003320A1 (zh)
CO (1) CO2022017056A2 (zh)
CR (1) CR20220594A (zh)
DO (1) DOP2022000256A (zh)
EC (1) ECSP22096235A (zh)
IL (1) IL298444A (zh)
MX (1) MX2022014938A (zh)
PE (1) PE20230389A1 (zh)
TW (1) TW202210510A (zh)
WO (1) WO2021240388A1 (zh)

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6818749B1 (en) 1998-10-31 2004-11-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Variants of humanized anti carcinoma monoclonal antibody cc49
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
IL155977A0 (en) 2000-11-30 2003-12-23 Medarex Inc Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
GB0115256D0 (en) 2001-06-21 2001-08-15 Babraham Inst Mouse light chain locus
IL166244A0 (en) 2001-07-12 2006-01-15 Jefferson Foote Super humanized antibodies
US6833441B2 (en) 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
KR101374454B1 (ko) 2005-03-31 2014-03-17 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 회합제어에 의한 폴리펩티드 제조방법
DE102005028778A1 (de) 2005-06-22 2006-12-28 SUNJÜT Deutschland GmbH Mehrlagige Folie mit einer Barriere- und einer antistatischen Lage
AU2007229698B9 (en) 2006-03-24 2012-11-08 Merck Patent Gmbh Engineered heterodimeric protein domains
US20090182127A1 (en) 2006-06-22 2009-07-16 Novo Nordisk A/S Production of Bispecific Antibodies
PL2103608T3 (pl) 2006-12-18 2013-02-28 Link Genomics Inc Środek do eradykacji Helicobacter pylori mający działanie hamujące na sekrecję kwasu żołądkowego
US8748356B2 (en) 2007-10-19 2014-06-10 Janssen Biotech, Inc. Methods for use in human-adapting monoclonal antibodies
JP2011507519A (ja) 2007-12-19 2011-03-10 セントコア・オーソ・バイオテツク・インコーポレーテツド ｐＩＸ又はｐＶＩＩへの融合を介したヒトデノボｐＩＸファージディスプレイライブラリの設計及び作製、ベクター、抗体、及び方法
NZ588554A (en) 2008-04-29 2013-03-28 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20100261620A1 (en) 2008-10-14 2010-10-14 Juan Carlos Almagro Methods of Humanizing and Affinity-Maturing Antibodies
JP2012525149A (ja) 2009-04-27 2012-10-22 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ヘテロ多量体分子を作製するための方法
EP3251503B1 (en) 2010-03-31 2024-03-20 Ablexis, LLC Genetic engineering of mice for the production of chimeric antibodies
NZ701825A (en) 2010-04-20 2016-06-24 Genmab As Heterodimeric antibody fc-containing proteins and methods for production thereof
CA2797981C (en) 2010-05-14 2019-04-23 Rinat Neuroscience Corporation Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
EP2420253A1 (en) 2010-08-20 2012-02-22 Leadartis, S.L. Engineering multifunctional and multivalent molecules with collagen XV trimerization domain
DK2635607T3 (da) 2010-11-05 2019-11-18 Zymeworks Inc Stabilt heterodimert antistofdesign med mutationer i fc-domænet
EP2771364B1 (en) 2011-10-27 2019-05-22 Genmab A/S Production of heterodimeric proteins
WO2013061083A2 (en) 2011-10-28 2013-05-02 Fredax Ab Therapeutic agents and uses thereof
CN109897103A (zh) 2011-11-04 2019-06-18 酵活有限公司 在Fc结构域中具有突变的稳定异源二聚的抗体设计
RS60499B1 (sr) 2011-12-20 2020-08-31 Medimmune Llc Modifikovani polipeptidi za bispecifične skelete antitela
SG10201607371UA (en) 2012-04-20 2016-10-28 Merus Nv Methods and means for the production of ig-like molecules
WO2014093908A2 (en) 2012-12-14 2014-06-19 Omt, Inc. Polynucleotides encoding rodent antibodies with human idiotypes and animals comprising same
DK2970980T3 (en) 2013-03-15 2018-10-22 Janssen Biotech Inc METHODS FOR MANAGING C-TERMINAL LYSIN, GALACTOSE AND SIALINIC ACID CONTENTS IN RECOMBINANT PROTEINS
AU2014351611B2 (en) 2013-11-19 2020-04-23 Janssen Biotech, Inc. Humanised anti kallikrein-2 antibody
WO2015181098A1 (en) * 2014-05-28 2015-12-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to human and cynomolgus cd3 epsilon
PL3247725T3 (pl) * 2015-01-23 2021-01-11 Sanofi Przeciwciała anty-CD3, przeciwciała anty-CD123 i przeciwciała bispecyficzne specyficznie wiążące się z CD3 i/lub CD123
WO2017027392A1 (en) * 2015-08-07 2017-02-16 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric cd3 receptor proteins
CN109843926B (zh) 2016-09-30 2023-01-20 豪夫迈·罗氏有限公司 针对cd3的双特异性抗体
EP3668898B1 (en) * 2017-08-14 2023-07-05 MorphoSys AG Humanized antibodies for cd3
JP7305624B2 (ja) * 2017-09-21 2023-07-10 ウーシー バイオロジクス アイルランド リミテッド 新規抗ＣＤ３ε抗体
WO2019060695A1 (en) 2017-09-22 2019-03-28 Kite Pharma, Inc. CHIMERIC POLYPEPTIDES AND USES THEREOF
EP3732199A1 (en) * 2017-12-27 2020-11-04 TeneoBio, Inc. Cd3-delta/epsilon heterodimer specific antibodies
US11203646B2 (en) * 2018-03-14 2021-12-21 Novimmune Sa Anti-CD3 epsilon antibodies and methods of use thereof
PE20210132A1 (es) 2018-05-24 2021-01-19 Janssen Biotech Inc Anticuerpos anti-cd3 y usos de estos
US20210040210A1 (en) * 2019-07-26 2021-02-11 Janssen Biotech, Inc. Proteins Comprising Kallikrein Related Peptidase 2 Antigen Binding Domains And Their Uses

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021240388A1 (en) 2021-12-02
EP4157459A1 (en) 2023-04-05
US20220411504A1 (en) 2022-12-29
PE20230389A1 (es) 2023-03-06
AU2021281134A1 (en) 2023-02-09
TW202210510A (zh) 2022-03-16
CO2022017056A2 (es) 2022-12-09
KR20230017841A (ko) 2023-02-06
BR112022023978A2 (pt) 2023-02-07
CA3184189A1 (en) 2021-12-02
MX2022014938A (es) 2023-03-06
JP2023528350A (ja) 2023-07-04
DOP2022000256A (es) 2023-03-15
CL2022003320A1 (es) 2023-02-03
IL298444A (en) 2023-01-01
CR20220594A (es) 2023-01-17
ECSP22096235A (es) 2023-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110997712B (zh) 特异性结合pd-1的抗体及其使用方法
US20240124583A1 (en) Proteins Comprising Kallikrein Related Paptidase 2 Antigen Binding Domains And Their Uses
US11827708B2 (en) Proteins comprising HLA-G antigen binding domains and their uses
US20230365684A1 (en) Materials And Methods For Binding Siglec-3/CD33
US20230040715A1 (en) Proteins comprising cd3 antigen binding domains and uses thereof
US20220411504A1 (en) Proteins comprising cd3 antigen binding domains and uses thereof
US20240025992A1 (en) Proteins comprising delta-like ligand 3 (dll3) antigen binding domains and their uses
TW202302648A (zh) Cd79b抗體於自體免疫治療應用之用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40093417

Country of ref document: HK