CN109897103A - 在Fc结构域中具有突变的稳定异源二聚的抗体设计 - Google Patents

在Fc结构域中具有突变的稳定异源二聚的抗体设计 Download PDF

Info

Publication number
CN109897103A
CN109897103A CN201811302754.7A CN201811302754A CN109897103A CN 109897103 A CN109897103 A CN 109897103A CN 201811302754 A CN201811302754 A CN 201811302754A CN 109897103 A CN109897103 A CN 109897103A
Authority
CN
China
Prior art keywords
modification
amino acid
acid substitution
domain polypeptide
domain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811302754.7A
Other languages
English (en)
Inventor
T·斯普雷特冯克罗伊登斯泰因
S·B·迪克西特
E·埃斯科巴-卡布雷拉
P·I·拉里奥
D·K·Y·潘
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zymeworks BC Inc
Original Assignee
Zymeworks Inc Canada
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zymeworks Inc Canada filed Critical Zymeworks Inc Canada
Publication of CN109897103A publication Critical patent/CN109897103A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B5/00—ICT specially adapted for modelling or simulations in systems biology, e.g. gene-regulatory networks, protein interaction networks or metabolic networks
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Abstract

本发明提供的支架具有在各个结构域(例如CH2和CH3)不对称的重链，来实现超越用天然同源二聚体(对称)Fc分子的参与调节效应功能的各种Fc受体之间的选择性，和所获得的变体Fc同源二聚体的增加的稳定性和纯度。这些新分子包含设计用于改变抗体起作用和其在治疗剂中找到用途的天然方式的异质组分的复合物。

