JP2023528350A - Ｃｄ３抗原結合ドメインを含むタンパク質及びその使用 - Google Patents

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フーヴァー，ジャクリン
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エム． ケイン，コリーン
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ズォラック，アダム
ケー． バット，トリベニ
デニス フェルトカムプ，マイケル
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Abstract

本開示は、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む、分化抗原群３（ＣＤ３）タンパク質に結合する抗原結合ドメイン、それらをコードするポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、それらを作製及び使用する方法を提供する。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２０年５月２７日に出願された米国仮出願第６３／０３０，４４８号、２０２０年７月２９日に出願された同第６３／０５７，９５８号、及び２０２０年１０月２２日に出願された同第６３／０９４，９３１号に対する優先権を主張する。前述の出願のそれぞれの開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
（配列表）
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出済みである、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。上記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年５月１１日に作成され、名称はＪＢＩ６３１６ＷＯＰＣＴ１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは１，０６１バイトである。
（技術分野）
本開示は、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインを含む、分化抗原群３（cluster of differentiation 3、ＣＤ３）タンパク質に結合する抗原結合ドメイン、それらをコードするポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、それらを作製及び使用する方法を提供する。
（背景）
二重特異性抗体及び抗体断片は、腫瘍細胞を殺傷するために細胞溶解性Ｔ細胞を動員する手段として検討されてきた。しかしながら、多くのＴ細胞動員二重特異性抗体の臨床的使用は、好ましくない毒性、潜在的な免疫原性、及び製造上の問題を含む課題によって制限されている。したがって、例えば、低い毒性及び好ましい製造プロファイルを含む、腫瘍細胞を殺傷するために細胞溶解性Ｔ細胞を動員する改善された二重特異性抗体が非常に必要とされている。
ヒトＣＤ３ Ｔ細胞抗原受容体タンパク質複合体は、６本の異なる鎖：ＣＤ３γ鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ０９６９３）、ＣＤ３δ鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ０４２３４）、２本のＣＤ３ε鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ０７７６６）、及び１本のＣＤ３ζ鎖ホモダイマー（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ２０９６３）（ε γ：ε δ：ζζ）で構成され、これは、Ｔ細胞受容体のα及びβ鎖に会合する。この複合体は、いくつかの細胞内シグナル伝達経路を認識する抗原結合において重要な役割を果たす。ＣＤ３複合体はシグナル伝達を媒介し、Ｔ細胞の活性化及び増殖をもたらす。ＣＤ３は、免疫応答に必要である。
腫瘍細胞を殺傷するための細胞傷害性Ｔ細胞の再指向は、多数の腫瘍学的適応症のための重要な治療機構となっている（Ｌａｂｒｉｊｎ，Ａ．Ｆ．，Ｊａｎｍａａｔ，Ｍ．Ｌ．，Ｒｅｉｃｈｅｒｔ，Ｊ．Ｍ．＆Ｐａｒｒｅｎ，Ｐ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｐｉｐｅｌｉｎｅ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １８，５８５－６０８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５７３－０１９－００２８－１（２０１９））。Ｔ細胞活性化は、２シグナル仮説に従い、第１のシグナルは、Ｔ細胞受容体（T cell receptor、ＴＣＲ）複合体の、抗原提示細胞（antigen presenting cell、ＡＰＣ）上でのその同族ペプチドＭＨＣ複合体との係合によって供給され、第２のシグナルは、共刺激性又は共阻害性のいずれかであり得る（Ｃｈｅｎ，Ｌ．＆Ｆｌｉｅｓ，Ｄ．Ｂ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏ－ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３，２２７－２４２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｉ３４０５（２０１３））。腫瘍は、多くの場合、Ｔ細胞ベースの免疫反応を誘導するのに十分な非自己抗原を提示することができず、Ｔ細胞結合性ＢｓＡｂ（ｂｓＴＣＥ）は、ＴＣＲ－ｐＭＨＣ相互作用の非存在下でＴ細胞性活性化を誘導することによって、この課題を克服することができる。Ｔ細胞受容体シグナル伝達は、ＴＣＲのＣＤ３サブユニットの細胞質領域におけるＩＴＡＭモチーフを介して起こる（Ｃｈｅｎ，Ｄ．Ｓ．＆Ｍｅｌｌｍａｎ，Ｉ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ｍｅｅｔｓ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒ－ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｃｙｃｌｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３９，１－１０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２０１３．０７．０１２（２０１３））。特に、ＣＤ３εサブユニットは、１つのＴＣＲ複合体当たり２つのコピーで存在し、Ｔ細胞結合のための魅力的な抗原を表す。実際に、ＣＤ３εを標的とする多数のｂｓＴＣＥは、ｍＡｂが欠乏していた臨床抗腫瘍有効性を示しており、いくつかの腫瘍標的に対する著しい医薬開発努力が進行中である（Ｌａｂｒｉｊｎ，Ａ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，２０１９）。ｂｓＴＣＥの臨床開発のための３つの主要な課題は、１）全身又はオフ腫瘍のＴ細胞活性化を介したサイトカイン放出に関連する急速かつ重度の毒性の可能性、２）高い効力及び鋭い治療指数を有するｂｓＴＣＥのための製剤化及び投薬の実用的課題、並びに３）腫瘍浸潤Ｔ細胞（ＴＩＬ）がｂｓＴＣＥによる過剰活性化に応答してアポトーシスを受ける、再活性誘導性Ｔ細胞死の可能性、である（Ｗｕ，Ｚ．＆Ｃｈｅｕｎｇ，Ｎ．Ｖ．Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｉｎｇ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｔ－ＢｓＡｂ）：Ｆｒｏｍ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔｏ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ １８２，１６１－１７５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｐｈａｒｍｔｈｅｒａ．２０１７．０８．００５（２０１８））。
まとめると、これらの観察は、より有利であり、がんを治療するために使用することができる新規なＣＤ３特異的結合タンパク質が当技術分野において必要とされていることを示唆している。
（概要）
本開示は、例えば、腫瘍抗原に対する高い親和性及びＴ細胞に対する弱い親和性を有する新規なＣＤ３ε特異性結合タンパク質を提供することによって、この必要性を満たす。本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質は、高い熱安定性、低減された脱アミド化リスク、及び減少した免疫原性を実証した。
ある特定の実施形態では、本開示は、分化抗原群３ε（cluster of differentiation 3ε、ＣＤ３ε）に結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、当該ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、以下を含む、単離タンパク質を提供する：
ａ．配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）の重鎖相補性決定領域（heavy chain complementarity determining region、ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号２４の軽鎖可変領域（ＶＬ）の軽鎖相補性決定領域（light chain complementarity determining region、ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ．配列番号２３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号２７のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｃ．配列番号２３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号２８のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｄ．配列番号２３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号２９のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
ｅ．配列番号２３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号３０のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３。
他の実施形態では、単離タンパク質は、以下のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む：
ａ．それぞれ、配列番号６、７、８、９、１０、及び１１、
ｂ．それぞれ、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、及び１７、又は
ｃ．それぞれ、配列番号１８、１９、２０、２１、１６、及び２２。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ、又はＶＨＨである。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｆａｂである。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、ＶＨＨである。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、第１のリンカー（Ｌ１）、及びＶＬ（ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ）、又はＶＬ、Ｌ１、及びＶＨ（ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ）を含む。
ある他の実施形態では、Ｌ１は、
ａ．約５～５０個のアミノ酸、
ｂ．約５～４０個のアミノ酸、
ｃ．約１０～３０個のアミノ酸、又は
ｄ．約１０～２０個のアミノ酸、を含む。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、又は６４のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３１、３７、又は６４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４、２７、２８、２９、又は３０のＶＬを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、
ａ．配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４のＶＬ、
ｂ．配列番号２３のＶＨ及び配列番号２７のＶＬ、
ｃ．配列番号２３のＶＨ及び配列番号２８のＶＬ、
ｄ．配列番号２３のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は
ｅ．配列番号２３のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、配列番号６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、又は７４のアミノ酸配列を含む。
本開示は、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質を提供し、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号１０３の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ、又はＶＨＨである。他の実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、第１のリンカー（Ｌ１）、及びＶＬ（ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ）、又はＶＬ、Ｌ１、及びＶＨ（ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ）を含む。他の実施形態では、Ｌ１は、ａ．約５～５０個のアミノ酸、ｂ．約５～４０個のアミノ酸、ｃ．約１０～３０個のアミノ酸、又はｄ．約１０～２０個のアミノ酸、を含む。他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、又は６４のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４、２７、２８、２９、又は３０のＶＬを含む。様々な実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４のＶＬ、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２７のＶＬ、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２８のＶＬ、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は配列番号２３のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、を含む。
他の実施形態では、単離タンパク質は、単一特異性タンパク質である。他の実施形態では、単離タンパク質は、多重特異性タンパク質である。他の実施形態では、多重特異性タンパク質は、二重特異性である。他の実施形態では、多重特異性タンパク質は、三重特異性である。
他の実施形態では、タンパク質は、半減期延長部分にコンジュゲートされる。
他の実施形態では、半減期延長部分は、免疫グロブリン（immunoglobulin、Ｉｇ）、Ｉｇの断片、Ｉｇ定常領域、Ｉｇ定常領域の断片、Ｆｃ領域、トランスフェリン、アルブミン、アルブミン結合ドメイン、又はポリエチレングリコールである。
他の実施形態では、単離タンパク質は、免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域又はそのＩｇ定常領域の断片を更に含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、Ｆｃ領域を含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ＣＨ２ドメインを含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ＣＨ３ドメインを含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ヒンジの少なくとも一部分、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のＮ末端にコンジュゲートされる。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のＣ末端にコンジュゲートされる。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、第２のリンカー（Ｌ２）を介してＩｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされる。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、又は６４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、多重特異性タンパク質は、ＣＤ３ε以外の抗原に結合する抗原結合ドメインを含む。
他の実施形態では、細胞抗原は、腫瘍関連抗原である。他の実施形態では、腫瘍関連抗原は、カリクレイン関連ペプチダーゼ２（ｈＫ２）タンパク質である。他の実施形態では、腫瘍関連抗原は、ヒト白血球抗原Ｇ（human leukocyte antigen G、ＨＬＡ－Ｇ）である。他の実施形態では、腫瘍関連抗原は、前立腺特異性膜抗原（prostate-specific membrane antigen、ＰＳＭＡ）である。他の実施形態では、腫瘍関連抗原は、デルタ様タンパク質３（ＤＬＬ３）である。他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、タンパク質のＦｃγ受容体（Fcγ receptor、ＦｃγＲ）への低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異を含む。他の実施形態では、タンパク質のＦｃγＲへの低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異は、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、Ｋ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及びＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓからなる群から選択され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、タンパク質のＦｃγＲへの増強された結合をもたらす少なくとも１つの変異を含む。
他の実施形態では、タンパク質のＦｃγＲへの増強された結合をもたらす少なくとも１つの変異は、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、及びＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅからなる群から選択され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。
他の実施形態では、ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、若しくはＦｃγＲＩＩＩ、又はそれらの任意の組み合わせである。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、タンパク質の半減期を調節する少なくとも１つの変異を含む。
他の実施形態では、タンパク質の半減期を調節する少なくとも１つの変異は、Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ、及びＨ４３５Ｒからなる群から選択され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。
他の実施形態では、タンパク質は、Ｉｇ定常領域のＣＨ３ドメインに少なくとも１つの変異を含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域のＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの変異は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｌ、Ｆ４０５Ｗ、Ｋ３９２Ｌ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｓ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｉ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｖ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、及びＴ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗからなる群から選択され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。
本開示はまた、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質と、医薬的に許容される担体と、を含む医薬組成物を提供する。
本開示はまた、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質をコードする、ポリヌクレオチドを提供する。
本開示はまた、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクターを提供する。
本開示はまた、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む、宿主細胞を提供する。
本開示はまた、本開示の単離タンパク質を産生する方法であって、タンパク質が発現される条件で本開示の宿主細胞を培養することと、宿主細胞によって産生されたタンパク質を収集することと、を含む、方法を提供する。
本開示はまた、対象におけるがんを治療する方法であって、治療有効量の、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む単離抗体を含む組成物を、それを必要とする対象に投与して、がんを治療することを含む、方法を提供する。他の実施形態では、がんは、固形腫瘍又は血液悪性腫瘍である。他の実施形態では、固形腫瘍は、前立腺がん、結腸直腸がん、胃がん、腎明細胞がん、膀胱がん、肺がん、扁平上皮がん、神経膠腫、乳がん、腎臓がん、血管新生障害、腎明細胞がん（clear cell renal carcinoma、ＣＣＲＣＣ）、膵臓がん、腎がん、尿路上皮がん、又は肝臓腺がんである。他の実施形態では、血液悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia、ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（myelodysplastic syndrome、ＭＤＳ）、急性リンパ性白血病（acute lymphocytic leukemia、ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（diffuse large B-cell lymphoma、ＤＬＢＣＬ）、慢性骨髄性白血病（chronic myeloid leukemia、ＣＭＬ）、又は芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm、ＤＰＤＣＮ）である。他の実施形態では、抗体は、第２の治療薬と組み合わせて投与される。
本開示はまた、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質に結合する、抗イディオタイプ抗体を提供する。
本開示はまた、ＣＤ３ε（配列番号１）上のエピトープに結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、当該エピトープが、配列番号１００、１０１、及び１０２のアミノ酸配列を含む不連続エピトープである、単離タンパク質を提供する。
本開示はまた、配列番号７４７、７４８、７７、７８、７４９、７５０、７５１、７５２、７５３、及び７５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離タンパク質を提供する。
一実施形態では、本開示は、配列番号７４７のアミノ酸配列を含む単離タンパク質を提供する。一実施形態では、本開示は、配列番号７４８のアミノ酸配列を含む単離タンパク質を提供する。一実施形態では、本開示は、配列番号７７のアミノ酸配列を含む単離タンパク質を提供する。一実施形態では、本開示は、配列番号７８のアミノ酸配列を含む単離タンパク質を提供する。一実施形態では、本開示は、配列番号７４９のアミノ酸配列を含む単離タンパク質を提供する。一実施形態では、本開示は、配列番号７５０のアミノ酸配列を含む単離タンパク質を提供する。一実施形態では、本開示は、配列番号７５１のアミノ酸配列を含む単離タンパク質を提供する。一実施形態では、本開示は、配列番号７５２のアミノ酸配列を含む単離タンパク質を提供する。一実施形態では、本開示は、配列番号７５３のアミノ酸配列を含む単離タンパク質を提供する。一実施形態では、本開示は、配列番号７５４のアミノ酸配列を含む単離タンパク質を提供する。
本開示はまた、配列番号８５及び８６のアミノ酸配列を含む単離タンパク質を提供する。
本開示はまた、配列番号８５及び８８のアミノ酸配列を含む単離タンパク質を提供する。
本開示はまた、配列番号８５及び９０のアミノ酸配列を含む単離タンパク質を提供する。
本開示はまた、配列番号８５及び９２のアミノ酸配列を含む単離タンパク質を提供する。
本開示はまた、配列番号８５及び９４のアミノ酸配列を含む単離タンパク質を提供する。
発明の概要、並びに以下の発明を実施するための形態は、添付の図面と併せて読むことで、更に理解される。開示される抗体及び方法を説明する目的で、当該抗体及び方法の例示的な実施形態を図面中に示す。ただし、当該抗体及び方法は、開示される特定の実施形態に限定されるものではない。図面は以下のとおりである。
初代ヒトＴ細胞へのハイブリドーマ上清の結合を示す図である。クローンＵＣＨＴ１を陽性対照として使用し（図１Ｂ）、マウスＩｇＧ１アイソタイプ（mouse IgG1 isotype、ｍＩｇＧ１）を陰性対照として使用した。 初代ヒトＴ細胞へのハイブリドーマ上清の結合を示す図である。クローンＵＣＨＴ１を陽性対照として使用し（図１Ｂ）、マウスＩｇＧ１アイソタイプ（mouse IgG1 isotype、ｍＩｇＧ１）を陰性対照として使用した。 大腸菌で発現した抗ＣＤ３ ｓｃＦｖバリアントのＣＤ３への結合を示す図である。 ＣＤ３Ｂ８１５（配列番号１１９）、ＣＤ３Ｗ２４４（配列番号２７）、ＣＤ３Ｗ２４５（配列番号２８）、ＣＤ３Ｗ２４６（配列番号２４）、ＣＤ３Ｗ２４７（配列番号２９）、及びＣＤ３Ｗ２４８（配列番号３０）のＶＬ領域のアラインメントを示す図である。 ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３ε：ＣＤ３Ｗ２４５）に結合したＣＤ３Ｗ２４５の複合体又はヒトＣＤ３ε（ＣＤ３ε：ＯＫＴ３）に結合したＯＫＴ３の複合体について測定された、水素－重水素交換質量分析（hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry、ＨＤＸ－ＭＳ）を使用して決定された水素－重水素交換速度を示す図である（配列番号５の断片である配列番号９９が示されている）。一重下線は、ＣＤ３ε単独と比較して、抗体の存在下で１０％～３０％の重水素化レベルの減少を有するセグメントを示し、二重下線は、３０％超の重水素化レベル減少を有するセグメントを示す。 ｍｕ１１Ｂ６、ｈｕ１１Ｂ６、ＫＬ２Ｂ３５７、ＫＬ２Ｂ３５８、ＫＬ２Ｂ３５９、ＫＬ２Ｂ３６０、ＨＣＦ３、及びＨＣＧ５のＶＨドメインの配列アラインメントを示す図である。図５は、出現順に、それぞれ、配列番号１２６、１２４、１３２、１３４、１３６、１３２、１２８、及び１３０を開示する。 ｍｕ１１Ｂ６、ｈｕ１１Ｂ６、ＫＬ２Ｂ３５７、ＫＬ２Ｂ３５８、ＫＬ２Ｂ３５９、ＫＬ２Ｂ３６０、ＬＤＣ６、及びＬＣＢ７のＶＬドメインの配列アラインメントを示す図である。図６は、出現順に、それぞれ、配列番号１２７、１２５、１３３、１３５、１３５、１３５、１２９、及び１３１を開示する。 ｈＫ２抗原の配列上にマッピングされた、選択されたｈＫ２抗体の結合エピトープを示す図である。図７は、出現順に、それぞれ、配列番号７４５、７４１、７４１、７４１、７４１、及び７４１を開示する。 標的細胞死を定量化するためのリアルタイムでのｉｎｃｕＣｙｔｅイメージングシステムによって測定されたＫＬ２Ｂ×ＣＤ３二重特異性分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ標的細胞傷害を示す図である。 標的細胞死からのアポトーシスシグナルを測定するために、蛍光カスパーゼ３／７試薬によって測定されたＫＬ２Ｂ×ＣＤ３二重特異性分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ標的細胞傷害を示す図である。 異なる用量におけるＣＤ２５陽性細胞の存在比率を示すことによって、ＫＬＫ２×ＣＤ３二重特異性抗体によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞の活性化及び増殖を示す図である。 増殖ゲートに入る細胞の存在比率を示すことによって、ＫＬＫ２×ＣＤ３二重特異性抗体によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞の活性化及び増殖を示す図である。 ＫＬＫ２×ＣＤ３二重特異性抗体によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞ＩＮＦ－γ放出を示す図である。 ＫＬＫ２×ＣＤ３二重特異性抗体によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞ＴＮＦ－α放出を示す図である。 選択された抗ｈＫ２抗体及び選択された抗ｈＫ２／ＣＤ３二重特異性抗体の結合パラトープを示す図である。下線付き配列はＣＤＲ領域を示し、ハイライトされた配列はパラトープ領域を示す。図１１Ａは、出現順に、それぞれ、配列番号２１９～２２０を開示する。図１１Ｂは、出現順に、それぞれ、配列番号２１３及び２２４を開示する。図１１Ｃは、出現順に、それぞれ、配列番号２０８及び２１５を開示する。図１１Ｄは、出現順に、それぞれ、配列番号７４２及び７４３を開示する。図１１Ｅは、出現順に、それぞれ、配列番号３２７及び２２１を開示する。図１１Ｆは、出現順に、それぞれ、配列番号３２９及び２２２を開示する。 選択された抗ｈＫ２抗体及び選択された抗ｈＫ２／ＣＤ３二重特異性抗体の結合パラトープを示す図である。下線付き配列はＣＤＲ領域を示し、ハイライトされた配列はパラトープ領域を示す。図１１Ａは、出現順に、それぞれ、配列番号２１９～２２０を開示する。図１１Ｂは、出現順に、それぞれ、配列番号２１３及び２２４を開示する。図１１Ｃは、出現順に、それぞれ、配列番号２０８及び２１５を開示する。図１１Ｄは、出現順に、それぞれ、配列番号７４２及び７４３を開示する。図１１Ｅは、出現順に、それぞれ、配列番号３２７及び２２１を開示する。図１１Ｆは、出現順に、それぞれ、配列番号３２９及び２２２を開示する。 選択された抗ｈＫ２抗体及び選択された抗ｈＫ２／ＣＤ３二重特異性抗体の結合パラトープを示す図である。下線付き配列はＣＤＲ領域を示し、ハイライトされた配列はパラトープ領域を示す。図１１Ａは、出現順に、それぞれ、配列番号２１９～２２０を開示する。図１１Ｂは、出現順に、それぞれ、配列番号２１３及び２２４を開示する。図１１Ｃは、出現順に、それぞれ、配列番号２０８及び２１５を開示する。図１１Ｄは、出現順に、それぞれ、配列番号７４２及び７４３を開示する。図１１Ｅは、出現順に、それぞれ、配列番号３２７及び２２１を開示する。図１１Ｆは、出現順に、それぞれ、配列番号３２９及び２２２を開示する。 選択された抗ｈＫ２抗体及び選択された抗ｈＫ２／ＣＤ３二重特異性抗体の結合パラトープを示す図である。下線付き配列はＣＤＲ領域を示し、ハイライトされた配列はパラトープ領域を示す。図１１Ａは、出現順に、それぞれ、配列番号２１９～２２０を開示する。図１１Ｂは、出現順に、それぞれ、配列番号２１３及び２２４を開示する。図１１Ｃは、出現順に、それぞれ、配列番号２０８及び２１５を開示する。図１１Ｄは、出現順に、それぞれ、配列番号７４２及び７４３を開示する。図１１Ｅは、出現順に、それぞれ、配列番号３２７及び２２１を開示する。図１１Ｆは、出現順に、それぞれ、配列番号３２９及び２２２を開示する。 選択された抗ｈＫ２抗体及び選択された抗ｈＫ２／ＣＤ３二重特異性抗体の結合パラトープを示す図である。下線付き配列はＣＤＲ領域を示し、ハイライトされた配列はパラトープ領域を示す。図１１Ａは、出現順に、それぞれ、配列番号２１９～２２０を開示する。図１１Ｂは、出現順に、それぞれ、配列番号２１３及び２２４を開示する。図１１Ｃは、出現順に、それぞれ、配列番号２０８及び２１５を開示する。図１１Ｄは、出現順に、それぞれ、配列番号７４２及び７４３を開示する。図１１Ｅは、出現順に、それぞれ、配列番号３２７及び２２１を開示する。図１１Ｆは、出現順に、それぞれ、配列番号３２９及び２２２を開示する。 選択された抗ｈＫ２抗体及び選択された抗ｈＫ２／ＣＤ３二重特異性抗体の結合パラトープを示す図である。下線付き配列はＣＤＲ領域を示し、ハイライトされた配列はパラトープ領域を示す。図１１Ａは、出現順に、それぞれ、配列番号２１９～２２０を開示する。図１１Ｂは、出現順に、それぞれ、配列番号２１３及び２２４を開示する。図１１Ｃは、出現順に、それぞれ、配列番号２０８及び２１５を開示する。図１１Ｄは、出現順に、それぞれ、配列番号７４２及び７４３を開示する。図１１Ｅは、出現順に、それぞれ、配列番号３２７及び２２１を開示する。図１１Ｆは、出現順に、それぞれ、配列番号３２９及び２２２を開示する。 ｓｃＦｖとしてフォーマットされた場合の熱処理後の組換えＨＬＡ－Ｇに結合するｖ領域の能力を示す図である。 水素－重水素交換ベースのＬＣ－ＭＳを用いた、ＨＬＡ－Ｇ（配列番号６９１）上の選択された抗体のエピトープマッピングを示す図である。示される配列は、成熟ＨＬＡ－Ｇの最初の残基から始まるアミノ酸残基番号付け（残基１８３～２７４が示される）を有する、配列番号６９１の断片である。図１３は、出現順に、それぞれ、配列番号７４６、７４６、７４４、及び７４４を開示する。 ＩｇＧ１（ＭＨＧＢ６６５）又はＩｇＧ４（ＭＨＧＢ５２３）のいずれかに対して遺伝子操作されたＭＨＧＢ６６５由来の可変領域によるＫ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞のＮＫ細胞媒介性細胞傷害の増強を示す図である。図１４Ａは、ＮＫＬ細胞媒介性細胞傷害を示し、図１４Ｂは、ＮＫ－９２細胞媒介性細胞傷害を示す。 ＩｇＧ１（ＭＨＧＢ６６５）又はＩｇＧ４（ＭＨＧＢ５２３）のいずれかに対して遺伝子操作されたＭＨＧＢ６６５由来の可変領域によるＫ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞のＮＫ細胞媒介性細胞傷害の増強を示す図である。図１４Ａは、ＮＫＬ細胞媒介性細胞傷害を示し、図１４Ｂは、ＮＫ－９２細胞媒介性細胞傷害を示す。 ＩｇＧ１（ＭＨＧＢ６６９）又はＩｇＧ４（ＭＨＧＢ５２６）のいずれかに対して遺伝子操作されたＭＨＧＢ６６９由来可変領域によるＫ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞のＮＫ細胞媒介性細胞傷害の増強を示す図である。図１５Ａは、ＮＫＬ細胞媒介性細胞傷害を示し、図１５Ｂは、ＮＫ－９２細胞媒介性細胞傷害を示す。 ＩｇＧ１（ＭＨＧＢ６６９）又はＩｇＧ４（ＭＨＧＢ５２６）のいずれかに対して遺伝子操作されたＭＨＧＢ６６９由来可変領域によるＫ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞のＮＫ細胞媒介性細胞傷害の増強を示す図である。図１５Ａは、ＮＫＬ細胞媒介性細胞傷害を示し、図１５Ｂは、ＮＫ－９２細胞媒介性細胞傷害を示す。 ＩｇＧ１（ＭＨＧＢ６８８）又はＩｇＧ４（ＭＨＧＢ５９６）のいずれかに対して遺伝子操作されたＭＨＧＢ６８８由来可変領域によるＫ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞のＮＫ細胞媒介性細胞傷害の増強を示す図である。図１６Ａは、ＮＫＬ細胞媒介性細胞傷害を示し、図１６Ｂは、ＮＫ－９２細胞媒介性細胞傷害を示す。 ＩｇＧ１（ＭＨＧＢ６８８）又はＩｇＧ４（ＭＨＧＢ５９６）のいずれかに対して遺伝子操作されたＭＨＧＢ６８８由来可変領域によるＫ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞のＮＫ細胞媒介性細胞傷害の増強を示す図である。図１６Ａは、ＮＫＬ細胞媒介性細胞傷害を示し、図１６Ｂは、ＮＫ－９２細胞媒介性細胞傷害を示す。 ＩｇＧ１（ＭＨＧＢ６９４）又はＩｇＧ４（ＭＨＧＢ６１６）のいずれかに対して遺伝子操作されたＭＨＧＢ６９４由来可変領域によるＫ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞のＮＫ細胞媒介性細胞傷害の増強を示す図である。図１７Ａは、ＮＫＬ細胞媒介性細胞傷害を示し、図１７Ｂは、ＮＫ－９２細胞媒介性細胞傷害を示す。 ＩｇＧ１（ＭＨＧＢ６９４）又はＩｇＧ４（ＭＨＧＢ６１６）のいずれかに対して遺伝子操作されたＭＨＧＢ６９４由来可変領域によるＫ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞のＮＫ細胞媒介性細胞傷害の増強を示す図である。図１７Ａは、ＮＫＬ細胞媒介性細胞傷害を示し、図１７Ｂは、ＮＫ－９２細胞媒介性細胞傷害を示す。 ＩｇＧ１（ＭＨＧＢ６８７）又はＩｇＧ４（ＭＨＧＢ５８５）のいずれかに対して遺伝子操作されたＭＨＧＢ６８７由来可変領域によるＫ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞のＮＫ細胞媒介性細胞傷害の増強を示す図である。図１８Ａは、ＮＫＬ細胞媒介性細胞傷害を示し、図１８Ｂは、ＮＫ－９２細胞媒介性細胞傷害を示す。 ＩｇＧ１（ＭＨＧＢ６８７）又はＩｇＧ４（ＭＨＧＢ５８５）のいずれかに対して遺伝子操作されたＭＨＧＢ６８７由来可変領域によるＫ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞のＮＫ細胞媒介性細胞傷害の増強を示す図である。図１８Ａは、ＮＫＬ細胞媒介性細胞傷害を示し、図１８Ｂは、ＮＫ－９２細胞媒介性細胞傷害を示す。 ＩｇＧ１（ＭＨＧＢ６７２）又はＩｇＧ４（ＭＨＧＢ５０８）のいずれかに対して遺伝子操作されたＭＨＧＢ６７２由来可変領域によるＫ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞のＮＫ細胞媒介性細胞傷害の増強を示す図である。図１９Ａは、ＮＫＬ細胞媒介性細胞傷害を示し、図１９Ｂは、ＮＫ－９２細胞媒介性細胞傷害を示す。 ＩｇＧ１（ＭＨＧＢ６７２）又はＩｇＧ４（ＭＨＧＢ５０８）のいずれかに対して遺伝子操作されたＭＨＧＢ６７２由来可変領域によるＫ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞のＮＫ細胞媒介性細胞傷害の増強を示す図である。図１９Ａは、ＮＫＬ細胞媒介性細胞傷害を示し、図１９Ｂは、ＮＫ－９２細胞媒介性細胞傷害を示す。 選択された抗体ＭＨＧＢ６６５（「Ｂ６６５」）、ＭＨＧＢ６６９（「Ｂ６６９」）、ＭＨＧＢ６７２（「Ｂ６７２」）、ＭＨＧＢ６８２（「Ｂ６８２」）、ＭＨＧＢ６８７（「Ｂ６８７」）、及びＭＨＧＢ６８８（「Ｂ６８８」）によって媒介される、ＪＥＧ－３細胞に対するＡＤＣＣ活性を示す図である。 選択された抗体のＡＤＣＣ活性を示す図である。 選択された抗体のＡＤＣＣ活性を示す図である。 選択された抗体のＣＤＣ活性を示す図である。 選択された抗体のＣＤＣ活性を示す図である。 ＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞ＨＵＰ－Ｔ３に対するＨＣ３Ｂ１２５の細胞傷害、及びＴ細胞活性化％を示す図である。 ＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞ＨＵＰ－Ｔ３に対するＨＣ３Ｂ１２５の細胞傷害、及びＴ細胞活性化％を示す図である。 ＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞ＲＥＲＦ－ＬＣ－Ａｄ－１に対するＨＣ３Ｂ１２５の細胞傷害、及びＴ細胞活性化％を示す図である。 ＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞ＲＥＲＦ－ＬＣ－Ａｄ－１に対するＨＣ３Ｂ１２５の細胞傷害、及びＴ細胞活性化％を示す図である。 ＲＥＲＦ－ＬＣ－Ａｄ－１細胞に対するＨＣ３Ｂ２５８及びＨＣ３Ｂ１２５の細胞傷害を示す図であり、エフェクター（Ｔ細胞）：標的（ＲＥＲＦ－ＬＣ－Ａｄ１）比は、示されるように、１：３、１：１、又は３：１であった。 対照（ＨＬＡ－Ｇ×ヌル）又はＨＣＢ１２５のいずれかで処置したＣＤ３４＋細胞ヒト化ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスにおいて確立された膵臓ＰＤＸの２７日目の群平均腫瘍体積（１７Ａ）及び個々の腫瘍体積を示す図である。 対照（ＨＬＡ－Ｇ×ヌル）又はＨＣＢ１２５のいずれかで処置したＣＤ３４＋細胞ヒト化ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスにおいて確立された膵臓ＰＤＸの２７日目の群平均腫瘍体積（１７Ａ）及び個々の腫瘍体積を示す図である。 対照（ＣＤ３×ヌル）又はＨＣＢ１２５のいずれかで処置したＴ細胞ヒト化ＮＳＧマウスにおける確立されたＨｕｐ－Ｔ３異種移植片の群平均腫瘍体積を示す図である。 ＤＬＬ３＋腫瘍細胞株への二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の細胞結合を示す図である。図２６Ａは、ＤＬＬ３＋腫瘍細胞株、ＳＨＰ７７細胞への二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の細胞結合を示す。図２６Ｂは、ＤＬＬ３＋腫瘍細胞株、ＨＣＣ１８３３細胞への二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の細胞結合を示す。 ＤＬＬ３＋腫瘍細胞株への二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の細胞結合を示す図である。図２６Ａは、ＤＬＬ３＋腫瘍細胞株、ＳＨＰ７７細胞への二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の細胞結合を示す。図２６Ｂは、ＤＬＬ３＋腫瘍細胞株、ＨＣＣ１８３３細胞への二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の細胞結合を示す。 ＦＡＣＳを使用したヒト汎Ｔ細胞に対する二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の結合を示す図である。 標的細胞死を定量化するためのリアルタイムでのｉｎｃｕＣｙｔｅイメージングシステムによって測定された二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの標的細胞傷害を示す図である。図２８Ａは、標的細胞死を定量化するためのリアルタイムでのｉｎｃｕＣｙｔｅイメージングシステムによって測定された抗ＤＬＬ３×ＣＤ３二重特異性分子のｉｎ ｖｉｔｒｏでの標的細胞傷害を示す。単離された汎Ｔ細胞を、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の存在下で１２０時間、ＤＬＬ３＋ＳＨＰ７７細胞と共インキュベートした。図２８Ｂは、標的細胞死を定量化するためにリアルタイムでｉｎｃｕＣｙｔｅイメージングシステムによって測定された抗ＤＬＬ３×ＣＤ３二重特異性分子のｉｎ ｖｉｔｒｏでの標的細胞傷害を示す。単離された汎Ｔ細胞を、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の存在下で１２０時間、ＤＬＬ３－ＨＥＫ２９３細胞と共インキュベートした。 標的細胞死を定量化するためのリアルタイムでのｉｎｃｕＣｙｔｅイメージングシステムによって測定された二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの標的細胞傷害を示す図である。図２８Ａは、標的細胞死を定量化するためのリアルタイムでのｉｎｃｕＣｙｔｅイメージングシステムによって測定された抗ＤＬＬ３×ＣＤ３二重特異性分子のｉｎ ｖｉｔｒｏでの標的細胞傷害を示す。単離された汎Ｔ細胞を、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の存在下で１２０時間、ＤＬＬ３＋ＳＨＰ７７細胞と共インキュベートした。図２８Ｂは、標的細胞死を定量化するためにリアルタイムでｉｎｃｕＣｙｔｅイメージングシステムによって測定された抗ＤＬＬ３×ＣＤ３二重特異性分子のｉｎ ｖｉｔｒｏでの標的細胞傷害を示す。単離された汎Ｔ細胞を、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の存在下で１２０時間、ＤＬＬ３－ＨＥＫ２９３細胞と共インキュベートした。 二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞ＩＦＮ－γ放出を示す図である。ＩＦＮ－γ濃度を、示された時点で収集した上清から測定した。 二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によって媒介される、ＰＢＭＣにおけるＤＬＬ３＋標的細胞株に対する細胞傷害を示す図である。図３０Ａは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によって媒介される、ＰＢＭＣにおけるＤＬＬ３＋標的細胞株に対する細胞傷害を示し、Ｅ：Ｔ比は、１０：１である。図３０Ｂは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によって媒介される、ＰＢＭＣにおけるＤＬＬ３＋標的細胞株に対する細胞傷害を示し、Ｅ：Ｔ比は、５：１である。図３０Ｃは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によって媒介される、ＰＢＭＣにおけるＤＬＬ３＋標的細胞株に対する細胞傷害を示し、Ｅ：Ｔ比は、１：１である。 二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によって媒介される、ＰＢＭＣにおけるＤＬＬ３＋標的細胞株に対する細胞傷害を示す図である。図３０Ａは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によって媒介される、ＰＢＭＣにおけるＤＬＬ３＋標的細胞株に対する細胞傷害を示し、Ｅ：Ｔ比は、１０：１である。図３０Ｂは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によって媒介される、ＰＢＭＣにおけるＤＬＬ３＋標的細胞株に対する細胞傷害を示し、Ｅ：Ｔ比は、５：１である。図３０Ｃは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によって媒介される、ＰＢＭＣにおけるＤＬＬ３＋標的細胞株に対する細胞傷害を示し、Ｅ：Ｔ比は、１：１である。 二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によって媒介される、ＰＢＭＣにおけるＤＬＬ３＋標的細胞株に対する細胞傷害を示す図である。図３０Ａは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によって媒介される、ＰＢＭＣにおけるＤＬＬ３＋標的細胞株に対する細胞傷害を示し、Ｅ：Ｔ比は、１０：１である。図３０Ｂは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によって媒介される、ＰＢＭＣにおけるＤＬＬ３＋標的細胞株に対する細胞傷害を示し、Ｅ：Ｔ比は、５：１である。図３０Ｃは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によって媒介される、ＰＢＭＣにおけるＤＬＬ３＋標的細胞株に対する細胞傷害を示し、Ｅ：Ｔ比は、１：１である。 全ＰＢＭＣ細胞傷害アッセイにおける二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体に応答したＣＤ３＋Ｔ細胞の増殖を示す図である。 二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体に応答したＴ細胞の活性化を示す図である。図３２Ａは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体に応答したＴ細胞の活性化、ＣＤ２５＋細胞％を示す。図３２Ｂは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体に応答したＴ細胞の活性化、ＣＤ６９＋細胞％を示す。図３２Ｃは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体に応答したＴ細胞の活性化、ＣＤ７１＋細胞％を示す。 二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体に応答したＴ細胞の活性化を示す図である。図３２Ａは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体に応答したＴ細胞の活性化、ＣＤ２５＋細胞％を示す。図３２Ｂは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体に応答したＴ細胞の活性化、ＣＤ６９＋細胞％を示す。図３２Ｃは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体に応答したＴ細胞の活性化、ＣＤ７１＋細胞％を示す。 二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体に応答したＴ細胞の活性化を示す図である。図３２Ａは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体に応答したＴ細胞の活性化、ＣＤ２５＋細胞％を示す。図３２Ｂは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体に応答したＴ細胞の活性化、ＣＤ６９＋細胞％を示す。図３２Ｃは、二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体に応答したＴ細胞の活性化、ＣＤ７１＋細胞％を示す。 最適化された二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の特徴を示す図である。図３３Ａは、ＩｎｃｕＣｙｔｅベースの細胞傷害アッセイにおいて評価された、最適化された抗ＤＬＬ３配列を有する及び有さない抗ＤＬＬ３×ＣＤ３二重特異性抗体の腫瘍溶解を示す。図３３Ｂは、単離された汎Ｔ細胞を、二重特異性ＤＬＬ３／Ｔ細胞再指向抗体の存在下で１２０時間、ＤＬＬ３＋ＳＨＰ７７細胞と共インキュベートしたことを示す。 最適化された二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の特徴を示す図である。図３３Ａは、ＩｎｃｕＣｙｔｅベースの細胞傷害アッセイにおいて評価された、最適化された抗ＤＬＬ３配列を有する及び有さない抗ＤＬＬ３×ＣＤ３二重特異性抗体の腫瘍溶解を示す。図３３Ｂは、単離された汎Ｔ細胞を、二重特異性ＤＬＬ３／Ｔ細胞再指向抗体の存在下で１２０時間、ＤＬＬ３＋ＳＨＰ７７細胞と共インキュベートしたことを示す。
発明の詳細な記述
本明細書に引用される、特許及び特許出願を含むがそれらに限定されない全ての刊行物は、完全に記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的でのみ使用され、限定を意図するものではないと理解すべきである。特に断らない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
本明細書に記載されているものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本発明の試験を実施するために使用することができるが、例示となる材料及び方法を本明細書に記載する。本発明を説明及び特許請求する上で以下の用語が使用される。
リストが提示される場合、特に指定しない限り、そのリストの各個々の要素及びそのリストの全ての組み合わせは別個の実施形態であることを、理解されたい。例えば、「Ａ、Ｂ、又はＣ」として提示される実施形態のリストは、実施形態「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ又はＣ」、「Ｂ又はＣ」、又は「Ａ、Ｂ、又はＣ」を含むと解釈されるべきである。
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用されるとき、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形は、その内容について特に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞（a cell）」という言及には、２つ又は３つ以上の細胞の組み合わせなどが含まれる。
移行句「備える／含む（comprising）」、「から本質的になる（consisting essentially of）」、及び「からなる（consisting）」は、特許用語において概ね受け入れられている意味を含意することを意図しており、すなわち、（ｉ）「備える／含む（comprising）」は、「含む」、「含有する」、又は「特徴とする」と同義であり、包括的又は非制限的なものであり、その他の列挙されていない要素又は方法工程を除外するものではなく、（ｉｉ）「からなる（consisting of）」は、特許請求の範囲において特定されていない、あらゆる要素、工程、又は成分を除外し、並びに（ｉｉｉ）「から本質的になる」は、特定される材料又は工程、並びに、特許請求される発明の「基本的かつ新しい特徴に実質的に影響しないもの」に、特許請求の範囲の範囲を制限する。語句「備える／含む（comprising）」（又はその同等語）を伴って記載される実施形態はまた、「からなる」及び「から本質的になる」を伴って独立して記載されるものも実施形態として提供する。
「約」は、当業者によって求められた特定の値について許容される誤差範囲内であることを意味し、これは、その値が測定又は決定される方法、すなわち、測定システムの制限事項にある程度依存する。特定のアッセイ、結果、又は実施形態の文脈において、実施例又は明細書の他の箇所に別途明示的に記載されない限り、「約」は、当該技術分野の実施につき１つの標準偏差、又は５％までの範囲のうちのいずれか大きい方の範囲内であることを意味する。
「活性化」又は「刺激」又は「活性化された」又は「刺激された」とは、活性化マーカーの発現、サイトカイン産生、増殖、又は標的細胞の細胞傷害の媒介をもたらす、細胞の生物学的状態の変化の誘導を指す。細胞は、一次刺激シグナルによって活性化され得る。共刺激シグナルは、一次シグナルの大きさを増幅し、初期刺激後の細胞死を抑制することができ、その結果、より耐久性のある活性化状態、ひいてはより高い細胞傷害能をもたらす。「共刺激シグナル」は、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーションなどの一次シグナルと組み合わせて、Ｔ細胞及び／若しくはＮＫ細胞の増殖、並びに／又は鍵となる分子の上方制御若しくは下方制御を引き起こすシグナルを指す。
「オルタナティブスカフォールド」とは、立体配座許容度が高い可変ドメインに会合する構造化コアを含有する、単鎖タンパク質フレームワークを指す。可変ドメインは、スカフォールドの完全性を損なうことなく導入される多型を許容するため、可変ドメインは、特異的抗原に結合するように遺伝子操作及び選択され得る。
「抗体依存性細胞傷害」、「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」、又は「antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity、ＡＤＣＣ」とは、抗体でコーティングされた標的細胞と、ナチュラルキラー細胞（natural killer cell、ＮＫ）、単球、マクロファージ、及び好中球などの溶解活性を有するエフェクター細胞との、エフェクター細胞上で発現するＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）を介した相互作用に依存する細胞死を誘導する機序を指す。
「抗体依存性細胞貪食作用」又は「Antibody-dependent cellular phagocytosis、ＡＤＣＰ」とは、マクロファージ、又は樹状細胞などの貪食細胞による内在化によって、抗体でコーティングされた標的細胞を排除する機序を指す。
「抗原」は、免疫応答を媒介することができる抗原結合ドメイン又はＴ細胞受容体が結合することができる任意の分子（例えば、タンパク質、ペプチド、多糖類、糖タンパク質、糖脂質、核酸、これらの一部分、又はこれらの組み合わせ）を指す。例示的な免疫応答には、抗体産生、及びＴ細胞、Ｂ細胞又はＮＫ細胞などの免疫細胞の活性化が含まれる。抗原は、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞、又は他の生物学的成分を有する流体、生物、タンパク質／抗原のサブユニット、殺傷若しくは不活性化された全細胞又は溶解物などの生体サンプルからの遺伝子によって発現し得る、当該サンプルから合成され得る、又は当該サンプルから精製され得る。
「抗原結合断片」又は「抗原結合ドメイン」とは、抗原に結合するタンパク質の一部分を指す。抗原結合断片は、合成ポリペプチド、酵素的に入手可能なポリペプチド、又は遺伝的に操作されたポリペプチドであってよく、これには、抗原に結合する免疫グロブリンの一部分、例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨ及びＶＬ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ及びＦｖ断片、１つのＶＨドメイン又は１つのＶＬドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）、サメ可変ＩｇＮＡＲドメイン、ラクダ化ＶＨドメイン、ＶＨＨドメイン、ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４部分などの抗体のＣＤＲを模倣するアミノ酸残基からなる最小認識ユニット、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／又はＨＣＤＲ３、並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び／又はＬＣＤＲ３、抗原に結合するオルタナティブスカフォールド、並びに抗原結合断片を含む多重特異性タンパク質が含まれる。抗原結合断片（ＶＨ及びＶＬなど）は、合成リンカーを介して互いに連結して、ＶＨ及びＶＬドメインが別々の一本鎖により発現された場合にＶＨ／ＶＬドメインが分子内又は分子間で対合して一価の抗原結合ドメイン、例えば一本鎖Ｆｖ（single chain Fv、ｓｃＦｖ）又はダイアボディを形成することができる、様々な種類の一本鎖抗体設計を形成することができる。抗原結合断片はまた、二重特異性及び多重特異性タンパク質を遺伝子操作するために、単一特異性又は多重特異性であり得る他の抗体、タンパク質、抗原結合断片、又はオルタナティブスカフォールドにコンジュゲートされてもよい。
「抗体」は、広義の意味を有し、マウス、ヒト、ヒト化、及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、抗原結合断片、二重特異性、三重特異性、四重特異性などの多特異性抗体、二量体、四量体、又は多量体抗体、一本鎖抗体、ドメイン抗体、及び必要とされる特異性の抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された形態を含む免疫グロブリン分子を含む。「完全長抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された、２本の重鎖（heavy chain、ＨＣ）及び２本の軽鎖（light chain、ＬＣ）、並びにこれらの多量体（例えばＩｇＭ）から構成される。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（framework region、ＦＲ）が散在しており相補性決定領域（complementarity determining region、ＣＤＲ）と呼称される超可変領域に更に分類され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲセグメントで構成される。免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに割り当てられ得る。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４として更に細分類される。どのような脊椎動物種の抗体軽鎖も、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明確に異なるタイプ、すなわち、カッパ（κ）及びラムダ（λ）のうちの一方に割り当てることができる。
「二重特異性」とは、２つの異なる抗原、又は同じ抗原内の２つの異なるエピトープに特異的に結合する分子（例えば、タンパク質又は抗体）を指す。二重特異性分子は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、カニクイザル（Macaca cynomolgus）（cynomolgus、ｃｙｎｏ）又はチンパンジー（Pan troglodytes）などの他の種由来の同じ抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有する場合もあり、２つ又は３つ以上の異なる抗原間で共有されているエピトープに結合する場合もある。
「二重特異性抗ｈＫ２／抗ＣＤ３抗体」、「ｈｋ２／ＣＤ３抗体」、「ｈｋ２×ＣＤ３抗体」、「抗ｈＫ２／抗ＣＤ３タンパク質」などは、ｈｋ２及びＣＤ３に結合し、かつｈＫ２に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインと、ＣＤ３に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインと、を含む抗体を指す。ｈＫ２及びＣＤ３に特異的に結合するドメインは、典型的にはＶＨ／ＶＬ対である。二重特異性抗ｈｋ２×ＣＤ３抗体は、ｈｋ２又はＣＤ３のいずれかへの結合に関して一価であってよい。
「二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３抗体」、「ＨＬＡ－Ｇ／ＣＤ３抗体」、「ＨＬＡ－Ｇ×ＣＤ３抗体」、「抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３タンパク質」などは、ＨＬＡ－Ｇ及びＣＤ３に結合し、かつＨＬＡ－Ｇに特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインと、ＣＤ３に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインと、を含む抗体を指す。ＨＬＡ－Ｇ及びＣＤ３に特異的に結合するドメインは、典型的にはＶＨ／ＶＬ対である。二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ×ＣＤ３抗体は、ＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ３のいずれかへの結合に関して一価であってもよい。
「二重特異性抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３抗体」、「抗ＤＬＬ３×ＣＤ３」、「ＤＬＬ３／ＣＤ３抗体」、「ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体」「抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３タンパク質」などは、ＤＬＬ３及びＣＤ３に結合し、かつＤＬＬ３に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインと、ＣＤ３に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインと、を含む抗体を指す。ＤＬＬ３及びＣＤ３に特異的に結合するドメインは、典型的にはＶＨ／ＶＬ対である。二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体は、ＤＬＬ３又はＣＤ３のいずれかへの結合に関して一価であってよい。
「がん」は、身体における異常細胞の制御されていない成長を特徴とする様々な疾患の広範な群を指す。制御されていない細胞分裂及び成長は、隣接組織を浸潤する悪性腫瘍の形成をもたらし、リンパ系又は血流を介して身体の遠位部分にも転移し得る。「がん」又は「がん組織」は、腫瘍を含み得る。
「分化抗原群３ε」又は「ＣＤ３ε」とは、「Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３イプシロン鎖」又は「Ｔ３Ｅ」とも称される、知られているタンパク質を指す。ＣＤ３εは、ＣＤ３－ガンマ、ＣＤ３－デルタ、及びＣＤ３－ゼータ、並びにＴ細胞受容体アルファ／ベータ、及びガンマ／デルタヘテロダイマーと一緒に、Ｔ細胞受容体－ＣＤ３複合体を形成する。この複合体は、いくつかの細胞内シグナル伝達経路を認識する抗原結合において重要な役割を果たす。ＣＤ３複合体はシグナル伝達を媒介し、Ｔ細胞の活性化及び増殖をもたらす。ＣＤ３は、免疫応答に必要である。完全長ＣＤ３εのアミノ酸配列を配列番号１に示す。ＣＤ３εの細胞外ドメイン（extracellular domain、ＥＣＤ）のアミノ酸配列を配列番号２に示す。本明細書全体を通して、「ＣＤ３ε特異的」又は「ＣＤ３εに特異的に結合する」又は「抗ＣＤ３ε抗体」は、ＣＤ３ε細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（配列番号２）に特異的に結合する抗体を含む、ＣＤ３εポリペプチド（配列番号１）に特異的に結合する抗体を指す。
配列番号１（ヒトＣＤ３イプシロン）：
ＭＱＳＧＴＨＷＲＶＬＧＬＣＬＬＳＶＧＶＷＧＱＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴＣＰＱＹＰＧＳＥＩＬＷＱＨＮＤＫＮＩＧＧＤＥＤＤＫＮＩＧＳＤＥＤＨＬＳＬＫＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣＹＰＲＧＳＫＰＥＤＡＮＦＹＬＹＬＲＡＲＶＣＥＮＣＭＥＭＤＶＭＳＶＡＴＩＶＩＶＤＩＣＩＴＧＧＬＬＬＬＶＹＹＷＳＫＮＲＫＡＫＡＫＰＶＴＲＧＡＧＡＧＧＲＱＲＧＱＮＫＥＲＰＰＰＶＰＮＰＤＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬＮＱＲＲＩ
配列番号２（ヒトＣＤ３イプシロン細胞外ドメイン）
ＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴＣＰＱＹＰＧＳＥＩＬＷＱＨＮＤＫＮＩＧＧＤＥＤＤＫＮＩＧＳＤＥＤＨＬＳＬＫＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣＹＰＲＧＳＫＰＥＤＡＮＦＹＬＹＬＲＡＲＶＣＥＮＣＭＥＭＤ
「補体依存性細胞傷害」又は「Complement-dependent cytotoxicity、ＣＤＣ」は、標的に結合したタンパク質のＦｃエフェクタードメインが補体成分Ｃ１ｑに結合し、これを活性化し、次に、補体カスケードを活性化して標的細胞死をもたらす、細胞死を誘導する機序を指す。補体の活性化はまた、標的細胞表面上に補体成分の沈着を生じさせ得、それは、白血球への補体受容体（例えば、ＣＲ３）の結合によって、ＣＤＣを容易にする。
「相補性決定領域」（ＣＤＲ）は、抗原に結合する抗体の領域である。ＶＨには３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）が存在し、ＶＬには３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）が存在する。ＣＤＲは、以下のものなどの様々な記述を用いて定義することができる：Ｋａｂａｔ（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９７０） Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １３２：２１１－５０；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－１７），ＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５－７７）、及びＡｂＭ（Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ Ｊ Ｂｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６３：８００－１５，１９９６）。様々な記述と可変領域の番号付けとの対応が記載されている（例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５－７７；Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ （２００１） ３０９：６５７－７０；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース；ウェブリソース（例えば、インターネットから検索することができる＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ＞）参照）。ＵＣＬ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ ＰＬＣによるａｂＹｓｉｓなどの利用可能なプログラムを使用して、ＣＤＲを描写することができる。本明細書で使用する場合、用語「ＣＤＲ」、「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、「ＨＣＤＲ３」、「ＬＣＤＲ１」、「ＬＣＤＲ２」、及び「ＬＣＤＲ３」は、本明細書で別途明示的に記載のない限り、上述したＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、又はＡｂＭの方法のいずれかにより定義されるＣＤＲを含む。
「減少する」、「低下する」、「低くする」、「低減する」、又は「軽減する」は、一般に、対照又はビヒクルによって媒介される応答と比較した場合に、試験分子が低減された応答（すなわち、下流効果）を媒介する能力を指す。例示的な応答は、Ｔ細胞拡大、Ｔ細胞活性化、又はＴ細胞媒介性腫瘍細胞殺傷、又はタンパク質のその抗原若しくは受容体への結合、増強されたＦｃγへの結合、又は増強されたＡＤＣＣ、ＣＤＣ及び／若しくはＡＤＣＰなどの増強されたＦｃエフェクター機能である。減少は、試験分子と対照（又はビヒクル）との間の測定された応答の統計的に有意な差、又は約１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、若しくは３０倍以上、例えば、５００、６００、７００、８００、９００、若しくは１０００倍以上（１を上回る全ての整数及びその間の小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）の減少など、測定された応答の減少であり得る。
「分化」は、細胞の能力若しくは増殖を減少させるか、又は細胞をより発達的に制限された状態に移動させる方法を指す。