Description

在Fc结构域中具有突变的稳定异源二聚的抗体设计
本申请为国际申请PCT/CA2012/050780进入中国国家阶段的中国专利申请(申请号为201280057691.8，申请日为2012年11月2日，发明名称为“在Fc结构域中具有突变的稳定异源二聚的抗体设计”) 的分案申请。
介绍
相关申请的交叉引用
本申请根据美国法典第35篇第119(e)条要求2011年11月4日提交的美国临时专利申请号61/556,090；2011年11月8日提交的美国临时专利申请号61/557,262；和2012年5月10日提交的美国临时专利申请号61/645,547的权益，所述临时申请中的每一个都通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明一般提供多肽异源二聚体、其组合物、以及制备和使用所述多肽异源二聚体的方法。更具体而言，本发明涉及热稳定的多特异性抗体，包括双特异性抗体，其包含异源二聚的Fc结构域。
发明背景
双特异性治疗剂是基于抗体的分子，其可以同时结合两个分离且不同的靶或相同抗原的不同表位。双特异性抗体由基于免疫球蛋白结构域的实体组成并且尝试结构上和功能上模拟抗体分子的组分。双特异性抗体的一个用途是重新引导细胞毒性免疫效应细胞，例如通过抗体依赖细胞毒性(ADCC)以增强对肿瘤细胞的杀伤。在这种背景下，双特异性抗体的一个臂结合肿瘤细胞上的抗原，而另一个臂结合效应细胞上表达的决定簇。通过交联肿瘤和效应细胞，所述双特异性抗体不仅在肿瘤细胞周围引入效应细胞，而且也同时引起其活化，造成有效杀死肿瘤细胞。双特异性抗体已经用于在肿瘤组织富集化学或放射治疗剂以最小化对正常组织的有害作用。这种情况下，双特异性抗体的一个臂与要破坏的靶向细胞上表达的抗原相结合，而另一个臂递送化疗药物、放射性同位素或毒素。超越双特异性，需要通过同时靶向多种形式达到其效力的蛋白治疗剂。此类复杂和新型生物效应可用蛋白治疗剂通过在蛋白中设计多靶结合和多功能方面而获得。
提供架构以融合其他功能弹头(war-head)或靶蛋白结合结构域以便设计这些多功能性和多靶结合治疗剂的坚固支架。理想地，支架不仅提供架构而且向所设计的治疗剂提供多种其他治疗上相关且有价值的特征。通常开发基于抗体的双特异性和多功能性治疗剂的一个主要障碍是难于为临床前和临床研究生产足够质量和数量的材料。在本领域中仍然需要包含单一可变结构域作为连接至变体Fc区的蛋白结合结构域的多肽构建体，所述变体Fc包含CH3结构域，其已经进行修饰以选择具有增加稳定性和纯度的异源二聚体。
发明概述
根据本发明的一个方面，提供了分离的包含修饰的异源二聚的 CH3结构域的异源二聚体Fc构建体，所述修饰的CH3结构域包含：与野生型CH3结构域多肽相比包含至少三个氨基酸修饰的第一修饰的CH3结构域多肽，和与野生型CH3结构域多肽相比包含至少三个氨基酸修饰的第二修饰的CH3结构域多肽；其中所述第一和第二CH3 结构域多肽中的至少一个包含K392J的氨基酸修饰，其中J选自L、 I或侧链体积基本上不大于K的侧链体积的氨基酸；其中所述第一和第二修饰的CH3结构域多肽优先形成具有至少约74℃的熔解温度 (Tm)和至少95％的纯度的异源二聚的CH3结构域；并且其中至少一个氨基酸修饰不是在所述第一和所述第二CH3结构域多肽之间的接口处的氨基酸的修饰。在某些实施方案中是本文所述的异源二聚体 Fc构建体，包含至少一个T350X修饰，其中X是选自缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、及其衍生物或变体的天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，包含至少一个T350V修饰。在实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述修饰的CH3结构域具有至少约75℃或更高的熔解温度(Tm)。在实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述修饰的CH3结构域具有约77℃或更高的Tm。在某些实施方案中，所述修饰的CH3结构域具有约80℃或更高的Tm。在某些实施方案中提供了本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中至少一个CH3结构域多肽是包含L351、F405和Y407中的至少一个的氨基酸修饰的修饰的CH3结构域多肽。在一些实施方案中是分离的异源二聚体Fc构建体，其中至少一个CH3结构域多肽是进一步包含T366的氨基酸修饰的修饰的CH3结构域多肽。在某些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中第一CH3结构域多肽是包含在位置L351、F405和Y407处的氨基酸修饰的修饰的 CH3结构域多肽，并且第二CH3结构域多肽是包含在位置T366、K392 和T394处的氨基酸修饰的修饰的CH3结构域多肽。在实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，所述第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰L351Y、F405A和Y407V，并且所述第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366L、K392M和T394W。在一些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，所述第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰L351Y、F405A和Y407V，并且所述第二CH3 结构域多肽包含氨基酸修饰T366L、K392L和T394W。在另一实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，所述第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰L351Y、F405A和Y407V，并且所述第二 CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366I、K392M和T394W。在一些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，所述第一 CH3结构域多肽包含氨基酸修饰L351Y、F405A和Y407V，并且所述第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366I、K392L和T394W。在某些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述第一和第二CH3结构域多肽中的至少一个是包含在位置S400处的氨基酸修饰的修饰的CH3结构域多肽。在另一实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，包含修饰S400Z，其中Z选自带正电的氨基酸和带负电的氨基酸。在一些实施方案中，带正电的氨基酸是赖氨酸或精氨酸并且带负电的氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。在某些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，所述第一CH3结构域多肽包含选自S400E和S400R的氨基酸修饰。在一些实施方案中提供了本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述第一和第二CH3结构域多肽中的至少一个是包含在位置N390处的氨基酸修饰的修饰的CH3结构域多肽。在一些实施方案中，N390 的修饰是N390Z，其中Z选自带正电的氨基酸和带负电的氨基酸。在实施方案中，N390Z是N390R。在本文所述的分离的异源二聚体 Fc构建体的某些实施方案中，所述第一CH3结构域多肽是包含氨基酸修饰S400E的修饰的CH3结构域多肽并且所述第二CH3结构域多肽是包含氨基酸修饰N390R的修饰的CH3结构域多肽。在本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体的一些实施方案中，第一和第二CH3 结构域多肽中的每一个是修饰的CH3结构域多肽，一个所述修饰的 CH3结构域多肽包含氨基酸修饰Q347R而另一个修饰的CH3结构域多肽包含氨基酸修饰K360E。
一方面，提供了分离的包含修饰的异源二聚的CH3结构域的异源二聚体Fc构建体，所述修饰的CH3结构域包含：与野生型CH3 结构域多肽相比包含至少三个氨基酸修饰的第一修饰的CH3结构域多肽，和与野生型CH3结构域多肽相比包含至少三个氨基酸修饰的第二修饰的CH3结构域多肽；其中所述第一和第二CH3结构域多肽中的至少一个包含K392J的氨基酸修饰，其中J选自L、I或侧链体积基本上不大于K的侧链体积的氨基酸；其中所述第一和第二修饰的CH3结构域多肽优先形成具有至少约74℃的熔解温度(Tm)和至少 95％的纯度的异源二聚的CH3结构域；并且其中至少一个氨基酸修饰不是在所述第一和所述第二CH3结构域多肽之间的接口处的氨基酸的修饰。在某些实施方案中是本文所述的异源二聚体Fc构建体，包含至少一个T350X修饰，其中X是选自缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、及其衍生物或变体的天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，包含至少一个 T350V修饰。在实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述修饰的CH3结构域具有至少约75℃或更高的熔解温度 (Tm)。在实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述修饰的CH3结构域具有约77℃或更高的Tm。在某些实施方案中，所述修饰的CH3结构域具有约80℃或更高的Tm。在实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中至少一个CH3 结构域多肽是包含K409和T411中的至少一个的氨基酸修饰的修饰的CH3结构域多肽。在某些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，包含K409F、T411E和T411D中的至少一个。在一些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中至少一个CH3结构域多肽是包含D399的氨基酸修饰的修饰的CH3结构域多肽。在一些实施方案中，D399的氨基酸修饰是D399R和D399K 中的至少一个。
一方面，提供了分离的包含修饰的异源二聚的CH3结构域的异源二聚体Fc构建体，所述修饰的CH3结构域包含：与野生型CH3 结构域多肽相比包含至少三个氨基酸修饰的第一修饰的CH3结构域多肽，和与野生型CH3结构域多肽相比包含至少三个氨基酸修饰的第二修饰的CH3结构域多肽；其中所述第一和第二CH3结构域多肽中的至少一个包含K392J的氨基酸修饰，其中J选自L、I或侧链体积基本上不大于K的侧链体积的氨基酸；其中所述第一和第二修饰的CH3结构域多肽优先形成具有至少约74℃的熔解温度(Tm)和至少 95％的纯度的异源二聚的CH3结构域；并且其中至少一个氨基酸修饰不是在所述第一和所述第二CH3结构域多肽之间的接口处的氨基酸的修饰。在某些实施方案中是本文所述的异源二聚体Fc构建体，包含至少一个T350X修饰，其中X是选自缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、及其衍生物或变体的天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，包含至少一个 T350V修饰。在实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述修饰的CH3结构域具有至少约75℃或更高的熔解温度 (Tm)。在实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述修饰的CH3结构域具有约77℃或更高的Tm。在某些实施方案中，所述修饰的CH3结构域具有约80℃或更高的Tm。在本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体的某些实施方案中，其中第一CH3 结构域多肽是包含选自K409F、T411E和T411D的至少一个氨基酸修饰的修饰的CH3结构域多肽，并且第二CH3结构域多肽是包含选自Y407A、Y407I、Y407V、D399R和D399K的至少一个氨基酸修饰的修饰的CH3结构域多肽。在一些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体中的任一个，进一步包含包含氨基酸修饰 T366V、T366I、T366A、T366M和T366L中的一个的第一修饰的CH3 结构域；和包含氨基酸修饰L351Y的第二修饰的CH3结构域。在一些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体中的任一个，包含包含氨基酸修饰K392L或K392E中的一个的第一修饰的CH3结构域；和包含氨基酸修饰S400R或S400V中的一个的第二修饰的 CH3结构域。
提供了分离的包含修饰的CH3结构域的异源二聚体Fc构建体，所述修饰的CH3结构域包含第一修饰的CH3结构域多肽和第二修饰的CH3结构域多肽，每个修饰的CH3结构域多肽包含至少四个氨基酸突变，其中所述第一和所述第二修饰的CH3结构域多肽中的至少一个包含选自N390Z和S400Z的突变，其中Z选自带正电的氨基酸和带负电的氨基酸，并且其中所述第一和第二修饰的CH3结构域多肽优先形成具有至少约70℃的熔解温度(Tm)和至少90％的纯度的异源二聚的CH3结构域。在实施方案中提供了分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述第一修饰的CH3结构域多肽包含在位置F405和Y407 处的氨基酸修饰并且所述第二修饰的CH3结构域多肽包含在位置 T394处的氨基酸修饰。在实施方案中提供了分离的异源二聚体Fc构建体，第一修饰的CH3结构域多肽包含在位置L351处的氨基酸修饰。在某些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，所述第二修饰的 CH3结构域多肽包含位置T366和K392中的至少一个的修饰。在一些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，其中所述修饰的CH3 结构域具有至少约75℃的熔解温度(Tm)并且以至少约95％的纯度形成。在某些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，至少一个修饰的CH3结构域多肽包含N390R、S400E和S400R中的至少一个的氨基酸修饰。在一些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，所述第一和第二修饰的CH3结构域多肽中的一个包含在位置347处的氨基酸修饰而另一个修饰的CH3结构域多肽包含在位置360处的氨基酸修饰。在某些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，所述第一和第二修饰的CH3结构域多肽中的至少一个包含T350V的氨基酸修饰。在特定的实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，所述第一修饰的CH3结构域多肽包含选自L351Y、F405A和Y407V的至少一个氨基酸修饰；并且所述第二修饰的CH3结构域多肽包含选自 T366L、T366I、K392L、K392M和T394W的至少一个氨基酸修饰。在本文所述的某些实施方案中是分离的异源二聚体，第一修饰的CH3 结构域多肽包含在位置D399和Y407处的氨基酸修饰，并且第二修饰的CH3结构域多肽包含在位置K409和T411处的氨基酸修饰。在一些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，第一CH3结构域多肽包含在位置L351处的氨基酸修饰，并且第二修饰的CH3结构域多肽包含在位置T366和K392处的氨基酸修饰。在特定的实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，所述第一和第二CH3结构域多肽中的至少一个包含T350V的氨基酸修饰。在某些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，其中所述修饰的CH3结构域具有至少约75℃或更高的熔解温度(Tm)并且以至少约95％的纯度形成。在某些实施方案中提供了本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，所述第一修饰的CH3结构域多肽包含选自L351Y、D399R、D399K、S400D、S400E、S400R、S400K、Y407A和Y407V的氨基酸修饰；并且所述第二修饰的CH3结构域多肽包含选自T366V、T366I、T366L、T366M、N390D、N390E、K392L、K392I、K392D、K392E、 K409F、K409W、T411D和T411E的氨基酸修饰。
本文提供了分离的包含修饰的CH3结构域的异源二聚体Fc构建，所述修饰的CH3结构域包含第一修饰的CH3结构域多肽和第二修饰的CH3结构域多肽，每个修饰的CH3结构域多肽包含至少三个氨基酸突变，其中所述第一和所述第二修饰的CH3结构域多肽中的一个包含选自T411E和T411D的突变，并且其中所述第一和第二修饰的CH3结构域多肽优先形成具有至少约70℃的熔解温度(Tm)和至少90％的纯度的异源二聚的CH3结构域。在实施方案中提供了分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述第一修饰的CH3结构域多肽包含在位置F405和Y407处的氨基酸修饰并且所述第二修饰的CH3结构域多肽包含在位置T394处的氨基酸修饰。在实施方案中提供了分离的异源二聚体Fc构建体，第一修饰的CH3结构域多肽包含在位置 L351处的氨基酸修饰。在某些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，所述第二修饰的CH3结构域多肽包含位置T366和K392中的至少一个的修饰。在一些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，其中所述修饰的CH3结构域具有至少约75℃的熔解温度(Tm)并且以至少约95％的纯度形成。在某些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，至少一个修饰的CH3结构域多肽包含N390R、S400E 和S400R中的至少一个的氨基酸修饰。在一些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，所述第一和第二修饰的CH3结构域多肽中的一个包含在位置347处的氨基酸修饰而另一个修饰的CH3结构域多肽包含在位置360处的氨基酸修饰。在某些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，所述第一和第二修饰的CH3结构域多肽中的至少一个包含T350V的氨基酸修饰。在特定的实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，所述第一修饰的CH3结构域多肽包含选自 L351Y、F405A和Y407V的至少一个氨基酸修饰；并且所述第二修饰的CH3结构域多肽包含选自T366L、T366I、K392L、K392M和 T394W的至少一个氨基酸修饰。在本文所述的某些实施方案中是分离的异源二聚体，第一修饰的CH3结构域多肽包含在位置D399和 Y407处的氨基酸修饰，并且第二修饰的CH3结构域多肽包含在位置 K409和T411处的氨基酸修饰。在一些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，第一CH3结构域多肽包含在位置L351处的氨基酸修饰，并且第二修饰的CH3结构域多肽包含在位置T366和K392处的氨基酸修饰。在特定的实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，所述第一和第二CH3结构域多肽中的至少一个包含T350V的氨基酸修饰。在某些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，其中所述修饰的CH3结构域具有至少约75℃的熔解温度(Tm)或更高并且以至少约95％的纯度形成。在某些实施方案中提供了本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，所述第一修饰的CH3结构域多肽包含选自 L351Y、D399R、D399K、S400D、S400E、S400R、S400K、Y407A 和Y407V的氨基酸修饰；并且所述第二修饰的CH3结构域多肽包含选自T366V、T366I、T366L、T366M、N390D、N390E、K392L、K392I、K392D、K392E、K409F、K409W、T411D和T411E的氨基酸修饰。
本文提供了分离的包含修饰的CH3结构域的异源二聚体Fc构建体，所述修饰的CH3结构域包含包含氨基酸修饰L351Y、F405A和 Y407V的第一修饰的CH3结构域多肽；并且第二修饰的CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366I、K392M和T394W。
一方面，提供了分离的包含修饰的CH3结构域的异源二聚体Fc 构建体，所述修饰的CH3结构域包含包含氨基酸修饰L351Y、F405A 和Y407V的第一修饰的CH3结构域多肽；和包含氨基酸修饰T366I、 K392L和T394W的第二修饰的CH3结构域多肽。
在某一方面，提供了分离的包含修饰的CH3结构域的异源二聚体Fc构建体，所述修饰的CH3结构域包含包含氨基酸修饰L351Y、 F405A和Y407V的第一修饰的CH3结构域多肽；和包含氨基酸修饰T366L、K392M和T394W的第二修饰的CH3结构域多肽。
在一些方面，提供了分离的包含修饰的CH3结构域的异源二聚体Fc构建体，所述修饰的CH3结构域包含包含氨基酸修饰L351Y、 F405A和Y407V的第一修饰的CH3结构域多肽；和包含氨基酸修饰 T366L、K392L和T394W的第二修饰的CH3结构域多肽。
一方面，提供了分离的包含修饰的CH3结构域的异源二聚体Fc 构建体，所述修饰的CH3结构域包含包含氨基酸修饰T350V、L351Y、F405A和Y407V的第一修饰的CH3结构域多肽；和包含氨基酸修饰 T350V、T366L、K392L和T394W的第二修饰的CH3结构域多肽。
一方面，提供了分离的包含修饰的CH3结构域的异源二聚体Fc 构建体，所述修饰的CH3结构域包含包含氨基酸修饰T350V、L351Y、 S400R、F405A、Y407V的第一修饰的CH3结构域多肽；和包含氨基酸修饰T350V、T366L、K392M和T394W的第二修饰的CH3结构域多肽。
一方面，提供了分离的包含修饰的CH3结构域的异源二聚体Fc 构建体，所述修饰的CH3结构域包含包含氨基酸修饰T350V、L351Y、 S400E、F405A、Y407V的第一修饰的CH3结构域多肽；和包含氨基酸修饰T350V、T366L、N390R、K392M和T394W的第二修饰的CH3 结构域多肽。
一方面，提供了分离的包含修饰的CH3结构域的异源二聚体Fc 构建体，所述修饰的CH3结构域包含包含氨基酸修饰T350V、L351Y、 F405A、Y407V的第一修饰的CH3结构域多肽；和包含氨基酸修饰 T350V、T366L、K392L和T394W的第二修饰的CH3结构域多肽。
一方面，提供了分离的包含修饰的CH3结构域的异源二聚体Fc 构建体，所述修饰的CH3结构域包含包含氨基酸修饰T366V、K392L、 K409F和T411E的第一修饰的CH3结构域多肽；和包含氨基酸修饰L351Y、D399R和Y407A的第二修饰的CH3结构域多肽。
一方面，提供了分离的包含修饰的CH3结构域的异源二聚体Fc 构建体，所述修饰的CH3结构域包含包含氨基酸修饰T366V,K392LE K409F和T411E的第一修饰的CH3结构域多肽；和包含氨基酸修饰 L351Y、D399R、S400R和Y407A的第二修饰的CH3结构域多肽。
根据本发明的一个方面，提供了分离的包含异源二聚体Fc区的异源二聚体，其中异源二聚体Fc区包含包含促进异源二聚体形成的氨基酸突变的修饰的CH3结构域，其中异源二聚体Fc区进一步包含变体CH2结构域，所述变体CH2结构域包含促进Fcγ受体的选择性结合的至少一个不对称氨基酸修饰。在一个实施方案中，与野生型 CH2结构域相比，变体CH2结构域选择性结合FcγIIIa受体。在一个实施方案中，所述修饰的CH3结构域具有约70℃或更高的熔解温度 (Tm)。在某些实施方案中，所述修饰的CH3结构域具有至少约75℃的熔解温度(Tm)。在一些实施方案中，所述修饰的CH3结构域具有至少约80℃的熔解温度(Tm)。
另一方面，提供了分离的包含异源二聚体Fc区的异源二聚体，其中异源二聚体Fc区包含包含氨基酸突变的修饰的CH3结构域，其中所述修饰的CH3结构域具有约70℃或更高的熔解温度(Tm)，并且其中与不包含氨基酸突变的CH3结构域相比，所述修饰的CH3结构域导致具一个或多个氨基酸突变异源二聚体Fc区的形成。在一个实施方案中，相对于野生型Fc区，异源二聚体Fc区在CH3结构域中不包含额外的二硫键。在可替代的实施方案中，相对于野生型Fc区，异源二聚体Fc区在所述修饰的CH3结构域中包含至少一个额外的二硫键，前体条件是约70℃或更高的熔解温度(Tm)是在不存在额外的二硫键的情况下。在另一个实施方案中，相对于野生型Fc区，异源二聚体Fc区在所述修饰的CH3结构域中包含至少一个额外的二硫键，并且其中所述修饰的CH3结构域具有约77.5℃或更高的熔解温度(Tm)。
在一个实施方案中提供了分离的包含异源二聚体Fc区的异源二聚体，其中异源二聚体Fc区包含包含氨基酸突变的修饰的CH3结构域，其中所述修饰的CH3结构域具有约70℃或更高的熔解温度(Tm) 并且异源二聚体Fc区以大于约90％的纯度形成或异源二聚体Fc区以大于约95％或更高的纯度形成或异源二聚体Fc区以约98％或更高的纯度形成。
在某些实施方案中还提供了分离的包含异源二聚体Fc区的异源二聚体，其中异源二聚体Fc区包含包含一个或多个氨基酸突变的修饰的CH3结构域，与不包含所述一个或多个氨基酸突变的CH3结构域相比，所述氨基酸突变导致具一个或多个氨基酸突变异源二聚体 Fc区的形成，其中所述修饰的CH3结构域具有约70℃或更高的熔解温度(Tm)或Tm为约71℃或更高或Tm为约74℃或更高。在另一个实施方案中，异源二聚体Fc区在具有约98％或更高的纯度的溶液中形成，且Tm约73℃或其中异源二聚体Fc区以约90％或更高的纯度形成，且Tm约75℃。
在某些实施方案中提供了分离的包含异源二聚体Fc区的异源二聚体，其中异源二聚体Fc区包含第一和第二CH3结构域多肽，其中所述第一和第二CH3结构域多肽中的至少一个包含氨基酸修饰 T350V。在某些实施方案中提供了分离的包含异源二聚体Fc区的异源二聚体，其中异源二聚体Fc区包含包含氨基酸修饰T350V的第一 CH3结构域多肽和也包含氨基酸修饰T350V的第二CH3结构域多肽。在某些实施方案中提供了分离的包含异源二聚体Fc区的异源二聚体，其中异源二聚体Fc区包含包含在位置F405和Y407处的氨基酸修饰的第一CH3结构域多肽和包含在位置T394处的氨基酸修饰第二CH3结构域多肽。第一CH3结构域多肽包含在位置D399和Y407 处的氨基酸修饰并且第二CH3结构域多肽包含在位置K409和T411 处的氨基酸修饰。在某些实施方案中提供了分离的包含异源二聚体 Fc区的异源二聚体，其中异源二聚体Fc区包含包含氨基酸修饰 L351Y和Y407A的第一CH3结构域多肽并且第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366A和K409F。一方面，第一CH3结构域多肽或第二CH3结构域多肽包含在位置T411、D399、S400、F405、N390 或K392处的另一个氨基酸修饰。在位置T411处的氨基酸修饰选自 T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W。在位置 D399处的氨基酸修饰选自D399R、D399W、D399Y或D399K的。在位置S400处的氨基酸修饰选自S400E、S400D、S400R或S400K。在位置F405处的氨基酸修饰选自F405I、F405M、F405T、F405S、F405V或F405W。在位置N390处的氨基酸修饰选自N390R、N390K 或N390D。在位置K392处的氨基酸修饰选自K392V、K392M、K392R、 K392L、K392F或K392E。
在某些实施方案中提供了分离的包含异源二聚体Fc区的异源二聚体，其中异源二聚体Fc区包含包含氨基酸修饰T350V和L351Y的第一CH3结构域多肽和也包含氨基酸修饰T350V和L351Y的第二 CH3结构域多肽。
在另一个实施方案中提供了分离的包含异源二聚体Fc区的异源二聚体，其中异源二聚体Fc区包含包含氨基酸修饰Y407A的第一 CH3结构域多肽和包含氨基酸修饰T366A和K409F的第二CH3结构域多肽。一方面，第一CH3结构域多肽或第二CH3结构域多肽进一步包含氨基酸修饰K392E、T411E、D399R和S400R。另一方面，第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰D399R、S400R和Y407A并且第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366A、K409F、K392E和T411E。在另一实施方案中所述修饰的CH3结构域具有约74℃或更高的熔解温度(Tm)并且异源二聚体具有约95％或更高的纯度。
在另一个实施方案中提供了分离的包含异源二聚体Fc区的异源二聚体，其中异源二聚体Fc区包含包含在位置L351处的氨基酸修饰和氨基酸修饰Y407A的第一CH3结构域多肽以及包含在位置T366 处的氨基酸修饰和氨基酸修饰K409F的第二CH3结构域多肽。一方面，在位置L351处的氨基酸修饰选自L351Y、L351I、L351D、L351R 或L351F。另一方面，在位置Y407处的氨基酸修饰选自Y407A、 Y407V或Y407S。又另一个方面，在位置T366处的氨基酸修饰选自 T366A、T366I、T366L、T366M、T366Y、T366S、T366C、T366V 或T366W。在一个实施方案中，所述修饰的CH3结构域具有约75℃或更高的熔解温度(Tm)并且异源二聚体具有约90％或更高的纯度。
在另一个实施方案中提供了分离的包含异源二聚体Fc区的异源二聚体，其中异源二聚体Fc区包含包含在位置F405处的氨基酸修饰和氨基酸修饰L351Y和Y407V的第一CH3结构域多肽以及包含氨基酸修饰T394W的第二CH3结构域多肽。一方面，第一CH3结构域多肽或第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰在位置K392、T411、 T366、L368或S400。在位置F405处的氨基酸修饰是F405A、F405I、 F405M、F405T、F405S、F405V或F405W。在位置K392处的氨基酸修饰是K392V、K392M、K392R、K392L、K392F或K392E。在位置T411处的氨基酸修饰是T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、 T411E或T411W。在位置S400处的氨基酸修饰是S400E、S400D、S400R或S400K。在位置T366处的氨基酸修饰是T366A、T366I、 T366L、T366M、T366Y、T366S、T366C、T366V或T366W。在位置L368处的氨基酸修饰是L368D、L368R、L368T、L368M、L368V、L368F、L368S和L368A。
在另一个实施方案中提供了分离的包含异源二聚体Fc区的异源二聚体，其中异源二聚体Fc区包含包含氨基酸修饰L351Y、F405A 和Y407V的第一CH3结构域多肽和包含氨基酸修饰T394W的第二 CH3结构域多肽。一方面，第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰 T366L或T366I。
在又另一个实施方案中提供了分离的包含异源二聚体Fc区的异源二聚体，其中异源二聚体Fc区包含包含氨基酸修饰Y349C、F405A 和Y407V中的至少一个的第一CH3结构域多肽和包含氨基酸修饰 T366I、K392M和T394W的第二CH3结构域多肽。
在某些实施方案中提供了分离的包含异源二聚体Fc区的异源二聚体，其中异源二聚体Fc区包含包含氨基酸修饰L351Y、F405A和 Y407V的第一CH3结构域多肽和包含氨基酸修饰K392M和T394W、以及T366L和T366I中的一个的第二CH3结构域多肽。
在另一个实施方案中提供了分离的包含异源二聚体Fc区的异源二聚体，其中异源二聚体Fc区包含包含氨基酸修饰F405A和Y407V 的第一CH3结构域多肽和包含氨基酸修饰T366L和T394W的第二 CH3结构域多肽。
在另一个实施方案中提供了分离的包含异源二聚体Fc区的异源二聚体，其中异源二聚体Fc区包含包含氨基酸修饰F405A和Y407V 的第一CH3结构域多肽和包含氨基酸修饰T366I和T394W的第二 CH3结构域多肽。
在异源二聚体的某些实施方案中提供了双特异性抗体或多特异性抗体。
在另一个实施方案中提供了包含本发明的异源二聚体和药学上可接受的载体的组合物。
在另一个实施方案中提供了包含编码本发明的异源二聚体的核酸的宿主细胞。
在某些实施方案中提供了异源二聚体，其中异源二聚体包含至少一种治疗性抗体。一方面，治疗性抗体选自：阿巴伏单抗 (abagovomab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿伦珠单抗、奥罗格雷 (aurograb)、巴匹珠单抗、巴利昔单抗、贝利木单抗(belimumab)、贝伐珠单抗、briakinumab、卡那单抗(canakinumab)、卡妥索单抗 (catumaxomab)、塞舍珠单抗(certolizumab pegol)、西妥昔单抗、达克珠单抗、地舒单抗(denosumab)、依法珠单抗、加利昔单抗(galiximab)、吉妥珠单抗奥佐米星、戈利木单抗(golimumab)、替伊莫单抗、英利昔单抗、伊匹木单抗、鲁昔单抗、美泊利单抗、莫他珠单抗、莫罗单抗、mycograb、那他珠单抗、尼妥珠单抗、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、培妥珠单抗、雷珠单抗、瑞利珠单抗、利妥昔单抗、替利珠单抗(teplizumab)、托珠单抗/atlizumab、托西莫单抗、曲妥珠单抗、 ProxiniumTM、RencarexTM、优特克单抗和扎芦木单抗(zalutumumab)。
在本发明的异源二聚体的另一个实施方案中提供了治疗患有由癌抗原表征的癌症的患者中的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的异源二聚体。
在本发明的异源二聚体的另一个实施方案中提供了治疗患有由免疫抗原表征的免疫病症的患者中的免疫病症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的异源二聚体。
在某些实施方案中，在本文所述的异源二聚体构建体中所用的修饰的Fc区包含G型免疫球蛋白，例如被定义为2类免疫球蛋白(IgG2) 或3类免疫球蛋白(IgG3)的免疫球蛋白。在一些实施方案中，在本文所述的异源二聚体构建体中所用的修饰的Fc区包含免疫球蛋白M或 IgM。在一些实施方案中，在本文所述的异源二聚体构建体中所用的修饰的Fc区包含免疫球蛋白A或IgA。在一些实施方案中，在本文所述的异源二聚体构建体中所用的修饰的Fc区包含免疫球蛋白D或 IgD。在一些实施方案中，在本文所述的异源二聚体构建体中所用的修饰的Fc区包含免疫球蛋白E或IgE。在某些实施方案中，在本文所述的异源二聚体构建体中所用的修饰的Fc区包含所有类别的免疫球蛋白G同种型，例如被定义为1类(IgG1)、2类(IgG2)、3类(IgG3) 或4类(IgG4)免疫球蛋白的免疫球蛋白。
附图简述
图1是显示CH3(顶部)、CH2(中部)和受体区域的野生型抗体的图示3-D结构。在左手侧上的虚线矩形扩展至右手侧，其显示CH3 的靶区的两个区域，区域1和区域2；
图2是显示在位置368处的野生型残基的图示3-D代表；
图3是显示突变的位置368的区域1的图示3-D代表；
图4是显示区域2中额外突变的图示3-D代表；
图5是对于前三种变体AZ1、AZ2和AZ3的碰撞评分、接口面积差异、包装差异、静电能差异和整体“亲和力评分”的计算机芯片上计算值的表格；
图6是显示“构建在”变体AZ1上的变体AZ2和AZ3的图示3-D 图像；
图7显示AZ2和AZ3变体的图示3-D代表；
图8显示如图5中但对于AZ1、AZ2和AZ3异源二聚体和潜在同源二聚体的表格。没有显示关于同源二聚体的亲和力评分，因为其是不相关的；
图9是野生型(左)和突变的AZ4(右)的3-D代表的图示；
图10显示如图5且显示对于AZ4异源二聚体和潜在同源二聚体的计算机上芯片计算值的表格；
图11是CH3变体AZ5(左)和AZ6(右)的图示；
图12如图5所述且显示对于AZ4、AZ5和AZ6的计算机上芯片数据的表格；
图13是抗体在左侧的图示3-D代表，具有使用异源二聚方法在受体区域的结合特征的可能性的绘图；
图14是IgG分子的图示；
图15显示Fcγ受体的多重序列比对。Genebank/Uniprot序列ID： FcγRIIA(spP12318)、FcγRIIB(sp P31994)、FcγRIIC(gi 126116592)、 FcγRIIIA(sp P08637)、FcγRIIIB(sp O75015)；
图16是Fc-FcγRIIIb复合物的晶体结构的图示[PDB ID:1T83, Radaev&Sun]。Fc和Fcγ受体的1:1复合物观察到在Fc和FcγR的两条链之间具有不对称接触；
图17显示基于由本文所述的异源二聚的变体形成的不对称Fc支架的多功能分子的图示：不对称Fc支架和不对称Fc单体IgG臂；
图18显示基于由本文所述的异源二聚的变体形成的不对称Fc支架的多功能分子的图示：不对称Fc单特异性IgG臂和不对称Fc双特异性IgG臂(共用轻链)；
图19显示基于由本文所述的异源二聚的变体形成的不对称Fc支架的多功能分子的图示。不对称Fc双特异性IgG臂和功能分子如毒素；
图20显示基于由本文所述的异源二聚的变体形成的不对称Fc支架的多功能分子：不对称Fc单一scFv臂和不对称Fc双特异性scFv 臂；
图21显示基于由本文所述的异源二聚的变体形成的不对称Fc支架的替代多功能分子：不对称Fc三特异性scFv臂和不对称Fc四特异性scFv臂。
图22显示了为了更好的FcγR选择性在Fc的一面不对称设计突变引入了用于FcγR相互作用的产生侧面和具有野生型样相互作用的非产生面。可以引入Fc的非产生面上的突变以阻断与FcR的相互作用和Fc偏好极性，以便只在产生面上相互作用。
图23显示了亲本野生型重链人IgG1序列的氨基酸序列。
图24显示Fc异源二聚体设计的迭代过程，其组合如下详述的阳性和阴性设计策略。
图25A-25C显示用来确定异源二聚体纯度的体外测定。该测定基于具有不同分子量的两条Fc重链的全长单特异性抗体支架；重链 A具有C-末端His标记(His)且重链B具有C末端可裂解的mRFP标记(RFP)。两条重链A(His)和B(RFP)连同固定量的轻链以不同的相对比率进行表达，产生具有不同分子量的3种可能的二聚体种类：a) 同源二聚体链A(His)/链A(His)(约150kDa)；b)异源二聚体链A (His)/链B(RFP)(约175kDa)；c)同源二聚体链B(RFP)/链B(RFP)(约 200kDa)。表达后，如实施例2中所述，通过非还原性SDS-PAGE确定异源二聚体相比于两种同源二聚体的比例，其允许通过分子量分开 3种二聚体种类。用考马斯亮蓝染色SDS-PAGE凝胶。图25A：测试的变体是仅WT链A(His)；仅WT链B(RFP)；WT链A(His)加链B (RFP)；对照1链A(His)加链B(RFP)，其具有>95％的报道的异源二聚体纯度。用针对如上所述针对IgG-Fc(抗Fc)、mRFP Tag(抗mRFP) 和HisTag(抗His)的抗体通过Western印迹验证二聚体条带的组成。 SDS-PAGE显示对于His/His同源二聚体的单一条带，对于His/RFP异源二聚体的双条带和对于RFP同源二聚体的多条带。多条带是 mRFP标记的人工产物且已被证实不影响Fc异源二聚体的物理特性。图25B：以公开的Fc异源二聚体变体对照1-4作为对照验证 SDS-PAGE测定，参见表A。以不同的链A(His)相比于链B(RFP)的相对比例表达变体：具体而言，分别地，比例1:3等于25％、10％、 65％的LC、HC_His、HC_mRFP比例；比例1:1等于25％、20％、55％的LC、HC_His、HC_mRFP比例且比例3:1等于25％、40％、35％的 LC、HC_His、HC_mRFP比例(链A(His)与链B(RFP)的表观1:1表达对于WT Fc已经确定为接近20％/55％(His/RFP))。图25C显示非还原SDS-PAGE测定以确定支架1变体的异源二聚体纯度。以不同的链A(His)相比于链B(RFP)的相对比例表达Fc变体，且如图2中所述通过非还原SDS-PAGE进行分析。具体而言，分别地，比例1:3 等于25％、10％、65％的LC、HC_His、HC_mRFP比例；比例1:1等于25％、20％、55％的LC、HC_His、HC_mRFP比例且比例3:1等于 25％、40％、35％的LC、HC_His、HC_mRFP比例(链A(His)与链B(RFP) 的表观1:1表达对于WT Fc已经确定为接近20％/55％(His/RFP))。
图26A-26B显示以链A(His)相比于链B(RFP)的特定比例表达 Fc的异源二聚体变体(参见表2)，通过蛋白A亲和层析纯化且如图 25A-25C中所述通过非还原SDS-PAGE进行分析。图26A说明基于通过目视检查SDS-PAGE结果所观察到的纯度的异源二聚体分类。为了比较，将等量的蛋白A纯化的产物上样至凝胶上。已经通过对选择的变体的LC/MS验证了该基于非还原SDS-PAGE的纯度的定义 (参见图28)。图26B提供了选择的蛋白A纯化的异源二聚体变体 (AZ94、AZ86、AZ70、AZ33和AZ34)的示例性SDS-PAGE结果。
图27A-27B说明用来测定由本文所述的异源二聚体变体形成的异源二聚的CH3-CH3结构域的熔解温度的DSC分析。使用两种独立方法以确定熔解温度。图27A提供了这样的热谱图，其拟合至4次独立的非2态转换(non-2-state-transitions)且进行优化以产生接近于 Herceptin的报道文献值约72℃(CH2)和约82℃(Fab)的CH2和Fab 转换值。图27B显示异源二聚体变体的标准化和基线校正的热谱图从 WT中减去，以产生仅对于CH3转换的正负差峰值。
图28说明如实施例2中所述的实例变体AZ70的LC/MS分析。注明了糖基化异源二聚体和同源二聚体的预期(计算的平均值)质量。与异源二聚体质量一致的区域含有对应于损失甘氨酸(-57Da)和添加 1个或2个己糖(分别为+162Da和+324Da)的主峰。如果没有对应于任一种同源二聚体的明显峰，那么异源二聚体纯度被归类为>90％。
图29A-29D显示在计算机芯片上分析初始阴性设计变体和独立阳性设计优化：支架1-疏水核心。显示了WT(图29A)；AZ6(图 29B)；AZ33(图29C)；和AZ19(图29D)的CH3接口。如详述部分所述的计算机芯片上的综合分析和变体与WT的比较表明，初始 AZ33异源二聚体的稳定性低于WT稳定性的原因之一是Y407和 T366的核心相互作用/包装的损失。初始AZ33显示如图29B所示的在该疏水核心处的非最佳包装，表明该区域、尤其是在位置T366处的优化可以改进AZ33的稳定性。这一点在图29C和图29D中以T366I 与T366L进行说明。实验数据与这种结构分析相关且显示T366L给出了Tm的最大改进。参见，实施例5。
图30显示在计算机芯片上分析初始阴性设计变体和独立阳性设计优化：支架1-稳定399-400环构型，说明在初始支架1变体AZ8 例举的构象动力学分析的实用性和重要性。在计算机芯片上诱变后的结构(接近WT的骨架构型)与50ns分子动力学模拟分析的代表性结构相叠加。该图突出了AZ8变体相比于WT的环区域D399-S400的较大构象差异，其进而将疏水核心暴露于溶剂且引起AZ8异源二聚体的稳定性降低。
图31A-31C显示在计算机芯片上分析初始阴性设计变体和独立阳性设计优化：支架1-稳定399-400环构型，说明来自计算机芯片上综合分析和MD模拟的信息如何用于所述阳性设计策略。如图30中所示，AZ8稳定性低于WT稳定性的原因之一是环399-400与409的减弱的相互作用，这主要是由于F405包装相互作用的损失(参见图 31A(WT)相比于对图31B(AZ8)的比较)。阳性设计策略之一是优化区域的疏水性包装以稳定399-400环构象。这通过图31C中所示的 K392M突变而实现。图31C代表异源二聚体AZ33，其具有74°的Tm，相比之下，初始阴性设计变体AZ8具有68°的Tm。
图32A-32B说明使用分子动力学轨迹的主成分分析观察到的Fc 分子的动力学。图32A显示作为参考的Fc结构的骨架轨迹。图32B 和C代表沿Fc结构中顶部2种主要运动方式观察到的动力学重叠。链A和B的CH2结构域表现出相对于彼此明显的开/关运动，而CH3 结构域是相对刚性的。CH3接口处的突变影响CH2结构域中这种开/ 关运动的相对灵活性和动力学。
图33A-33C显示在计算机芯片上分析初始阴性设计变体和独立阳性设计优化：支架2-疏水性包装，说明两个支架2变体相比于WT 的疏水核心包装。WT Fc(图33A)；AZ63(图33B)；和AZ70(图 33C)。初始支架2变体的计算机芯片上的综合分析表明，Y407-T366 核心WT相互作用的损失是初始支架2变体的稳定性低于WT稳定性的原因之一。Y407-T366的损失被突变K409F部分补偿，但如图33B 中所示，特别地T366A突变留下疏水核心中的腔体，这使变体相比于WT不稳定。如图33C中的Fc变体AZ70所示，由额外突变 T366V_L351Y靶向该疏水核心证明是成功的；AZ70具有75.5℃的实验确定的Tm。参见，表4以及实施例6。
图34A-34C显示在计算机芯片上分析初始阴性设计变体和独立阳性设计优化：支架2-稳定399-400环构型，说明两个支架2变体相比于WT的环399-400的相互作用：WT Fc(图34A)；AZ63(图 34B)；和AZ94(图34C)。初始支架2变体的计算机芯片上的综合分析表明，由于突变K409F的WT盐桥K409-D399的损失(图34A) 和因此不满意D399(图34B)引起399-400环的更加'开放的'构象。这进而导致疏水核心的更大的溶剂暴露和变体相比于WT的进一步的不稳定。用于稳定399-400环且补偿K409-D399相互作用损失的策略之一是设计如图34C对于变体AZ94所示的额外的盐桥D399R-T411E 和S400R-K392E。实验数据显示>95％的纯度和74℃的Tm。参见，表4以及实施例6。此外，尽管AZ94与初始支架2变体(纯度<90％， Tm 71℃)相比具有相当高的纯度和稳定性，但是与AZ70变体中鉴定的“最佳”疏水核心突变相比，AZ94的疏水核心突变是次优选的(图 33)。由于AZ70中疏水核心的突变(T366V_L351Y)在环399-400处的 AZ94的盐桥突变的远端，所以预期AZ70氨基酸突变和额外的AZ94 突变的组合具有比AZ70或AZ94更高的熔解温度。可以如实施例1-4 中所述测试该组合。
图35说明同源二聚的IgG1 Fc、异源二聚的变体het1(对照 1):A:Y349C_T366S_L368A_Y407V/B:S354C_T366W和het2(对照 4):A:K409D_K392D/B:D399K_D356K与六种Fcγ受体结合的结合常数(Ka(M-1))。与野生型IgG1 Fc相比，异源二聚的Fc变体趋向于显示与Fcγ受体结合的轻微改变。参见，实施例7。
图36A显示基于野生型结合强度作为参考，野生型IgG1 Fc和它的各种同源二聚体和不对称突变体形式与IIbF、IIBY和IIaR受体的相对结合强度。(Homo Fc+S267D)是指同源二聚的Fc与两条链上的 S267D突变的结合强度。(Het Fc+asym S267D)是指同源二聚的Fc与Fc中两条链之一中引入S267D突变的结合强度。报道了通过在两条Fc链中任一条上引入突变而获得的结合强度的平均值。在一条链上引入该突变将结合强度降低至对于同源二聚形式中相同突变观察到强度的约一半。(Het Fc+asym S267D+asym E269K)是指同源二聚的Fc与两条Fc链之一上以不对称方式中引入S267D和E269K突变的结合强度。E269K突变阻断了FcgR与Fc的一个面的相互作用，且能够将结合强度降低对于不对称S267D变体(Het Fc+S267D)本身所观察到的结合强度的约一半。此处的Het Fc是由图35中对于变体 het2(对照4)所指出的CH3突变构成。
图36B显示各种Fc及其变体与多种FcgRIIa、FcgRIIb和FcgRIIIa 同种异型的结合常数(Ka(M-1))。野生型IgG1 Fc对于各种Fcg受体的 Ka以具有水平阴影的柱表示。具有垂直阴影的条(同源二聚体基础2) 代表异源二聚体Fc与突变S239D/D265S/I332E/S298A的Ka。具有倾斜阴影的柱代表同源二聚体Fc与CH2结构域中不对称突变 A:S239D/D265S/I332E/E269K和B:S239D/D265S/S298A的Ka。不对称突变的引入能够实现IIIa和IIa/IIb受体之间的增加的选择性。此处的异源二聚体Fc是由图35中对于变体het2(对照4)所指出的CH3突变构成。
图36C显示野生型IgG1和Fc区的CH2结构域中涉及同源二聚或不对称突变的三种其他变体的结合常数(Ka(M-1))。野生型Fc的Ka 以网格阴影的柱表示。Fc变体与在Fc的两条链上以同源二聚方式(同源二聚体基础1)中引入的基础突变 S239D/K326E/A330L/I332E/S298A的Ka以倾斜模式的柱显示。在异源二聚的Fc(异源二聚基础1)的链A和B中以不对称方式引入相关突变以水平线显示。具有垂直阴影线的柱代表包括E269K突变的不对称变体(异源基础1+PD)。此处的异源二聚体Fc是由图35中对于变体het2(对照4)所指出的CH3突变构成。
图37-表6是基于如实施例5中对于支架1所述的第三设计阶段的变体CH3结构域的列表。
图38-表7是基于如实施例6中对于支架2所述的第三设计阶段的修饰的CH3结构域的列表。
图39A-39B说明使用LC/MS在无任何C-末端标记下变体的纯度确定。图39A显示一个代表性变体的LC/MS光谱(AZ162： L351Y_F405A_Y407V/T366L_K392L_T394W)。如实施例中所述，使用3种不同的1:1.5(AZ133-1)、1:1(AZ133-2)和1.5:1(AZ133-3)的重链-A与重链-B的比例通过短暂共表达来表达变体。纯化样品并在 37℃用Endo S脱糖基化1小时。在MS分析之前将样品注射到Poros R2柱并且在具有20-90％ACN,0.2％FA的梯度中洗脱3分钟。LC柱的峰用LTQ-Orbitrap XL质谱仪(锥孔电压：50V’镜筒透镜：215V； FT分辨率：7,500)分析并且用软件Promass积分以产生分子量分布。图39B显示对照2样品的LC/MS光谱，其表示结节入孔变体。如实施例中所述，使用3种不同的1:1.5(对照2-1)、1:1(对照2-2)和1.5:1 (对照2-3)的重链-A与重链-B的比例通过短暂共表达来表达变体。纯化样品并在37℃用Endo S脱糖基化1小时。在MS分析之前将样品注射到Poros R2柱并且在具有20-90％ACN,0.2％FA的梯度中洗脱3 分钟。LC柱的峰用LTQ-Orbitrap XL质谱仪(锥孔电压：50V’镜筒透镜：215V；FT分辨率：7,500)分析并且用软件Promass积分以产生分子量分布。
图40A-40B使用与Fc异源二聚体的链-A和链-B的N末端稠合的Fc异源二聚体抗-HER2和抗-HER3 scFv验证双特异性结合。在图 40-A中说明所获得的变体双特异性HER2/HER3变体和两个单价-单特异性HER2、HER3变体(深灰色的链-A；浅灰色的链-B)。图40-B 验证双特异性结合的测试。
图41说明比较野生型IgG1 Fc和AZ3003的计算模型。AZ3002 的计算模型在T350位置处与AZ3003相同。该表总结了所选择的异源二聚体变体和T350V突变对CH3熔解温度的稳定效应。该图显示如实施例11中所述地表达并纯化异源二聚体变体。如实施例3中所述地进行DSC并且如实施例11中所述地进行LC/MS定量。
图42说明先导异源二聚体的晶体结构和预测的模型的比较。在卡通图示中突显突变的接口残基(表中所示)。
图43描绘了对纯化的先导异源二聚体的糖基化模式的分析。
图44说明对纯化的先导异源二聚体的强制降解评估的结果。
图45描绘了工业标准抗体纯化方法流程。
图46描绘了AZ3003异源二聚体变体的下游纯化评估的总结，显示步骤收率和回收率(详细参见实施例15)。如实施例11中详细所述地，在10L短暂CHO中制备异源二聚体。
详述
本文提供了包含促进异源多聚体形成的特定氨基酸修饰的修饰的CH3结构域。在一个实施方案中，修饰的CH3结构域包含促进异源二聚体形成的特定氨基酸修饰(参见，例如表1.1-1.3)。在另一个实施方案中，修饰的CH3结构域包含具有增加稳定性的促进异源二聚体形成的特定氨基酸修饰(参见，例如表4、表6和表7)。将稳定性测量作为CH3结构域的熔解温度(Tm)，并且增加的稳定性是指约70℃或更高的Tm。CH3结构域形成异源多聚体或多特异性抗体的Fc区的部分。因此，在一个实施方案中，本文提供了包含异源二聚体Fc 区的异源多聚体，其中所述异源二聚体Fc区包含修饰的或变体CH3 结构域，所述修饰的CH3结构域包含促进异源二聚体形成的氨基酸突变，其中所述修饰的CH3结构域选自表1所列变体。在第二个实施方案中，提供了包含异源二聚体Fc区的异源多聚体，其中所述异源二聚体Fc区包含具有增加稳定性的变体CH3结构域，所述修饰的CH3结构域包含促进异源二聚体形成的氨基酸突变，其中所述修饰的 CH3结构域具有约70℃或更高的熔解温度(Tm)。
用来生成修饰的CH3结构域的氨基酸修饰包括，但不限于，氨基酸插入、缺失、取代、和重排。CH3结构域的修饰和修饰的CH3 结构域在本文中被统称为“CH3修饰”、“修饰的CH3结构域”、“修饰的CH3结构域”或“CH3变体”。在某些实施方案中，将这些修饰的 CH3结构域并入选择的分子。相应地，在一个实施方案中，提供了分子，例如多肽，诸如免疫球蛋白(例如，抗体)和其他结合蛋白，其包含并入修饰的CH3结构域的Fc区(如本文所使用的“Fc区”和类似术语包括包含CH3结构域的至少部分的任何重链恒定区结构域)。包含含有修饰的CH3结构域(例如，包含一个或多个氨基酸插入、缺失、取代、或重排的CH3结构域)的Fc区的分子在本文被称为“Fc变体”、“异源二聚体”或“异源多聚体”。本Fc变体包含已经不对称修饰的CH3 结构域以产生异源二聚体Fc变体或区域。Fc区是由两个重链恒定结构域多肽-链A和链B-构成，所述链A和链B可以交换使用，条件是每个Fc区包含一个链A和一个链B多肽。将氨基酸修饰以不对称方式引入CH3，当两个修饰的CH3结构域形成Fc变体时导致异源二聚体(见，例如，表1)。如本文所使用的，不对称的氨基酸修饰是其中在一种多肽(例如，“链A”)上特定位置的氨基酸不同于异源二聚体或Fc变体的相同位置的第二种多肽(例如，“链B”)上的氨基酸的任何修饰。这可以是来自对Fc变体的链A和链B的两个不同氨基酸的两个氨基酸中仅一个的修饰或两个氨基酸的修饰的结果。可以理解的是，修饰的CH3结构域包含一个或多个不对称的氨基酸修饰。
在第一和所述第二CH3结构域多肽之间的接口处的氨基酸是在第一或第二CH3结构域多肽上的与在另一个CH3结构域多肽上的氨基酸相互作用(导致形成二聚的CH3结构域)的任何氨基酸。不在第一和所述第二CH3结构域多肽之间的接口处的氨基酸是在第一或第二 CH3结构域多肽上的不与在另一个CH3结构域多肽上的氨基酸相互作用的任何氨基酸。在本文所述的实施方案中，不在第一和所述第二 CH3结构域多肽之间的接口处的修饰的氨基酸是在第一或第二CH3 结构域多肽上的在其如本文所述进行修饰后不与在另一个CH3结构域多肽上的氨基酸的任何氨基酸。例如，在本文所述的某些实施方案中，提供了氨基酸位置T350的修饰。如实施例12中提供的和图42 中显示的晶体结构所表明，T350不参与两个CH3结构域多肽之间的相互作用。对T350的任何修饰已显示对CH3二聚体的形成具有微不足道的影响，如由Carter等人Biochemistry 1998,37,9266所述。在本文所述的异源二聚体Fc构建体中，观察到在T350位置处的修饰对变体CH3结构域具有不期望的稳定效应，尽管其不直接参与CH3二聚体自身的形成。例如，包含至少一个T350X修饰的变体(其中X是选自缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、及其衍生物或变体的天然或非天然氨基酸)形成非常稳定的变体CH3结构域。在本文所述的一些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其包含至少一个T350V修饰。在某些实施方案中，第一和第二变体CH3结构域多肽包含与不包含所述修饰的对应的CH3结构域相比赋予变体CH3 结构域不期望的稳定性的T350V修饰。
除非另有说明，在本说明书中，任何浓度范围、百分比范围、比例范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数值，适当时也包括其分数值(如整数的十分之一和百分之一)。除非另有说明，本文所使用的“约”指所述范围、数值、序列或结构的±10％。应理解，除非另有说明或上下文注明，本文所用术语“一个”和“一种”指“一个或多个”所列举的组分。替代物的使用(例如“或”)应理解为所述替代物中的一个、两个或其任何组合。本文所使用术语“包括”和“包含”可以作为同义词使用。此外，应理解衍生自本文所述结构和取代物(如修饰的CH3结构域)的各种组合的单个单链多肽或异源二聚体就好像各单链多肽或异源二聚体单独列出那样相同的程度被本申请所公开。因此，特定组分形成单个单链多肽或异源二聚体的选择属于本发明范围内。
“第一多肽”是与第二多肽结合的任何多肽，在本文中也称为“链 A”。第一和第二多肽在“接口”处相遇。“第二多肽”是经由“接口”与第一多肽结合的任何多肽，在本文中也称为“链B”。“接口”包含在第一多肽中与第二多肽的接口中的一个或多个“接触”氨基酸残基相互作用的那些“接触”氨基酸残基。如本文所使用的，接口包含Fc区的CH3 结构域，其优选源自IgG抗体，最优选人IgG1抗体。
如本文所使用，“分离的”异源多聚体意味着已经鉴定和从其天然细胞培养环境的组分中分离和/或回收的异源多聚体。其天然环境的污染组分是可干扰所述异源多聚体的诊断或治疗性用途的物质，可以包括酶、激素和其他蛋白或非蛋白溶质。
侧链体积"基本上不大于"第一氨基酸的氨基酸是侧链体积比基于来自A.A.Zamyatnin,Prog.Biophys.Mol.Biol.24：107-123,1972 的侧链体积值的第一氨基酸大不超过的任何氨基酸。在某些实施方案中，所述体积比第一氨基酸大不超过在一些实施方案中，所述体积比第一氨基酸大不超过例如，在本文所述的某些实施方案中是赖氨酸(K)的突变诸如K392J，其中J选自L、I或侧链体积基本上不大于K的侧链体积的氨基酸。
变体Fc异源二聚体一般纯化至基本上同质性。短语“基本上同质”、“基本上同质形式”和“基本上同质性”用来表明产物基本上没有源自不需要的多肽组合的副产物(例如，同源二聚体)。在纯度的方面表示，基本上同质性是指副产物的量不超过10％，优选为低于5％，更优选低于1％，最优选低于0.5％，其中所述百分比以重量计。
抗体技术领域技术人员理解的术语各自具有所述领域获得的含义，除非本文作明确的不同定义。已知抗体具有变体区、铰链区和恒定结构域。有关免疫球蛋白结构和功能的综述参见例如Harlow等人编，Antibodies：A Laboratory Manual，第14章Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，1988)。
在通过平衡稳定性相比于特异性的蛋白工程改造的背景中通过阳性和阴性设计的概念显示从野生型同源二聚体设计变体Fc异源二聚体，其中以当多肽在细胞培养条件中表达时驱动异源二聚体形成超过同源二聚体形成为目标引入突变。通过在一条链引入大侧链且在另一条链引入小侧链，例如Genentech开发的结节入孔(Knobs-into-holes) 策略(Ridgway JB,Presta LG,Carter P.‘Knobs-into-holes'engineering of antibodyCH3domains for heavy chain heterodimerization.Protein Eng. 1996Jul；9(7):617-21；Atwell S,Ridgway JB,Wells JA,Carter P.Stable heterodimers from remodelingthe domain interface of a homodimer using a phage display library.J MolBiol.270(1):26-35(1997)))，或通过导致排斥同源二聚体形成的静电工程改造，例如Amgen开发的静电转向策略(Gunaskekaran K,等人Enhancing antibody Fc heterodimerformation through electrostatic steering effects:applications to bispecificmolecules and monovalent IgG.JBC 285(25):19637-19646(2010))阴性设计策略使对同源二聚体形成不利的相互作用最大化。在这两个实例中，将阴性设计不对称点突变引入野生型CH3结构域以驱动异源二聚体形成。迄今为止，只有阴性设计策略已经用于开发Fc异源二聚体。公开的结果显示，仅使用阴性设计方法设计的异源二聚体导致具有>95％异源二聚体的高特异性，但是使复合物相当不稳定(同上)。这些阴性设计异源二聚体具有69℃或更低的修饰的CH3结构域的熔解温度，与野生型相比，不存在额外的二硫键。参见下面的表A。
表A：公布的Fc异源二聚体抗体
*我们在我们的测定系统观察到对照1的>90％的纯度，但不是如以前在文献中报道的100％。
*我们在我们的测定系统观察到对照4的高于77℃的Tm；对于这种变体的Tm在文献中还没有公开。
NP–对于对照3的Tm还没有公开，并且它在我们的测定系统中没有进行测试。
野生型IgG1的熔解温度显示为81-83的范围，因为文献中的值取决于使用的测定系统而变化，我们在我们的测定系统中报告了 81.5℃的值。
在阴性设计相比，用于工程改造蛋白的一般概念是阳性设计。在这种情况下，将氨基酸修饰引入多肽以使蛋白内或蛋白之间的有利相互作用最大化。这种策略假设，当引入多个特异性稳定期望的异源二聚体的突变而同时忽略对同源二聚体的影响时，净效果将是对于期望的异源二聚体相互作用相比于同源二聚体的更好的特异性，和因此更高的异源二聚体特异性。在蛋白工程改造的背景下可以理解的是，阳性设计策略优化了期望的蛋白相互作用的稳定性，但很少达到>90％特异性(Havranek JJ&Harbury PB.Automated designof specificity in molecular recognition.Nat Struct Biol.10(1):45-52(2003)；Bolon DN, Grant RA,Baker TA,Sauer RT.Specificity versus stability incomputational protein design.Proc Natl Acad Sci USA. 6；102(36):12724-9(2005)；Huang PS,Love JJ,Mayo SL.A de novo designed protein protein interface ProteinSci.16(12):2770-4(2007))。在本公开之前，阳性设计策略没有用于设计Fc异源二聚体，因为对特异性投入的关注比治疗性抗体的制备和开发更多。此外，有利的阳性设计突变难以预测。用于改进稳定性的其他方法，诸如额外的二硫键，已经进行尝试以改进Fc异源二聚体的稳定性，但是对于分子的改进的成功有限。(参见，表A)这可能是因为所有工程改造的FcCH3 结构域二硫键是溶剂暴露的，这导致二硫键的较短生命周期，和因此对异源二聚体的长期稳定性的显著影响-特别是当工程改造的CH3结构域在没有额外二硫键的情况下具有小于70℃的Tm(如对照4，其在没有额外二硫键的情况下具有69℃的Tm(参见对照2)。可以考虑，改进稳定性的其他方法，诸如二硫键，也可以与本发明的Fc变体使用，条件是CH3结构域在没有二硫键的情况下的内在稳定性(作为熔解温度来测量)为70℃或更高，特别是当CH3结构域在没有二硫键的情况下的内在稳定性(作为熔解温度来测量)为72℃或更高。
因此，我们在本文中公开用于设计Fc异源二聚体的新方法，其导致稳定且高特异性异源二聚体形成。这种设计方法组合阴性和阳性设计策略连同结构和计算模型引导的蛋白工程改造技术。这种功能强大的方法已经允许我们设计在IgG1 CH3结构域中新的突变组合，其中仅使用标准细胞培养条件形成异源二聚体，与同源二聚体相比其具有超过90％的纯度，并且获得的异源二聚体具有70℃或更高的熔解温度。在示例性实施方案中，Fc变体异源二聚体具有73℃或更高的熔解温度和高于98％的纯度。在其他示例性实施方案中，Fc变体异源二聚体具有75℃或更高的熔解温度和高于90％的纯度。在本文所述的异源二聚体Fc变体的某些实施方案中，Fc变体异源二聚体具有 77℃或更高的熔解温度和高于98％的纯度。在本文所述的异源二聚体 Fc变体的某些实施方案中，Fc变体异源二聚体具有78℃或更高的熔解温度和高于98％的纯度。在本文所述的异源二聚体Fc变体的某些实施方案中，Fc变体异源二聚体具有79℃或更高的熔解温度和高于 98％的纯度。在本文所述的异源二聚体Fc变体的某些实施方案中， Fc变体异源二聚体具有80℃或更高的熔解温度和高于98％的纯度。在本文所述的异源二聚体Fc变体的某些实施方案中，Fc变体异源二聚体具有81℃或更高的熔解温度和高于98％的纯度。
在某些实施方案中，提供了分离的包含异源二聚体Fc区的异源多聚体，其中所述异源二聚体Fc区包含具有增加稳定性的修饰的 CH3结构域，所述修饰的CH3结构域包含促进异源二聚体形成的氨基酸突变，其中所述修饰的CH3结构域具有70℃或更高的熔解温度(Tm)。如本文所使用的，"增加的稳定性"或"稳定的异源二聚体"是指在异源二聚体形成中的修饰的CH3结构域，其具有约70℃或更高的熔解温度。在某些实施方案中，"增加的稳定性"或"稳定的异源二聚体"是指在异源二聚体形成中的修饰的CH3结构域，其具有约72℃或更高的熔解温度。在某些实施方案中，"增加的稳定性"或"稳定的异源二聚体"是指在异源二聚体形成中的修饰的CH3结构域，其具有约 74℃或更高的熔解温度。在某些实施方案中，"增加的稳定性"或"稳定的异源二聚体"是指在异源二聚体形成中的修饰的CH3结构域，其具有约75℃或更高的熔解温度。在某些实施方案中，"增加的稳定性" 或"稳定的异源二聚体"是指在异源二聚体形成中的修饰的CH3结构域，其具有约76℃或更高的熔解温度。在某些实施方案中，"增加的稳定性"或"稳定的异源二聚体"是指在异源二聚体形成中的修饰的 CH3结构域，其具有约78℃或更高的熔解温度。在某些实施方案中， "增加的稳定性"或"稳定的异源二聚体"是指在异源二聚体形成中的修饰的CH3结构域，其具有约79℃或更高的熔解温度。在某些实施方案中，"增加的稳定性"或"稳定的异源二聚体"是指在异源二聚体形成中的修饰的CH3结构域，其具有约80℃或更高的熔解温度。在某些实施方案中，"增加的稳定性"或"稳定的异源二聚体"是指在异源二聚体形成中的修饰的CH3结构域，其具有约81℃或更高的熔解温度。此外，可以理解的是，术语“促进异源二聚体形成”在本文中是指CH3结构域中的氨基酸突变，其导致与同源二聚体形成相比的高于90％的异源二聚体形成。
在进一步实施方案中，这种增加的稳定性是在额外的二硫键不存在的情况下。具体而言，增加的稳定性是在CH3结构域中额外的二硫键不存在的情况下。在一个实施方案中，与野生型CH3结构域相比，修饰的CH3结构域不包含额外的二硫键。在可替代的实施方案中，与野生型CH3结构域相比，修饰的CH3包含至少一个二硫键，条件是所述修饰的CH3在二硫键不存在的情况下具有70℃或更高的熔解温度。在一个实施方案中，与野生型CH3结构域相比，修饰的 CH3结构域包含至少一个二硫键，并且修饰的CH3结构域具有约 77.5℃或更高的熔解温度(Tm)。在一个实施方案中，与野生型CH3 结构域相比，修饰的CH3结构域包含至少一个二硫键，并且修饰的 CH3结构域具有约78℃或更高的熔解温度(Tm)。在另一个实施方案中，与野生型CH3结构域相比，修饰的CH3结构域包含至少一个二硫键，并且修饰的CH3结构域具有下列熔解温度(Tm)：高于约78℃、或高于约78.5℃、或高于约79℃、或高于约79.5℃、或高于约80℃、或高于约80.5℃、或高于约81℃、或高于约81.5℃、或高于约82℃、或高于约82.5℃、或高于约83℃。
在一个实施方案中，修饰的CH3结构域具有下列熔解温度：高于约70℃、或高于约70.5℃、或高于约71℃、或高于约71.5℃、或高于约72℃、或高于约72.5℃、或高于约73℃、或高于约73.5℃、或高于约74℃、或高于约74.5℃、或高于约75℃、或高于约75.5℃、或高于约76℃、或高于约76.5℃、或高于约77℃、或高于约77.5℃、或高于约78℃、或高于约78.5℃、或高于约79℃、或高于约79.5℃、或高于约80℃、或高于约80.5℃、或高于约81℃、或高于约81.5℃、或高于约82℃、或高于约82.5℃、或高于约83℃。在另一个实施方案中，修饰的CH3结构域具有下列熔解温度：约70℃、或约70.5℃、或约71℃、或约71.5℃、或约72℃、或约72.5℃、或约73℃、或约 73.5℃、或约74℃、或约74.5℃、或约75℃、或约75.5℃、或约76℃、或约76.5℃、或约77℃、或约77.5℃、或约78℃、或约78.5℃、或约79℃、或约79.5℃、或约80℃、或约80.5℃、或约81℃。在又另一个实施方案中，修饰的CH3结构域具有下列熔解温度：约70℃至约81℃、或约70.5℃至约81℃、或约71℃至约81℃、或约71.5℃至约81℃、或约72℃至约81℃、或约72.5℃至约81℃、或约73℃至约81℃、或约73.5℃至约81℃、或约74℃至约81℃、或约74.5℃至约81℃、或约75℃至约81℃、或约75.5℃至约81℃、或76℃至约 81℃、或约76.5℃至约81℃、或约77℃至约81℃、或约77.5℃至约 81℃、或约78℃至约81℃、或约78.5℃至约82℃、或约79℃至约 81℃。在又另一个实施方案中，修饰的CH3结构域具有下列熔解温度：约71℃至约76℃、或约72℃至约76℃、或约73℃至约76℃、或约74℃至约76℃。
除增加的稳定性以外，异源二聚体Fc区包含修饰的CH3结构域，所述修饰的CH3结构域包含促进异源二聚体形成的氨基酸突变。可以理解的是，这些促进异源二聚体形成的氨基酸突变是与同源二聚体形成相比的。与同源二聚体形成相比的这种异源二聚体形成在本文中统称为“纯度”或“特异性”或“异源二聚体纯度”或“异源二聚体特异性”。可以理解的是，异源二聚体纯度是指在选择性纯化同源二聚体种类之前在标准细胞培养条件下在溶液中形成的所需异源二聚体与形成的同源二聚体种类相比的百分比。例如，90％的异源二聚体纯度表明溶液中的90％二聚体种类是所需异源二聚体。在一个实施方案中，Fc变体异源二聚体具有下列纯度：高于约90％、或高于约91％、或高于约92％、或高于约93％、或高于约94％、或高于约95％、或高于约96％、或高于约97％、或高于约98％、或高于约99％。在另一个实施方案中，Fc变体异源二聚体具有下列纯度：约90％、或约 91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％、或约100％。
在特定的实施方案中，分离的包含异源二聚体Fc区的异源多聚体，其中所述异源二聚体Fc区包含具有增加稳定性的修饰的CH3结构域，所述修饰的CH3结构域包含促进异源二聚体形成的氨基酸突变，其中所述修饰的CH3结构域具有70℃或更高的熔解温度(Tm)并且获得的异源二聚体具有高于90％的纯度。在一个方面，获得的Fc 变体异源二聚体具有高于98％的纯度，并且修饰的CH3结构域具有下列熔解温度：高于约70℃、或高于约71℃、或高于约72℃、或高于约73℃、或高于约74℃、或高于约75℃、或高于约76℃、或高于约77℃、或高于约78℃、或高于约79℃、或高于约80℃或高于约 81℃。在进一步的方面，修饰的CH3结构域具有70℃或更高的熔解温度并且获得的Fc变体异源二聚体具有下列纯度：高于约90％、或高于约91％、或高于约92％、或高于约93％、或高于约94％、或高于约95％、或高于约96％、或高于约97％、或高于约98％、或高于约99％。
为了设计这些具有改进的稳定性和纯度的Fc变体，我们采用了计算设计和实验筛选的迭代过程来选择阳性和阴性设计策略的最成功组合(参见，图24)。
具体而言，在初始设计阶段，如实施例1-3中所述制备不同的阴性设计Fc变体异源二聚体且测试表达和稳定性。初始设计阶段包括 Fc变体异源二聚体AZ1-AZ16(参见，表1)。从阴性设计Fc变体异源二聚体的该初始组(预期其具有较低稳定性(例如，小于71℃的Tm))，选择具有大于90％纯度和约68℃或更高的熔解温度的Fc变体异源二聚体用于进一步开发。这包括Fc变体异源二聚体AZ6、AZ8和AZ15。在第二个设计阶段，使用阳性设计策略遵循详细的计算和结构分析将那些选择的Fc变体异源二聚体进行进一步修饰以驱动稳定性和纯度。用计算方法和全面结构功能分析各自分析选择的Fc变体异源二聚体(AZ6、AZ8、和AZ15)，以鉴定这些Fc变体具有比野生型Fc同源二聚体(其对于IgG1为81℃)更低稳定性的结构原因。对于Fc变体异源二聚体和Tm值的列表，参见表4。
在某些实施方案中，修饰的CH3结构域选自AZ1、或AZ2、或 AZ3、或AZ4、或AZ5、或AZ6、或AZ7、或AZ8、或AZ9、或AZ10、或AZ11、或AZ12、或AZ13、或AZ14、或AZ15、或AZ16。在选择的实施方案中，修饰的CH3结构域是AZ6、或AZ8或AZ15。
计算机工具和结构-功能分析包括，但不限于分子动力学分析 (MD)、侧链/骨架重新包装、知识库潜力(Knowledge Base Potential, KBP)、腔体和(疏水)包装分析(LJ、CCSD、SASA、dSASA(碳/全原子))、静电-GB计算、和偶联分析。(对于计算策略的综述，参见图24)
蛋白工程改造方法的一个方面依赖于源自X射线晶体学的Fc IgG蛋白的结构信息和CH3结构域的野生型和变体形式的计算建模和模拟相组合。这使我们获得关于单个氨基酸的潜在作用和它们的协同作用的新的结构和物理化学见解。从多个修饰的CH3结构域获得的这些结构和物理化学见解，连同获得的有关它们的稳定性和纯度的经验数据帮助我们开发且理解与Fc同源二聚体相比的Fc异源二聚体的纯度和稳定性之间的关系和模拟的结构模型。为了进行我们的模拟，我们通过构建完整和现实的模型和完善IgG1抗体的野生型Fc 结构质量来开始。源自X-射线晶体学的蛋白结构缺乏关于在生理条件下在水介质中蛋白的某些特征的细节，我们的完善程序解决了这些限制。这些包括构建蛋白结构的缺失区域(往往是蛋白的柔性部分如环和一些残基侧链)，评价和定义中性和带电荷残基的质子状态和与蛋白相关的潜在功能相关水分子的放置。
分子动力学(MD)算法是我们使用的一种工具，其通过模拟蛋白结构来评价在含水环境中的Fc同源二聚体和修饰的CH3结构域的内在动力学性质。分子动力学模拟追踪由蛋白中的所有原子实体和其局部环境之间的相互作用和力作用产生的运动导致的分子的动力学轨道，在这种情况下，原子构成Fc和其周围水分子。分子动力学模拟后，分析轨道的各方面来获得对Fc同源二聚体和变体Fc异源二聚体的结构和动力学特征的见解，我们使用其来鉴定特定的氨基酸突变来改进分子的纯度和稳定性。
因此，使用方法来研究生成的MD轨迹，所述方法如主要组分分析以显示在Fc结构中的固有频率低的运动模式。这提供了对于蛋白的潜在构象亚状态的见解(参见，图32)。尽管Fc区中的链A和B之间的关键蛋白-蛋白相互作用发生在CH3结构域的接口处，但是我们的模拟表明，该接口在运动中充当铰链，其涉及CH2结构域的N末端相对于彼此的“开放”与“闭合”。如图16中可见，CH2结构域与FcgR 在其末端相互作用。因此，尽管不希望被理论所束缚，似乎在CH3 接口处引入氨基酸突变赋予在Fc的N末端处的开放/闭合运动的量级和性质，和因此Fc与FcgR如何相互作用。参见，实施例4和表5。
还研究生成的MD轨迹来基于分析它们的柔韧性概况和分析它们的环境来确定Fc结构中特定氨基酸残基位置的易变性。该算法使我们鉴定不能影响蛋白结构和功能的残基，提供了对于修饰的CH3 结构域的后续设计阶段的残基特征和易变性的独特见解。该分析还使我们能够比较多种模拟，且在分析概况后基于异常值评价易变性。
还研究生成的MD轨迹来确定蛋白中的相关残基运动和由它们之间的偶联导致的残基网络的形成。发现Fc结构中的动力学相关性和残基网络在理解蛋白作为动力学实体和用于发展在远端位点处的突变的影响的见解中是关键步骤。参见，例如实施例6
因此，我们详细研究了突变对突变位点的局部环境的影响。链A 和B之间的CH3的接口处的包装良好的核心的形成对于稳定的Fc 结构中两条链的自发配对是关键的。良好包装是相互作用分子伴侣之间的强结构互补性连同接触基团之间的有利相互作用的结果。有利的相互作用由良好去除溶剂暴露的掩埋的疏水性接触和/或亲水性极性基团之间的互补性静电接触的形成导致的。这些疏水性和亲水性接触对CH3接口处的二聚体形成的自由能具有熵和焓的贡献。我们采用了多种算法来精确地模拟链A和B之间的CH3接口处的包装，且随后通过对一些相关物理化学特性进行评分而评价接口的热力学特性。
我们采用了一些蛋白包装方法，包括柔韧的骨架来优化且制备用于我们计算筛选的大量变体的模型结构。包装之后，我们评价了许多项目，包括接触密度、碰撞评分、氢键、疏水性和静电。使用溶剂化模型使我们能够更准确地在蛋白中的特定位置突变为替代残基类型之后解决溶剂环境的影响和对比自由能差异。接触密度和碰撞评分提供了互补性(有效蛋白包装的关键方面)的量度。这些筛选程序基于基于知识的潜力或偶联分析方案的应用，其依赖于成对残基相互作用能和熵计算。
这种全面的计算机芯片上分析提供了关于连接热点、不对称位点、腔体和较差包装区、个别位点的结构动力学和局部解折叠位点与野生型相比的每个Fc变体的差异的更详细理解。所述计算分析的这些组合结果鉴定了没有优化和组合负责更低稳定性(例如，68℃的Tm) 和/或<90％纯度的更低特异性的特定残基、序列/结构基序和腔体。在第二个设计阶段，我们使用靶向的阳性设计来通过额外的点突变来专门解决这些假设，且使用上述方法和分析通过计算机芯片上工程改造来测试这些(参见，图24)。如实施例1-4中所述，实验验证在第二阶段中对于每种靶向设计进行设计以改进稳定性和纯度的Fc变体异源二聚体(Fc变体异源二聚体AZ17-AZ101)的表达和稳定性。
在某些实施方案中，本文提供了分离的包含异源二聚体Fc区的异源多聚体，其中所述异源二聚体Fc区包含具有增加稳定性的修饰的CH3结构域，所述修饰的CH3结构域包含促进异源二聚体形成的氨基酸突变，其中所述修饰的CH3结构域是AZ17、或AZ18、或AZ19、或AZ20、或AZ21、或AZ22、或AZ23、或AZ24、或AZ25、或AZ26、或AZ27、或AZ28、或AZ29、或AZ30、或AZ21、或AZ32、或AZ33、或AZ34、或AZ35、或AZ36、或AZ37、或AZ38、或AZ39、或AZ40、或AZ41、或AZ42、或AZ43、或AZ44、或AZ45、或AZ46、或AZ47、或AZ48、或AZ49、或AZ50、或AZ51、或AZ52、或AZ53、或AZ54、或AZ55、或AZ56、或AZ57、或AZ58、或AZ59、或AZ60、或AZ61、或AZ62、或AZ63、或AZ64、或AZ65、或AZ66、或AZ67、或AZ68、或AZ69、或AZ70、或AZ71、或AZ72、或AZ73、或AZ74、或AZ75、或AZ76、或AZ77、或AZ78、或AZ79、或AZ80、或AZ81、或AZ82、或AZ83、或AZ84、或AZ85、或AZ86、或AZ87、或AZ88、或AZ89、或AZ90、或AZ91、或AZ92、或AZ93、或AZ94、或AZ95、或AZ96、或AZ97、或AZ98、或AZ99、或AZ100、或AZ101。在一个示例性实施方案中，修饰的CH3结构域是AZ17、或AZ18、或AZ19、或 AZ20、或AZ21、或AZ22、或AZ23、或AZ24、或AZ25、或AZ26、或AZ27、或AZ28、或AZ29、或AZ30、或AZ21、或AZ32、或AZ33、或AZ34、或AZ38、或AZ42、或AZ43、或AZ44、或AZ45、或 AZ46、或AZ47、或AZ48、或AZ49、或AZ50、或AZ52、或AZ53、或AZ54、或AZ58、或AZ59、或AZ60、或AZ61、或AZ62、或AZ63、或AZ64、或AZ65、或AZ66、或AZ67、或AZ68、或AZ69、或AZ70、或AZ71、或AZ72、或AZ73、或AZ74、或AZ75、或AZ76、或AZ77、或AZ78、或AZ79、或AZ81、或AZ82、或AZ83、或AZ84、或AZ85、或AZ86、或AZ87、或AZ88、或AZ89、或AZ91、或AZ92、或AZ93、或AZ94、或AZ95、或AZ98、或AZ99、或AZ100、或AZ101。在特定的实施方案中，修饰的CH3结构域是AZ33或AZ34。在另一个实施方案中，修饰的CH3结构域是AZ70或AZ90。
在一个示例性实施方案中，CH3结构域包含第一和第二多肽(本文也称为链A和链B)，其中第一多肽包含氨基酸修饰L351Y、F405A 和Y407V，且其中第二多肽包含氨基酸修饰T366I、K392M和T394W。在另一个实施方案中，第一多肽包含氨基酸修饰L351Y、S400E、F405A和Y407V且第二多肽包含氨基酸修饰T366I、N390R、K392M 和T394W。
在后续设计阶段中使用计算结构-功能分析、靶向工程改造和实验验证的这种迭代过程来设计表1中列出的剩余Fc变体，且导致具有高于90％纯度和具有大于70℃的CH3结构域熔解温度的增加稳定性的Fc变体异源二聚体。在某些实施方案中，Fc变体包含选自AZ1至AZ 136的氨基酸突变。在进一步实施方案中，Fc变体包含选自表 4中列出的Fc变体的氨基酸突变。
从第一和第二设计阶段鉴定了两个核心支架，支架1和支架2，其中将额外的氨基酸修饰引入这些支架以微调Fc变体异源二聚体的纯度和稳定性。对于开发支架1包括AZ8、AZ17-62和表6中列出的变体的详细描述，请参见实施例5。对于开发支架2包括AZ15和AZ63-101和表7中列出的变体的详细描述，请参见实施例6。
支架1的核心突变包含L351Y_F405A_Y407V/T394W。支架1a 包含氨基酸突变T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V且支架1b包含氨基酸突变T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V。参见，实施例 5。
在某些实施方案中，修饰的CH3结构域包含第一和第二多肽(本文也称为链A和链B)，其中第一多肽包含氨基酸修饰L351Y、F405A 和Y407V，且第二多肽包含氨基酸修饰T394W。在一个方面，修饰的CH3结构域进一步包含在位置F405和/或K392处的点突变。在位置K392处的这些突变包括但不限于K392V、K392M、K392R、K392L、 K392F或K392E。在位置F405处的这些突变包括但不限于F405I、 F405M、F405S、F405S、F405V或F405W。在另一个方面，修饰的CH3结构域进一步包含在位置T411和/或S400处的点突变。在位置 T411处的这些突变包括但不限于T411N、T411R、T411Q、T411K、 T411D、T411E或T411W。在位置S400处的这些突变包括但不限于 S400E、S400D、S400R或S400K。在又另一个实施方案中，修饰的 CH3结构域包含第一和第二多肽，其中第一多肽包含氨基酸修饰 L351Y、F405A和Y407V，且第二多肽包含氨基酸修饰T394W，其中所述第一和/或第二多肽包含在位置T366和/或L368处的进一步氨基酸修饰。在位置T366处的这些突变包括但不限于T366A、T366I、 T366L、T366M、T366Y、T366S、T366C、T366V或T366W。在一个示例性实施方案中，在位置T366处的氨基酸突变是T366I。在另一个示例性实施方案中，在位置T366处的氨基酸突变是T366L。在位置L368处的突变是L368D、L368R、L368T、L368M、L368V、L368F、 L368S和L368A。
在某些实施方案中，修饰的CH3结构域包含第一和第二多肽(本文也称为链A和链B)，其中第一多肽包含氨基酸修饰L351Y、F405A 和Y407V，且第二多肽包含氨基酸修饰T366L和T394W。在另一个实施方案中，修饰的CH3结构域包含第一和第二多肽，其中第一多肽包含氨基酸修饰L351Y、F405A和Y407V，且第二多肽包含氨基酸修饰T366I和T394W。
在某些其他实施方案中，修饰的CH3结构域包含第一和第二多肽(本文也称为链A和链B)，其中第一多肽包含氨基酸修饰L351Y、 F405A和Y407V，且第二多肽包含氨基酸修饰T366L、K392M和T394W。在另一个实施方案中，修饰的CH3结构域包含第一和第二多肽，其中第一多肽包含氨基酸修饰L351Y、F405A和Y407V，且第二多肽包含氨基酸修饰T366I、K392M和T394W。
在又另一个实施方案中，修饰的CH3结构域包含第一和第二多肽(本文也称为链A和链B)，其中第一多肽包含氨基酸修饰F405A和 Y407V，且第二多肽包含氨基酸修饰T366L、K392M和T394W。在另一个实施方案中，修饰的CH3结构域包含第一和第二多肽，其中第一多肽包含氨基酸修饰F405A和Y407V，且第二多肽包含氨基酸修饰T366I、K392M和T394W。
在某些实施方案中，修饰的CH3结构域包含第一和第二多肽(本文也称为链A和链B)，其中第一多肽包含氨基酸修饰F405A和 Y407V，且第二多肽包含氨基酸修饰T366L和T394W。在另一个实施方案中，修饰的CH3结构域包含第一和第二多肽，其中第一多肽包含氨基酸修饰F405A和Y407V，且第二多肽包含氨基酸修饰T366I 和T394W。
在示例性实施方案中，本文提供了分离的包含异源二聚体Fc区的异源二聚体，其中所述异源二聚体Fc区包含具有增加稳定性的修饰的CH3结构域，所述修饰的CH3结构域包含促进异源二聚体形成的氨基酸突变，其中所述修饰的CH3结构域具有约74℃或更高的熔解温度(Tm)。在另一个实施方案中，本文提供了分离的包含异源二聚体Fc区的异源二聚体，其中所述异源二聚体Fc区包含具有增加稳定性的修饰的CH3结构域，所述修饰的CH3结构域包含促进异源二聚体形成的氨基酸突变，其中所述修饰的CH3结构域具有约74℃或更高的熔解温度(Tm)并且异源二聚体具有约98％或更高的纯度。
在某些实施方案中，分离的包含异源二聚体Fc区的异源二聚体，其中所述异源二聚体Fc区包含具有增加稳定性的修饰的CH3结构域，所述修饰的CH3结构域包含促进异源二聚体形成的氨基酸突变，其中所述修饰的CH3结构域具有高于70℃的熔解温度(Tm)并且所述修饰的CH3结构域选自表6。
支架2的核心突变包含L351Y_Y407A/T366A_K409F。支架2a 包含氨基酸突变L351Y_Y407A/T366V_K409F且支架2b包含氨基酸突变Y407A/T366A_K409F。参见实施例6。
在某些实施方案中，所述修饰的CH3结构域包含第一和第二多肽(在本文也称为链A和链B)，其中第一多肽包含氨基酸修饰L351Y 和Y407A并且第二多肽包含氨基酸修饰T366A和K409F。一方面，所述修饰的CH3结构域进一步包含在位置T366、L351和Y407处的点突变。在位置T366处的这些突变包括但不限于T366I、T366L、 T366M、T366Y、T366S、T366C、T366V或T366W。在特定的实施方案中，在位置T366处的突变是T366V。在位置L351处的突变包括但不限于L351I、L351D、L351R或L351F。在位置Y407处的突变包括但不限于Y407V或Y407S。参见，在表1和表4以及实施例 6中的CH3变体AZ63-AZ70。
在示例性实施方案中，所述修饰的CH3结构域包含第一和第二多肽(在本文也称为链A和链B)，其中第一多肽包含氨基酸修饰 L351Y和Y407A并且第二多肽包含氨基酸修饰T366V和K409F。
在示例性实施方案中，本文提供了分离的包含异源二聚体Fc区的异源二聚体，其中所述异源二聚体Fc区包含具有增加稳定性的修饰的CH3结构域，所述修饰的CH3结构域包含促进异源二聚体形成的氨基酸突变，其中所述修饰的CH3结构域具有约75.5℃或更高的熔解温度(Tm)。在另一个实施方案中，本文提供了分离的包含异源二聚体Fc区的异源二聚体，其中所述异源二聚体Fc区包含具有增加稳定性的修饰的CH3结构域，所述修饰的CH3结构域包含促进异源二聚体形成的氨基酸突变，其中所述修饰的CH3结构域具有约75℃或更高的熔解温度(Tm)并且异源二聚体具有约90％或更高的纯度。
在其他某些实施方案中，所述修饰的CH3结构域包含第一和第二多肽(在本文也称为链A和链B)，其中第一多肽包含氨基酸修饰 L351Y和Y407A并且第二多肽包含氨基酸修饰T366A和K409F，其中所述修饰的CH3结构域包含一个或多个在位置T411、D399、S400、 F405、N390和/或K392处的氨基酸修饰。在位置D399处的这些突变包括但不限于D399R、D399W、D399Y或D399K。突变在位置T411 包括但不限于T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W。在位置S400处的突变包括但不限于S400E、S400D、S400R 或S400K。在位置F405处的突变包括但不限于F405I、F405M、F405S、 F405S、F405V或F405W。在位置N390处的突变包括但不限于N390R、 N390K或N390D。在位置K392处的突变包括但不限于K392V、 K392M、K392R、K392L、K392F或K392E。参见，表1和表4以及实施例6中的CH3变体AZ71-101。
在示例性实施方案中，所述修饰的CH3结构域包含第一和第二多肽(在本文也称为链A和链B)，其中第一多肽包含氨基酸修饰 Y407A并且第二多肽包含氨基酸修饰T366A和K409F。一方面，这个修饰的CH3结构域进一步包含氨基酸修饰K392E、T411E、D399R 和S400R。在另一实施方案中，所述修饰的CH3结构域包含第一和第二多肽，其中第一多肽包含氨基酸修饰D399R、S400R和Y407A 并且第二多肽包含氨基酸修饰T366A、K409F、K392E和T411E。
在示例性实施方案中，本文提供了分离的包含异源二聚体Fc区的异源二聚体，其中所述异源二聚体Fc区包含具有增加稳定性的修饰的CH3结构域，所述修饰的CH3结构域包含促进异源二聚体形成的氨基酸突变，其中所述修饰的CH3结构域具有约74℃或更高的熔解温度(Tm)。在另一个实施方案中，本文提供了分离的包含异源二聚体Fc区的异源二聚体，其中所述异源二聚体Fc区包含具有增加稳定性的修饰的CH3结构域，所述修饰的CH3结构域包含促进异源二聚体形成的氨基酸突变，其中所述修饰的CH3结构域具有约74℃或更高的熔解温度(Tm)并且异源二聚体具有约95％或更高的纯度。
在某些实施方案中，本文提供了分离的包含异源二聚体Fc区的异源二聚体，其中所述异源二聚体Fc区包含具有增加稳定性的修饰的CH3结构域，所述修饰的CH3结构域包含促进异源二聚体形成的氨基酸突变，其中所述修饰的CH3结构域具有高于70℃的熔解温度(Tm)并且所述修饰的CH3结构域选自表7。
此外，设计具有改进的稳定性和纯度的Fc变体异源二聚体的这种新方法可以应用于Fc区的其他类型和同种型。在某些实施方案中， Fc区是人IgG Fc区。在进一步实施方案中，人IgG Fc区是人IgGI、 IgG2、IgG3、或IgG4Fc区。在一些实施方案中，Fc区来自选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的免疫球蛋白。在一些实施方案中，IgG是选自IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG4的亚型。
表1.1：用于生成Fc变体异源二聚体的CH3结构域氨基酸修饰
表1.2：用于生成Fc变体异源二聚体的CH3结构域氨基酸修饰。如图29A-29B中所示以及实施例中所述地评估CH3结构域的DSC 熔解温度。
表1.3：用于生成Fc变体异源二聚体的CH3结构域氨基酸修饰。如实施例以及附图35中所述地确定上表中的Kd。
本文描述的Fc区包含CH3结构域或其片段，并且可以额外地包含一个或多个额外的恒定区结构域或其片段，包括铰链、CH1或CH2。将被理解的是，Fc氨基酸残基的编号是如Kabat等人，1991,NIH Publication 91-3242,National Technical InformationService,Springfield, Va中的EU索引的编号。如“Kabat中所述的EU索引”是指人IgG1Kabat抗体的EU索引编号。为了方便，表B提供了来自人IgG1的 CH2和CH3结构域的根据Kabat中所述的EU索引编号的氨基酸。
表B
根据本发明的一个方面，提供了分离的异源二聚体Fc构建体，包含修饰的异源二聚的CH3结构域，所述修饰的CH3结构域包含：包含与野生型CH3结构域多肽相比至少三个氨基酸修饰的第一修饰的CH3结构域多肽，和与野生型CH3结构域多肽相比包含至少三个氨基酸修饰的第二修饰的CH3结构域多肽；其中所述第一和第二CH3 结构域多肽中的至少一个包含K392J的氨基酸修饰，其中J选自L、 I或侧链体积基本上不大于K的侧链体积的氨基酸；其中所述第一和第二修饰的CH3结构域多肽优先形成具有至少约74□C的熔解温度 (Tm)和至少95％的纯度的异源二聚的CH3结构域；并且其中至少一个氨基酸修饰不是在所述第一和所述第二CH3结构域多肽之间的接口处的氨基酸的修饰。在某些实施方案中是本文所述的异源二聚体 Fc构建体，包含至少一个T350X修饰，其中X是选自缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、及其衍生物或变体的天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，包含至少一个T350V修饰。在实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述修饰的CH3结构域具有至少约75℃或更高的熔解温度(Tm)。在实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述修饰的CH3结构域具有约77℃或更高的Tm。在某些实施方案中，所述修饰的CH3结构域具有约80℃或更高的Tm。在某些实施方案中提供了本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中至少一个CH3结构域多肽是包含L351、F405和Y407中的至少一个的氨基酸修饰的修饰的CH3结构域多肽。在一些实施方案中是分离的异源二聚体Fc构建体，其中至少一个CH3结构域多肽是进一步包含T366的氨基酸修饰的修饰的CH3结构域多肽。在某些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中第一CH3结构域多肽是包含在位置L351、F405和Y407处的氨基酸修饰的修饰的 CH3结构域多肽，并且第二CH3结构域多肽是包含在位置T366、K392 和T394处的氨基酸修饰的修饰的CH3结构域多肽。在实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，所述第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰L351Y、F405A和Y407V，并且所述第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366L、K392M和T394W。在一些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，所述第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰L351Y、F405A和Y407V，并且所述第二CH3 结构域多肽包含氨基酸修饰T366L、K392L和T394W。在另一实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，所述第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰L351Y、F405A和Y407V，并且所述第二 CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366I、K392M和T394W。在一些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，所述第一 CH3结构域多肽包含氨基酸修饰L351Y、F405A和Y407V，并且所述第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366I、K392L和T394W。在某些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述第一和第二CH3结构域多肽中的至少一个是包含在位置S400处的氨基酸修饰的修饰的CH3结构域多肽。在另一实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，包含修饰S400Z，其中Z选自带正电的氨基酸和带负电的氨基酸。在一些实施方案中，带正电的氨基酸是赖氨酸或精氨酸并且带负电的氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。在某些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，所述第一CH3结构域多肽包含选自S400E和S400R的氨基酸修饰。在一些实施方案中提供了本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述第一和第二CH3结构域多肽中的至少一个是包含在位置N390处的氨基酸修饰的修饰的CH3结构域多肽。在一些实施方案中，N390的修饰是N390Z，其中Z选自带正电的氨基酸和带负电的氨基酸。在实施方案中，N390Z是N390R。在本文所述的分离的异源二聚体Fc 构建体的某些实施方案中，所述第一CH3结构域多肽是包含氨基酸修饰S400E的修饰的CH3结构域多肽并且所述第二CH3结构域多肽是包含氨基酸修饰N390R的修饰的CH3结构域多肽。在本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体的一些实施方案中，第一和第二CH3结构域多肽中的每一个是修饰的CH3结构域多肽，一个所述修饰的CH3 结构域多肽包含氨基酸修饰Q347R而另一个修饰的CH3结构域多肽包含氨基酸修饰K360E。
一方面，提供了分离的异源二聚体Fc构建体，包含修饰的异源二聚的CH3结构域，所述修饰的CH3结构域包含：与野生型CH3 结构域多肽相比包含至少三个氨基酸修饰的第一修饰的CH3结构域多肽，和与野生型CH3结构域多肽相比包含至少三个氨基酸修饰的第二修饰的CH3结构域多肽；其中所述第一和第二CH3结构域多肽中的至少一个包含K392J的氨基酸修饰，其中J选自L、I或侧链体积基本上不大于K的侧链体积的氨基酸；其中所述第一和第二修饰的CH3结构域多肽优先形成具有至少约74□C的熔解温度(Tm)和至少95％的纯度的异源二聚的CH3结构域；并且其中至少一个氨基酸修饰不是在所述第一和所述第二CH3结构域多肽之间的接口处的氨基酸的修饰。在某些实施方案中是本文所述的异源二聚体Fc构建体，包含至少一个T350X修饰，其中X是选自缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、及其衍生物或变体的天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，包含至少一个 T350V修饰。在实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述修饰的CH3结构域具有至少约75℃或更高的熔解温度 (Tm)。在实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述修饰的CH3结构域具有约77℃或更高的Tm。在某些实施方案中，所述修饰的CH3结构域具有约80℃或更高的Tm。在实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中至少一个CH3 结构域多肽是修饰的CH3结构域多肽，包含K409和T411中的至少一个的氨基酸修饰。在某些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，包含K409F、T411E和T411D中的至少一个。在一些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中至少一个CH3结构域多肽是包含D399的氨基酸修饰的修饰的CH3结构域多肽。在一些实施方案中，D399的氨基酸修饰是D399R和D399K 中的至少一个。
一方面，提供了分离的异源二聚体Fc构建体，包含修饰的异源二聚的CH3结构域，所述修饰的CH3结构域包含：与野生型CH3 结构域多肽相比包含至少三个氨基酸修饰的第一修饰的CH3结构域多肽，和与野生型CH3结构域多肽相比包含至少三个氨基酸修饰的第二修饰的CH3结构域多肽；其中所述第一和第二CH3结构域多肽中的至少一个包含K392J的氨基酸修饰，其中J选自L、I或侧链体积基本上不大于K的侧链体积的氨基酸；其中所述第一和第二修饰的CH3结构域多肽优先形成具有至少约74℃的熔解温度(Tm)和至少 95％的纯度的异源二聚的CH3结构域；并且其中至少一个氨基酸修饰不是在所述第一和所述第二CH3结构域多肽之间的接口处的氨基酸的修饰。在某些实施方案中是本文所述的异源二聚体Fc构建体，包含至少一个T350X修饰，其中X是选自缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、及其衍生物或变体的天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，包含至少一个 T350V修饰。在实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述修饰的CH3结构域具有至少约75℃或更高的熔解温度 (Tm)。在实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述修饰的CH3结构域具有约77℃或更高的Tm。在某些实施方案中，所述修饰的CH3结构域具有约80℃或更高的Tm。在本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体的某些实施方案中，其中第一CH3 结构域多肽是包含选自K409F、T411E和T411D的至少一个氨基酸修饰的修饰的CH3结构域多肽，并且第二CH3结构域多肽是包含选自Y407A、Y407I、Y407V、D399R和D399K的至少一个氨基酸修饰的修饰的CH3结构域多肽。在一些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体中的任一个，其进一步包含包含氨基酸修饰 T366V、T366I、T366A、T366M和T366L中的一个的第一修饰的CH3 结构域；和包含氨基酸修饰L351Y的第二修饰的CH3结构域。在一些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体中的任一个，其包含包含氨基酸修饰K392L或K392E中的一个的第一修饰的CH3结构域；和包含氨基酸修饰S400R或S400V中的一个的第二修饰的CH3结构域。
本文提供了分离的异源二聚体Fc构建体，包含修饰的CH3结构域，所述修饰的CH3结构域包含第一修饰的CH3结构域多肽和第二修饰的CH3结构域多肽，每个修饰的CH3结构域多肽包含至少四个氨基酸突变，其中所述第一和所述第二修饰的CH3结构域多肽中的至少一个包含选自N390Z和S400Z的突变，其中Z选自带正电的氨基酸和带负电的氨基酸，并且其中所述第一和第二修饰的CH3结构域多肽优先形成具有至少约70□C的熔解温度(Tm)和至少90％的纯度的异源二聚的CH3结构域。在实施方案中提供了分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述第一修饰的CH3结构域多肽包含在位置F405 和Y407处的氨基酸修饰并且所述第二修饰的CH3结构域多肽包含在位置T394处的氨基酸修饰。在实施方案中提供了分离的异源二聚体 Fc构建体，第一修饰的CH3结构域多肽包含在位置L351处的氨基酸修饰。在某些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，所述第二修饰的CH3结构域多肽包含位置T366和K392中的至少一个的修饰。在一些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，其中所述修饰的CH3结构域具有至少约75□C的熔解温度(Tm)并且以至少约95％的纯度形成。在某些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，至少一个修饰的CH3结构域多肽包含N390R、S400E和S400R中的至少一个的氨基酸修饰。在一些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，所述第一和第二修饰的CH3结构域多肽中的一个包含位置347 的氨基酸修饰而另一个修饰的CH3结构域多肽包含在位置360处的氨基酸修饰。在某些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，所述第一和第二修饰的CH3结构域多肽中的至少一个包含T350V的氨基酸修饰。在特定的实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，所述第一修饰的CH3结构域多肽包含选自L351Y、F405A和Y407V的至少一个氨基酸修饰；并且所述第二修饰的CH3结构域多肽包含选自T366L、T366I、K392L、K392M和T394W的至少一个氨基酸修饰。在本文所述的某些实施方案中是分离的异源二聚体，第一修饰的CH3 结构域多肽包含在位置D399和Y407处的氨基酸修饰，并且诶第二修饰的CH3结构域多肽包含在位置K409和T411处的氨基酸修饰。在一些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，第一CH3结构域多肽包含在位置L351处的氨基酸修饰，并且第二修饰的CH3结构域多肽包含在位置T366和K392处的氨基酸修饰。在特定的实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，所述第一和第二CH3结构域多肽中的至少一个包含T350V的氨基酸修饰。在某些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，其中所述修饰的CH3结构域具有至少约750C的熔解温度(Tm)或更高并且以至少约95％的纯度形成。在某些实施方案中提供了本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，所述第一修饰的CH3结构域多肽包含选自L351Y、D399R、D399K、 S400D、S400E、S400R、S400K、Y407A和Y407V的氨基酸修饰；并且所述第二修饰的CH3结构域多肽包含选自T366V、T366I、 T366L、T366M、N390D、N390E、K392L、K392I、K392D、K392E、 K409F、K409W、T411D和T411E的氨基酸修饰。
本文提供了分离的包含修饰的CH3结构域的异源二聚体Fc构建体，所述修饰的CH3结构域包含第一修饰的CH3结构域多肽和第二修饰的CH3结构域多肽，每个修饰的CH3结构域多肽包含至少三个氨基酸突变，其中所述第一和所述第二修饰的CH3结构域多肽中的一个包含选自T411E和T411D的突变，并且其中所述第一和第二修饰的CH3结构域多肽优先形成具有至少约70□C的熔解温度(Tm)和至少90％的纯度的异源二聚的CH3结构域。在实施方案中提供了分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述第一修饰的CH3结构域多肽包含在位置F405和Y407处的氨基酸修饰并且所述第二修饰的CH3结构域多肽包含在位置T394处的氨基酸修饰。在实施方案中提供了分离的异源二聚体Fc构建体，第一修饰的CH3结构域多肽包含在位置 L351处的氨基酸修饰。在某些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，所述第二修饰的CH3结构域多肽包含位置T366和K392中的至少一个的修饰。在一些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，其中所述修饰的CH3结构域具有至少约75□C的熔解温度(Tm) 和并且以至少约95％的纯度形成。在某些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，至少一个修饰的CH3结构域多肽包含N390R、 S400E和S400R中的至少一个的氨基酸修饰。在一些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，所述第一和第二修饰的CH3结构域多肽中的一个包含位置347的氨基酸修饰而另一个修饰的CH3结构域多肽包含在位置360处的氨基酸修饰。在某些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，所述第一和第二修饰的CH3结构域多肽中的至少一个包含T350V的氨基酸修饰。在特定的实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，所述第一修饰的CH3结构域多肽包含选自L351Y、F405A和Y407V的至少一个氨基酸修饰；所述第二修饰的 CH3结构域多肽包含选自T366L、T366I、K392L、K392M和T394W 的至少一个氨基酸修饰。在本文所述的某些实施方案中是分离的异源二聚体，第一修饰的CH3结构域多肽包含在位置D399和Y407处的氨基酸修饰，并且第二修饰的CH3结构域多肽包含在位置K409和 T411处的氨基酸修饰。在一些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，第一CH3结构域多肽包含在位置L351处的氨基酸修饰，并且第二修饰的CH3结构域多肽包含在位置T366和K392处的氨基酸修饰。在特定的实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，所述第一和第二CH3结构域多肽中的至少一个包含T350V的氨基酸修饰。在某些实施方案中是本文所述的分离的异源二聚体，其中所述修饰的 CH3结构域具有至少约75℃或更高的熔解温度(Tm)并且以至少约 95％的纯度形成。在某些实施方案中提供了本文所述的分离的异源二聚体Fc构建体，所述第一修饰的CH3结构域多肽包含选自L351Y、D399R、D399K、S400D、S400E、S400R、S400K、Y407A和Y407V 的氨基酸修饰；并且所述第二修饰的CH3结构域多肽包含选自 T366V、T366I、T366L、T366M、N390D、N390E、K392L、K392I、K392D、K392E、K409F、K409W、T411D和T411E的氨基酸修饰。
本文提供了分离的异源二聚体Fc构建体，包含修饰的CH3结构域，所述修饰的CH3结构域包含包含氨基酸修饰L351Y、F405A和 Y407V的第一修饰的CH3结构域多肽；和包含氨基酸修饰T366I、 K392M和T394W的第二修饰的CH3结构域多肽。
一方面，提供了分离的包含修饰的CH3结构域的异源二聚体Fc 构建体，所述修饰的CH3结构域包含包含氨基酸修饰L351Y、F405A 和Y407V的第一修饰的CH3结构域多肽；和氨基酸修饰T366I、 K392L和T394W的第二修饰的CH3结构域多肽。
在某一方面，提供了分离的包含修饰的CH3结构域的异源二聚体Fc构建体，所述修饰的CH3结构域包含包含氨基酸修饰L351Y、F405A和Y407V的第一修饰的CH3结构域多肽；和包含氨基酸修饰 T366L、K392M和T394W的第二修饰的CH3结构域多肽。
在一些方面，提供了分离的包含修饰的CH3结构域的异源二聚体Fc构建体，所述修饰的CH3结构域包含包含氨基酸修饰L351Y、 F405A和Y407V的第一修饰的CH3结构域多肽；和包含氨基酸修饰 T366L、K392L和T394W的第二修饰的CH3结构域多肽。
一方面，提供了分离的包含修饰的CH3结构域的异源二聚体Fc 构建体，所述修饰的CH3结构域包含包含氨基酸修饰T350V、L351Y、 F405A和Y407V的第一修饰的CH3结构域多肽；和包含氨基酸修饰 T350V、T366L、K392L和T394W的第二修饰的CH3结构域多肽。
一方面，提供了分离的包含修饰的CH3结构域的异源二聚体Fc 构建体，所述修饰的CH3结构域包含包含氨基酸修饰T350V、L351Y、 S400R、F405A、Y407V的第一修饰的CH3结构域多肽；和包含氨基酸修饰T350V、T366L、K392M和T394W的第二修饰的CH3结构域多肽。
一方面，提供了分离的包含修饰的CH3结构域的异源二聚体Fc 构建体，所述修饰的CH3结构域包含包含氨基酸修饰T350V、L351Y、 S400E、F405A、Y407V的第一修饰的CH3结构域多肽；和包含氨基酸修饰T350V、T366L、N390R、K392M和T394W的第二修饰的CH3 结构域多肽。
一方面，提供了分离的包含修饰的CH3结构域的异源二聚体Fc 构建体，所述修饰的CH3结构域包含包含氨基酸修饰T350V、L351Y、 F405A、Y407V的第一修饰的CH3结构域多肽；和包含氨基酸修饰 T350V、T366L、K392L和T394W的第二修饰的CH3结构域多肽。
一方面，提供了分离的包含修饰的CH3结构域的异源二聚体Fc 构建体，所述修饰的CH3结构域包含包含氨基酸修饰T366V、K392L、K409F和T411E的第一修饰的CH3结构域多肽；和包含氨基酸修饰 L351Y、D399R和Y407A的第二修饰的CH3结构域多肽。
一方面，提供了分离的包含修饰的CH3结构域的异源二聚体Fc 构建体，所述修饰的CH3结构域包含包含氨基酸修饰T366V、K392LE K409F和T411E的第一修饰的CH3结构域多肽；和包含氨基酸修饰 L351Y、D399R、S400R和Y407A的第二修饰的CH3结构域多肽。
在某些实施方案中，Fc变体包含CH2结构域。在一些实施方案中，CH2结构域是变体CH2结构域。在一些实施方案中，变体CH2 结构域在第一和/或第二多肽链中包含不对称氨基酸取代。在一些实施方案中，异源多聚体在CH2结构域中包含不对称氨基酸取代，使得所述异源多聚体的一条链选择性结合Fc受体。