「デルタ様タンパク質３」又は「ＤＬＬ３」は、デルタ様３、デルタ３、又はショウジョウバエデルタホモログ３とも称される、知られているタンパク質を指す。特定されない限り、本明細書で使用される場合、ＤＬＬ３は、ヒトＤＬＬ３を指す。全てのＤＬＬ３アイソフォーム及びバリアントが、「ＤＬＬ３」に包含される。様々なアイソフォームのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０５８６３７．１（アイソフォーム１前駆体、６１８アミノ酸）及びＮＰ＿９８２３５３．１（アイソフォーム２前駆体、５８７アミノ酸）から検索可能である。完全長ＤＬＬ３のアミノ酸配列を配列番号２５５に示す。ＤＬＬ３の配列は、ＤＳＬドメイン（残基１７６～２１５）、ＥＧＦ－１ドメイン（残基２１６～２４９）、ＥＧＦ－２ドメイン（残基２７４～３１０）、ＥＧＦ－３ドメイン（残基３１２～３５１）、ＥＧＦ－４ドメイン（残基３５３～３８９）、ＥＧＦ－５ドメイン（残基３９１～４２７）、及びＥＧＦ－６ドメイン（残基４２９～４６５）を含む。
＞配列番号７１６（ＮＰ＿０５８６３７．１デルタ様タンパク質３アイソフォーム１前駆体［ホモサピエンス］）
ＭＶＳＰＲＭＳＧＬＬＳＱＴＶＩＬＡＬＩＦＬＰＱＴＲＰＡＧＶＦＥＬＱＩＨＳＦＧＰＧＰＧＰＧＡＰＲＳＰＣＳＡＲＬＰＣＲＬＦＦＲＶＣＬＫＰＧＬＳＥＥＡＡＥＳＰＣＡＬＧＡＡＬＳＡＲＧＰＶＹＴＥＱＰＧＡＰＡＰＤＬＰＬＰＤＧＬＬＱＶＰＦＲＤＡＷＰＧＴＦＳＦＩＩＥＴＷＲＥＥＬＧＤＱＩＧＧＰＡＷＳＬＬＡＲＶＡＧＲＲＲＬＡＡＧＧＰＷＡＲＤＩＱＲＡＧＡＷＥＬＲＦＳＹＲＡＲＣＥＰＰＡＶＧＴＡＣＴＲＬＣＲＰＲＳＡＰＳＲＣＧＰＧＬＲＰＣＡＰＬＥＤＥＣＥＡＰＬＶＣＲＡＧＣＳＰＥＨＧＦＣＥＱＰＧＥＣＲＣＬＥＧＷＴＧＰＬＣＴＶＰＶＳＴＳＳＣＬＳＰＲＧＰＳＳＡＴＴＧＣＬＶＰＧＰＧＰＣＤＧＮＰＣＡＮＧＧＳＣＳＥＴＰＲＳＦＥＣＴＣＰＲＧＦＹＧＬＲＣＥＶＳＧＶＴＣＡＤＧＰＣＦＮＧＧＬＣＶＧＧＡＤＰＤＳＡＹＩＣＨＣＰＰＧＦＱＧＳＮＣＥＫＲＶＤＲＣＳＬＱＰＣＲＮＧＧＬＣＬＤＬＧＨＡＬＲＣＲＣＲＡＧＦＡＧＰＲＣＥＨＤＬＤＤＣＡＧＲＡＣＡＮＧＧＴＣＶＥＧＧＧＡＨＲＣＳＣＡＬＧＦＧＧＲＤＣＲＥＲＡＤＰＣＡＡＲＰＣＡＨＧＧＲＣＹＡＨＦＳＧＬＶＣＡＣＡＰＧＹＭＧＡＲＣＥＦＰＶＨＰＤＧＡＳＡＬＰＡＡＰＰＧＬＲＰＧＤＰＱＲＹＬＬＰＰＡＬＧＬＬＶＡＡＧＶＡＧＡＡＬＬＬＶＨＶＲＲＲＧＨＳＱＤＡＧＳＲＬＬＡＧＴＰＥＰＳＶＨＡＬＰＤＡＬＮＮＬＲＴＱＥＧＳＧＤＧＰＳＳＳＶＤＷＮＲＰＥＤＶＤＰＱＧＩＹＶＩＳＡＰＳＩＹＡＲＥＶＡＴＰＬＦＰＰＬＨＴＧＲＡＧＱＲＱＨＬＬＦＰＹＰＳＳＩＬＳＶＫ
「コードする」又は「コードすること」とは、定義されたヌクレオチドの配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）か、又は定義されたアミノ酸の配列のいずれかを有する、生物学的プロセスにおける他のポリマー及び巨大分子の合成のためのテンプレートとして機能する、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特異性配列の固有の特性、並びにそれから生じる生物学的特性を指す。したがって、細胞又は他の生物系において、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳がタンパク質を生成する場合、その遺伝子、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡは、タンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であるコード鎖と、遺伝子又はｃＤＮＡの転写のテンプレートとして使用される非コード鎖とはいずれも、その遺伝子又はｃＤＮＡのタンパク質又は他の産物をコードするとして言及され得る。
「増強する」、「促進する」、「増加させる」、「拡大する」、又は「改善する」は、一般に、対照又はビヒクルによって媒介される応答と比較した場合に、より大きな応答（すなわち、下流効果）を媒介する試験分子の能力を指す。例示的な応答は、Ｔ細胞拡大、Ｔ細胞活性化、又はＴ細胞媒介性腫瘍細胞殺傷、又はタンパク質のその抗原若しくは受容体への結合、増強されたＦｃγへの結合、又は増強されたＡＤＣＣ、ＣＤＣ及び／若しくはＡＤＣＰなどの増強されたＦｃエフェクター機能である。増強は、試験分子と対照（又はビヒクル）との間の測定された応答の統計的に有意な差、又は約１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、若しくは３０倍以上、例えば、５００、６００、７００、８００、９００、若しくは１０００倍以上（１を上回る全ての整数及びその間の小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）の増加など、測定された応答の増加であり得る。
「エピトープ」とは、抗体、又はその抗体結合部分が特異的に結合する抗原の一部分を指す。エピトープは、典型的には、化学的に活性な（極性、非極性又は疎水性など）部分の表面集団、例えばアミノ酸又は多糖側鎖からなり、特定の三次元構造特性並びに特定の電荷特性を有し得る。エピトープは、立体配座上の空間単位を形成する連続的な及び／又は不連続なアミノ酸によって構成され得る。不連続なエピトープでは、抗原の直鎖配列の異なる部分にあるアミノ酸が、タンパク質分子の折り畳みにより三次元空間でごく近接するようになる。抗体「エピトープ」は、エピトープを識別するために使用する方法論によって異なる。
「拡大」とは、細胞分裂及び細胞死の結果を指す。
「発現する」及び「発現」は、細胞内又はｉｎ ｖｉｔｒｏで起こる周知の転写及び翻訳を指す。したがって、発現産物、例えば、タンパク質は、細胞によって又はｉｎ ｖｉｔｒｏで発現し、細胞内、細胞外、又は膜貫通タンパク質であってもよい。
「発現ベクター」とは、発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの翻訳を指示するために、生物系又は再構成された生物系で利用することができるベクターを指す。
「ｄＡｂ」又は「ｄＡｂ断片」は、ＶＨドメインで構成される抗体断片を指す（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４ ５４６（１９８９））。
「Ｆａｂ」又は「Ｆａｂ断片」は、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、及びＣＬドメインで構成される抗体断片を指す。
「Ｆ（ａｂ’）２」又は「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、ヒンジ領域内のジスルフィド架橋によって接続された２つのＦａｂ断片を含む抗体断片を指す。
「Ｆｄ」又は「Ｆｄ断片」は、ＶＨ及びＣＨ１ドメインで構成される抗体断片を指す。
「Ｆｖ」又は「Ｆｖ断片」は、抗体の単一のアーム由来のＶＨドメイン及びＶＬドメインで構成される抗体断片を指す。
「完全長抗体」は、ジスルフィド結合によって相互に接続された、２本の重鎖（ＨＣ）及び２本の軽鎖（ＬＣ）、並びにこれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）で構成される。各重鎖は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメインで構成され、重鎖定常ドメインは、サブドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）で構成される。ＶＨ及びＶＬは、フレームワーク領域（ＦＲ）が散在している、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に更に細分化され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲセグメントで構成される。
「遺伝子修飾」とは、宿主細胞が、導入された遺伝子又は配列を発現して、所望の物質、典型的には、導入された遺伝子又は配列によってコードされるタンパク質又は酵素を産生するように、「外来」（すなわち、外因性又は細胞外）遺伝子、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を宿主細胞に導入することを指す。導入された遺伝子又は配列はまた、「クローニングされた」又は「外来」遺伝子又は配列と呼ばれる場合もあり、開始、終止、プロモータ、シグナル、分泌、又は細胞の遺伝機構によって使用される他の配列などのキメラ抗原受容体をコードしているポリヌクレオチドに操作可能に連結した調節配列又は制御配列を含んでいてよい。遺伝子又は配列は、既知の機能を有さない非機能的配列を含んでいてよい。導入されたＤＮＡ又はＲＮＡを受け取って発現する宿主細胞は、「遺伝的に操作されている」。宿主細胞に導入されたＤＮＡ又はＲＮＡは、宿主細胞と同じ属若しくは種の細胞を含む任意の起源、又は異なる属若しくは種に由来し得る。
「異種」とは、自然界では互いに対して同じ関係で見られない、２つ又は３つ以上のポリヌクレオチド又は２つ又は３つ以上のポリペプチドを指す。
「異種ポリヌクレオチド」とは、本明細書に記載される２つ又は３つ以上のネオ抗原をコードする、天然には存在しないポリヌクレオチドを指す。
「異種ポリペプチド」とは、本明細書に記載される２つ又は３つ以上のネオ抗原ポリペプチドを含む、天然には存在しないポリペプチドを指す。
「宿主細胞」は、異種核酸を含有する任意の細胞を指す。例示的な異種核酸は、ベクター（例えば、発現ベクター）である。
「ヒト抗体」は、ヒト対象に投与されたときに免疫応答が最小限になるように最適化された抗体を指す。ヒト抗体の可変領域は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体が定常領域又は定常領域の一部を含む場合、当該定常領域もヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体は、ヒト抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られた場合、ヒト起源の配列に「由来する」重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。このような例示的な系は、ファージにディスプレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリ、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を保有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばマウス又はラットを含む。「ヒト抗体」は、典型的には、ヒト抗体及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を得るために使用した系の違い、フレームワーク若しくはＣＤＲへの体細胞変異の導入若しくは置換の意図的な導入、又はこれらの両方により、ヒトで発現した免疫グロブリンと比較したときにアミノ酸の違いを含有する。典型的には、「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子によってコードされているアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。場合によっては、「ヒト抗体」は、例えばＫｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９６：５７－８６に記載されるヒトフレームワーク配列分析から得られたコンセンサスフレームワーク配列、又は例えばＳｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５－９６及び国際公開第２００９／０８５４６２号に記載される、ファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリに組み込まれた合成ＨＣＤＲ３を含有し得る。少なくとも１つのＣＤＲが非ヒト種に由来する抗体は、「ヒト抗体」の定義には含まれない。
「ヒト化抗体」は、少なくとも１つのＣＤＲが非ヒト種に由来し、少なくとも１つのフレームワークがヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体を指す。ヒト化抗体は、フレームワークに置換を含むことができるため、フレームワークは、発現したヒト免疫グロブリン又はヒト免疫グロブリン生殖細胞系列遺伝子配列の厳密なコピーではない場合がある。
「～と組み合わせて」は、２つ又は３つ以上の治療薬を、混合物の状態で一緒に、単剤として同時に、又は単剤として任意の順序で順次に、対象に投与することを意味する。
「細胞内シグナル伝達ドメイン」又は「細胞質シグナル伝達ドメイン」とは、分子の細胞内部分を指す。これは、タンパク質の機能的部分であり、セカンドメッセンジャを生成することにより定められたシグナル伝達経路を介して細胞活動を調節するために細胞内で情報を伝達することによって作用する、又はかかるメッセンジャに応答することによりエフェクターとして機能することによって作用する。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ含有細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。
「単離された」は、組換え細胞などにおいて分子が産生される系の他の成分から離して実質的に分離及び／又は精製された分子の均質な集団（例えば、合成ポリヌクレオチド又はポリペプチド）に加えて、少なくとも１つの精製又は単離工程に供されたタンパク質を指す。「単離／単離された」とは、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まない分子を指し、より高い純度、例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の純度まで単離された分子を包含する。
「カリクレイン関連ペプチダーゼ２」又は「ｈＫ２」とは、カリクレイン－２、顆粒状カリクレイン２、又はＨＫ２とも称される、知られているタンパク質を指す。ｈＫ２は、プレプロタンパク質として産生され、タンパク質分解中に切断されて、活性プロテアーゼを生成する。全てのｈＫ２アイソフォーム及びバリアントが、「ｈＫ２」に包含される。様々なアイソフォームのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５５４２．１、ＮＰ＿００１００２２３１．１、及びＮＰ＿００１２４３００９から検索可能である。完全長ｈＫ２のアミノ酸配列を配列番号９８に示す。配列は、シグナルペプチド（残基１～１８）及びプロペプチド領域（残基１９～２４）を含む。
配列番号９８
ＭＷＤＬＶＬＳＩＡＬＳＶＧＣＴＧＡＶＰＬＩＱＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＡＶＹＳＨＧＷＡＨＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＬＫＫＮＳＱＶＷＬＧＲＨＮＬＦＥＰＥＤＴＧＱＲＶＰＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＮＭＳＬＬＫＨＱＳＬＲＰＤＥＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＫＩＴＤＶＶＫＶＬＧＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＲＰＲＳＬＱＣＶＳＬＨＬＬＳＮＤＭＣＡＲＡＹＳＥＫＶＴＥＦＭＬＣＡＧＬＷＴＧＧＫＤＴＣＧＧＤＳＧＧＰＬＶＣＮＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＰＥＰＣＡＬＰＥＫＰＡＶＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＡＡＮＰ
「ヒト白血球抗原Ｇ」又は「ＨＬＡ－Ｇ」は、「ＨＬＡクラスＩ組織適合抗原、アルファ鎖Ｇ」又は「ＭＨＣクラスＩ抗原Ｇ」とも称される、知られているタンパク質を指す。全てのＨＬＡ－Ｇアイソフォーム及びバリアントは、「ＨＬＡ－Ｇ」に包含される。様々なアイソフォームのアミノ酸配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｐ１７６９３－１～Ｐ１７６９３－７から検索可能である。配列番号６９１は、ＨＬＡ－Ｇ１と呼ばれる例示的なＨＬＡ－Ｇアイソフォームを表す。
Figure 2023528350000001
「調節する」は、対照又はビヒクルによって媒介される応答と比較したときに、増強されたか、又は低減された応答を媒介する（すなわち、下流効果）試験分子の増強されたか、又は減少した能力のいずれかを指す。
「モノクローナル抗体」とは、抗体重鎖からＣ末端リジンを除去する、又はアミノ酸の異性化若しくは脱アミド、メチオニンの酸化、又はアスパラギン若しくはグルタミンの脱アミドなどの翻訳後修飾といった、可能な周知の変更を除いて同一である、抗体分子の実質的に均質な母集団から得られた抗体、即ち、集団を構成する個別の抗体を意味する。モノクローナル抗体は、典型的には、１つの抗原性エピトープに結合する。二重特異性モノクローナル抗体は、２つの異なる抗原性エピトープに結合する。モノクローナル抗体は、抗体集団内で不均一なグリコシル化を有し得る。モノクローナル抗体は、単一特異性であってよく、又は、二重特異性などの多特異性であってよく、一価、二価、又は多価であってよい。
「多重特異性」とは、２つ又は３つ以上の異なる抗原、又は同じ抗原内の２つ又は３つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する、抗体などの分子を指す。多重特異性分子は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、カニクイザル（Macaca fascicularis）（cynomolgus、ｃｙｎｏ）又はチンパンジー（Pan troglodytes）などの他の種由来の同じ抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有する場合もあり、２つ又は３つ以上の異なる抗原間で共有されているエピトープに結合する場合もある。
「ナチュラルキラー細胞」及び「ＮＫ細胞」は、本明細書では互換的かつ同義的に使用される。ＮＫ細胞とは、ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋及び／又はＣＤ５７＋ＴＣＲ－表現型を有する分化リンパ球を指す。ＮＫ細胞は、特定の細胞溶解性酵素の活性化によって「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現できない細胞に結合し、殺傷する能力、腫瘍細胞又はＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する他の疾患細胞を殺傷する能力、及び免疫応答を刺激又は阻害するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力を特徴とする。
「動作可能に連結された」及び類似の語句は、核酸又はアミノ酸に関して使用される場合、それぞれ、互いに機能的な関係で配置された核酸配列又はアミノ酸配列の動作上の連結を指す。例えば、動作可能に連結されたプロモータ、エンハンサーエレメント、オープンリーディングフレーム、５’及び３’ＵＴＲ、並びにターミネーター配列は、核酸分子（例えば、ＲＮＡ）の正確な産生をもたらし、場合によっては、ポリペプチドの産生（すなわち、オープンリーディングフレームの発現）をもたらす。動作可能に連結されたペプチドは、ペプチドの機能ドメインが互いに適切な距離で配置されて、各ドメインの意図された機能を付与するペプチドを指す。
「パラトープ」という用語は、抗原の結合に関与し、抗原と相互作用する残基を含む抗体分子の区域又は領域を指す。パラトープは、高次構造的空間単位を形成する連続的及び／又は不連続なアミノ酸で構成され得る。所与の抗体のパラトープは、様々な実験及び計算方法を使用して、様々なレベルで詳細に定義及び特性評価することができる。実験方法は、水素／重水素交換質量分析（hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry、ＨＸ－ＭＳ）を含む。パラトープは、用いられるマッピング方法に応じて異なって定義される。
「医薬的組み合わせ」とは、一緒に又は別々に投与される２つ又は３つ以上の活性成分の組み合わせを指す。
「医薬組成物」とは、活性成分と医薬的に許容される担体とを組み合わせて得られる組成物を指す。
「医薬的に許容される担体」又は「賦形剤」は、対象に対して毒性のない、活性成分以外の医薬組成物中の成分を指す。例示的な医薬的に許容される担体は、バッファ、安定剤、又は防腐剤である。
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」とは、糖－リン酸骨格又は他の同等の共有結合化学によって共有結合されたヌクレオチド鎖を含む、合成分子を指す。ｃＤＮＡは、ポリヌクレオチドの典型例である。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子であり得る。
疾患又は障害を「予防する」、「予防すること」、「予防」、又は「予防法」とは、対象において障害が発生するのを防ぐことを意味する。
「増殖」とは、細胞の対称的又は非対称的な分裂のいずれかである細胞分裂の増加を指す。
「プロモータ」とは、転写を開始させるために必要な最小配列を指す。プロモータはまた、それぞれ転写を増強又は抑制するエンハンサー又はリプレッサーエレメントを含み得る。
「タンパク質」又は「ポリペプチド」は、本明細書では互換的に使用され、各々がペプチド結合によって連結された少なくとも２つのアミノ酸残基で構成されている１つ又は２つ以上のポリペプチドを含む分子を指す。タンパク質は、モノマーであってもよく、又は同一若しくは異なる２つ又は３つ以上のサブユニットのタンパク質複合体であってもよい。５０個未満のアミノ酸からなる小分子ポリペプチドは、「ペプチド」と称され得る。タンパク質は、異種融合タンパク質、糖タンパク質、又はリン酸化、アセチル化、ミリストイル化、パルミトイル化、グリコシル化、酸化、ホルミル化、アミド化、シトルリン化、ポリグルタミル化、ＡＤＰ－リボシル化、ペグ化又はビオチン化などの翻訳後改変によって修飾されたタンパク質であり得る。タンパク質は、抗体であってもよいか、又は抗体の抗原結合断片を含んでもよい。タンパク質は、組換え発現し得る。
「組換え体」は、組換え手段によって調製、発現、創出、又は単離されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、ウイルス、及び他の巨大分子を指す。
「調節エレメント」とは、核酸配列の発現のある側面を制御する任意のシス又はトランス作用性遺伝要素を指す。
「再発性」とは、治療薬による前の治療の後の改善期間後に疾患又は疾患の徴候及び症状が再開することを指す。
「難治性」とは、治療に応答しない疾患を指す。難治性疾患は、治療前若しくは治療開始時に治療に抵抗性であり得るか、又は難治性疾患は、治療中に抵抗性疾患となり得る。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」とは、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む少なくとも１つの抗体断片と、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む少なくとも１つの抗体断片と、を含む融合タンパク質を指し、ＶＬ及びＶＨは、ポリペプチドリンカーを介して連続的に連結され、一本鎖ポリペプチドとして発現することができる。特に指定しない限り、本明細書で使用するとき、ｓｃＦｖは、ＶＬ及びＶＨ可変領域をいずれの順序で有していてもよく、例えば、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に関して、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含んでいてもよく、又はＶＨ－リンカー－ＶＬを含んでいてもよい。
「（ｓｃＦｖ）２」又は「タンデムｓｃＦｖ」又は「ビス－ｓｃＦｖ」断片とは、２つの軽鎖可変領域（ＶＬ）と、２つの重鎖可変領域（ＶＨ）と、を含む融合タンパク質を指し、２つのＶＬ及び２つのＶＨは、ポリペプチドリンカーを介して連続的に連結され、一本鎖ポリペプチドとして発現することができる。２つのＶＬ及び２つのＶＨは、ペプチドリンカーによって融合されて、二価分子ＶＬＡ－リンカー－ＶＨＡ－リンカー－ＶＬＢ－リンカー－ＶＨＢを形成して、２つの異なる抗原又はエピトープに同時に結合することができる２つの結合部位を形成する。
「特異的に結合する」、「特異的結合」、「特異的に結合している」、又は「結合する」とは、タンパク質性分子が、抗原又は抗原内のエピトープに、他の抗原に対する親和性よりも高い親和性で結合することを指す。典型的には、タンパク質性分子は、約１×１０－７Ｍ以下、例えば約５×１０－８Ｍ以下、約１×１０－８Ｍ以下、約１×１０－９Ｍ以下、約１×１０－１０Ｍ以下、約１×１０－１１Ｍ以下、又は約１×１０－１２Ｍ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で抗原又は抗原内のエピトープに結合し、典型的には、ＫＤは、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合についてのＫＤよりも少なくとも１００倍小さい。本明細書に記載の前立腺ネオ抗原の文脈において、「特異的結合」とは、タンパク質性分子が、前立腺ネオ抗原がそのバリアントである野生型タンパク質に検出可能には結合することなく、前立腺ネオ抗原に結合することを指す。
「対象」は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」としては、あらゆる脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの哺乳類及び非哺乳類が挙げられる。「対象」及び「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され得る。
「Ｔ細胞」及び「Ｔリンパ球」は、互換的であり、本明細書では同義的に使用される。Ｔ細胞には、胸腺細胞、ナイーブＴリンパ球、メモリＴ細胞、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、静止Ｔリンパ球、又は活性化Ｔリンパ球が含まれる。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（T helper、Ｔｈ）細胞、例えば、Ｔヘルパー１（T helper 1、Ｔｈ１）又はＴヘルパー２（T helper 2、Ｔｈ２）細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ、ＣＤ４＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＩＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、又はＴ細胞の任意の他のサブセットであり得る。また、「ＮＫＴ細胞」も含まれ、これは、半不変αβＴ細胞受容体を発現するだけでなく、ＮＫ１．１などの典型的にはＮＫ細胞に関連する様々な分子マーカーも発現する、Ｔ細胞の特殊な集団を指す。ＮＫＴ細胞には、ＮＫ１．１＋及びＮＫ１．１－、並びにＣＤ４＋、ＣＤ４－、ＣＤ８＋、及びＣＤ８－細胞が含まれる。ＮＫＴ細胞のＴＣＲは、ＭＨＣ Ｉ様分子ＣＤ Ｉｄによって提示される糖脂質抗原を認識するという点で独特である。ＮＫＴ細胞は、炎症又は免疫寛容のいずれかを促進するサイトカインを産生する能力により、保護効果又は有害効果のいずれかを有し得る。また、「ガンマデルタＴ細胞（γδＴ細胞）」も含まれ、これは、それらの表面に異なるＴＣＲを有するＴ細胞の小さなサブセットの特殊な集団を指し、ＴＣＲがα及びβ－ＴＣＲ鎖と表記される２つの糖タンパク質鎖から構成されるＴ細胞の大部分とは異なり、γδＴ細胞におけるＴＣＲは、γ鎖及びδ鎖から構成される。γδＴ細胞は、免疫監視及び免疫調節において役割を果たすことができ、ＩＬ－１７の重要な供給源であること、及び強固なＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導することが見出された。また、「調節性Ｔ細胞」又は「Ｔｒｅｇ」も含まれ、これは、異常又は過剰な免疫応答を抑制し、免疫寛容における役割を果たす、Ｔ細胞を指す。Ｔｒｅｇは、典型的には、転写因子Ｆｏｘｐ３陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞であり、かつ、ＩＬ－１０産生ＣＤ４＋Ｔ細胞である転写因子Ｆｏｘｐ３陰性調節性Ｔ細胞も含み得る。
本明細書において互換的に使用される「治療有効量」又は「有効量」は、所望の治療結果を達成するのに必要な投薬量及び期間で有効な量を指す。治療有効量は、個体の病態、年齢、性別、及び体重などの要因、並びに個体において所望の応答を引き出す治療薬又は治療薬の組み合わせの能力によって様々であってよい。有効な治療薬又は治療薬の組み合わせの例示的な指標としては、例えば、患者の健康状態の改善、腫瘍量の低減、腫瘍の成長の停止若しくは減速、及び／又は体内の他の箇所へのがん細胞の転移の不在が含まれる。
「形質導入」とは、ウイルスベクターを使用する、外来核酸の細胞への導入を指す。
がんなどの疾患又は障害を「治療する」、「治療している」、又は「治療」は、以下のうちの１つ以上を達成することを指す：障害の重症度及び／若しくは期間を低減する、治療される障害の特徴的な症状の悪化を阻害する、以前障害を有していた対象における障害の再発を制限若しくは予防する、又は以前に障害の症状を有していた対象における症状の再発を制限若しくは予防する。
「腫瘍細胞」又は「がん細胞」とは、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又は組織培養のいずれかにおいて、自発的な又は誘導された表現型の変化を有するがん性、前がん性、又は形質転換細胞を指す。これらの変化は、必ずしも新たな遺伝物質の取り込みを伴うものではない。形質転換は、形質転換ウイルスの感染及び新たなゲノム核酸の組み込み、外因性核酸の取り込みにより発生させることもできるが、自然発生的に又は発がん物質に曝露した後に発生し、それによって内因性の遺伝子が変異する場合もある。形質転換／がんは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、及びｅｘ ｖｉｖｏにおける、形態学的変化、細胞の不死化、異常な増殖制御、病巣の形成、増殖、悪性病変、腫瘍特異的マーカーレベルの調節、浸潤性、ヌードマウスなどの好適な動物宿主における腫瘍の増殖などによって例示される。
「バリアント」、「変異体」、又は「変化した」とは、１つ又は２つ以上の修飾、例えば、１つ又は２つ以上の置換、挿入、又は欠失によって参照ポリペプチド又は参照ポリヌクレオチドとは異なる、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。
本明細書全体を通して、抗体定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、本明細書に別途明示的に記載のない限り、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に記載のＥＵインデックスに従う。
Ｉｇ定常領域の変異は、以下のように称される。Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖは、１つの免疫グロブリン定常領域におけるＬ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖ変異を指す。Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗは、１つの多量体タンパク質中に存在する、第１のＩｇ定常領域におけるＬ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異並びに第２のＩｇ定常領域におけるＴ３９４Ｗ変異を指す。
「ＶＨＨ」とは、重鎖ホモ二量体によって排他的に構成される単一ドメイン抗体又はナノボディを指す。ＶＨＨ単一ドメイン抗体は、従来のＦａｂ領域の軽鎖及び重鎖のＣＨ１ドメインを欠く。
特に明記しない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などのあらゆる数値は、全ての場合において、「約」という用語によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、数値は、典型的には、記載される値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％～１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は０．９％（ｗ／ｖ）～１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用するとき、数値範囲の使用は、文脈上そうでない旨が明確に示されない限り、その範囲内の整数及び値の分数を含む、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含む。
本明細書全体を通して、抗体定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、本明細書に別途明示的に記載のない限り、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に記載のＥＵインデックスに従う。
Figure 2023528350000002
ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメイン。
本開示は、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメイン、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む単一特異性又は多重特異性タンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、並びにそれを作製及び使用する方法を提供する。本明細書で同定されたＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、高い熱安定性、低減された脱アミド化リスク、及び減少した免疫原性に関して有利な特性を実証した。
本開示はまた、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、当該ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号１０３の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、単離タンパク質を提供する。配列番号１０３は、高い熱安定性、低減された脱アミド化リスク、及び減少した免疫原性を含む、改善された特性を実証する、バリアントを包含するＶＬ属アミノ酸配列を表す。例えば、低減された脱アミド化リスクを付与するように遺伝子操作された位置は、ＶＬ中の残基Ｎ９２であり（Ｋａｂａｔ番号付けによる配列番号２４のＣＤ３Ｂ８１５ ＶＬ配列を使用した残基番号付け（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１））、減少した免疫原性を付与するように遺伝子操作された位置は、残基Ｙ４９及び／又はＬ７８におけるヒトからマウスへの復帰変異であった（配列番号２４のＣＤ３Ｂ８１５ ＶＬを使用したＫａｂａｔによる残基番号付け）。残基Ｎ９２における遺伝子操作された位置は、ＬＣＤＲ３内にあった。この位置に変異があっても、抗体は、抗原に結合する能力を保持した。
本開示は、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、当該ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、配列番号２４の軽鎖可変領域（ＶＬ）の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と、を含む、単離タンパク質を提供する。
本開示は、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、当該ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、以下のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離タンパク質を提供する：
それぞれ配列番号６、７、８、９、１０、及び１１、
それぞれ配列番号１２、１３、１４、１５、１６、及び１７、又は
それぞれ配列番号１８、１９、２０、２１、１６、及び２２。
本開示は、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、当該ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、配列番号２３のＶＨと、配列番号２４、２７、２８、２９、又は３０のＶＬと、を含む、単離タンパク質を提供する。
本開示は、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、当該ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、以下を含む、単離タンパク質を提供する：
配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４のＶＬ、
配列番号２３のＶＨ及び配列番号２７のＶＬ、
配列番号２３のＶＨ及び配列番号２８のＶＬ、
配列番号２３のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は
配列番号２３のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ。
本開示は、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、当該ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、配列番号２５又は２６のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質を提供する。他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、配列番号８５又は８６のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、配列番号８５又は８８のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、配列番号８５又は９０のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、配列番号８５又は９２のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、配列番号８５又は９４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、（ｓｃＦｖ）２である。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｆｖである。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｆａｂである。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｆ（ａｂ’）２である。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｆｄである。
他の実施形態では、ＣＤ３ε抗原結合ドメインは、ｄＡｂである。
他の実施形態では、ＣＤ３ε抗原結合ドメインは、ＶＨＨである。
ＣＤ３ε結合ｓｃＦｖ
ＣＤ３εに結合する本明細書で同定されたＶＨドメイン及びＶＬドメインのいずれも、ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨ配向のいずれのｓｃＦｖフォーマットにも遺伝子操作され得る。また、本明細書で同定されたＶＨドメイン及びＶＬドメインのいずれも、例えば以下のｓｃ（Ｆｖ）２構造を生成するために使用され得る：ＶＨ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＨ、ＶＨ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＬ。ＶＨ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＬ。ＶＬ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＬ。ＶＬ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＨ、又はＶＬ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＨ。
本明細書で同定されたＶＨ及びＶＬドメインは、ｓｃＦｖフォーマットに組み込むことができ、得られたｓｃＦｖのＣＤ３εへの結合及び熱安定性は、既知の方法を使用して評価することができる。結合は、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００、若しくはＫｉｎＥｘＡ機器、ＥＬＩＳＡ、又は当業者に公知の競合的結合アッセイを使用して評価することができる。結合は、精製されたｓｃＦｖ又は大腸菌上清、又は発現したｓｃＦｖを含有する溶解細胞を使用して評価することができる。試験ｓｃＦｖのＣＤ３εに対する親和性の測定値は、異なる条件（例えば、モル浸透圧濃度、ｐＨ）下で測定した場合に異なり得る。したがって、親和性及びその他の結合パラメータ（例えば、ＫＤ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の測定は、典型的には、標準的な条件、及び標準化緩衝液を用いて行われる。熱安定性は、５０℃、５５℃、又は６０℃などの高温で、５分（ｍｉｎ）、１０分、１５分、２０分、２５分、又は３０分などの期間、試験ｓｃＦｖを加熱し、試験ｓｃＦｖのＣＤ３εへの結合を測定することによって評価することができる。非加熱ｓｃＦｖサンプルと比較したときに、ＣＤ３εと同等の結合を保持しているｓｃＦｖが、熱安定性であると称される。
組換え発現系にて、リンカーはペプチドリンカーであり、任意の天然に存在するアミノ酸を含み得る。リンカーに含まれ得る例示的なアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ及びＴｈｅである。リンカーは、ＣＤ３εへの結合などの所望の活性を保持するように、互いに対して正確な高次構造を形成するような方法でＶＨ及びＶＬを連結させるのに適切な長さを有している必要がある。
リンカーは、約５～５０個のアミノ酸長であり得る。他の実施形態では、リンカーは、約１０～４０個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、約１０～３５個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、約１０～３０個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、約１０～２５個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、約１０～２０個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、約１５～２０個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、約１６～１９個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、６個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、７個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、８個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、９個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、１０個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、１１個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、１２個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、１３個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、１４個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、１５個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、１６個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、１７個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、１８個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、１９個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、２０個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、２１個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、２２個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、２３個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、２４個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、２５個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、２６個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、２７個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、２８個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、２９個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、３０個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、３１個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、３２個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、３３個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、３４個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、３５個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、３６個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、３７個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、３８個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、３９個のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、４０個のアミノ酸長である。使用され得る例示的なリンカーは、Ｇｌｙリッチリンカー、Ｇｌｙ及びＳｅｒ含有リンカー、Ｇｌｙ及びＡｌａ含有リンカー、Ａｌａ及びＳｅｒ含有リンカー、並びに他の柔軟なリンカーである。
他のリンカー配列は、免疫グロブリン重鎖又は軽鎖アイソタイプに由来する免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＬ又はＣＨ１の部分を含み得る。代替的に、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーを含む様々な非タンパク質性ポリマーは、リンカーとして利用され得る。使用され得る例示的なリンカーを表２に示す。追加のリンカーは、例えば、国際公開第２０１９／０６０６９５号に記載されている。
Figure 2023528350000003
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、第１のリンカー（Ｌ１）、及びＶＬ（ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ）を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＬ、Ｌ１、及びＶＨを含む（ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ）。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号４３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号４５のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号４６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号４７のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号４８のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号４９のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号５０のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号５３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号５５のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号５６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号５７のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号６０のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号６１のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号６２のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号６４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、
配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、配列番号２４の軽鎖可変領域（ＶＬ）の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と、を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、以下のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む：
それぞれ配列番号６、７、８、９、１０、及び１１、又は
それぞれ配列番号１２、１３、１４、１５、１６、及び１７、又は
それぞれ配列番号１８、１９、２０、２１、１６、及び２２。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、それぞれ配列番号６、７、８、９、１０、及び１１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、それぞれ配列番号１２、１３、１４、１５、１６、及び１７のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、それぞれ配列番号１８、１９、２０、２１、１６、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４のＶＬを含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２７のＶＬを含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２３のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、又は７４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号６５のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号６６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号６７のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号６８のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号６９のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号７０のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号７４のアミノ酸配列を含む。
ＣＤ３εに結合する他の抗原結合ドメイン
ＣＤ３εに結合する本明細書で同定されたＶＨドメイン及びＶＬドメインのいずれも、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖフォーマットに遺伝子操作することができ、それらのＣＤ３εへの結合及び熱安定性は、本明細書に記載されるアッセイを使用して評価することができる。
他の実施形態では、Ｆａｂは、
配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、配列番号２４の軽鎖可変領域（ＶＬ）の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と、を含む。
他の実施形態では、Ｆａｂは、以下のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む：
それぞれ配列番号６、７、８、９、１０、及び１１、
それぞれ配列番号１２、１３、１４、１５、１６、及び１７、又は
それぞれ配列番号１８、１９、２０、２１、１６、及び２２。
他の実施形態では、Ｆａｂは、それぞれ配列番号６、７、８、９、１０、及び１１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆａｂは、それぞれ配列番号１２、１３、１４、１５、１６、及び１７のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆａｂは、それぞれ配列番号１８、１９、２０、２１、１６、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆａｂは、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆａｂは、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２７のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆａｂは、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆａｂは、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆａｂは、配列番号２３のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆａｂは、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４、２７、２８、２９、又は３０のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、
配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、配列番号２４の軽鎖可変領域（ＶＬ）の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と、を含む。
他の実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、以下のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む：
それぞれ配列番号６、７、８、９、１０、及び１１、
それぞれ配列番号１２、１３、１４、１５、１６、及び１７、又は
それぞれ配列番号１８、１９、２０、２１、１６、及び２２。
他の実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、それぞれ配列番号６、７、８、９、１０、及び１１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、それぞれ配列番号１２、１３、１４、１５、１６、及び１７のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、それぞれ配列番号１８、１９、２０、２１、１６、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２７のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号２３のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号２３のＶＨ、及び配列番号２４、２７、２８、２９、又は３０のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆｖは、
配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、配列番号２４の軽鎖可変領域（ＶＬ）の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と、を含む。
他の実施形態では、Ｆｖは、以下のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む：
それぞれ配列番号６、７、８、９、１０、及び１１、
それぞれ配列番号１２、１３、１４、１５、１６、及び１７、又は
それぞれ配列番号１８、１９、２０、２１、１６、及び２２。
他の実施形態では、Ｆｖは、それぞれ配列番号６、７、８、９、１０、及び１１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆｖは、それぞれ配列番号１２、１３、１４、１５、１６、及び１７のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆｖは、それぞれ配列番号１８、１９、２０、２１、１６、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆｖは、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆｖは、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２７のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆｖは、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆｖは、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆｖは、配列番号２３のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆｖは、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４、２７、２８、２９、又は３０のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｆｄは、
配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆｄは、それぞれ配列番号６、７、及び８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、及びＨＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆｄは、それぞれ配列番号１２、１３、及び１４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、及びＨＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆｄは、それぞれ配列番号１８、１９、及び２０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、及びＨＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、Ｆｄは、配列番号２３のＶＨを含む。
相同な抗原結合ドメイン及び保存的置換を有する抗原結合ドメイン
ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインのバリアントは、本開示の範囲内である。例えば、バリアントは、親抗原結合ドメインと比較したときに改善された機能的性質を保持するか又は有する限り、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインに１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９個のアミノ酸置換を含んでいてよい。他の実施形態では、配列同一性は、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインに対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であってよい。他の実施形態では、バリアントは、フレームワーク領域に存在する。他の実施形態では、バリアントは、保存的置換により生成される。
例えば、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、ＶＬ中の残基位置Ｙ４９、Ｌ７８、又はＮ９２（残基番号付けはＫａｂａｔに従う）に置換を含み得る。保存的置換は、任意の指定の位置で行うことができ、得られたＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインのバリアントを、本明細書に記載のアッセイで所望の特性について試験する。
また、以下と少なくとも８０％同一であるＶＨ及びＶＬを含む、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインも提供される：
配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４のＶＬ、
配列番号２３のＶＨ及び配列番号２７のＶＬ、
配列番号２３のＶＨ及び配列番号２８のＶＬ、
配列番号２３のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は
配列番号２３のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ。
他の実施形態では、同一性は、８５％である。他の実施形態では、同一性は、９０％である。他の実施形態では、同一性は、９１％である。他の実施形態では、同一性は、９１％である。他の実施形態では、同一性は、９２％である。他の実施形態では、同一性は、９３％である。他の実施形態では、同一性は、９４％である。他の実施形態では、同一性は、９４％である。他の実施形態では、同一性は、９５％である。他の実施形態では、同一性は、９６％である。他の実施形態では、同一性は、９７％である。他の実施形態では、同一性は、９８％である。他の実施形態では、同一性は、９９％である。
２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮した、配列により共有される同一の位置の数の関数（すなわち、同一性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）である。
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ ４：１１－１７（１９８８））のアルゴリズムを使用し、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用して決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（インターネットから検索することができる＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍ＞）のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８：４４４－４５３（１９７０））のアルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６、又は４、長さ重み１、２、３、４、５、又は６を使用して決定することができる。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合するバリアント抗原結合ドメインは、ＣＤ３εに結合する親抗原結合断片の所望の機能的特性を保持しながら、ＣＤＲ領域のうちのいずれかに１つ又は２つの保存的置換を含む。
「保存的改変」とは、アミノ酸修飾を含む抗体の結合特性に著しく影響を与えることも変化させることもないアミノ酸修飾を指す。保存的改変は、アミノ酸の置換、付加、及び欠失を含む。保存的アミノ酸置換は、あるアミノ酸が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、明確に定義されており、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファン）、芳香族側鎖（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン）、脂肪族側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン）、アミド（例えば、アスパラギン、グルタミン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び含硫黄側鎖（システイン、メチオニン）を有するアミノ酸を含む。更に、ポリペプチド中の任意の天然残基はまた、アラニンスキャニング変異誘発（ＭａｃＬｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｓｃａｎｄ Ｓｕｐｐｌ ６４３：５５－６７；Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ａｄｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３５：１－２４）について以前に記載されているように、アラニンで置換され得る。本発明の抗体に対するアミノ酸置換は、既知の方法、例えばＰＣＲ突然変異誘発（米国特許第４，６８３，１９５号）により行うことができる。あるいは、バリアントのライブラリは、例えば、ランダムコドン（ＮＮＫ）又は非ランダムコドン（例えば１１個のアミノ酸（Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）をコードするＤＶＫコドン）を用いて生成することもできる。得られるバリアントは、本明細書に記載のアッセイを用いて、その特徴について試験することができる。
ＣＤ３εに結合する抗原結合断片を作製する方法
本開示で提供されるＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、様々な技術を使用して生成することができる。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ法を使用して、ＣＤ３εに結合するＶＨ／ＶＬ対を同定することができる。ハイブリドーマ法では、マウス又は他の宿主動物、例えば、ハムスター、ラット、若しくはニワトリを、ヒト及び／又はカニクイザルＣＤ３εで免疫し、続いて、標準的な方法を用いて骨髄腫細胞で免疫した動物の脾臓細胞を融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する。１個の不死化したハイブリドーマ細胞から生じたコロニーを、結合特異性、交差反応性又はその欠如、抗原に対する親和性、及び任意の所望の機能性などの所望の特性を有するＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含有する抗体の生成についてスクリーニングしてよい。
非ヒト動物を免疫することによって生成されたＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインをヒト化してもよい。ヒトアクセプタフレームワークの選択を含む例示的なヒト化技術としては、ＣＤＲ移植（米国特許第５，２２５，５３９号）、ＳＤＲ移植（米国特許第６，８１８，７４９号）、リサーフェシング（Ｐａｄｌａｎ，（１９９１）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８：４８９－４９９）、特異性決定残基リサーフェシング（米国特許出願公開第２０１０／０２６１６２０号）、ヒトフレームワーク適合（米国特許第８，７４８，３５６号）、又は超ヒト化（米国特許第７，７０９，２２６号）が挙げられる。これらの方法では、ＣＤＲの長さの類似性若しくはカノニカル構造の同一性、又はこれらの組み合わせに基づいて、親フレームワークに対する全体的な相同性に基づき選択され得るヒトフレームワークに、親抗体のＣＤＲ又はＣＤＲ残基のサブセットを移植する。
ヒト化抗原結合ドメインは、国際公開第１０９０／００７８６１号及び同第１９９２／２２６５３号に記載されているものなどの技術により、変化させたフレームワーク支持残基を組み込んで結合親和性を保持することによって（復帰変異）、又はＣＤＲのいずれかに多様性を導入して、例えば抗原結合ドメインの親和性を改善することによって、所望の抗原に対するその選択性又は親和性を改善するように更に最適化してもよい。
自身のゲノムにヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を保有するマウス、ラット、又はニワトリなどのトランスジェニック動物を使用して、ＣＤ３εに結合する抗原結合断片を作製することができ、これらは例えば、米国特許第６，１５０，５８４号、国際公開第１９９９／４５９６２号、同第２００２／０６６６３０号、同第２００２／４３４７８号、同第２００２／０４３４７８号、及び同第１９９０／０４０３６号に記載されている。このような動物の内在的な免疫グロブリン遺伝子座を破壊又は欠失させてもよく、相同又は非相同組換えを使用して、導入染色体（transchromosome）を使用して、又はミニ遺伝子を使用して、少なくとも１つの完全な又は部分的なヒト免疫グロブリン遺伝子座を動物のゲノムに挿入してもよい。Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ（＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ．ｃｏｍ＞）、Ｈａｒｂｏｕｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈａｒｂｏｕｒａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ｃｏｍ）、Ｏｐｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（ＯＭＴ）（＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｍｔｉｎｃ．ｎｅｔ＞）、ＫｙＭａｂ（＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｙｍａｂ．ｃｏｍ＞）、Ｔｒｉａｎｎｉ（＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｒｉａｎｎｉ．ｃｏｍ＞）、及びＡｂｌｅｘｉｓ（＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｌｅｘｉｓ．ｃｏｍ＞）などの企業は、上記の技術を使用して、選択された抗原を対象としたヒト抗体を提供するように従事し得る。
ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、ヒト免疫グロブリン又はその一部、例えばＦａｂ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、又は不対若しくは対合抗体可変領域を発現するようにファージが遺伝子操作されているファージディスプレイライブラリから選択することができる。ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、例えば、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５－９６、及び国際公開第０９／０８５４６２号）に記載されるバクテリオファージｐＩＸ被覆タンパク質との融合タンパク質として抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を発現するファージディスプレイライブラリから単離され得る。ライブラリを、ヒト及び／又はカニクイザルＣＤ３εへのファージ結合についてスクリーニングしてよく、得られた陽性クローンを更に特性評価し、クローン溶解物からＦａｂを単離し、ｓｃＦｖ又は抗原結合断片の他の構成に変換してよい。
免疫原性抗原の調製並びに本開示の抗原結合ドメインの発現及び生成は、組換えタンパク質生成などの任意の好適な技術を用いて実施することができる。免疫原性抗原は、精製タンパク質、あるいは全細胞又は細胞若しくは組織抽出物を含むタンパク質混合物の形態で動物に投与されてもよく、あるいは、抗原は、当該抗原又はその一部分をコードする核酸から動物の体内で新規に（de novo）形成されてもよい。
半減期延長部分へのコンジュゲーション
本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、半減期延長部分にコンジュゲートさせてもよい。例示的な半減期延長部分は、アルブミン、アルブミンバリアント、アルブミン結合タンパク質及び／又はドメイン、トランスフェリン並びにその断片及び類似体、免疫グロブリン（Ｉｇ）又はその断片、例えばＦｃ領域である。前述の半減期延長部分のアミノ酸配列は公知である。Ｉｇ又はその断片は、全てのアイソタイプ（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ）を含む。
本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインにコンジュゲートされ得る追加の半減期延長部分としては、所望の特性のための、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、例えば、ＰＥＧ５０００又はＰＥＧ２０，０００、異なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、例えば、ラウリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、ステアリン酸エステル、アラキジン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エステル、アラキドン酸エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸など、ポリリジン、オクタン、炭水化物（デキストラン、セルロース、オリゴ糖又は多糖類）が挙げられる。これら部分は、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインと直接融合させてよく、標準的なクローニング及び発現技術によって作製してよい。あるいは、周知の化学的カップリング方法を用いて、組換えで生成された本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインにその部分を結合させてもよい。
例えば、システイン残基を本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインのＣ末端に組み込むか、又は遺伝子操作してシステインをＣＤ３ε結合部位から離れる方向に面する残基位置にし、周知の方法を用いてペギル基をシステインに結合させることによって、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインにペギル部分をコンジュゲートさせることができる。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合断片は、半減期延長部分にコンジュゲートされる。
他の実施形態では、半減期延長部分は、免疫グロブリン（Ｉｇ）、Ｉｇの断片、Ｉｇ定常領域、Ｉｇ定常領域の断片、Ｆｃ領域、トランスフェリン、アルブミン、アルブミン結合ドメイン、又はポリエチレングリコールである。他の実施形態では、半減期延長部分は、Ｉｇ定常領域である。
他の実施形態では、半減期延長部分は、Ｉｇである。
他の実施形態では、半減期延長部分は、Ｉｇの断片である。
他の実施形態では、半減期延長部分は、Ｉｇ定常領域である。
他の実施形態では、半減期延長部分は、Ｉｇ定常領域の断片である。
他の実施形態では、半減期延長部分は、Ｆｃ領域である。
他の実施形態では、半減期延長部分は、アルブミンである。
他の実施形態では、半減期延長部分は、アルブミン結合ドメインである。
他の実施形態では、半減期延長部分は、トランスフェリンである。
他の実施形態では、半減期延長部分は、ポリエチレングリコールである。
半減期延長部分にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、知られているｉｎ ｖｉｖｏモデルを利用して、それらの薬物動態特性について評価することができる。
免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域又はＩｇ定常領域の断片へのコンジュゲーション
本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートして、Ｆｃエフェクター機能Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）、貪食作用、又は細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）のダウンレギュレーションを含む、抗体様特性を付与することができる。Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片はまた、本明細書で論じられるように、半減期延長部分としても機能する。本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、標準的な方法を使用して遺伝子操作して従来の完全長抗体にすることができる。ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む完全長抗体は、本明細書に記載のとおり、更に遺伝子操作されてもよい。
免疫グロブリン重鎖定常領域は、サブドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３で構成される。ＥＵインデックスに従う残基番号付けで、重鎖においてＣＨ１ドメインは残基Ａ１１８～Ｖ２１５に及び、ＣＨ２ドメイン残基はＡ２３１～Ｋ３４０に及び、ＣＨ３ドメイン残基Ｇ３４１～Ｋ４４７に及ぶ。いくつかの例では、Ｇ３４１は、ＣＨ２ドメイン残基と称される。ヒンジは、概して、Ｅ２１６を含み、ヒトＩｇＧ１のＰ２３０で終結すると定義される。Ｉｇ Ｆｃ領域は、Ｉｇ定常領域の少なくともＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、したがって、Ｉｇ重鎖定常領域の少なくともおよそＡ２３１からＫ４４７までの領域を含む。
本発明はまた、免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを提供する。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域は、重鎖定常領域である。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域は、軽鎖定常領域である。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、Ｆｃ領域を含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ＣＨ２ドメインを含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ＣＨ３ドメインを含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ヒンジの少なくとも一部分、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む。ヒンジの一部分は、Ｉｇヒンジの１つ又は２つ以上のアミノ酸残基を指す。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のＮ末端にコンジュゲートされる。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のＣ末端にコンジュゲートされる。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、第２のリンカー（Ｌ２）を介してＩｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされる。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、又は６４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号４３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号４５のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号４６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号４７のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号４８のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号４９のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号５０のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号５３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号５５のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号５６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号５７のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号６０のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号６１のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号６２のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号６４のアミノ酸配列を含む。
Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、いくつかの知られているアッセイを使用してそれらの機能性について評価することができる。ＣＤ３εへの結合は、本明細書に記載の方法を使用して評価することができる。Ｉｇ定常ドメイン又はＩｇ定常領域の断片、例えばＦｃ領域によって付与される変化した特性は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、若しくはＦｃＲｎ受容体などの受容体の可溶性形態を使用するＦｃ受容体結合アッセイにおいて、又は例えばＡＤＣＣ、ＣＤＣ、若しくはＡＤＣＰを測定する細胞ベースのアッセイを使用して、アッセイすることができる。
ＡＤＣＣは、ＣＤ３ε発現細胞を標的細胞として、そしてＮＫ細胞をエフェクター細胞として使用するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用して評価することができる。細胞溶解は、溶解した細胞からの標識（例えば、放射性基質、蛍光染料、又は天然の細胞内タンパク質）の放出によって検出することができる。例示的なアッセイでは、標的細胞を、１つの標的細胞の、４つのエフェクター細胞に対する比で使用する。標的細胞はＢＡＴＤＡで予め標識し、エフェクター細胞及び試験抗体と組み合わせる。サンプルを２時間インキュベートし、上清に放出したＢＡＴＤＡを測定することにより、細胞溶解を測定する。０．６７％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）による最大の細胞傷害に対してデータを正規化し、また任意の抗体の非存在下における標的細胞からのＢＡＴＤＡの自然放出によって最小対照を求める。
ＡＤＣＰは、単球由来マクロファージをエフェクター細胞として、そして、ＧＦＰ又は他の標識分子を発現するように遺伝子操作された任意のＣＤ３ε発現細胞を標的細胞として使用することによって評価することができる。例示的なアッセイでは、エフェクター：標的細胞比は、例えば４：１とすることができる。エフェクター細胞は、本発明の抗体を添加し又は添加せずに、標的細胞とともに４時間インキュベートしてよい。インキュベーション後、細胞は、アクターゼを用いて剥離できる。マクロファージは、蛍光標識に結合した抗ＣＤ１１ｂ抗体及び抗ＣＤ１４抗体を用いて特定することができ、貪食作用の割合は、標準的な方法を用いて、ＣＤ１１＋ＣＤ１４＋マクロファージにおけるＧＦＰ蛍光％に基づいて求めることができる。
細胞のＣＤＣは、例えば、Ｄａｕｄｉ細胞を、ＲＰＭＩ－Ｂ（１％のＢＳＡを補給したＲＰＭＩ）に１×１０５個の細胞／ウェル（５０μＬ／ウェル）で播種し、５０μＬの試験タンパク質を０～１００μｇ／ｍＬの最終濃度でウェルに添加し、反応物を室温で１５分間インキュベートし、１１μＬのプールヒト血清をウェルに添加し、反応物を３７℃で４５分間インキュベートすることによって測定され得る。溶解した細胞の百分率（％）は、標準法を使用して、ＦＡＣＳアッセイにおけるヨウ化プロピジウム染色細胞の％として検出され得る。
本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質
本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、標準的な方法を使用して様々な設計の単一特異性又は多重特異性タンパク質に遺伝子操作され得る。
本開示はまた、本開示のＣＤ３εに結合する単離抗原結合ドメインを含む単一特異性タンパク質を提供する。
他の実施形態では、単一特異性タンパク質は、抗体である。
本開示はまた、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質を提供する。
他の実施形態では、多重特異性タンパク質は、二重特異性である。
他の実施形態では、多重特異性タンパク質は、三重特異性である。
他の実施形態では、多重特異性タンパク質は、四重特異性である。
他の実施形態では、多重特異性タンパク質は、ＣＤ３εへの結合について一価である。
他の実施形態では、多重特異性タンパク質は、ＣＤ３εへの結合について二価である。
本開示はまた、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメインと、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む単離多重特異性タンパク質を提供する。
他の実施形態では、腫瘍抗原は、ｈＫ２抗原である。他の実施形態では、腫瘍抗原は、ＨＬＡ－Ｇ抗原である。他の実施形態では、腫瘍抗原は、ＤＬＬ３抗原である。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメイン及び／又は腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ、又はＶＨＨを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメイン及び／又は腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂを含む。
他の実施態様では、ＣＤ３εに結合する第一の抗原結合ドメイン及び／又は腫瘍抗原に結合する第二の抗原結合ドメインは、Ｆ（ａｂ’）２を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメイン及び／又は腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、ＶＨＨを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメイン及び／又は腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、Ｆｖを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメイン及び／又は腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、Ｆｄを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメイン及び／又は腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、第１のリンカー（Ｌ１）、及びＶＬ（ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ）、又はＶＬ、Ｌ１、及びＶＨ（ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ）を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、約５～５０個のアミノ酸を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、約５～４０個のアミノ酸を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、約１０～３０個のアミノ酸を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、約１０～２０個のアミノ酸を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、又は６４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号４３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号４５のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号４６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号４７のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号４８のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号４９のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号５０のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号５３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号５５のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号５６のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号５７のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号６０のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号６１のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号６２のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号６４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号６、１２、又は１８のＨＣＤＲ１、配列番号７、１３、又は１９のＨＣＤＲ２、配列番号８、１４、又は２０のＨＣＤＲ３、配列番号９、１５、又は２１のＬＣＤＲ１、配列番号１０又は１６のＬＣＤＲ２、及び配列番号１１、１７、又は２２のＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメインは、以下のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む：
それぞれ配列番号６、７、８、９、１０、及び１１、
それぞれ配列番号１２、１３、１４、１５、１６、及び１７、又は
それぞれ配列番号１８、１９、２０、２１、１６、及び２２。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４のＶＬを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２７のＶＬを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号２３のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４、２７、２８、２９、又は３０のＶＬを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号６５、６６、６７、６８、６９、６０、７１、７２、７３、又は７４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号６５のアミノ酸配列を有する。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号６６のアミノ酸配列を有する。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号６７のアミノ酸配列を有する。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号６８のアミノ酸配列を有する。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号６９のアミノ酸配列を有する。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号７０のアミノ酸配列を有する。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号７１のアミノ酸配列を有する。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号７２のアミノ酸配列を有する。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号７３のアミノ酸配列を有する。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の結合ドメインは、配列番号７４のアミノ酸配列を有する。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、以下を含む：
配列番号１４９のＨＣＤＲ１、配列番号１５０のＨＣＤＲ２、配列番号１５１のＨＣＤＲ３、配列番号１７１のＬＣＤＲ１、配列番号１７２のＬＣＤＲ２、及び配列番号１７３のＬＣＤＲ３、又は
配列番号１２６のＶＨ及び配列番号１２７のＶＬ。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、以下を含む：
配列番号１４９のＨＣＤＲ１、配列番号１５２のＨＣＤＲ２、配列番号１５１のＨＣＤＲ３、配列番号１７４のＬＣＤＲ１、配列番号１７５のＬＣＤＲ２、及び配列番号１７３のＬＣＤＲ３、又は
配列番号１２４のＶＨ及び配列番号１２５のＶＬ。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、以下を含む：
配列番号１４９のＨＣＤＲ１、配列番号１５２のＨＣＤＲ２、配列番号１５１のＨＣＤＲ３、配列番号１７４のＬＣＤＲ１、配列番号１７５のＬＣＤＲ２、及び配列番号１７３のＬＣＤＲ３、又は
配列番号１２８のＶＨ及び配列番号１２９のＶＬ。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、以下を含む：
配列番号１４９のＨＣＤＲ１、配列番号１５２のＨＣＤＲ２、配列番号１５１のＨＣＤＲ３、配列番号１７４のＬＣＤＲ１、配列番号１７５のＬＣＤＲ２、及び配列番号１７３のＬＣＤＲ３、又は
配列番号１３０のＶＨ及び配列番号１３１のＶＬ。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、以下を含む：
配列番号１４９のＨＣＤＲ１、配列番号１５２のＨＣＤＲ２、配列番号１５１のＨＣＤＲ３、配列番号１７１のＬＣＤＲ１、配列番号１７２のＬＣＤＲ２、及び配列番号１７３のＬＣＤＲ３、又は
配列番号１３２のＶＨ及び配列番号１３３のＶＬ。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、以下を含む：
配列番号１４９のＨＣＤＲ１、配列番号１５２のＨＣＤＲ２、配列番号１５１のＨＣＤＲ３、配列番号１７１のＬＣＤＲ１、配列番号１７２のＬＣＤＲ２、及び配列番号１７３のＬＣＤＲ３、又は
配列番号１３４のＶＨ及び配列番号１３５のＶＬ。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、以下を含む：
配列番号１４９のＨＣＤＲ１、配列番号１５２のＨＣＤＲ２、配列番号１５１のＨＣＤＲ３、配列番号１７１のＬＣＤＲ１、配列番号１７２のＬＣＤＲ２、及び配列番号１７３のＬＣＤＲ３、又は
配列番号１３６のＶＨ及び配列番号１３５のＶＬ。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、以下を含む：
配列番号１４９のＨＣＤＲ１、配列番号１５２のＨＣＤＲ２、配列番号１５１のＨＣＤＲ３、配列番号１７１のＬＣＤＲ１、配列番号１７２のＬＣＤＲ２、及び配列番号１７３のＬＣＤＲ３、又は
配列番号１３２のＶＨ及び配列番号１３５のＶＬ。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、以下を含む：
配列番号１５３のＨＣＤＲ１、配列番号１５４のＨＣＤＲ２、配列番号１５５のＨＣＤＲ３、配列番号１７６のＬＣＤＲ１、配列番号１７７のＬＣＤＲ２、及び配列番号１７８のＬＣＤＲ３、又は
配列番号１３７のＶＨ及び配列番号１３８のＶＬ。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、以下を含む：
配列番号１５６のＨＣＤＲ１、配列番号１５７のＨＣＤＲ２、配列番号１５８のＨＣＤＲ３、配列番号１８２のＬＣＤＲ１、配列番号１８３のＬＣＤＲ２、及び配列番号１８４のＬＣＤＲ３、又は
配列番号１３９のＶＨ及び配列番号１４０のＶＬ。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、以下を含む：
配列番号１５９のＨＣＤＲ１、配列番号１６０のＨＣＤＲ２、配列番号１６１のＨＣＤＲ３、配列番号１７９のＬＣＤＲ１、配列番号１８０のＬＣＤＲ２、及び配列番号１８１のＬＣＤＲ３、又は
配列番号１４１のＶＨ及び配列番号１４２のＶＬ。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、以下を含む：
配列番号１６２のＨＣＤＲ１、配列番号１６３のＨＣＤＲ２、配列番号１６４のＨＣＤＲ３、配列番号１８５のＬＣＤＲ１、配列番号１８６のＬＣＤＲ２、及び配列番号１８７のＬＣＤＲ３、又は
配列番号１４３のＶＨ及び配列番号１４４のＶＬ。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、以下を含む：
配列番号１６５のＨＣＤＲ１、配列番号１６６のＨＣＤＲ２、配列番号１６７のＨＣＤＲ３、配列番号１９１のＬＣＤＲ１、配列番号１９２のＬＣＤＲ２、及び配列番号１９３のＬＣＤＲ３、又は
配列番号１４５のＶＨ及び配列番号１４６のＶＬ。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、以下を含む：
配列番号１６８のＨＣＤＲ１、配列番号１６９のＨＣＤＲ２、配列番号１７０のＨＣＤＲ３、配列番号１９１のＬＣＤＲ１、配列番号１９２のＬＣＤＲ２、及び配列番号１８８のＬＣＤＲ３、又は
配列番号１４７のＶＨ及び配列番号１４８のＶＬ。
他の実施形態では、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１４３のＶＨ及び配列番号３５８のＶＬを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメインは、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域若しくは第１のＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされ、かつ／又は腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、第２の免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域若しくは第２のＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされる。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域の断片及び／又は第２のＩｇ定常領域の断片は、Ｆｃ領域を含む。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域の断片及び／又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＣＨ２ドメインを含む。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域の断片及び／又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＣＨ３ドメインを含む。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域の断片及び／又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域の断片及び／又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ヒンジの少なくとも一部分、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む。
他の実施形態では、多重特異性タンパク質は、ＣＤ３εに結合する第１の抗原結合ドメインと第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片との間、及び腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合ドメインと第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片との間に、第２のリンカー（Ｌ２）を更に含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、又は６４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片、及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ１アイソタイプである。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ２アイソタイプである。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ３アイソタイプである。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ４アイソタイプである。
第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、本明細書に記載のとおり更に遺伝子操作されてもよい。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片、及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、多重特異性タンパク質のＦｃγＲへの低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異を含む。
他の実施形態では、多重特異性タンパク質のＦｃγＲへの低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異は、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、Ｋ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及びＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓからなる群から選択され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片、及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、多重特異性タンパク質のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）への増強された結合をもたらす少なくとも１つの変異を含む。
他の実施形態では、多重特異性タンパク質のＦｃγＲへの増強された結合をもたらす少なくとも１つの変異は、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、及びＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅからなる群から選択され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。
他の実施形態では、ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、若しくはＦｃγＲＩＩＩ、又はそれらの任意の組み合わせである。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片、及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、多重特異性タンパク質の半減期を調節する少なくとも１つの変異を含む。
他の実施形態では、多重特異性タンパク質の半減期を調節する少なくとも１つの変異は、Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ、及びＨ４３５Ｒからなる群から選択され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。
他の実施形態では、多重特異性タンパク質は、第１のＩｇ定常領域のＣＨ３ドメイン若しくは第１のＩｇ定常領域の断片のＣＨ３ドメインに少なくとも１つの変異を、かつ／又は第２のＩｇ定常領域のＣＨ３ドメイン若しくは第２のＩｇ定常領域の断片のＣＨ３ドメインに少なくとも１つの変異を含む。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域のＣＨ３ドメイン若しくは第１のＩｇ定常領域の断片のＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの変異、及び／又は第２のＩｇ定常領域のＣＨ３ドメイン若しくは第２のＩｇ定常領域の断片のＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの変異は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｌ、Ｆ４０５Ｗ、Ｋ３９２Ｌ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｓ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｉ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｖ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、及びＴ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗからなる群から選択され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、以下の変異を含む：
第１のＩｇ定常領域におけるＬ２３５Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、及び第２のＩｇ定常領域におけるＬ２３５Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ、又は
第１のＩｇ定常領域におけるＬ２３５Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ、及び第２のＩｇ定常領域におけるＬ２３５Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ。
ＣＤ３εに結合する抗原結合断片を含む多重特異性タンパク質の生成。
本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合断片は、多重特異性抗体に遺伝子操作してもよく、これらもまた、本発明の範囲内に包含される。
ＣＤ３εに結合する抗原結合断片は、Ｆａｂアーム交換を使用して生成される完全長多重特異性抗体に遺伝子操作してもよく、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＦａｂアーム交換を促進する、Ｉｇ定常領域ＣＨ３ドメイン内の２つの単一特異性二価抗体に置換が導入される。この方法では、ヘテロ二量体の安定性を促進する特定の置換をＣＨ３ドメインに有するように、２つの単一特異性二価抗体を遺伝子操作する。これらの抗体は、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合を異性化させるために十分な還元条件下においてともにインキュベーションされ、それにより、Ｆａｂアーム交換により二重特異性抗体が生成される。インキュベート条件は、最適には、非還元条件に戻され得る。使用され得る代表的な還元剤は、２－メルカプトエチルアミン（2- mercaptoethylamine、２－ＭＥＡ）、ジチオスレイトール（dithiothreitol、ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（dithioerythritol、ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（tris(2-carboxyethyl)phosphine、ＴＣＥＰ）、Ｌ－システイン、及びβ－メルカプトエタノールであり、好ましくは、２－メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、及びトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される還元剤である。例えば、少なくとも２０℃の温度で、少なくとも２５ｍＭの２－ＭＥＡの存在下又は少なくとも０．５ｍＭのジチオスレイトールの存在下で、ｐＨ５～８、例えばｐＨ７．０又はｐＨ７．４で、少なくとも９０分間のインキュベートを用いることができる。
使用され得るＣＨ３変異としては、ノブインホール変異（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、静電的マッチ変異（Ｃｈｕｇａｉ、Ａｍｇｅｎ、ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ、Ｏｎｃｏｍｅｄ）、鎖交換遺伝子操作ドメインボディ（Strand Exchange Engineered Domain body、ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ）、Ｄｕｏｂｏｄｙ（登録商標）変異（Ｇｅｎｍａｂ）、及び他の非対称変異（例えば、Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ）などの技術が挙げられる。
ノブインホール変異は、例えば、国際公開第１９９６／０２７０１１号に開示されており、小さい側鎖（ホール）を有するアミノ酸が第１のＣＨ３領域に導入され、大きな側鎖（ノブ）を有するアミノ酸が第２のＣＨ３領域に導入され、第１のＣＨ３領域と第２のＣＨ３領域との間に優先的な相互作用をもたらす、ＣＨ３領域の界面上の変異が含まれる。ノブ及びホールを形成する例示的なＣＨ３領域変異は、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖである。
重鎖ヘテロ二量体形成は、米国特許出願公開第２０１０／００１５１３３号、同第２００９／０１８２１２７号、同第２０１０／０２８６３７号、又は同第２０１１／０１２３５３２号に記載のように、第１のＣＨ３領域上の正に荷電した残基及び第２のＣＨ３領域上の負に荷電した残基を置換することにより、静電相互作用を使用することによって促進され得る。
重鎖ヘテロ二量体化を促進するために使用することができる他の非対称変異は、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は同第２０１３／０１９５８４９号（Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ）に記載のＬ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗである。
ＳＥＥＤｂｏｄｙ変異は、米国特許出願公開第２００７／０２８７１７０号に記載のように、選択ＩｇＧ残基をＩｇＡ残基と置換して、重鎖ヘテロ二量体化を促進することを伴う。
使用され得る他の例示的な変異は、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１３／１５７９５４号、国際公開第２０１３／０９６２９１号、及び米国特許出願公開第２０１８／０１１８８４９号に記載のＲ４０９Ｄ＿Ｋ３７０Ｅ／Ｄ３９９Ｋ＿Ｅ３５７Ｋ、Ｓ３５４Ｃ＿Ｔ３６６Ｗ／Ｙ３４９Ｃ＿Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｙ３４９Ｃ＿Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ＿Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｋ／Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｋ／Ｙ３４９Ｅ、Ｌ３５１Ｋ／Ｙ３４９Ｄ、Ｌ３５１Ｋ／Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｋ３９２Ｄ／Ｄ３９９Ｋ、Ｋ３９２Ｄ／Ｅ３５６Ｋ、Ｋ２５３Ｅ＿Ｄ２８２Ｋ＿Ｋ３２２Ｄ／Ｄ２３９Ｋ＿Ｅ２４０Ｋ＿Ｋ２９２Ｄ、Ｋ３９２Ｄ＿Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３５６Ｋ＿Ｄ３９９Ｋである。
Ｄｕｏｂｏｄｙ（登録商標）変異（Ｇｅｎｍａｂ）は、例えば、米国特許第９１５０６６３号及び米国特許出願公開第２０１４／０３０３３５６号に開示されており、Ｆ４０５Ｌ／Ｋ４０９Ｒ、野生型／Ｆ４０５Ｌ＿Ｒ４０９Ｋ、Ｔ３５０Ｉ＿Ｋ３７０Ｔ＿Ｆ４０５Ｌ／Ｋ４０９Ｒ、Ｋ３７０Ｗ／Ｋ４０９Ｒ、Ｄ３９９ＡＦＧＨＩＬＭＮＲＳＴＶＷＹ／Ｋ４０９Ｒ、Ｔ３６６ＡＤＥＦＧＨＩＬＭＱＶＹ／Ｋ４０９Ｒ、Ｌ３６８ＡＤＥＧＨＮＲＳＴＶＱ／Ｋ４０９ＡＧＲＨ、Ｄ３９９ＦＨＫＲＱ／Ｋ４０９ＡＧＲＨ、Ｆ４０５ＩＫＬＳＴＶＷ／Ｋ４０９ＡＧＲＨ、及びＹ４０７ＬＷＱ／Ｋ４０９ＡＧＲＨの変異が含まれる。
ＣＤ３εに結合する抗原結合断片を組み込むことができる更なる二重特異性又は多重特異性構造としては、二重可変ドメイン免疫グロブリン（Dual Variable Domain Immunoglobulin、ＤＶＤ）（国際公開第２００９／１３４７７６号；ＤＶＤは、ＶＨ１－リンカー－ＶＨ２－ＣＨ構造を有する重鎖と、ＶＬ１－リンカー－ＶＬ２－ＣＬ構造を有する軽鎖とを含む完全長抗体であり、リンカーは任意である）、異なる特異性を有する２つの抗体アームを結合するための様々な二量化ドメインを含む構造、例えば、ロイシンジッパー又はコラーゲン二量化ドメイン（国際公開第２０１２／０２２８１１号、米国特許第５，９３２，４４８号、米国特許第６，８３３，４４１号）、一緒にコンジュゲートされた２つ又は３つ以上のドメイン抗体（domain antibodies、ｄＡｂｓ）、ダイアボディ、ラクダ科抗体及び遺伝子操作されたラクダ科抗体などの重鎖のみの抗体、二重標的（Dual Targeting、ＤＴ）－Ｉｇ（ＧＳＫ／Ｄｏｍａｎｔｉｓ）、２ｉｎ１抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、架橋Ｍａｂ（Ｋａｒｍａｎｏｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、ｍＡｂ２（Ｆ－Ｓｔａｒ）及びＣｏｖＸ－ボディ（ＣｏｖＸ／Ｐｆｉｚｅｒ）、ＩｇＧ様二重特異性（ＩｎｎＣｌｏｎｅ／Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、Ｔｓ２Ａｂ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡＺ）及びＢｓＡｂ（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＨＥＲＣＵＬＥＳ（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）及びＴｖＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）、ＳｃＦｖ／Ｆｃ融合（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ，Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ））、二重親和性再標的技術（Ｄｕａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｆｃ－ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）及び二重（ＳｃＦｖ）２－Ｆａｂ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ－－Ｃｈｉｎａ）、二重活性又はＢｉｓ－Ｆａｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｄｏｃｋ－ａｎｄ－Ｌｏｃｋ（ＤＮＬ）（ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ）、二価二重特異性（Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ）及びＦａｂ－Ｆｖ（ＵＣＢ－Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）が挙げられる。ＳｃＦｖ抗体、ダイアボディに基づく抗体、及びドメイン抗体には、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（Bispecific T Cell Engager、ＢｉＴＥ）（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）、タンデムダイアボディ（Tandem Diabody、Ｔａｎｄａｂ）（Ａｆｆｉｍｅｄ）、二重親和性再標的技術（Dual Affinity Retargeting Technology、ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、一本鎖ダイアボディ（Ａｃａｄｅｍｉｃ）、ＴＣＲ様抗体（ＡＩＴ、ＲｅｃｅｐｔｏｒＬｏｇｉｃｓ）、ヒト血清アルブミンＳｃＦｖ融合体（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ）、及びＣＯＭＢＯＤＹ（Ｅｐｉｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、二重標的ナノボディ（Ａｂｌｙｎｘ）、二重標的重鎖のみドメイン抗体が含まれるが、これらに限定されない。
本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインはまた、３本のポリペプチド鎖を含む多重特異性タンパク質に遺伝子操作してもよい。このような設計では、少なくとも１つの抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖの形態である。例示的な設計としては次の設計１～４が挙げられる（「１」が第１の抗原結合ドメインを示し、「２」が第２の抗原結合ドメインを示し、「３」が第３の抗原結合ドメインを示す）。
設計１：鎖Ａ）ｓｃＦｖ１－ＣＨ２－ＣＨ３、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計２：鎖Ａ）ｓｃＦｖ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計３：鎖Ａ）ｓｃＦｖ１－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計４：鎖Ａ）ＣＨ２－ＣＨ３－ｓｃＦｖ１、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
ＣＨ３操作は、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は米国特許出願公開第２０１３／０１９５８４９号（Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ）に記載のＬ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗの変異など、設計１～４に組み込まれ得る。
アイソタイプ、アロタイプ、及びＦｃ遺伝子操作
本開示のタンパク質中に存在するＩｇ定常領域又はＦｃ領域などのＩｇ定常領域の断片は、任意のアロタイプ又はアイソタイプのものであってよい。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ１アイソタイプである。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ２アイソタイプである。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ３アイソタイプである。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ４アイソタイプである。
Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、任意のアロタイプであり得る。アロタイプは結合又はＦｃ媒介性エフェクター機能などのＩｇ定常領域の特性に影響を与えないことが予想される。断片のＩｇ定常領域を含む治療用タンパク質の免疫原性は、輸注反応のリスク増大及び治療応答の期間短縮に関連している（Ｂａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４８：６０２－０８）。断片のＩｇ定常領域を含む治療用タンパク質が宿主において免疫応答を誘導する程度は、Ｉｇ定常領域のアロタイプによってある程度決定され得る（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １２：２１３－２１）。Ｉｇ定常領域のアロタイプは、抗体の定常領域配列における特定の位置のアミノ酸配列の変異に関連する。表３は、選択ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４アロタイプを示す。
Figure 2023528350000004
Ｃ末端リジン（C-terminal lysine、ＣＴＬ）は、Ｉｇ定常領域から、血流中の内因性循環カルボキシペプチダーゼによって除去され得る（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ １０８：４０４－４１２）。製造中、米国特許出願公開第２０１４／０２７３０９２号に記載のとおり細胞外Ｚｎ２＋、ＥＤＴＡ、又はＥＤＴＡ－Ｆｅ３＋の濃度を制御することによって、ＣＴＬの除去を最高レベル未満に制御することができる。タンパク質のＣＴＬ含量を、既知の方法を使用して測定することができる。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域にコンジュゲートした、ＣＤ３εに結合する抗原結合断片は、約１０％～約９０％のＣ末端リジン含有量を有する。他の実施形態では、Ｃ末端リジン含量は、約２０％～約８０％である。他の実施形態では、Ｃ末端リジン含量は、約４０％～約７０％である。他の実施形態では、Ｃ末端リジン含量は、約５５％～約７０％である。他の実施形態では、Ｃ末端リジン含量は、約６０％である。
Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインに対してＦｃ領域変異を行って、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及び／若しくはＡＤＣＰなどのエフェクター機能、並びに／又は薬物動態特性を調節することができる。これは、変異したＦｃの活性化ＦｃγＲｓ（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩ）、ＦｃγＲＩＩｂ、及び／又はＦｃＲｎへの結合を制御する変異をＦｃに導入することによって達成可能である。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片に少なくとも１つの変異を含む。
他の実施形態では、少なくとも１つの変異は、Ｆｃ領域にある。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｆｃ領域に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個の変異を含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、抗体のＦｃＲｎへの結合を調節する、Ｆｃ領域における少なくとも１つの変異を含む。
半減期（例えば、ＦｃＲｎへの結合）を調節するために変異させることが可能なＦｃの位置としては、位置２５０、２５２、２５３、２５４、２５６、２５７、３０７、３７６、３８０、４２８、４３４、及び４３５が挙げられる。単独で、又は組み合わせで行われることができる例示的な変異は、変異Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｉ２５３Ａ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｐ２５７Ｉ、Ｔ３０７Ａ、Ｄ３７６Ｖ、Ｅ３８０Ａ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｓ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４Ｆ、Ｈ４３５Ａ、及びＨ４３５Ｒである。抗体の半減期を増加させるように行われ得る例示的な単独で又は組み合わせでの変異は、変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ及びＴ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａである。半減期を低減させるように行われ得る例示的な単独で又は組み合わせでの変異は、変異Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ及びＨ４３５Ｒである。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ変異を含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、タンパク質の活性化Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）への結合を低減する、かつ／又はＣ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）、若しくは貪食作用（ＡＤＣＰ）などのＦｃエフェクター機能を低減させる、Ｆｃ領域における少なくとも１つの変異を含む。
タンパク質の活性化ＦｃγＲへの結合を低下させ、続いて、エフェクター機能を低減させるために変異させることが可能なＦｃ位置としては、位置２１４、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２６５、２６７、２６８、２７０、２９５、２９７、３０９、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、及び３６５が挙げられる。単独で、又は組み合わせで加えることができる例示的な変異は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４における、変異Ｋ２１４Ｔ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｇ２３６の欠失、Ｖ２３４Ａ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｑ２６８Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３２７Ｓ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓである。ＡＤＣＣが低下したタンパク質をもたらす例示的な組み合わせの変異は、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、全てのＩｇアイソタイプにおけるＮ２９７Ａ、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、ＩｇＧ１におけるＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、ＩｇＧ２におけるＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ１におけるＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及び、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓの変異である。また、ＩｇＧ２由来の残基１１７～２６０及びＩｇＧ４由来の残基２６１～４４７を有するＦｃなどのハイブリッドＩｇＧ２／４ Ｆｃドメインを使用してもよい。
ＣＤＣが低下したタンパク質をもたらす例示的な変異は、Ｋ３２２Ａ変異である。
周知のＳ２２８Ｐ変異をＩｇＧ４抗体に加えて、ＩｇＧ４の安定性を増強することができる。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｋ２１４Ｔ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｇ２３６の欠失、Ｖ２３４Ａ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｑ２６８Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３２７Ｓ、Ｌ３２８Ｆ、Ｋ３２２、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓからなる群から選択される、少なくとも１つの変異を含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ変異を含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、タンパク質のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）への結合を増強する、並びに／又はＣ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）、及び／若しくは貪食作用（ＡＤＣＰ）などのＦｃエフェクター機能を増強する、Ｆｃ領域における少なくとも１つの変異を含む。
タンパク質の活性化ＦｃγＲへの結合を増加させる、かつ／又はＦｃエフェクター機能を増強するために変異させることが可能なＦｃ位置としては、位置２３６、２３９、２４３、２５６，２９０，２９２、２９８、３００、３０５、３１２、３２６、３３０、３３２、３３３、３３４、３４５、３６０、３３９、３７８、３９６、又は４３０（ＥＵインデックスに従った残基番号付け）が挙げられる。単一で又は組み合わせて行われ得る例示的な変異は、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｔ２５６Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ｐ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｌ、Ｋ３２６Ａ、Ａ３３０Ｋ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３３９Ｔ及びＰ３９６Ｌである。ＡＤＣＣ又はＡＤＣＰが増加したタンパク質をもたらす例示的な組み合わせの変異は、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ及びＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅである。
ＣＤＣを増強させるように変異され得るＦｃ位置としては、位置２６７、２６８、３２４、３２６、３３３、３４５及び４３０が挙げられる。単一で又は組み合わせで行われ得る例示的な変異は、Ｓ２６７Ｅ、Ｆ１２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３４５Ｋ、Ｅ３４５Ｑ、Ｅ３４５Ｒ、Ｅ３４５Ｙ、Ｅ４３０Ｓ、Ｅ４３０Ｆ及びＥ４３０Ｔである。ＣＤＣが増加したタンパク質をもたらす例示的な組み合わせの変異は、Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ａ、Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ、Ｓ２６７Ｅ／Ｓ３２４Ｔ、及びＳ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔである。
本明細書に記載される特異性変異は、それぞれ配列番号９５、９６、及び９７のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４野生型アミノ酸配列と比較した場合の変異である。
配列番号９５、野生型ＩｇＧ１
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号９６、野生型ＩｇＧ２
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号９７、野生型ＩｇＧ４
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
抗体のＦｃγＲ又はＦｃＲｎへの結合は、フローサイトメトリーを用いて、各受容体を発現するように遺伝子操作された細胞にて評価することができる。例示的な結合アッセイでは、９６ウェルプレートに２×１０５個／ウェルの細胞を播種し、ＢＳＡ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＵＳＡ）中にて４℃で３０分間ブロッキングする。細胞を、氷上で、４℃で１．５時間、試験抗体とともにインキュベートする。ＢＳＡ染色緩衝液で２回洗浄した後、細胞を、Ｒ－ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともに４℃で４５分間、インキュベートする。細胞を、染色緩衝液で２回洗浄し、その後、１：２００希釈したＤＲＡＱ７生／死細胞染色試薬（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＵＳＡ）を含有する１５０μＬのＳｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ中に再懸濁する。染色された細胞のＰＥ及びＤＲＡＱ７シグナルを、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＵＳＡ）によって、それぞれＢ２及びＢ４チャンネルを使用して検出する。生細胞をＤＲＡＱ７除外でゲートし、収集された少なくとも１０，０００生細胞イベントについて、幾何平均蛍光シグナルを決定する。解析にはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用する。データを、平均蛍光シグナルに対する抗体濃度の対数としてプロットする。非線形回帰分析を実行する。
糖鎖遺伝子操作
Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインのＡＤＣＣを媒介する能力は、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のオリゴ糖成分を遺伝子操作することによって増強することができる。ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３は、Ａｓｎ２９７においてＮ－グリコシル化される。ここで、グリカンの大部分は、公知の二分岐Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１、Ｇ１Ｆ、Ｇ２、又はＧ２Ｆの形態である。操作されていないＣＨＯ細胞により産生され得るＩｇ定常領域含有タンパク質は、典型的には、少なくとも約８５％のグリカンフコース含量を有する。Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインに結合した二分岐複合体型オリゴ糖からコアフコースを除去すると、抗原結合もＣＤＣ活性も変化させることなく、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ結合を介してタンパク質のＡＤＣＣが増強される。このようなタンパク質は、二分岐の複合型のＦｃオリゴ糖を有する比較的高い脱フコシル化免疫グロブリンの発現の成功に導くと報告された異なる方法を使用して達成することができ、以下が含まれる：培養物の浸透圧の制御（Ｋｏｎｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６４（：２４９－６５，２０１２）、宿主細胞株としてのバリアントＣＨＯ株Ｌｅｃ１３の適用（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２６７３３－２６７４０，２００２）、宿主細胞株としてのバリアントＣＨＯ株ＥＢ６６の適用（Ｏｌｉｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ；２（４）：４０５－４１５，２０１０；ＰＭＩＤ：２０５６２５８２）、宿主細胞株としてのラットハイブリドーマ細胞株ＹＢ２／０の適用（Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３４６６－３４７３，２００３）、１，６－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子に対して特異的な低分子干渉ＲＮＡの導入（Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８８：９０１－９０８，２００４）、又はβ－１，４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ及びゴルジα－マンノシダーゼＩＩ若しくは強力なアルファ－マンノシダーゼＩ阻害物質であるキフネンシンの共発現（Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：５０３２－５０３６，２００６、Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９３：８５１－８６１，２００６；Ｘｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９９：６５２－６５，２００８）。
他の実施形態では、本開示のＩｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、約１％～約１５％、例えば、約１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％のフコース含有量を有する二分岐グリカン構造を有する。他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、約５０％、４０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、又は２０％のフコース含有量を有するグリカン構造を有する。
「フコース含有量」とは、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコース単糖類の量を意味する。フコースの相対量は、フコース含有構造の全糖構造に対する割合である。これらの糖構造は、複数の方法、例えば、１）国際公開第２００８／０７７５４６ ２号に記載されるような、Ｎ－グリコシダーゼＦ処理サンプル（例えば、複合体、ハイブリッド、及びオリゴ－並びに高マンノース構造）のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦの使用、２）Ａｓｎ２９７グリカンの酵素放出、その後の誘導体化、並びに蛍光検出を備えたＨＰＬＣ（ＵＰＬＣ）及び／又はＨＰＬＣ－ＭＳ（ＵＰＬＣ－ＭＳ）による検出／定量化、３）第１のＧｌｃＮＡｃ単糖類と第２のＧｌｃＮＡｃ単糖類との間を切断し、フコースを第１のＧｌｃＮＡｃに付加されたままにさせる、Ｅｎｄｏ Ｓ又は他の酵素によるＡｓｎ２９７グリカンの処理を伴うか又はこの処理なしでの、天然又は還元ｍＡｂのインタクトプロテイン分析、４）酵素消化（例えば、トリプシン又はエンドペプチダーゼＬｙｓ－Ｃ）によるｍＡｂの構成ペプチドへの消化、その後のＨＰＬＣ－ＭＳ（ＵＰＬＣ－ＭＳ）による分離、検出及び定量、５）Ａｓｎ ２９７にＰＮＧａｓｅ Ｆを有する特異的な酵素脱グリコシル化により、ｍＡｂタンパク質からｍＡｂオリゴ糖を分離すること、により特性決定及び定量化可能である。このように放出されるオリゴ糖は、フルオロフォアで標識し、実測された質量の理論上の質量との比較によるマトリックス支援レーザー脱離イオン化（matrix-assisted laser desorption ionization、ＭＡＬＤＩ）質量分析によるグリカン構造の細かな特性評価、イオン交換ＨＰＬＣ（ＧｌｙｃｏＳｅｐ Ｃ）によるシアル化の程度の決定、順相ＨＰＬＣ（ＧｌｙｃｏＳｅｐ Ｎ）による親水性基準に準拠するオリゴ糖型の分離及び定量、並びに高性能キャピラリー電気泳動－レーザー誘起蛍光（high performance capillary electrophoresis-laser induced fluorescence、ＨＰＣＥ－ＬＩＦ）によるオリゴ糖の分離及び定量、を可能にする様々な補足的技術によって分離及び特定することができる。
「低フコース」又は「低フコース含有量」は、本明細書で使用するとき、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、約１％～１５％のフコース含有量を有することを指す。
「正常フコース」又は「正常フコース含有量」は、本明細書で使用するとき、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、約５０％超、典型的には８０％超又は８５％超のフコース含有量を有することを指す。
抗イディオタイプ抗体
抗イディオタイプ抗体は、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインに特異的に結合する抗体である。