在某些实施方案中，异源多聚体选择性结合Fc受体。在一些实施方案中，Fc受体是Fcγ受体家族的成员。在一些实施方案中，受体选自FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa和FcγRIIIb。在一个实施方案中，CH2结构域包含促进与Fcγ受体的选择性结合的不对称氨基酸修饰。
在一些实施方案中，异源多聚体与FcγRIIIa选择性结合。在一些实施方案中，异源多聚体包含选自S267D、K392D和K409D的不对称氨基酸取代。在一些实施方案中，异源多聚体与FcγRIIa选择性结合。在一些实施方案中，异源多聚体包含选自S239D、K326E、A330L和I332E的不对称氨基酸取代。在一些实施方案中，异源多聚体与 FcγRIIb选择性结合。在一些实施方案中，异源多聚体包含选自 S239D、D265S、E269K和I332E的不对称氨基酸取代。在一些实施方案中，异源多聚体与FcγRIIIa和FcγRIIa选择性结合。在一些实施方案中，异源多聚体包含选自S239D、D265S和S298A的不对称氨基酸取代。在一些实施方案中，异源多聚体与FcγRIIIa和FcγRIIb选择性结合。在一些实施方案中，异源多聚体包含选自S239D、S298A、K326E、A330L和I332E的不对称氨基酸取代。在一些实施方案中，异源多聚体与FcγRIIa和FcγRIIb选择性结合。在一些实施方案中，异源多聚体包含选自S239D、D265S、S298A和I332E的不对称氨基酸取代。
在某些实施方案中提供了设计包含本文所述的异源多聚体的多功能治疗剂的方法。在一些实施方案中提供了设计包含变体Fc异源二聚体的双功能治疗剂的方法。在一些实施方案中提供了用于设计用 CH2结构域中的突变衍生的变体Fc异源二聚体的CH3结构域中的不对称突变的方法。在一些实施方案中提供了基于不对称Fc中的突变设计对于不同Fcγ受体的选择性的方法。在某些实施方案中提供了设计偏爱Fcγ受体与Fc分子的一面结合的突变的方法。在某些实施方案中提供了设计偏爱Fcγ受体与本文所述异源多聚体的不对称Fc支架的仅一面相互作用的极性驱动者的方法。
在一些实施方案中，提供了包含不对称Fc的CH2结构域中的突变的多肽，所述突变导致优先的Fcγ受体选择性概况。在一些实施方案中，CH3结构域中的突变导致异源二聚的Fc的优先形成。在某些实施方案中是基于本文所述不对称Fc设计双特异性治疗实体的方法。在某些实施方案中是基于本文所述不对称Fc设计多特异性治疗实体的方法。
单克隆抗体如IgG是由两条等同重多肽链和两条轻多肽链构成的对称分子(图14)，每条包含多个免疫球蛋白(Ig)结构域。mAb的IgG 类存在于四种同种型(IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4)之一中。分别地，重链由四个Ig结构域(VH、CH1、CH2和CH3)构成，且轻链由两个 (VL和CL)Ig结构域构成。来自每个重链的VH和CH1结构域与轻链的VL和CL结构域组合以形成mAb的两个Fab(“片段抗原结合”) 臂。两条重链的CH3和CH2结构域经由跨CH3结构域的蛋白-蛋白接触和CH2结构域中的糖基化相互作用，以形成同源二聚的Fc(“可结晶的片段”)区。抗体的CH1和CH2结构域之间的接头区构成抗体分子的铰链区。除连接mAb的Fab和Fc区以外，铰链也保持跨越两条重链的二硫键链接，且使它们保持在一起。铰链区中的氨基酸和二硫化连接的数量在IgG的四种同种型之间是显著不同的。IgG分子中的糖基化模式可以是显著不同的，在IgG分子中已经观察到约30个不同的碳水化合物部分[Arnold J.N.；Wormald M.R.；Sim R.B.；Rudd P.M.和Dwek R.A.(2007)Annual Reviews of Immunology25,21-50]。
单克隆抗体结构的对称性质导致两条Fab臂都具有成熟以识别相同表位的抗原结合能力亲和力。在另一末端，抗体分子的Fc部分参与与免疫或“效应”细胞上的各种受体分子的相互作用，且这些相互作用中的一些负责介导效应功能如抗体依赖的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)和补体活化。通常，效应功能涉及免疫应答，其导致病原体或毒素中和和消除、补体活化、和来自体液免疫系统的吞噬应答。效应细胞上的Fcγ受体(FcγR)分子接触参与完整抗原-抗体免疫复合物的活化的IgG抗体的Fc，以介导和调节效应应答。优化基于单克隆抗体的蛋白治疗剂与这些Fcγ受体的相互作用可以导致改进这些药物候选的效力。
在人中，有三种已知种类的FcγR，每一类内具有进一步的多态类型。已知IgG1分子中的Fc以纳摩尔范围内的解离常数结合FcγRI (CD64)，而FcγRII(CD32)和fcγRIII(CD16)结合以微摩尔范围发生 [Bruhns P.；Iannascoli B.；England P.；Mancardi D.A.；Fernandez N.； Jorieux S.和Daeron M.(2009)Blood 113：3716-25]。高亲和力FcγRI 受体可以结合单体形式的IgG，而低亲和力FcγRII和FcγRIII受体由于抗体亲抗原性效应仅可以结合抗原-抗体免疫复合物或IgG聚集体。不同IgG形式对于不同FcγR具有不同的亲和力；具体而言，IgG1和 IgG3表现出更强的活性。Fcγ受体是跨膜蛋白的胞外结构域，且具有参与调节细胞内的信号传递途径的胞质结构域。当与抗体介导的免疫复合物结合后聚集在免疫细胞表面上时，根据与这些细胞表面受体的胞质端上的FcγR连接的信号传递单元的性质，这些分子调节效应应答[Nimmerjahn F.和Ravetch J.V.(2008)Nature Immu Rev 8(1):34-47]。
在人染色体水平，三个基因编码FcγRI(FcγRIA、FcγRIB、FcγRIC) 和FcγRII(FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC)且两个基因编码FcγRIII (FcγRIIIA、FcγRIIIB)。在结合IgG的人Fcγ受体中，已经显示FcγRIA、 FcγRIC和FcγRIIIA类型与共同γ-链信号衔接蛋白膜相关，其含有基于细胞质免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，所述活化基序导致效应功能的活化。FcγRIIA和FcγRIIC还包含细胞质ITAM，但没有共同γ-链信号衔接蛋白。同时，FcγRIIB连接至基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。导致ITIM磷酸化的FcγRIIB活化导致活化信号传递级联的抑制。FcγRIIIB，尽管缺乏基于酪氨酸的免疫调节细胞质尾部，但是具有GPI(糖基-磷脂酰-肌醇)锚，且已经显示有助于在FcγRIIA 存在的情况下活化一些粒细胞。
表C：Fcγ受体特征
ITAM：基于免疫受体酪氨酸的活化基序；ITIM：基于免疫受体酪氨酸的抑制基序；GPI糖基磷脂酰肌醇
尽管ITAM和ITIM基序和相关受体分子的功能作用是已知的，但是组合的信号传递的调节的性质和机制还没有完全理解，特别是当与参与信号转导的许多其他免疫细胞表面受体和衔接分子(例如BCR、CD22、CD45等)的活性相组合时。在该背景下，设计可以以精细的选择性概况与这些Fcγ受体相互作用的Fc样分子在去卷积和调节这种具有精细调节活性的受体分子的作用的任何尝试中是有价值的支架。
在设计可以区分FcγR的抗体分子的背景中，下列事实使努力变得复杂：FcγRII和FcγRIII受体类型的细胞外Fc结合部分表现出高度序列相似性(图15)，这可以至少部分归因为祖传区段性重复。FcγRII 受体两个主要类型A和B具有69％序列同一性，而FcγRIIA和 FcγRIIIA表现出约44％序列同一性。FcγRIIB和FcγRIIC的差异仅在于胞外区的2个残基，尽管它们的胞内区显著不同，显著之处在于分别存在ITIM和ITAM基序。因此，可以预期的是，需要结合一种受体的治疗性抗体分子也可能与其他受体类型结合，可能导致不希望的治疗效果。
进一步使问题复杂化的是，每个受体类型呈现多个单核苷酸多态性(SNP)和拷贝数变化(CNV)。获得的受体多样性差异地影响其与IgG 的亲和力和其作用机制。这些遗传变化可以影响特定IgG亚类对于 Fcγ受体的亲和力，改变下游效应事件或影响改变受体表达水平的机制，导致功能相关的表型、非功能性或功能未知的受体变体(Bournazos S.；WoofJ.M.；Hart S.P.和Dransfield I.(2009)Clinical and Experimental Immunology 157(2):244-54)。它们可能导致复杂效果，改变活化和抑制受体信号传递之间的平衡，导致疾病易患表型的生成。
这些等位基因变化中的一些列举在表C中。值得注意的是， FcγRIIa中的R131变体是用IgG1的高响应者，而可替代的H131变体显示出与IgG2和IgG3的更有效相互作用。在FcγRIIIa的情况下，对于158位V纯合的供体表现出与纯合F/F158个体相比增加的NK 细胞活性，这是由于前者同种异型对于人IgG1、IgG3和IgG4的更高亲和力。FcγRIIIb的等位基因变体NA1和NA2是四氨基酸取代的结果，其依次导致受体糖基化的差异。NA1等位基因呈现出由嗜中性粒细胞的免疫复合物的增强的结合和吞噬作用。FcγRIIB具有两种已知的等位基因变体232I和232T。已知232T变体的阴性调节活性强烈受损。已经报道了FcγR多态性的频率和其与对感染或疾病状况的易感性的差异响应的关联，所述疾病状况如系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、血管炎、免疫介导的血小板紫癜(ITP)、重症肌无力、多发性硬化症(MS)、和免疫神经病变(吉兰-巴雷综合征 (GBS))。
已经表明了FcγR基因、特别是对于FcγRIIIB、FcγRIIc和FcγRIIIA 的基因座中拷贝数变化，且已经注意到这些差异与这些受体的细胞表面表达的进一步关联。相比之下，FcγRIIa和FcγRIIb没有显示基因拷贝数变化。事实上，FcγRIIIb的低拷贝数已经与自身免疫性疾病系统性红斑狼疮(SLE)中的肾小球肾炎相关[Aitman TJ等人(2006)Nature 16；439(7078):851-5]。鉴于非信号传递GPI模块锚定FcγRIIIb 受体的事实，这是特别有趣的。可以推测这些FcγRIIIb受体的存在可以潜在地充当Fc与其他信号传递FcγR的相互作用的竞争性抑制剂。 FcγRIIc中的拷贝数变化的影响也是特别有趣的。FcγRIIc中202位处的C/T SNP将谷氨酰胺残基转换为终止密码子，防止了功能蛋白的生成。FcγRIIc的功能开放阅读框在9％的健康个体(白人群体)中表达，且在ITP群体中该等位基因有显著过高比例的呈现(19％)，暗示这些表型对于ITP的倾向[Breunis WB等人(2008)Blood111(3):1029-38]。已经表明，在NK细胞上表达功能FcγRIIc的个体中，这些受体以比FcγRIIIa更大的程度介导实现的ADCC。这样的与这些多态性和遗传变化相关的复杂性突出了个性化治疗策略的需要，要求高度定制的治疗剂。
各种效应细胞在这些Fcγ受体以及在它们的体液和组织分布中不同，因此有助于它们的活化和作用机制中的变化[表D]。调谐治疗性抗体对识别特定FcγR类型的选择性和调节某些类别的效应细胞的影响，导致对于特定疾病状况的效应机制的优化。根据所治疗的疾病状况，这意在选择性活化或抑制特定效应物形式。
表D：FcγR的细胞分布
此外，FcγR也由滤泡树突状细胞、内皮细胞、小胶质细胞、破骨细胞和系膜细胞表达。目前，这些其他细胞上FcγR表达的功能意义是未知的。
高亲和力FcγRI由三个C型免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域构成，而低亲和力FcγRII和FcγRIII各自由两个C型IgSF结构域构成。已经通过晶体学解析了FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa和FcγRIIIb受体蛋白的结构。在这些结构中的两个IgSF结构域相对于彼此50-55度定位，且通过铰链连接。
Fc-FcγR共复合物的公开可获得的结构是Fc-FcγRIIIb系统的结构，且复合物中的FcγR几何学保持与蛋白的apo状态中观察到的非常接近[Sondermann P.；Huber R.；Oosthuizen V.和Jacob U.(2000) Nature 406,267-273.；Radaev S.；Motyaka S.；Fridman W.； Sautes-Fridman C.和Sun P.D.(2001)J Biol Chem 276,16469-16477；Sondermann P.等人Biochem Soc Trans.2002 Aug；30(4):481-6； Sondermann P,Oosthuizen V.Immunol Lett.2002 Jun 3；82(1-2):51-6； Radaev S,Sun P.MolImmunol.2002 May；38(14):1073-83.][图16]。受体之间的强序列和结构相似性形成了与其他受体结合的Fc的比较模型的基础。另一方面，这些受体分子之间的序列和结构相似性也使设计在受体和其不同同种型之间具有精细选择性的Fc变得具有挑战性。
在基于晶体学评价Fc-FcγR复合物的结构之前，存在如下问题： Fc分子中的2倍对称轴是否意味着对于Fc-FcγR结合的两个潜在结合位点和有效的2:1化学计量比。Fc-FcγR相互作用的基于核磁共振 (NMR)的结构研究表明，Fc与在分子的一个面上的一个FcγR的结合诱导了构象变化，所述构象变化排除了第二个FcγR分子与相同抗体分子的Fc的结合[Kato K.等人(2000)J Mol Biol.295(2):213-24]。 Fc-FcγRIIIb的可获得的共晶体复合物的几何学验证了以1:1化学计量的不对称取向的FcγR与Fc的结合。如图16中所示，FcγR结合至马蹄形Fc分子的一个末端上的裂口，且与来自两条链的CH2结构域接触。
丙氨酸扫描诱变[Shields RL等人(2001)JBC 276(9):6591-604]提供了关于Fc与不同受体类型相互连接且因此参与Fc-FcγR相互作用和识别的残基的见解。传统上，已经将治疗性抗体的优化聚焦在表现出与活化受体FcγRIII结合增加[美国专利号6,737,056]或与FcγRIIb 亲和力降低[US2009/0010920A1]的突变。在所有这些可替代的变体中，同时在两条链中引入突变。
单克隆抗体经常通过诱导靶标和效应免疫细胞的空间定位而表现出它们的治疗活性。天然抗体通过与使用其Fab结构域的靶标和使用Fc结构域的效应细胞相互作用而介导这个。它们能够面对面并置免疫复合物和效应细胞，使得可以诱导细胞介导的应答。对于FcγR 信号传递所需的抗体亲抗原性(其起源于免疫复合物的形成，所述形成涉及多个抗体分子靶向单个靶标)是免疫作用的时空组织的重要性的另一个实例。
对于作为mAb分子的效应活性的部分诱导的细胞信号传递还存在时空方面。细胞信号传递如基于FcγR分子活化的那些涉及相关受体分子在被称为脂质筏的膜结构域区域内的定位。脂质筏富含鞘糖脂和胆固醇和几类上游信号转导分子，包括Src家族激酶。细胞刺激之后，招募各种信号分子、衔接蛋白和信号传递激酶以及磷酸酶。脂质筏处的分子组装对于信号转导是重要的。
非天然设计策略，组合不同的抗原特异性和增加的亲和力以提供更好的结合特性是双特异性治疗剂设计的基础。设计双特异性抗体或其他形式的双功能或多功能蛋白治疗剂以介导靶标和各种效应细胞之间的相互作用[Müller&Kontermann(2010)BioDrugs 24(2):89-98]。将多特异性治疗分子工程改造以便使辅助性T细胞或其他免疫效应细胞重新针对特定靶细胞。
在另一个实施方案中，本发明涉及基于与FcγRIIa、FcγRIIb和/ 或FcγRIIIa的计算的结合亲和力在计算机芯片上鉴定Fc变体多肽的方法。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括在计算机芯片上计算所述Fc变体多肽的静电、溶剂化作用、包装、包装密度、氢结合和熵效应。在又另一个实施方案中，本发明的方法进一步包括构建 Fc变体多肽和在哺乳动物细胞中表达治疗性抗体背景中的所述多肽且进一步表达所述抗体。在又另一个实施方案中，本发明的方法包括：通过位点定向诱变、基于PCR的诱变、盒式诱变或从头合成而构建在计算机芯片上鉴定的Fc变体多肽。
在合成Fc支架的设计中考虑的因素包括在计算机芯片上计算立体排斥、埋藏的接口区域的改变、相对接触密度、相对溶剂化作用和静电影响。所有这些基质用来达到亲和力评分。
在一个方面，本申请描述了经由设计建立在异源二聚体Fc上的不对称支架而实现精细的FcγR选择性概况的分子设计。该支架允许 CH2结构域中的不对称突变以实现多种新的选择性概况。此外，支架具有用于工程改造多功能(双、三、四或五功能)治疗分子的固有特征。
在某些实施方案中，可以对于对新生Fc受体(FcRn)的pH依赖性结合特性将不对称支架进行优化，从而能够更好地再循环分子且增强其半衰期和相关的药代动力学特性。
可以对于与功能相关的FcγRI受体同种异型的结合将不对称支架进行优化。FcγRI是参与慢性炎性病症的巨噬细胞上的主要标记，所述慢性炎性病症如类风湿关节炎、特应性皮炎、银屑癣和多种肺病。
可以对于蛋白A结合对不对称支架进行优化。蛋白A结合经常用于分离和纯化抗体分子。可以将突变引入不对称支架以避免治疗剂在储存过程中的聚集。
因此，特别考虑本发明的Fc变体可以尤其含有一种或多种额外的氨基酸残基取代、突变和/或修饰，其导致具有优选特征的抗体，所述特征包括但不限于：增加的血清半衰期、增加结合亲和力、降低的免疫原性、增加的产量、增强或降低的ADCC和CDC活性、改变的糖基化和/或二硫键和修饰的结合特异性。
可以考虑，本发明的Fc变体可以具有相对于可比较的分子的其他改变的特性，包括在哺乳动物、特别是人中增加的体内半衰期(例如，血清半衰期)，在体内(例如，血清半衰期)和/或在体外(例如，保质期)增加的稳定性和/或增加的熔解温度(Tm)。在一个实施方案中，本发明的Fc变体具有下列的体内半衰期：大于15天、大于20天、大于25天、大于30天、大于35天、大于40天、大于45天、大于 2个月、大于3个月、大于4个月、或大于5个月。在另一个实施方案中，本发明的Fc变体具有下列的体外半衰期(例如，液体或粉末制剂)：大于15天、大于30天、大于2个月、大于3个月、大于6个月、或大于12个月、或大于24个月、或大于36个月、或大于60个月。
本领域技术人员还将理解的是，本发明的Fc变体当施用于受试者时可以具有改变的免疫原性。相应地，可以考虑使Fc变体的免疫原性的最小化的修饰的CH3结构域通常对于治疗应用是更期望的。
本发明的Fc变体可以与其他Fc修饰组合，包括但不限于改变效应物功能的修饰。本发明包括组合本发明的Fc变体与其他Fc修饰来提供抗体或Fc融合蛋白中累加的、协同的或新的特性。这种修饰可以是在铰链、CH1、或CH2、(或CH3，条件是它没有阴性改变本发明的修饰的CH3结构域的稳定性和纯度特性)结构域或它们的组合中。考虑到，本发明的Fc变体增强与它们相组合的修饰的特征。例如，如果本发明的Fc变体与突变体组合(已知所述突变体以比包含野生型Fc区的可比较分子更高的亲和力结合FcγRIIIA)；那么与本发明的突变体的组合导致FcγRIIIA亲和力方面更高倍数的增强。
在一个实施方案中，本发明Fc变体可以与其他已知的Fc变体组合，其他已知的Fc变体如下列参考文献中公开的那些：Duncan等人， 1988，Nature 332:563-564；Lund等人，1991，J Immunol 147:2657-2662； Lund等人，1992，Mol Immunol 29:53-59；Alegre等人，1994， Transplantation 57：1537-1543；Hutchins等人，1995，Proc Natl.Acad Sci USA92:11980-11984；Jefferis等人，1995，Immunol Lett.44:111-117； Lund等人，1995，FasebJ 9:115-119；Jefferis等人，1996，Immunol Lett 54:101-104；Lund等人，1996，Immunol157:4963-4969；Armour等人，1999，Eur J Immunol 29:2613-2624；Idusogie等人，2000，JImmunol 164:4178-4184；Reddy等人，2000，J Immunol 164:1925-1933；Xu 等人，2000，Cell Immunol 200:16-26；Idusogie等人，2001，J Immunol 166:2571-2575；Shields等人，2001，J Biol Chem 276:6591-6604；Jefferis 等人，2002，Immunol Lett 82:57-65；Presta等人，2002，Biochem Soc Trans 30:487-490)；美国专利号5,624,821；5,885,573；6,194,551；美国专利公布号60/601,634和60/608,852；PCT公布号WO00/42072和 WO99/58572。
本领域技术人员将理解，本发明的Fc变体可以具有改变的Fc的配体(例如，FcγR，C1q)结合特性(结合特性的实例包括但不限于：结合特异性、平衡解离常数(KD)、解离和结合速率(分别是Koff和Kon)、结合亲和力和/或抗体亲抗原性)，并且某些改变或多或少是期望的。本领域中众所周知的是，平衡解离常数(KD)被定义为koff/kon。通常应理解，具有低KD的结合分子(例如，和抗体)比具有高KD的结合分子(例如，和抗体)更优选。然而，在一些情况下，Kon或Koff值可能比 KD值更相关。本领域技术人员可以确定对给定抗体应用而言哪一个动力学参数最重要。例如，增强Fc与一种或多种阳性调节物(例如， FcγRIIIA)的结合同时未改变或甚至降低Fc与阴性调节物FcγRIIB的结合的修饰的CH3和/或CH2对于增强ADCC活性将是更有利的。可替代地，降低与一种或多种阳性调节物的结合和/或增强与FcγRIIB的结合的修饰的CH3和/或CH2对于降低ADCC活性将是有利的。相应地，结合亲和力的比值(例如，平衡解离常数(KD))可以表明Fc变体的ADCC活性是否增强或降低。例如，FcγRIIIA/FcγRIIB平衡解离常数的比值(KD)的降低将与改进的ADCC活性相关，而比值的增加将与ADCC活性的下降相关。
作为Fc变体的表征的部分，测试它们与FcγRIIIA(CD16a)和 FcγRIIB(CD32b)的结合亲和力，其报告为与野生型IgG1相比的比值。 (参见实施例4和表5)在这样的情况下，可能评价CH3结合域突变对与这些激活和抑制Fc受体的结合的影响。在一个实施方案中，本文提供了分离的包含异源二聚体Fc区的异源多聚体，其中所述异源二聚体Fc区包含具有增加稳定性的修饰的CH3结构域，所述修饰的 CH3结构域包含促进异源二聚体形成的氨基酸突变，其中所述修饰的 CH3结构域具有高于70℃的熔解温度(Tm)，其中与野生型同源二聚体相比，异源二聚体与CD16a的结合约相同。在某些实施方案中，与野生型同源二聚体相比，异源二聚体与CD16a的结合是增加的。在可替代的实施方案中，与野生型同源二聚体相比，异源二聚体与 CD16a的结合是减少的。
在某些实施方案中，本文提供了分离的包含异源二聚体Fc区的异源多聚体，其中所述异源二聚体Fc区包含具有增加稳定性的修饰的CH3结构域，所述修饰的CH3结构域包含促进异源二聚体形成的氨基酸突变，其中所述修饰的CH3结构域具有高于70℃的熔解温度(Tm)，其中与野生型同源二聚体相比，异源二聚体与CD32b的结合约相同。在某些实施方案中，与野生型同源二聚体相比，异源二聚体与CD32b的结合是增加的。在可替代的实施方案中，与野生型同源二聚体相比，异源二聚体与CD32b的结合是减少的。
本领域技术人员将理解，可以将KD报道作为Fc变体与CD16a 的结合和Fc变体与CD32b的结合的比值(数据未显示)，而不是报道结合CD16a和CD32b的KD作为Fc变体与野生型同源二聚体的比值。该比值可以提供与野生型相比修饰的CH3结构域突变对ADCC或不变、或增加或降低的指示，如下面更详细地描述的。
本发明的Fc变体对FcγR的亲和力和结合性质最初使用本领域已知用于测定Fc-FcγR相互作用，即，Fc区与FcγR的特异性结合的体外测定(基于生物化学或免疫学的测定)来测定，包括但不限于 ELISA测定、表面等离子共振测定、免疫沉淀测定(参见下面题为“表征和功能测定”的部分)和其他方法如间接结合测定、竞争性抑制测定、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和层析法(例如凝胶过滤)。这些和其他方法可利用所检测的一种或多种组分上的标记和/或利用各种检测方法，包括但不限于发色、荧光、发光或同位素标记。有关结合亲和力和动力学的详细描述可参见Paul，W.E.编，Fundamental Immunology，第4版，Lippincott-Raven，Philadelphia(1999)，其关注于抗体-免疫原相互作用。
考虑到，本发明的分子的结合性质也通过用于测定一种或多种 FcγR介体效应细胞功能的体外功能性测定来表征(参见下面题为“表征和功能测定”的部分)。在某些实施方案中，本发明的分子在体内模型(例如，本文中描述和公开的那些)中具有与基于体外的测定的那些所类似的结合性质。然而，本发明不排除在基于体外的测定中不展现期望的表型、但在体内展现期望的表型的本发明的分子。
本发明涵盖相对于可比较的分子以增加的亲和力结合FcγRIIIA (CD16a)的Fc变体。在特定的实施方案中，相对于可比较的分子，本发明的Fc变体以增加的亲和力结合FcγRIIIA且以不变或降低的结合亲和力结合FcγRIIB(CD32b)。在又另一实施方案中，相对于可比较的分子，本发明的Fc变体具有降低的FcγRIIIA/FcγRIIB平衡解离常数(KD)的比值。
本发明还考虑了相对于可比较的分子以降低的亲和力结合 FcγRIIIA(CD16a)的Fc变体。在特定的实施方案中，相对于可比较的分子，本发明的Fc变体以降低的亲和力结合FcγRIIIA，且相对于可比较的分子，以不变或增加的结合亲和力结合FcγRIIB。
在一个实施方案中，Fc变体以增加的亲和力与FcγRIIIA结合。在特定的实施方案中，所述Fc变体对于FcγRIIIA的亲和力比可比较分子的高至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少 10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少 100倍、或至少200倍。在其他实施方案中，相对于可比较的分子， Fc变体对于FcγRIIIA的亲和力增加至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少 S0％、或至少90％、或至少100％、或至少150％、或至少200％。
在另一个实施方案中，相对于可比较的分子，Fc变体对于Fc配体(例如，FcγR、C1q)的平衡解离常数(KD)降低约2倍和10倍之间、或约5倍和50倍之间、或约25倍和250倍之间、或约100倍和500 倍之间、或约250倍和1000倍之间。
在另一个实施方案中，相对于可比较的分子，所述Fc变体对于FcγRIIIA的平衡解离常数(KD)降低至少2倍、或至少3倍、或至少5 倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍、或至少400倍、或至少600倍。在另一个实施方案中，相对于可比较的分子，Fc变体对于FcγRIIIA的平衡解离常数(KD)降低至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少150％、或至少200％。
在一个实施方案中，Fc变体以不变或降低的亲和力与FcγRIIB 结合。在特定实施方案中，相对于可比较的分子，所述Fc变体对于 FcγRIIB的亲和力不变或降低至少1倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少50倍、或至少100倍。在其他实施方案中，相对于可比较的分子，Fc变体对于FcγRIIB的亲和力不变或降低至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少150％、或至少200％。
在另一个实施方案中，相对于可比较的分子，所述Fc变体对于 FcγRIIB的平衡解离常数(KD)不变或增加至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少 S0倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍。在另一个特定实施方案中，相对于可比较的分子，Fc变体对于FcγRIIB的平衡解离常数(KD)不变或增加至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少 90％、或至少100％、或至少150％、或至少200％。
在又另一个实施方案中，相对于可比较的分子，Fc变体以增加的亲和力结合FcγRIIIA，且相对于可比较的分子，以不变或降低的结合亲和力结合FcγRIIB。在特定实施方案中，相对于可比较的分子， Fc变体对于FcγRIIIA的亲和力增加至少1倍、或至少3倍、或至少 5倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少50倍、或至少100倍。在另一个特定实施方案中，相对于可比较的分子，Fc变体对于FcγRIIB的亲和力或不变或降低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少50倍、或至少100 倍。在其他实施方案中，相对于可比较的分子，Fc变体对于FcγRIIIA 的亲和力增加至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少150％、或至少200％并且相对于可比较的分子， Fc变体对于FcγRIIB的亲和力或不变或增加至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少150％、或至少200％。
在又另一个实施方案中，Fc变体相对于可比较的分子的 FcγRIIIA/FcγRIIB平衡解离常数(KD)的比值降低。在特定实施方案中， Fc变体相对于可比较的分子的FcγRIIIA/FcγRIIB平衡解离常数(KD) 的比值降低至少1倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少50倍、或至少100倍。在另一个特定实施方案中， Fc变体相对于可比较的分子的FcγRIIIA/FcγRIIB平衡解离常数(KD) 的比值降低至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少150％、或至少200％。
在另一个实施方案中，相对于可比较的分子，Fc变体以降低的亲和力结合FcγRIIIA。在特定实施方案中，相对于可比较的分子，所述Fc变体对于FcγRIIIA的亲和力降低至少1倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少50倍、或至少100倍。在其他实施方案中，相对于可比较的分子，Fc变体对于FcγRIIIA的亲和力降低至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少150％、或至少200％。
在又另一个实施方案中，相对于可比较的分子，Fc变体以降低的亲和力结合FcγRIIIA，且以不变或增加的亲和力结合FcγRIIB。在特定实施方案中，相对于可比较的分子，Fc变体对于FcγRIIIA的亲和力降低至少1倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少50倍、或至少100倍。在另一个特定实施方案中， Fc变体对于FcγRIIB的亲和力比可比较的分子高至少2倍、或至少3 倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少 50倍、或至少100倍。在其他实施方案中，相对于可比较的分子， Fc变体对于FcγRIIIA的亲和力降低至少10％、或至少20％、或至少 30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少 80％、或至少90％、或至少100％、或至少150％、或至少200％并且相对于可比较的分子，Fc变体对于FcγRIIB的亲和力增加至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少150％、或至少200％。
在又另一个实施方案中，当与可比较的分子比较时，Fc变体对于FcγRIIIA的平衡解离常数(KD)增加至少1倍、或至少3倍、或至少 5倍或至少10倍或至少20倍、或至少50倍。在特定实施方案中，相对于可比较的分子，所述Fc变体对于FcγRIIB的平衡解离常数(KD)降低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10 倍、或至少20倍、或至少50倍或至少100倍。
对于fcγR选择性的CH2变化
该复合物中Fc-FcγR蛋白-蛋白相互作用表明Fc分子中的两条链与FcγR分子上的两个不同位点相互作用。尽管天然Fc分子中的两条重链中存在对称性，但是一条链上的残基附近的局部FcγR环境不同于在相对Fc链上相同残基位置周围的FcγR残基。两个对称相关位置与FcγR残基的不同选择相互作用。
鉴于Fc与FcγR结合中的不对称性，Fc分子的链A和B中的同时突变不会以对称的方式影响与FcγR的相互作用。当引入突变以优化Fc的一条链上与其局部FcγR环境的相互作用时，在同源二聚体 Fc结构中，第二条链中的对应突变对于所需的FcγR结合和选择性概况可以是有利的、不利或没有帮助的。
使用结构和计算引导的方法，将不对称突变在Fc的两条链中进行工程改造以克服传统Fc工程改造策略的这些限制，所述传统Fc工程改造策略在Fc的两条链上引入相同的突变。如果对于与受体分子的其对应面的增强的结合将Fc的两条链独立地进行优化，那么可以获得受体之间更好的结合选择性。
例如，可以设计Fc的一条链上特定位置处的突变以增强对特定残基的选择性，这是阳性设计努力，同时可以将相同的残基位置突变以便与可替代的Fcγ受体类型中的其局部环境不利地相互作用，这是阴性设计努力，从而实现两种受体之间更好的选择性。在某些实施方案中，提供了用于在CH2结构域中设计不对称氨基酸修饰的方法，其与不同的Fcγ受体相比，选择性结合一种Fcγ受体(例如选择性结合FcgRIIIa而非FcgRIIb)。在其他某些实施方案中，提供了用于在变体Fc异源二聚体的CH2结构域中设计不对称氨基酸修饰的方法，其包含CH3结构域中的氨基酸修饰以促进异源二聚体形成。在另一个实施方案中，提供了基于变体Fc异源二聚体设计对于不同Fcγ受体的选择性的方法，所述变体Fc异源二聚体包含CH2结构域中的不对称氨基酸修饰。在又另一个实施方案中，提供了用于设计偏爱Fcγ受体与Fc分子的一面结合的不对称氨基酸修饰的方法。在其他某些实施方案中，提供了用于设计偏爱Fcγ受体以便与变体Fc异源二聚体的仅一面相互作用的极性驱动者的方法，所述变体Fc异源二聚体包含CH2结构域中的不对称氨基酸修饰。
可以定制CH2结构域中的突变的不对称设计以识别Fc分子的一面上的FcγR。这构成了不对称Fc支架的产生面，而相对面呈现野生型样相互作用倾向型，而没有设计的选择性概况，且可以视为非产生面。可以采用阴性设计策略以便在非产生面上引入突变以阻断FcγR 与不对称Fc支架的该面的相互作用，在那里通过迫使Fcγ受体具有期望的相互作用倾向。
表E：Fc对于不同Fcγ受体的可能有趣的选择性概况
(↑/-)表明表现出与特定受体类型或其同种异型之一的增加的或野生型样结合的变体。(×)表明与受体或子集同种异型没有明显的结合。
本发明还涉及融合多肽，其包含与Fc区融合的结合结构域，其中所述Fc区包含具有增加稳定性的修饰的CH3结构域，所述修饰的 CH3结构域包含促进异源二聚体形成的氨基酸突变，其中所述修饰的 CH3结构域具有高于70℃的熔解温度(Tm)。特别考虑的是，可以通过本领域技术人员众所周知的方法生成包含含有修饰的CH3结构域的异源二聚体的分子。简而言之，这些方法包括但不限于将具有期望特异性的可变区或结合结构域(例如，从噬菌体展示或表达文库分离的，或者源自受体的人或非人抗体或结合结构域的可变区)与变体Fc 异源二聚体相组合。可替代地，本领域技术人员可以通过修饰包含 Fc区的分子(例如抗体)的Fc区中的CH3结构域而生成变体Fc异源二聚体。
在一个实施方案中，Fc变体是抗体或Fc融合蛋白。在特定的实施方案中，本发明提供了包含Fc区的抗体，所述Fc区包含具有增加稳定性的修饰的CH3结构域，所述修饰的CH3结构域包含促进异源二聚体形成的氨基酸突变，其中所述修饰的CH3结构域具有高于 70℃的熔解温度(Tm)。这样的抗体包括，可以进行修饰以生成Fc变体的天然包含含有CH3结构域的Fc区的IgG分子，或已经工程改造以含有包含修饰的CH3结构域的Fc区的抗体衍生物。本发明的Fc 变体包括任何抗体分子，所述抗体分子结合，优选地，特异性结合(即，通过本领域众所周知用于测定特异性抗原-抗体结合的免疫测定法测定的、竞争排除非特异性结合)抗原，所述抗原包含并入修饰的CH3 结构域的Fc区。这种抗体包括但不限于，多克隆的、单克隆的、单特异性的、双特异性的、多特异性的、人类的、人源化的、嵌合的抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、二硫化物连接的Fvs、以及含有VL或VH结构域甚至特异性结合抗原的互补决定区(CDR)、在某些情况下进行工程改造以含有或融合到变体Fc异源二聚体的片段。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指分泌的抗体结合于某些细胞毒性细胞(如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上的Fc受体(FcR)，使得这些细胞毒性效应细胞特异性结合于携带抗原(antigen-healing)的靶细胞，随后用细胞毒素杀死该靶细胞的细胞毒性形式。靶向靶细胞表面的特异性高亲和力IgG抗体将细胞毒性细胞“武装”起来，是进行这种杀伤作用绝对需要的。靶细胞裂解是细胞内过程，需要直接的细胞间接触，并且不涉及补体。
可以测定任何具体抗体通过ADCC介导靶细胞裂解的能力。为了评价ADCC活性，将感兴趣的抗体和免疫效应细胞一起加到靶细胞中，通过抗原抗体复合物可以激活该效应细胞，进而导致该靶细胞的细胞裂解。通常通过裂解细胞释放标记(如放射性底物、荧光染料或天然的细胞内蛋白质)来检测细胞裂解。可以用于这类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。体外ADCC 测定的具体实例参见Wisecarver等人，1985，79:277；Bruggemann 等人，1987，J Exp Med 166:1351；Wilkinson等人，2001，J ImmunolMethods 258:183；Patel等人，1995J Immunol Methods 184:29和本文所述(参见下面题为“表征和功能测定”的部分)。或者或此外，可以在体内评价感兴趣的抗体的ADCC活性，例如在如Clynes等人，1998， PNAS USA 95:652所述的动物模型中评价。
考虑本发明的Fc变体通过用于测定一种或多种FcγR介体效应细胞功能的体外功能性测定来表征。在特定的实施方案中，本发明的分子在体内模型(例如，本文中描述和公开的那些)中具有与基于体外的测定的那些所类似的结合性质和效应细胞功能。然而，本发明不排除在基于体外的测定中不展现期望的表型、但在体内展现期望的表型的本发明的分子。
本发明进一步提供了具有增强的CDC功能的Fc变体。在一个实施方案中，Fc变体具有增加的CDC活性。在一个实施方案中，Fc 变体的CDC活性比可比较的分子高至少2倍、或至少3倍、或至少 5倍、或至少10倍、或至少50倍、或至少100倍。在另一个实施方案中，Fc变体结合C1q的亲和力比可比较的分子高至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少50倍、或至少100倍。在又另一个实施方案中，相对于可比较的分子，Fc变体的CDC活性增加至少10％、或至少20％、或至少 30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少 80％、或至少90％、或至少100％、或至少150％、或至少200％。在特定的实施方案中，本发明的Fc变体以增加的亲和力结合C1q；具有增强的CDC活性且与至少一种抗原特异性结合。
本发明还提供了具有降低的CDC功能的Fc变体。在一个实施方案中，Fc变体具有降低的CDC活性。在一个实施方案中，Fc变体的 CDC活性比可比较的分子低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少50倍或至少100倍。在另一个实施方案中，相对于可比较的分子，Fc变体结合C1q的亲和力降低至少1倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少50倍、或至少100倍。在另一个实施方案中，相对于可比较的分子，Fc变体的CDC活性降低至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少150％、或至少200％。在特定的实施方案中， Fc变体以降低的亲和力结合C1q，具有降低的CDC活性且与至少一种抗原特异性结合。
在一些实施方案中，Fc变体包含一种或多种工程改造的糖形式，即共价连接于含有Fc区的分子的糖组成。工程改造的糖形式可以用于各种目的，包括但不限于提高或降低效应物功能。可以通过本领域技术人员已知的任何方法产生工程改造的糖形式，例如，采用工程改造或变体表达株，通过与一种或多种酶如β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTI11)共同表达，通过在各种生物体或来自各种生物体的细胞系中表达含有Fc区的分子，或者通过在含有Fc区的分子表达后修饰碳水化合物。产生工程改造的糖形式的方法是本领域已知的，包括但不限于Umana等人，1999，Nat.Biotechnol 17:176-180；Davies等人，20017Biotechnol Bioeng 74:288-294；Shields等人，2002，J Biol Chem 277:26733-26740；Shinkawa等人，2003，J Biol Chem 278:3466-3473)；美国专利号6,602,684；美国序列号10/277,370；美国序列号 10/113,929；PCT WO 00/61739A1；PCT WO 01/292246A1；PCTWO 02/311140A1；PCT WO 02/30954A1所述的方法；PotillegentTM技术 (Biowa，Inc.Princeton，N.J.)；GlycoMAbTM糖基化工程改造技术 (GLYCART biotechnology AG，Zurich，Switzerland)。参见例如WO 00061739；EA01229125；US 20030115614；Okazaki等人，2004，JMB， 336:1239-49。
考虑Fc变体包括包含可变区和异源二聚体Fc区的抗体，其中所述异源二聚体Fc区包含具有增加稳定性的修饰的CH3结构域，所述修饰的CH3结构域包含促进异源二聚体形成的氨基酸突变，其中所述修饰的CH3结构域具有高于70℃的熔解温度(Tm)。为抗体的Fc 变体可以通过将特异性结合至少一种抗原的其片段的可变结构域与包含修饰的CH3结构域的异源二聚体Fc区相组合而“重新”产生。可替代地，可以通过修饰结合抗原的含有Fc区的抗体的CH3结构域而产生异源二聚体Fc变体。
本发明的抗体可以包括但不限于合成抗体、单克隆抗体、重组产生的抗体、胞内抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、合成抗体、单链FvFc(scFvFc)、单链Fv(scFv)和抗-独特型(抗-Id)抗体。具体而言，用于本发明方法中的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分。本发明免疫球蛋白分子可以是任何类型(如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。
本发明的抗体可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物(如人、鼠、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡)。在特定的实施方案中，该抗体是人或人源化单克隆抗体，特别地双特异单克隆抗体。本文所使用的“人”抗体包括具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，并且包括由人免疫球蛋白文库或由人基因表达抗体的小鼠分离的抗体。
抗体如所有多肽都具有等电点(pI)，等电点(pI)通常定义为多肽不带净电荷时的pH。本领域已知一般当溶液的pH等于该蛋白的等电点(pI)时该蛋白的溶解度最低。可能通过改变抗体中可电离残基的数量和位置以调节pI，从而优化溶解度。例如，可通过进行适当的氨基酸取代(例如用带电氨基酸如赖氨酸取代不带电残基如丙氨酸)操纵多肽的pI。不受任何具体理论的束缚，导致所述抗体pI改变的抗体的氨基酸取代可提高该抗体的溶解度和/或稳定性。本领域技术人员可以理解何种氨基酸取代最适合特定抗体获得所需pI。可以通过各种方法测定蛋白质的pI，这些方法包括但不限于：等电聚焦和各种计算机算法(参见例如，Bjellqvist等人，1993，Electrophoresis 14:1023)。在一个实施方案中，本发明Fc变体PI是介于pH 6.2和pH 8.0之间。在另一个实施方案中，本发明抗体PI是介于pH 6.8和pH7.4之间。在一个实施方案中，导致本发明Fc变体pI改变的取代将不会显著降低它与抗原的结合亲和力。可以考虑，具有增加稳定性的修饰的CH3 结构域也可以导致pI的变化。在一个实施方案中，特异性选择变体 Fc异源二聚体以影响增加稳定性和纯度和，任何期望的pI变化。
本发明的抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性或具有更多特异性的。多特异性抗体可以特异性结合于所需靶分子的不同表位，或者可以特异性结合于靶分子和异源表位，如异源多肽或固体支持物。参见例如国际公布号WO 94/04690、WO 93/17715、WO 92/08802、 WO91/00360和WO 92/05793；Tutt等人，1991，J.Immunol.147:60-69；美国专利号4,474,893、4,714,681、4,925,648、5,573,920和5,601,819；以及Kostelny等人，1992，J.Immunol.148:1547)。
可以基于如图20中所示的这种不对称支架设计多功能靶向分子的各种实施方案。
多特异性抗体对至少两种不同抗原具有结合特异性。虽然这类分子通常只结合两种抗原(即双特异性抗体，BsAb)，但本发明也包括具有额外的特异性的抗体如三特异性抗体。BsAb的实例包括但不限于一个臂针对肿瘤细胞抗原且另一个臂针对细胞毒性分子，或两个臂针对两个不同的肿瘤细胞抗原，或两个臂针对两种不同的可溶性配体，或一个臂针对可溶性配体且另一臂针对细胞表面受体，或两个臂针对两种不同的细胞表面受体的那些。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。
根据不同方法，将具有所需结合特异性的抗体可变结构域(抗体- 抗原组合位点)融合于免疫球蛋白恒定结构域序列。可以与含有铰链、 CH2和CH3区的至少部分的免疫球蛋白重链恒定区融合。考虑含有结合轻链所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)存在于至少一种融合物中。将编码免疫球蛋白重链融合物，如果需要，还有免疫球蛋白轻链的DNA，插入分开的表达载体中，共同转染到合适的宿主生物体中。在当用于构建的三条多肽链的不等比例提供了最佳产量的实施方案中，这为调整所述三个多肽片段的相互比例提供了很大的灵活性。参见，实施例1和表2。然而，当表达比例相同的至少两种多肽链导致高产率或该比例不是特别重要时，可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体中。
双特异性抗体包括交联或“异源缀合”的抗体。例如，异源缀合物中的一种抗体可以偶联于抗生物素蛋白，另一种抗体缀合于生物素。提议用这类抗体(例如)使免疫系统细胞靶向不良细胞(美国专利号 4,676,980)，并用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和 EP 03089)。可以采用任何常规的交联方法制备异源缀合物抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，参见美国专利号4,676,980以及许多交联技术。
考虑具有多于两价且并入修饰的CH3结构域和获得的本发明的 Fc异源二聚体的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。参见例如Tutt 等人，J.Immunol.147:60(1991)。
本发明的抗体也包括在哺乳动物(如人)中的半衰期(如血清半衰期)大于15天、大于20天、大于25天、大于30天、大于35天、大于40天、大于45天、大于2个月、大于3个月、大于4个月或大于 5个月的抗体。本发明的抗体在哺乳动物(如人)中的半衰期延长导致所述抗体或抗体片段在该哺乳动物中的血清滴度较高，因此降低施用所述抗体或抗体片段的频率和/或降低施用所述抗体或抗体片段的浓度。可以通过本领域技术人员已知的技术产生体外半衰期延长的抗体。例如，可通过修饰(如取代、缺失或加入)经鉴定参与Fc结构域和FcRn受体之间的相互作用的氨基酸残基，产生体内半衰期延长的抗体(参见例如，国际公布号WO 97/34631；WO 04/029207；美国专利号6,737,056和美国专利公布号2003/0190311)。
在一个特定实施方案中，包含修饰的CH3结构域的变体Fc异源二聚体是多特异性抗体(本文中被称为本发明的抗体)，本发明的抗体与感兴趣的抗原特异性结合。具体而言，本发明的抗体是双特异性抗体。在一个实施方案中，本发明的抗体特异性结合多肽抗原。在另一个实施方案中，本发明的抗体特异性结合非多肽抗原。在又另一个实施方案中，将本发明的抗体施用于患有疾病或病症的哺乳动物可以导致在该哺乳动物中的治疗益处。
基本上任何分子都可以被本文提供的变体Fc异源二聚体构建体 (例如抗体、Fc融合蛋白)靶向和/或并入所述变体Fc异源二聚体构建体中，所述变体Fc异源二聚体构建体包括但不限于以下蛋白质列表以及属于以下蛋白质列表的亚基、结构域、基序和表位：肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝集因子如因子VII、因子VIIIC、因子IX、组织因子(TF)和冯维勒布兰德因子；抗凝因子如蛋白C；心钠素；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或组织类型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶； RANTES(活化后可调节的、通常T细胞表达和分泌的)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；苗勒管(Muellerian)- 抑制物；松弛素A-链；松弛素B-链；松弛素原；小鼠促性腺素-相关肽；微生物蛋白质，如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原(CTLA)，如CTLA-4；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体，例如，EGFR、VEGFR；干扰素，如α干扰素(α-IFN)、β干扰素(β-IFN)和γ干扰素(γ-IFN)；蛋白A 或D；类风湿性因子；神经营养因子如骨源性的神经营养因子(BDNF)，神经营养因子-3、神经营养因子-4、神经营养因子-5或神经营养因子 -6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神经生长因子；血小板源性生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，如AFGF和PFGF；表皮生长因子 (EGF)；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-1、TGF-2、 TGF-3、TGF-4或TGF-5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)； des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，如 CD2、CD3、CD4、CD8、CD11a、CD14、CD18、CD19、CD20、CD22、 CD23、CD25、CD33、CD34、CD40、CD40L、CD52、CD63、CD64、 CD80和CD147；红细胞生成素；成骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素如干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ；集落刺激因子(CSF)，如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(IL)，如IL-1 至IL-13；TNFα，超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如AIDS包膜的一部分，如gp120；转移蛋白；归巢受体；地址素；调控蛋白；细胞粘附分子如LFA-1、Mac l、p150.95、VLA-4、ICAM-1、ICAM-3和VCAM、a4/p7整联蛋白和(Xv/p3 整联蛋白包括任一种或其亚基，整联蛋白α亚基，如CD49a、CD49b、 CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、α7、α8、α9、αD、CD11a、CD11b、 CD51、CD11c、CD41、αIIb、αIELb；整联蛋白β亚基，如CD29、 CD18、CD61、CD104、β5、β6、β7和β8；整联蛋白亚基组合，包括但不限于：αVβ3、αVβ5和α4β7；凋亡途径成员；IgE；血型抗原； flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mp1受体；CTLA-4；蛋白C；Eph受体如EphA2、EphA4、EphB2等；人白细胞抗原(HLA)如HLA-DR；补体蛋白如补体受体CR1、C1Rq和其他补体因子如C3和C5；糖蛋白受体如GpIbα、GPIIb/IIIa和CD200；以及任何上述多肽的片段。
还提供了特异性结合癌抗原的本发明的抗体，所述癌抗原包括但不限于：ALK受体(多效营养因子受体)、多效营养因子、KS1/4泛癌抗原；卵巢癌抗原(CA125)；前列腺酸磷酸酯；前列腺特异性抗原 (PSA)；黑色素瘤-相关抗原p97；黑色素瘤抗原gp75；高分子量黑色素瘤抗原(HMW-MAA)；前列腺特异性膜抗原；癌胚抗原(CEA)；多形上皮粘蛋白抗原；人乳脂球抗原；结直肠肿瘤相关抗原，如：CEA、 TAG-72、CO17-1A、GICA19-9、CTA-1和LEA；伯基特淋巴瘤抗原-38.13；CD19；人B-淋巴瘤抗原-CD20；CD33；黑色素瘤特异性抗原如神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、神经节苷脂GM2和神经节苷脂GM3；肿瘤特异性移植类型细胞表面抗原(TSTA)；病毒诱导的肿瘤抗原，包括T-抗原、DNA肿瘤病毒和RNA肿瘤病毒的包膜抗原；癌胚抗原-甲胎蛋白如结肠的CEA、5T4癌胚滋养层糖蛋白和膀胱肿瘤癌胚抗原；分化抗原，如人肺癌抗原L6和L20；纤维肉瘤抗原；人白血病T细胞抗原-Gp37；新糖蛋白(neoglycoprotein)；鞘脂；乳腺癌抗原如EGFR(表皮生长因子受体)；NY-BR-16；NY-BR-16和HER2 抗原(p185HER2)；多形性上皮粘蛋白(PEM)；恶性人淋巴细胞抗原 -APO-1；分化抗原，如胎儿红细胞中发现的I抗原；成年人红细胞中发现的原内胚层I抗原；着床前胚胎；胃腺癌中发现的I(Ma)；乳腺上皮中发现的M18、M39；骨髓细胞中发现的SSEA-1；VEP8；VEP9； Myl；Va4-D5；结直肠癌中发现的D156-22；TRA-1-85(血型H)；睾丸和卵巢癌中发现的SCP-1；结肠腺癌中发现的C14；肺腺癌中发现的F3；胃癌中发现的AH6；Y半抗原；胚胎癌细胞中发现的Ley； TL5(血型A)；A431细胞中发现的EGF受体；胰腺癌中发现的E1系列(血型B)；胚胎癌细胞中发现的FC10.2；胃腺癌抗原；腺癌中发现的CO-514(血型Lea)；腺癌中发现的NS-10；CO-43(血型Leb)；A431 细胞EGF受体中发现的G49；结肠腺癌中发现的MH2(血型 ALeb/Ley)；结肠癌中发现的19.9；胃癌粘蛋白；骨髓细胞中发现的 T5A7；黑色素瘤中发现的R24；胚胎癌细胞中发现的4.2、GD3、D1.1、 OFA-1、GM2、OFA-2、GD2和M1：22：25：8以及4-8细胞期胚胎中发现的SSEA-3和SSEA-4；皮肤T细胞淋巴瘤抗原；MART-1抗原；唾液酸Tn(STn)抗原；结肠癌抗原NY-CO-45；肺癌抗原NY-LU-12 变体A；腺癌抗原ART1；副肿瘤性相关性脑-睾丸-癌症抗原(癌神经元抗原MA2；副肿瘤性神经元抗原)；神经肿瘤腹侧抗原2(NOVA2)；肝细胞癌抗原基因520；肿瘤相关抗原CO-029；肿瘤相关抗原 MAGE-C1(癌症/睾丸抗原CT7)、MAGE-B1(MAGE-XP抗原)、 MAGE-B2(DAM6)、MAGE-2、MAGE-4-a、MAGE-4-b和MAGE-X2；癌症-睾丸抗原(NY-EOS-1)以及任何上述多肽的片段。
在某些实施方案中，本文所述的异源多聚体包含至少一种治疗性抗体。在一些实施方案中，治疗性抗体结合癌靶抗原。在一个实施方案中，治疗性抗体可以是选自下列中的一种：阿巴伏单抗 (abagovomab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿伦珠单抗、奥罗格雷、巴匹珠单抗、巴利昔单抗、贝利木单抗(belimumab)、贝伐珠单抗、 briakinumab、卡那单抗(canakinumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、塞舍珠单抗(certolizumab pegol)、西妥昔单抗、达克珠单抗、地舒单抗(denosumab)、依法珠单抗、加利昔单抗(galiximab)、吉妥珠单抗奥佐米星、戈利木单抗(golimumab)、替伊莫单抗、英利昔单抗、伊匹木单抗、鲁昔单抗、美泊利单抗、莫他珠单抗、莫罗单抗、mycograb、那他珠单抗、尼妥珠单抗、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗 (ofatumumab)、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、培妥珠单抗、雷珠单抗、瑞利珠单抗、利妥昔单抗、替利珠单抗(teplizumab)、托珠单抗/atlizumab、托西莫单抗、曲妥珠单抗、ProxiniumTM、 RencarexTM、优特克单抗、扎芦木单抗(zalutumumab)和任何其他抗体。
本发明的抗体包括修饰的衍生物(即，通过将任何类型的分子共价结合到抗体上，从而共价结合)。例如但不限于，抗体衍生物包括通过，例如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、连接于细胞配体或其他蛋白质等方法修饰的抗体。可以通过已知技术进行任何许多化学修饰，这些技术包括但不限于：特定化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，该衍生物可以含有一个或多个非经典氨基酸。
可以通过将聚合物分子如高分子量聚乙二醇(PEG)连接到抗体或抗体片段，产生体内半衰期延长的抗体或其片段。可以通过PEG与所述抗体或抗体片段的N末端或C末端的位点特异性缀合，或通过赖氨酸残基上存在的ε-氨基、利用或不利用多功能接头，将PEG连接于抗体或抗体片段。可以利用导致生物活性损失最小的直链或支链聚合物衍生化。通过SDS-PAGE和质谱密切监测缀合程度，以保证PEG分子适当地缀合于所述抗体。可以通过，例如大小排阻或离子交换层析将未反应的PEG与抗体-PEG缀合物分离开。
另外，可以将抗体缀合于白蛋白，以制备体内更稳定且具有更长的体内半衰期的抗体或抗体片段。本领域众所周知这些技术，参见例如国际公布号WO 93/15199、WO 93/15200和WO 01/77137；和欧洲专利号EP 413,622。本发明涵盖与一个或多个部分融合或缀合的抗体或其片段的用途，所述部分包括但不限于：肽、多肽、蛋白质、融合蛋白、核酸分子、小分子、模拟剂、合成药物、无机分子和有机分子。
本发明涵盖与异源蛋白或多肽(或其部分，例如，至少10、至少 20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少 90或至少100个氨基酸的多肽)重组地融合或化学地缀合(包括共价和非共价缀合)的抗体或其片段以产生融合蛋白的用途。融合不一定需要直接融合，但可以通过接头序列进行。例如，可以采用抗体，通过将抗体融合或缀合于特定细胞表面受体的特异性抗体，使异源多肽在体外或体内靶向至特定细胞类型。也可以将融合或缀合于异源多肽的抗体用于使用本领域已知方法的体外免疫测定和纯化方法。参见例如，国际公布号WO 93/21232；欧洲专利号EP 439,095；Naramura 等人，1994，Immunol.Lett.39:91-99；美国专利号5,474,981；Gillies 等人，1992，PNAS 89:1428-1432；和Fell等人，1991，J.Immunol. 146:2446-2452。
本发明进一步包括包含与抗体片段融合或缀合的异源蛋白、肽或多肽的组合物。例如，可以将异源多肽融合或缀合于Fab片段、Fd 片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH结构域、VL结构域、VH CDR、 VL CDR或其片段。本领域众所周知融合或缀合多肽到抗体部分的方法。参见例如，美国专利号5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、 5,447,851和5,112,946；欧洲专利号EP 307,434和EP 367,166；国际公布号WO 96/04388和WO 91/06570；Ashkenazi等人，1991，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 88：10535-10539；Zheng等人，1995，J.Immunol. 154:5590-5600；和Vil等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:11337-11341。
通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(共同称为“DNA改组”)的技术，可以产生其他的融合蛋白，如，特异性结合抗原(如，同上)的抗体。可以采用DNA改组来改变本发明抗体或其片段的活性(例如，具有更高亲和力和更低离解速率的抗体或其片段)。参见，一般地，美国专利号5,605,793、5,811,238、5,830,721、 5,834,252和5,837,458，和Patten等人，1997，Curr.Opinion Biotechnol. 8：724-33；Harayama，1998，TrendsBiotechnol.16(2)：76-82；Hansson 等人，1999，J.Mol.Biol.287：265-76；以及Lorenzo和Blasco，1998， BioTechniques 24(2)：308-313。可以在重组之前通过易错PCR、随机核苷酸插入或其他方法经历随机诱变来改变抗体或其片段、或编码的抗体或其片段。编码其部分特异性结合抗原的抗体或抗体片段的多核苷酸的一个或多个部分可以与一种或多种异源分子的一个或多个成分、基序、段、部分、结构域、片段等等重组。
本发明还包括缀合于治疗剂的变体Fc异源二聚体或其片段的用途。
可以将抗体或其片段缀合于治疗部分，例如细胞毒素，如细胞抑制剂或杀细胞剂、治疗剂或放射性金属离子，如α-发射体。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何试剂。实例包括核糖核酸酶、monomethylauristatin E和F、紫杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊甙、替诺泊甙(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、道诺霉素、二羟炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素类、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、表柔比星和环磷酰胺和它们的类似物或同系物。治疗剂包括但不限于抗代谢剂(如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺)、烷化剂(如双氯乙基甲胺、塞替派(thioepa)苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BCNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺二氯二胺铂(II)(DDP) 顺铂)、蒽环霉素(如道诺霉素和多柔比星)、抗生素(如放线菌素D(以前为放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))和抗-有丝分裂剂(如长春新碱和长春碱)。更详细的治疗剂列表可参见PCT公开 WO03/075957。
另外，可将抗体及其片段缀合于改变给定生物应答的治疗剂或药物部分。治疗剂或药物部分不应解释为仅限于经典化疗剂。例如，药物部分可以是具有所需生物学活性的蛋白质或多肽。这类蛋白质可以包括，例如，毒素，如相思豆毒蛋白，蓖麻毒蛋白A，昂科酶(Onconase)(或另一种细胞毒性RNA酶)，假单胞菌外毒素，霍乱毒素或白喉毒素；蛋白质如肿瘤坏死因子，α-干扰素，β-干扰素，神经生长因子，血小板源性生长因子，组织纤溶酶原激活物，凋亡剂，如 TNF-α、TNF-β、AIM I(参见国际公布号WO 97/33899)、AIM II(参见国际公布号WO 97/34911)、Fas配体(Takahashi等人，1994，J. Immunol.，6:1567)和VEGI(参见国际公布号WO 99/23105)，血栓形成剂(thrombotic agent)或抗-血管生成剂，如血管抑制素或内皮抑制素；或者，生物应答改变剂，例如，淋巴因子(如白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (“GM-CSF”)和粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”))或生长因子(如生长激素(“GH”))。
而且，可以将抗体缀合于治疗部分如放射性物质或用于缀合放射性金属离子的大环螯合剂(参见上述放射性物质的实例)。在某些实施方案中，大环螯合剂是可以通过接头分子连接于抗体的1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N’,N”,N”-四乙酸(DOTA)。本领域通常已知这类接头分子，参见Denardo等人，1998，Clin Cancer Res.4:2483；Peterson等人，1999，Bioconjug.Chem.10:553；和Zimmerman等人，1999，Nucl. Med.Biol.26:943。
本领域已知将抗体融合或缀合于多肽部分的方法。参见例如，美国专利号5,336,603；5,622,929；5,359,046；5,349,053；5,447,851和 5,112,946；EP 307,434；EP 367,166；PCT公开WO 96/04388和WO 9I/06570；Ashkenazi等人，1991，PNAS USA 88:10535；Zheng等人， 1995，J Immunol 154:5590；和Vil等人，1992，PNAS USA 89:11337。抗体与部分的融合不一定需要直接融合，但可通过接头序列融合。本领域通常知道这类接头分子，参见Denardo等人，1998，Clin Cancer Res 4:2483；Peterson等人，1999，Bioconjug Chem10:553；Zimmerman 等人，1999，Nucl Med Biol 26:943；Garnett，2002，Adv Drug DelivRev 53:17l。
Fc变体、其衍生物、类似物或片段(如本发明的抗体或融合蛋白) 的重组表达需要构建含有编码Fc变体(如抗体或融合蛋白)的多核苷酸的表达载体。一旦获得编码Fc变体(如抗体或融合蛋白)的多核苷酸，可以利用本领域众所周知技术通过重组DNA技术产生用于产生 Fc变体(如抗体或融合蛋白)的载体。因此，本文描述了通过表达含有 Fc变体(如抗体或融合蛋白)编码核苷酸序列的多核苷酸制备蛋白质的方法。可以利用本领域技术人员众所周知的方法构建含有Fc变体 (如抗体或融合蛋白)编码序列和合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如，体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。因此，本发明提供包含可操作连接于启动子的编码本发明Fc 变体的核苷酸序列的可复制载体。这类载体可以包括编码抗体分子恒定区(参见例如国际公布号WO 86/05807；国际公布号WO89/01036；和美国专利号5,122,464)和抗体可变区的核苷酸序列，或者可以将产生Fc变体的多肽克隆到这类载体中，用于表达全长抗体链(如重链或轻链)，或者含有非抗体衍生多肽和并入至少修饰的CH3结构域的Fc 区的融合物的完整Fc变体。
通过常规技术将该表达载体转移到宿主细胞中，然后通过常规技术培养该转染细胞，产生本发明的Fc变体。因此，本发明包括含有可操作连接于异源启动子的编码本发明的Fc变体的多核苷酸的宿主细胞。在特定的实施方案中，为了表达含有双链抗体的Fc变体，可以在宿主细胞中共同表达编码重链和轻链的载体，以表达整个免疫球蛋白分子，如下所详述。
可以利用各种宿主表达载体系统来表达本发明的Fc变体(如抗体或融合蛋白分子)(参见例如，美国专利号5,807,715)。这类宿主表达系统代表可以产生并随后纯化感兴趣编码序列的载体，但也代表用合适的核苷酸编码序列转化或转染时，可以原位表达本发明的Fc变体的细胞。这些包括但不限于微生物，例如用含有Fc变体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(如大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用含有Fc变体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(如毕赤酵母(Saccharomyces Pichia))；用含有Fc变体编码序列的重组病毒表达载体(如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有Fc变体编码序列的重组病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的或用含有Fc变体编码序列的重组质粒表达载体(如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或者哺乳动物细胞系统(如COS、CHO、BHK、293、 NS0和3T3细胞)，其携带含有衍生自哺乳动物细胞基因组(如金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒(如腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的启动子的重组表达构建体。在某些实施方案中，利用细菌细胞如大肠杆菌，或真核细胞来表达作为重组抗体或融合蛋白分子的 Fc变体。例如，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)与载体如来自人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件的组合，是抗体的有效表达系统(Foecking等人，1986，Gene 45:101；和Cockett等人，1990， Bio/Technology 8:2)。在一个特定实施方案中，编码本发明的Fc变体 (如抗体或融合蛋白)的核苷酸序列的表达受到组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子的调节。
在细菌系统中，可以根据所表达Fc变体(如抗体或融合蛋白)的所需用途有利地选择许多表达载体。例如，当待产生大量这类蛋白质而用于产生Fc变体药物组合物时，可能需要指导表达容易纯化的高水平融合蛋白产物的载体。这类载体包括但不限于，大肠杆菌表达载体 pUR278(Ruther等人，1983，EMBO 12:1791)，其中Fc变体编码序列可以单独连接到载体中，其与lac Z编码区同框，以便产生lac Z-融合蛋白；pIN载体(Inouye和Inouye，1985，Nucleic Acids Res. 13:3101-3109；Van Heeke和Schuster，1989，J.Biol.Chem.24:5503-5509)；等等。也可以采用pGEX载体表达外来多肽与谷胱甘肽5-转移酶(GST)的融合蛋白。这种融合蛋白一般是可溶性的，通过与基质谷胱甘肽-琼脂糖珠吸附和结合然后在游离谷胱甘肽存在下洗脱而容易地从裂解的细胞中纯化。设计pGEX载体以包括凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，以便可以由GST部分释放克隆的靶基因产物。
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多面体病病毒(AcNPV)用作表达外来基因的载体。该病毒在草地贪夜蛾 (Spodoptera frugiperda)细胞中生长。可将Fc变体(如抗体或融合蛋白) 编码序列单独克隆到病毒的非必需区(如多角体蛋白基因)中，并置于 AcNPV启动子(如多角体蛋白启动子)的控制下。
在哺乳动物宿主细胞中，可以利用许多基于病毒的表达系统。在腺病毒用作表达载体的情况下，可以将感兴趣的Fc变体(如抗体或融合蛋白)编码序列连接于腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联前导序列。然后，可以通过体外或体内重组将该嵌合基因插入腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非必需区(如E1或E3区)将产生活的且能够在感染宿主中表达Fc变体(如抗体或融合蛋白)的重组病毒(参见例如Logan和Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:355-359)。插入的抗体编码序列的有效翻译也可能需要特定的起始信号。这些信号包括ATG启动密码子和相邻序列。另外，该启动密码子必须与所需编码序列的阅读框同相，以保证完整插入物的翻译。这些外源性翻译控制信号和启动密码子可以来自各种来源，包括天然的和合成的。可以通过包括合适的转录增强子元件、转录终止子等提高表达效率(参见例如Bittner等人，1987，Methods in Enzymol. 153:516-544)。
可以通过本领域已知的任何启动子或增强子元件控制Fc变体(如抗体或融合蛋白)的表达。可以用于控制编码Fc变体(如抗体或融合蛋白)的基因表达的启动子包括但不限于：SV40早期启动子区(Bernoist 和Chambon，1981，Nature 290:304-310)、劳氏肉瘤病毒3’长末端重复中含有的启动子(Yamamoto等人，1980，Cell 22:787-797)、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 78:1441-1445)、金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster等人，1982， Nature 296:39-42)、四环素(Tet)启动子(Gossen等人，1995，Proc.Nat. Acad.Sci.USA 89:5547-5551)；原核表达载体如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 75:3727-3731)，或tac启动子(DeBoer等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.80:21-25；也参见“Useful proteinsfrom recombinant bacteria”，刊于Scientific American，1980，242:74-94)；含有胭脂碱合成酶启动子区的植物表达载体(Herrera-Estrella等人，Nature 303:209-213)或花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(Gardner等人，1981，Nucl.Acids Res. 9:2871)和光合作用酶二磷酸核酮糖羧化酶的启动子(Herrera-Estrella 等人，1984，Nature 310：115-120)；来自酵母或其他真菌的启动子元件如Gal 4启动子、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子和以下动物转录控制区，它们表现出组织特异性并被用于转基因动物：在胰腺腺细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等人，1984，Cell 38:639-646；Ornitz等人，1986，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50:399-409；MacDonald，1987， Hepatology 7:425-515)；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan，1985，Nature 315:115-122)，在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等人，1984，Cell 38:647-658；Adames 等人，1985，Nature 318:533-538；Alexander等人，1987，Mol.Cell.Biol. 7:1436-1444)，在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区(Leder等人，1986，Cell 45:485-495)，在肝中有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert等人，1987，Genes and Devel.1:268-276)，在肝中有活性的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf等人，1985，Mol.Cell. Biol.5:1639-1648；Hammer等人，1987，Science 235:53-58；在肝中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等人，1987，Genesand Devel.1:161-171)，在骨髓细胞中有活性的β-珠蛋白基因控制区 (Mogram等人，1985，Nature 315:338-340；Kollias等人，1986，Cell 46:89-94；在脑的少突胶质细胞中有活性的髓磷脂碱性蛋白基因控制区(Readhead等人，1987，Cell 48:703-712)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Sani，1985，Nature 314:283-286)；在神经元细胞中有活性的神经元特异性烯醇酶(NSE)(Morelli等人，1999， Gen.Virol.80:571-83)；在神经元细胞中有活性的脑源性神经营养因子 (BDNF)基因控制区(Tabuchi等人，1998，Biochem.Biophysic.Res.Com. 253:818-823)；在星形细胞中有活性的胶质细胞原纤维酸性蛋白 (GFAP)启动子(Gomes等人，1999，Braz J Med Biol Res 32(5):619-631； Morelli等人，1999，Gen.Virol.80:571-83)和在下丘脑中有活性的促性腺释放激素基因控制区(Mason等人，1986，Science 234:1372-1378)。
可以通过三种通用方法鉴定含有编码本发明Fc变体(如抗体或融合蛋白)的基因插入物的表达载体：(a)核酸杂交，(b)是否存在“标记”基因功能，和(c)插入序列的表达。在第一种方法中，可以通过核酸杂交利用含有分别与编码肽、多肽、蛋白质或融合蛋白的插入基因同源的序列的探针，来检测表达载体中是否存在编码肽、多肽、蛋白质或融合蛋白的基因。在第二种方法中，可以根据是否存在因载体中插入编码抗体或融合蛋白的核苷酸序列所致的某些“标记”基因功能(如胸苷激酶活性、抗生素抗性、转化表型、杆状病毒中形成包涵体等)，来鉴定和选择重组载体/宿主系统。例如，如果编码Fc变体(如抗体或融合蛋白)的核苷酸序列被插入载体的标记基因序列中，那么可以通过不存在标记基因功能来鉴定含有编码抗体或融合蛋白插入物的基因的重组体。在第三种方法中，可以通过测定该重组体表达的基因产物(如抗体或融合蛋白)来鉴定重组表达载体。这类测定可以基于(例如) 该融合蛋白在体外测定系统(如与抗-生物活性分子抗体的结合)中的物理或功能特性。
此外，可以选择以期望的特定形式调节插入序列表达或修饰并加工基因产物的宿主细胞品系。可以在某些诱导物的存在下提高某些启动子引起的表达；因此，可以控制遗传工程改造的融合蛋白的表达。而且，不同宿主细胞的翻译和翻译后加工和修饰具有特征性和特定的机制(如蛋白质的糖基化、磷酸化)。可以选择合适的细胞系或宿主系统，以保证对所表达的外来蛋白进行所需的修饰和加工。例如，在细菌系统中表达将产生无糖基化的产物，在酵母中表达将产生糖基化产物。可以采用包含具有合适地加工基因产物的初始转录物(如糖基化和磷酸化)的细胞机制的真核宿主细胞。这类哺乳动物宿主细胞包括但不限于：CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、 WI38、NS0，具体而言，神经元细胞系，例如SK-N-AS、SK-N-FI、 SK-N-DZ人神经母细胞瘤(Sugimoto等人，1984，J.Natl.Cancer Inst. 73:51-57)、SK-N-SH人神经母细胞瘤(Biochim.Biophys.Acta，1982， 704:450-460)、Daoy人小脑髓母细胞瘤(He等人，1992， Cancer Res.52:1144-1148)DBTRG-05MG胶质母细胞瘤细胞(Kruse等人，1992，In Vitro Cell.Dev.Biol.28A:609-614)、IMR-32人神经母细胞瘤(Cancer Res.，1970，30:2110-2118)、1321N1人星形细胞瘤(Proc. Natl.Acad.Sci.USA，1977，74:4816)、MOG-G-CCM人星形细胞瘤 (Br.J.Cancer，1984，49：269)、U87MG人胶质母细胞瘤-星形细胞瘤(Acta Pathol.Microbiol.Scand.，1968，74:465-486)、A172人胶质母细胞瘤(Olopade等人，1992，Cancer Res.52:2523-2529)、C6大鼠胶质瘤细胞(Benda等人，1968，Science 161:370-371)、Neuro-2a小鼠神经母细胞瘤(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1970，65:129-136)、NB41A3 小鼠神经母细胞瘤(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1962，48:1184-1190)、 SCP绵羊脉络丛(Bolin等人，1994，J.Virol.Methods 48:211-221)、 G355-5，PG-4猫正常星形细胞(Haapala等人，1985，J.Virol. 53:827-833)、Mpf白鼬脑(Trowbridge等人，1982，In Vitro 18:952-960) 和正常细胞系，例如，CTX TNA2大鼠正常脑皮层(Radany等人，1992， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6467-6471)，如CRL7030和Hs578Bst。另外，不同载体/宿主表达系统可以不同程度地影响加工反应。
为了长期、高产率地生产重组蛋白，常常优选稳定的表达。例如，可以工程改造稳定表达本发明的Fc变体(如抗体或融合蛋白)的细胞系。与其使用含有病毒复制起点的表达载体，不如用合适表达控制元件(如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和选择性标记来转化宿主细胞。引入外来DNA后，使工程改造细胞在富营养培养基中生长1-2天，然后换到选择性培养基中。重组质粒中的选择性标记对选择赋予抗性，使得细胞能够将该质粒稳定整合到其染色体中，生长形成细胞灶，进而可克隆并扩增成细胞系。这种方法可以有利地用于工程改造表达特异性结合抗原的Fc变体的细胞系。这类工程改造的细胞系在筛选和评估影响特异性结合抗原的 Fc变体(如多肽或融合蛋白)活性的化合物中特别有用。
可以采用许多选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶 (Wigler等人，1977，Cell 11:223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska和Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:2026) 和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等人，1980，Cell22:817)基因，它们分别可用于tk-细胞、hgprt-细胞或aprt-细胞。另外，抗代谢物抗性可用作选择dhfr、gpt、neo和hygro基因的基础，dhfr赋予甲氨蝶呤抗性(Wigler等人，1980，Natl.Acad.Sci.USA 77:3567；O’Hare等人， 1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527)；gpt赋予霉酚酸抗性 (Mulligan和Berg，198l，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072)；neo赋予氨基糖苷G-418抗性(Colberre-Garapin等人，1981，J.Mol.Biol. 150:1)；hygro赋予潮霉素抗性(Santerre等人，1984，Gene 30:147)。
一旦通过重组表达产生Fc变体(如抗体或融合蛋白)后，可通过本领域已知的任何蛋白质纯化方法进行纯化，例如层析(如离子交换层析、亲和力层析、特别是使用蛋白A后对特定抗原的亲和力层析，以及大小柱层析)、离心、差异溶解度或任何其他标准蛋白质纯化技术。
Fc变体一般作为分泌的多肽从培养基中回收，尽管当没有分泌信号直接产生时它也可以从宿主细胞裂解物中回收。如果Fc变体是膜结合的，它可以用合适的去污剂溶液(例如，Triton-X 100)从膜中释放。
当Fc变体在除一种人来源以外的重组细胞中产生时，它完全不含人来源的蛋白或多肽。然而，有必要从重组细胞蛋白或多肽纯化 Fc变体，以获得对于Fc变体基本上同质的制剂。作为第一个步骤，通常将培养基或裂解物离心以除去颗粒细胞碎片。
可以通过羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析、或亲和层析(亲和层析是优选的纯化技术)方便地纯化具有抗体恒定区的Fc异源二聚体。根据待回收的多肽，也可使用其他蛋白纯化技术诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上的层析、肝素琼脂糖上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。蛋白A作为亲和配体的适用性取决于使用的免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化免疫球蛋白Fc区，其基于人γ1、γ2、或γ4重链(Lindmark等人，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。推荐G蛋白用于所有小鼠亚型和用于人γ3(Guss等人，EMBO J.5:15671575(1986))。亲和配体所结合的基质最常用的是琼脂糖，但是可使用其他基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能获得比琼脂糖更快的流速和更短的处理时间。用于将免疫粘附分子与蛋白A或G亲和柱结合的条件完全取决于Fc结构域的特征；即其种类和同种型。通常，当选择适当配体时，从无条件的培养液直接发生有效结合。可以在酸性 pH(3.0或3.0以上)，或在含有温和离液序列高的盐的中性pH缓冲液中有效地洗脱结合的变体Fc异源二聚体。这种亲和层析步骤可以导致>95％纯的变体Fc异源二聚体制剂。
可通过载体扩增提高Fc变体(如抗体或融合蛋白)的表达水平(综述参见Bebbington和Hentschel，The use of vectors based on gene amplification for theexpression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，第3卷(AcademicPress,New York, 1987))。例如，当表达抗体或融合蛋白的载体系统中的标记扩增时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平提高将提高标记基因的拷贝数。由于扩增区域与抗体基因相连，所以也将提高抗体或融合蛋白的产量 (Crouse等人，1983，Mol.Cell.Biol.3:257)。
可利用两种本发明表达载体共转染宿主细胞。例如，第一种载体编码重链衍生的多肽，第二种载体编码轻链衍生的多肽。这两种载体可含有相同的选择性标记，使得能够等同地表达重链和轻链多肽。或者可采用编码并能够表达融合蛋白或者重链与轻链多肽的单一载体。融合蛋白或重链与轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。
表征和功能测定
可以以各种方式表征本发明的Fc变体(例如，抗体或融合蛋白)。在一个实施方案中，使用本领域众所周知的技术评估变体Fc异源二聚体的纯度，所述技术包括但不限于SDS-PAGE凝胶、western印迹、密度测定法或质谱法。可以使用一系列技术表征蛋白稳定性，所述技术不限于，大小排阻层析法、UV可见和CD光谱法、质谱法、差示光散射、台式稳定性测定、冻融加上其他表征技术、差示扫描量热法、差示扫描荧光测定法、疏水相互作用层析法、等电聚焦、受体结合测定或相对蛋白表达水平。在一个示例性实施方案中，使用本领域众所周知的技术诸如差示扫描量热法或差示扫描荧光测定法，与野生型 CH3结构域相比，通过变体Fc异源二聚体的熔解温度评估修饰的 CH3结构域的稳定性。
也可以测定本发明的Fc变体的特异性结合配体(例如，FcγRIIIA、 FcγRIIB、C1q)的能力。这样的测定可以在溶液中(例如,Houghten, Bio/Techniques,13:412-421,1992)、珠粒上(Lam,Nature,354:82-84, 1991、芯片上(Fodor,Nature,364:555-556,1993)、细菌上(美国专利号 5,223,409)、质粒上(Cull等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:1865-1869, 1992)、或噬菌体上(Scott和Smith,Science,249:386-390,1990；Devlin,Science,249:404-406,1990；Cwirla等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 87:6378-6382,1990；和Felici,J.Mol.Biol.,222:301-310,1991)进行。然后可以测定已经鉴定特异性结合配体(例如，FcγRIIIA、FcγRIIB、 C1q或抗原)的分子的对于配体的亲和力。
可以通过本领域已知的任何方法测定本发明的Fc变体与分子如抗原(例如，癌抗原和与其他抗原的交叉反应性)或配体(例如，FcγR) 的特异性结合。可用于分析特异性结合和交叉反应性的免疫测定包括但不限于使用下列技术的竞争性和非竞争性测定系统：如western印迹、放射性免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体-固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白A 免疫测定、仅举几个实例。这些测定是常规的和本领域众所周知的(参见例如，Ausubel等人编辑，1994，Current Protocols in Molecular Biology，第1版，John Wiley&Sons,Inc.,New York)。
可以通过竞争性结合测定来确定本发明的Fc变体与分子，如抗原或配体(例如FcγR)的结合亲和力和相互作用的解离速率。竞争性结合测定的一个实例是放射免疫测定法，其包括在渐增量的未标记配体如FcγR存在的情况下将标记的配体如FcγR(例如3H或125I)与感兴趣的分子(例如，本发明的Fc变体)孵育，且检测与标记的配体结合的分子。可以通过scatchard分析从饱和数据确定本发明的分子与配体的亲和力和结合解离速率。
也可以使用本领域已知的任何基于表面等离子共振(SPR)的测定 (例如，BIAcore动力学分析)来确定Fc变体的动力学参数。基于SPR 技术的综述参见Mullet等人，2000，Methods 22：77-91；Dong等人，2002,Review in Mol.Biotech.,82：303-23；Fivash等人，1998,Current Opinion in Biotechnology 9：97-101；Rich等人，2000,Current Opinionin Biotechnology 11：54-61。此外，在美国专利号6,373,577；6,289,286； 5,322,798；5,341,215；6,268,125中描述用于测量蛋白-蛋白相互作用的任何SPR仪器和基于SPR的方法涵盖在本发明的方法中。
使用本领域技术人员已知的任何技术的荧光活化的细胞分选(FACS)，可以用于表征Fc变体与细胞表面上表达的分子(例如， FcγRIIIA,FcγRIIB)的结合。流式分选仪能够快速地检查大量的含有文库插入物的单独的细胞(例如，10,000,000-100,000,000个细胞/每小时)(Shapiro等人，Practical Flow,Cytometry,1995)。用于分选和检查生物细胞的流式细胞仪是本领域众所周知的。例如，在美国专利号 4,347,935、5,464,581、5,483,469、5,602,039、5,643,796和6,211,477 中描述了已知的流式细胞仪。其他已知的流式细胞仪是Becton Dickinson and Company制造的FACS VantageTM系统，和Union Biometrica制造的COPASTM系统。
可以通过本发明的Fc变体介导FcγR介导的效应细胞功能来表征本发明的Fc变体。可以测定的效应细胞功能的实例包括但不限于，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、调理作用、调理吞噬作用(opsonophagocytosis)、C1q结合以及补体依赖性细胞介导的细胞毒性(CDC)。可以使用本领域技术人员已知用于确定效应细胞功能活性的任何基于细胞的或无细胞的测定(对于效应细胞测定，参见Perussia等人，2000，MethodsMol.Biol.121：179-92；Baggiolini 等人，1998Experientia,44(10)：841-8；Lehmann等人，2000J.Immunol. Methods,243(1-2)：229-42；Brown E J.1994,Methods Cell Biol.,45：147-64；Munn等人，1990J.Exp.Med.,172：231-237,Abdul-Majid等人，2002Scand.J.Immunol.55：70-81；Ding等人，1998,Immunity 8:403-411)。
具体而言，可以使用本领域技术人员已知的任何标准方法，在效应细胞(如天然杀伤细胞)中测定本发明的Fc变体的FcγR介导的 ADCC活性(参见例如，Perussia等人，2000，Methods Mol.Biol.121： 179-92)。确定本发明的分子的ADCC活性的示例性测定基于51Cr释放测定，包括：用[51Cr]Na2CrO4(这种细胞膜可透过的分子一般被用于标记，因为它结合胞浆蛋白，虽然以缓慢动力学从细胞自发释放，但是在靶细胞坏死之后大量地释放)标记靶细胞；用本发明的Fc变体调理靶细胞；在微量滴定板上以合适的靶细胞对效应细胞比例来组合调理的放射性标记的靶细胞和效应细胞；在37℃培养细胞的混合物 16-18小时；收集上清液；并分析放射性。随后可以确定本发明的分子的细胞毒性，例如，使用以下公式：裂解％＝(实验的cpm-靶渗漏cpm)/(去污剂裂解cpm-靶渗漏cpm)xl00％。可替代的，裂解％＝(ADCC-AICC)/(最大释放-自发释放)。特异性裂解可以使用以下公式计算：特异性裂解＝本发明的分子的裂解％-不存在本发明分子时的裂解％。通过改变靶细胞：效应细胞比例或抗体浓度，可以产生图表。
表征Fc变体结合C1q和介导补体依赖的细胞毒性(CDC)的能力的方法是本领域中众所周知的。例如，为了确定C1q结合，可以进行 C1q结合ELISA。示例性的测定可以包含以下：在包被缓冲液中用多肽变体或起始多肽(对照)在4C过夜包被测定板。然后可以洗涤和封闭平板。在洗涤之后，将人C1q的等分试样添加到每个孔，在室温下孵育2小时。进一步的洗涤之后，可以将100uL绵羊抗补体C1q过氧化物酶缀合的抗体添加到每个孔，在室温下孵育1小时。可以再次用洗涤缓冲液洗涤平板，将含有OPD(O-苯二胺二氢氯化物(Sigma)) 的100uL底物缓冲液添加到每个孔中。可以容许通过黄色的出现观察到的氧化反应进行30分钟，并且通过添加100ul 4.5NH2SO4来停止。然后可以在(492-405)nm读取吸光度。
为了评估补体活化，可以进行补体依赖性细胞毒性(CDC)测定(例如Gazzano-Santoro等人，1996，J.Immunol.Methods 202:163中所描述)。简而言之，可以用缓冲液稀释各种浓度的Fc变体和人补体。表达Fc变体所结合的抗原的细胞可以被稀释到约1×106细胞/ml的密度。Fc变体、稀释的人补体和表达抗原的细胞的混合物可以添加到平底组织培养96孔平板上，容许在37C、5％CO2下孵育2小时以促进补体介导的细胞裂解。然后可以向每个孔添加50uL的阿尔玛蓝 (Accumed International)，并在37C孵育过夜。用530nm的激发和590nm的发射，使用96孔荧光计测量吸光度。结果可以相对荧光单位(RFU)表示。可以从标准曲线计算样品浓度，对于感兴趣的Fc变体报告相对于可比较分子(即，包含具有未修饰或野生型CH3结构域的 Fc区的分子)的百分比活性。
可以用豚鼠、兔或人血清进行补体测定。可以通过监测细胞内的酶诸如乳酸脱氢酶(LDH)来检测靶细胞的补体裂解，如描述于 Korzeniewski等人，1983,Immunol.Methods64(3)：313-20；和Decker 等人，1988,J.Immunol Methods 115(1)：61-9；或其中靶细胞标记的细胞内标记如铕、铬51或铟111的释放。
方法
本发明包括将一种或多种本发明的Fc变体(如抗体)施用于动物，特别是哺乳动物，特别是人，以预防、治疗或改善与疾病、病症或感染相关的一种或多种症状。本发明的Fc变体尤其可用于治疗或预防需要改变效应细胞功能功效(如ADCC、CDC)的疾病或病症。Fc变体及其组合物特别可用于治疗或预防原发性或转移性肿瘤疾病(即癌症) 和感染性疾病。本发明的分子可以提供于本领域已知的或如本文所述的药学可接受的组合物中。如下所详述，本发明分子可用于治疗或预防癌症(特别是被动免疫治疗)、自身免疫病、炎性病症或感染性疾病的方法中。
本发明Fc变体也可以有利地与本领域已知的其他治疗剂联用，以治疗或预防癌症、自身免疫病、炎性病症或感染性疾病。在一个特定实施方案中，本发明Fc变体可以与单克隆或嵌合抗体、淋巴因子或造血生长因子(如IL-2、IL-3和IL-7)联用，以提高与该分子相互作用的效应细胞的数量或活性并提高免疫应答。本发明Fc变体也可以有利地与治疗疾病、病症或感染的一种或多种药物联用，这些药物包括例如抗癌药、抗炎药或抗病毒药。
相应地，本发明提供了用于通过施用本发明的一种或多种Fc变体而预防、治疗或改善与癌症和相关状况相关的一种或多种症状的方法。尽管不期望被任何作用机制所束缚，本发明的Fc变体(其以高于可比较分子的亲和力结合FcγRIIIA和/或FcγRIIA，且进一步以低于可比较分子的亲和力结合FcγRIIB，和/或所述Fc变体具有增强的效应功能，例如，ADCC、CDC、吞噬作用、调理作用等)将导致癌细胞的选择性靶向和有效破坏。
本发明还包括将本发明一种或多种Fc变体与本领域技术人员已知的其他疗法联合施用，以治疗或预防癌症，这些疗法包括但不限于：目前标准和实验性的化疗、激素治疗、生物治疗、免疫治疗、放疗或手术。在一些实施方案中，本发明分子可与治疗或预防有效量的一种或多种抗癌药、治疗性抗体或本领域技术人员已知用于治疗和/或预防癌症的其他药物联合施用。可以与本发明Fc变体联用的给药方案和治疗的实例是本领域众所周知的，详见其他文献(参见例如，PCT 公开WO 02/070007和WO 03/075957)。
可用本发明方法和组合物治疗或预防的癌症和相关病症包括但不限于：白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨和结缔组织肉瘤、脑瘤、乳腺癌、肾上腺癌、甲状腺癌、胰腺癌、垂体癌、眼癌、阴道癌、外阴癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、食道癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、肺癌、睾丸癌、前列腺癌、阴茎癌；口腔癌、唾液腺癌、咽喉癌、皮肤癌、肾癌、膀胱癌(这些病症的综述参见 Fishman等人，1985，Medicine，第2版，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia 和Murphy等人，1997，Informed Decisions：The Complete Book of CancerDiagnosis,Treatment,and Recovery，Viking Penguin， Penguin Books U.S.A.，Inc.，United States of America)。
本发明进一步考虑了工程改造本领域已知的任何抗体而用于治疗和/或预防癌症和相关病症，使得该抗体包含并入本发明的修饰的 CH3结构域的Fc区。
在一个特定实施方案中，与不存在本发明所述分子时原发性肿瘤的生长或转移相比，本发明分子(如含有变体Fc异源二聚体)将原发性肿瘤的生长或癌细胞的转移抑制或降低至少99％、至少95％、至少 90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、至少50％、至少45％、至少40％、至少45％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％或至少10％。
本发明包括一种或多种本发明Fc变体用于预防、治疗或控制受试者中与炎性病症相关的一种或多种症状的用途。尽管不期望受任何作用机制所束缚，但是对于FcγRIIB具有增强亲和力的Fc变体将导致活化受体的抑制和因此免疫应答的抑制，且对于治疗和/或预防自身免疫性病症具有治疗效力。此外，结合多于一个与炎症病症相关的目标的抗体，如包含变体Fc异源二聚体的双特异性抗体，可以提供相对于单价治疗的增效剂效果。
本发明还包括将本发明Fc变体与治疗或预防有效量的一种或多种抗炎药联合施用。本发明也提供预防、治疗或控制与自身免疫病有关的一种或多种症状的方法，还包括将本发明Fc变体与治疗或预防有效量的一种或多种免疫调节剂联合施用于所述受试者。可通过施用本发明Fc变体治疗的自身免疫病的实例包括但不限于：斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森病、肾上腺的自身免疫性贫血、自身免疫性溶血性、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎和睾丸炎、自身免疫性血小板减少、贝切特病、大泡性类天疱疮、心肌病、脂肪便症-皮炎、慢性疲劳免疫机能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多神经病、丘-施综合征、疤痕性类天疱疮、CREST综合征、冷凝集素病、克罗恩氏病、盘状狼疮、特发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、格-巴综合征(Guillain-Barre)、桥本甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA神经病、青少年关节炎、扁平苔藓、红斑狼疮、梅尼尔病、混合型结缔组织病、多发性硬化、1型或免疫介导的糖尿病、重症肌无力、寻常天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多发性软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、雷诺现象(Raynauld′s phenomenon)、莱特尔综合征、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、斯耶格伦综合征、全身肌强直综合征、系统性红斑狼疮、红斑狼疮、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎如疱疹样皮炎血管炎、白癫风和韦格纳肉芽肿病。炎性病症的实例包括但不限于：哮喘、脑炎、炎性肠病、慢性阻塞性肺病(COPD)、变应性病症、感染性休克、肺纤维化、未分化脊椎关节病、未分化关节病、关节炎、炎性骨质溶解和慢性病毒或细菌感染所致的慢性炎症。一些自身免疫性病症与炎性疾病有关，因此，所认为的自身免疫性病症和炎性病症有重叠。因此，一些自身免疫性病症可被表征为炎性病症。可按照本发明方法预防、治疗或控制的炎性病症的实例包括但不限于：哮喘、脑炎、炎性肠病、慢性阻塞性肺病(COPD)、变应性病症、感染性休克、肺纤维化、未分化脊椎关节病、未分化关节病、关节炎、炎性骨质溶解和慢性病毒或细菌感染所致的慢性炎症。
也可以利用本发明Fc变体减轻患有炎性病症的动物，特别是哺乳动物的炎症。在一个特定实施方案中，与未施用所述分子的动物的炎症相比，本发明Fc能将动物的炎症减轻至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、至少50％、至少45％、至少40％、至少45％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％或至少10％。
本发明进一步考虑了工程改造本领域已知的任何抗体而用于治疗和/或预防自身免疫性疾病或炎性病症，使得该抗体包含本发明的变体Fc异源二聚体。
本发明也包括治疗或预防受试者的感染性疾病的方法，所述方法包括施用治疗或预防有效量的本发明一种或多种Fc变体。可用本发明Fc变体治疗或预防的感染性疾病是包括但不限于病毒、细菌、真菌、原生动物和病毒等感染物引起的。
可用本发明Fc变体与本发明方法一起治疗或预防的病毒性疾病包括但不限于以下所致的疾病：甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、水痘病毒、腺病毒、I型单纯疱疹病毒(HSV-I)、 II型单纯疱疹病毒(HSV-II)、牛疫病毒、鼻病毒、艾柯病毒、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、乳头瘤病毒、乳多空病毒、巨细胞病毒、棘状病毒、虫媒病毒、汉他病毒(hunta virus)、柯萨奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒、天花病毒、EB病毒、I型人体免疫缺陷病毒病毒(HIV-I)、II型人体免疫缺陷病毒病毒(HIV-II)以及病毒性疾病如病毒性脑膜炎、脑炎、登革热或天花的病原体。
可用本发明Fc变体和本发明方法一起治疗或预防的细菌所致的细菌性疾病包括但不限于：分枝杆菌立克次体病、支原体病、奈瑟菌病、肺炎链球菌(S.pneumonia)病、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi) 病(莱姆病)、炭疽杆菌(Bacillus antracis)病(炭疽)、破伤风、链球菌病、葡萄球菌病、分支杆菌病、破伤风、百日咳、霍乱、鼠疫、白喉、衣原体病、金黄色葡萄球菌(S.aureus)病和军团菌病。可用本发明分子和本发明方法一起治疗或预防的原生动物所致的原生动物病包括但不限于：利什曼原虫病、克氏原虫病(kokzidioa)、锥虫病或疟疾。可用本发明分子和本发明方法一起治疗或预防的寄生虫所致的寄生虫疾病包括但不限于：衣原体病和立克次体病。
在一些实施方案中，本发明Fc变体可与治疗或预防有效量的一种或多种本领域技术人员已知用于治疗和/或预防感染性疾病的其他治疗剂联合施用。本发明考虑将本发明分子与本领域技术人员已知用于治疗和/或预防感染性疾病的其他分子联用，所述其他分子包括但不限于抗生素、抗真菌剂和抗病毒剂。
本发明提供了方法和药物组合物，所述组合物包含本发明的Fc 变体(例如抗体、多肽)。本发明还提供了通过将有效量的至少一种本发明的Fc变体，或包含至少一种本发明的Fc变体的药物组合物施用于受试者而治疗、预防和改善一种或多种与疾病、病症或感染相关的症状的方法。一方面，该Fc变体是基本纯化的(即基本不含限制其作用或产生不良副作用的物质，这包括同源二聚体和其他细胞材料)。在一个特定实施方案中，受试者是动物，如哺乳动物，包括非灵长动物(如牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)和灵长动物(例如猴，如猕猴和人)。在一个特定实施方案中，受试者是人。在又另一个特定实施方案中，本发明抗体是来自与受试者相同的物种。
组合物的施用途径取决于所治疗的疾病。例如，静脉内注射可优选用于治疗全身性病症，如淋巴癌或已经转移的肿瘤。技术人员无需过多实验，结合标准的剂量反应研究，即可确定该组合物的施用剂量。在作出那些确定中考虑的相关环境因素包括所治疗的疾病，所施用组合物的选择，患者个体的年龄、体重和反应，以及患者症状的严重性。根据状况，可通过口服、肠胃外、鼻内、阴道、直肠、舌、舌下、含服、颊内和/或透皮途径将该组合物施用于患者。
因此，无需过多实验，可以通过本领域众所周知方式将组合物设计成口服、舌、舌下、含服或颊内施用的形式，例如用惰性稀释剂或用可食用载体。该组合物可以包封在明胶胶囊中，或者压成片剂。出于口服治疗性施用的目的，本发明的药物组合物可掺入赋形剂，以片剂、含片、胶囊剂、酏剂、悬浮剂、糖浆剂、薄片、咀嚼剂等形式使用。
片剂、丸剂、胶囊剂、含片等也可含有粘合剂、接受剂(recipient)、崩解剂、润滑剂、甜味剂和/或调味剂。粘合剂的一些实例包括微晶纤维素、黄蓍胶和明胶。赋形剂的实例包括淀粉和乳糖。崩解剂的一些实例包括海藻酸、玉米淀粉等。润滑剂的实例包括硬脂酸镁和硬脂酸钾。助流剂的实例是胶体二氧化硅。甜味剂的一些实例包括蔗糖、糖精等。调味剂的实例包括薄荷、水杨酸甲酯、橙调味剂等。用于制备这些各种组合物的材料应该是药物纯的，且在所用含量下无毒的。
可以通过肠胃外途径，如静脉内、肌肉内、鞘内和/或皮下注射施用本发明的药物组合物。可以通过将本发明组合物掺入溶液或悬浮液中进行肠胃外施用。这类溶液或悬浮液还可包含无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇和/或其他合成溶剂。肠胃外制剂还可包含抗菌剂如苄醇和/或对羟基苯甲酸甲酯，解毒剂如抗坏血酸和/或亚硫酸氢钠，以及螯合剂如EDTA。也可添加缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐，以及涨度调节剂，如氯化钠和右旋糖。肠胃外制剂可封装在安瓿、一次性注射器和/或玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。直肠施用包括将该组合物施用于直肠和/或大肠。可使用栓剂和/或灌肠剂来实现这种施用。可用本领域已知方法制备栓剂。透皮施用包括通过皮肤经皮吸收该组合物。透皮制剂包括贴剂、油膏剂、乳膏剂、凝胶剂、软膏剂等。本发明组合物可经鼻施用于患者。如本文所使用，经鼻施用或鼻施用包括将该组合物施用于患者鼻孔和/或鼻腔的粘膜。
可以根据本发明的方法使用本发明的药物组合物而用于预防、治疗或改善一种或多种与疾病、病症或感染相关的症状。可以考虑，本发明的药物组合物是无菌的，且是用于施用于受试者的合适形式。
在一个实施方案中，本发明组合物是基本不含内毒素和/或相关热原物质的无热原制剂。内毒素包括限定在微生物内并且在微生物破坏或死亡时释放的毒素。热原物质也包括来自细菌和其他微生物外膜的诱导发热的热稳定性物质(糖蛋白)。如果施用于人，这些物质都可以引起发热、低血压和休克。由于潜在的有害作用，从静脉内施用的药物溶液中除去即使很少量的内毒素，也是有利的。食品药品管理局 (＂FDA＂)已经规定，在静脉内施用应用中，每小时上限是5内毒素单位(EU)/剂量/千克体重(The United StatesPharmacopeial Convention， Pharmacopeial Forum 26(1):223(2000))。当治疗性蛋白质施用量为几百或几千毫克/千克体重时，正如单克隆抗体的情况，除去甚至痕量的内毒素也是有利的。在特定的实施方案中，该组合物中的内毒素和热原水平小于10EU/mg，或小于5EU/mg，或小于1EU/mg，或小于 0.1EU/mg，或小于0.01EU/mg，或小于0.001EU/mg。
本发明提供预防、治疗或改善与疾病、病症或感染有关的一种或多种症状的方法，所述方法包括：(a)将一个剂量的预防或治疗有效量的含有一种或多种Fc变体的组合物施用于需要其的受试者，和(b)随后施用一个或多个剂量的所述Fc变体，以将Fc变体的血浆浓度维持在所需水平(如约0.1-100μg/ml)，它连续结合抗原。在一个特定实施方案中，将Fc变体的血浆浓度维持在10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、 25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml或50μg/ml。在一个特定实施方案中，所述待施用Fc变体的有效量为每剂量至少 1mg/kg至8mg/kg。在另一个特定实施方案中，所述待施用Fc变体的有效量为每剂量至少4mg/kg至5mg/kg。在又另一个特定实施方案中，所述待施用Fc变体的有效量为每剂量50mg至250mg。在仍另一个特定实施方案中，所述待施用Fc变体的有效量为每剂量100mg至 200mg。