本発明はまた、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインに特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
本発明はまた、以下を含むＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインに特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する；
配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４のＶＬ、
配列番号２３のＶＨ及び配列番号２７のＶＬ、
配列番号２３のＶＨ及び配列番号２８のＶＬ、
配列番号２３のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は
配列番号２３のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ。
抗イディオタイプ（Ｉｄ）抗体は、抗体の抗原決定基（例えば、パラトープ又はＣＤＲ）を認識する抗体である。Ｉｄ抗体は、抗原をブロッキングするものであっても、しないものであってもよい。抗原ブロッキングＩｄは、サンプル中の遊離抗原結合ドメイン（例えば、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメイン）を検出するために使用され得る。ブロッキングしないＩｄを使用して、サンプル中の全抗体（遊離しているもの、抗原に一部結合しているもの、又は抗原に完全に結合しているもの）を検出することができる。Ｉｄ抗体は、抗Ｉｄが調製されている抗体で動物を免疫することによって調製することができる。
また、更に別の動物で免疫応答を誘導する免疫原として抗Ｉｄ抗体を使用して、いわゆる抗－抗Ｉｄ抗体を生成することもできる。抗－抗Ｉｄは、抗Ｉｄを誘導した元の抗原結合ドメインとエピトープが同一であり得る。したがって、抗原結合ドメインのイディオタイプ決定基に対する抗体を使用することによって、同一の特異性の抗原結合ドメインを発現する他のクローンを同定することが可能である。抗Ｉｄ抗体は、本明細書の他の箇所に記載のものなどの任意の好適な技術によって変動（それにより、抗Ｉｄ抗体バリアントを産生する）、及び／又は誘導することができる。
免疫コンジュゲート（Immunoconjugates）
本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメイン、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質、又はＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質（本明細書ではまとめてＣＤ３ε結合タンパク質と呼ぶ）は、異種分子にコンジュゲートされ得る。
他の実施形態では、異種分子は、検出可能な標識又は細胞傷害性剤である。
本発明はまた、検出可能な標識にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する、抗原結合断片を提供する。
本発明はまた、検出可能な標識にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する抗原結合断片を含む、タンパク質を提供する。
本発明はまた、検出可能な標識にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する抗原結合断片を含む、多重特異性タンパク質を提供する。
本発明はまた、細胞傷害性剤にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する、抗原結合断片を提供する。
本発明はまた、細胞傷害性剤にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する抗原結合断片を含む、タンパク質を提供する。
本発明はまた、細胞傷害性剤にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する抗原結合断片を含む、多重特異性タンパク質を提供する。
本開示のＣＤ３ε結合タンパク質を使用して、治療薬を腫瘍抗原発現細胞に向けることができる。あるいは、内在化してから細胞機能を修飾することを意図する治療薬に結合させた本開示のＣＤ３ε結合タンパク質を用いて、ＣＤ３ε発現細胞を標的とすることもできる。
他の実施形態では、検出可能な標識は、細胞傷害性剤でもある。
検出可能な標識にコンジュゲートした本開示のＣＤ３ε結合タンパク質は、様々なサンプルにおけるＣＤ３εの発現を評価するために使用することができる。
検出可能な標識は、本開示のＣＤ３ε結合タンパク質にコンジュゲートさせたとき、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的手段を介して後者を検出可能なものにする組成物を含む。
例示的な検出可能な標識としては、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光染料、電子密度試薬、酵素（例えば、一般的にＥＬＩＳＡにおいて使用される）、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテン、発光分子、化学発光分子、蛍光色素、フルオロフォア、蛍光消光剤、有色分子、放射性同位体、シンチレート（scintillates）、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体又はその断片、ポリヒスチジン、Ｎｉ２＋、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、重金属、酵素、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、電子供与体／受容体、アクリジニウムエステル、及び比色基質が挙げられる。
検出可能な標識は、例えば、検出可能な標識が放射性同位体であるときなど、自発的にシグナルを発し得る。他の場合、検出可能な標識は、外部場によって刺激された結果として、シグナルを発する。
例示的な放射性同位体は、γ放出、オージェ放出、β放出、α放出、又はポジトロン放出性の放射性同位体であり得る。例示的な放射性同位体としては、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、１９Ｆ、５５Ｃｏ、５７Ｃｏ、６０Ｃｏ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９０Ｓｒ、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、１１５Ｉｎ、１２３１、１２４１、１２５Ｉ、１３１１、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ、２２６Ｒａ、２２５Ａｃ、及び２２７Ａｃが挙げられる。
例示的な金属原子は、２０超の原子番号を有する金属、例えば、カルシウム原子、スカンジウム原子、チタン原子、バナジウム原子、クロム原子、マンガン原子、鉄原子、コバルト原子、ニッケル原子、銅原子、亜鉛原子、ガリウム原子、ゲルマニウム原子、ヒ素原子、セレン原子、臭素原子、クリプトン原子、ルビジウム原子、ストロンチウム原子、イットリウム原子、ジルコニウム原子、ニオブ原子、モリブデン原子、テクネチウム原子、ルテニウム原子、ロジウム原子、パラジウム原子、銀原子、カドミウム原子、インジウム原子、スズ原子、アンチモン原子、テルル原子、ヨウ素原子、キセノン原子、セシウム原子、バリウム原子、ランタン原子、ハフニウム原子、タンタル原子、タングステン原子、レニウム原子、オスミウム原子、イリジウム原子、白金原子、金原子、水銀原子、タリウム原子、鉛原子、ビスマス原子、フランシウム原子、ラジウム原子、アクチニウム原子、セリウム原子、プラセオジム原子、ネオジム原子、プロメチウム原子、サマリウム原子、ユウロピウム原子、ガドリニウム原子、テルビウム原子、ジスプロシウム原子、ホルミウム原子、エルビウム原子、ツリウム原子、イッテルビウム原子、ルテチウム原子、トリウム原子、プロトアクチニウム原子、ウラン原子、ネプツニウム原子、プルトニウム原子、アメリシウム原子、キュリウム原子、バーケリウム原子、カリホルニウム原子、アインスタイニウム原子、フェルミウム原子、メンデレビウム原子、ノーベリウム原子、又はローレンシウム原子である。
他の実施形態では、金属原子は、２０超の原子番号を有するアルカリ土類金属であり得る。
他の実施形態では、金属原子は、ランタニドであり得る。
他の実施形態では、金属原子は、アクチニドであり得る。
他の実施形態では、金属原子は、遷移金属であり得る。
他の実施形態では、金属原子は、卑金属であり得る。
他の実施形態では、金属原子は、金原子、ビスマス原子、タンタル原子、及びガドリニウム原子であり得る。
他の実施形態では、金属原子は、５３（すなわち、ヨウ素）～８３（すなわち、ビスマス）の原子番号を有する金属であり得る。
他の実施形態では、金属原子は、磁気共鳴映像法に好適な原子であり得る。
金属原子は、Ｂａ２＋、Ｂｉ３＋、Ｃｓ＋、Ｃａ２＋、Ｃｒ２＋、Ｃｒ３＋、Ｃｒ６＋、Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｃｕ＋、Ｃｕ２＋、Ｃｕ３＋、Ｇａ３＋、Ｇｄ３＋、Ａｕ＋、Ａｕ３＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｆ３＋、Ｐｂ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｎ３＋、Ｍｎ４＋、Ｍｎ７＋、Ｈｇ２＋、Ｎｉ２＋、Ｎｉ３＋、Ａｇ＋、Ｓｒ２＋、Ｓｎ２＋、Ｓｎ４＋、及びＺｎ２＋などの＋１、＋２、又は＋３酸化状態の形態の金属イオンであり得る。金属原子は、金属酸化物、例えば、酸化鉄、酸化マンガン、又は酸化ガドリニウムを含み得る。
好適な色素としては、例えば、５（６）－カルボキシフルオレセイン、ＩＲＤｙｅ ６８０ＲＤマレイミド、又はＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ、ルテニウムポリピリジル色素などの任意の市販の色素が挙げられる。
好適なフルオロフォアは、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyanate、ＦＩＴＣ）、フルオレセインチオセミカルバジド、ローダミン、テキサスレッド、ＣｙＤｙｅ（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｓ（例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ５９４、Ａｌｅｘａ６４７）、近赤外（near infrared、ＮＩＲ）（７００～９００ｎｍ）蛍光染料、並びにカルボシアニン及びアミノスチリル染料である。
検出可能な標識にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、造影剤として使用することができる。
検出可能な標識にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質は、造影剤として使用することができる。
検出可能な標識にコンジュゲートしたＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質は、造影剤として使用することができる。
他の実施形態では、細胞傷害性剤は、化学療法剤、薬物、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、若しくは動物由来の酵素活性を有する毒素、又はその断片）、又は放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）である。
他の実施形態では、細胞傷害性剤は、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、ビンデシン、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシン、ゲルダナマイシン、マイタンシノイド、又はカリケアマイシンである。細胞傷害性剤は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、又はトポイソメラーゼ阻害を含む機構によってその細胞傷害性又は細胞増殖抑制作用を誘発し得る。
他の実施形態では、細胞傷害性剤は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の未結合活性断片、エキソトキシンＡ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａからの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、ニガウリ（momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サボン草（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、マイトジェリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、並びにトリコテセンなどの酵素活性毒素である。
他の実施形態では、細胞傷害性剤は、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１８６Ｒｅなどの放射性核種である。
他の実施形態では、細胞傷害性剤は、ドラスタチン若しくはドロスタチンのペプチド類似体及び誘導体、アウリスタチン、又はモノメチルアウリスタチンフェニルアラニンである。例示的な分子は、米国特許第５，６３５，４８３号及び同第５，７８０，５８８号に開示されている。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰの加水分解、並びに核及び細胞の分裂に干渉し（Ｗｏｙｋｅ ｅｔ ａｌ （２００１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５（１２）：３５８０～３５８４）、抗がん及び抗真菌活性を有することが示されている。ドラスタチン及びアウリスタチン薬剤部位は、ペプチド薬剤部位のＮ（アミノ）末端若しくはＣ（カルボキシル）末端を介して（国際公開第０２／０８８１７２号）、又は抗体内に遺伝子操作された任意のシステインを介して、本発明の抗体に結合することができる。
本開示のＣＤ３ε結合タンパク質は、既知の方法を使用して検出可能な標識にコンジュゲートさせることができる。
他の実施形態では、検出可能な標識は、キレート剤と複合体を形成している。
他の実施形態では、検出可能な標識は、リンカーを介して本開示のＣＤ３ε結合タンパク質にコンジュゲートされる。
検出可能な標識又は細胞傷害性部分は、既知の方法を用いて、本開示のＣＤ３ε結合タンパク質に直接又は間接的に連結させることができる。好適なリンカーは、当該技術分野において既知であり、例えば、補欠分子族、非フェノールリンカー（Ｎ－スクシミジル－ベンゾエートの誘導体、ドデカボラート）、大環状及び非環式の両キレート剤のキレート部分、例えば、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０，四酢酸（ＤＯＴＡ）の誘導体、ジエチレントリアミン五酢酸（diethylenetriaminepentaacetic avid、ＤＴＰＡ）の誘導体、Ｓ－２－（４－イソチオシアナトベンジル）－１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ）の誘導体、及び１，４，８，１１－テトラアザシクロドデカン－１，４，８，１１－四酢酸（ＴＥＴＡ）の誘導体、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミダートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベラート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えば、トルエン２，６－ジイソシアナート）、及びビス－活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）、並びに他のキレート部分が挙げられる。好適なペプチドリンカーは周知である。
他の実施形態では、本開示のＣＤ３ε結合タンパク質は、腎クリアランスを介して血液から除去される。
キット
本発明はまた、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含むキットを提供する。
本発明はまた、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質を含むキットを提供する。
本発明はまた、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質を含むキットを提供する。
キットは、治療的使用のために、及び診断キットとして使用することができる。
キットを使用して、サンプル中のＣＤ３εの存在を検出することができる。
他の実施形態では、キットは、本開示のＣＤ３ε結合タンパク質と、ＣＤ３ε結合タンパク質を検出するための試薬と、を含む。キットは、使用説明書；他の試薬、例えば、標識、治療薬、又はキレート化若しくは別の方法のカップリングに有用な剤、標識若しくは治療薬に対する抗体、又は放射線防護組成物；投与するために当該抗体を調製するためのデバイス又は他の材料；医薬的に許容される担体、及び対象に投与するためのデバイス又は他の材料を含む、１つ又は２つ以上の他の要素を含み得る。
他の実施形態では、キットは、容器内のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインと、キットの使用説明書と、を含む。
他の実施形態では、キットは、容器内のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質と、キットの使用説明書と、を含む。
他の実施形態では、キットは、容器内のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質と、キットの使用説明書と、を含む。
他の実施形態では、キットにおけるＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが標識される。
他の実施形態では、キットにおけるＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質が標識される。
他の実施形態では、キットにおけるＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質が標識される。
他の実施形態では、キットは、以下を含むＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む：
配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４のＶＬ、
配列番号２３のＶＨ及び配列番号２７のＶＬ、
配列番号２３のＶＨ及び配列番号２８のＶＬ、
配列番号２３のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は
配列番号２３のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ。
他の態様では、キットは、配列番号６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、又は７４を含む、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む。
ＣＤ３εを検出する方法
本発明はまた、サンプル中のＣＤ３εを検出する方法であって、サンプルを入手することと、当該サンプルを本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインと接触させることと、当該サンプル中の結合したＣＤ３εを検出することと、を含む、方法を提供する。
他の実施形態では、サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、滑液、循環細胞、組織に会合していない細胞（すなわち、遊離細胞）、組織（例えば、外科的に切除された組織、穿刺吸引を含む生検材料）、組織プレパラートなどに由来し得る。
本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、既知の方法を使用して検出することができる。例示的な方法としては、蛍光若しくは化学発光標識、又は放射線標識を使用して抗体を直接標識すること、又は本発明の抗体に、ビオチン、酵素、又はエピトープタグなどの容易に検出可能な部分を結合させることが挙げられる。例示的な標識及び部分は、ルテニウム、１１１Ｉｎ－ＤＯＴＡ、１１１Ｉｎ－ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びベータガラクトシダーゼ、ポリ－ヒスチジン（ＨＩＳタグ）、アクリジン染料、シアニン染料、フルオロン染料、オキサジン染料、フェナントリジン染料、ローダミン染料、及びＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）染料である。
本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、サンプル中のＣＤ３εを検出するための様々なアッセイで使用してよい。例示的なアッセイは、ウェスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴、免疫沈降、平衡透析、免疫拡散、電気化学発光（electrochemiluminescence、ＥＣＬ）イムノアッセイ、免疫組織化学的検査、蛍光活性化細胞選別（fluorescence-activated cell sorting、ＦＡＣＳ）、又はＥＬＩＳＡアッセイである。
ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞
本発明はまた、本開示のＣＤ３ε結合タンパク質のいずれかをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。ＣＤ３ε結合タンパク質は、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメイン、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質を含む。
本発明はまた、ＣＤ３ε結合タンパク質又はその断片のいずれかをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２３のＶＨをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２４、２７、２８、２９、又は３０のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２４のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２７のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２８のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２９のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号３０のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２３のＶＨ、及び配列番号２４、２７、２８、２９、又は３０のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、以下をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する
配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４のＶＬ、
配列番号２３のＶＨ及び配列番号２７のＶＬ、
配列番号２３のＶＨ及び配列番号２８のＶＬ、
配列番号２３のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は
配列番号２３のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ。
本発明はまた、配列番号：６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、又は７４のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号６５のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号６６のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号６７のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号６８のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号６９のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号７０のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号７１のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号７２のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号７３のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号７４のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本開示のいくつかの実施形態はまた、本開示のＣＤ３ε結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド又は本開示のＣＤ３ε結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含む、単離又は精製核酸を提供する。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る。「高ストリンジェンシー条件」は、ポリヌクレオチドが、非特異的なハイブリダイゼーションよりも強い検出可能な量で標的配列（本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズすることを意味する。高ストリンジェンシー条件は、正確に相補的な配列を有するポリヌクレオチド、又は点在する不一致をほんのわずかに含有するポリヌクレオチドを、ヌクレオチド配列と一致したいくつかの小領域（例えば、３～１２塩基）を偶然に有するランダム配列と識別する条件を含む。かかる相補的な小領域は、１４～１７又はそれ以上の塩基の完全長相補体よりも容易に融解され、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションにより、それらが容易に識別可能となる。比較的高ストリンジェンシーな条件は、例えば、約５０～７０℃の温度で約０．０２～０．１ＭのＮａＣｌ又は等価物によって提供されるものなど、低塩及び／又は高温条件を含む。このような高ストリンジェンシー条件は、ヌクレオチド配列と鋳型又は標的鎖との間の不一致を、たとえあったとしても、ほとんど許容しない。条件は、漸増量のホルムアミドの添加によって、よりストリンジェントになり得ることが、概ね理解される。
本開示のポリヌクレオチド配列は、意図とする宿主細胞においてヌクレオチド配列を発現させる１つ又は２つ以上の制御エレメント（例えばプロモータ又はエンハンサー）に動作可能に連結し得る。ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡであってもよい。プロモータは、強い、弱い、組織特異的、誘導性、又は発生段階特異的なプロモータであってよい。使用され得る例示的なプロモータは、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（hypoxanthine phosphoribosyl transferase、ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ベータアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンなどである。加えて、多くのウイルスプロモータが、真核細胞中で構成的に機能し、記載される実施形態での使用に好適である。このようなウイルスプロモータとしては、サイトメガロウイルス（Cytomegalovirus、ＣＭＶ）最初期プロモータ、ＳＶ４０の初期及び後期プロモータ、マウス乳がんウイルス（Mouse Mammary Tumor Virus、ＭＭＴＶ）プロモータ、モロニー白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus、ＨＩＶ）、エプスタインバーウイルス（Epstein Barr Virus、ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（Rous Sarcoma Virus、ＲＳＶ）、及び他のレトロウイルスの長端末反復配列（long terminal repeat、ＬＴＲ）、並びに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモータが挙げられる。メタロチオネインプロモータ、テトラサイクリン誘導性プロモータ、ドキシサイクリン誘導性プロモータ、タンパク質キナーゼＲ２’，５’－オリゴアデニル酸合成酵素、Ｍｘ遺伝子、ＡＤＡＲ１などの１つ又は２つ以上のインターフェロン刺激応答エレメント（interferon-stimulated response element、ＩＳＲＥ）を含有するプロモータなどの誘導性プロモータを使用してもよい。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。本開示はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。そのようなベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現用ベクター、トランスポゾンベースのベクター、又は任意の手段によって所与の生物又は遺伝子的バックグラウンドに本発明の合成ポリヌクレオチドを導入するのに好適な任意の他のベクターであってもよい。本開示のＣＤ３ε結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＣＤ３ε結合タンパク質の発現を確実にする発現ベクター中の制御配列に動作可能に連結され得る。そのような調節エレメントとしては、転写プロモータ、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終了を制御する配列を挙げることができる。発現ベクターはまた、１つ又は２つ以上の非転写エレメント、例えば、複製起点、発現する遺伝子に連結された好適なプロモータ及びエンハンサー、他の５’又は３’隣接非転写配列、５’又は３’非翻訳配列（例えば、必須リボソーム結合部位）、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、又は転写終結配列を含んでいてもよい。宿主において複製する能力を付与する複製の起点もまた、組み込まれ得る。
発現ベクターは、天然に存在する若しくは天然に存在しないヌクレオチド間結合、又は両方の種類の結合を含み得る。天然に存在しない又は改変されたヌクレオチド又はヌクレオチド間連結は、ベクターの転写又は複製を阻害しない。
ベクターを適切な宿主に組み込んだら、組み込まれたポリヌクレオチドによってコードされる本開示のＣＤ３ε結合タンパク質を高レベルで発現させるのに好適な条件下で宿主を維持する。脊椎動物細胞を形質転換するのに使用される発現ベクター中の転写及び翻訳制御配列は、ウイルス源により提供することができる。例示的なベクターは、Ｏｋａｙａｍａ ａｎｄ Ｂｅｒｇ，３ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２８０（１９８３）によって記載されるように構築され得る。
本開示のベクターはまた、１つ又は２つ以上の内部リボソーム進入部位（Internal Ribosome Entry Site、ＩＲＥＳ）を含有してもよい。ＩＲＥＳ配列を融合ベクターに含めることは、一部のタンパク質の発現を増強させるのに有益であり得る。他の実施形態では、ベクター系は、１つ又は２つ以上のポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０）を含むこととなり、これは、前述の核酸配列のうちのいずれかの上流又は下流にあってもよい。ベクターの成分は、近接して連結されてもよいか、又は遺伝子産物を発現させるのに最適な間隔を提供するように（即ち、ＯＲＦ間に「スペーサー」ヌクレオチドを導入することにより）配置されてもよいか、又は別の方法で位置付けられてもよい。また、調節エレメント、例えば、ＩＲＥＳモチーフが、発現に最適な間隔を提供するように配置されてもよい。
本開示のベクターは、環状であっても線形であってもよい。これらは、原核生物又は真核生物の宿主細胞において機能的な複製系を含有するように調製され得る。複製系は、例えば、ＣｏｌＥ１、ＳＶ４０、２μプラスミド、λ、ウシパピローマウイルスなどに由来していてよい。
組換え発現ベクターは、一過性の発現のため、安定な発現のためのいずれか、又はその両方のために設計され得る。また、組換え発現ベクターは、構成的発現又は誘導性発現のために作製され得る。
更に、組換え発現ベクターは、自殺遺伝子を含むように作製され得る。本明細書で使用するとき、「自殺遺伝子」という用語は、自殺遺伝子を発現する細胞を死に至らしめる遺伝子を指す。自殺遺伝子は、遺伝子を発現する細胞に対し薬剤（例えば、薬物）に対する感受性を付与し、細胞が薬剤と接触したとき又は薬剤に曝露されたときに細胞を死に至らしめる遺伝子であり得る。自殺遺伝子は、当技術分野で知られており、例えば、単純ヘルペスウイルス（Herpes Simplex Virus、ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（thymidine kinase、ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリルを含む。ベクターはまた、当技術分野で周知の選択マーカーを含んでもよい。選択マーカーは、陽性及び陰性選択マーカーを含む。マーカー遺伝子は、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質、重金属などに対する耐性）、栄養要求性宿主における原栄養を提供するための補完などを含む。例示的なマーカー遺伝子としては、抗生物質耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ペニシリン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、ヒスチジノール×耐性遺伝子）、グルタミン合成酵素遺伝子、ガンシクロビル選択用のＨＳＶ－ＴＫ、ＨＳＶ－ＴＫ誘導体、又は６－メチルプリン選択用の細菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子が挙げられる（Ｇａｄｉ ｅｔ ａｌ．，７ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１７３８－１７４３（２０００））。選択マーカーをコードする核酸配列又はクローニング部位は、目的のポリペプチドをコードする核酸配列又はクローニング部位の上流又は下流にあってもよい。
使用され得る例示的なベクターは、細菌：ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓ ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）である。真核生物：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＲ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＥ６．４（Ｌｏｎｚａ）並びにｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ）である。追加のベクターとしては、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｌｅｎ Ｂｕｒｎｉｅ，Ｍｄ．）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、及びｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。λＧＴ１０、λＧＴ１１、λＥＭＢＬ４、及びλＮＭ１１４９、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのバクテリオファージベクターを使用することができる。例示的な植物発現ベクターとしては、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ０１．２、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１．３、及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。例示的な動物発現ベクターとしては、ｐＥＵＫ－Ｃｌ、ｐＭＡＭ、及びｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、例えば、ガンマレトロウイルスベクター．ａｓｅ、及びニトロレダクターゼであってよい。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号２３のＶＨをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号２４、２７、２８、２９、又は３０のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号２４のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号２７のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号２８のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号２９のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号３０のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号２３のＶＨ、及び配列番号２４、２７、２８、２９、又は３０のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、以下をコードするポリヌクレオチドを含む：
配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４のＶＬ、
配列番号２３のＶＨ及び配列番号２７のＶＬ、
配列番号２３のＶＨ及び配列番号２８のＶＬ、
配列番号２３のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は
配列番号２３のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、又は７４のポリペプチドコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号６５のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号６６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号６７のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号６８のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号６９のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号７０のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号７１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号７２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号７３のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ベクターは、配列番号７４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
また、本発明は、本発明の１つ又は２つ以上のベクターを含む、宿主細胞を提供する。「宿主細胞」は、ベクターが導入された細胞を指す。宿主細胞という用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の後代、また特定の対象細胞から生成された安定な細胞株も指すことを意図すると理解される。変異又は環境による影響のいずれかにより、後続世代においてある特定の改変が生じることがあるため、そのような後代は親細胞と同一ではないことがあるが、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内には依然として含まれる。そのような宿主細胞は、真核細胞、原核細胞、植物細胞、又は古細菌細胞であってもよい。原核宿主細胞の例は、大腸菌、バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）などの桿菌（acilli）、及びサルモネラ（Salmonella）、セラチア（Serratia）、及び様々なシュードモナス種（Pseudomonas species）などの他の腸内細菌科である。酵母などの他の微生物も発現に有用である。好適な酵母宿主細胞の例は、サッカロミセス（Saccharomyces）（例えば、Ｓ．セレビジアエ（S.cerevisiae））及びピキア（Pichia）である。例示的な真核細胞は、哺乳動物、昆虫、鳥類、又は他の動物由来のものであってもよい。哺乳類真核細胞は、ハイブリドーマなどの不死化細胞株、又はＳＰ２／０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＣＲＬ－１５８１）、ＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＵＫ、ＥＣＡＣＣ番号８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６４６）、及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８０）マウス細胞株などの骨髄腫の細胞株を含む。例示的なヒト骨髄腫細胞株は、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ ＣＲＬ－ＴＩＢ－１９６）である。他の有用な細胞株としては、ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ））、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－６１）、又はＤＧ４４などの、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来するものが挙げられる。
本開示はまた、ＣＤ３ε結合タンパク質が発現する条件下で本開示の宿主細胞を培養することと、宿主細胞によって生成されたＣＤ３ε結合タンパク質を回収することと、を含む、本開示のＣＤ３ε結合タンパク質の生成方法も提供する。タンパク質を作製し、それを精製する方法は既知である。（化学的に又は組換えによって）合成されてから、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製、ゲル電気泳動などを含む標準的な手順に従ってＣＤ３ε結合タンパク質を精製することができる（全般的には、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，（１９８２）を参照）。対象タンパク質は、実質的に純粋、例えば、純度が少なくとも約８０％～８５％、純度が少なくとも約８５％～９０％、純度が少なくとも約９０％～９５％、又は純度が少なくとも約９８％～９９％、若しくはそれ以上であってよく、例えば、細胞残屑、対象タンパク質以外の巨大分子などの夾雑物を含んでいなくてよい。
本開示のＣＤ３ε結合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを、標準的な分子生物学的方法を用いてベクターに組み込むことができる。宿主細胞の形質転換、培養、抗体発現、及び精製は、周知の方法を使用して行われる。
修飾ヌクレオチドを使用して、本開示のポリヌクレオチドを生成することができる。例示的な修飾ヌクレオチドは、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、Ｎ６－置換アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルキューオシン、５”－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ウィブトキソシン（wybutoxosine）、シュードウラシル、キューオシン、ベータ－Ｄ－ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、及び２，６－ジアミノプリンである。
医薬組成物／投与
本発明はまた、本開示のＣＤ３ε結合タンパク質と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
本開示はまた、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインと、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
本開示はまた、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
本開示はまた、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
本開示はまた、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインと、本開示の腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメインと、を含む多重特異性タンパク質、及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
治療用途では、本開示のＣＤ３ε結合タンパク質は、医薬的に許容される担体中に活性成分として有効量の抗体を含有する医薬組成物として調製することができる。これらの溶液は滅菌され、概して粒子状物質を含まない。これらは、従来周知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌することができる。この組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる医薬的に許容可能な補助物質、例えばｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤などを含むことができる。
医薬組成物に関して本明細書で使用するとき、「医薬的に許容される」という用語は、動物及び／又はヒトにおける使用について、連邦政府若しくは州政府の規制機関によって承認されているか、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められている薬局方に列挙されていることを意味する。
治療及び使用の方法
本開示はまた、治療において使用するための、ＣＤ３εに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、本開示の第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む、二重又は多重特異性タンパク質を提供する。
本開示はまた、細胞増殖性障害の治療において使用するための、ＣＤ３εに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、本開示の第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む、二重又は多重特異性タンパク質を提供する。
本開示はまた、がんの治療において使用するための、ＣＤ３εに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、本開示の第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む、二重又は多重特異性タンパク質を提供する。
本開示はまた、がんを治療するための医薬の製造において使用するための、ＣＤ３εに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、本開示の第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む、二重又は多重特異性タンパク質を提供する。
一態様では、本開示は、全般的には、がんを発症するリスクのある対象の治療に関する。本発明はまた、化学療法及び／又は免疫療法により対象において著しく免疫が抑制され、それによって対象のがんを発症するリスクを増加させる、悪性腫瘍を治療することを含む。
本開示はまた、がん性状態を発症するリスクを有する対象における非がん性状態を治療する方法であって、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを当該対象に投与して当該非がん性状態を治療することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、がん性状態を発症するリスクを有する対象における非がん性状態を治療する方法であって、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質を当該対象に投与して当該非がん性状態を治療することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、がん性状態を発症するリスクを有する対象における非がん性状態を治療する方法であって、本開示のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質を当該対象に投与して当該非がん性状態を治療することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、がん性状態を発症するリスクを有する対象における非がん性状態を治療する方法であって、本開示の免疫コンジュゲートを当該対象に投与して当該非がん性状態を治療することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、がん性状態を発症するリスクを有する対象における非がん性状態を治療する方法であって、本開示の医薬組成物を当該対象に投与して当該非がん性状態を治療することを含む、方法を提供する。
本開示はまた、対象におけるがんを治療する方法であって、治療有効量のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質を、がんを治療するために、当該対象に投与することを含み、当該ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが以下を含む、方法を提供する：
配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４のＶＬ、
配列番号２３のＶＨ及び配列番号２７のＶＬ、
配列番号２３のＶＨ及び配列番号２８のＶＬ、
配列番号２３のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は
配列番号２３のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ。
本開示はまた、対象におけるがんを治療する方法であって、治療有効量のＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質を、がんを治療するために、当該対象に投与することを含み、当該ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、配列番号６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、又は７４のアミノ酸配列を含む、方法を提供する。
本開示の更なる態様は、細胞増殖性障害の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効量の、ＣＤ３εに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、本開示の第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む二重又は多重特異性タンパク質を、対象に投与することを含む、方法である。他の実施形態では、ＣＤ３εに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、本開示の第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む二重又は多特異性タンパク質が、対象に投与される。
前述の使用又は方法のいずれかにおいて、細胞増殖性疾患はがんである。他の実施形態では、がんは、食道がん、胃がん、小腸がん、大腸がん、結腸直腸がん、乳がん、非小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫（non-Hodgkin's lymphoma、ＮＨＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、腎がん、前立腺がん、肝臓がん、頭頸部がん、黒色腫、卵巣がん、中皮腫、神経膠芽腫、胚中心Ｂ細胞様（germinal-center B-cell-like、ＧＣＢ）ＤＬＢＣＬ、活性化Ｂ細胞様（activated B-cell-like、ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬ、濾胞性リンパ腫（follicular lymphoma、ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（mantle cell lymphoma、ＭＣＬ）、急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia、ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（chronic lymphoid leukemia、ＣＬＬ）、辺縁帯リンパ腫（marginal zone lymphoma、ＭＺＬ）、小リンパ性白血病（small lymphocytic leukemia、ＳＬＬ）、リンパ形質細胞性リンパ腫（lymphoplasmacytic lymphoma、ＬＬ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症（Waldenstrom macroglobulinemia、ＷＭ）、中枢神経系リンパ腫（central nervous system lymphoma、ＣＮＳＬ）、バーキットリンパ腫（Burkitt's lymphoma、ＢＬ）、Ｂ細胞性リンパ性白血病、脾臓辺縁帯リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、脾臓リンパ腫／白血病・分類不能型、脾臓びまん性赤色髄小細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病バリアント、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖疾患、形質細胞骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、骨外性形質細胞腫、粘膜関連リンパ組織の節外性辺縁帯リンパ腫（ｍｕｃｏｓａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅ、ＭＡＬＴリンパ腫）、節性辺縁帯リンパ腫、小児節性辺縁帯リンパ腫、小児濾胞性リンパ腫、原発性皮膚濾胞中心リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＣＮＳの原発性ＤＬＢＣＬ、原発性皮膚ＤＬＢＣＬ・下肢型、高齢者のＥＢＶ陽性ＤＬＢＣＬ、慢性炎症に関連するＤＬＢＣＬ、リンパ腫様肉芽腫症、縦隔（胸腺）原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＫ陽性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、ＨＨＶ８関連多中心性キャッスルマン病において生じる大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫：びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫とバーキットリンパ腫との中間の特徴を有する分類不能Ｂ細胞リンパ腫、古典的ホジキンリンパ腫、及び軽鎖アミロイドーシスからなる群から選択される。
他の実施形態では、がんは、食道がんである。他の実施形態では、がんは、腺がん、例えば、転移性腺がん（例えば、結腸直腸腺がん、胃腺がん、又は膵臓腺がん）である。
別の態様では、本開示は、（ａ）ＣＤ３εに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、本開示の第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む、前述の二重又は多重特異性抗体のうちのいずれか１つを含む組成物と、（ｂ）細胞増殖性障害を治療又は進行を遅延させるために、対象に当該組成物を投与するための指示書を含む添付文書と、を含むキットを特徴とする。
前述の使用又は方法のいずれかにおいて、対象はヒトであってよい。
併用療法
本開示のＣＤ３ε結合タンパク質は、少なくとも１つの追加の療法と併用投与してもよい。
他の実施形態では、１つの治療の送達は、投与に関して重複があるように、第２の治療の送達が開始されるときにまだ行われている。これは、本明細書において「同時」又は「同時送達」と称されることがある。他の実施形態では、１つの治療の送達は、もう１つの治療の送達が開始される前に終了する。いずれかの場合のいくつかの実施形態では、併用投与のため、治療はより効果的である。例えば、第２の治療はより効果的であり、例えば、同等の効果が、第２の治療を少なくして見られ、又は第２の治療が、第１の治療なく第２の治療が施される場合に見られるよりも、症状を大幅に軽減し、又は第１の治療と同様の状況が見られる。他の実施形態では、送達は、障害に関連する症状又は他のパラメータの低減が、他方の治療なしで送達される一方の治療で観察される低減よりも大きくなるようなものである。送達は、送達された第１の治療の効果が、第２の送達時に依然として検出可能であるようなものであり得る。
本明細書に記載されるＣＤ３ε結合タンパク質及び少なくとも１つの追加の治療薬は、同時に、同じ若しくは別個の組成物で、又は連続して、投与することができる。連続投与の場合、本明細書に記載されるＣＤ３ε結合タンパク質を最初に投与し、次に追加の薬剤を投与することができ、又は投与の順序を逆にすることができる。
実施形態：
本発明は、以下の非限定的な実施形態を提供する。
１．分化抗原群３ε（ＣＤ３ε）に結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、
ａ．配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号２４の軽鎖可変領域（ＶＬ）の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ．配列番号２３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号２７のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｃ．配列番号２３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号２８のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｄ．配列番号２３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号２９のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
ｅ．配列番号２３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号３０のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、を含む、単離タンパク質。
２．
ａ．それぞれ、配列番号６、７、８、９、１０、及び１１、
ｂ．それぞれ、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、及び１７、又は
ｃ．それぞれ、配列番号１８、１９、２０、２１、１６、及び２２、のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態１に記載の単離タンパク質。
３．ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ又はＶＨＨである、実施形態１又は２に記載の単離タンパク質。
４．ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、Ｆａｂである、実施形態３に記載の単離タンパク質。
５．ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、ＶＨＨである、実施形態３に記載の単離タンパク質。
６．ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖである、実施形態３に記載の単離タンパク質。
７．ｓｃＦｖが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、第１のリンカー（Ｌ１）、及びＶＬ（ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ）、又はＶＬ、Ｌ１、及びＶＨ（ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ）を含む、実施形態６に記載の単離タンパク質。
８．Ｌ１が、
ａ．約５～５０個のアミノ酸、
ｂ．約５～４０個のアミノ酸、
ｃ．約１０～３０個のアミノ酸、又は
ｄ．約１０～２０個のアミノ酸、を含む、実施形態７に記載の単離タンパク質。
９．Ｌ１が、配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、又は６４のアミノ酸配列を含む、実施形態７に記載の単離タンパク質。
１０．Ｌ１が、配列番号３１、３７、又は６４のアミノ酸配列を含む、実施形態９に記載の単離タンパク質。
１１．ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４、２７、２８、２９、又は３０のＶＬを含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の単離タンパク質。
１２．ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、
ａ．配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４のＶＬ、
ｂ．配列番号２３のＶＨ及び配列番号２７のＶＬ、
ｃ．配列番号２３のＶＨ及び配列番号２８のＶＬ、
ｄ．配列番号２３のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は
ｅ．配列番号２３のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、を含む、実施形態１１に記載の単離タンパク質。
１３．ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、配列番号６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、又は７４のアミノ酸配列を含む、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の単離タンパク質。
１４．ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、当該ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号１０３の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、単離タンパク質。
１５．ＣＤ３εに結合する当該抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ又はＶＨＨである、実施形態１４に記載の単離タンパク質。
１６．ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、Ｆａｂである、実施形態１５に記載の単離タンパク質。
１７．ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、ＶＨＨである、実施形態１５に記載の単離タンパク質。
１８．ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖである、実施形態１５に記載の単離タンパク質。
１９．ｓｃＦｖが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、第１のリンカー（Ｌ１）、及びＶＬ（ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ）、又はＶＬ、Ｌ１、及びＶＨ（ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ）を含む、実施形態１８に記載の単離タンパク質。
２０．Ｌ１が、
ａ．約５～５０個のアミノ酸、
ｂ．約５～４０個のアミノ酸、
ｃ．約１０～３０個のアミノ酸、又は
ｄ．約１０～２０個のアミノ酸、を含む、実施形態１９に記載の単離タンパク質。
２１．Ｌ１が、配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、又は６４のアミノ酸配列を含む、実施形態２０に記載の単離タンパク質。
２２．Ｌ１が、配列番号３１、３７、又は６４のアミノ酸配列を含む、実施形態２１に記載の単離タンパク質。
２３．ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４、２７、２８、２９、又は３０のＶＬを含む、実施形態１４～２２に記載の単離タンパク質。
２４．ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、
ａ．配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４のＶＬ、
ｂ．配列番号２３のＶＨ及び配列番号２７のＶＬ、
ｃ．配列番号２３のＶＨ及び配列番号２８のＶＬ、
ｄ．配列番号２３のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は
ｅ．配列番号２３のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、を含む、実施形態２３に記載の単離タンパク質。
２５．単離タンパク質が、多重特異性タンパク質である、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の単離タンパク質。
２６．多重特異性タンパク質が、二重特異性タンパク質である、実施形態２５に記載の単離タンパク質。
２７．多重特異性タンパク質が、三重特異性タンパク質である、実施形態２５に記載の単離タンパク質。
２８．免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域又はそのＩｇ定常領域の断片を更に含む、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の単離タンパク質。
２９．Ｉｇ定常領域の断片が、Ｆｃ領域を含む、実施形態２８に記載の単離タンパク質。
３０．Ｉｇ定常領域の断片が、ＣＨ２ドメインを含む、実施形態２８に記載の単離タンパク質。
３１．Ｉｇ定常領域の断片が、ＣＨ３ドメインを含む、請求項２８に記載の単離タンパク質。
３２．Ｉｇ定常領域の断片が、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む、実施形態２８に記載の単離タンパク質。
３３．Ｉｇ定常領域の断片が、ヒンジの少なくとも一部分、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む、実施形態２８に記載の単離タンパク質。
３４．Ｉｇ定常領域の断片が、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む、実施形態２８に記載の単離タンパク質。
３５．ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のＮ末端にコンジュゲートされる、実施形態２８～３４のいずれか１つに記載の単離タンパク質。
３６．ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のＣ末端にコンジュゲートされる、実施形態２８～３４のいずれか１つに記載の単離タンパク質。
３７．ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、第２のリンカー（Ｌ２）を介してＩｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされる、実施形態２８～３６のいずれか１つに記載の単離タンパク質。
３８．Ｌ２が、配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、又は６４のアミノ酸配列を含む、実施形態３７に記載の単離タンパク質。
３９．多重特異性タンパク質が、ＣＤ３ε以外の抗原に結合する抗原結合ドメインを含む、実施形態２８～３８のいずれか１つに記載の単離タンパク質。
４０．細胞表面抗原が、腫瘍関連抗原である、実施形態３９に記載の多重特異性抗体。
４１．細胞抗原が、カリクレイン関連ペプチダーゼ２（ｈＫ２）、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）、及びデルタ様タンパク質３（ＤＬＬ３）からなる群から選択される、実施形態３９～４０のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
４２．Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである、実施形態２８～４１のいずれか１つに記載の単離タンパク質。
４３．Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片が、タンパク質のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）への低減された結合もたらす少なくとも１つの変異を含む、実施形態２８～４２のいずれか１つに記載の単離タンパク質。
４４．タンパク質のＦｃγＲへの低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異が、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、Ｋ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及びＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓからなる群から選択され、残基番号付けはＥＵインデックスに従う、実施形態４３に記載の単離タンパク質。
４５．Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片が、タンパク質のＦｃγＲへの増強された結合をもたらす少なくとも１つの変異を含む、実施形態２８～４２のいずれか１つに記載の単離タンパク質。
４６．タンパク質のＦｃγＲへの増強された結合をもたらす少なくとも１つの変異が、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、及びＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、実施形態４５に記載の単離タンパク質。