本发明也包括预防、治疗或改善与疾病、病症或感染有关的一种或多种症状的方案，其中将Fc变体与Fc变体和/或变体融合蛋白以外的治疗(如预防或治疗剂)联用。本发明部分基于下列认识：本发明Fc变体能加强其他癌症治疗(包括现有的标准治疗和实验性化疗)的作用、与其协同作用、提高其有效性、提高其耐受性和/或降低其副作用。本发明联合疗法具有累加效力、累加治疗作用或协同作用。本发明联合疗法使得能够与Fc变体联合采用低剂量治疗(如预防或治疗剂)来预防、治疗或改善与疾病、病症或感染有关的一种或多种症状，和/或以较低频率将这类预防或治疗剂施用于患有疾病、病症或感染的受试者，以提高所述受试者的生活质量和/或实现预防或治疗作用。另外，本发明的联合疗法降低或避免与施用现有单一药物治疗和/或现有联合治疗有关的不良或有害的副作用，进而提高患者对该治疗方案的顺应性。可与本发明Fc变体联用的许多分子是本领域众所周知的。参见例如，PCT公开WO 02/070007、WO 03/075957和美国专利公开2005/064514。
本发明提供了试剂盒，所述试剂盒在一个或多个容器中包含一种或多种Fc变体，所述Fc变体具有改变的与FcγR和/或C1q的结合亲和力和改变的特异性结合抗原的ADCC和/或CDC活性，所述Fc变体与可检测试剂、治疗剂或药物缀合或融合，其用于监测、诊断、预防、治疗或改善一种或多种与疾病、病症、或感染相关的症状。
仅仅出于举例的目的，本发明包括但不限于如下技术方案：
技术方案1.一种分离的异源二聚体Fc构建体，包含修饰的异源二聚的CH3结构域，所述修饰的CH3结构域包含：
与野生型CH3结构域多肽相比包含至少三个氨基酸修饰的第一修饰的CH3结构域多肽，和与野生型CH3结构域多肽相比包含至少三个氨基酸修饰的第二修饰的CH3结构域多肽；
其中所述第一和第二CH3结构域多肽中的至少一个包含K392J 的氨基酸修饰，其中J选自L、I或侧链体积基本上不大于K的侧链体积的氨基酸；
其中所述第一和第二修饰的CH3结构域多肽优先形成具有至少约74℃的熔解温度(Tm)和至少95％的纯度的异源二聚的CH3结构域；且
其中至少一个氨基酸修饰不是在所述第一和所述第二CH3结构域多肽之间的接口处的氨基酸的修饰。
技术方案2.根据技术方案1所述的分离的异源二聚体Fc构建体，包含至少一个T350X修饰，其中X是选自缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、及其衍生物或变体的天然或非天然氨基酸。
技术方案3.根据技术方案1所述的分离的异源二聚体Fc构建体，包含至少一个T350V修饰。
技术方案4.根据技术方案1-3中任一项所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述修饰的CH3结构域具有至少约75℃或更高的熔解温度(Tm)。
技术方案5.根据技术方案4所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述修饰的CH3结构域具有约77℃或更高的Tm。
技术方案6.根据技术方案4-5中任一项所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述修饰的CH3结构域具有约80℃或更高的Tm。
技术方案7.根据技术方案1-6中任一项所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中至少一个CH3结构域多肽是包含L351、F405和 Y407中的至少一个的氨基酸修饰的修饰的CH3结构域多肽。
技术方案8.根据技术方案1-7中任一项所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中至少一个CH3结构域多肽是包含T366的氨基酸修饰的修饰的CH3结构域多肽。
技术方案9.根据技术方案1-8中任一项所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述第一CH3结构域多肽是包含在位置L351、 F405和Y407处的氨基酸修饰的修饰的CH3结构域多肽，并且所述第二CH3结构域多肽是包含在位置T366、K392和T394处的氨基酸修饰的修饰的CH3结构域多肽。
技术方案10.根据技术方案9所述的分离的异源二聚体Fc构建体，所述第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰L351Y、F405A和 Y407V，并且所述第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366L、 K392M和T394W。
技术方案11.根据技术方案9所述的分离的异源二聚体Fc构建体，所述第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰L351Y、F405A和 Y407V，并且所述第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366L、 K392L和T394W。
技术方案12.根据技术方案9所述的分离的异源二聚体Fc构建体，所述第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰L351Y、F405A和 Y407V，并且所述第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366I、 K392M和T394W。
技术方案13.根据技术方案9所述的分离的异源二聚体Fc构建体，所述第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰L351Y、F405A和 Y407V，并且所述第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366I、K392L 和T394W。
技术方案14.根据技术方案1-11中任一项所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述第一和第二CH3结构域多肽中的至少一个是包含在位置S400处的氨基酸修饰的修饰的CH3结构域多肽。
技术方案15.根据技术方案12所述的分离的异源二聚体Fc构建体，包含所述修饰S400Z，其中Z选自带正电的氨基酸和带负电的氨基酸。
技术方案16.根据技术方案1-13中任一项所述的分离的异源二聚体Fc构建体，所述第一CH3结构域多肽包含选自S400E和S400R 的氨基酸修饰。
技术方案17.根据技术方案1-11中任一项所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述第一和第二CH3结构域多肽中的至少一个是包含在位置N390处的氨基酸修饰的修饰的CH3结构域多肽。
技术方案18.根据技术方案15所述的分离的异源二聚体Fc构建体，包含所述修饰N390Z，其中Z选自带正电的氨基酸和带负电的氨基酸。
技术方案19.根据技术方案1-16中任一项所述的分离的异源二聚体Fc构建体，所述第二CH3结构域包含所述氨基酸修饰N390R。
技术方案20.根据技术方案1-17中任一项所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述第一CH3结构域多肽是包含所述氨基酸修饰S400E的修饰的CH3结构域多肽并且所述第二CH3结构域多肽是包含所述氨基酸修饰N390R的修饰的CH3结构域多肽。
技术方案21.根据技术方案1-18中任一项所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述第一和第二CH3结构域多肽中的每一个是修饰的CH3结构域多肽，一个所述修饰的CH3结构域多肽包含所述氨基酸修饰Q347R且另一个所述修饰的CH3结构域多肽包含所述氨基酸修饰K360E。
技术方案22.根据技术方案1-4中任一项所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中至少一个CH3结构域多肽是包含K409和T411 中的至少一个的氨基酸修饰的修饰的CH3结构域多肽。
技术方案23.根据技术方案22所述的分离的异源二聚体Fc构建体，包含K409F、T411E和T411D中的至少一个。
技术方案24.根据技术方案1-23中任一项所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中至少一个CH3结构域多肽是包含D399氨基酸修饰的修饰的CH3结构域多肽。
技术方案25.根据技术方案24所述的分离的异源二聚体Fc构建体，包含D399R和D399K中的至少一个。
技术方案26.根据技术方案1-25中任一项所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述第一CH3结构域多肽是包含选自K409F、T411E和T411D的至少一个氨基酸修饰的修饰的CH3结构域多肽，并且所述第二CH3结构域多肽是包含选自Y407A、Y407I、Y407V、 D399R和D399K的至少一个氨基酸修饰的修饰的CH3结构域多肽。
技术方案27.根据技术方案1-26中任一项所述的分离的异源二聚体Fc构建体，包含包含氨基酸修饰T366V、T366I、T366A、T366M 和T366L中的一个的第一修饰的CH3结构域；和包含所述氨基酸修饰L351Y的第二修饰的CH3结构域。
技术方案28.根据技术方案1-27中任一项所述的分离的异源二聚体Fc构建体，包含包含氨基酸修饰K392L或K392E中的一个的第一修饰的CH3结构域；和包含所述氨基酸修饰S400R或S400V中的一个的第二修饰的CH3结构域。
技术方案29.一种分离的异源二聚体Fc构建体，包含包含第一修饰的CH3结构域多肽和第二修饰的CH3结构域多肽的修饰的CH3 结构域，每个修饰的CH3结构域多肽包含至少四个氨基酸突变，
其中所述第一和所述第二修饰的CH3结构域多肽中的至少一个包含选自N390Z和S400Z的突变，其中Z选自带正电的氨基酸和带负电的氨基酸，并且
其中所述第一和第二修饰的CH3结构域多肽优先形成具有至少约70℃的熔解温度(Tm)和至少90％的纯度的异源二聚的CH3结构域，
技术方案30.一种分离的异源二聚体Fc构建体，包含包含第一修饰的CH3结构域多肽和第二修饰的CH3结构域多肽的修饰的CH3 结构域，每个修饰的CH3结构域多肽包含至少三个氨基酸突变，
其中所述第一和所述第二修饰的CH3结构域多肽中的一个包含选自T411E和T411D的突变，且
其中所述第一和第二修饰的CH3结构域多肽优先形成具有至少约70℃的熔解温度(Tm)和至少90％的纯度的异源二聚的CH3结构域。
技术方案31.根据技术方案29-30中任一项所述的分离的异源二聚体，所述第一修饰的CH3结构域多肽包含在位置F405和Y407处的氨基酸修饰并且所述第二修饰的CH3结构域多肽包含在位置T394 处的氨基酸修饰。
技术方案32.根据技术方案31所述的分离的异源二聚体，所述第一修饰的CH3结构域多肽包含在位置L351处的氨基酸修饰。
技术方案33.根据技术方案31所述的分离的异源二聚体，所述第二修饰的CH3结构域多肽包含位置T366和K392中的至少一个的修饰。
技术方案34.根据技术方案29-34中任一项所述的分离的异源二聚体，其中所述修饰的CH3结构域具有至少约75℃的熔解温度(Tm) 并且以至少约95％的纯度形成。
技术方案35.根据技术方案29-34中任一项所述的分离的异源二聚体，至少一个修饰的CH3结构域多肽包含N390R、S400E和S400R 中的至少一个的氨基酸修饰。
技术方案36.根据技术方案29-35中任一项所述的分离的异源二聚体，所述第一和第二修饰的CH3结构域多肽中的一个包含位置347 的氨基酸修饰而另一个修饰的CH3结构域多肽包含在位置360处的氨基酸修饰。
技术方案37.根据技术方案29-36中任一项所述的分离的异源二聚体，所述第一和第二修饰的CH3结构域多肽中的至少一个包含 T350V的氨基酸修饰。
技术方案38.根据技术方案29-37中一项所述的分离的异源二聚体，所述第一修饰的CH3结构域多肽包含选自L351Y、F405A和 Y407V至少一个氨基酸修饰；并且所述第二修饰的CH3结构域多肽包含选自T366L、T366I、K392L、K392M和T394W的至少一个氨基酸修饰。
技术方案39.根据技术方案29-30中任一项所述的分离的异源二聚体，所述第一修饰的CH3结构域多肽包含在位置D399和Y407处的氨基酸修饰，并且第二修饰的CH3结构域多肽包含在位置K409 和T411处的的氨基酸修饰。
技术方案40.根据技术方案39所述的分离的异源二聚体，所述第一CH3结构域多肽包含在位置L351处的氨基酸修饰，并且所述第二修饰的CH3结构域多肽包含在位置T366和K392处的氨基酸修饰。
技术方案41.根据技术方案40所述的分离的异源二聚体，所述第一和第二CH3结构域多肽中的至少一个包含T350V的氨基酸修饰。
技术方案42.根据技术方案39-41中任一项所述的分离的异源二聚体，其中所述修饰的CH3结构域具有至少约75℃或更高的熔解温度(Tm)并且以至少约95％的纯度形成。
技术方案43.根据技术方案39所述的分离的异源二聚体，所述第一修饰的CH3结构域多肽包含选自L351Y、D399R、D399K、 S400D、S400E、S400R、S400K、Y407A和Y407V的氨基酸修饰；并且所述第二修饰的CH3结构域多肽包含选自T366V、T366I、 T366L、T366M、N390D、N390E、K392L、K392I、K392D、K392E、 K409F、K409W、T411D和T411E的氨基酸修饰。
技术方案44.一种分离的异源二聚体Fc构建体，包含修饰的CH3 结构域，所述修饰的CH3结构域包含包含氨基酸修饰L351Y、F405A 和Y407V的第一修饰的CH3结构域多肽；和包含氨基酸修饰T366I、 K392M和T394W的第二修饰的CH3结构域多肽。
技术方案45.一种分离的异源二聚体Fc构建体，包含修饰的CH3 结构域，所述修饰的CH3结构域包含包含氨基酸修饰L351Y、F405A 和Y407V的第一修饰的CH3结构域多肽；和包含氨基酸修饰T366I、 K392L和T394W的第二修饰的CH3结构域多肽。
技术方案46.一种分离的异源二聚体Fc构建体，包含修饰的CH3 结构域，所述修饰的CH3结构域包含包含氨基酸修饰L351Y、F405A 和Y407V的第一修饰的CH3结构域多肽；和包含氨基酸修饰T366L、 K392M和T394W的第二修饰的CH3结构域多肽。
技术方案47.一种分离的异源二聚体Fc构建体，包含修饰的CH3 结构域，所述修饰的CH3结构域包含包含氨基酸修饰L351Y、F405A 和Y407V的第一修饰的CH3结构域多肽；和包含氨基酸修饰T366L、 K392L和T394W的第二修饰的CH3结构域多肽。
技术方案48.根据技术方案1-47中任一项所述的分离的异源二聚体Fc构建体，包含基于G型免疫球蛋白(IgG)的修饰的Fc区。
技术方案49.根据技术方案48所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述IgG是IgG2和IgG3中的一个。
技术方案50.根据技术方案1-47中任一项所述的分离的异源二聚体Fc构建体，包含基于免疫球蛋白M(IgM)的修饰的Fc区。
技术方案51.根据技术方案1-47中任一项所述的分离的异源二聚体Fc构建体，包含基于免疫球蛋白A(IgA)的修饰的Fc区。
技术方案52.根据技术方案1-47中任一项所述的分离的异源二聚体Fc构建体，包含基于免疫球蛋白D(IgD)的修饰的Fc区。
技术方案53.根据技术方案1-47中任一项所述的分离的异源二聚体Fc构建体，包含基于免疫球蛋白E(IgE)的修饰的Fc区。
技术方案54.根据技术方案1-49中任一项所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述异源二聚体是双特异性抗体。
技术方案55.根据技术方案1-49中任一项所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中所述异源二聚体是多特异性抗体。
技术方案56.一种组合物，包含根据技术方案1-55中任一项所述的分离的异源二聚体Fc构建体和药学上可接受的载体。
技术方案57.一种哺乳动物宿主细胞，包含编码根据技术方案 1-55中任一项所述的分离的异源二聚体Fc构建体的核酸。
技术方案58.根据技术方案1-55中任一项所述的分离的异源二聚体Fc构建体，包含至少一种治疗性抗体。
技术方案59.根据技术方案1-55中任一项所述的分离的异源二聚体Fc构建体，其中其中所述异源二聚体包含选自由以下组成的组的至少一种治疗性抗体：阿巴伏单抗、阿达木单抗、阿伦珠单抗、奥罗格雷、巴匹珠单抗、巴利昔单抗、贝利木单抗、贝伐珠单抗、briakinumab、卡那单抗、卡妥索单抗、塞舍珠单抗、西妥昔单抗、达克珠单抗、地舒单抗、依法珠单抗、加利昔单抗、吉妥珠单抗奥佐米星、戈利木单抗、替伊莫单抗、英利昔单抗、伊匹木单抗、鲁昔单抗、美泊利单抗、莫他珠单抗、莫罗单抗、mycograb、那他珠单抗、尼妥珠单抗、奥瑞珠单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、培妥珠单抗、雷珠单抗、瑞利珠单抗、利妥昔单抗、替利珠单抗、托珠单抗/atlizumab、托西莫单抗、曲妥珠单抗、ProxiniumTM、 RencarexTM、优特克单抗和扎芦木单抗。
技术方案60.一种治疗患有由癌抗原表征的癌症的患者中的癌症的方法，所述方法包括向所述患者使用治疗有效量的根据技术方案 1-59中任一项所述的分离的异源二聚体Fc构建体。
技术方案61.一种治疗患有由免疫抗原表征的免疫病症的患者中的免疫病症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的根据技术方案1-59中任一项所述的分离的异源二聚体Fc构建体。
实施例
给出下列实施例用来说明本发明的实施。它们不是用来限制或定义本发明的整个范围。
实施例1：具有异源二聚体Fc结构域的二价单特异性抗体的产生。
使用针对人/哺乳动物表达优化的密码子经由基因合成构建编码抗体重链和轻链的基因。从已知Her2/neu结合Ab生成Fab序列 (Carter P.等人(1992)Humanization of ananti P185 Her2 antibody for human cancer therapy.Proc Natl Acad Sci 89,4285.)且Fc是IgG1同种型(SEQ ID NO:1)。将最终基因产物亚克隆到哺乳动物表达载体pTT5 中(NRC-BRI,Canada)(Durocher,Y.,Perret,S.&Kamen,A.High-level and high-throughputrecombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human HEK293-EBNA1 cells. Nucleic acids research 30,E9(2002))。经由pTT5模板载体的位点定向诱变引入CH3结构域中的突变。对于进行的修饰的CH3结构域突变的列表，参见表1和表6和表7。
为了估计异源二聚体的形成和确定同源二聚体相比于异源二聚体的比例，设计了两条具有不同大小的C-末端延伸的异源二聚体重链(具体地，具有C-末端的His标记的链A和具有C-末端mRFP加 StrepTagII的链B)。该分子量的差异使在非还原性SDS-PAGE中同源二聚体相比于异源二聚体存在差异，如图25A中所示。
用1mg/mL 25kDa聚乙烯亚胺(PEI,Polysciences)以2.5:1的 PEI:DNA比例在指数生长期(1.5至2百万个细胞/mL)转染HEK293 细胞。(Raymond C.等人A simplifiedpolyethylenimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods.55(1):44-51(2011))。为了确定用于形成异源二聚体的最佳浓度范围，以三个不同比例的两条重链转染DNA。例如，以2ml培养体积和转染DNA进行该步骤，所述转染DNA由下列构成：5％GFP、 45％鲑精DNA、25％轻链和25％总重链，其中以10％/65％、20％/55％、 40％/35％的3个不同相对比例(链_A(His)/链_B(mRFP))取样重链A 质粒(具有C末端His标记)和重链B质粒(具有C-末端StrepTagII加 RFP)以65％/55％/35％或10％/20％/40％)(确定WT_His/WT_mRFP异源二聚体的表观1:1表达比例接近于DNA比例20％/55％)。在转染后 4至48小时，在F17无血清培养基(Gibco)中，添加TN1蛋白胨至0.5％的终浓度。通过SDS-PAGE分析表达的抗体，以确定用于形成最佳异源二聚体的重链和轻链的最佳比例(参见图25B和C)。
如上所述选择的DNA比例，例如AZ33和AZ34的50％轻链质粒、25％重链A质粒、25％重链B，与5％GFP以及45％鲑精DNA，用于转染150mL细胞培养物。5-6天后收获转染的细胞，以4000rpm 离心后收集培养液且用0.45μm滤器澄清。对于用于进一步分析生成的具有CH3突变的每种抗体，对于在按比例放大转染测定中使用的轻和重链A和B质粒的百分比列表，包括纯度和熔解温度的测定值，参见下表2。
表2：
实施例2：具有异源二聚体Fc结构域的二价单特异性抗体的纯化。
将澄清的培养液上样到MabSelect SuRe(GE Healthcare)蛋白A柱上，且用10倍柱体积的PBS缓冲液pH 7.2进行洗涤。用10倍柱体积的柠檬酸盐缓冲液pH 3.6洗脱抗体，合并的级分含有用pH 11的 TRIS中和的抗体。最后使用Econo-Pac 10DG柱(Bio-Rad)将蛋白脱盐。通过在25℃在PBS中以1:10,000的比例将抗体与肠激酶(NEB)孵育过夜而去除在重链B上的C末端mRFP标记。通过凝胶过滤从混合物纯化抗体。对于凝胶过滤，将3.5mg抗体混合物浓缩至1.5mL，且以1mL/min的流速经由AKTA Express FPLC上样至Sephadex 200 HiLoad16/600 200pg柱(GE Healthcare)。以1mL/min的流速使用pH 7.4的PBS缓冲液。收集对应于纯化抗体的级分，浓缩至约1mg/mL 且储存于-80℃。
使用非还原性SDS-PAGE和质谱测定与同源二聚体相比异源二聚体的形成。在肠激酶(EK)处理前，在4-12％梯度SDS-PAGE、非还原凝胶上运行蛋白A纯化的抗体，以确定形成的异源二聚体的百分比(参见图26)。对于质谱，在与Waters Q-TOF2质谱仪连接的Agilent1100 HPLC系统上进行所有Trap LC/MS(ESI-TOF)实验。将5μg凝胶过滤纯化的抗体注射到蛋白MicroTrap(1.0×8.0mm)中，用1％乙腈洗涤8分钟，1至20％乙腈/0.1％甲酸的梯度2分钟，然后用20至 60％乙腈/0.1％甲酸的梯度洗脱20分钟。将洗脱物(30-50μL/min)引导至光谱仪，每秒获得谱(m/z 800至4,000)。(参见图28)。除了AZ12 和AZ14(其中每种具有大于85％异源二聚体形成)，选择具有大于90％异源二聚体的变体用于进一步分析。
实施例3：使用差示扫描量热法(DSC)确定具有异源二聚体Fc 结构域的二价单特异性抗体的稳定性。
使用GE VP-毛细管仪器进行所有DSC实验。将蛋白缓冲交换至 PBS(pH 7.4)中，且稀释至0.4至0.5mg/m，将0.137ml上样至样品室，且用1℃/min的扫描速率20至100℃测量。使用Origin软件(GE Healthcare)分析数据，减去PBS缓冲液背景。(参见图27)。对于测试的变体和确定的熔解温度的列表，参见表3。对于具有70℃和以上的熔解温度的变体和对于每种变体的特定Tm的列表，参见表4。
表3：与同源二聚体形成相比具有90％或更多异源二聚体形成的 IgG1抗体中变体CH3结构域的熔解温度测量值
表4：IgG1抗体中选择“变体”CH3结构域的熔解温度测量值
变体 Tm℃ 变体 Tm℃ 变体 Tm℃ 变体 Tm℃
野生型 81.5 AZ42 70 AZ73 71 AZ91 71.5
对照1 69 AZ44 71.5 AZ74 71 AZ92 71.5
对照2 69 AZ46 70.5 AZ75 70 AZ93 71.5
AZ12 ＞77 AZ47 70.5 AZ76 71.5 AZ94 73.5
AZ14 ＞77 AZ48 70.5 AZ77 71 AZ95 72
AZ15 71.5 AZ49 71 AZ78 70 AZ98 70
AZ17 71 AZ63 71.5 AZ79 70 AZ100 71.5
AZ19 70.5 AZ64 74 AZ81 70.5 AZ101 74
AZ20 70 AZ65 73 AZ82 71 AZ106 74
AZ21 70 AZ66 72.5 AZ83 71 AZ114 71
AZ25 70.5 AZ67 72 AZ84 71.5 AZ115 70
AZ29 70 AZ68 72 AZ85 71.5 AZ122 71
AZ30 71 AZ69 71 AZ86 72.5 AZ123 70
AZ32 71.5 AZ70 75.5 AZ87 71 AZ124 70
AZ33 74 AZ71 71 AZ88 72 AZ129 70.5
AZ34 73.5 AZ72 70.5 AZ89 72.5 AZ130 71
实施例4：使用表面等离子共振评价FcγR结合
使用BioRad ProteOn XPR36仪器在25℃用10mM HEPES，150mM NaCl，3.4mM EDTA，和0.05％Tween 20 pH 7.4进行所有结合实验。通过以25μL/min将4.0μg/mL注入10mMNaOAc(pH 4.5)中而将重组HER-2/neu(p185,ErbB-2(eBiosciences,Inc.))捕获在活化的GLM传感芯片上，直到固定约3000共振单位(RU)，猝灭剩余的活性基团。通过在注射缓冲液以建立稳定基线后当以25μL/min注射 240s(导致约500RU)时结合Her-2/neu蛋白而将40μg/mL纯化的包含修饰的CH3结构域的抗HER-2/neu抗体间接捕获在传感芯片上。以 60μL/min注射FcγR(CD16a(f同种异型)和CD32b)浓度(6000、2000、 667、222、和74.0nM)持续120s，和180s解离相，以获得一组结合传感图。使用平衡拟合模型从结合等温线确定获得的KD值，报告值作为三次独立运行的平均值。用野生型IgG1 Fc结构域进行比较，且结合表示为WT kD与变体kD的比值(参见，表5)。
表5：不依赖于CD16a和CD32b的野生型IgG1与修饰的CH3 结构域抗体结合的kD比值
实施例5：使用Fc_CH3工程改造-支架1(1a和1b)合理设计Fc 变体且开发AZ17-62和AZ133-AZ2438
为了获得具有高稳定性和纯度的AZ变体，采用了上述结构和计算策略。(参见图24)。例如，AZ8的深入结构-功能分析提供了对于与野生型人IgG1相比AZ8,L351Y_V397S_F405A_Y407V/ K392V_T394W的每个引入突变的详细理解，且表明重要的核心异源二聚体突变是L351Y_F405A_Y407V/T394W，而V397S,K392V对于异源二聚体形成是无关的。核心突变(L351Y_F405A_Y407V/ T394W)在本文中被称为“支架1”突变。此外，分析显示，相对于野生型(WT)同源二聚体形成丢失的重要接口热点是WT-F405-K409、 Y407-T366的相互作用和Y407-Y407和-F405的包装(参见图29)。这反映在包装、腔体和MD分析中，其显示在环区D399-S400-D401(参见图30)和在K370的相关的β-折叠中的较大构象差异。这导致 K409-D399的链间相互作用的损失(参见图30)和K370与E357强氢键的减弱(K370不再与S364和E357直接接触，但完全是溶剂暴露的)。在WT IgG1 CH3结构域中，这些区域拴系在边缘处的接口，保护核心相互作用免于大量溶剂竞争，且增加有利的疏水性范德华相互作用的动态发生。其结果是与WT相比AZ8的更低埋藏的表面区域和疏水核心的更高的溶剂可接近性。这表明对于AZ8相比于WT稳定性的更低稳定性的最重要因素是a)WT-F405-K409相互作用和F405的包装的损失，和b)Y407-Y407和Y407-T366的强包装相互作用的损失。参见，图29。
因此，我们鉴定了负责AZ8相比于WT的低稳定性的关键残基/ 序列基序。为了改进AZ8的稳定性和异源二聚体特异性，因此将随后的阳性设计工程改造努力专注于将位置399-401的环构象稳定在更 '封闭'-WT样构象中(参见图30)且对于在位置T366和L368处的疏水核心的总体稍微减少的(更松散的)包装进行补偿(参见图29)。
为了实现在位置399-401处的环构象的这种稳定性，使用所述计算方法来评价不同的靶向设计思路。具体而言，分析对于Fc变体AZ8 的3种不同的独立选择，以优化鉴定的关键区域用于改进稳定性。首先，评价在位置K409和F405A附近的结合袋的更好的疏水性包装以便既保护疏水核心又稳定399-400的环构象(参见图30)。这些包括但不限于在位置F405和K392处的额外点突变。其次，评价用于改进在位置399-409处的静电相互作用的选择，以稳定399-400的环构象且保护疏水核心。这包括但不限于在位置T411和S400处的额外点突变。第三，评价在T366、T394W和L368核心包装位置的结合袋以改进核心疏水包装(参见图29)。这些包括但不限于在位置T366和 L368处的额外点突变。在计算机芯片上测试不同独立的阳性设计思路，且实验验证使用计算工具的某些良好变体(AZ17-AZ62)，用于如实施例1-4中所述的表达和稳定性。对于包含该设计策略的具有70℃或更高的熔解温度的某些基于Fc的异源二聚体构建体的列表，参见表4。
Fc变体AZ33是开发Fc变体的实例，其中支架1进行修饰，导致支架1a突变以改进稳定性和纯度。基于AZ8设计该Fc变体，其目标在于改进在位置392-394-409和366处的疏水包装以便既保护疏水核心又稳定399-400的环构象。该Fc变体AZ33异源二聚体具有两个不同于核心突变AZ8、K392M和T366I的额外点突变。突变 T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V在本文中被称为“支架1a”突变。设计突变K392M以改进K409和F405A位附近的腔体的包装以便保护疏水核心且稳定399-400的环构象(参见图31)。设计T366I以改进核心疏水包装且消除T394W链的同源二聚体的形成(参见图29)。对于AZ33的实验数据显示相对于其他阴性设计Fc变体例如AZ8(Tm 68℃)的显著改进的稳定性，其中AZ33具有74℃的Tm和>98％的异源二聚体含量。(参见，图25C)。
在Fc变体异源二聚体的第三阶段设计中使用支架1突变开发Fc 变体
尽管AZ33提供了相对于初始起始变体AZ8的显著的稳定性和特异性(或纯度)改进，但是我们的分析表明，可以用进一步氨基酸修饰且使用AZ33的实验数据和上述设计方法进行对Fc变体异源二聚体的稳定性的进一步改进。已经独立地测试了不同设计思路的表达和稳定性，但是独立的设计思路是可转移的，且最成功的异源二聚体将含有不同设计的组合。具体而言，为了优化AZ8包装，已经不依赖于优化残基L366T-L368处的核心包装的突变而评价K409-F405A-K392 附近的腔体处的突变。这两个区域366-368和409-405-392相互远离，且被认为是独立的。例如，已经关于在409-405-392、但不是在366-368 处的包装对Fc变体AZ33进行优化，因为这些优化突变是分开评价的。366-368突变的比较表明，相比于T366和还有T366I(在Fc变体 AZ33的开发中使用的点突变)，T366L具有改进的稳定性。因此，提出的实验数据立即表明通过引入T366L而非T366I(例如)的AZ33的进一步优化。因此，CH3结构域中的氨基酸突变 T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V在本文中被称为“支架1b”突变。
以类似的方式，已经分析了完整的实验数据以鉴定可以用于进一步改进目前的Fc变体异源二聚体AZ33的点突变。通过上述计算方法对这些鉴定的突变进行分析，且排序以产生基于AZ33的额外Fc 变体异源二聚体的列表，如表6中所示。
实施例6：使用Fc_CH3工程改造-支架2(a和b)合理设计Fc变体且开发AZ63-101和AZ2199-AZ2524
为了改进初始阴性设计阶段Fc变体AZ15的稳定性和纯度，采用了上述结构和计算策略(参见，图24)。例如，Fc变体AZ15的深入结构-功能分析提供了对于与野生型(WT)人IgG1相比AZ15, L351Y_Y407A/E357L_T366A_K409F_T411N的每个引入突变的详细理解，且表明重要的核心异源二聚体突变是L351Y_Y407A/ T366A_K409F，而E357L,T411N对于异源二聚体形成和稳定性不是直接相关的。核心突变(L351Y_Y407A/T366A_K409F)在本文中被称为“支架2”突变。此外，分析显示，相对于野生型(WT)同源二聚体形成丢失的重要接口热点是盐桥D399-K409、氢键Y407-T366和包装 Y407-Y407。下面提供的详细分析描述了我们如何改进我们的初始Fc 变体AZ15和获得这些改进稳定性的Fc变体进行的位置和氨基酸修饰。
使用支架2突变开发Fc变体和进一步开发支架2a突变。
计算机芯片上分析表明，由于WT-Y407-Y407相互作用的损失，先前Fc变体设计例如AZ15突变K409F_T366A_Y407A的非最佳包装和疏水核心的总体减少的包装。用更优的包装设计本文所述的异源多聚体。本文所述的一些阳性设计努力集中在点突变以补偿初始Fc变体AZ15中的包装缺陷。靶向的残基包括T366、L351、和Y407位。在计算机芯片上测试这些的不同组合，且关于表达和稳定性实验验证使用计算工具的排序最佳的Fc变体(AZ63-AZ70)，如实施例1-4中所述。
Fc变体AZ70是开发Fc变体的实例，其中支架2进行修饰，导致支架2a突变以改进稳定性和纯度。基于AZ15设计该Fc变体，其目标实现如上所述的疏水核心的更好包装。Fc变体AZ70具有与上述相同的支架2核心突变(L351Y_Y407A/T366A_K409F)，除了将T366 突变为T366V而非T366A(图33)。L351Y突变将366A_409F/407A 变体熔解温度从71.5℃改进至74℃，且366A至366V的额外改变将 Tm改进至75.5℃。(参见，表4中的AZ63、AZ64和AZ70，其分别具有71.5℃、74℃和75.5℃的Tm)。核心突变(L351Y_Y407A/ T366V_K409F)在本文中被称为“支架2a”突变。对于Fc变体AZ70的实验数据显示相比于初始阴性设计Fc变体AZ15(Tm 71℃)的显著改进的稳定性，其中AZ70具有75.5℃的Tm和>90％的异源二聚体含量(图33和27)。
使用支架2突变开发Fc变体和进一步开发支架2b突变。
分子动力学模拟(Molecular Dynamics simulation,MD)和包装分析显示环399-400的优选的更'开放'构象，这可能是由于WT盐桥 K409-D399的损失。这也导致不满意的D399，这依次优选与K392 的补偿性相互作用，且诱导环的更'开放'构象。这种更'开放'环构象导致核心CH3结构域接口残基的总体下降的包装和更高的溶剂可接近性，这依次使异源二聚体的稳定性显著下降。因此，针对性的阳性设计努力之一是通过补偿D399-K409盐桥和K409的包装相互作用的损失的额外点突变而将该环拴系在更'封闭的'WT样构象中。靶向残基包括T411、D399、S400、F405、N390、K392以及它们的组合。在计算机芯片上针对上述位置测试不同包装、疏水性和静电阳性工程改造策略，且关于表达和稳定性实验验证使用计算工具测定的排序最佳的 Fc变体(AZ71-AZ101)，如实施例1-4中所述。
Fc变体AZ94是开发Fc变体的实例，其中支架2进行修饰，导致支架2b突变连同额外的点突变以改进稳定性和纯度。基于将环 399-400拴系在更'封闭的'WT样构象中且补偿如上所述的D399-K409 盐桥的损失的目标设计该Fc变体。Fc变体AZ94具有对于支架2的 4个额外点突变(L351Y_Y407A/T366A_K409F)，且将L351Y回复为野生型L351，留下(Y407A/T366A_K409F)作为用于该Fc变体的核心突变。核心突变Y407A/T366A_K409F在本文中被称为“支架2b”突变。AZ94的四个额外点突变是K392E_T411E/D399R_S400R。将突变T411E/D399R工程改造以形成额外的盐桥且弥补K409/D399 相互作用的损失(图34)。此外，设计这种盐桥以通过排除两个潜在同源二聚体中的电荷-电荷相互作用以防止同源二聚体形成。额外突变 K392E/S400R意在形成另一种盐桥，且因此进一步将399_400环拴系在更“封闭”的WT样构象中(图34)。对于AZ94的实验数据显示相对于初始阴性设计Fc变体AZ15(Tm 71℃,>90％纯度)的改进的稳定性和纯度，其中Fc变体AZ94具有74℃的Tm和>95％的异源二聚体含量或纯度。
在Fc变体异源二聚体的第三阶段设计中使用支架2突变开发Fc 变体
Fc变体AZ70和AZ94提供了相对于初始阴性设计Fc变体例如 AZ15的稳定性和纯度的显著改进，但是我们的分析和AZ70和AZ94 的比较直接表明，可以用进一步氨基酸修饰进行对Fc变体异源二聚体的稳定性的预期之中的改进。例如，设计Fc变体AZ70和AZ94 靶向初始变体AZ15中的两个不同的非优化区域，这是通过改进疏水核心的包装和在核心接口残基的外部进行突变来完成的，导致额外的盐桥和氢键键合来使在位置399-401处的环构象稳定。Fc变体AZ70 和AZ94的额外点突变相互远离，且因此对于设计在相同支架2核心突变(包括2a和2b突变)附近设计的其他Fc变体是独立的且是可转移的。具体而言，AZ70只携带优化的核心突变L351Y_Y407A/ T366A_K409F，但没有额外的盐桥，而AZ94包含四个额外静电突变 (K392E_T411E/D399R_S400R)，但在疏水核心接口中少一个突变 (Y407A/T366A_K409F)。这些支架2b突变比AZ70稳定性更差(参见，例如AZ63，其具有和AZ94等同的核心突变和72℃的Tm)，但是通过添加K392E_T411E/D399R_S400R突变而补偿。提供的实验稳定性和纯度数据表明，结合AZ70的突变(其优化了AZ94的疏水核心和静电突变)应当进一步改进Fc变体异源二聚体的稳定性和纯度。以类似的方式，已经分析了支架2Fc变体(AZ63-101)完整的实验数据以鉴定可以用于进一步改进Fc变体异源二聚体AZ70和AZ94的点突变。通过上述计算方法对这些鉴定的突变进行进一步分析，且排序以产生基于AZ70和AZ94的额外Fc变体异源二聚体的列表，如表7中所示。
实施例7：异源二聚体CH3对FcgR结合的影响
作为异源二聚体Fc与FcgR的活性的典型实例，已经如实施例4 中对于FcgR结合所述在SPR测定中测试了两种具有含有Her2结合 Fab臂的异源二聚体Fc区的变体抗体 A:K409D_K392D/B:D399K_D356K(对照1(图35中的het 1))和 A:Y349C_T366S_L368A_Y407V/B:S354C_T366W(对照4(图35中的 het 2))。如图35中所示，我们观察到，两种异源二聚体Fc区都以与野生型IgG1 Fc区相同的相对强度结合不同的Fcγ受体，但是总体而言，异源二聚体Fc区与每种FcgR的结合略优于野生型抗体。这表明， Fc的CH3接口处的突变可以影响Fc区横跨CH2结构域对于Fcγ受体的结合强度，正如分子动力学模拟和分析中观察到的。
实施例8：异源二聚体Fc的CH2中的不对称突变对FcgR结合的影响
已知Fc区的CH2结构域中在位置267处的丝氨酸突变为天冬氨酸(S267D)当以同源二聚的方式引入CH2结构域的两条链中时增强与 FcγIIbF、IIbY&IIaR受体的结合。可以将这种突变引入异源二聚体 Fc分子的仅一个CH2结构域中以获得相对于当这种突变引入同源二聚体CH2Fc时约一半的结合强度的改进，如在图36A中提供的数据所表明的。另一方面，Fc的同源二聚体CH2结构域中的E269K突变防止了Fc区与FcgR的结合。我们提出了通过在Fc的CH2结构域中的两条链之一上不对称引入这些有利和不利突变而增强操作Fc区对于Fcg受体的结合强度的方案。以不对称方式将E269K突变引入异源二聚体Fc的一条CH2链上通过阻断FcgR在其存在的面处的结合、同时使Fc的另一面与FcgR以正常方式相互作用而充当极性驱动者。来自这些实验的结果提供在图36A中。经由Fc的两条链以独立方式选择性改变结合强度的机会提供了操作Fc和Fcg受体之间的结合强度和选择性的增加的机会。因此，CH2结构域中突变的这种不对称设计使我们能够引入阳性和阴性设计策略以支持或不支持某些结合模型，提供了引入选择性的更多的机会。
在随后的实验中，我们已经改变了基础Fc突变体 S239D_D265S_I332E_S298A的选择性概况，其显示与FcγIIIaF和 IIIaV受体的增加的结合强度，同时继续表现出与FcγIIaR、IIbF和 IIbY受体更弱的结合。这显示在图36B中显示的结合概况中。通过在链A中引入不对称突变E269K和在链B中避免I332E突变，我们能够生成新的FcgR结合概况，其进一步减弱IIa和IIb受体结合，且使Fc对于IIIa受体结合更加特异性。
在图36C中显示的另一个实例中，突出了相对于同源二聚体Fc 的不对称突变，其涉及CH2结构域中的突变 S239D/K326E/A330L/I332E/S298A。相对于野生型IgG1 Fc，这种变体显示了与IIIa受体结合的增加，但也比野生型Fc略强地结合IIa 和IIb受体。以不对称方式A:S239D/K326E/A330L/I332E和B:S298A 引入这些突变、同时降低IIIa结合，也增加了IIa/IIb受体结合，在这个过程中失去了选择性。通过在这种异源二聚体变体中引入不对称E269K突变(即A:S239D/K326E/A330L/I332E/E269K和B:S298A)，将 IIa/IIb结合降回至野生型水平。这突出了如下事实：在Fc的CH2结构域中使用不对称突变能够提供设计改进的FcγR选择性的重要机会。
实施例中采用的试剂是商业上可获得的，或者可以使用商业上可获得的仪器、方法、或本领域已知的试剂来制备。上述实施例说明了本发明的各个方面和本发明的方法的实施。实施例并不意在提供本发明的许多不同实施方案的详尽描述。因此，尽管为了理解清晰，已借助例证和实例相当详细地描述了上述发明，对本领域普通技术人员而言容易理解的是，在没有背离所附的权利要求书的精神和范围的情况下，可以对本发明做一些改变和修饰。
实施例9：通过SPR确定的FcRn结合。
在两个不同的取向中通过SPR确定与FcRn的结合。
1.使异源二聚体变体流经固定化FcRn：在该实验中，使用标准 NHS/EDC偶联制备约5000RU的高密度表面。一式三份地，以50uL min注射100nM WT和每个变体持续120s，在MES pH6电泳缓冲液中解离600s。
2.使FcRn流经间接捕获的异源二聚体变体：在该SPR实验中，使用山羊抗-人类IgG表面以间接捕获抗体(各约400RU)，随后注射3 倍FcRn稀释液系列(6000nM高浓度)。电泳缓冲液为于pH6的10mM MES/150mM NaCl/3.4mM EDTA/0.05 Tween20。FcRn与山羊多克隆表面无显著结合。所有变体显示与WT传感图类似。下面表8显示通过间接固定用流式FcRn(2.)确定的Kd。
表8：通过间接固定用流式FcRn确定的Kd
实施例10：本文所述的Fc异源二聚体的双特异性结合
使用具有突变链-A：L351Y_F405A_Y407V、链-B：T366L_K392M_T394W的Fc异源二聚体以及与Fc异源二聚体的链-A 和链-B的N末端稠合的抗-HER2和抗-HER3 scFv验证双特异性结合。在图40A中说明所获得的变体双特异性HER2/HER3变体和两个单价 -单特异性HER2、HER3变体。为了测试双特异性结合，一定剂量范围的两个单价变体(抗-HER2单价和抗-HER2单价，在图40A中说明) 和双特异性抗-HER2/HER3异源二聚体用MALME-M3黑素瘤分子孵育，随后FACS分析以确定每个分子的表观结合亲和力(在图40B中所示)。根据在以下文献中所述的方案建立测定系统："Antitumor activity of a novel bispecific antibodythat targets the ErbB2/ErbB3 oncogenic unit and inhibits heregulin-inducedactivation of ErbB3", McDonagh CF等人，Mol Cancer Ther.11(3):582-93(2012)。
实施例11：具有异源二聚体Fc结构域的二价单特异性抗体的表达和纯化以及通过LC/MS对纯度的定量
如实施例1和2中所述地产生并纯化异源二聚的变体AZ133(A： L351Y/F405A/Y407V，B：T366L/K392M/T394W)、AZ138(A： F405A/Y407V，B：T366L/K392M/T394W)、AZ3002(A：T350V/L351Y/F405A/Y407V，B：T350V/T366L/K392M/T394W)、 AZ3003(A：T350V/L351Y/F405A/Y407V，B： T350V/T366L/K392L/T394W)和其他AZ构建体AZ3000-AZ3021。为了评估异源二聚体形成的稳健性和过量的一条异源二聚体链对异源二聚体纯度的影响，使用两条重链A和B的3种不同的DNA比例(例如比例A:B＝1:1.5；1:1；1.5:1)短暂表达选择的异源二聚体。
如实施例1中详细所述地，经由基因合成使用针对人类/哺乳动物表达优化的密码子来构建编码异源二聚体重链和轻链的基因。Fab 序列由已知Her2/neu结合Ab产生(Carter P.等人(1992)Humanization of an anti P185 Her2 antibody for humancancer therapy.Proc Natl Acad Sci 89,4285)并且Fc为IgG1同种型(SEQ ID NO:1)。如实施例1-2中所述地，使用1:1.5、1:1和1.5:1的3种不同的重链-A和重链-B比例通过短暂共表达来表达变体。通过蛋白-A亲和力色谱和制备型凝胶过滤纯化样品(参见实施例2的细节)。在37℃用PNGaseF将经纯化的样品脱糖基化过夜。在MS分析之前，将样品注射到PorosR2柱中并且以具有20-90％ACN、0.2％FA的梯度洗脱3分钟。LC柱的峰用 LTQ-Orbitrap XL质谱仪(锥孔电压：50V’镜筒透镜：215V；FT分辨率：7,500)分析并且用软件Promass积分以产生分子重量特性。
使用异源二聚体和同源二聚体的相对峰高以评估异源二聚体纯度(参见图39)。
实施例12：异源二聚体AZ3002和AZ3003的晶体结构:
在CHO中表达AZ3002和AZ3003的异源二聚的Fc构建体并通过pA和SEC纯化至同质性。经由悬滴式蒸汽扩散法借助于微接种在上述母液溶液中以2:1的比例孵育约24小时后，在18℃使纯化的Fc 异源二聚体结晶，所述母液溶液由5％(v/v)乙二醇、18％(w/v)聚乙二醇3350和0.15M碘化铵组成。通过使乙二醇浓度增至30％(v/v)且随后在液氮中急骤冷却对晶体进行冷冻保护。使用针对总计200度的0.5度振幅，在100K收集两种晶体的衍射数据，并且用XDS处理1。使用PDBID：2J6E作为查询蛋白，经由分子替换利用Phaser解析 AZ3002的结构2。然后使用AZ3002的结构以类似的方式解析 AZ3003。为了提供完善的双晶，用Refmac修正的Coot对存在于结晶学的不对称单元中的不对称异源二聚体(各具有0.5原子占用率的两种可能的异源二聚体对)的互反关系(例如分子A的占用率可同样地由分子B描述，反之亦然)进行建模3，4。衍射数据处理和结构修正统计示于表9中。
表9：
1.Kabsch，W.XDS.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66，125-132(2010).
2.McCoy，A.J.Solving structures of protein complexes by molecularreplacement with Phaser.Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.63，32-41(2007).
3.Emsley，P.&Cowtan，K.Coot：model-building tools for moleculargraphics.Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.60，2126-2132(2004).
4.Murshudov，G.N.，Vagin，A.A.&Dodson，E.J.Refinement of macromolecularstructures by the maximum-likelihood method.Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.53，240-255 (1997).
晶体结构的重迭显示于图42中。AZ3002和AZ3003异源二聚体的晶体结构显示与计算机芯片上模型非常一致( )并且符合所预测的关键核心包装残基的构象。
实施例13：AZ3003的糖基化分析
如实施例11中所述，表达并纯化AZ3003异源二聚体。使用标准制造商方案，用GlykoPrepTM Rapid N-Glycan Preparation和 InstantABTM(Prozyme)分析聚糖。
结果显示于图43中并且说明AZ3003具有典型的糖基化模式。
实施例14：AZ3003在强制降解条件下的稳定性评估
通过在强制降解条件下孵育来评估AZ3003异源二聚体的稳定性。mAb在强制降解条件下的稳定性对于长期和制剂稳定性可以是良好的评估。
在没有聚集迹象下将纯化的异源二聚体样品(如实施例11中所述的表达和纯化)浓缩至100mg/ml。将样品稀释至适合的缓冲剂中并且如下表10中所述在强制降解条件下进行评价。通过SDS-PAGE和 HPLC-SEC分析经处理的样品。
用购自LONZA的预制梯度凝胶在还原(R)和非还原(NR)条件下进行SDS-PAGE。通过用Coomassie Brilliant Blue G-250染色使蛋白质条带可视化。
使用Phenomenex,BIOSEP-SEC-S4000或BioRad Bio-Sil TSK 4000 HPLC柱以0.8ml/min流速用10mM磷酸钠、0.14M NaCl、10％异丙醇作为电泳缓冲液，进行分析型SEC-HPLC。这允许潜在的更高和更低的分子和物种的定量。
表10：用于降解AZ3003的强制降解条件
结果显示于图44中并表明AZ3003异源二聚体是稳定的，且表现出稳定性特征，这与工业标准mAb的稳定性一致。
实施例15：AZ3003在下游的纯化评估
使用如图45中所示的工业标准抗体纯化方法流程，进行AZ3003 的可制造性评估以评价AZ3003的行为。该方法涉及三柱步阶平台，其包括用于产物捕获的蛋白A亲和色谱法，接着用于除去聚集体、滤取的蛋白A和HCP的阳离子交换(CEX)色谱法，以及最后在流经型模式中的阴离子交换(AEX)色谱法以捕获病毒、DNA和带负电的污染物。该评估用于在研究/开发阶段早期鉴定候选药物的潜在的制造问题(例如，方法稳定性、产物稳定性和质量)。
在可制造性评估期间，使用在图46中显示的工业标准纯化方法评价色谱行为、蛋白质稳定性和产物质。表11(下面)列出了用于评估即步骤收率、高分子量聚集体(HMW)含量和洗脱体积的主要标准。在纯化期间的高-步骤收率和低-洗脱体积指示功能良好的、稳定的蛋白质。在纯化期间HMW含量的监控及其去除是至关重要的，因为终产物中蛋白质聚集体(HMW种类)的存在可导致患者中的活性免疫原性反应的降低和/或在药物产品半衰期期间的微粒形成。因为高水平的聚集体将需要用于去除的额外纯化步骤，所以具有最小初始HMW含量(<4％)的Mab的表达是期望的，由此增加制造的时间和成本。
表11：用于可制造性评估的主要标准
使用标准工业纯化方法验证AZ3003的稳定性、色谱行为和产物质量。
1.1蛋白A捕获
使用来自Millipore的瓶盖滤器(PES)对表达AZ3003的CM进行 0.22-μm过滤并且将其施加至用5CV的20mM Tris-HCl、0.14M NaCl、pH 7.5平衡的Mab Select SuRe(1.6×25cm)柱。加载后，用平衡缓冲液彻底洗涤柱子，直至A280吸光度达到稳定的基线。用0.1M乙酸盐缓冲液(pH 3.6)洗脱AZ3003并立即通过添加1/10体积的1M tris碱而滴定至pH5.2。
洗脱步骤后，用0.1M乙酸盐(pH 3.0)洗涤柱子。SDS-PAGE分析显示，所有Mab与柱子结合，因为在柱子FT中未检测出Mab。在 pH 3.6洗脱缓冲液中检测出高度纯化的Mab。使用蛋白A亲和色谱法的初始捕获和纯化步骤得到纯度>90％的产物。
1.2低pH保持研究
下游方法中的下一步骤为低pH保持，其为了灭活病毒而进行。从蛋白A柱洗脱后，用10％乙酸将Mab(约10mg/ml,pH 4.0)滴定至 pH 3.6，并在搅拌下于RT孵育90min。通过SDS-PAGE、SEC-HPLC 以及通过在A410nm的浊度测量评价AZ3003抗低pH处理的稳定性。AZ3003对低pH保持步骤的耐受性良好，显示在SDS-PAGE或 SEC-HPLC中无变化。此外，在90-min孵育后检测到浊度增加，指示缺少不溶性聚集体的形成，这可在纯化期间是棘手的问题(即，阻塞方法中的滤器和柱子，产物损失)。这些数据显示AZ30003对低pH 保持步骤稳定。
1.3阳离子交换色谱法(CEX)
作为纯化方法中的第二步骤研究CEX。评价以下两种树脂：来自Merk/Millipore的Fractogel EMD SO3(M)和来自GE Lifesciences 的SP HP。
Fractogel EMD SO3(M)，pH 5.2：通过添加10％(v/v)1M tris碱将Mab SelectSuRe混合物(35mg)滴定至pH 5.2，然后用平衡缓冲液 20mM乙酸盐(pH 5.2)进行2倍稀释。将该混合物施加至用5CV的 20mM乙酸盐(pH 5.2)平衡的Fractogel EMD SO3(M)柱子。用平衡缓冲液洗涤柱子，直至A280吸光度达到稳定的基线。用超过10CV的 0至600mM NaCl(pH5.2)的线性盐梯度从柱子洗脱Mab。用20mM 乙酸盐、1M NaCl、pH 5.2，接着用1N NaOH处理将剩余的污染物从柱子脱去。进行SDS-PAGE和SEC-HPLC分析以监控HMW水平以及其从该柱子的主要Mab级分中的去除。步骤收率(基于A280nm 读数)为73％。
SP HP，pH 5.2：通过添加10％(v/v)1M tris碱将Mab Select SuRe 混合物(50mg)滴定至pH 5.2，然后同样用平衡缓冲液20mM乙酸盐 (pH 5.2)稀释。将该混合物施加至用5CV的20mM乙酸盐(pH 5.2)平衡的SP HP柱(1.6×2.5cm/5ml)(图21)。将柱子用平衡缓冲液洗涤，直至A280吸光度达到稳定的基线。用超过10CV的0至600mM NaCl (pH 5.2)的线性盐梯度从柱子洗脱Mab。用20mM乙酸盐、1M NaCl、 pH 5.2，接着用1N NaOH处理将剩余的污染物从柱子脱去。进行 SDS-PAGE和SEC-HPLC分析以监控聚集水平以及其在该柱子上的分离。
步骤收率(基于A280nm读数)为87％。
1.4阴离子交换色谱法(AEX)
阴离子交换(例如季胺，Q)已广泛用于单克隆抗体纯化。在流经型模式中操作AEX介质，Mab在FT中出现同时允许HCP、DNA、病毒和内毒素的滞留。
用1M tris碱将Fractogel SO3 M混合物pH 5.2(25mg)滴定至pH 7.0并将其施加至用5CV的10mM磷酸盐(pH 7.0)平衡的1ml HiTrap Q FF。用平衡缓冲液洗涤柱子。但是，在这种情况下，未达到稳定基线。因此，用PBS洗涤柱子以洗脱任何残留的结合Mab。然后，用10mM磷酸盐、1M NaCl、pH 7.0洗涤柱子以除去任何结合的污染物。该步骤需要进一步优化以使所有Mab级分存在于流经型模式中。步骤收率(基于A280nm读数)为82％，通过SEC-HPLC估计纯度>98％。
1.5下游纯化的SDS-PAGE分析
对来自每个纯化步骤的洗脱物进行SDS-PAGE(图35)以在整个方法中监控污染物去除以及评价终产物质量和纯度。凝胶分析显示，期望的Mab在非还原和还原条件下的迁移模式。来自两种CEX树脂的混合物的凝胶比较显示产物特性无主要差异。针对纯度和污染条带，来自CEX、CHT和HIC pH 5.0和pH 7.0的主要混合物均看似类似的。
1.7通过SEC-HPLC评价纯度
在天然条件下通过SEC(大小排阻)-HPLC评价在三柱色谱法步骤蛋白A；CEX；AEX流经型模式后纯化的AZ3003(图46)。
AZ3003显示单峰在期望的天然IgG1的150kDa区域内洗脱。纯度估计为>98％。
1.8用于纯化AZ3003的方法收率
计算下游纯化方法的方法收率并且在图46中列出。对于使用工业标准三柱纯化方法纯化的IgG，AZ3003的步骤收率是典型的。
使用工业标准纯化方法(蛋白A亲和树脂，CEX，接着AEX)，成功地从CM纯化AZ3003。
这些结果指示，AZ3003在总体回收收率方面与标准mAb类似(参见KelleyB.Biotechnol.Prog.2007,23,995-1008)和最低程度观察到的聚集。也针对低pH保持&CHT(陶瓷羟磷灰石)和HIC(疏水性相互作用色谱法)(Phenyl HP pH 5和pH 7)，评价AZ3003，其中无聚集体的回收率良好。图46说明，使用工业标准纯化方法(蛋白A亲和树脂， CEX，接着AEX)成功地从CM纯化先导异源二聚体。
本说明书中所提到的所有出版物、专利以及专利申请都如同每篇出版物、专利或专利申请被特别且单独指出通过引用并入本文一样的程度通过引用并入本说明书。

Claims (44)

1.一种分离的异源多聚体Fc构建体，包含修饰的异源二聚的CH3结构域，所述修饰的异源二聚的CH3结构域包含：
第一修饰的CH3结构域多肽和第二修饰的CH3结构域多肽，所述第一和第二修饰的CH3结构域多肽与野生型CH3结构域多肽相比各自包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代与同源二聚的CH3结构域相比促进异源二聚的CH3结构域的形成；
其中所述氨基酸取代包含在所述第一修饰的CH3结构域多肽中在位置F405和Y407处的氨基酸取代，和在所述第二修饰的CH3结构域多肽中在位置T366、K392和T394处的氨基酸取代；
其中在位置T366处的氨基酸取代是T366I或T366L，在位置K392处的氨基酸取代是K392L、K392M或K392F，在位置T394处的氨基酸取代是T394W，在位置F405处的氨基酸取代是F405A、F405S、F405T或F405V，以及在位置Y407处的氨基酸取代是Y407V；
其中所述第一和第二修饰的CH3结构域多肽各自进一步包含氨基酸取代T350V；
其中所述第一和第二修饰的CH3结构域多肽形成具有74℃至83℃之间的熔解温度(Tm)和至少95％的纯度的异源二聚的CH3结构域；
其中所述异源多聚体Fc构建体基于G型免疫球蛋白(IgG)，且
其中氨基酸的编号根据Kabat中所述的EU索引。
2.根据权利要求1所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述修饰的CH3结构域具有76℃至83℃之间的熔解温度(Tm)。
3.根据权利要求1所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中在位置F405处的氨基酸取代为F405A。
4.根据权利要求1所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述第一修饰的CH3结构域多肽进一步包含氨基酸取代L351Y。
5.根据权利要求4所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述第二修饰的CH3结构域多肽中在位置K392处的氨基酸取代是K392L或K392M。
6.根据权利要求4所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述氨基酸取代包含在所述第一修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代L351Y、F405A和Y407V，和在所述第二修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T366I或T366L、K392L或K392M、和T394W。
7.根据权利要求1-6任一项所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述第一修饰的CH3结构域多肽进一步包含氨基酸取代S400E。
8.根据权利要求7所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述第二修饰的CH3结构域多肽进一步包含氨基酸取代N390R。
9.根据权利要求1-6任一项所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述第一修饰的CH3结构域多肽进一步包含氨基酸取代S400R。
10.根据权利要求9所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述第二修饰的CH3结构域多肽进一步包含氨基酸取代N390D或N390E。
11.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述第一修饰的CH3结构域多肽进一步包含氨基酸取代Q347R且所述第二修饰的CH3结构域多肽进一步包含氨基酸取代K360E。
12.根据权利要求1所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述氨基酸取代包含在所述第一修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、F405A和Y407V，和在所述第二修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、T366L、K392M和T394W。
13.根据权利要求1所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述氨基酸取代包含在所述第一修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、L351Y、F405A和Y407V，和在所述第二修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、T366L、K392M和T394W。
14.根据权利要求1所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述氨基酸取代包含在所述第一修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、L351Y、F405A和Y407V，和在所述第二修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、T366L、K392L和T394W。
15.根据权利要求1所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述氨基酸取代包含在所述第一修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、L351Y、S400R、F405A和Y407V，和在所述第二修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、T366L、K392M和T394W。
16.根据权利要求1所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述氨基酸取代包含在所述第一修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、L351Y、S400E、F405A和Y407V，和在所述第二修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、T366L、N390R、K392M和T394W。
17.根据权利要求1所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述氨基酸取代包含在所述第一修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、L351Y、S400E、F405V和Y407V，和在所述第二修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、T366L、N390R、K392M和T394W。
18.根据权利要求1所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述氨基酸取代包含在所述第一修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、L351Y、S400E、F405T和Y407V，和在所述第二修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、T366L、N390R、K392M和T394W。
19.根据权利要求1所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述氨基酸取代包含在所述第一修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、L351Y、S400E、F405S和Y407V，和在所述第二修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、T366L、N390R、K392M和T394W。
20.根据权利要求1所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述氨基酸取代包含在所述第一修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、S400E、F405A和Y407V，和在所述第二修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、T366L、N390R、K392M和T394W。
21.根据权利要求1所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述氨基酸取代包含在所述第一修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、L351Y、S400E、F405A和Y407V，和在所述第二修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、L351Y、T366L、N390R、K392M和T394W。
22.根据权利要求1所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述氨基酸取代包含在所述第一修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代Q347R、T350V、L351Y、S400E、F405A和Y407V，和在所述第二修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、K360E、T366L、N390R、K392M和T394W。
23.根据权利要求1所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述氨基酸取代包含在所述第一修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、L351Y、S400R、F405A和Y407V，和在所述第二修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、T366L、N390D、K392M和T394W。
24.根据权利要求1所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述氨基酸取代包含在所述第一修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、L351Y、S400R、F405A和Y407V，和在所述第二修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、T366L、N390E、K392M和T394W。
25.根据权利要求1所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述氨基酸取代包含在所述第一修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、L351Y、S400E、F405A和Y407V，和在所述第二修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、T366L、N390R、K392L和T394W。
26.根据权利要求1所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述氨基酸取代包含在所述第一修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、L351Y、S400E、F405A和Y407V，和在所述第二修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、T366L、N390R、K392F和T394W。
27.根据权利要求1所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述氨基酸取代包含在所述第一修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代Y349C、T350V、L351Y、S400E、F405A和Y407V，和在所述第二修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、S354C、T366L、N390R、K392M和T394W。
28.根据权利要求1所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述氨基酸取代包含在所述第一修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代Y349C、T350V、S400E、F405A和Y407V，和在所述第二修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、S354C、T366L、N390R、K392M和T394W。
29.根据权利要求1所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述氨基酸取代包含在所述第一修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代Y349C、T350V、F405A和Y407V，和在所述第二修饰的CH3结构域多肽中的氨基酸取代T350V、S354C、T366L、K392M和T394W。
30.根据权利要求1-6和12-29中任一项所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述IgG是IgG2、IgG3和IgG4中的一个。
31.根据权利要求1-6和12-29中任一项所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述IgG是IgG1。
32.根据权利要求31所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述异源多聚体Fc构建体是双特异性或多特异性抗体。
33.根据权利要求32所述的分离的异源多聚体Fc构建体，包含至少一种结合癌抗原的抗原结合结构域。
34.根据权利要求1-6和12-29中任一项所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述异源多聚体Fc构建体是双特异性或多特异性抗体。
35.根据权利要求34所述的分离的异源多聚体Fc构建体，包含至少一种结合癌抗原的抗原结合结构域。
36.根据权利要求1-6和12-29中任一项所述的分离的异源多聚体Fc构建体，其中所述异源多聚体Fc构建体与治疗剂缀合。
37.一种组合物，包含根据权利要求1-36中任一项所述的分离的异源多聚体Fc构建体和药学上可接受的载体。
38.一种或多种多核苷酸，其编码根据权利要求1-35中任一项所述的分离的异源多聚体Fc构建体。
39.一种或多种表达载体，其包含编码根据权利要求1-35中任一项所述的分离的异源多聚体Fc构建体的多核苷酸。
40.一种多顺反子表达载体，其包含编码根据权利要求1-35中任一项所述的分离的异源多聚体Fc构建体的多核苷酸。
41.一种哺乳动物宿主细胞，包含编码根据权利要求1-35中任一项所述的分离的异源多聚体Fc构建体的一种或多种多核苷酸。
42.一种在哺乳动物细胞中表达根据权利要求1-35中任一项所述的分离的异源多聚体Fc构建体的方法，所述方法包括：
a.使用一种或多种编码根据权利要求1-35中任一项所述的分离的异源多聚体Fc构建体的多核苷酸转染至少一种哺乳动物细胞，从而产生至少一种瞬时或稳定转染的哺乳动物细胞；和
b.在适合表达所述分离的异源多聚体Fc构建体的条件下，培养所述瞬时或稳定转染的哺乳动物细胞。
43.根据权利要求1-36中任一项所述的分离的异源多聚体Fc构建体在制备治疗患有由癌抗原表征的癌症的患者中的癌症的药物中的用途。
44.根据权利要求1-32、34和36中任一项所述的分离的异源多聚体Fc构建体在制备治疗患有由免疫抗原表征的免疫病症的患者中的免疫病症的药物中的用途。
CN201811302754.7A 2011-11-04 2012-11-02 在Fc结构域中具有突变的稳定异源二聚的抗体设计 Pending CN109897103A (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161556090P 2011-11-04 2011-11-04
US61/556,090 2011-11-04
US201161557262P 2011-11-08 2011-11-08
US61/557,262 2011-11-08
US201261645547P 2012-05-10 2012-05-10
US61/645,547 2012-05-10
CN201280057691.8A CN104080811B (zh) 2011-11-04 2012-11-02 在Fc结构域中具有突变的稳定异源二聚的抗体设计