４７．ＦｃγＲが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、若しくはＦｃγＲＩＩＩ、又はそれらの任意の組み合わせである、実施形態４３～４６のいずれか１つに記載の単離タンパク質。
４８．Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片が、タンパク質の半減期を調節する少なくとも１つの変異を含む、実施形態２８～４７のいずれか１つに記載の単離タンパク質。
４９．タンパク質の半減期を調節する少なくとも１つの変異が、Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ、及びＨ４３５Ｒからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、実施形態４８に記載の単離タンパク質。
５０．タンパク質が、Ｉｇ定常領域のＣＨ３ドメインに少なくとも１つの変異を含む、実施形態２８～４９のいずれか１つに記載の単離タンパク質。
５１．Ｉｇ定常領域のＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの変異が、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｌ、Ｆ４０５Ｗ、Ｋ３９２Ｌ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｓ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｉ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｖ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ及びＴ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、実施形態４０に記載の単離タンパク質。
５２．実施形態１～５１のいずれか１つに記載の単離タンパク質と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
５３．実施形態１～５１のいずれか１つに記載の単離タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
５４．実施形態５３に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
５５．実施形態５４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
５６．実施形態１～５１のいずれか１つに記載の単離タンパク質を産生する方法であって、タンパク質が発現する条件で実施形態５５に記載の宿主細胞を培養することと、宿主細胞によって産生されたタンパク質を収集することと、を含む、方法。
５７．対象におけるがんを治療する方法であって、治療有効量の、実施形態１～５１のいずれか一項に記載の単離された抗体を、がんを治療するために、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
５８．がんが、固形腫瘍又は血液悪性腫瘍である、実施形態５７に記載の方法。
５９．固形腫瘍が、前立腺がん、結腸直腸がん、胃がん、腎明細胞がん、膀胱がん、肺がん、扁平上皮がん、神経膠腫、乳がん、腎臓がん、血管新生障害、腎明細胞がん（ＣＣＲＣＣ）、膵臓がん、腎がん、尿路上皮がん、又は肝臓腺がんである、実施形態５８に記載の方法。
６０．血液悪性腫瘍が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、又は芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＤＰＤＣＮ）である、実施形態５８に記載の方法。
６１．抗体が、第２の治療薬と組み合わせて投与される、実施形態５７～６０のいずれか１つに記載の方法。
６２．実施形態１～５１のいずれか１つに記載の単離タンパク質に結合する、抗イディオタイプ抗体。
６３．ＣＤ３ε（配列番号１）上のエピトープに結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、エピトープが、配列番号１００、１０１、及び１０２のアミノ酸配列を含む不連続エピトープである、単離タンパク質。
６４．配列番号７５、７６、７１７、７１８、７９、８０、８１、８２、８３、及び８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
６５．配列番号７４７、７４８、７７、７８、７４９、７５０、７５１、７５２、７５３、及び７５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
６６．配列番号７５のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
６７．配列番号７６のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
６８．配列番号７１７のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
６９．配列番号７１８のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
７０．配列番号７９のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
７１．配列番号８０のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
７２．配列番号８１のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
７３．配列番号８２のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
７４．配列番号８３のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
７５．配列番号８４のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
７６．配列番号７４７のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
７７．配列番号７４８のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
７８．配列番号７７のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
７９．配列番号７８のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
８０．配列番号７４９のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
８１．配列番号７５０のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
８２．配列番号７５１のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
８３．配列番号７５２のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
８４．配列番号７５３のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
８５．配列番号７５４のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
８６．配列番号８５及び８６のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
８７．配列番号８５及び８８のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
８８．配列番号８５及び９０のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
８９．配列番号８５及び９２のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
９０．配列番号８５及び９４のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
９１．配列番号７１９及び８６のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
９２．配列番号７１９及び８８のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
９３．配列番号７１９及び９０のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
９４．配列番号７１９及び９２のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
９５．配列番号７１９及び９４のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
本明細書において開示した実施形態のいくつかを更に説明するために、以下の実施例を提供する。これらの実施例は、例示を目的とするものであって、本開示の実施形態を制限するものではない。
実施例１．抗ＣＤ３ｍＡｂｓの生成及び特性評価
Ａｂｌｅｘｉｓ（登録商標）トランスジェニックマウスプラットフォームを使用して、抗ＣＤ３抗体を生成した。Ａｂｌｅｘｉｓ（登録商標）マウスは、ヒトＣＨ１及びＣＬドメインに連結されたヒト可変ドメイン、キメラヒト／マウスヒンジ領域、及びマウスＦｃ領域を有する抗体を生成する。Ａｂｌｅｘｉｓ（登録商標）カッパマウス及びラムダマウス系統と呼ばれる２つの特定の系統は、特定のマウス配列を欠き、国際公開第１１／１２３７０８号及び国際公開第２００３／０００７３７号に記載されている。
１３匹のカッパマウス及び１２匹のラムダマウスを含むＡｂｌｅｘｉｓマウスを、ＴＲＣＷ５（配列番号３）で免疫した。ＴＲＣＷ５は、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，ＪＭＢ（２０００）３０２（４）：８９９－９１６によって報告されているように、２６アミノ酸リンカーによってＣＤ３εの細胞外領域に融合されたＣＤ３δの細胞外領域で構成される。このポリペプチドは、そのＣ末端に、部位特異的ビオチン化に使用されるＣ末端Ａｖｉタグを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを有していた（Ｆａｉｒｈｅａｄ ＆ Ｈｏｗａｒｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ （２０１５）；１２６６：１７１－１８４）。
ＴＲＣＷ５（配列番号３）：
ＦＫＩＰＩＥＥＬＥＤＲＶＦＶＮＣＮＴＳＩＴＷＶＥＧＴＶＧＴＬＬＳＤＩＴＲＬＤＬＧＫＲＩＬＤＰＲＧＩＹＲＣＮＧＴＤＩＹＫＤＫＥＳＴＶＱＶＨＹＲＭＧＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＤＡＫＫＤＤＡＫＫＤＧＳＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴＣＰＱＹＰＧＳＥＩＬＷＱＨＮＤＫＮＩＧＧＤＥＤＤＫＮＩＧＳＤＥＤＨＬＳＬＫＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣＹＰＲＧＳＫＰＥＤＡＮＦＹＬＹＬＲＡＲＶＳＰＰＳＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ
マウスを週２回、７週間にわたって免疫した。４２日目に、６箇所の皮下及び２箇所の皮内注射を含む８部位に広げて５０μｇのＴＲＣＷ５及び５０μｇのＣＤ４０ ｍＡｂを投与することによって、マウスをハイブリドーマ融合のためにブーストした。最終的なブーストについては、マウスに、４．７４ｘ１０７個の細胞／ｍＬで、ＣＤ３εを含むＴ細胞受容体複合体を内因的に発現するＴ細胞株であるＪｕｒｋａｔ細胞（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ（１９７７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９（５）：６２１－６）を２０μＬ注射した。
リンパ節及び脾臓をマウスから摘出し、コホートごとに融合を実施した。リンパ節細胞をカウントし、ＦＯ骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ（ＣＲＬ－１６４６））と１：１の比で合わせ、抗体スクリーニングの前に３７℃で１０日間インキュベートした。次いで、製造指示書に従って、プレート（ＥＬＩＳＡ、Ｔｈｅｒｍｏカタログ番号３４０２２）上に非特異的に固定化されたＴＲＣＷ５を使用するか、又はビオチン化ＴＲＣＷ５（ＳＰＡＲＣＬ ＥＬＩＳＡ、Ｌｕｍｉｇｅｎ）へのストレプトアビジンコンジュゲーションのいずれかによって、ハイブリドーマ融合細胞からの上清を、ＴＲＣＷ５への結合についてアッセイした。ＥＬＩＳＡアッセイは、０．５ｕｇ／ｍＬのＴＲＣＷ５及び０．５ｕｇ／ｍＬのＨＶＥＭ－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄカタログ番号３６５－ＨＶ）でプレートをコーティングすることによって、４℃で一晩実施した。４℃で一晩、リン酸緩衝生理食塩水（phosphate-buffered saline、ＰＢＳ）中０．４％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加することによって、プレートをブロッキングした。０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を補充した１×ＰＢＳでプレートを洗浄した。各ウェルに対し、５０ｕＬのハイブリドーマ上清を適用し、室温で１時間インキュベートした。結合した抗体は、ブロッキング緩衝液で１：１０，０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎカタログ番号１１５－０３６－０７１）の添加、続いて室温での３０分間インキュベートによって検出した。３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（tetramethylbenzidine、ＴＭＢ）基質緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏカタログ番号３４０２２）を２５ｕＬ／ウェルで添加し、暗所で１０分間インキュベートした。２５ｕＬ／ウェルの４ＭのＨ２ＳＯ４を添加することによって、反応を停止させた。ＢｉｏＴｅｋ（登録商標）Ｅｐｏｃｈ２マイクロプレートリーダーを使用して、４５０ｎｍで発光を読み取った。バックグラウンドよりも少なくとも３倍高いシグナルを有するヒットを選択した。
２つのアッセイフォーマットの結果、４２６ヒット（ＥＬＩＳＡから２６４ヒット、ＳＰＡＲＣＬ ＥＬＩＳＡから１９４、７０ヒットは両方のアッセイで同定された）が得られた。これら４２６個の初期ヒットのうち、４９個のＥＬＩＳＡ、及び３２個のＳＰＡＲＣＬ ＥＬＩＳＡヒットを確認した。陽性バインダーに対応するハイブリドーマ融合物を再度供給し、フローサイトメトリーを使用して、Ｊｕｒｋａｔ細胞に結合する能力について試験した。結果は、平均蛍光指数（ＭＦＩ、表４を参照されたい）に基づいて、クローン００３＿Ｆ１２、クローン０３６＿Ｅ１０、及びクローン０６５＿Ｄ０３を含む３つの抗体が、ＣＤ３を内因的に発現するＪｕｒｋａｔ細胞に対して著しい結合を示すことを示唆した。クローン００３＿Ｆ１２及び０３６＿Ｅ１０（ヒトカッパマウスから）は、ＥＬＩＳＡによってヒトカッパ軽鎖について陽性であることが確認されたが、クローン０６５＿Ｄ０３（ヒトラムダマウスから）は、ヒトラムダについて陰性であった。次いで、これら３つのクローンの可変遺伝子を配列決定した。
Figure 2023528350000005
次に、これら３つのクローンを、初代ヒト及びカニクイザルＴ細胞に結合する能力についてスクリーニングした。簡潔に述べると、初代ヒト及びカニクイザル汎Ｔ細胞をフロー染色緩衝液中１×１０６個の細胞／ｍＬで再懸濁させ、細胞を５０，０００個の細胞／ウェルで播種した。各ウェルに、５０ｕＬのハイブリドーマ上清を添加し、混合物を氷上で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、２００ｕＬの染色緩衝液を添加し、３００×Ｇで５分間遠心分離することによって細胞をペレット化した。Ａｌｅｘａ－６４７にコンジュゲートした抗マウスＩｇＧを、５０ｕＬの総体積で染色緩衝液中２ｕｇ／ｍＬで添加し、氷上で３０分間インキュベートした。１５０ｕＬの染色緩衝液を添加し、３００×Ｇで５分間遠心分離することによって細胞をペレット化した。細胞を、１：１，０００希釈したＳｙｔｏｘ ｇｒｅｅｎ死細胞染色剤を含有するランニング緩衝液３０ｕＬに再懸濁させ、ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ上で泳動させた。細胞をＦＣＳ対ＳＣＳでゲーティングして、残屑を除去した。シングレットをＳＣＳ－Ａ対ＳＣＳ－Ｈでゲーティングし、シングレット集団から、Ｓｙｔｏｘ ｇｒｅｅｎによる低－陰性についてＢＬ１チャネルを用いて生細胞を選択した。ＲＬ１（Ａｌｅｘａ－６４７）幾何平均により試験物質を陰性対照と比較することによって、ＣＤ３結合を評価した。このアッセイにおいて、クローン０６５＿Ｄ０３は、最も高い細胞結合シグナルを示した（図１Ａ～図１Ｂ）。
したがって、クローン０６５＿Ｄ０３の可変領域をＩｇＧ１骨格にクローニングして、ＣＤ３Ｂ８１５と呼ばれる抗体を得た（配列を表５に示す）。Ｊｕｒｋａｔ細胞への結合についてＣＤ３Ｂ８１５を再度スクリーニングしたところ、Ｊｕｒｋａｔ細胞への陽性結合を示した。
Figure 2023528350000006
ＣＤ３結合ドメインのヒト化及びｓｃＦｖフォーマット化
ＣＤ３Ｂ８１５のｖ領域の軽鎖（ＬＣ）を、ｓｃＦｖフォーマットでヒト化した。簡潔に述べると、ＣＤ３Ｂ８１５からのＬＣをヒトＩＧＨＶ３－２１＊０４生殖細胞系にグラフトし、ヒトからマウスへの復帰変異について２つの位置（Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従うＹ４９Ｋ及びＬ７８Ｖ）を同定した。この結果、Ｙ４９Ｋ、Ｌ７８Ｖのいずれか、又はＹ４９Ｋ及びＬ７８Ｖの両方を有するバリアントが得られた。ＣＤ３Ｂ８１５からのＬＣはまた、９２～９３位における脱アミド化のリスクを提示するＮＳモチーフを含んでいた。したがって、生成されたいくつかのバリアントもＮ９２Ｇを含有していた。これらのバリアント及び関連する変異を表６に記載し、ＶＨ及びＶＬアミノ酸及び核酸配列を表７及び８に示す。ＣＤＲ配列を表９～１１に示す。
Figure 2023528350000007
Figure 2023528350000008
Figure 2023528350000009
Figure 2023528350000010
Figure 2023528350000011
Figure 2023528350000012
Figure 2023528350000013
図３は、ＣＤ３Ｂ８１５、ＣＤ３Ｗ２４４、ＣＤ３Ｗ２４５、ＣＤ３Ｗ２４６、及びＣＤ３Ｗ２４７のＶＬ領域のアラインメントを示す。配列番号１０３のコンセンサスアミノ酸配列をＶＬ領域について決定し、ＣＤＲ残基に下線を付した。
Figure 2023528350000014
式中、Ｘ１は、Ｌ若しくはＭである、Ｘ２は、Ｇ若しくはＳである、Ｘ３は、Ｉ若しくはＳである、Ｘ４は、Ｖ若しくはＡである、Ｘ５は、Ｐ若しくはＶである、Ｘ６は、Ｅ若しくはＤである、Ｘ７は、Ｓ若しくはＴである、Ｘ８は、Ｆ若しくはＩである、Ｘ９は、Ｓ若しくはＴである、Ｘ１０は、Ｔ若しくはＰである、Ｘ１１は、Ｎ若しくはＧである、Ｘ１２は、Ｇ若しくはＫである、Ｘ１３は、Ｓ若しくはＡである、Ｘ１４は、Ｒ若しくはＫである、Ｘ１５は、Ｋ若しくはＹである、Ｘ１６は、Ｉ若しくはＶである、Ｘ１７は、Ｎ若しくはＳである、Ｘ１８は、Ｖ若しくはＬである、Ｘ１９は、Ｓ若しくはＰである、Ｘ２０は、Ｉ若しくはＦである、Ｘ２１は、Ｄ若しくはＴである、Ｘ２２は、Ｎ若しくはＧである、又はＸ２３は、Ｇ若しくはＱである。
熱ショック後のヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖバリアントのＣＤ３への結合。
次に、大腸菌における発現のために、リンカーＧＴＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号６４）（表１２）を使用して、ＶＨ－ＶＬ配向のｓｃＦｖとしてＣＤ３Ｂ８１５由来の可変領域をフォーマットし、次に、組換えＣＤ３（ＣＤ３Ｗ１４７、配列番号４）への結合、Ｔ細胞への結合、及び熱安定性についてスクリーニングした。
Figure 2023528350000015
ＣＤ３Ｗ１４７（配列番号４）：
ＱＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴＣＰＱＹＰＧＳＥＩＬＷＱＨＮＤＫＮＩＧＧＤＥＤＤＫＮＩＧＳＤＥＤＨＬＳＬＫＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣＹＰＲＧＳＫＰＥＤＡＮＦＹＬＹＬＲＡＲＶＧＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＤＡＫＫＤＤＡＫＫＤＧＳＱＳＩＫＧＮＨＬＶＫＶＹＤＹＱＥＤＧＳＶＬＬＴＣＤＡＥＡＫＮＩＴＷＦＫＤＧＫＭＩＧＦＬＴＥＤＫＫＫＷＮＬＧＳＮＡＫＤＰＲＧＭＹＱＣＫＧＳＱＮＫＳＫＰＬＱＶＹＹＲＭＧＳＧＳＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＦＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＲＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＫＰＶＬＤＳＤＧＳＦＲＬＥＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＧＧＨＨＨＨＨＨ
大腸菌において発現させた抗ＣＤ３ ｓｃＦｖバリアント（表７）のＣＤ３への結合を決定した。簡潔に述べると、ｓｃＦｖをコードする配列を、分泌のためにＰｅｌＢリーダー配列を有するｐＡＤＬ（商標）－２２ｃベクターにクローニングした（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。大腸菌細胞をプラスミドで形質転換し、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを補充した２×ＹＴ微生物成長培地において３７℃で一晩成長させた。一晩経った培養物を使用して、５ｍＬの発現培養物に接種し、ＯＤ６００約２．０まで３７℃で成長させた。１ｍＭのＩＰＴＧを添加することによってタンパク質発現を誘導し、培養物を一晩成長させた。発現後、２，２００×ｇで５分間遠心分離することによって細胞をペレット化し、上清を収集し、ＥＬＩＳＡ分析で直接試験した。
ＥＬＩＳＡ分析のために、ボティニル化ＣＤ３Ｗ１４７（ホモ二量体ＣＤ３εγ－Ｆｃ、配列番号４）を、２倍希釈で０．０３９ｕｇ／ｍＬ～２．５ｕｇ／ｍＬの範囲の濃度でプレート上に固定化し、続いて室温で４５分間インキュベートした。プレートを、３％ミルクを補充した１×ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎでブロックした。プレートを１×ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄した。大腸菌上清を６０℃に加熱し、次いで室温に冷却して、それらの熱安定性を評価した。上清を各プレートに添加し、室温で４５分間インキュベートした。結合したｓｃＦｖを、１つのウェル当たり５０ｕＬで１：１，０００に希釈したニワトリ抗ＨＡ－西洋ワサビペルオキシダーゼを使用して検出し、次いで化学発光基質（Ｓｉｇｍａカタログ番号１１５８２９５０００１）で検出した。ＣＤ３Ｂ８１５に由来する全ての試験したｓｃＦｖ分子は、ＣＤ３εに結合した（図２）。
次いで、フローサイトメトリーを使用して、Ｔ細胞に結合する能力についてｓｃＦｖ分子を試験した。簡潔に述べると、ヒトＴ細胞を解凍し、１×１０＾６細胞／ｍＬでフロー染色バッファに再懸濁させ、５０，０００細胞／ウェルで播種した。陽性対照であるＣＤ３Ｗ３６は、ＬＨ－ｓｃＦｖとしてフォーマット化された抗ＣＤ３抗体ＳＰ３４で構成されており、呼吸器合胞体ウイルスからのＦ－糖タンパク質を標的とするｓｃＦｖである陰性対照Ｂ２３を結合の比較のために使用した。大腸菌上清を１５０ｕＬ／ウェルで添加し、４℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを染色緩衝液で洗浄し、染色緩衝液で１：１００に希釈したＡｌｅｘａ－６４７にコンジュゲートした抗Ｈｉｓ抗体で検出し、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、２００ｕＬのＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔランニング緩衝液を混合物に添加し、細胞を１：１，０００のＳｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎ死細胞染色剤を含有するランニング緩衝液３０ｕＬ中に再懸濁させ、ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒで分析した。上記のとおり、ゲーティング及び分析を行った。ＣＤ３Ｂ８１５に由来する全てのｓｃＦｖ分子が、Ｔ細胞結合と一致する平均蛍光指数を示した（表１３）。
Figure 2023528350000016
エピトープ同定
水素－重水素交換質量分析（ＨＤＸ－ＭＳ）によって、ＣＤ３上のエピトープを決定した。抗体クローンＯＫＴ３をＨＤＸ実験の対照として使用し、それは、そのＣＤ３ε上のエピトープが結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ １ＳＹ６）から知られていたためである（Ｋｊｅｒ－Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１，７６７５－７６８０）。
ＨＤＸ－ＭＳのオンエクスチェンジ実験。血清アルブミンドメインに融合した２６ａａリンカー領域と融合したＣＤ３εγで構成された１０μＬの１０μＭ ＣＤ３Ｗ２２０（配列番号５）を、１．２モル過剰のリガンド及び３０μＬのＨ２Ｏ又は重水素化緩衝液（２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．４、９５％のＤ２Ｏ中の１５０ｍＭ ＮａＣｌ、又は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．４、９５％のＤ２Ｏ中の１５０ｍＭ ＮａＣｌ）と混合してか、又は混合せずにオンエクスチェンジ反応を開始させた。反応混合物を１５、５０、１５０、５００、又は１，５００秒間１．２℃でインキュベートした。オンエクスチェンジした溶液を、冷却した４０μＬの８Ｍ尿素、１Ｍ ＴＣＥＰ、ｐＨ３．０を添加することによってクエンチし、直ちに分析した。
ＣＤ３Ｗ２２０（ＣＤ３εγ－ＨＳＡ－６ｘＨｉｓ）（配列番号５）：
ＱＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴＣＰＱＹＰＧＳＥＩＬＷＱＨＮＤＫＮＩＧＧＤＥＤＤＫＮＩＧＳＤＥＤＨＬＳＬＫＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣＹＰＲＧＳＫＰＥＤＡＮＦＹＬＹＬＲＡＲＶＧＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＤＡＫＫＤＤＡＫＫＤＧＳＱＳＩＫＧＮＨＬＶＫＶＹＤＹＱＥＤＧＳＶＬＬＴＣＤＡＥＡＫＮＩＴＷＦＫＤＧＫＭＩＧＦＬＴＥＤＫＫＫＷＮＬＧＳＮＡＫＤＰＲＧＭＹＱＣＫＧＳＱＮＫＳＫＰＬＱＶＹＹＲＭＧＧＧＳＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＳＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬＧＧＧＳＨＨＨＨＨＨＨＨ
ＨＤＸ－ＭＳデータ取得のための全般的な手順。自動ＨＤｘシステム（ＬＥＡＰ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＮＣ）を用いて、ＨＤＸ－ＭＳサンプル調製を行った。カラム及びポンプは、プロテアーゼ、プロテアーゼＸＩＩＩ型（アスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ）由来のプロテアーゼ、ＸＩＩＩ型）／ペプシンカラム（ｗ／ｗ、１：１、２．１×３０ｍｍ）（ＮｏｖａＢｉｏＡｓｓａｙ Ｉｎｃ．，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）、トラップ、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ ＶａｎＧｕａｒｄ Ｐｒｅ－ｃｏｌｕｍｎ（２．１×５ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）、分析用、Ａｃｃｕｃｏｒｅ Ｃ１８（２．１×１００ｍｍ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、及びＬＣポンプ、ＶＨ－Ｐ１０－Ａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であった。ローディングポンプ（プロテアーゼカラムからトラップカラムへ）は、９９％の水、１％のアセトニトリル、０．１％のギ酸で６００μＬ／分に設定した。勾配ポンプ（トラップカラムから分析カラムへ）は、１００μＬ／分において２０分間で０．１％ギ酸水溶液中８％～２８％のアセトニトリルに設定した。
ＭＳデータ取得。２７５℃のキャピラリー温度、分解能１５０，０００、及び質量範囲（ｍ／ｚ）３００～１，８００で、ＬＴＱ（商標）Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して質量分析を実行した。
ＨＤＸ－ＭＳデータ抽出。ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ３．０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＨＤＸ実験の前に非重水素化サンプルのペプチド同定に使用した。ＨＤＥｘａｍｉｎｅｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．５（Ｓｉｅｒｒａ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ，Ｍｏｄｅｓｔｏ，ＣＡ）を使用して、ＨＤＸ実験についてのＭＳ生データファイルから質量中心値を抽出した。
ＨＤＸ－ＭＳデータ分析。抽出されたＨＤＸ－ＭＳデータをＥｘｃｅｌで更に分析した。全ての交換時点（１．２℃でｐＨ６．４又はｐＨ８．４）を、ｐＨ７．４及び２３℃における等価時点に変換した（例えば、１．２℃、ｐＨ６．４で１５秒は、２３℃、ｐＨ７．４で０．１５秒と等価である；表１４）。
Figure 2023528350000017
結果。抗ＣＤ３アームとしてＣＤ３Ｗ２４５を含む二重特異性抗体であるＫＬＣＢ９１（実施例３に記載）を組換えＣＤ３ε（配列番号５）とともにインキュベートした結果、抗原の特定のセグメントにおいて、異なるパターンの全体的な保護及び保護度が得られた。ＫＬＣＢ９１及びＯＫＴ３は両方とも、立体配座非同一エピトープを示す非連続セグメント（図４）を保護していた。保護されたセグメントをＣＤ３εの結晶構造（ＰＤＢ １ＳＹ６）にマッピングして、３次元で結合エピトープを可視化した。
ＣＤ３ε（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｐ０７７６６）に結合したＯＫＴ３の結晶構造と一致して、ＯＫＴ３のエピトープは、ＣＤ３ε（配列番号５）の残基２９～３７、７９～８４、及び８７～８９に及ぶペプチドからなることが見出された（図４）。ＣＤ３Ｗ２４５は、ＯＫＴ３のエピトープと部分的に重複するエピトープに結合し、ＣＤ３ε（配列番号５）のアミノ酸残基２９～３７（ＰＱＹＰＧＳＥＩＬ、配列番号１００）、５５～６３（ＧＳＤＥＤＨＬＳＬ、配列番号１０１）、及び７９～８４（ＰＲＧＳＫＰ、配列番号１０２）を含んでいた（図４）。
実施例２．抗カリクレイン関連ペプチダーゼ２（ｈＫ２）抗体及びｓｃＦｖの生成
親ｍ１１Ｂ６抗体のヒト化からの抗体作製。
親マウス抗カリクレイン関連ペプチターゼ２（ｈＫ２）抗体であるｍ１１Ｂ６は、Ｖａｉｓａｎｅｎら（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５０：９，１６０７－１６１７（２００４））に記載されている。ヒト化１１Ｂ６（本明細書ではｈｕ１１Ｂ６と称する）は、米国特許第９，３４５，７８２号及び同第１０，１００，１２５号において作製及び記載されている。
ｈｕ１１Ｂ６の遺伝子操作を開始して、改善された熱安定性などの改善された特性を有する追加の抗ＨＫ２抗体を作製した。モデリングを使用してｈｕ１１Ｂ６の熱安定性を改善するために場合により変更されることができるｈｕ１１Ｂ６フレームワークにおける残基の位置を同定した。同定された位置は、ＶＨにおける残基Ｐ４１、Ｉ４９、Ｍ７０、及びＡ８８、並びにＶＬにおけるＳ８０、Ｌ８２、Ａ８８、及びＹ９１であった（配列番号１２４のｈｕ１１Ｂ６＿ＶＨ及び配列番号１２５のｈｕ１１Ｂ６＿ＶＬのアミノ酸配列に従う残基番号付け）。
可変領域のうちの１つがコンビナトリアルライブラリを表し、第２のものが親ｈｕ１１Ｂ６ ＶＨ又はＶＬである、ＶＨ－リンカー－ＶＬ配向で、バイナリコンビナトリアルｓｃＦｖライブラリを作製した。ＧＧＳＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＧＧＳ（配列番号３１）のリンカー配列を使用して、ＶＨ／ＶＬ領域をコンジュゲートさせた。遺伝子操作されたｓｃＦｖを大腸菌で発現させ、上清中の生成されたｓｃＦｖを、ＥＬＩＳＡによってヒトｈＫ２への結合について試験し、ｈｕ１１Ｂ６の結合と比較した。ｈｕ１１Ｂ６と同等の結合を呈する任意の新たなバリアントを集約し、５５℃、６０℃、及び６５℃で１０分間、上清をインキュベートした後にヒトｈＫ２への結合について更に試験した。５５℃、６０℃、及び６５℃でインキュベートした後にｈｕ１１Ｂ６への同等の結合を保持し、熱安定性が改善していた分子を両配向（ＶＨ－リンカー－ＶＬ、ＶＬ－リンカー－ＶＨ）でマトリクス化し、更なる特性評価のために哺乳類ｓｃＦｖに変換した。
加えて、親マウス１１Ｂ６の別のヒト化を、Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ （ＭＡｂｓ．２０１５；７（４）：７７８－９１）によって概説されているアプローチに従って、広範囲に及ぶ生殖系列の多様性で実施し、増強された熱安定性についてバリアントを慎重にスクリーニングした。配列保存に基づいて、ヒト重鎖生殖系列ＩＧＨＶ４－３０及び軽鎖生殖系列ＩＧＫＶ３Ｄ－１１を、フレームワーク適合について選択した。体細胞超変異部位及びマウス／ヒト生殖細胞系列の多様性の選択セットを含む残基を用いて、バイナリｓｃＦｖライブラリを構築した。バリアントをクローニングし、上記のとおり大腸菌で発現させた。増強された熱安定性について、シングルポイントＥＬＩＳＡにおいて異なる温度で上清をスクリーニングした。マウス／ヒトキメラ１１Ｂ６ ｓｃＦＶを親対照として使用した。マウス１１Ｂ６と同様の結合活性及び６７℃のＴｍ値を維持したクローンＫＬ２Ｂ３５９を、追加のプロファイリングのためにｓｃＦｖ－Ｆｃに変換した。ＳＰＲによって測定されたＫＬ２Ｂ３５９のｈＫ２への親和性（ＫＤ）は、約０．７～１ｎＭであった。このキャンペーンからＨＣＦ３－ＬＣＤ６、ＨＣＧ５－ＬＣＢ７、ＫＬ２Ｂ３５７、ＫＬ２Ｂ３５８、及びＫＬ２Ｂ３６０も得られ、機能性について更に特性評価した。
ヒト免疫グロブリン遺伝子座を発現するトランスジェニックマウス（Ａｂｌｅｘｉｓ（登録商標））及びトランスジェニックラット（ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標））を使用した抗体作製。
ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）は、キメラヒト／ラットＩｇＨ遺伝子座（ラットＣＨ遺伝子座に連結された天然構成の２２個のヒトＶＨ、全てのヒトＤ及びＪＨセグメントを含む）を、完全なヒトＩｇＬ遺伝子座（Ｊκ－Ｃκに連結された１２個のＶκ及びＪλ－Ｃλに連結された１６個のＶλ）とともに含有する。（例えば、Ｏｓｂｏｒｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９０（４）：１４８１－１４９０を参照のこと）。したがって、このラットは、ラット免疫グロブリンの発現の減少を呈し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖及び軽鎖の導入遺伝子が、クラススイッチ及び体細胞変異を受けて、完全なヒト可変領域を有する高親和性キメラヒト／ラットＩｇＧモノクローナル抗体が生成される。ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）の調製及び使用、並びにこのようなラットが有しているゲノム改変は、国際公開第１４／０９３９０８号に記載されている。
Ａｂｌｅｘｉｓ（登録商標）マウス（実施例１に記載）及びＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）ラットを可溶性完全長ＫＬＫ２タンパク質（ヒトカリクレイン－２ ６－Ｈｉｓタンパク質）で免疫した。
ヒトカリクレイン－２ ６－Ｈｉｓタンパク質（配列番号３５５）：
ＶＰＬＩＥＧＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＡＶＹＳＨＧＷＡＨＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＬＫＫＮＳＱＶＷＬＧＲＨＮＬＦＥＰＥＤＴＧＱＲＶＰＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＮＭＳＬＬＫＨＱＳＬＲＰＤＥＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＫＩＴＤＶＶＫＶＬＧＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＲＰＲＳＬＱＣＶＳＬＨＹＳＥＫＶＴＥＦＭＬＣＡＧＬＷＴＧＧＫＤＴＣＧＧＤＳＧＧＰＬＶＣＮＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＰＥＰＣＡＬＰＥＫＰＡＶＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＡＡＮＰＨＨＨＨＨＨ
Ａｂｌｅｘｉｓマウス及びＯｎｉＲａｔラット由来のリンパ球をリンパ節から抽出し、コホートごとに融合を行った。細胞を合わせ、ＣＤ１３８発現について選別した。可溶性ｈＫ２抗原を使用してハイスループット小型化ＭＳＤフォーマットで、ハイブリドーマスクリーニングを実施した。約＞３００個のサンプルがｈＫ２バインダーであると同定された。Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ ＳＰＲによる単一サイクル速度論法によって、＞３００個の抗ｈＫＬＫ２上清サンプルのヒトＫＬＫ２タンパク質への結合を測定した。更に、上清サンプルをヒトＫＬＫ３タンパク質への結合についても同様に試験した。並行して、上清を、フローサイトメトリーによって、ＫＬＫ２発現細胞株ＶＣａｐ及び陰性細胞株ＤＵ１４５への結合についても試験した。選択された細胞バインダーを、上記のとおり、ＶＨ－ＶＬ及びＶＬ／ＶＨの両配向におけるｓｃＦｖ変換及び熱安定性試験に進めた。Ａｂｌｅｘｉｓマウス免疫キャンペーンから、ＫＬ２Ｂ４１３、ＫＬ２Ｂ３０、ＫＬ２Ｂ５３、及びＫＬ２Ｂ２４２が得られた。ＯｍｎｉＲａｔ免疫キャンペーンから、ＫＬ２Ｂ４６７及びＫＬ２Ｂ４９４が得られた。
上記の様々な免疫及びヒト化キャンペーンを通して生成された抗体を、ｆａｂフォーマット、ｍＡｂフォーマット、ＶＨ－リンカーＶＬ配向のｓｃＦｖフォーマット、又はＶＬ－リンカー－ＶＨ配向のｓｃＦｖフォーマットで発現させ、以下に記載のとおり更に分析した。上記配列番号３１のリンカー配列を使用して、ＶＨ／ＶＬ領域をコンジュゲートさせた。
抗ＫＬＫ２抗体の構造的特性評価
細胞内アッセイにおいて最も高い性能を示した抗体可変ドメイン及びｓｃＦｖ抗体断片の配列を本明細書に提供する。可変ドメインは、ｆａｂフォーマット、ＶＨ－リンカーＶＬ配向のｓｃＦｖフォーマット、又はＶＬ－リンカー－ＶＨ配向のｓｃＦｖフォーマットで発現させた。
可変ドメインＶＨ、ＶＬ、及びＣＤＲ
表１５は、選択された抗ｈＫ２抗体のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を示す。表１６は、選択された抗ｈＫ２抗体のＫａｂａｔ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を示す。表１７は、選択された抗ｈＫ２抗体のＫａｂａｔ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を示す。表１８は、選択された抗ｈＫ２抗体のＡｂＭ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を示す。表１９は、抗ｈＫ２のＡｂＭ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を示す。表２０に、選択されたｈＫ２抗体の可変ドメイン配列及び配列番号を要約する。表２１は、ＶＨ及びＶＬ領域のタンパク質及びＤＮＡの配列番号を示す。
Figure 2023528350000018
Figure 2023528350000019
Figure 2023528350000020
Figure 2023528350000021
Figure 2023528350000022
Figure 2023528350000023
Figure 2023528350000024
Figure 2023528350000025
Figure 2023528350000026
Figure 2023528350000027
Figure 2023528350000028
Figure 2023528350000029
配列番号２２５ （ｍ１１Ｂ６ ＶＨ ｃＤＮＡ）
ＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＣＧＧＡＣＴＴＧＴＴＡＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＧＴＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＣＧＴＣＡＣＣＧＧＣＡＡＣＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＧＣＧＡＴＴＡＣＧＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＴＣＣＣＴＧＧＡＡＡＴＣＧＡＣＴＣＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＡＣＡＴＴＴＣＡＴＡＣＴＣＣＧＧＴＴＣＡＡＣＣＡＣＴＴＡＣＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＴＧＡＡＡＴＣＴＡＧＧＴＴＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＣＧＴＧＡＴＡＣＣＴＣＡＡＡＧＡＡＣＣＡＡＴＴＴＴＴＴＣＴＧＣＡＡＣＴＧＡＡＴＡＧＣＧＴＡＡＣＴＣＣＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＴＡＴＴＴＣＴＧＣＧＣＣＡＣＴＧＧＧＴＡＴＴＡＣＴＡＴＧＧＣＴＣＡＧＧＴＴＴＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＣＡＣＴＣＴＣＧＴＣＡＣＣＧＴＣＡＧＣＡＧＣ
配列番号２２６ （ｈｕ１１Ｂ６ ＶＨ ｃＤＮＡ）
ＣＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＣＡＡＧＡＧＡＧＣＧＧＡＣＣＧＧＧＣＣＴＧＧＴＡＡＡＧＣＣＡＴＣＣＧＡＣＡＣＡＴＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＧＴＧＴＧＣＧＧＴＡＡＧＴＧＧＡＡＡＣＴＣＴＡＴＣＡＣＴＡＧＣＧＡＣＴＡＴＧＣＧＴＧＧＡＡＴＴＧＧＡＴＡＡＧＡＣＡＡＣＣＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＡＧＧＡＴＡＴＡＴＣＡＧＣＴＡＴＴＣＣＧＧＴＴＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＣＡＡＴＣＣＴＴＣＣＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＴＡＴＧＴＣＡＣＧＣＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＡＧＡＡＴＣＡＧＴＴＣＴＣＡＴＴＧＡＡＡＴＴＧＴＣＡＴＣＣＧＴＡＡＣＧＧＣＣＧＴＴＧＡＣＡＣＴＧＣＧＧＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＣＧＣＡＡＣＣＧＧＡＴＡＴＴＡＣＴＡＣＧＧＣＴＣＴＧＧＴＴＴＴＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＡＣＡＣＴＴＧＴＴＡＣＴＧＴＴＡＧＴＴＣＡ
配列番号２２７ （ＨＣＦ３－ＬＣＤ６ ＶＨ ｃＤＮＡ）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＣＣＡＧＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＡＡＧＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＧＣＣＧＴＧＡＧＣＧＧＣＡＡＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＧＴＴＣＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＡＣＡＴＣＡＧＣＴＡＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＣＣＡＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＧＣＣＧＣＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＧＣＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＣＣＣＣＴＧＴＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＣＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣ
配列番号２２８ （ＨＣＧ５－ＬＣＢ７ ＶＨ ｃＤＮＡ）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＣＣＡＧＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＡＡＧＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＧＣＣＧＴＧＡＧＣＧＧＣＡＡＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＧＴＴＣＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＡＣＡＴＣＡＧＣＴＡＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＣＣＡＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＧＣＣＧＣＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＧＣＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＣＣＣＣＴＧＴＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＣＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣ
配列番号２２９ （ＫＬ２Ｂ３５７，ＫＬ２Ｂ３６０ ＶＨ ｃＤＮＡ）
ＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＡＧＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＣＣＣＴＣＴＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＣＴＣＴＧＡＣＴＡＣＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＴＣＧＧＣＡＧＴＴＣＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＡＣＡＴＣＴＣＣＴＡＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＴＣＣＣＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＣＣＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧＴＧＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＡＴＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＣＡＣＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＴＴＴＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＴＡＣＣＧＴＧＴＣＴＡＧＴ
配列番号２３０ （ＫＬ２Ｂ３５８ ＶＨ ｃＤＮＡ）
ＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＡＧＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＣＣＣＴＣＴＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＣＴＣＴＧＡＣＴＡＣＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＴＣＧＧＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＡＣＡＴＣＴＣＣＴＡＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＴＣＣＣＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＣＣＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧＴＧＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＡＴＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＣＡＣＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＴＴＴＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＴＡＣＣＧＴＧＴＣＴＡＧＴ
配列番号２３１ （ＫＬ２Ｂ３５９ ＶＨ ｃＤＮＡ）
ＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＡＧＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＣＣＣＴＣＴＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＣＴＣＴＧＡＣＴＡＣＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＴＣＧＧＣＡＧＴＴＣＣＣＴＧＧＣＡＡＧＣＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＡＣＡＴＣＴＣＣＴＡＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＴＣＣＣＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＣＣＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧＴＧＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＡＴＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＣＡＣＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＴＴＴＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＴＡＣＣＧＴＧＴＣＴＡＧＴ
配列番号２３２ （ＫＬ２Ｂ４１３ ＶＨ ｃＤＮＡ）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＡＣＴＴＧＴＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＴＣＴＧＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＡＧＧＡＡＧＴＣＴＣＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＣＴＡＧＴＧＧＣＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡＧＣＴＣＡＴＡＴＴＧＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＧＴＧＡＧＡＣＡＡＧＣＣＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＧＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＡＧＣＴＡＡＣＡＴＴＡＡＡＣＡＧＧＡＣＧＧＣＴＣＣＧＡＡＣＧＧＴＡＣＴＡＴＧＴＴＧＡＴＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＧＡＣＧＧＴＴＣＡＣＴＡＴＡＴＣＣＡＧＧＧＡＴＡＡＴＧＣＡＡＡＡＡＡＴＴＣＡＣＴＣＴＡＴＣＴＴＣＡＡＡＴＧＡＡＣＴＣＡＣＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＣＧＣＣＡＧＧＧＡＴＣＡＡＡＡＴＴＡＴＧＡＣＡＴＡＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＡＴＴＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＴＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＡＡＣＣＧＴＴＡＣＣＧＴＣＴＣＡＡＧＴ
配列番号２３３ （ＫＬ２Ｂ３０ ＶＨ ｃＤＮＡ）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＧＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＴＣＧＧＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＴＣＡＧＴＡＧＴＴＡＣＴＡＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＧＣＣＣＧＣＣＧＧＧＴＣＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＧＣＧＴＴＴＡＴＡＴＧＴＣＡＧＴＧＧＧＴＴＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＣＣＣＴＣＣＣＴＣＡＡＧＡＧＴＣＧＡＧＴＣＡＣＣＴＴＧＴＣＡＣＴＡＧＡＣＣＣＧＴＣＣＡＧＧＡＡＣＣＡＧＴＴＧＴＣＣＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＧＴＴＣＴＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＡＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＧＧＧＡＧＡＴＡＧＴＧＧＧＡＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＴＧＧＴＴＣＧＡＣＣＣＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号２３４ （ＫＬ２Ｂ５３ ＶＨ ｃＤＮＡ）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＴＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＧＡＣＡＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＡＴＴＡＴＴＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＡＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＧＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＧＡＣＴＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＣＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＡＡＧＴＧＧＣＴＧＧＴＣＣＣＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＴＴＡＣＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＡＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＴＴＣＡ
配列番号３６１ （ＫＬ２Ｂ２４２ ＶＨ ｃＤＮＡ）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＧＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＴＣＧＧＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＴＣＡＧＴＡＧＴＴＡＣＴＡＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＧＣＣＣＧＣＣＧＧＧＴＣＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＧＣＧＴＴＴＡＴＡＴＧＴＣＡＧＴＧＧＧＴＴＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＣＣＣＴＣＣＣＴＣＡＡＧＡＧＴＣＧＡＧＴＣＡＣＣＴＴＧＴＣＡＣＴＡＧＡＣＣＣＧＴＣＣＡＧＧＡＡＣＣＡＧＴＴＧＴＣＣＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＧＴＴＣＴＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＡＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＧＧＧＡＧＡＴＡＧＴＧＧＧＡＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＴＧＧＴＴＣＧＡＣＣＣＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号７２４ （ＫＬ２Ｂ４６７ ＶＨ ｃＤＮＡ）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＴＡＣＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＴＴＴＡＴＡＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧＴＡＡＴＡＡＡＴＡＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＣＣＡＣＣＴＣＣＣＴＴＡＴＡＧＴＧＧＧＡＧＣＴＡＣＴＧＧＧＣＣＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＴＴＣＡ
配列番号２３５ （ＫＬ２Ｂ４９４ ＶＨ ｃＤＮＡ）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＧＴＣＡＴＴＡＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＡＣＴＡＴＴＧＧＴＧＧＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＡＧＣＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＣＴＣＡＴＡＴＴＧＴＡＡＴＧＧＴＧＡＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴＣＴＡＣＧＡＣＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＡＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号２３７ （ｍ１１Ｂ６ ＶＬ ｃＤＮＡ）
ＧＡＣＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＡＣＡＧＡＧＴＣＣＡＧＣＡＴＣＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＴＣＴＴＴＧＧＧＧＣＡＧＣＧＧＧＣＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＴＧＣＣＧＴＧＣＡＴＣＴＧＡＡＡＧＴＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＴＧＧＡＡＣＴＴＣＴＣＴＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＴＣＧＣＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＴＴＡＴＡＴＡＴＧＣＣＧＣＴＴＣＣＡＡＣＧＴＧＧＡＧＴＣＣＧＧＡＧＴＡＣＣＡＧＣＡＣＧＣＴＴＴＴＣＣＧＧＣＴＣＴＧＧＧＴＣＣＧＧＣＡＣＡＧＡＣＴＴＴＴＣＣＣＴＣＡＡＴＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＡＡＧＡＣＧＡＴＴＴＴＴＣＣＡＴＧＴＡＴＴＴＴＴＧＣＣＡＡＣＡＧＡＣＡＣＧＣＡＡＧＧＴＴＣＣＡＴＡＴＡＣＡＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＴＡＡＡＣＴＴＧＡＧＡＴＣＡＡＡ
配列番号２３８ （ｈｕ１１Ｂ６ ＶＬ ｃＤＮＡ）
ＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧＣＣＣＧＧＡＴＴＣＣＣＴＴＧＣＴＧＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＡＧＡＡＣＧＡＧＣＴＡＣＧＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＡＡＧＴＧＡＡＴＣＣＧＴＡＧＡＡＴＡＣＴＴＣＧＧＧＡＣＡＴＣＡＴＴＧＡＴＧＣＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＧＧＧＧＣＡＡＣＣＧＣＣＣＡＡＡＴＴＧＣＴＧＡＴＡＴＡＴＧＣＧＧＣＴＡＧＴＡＡＴＡＧＡＧＡＡＴＣＡＧＧＡＧＴＡＣＣＧＧＡＴＡＧＧＴＴＴＡＧＴＧＧＴＴＣＡＧＧＡＴＣＡＧＧＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＡＡＴＡＡＧＴＡＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＣＧＡＡＧＡＣＧＴＡＧＣＡＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＡＣＡＡＡＣＣＣＧＡＡＡＧＧＴＧＣＣＡＴＡＴＡＣＧＴＴＴＧＧＡＣＡＧＧＧＴＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ
配列番号２３９ （ＨＣＦ３－ＬＣＤ６ ＶＬ ｃＤＮＡ）
ＧＡＣＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＡＧＡＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＡＧＣＣＴＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＧＴＧＧＡＧＴＡＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＣＴＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＣＴＧＣＣＡＧＣＡＡＣＣＧＣＧＡＧＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＡＧＡＣＣＧＣＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＣＡＧＡＧＣＧＴＧＣＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣＴＣＣＧＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＡＣＣＣＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ
配列番号２４０ （ＨＣＧ５－ＬＣＢ７ ＶＬ ｃＤＮＡ）
ＧＡＣＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＡＧＡＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＡＧＣＣＴＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＧＴＧＧＡＧＴＡＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＣＴＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＣＴＧＣＣＡＧＣＡＡＣＣＧＣＧＡＧＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＡＧＡＣＣＧＣＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＡＣＣＣＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ
配列番号２４１ （ＫＬ２Ｂ３５７ ＶＬ ｃＤＮＡ）
ＧＡＣＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＡＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＣＧＡＧＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＴＣＣＧＡＧＴＣＣＧＴＧＧＡＡＴＡＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＴＣＴＣＴＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＡＡＣＧＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣＧＴＧＣＣＣＧＡＴＡＧＡＴＴＴＴＣＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＴＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＴＧＴＧＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＡＣＣＣＧＧＡＡＧＧＴＧＣＣＣＴＡＣＡＣＡＴＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＡＣＡＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＧ
配列番号２４２ （ＫＬ２Ｂ３５８，ＫＬ２Ｂ３５９，ＫＬ２Ｂ３６０ ＶＬ ｃＤＮＡ）
ＧＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＴＧＣＣＡＣＡＣＴＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＧＡＧＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＴＴＧＴＡＧＡＧＣＣＴＣＣＧＡＧＴＣＣＧＴＧＧＡＡＴＡＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＴＣＴＣＴＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＡＧＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＡＡＣＧＴＣＧＡＡＴＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＣＧＣＴＡＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＣＡＧＡＣＴＴＴＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＣＣＧＴＧＧＡＡＣＣＣＧＡＧＧＡＴＴＴＣＧＣＴＧＴＧＴＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＡＣＣＣＧＧＡＡＧＧＴＧＣＣＣＴＡＣＡＣＡＴＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＡＣＡＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＧ
配列番号２４３ （ＫＬ２Ｂ４１３ ＶＬ ｃＤＮＡ）
ＧＡＡＡＴＣＧＴＡＣＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＴＴＣＴＴＴＣＴＴＧＡＧＴＧＣＡＴＣＡＧＴＴＧＧＧＧＡＴＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＴＴＡＣＴＴＧＴＡＧＡＧＣＡＴＣＴＣＡＡＧＧＴＡＴＴＴＣＴＴＣＡＴＡＣＴＴＧＴＣＴＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＣＡＣＣＣＡＡＡＣＴＣＴＴＧＡＴＣＴＡＣＧＣＣＡＣＣＴＣＴＡＣＡＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＴＣＣＴＴＣＴＡＧＧＴＴＴＴＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＧＧＴＡＣＣＧＡＧＴＴＣＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＴＡＡＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＣＧＣＴＡＣＴＴＡＴＴＡＴＴＧＴＣＡＧＣＡＧＣＴＴＡＡＴＴＣＴＴＡＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＴＡＡＧＧＴＣＧＡＧＡＴＣＡＡＡ
配列番号２４４ （ＫＬ２Ｂ３０ ＶＬ ｃＤＮＡ）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＡＧＣＡＧＴＴＡＴＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＴＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＣＴＴＡＡＴＡＧＴＴＡＣＣＣＴＣＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ
配列番号２４５ （ＫＬ２Ｂ５３ ＶＬ ｃＤＮＡ）
ＧＡＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＧＡＧＴＣＡＧＧＡＣＡＴＴＡＧＣＡＡＴＴＡＴＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＴＴＣＣＴＡＡＧＴＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＡＣＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＴＣＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＡＡＧＴＡＴＡＡＣＡＧＴＧＣＣＣＣＧＴＡＣＡＣＴＴＴＴＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＡＣＧＡＣＴＧＧＡＧＡＴＴＡＡＡ
配列番号２４６ （ＫＬ２Ｂ２４２ ＶＬ ｃＤＮＡ）
ＴＣＣＴＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＣＧＴＧＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＴＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＴＴＧＧＧＧＧＡＡＡＡＴＴＡＴＧＣＴＴＧＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴＴＧＧＴＣＡＴＣＴＡＴＣＡＡＧＡＴＡＧＴＡＡＧＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＧＣＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＣＴＣＴＧＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＣＴＣＴＧＧＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＧＣＧＴＧＧＧＡＣＡＡＣＡＧＴＡＴＴＧＴＧＧＴＡＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡ
配列番号２４７ （ＫＬ２Ｂ４６７ ＶＬ ｃＤＮＡ）
ＣＡＧＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＧＧＴＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＣＣＣＧＧＧＣＡＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＡＴＴＡＣＣＴＧＴＧＧＧＧＧＡＧＡＣＡＡＣＡＴＴＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＧＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＴＣＧＴＣＴＡＴＧＡＴＡＡＴＡＧＣＧＡＣＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＧＣＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＣＴＣＴＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＴＣＧＡＡＧＣＣＧＧＧＧＡＴＧＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＧＴＧＴＧＧＧＡＴＡＧＴＡＧＴＡＧＴＧＡＴＣＡＴＣＣＴＧＴＧＧＴＡＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＡ
配列番号２３５ （ＫＬＫ２Ｂ４９４＿ＶＨ ＤＮＡ）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＧＴＣＡＴＴＡＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＡＣＴＡＴＴＧＧＴＧＧＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＡＧＣＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＣＴＣＡＴＡＴＴＧＴＡＡＴＧＧＴＧＡＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴＣＴＡＣＧＡＣＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＡＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号２３６（ＫＬＫ２Ｂ４９４＿ＶＬ ＤＮＡ）
ＴＣＴＴＣＴＧＡＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＧＧＴＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＣＧＧＣＣＡＧＧＡＴＴＡＣＣＴＧＴＧＧＧＧＧＡＡＡＣＡＡＣＡＴＴＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＧＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＴＣＧＴＣＴＡＴＧＡＴＧＡＴＡＧＣＧＡＣＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＧＣＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＣＴＣＴＧＧＧＡＡＣＡＣＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＴＣＧＡＡＧＣＣＧＧＧＧＡＴＧＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＧＴＧＴＧＧＧＡＴＡＧＴＡＧＴＡＧＴＧＡＴＣＡＴＧＴＧＧＴＡＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡ
コンセンサスＶＨ及びＶＬ配列
図５は、ｍｕ１１Ｂ６、ｈｕ１１Ｂ６、ＫＬ２Ｂ３５７、ＫＬ２Ｂ３５８、ＫＬ２Ｂ３５９、ＫＬ２Ｂ３６０、ＨＣＦ３、及びＨＣＧ５のＶＨドメインの配列アラインメントを示す。図６は、ｍｕ１１Ｂ６、ｈｕ１１Ｂ６、ＫＬ２Ｂ３５７、ＫＬ２Ｂ３５８、ＫＬ２Ｂ３５９、ＫＬ２Ｂ３６０、ＬＤＣ６、及びＬＣＢ７のＶＬドメインの配列アラインメントを示す。配列番号３５６及び配列番号３５７のコンセンサスアミノ酸配列を、それぞれＶＨ及びＶＬドメインについて決定した。ＨＣＤＲ及びＬＣＤＲ残基には下線を付す。
Figure 2023528350000030
配列中、Ｘ１は、Ｄ若しくはＱであり、Ｘ２はＡ若しくはＴであり、Ｘ３は、Ｐ若しくはＦであり、Ｘ４は、Ｇ若しくはＲであり、Ｘ５は、Ｉ若しくはＭであり、Ｘ６は、Ｉ若しくはＭであり、Ｘ７は、Ａ若しくはＰであり、又はＸ８は、Ｖ若しくはＡである。
Figure 2023528350000031
配列中、Ｘ１は、Ｄ又はＥであり、Ｘ２は、Ｄ又はＡであり、Ｘ３は、Ｓ又はＴであり、Ｘ４は、Ａ又はＳであり、Ｘ５は、Ｖ又はＬであり、Ｘ６は、Ｌ又はＰであり、Ｘ７は、Ｉ又はＬであり、Ｘ８は、Ｎ又はＳであり、Ｘ９は、Ｒ又はＫであり、Ｘ１０は、Ｋ又はＲであり、Ｘ１１は、Ｖ又はＲであり、Ｘ１２は、Ｖ又はＩであり、Ｘ１３は、Ａ又はＤであり、Ｘ１４は、Ｑ又はＳであり、Ｘ１５は、Ｌ又はＶであり、Ｘ１６は、Ｑ又はＥであり、Ｘ１７は、Ｐ又はＡであり、Ｘ１８は、Ｆ又はＶであり、Ｘ１９は、Ａ又はＳであり、Ｘ２０は、Ｙ又はＦであり、Ｘ２１は、Ｑ又はＧであり、かつＸ２２は、Ｌ又はＶである。
Ｆａｂ－Ｆｃ及びｓｃＦｖ
ｈＫ２特異性ＶＨ／ＶＬ領域を、ＶＨ－ＣＨ１－リンカーＣＨ２－ＣＨ３及びＶＬ－ＣＬとして遺伝子操作し、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４として発現させたか、又はＶＨ－リンカー－ＶＬ若しくはＶＬ－リンカー－ＶＨ配向のいずれかのｓｃＦｖとして遺伝子操作した。ｓｃＦｖに使用したリンカーは、上記配列番号３１のリンカーであった。ｓｃＦｖを使用して、実施例３に記載されるように二重特異性抗体を生成した。
表２２は、ｍＡｂフォーマットの選択された抗ｈＫ２抗体のＨＣアミノ酸配列を示す。表２３は、ｍＡｂにおける選択された抗ｈＫ２抗体のＬＣのアミノ酸配列を示す。表２４に、ｍＡｂフォーマットの選択された抗ｈＫ２抗体のＨＣ及びＬＣのＤＮＡ配列番号を要約する。表２５は、ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨ配向の選択されたｓｃＦｖのアミノ酸配列を示す。
Figure 2023528350000032
Figure 2023528350000033
Figure 2023528350000034
Figure 2023528350000035
配列番号２４８ （ｍ１１Ｂ６ ＨＣ ｃＤＮＡ）
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配列番号２４９ （ｈｕ１１Ｂ６ ＨＣ ｃＤＮＡ）
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配列番号２５０ （ＫＬ２Ｂ３０ ＨＣ ｃＤＮＡ）
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配列番号２５１ （ＫＬ２Ｂ５３ ＨＣ ｃＤＮＡ）
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配列番号２５２ （ＫＬ２Ｂ２４２ ＨＣ ｃＤＮＡ）
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配列番号２５３ （ＫＬ２Ｂ４６７ ＨＣ ｃＤＮＡ）
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配列番号２５４ （ＫＬ２Ｂ４９４ ＨＣ ｃＤＮＡ）
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配列番号２５５ （ｍｕ１１Ｂ６ ＬＣ ｃＤＮＡ）
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配列番号２５６ （ｈｕ１１Ｂ６ ＬＣ ｃＤＮＡ）
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配列番号２５７ （ＫＬ２Ｂ３０ ＬＣ ｃＤＮＡ）
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配列番号２５８ （ＫＬ２Ｂ５３ ＬＣ ｃＤＮＡ）
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配列番号２５９ （ＫＬ２Ｂ２４２ ＬＣ ｃＤＮＡ）
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配列番号２６０ （ＫＬ２Ｂ４６７ ＬＣ ｃＤＮＡ）
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配列番号２６１ （ＫＬ２Ｂ４９４ ＬＣ ｃＤＮＡ）
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抗ｈＫ２抗体の生物物理学的特性評価
抗ｈＫ２抗体の親和性及び熱安定性。
可溶性ｈＫ２に対する選択されたｈＫ２抗体の親和性を、表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance、ＳＰＲ）によって測定した。ＳＰＲは、複合体の形成及び解離時の質量の変化を測定することによって、２つの結合パートナー間の相互作用の強度を試験するための無標識技術である。抗体を、抗Ｆｃ抗体でコーティングされたセンサチップ上に捕捉し、続いて、様々な濃度並びに指定の会合及び解離時間で可溶性ｈＫ２を注入した。解離後、表面を適切な溶液で再生して、次の相互作用の準備を行った。センサグラムを１：１ラングミュアモデルに適合させることによって、速度情報（オンレート及びオフレート定数）を抽出した。結合親和性（ＫＤ）は、速度定数の比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）として報告される。選択されたｈＫ２抗体のＫＤ値を表２６に列挙する。
熱安定性は、自動化されたＰｒｏｍｅｔｈｅｕｓの機器を用いて、示差走査蛍光測定（ＮａｎｏＤＳＦ）で決定した。ＮａｎｏＤＳＦを使用して、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４中０．５ｍｇ／ｍＬの濃度の分子のＴｍを測定した。サンプルを３８４ウェルサンプルプレートから２４ウェルキャピラリーにロードすることによって、測定を行った。各サンプルについて、２回測定を行った。熱走査は、１．０℃／分の速度で２０℃～９５℃に及んだ。固有のトリプトファン及びチロシンの蛍光を３３０ｎｍ及び３５０ｎｍの発光波長でモニタリングし、Ｆ３５０／Ｆ３３０ｎｍ比を温度に対してプロットして、アンフォールディング曲線を作成した。測定されたＴｍ値を表２６に列挙する。
Figure 2023528350000041
Ａｂｌｅｘｉｓ免疫キャンペーンから生成されたＫＬ２Ｂ４１３ ｓｃＦｖは、Ｎａｎｏ ＤＳＦによって測定したとき６７℃の熱安定性（Ｔｍ）、及び約３４ｎＭのヒトｈＫ２に対する結合親和性（ＫＤ）を有した。再ヒト化キャンペーンについて得られ、そして、マウス１１Ｂ６と同様の結合親和性を維持していたクローンＫＬ２Ｂ３５９を、追加のプロファイリングのためにｓｃＦｖ－Ｆｃ及びＣＡＲ－Ｔに変換した。ＫＬ２Ｂ３５９ ｓｃＦｖは、６７℃のＴｍ及び約０．７～１ｎＭのｈＫ２に対する結合親和性（ＫＤ）を示す。ＫＬ２Ｂ３０、ＫＬ２Ｂ２４２、ＫＬ２Ｂ５３、ＫＬ２Ｂ４６７、及びＫＬ２Ｂ４９４ Ｆａｂは、０．５ｎＭ未満の結合親和性、及び７０℃を超えるＴｍ値を示した。
エピトープ及びパラトープマッピング
選択された抗ｈＫ２抗体のエピトープ及びパラトープを、水素－重水素交換質量分析（ＨＤＸ－ＭＳ）によって求めた。ヒトＫＬＫ２抗原を、エピトープ及びパラトープマッピング実験に使用した。
簡潔に述べると、精製されたＫＬＫ２抗原を、重水標識緩衝液中で抗ｈＫ２抗体の有り、及び無しでインキュベートした。水素－重水素交換（hydrogen-deuterium exchange、ＨＤＸ）混合物を、８Ｍ尿素、１Ｍ ＴＣＥＰ、ｐＨ３．０の添加によって異なる時点でクエンチした。クエンチしたサンプルを、室温でバッファＡ（Ｈ２Ｏ中１％アセトニトリル、０．１％ＦＡ）で平衡化した固定化ペプシン／ＦＰＸＩＩＩカラムに６００μＬ／分で通した。消化性断片を、バッファＡを用いて６００μＬ／分で逆相トラップカラムにロードし、１分間脱塩した（６００μＬのバッファＡ）。脱塩された断片を、２０分かけて１００μＬ／分で８％→３５％バッファＢ（９５％アセトニトリル、５％Ｈ２Ｏ、０．００２５％ＴＦＡ）の線形勾配を有するＣ１８カラムによって分離し、質量分析によって分析した。２７５℃のキャピラリー温度、分解能１５０，０００、及び質量範囲（ｍ／ｚ）３００～１，８００で、ＬＴＱ（商標）Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して質量分析を実行した。ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ３．０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＨＤＸ実験の前に非重水素化サンプルのペプチド同定に使用した。ＨＤＥｘａｍｉｎｅｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．５（Ｓｉｅｒｒａ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ，Ｍｏｄｅｓｔｏ，ＣＡ）を使用して、ＨＤＸ実験についてのＭＳ生データファイルから質量中心値を抽出した。
ｈＫ２抗体、ｈｕ１１Ｂ６、ＫＬ２Ｂ４９４、ＫＬ２Ｂ４６７、ＫＬ２Ｂ３０、ＫＬ２Ｂ４１３、及びＫＬ２Ｂ５３を溶解性ｈＫ２タンパク質とともにインキュベートした結果、異なるパターンの水素交換及び全体的な保護が得られた。保護されたセグメントをｈＫ２抗原の配列にマッピングして、結合エピトープを可視化した（図７）。ＫＬ２Ｂ４９４、ＫＬ２Ｂ４６７、及びＫＬ２Ｂ３０は、（ｉ）残基１７３～１７８（配列番号２０９、ＫＶＴＥＦ）（例えば、配列番号２０９の残基のうちの少なくとも３つ、すなわち、１７３～１７５におけるＫＶＴ残基に結合したＫＬ２Ｂ４９４、ＫＬ２Ｂ４６７、及びＫＬ２Ｂ３０）、並びに（ｉｉ）残基２３０～２３４（配列番号２１６、ＨＹＲＫＷ）（例えば、配列番号２１６の残基のうちの少なくとも３つ、すなわち、２３０～２３２におけるＨＹＲ残基に結合したＫＬ２Ｂ４９４、ＫＬ２Ｂ４６７、及びＫＬ２Ｂ３０）、の共通配列に結合した。ＫＬ２Ｂ４１３はまた、図７に示されるとおり、配列番号２０９の全ての残基及び配列番号２１６のＫＷ残基に結合した。本発明の実施形態は、ｈＫ２に結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、当該抗原結合ドメインが、配列番号２０９及び配列番号２１６の配列を有するエピトープ内でｈＫ２に結合し、例えば、当該抗原結合ドメインが、配列番号２０９の全ての残基、又は少なくとも４つの残基、又は少なくとも３つの残基に結合し、配列番号２１６の全ての残基、又は少なくとも４つの残基、又は少なくとも３つの残基に結合する、単離タンパク質を提供する。
ＫＬ２Ｂ５３は、異なるパターンの保護を示し、残基２７～３２（配列番号２１７、ＳＨＧＷＡＨ）、６０～７５（配列番号２１８、ＲＨＮＬＦＥＰＥＤＴＧＱＲＶＰ）、及び１３８～１４７（配列番号２９２、ＧＷＧＳＩＥＰＥＥ）からなる配列に結合した。
実施形態によれば、単離抗ｈＫ２／抗ＣＤ３タンパク質（例えば、ｈｕ１１Ｂ６、ＫＬ２Ｂ４９４、ＫＬ２Ｂ４６７、ＫＬ２Ｂ３０、ＫＬ２Ｂ４１３、又はＫＬ２Ｂ５３）は、配列番号２０９、２１６、２１７、２１８、及び２９２からなる群から選択される１つ又は２つ以上のアミノ酸配列を含むｈＫ２の不連続エピトープ（すなわち、残基が配列中に離れて配置されているエピトープ）に特異的に結合するｈｋ２特異性抗原結合ドメインを含む。
抗ｈＫ２抗体ｈｕ１１Ｂ６、ＫＬ２Ｂ４９４、ＫＬ２Ｂ４６７、ＫＬ２Ｂ４１３、並びに抗ｈＫ２／ＣＤ３二重特異性抗体ＫＬＣＢ１１３及びＫＬＣＢ８０のパラトープを、ＨＤＥｘａｍｉｎｅｒ残基プロットからの重水素取り込みにおける有意差に基づいて同定した。ＫＬ２ＢＢ４９４は、３つのパラトープ領域を含み、そのうちの２つが、ＫＬ２Ｂ４９４重鎖可変ドメイン（ＧＦＴＦＳＨ（配列番号）７２９）及びＴＡＶＹＹＣＡＫＰＨＩＶＭＶＴＡＬ（配列番号７３０））に位置し、１つのパラトープ領域が、軽鎖可変ドメイン内（ＹＤＤＳＤＲＰＳＧＩＰＥＲ（配列番号７３１））に位置する。ＫＬ２Ｂ４６７は、３つのパラトープ領域を含み、そのうちの２つが、ＫＬ２Ｂ４６７重鎖可変ドメイン（ＦＴＦＳＹ（配列番号）７３２）及びＧＳＹＷＡＦＤＹ（配列番号７３３））に位置し、１つのパラトープ領域が、軽鎖可変ドメイン（ＤＮＳＤ（配列番号７３４））内に位置する。Ｈｕ１１Ｂ６は、重鎖（ＧＮＳＩＴＳＤＹＡ（配列番号７３５））に位置する１つのエピトープ領域を含む。ＫＬ２Ｂ４１３は、重鎖可変ドメイン（ＧＦＴＦ（配列番号７３６）及びＡＲＤＱＮＹＤＩＬ（配列番号７３７））に位置する２つのパラトープ領域を含む。二重特異性ＫＬＣＢ８０のＫＬ２Ｂ３０は、重鎖（アミノ酸残基ＴＩＦ及びＶＴＰＮＦ（配列番号７３８）を含む）に位置するパラトープ領域及び軽鎖（ＹＡＡＳＴＬＱＳＧ（配列番号７３９））に位置するパラトープ領域を含む。二重特異性ＫＬＣＢ１１３のＫＬ２Ｂ５３は、重鎖（アミノ酸残基ＥＳＧＷＳＨＹを含む（配列番号７４０））に位置する１つのパラトープ領域を含む。図１１（１１Ａ～１１Ｆ）は、これらの抗ｈＫ２抗体及び抗ｈＫ２／ＣＤ３二重特異性抗体の結合パラトープを示す（下線付き配列は、ＣＤＲ領域を示し、ハイライトされた配列は、パラトープ領域を示す）。
実施例３．二重特異性抗ｈＫ２×抗ＣＤ３抗体の生成
実施例２で生成された抗ｈＫ２抗体のＶＨ／ＶＬ領域及び実施例１で生成された抗ＣＤ３抗体のＶＨ／ＶＬ領域を、二重特異性フォーマットに遺伝子操作し、ＩｇＧ１として発現させた。
ｈＫ２／ＣＤ３二重特異性生成のためのＣＤ３ ｓｃＦｖの遺伝子操作
ＣＤ３ ＶＨ／ＶＬ領域を、配列番号３１のリンカーを使用して、ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨ配向のいずれかのｓｃＦｖとして遺伝子操作した（表２７）。ＣＤ３に結合するＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨのｓｃＦｖ分子を、Ｆｃサイレンシング変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ）及び選択的ヘテロ二量体化を促進するように設計されたＴ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含むｓｃＦｖ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３（ｓｃＦｖ－Ｆｃとも称される）フォーマットに更に遺伝子操作した（表２８）。配列番号２９３のポリペプチドを定常ドメインヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３として使用した。ＣＤ３に結合するｓｃＦｖ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３タンパク質を、ＣＨ３ドメインにＣ末端溶解素を有するか又は欠くかのいずれかに遺伝子操作した（表２８）。ｓｃＦｖフォーマット及びｓｃＦｖ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３フォーマットでの抗ＣＤ３分子のＤＮＡ配列番号を、表２９に示す。
Figure 2023528350000042
Figure 2023528350000043
Figure 2023528350000044
Figure 2023528350000045
Figure 2023528350000046
Figure 2023528350000047
配列番号２９４（ＣＤ３Ｗ２４４＿ＨＬ）
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配列番号２９５（ＣＤ３Ｗ２４４＿ＬＨ）
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配列番号２９６（ＣＤ３Ｗ２４５＿ＨＬ）
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配列番号２９７（ＣＤ３Ｗ２４５＿ＬＨ）
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配列番号２９８（ＣＤ３Ｗ２４６＿ＨＬ）
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配列番号２９９（ＣＤ３Ｗ２４６＿ＬＨ）
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配列番号３００（ＣＤ３Ｗ２４７＿ＨＬ）
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配列番号３０１（ＣＤ３Ｗ２４７＿ＬＨ）
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配列番号３０２（ＣＤ３Ｗ２４８＿ＨＬ）
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配列番号３０３（ＣＤ３Ｗ２４８＿ＬＨ）
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配列番号３０４（ＣＤ３Ｗ２４４＿ＨＬ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）
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配列番号３０５ （ＣＤ３Ｗ２４４＿ＬＨ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）
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配列番号３０６ （ＣＤ３Ｗ２４５＿ＨＬ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）
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配列番号３１１ （ＣＤ３Ｗ２４７＿ＬＨ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）
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配列番号３１２ （ＣＤ３Ｗ２４８＿ＨＬ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）
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配列番号３１３ （ＣＤ３Ｗ２４８＿ＬＨ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）
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ｈＫ２／ＣＤ３二重特異性生成のためのＣＤ３ Ｆａｂの遺伝子操作
ＣＤ３特異的ＶＨ及びＶＬ領域を、それぞれＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３及びＶＬ－ＣＬフォーマットに遺伝子操作し、ＩｇＧ１として発現させた。Ｆｃサイレンシング変異Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ及び選択的ヘテロ二量体化を促進するように設計されたＣＨ３変異Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖを含む配列番号３１４のポリペプチドを使用して、ＣＤ３特異的ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３を生成した（表３０）。ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３重鎖を、ＣＨ３ドメインにＣ末端溶解素を有するか又は欠くかのいずれかで遺伝子操作した。Ｃ末端溶解素を欠くＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３重鎖を配列番号８５に示す。
配列番号３１４（ｈｕＩｇＧ１＿Ｇ１ｍ（１７）＿ＡＡＳ＿ＺＷＡ）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＳＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＶＹＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＡＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号３６３又は３６４のポリペプチドを使用して、ＣＤ３特異的ＶＬ－ＣＬを生成した（表３１）
配列番号３６３（ヒトカッパ軽鎖）
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号３６４（ヒトラムダ軽鎖）
ＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ
ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３形式のＨＣ及びＶＬ－ＣＬ形式のＬＣとしての抗ＣＤ３分子のＤＮＡ配列を表３２に示す。
Figure 2023528350000048
Figure 2023528350000049
Figure 2023528350000050
配列番号３１５（ＣＤ３Ｗ２４４、ＣＤＲＷ２４５、ＣＤ３Ｗ２４６、ＣＤ３Ｗ２４７、ＣＤ３Ｗ２４８ ＨＣ ｃＤＮＡ）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＴＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＡＡＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＡＧＣＣＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＡＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＣＴＡＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＧＡＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＧＣＧＧＴＣＴＧＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＣＣＣＧＣＧＧＴＴＧＧＧＧＣＣＣＡＴＴＣＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＴＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＧＴＧＴＡＣＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＧＣＣＣＴＣＧＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＴＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡ
配列番号３１６ （ＣＤ３Ｗ２４４ ＬＣ ｃＤＮＡ）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＡＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＣＧＴＣＧＧＣＧＡＣＣＧＣＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＣＣＧＣＣＡＧＡＧＣＡＴＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＡＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＡＴＣＡＧＣＧＧＴＧＴＧＣＣＡＡＧＣＣＧＣＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＧＣＣＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴ
配列番号３１７ （ＣＤ３Ｗ２４５ ＬＣ ｃＤＮＡ）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＡＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＣＧＴＣＧＧＣＧＡＣＣＧＣＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＣＣＧＣＣＡＧＡＧＣＡＴＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＡＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＡＴＣＡＧＣＧＧＴＧＴＧＣＣＡＡＧＣＣＧＣＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＧＣＣＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴ
配列番号３１８ （ＣＤ３Ｗ２４６ ＬＣ ｃＤＮＡ）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＡＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＣＧＴＣＧＧＣＧＡＣＣＧＣＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＣＣＧＣＣＡＧＡＧＣＡＴＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＡＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＡＴＣＡＧＣＧＧＴＧＴＧＣＣＡＡＧＣＣＧＣＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＧＣＣＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴ
配列番号３１９ （ＣＤ３Ｗ２４７ ＬＣ ｃＤＮＡ）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＡＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＣＧＴＣＧＧＣＧＡＣＣＧＣＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＣＣＧＣＣＡＧＡＧＣＡＴＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＡＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＡＴＣＡＧＣＧＧＴＧＴＧＣＣＡＡＧＣＣＧＣＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＧＣＣＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴ
配列番号３２０ （ＣＤ３Ｗ２４８ ＬＣ ｃＤＮＡ）
ＧＡＣＡＴＣＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＡＴＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＡＧＴＣＣＡＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＴＣＡＧＴＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＡＧＣＡＴＴＧＧＣＡＣＡＧＣＣＡＴＡＣＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡＡＣＡＡＡＴＧＧＴＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＣＡＴＡＡＡＧＴＡＴＧＣＴＴＣＴＧＡＧＴＣＴＡＴＣＴＣＴＧＧＧＡＴＣＣＣＴＴＣＣＡＧＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＴＡＣＴＣＴＴＡＣＣＡＴＣＡＡＣＡＧＴＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＡＡＧＡＴＡＴＴＧＣＡＧＡＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＡＡＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＧＣＣＧＴＡＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴ
配列番号３５１（ＣＤ３Ｂ３７６ ＨＣ）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＡＧＡＧＴＧＧＴＣＣＣＡＧＡＣＴＣＧＴＧＡＧＡＣＣＣＴＣＴＣＡＡＡＣＡＣＴＣＡＧＴＴＴＧＡＣＴＴＧＴＧＣＣＡＴＣＴＣＡＧＧＣＧＡＴＴＣＡＧＴＴＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＴＧＣＡＧＣＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＴＴＡＧＧＣＡＧＴＣＡＣＣＴＡＧＴＣＧＣＧＧＴＣＴＴＧＡＡＴＧＧＣＴＴＧＧＧＣＧＴＡＣＡＴＡＣＴＡＴＣＧＣＴＣＴＡＡＡＴＧＧＴＴＧＴＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＴＧＴＧＴＣＣＧＴＧＡＡＧＡＧＣＣＧＡＡＴＣＡＣＣＧＴＡＡＡＣＣＣＴＧＡＴＡＣＣＴＣＣＡＧＧＡＡＴＣＡＧＴＴＣＡＣＡＴＴＧＣＡＡＣＴＧＡＡＴＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＴＧＣＡＣＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＣＣＧＡＧＧＡＴＡＴＡＧＣＡＧＴＡＧＣＴＴＣＧＡＣＴＡＴＴＧＧＧＧＡＣＡＡＧＧＧＡＣＡＣＴＣＧＴＴＡＣＣＧＴＴＡＧＴＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＴＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＧＴＧＴＡＣＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＧＣＣＣＴＣＧＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＴＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴ
配列番号３５２（ＣＤ３Ｂ３７６ ＬＣ）
ＣＡＧＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＣＣＣＡＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＧＴＧＴＣＴＧＧＣＴＣＴＣＣＣＧＧＣＣＡＧＴＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＧＴＡＣＣＧＧＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＧＣＡＣＣＴＡＣＡＡＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＣＧＡＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＣＴＧＴＡＣＧＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＧＣＧＧＣＣＣＴＣＴＧＧＣＧＴＧＴＣＣＴＣＣＡＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＡＣＡＣＣＧＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＡＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＣＣＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＣＡＣＴＧＴＧＴＧＴＣＣＴＡＣＧＣＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＧＣＴＧＴＴＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＧＴＣＡＧＣＣＣＡＡＧＧＣＴＧＣＡＣＣＣＡＧＴＧＴＣＡＣＴＣＴＧＴＴＣＣＣＧＣＣＣＴＣＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＴＴＣＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＣＡＴＡＡＧＴＧＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＧＧＧＡＧＣＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＧＣＣＧＡＴＡＧＣＡＧＣＣＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＧＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣＣＴＣＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＡＣＡＡＣＡＡＧＴＡＣＧＣＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＴＣＣＣＡＣＡＧＡＡＧＣＴＡＣＡＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＣＡＣＧＣＡＴＧＡＡＧＧＧＡＧＣＡＣＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＣＣＴＡＣＡＧＡＡＴＧＴＴＣＡ
ｈＫ２／ＣＤ３二重特異性生成のためのｈＫ２ ｓｃＦｖ－Ｆｃの遺伝子操作
実施例２に記載される、配列番号３１のリンカー（表２）を使用してＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨ配向のいずれかのｓｃＦｖとして遺伝子操作されたｈＫ２ ＶＨ／ＶＬ領域を、Ｆｃサイレンシング変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ）及び選択的ヘテロ二量体化を促進するように設計されたＴ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗ変異を含むｓｃＦｖ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３フォーマットに更に遺伝子操作し、ＩｇＧ１として発現させた（表３３）。配列番号３２１のポリペプチドを定常ドメインヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｆｃ）として使用した。
配列番号３２１（ｈｕＩｇＧ１＿Ｇ１ｍ（１７）－ヒンジ－Ｆｃ＿Ｃ２２０Ｓ＿ＡＡＳ＿ＺＷＢ）
ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＳＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＬＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＬＴＷＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
Figure 2023528350000051
ｈＫ２／ＣＤ３二重特異性生成のためのｈＫ２ Ｆａｂ－Ｆｃの遺伝子操作
ｈＫ２特異性ＶＨ及びＶＬ領域を、それぞれＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３及びＶＬ－ＣＬフォーマットに遺伝子操作した。Ｆｃサイレンシング変異Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ及び選択的ヘテロ二量体化を促進するように設計されたＣＨ３変異Ｔ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗを含む配列番号３２６のポリペプチドを使用して、ＣＤ３特異的ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３を生成した。
配列番号３２６（ｈｕＩｇＧ１＿Ｇ１ｍ（１７）＿ＡＡＳ＿ＺＷＢ）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＳＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＬＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＬＴＷＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号３６３又は３６４のポリペプチドを使用して、ｈＫ２特異性ＶＬ－ＣＬを生成した。
配列番号３６３（ヒトカッパ軽鎖）
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号３６４（ヒトラムダ軽鎖）
ＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ
ｈＫ２ Ｆａｂ－Ｆｃ ＨＣのアミノ酸配列を表３４に示す。
Figure 2023528350000052
ｈＫ２／ＣＤ３二重特異性
上記のとおりＨＬ及びＬＨの両方の配向の、Ｆａｂとして遺伝子操作されたＣＤ３Ｗ２４５及びＣＤ３Ｂ３７６抗ＣＤ３特異性アーム、並びにｓｃＦｖとして遺伝子操作されたＫＬ２Ｂ３５９、ＫＬ２Ｂ４１３、ＫＬ２Ｂ４６７、及びＫＬ２Ｂ４９４のｈＫ２ ＶＨ／ＶＬ領域を発現させて、二重特異性抗体を生成し、フォーマットｓｃＦｖ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３のｈＫ２結合アーム並びに重鎖：ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３及び軽鎖：ＶＬ－ＣＬのフォーマットのＣＤ３結合アームを有するｈＫ２／ＣＤ３二重特異性抗体を得た。あるいは、上記のとおり、ＬＨ－リンカー－ＶＨ配向のｓｃＦｖとして遺伝子操作された抗ＣＤ３抗体ＣＤ３Ｗ２４５のＶＨ／ＶＬ領域、並びにＦａｂとして遺伝子操作された抗ｈＫ２抗体ＫＬ２Ｂ３０、ＫＬ２Ｂ２４２、及びＫＬ２Ｂ５３のＶＨ／ＶＬ領域を発現させて、二重特異性抗体を生成し、重鎖ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３及び軽鎖ＶＬ－ＣＬのフォーマットのｈＫ２結合アーム並びにフォーマットｓｃＦｖ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３のＣＤ３結合アームを有するｈＫ２／ＣＤ３二重特異性抗体を得た。抗ｓｃＦｖを生成するために使用したリンカーは、配列番号３１のリンカーである。
Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ ＣＨ３変異を１本の重鎖に遺伝子操作し、Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ ＣＨ３変異を上記のとおり他の重鎖に遺伝子操作した。加えて、ＨＫ２結合アーム及びＣＤ３結合アームの両方を、上記のとおりＦｃエフェクターサイレンシング変異Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓを含有するように遺伝子操作した。
遺伝子操作された鎖を発現させ、得られた二重特異性抗体を標準的な方法を使用して精製した。二重特異性抗体を、実施例５に記載されるように、ｈＫ２及びＣＤ３へのそれらの結合、並びにそれらの細胞傷害について特性評価した。表３５は、選択された抗ｈＫＬ２／ＣＤ３二重特異性抗体のＣＤＲ配列番号を示す。表３６は、選択された抗ｈＫＬ２／ＣＤ３二重特異性抗体のＶＨ、ＶＬ、及びｓｃＦｖの配列番号を示す。表３７は、選択された抗ｈＫＬ２／ＣＤ３二重特異性抗体のＨＣ１、ＨＣ２、ＬＣ１、及びＬＣ２の配列番号を示す。ＨＣ１及びＬＣ１は、ｈＫＬ２結合アームの重鎖及び軽鎖を指す。あるいは、ＨＣ１は、ｈＫｌ２結合アームのｓｃＦｖ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を指す場合もある。ＨＣ２及びＬＣ２は、ＣＤ３結合アームの重鎖及び軽鎖を指す。あるいは、ＨＣ２は、ＣＤ３結合アームのｓｃＦｖ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を指す場合もある。表３８は、ＨＣ１、ＬＣ１、ＨＣ２、及びＬＣ２のアミノ酸配列を示す。表３９は、ＨＣ１、ＬＣ１、ＨＣ２、及びＬＣ２のｃＤＮＡ配列を示す。
Figure 2023528350000053
Figure 2023528350000054
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Figure 2023528350000058
Figure 2023528350000059
配列番号３３２（ＫＬ２Ｂ３５９－ＬＨ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）
ＧＡＧＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＡＡＴＣＣＣＣＡＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＡＣＣＣＧＧＴＧＡＧＣＧＧＧＣＡＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＴＡＧＡＧＣＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＴＧＧＣＡＣＡＴＣＣＣＴＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＡＣＡＡＣＣＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＣＡＴＡＴＡＴＧＣＣＧＣＣＴＣＡＡＡＴＧＴＣＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＴＡＣＣＴＧＣＡＣＧＧＴＴＴＴＣＡＧＧＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＴＡＣＴＧＡＣＴＴＣＡＣＡＴＴＧＡＣＴＡＴＡＴＣＣＴＣＴＧＴＡＧＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＣＴＡＣＴＴＣＴＧＣＣＡＧＣＡＡＡＣＴＡＧＧＡＡＧＧＴＴＣＣＡＴＡＴＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧＧＣＧＧＴＡＣＡＡＡＡＧＴＴＧＡＧＡＴＡＡＡＧＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＡＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＧＴＡＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＡＣＣＴＧＧＧＣＴＣＧＴＣＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＡＧＡＣＡＴＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＡＴＧＣＡＣＡＧＴＴＴＣＣＧＧＣＡＡＣＡＧＴＡＴＴＡＣＴＴＣＣＧＡＣＴＡＴＧＣＴＴＧＧＡＡＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＡＴＴＣＣＣＡＧＧＡＡＡＧＣＧＧＣＴＣＧＡＧＴＧＧＡＴＡＧＧＴＴＡＴＡＴＴＴＣＴＴＡＣＴＣＴＧＧＡＴＣＴＡＣＴＡＣＣＴＡＣＡＡＴＣＣＣＡＧＴＴＴＧＡＡＧＴＣＴＣＧＣＧＴＧＡＣＡＡＴＴＡＧＣＣＧＧＧＡＣＡＣＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＣＡＡＴＴＣＴＣＡＣＴＴＡＡＡＣＴＴＡＧＴＴＣＴＧＴＡＡＣＣＧＣＴＧＣＣＧＡＴＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＣＴＧＧＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＧＧＡＡＧＣＧＧＡＴＴＴＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＡＡＣＴＴＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＣＴＴＣＣＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＡＧＣＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＴＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＧＴＧＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＣＴＣＡＣＣＴＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＴＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴ
配列番号３３３（ＫＬ２Ｂ４１３－ＬＨ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）
ＧＡＧＧＴＡＣＡＡＣＴＴＧＴＣＧＡＡＡＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＴＣＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＧＡＴＣＡＣＴＴＣＧＣＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＴＡＧＣＣＴＣＴＧＧＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＴＣＡＴＣＴＴＡＣＧＡＣＡＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＡＣＣＴＧＧＴＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＴＧＣＣＡＴＣＡＴＴＡＧＴＴＡＣＧＡＴＧＧＣＴＣＣＡＡＡＡＡＡＧＡＴＴＡＣＡＣＣＧＡＴＡＧＣＧＴＡＡＡＧＧＧＣＡＧＡＴＴＴＡＣＣＡＴＴＴＣＣＡＧＧＧＡＴＡＡＴＴＣＡＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＧＡＣＡＧＣＣＴＣＣＧＣＧＴＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＡＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＧＡＧＴＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＣＣＡＴＴＡＴＴＡＣＴＡＴＴＡＴＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＡＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＴＡＧＴＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＴＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＧＴＧＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＣＴＣＡＣＣＴＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＴＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴ
配列番号３３４（ＫＬ２Ｂ４６７－ＬＨ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）
ＣＡＧＡＧＣＧＴＡＣＴＴＡＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＣＴＧＴＡＧＣＣＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＣＡＧＣＣＡＧＴＡＴＴＡＣＡＴＧＣＧＧＴＧＧＴＧＡＣＡＡＴＡＴＡＧＧＴＴＣＣＡＡＡＴＣＣＧＴＧＣＡＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＧＣＡＡＧＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＣＧＴＧＧＴＡＴＡＴＧＡＴＡＡＴＴＣＣＧＡＣＣＧＣＣＣＴＴＣＣＧＧＣＡＴＴＣＣＣＧＡＡＣＧＧＴＴＴＡＧＴＧＧＴＴＣＡＡＡＴＴＣＡＧＧＣＡＣＣＡＣＡＧＣＡＡＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＴＣＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＡＡＧＣＣＧＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＧＴＡＴＧＧＧＡＣＴＣＴＡＧＴＡＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＧＴＣＴＴＣＧＧＴＧＧＧＧＧＡＡＣＣＡＡＡＧＴＧＡＣＣＧＴＴＣＴＧＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＡＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＣＧＴＡＧＡＡＡＧＴＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＴＡＧＴＴＣＡＧＣＣＡＧＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＣＣＧＧＣＴＧＡＧＴＴＧＴＧＣＡＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＴＴＡＣＴＴＴＴＴＣＣＴＡＣＴＡＴＧＧＡＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＡＣＧＴＣＡＧＧＣＡＣＣＣＧＧＣＡＡＡＧＧＴＴＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＧＣＡＴＴＣＡＴＴＴＣＴＴＡＴＧＡＴＧＧＡＴＣＡＡＡＴＡＡＧＴＡＴＴＡＴＧＣＣＧＡＴＡＧＴＧＴＡＡＡＧＧＧＣＡＧＡＴＴＴＡＣＡＡＴＡＡＧＴＣＧＡＧＡＣＡＡＣＴＣＡＡＡＧＡＡＣＡＣＴＣＴＣＴＡＣＣＴＣＣＡＡＡＴＧＡＡＴＡＧＴＣＴＴＣＧＧＧＣＡＧＡＧＧＡＴＡＣＴＧＣＡＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣＡＴＣＴＴＣＣＴＴＡＴＴＣＣＧＧＴＴＣＴＴＡＣＴＧＧＧＣＡＴＴＣＧＡＴＴＡＴＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＡＣＡＡＧＴＴＡＣＣＧＴＧＴＣＴＡＧＣＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＡＧＣＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＴＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＧＴＧＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＣＴＣＡＣＣＴＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＴＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴ
配列番号３３８（ＫＬ２Ｂ４９４－ＬＨ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）
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配列番号３３５（ＫＬＫ２Ｂ３０ Ｆａｂ ＨＣ ｃＤＮＡ）
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配列番号７２２（ＫＬＫ２Ｂ３０ Ｆａｂ ＬＣ ｃＤＮＡ）
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配列番号３３７（ＫＬ２Ｂ５３ Ｆａｂ ＨＣ ｃＤＮＡ）
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配列番号７２３（ＫＬ２Ｂ５３ Ｆａｂ ＬＣ ｃＤＮＡ）
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配列番号３３６（ＫＬＫ２Ｂ２４２ Ｆａｂ ＨＣ ｃＤＮＡ及びＫＬ２Ｂ２４２ＬＣ＿Ｃ３３Ｓ Ｆａｂ ＨＣ）
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配列番号３６０（ＫＬＫ２Ｂ２４２ＬＣ＿Ｃ３３Ｓ Ｆａｂ ＬＣ ｃＤＮＡ）
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配列番号３３９（ＫＬＫ２Ｂ３０ ｗＫ４７７ Ｆａｂ ＨＣ ｃＤＮＡ）
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配列番号３５３（ＣＤ３Ｗ２４５－ＬＨ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ ｃＤＮＡ）
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配列番号３５４（Ｋ４４７を伴うＣＤ３Ｗ２４５－ＬＨ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）。
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配列番号７２５（ＣＤ３Ｗ２４５ Ｆａｂ－ＨＣ－Ｆｃ）
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配列番号７２６（ＣＤ３Ｗ２４５ Ｆａｂ－ＬＣ－Ｆｃ）
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配列番号３５１（ＣＤ３Ｂ３７６ Ｆａｂ－ＨＣ－Ｆｃ）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＡＧＡＧＴＧＧＴＣＣＣＡＧＡＣＴＣＧＴＧＡＧＡＣＣＣＴＣＴＣＡＡＡＣＡＣＴＣＡＧＴＴＴＧＡＣＴＴＧＴＧＣＣＡＴＣＴＣＡＧＧＣＧＡＴＴＣＡＧＴＴＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＴＧＣＡＧＣＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＴＴＡＧＧＣＡＧＴＣＡＣＣＴＡＧＴＣＧＣＧＧＴＣＴＴＧＡＡＴＧＧＣＴＴＧＧＧＣＧＴＡＣＡＴＡＣＴＡＴＣＧＣＴＣＴＡＡＡＴＧＧＴＴＧＴＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＴＧＴＧＴＣＣＧＴＧＡＡＧＡＧＣＣＧＡＡＴＣＡＣＣＧＴＡＡＡＣＣＣＴＧＡＴＡＣＣＴＣＣＡＧＧＡＡＴＣＡＧＴＴＣＡＣＡＴＴＧＣＡＡＣＴＧＡＡＴＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＴＧＣＡＣＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＣＣＧＡＧＧＡＴＡＴＡＧＣＡＧＴＡＧＣＴＴＣＧＡＣＴＡＴＴＧＧＧＧＡＣＡＡＧＧＧＡＣＡＣＴＣＧＴＴＡＣＣＧＴＴＡＧＴＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＴＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＧＴＧＴＡＣＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＧＣＣＣＴＣＧＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＴＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴ
配列番号３５２（ＣＤ３Ｂ３７６ Ｆａｂ－ＬＣ－Ｆｃ）
ＣＡＧＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＣＣＣＡＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＧＴＧＴＣＴＧＧＣＴＣＴＣＣＣＧＧＣＣＡＧＴＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＧＴＡＣＣＧＧＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＧＣＡＣＣＴＡＣＡＡＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＣＧＡＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＣＴＧＴＡＣＧＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＧＣＧＧＣＣＣＴＣＴＧＧＣＧＴＧＴＣＣＴＣＣＡＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＡＣＡＣＣＧＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＡＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＣＣＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＣＡＣＴＧＴＧＴＧＴＣＣＴＡＣＧＣＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＧＣＴＧＴＴＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＧＴＣＡＧＣＣＣＡＡＧＧＣＴＧＣＡＣＣＣＡＧＴＧＴＣＡＣＴＣＴＧＴＴＣＣＣＧＣＣＣＴＣＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＴＴＣＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＣＡＴＡＡＧＴＧＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＧＧＧＡＧＣＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＧＣＣＧＡＴＡＧＣＡＧＣＣＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＧＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣＣＴＣＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＡＣＡＡＣＡＡＧＴＡＣＧＣＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＴＣＣＣＡＣＡＧＡＡＧＣＴＡＣＡＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＣＡＣＧＣＡＴＧＡＡＧＧＧＡＧＣＡＣＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＣＣＴＡＣＡＧＡＡＴＧＴＴＣＡ
実施例４：ｈＫ２×ＣＤ３二重特異性抗体の生物物理学的特性評価
選択されたｈＫ２×ＣＤ３二重特異性抗体の親和性
ｈＫ２又はヒトＣＤ３に対する選択されたｈＫ２×ＣＤ３二重特異性抗体の親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。ＳＰＲは、複合体の形成及び解離時の質量の変化を測定することによって、２つの結合パートナー間の相互作用の強度を試験するための無標識技術である。抗体を、抗Ｆｃ抗体でコーティングされたセンサチップ上に捕捉し、続いて、様々な濃度並びに指定の会合及び解離時間で可溶性ｈＫ２（又は可溶性組換えＣＤ３）を注入した。解離後、表面を適切な溶液で再生して、次の相互作用の準備を行った。センサグラムを１：１ラングミュアモデルに適合させることによって、速度情報（オンレート及びオフレート定数）を抽出した。結合親和性（ＫＤ）は、速度定数の比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）として報告される。選択されたｈＫ２／ＣＤ３二重特異性抗体のＫＤ値を表４０に列挙する。
Figure 2023528350000060
選択されたｈＫ２×ＣＤ３二重特異性抗体の熱安定性
二重特異性抗体サンプルの熱安定性を、自動化Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ機器を使用してＮａｎｏＤＳＦ法によって決定した。サンプルを、３８４ウェルサンプルプレートから２４ウェルキャピラリーに装填することによって測定を行った。各サンプルについて、２回測定を行った。Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮａｎｏＤＳＦユーザインターフェース（溶融走査（Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｓｃａｎ）タブ）を使用して、実行のための実験パラメータを設定した。サンプルの熱走査は、１．０℃／分の速度で２０℃～９５℃に及んだ。二重ＵＶ技術は、発光波長３３０ｎｍ及び３５０ｎｍのトリプトファン及びチロシンの固有蛍光を監視し、この比（Ｆ３５０ｎｍ／Ｆ３３０ｎｍ）を温度に対してプロットして、展開曲線を生成する。Ｎａｎｏ ＤＳＦは、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４中に０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で、全ての分子のＴｍを測定するために使用する。測定されたＴｍ値を表４１に列挙する。
Figure 2023528350000061
ＡＣ－ＳＩＮＳ（親和性捕捉－自己相互作用ナノ粒子分光法）による自己会合能
ハイスループットスクリーニングアッセイを使用して、Ａｂ候補が自己相互作用する傾向を測定した。自己相互作用の傾向は、通常、低いＡｂ溶解度及び下流のＡｂ製造における課題につながる。このアッセイで、金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）をヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）捕捉抗体でコーティングし、その後、ポリクローナルヤギＩｇＧの存在下で、候補Ａｂとインキュベートした。自己会合した任意の候補Ａｂは、ＡｕＮＰに近接し、最大吸光度の波長（λｍａｘ）とも呼ばれる、ナノ粒子のプラズモン波長（λｐ）のシフトをもたらす。各候補Ａｂについてのシフトの大きさ（Δλｍａｘ）は、その自己会合の強度を示す。自己会合能を示さないものから高い自己会合能を示すものまで、適切な対照抗体を、このアッセイにおいて使用した。このアッセイにおいて試験された全ての分子は、自己会合についての危険性がないか、又は低いことを示した。
実施例５：二重特異性ｈＫ２×ＣＤ３抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの特性評価。
ｈＫ２×ＣＤ３二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害
生成された二重特異性抗体の細胞傷害能を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅプラットフォーム上でライブタイムラプスイメージングを使用するＴ－細胞媒介性細胞傷害アッセイを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで測定した。二重特異性抗体を、エフェクター：目標比（Ｅ：Ｔ比）３：１で、健常ドナーから単離された汎ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞の存在下で、ｈＫ２陽性細胞株ＶＣａＰ細胞において試験した。アポトーシスによる細胞死を、標的ＶＣａＰ細胞によって安定的に発現される色素からの蛍光シグナルを測定することによって監視した。
正常ドナー汎Ｔ細胞を、ＫＬＫ２＋ＶＣａＰ細胞と共インキュベートした。ＫＬＫ２×ＣＤ３二重特異性抗体を０～１００ｎＭで９６時間投与した。３：１のエフェクター対標的（Effector-to-Target、ＥＴ）比を使用した。（Ａ）標的細胞は、標的細胞死を定量化するためにリアルタイムでＩｎｃｕＣｙｔｅイメージングシステムによって測定された赤色核色素を安定的に発現していた。全体的な腫瘍細胞溶解を、ＶＣａＰ細胞のリアルタイム動態殺傷曲線のＡＵＣに基づいてグラフ化した（図８Ａ）。緑色蛍光カスパーゼ３／７試薬を使用して、標的細胞死からのアポトーシスシグナルを測定した。総カスパーゼ３／７活性を、リアルタイムカスパーゼ３／７活性曲線のＡＵＣに基づいてグラフ化した（図８Ｂ）。データは、試験した二重特異性ｈＫ２／ＣＤ３抗体が、時間の増加とともに生存ＶＣａＰ細胞の用量依存的減少を促進し、したがって、ＶＣａＰ腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死を誘導することを示した。二重特異性ｈＫ２×ＣＤ３抗体は、Ｔ細胞活性化の媒介に有効であり、用量依存的ＫＬＫ２＋腫瘍細胞殺傷を示す。
ｈＫ２×ＣＤ３二重特異性分子によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞活性化及び増殖
ｈＫ２×ＣＤ３二重特異性抗体を、Ｔ細胞活性化及び増殖を促進するそれらの能力について試験した。正常ドナー汎Ｔ細胞をＣＦＳＥ（５ｕＭ）で標識し、ＫＬＫ２（＋）ＶＣａＰ細胞と共培養した。ＫＬＫ２×ＣＤ３二重特異性抗体を０～１００ ｎＭで９６時間投与した。３：１のエフェクター対標的（ＥＴ）比を使用した。９６時間の共インキュベーション後、細胞を採取し、ＣＤ２５、生／死色素で染色した。Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアを備えるＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターでフローサイトメトリー分析を行った。ＣＴＶ色素希釈及び活性化マーカーＣＤ２５の存在比率を決定した。異なる用量でのＣＤ２５陽性細胞の存在比率を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ活性化をグラフ化した（図９Ａ）。増殖ゲートを、０ｎＭ処置群を使用して決定した。増殖ゲートに入った細胞の存在比率を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞増殖をグラフ化した（図９Ｂ）。データは、様々なＫＬＫ２×ＣＤ３二重特異性抗体によるＴ細胞の用量依存的活性化及び増殖を確認する。
ｈＫ２×ＣＤ３二重特異性分子によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞サイトカイン放出。
Ｔ細胞サイトカイン放出に対する抗ｈＫ２×ＣＤ３抗体の効果をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定した。上清サンプルを、上記のｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞傷害実験から収集した。１３プレックスサイトカインＬｕｍｉｎｅｘアッセイを実施して、ｈＫ２×ＣＤ３二重特異性抗体の異なる用量でのＩＦＮ－及びＴＮＦ－α濃度を定量化した。図１０Ａ及び図１０Ｂは、用量依存的な方法でＫＬＫ２×ＣＤ３二重特異性抗体によって誘発されるＴ細胞による機能的サイトカイン放出を示す。
Ｔ細胞ヒト化マウスにおける確立された皮下（subcutaneous、ＳＣ）ヒト前立腺異種移植モデルにおける二重特異性ｈＫ２×ＣＤ３抗体の有効性。
ＫＬＫ２×ＣＤ３二重特異性のｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を、ヒト前立腺腫瘍ＶＣａＰ皮下マウス異種移植モデルにおいて評価した。ＫＬＫ２×ＣＤ３分子の抗腫瘍有効性を、確立された皮下ヒト前立腺ＶＣａＰ異種移植片において評価した。完全なままの雄ＮＳＧマウスを使用して、ヒト腫瘍及びヒトＴ細胞を移植するための好適な宿主を提供した。ヒト前立腺細胞株ＶＣａＰは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した。ＶＣａＰ細胞を指数関数的成長中に採取し、マウスの右側腹部に０．２ｍＬの体積で１×１０７個の細胞を皮下注射した。２０ｅ６のヒトＴ細胞を各動物に腹腔内注射した。３つの用量レベルを５倍増加で評価した：０．２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、及び５ｍｇ／ｋｇ。二重特異性抗体を腹腔内経由で週に２回投与した。眼血液を、最初の腹腔内投薬の６時間後にサンプリングし、機能的サイトカインレベルを、Ｌｕｍｉｎｅｘベースのアッセイを使用して測定した。腫瘍体積及び体重測定値を、全ての研究を通して週２で収集した。パーセントデルタ腫瘍成長阻害（ΔＴＧＩ）を、処置群と対照群との間の平均腫瘍量の差として定義し、％ΔＴＧＩ＝（［（ＴＶｃ－ＴＶｃ０）－（ＴＶｔ－（ＴＶｔ０）］／（ＴＶｃ－ＴＶｃ０））×１００として計算し、式中、「ＴＶｃ」は、所与の対照群の平均腫瘍量であり、「ＴＶｃ０」は、所与の対照群の平均初期腫瘍量であり、「ＴＶｔ」は、治療群の平均腫瘍量であり、「ＴＶｔ０」は、治療群の平均初期腫瘍量である。ＴＧＩ％を（［ＴＶｃ－［ＴＶｔ］／ＴＶｃ）×１００として定義した。
本発明のＫＬＫ２×ＣＤ３化合物は、用量依存的な抗腫瘍効果を示し、すなわち、１ｍｇ／ｋｇでわずかな腫瘍増殖阻害を示し、５ｍｇ／ｋｇで抗腫瘍効果を示した。最初の投薬から６時間後のサイトカイン評価は、活性ＫＬＫ２×ＣＤ３化合物のバックグラウンドを超える機能的サイトカイン放出を示し、これはｉｎ ｖｉｖｏでの有効性と一致する。
実施例６．ＨＬＡ－Ｇ細胞株の生成。
ＭＨＣクラスＩタンパク質：ＨＬＡ－Ａ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８９２）、ＨＬＡ－Ｂ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１８４６４）、ＨＬＡ－Ｃ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ３０５０８）、及びＨＬＡ－Ｅ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１３７４７）を含む全てのＨＬＡの発現を欠く（したがって、ＮＫ細胞ベースの殺傷に好適である）Ｋ５６２慢性骨髄性白血病細胞株（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－２４３）を、ｐＣＤＨレンチウイルスベクターを使用して形質導入して、レンチウイルス粒子においてＨＬＡ－Ｇ１－ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）－β－２－ミクログロブリン（β２Ｍ、ＬＰＰ－ＣＳ－Ｚ７４１２－Ｉ００３５－０２－２００、Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ）又はヒトＨＬＡ－Ｇ（Ｃ４２Ｓ）－ＩＲＥＳ－β２Ｍ（ＬＰＰ－ＣＳ－Ｚ７４１２－Ｉ００３５－０１－２００、Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ）を発現させ、ＩＭＤＭ、１０％ＦＢＳ中で培養した。第１継代における、安定なＨＬＡ－Ｇ発現を確実にするための、
１０μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ、Ａ１１１３８０３）での選択。密度がおよそ３～４日毎に約３×１０６個／ｍＬに達したら、細胞を１：１０に分割した。
実施例７：ＨＬＡ－Ｇ抗体の生成。
抗ＨＬＡ－Ｇ抗体は、ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）トランスジェニックヒト化ラットを使用して生成した。ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）は、キメラヒト／ラットＩｇＨ遺伝子座（ラットＣＨ遺伝子座に連結された天然構成の２２個のヒトＶＨ、全てのヒトＤ及びＪＨセグメントを含む）を、完全なヒトＩｇＬ遺伝子座（Ｊκ－Ｃκに連結された１２個のＶκ及びＪλ－Ｃλに連結された１６個のＶλ）とともに含有する。（例えば、Ｏｓｂｏｒｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９０（４）：１４８１－１４９０を参照のこと）。したがって、このラットは、ラット免疫グロブリンの発現の減少を呈し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖及び軽鎖の導入遺伝子が、クラススイッチ及び体細胞変異を受けて、完全なヒト可変領域を有する高親和性キメラヒト／ラットＩｇＧモノクローナル抗体が生成される。ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）の調製及び使用、並びにこのようなラットが有しているゲノム改変は、国際公開第１４／０９３９０８号に記載されている。
ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）ラットを、組換えヒトＨＬＡ－Ｇ１又は組換えヒトＨＬＡ－Ｇ５のいずれかのαサブユニット、α１、α２、α及び３ドメインを含有するが、膜貫通領域を欠く、β２ｍサブユニット及びヒストンＨ２Ａに融合されたＨＬＡ－Ｇの可溶性アイソフォーム、ＨＬＡ－Ｇ１を発現するＫ５６２細胞、又はＣ４２Ｓ変異を有するＨＬＡ－Ｇ１細胞外ドメインをコードするＤＮＡを含む構築物を使用して免疫した（表４２）。場合によっては、安定性を高めるためにヒストンＨ２Ａペプチドを抗原に融合させた。表４２は、抗原の配列を示す。
Figure 2023528350000062
Figure 2023528350000063
Figure 2023528350000064
Figure 2023528350000065
Figure 2023528350000066
ＨＹＢ：４２０については、ＯｍｎｉＲａｔを、組換えヒトＨＬＡ－Ｇ１、ヒトＨＬＡ－Ｇ５、及びカニクイザルＭａｆａ－ＡＧ（ＨＬＡ－Ｇ１のホモログ）タンパク質を用いた反復免疫複数部位（Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｉｔｅ、ＲＩＭＭＳ）プロトコルに従うことによって、週２回、合計１２回の追加免疫のために免疫した。最終細胞追加免疫を、Ｋ５６２細胞由来のｈＨＬＡ－Ｇ１ Ｋ５６２発現細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２４３（商標））を使用して行った。血清力価は、免疫原をプレート上にコーティングした固相ＥＬＩＳＡによって決定した。流入領域リンパ節を、ハイブリドーマ生成のためのＦＯ骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１６４６（商標））とのリンパ球融合のために採取した。
ＨＹＢ：４２３に関しては、ＯｍｎｉＲａｔをヒトＨＬＡ－Ｇ ｐＤＮＡ（ｐＤＲ００００５７４４１（表３）；Ｃ＞Ｓバリアント）で脛骨筋を介して免疫し、その直後にｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔を複数回行った。ラットは、ヒト及びカニクイザルＨＬＡ－Ｇ過剰発現細胞の両方の組み合わせの最終追加免疫を受けた。流入領域リンパ節を収集し、ハイブリドーマ生成のためにＦＯ骨髄腫細胞と融合させた。
ＨＹＢ：４２１については、ＯｍｎｉＲａｔをヒトＨＬＡ－Ｇ ｐＤＮＡで各脛骨筋に免疫し、続いてｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔を行った。力価を評価し、２５日目に０～８００の範囲であった。ラットを数ヶ月間休ませ、次いでｐＤＮＡで更に免疫し、続いてヒトＨＬＡ－Ｇを外因的に過剰発現するＫ５６２細胞で最終追加免疫した。より低い流入領域リンパ節を下流のハイブリドーマ生成に使用した。
下流スクリーニングのための抗体クローンを選択するために、ハイブリドーマ上清を、ヒトＨＬＡ－Ｇのみを発現する細胞に結合し、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃを外因的に発現する細胞、又は細胞表面ＭＨＣクラスＩ抗原を発現しない野生型Ｋ５６２細胞には結合しないそれらの能力についてスクリーニングした。Ｋ５６２－ＨＬＡ－Ｇへの＞２０倍高い結合及びＫ５６２－ＨＬＡ－Ａ／Ｂ／Ｃへの１０倍低い結合（アイソタイプ対照と比較して）を示した上清を、ｖ領域配列決定及びクローニングのために選択した。モノクローナル抗体を、エフェクター機能を欠くサイレントフォーマット（ＩｇＧ４ ＰＡＡ又はＩｇＧ１ ＡＡＳ、ここで、「ＰＡＡ」は、ＥＵ番号付けにおけるＰ２２８Ｓ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａを示し、「ＡＡＳ」は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ｓの変異を示す）及び正常なエフェクター機能を有する活性フォーマット（ＩｇＧ１）の両方で生成した。抗体をＣＨＯ細胞からの上清中で発現させ、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって単離した。次いで、組換え抗体を、ＨＬＡーＧ発現細胞に対する選択性について、並びに組換えＨＬＡーＧ（ＭＨＧＷ２）に結合するそれらの能力について（上記のように）再スクリーニングした。これらの分析から、４８個の独特なｖ領域のパネルを同定し、８個の独特なｖ領域を更なる分析のために選択した。ＭＨＧＢ６８８及びＭＨＧＢ６９４に由来する、これらの８つのｖ領域のうちの２つは、それぞれＭＨＧＢ７３８及びＭＨＧＢ７３７をもたらすように生殖系列最適化した。
実施例８．抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の構造的特性評価
選択抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の可変ドメインは、ｆａｂフォーマット、ＶＨ－リンカーＶＬ配向のｓｃＦｖフォーマット、又はＶＬ－リンカー－ＶＨ配向のｓｃＦｖフォーマットで発現させた。
可変ドメインＶＨ、ＶＬ、及びＣＤＲ
表４３は、選択された抗ＨＬＡーＧ抗体のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を示す。表４４は、選択された抗ＨＬＡ－Ｇ抗体のＫａｂａｔ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を示す。表４５は、選択された抗ＨＬＡ－Ｇ抗体のＫａｂａｔ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を示す。表４６は、選択された抗ＨＬＡ－Ｇ抗体のＣｈｏｔｈｉａ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を示す。表４７は、抗ＨＬＡ－ＧのＣｈｏｔｈｉａ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を示す。表４８は、選択された抗ＨＬＡ－Ｇ抗体のＩＭＧＴ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を示す。表４９は、抗ＨＬＡ－ＧのＩＭＧＴ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を示す。表５０は、選択された抗ＨＬＡ－Ｇ抗体のＡｂＭ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を示す。表５１は、抗ＨＬＡ－ＧのＡｂＭ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を示す。
Figure 2023528350000067
Figure 2023528350000068
Figure 2023528350000069
Figure 2023528350000070
Figure 2023528350000071
Figure 2023528350000072
Figure 2023528350000073
Figure 2023528350000074
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生殖系列最適化
抗体のｖ領域配列を、潜在的な翻訳後修飾のリスク、生殖系列適合性、及びｓｃＦｖとしてフォーマットするそれらの能力について分析した。２つの抗体、ＭＨＧＢ６９４及びＭＨＧＢ６８８を、生殖系列最適化した。ＭＨＧＢ６９４のｖ領域は、２つの生殖系列変異（Ｅ４６Ｄ及びＮ７７Ｈ）を含有し、したがって、このｖ領域を、これらの部位における生殖系列配列へのこれらの残基の逆変異によって最適化して、ＶＨドメインにおけるＤ４６Ｅ及びＨ７７Ｎの変異によってＭＨＧＢ７３７可変領域を生成した。ＭＨＧＢ６８８のｖ領域は、ＶＨドメインにおけるＥ１Ｑ、Ｌ５Ｑ、Ｅ６Ｑ、及びＳ７１Ｐの変異によって、及びＶＬにおけるＫ３０Ｅ、Ｇ６６Ｖの変異によって同様に最適化した。本発明者らは、ＭＨＧＢ６８８が、脱アミド化のリスクを提示する９２～９３位（Ｋａｂａｔ）での「ＮＳ」モチーフも含有することを見出した。ＭＨＧＢ６７２のＶＬは、９２～９３位に「ＨＳ」を含有することを除いて、同一のＬＣ－ＣＤＲを有していたので、本発明者らは、Ｎ９２Ｈを変異させた。この変化の組み合わせは、ＭＨＧＢ７３８をもたらした。
Ｆａｂ－Ｆｃ及びｓｃＦｖ
ＨＬＡ－Ｇ特異的ＶＨ／ＶＬドメインを遺伝子操作して、抗体フォーマットで、又はｓｃＦｖとして、又は二重特異性抗体のアームとして（Ｆａｂ－Ｆｃ又はｓｃＦｖ－Ｆｃのいずれかとして）発現させた。抗体フォーマット及びＦａｂ－Ｆｃ二重特異性アームフォーマットは、ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３としての重鎖及びＶＬ－ＣＬとしての軽鎖を含み、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４として発現させた。ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットは、ＶＨ－リンカー－ＶＬ－Ｆｃ又はＶＬ－リンカー－ＶＨ－Ｆｃ配向のいずれかを含んだ。ｓｃＦｖに使用したリンカーは、上記の配列番号３１のリンカーであった。ｓｃＦｖ－Ｆｃ及びＦａｂ－Ｆｃを使用して、実施例１４に記載されるように二重特異性抗体を生成した。
表５２は、選択された抗ＨＬＡーＧ抗体のＨＣアミノ酸配列を示す。表５３は、選択された抗ＨＬＡーＧ抗体のＬＣアミノ酸配列を示す。表５４に、選択された抗ＨＬＡ－Ｇ抗体のＨＣ及びＬＣ ＤＮＡ配列番号を要約する。表５５は、ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨ配向の選択されたｓｃＦｖのアミノ酸配列を示す。表５６は、選択されたｓｃＦｖ－Ｆｃのアミノ酸配列を示す。表５７は、ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットの選択された抗ＨＬＡ－Ｇ抗体のｓｃＦｖ及びｓｃＦｖ－Ｆｃ ＤＮＡ配列番号を示す。
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配列番号５５７
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＧＣＴＡＴＣＡＧＣＧＧＣＧＡＴＡＧＣＧＴＧＡＧＣＴＣＣＡＡＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＧＡＧＣＣＣＴＡＧＣＡＧＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＣＴＧＧＧＣＡＧＧＡＣＣＴＡＣＴＡＣＡＧＧＡＧＣＡＡＧＴＧＧＴＡＣＡＡＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣＧＴＧＴＣＣＧＴＧＡＡＧＡＧＣＡＧＧＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣＣＣＣＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＡＴＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＣＡＧＣＧＴＧＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＧＧＣＧＡＣＡＧＡＡＧＧＴＡＣＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＧＣＣＴＧＣＣＴＴＴＣＧＣＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡ
配列番号５５８
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配列番号５５９
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配列番号５６０
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配列番号５６１
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配列番号５６２
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配列番号５６３
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配列番号５６６
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配列番号５６７
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配列番号５６８
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配列番号５６９
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配列番号５７７
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＡＧＣＧＧＡＣＣＴＧＧＴＣＴＧＧＴＴＡＡＧＣＣＴＴＣＣＣＡＡＡＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＴＴＧＴＧＣＴＡＴＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＡＧＴＧＴＴＡＧＣＴＣＣＡＡＴＡＧＧＧＣＡＧＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＡＧＡＣＡＧＴＣＣＣＣＡＡＧＣＣＧＴＧＧＡＣＴＴＧＡＧＴＧＧＣＴＴＧＧＡＣＧＴＡＣＴＴＡＴＴＡＣＡＧＧＡＧＴＡＡＡＴＧＧＴＡＣＡＡＴＧＡＴＴＡＴＧＣＣＧＴＴＴＣＴＧＴＧＡＡＧＡＧＣＣＧＴＡＴＴＡＣＴＡＴＡＡＡＣＣＣＡＧＡＴＡＣＴＴＣＴＡＡＡＡＡＴＣＡＡＡＴＴＴＣＣＣＴＴＣＡＧＣＴＣＡＡＣＴＣＡＧＴＴＡＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＴＡＣＴＧＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＣＧＣＡＡＧＡＧＴＴＣＧＡＣＣＴＧＧＣＡＴＴＣＣＣＴＴＣＧＡＴＴＡＴＴＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＧＡＣＡＣＣＣＧＴＴＡＣＴＧＴＧＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＴＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＴＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴ
配列番号５７８
ＧＡＴＡＴＴＧＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＡＧＡＴＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＴＡＡＧＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＣＧＧＧＣＴＡＣＴＡＴＴＡＡＣＴＧＴＡＡＧＴＣＴＴＣＣＣＡＧＡＧＴＧＴＡＴＴＧＴＴＣＴＣＴＴＣＡＡＡＴＡＡＣＡＡＡＡＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣＡＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＡＡＡＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＣＣＣＣＣＴＡＡＡＣＴＴＣＴＣＡＴＡＴＡＣＴＧＧＧＣＡＴＣＣＡＣＴＣＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＴＧＴＧＣＣＡＧＡＣＣＧＴＴＴＣＴＣＡＧＧＧＡＧＴＧＴＧＴＣＡＧＧＴＡＣＡＧＡＴＴＴＴＡＣＡＣＴＣＡＣＡＡＴＴＴＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＧＣＣＧＡＡＧＡＣＧＴＴＧＣＡＧＴＡＴＡＴＴＡＴＴＧＣＣＡＡＣＡＡＴＡＴＣＡＣＴＣＴＡＣＡＣＣＴＴＧＧＡＣＡＴＴＴＧＧＴＣＡＡＧＧＴＡＣＴＡＡＡＧＴＣＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＧＣＴＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＧＡＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＣＣＧＧＣＡＣＡＧＣＴＴＣＴＧＴＣＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＣＧＧＧＡＡＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＴＧＣＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＣＡＡＣＴＣＣＣＡＡＧＡＧＴＣＴＧＴＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＡＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＧＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＴＣＴＡＧＣＣＣＴＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＣＴＴＴＣＡＡＣＣＧＧＧＧＣＧＡＧＴＧＴ
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実施例９．抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の生物物理学的特性評価
抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の熱安定性。
元のｖ領域及び生殖系列最適化ｖ領域を、ｓｃＦｖフォーマットにおける熱安定性についてスクリーニングした。簡潔に述べると、ｖ領域をｓｃＦｖフォーマットにクローニングし、大腸菌において発現させた。培養上清を、組換えＨＬＡ－Ｇに結合するそれらの能力についてＥＬＩＳＡによって評価した。また、上清サンプルに５５、６０、又は６５℃のいずれかで熱ショックを与え、熱ショックを与えたサンプルの結合を非加熱サンプルと比較した。この分析は、ｓｃＦｖとしてフォーマットされた場合のｖ領域の熱安定性の推定値を提供した。この分析に基づいて、それぞれＭＨＧＢ６９４及びＭＨＧＢ６８８の生殖系列最適化バージョンであるＭＨＧＢ７３７及びＭＨＧＢ７３８が好ましかった。
図１２及び表５８は、ｓｃＦｖとしてフォーマットされた場合の熱処理後の組換えＨＬＡ－Ｇに結合するｖ領域の能力を示す。Ｖ領域を大腸菌からの上清においてｓｃＦｖとして発現させ、組換えＨＬＡ－Ｇに結合するそれらの能力についてＥＬＩＳＡによって分析した。サンプルを室温で、又は５５、６０、若しくは６５℃で１０分間熱処理した後に試験した。Ｂ２３は、アイソタイプ対照であった。
Figure 2023528350000107
結合特異性及び親和性
ＩｇＧ１ ｍＡｂフォーマットのｖ領域を、ＨＬＡ－Ｇを発現するが他のＭＨＣクラスＩ分子を発現しない細胞に特異的に結合するそれらの能力について試験した（表５９）。簡単に説明すると、１．５×１０７個の細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、７ｍＬの１×ＰＢＳに再懸濁し、１０分間インキュベートした。インキュベーション後、８ｍＬのウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加し、細胞を３００×ｇで５分間遠心分離することによって洗浄し、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中１×１０６個の細胞／ｍＬ
で再懸濁した。次いで、細胞を３００×ｇで５分間遠心分離することによって洗浄し、ヤギ抗ヒトＦｃ Ａ６４７（Ｊａｃｋｓｏｎカタログ番号１０９－６０６－０９８）を補充した染色緩衝液に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、１５０μＬの染色緩衝液を添加し、細胞を３００×ｇで５分間の遠心分離によって洗浄した。細胞を２００μＬのランニング緩衝液（１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％（ｖ／ｖ）プルロニック酸を補充した染色緩衝液）に再懸濁し、３００×ｇで５分間遠心分離することによって洗浄した。細胞を３０ｍＬのランニング緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリーによって抗体結合について分析した。
Figure 2023528350000108
次に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、ｍＡｂとして組換えＨＬＡ－Ｇに結合するそれらの能力について試験した。ＳＰＲは、複合体の形成及び解離時の質量の変化を測定することによって、２つの結合パートナー間の相互作用の強度を試験するための無標識技術である。簡潔に述べると、抗体をセンサチップ上に固定化し、これをヤギ抗ヒトＦｃと結合させた。可溶性ＨＬＡ－Ｇ１細胞外ドメイン（ＭＨＧＷ８）を、固定化した抗体上に流し、会合／解離応答を監視した。センサグラムを１：１ラングミュアモデルに適合させることによって、速度情報（オンレート及びオフレート定数）を抽出した。結合親和性（ＫＤ）は、速度定数の比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）として報告した。抗体親和性（Ｋｄ）は、約７７ｐＭ～２．６ｎＭの範囲であり、表６０に示される。
Figure 2023528350000109
実施例１０．リガンド遮断
ＨＬＡ－Ｇは、ある特定の腫瘍型上で過剰発現され、したがって、腫瘍細胞のマーカーとして機能することができる。更に、ＨＬＡ－Ｇは、ＮＫ細胞などの免疫エフェクター細胞上で発現されるリガンドＩＬＴ２及びＩＬＴ４に結合する４，５。ＨＬＡ－ＧとＩＬＴ２／ＩＬＴ４との間の相互作用は、ＮＫ細胞活性の阻害をもたらす。したがって、本発明者らは、ＩＬＴ２／４と競合的にＨＬＡ－Ｇに結合する抗体が、腫瘍細胞とＮＫ細胞との間の阻害性相互作用を防止し、ＮＫ媒介性腫瘍細胞殺傷の増加をもたらすと仮定した。この仮説に取り組むために、本発明者らはまず、競合アッセイを使用して、抗体がＨＬＡ－ＧとＩＬＴ２／４との間の相互作用を遮断し得るかどうかをアッセイした。ＨＬＡ－Ｇ－デキストラマー複合体とＩＬＴ２又はＩＬＴ４受容体を外因的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞との間の結合は、蛍光シグナルをもたらす。ＨＬＡ－Ｇ－デキストラマーとＩＬＴ－２／４細胞との間の相互作用と競合するｍＡｂの添加は、蛍光シグナルの減少をもたらす。蛍光シグナル阻害の逆数は、ｍＡｂのリガンド遮断阻害に関連した（表６０）。簡単に説明すると、組換えビオチン化ＨＬＡ－Ｇ１（ＭＨＧＷ８）は、ストレプトアビジンＡＰＣ－デキストラマー（Ｉｍｍｕｄｅｘカタログ番号ＤＸ０１－ＡＰＣ）に、１つのデキストラマー分子当たりおよそ４つのＨＬＡ－Ｇ１タンパク質の最終比まで結合した。デキストラマー－ＨＬＡ－Ｇ複合体を、ＩＬＴ－２を外因的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞又はＩＬＴ－４を外因的に発現する細胞と混合し、４℃で３０分間インキュベートした。抗ＨＬＡ－Ｇ抗体を各濃度で添加し、デキストラマー－ＨＬＡ－Ｇ複合体とともに３０分間、℃でインキュベートした。細胞を添加し（２５，０００細胞）、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞とデキストラマーＨＬＡ－Ｇ複合体との混合物を遠心分離によって洗浄し、３０μＬのランニング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ ＢＤカタログ番号５５４６５７）に再懸濁した。再懸濁した混合物を、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ（登録商標）ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ Ｐｌｕｓを使用するフローサイトメトリーによって蛍光シグナルについて分析した。ゲーティングは、最初に一重項細胞に対して、次いでＳｙｔｏｘ（商標）Ｂｌｕｅ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ染色剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して生細胞に対して、次いでＩＬＴ－２／４を発現する細胞についてはＧＦＰに対して、次いで結合したデキストラマー－ＨＬＡ－Ｇ複合体についてはＡＰＣに対して行った。ＭＨＧＢ７３７を除く全ての抗体は、ＩＬＴ４とのＨＬＡ－Ｇ相互作用を阻害することができ、ＭＨＧＢ７３７及びＭＨＧＢ６８７を除く全ての抗体は、ＩＬＴ２との相互作用を阻害することができた（表６１）。これは、このキャンペーンにおいて発見された抗体が、腫瘍を標的とし、腫瘍細胞による免疫阻害を軽減することの両方ができることを示唆した。
Figure 2023528350000110
実施例１１．エピトープのマッピング
次に、本発明者らは、このリガンド結合の阻害が、ＨＬＡ－Ｇ上の同じ結合部位に対するＩＬＴ２／４との直接競合によるものであるかどうかを問うた。この仮説に取り組むために、本発明者らは、水素－重水素交換ベースのＬＣ－ＭＳ（実施例９に記載される）を使用して、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－４、ＭＨＧＢ７３２、又はＭＨＧＢ７３８のいずれかについてのＨＬＡ－Ｇ上のエピトープを同定した（図１３）。ＭＨＧＢ７３２及びＭＨＧＢ７３８ Ａｂの両方の結合は、α３ドメイン（成熟蛋白のアミノ酸残基１９１～１９８、配列ＨＨＰＶＦＤＹＥ（配列番号６６７））における同じペプチドを強力に保護し、３０％未満の重水素化レベルでの平均変化をもたらした。このペプチドはまた、ＩＬＴ２の存在下で保護され、ＩＬＴ４の存在下ではより低い程度で保護された。ＭＨＧＢ７３２及びＭＨＧＢ７３８抗体は両方とも、成熟タンパク質、配列ＶＰＳの残基２４９～２５１からなる第２のエピトープを著しく保護した（１０％～３０％の重水素化レベルでの平均変化）。エピトープをＨＬＡ－Ｇ（ＰＤＢ ＩＤ １ＹＤＰ）６の結晶構造上にマッピングしたところ、ＭＨＧＢ７３２及びＭＨＧＢ７３８ Ａｂ並びにＩＬＴ２／４についてのエピトープがα３ドメインの膜近位領域に存在することが示された。
実施例１２．ＮＫ細胞ベースの細胞傷害に対する効果
次いで、本発明者らは、ＨＬＡ－ＧとＩＬＴ－２／４との相互作用の阻害が、ＮＫ細胞ベースの細胞傷害を介して抗腫瘍活性を媒介し得るかどうかを問うた。これに取り組むために、本発明者らは、各可変領域を、ＩｇＧ１、又はエフェクター機能を欠くサイレントＩｇＧ４－ＰＡＡ定常領域のいずれかにクローニングした。次いで、本発明者らは、Ｆｃ受容体を発現するＮＫ細胞（ＮＫ－９２）又はＦｃ受容体を欠くＮＫ細胞（ＮＫＬ）のいずれかによって媒介されるＫ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞の細胞傷害を媒介する各抗体の能力を試験した。簡潔に述べると、ＨＬＡ－Ｇ細胞を過剰発現するＫ５６２細胞を、細胞増殖色素として機能するカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（Carboxyfluorescein succinimidyl ester、ＣＦＳＥ）で標識した。抗体を、図１４Ａ～図１９Ｂにおける希釈に従って９６ウェルプレートに希釈した。Ｋ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞を抗体の各ウェルに添加し、４℃で１時間インキュベートした。ＮＫＬ細胞を約１００，０００個の細胞／ウェルで添加し、混合物をＩＬ２及びＮＫｐ４６（ＮＫＬ細胞を活性化するため）の存在下、４℃で一晩（ＮＫＬ細胞）又は４時間（ＮＫ－９２細胞）インキュベートした。細胞を遠心分離によって洗浄し、生／死染色を含む緩衝液中に再懸濁した。混合物を１３０μＬの染色緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａサイトメーターを使用してフローサイトメトリーによって分析した。ＮＫ受容体の非存在下で細胞傷害を媒介し得る抗体は、ＨＬＡ－ＧとＩＬＴ－２／４との間の免疫チェックポイント相互作用を遮断することを介してこの相互作用を媒介すると考えられた（図１４Ａ～図１９Ｂ）。本発明者らは、ＩＬＴ２を遮断することができる全ての抗体（ＭＨＧＢ６８７を除く全てのＡｂ）が、２４時間アッセイにおいてＫ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞に対するＮＫＬ細胞媒介性細胞傷害を増強することができた（図１４Ａ、図１５Ａ、図１６Ａ、図１７Ａ、図１８Ａ、図１９Ａ）が、ＩｇＧ１ベースの抗体のみがＦｃ受容体媒介性細胞傷害を増強することができたことを見出した。これは、Ｆｃ受容体媒介性エフェクター機能の非存在下であっても、リガンド遮断が重要な抗腫瘍機構として機能し得ることを示唆した。
実施例１３．ｍＡｂのエフェクター機能
本発明者らは、ＨＬＡ－Ｇを内因的に発現する絨毛がん細胞株ＪＥＧ－３（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－３６）に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して腫瘍細胞殺傷を更に媒介する抗体の能力を試験した（図２０）。抗体を、細胞内に一方向に浸透することができるＢＡＴＤＡ色素（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒカタログ番号Ｃ１３６－１００）で標識されたＪＥＧ－３細胞に添加した。細胞溶解時に、色素は、ユーロピウムを含有する溶液中に放出され、ユーロピウムは、色素と反応して蛍光キレートを形成し、その蛍光シグナルを測定することができる。一晩培養したＰＢＭＣを、５０：１のＥ：Ｔ比で、５，０００個の細胞／ウェルでＪＥＧ－３細胞に添加し、混合物を３７℃で４時間インキュベートした。細胞混合物をユーロピウム溶液に１：１０で添加し、室温で１５分間インキュベートし、６１０ｎｍでの蛍光を監視して、シグナルを決定した。１００％の殺傷についての蛍光シグナルを、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００界面活性剤と混合したＢＡＤＴＡ標識標的細胞を含有するウェルを使用して決定した。
抗ＨＬＡ－Ｇ Ａｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＡＤＣＣを示し得るので、本発明者らは、この活性が増強され得るか否かを問うた。いくつかの研究は、１０％未満の末端フコシル化Ｆｃを有する抗体が、Ｆｃ受容体へのより高い親和性結合に起因して、増強されたエフェクター機能を示すことを示した７。したがって、本発明者らは、低フコースＣＨＯ宿主においてＭＨＧＢ７３２及びＭＨＧＢ７３８を生成して、１０％未満の末端フコースを有する抗体（ＭＨＧＢ７３８．ＣＬＦ）を産生した（表６２、図２１Ａ～Ｄ）。陰性対照として、本発明者らは、Ｆｃ受容体に結合することができないＦｃ領域を有するＭＨＧＢ７３８のバージョンを生成し、このタンパク質をＭＨＧＢ７４５と称した。
正常フコース抗体及び低フコース抗体を、ＪＥＧ－３細胞（図２１Ａ）又はＲＥＲＦ－ＬＣ－Ａｄ－１細胞（ヒト肺腺がん細胞株、ＪＣＲＢ１０２０）（図２１Ｂ）いずれかに対するＮＫ細胞ベースのＡＤＣＣを誘導するそれらの能力について試験した。フコシルトランスフェラーゼ酵素を天然に低レベルで発現するＣＨＯ細胞中における重鎖及び軽鎖をコードする構築物を発現させることによって低フコース抗体を生成し、１０％未満のコアフコースを有する抗体の産生をもたらした。エフェクター細胞対標的細胞の比をグラフに示す。アッセイは、上記のＡＤＣＣアッセイと同じ方法で行った。ＭＨＧＢ７４５及びアイソタイプ対照の両方は、アッセイにおいてＡＤＣＣを誘導しなかった。２つのＩｇＧ１ Ａｂ、ＭＨＧＢ７３２、及びＭＨＧＢ７３８は、ＡＤＣＣを誘導することができたが、低フコースＦｃ領域を有する同じ抗体は、約１０倍増強されたＡＤＣＣ活性を示した。これは、ＡＤＣＣ増強が低フコース抗体の使用によって得られ得ることを示した。
次に、本発明者らは、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介する抗体の能力を試験した（図２１Ｃ及び図２１Ｄ）。簡潔に述べると、アッセイは、ＤＭＥＭ（ＪＥＧ－３）又はＲＰＭＩ（ＲＥＲＦ－ＬＣ－Ａｄ－１）を含有する１０％ＦＢＳ中で実行した。抗体を標的細胞に添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、１５～２０％（ストック濃度）のウサギ補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅカタログ番号ＣＬ３４４１－Ｓ）及び熱不活性化補体をそれぞれ２５μＬ／ウェルの体積でウェルに添加した。混合物を３７℃で４～１２時間インキュベートした。標的細胞溶解を、１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｒｅ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ９２４２）試薬の添加、続いて室温での１０分間のインキュベーションによって検出した。発光を、Ｔｅｃａｎ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ ＳＰＡＲＫ（登録商標）を用いて監視した。２つのＩｇＧ１抗体、ＭＨＧＢ７３２、及びＭＨＧＢ７３８は、ＣＤＣを媒介しなかった。ＩｇＧ１ Ａｂは、ＣＤＣを媒介することができなかったので、本発明者らは、ＣＤＣ活性を特異的に増強することが示されたＫ２４８Ｅ、Ｔ４３７Ｒ（ＲＥ）変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃにｖ領域をクローニングした８。ＩｇＧ１対応物と同一のｖ領域を有するこれらのＡｂは、ＣＤＣ活性を媒介することができた。本発明者らは、ＲＥ Ｆｃバリアントが低フコースＡｂにおけるＡＤＣＣ活性増強に影響を及ぼすかどうか、及び低フコースＦｃがＲＥ ＦｃバリアントのＣＤＣ活性に影響を及ぼすかどうかを問うた。低フコース宿主（１０％未満のフコシル化Ｆｃを有する）、ＭＨＧＢ７５２、及びＭＨＧＢ７５８において産生されたＲＥ Ａｂは、低フコースＩｇＧ１ Ａｂ ＭＨＧＢ７３２及びＭＨＧＢ７３８と同一のＡＤＣＣ活性を有した（図２１Ａ及び図２１Ｂ）。同様に、低フコース宿主において産生されたＲＥ Ａｂは、正常フコース宿主において産生されたＲＥ Ａｂと同一のＣＤＣ活性を有した（図２１Ｃ及び図２１Ｄ）。
Figure 2023528350000111
実施例１４：二重特異性ＨＬＡ－Ｇ×ＣＤ３抗体の生成
実施例７～１３で生成された抗ＨＬＡ－Ｇ抗体のＶＨ／ＶＬ領域及び実施例１の抗ＣＤ３抗体のＶＨ／ＶＬ領域を、二重特異性フォーマットに遺伝子操作し、ＩｇＧ１として発現させた。
ＨＬＡ－Ｇ×ＣＤ３二重特異性生成のためのＣＤ３ ｓｃＦｖ－Ｆｃ及びＣＤ３ Ｆａｂの遺伝子操作。
ＣＤ３特異的ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、及びＦａｂ－Ｆｃを、実施例３に記載されるように生成した。更に、ＣＤ３特異的ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、及びＦａｂ－Ｆｃは、米国特許出願公開第２０２０／００４８３４９号に記載されているＣＤ３Ｂ４５０、及びＳＰ３４－２抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５５１９１６）に由来するＣＤ３Ｂ２１９からのＶＨ／ＶＬ領域を用いて生成した。ヌル－ｓｃＦｖ－Ｆｃ及びＢ２３Ｂ６２－Ｆａｂ－Ｆｃを陰性対照として使用した。
ＣＤ３Ｂ４５０－ＬＨ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ（配列番号６８４）：
ＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣＴＧＴＳＳＮＩＧＴＹＫＦＶＳＷＹＱＱＨＰＧＫＡＰＫＶＭＩＹＥＶＳＫＲＰＳＧＶＳＮＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＶＳＹＡＧＳＧＴＬＬＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＧＳＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＧＧＳＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＩＳＧＤＳＶＦＮＮＮＡＡＷＳＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＲＴＹＹＲＳＫＷＬＹＤＹＡＶＳＶＫＳＲＩＴＩＮＰＤＴＳＫＮＱＦＳＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＳＳＳＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＳＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＶＹＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＡＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
ＣＤ３Ｂ２１９－ＬＨ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ（配列番号６８５）：
ＱＴＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＱＫＰＧＱＡＰＲＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＴＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＧＫＡＡＬＴＬＳＧＶＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＧＳＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＳＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＶＹＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＡＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
ヌル－ｓｃＦｖ－Ｆｃ（配列番号６８６）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＣＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＳＧＧＳＧＧＣＰＰＣＧＧＳＧＧＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＹＤＧＩＹＧＥＬＤＦＷＧＣＧＴＬＶＴＶＳＳＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＳＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＶＹＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＡＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
Ｂ２３Ｂ６２－Ｆａｂ－Ｆｃアーム重鎖（配列番号６８７）：
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＳＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＶＹＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＡＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
Ｂ２３Ｂ６２－Ｆａｂ－Ｆｃアーム軽鎖（配列番号６８８）：
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＡＳＱＳＶＤＹＮＧＩＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＰＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＩＩＥＤＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＣＤ３Ｂ２１９－Ｆａｂ－Ｆｃアーム重鎖（配列番号６８９）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＳＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＶＹＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＡＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
ＣＤ３Ｂ２１９－Ｆａｂ－Ｆｃアーム軽鎖（配列番号６９０）：
ＱＴＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＱＫＰＧＱＡＰＲＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＴＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＧＫＡＡＬＴＬＳＧＶＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ
ＨＬＡ－Ｇ／ＣＤ３二重特異性生成のためのＨＬＡ－Ｇ Ｆａｂ－Ｆｃの遺伝子操作
ＨＬＡ－Ｇ特異性ＶＨ及びＶＬ領域を、それぞれＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３及びＶＬ－ＣＬフォーマットに遺伝子操作した。Ｆｃサイレンシング変異Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ及び選択的ヘテロ二量体化を促進するように設計されたＣＨ３変異Ｔ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗを含む配列番号３２６のポリペプチドを使用して、ＨＬＡ－Ｇ特異性ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を生成した。
配列番号３６３又は３６４のポリペプチドを使用して、ＨＬＡ－Ｇ特異性ＶＬ－ＣＬを生成した。
ＨＬＡ－Ｇ Ｆａｂ－Ｆｃ ＨＣ及びＬＣのアミノ酸配列をそれぞれ表６３及び６４に示す。ＨＬＡ－Ｇ Ｆａｂ－Ｆｃ ＨＣ及びＬＣのｃＤＮＡ配列番号を表６５に列挙する。
Figure 2023528350000112
Figure 2023528350000113
Figure 2023528350000114
Figure 2023528350000115
Figure 2023528350000116
ＨＬＡ－Ｇ／ＣＤ３二重特異性生成のためのＨＬＡ－Ｇ ｓｃＦｖ－Ｆｃの遺伝子操作
実施例２に記載される配列番号３１のリンカー（表２）を使用してＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨ配向のいずれかのｓｃＦｖとして遺伝子操作されたＨＬＡ－Ｇ ＶＨ／ＶＬ領域を、Ｆｃサイレンシング変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ）及び選択的ヘテロ二量体化を促進するように設計されたＴ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗ変異を含むｓｃＦｖ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３フォーマットに更に遺伝子操作し、ＩｇＧ１として発現させた。配列番号３２１のポリペプチドを定常ドメインヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３として使用した。
ｓｃＦｖ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３フォーマット（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）の抗ＨＬＡ－Ｇ分子のアミノ酸配列を表６６に示す。ｓｃＦｖ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３フォーマット（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）の抗ＨＬＡ－Ｇ分子のｃＤＮＡ配列を表６７に列挙する。
Figure 2023528350000117
Figure 2023528350000118
ＨＬＡ－Ｇ×ＣＤ３二重特異性
上記のとおりＨＬ及びＬＨ配向の両方の、Ｆａｂ－Ｆｃとして遺伝子操作された抗ＣＤ３抗体ＣＤ３Ｂ３７６、ＣＤ３Ｂ４５０、ＣＤ３Ｂ２１９、及びＣＤ３Ｗ２４６のＶＨ／ＶＬ領域、並びにｓｃＦｖ－Ｆｃとして遺伝子操作された抗ＨＬＡ－Ｇ抗体ＭＨＧＢ７３８、ＭＨＧＢ７３２、及びＭＨＧＢ７３７のＶＨ／ＶＬ領域を発現させて、二重特異性抗体を生成し、フォーマットｓｃＦｖ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３のＨＬＡ－Ｇ結合アーム並びに重鎖：ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３及び軽鎖：ＶＬ－ＣＬのフォーマットのＣＤ３結合アームを有するＨＬＡ－Ｇ／ＣＤ３二重特異性抗体を得た（表６８）。Ｂ２３Ｂ６２－Ｆａｂ－Ｆｃアームを、ＣＤ３特異的アームのアイソタイプ対照として使用した。
あるいは、上記のとおり、ＨＬ及び／又はＬＨ配向のｓｃＦｖ－Ｆｃとして遺伝子操作された抗ＣＤ３抗体ＣＤ３Ｗ２４６、ＣＤ３Ｂ４５０、及びＣＤ３Ｂ２１９のＶＨ／ＶＬ領域（表６８を参照）、並びにＦａｂとして遺伝子操作された抗ＨＬＡ－Ｇ抗体ＭＨＧＢ７３８、ＭＨＧＢ７３２、及びＭＨＧＢ７３７のＶＨ／ＶＬ領域を発現させて、二重特異性抗体を生成し、重鎖ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３の及び軽鎖ＶＬ－ＣＬのフォーマットのＨＬＡ－Ｇ結合アーム並びにフォーマットｓｃＦｖ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３のＣＤ３結合アームを有するＨＬＡ－Ｇ／ＣＤ３二重特異性抗体を得た。抗ｓｃＦｖを生成するために使用されるリンカーは、配列番号３１のリンカーである（表６８）。
Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ ＣＨ３変異を１本の重鎖に遺伝子操作し、Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ ＣＨ３変異を上記のとおり他の重鎖に遺伝子操作した。加えて、ＨＫ２結合アーム及びＣＤ３結合アームの両方を、上記のとおりＦｃエフェクターサイレンシング変異Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓを含有するように遺伝子操作した。
遺伝子操作された鎖を発現させ、得られた二重特異性構築物を標準的な方法を使用して精製した。二重特異性は、実施例１５～１７に記載されるように、ＨＬＡ－Ｇ及びＣＤ３へのそれらの結合、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害、免疫チェックポイント応答、並びにｉｎ ｖｉｖｏ有効性について特性評価した。
Figure 2023528350000119
実施例１５．ＢｓＡｂフォーマッティング及びｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
腫瘍細胞に対するＴ細胞再指向は、臨床において重要な有望性を示しており、本発明者らは、ＨＬＡ－Ｇ及びＴ細胞受容体複合体のＣＤ３サブユニットを標的とする二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）が、ＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞に対して細胞傷害を示すかどうかを問うた。リードｖ領域を、一連のＣＤ３結合再指向アームを有するＢｓＡｂとしてフォーマットした（表６９）。簡潔に述べると、１ウェル当たり５０，０００個の細胞の標的細胞（ＮＣＩ－Ｈ２００９－ｂ２ｍ）を、１ウェル当たり１０ｎＭから開始して、半対数増分で連続的に増加させた濃度の抗体とともにインキュベートした。精製した初代Ｔ細胞を３：１の比で添加し、混合物を３７℃で７２時間インキュベートした。染色溶液を、１０＾６個の細胞当たり１ｕＬのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ近赤外染色剤（Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ、Ｌ３４９７６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１０＾６個の細胞当たり５ｕＬのＢｒｉｌｌｉａｎｔ ｖｉｏｌｅｔ抗ＣＤ２５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３０２６３０）をＢＤ ＦＡＣＳ染色緩衝液中に添加して調製した。細胞混合物を、フローサイトメトリーによる加算分析の前にＡｃｃｕｔａｓｅで解離させた。細胞をＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａ及びＣＦＳＥ（ＢＬ－１）対ＳＳＣ－Ａでゲーティングし、非生存腫瘍細胞を、ＣＦＳＥ（ＢＬ－１）対近赤外Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ（ＲＬ２－Ｈ）ゲーティングについて全腫瘍標的細胞集団によって同定した。ＦｏｒｅＣｙｔ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）アドバンストメトリクスを使用してデータを分析して、腫瘍の細胞傷害を計算した。全てのＢｓＡｂは、ＨＬＡ－Ｇ結合ｖ領域がＣＤ３結合アームと対になった場合にＴ細胞媒介性細胞傷害を増強する能力を示し、ＥＣ５０値は、ＨＬＡ－Ｇ標的アーム及びＣＤ３標的アームの両方の結合親和性と相関した（表６９）。
Figure 2023528350000120
ＢｓＡｂを、追加の細胞株Ｈｕｐ－Ｔ３及びＲＥＲＦ－ＬＣ－Ａｄ－１に対するＴ細胞活性化及びＴ細胞ベースの細胞傷害を媒介するそれらの能力について更に試験した（図２２Ａ～図２２Ｄ）。図２２Ａ～図２２Ｄは、ＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞に対するＨＣ３Ｂ１２５によって媒介される細胞傷害を示す。
２つのＢｓＡｂ、ＨＣ３Ｂ１２５、及びＨＣ３Ｂ２５８は、重鎖におけるＣ末端リジン、Ｋ４４７を発現するためのコドンの存在（ＨＣ３Ｂ２５８）又は非存在（ＨＣ３Ｂ１２５）のみが異なっていた。抗体の重鎖のＣ末端リジンは、通常タンパク質分解的に処理されるので、２つのＡｂは、同一の質量スペクトルを示した（表７０）。更に、それらは、Ｔ細胞及びＫ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞の両方に対する熱安定性及び結合親和性などの同一の生物物理学的特性を示した。更に、ＨＣ３Ｂ２５８は、ＨＣ３Ｂ１２５と同様の細胞傷害特性を示した（図２３）。
Figure 2023528350000121
実施例１６．免疫チェックポイント応答の観察
本発明者らは、細胞傷害の機構がエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ）を特徴とする抗ＨＬＡ－Ｇ ｍＡｂ、及びＣＤ３×ＨＬＡ－Ｇ ＢｓＡｂが、ＨＬＡ－Ｇを発現する全ての細胞型の殺傷を誘導し得ることを観察した。腫瘍は、多くの場合、ＰＤ－Ｌ１又はＣＴＬＡ－４などの免疫細胞を阻害することができる、ある特定の免疫チェックポイントモジュレーターの上方制御を介して免疫監視を逃れる９。したがって、本発明者らは、ＣＤ３×ＨＬＡ－Ｇ ＢｓＡｂを介したＴ細胞媒介性細胞傷害のためにがん細胞を標的化することが、腫瘍細胞上の免疫チェックポイントモジュレーターの発現を克服することができるかどうかを問うた。本発明者らは、ＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞が免疫チェックポイントリガンドを発現したかどうかを測定した（表７１）。簡潔に述べると、細胞を実施例１１のように培養し、次いで、表７１に示される受容体を標的とする市販の抗体で染色した。フローサイトメトリーを用いて蛍光を測定して、各受容体の相対的発現レベルを決定した。興味深いことに、本発明者らは、ＲＥＲＦ－ＬＣ－Ａｄ１細胞が他の標的細胞よりも有意に高いレベルでＰＤ－Ｌ１を発現すること、及びＣＤ３×ＨＬＡ－Ｇ ＢｓＡｂがＲＥＲＦ－ＬＣ－Ａｄ１細胞に対するＴ細胞ベースの細胞傷害を依然として媒介し得ることを観察した（図２２Ａ～図２２Ｄ）。本発明者らは、Ｔ細胞ベースの細胞傷害のための腫瘍細胞上のＨＬＡ－Ｇのα３ドメインを標的とする本発明者らのＡｂが、腫瘍細胞上の免疫チェックポイントリガンド発現を克服することができたことを観察した。
Figure 2023528350000122
実施例１７．ｉｎ ｖｉｖｏ有効性
患者におけるＨＬＡ－Ｇ発現と予後不良との間の相関は、ほとんどのタイプのがんにおいて確立されているが、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍エスケープにおけるＨＬＡ－Ｇの直接的な役割は、これまで実証されていない。ＨＬＡ－Ｇのマウス相同体は存在しないが、ＩＬＴ－２は存在し、したがって、ＨＬＡ－Ｇの役割の研究は、異種移植モデル及びヒト化マウスを必要とする。
Ａｂ及びＢｓＡｂを、一連のマウス研究においてｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍有効性を媒介するそれらの能力について試験した。図２４Ａ～図２４Ｂ、表７２に示される研究は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからのヒト化雌ｈＮＳＧ－ＳＧＭ３マウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１ＷｊｌＴｇ（ＣＭＶ－ＩＬ３、ＣＳＦ２、ＫＩＴＬＧ）に皮下移植された膵臓腫瘍モデルＰＡＸＦ１６５７（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｇｅｒｍａｎｙ ＧｍｂＨ）を用いた有効性実験からなった。３人の異なるドナー（＃２５９５、＃２５９７、及び＃５８６７）からのヒト臍帯血由来のＣＤ３４＋造血幹細胞（hematopoietic stem cell、ＨＳＣ）を移植されたマウスは、移植の１０～１１週間後に、ＨＳＣの十分な程度の生着（２５％を超えるヒトＣＤ４５＋細胞）について、配給業者によってチェックされた。ＰＡＸＦ１６５７腫瘍を到着の１８日後に移植し、生着の程度を無作為化の２日前に再チェックした。実験は、それぞれ１つのＰＡＸＦ１６５７腫瘍を有する１０匹又は１１匹のマウスの８つの群で構成された。絶対腫瘍体積（absolute tumor volume、ＡＴＶ）を、無作為化の日に、次いで週２回、デジタルキャリパー（Ｓ＿Ｃａｌ ＥＶＯ Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いた二次元測定によって決定した。腫瘍体積は、式：腫瘍体積＝（ｌ×ｗ２）×０．５（式中、ｌ＝腫瘍の最大直径及びｗ＝幅（垂直直径）（ｍｍ単位））に従って計算した。４６．７ｍｍ３～１１７．７ｍｍ３の腫瘍体積で、３人のドナーからのＨＳＣを用いてヒト化されたマウスの群の間で可能な限り均一な分布を同時に確保しながら、同等の群平均及び中央値腫瘍体積を目指して、マウスを８つの群に分配した。各抗体を２つ又は３つの用量レベルで評価し、０、３、７、１０、１４、１７、２１、２４日目に投与した（静脈内、２回／週）。ビヒクル対照群を参照として用いて、全ての群の抗腫瘍有効性を評価した。腫瘍成長阻害（Tumor growth inhibition、ＴＧＩ）は、対照群における変化に対する試験群の腫瘍体積の変化の比較によって処置期間の終わりに決定され、パーセントでデルタＴＧＩ値（本文ではＴＧＩと示される）として表される。ＴＧＩは、次式：デルタＴＧＩｘ［％］＝（１－平均（Ｔｘ－Ｔ０）／平均（Ｃｘ－Ｃ０））×１００に従って、絶対腫瘍体積を使用して計算し、式中、Ｔ０及びＣ０は、処置の開始時（すなわち無作為化の日）の試験群及び対照群における絶対腫瘍体積であり、Ｔｘ及びＣｘは、処置期間の終わりの対応する絶対腫瘍体積である。これは、この研究において２５日目であった。実験は、２７日目に終了した。ＨＣ３Ｂ１２５は、ｈＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスにおける腫瘍モデルＰＡＸＦ１６５７の成長を著しく阻害した。ビヒクル対照群と比較した腫瘍成長阻害は、評価された３つ全ての用量レベルについて統計的に有意であった（Ｄｕｎｎポスト検定と組み合わせたＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定、表５０）。腫瘍は、０．００２ｍｇのＨＣ３Ｂ１２５群の６／１１匹の動物、０．００６ｍｇの８／１１匹の動物、及び０．０２ｍｇの９／１１匹の動物において完全に退縮した。実験の終わりに、０．００２ｍｇ／０．００６ｍｇ／０．０２ｍｇのＨＣ３Ｂ１２５群において、それぞれ６／７／６匹の腫瘍のない生存者がいた。
腫瘍成長は、試験したいずれの用量レベルにおいてもＨＣ３Ｂ１２８によって阻害されなかった。対照群と比較して高用量のＨＣ３Ｂ１２８で群平均腫瘍体積のわずかな減少が観察されたが、その差は、統計的に有意ではなかった（表７１）。
Figure 2023528350000123
 ｎ／ａ＝該当なしｎ．ｒ．＝到達していない（すなわち、群中央値ＲＴＶは、常に２００％／４００％未満である）。
抗体のビヒクル：ＰＢＳ
２各群におけるデルタＴＧＩ値は、腫瘍成長阻害のセクションに示される式に従って、最後の２ＱＷ処置が投与された後の最初の測定日（２５日目）に計算し、追加のＴＧＩ、Ｔ／Ｃ、及び腫瘍退縮値については、付録１を参照されたい。
３腫瘍退縮のセクションに従って、部分的（ＰＲ）及び完全な退縮（ＣＲ）を決定した。ＴＦＳ：腫瘍のない生存者、Ｔｄ、腫瘍二倍加時間、ｔｑ、腫瘍四倍化時間。
ＨＣ３Ｂ１２５での処置はまた、ＨｕＰ－Ｔ３細胞株由来異種移植片（ＣＤＸ）モデルにおいて腫瘍増殖阻害をもたらし得た（図２５、表７３）。研究は、Ｔ細胞ヒト化ＮＳＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）マウスに皮下移植された膵臓腫瘍モデルＨｕＰ－Ｔ３（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（５０％Ｃｕｌｔｒｅｘ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）における１０ｅ６個の細胞／マウス）を用いた有効性実験からなった。実験は、それぞれ１つのＨｕＰ－Ｔ３腫瘍を有する１０匹のマウスの６つの群を含んだ。７日目に、７５ｍｍ３～１５０ｍｍ３の腫瘍体積で、同等の群平均及び中央値腫瘍体積を有することを目的として、マウスを６群に無作為化した。マウスに、
無作為化と同日の無作為化後に、Ｔ細胞を腹腔内移植した（２０ｅ６個の細胞／マウス、０．２ｍＬ／動物、ＡＬＬＣＥＬＬＳ ６０９３ Ｔ細胞ドナー）。ＨＣ３Ｂ１２５抗体を５つの用量レベルで評価した。全ての群の抗腫瘍効果を、参照としてヌル×ＣＤ３処置群を用いて評価した。処置は、Ｔ細胞生着の１日後に開始し、８、１１、１４、１７、２１、２４、２８、３１、３５、３８、４２、４８日目に行った（腹腔内、２回／週）。腫瘍成長阻害は、処置期間の終わりに、ヌル×ＣＤ３処置対照群の群平均腫瘍体積の変化に対する試験群の群平均腫瘍体積の変化の比較によって決定し、パーセントでデルタＴＧＩ値（本文ではＴＧＩと示される）として表した。腫瘍移植後４２日目を最終日としてＴＧＩ計算に使用した。実験は、４６日目に終了した。ＨＣ３Ｂ１２５は、ｈＮＳＧマウスにおける腫瘍モデルＨｕＰＴ３の成長を著しく阻害した。ヌル×ＣＤ３処置対照群と比較した腫瘍成長阻害は、評価した５つ全ての用量レベルについて統計的に有意であった（表７３）。
Figure 2023528350000124
参考文献
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実施例１８．二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３の生成
トランスジェニックマウス（Ａｂｌｅｘｉｓ（登録商標））及び実施例１の抗ＣＤ３抗体のＶＨ／ＶＬ領域を使用して生成された抗デルタ様リガンド３（ＤＬＬ３）抗体のＶＨ／ＶＬ領域を、二重特異性フォーマットに遺伝子操作し、ＩｇＧ１として発現させた。更に、米国特許出願公開第２０２０／００４８３４９号に記載されているＣＤ３特異的抗体ＣＤ３Ｂ３７６及びＣＤ３Ｂ４５０のＶＨ／ＶＬ領域を使用した。
設計された重鎖分子を、
ＩｎＦｕｓｉｏｎ法（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）を使用するライゲーション非依存的クローニングのために、５’末端及び３’末端に１５ｂｐの重複を含有するｇｂｌｏｃｋ（ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）に合成した。全ての軽鎖構築物を、ヒトκ定常ドメインへのインフレームライゲーションのために、ＢｓｗｉＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含有するｐＬｏｎｚａベクターに挿入した。マウスＩｇＨシグナルペプチドをコードして、ｍＡｂの培養上清への効率的な分泌を可能にした。全てのｇｂｌｏｃｋを滅菌水中で再構成し、製造業者のプロトコルに従って５０℃で１０分間インキュベートした。ｐＬｏｎｚａベクター（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて線状化し、続いてゲル抽出及びクリーンアップを行った。線状化ベクター対インサートの２：１の質量比を使用し、続いて５０℃で１５分間、熱パルスを行った。注入反応を大腸菌（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）に形質転換し、得られたコロニーをミニプレップのためにスケーリングした。全ての構築物は、エンドトキシンを含まないｍａｘｉ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して配列検証し、スケールアップさせた。
二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３生成のためのＣＤ３及びＤＬＬ３ ｓｃＦｖの遺伝子操作
ＣＤ３ ＶＨ／ＶＬ領域を、配列番号３１のリンカーを使用してＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨ配向のいずれかのｓｃＦｖとして遺伝子操作した（表２）。ＣＤ３に結合するＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨのｓｃＦｖ分子を、Ｆｃサイレンシング変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ）、及び二量化変異を含むｓｃＦｖ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３フォーマットに更に遺伝子操作し、ＤＬＬ３及びＣＤ３重鎖のヘテロ二量体を可能にした。
ＤＬＬ３ ＶＨ／ＶＬ領域を、配列番号３１の上記のＣＤ３ ｓｃＦｖ生成と同じリンカーを使用して、ＶＬ－リンカー－ＶＨ配向のｓｃＦｖとして遺伝子操作した（表２）。ＤＬＬ３に結合するＶＬ－リンカー－ＶＨ ｓｃＦｖ分子を、Ｆｃサイレンシング変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ）を含むｓｃＦｖ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３フォーマットに更に遺伝子操作した。Ｆｃドメインの選択的ヘテロ二量体化を促進するように設計された変異もまた、Ｆｃドメインにおいて遺伝子操作した。
ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性生成のためのＣＤ３及びＤＬＬ３ Ｆａｂの遺伝子操作
ＣＤ３及びＤＬＬ３特異的ＶＨ及びＶＬ領域もまた、それぞれＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３及びＶＬ－ＣＬフォーマットに遺伝子操作し、ＩｇＧ１として発現させた。Ｆｃサイレンシング変異Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５ＳをＦｃ領域に導入した。Ｆｃドメインの選択的ヘテロ二量体化を促進するように設計された変異もまた、Ｆｃドメインにおいて遺伝子操作した。
二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の発現
二重特異性抗体を、製造業者の推奨に従って精製プラスミドＤＮＡでの一過性トランスフェクションによってＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞において発現させた。簡潔に述べると、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞を、３７℃、８％ＣＯ２、及び１２５ＲＰＭに設定された軌道振動インキュベーター内で、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ２９１００）中に懸濁させて維持した。細胞を継代し、トランスフェクションの前に、６．０×１０６個の細胞／ｍＬに希釈し、細胞生存率を９９．０％以上で維持した。一過性トランスフェクションは、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯトランスフェクションキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ２９１３１）を使用して行った。トランスフェクトされる希釈された細胞１ｍＬ毎に、ＨＣ１：ＬＣ１：ＨＣ２＝１：２：２の比での０．５マイクログラムの各二重特異性抗体をコードするＤＮＡ、及び０．５マイクログラムのｐＡｄＶＡｎｔａｇｅ ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ１７１１）を使用し、ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）ＳＦＭ複合体形成培地中に希釈した。細胞１リットル毎に、２．５６ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬を８ｍＬのＯｐｔｉＰＲＯ（商標）に希釈した。希釈したＤＮＡ及びトランスフェクション試薬を１分間組み合わせ、ＤＮＡ／脂質複合体を形成させ、次いで細胞に添加した。一晩インキュベートした後、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）フィード及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯエンハンサーを、製造業者の標準プロトコルのとおり、細胞に添加した。細胞を軌道振盪（１２５ｒｐｍ）しながら、３７ｏＣで７日間インキュベートした後、培養ブロスを採取した。一過的にトランスフェクトされたＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞からの培養上清を、遠心分離（３０分、３０００ｒｃｆ）、続いて濾過（０．２μｍのＰＥＳ膜、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）によって浄化した。
二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３の精製
濾過した細胞培養上清を、ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ １５０クロマトグラフィーシステムを使用して、予め平衡化した（１×ＤＰＢＳ、ｐＨ７．２）ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に装填した。装填後、カラムを５カラム体積の１×ＤＰＢＳ、ｐＨ７．２で洗浄した。タンパク質を、８カラム体積の０．１Ｍ酢酸ナトリウム（Ｎａ）、ｐＨ３．５で溶出した。タンパク質画分を、２．５Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．２を最終体積の１５％（ｖ／ｖ）まで添加することによって完全に中和し、シリンジ濾過した（０．２μｍ）。中和されたタンパク質溶液を、２×５ｍＬのプレパックされたＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＧ－ＣＨ１ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｒｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に装填した。カラムを１０カラム体積の１×ＤＰＢＳ、ｐＨ７．２で洗浄した。タンパク質を、１０カラム体積の０．１Ｍ酢酸ナトリウム（Ｎａ）、ｐＨ３．５で溶出した。タンパク質画分を、２．５Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．２を最終体積の１５％（ｖ／ｖ）まで添加することによって完全に中和した。主要なピーク画分をプールし、１×ＤＰＢＳ、ｐＨ７．２中に透析し、合計３回透析交換し、濾過した（０．２μｍ）。
表７４～７７は、選択ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体の配列情報を示す。
Figure 2023528350000125
Figure 2023528350000126
Figure 2023528350000127
Figure 2023528350000128
Figure 2023528350000129
Figure 2023528350000130
＞配列番号７０５（ＤＬ３Ｂ５８２及びＤＬ３Ｂ５８３におけるＤＬ３Ｂ２７９－Ｆａｂ－Ｆｃ ＨＣ１ ｃＤＮＡ）
ＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＴＧＧＴＣＣＡＧＡＧＴＧＧＴＧＣＣＧＡＡＧＴＡＡＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＡＧＣＡＴＣＣＧＴＡＡＡＧＧＴＧＴＣＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＡＧＴＧＧＣＡＡＴＡＣＴＴＴＣＡＣＴＡＡＣＴＡＴＴＡＣＡＴＣＣＡＴＴＧＧＧＴＣＣＧＡＣＡＡＧＣＣＣＣＣＧＧＡＣＡＡＧＧＡＴＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＴＡＴＴＡＴＣＡＡＣＣＣＣＴＣＣＧＧＴＧＧＧＴＣＴＡＣＴＴＣＴＴＡＣＧＣＴＣＡＡＡＡＡＣＴＣＣＡＧＧＧＣＣＧＡＡＴＧＡＣＡＡＴＧＡＣＡＣＧＣＧＡＣＡＣＣＴＣＡＡＣＴＴＣＡＡＣＣＧＴＴＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＴＡＧＣＡＧＴＣＴＴＣＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＴＴＴＧＣＧＣＴＡＧＧＣＡＧＧＧＧＣＣＴＴＴＣＡＴＡＧＧＡＧＡＣＧＣＴＴＴＴＧＡＣＡＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＡＡＣＡＡＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＡＧＴＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＴＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＧＴＧＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＣＴＣＡＣＣＴＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＴＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴ
＞配列番号７０６（ＤＬ３Ｂ５８２及びＤＬ３Ｂ５８３におけるＤＬ３Ｂ２７９－Ｆａｂ－Ｆｃ ＬＣ１ ｃＤＮＡ）
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＞配列番号７０７（ＤＬ３Ｂ５８５及びＤＬ３Ｂ５８７におけるＤＬ３Ｂ２７９ ＬＨ ｓｃＦｖ－Ｆｃ ｃＤＮＡ）
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＞配列番号７０８（ＤＬ３Ｂ２７９ ＬＨ ｓｃＦｖバリアント－Ｆｃ ｃＤＮＡ）
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＞配列番号７０９（ＤＬ３Ｂ２７９ ｓｃＦｖ－ＦｃバリアントＫＩＨ ｃＤＮＡ）
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＞配列番号７１０（ＣＤ３Ｗ２４５ ＬＨ ｓｃＦｖ－Ｆｃ ｃＤＮＡ）
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＞配列番号７１１（ＣＤ３Ｗ２４５ ＨＬ ｓｃＦｖ－Ｆｃ ｃＤＮＡ）
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＞配列番号７１２（ＣＤ３Ｗ２４５ Ｆａｂ－Ｆｃ ＨＣ２ ｃＤＮＡ）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＧＡＴＡＴＡＡＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＴＣＣＡＴＴＡＧＴＡＣＴＡＧＴＡＧＴＡＡＴＴＡＣＡＴＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＴＣＡＣＴＧＧＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＧＣＧＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＡＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＡＣＧＡＧＡＧＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＴＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＴＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＧＴＧＴＡＣＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＧＣＣＣＴＣＧＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＴＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴ
＞配列番号７１３（ＣＤ３Ｗ２４５ Ｆａｂ－Ｆｃ ＬＣ２ ｃＤＮＡ）
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＞配列番号７１４（ＣＤ３Ｂ３７６ Ｆａｂ－Ｆｃ ＨＣ２ ＫＩＨ ｃＤＮＡ）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＣＣＣＴＡＧＡＣＴＣＧＴＧＣＧＧＣＣＴＴＣＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＡＣＣＴＧＴＧＣＣＡＴＣＴＣＣＧＧＣＧＡＣＴＣＣＧＴＧＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＴＣＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＴＣＧＣＧＧＴＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＣＧＧＴＣＧＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＧＣＴＣＴＡＡＡＴＧＧＣＴＧＴＡＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣＧＴＧＴＣＣＧＴＧＡＡＧＴＣＣＣＧＧＡＴＣＡＣＣＧＴＧＡＡＣＣＣＴＧＡＣＡＣＣＴＣＣＣＧＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＣＴＣＣＧＴＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＡＧＧＣＴＡＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＧＡＣＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＣＴＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＧＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＧＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＧＣＣＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＧＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＧＧＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＴＣＴＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＡＡＡＡ
＞配列番号７１５（ＣＤ３Ｂ３７６ Ｆａｂ－Ｆｃ ＬＣ ＫＩＨ ｃＤＮＡ）
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実施例１９．二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の特性評価
二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３媒介性細胞傷害に対するＤＬＬ３エピトープの効果
ＤＬＬ３＋標的細胞に対する二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３媒介性殺傷に対するＤＬＬ３エピトープの効果を決定するために、エフェクターとしてヒト汎Ｔ細胞及び標的としてＳＨＰ－７７細胞を３：１の比で使用して、７２時間、Ｔ細胞再指向を実施した。２０ｎＭからの１／２対数希釈（１０ｎＭで最終開始）における等容量（１００ｕＬ）の２×試験サンプルを、最終容量２００ｕＬのＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ中で１５０，０００個の汎Ｔ細胞と混合した５０，０００個のＣＳＦＥ標識ＳＨＰ－７７細胞に３７℃で７２時間添加した。７２時間後、プレートをＰＢＳで１回洗浄し、染色緩衝液中で近赤外Ｌ／Ｄ染色剤及びＢＶ４２１標識抗ＣＤ２５抗体とともに２０分間インキュベートした。細胞を染色緩衝液で２回洗浄し、２５ｕＬのＡｃｃｕｔａｓｅ中に１０分間再懸濁し、次いで２５ｕＬのＱＳｏｌ緩衝液を添加した。プレートをＩＱｕｅ ｐｌｕｓで読み取り、細胞をＣＳＦＥ陽性集団（腫瘍細胞）及びＣＳＦＥ陰性細胞（Ｔ細胞）でゲーティングし、続いて両方の集団を生／死染色でゲーティングした。生存Ｔ細胞を更にＣＤ２５染色でゲーティングした。算出された出力は、腫瘍殺傷％、ＣＤ２５ Ｔ細胞活性化％、及びＴ細胞生存率であった。ルビーレッド染色対照（偽１００％死亡）及びＴ細胞のみ／ＳＨＰ－７７のみを使用して、デブリからの細胞を含有する核、次いで個々の細胞集団をゲーティングした。データを、ＧｅｎｅＤａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｒにおいて、４つのパラメータ曲線フィットを使用して分析した。以下の表は、様々なＣＤ３アームと対になった各ＤＬＬ３結合剤について７２時間の終わりに観察されたＳＨＰ－７７細胞の最大溶解パーセントを示す。結果は、腫瘍殺傷％がＤＬＬ３上の結合エピトープに依存し、膜から離れるほど細胞溶解が少ないことを示す（表７８～８０）。ＤＬＬ３結合エピトープがより膜近位になるにつれて、腫瘍殺傷％は、改善された。この傾向は、ＤＬＬ３結合剤を３つの異なるＣＤ３と対にした場合、比較的一貫している。
本発明者らは、予想外にも、ＤＬＬ３内の結合ドメインが一次配列のＣ末端に向かって、又は腫瘍膜の近位に移動するにつれて、各ドメインにおける最大殺傷が増加するという興味深い傾向が現れることを発見した。特に、最大死滅効率は、ＥＧＦ２からＥＧＦ６へと改善し、試験された抗体がＥＧＦ－６ドメインで、又はＣ末端のより近くで結合する場合、最も高いパーセンテージに達する。
Figure 2023528350000131
Figure 2023528350000132
Figure 2023528350000133
ＤＬＬ３に対する二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の結合親和性
組換えヒトＤＬＬ３に対する抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定した。抗体をヤギ抗Ｆｃ抗体修飾Ｃ１チップ上に捕捉し、９０ｎＭ～１．１ｎＭの濃度に及ぶＤＬＬ３抗原の３倍連続希釈で滴定した。１００μＬ／分の流速を使用して、会合を２分間、解離を５又は６０分間、監視した。生の結合データを、ブランクから分析物結合シグナルを差し引くことによって参照し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ評価ソフトウェアを使用する１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを使用して分析して、結合親和性を計算するために使用される動態を得た。組換えヒトＤＬＬ３に対する抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の結合親和性を表８１に要約する。
Figure 2023528350000134
二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の熱安定性
熱安定性（立体配座安定性）二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体を、自動化Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ機器を使用してＮａｎｏＤＳＦ法によって決定した。サンプルを、３８４ウェルサンプルプレートから２４ウェルキャピラリーに装填することによって測定を行った。二重の実行を行った。熱走査スキャンは、１．０℃／分の加熱速度で、２０℃～９５℃に及ぶ。データを処理して、３３０ｎｍ、３５０ｎｍ、比３３０／３５０、並びに熱転移、アンフォールディングの開始、Ｔｍ、及びＴａｇｇが得られた散乱データについて積分データ及び一次微分解析を得た。
結果は、これらの二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体が５９℃より高い第１の転移（Ｔｍ１）を有することを示す。結果はまた、ＤＬ３Ｂ５８５を除くほとんどのタンパク質が、Ｔａｇｇが７０℃を超える及びＴｍ１より５度以上高い場合に、低い凝集能力を有することを示す（表８２）。
Figure 2023528350000135
ＤＬＬ３＋腫瘍細胞への二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の結合
本発明者らは、ＤＬＬ３＋ヒト腫瘍細胞株（ＨＣＣ１８３３及びＳＨＰ－７７）に対する二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の細胞結合プロファイルを決定した。接着性ＳＣＬＣ ＨＣＣ１８３３細胞をＤＰＢＳで洗浄し、０．２５％トリプシンを添加して、細胞を剥離させた。培地を添加して、トリプシンを中和し、細胞を１５ｍＬのコニカルチューブに移した。懸濁ＳＣＬＣ ＳＨＰ７７細胞を１５ｍＬのコニカルチューブに移し、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した。培地を吸引し、細胞をＤＰＢＳでもう一度洗浄した。Ｖｉ－ｃｅｌｌ ＸＲ細胞生存率アナライザーを使用して細胞を計数し、１００ｕＬのＤＰＢＳ中に１００Ｋ／ウェルで播種した。プレートを１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、ＤＰＢＳで２回洗浄した。細胞をＶｉｏｌｅｔ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色剤（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）で染色し、暗所にて室温で２５分間インキュベートした。細胞を遠心分離し、ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で２回洗浄した。
試験抗体をＦＡＣＳ染色緩衝液中で１００ｎＭの最終出発濃度に希釈し、合計１０個の希釈点のために出発濃度から３倍連続希釈物を調製した。連続希釈した試験抗体（１００ｕＬ／ウェル）を細胞に添加し、３７ｏで３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ染色緩衝液で２回洗浄し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７結合ロバ抗ヒト二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、細胞とともに４ｏで３０分間インキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳ染色緩衝液で２回洗浄し、１００ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。細胞を、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを使用してＢＤ Ｃｅｌｅｓｔａ上で泳動させ、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。図２６Ａ及び図２６Ｂに示されるように、ＤＬＬ３－Ｆａｂアーム（ＤＬ３Ｂ５８２及びＤＬ３Ｂ５８３）とＤＬＬ３－ｓｃＦｖアーム（ＤＬ３Ｂ５８５及びＤＬ３Ｂ５８７）との間の結合プロファイルは、中程度に異なる。
汎Ｔ細胞への二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の結合
正常ヒトＴ細胞に対する二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の細胞結合プロファイルも評価した。ヒト汎Ｔ細胞（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｏｌｍａｒ，ＰＡ）を解凍し、ＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸生理食塩水緩衝液）を含む１５ｍＬのコニカルに移した。細胞を１３００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＤＰＢＳを吸引し、細胞をＤＰＢＳ中に再懸濁した。Ｖｉ－ｃｅｌｌ ＸＲ細胞生存率アナライザーを使用して細胞を計数し、１００ｕＬのＤＰＢＳ中に１００Ｋ／ウェルで播種した。プレートを１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、ＤＰＢＳで２回洗浄した。細胞をＶｉｏｌｅｔ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色剤（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）で染色し、暗所にて室温で２５分間インキュベートした。細胞を遠心分離し、ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で２回洗浄した。試験抗体をＦＡＣＳ染色緩衝液中で１００ｎＭの最終出発濃度に希釈し、合計１０個の希釈点のために出発濃度から３倍連続希釈物を調製した。連続希釈した試験抗体（１００ｕＬ／ウェル）を細胞に添加し、３７ｏで３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ染色緩衝液で２回洗浄し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７コンジュゲートロバ抗ヒト二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、細胞とともに４ｏで３０分間インキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳ染色緩衝液で２回洗浄し、１００ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。細胞を、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを使用してＢＤ Ｃｅｌｅｓｔａ上で泳動させ、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。図２７に示されるように、細胞結合プロファイルは、様々なＣＤ３アームにわたって異なる。
汎Ｔ細胞におけるＤＬＬ３＋標的細胞株に対する二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３媒介性細胞傷害
本発明者らは、ＤＬＬ３＋及びＤＬＬ３－細胞株における二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体のＴ細胞媒介性殺傷能を評価した。赤色核色素を安定的に発現するＤＬＬ３＋ＳＨＰ７７及びＤＬＬ３－ＨＥＫ２９３を生成して、ＩｎｃｕＣｙｔｅベースの細胞傷害アッセイにおいて使用した。健康なドナーＴ細胞の凍結バイアル（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｏｌｍａｒ，ＰＡ）を３７℃の水浴中で解凍し、１５ｍＬのコニカルチューブに移し、５ｍＬのフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ／１０％ＨＩ ＦＢＳ培地で１回洗浄した。Ｖｉａｃｅｌｌ ＸＲ細胞生存アナライザーを使用して細胞を計数し、Ｔ細胞を、５：１の最終エフェクターＴ細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比
で標的細胞と組み合わせた。細胞混合物（１００ｕＬ／ウェル）を５０ｍＬのコニカルチューブ中で合わせ、透明な９６ウェル平底プレートに添加した。次いで、試験抗体を、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ／１０％ＨＩＦＢＳ培地中で６０ｎＭの最終出発濃度に希釈し、合計１１個の希釈点のために出発濃度から３倍連続希釈物を調製した。連続希釈した試験抗体（１００ｕＬ／ウェル）を合わせた細胞に添加した。プレートを、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｚｏｏｍ又はＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３（登録商標）（Ｅｓｓｅｎ）のいずれかの中に、３７℃、５％ＣＯ２で１２０時間置いた。標的細胞株は、標的細胞溶解の動態を追跡するために使用された赤色核色素を安定的に発現する。細胞成長阻害（％）＝（初期生存標的細胞数－現時点の生存標的細胞数）／初期生存細胞数×１００％。図２８Ａ及び図２８Ｂに示されるように、Ｔ細胞細胞傷害アッセイの結果は、全ての二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体が、５日までに９５％超の腫瘍溶解を達成することができることを実証する。
汎Ｔ細胞における二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によって媒介されるサイトカイン誘導
本発明者らは、ＤＬＬ３＋ヒト腫瘍細胞株における二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体のサイトカイン放出プロファイルを評価した。上清を、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐａｎｅｌ Ｉ組織培養キット（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して分析し、湿った氷上で解凍し、１，５００ｒｐｍで５分間、４℃で回転させ、次いで氷上に置いた。ＭＵＬＴ－ＳＰＯＴアッセイプレートを製造業者のプロトコルに従って予め洗浄した。標準曲線を、ＭＳＤ希釈剤１中の提供された較正物質の連続希釈によって調製した。標準及び試験抗体サンプル（２５ｕＬ／ウェル）を予め洗浄したプレートに添加した。ＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ ６０００でアッセイプレートを読み取った。図２９に示されるように、サイトカインプロファイリング実験の結果は、ＩＦＮ－γ産生が二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体のＣＤ３親和性と相関することを実証する。
ＰＢＭＣにおけるＤＬＬ３＋標的細胞株に対する二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３媒介性細胞傷害
様々なレベルの抗原発現を有するＤＬＬ３＋標的細胞に対する二重特異性の有効性を試験するために、ＤＬＬ３高発現細胞株（ＳＨＰ－７７及びＨＣＣ１８３３）及びＤＬＬ３低発現細胞株（Ｇ３６１）を細胞傷害アッセイで試験した。ＳＨＰ－７７及びＨＣＣ１８３３は、それぞれ肺上皮細胞株及び肺腺がん細胞株である。Ｇ３６１細胞は、悪性皮膚黒色腫に由来する。核制限されたＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ（ＮＬＲ）タンパク質を安定的に発現するＤＬＬ３＋ＳＨＰ－７７細胞株を、細胞傷害アッセイで使用した。アッセイ当日、ＳＨＰ－７７－ＮＬＲ細胞を５０ｍＬのファルコンチューブに収集し、１３００ｒｐｍで５分間スピンダウンした。次いで、細胞ペレットを修飾ＲＰＭＩ １６４０培地＋１０％ＦＢＳ（完全培地）に再懸濁し、血球計数器とともにトリパンブルー生死マーカーを使用して細胞数を推定した。次いで、ＳＨＰ－７７－ＮＬＲ細胞を、コラーゲンでコーティングされた９６ウェルプレート上に、１０，０００細胞／ウェル／９０μＬの完全培地で播種した。細胞を穏やかに撹拌することによって均一に分布させ、５％ＣＯ２インキュベーター中で１時間静置した。ＨＣＣ１８３３及びＧ３６１標的細胞株の場合、ＰＢＭＣ添加の１日前に、３０００個の細胞／ウェル／９０μＬの完全培地を９６ウェル平底組織培養プレートに播種した。
健康なドナーから凍結したＰＢＭＣのバイアル（Ｃｌｉｎｉｇｅｎｅ）を３７℃の水浴中で急速に解凍し、１５ｍＬのコニカルチューブに移し、１０ｍＬの完全培地で１回洗浄した。細胞を抗ヒトＣＤ３抗体で染色し、フローサイトメーターによって分析して、ＰＢＭＣ内のＣＤ３％を決定した。各ドナーからのＰＢＭＣを、血球計数器とともにトリパンブルー生死マーカーを使用して計数し、必要とされるエフェクター対標的（effector to target、ＥＴ）比（ＣＤ３：標的細胞）を得るために必要なＰＢＭＣの数を、９０μＬの完全培地中の藩種された標的細胞に添加した。次いで、試験抗体を完全培地中の１０×ストックとして調製し、３倍連続希釈物を調製した。抗体の最終濃度が１×になるように、連続希釈した試験抗体をＰＢＭＣ－腫瘍共培養物に２０μＬ／ウェルで添加した。抗体を含まないウェル（ＮＢＳ）を基底細胞傷害の対照として使用した。プレートを、５％ＣＯ２、３７℃でＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３（登録商標）（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）中に５日間置いた。赤色シグナルの増加は、標的細胞増殖に対応し、シグナルの減少は、標的細胞死に対応する。結果を表８３に要約する。溶解％を、＝｛１００－（抗体を用いた特定の時点での赤色シグナル強度／ＮＢＳウェルにおけるその時点での赤色シグナル強度）＊１００｝として計算した。
Figure 2023528350000136
強力な腫瘍細胞溶解が、異なる起源及び抗原密度の細胞株にわたって二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体で観察された。高親和性ＣＤ３二重特異性抗体（ＤＬ３Ｂ５８３）の有効性を低親和性ＣＤ３二重特異性抗体（ＤＬ３Ｂ５８５）と比較するために、ＤＬＬ３高発現ＳＨＰ－７７細胞に対する細胞傷害を様々なＥＴ比で試験した。３人のドナーからの全ＰＢＭＣを、ＤＬＬ３＋ＳＨＰ－７７－ＮＬＲ細胞とともに、示されたＥＴ比（ＣＤ３：ＳＨＰ－７７）で、二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の存在下で培養した。ＰＢＭＣ及び標的細胞を含むが抗体を含まないウェルを、基底細胞傷害の対照として使用した。プレートを、５％ＣＯ２インキュベーターを用いて３７℃でＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３（登録商標）（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）中で最大１２０時間走査した。溶解％を、＝｛１００－（抗体を用いた特定の時点での赤色シグナル強度／ＮＢＳウェルにおけるその時点での赤色シグナル強度）＊１００｝として計算した。グラフ上の各点は、３人のドナーの平均を表す。図３０Ａ～図３０Ｃに示されるように、高親和性ＣＤ３（ＤＬ３Ｂ５８３）及び低親和性ＣＤ３（ＤＬ３Ｂ５８５）アームの両方を有する二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体は、ＳＨＰ－７７細胞に対して強固な細胞傷害を示した。９０ｎＭ及び３０ｎＭの抗体濃度での標的細胞溶解は、１０：１のＥＴ比については、高親和性ＣＤ３抗体と低親和性ＣＤ３抗体との間で同様であった。
全ＰＢＭＣ細胞傷害アッセイにおける二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体に応答したＣＤ３＋Ｔ細胞の増殖
ＣＤ８＋Ｔ細胞への二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の結合が、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及び拡大を誘導し得るかどうかを試験するために、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の経時変化分析を行った。ＤＬＬ３＋ＳＨＰ－７７細胞をアッセイに使用した。アッセイ当日、ＳＨＰ－７７細胞を５０ｍＬファルコンチューブに収集し、１３００ｒｐｍで５分間スピンダウンした。次いで、細胞ペレットを１ｍＬの修飾ＲＰＭＩ １６４０培地＋１０％ＦＢＳ（完全培地）に再懸濁し、血球計数器とともにトリパンブルー生死マーカーを使用して細胞数を推定した。次に、ＳＨＰ７７細胞をＵ底９６ウェルプレートに１０，０００個の細胞／ウェル／９０μＬの完全培地で播種した。
健康なドナーから凍結したＰＢＭＣのバイアル（Ｃｌｉｎｉｇｅｎｅ）を３７℃の水浴中で急速に解凍し、１５ｍＬのコニカルチューブに移し、１０ｍＬの完全培地で１回洗浄した。細胞を抗ヒトＣＤ３抗体で染色し、フローサイトメーターによって分析して、ＰＢＭＣ内のＣＤ３％を決定した。ＰＢＭＣをＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ色素（Ｃ３４５７１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。各ドナーからのＰＢＭＣを、血球計数器とともにトリパンブルー生死マーカーを使用して計数し、１０：１（ＣＤ３：標的細胞）のエフェクター対標的（ＥＴ）比を得るために必要なＰＢＭＣの数を、９０μＬの完全培地中の播種された標的細胞に添加した。
次いで、試験抗体を完全培地中の１０×ストックとして調製し、合計３つの希釈点のために出発濃度から３倍連続希釈物を調製した。抗体の最終濃度が１×になるように、連続希釈した試験抗体をＰＢＭＣ－腫瘍共培養物に２０μＬ／ウェルで添加した。抗体を含まないウェル（ＮＢＳ）を基底細胞傷害の対照として使用した。プレートを、指示された期間、５％ＣＯ２のインキュベーター内でインキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、細胞懸濁液をｖ底プレートに移し、１５００ｒｐｍで５分間スピンダウンした。ペレットを１００μＬのＤＰＢＳに再懸濁した。１０μＬの細胞懸濁液を採取し、血球計数器とともにトリパンブルーを使用して各抗体濃度での総細胞数を決定した。細胞懸濁液の残りを、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｌ１０１１９）に供し、氷上で２０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液を使用して生存染色剤を不活性化し、１５００ｒｐｍで５分間スピンダウンした。細胞をＢＤ Ｆｃブロック（５６４２２０、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で１０分間染色した後、ＣＤ３抗体及びＣＤ８抗体で染色し、フローサイトメーターで取得した。ＣＤ８ Ｔ細胞に対するゲーティングを実施して、ＣＤ３ Ｔ細胞内での細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞集団の拡大を推定した。図３１に示されるように、二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体のＴ細胞への結合は、細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞の拡大を強力に媒介する。
全ＰＢＭＣアッセイにおける二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によるＣＤ８ Ｔ細胞の活性化プロファイル
ＤＬＬ３×ＣＤ３二重特異性の結合に応答した細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞集団の活性化状態を調べるために、ＣＤ２５、ＣＤ６９、及びＣＤ７１マーカーの動態分析を行った。ＤＬＬ３＋ＳＨＰ－７７細胞をアッセイに使用した。ＳＨＰ－７７細胞を５０ｍＬのファルコンチューブに収集し、１３００ｒｐｍで５分間スピンダウンした。次いで、細胞ペレットを１ｍＬの修飾ＲＰＭＩ １６４０培地＋１０％ＦＢＳ（完全培地）に再懸濁し、血球計数器とともにトリパンブルー生死マーカーを使用して細胞数を推定した。次に、ＳＨＰ－７７細胞をＵ底９６ウェルプレートに１０，０００個の細胞／ウェル／９０μＬの完全培地で播種した。
健康なドナーから凍結したＰＢＭＣのバイアル（Ｃｌｉｎｉｇｅｎｅ）を３７℃の水浴中で急速に解凍し、１５ｍＬのコニカルチューブに移し、１０ｍＬの完全培地で１回洗浄した。細胞を抗ヒトＣＤ３抗体で染色し、フローサイトメーターによって分析して、ＰＢＭＣ内のＣＤ３％を決定した。各ドナーからのＰＢＭＣを、血球計数器とともにトリパンブルー生死マーカーを使用して計数し、１０：１（ＣＤ３：標的細胞）のエフェクター対標的（ＥＴ）比を得るために必要なＰＢＭＣの数を、９０μＬの完全培地中の播種された標的細胞に添加した。
試験抗体を完全培地中の１０×ストックとして調製し、合計３つの希釈点のために出発濃度から３倍連続希釈物を調製した。抗体の最終濃度が１×になるように、連続希釈した試験抗体をＰＢＭＣ－腫瘍共培養物に２０μＬ／ウェルで添加した。抗体を含まないウェル（ＮＢＳ）を基底細胞傷害の対照として使用した。プレートを、示された期間、５％ＣＯ２のインキュベーター内でインキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、細胞懸濁液をｖ底プレートに移し、１５００ｒｐｍで５分間スピンダウンした。ペレットを１００μＬのＤＰＢＳに再懸濁した。１０μｌの細胞懸濁液を採取し、血球計数器とともにトリパンブルーを使用して各抗体濃度での総細胞数を決定した。
細胞懸濁液の残りを、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｌ１０１１９）に供し、氷上で２０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液を使用して生存染色剤を不活化し、１５００ｒｐｍで５分間スピンダウンした。細胞をＢＤ Ｆｃブロック（５６４２２０、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で１０分間染色した後、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、及びＣＤ７１抗体で染色し、フローサイトメーターで取得した。図３２Ａ～図３２Ｃに示されるように、細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞の強力な活性化は、ＣＤ８ Ｔ細胞の表面上のＣＤ２５、ＣＤ６９、及びＣＤ７１発現の上方制御によって示されるように、二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体で見られた。
全ＰＢＭＣアッセイにおける二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体によって媒介されるサイトカイン誘導
Ｔ細胞再指向二重特異性抗体は、サイトカイン放出症候群の誘導のために毒性を引き起こし得る。これらのサイトカインは、Ｔ細胞自体又は骨髄細胞によって産生され得、より多くのサイトカイン産生のフィードバックループをもたらす。ＤＬＬ３×ＣＤ３二重特異性の添加によるＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１０、ＧＭＣＳＦ、及び他のＴ細胞サイトカインなどのサイトカインの放出を理解するために、細胞傷害アッセイからの培養上清をこれらのサイトカインのレベルについて試験した。ＤＬＬ３＋ＳＨＰ－７７細胞をアッセイに使用した。ＳＨＰ－７７細胞を５０ｍＬのファルコンチューブに収集し、１３００ｒｐｍで５分間スピンダウンした。次いで、細胞ペレットを１ｍＬの修飾ＲＰＭＩ １６４０培地＋１０％ＦＢＳ（完全培地）に再懸濁し、血球計数器とともにトリパンブルー生死マーカーを使用して細胞数を推定した。次いで、ＳＨＰ－７７細胞を、１０，０００個の細胞／ウェル／９０μＬの完全培地でＵ底９６ウェルプレートに播種した。
健康なドナーから凍結したＰＢＭＣのバイアル（Ｃｌｉｎｉｇｅｎｅ）を３７℃の水浴中で急速に解凍し、１５ｍＬのコニカルチューブに移し、１０ｍＬの完全培地で１回洗浄した。細胞を抗ヒトＣＤ３抗体で染色し、フローサイトメーターによって分析して、ＰＢＭＣ内のＣＤ３％を決定した。各ドナーからのＰＢＭＣを、血球計数器とともにトリパンブルー生死マーカーを使用して計数し、１０：１（ＣＤ３：標的細胞）のエフェクター対標的（ＥＴ）比を得るために必要なＰＢＭＣの数を、９０μＬの完全培地中の播種された標的細胞に添加した。
試験抗体を完全培地中の１０×ストックとして調製し、抗体の最終濃度が１×になるように、２０μＬ／ウェルでＰＢＭＣ－腫瘍共培養物に添加した。抗体を含まないウェル（ＮＢＳ）を基底細胞傷害の対照として使用した。プレートを、示された期間、５％ＣＯ２のインキュベーター内でインキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、細胞懸濁液をｖ底プレートに移し、１５００ｒｐｍで５分間スピンダウンした。上清を収集し、－２０℃で保存して、ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ ＭＡＰ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８＋Ｔ Ｃｅｌｌ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄ Ｐａｎｅｌ（ＨＣＤ８ＭＡＧ－１５Ｋ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＬｕｍｉｎｅｘを行った。ｅＸＰＯＮＥＮＴソフトウェアとともにＭＡＧＰＩＸを使用してプレートを分析した。結果を表８４に要約する。
Figure 2023528350000137
より高い親和性のＣＤ３アームを有する二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体（ＤＬ３Ｂ５８２及びＤＬ３Ｂ５８３）、特に、ＩＬ－１０、ＩＬ－６、ＩＬ－２及びＩＬ－４と比較して、より低い親和性のＣＤ３を有する二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体（ＤＬ３Ｂ５８５）では、低レベルのサイトカイン放出が観察されたが、これらの二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３の細胞傷害性効力は同等であった。
実施例２０．最適化された抗ＤＬＬ３抗体配列を有する二重特異性抗ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の特性評価
ＤＬＬ３に対する二重特異性抗ＤＬＬ３バリアント×ＣＤ３抗体の結合親和性
実施例１に記載されるように、ＤＬ３Ｂ２７９バリアントのＨＣＤＲ１領域（又は使用される描写によってはＨＣＤＲ１領域付近）におけるＮからＱへの変異がＤＬＬ３への結合の変化をもたらさなかったことを確実にするために、組換えヒトＤＬＬ３に対するＤＬ３Ｂ２７９バリアントの結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定し、親ＤＬ３Ｂ２７９と比較した。抗体をヤギ抗Ｆｃ抗体修飾Ｃ１チップ上に捕捉し、９０ｎＭ～１．１ｎＭの濃度にわたるヒト及びカニクイザルＤＬＬ３抗原の３倍連続希釈で滴定した。５０μＬ／分の流速を使用して、会合を３分間、解離を６０分間監視した。生の結合データを、ブランクから分析物結合シグナルを差し引くことによって参照し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ評価ソフトウェアを使用する１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを使用して分析して、結合親和性を計算するために使用される動態を得た。結果（表８５）は、ＤＬ３Ｂ２７９バリアント（ＤＬ３Ｂ２７９－ＶＬ－Ａ９９Ｇ－ＶＨ－Ｎ２７Ｑ＿Ｍ１０５Ｔ－ＬＨ－ｓｃＦＶ）を含有するＤＬＬ３×ＣＤ３二重特異性（Ｃ３Ｃ３Ｂ８０）の結合親和性が、元のＤＬ３Ｂ５８５－ＬＨ－ｓｃＦｖ分子（ＤＬ３Ｂ２７９：２４ ｐＭ）を含有する元のＤＬＬ３×ＣＤ３二重特異性（ＤＬ３Ｂ５８５）の結合親和性と同等であることを示した。
Figure 2023528350000138
ＤＳＦによる二重特異性抗ＤＬＬ３バリアント×ＣＤ３抗体の立体配座安定性
ＤＬ３Ｂ２７９バリアント（Ｄ３Ｃ３Ｂ８０）の新たなＤＬ３Ｂ２７９配列を含有する二重特異性抗ＤＬＬ３ ＣＤ３抗体の熱安定性（立体配座安定性）を、自動Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ機器を使用するＮａｎｏＤＳＦ法によって決定した。サンプルを、３８４ウェルサンプルプレートから２４ウェルキャピラリーに装填することによって測定を行った。二重の実行を行った。熱走査は、１．０℃／分の速度で２０℃～９５℃に及ぶ。データを処理して、３３０ｎｍ、３５０ｎｍ、比３３０／３５０、並びに熱転移、アンフォールディングの開始、Ｔｍ１、及びＴａｇｇが得られた散乱データについて積分データ及び一次微分解析を得た。結果（表８６）は、ＤＬ３Ｂ２７９－ＶＬ－Ａ９９Ｇ－ＶＨ－Ｎ２７Ｑ＿Ｍ１０５Ｔ－ＬＨ－ｓｃＦＶバリアント（Ｄ３Ｃ３Ｂ８０）を有する二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体の熱安定性が、元のＤＬ３Ｂ２７９－ＬＨ－ｓｃＦｖ配列を有する元の二重特異性分子（表８６に示されるＤＬ３Ｂ５８５：Ｔａｇｇ＝６２．７、Ｔｍ１＝６０．８）における熱安定性と同等であることを示した。
Figure 2023528350000139
Ｔ細胞への二重特異性抗ＤＬＬ３バリアント×ＣＤ３抗体の結合
ヒト汎Ｔ細胞（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｏｌｍａｒ，ＰＡ）を解凍し、ＤＰＢＳを含む１５ｍＬのコニカルに移した。細胞を１３００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＤＰＢＳを吸引し、細胞をＤＰＢＳ中に再懸濁した。Ｖｉ－ｃｅｌｌ ＸＲ細胞生存率アナライザーを使用して細胞を計数し、１００ｕＬのＤＰＢＳ中に１００Ｋ／ウェルで播種した。プレートを１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、ＤＰＢＳで２回洗浄した。細胞をＶｉｏｌｅｔ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色剤（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）で染色し、暗所にて室温で２５分間インキュベートした。細胞を遠心分離し、ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で２回洗浄した。試験抗体をＦＡＣＳ染色緩衝液中で１００ｎＭの最終出発濃度に希釈し、合計１０個の希釈点のために出発濃度から３倍連続希釈物を調製した。連続希釈した試験抗体（１００ｕＬ／ウェル）を細胞に添加し、３７ｏで３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ染色緩衝液で２回洗浄し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７コンジュゲートロバ抗ヒト二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、細胞とともに４℃で３０分間インキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳ染色緩衝液で２回洗浄し、１００ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。細胞を、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを使用してＢＤ Ｃｅｌｅｓｔａ上で泳動させ、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。図３３Ａに示されるように、ＤＬ３Ｂ２７９－ＶＬ－Ａ９９Ｇ－ＶＨ－Ｎ２７Ｑ＿Ｍ１０５Ｔ－ＬＨ－ｓｃＦＶバリアントを有する二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体（Ｄ３Ｃ３Ｂ８０）は、元のＤＬ３Ｂ２７９－ＬＨ－ｓｃＦｖ配列を有する元の二重特異性分子（ＤＬ３Ｂ５８５）と同等のＴ細胞への結合を有する。
ＩｎｃｕＣｙｔｅによる汎Ｔ細胞におけるＤＬＬ３＋標的細胞株に対する二重特異性抗ＤＬＬ３バリアント×ＣＤ３媒介性細胞傷害
赤色核色素を安定的に発現するＤＬＬ３＋ＳＨＰ７７を生成して、ＩｎｃｕＣｙｔｅベースの細胞傷害アッセイで使用した。健康なドナーＴ細胞の凍結バイアル（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｏｌｍａｒ，ＰＡ）を３７℃の水浴中で解凍し、１５ｍＬのコニカルチューブに移し、５ｍＬのフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ／１０％ＨＩ ＦＢＳ培地で１回洗浄した。Ｖｉａｃｅｌｌ ＸＲ細胞生存アナライザーを使用して細胞を計数し、Ｔ細胞を、５：１の最終エフェクターＴ細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比
で標的細胞と組み合わせた。細胞混合物を５０ｍＬのコニカルチューブ内で合わせた。細胞混合物（１００ｕＬ／ウェル）を透明な９６ウェル平底プレートに添加した。次に、試験抗体を、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ／１０％ＨＩ ＦＢＳ培地中で６０ｎＭの最終開始濃度に希釈し、合計１１個の希釈点のために開始濃度から３倍連続希釈物を調製した。連続希釈した試験抗体（１００ｕＬ／ウェル）を、合わせた細胞に添加した。プレートを、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｚｏｏｍ又はＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３（登録商標）（Ｅｓｓｅｎ）のいずれかの中に、３７℃、５％ＣＯ２で１２０時間置いた。標的細胞株は、標的細胞溶解の動態を追跡するために使用される赤色核色素を安定的に発現する。細胞成長阻害パーセントは、初期可変標的細胞数と現在の生存標的細胞数との差を初期生存細胞数で除したものに等しい。図３３Ｂに示されるように、ＤＬ３Ｂ２７９－ＶＬ－Ａ９９Ｇ－ＶＨ－Ｎ２７Ｑ＿Ｍ１０５Ｔ－ＬＨ－ｓｃＦＶバリアントを有する二重特異性ＤＬＬ３×ＣＤ３抗体（Ｄ３Ｃ３Ｂ８０）は、元のＤＬ３Ｂ２７９－ＬＨ－ｓｃＦｖ配列を有する元の二重特異性分子（ＤＬ３Ｂ５８５）と同等の細胞成長阻害を有する。
本実施例は、本明細書に開示される単離多重特異性タンパク質が、Ｔ細胞媒介性細胞傷害を媒介する、Ｔ細胞の活性化及び増殖を促進する、Ｔ細胞サイトカイン放出を増加させる、並びに／又は抗腫瘍効果の増加を示すのに特に有効であることを実証する。これらの活性は、標的細胞上のＤＬＬ３及びＴ細胞上のＣＤ３を標的とする抗原結合ドメインの組み合わせの反映である。当業者であれば、そのような活性は、二重特異性抗体が組み立てられる機構に関係なく、結合ドメインを二重特異性抗体に組み立てることから予想されることを理解するであろう。

Claims (68)

  1. 分化抗原群３ε（ＣＤ３ε）に結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、前記ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、
    ａ．配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号２４の軽鎖可変領域（ＶＬ）の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
    ｂ．配列番号２３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号２７のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
    ｃ．配列番号２３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号２８のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
    ｄ．配列番号２３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号２９のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
    ｅ．配列番号２３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号３０のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離タンパク質。
  2. ａ．それぞれ、配列番号６、７、８、９、１０、及び１１、
    ｂ．それぞれ、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、及び１７、又は
    ｃ．それぞれ、配列番号１８、１９、２０、２１、１６、及び２２、のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
  3. 前記ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ、又はＶＨＨである、請求項１又は２に記載の単離タンパク質。
  4. 前記ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、Ｆａｂである、請求項３に記載の単離タンパク質。
  5. 前記ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖである、請求項３に記載の単離タンパク質。
  6. 前記ｓｃＦｖが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、第１のリンカー（Ｌ１）、及びＶＬ（ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ）、又はＶＬ、Ｌ１、及びＶＨ（ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ）を含む、請求項５に記載の単離タンパク質。
  7. 前記Ｌ１が、
    ａ．約５～５０個のアミノ酸、
    ｂ．約５～４０個のアミノ酸、
    ｃ．約１０～３０個のアミノ酸、又は
    ｄ．約１０～２０個のアミノ酸、を含む、請求項６に記載の単離タンパク質。
  8. 前記Ｌ１が、配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、又は６４のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の単離タンパク質。
  9. 前記Ｌ１が、配列番号３１、３７、又は６４のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の単離タンパク質。
  10. 前記ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４、２７、２８、２９、又は３０のＶＬを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  11. 前記ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、
    ａ．配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４のＶＬ、
    ｂ．配列番号２３のＶＨ及び配列番号２７のＶＬ、
    ｃ．配列番号２３のＶＨ及び配列番号２８のＶＬ、
    ｄ．配列番号２３のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は
    ｅ．配列番号２３のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含む、請求項１０に記載の単離タンパク質。
  12. 前記ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、配列番号６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、又は７４のアミノ酸配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  13. ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、前記ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号１０３の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、単離タンパク質。
  14. 前記ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ、又はＶＨＨである、請求項１３に記載の単離タンパク質。
  15. 前記ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、Ｆａｂである、請求項１４に記載の単離タンパク質。
  16. 前記ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖである、請求項１４に記載の単離タンパク質。
  17. 前記ｓｃＦｖが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、第１のリンカー（Ｌ１）、及びＶＬ（ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ）、又はＶＬ、Ｌ１、及びＶＨ（ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ）を含む、請求項１６に記載の単離タンパク質。
  18. 前記Ｌ１が、
    ａ．約５～５０個のアミノ酸、
    ｂ．約５～４０個のアミノ酸、
    ｃ．約１０～３０個のアミノ酸、又は
    ｄ．約１０～２０個のアミノ酸、を含む、請求項１７に記載の単離タンパク質。
  19. 前記Ｌ１が、配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、又は６４のアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の単離タンパク質。
  20. 前記Ｌ１が、配列番号３１、３７、又は６４のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の単離タンパク質。
  21. 前記ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４、２７、２８、２９、又は３０のＶＬを含む、請求項１３～２０に記載の単離タンパク質。
  22. 前記ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、
    ａ．配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４のＶＬ、
    ｂ．配列番号２３のＶＨ及び配列番号２７のＶＬ、
    ｃ．配列番号２３のＶＨ及び配列番号２８のＶＬ、
    ｄ．配列番号２３のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は
    ｅ．配列番号２３のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含む、請求項２１に記載の単離タンパク質。
  23. 前記単離タンパク質が、多重特異性タンパク質である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  24. 前記多重特異性タンパク質が、二重特異性タンパク質である、請求項２３に記載の単離タンパク質。
  25. 前記多重特異性タンパク質が、三重特異性タンパク質である、請求項２３に記載の単離タンパク質。
  26. 免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域又はその前記Ｉｇ定常領域の断片を更に含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  27. 前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、Ｆｃ領域を含む、請求項２６に記載の単離タンパク質。
  28. 前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、ＣＨ２ドメインを含む、請求項２６に記載の単離タンパク質。
  29. 前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、ＣＨ３ドメインを含む、請求項２６に記載の単離タンパク質。
  30. 前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む、請求項２６に記載の単離タンパク質。
  31. 前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、ヒンジの少なくとも一部分、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む、請求項２６に記載の単離タンパク質。
  32. 前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む、請求項２６に記載の単離タンパク質。
  33. 前記ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片のＮ末端にコンジュゲートされる、請求項２６～３２のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  34. 前記ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片のＣ末端にコンジュゲートされる、請求項２６～３２のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  35. 前記ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、第２のリンカー（Ｌ２）を介して前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片にコンジュゲートされる、請求項２６～３２のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  36. 前記Ｌ２が、配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、又は６４のアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載の単離タンパク質。
  37. 前記多重特異性タンパク質が、ＣＤ３ε以外の抗原に結合する抗原結合ドメインを含む、請求項２３～３６のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  38. 前記細胞抗原が、腫瘍関連抗原である、請求項３７に記載の多重特異性抗体。
  39. 前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである、請求項２６～３８のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  40. 前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）への前記タンパク質の低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異を含む、請求項２６～３９のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  41. 前記ＦｃγＲへの前記タンパク質の低減された結合をもたらす前記少なくとも１つの変異が、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、Ｋ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及びＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、請求項４０に記載の単離タンパク質。
  42. 前記ＦｃγＲが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、若しくはＦｃγＲＩＩＩ、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項４０～４１のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  43. 前記タンパク質が、前記Ｉｇ定常領域のＣＨ３ドメインに少なくとも１つの変異を含む、請求項２６～４２のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  44. 前記Ｉｇ定常領域の前記ＣＨ３ドメインにおける前記少なくとも１つの変異が、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｌ、Ｆ４０５Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｋ３９２Ｌ、Ｔ３９４Ｓ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｉ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３６６Ｖ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ及びＴ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、請求項３８に記載の単離タンパク質。
  45. 請求項１～４４のいずれか一項に記載の単離タンパク質と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
  46. 請求項１～４４のいずれか一項に記載の単離タンパク質コードする、ポリヌクレオチド。
  47. 請求項４６に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  48. 請求項４７に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  49. 請求項１～４４のいずれか一項に記載の単離タンパク質を産生する方法であって、前記タンパク質が発現する条件で請求項４８に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞によって産生された前記タンパク質を収集することと、を含む、方法。
  50. 対象におけるがんを治療する方法であって、治療有効量の、請求項１～４４のいずれか一項に記載の単離された抗体を、前記がんを治療するために、それを必要とする前記対象に投与することを含む、方法。
  51. 請求項１～５０のいずれか一項に記載の単離タンパク質に結合する、抗イディオタイプ抗体。
  52. ＣＤ３ε（配列番号１）上のエピトープに結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、前記エピトープが、配列番号１００、１０１、及び１０２のアミノ酸配列を含む不連続エピトープである、単離タンパク質。
  53. 配列番号７４７、７４８、７７、７８、７４９、７５０、７５１、７５２、７５３、及び７５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
  54. 配列番号７４７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
  55. 配列番号７４８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
  56. 配列番号７７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
  57. 配列番号７８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
  58. 配列番号７４９のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
  59. 配列番号７５０のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
  60. 配列番号７５１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
  61. 配列番号７５２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
  62. 配列番号７５３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
  63. 配列番号７５４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
  64. 配列番号８５及び８６のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
  65. 配列番号８５及び８８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
  66. 配列番号８５及び９０のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
  67. 配列番号８５及び９２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
  68. 配列番号８５及び９４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
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