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280057691.8A Division CN104080811B (zh) 2011-11-04 2012-11-02 在Fc结构域中具有突变的稳定异源二聚的抗体设计

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109897103A true CN109897103A (zh) 2019-06-18

Family

ID=48191150

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280057691.8A Active CN104080811B (zh) 2011-11-04 2012-11-02 在Fc结构域中具有突变的稳定异源二聚的抗体设计
CN201811302754.7A Pending CN109897103A (zh) 2011-11-04 2012-11-02 在Fc结构域中具有突变的稳定异源二聚的抗体设计

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280057691.8A Active CN104080811B (zh) 2011-11-04 2012-11-02 在Fc结构域中具有突变的稳定异源二聚的抗体设计

Country Status (20)

Country Link
US (5) US9574010B2 (zh)
EP (1) EP2773671B1 (zh)
JP (1) JP6326371B2 (zh)
KR (1) KR102052774B1 (zh)
CN (2) CN104080811B (zh)
AU (2) AU2012332021B8 (zh)
BR (1) BR112014010580B1 (zh)
CA (1) CA2854233C (zh)
CY (1) CY1124872T1 (zh)
DK (1) DK2773671T3 (zh)
ES (1) ES2899956T3 (zh)
HK (1) HK1200465A1 (zh)
HR (1) HRP20211773T1 (zh)
HU (1) HUE056462T2 (zh)
MX (1) MX358862B (zh)
PL (1) PL2773671T3 (zh)
PT (1) PT2773671T (zh)
RS (1) RS62689B1 (zh)
RU (1) RU2675319C2 (zh)
WO (1) WO2013063702A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021136227A1 (zh) * 2019-12-31 2021-07-08 周易 Ch3 结构域改造诱导形成的异源二聚体及其制备方法和应用

Families Citing this family (240)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101198698B (zh) 2005-03-31 2014-03-19 中外制药株式会社 通过调节多肽缔合制备多肽的方法
CA2647846C (en) 2006-03-31 2016-06-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
EP3345616A1 (en) 2006-03-31 2018-07-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody modification method for purifying bispecific antibody
KR101922788B1 (ko) 2007-09-26 2018-11-27 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항체 정상영역 개변체
CN106519025B (zh) 2007-09-26 2021-04-23 中外制药株式会社 利用cdr的氨基酸取代来改变抗体等电点的方法
EP2409991B1 (en) 2009-03-19 2017-05-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
WO2010107109A1 (ja) 2009-03-19 2010-09-23 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
JP5837821B2 (ja) 2009-09-24 2015-12-24 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
JP5889181B2 (ja) 2010-03-04 2016-03-22 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
AU2011283694B2 (en) 2010-07-29 2017-04-13 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
WO2012058768A1 (en) 2010-11-05 2012-05-10 Zymeworks Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the fc domain
WO2012067176A1 (ja) 2010-11-17 2012-05-24 中外製薬株式会社 血液凝固第viii因子の機能を代替する機能を有する多重特異性抗原結合分子
CA2828811C (en) 2011-03-03 2021-09-21 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs
RU2641256C2 (ru) * 2011-06-30 2018-01-16 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Гетеродимеризованный полипептид
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
KR102398736B1 (ko) 2011-10-31 2022-05-16 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항원 결합 분자
BR112014010580B1 (pt) 2011-11-04 2021-01-12 Zymeworks, Inc. constructo de fc heteromultimérico isolado, composição, uso de um constructo de fc heteromultimérico isolado, composição de ácido nucléico e método para expressar o constructo de fc heteromultimérico isolado
ES2843054T3 (es) * 2012-05-10 2021-07-15 Zymeworks Inc Construcciones heteromultiméricas de cadenas pesadas de inmunoglobulina con mutaciones en el dominio Fc
WO2013187495A1 (ja) 2012-06-14 2013-12-19 中外製薬株式会社 改変されたFc領域を含む抗原結合分子
WO2014004586A1 (en) 2012-06-25 2014-01-03 Zymeworks Inc. Process and methods for efficient manufacturing of highly pure asymmetric antibodies in mammalian cells
WO2014012082A2 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design an constructs
BR112015000798A2 (pt) * 2012-07-13 2017-06-27 Zymeworks Inc heterodímeros assimétricos biespecíficos compreendendo construtos anti-cd3
TWI717591B (zh) 2012-08-24 2021-02-01 日商中外製藥股份有限公司 ＦｃγＲＩＩｂ特異性Ｆｃ區域變異體
CA2886422C (en) 2012-10-03 2022-12-13 Jason Baardsnes Methods of quantitating heavy and light chain polypeptide pairs
EP2914634B1 (en) * 2012-11-02 2017-12-06 Zymeworks Inc. Crystal structures of heterodimeric fc domains
RS58192B1 (sr) 2012-11-21 2019-03-29 Janssen Biotech Inc Bispecifična egfr/c-met antitela
US9914785B2 (en) 2012-11-28 2018-03-13 Zymeworks Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
EP2925785A4 (en) 2012-11-28 2016-11-16 Zymeworks Inc MANIPULATED IMMUNOGLOBULIN HEAVY CHAIN LIGHT CHAIN COUPLES AND USES THEREOF
WO2014104165A1 (ja) 2012-12-27 2014-07-03 中外製薬株式会社 ヘテロ二量化ポリペプチド
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
CA3211863A1 (en) 2013-01-14 2014-07-17 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
CA2897987A1 (en) 2013-01-15 2014-07-24 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
MX365501B (es) * 2013-03-14 2019-06-05 Amgen Inc Eliminacion de ligandos lixiviados de purificacion de afinidad.
EP2970486B1 (en) 2013-03-15 2018-05-16 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
SG11201508170TA (en) 2013-04-02 2015-11-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fc REGION VARIANT
CA2910945A1 (en) 2013-05-08 2014-11-13 Zymeworks Inc. Bispecific her2 and her3 antigen binding constructs
DK3004174T3 (da) * 2013-05-31 2019-07-22 Zymeworks Inc Heteromultimerer med reduceret eller nedreguleret effektorfunktion
KR102441231B1 (ko) 2013-09-27 2022-09-06 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 폴리펩티드 이종 다량체의 제조방법
CN113307873A (zh) 2013-11-11 2021-08-27 中外制药株式会社 含有改变了抗体可变区的抗原结合分子
EP3068892A4 (en) * 2013-11-13 2017-05-31 Zymeworks Inc. Monovalent antigen binding constructs targeting egfr and/or her2 and uses thereof
WO2015077891A1 (en) * 2013-11-27 2015-06-04 Zymeworks Inc. Bispecific antigen-binding constructs targeting her2
CN105873948B (zh) * 2014-01-15 2021-04-13 豪夫迈·罗氏有限公司 具有修饰的FCRN结合性质的Fc区变体
BR112016016114A2 (pt) * 2014-01-15 2018-05-22 Zymeworks Inc Construtos de ligação a antígeno cd19 e cd3 bi- específico.
AU2015213593B2 (en) * 2014-02-10 2020-09-03 Igm Biosciences, Inc. IgA multi-specific binding molecules
HUE048734T2 (hu) 2014-03-28 2020-08-28 Xencor Inc CD38-hoz és CD3-hoz kötõdõ bispecifikus ellenanyagok
DK3126384T3 (da) 2014-04-01 2021-01-18 Adimab Llc Multispecifikke antistofanaloger omfattende en fælles letkæde, og fremgangsmåder til deres fremstilling og anvendelse
WO2015173756A2 (en) * 2014-05-16 2015-11-19 Pfizer Inc. Bispecific antibodies
EA201692476A1 (ru) 2014-05-28 2017-07-31 Займворкс Инк. Модифицированные антигенсвязывающие полипептидные конструкции и их применение
EP3722315A1 (en) 2014-09-05 2020-10-14 Janssen Pharmaceutica NV Cd123 binding agents and uses thereof
CA2959428A1 (en) 2014-09-19 2016-03-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Chimeric antigen receptors
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
MA41019A (fr) 2014-11-26 2021-05-05 Xencor Inc Anticorps hétérodimériques se liant aux antigènes cd3 et cd38
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
JP6696982B2 (ja) 2014-11-26 2020-05-20 ゼンコー・インコーポレイテッドＸｅｎｃｏｒ、 Ｉｎｃ． Ｃｄ３および腫瘍抗原に結合するヘテロ二量体抗体
US20170355779A1 (en) * 2014-11-27 2017-12-14 Zymeworks Inc. Methods of using bispecific antigen-binding constructs targeting her2
WO2016105450A2 (en) 2014-12-22 2016-06-30 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
MA41375A (fr) 2015-01-22 2017-11-28 Lilly Co Eli Anticorps igg bispécifiques et leurs procédés de préparation
US10227411B2 (en) 2015-03-05 2019-03-12 Xencor, Inc. Modulation of T cells with bispecific antibodies and FC fusions
US11142587B2 (en) 2015-04-01 2021-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide hetero-oligomer
BR112017023829A2 (pt) 2015-05-06 2018-07-31 Janssen Biotech Inc agentes de ligação biespecíficos de antígeno de membrana específico da próstata (psma) e usos dos mesmos
CN108137706A (zh) 2015-07-15 2018-06-08 酵活有限公司 药物缀合的双特异性抗原结合构建体
WO2017031104A1 (en) 2015-08-17 2017-02-23 Janssen Pharmaceutica Nv Anti-bcma antibodies, bispecific antigen binding molecules that bind bcma and cd3, and uses thereof
AU2016331819B2 (en) 2015-09-30 2023-08-24 Janssen Biotech, Inc. Agonistic antibodies specifically binding human CD40 and methods of use
RU2018116846A (ru) 2015-10-08 2019-11-08 Займворкс Инк. Антигенсвязывающие полипептидные конструкции, содержащие легкие цепи каппа и лямбда, и их применения
JP2018534933A (ja) 2015-11-02 2018-11-29 ヤンセン ファーマシューティカ エヌ．ベー． 抗ｉｌ１ｒａｐ抗体、ｉｌ１ｒａｐとｃｄ３を結合する二重特異性抗原結合分子、及びその使用
MX2018005550A (es) 2015-11-03 2019-07-18 Janssen Biotech Inc Anticuerpos que se unen especificamente a tim-3 y sus usos.
EP3378487B1 (en) 2015-11-18 2022-03-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Combination therapy using t cell redirection antigen binding molecule against cell having immunosuppressing function
JP6925278B2 (ja) 2015-11-18 2021-08-25 中外製薬株式会社 液性免疫応答の増強方法
JP7058219B2 (ja) 2015-12-07 2022-04-21 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｐｓｍａに結合するヘテロ二量体抗体
CN106883297B (zh) * 2015-12-16 2019-12-13 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 基于ch3结构域的异二聚体分子、其制备方法及用途
EP3398965A4 (en) 2015-12-28 2019-09-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha METHOD FOR PROMOTING THE EFFICACY OF PURIFYING A POLYPEPTIDE CONTAINING AN FC REGION
TW202214700A (zh) 2016-03-14 2022-04-16 日商中外製藥股份有限公司 用於癌之治療的細胞傷害誘導治療劑
EP3433281A1 (en) 2016-03-21 2019-01-30 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific and multifunctional molecules and uses thereof
WO2017201142A1 (en) * 2016-05-17 2017-11-23 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Treatment of lung adenocarcinoma
WO2017210586A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals expressing exogenous terminal deoxynucleotidyltransferase
EP4257613A3 (en) 2016-06-14 2023-12-13 Xencor, Inc. Bispecific checkpoint inhibitor antibodies
RU2019102008A (ru) 2016-06-28 2020-07-28 Ксенкор, Инк. Гетеродимерные антитела, которые связывают рецептор соматостатина 2-го типа
MA45554A (fr) * 2016-07-01 2019-05-08 Resolve Therapeutics Llc Fusions de binucléase optimisées.
TWI781108B (zh) 2016-07-20 2022-10-21 比利時商健生藥品公司 抗ｇｐｒｃ５ｄ抗體、結合ｇｐｒｃ５ｄ與ｃｄ３之雙特異性抗原結合分子及其用途
MA45919A (fr) 2016-08-12 2019-06-19 Janssen Biotech Inc Conception d'anticorps modifiés et d'autres molécules contenant un domaine fc présentant des fonctions d'agonisme et d'effecteur améliorées
US20180044430A1 (en) 2016-08-12 2018-02-15 Janssen Biotech, Inc. FC Engineered Anti-TNFR Superfamily Member Antibodies Having Enhanced Atonistic Activity and Methods of Using Them
JP7048608B2 (ja) 2016-08-15 2022-04-05 チルドレンズ メディカル センター コーポレーション Ａｐｏｍ－ｆｃ融合タンパク質、それとスフィンゴシン１－リン酸（ｓ１ｐ）との複合体、および血管疾患および非血管疾患を処置するための方法
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
CN109790215B (zh) * 2016-09-29 2023-06-30 北京韩美药品有限公司 异源二聚体免疫球蛋白构建体和其制备方法
PE20191033A1 (es) 2016-10-14 2019-08-05 Xencor Inc PROTEINAS DE FUSION FC HETERODIMERICAS IL 15/IL 15R(alfa)
JOP20190097A1 (ar) 2016-10-27 2019-04-28 Janssen Pharmaceutica Nv الجلوبولينات المناعية واستخداماتها
PE20191080A1 (es) * 2016-11-18 2019-08-20 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo biespecifico heterodimerico estructural de anticuerpo natural anti-pd-1/anti-her2 y metodo para preparar el mismo
US11111305B2 (en) 2017-01-09 2021-09-07 Torch Therapeutics Method of using a bispecific antibody to conditionally inhibit a receptor signaling complex
JP7123063B2 (ja) * 2017-02-02 2022-08-22 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 抗体ドメインの好ましい対形成
RU2019128134A (ru) 2017-02-07 2021-03-09 Дайити Санкио Компани, Лимитед Антитело против gprc5d и молекула, содержащая антитело
WO2018151820A1 (en) 2017-02-16 2018-08-23 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof
EP3585813A1 (en) 2017-02-22 2020-01-01 Sutro Biopharma, Inc. Pd-1/tim-3 bi-specific antibodies, compositions thereof, and methods of making and using the same
BR112019015915A2 (pt) 2017-02-28 2020-04-07 Daiichi Sankyo Co Ltd método para o tratamento de câncer de pulmão de células não pequenas resistentes a egfr-tki através da administração do conjugado de anticorpo anti-her3-fármaco
CN110520436A (zh) 2017-03-15 2019-11-29 潘迪恩治疗公司 靶向免疫耐受性
AU2018243104A1 (en) * 2017-04-01 2019-10-17 Beijing Hanmi Pharm. Co., Ltd. Anti-PD-L1/anti-PD-1 natural antibody structure-like heterodimeric bispecific antibody and preparation thereof
JOP20190222A1 (ar) 2017-04-11 2019-09-24 Zymeworks Inc الأجسام المضادة ثنائية النوعية المضادة لـ pd-l1 والمضادة لـ tim-3
JOP20190248A1 (ar) 2017-04-21 2019-10-20 Amgen Inc بروتينات ربط مولد ضد trem2 واستخداماته
EP3630292A2 (en) 2017-05-24 2020-04-08 Sutro Biopharma, Inc. Pd-1/lag3 bi-specific antibodies, compositions thereof, and methods of making and using the same
JP2020521452A (ja) 2017-05-24 2020-07-27 パンディオン・セラピューティクス・インコーポレイテッド 標的化免疫寛容
US20210246227A1 (en) 2017-05-31 2021-08-12 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules that bind to myeloproliferative leukemia (mpl) protein and uses thereof
WO2018226580A2 (en) 2017-06-05 2018-12-13 Janssen Biotech, Inc. Antibodies that specifically bind pd-1 and methods of use
WO2018224951A2 (en) 2017-06-05 2018-12-13 Janssen Biotech, Inc. Engineered multispecific antibodies and other multimeric proteins with asymmetrical ch2-ch3 region mutations
WO2019006472A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Xencor, Inc. TARGETED HETETRODIMERIC FUSION PROTEINS CONTAINING IL-15 / IL-15RA AND ANTIGEN-BINDING DOMAINS
AR112603A1 (es) 2017-07-10 2019-11-20 Lilly Co Eli Anticuerpos biespecíficos inhibidores de punto de control
EP3668536A4 (en) * 2017-08-15 2021-05-26 Kindred Biosciences, Inc. VARIANTS OF IGG FC FOR VETERINARY USE
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
KR20200039778A (ko) 2017-08-22 2020-04-16 사나바이오, 엘엘씨 가용성 인터페론 수용체 및 그의 용도
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
KR20200085828A (ko) 2017-11-08 2020-07-15 젠코어 인코포레이티드 신규의 항-pd-1 서열을 사용한 이중특이적 및 단일특이적 항체
US10323109B2 (en) 2017-11-17 2019-06-18 Chevron Phillips Chemical Company Lp Methods of preparing a catalyst utilizing hydrated reagents
KR20200093639A (ko) * 2017-12-04 2020-08-05 북경한미약품 유한공사 천연 항체 구조-유사 헤테로다이머 형태의 항 pd-l1/항 cd47 이중특이성 항체 및 이의 제조
US10174091B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
MX2020006322A (es) 2017-12-19 2020-09-18 Xencor Inc Proteinas de fusion il-2 fc modificadas.
US11667713B2 (en) 2017-12-28 2023-06-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
WO2019148412A1 (en) 2018-02-01 2019-08-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-pd-1/lag3 bispecific antibodies
WO2019153200A1 (zh) * 2018-02-08 2019-08-15 北京韩美药品有限公司 抗pd-1/抗her2天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备
AU2019218433A1 (en) * 2018-02-11 2020-09-03 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. Anti-PD-1/anti-VEGF natural antibody structure-like heterodimeric form bispecific antibody and preparation thereof
WO2019173911A1 (en) 2018-03-13 2019-09-19 Zymeworks Inc. Anti-her2 biparatopic antibody-drug conjugates and methods of use
WO2019178362A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
EP3765516A2 (en) 2018-03-14 2021-01-20 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules and uses thereof
US20190292263A1 (en) 2018-03-24 2019-09-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified non-human animals for generating therapeutic antibodies against peptide-mhc complexes, methods of making and uses thereof
CA3093850A1 (en) 2018-03-26 2019-10-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized rodents for testing therapeutic agents
CA3096052A1 (en) 2018-04-04 2019-10-10 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
CA3097741A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Xencor, Inc. Tim-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and tim-3 antigen binding domains
CA3097593A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Xencor, Inc. Pd-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and pd-1 antigen binding domains and uses thereof
AU2019270624A1 (en) 2018-05-16 2020-11-26 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating cancers and enhancing efficacy of T cell redirecting therapeutics
MX2020012598A (es) 2018-05-24 2021-05-27 Janssen Biotech Inc Agentes aglutinantes del psma y usos de estos.
US11603405B2 (en) 2018-05-24 2023-03-14 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD3 antibodies and uses thereof
KR20210011999A (ko) 2018-05-24 2021-02-02 얀센 바이오테크 인코포레이티드 단일특이성 및 다중특이성 항-tmeff2 항체 및 이의 용도
JOP20190116A1 (ar) 2018-05-24 2019-11-24 Janssen Biotech Inc الأجسام المضادة لتكتل التمايز 33 (cd33)، والأجسام المضادة ثنائية النوعية لتكتل التمايز 33 (cd33)/تكتل التمايز 3 (cd3) واستخداماتها
EP4023059A1 (en) 2018-06-14 2022-07-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals capable of dh-dh rearrangement in the immunoglobulin heavy chain coding sequences
WO2019244107A1 (en) 2018-06-21 2019-12-26 Daiichi Sankyo Company, Limited Compositions including cd3 antigen binding fragments and uses thereof
EP3818083A2 (en) 2018-07-03 2021-05-12 Elstar Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
BR112021005246A2 (pt) 2018-09-20 2021-06-15 Daiichi Sankyo Company, Limited agente terapêutico, e, método de tratamento para câncer
AU2019355971A1 (en) 2018-10-03 2021-05-06 Xencor, Inc. IL-12 heterodimeric Fc-fusion proteins
JP2022516635A (ja) 2019-01-04 2022-03-01 リゾルブ セラピューティクス， エルエルシー ヌクレアーゼ融合タンパク質によるシェーグレン病の処置
TW202043256A (zh) 2019-01-10 2020-12-01 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
JP2022518208A (ja) 2019-01-15 2022-03-14 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 若年性特発性関節炎の治療のための抗ｔｎｆ抗体、組成物、及び方法
BR112021014267A2 (pt) 2019-01-23 2022-02-15 Janssen Biotech Inc Composições de anticorpo anti-tnf e métodos para o tratamento de artrite psoriática
CA3130754A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
WO2020172598A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cells and uses thereof to treat autoimmune disorders
GB2599229A (en) 2019-02-21 2022-03-30 Marengo Therapeutics Inc Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
JP2022521937A (ja) 2019-02-21 2022-04-13 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド ＮＫｐ３０に結合する抗体分子およびその使用
WO2020172596A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Elstar Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and thereof
SG11202108311RA (en) 2019-02-26 2021-09-29 Janssen Biotech Inc Combination therapies and patient stratification with bispecific anti-egfr/c-met antibodies
MX2021010390A (es) 2019-03-01 2021-11-17 Xencor Inc Anticuerpos heterodimericos que se unen a enpp3 y cd3.
EP3937977A2 (en) 2019-03-11 2022-01-19 Janssen Biotech, Inc. Anti-v beta17 /anti-cd123 bispecific antibodies
WO2020183269A1 (en) 2019-03-14 2020-09-17 Janssen Biotech, Inc. Manufacturing methods for producing anti-tnf antibody compositions
CA3133388A1 (en) 2019-03-14 2020-09-17 Janssen Biotech, Inc. Methods for producing anti-tnf antibody compositions
JP2022526881A (ja) 2019-03-14 2022-05-27 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗ｔｎｆ抗体組成物を産生するための方法
CN113825765A (zh) 2019-03-14 2021-12-21 詹森生物科技公司 用于制备抗il12/il23抗体组合物的制造方法
CA3139508A1 (en) 2019-05-08 2020-11-12 Janssen Biotech, Inc. Materials and methods for modulating t cell mediated immunity
TWI759742B (zh) * 2019-05-14 2022-04-01 南韓商普羅根有限公司 新穎的經修飾之免疫球蛋白Ｆｃ融合蛋白及其用途
JOP20210304A1 (ar) 2019-05-14 2023-01-30 Janssen Biotech Inc علاجات مركبة باستخدام الأجسام المضادة ثنائية النوعية المضادة لمستقبل عامل نمو البشرة (EGFR)/ مستقبل عامل نمو خلايا الكبد (c-Met) ومثبطات كيناز التيروسين الخاصة بمستقبل عامل نمو البشرة (EGFR) من الجيل الثالث
WO2020232247A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 Provention Bio, Inc. Methods and compositions for preventing type 1 diabetes
BR112021023345A2 (pt) 2019-05-20 2022-02-01 Pandion Operations Inc Imunotolerância com alvo em madcam
EP3976648A1 (en) 2019-06-03 2022-04-06 Janssen Biotech, Inc. Anti-tnf antibody compositions, and methods for the treatment of psoriatic arthritis
BR112021023735A2 (pt) 2019-06-05 2022-01-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molécula de ligação de sítio de clivagem de anti-corpo
CA3139250A1 (en) 2019-07-10 2021-01-14 Naoki Kimura Claudin-6 binding molecules and uses thereof
KR20220034206A (ko) 2019-07-12 2022-03-17 얀센 파마슈티카 엔.브이. 결합제 및 이의 용도
TW202118788A (zh) 2019-07-26 2021-05-16 美商健生生物科技公司 包含血管舒緩素相關肽酶2抗原結合域之蛋白質及其用途
AU2020328049A1 (en) 2019-08-15 2022-02-17 Janssen Biotech, Inc. Materials and methods for improved single chain variable fragments
CN110634533B (zh) * 2019-08-27 2022-08-16 中山大学 一种基于计算机模拟获取可调控的trpv5变异体的方法
CA3151574A1 (en) * 2019-09-27 2021-04-01 Dhan Sidhartha CHAND Heterodimeric proteins
JP2023506750A (ja) 2019-12-11 2023-02-20 シラグ・ゲーエムベーハー・インターナショナル Ｌｔｂｒ及びｅｄｂ結合ドメインを含む多重特異性結合分子並びにその使用
WO2021138407A2 (en) 2020-01-03 2021-07-08 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to cd33 and uses thereof
US20230348624A1 (en) 2020-01-30 2023-11-02 Umoja Biopharma, Inc. Bispecific transduction enhancer
TW202144388A (zh) 2020-02-14 2021-12-01 美商健生生物科技公司 在卵巢癌中表現之新抗原及其用途
TW202144389A (zh) 2020-02-14 2021-12-01 美商健生生物科技公司 在多發性骨髓瘤中表現之新抗原及其用途
IL302347A (en) 2020-03-13 2023-06-01 Janssen Biotech Inc Materials and methods for binding SIGLEC-3/CD33
AU2021246385A1 (en) 2020-03-30 2022-12-08 Daiichi Sankyo Company, Limited Bispecific antibody
IL296802A (en) 2020-03-31 2022-11-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd A method for the production of multispecific antigen binding molecules
EP4136121A1 (en) 2020-04-16 2023-02-22 Janssen Biotech, Inc. Systems, materials, and methods for reversed-phase high performance liquid chromatography (rp-hplc) for monitoring formation of multi-specific molecules
CN111601240B (zh) * 2020-04-21 2021-06-15 上海因势智能科技有限公司 基于移动终端和基站进行人群轨迹计算的方法
GB202005879D0 (en) * 2020-04-22 2020-06-03 Petmedix Ltd Heterodimeric proteins
AU2021261420A1 (en) 2020-04-24 2022-12-01 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to T cell related cancer cells and uses thereof
CA3180173A1 (en) 2020-04-30 2021-11-04 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating cytokine-related adverse events
CA3182697A1 (en) 2020-05-11 2021-11-18 Janssen Biotech, Inc. Methods for treating multiple myeloma
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
CA3184189A1 (en) 2020-05-27 2021-12-02 Janssen Biotech, Inc. Proteins comprising cd3 antigen binding domains and uses thereof
EP4171614A1 (en) 2020-06-29 2023-05-03 Resolve Therapeutics, LLC Treatment of sjogren's syndrome with nuclease fusion proteins
US11827708B2 (en) 2020-07-29 2023-11-28 Janssen Biotech, Inc. Proteins comprising HLA-G antigen binding domains and their uses
AU2021317974A1 (en) 2020-07-31 2023-03-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical Composition comprising Cell Expressing Chimeric Receptor
MX2023001962A (es) 2020-08-19 2023-04-26 Xencor Inc Composiciones anti-cd28.
AU2021333779A1 (en) 2020-08-26 2023-04-13 Marengo Therapeutics, Inc. Methods of detecting TRBC1 or TRBC2
WO2022046920A2 (en) 2020-08-26 2022-03-03 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
WO2022046922A2 (en) 2020-08-26 2022-03-03 Marengo Therapeutics, Inc. Antibody molecules that bind to nkp30 and uses thereof
US20220090060A1 (en) 2020-09-11 2022-03-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Identification and production of antigen-specific antibodies
EP4228693A1 (en) 2020-10-13 2023-08-23 Janssen Biotech, Inc. Bioengineered t cell mediated immunity, materials and other methods for modulating cluster of differentiation iv &/or viii
KR20230110523A (ko) 2020-10-22 2023-07-24 얀센 바이오테크 인코포레이티드 델타-유사 리간드 3(dll3) 항원 결합 영역을 포함하는 단백질 및 그의 용도
AU2021392318A1 (en) * 2020-12-03 2023-07-20 Zymeworks Bc Inc. Heterodimeric iga fc constructs and methods of use thereof
WO2022140797A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Immunowake Inc. Immunocytokines and uses thereof
AU2021410655A1 (en) 2020-12-23 2023-06-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acids encoding anchor modified antibodies and uses thereof
TWI825544B (zh) * 2020-12-31 2023-12-11 大陸商信達生物製藥（蘇州）有限公司 含異二聚體抗體Ｆｃ的蛋白以及其製備方法
AU2022214491A1 (en) 2021-01-28 2023-09-14 Janssen Biotech, Inc. Psma binding proteins and uses thereof
BR112023016121A2 (pt) 2021-02-16 2023-11-28 Janssen Pharmaceutica Nv Anticorpo triespecífico que direciona bcma, gprc5d e cd3
US11639396B2 (en) 2021-02-16 2023-05-02 Janssen Biotech, Inc. Antibody binding to a linker peptide
CA3212665A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
KR20230156094A (ko) 2021-03-09 2023-11-13 얀센 바이오테크 인코포레이티드 Egfr-활성화 돌연변이가 결여된 암의 치료
US11859012B2 (en) 2021-03-10 2024-01-02 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and GPC3
CN117377694A (zh) 2021-03-24 2024-01-09 詹森生物科技公司 包含cd3抗原结合结构域的蛋白质及其用途
AU2022244453A1 (en) 2021-03-24 2023-11-09 Janssen Biotech, Inc. Antibody targeting cd22 and cd79b
AU2022244114A1 (en) 2021-03-24 2023-11-09 Janssen Biotech, Inc. TRISPECIFIC ANTIBODY TARGETING CD79b, CD20, AND CD3
BR112023019205A2 (pt) 2021-03-26 2023-10-24 Janssen Biotech Inc Anticorpos humanizados contra tau de filamento helicoidal pareado e usos dos mesmos
IL305818A (en) 2021-03-29 2023-11-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Multispecific stable compound and its use
EP4320147A2 (en) 2021-04-08 2024-02-14 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules binding to tcr and uses thereof
TW202309094A (zh) 2021-05-18 2023-03-01 美商健生生物科技公司 用於識別癌症患者以進行組合治療之方法
AU2022306973A1 (en) 2021-07-09 2024-02-22 Janssen Biotech, Inc. Manufacturing methods for producing anti-il12/il23 antibody compositions
KR20240032991A (ko) 2021-07-09 2024-03-12 얀센 바이오테크 인코포레이티드 항-tnf 항체 조성물의 생성을 위한 제조 방법
KR20240034218A (ko) 2021-07-09 2024-03-13 얀센 바이오테크 인코포레이티드 항-tnf 항체 조성물을 생산하기 위한 제조 방법
WO2023004425A2 (en) * 2021-07-23 2023-01-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Cd3-expressing natural killer cells with enhanced function for adoptive immunotherapy
WO2023037333A1 (en) 2021-09-13 2023-03-16 Janssen Biotech, Inc CD33 X Vδ2 MULTISPECIFIC ANTIBODIES FOR THE TREATMENT OF CANCER
WO2023046322A1 (en) 2021-09-24 2023-03-30 Janssen Pharmaceutica Nv Proteins comprising cd20 binding domains, and uses thereof
WO2023077155A1 (en) 2021-11-01 2023-05-04 Janssen Biotech, Inc. Compositions and methods for the modulation of beta chain-mediated immunity
WO2023086772A1 (en) 2021-11-12 2023-05-19 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind to b7h3 and nkg2d
WO2023089587A1 (en) 2021-11-22 2023-05-25 Janssen Biotech, Inc. Compositions comprising enhanced multispecific binding agents for an immune response
US20230183360A1 (en) 2021-12-09 2023-06-15 Janssen Biotech, Inc. Use of Amivantamab to Treat Colorectal Cancer
US20230227545A1 (en) 2022-01-07 2023-07-20 Johnson & Johnson Enterprise Innovation Inc. Materials and methods of il-1beta binding proteins
US20230295348A1 (en) 2022-01-24 2023-09-21 Novimmune Sa Composition and methods for the selective activation of cytokine signaling pathways
TW202342057A (zh) 2022-02-07 2023-11-01 美商健生生物科技公司 用於減少用ｅｇｆｒ／ｍｅｔ雙特異性抗體治療之患者的輸注相關反應之方法
US20240002544A1 (en) 2022-03-07 2024-01-04 Novimmune Sa Cd28 bispecific antibodies for targeted t cell activation
WO2023170295A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 Janssen Pharmaceutica Nv Multispecific antibodies and uses thereof
WO2023170290A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 Janssen Pharmaceutica Nv Multispecific antibodies and uses thereof
WO2023170291A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 Janssen Pharmaceutica Nv Multispecific antibodies and uses thereof
US20230287146A1 (en) 2022-03-14 2023-09-14 LamKap Bio gamma AG BISPECIFIC GPC3xCD28 AND GPC3xCD3 ANTIBODIES AND THEIR COMBINATION FOR TARGETED KILLING OF GPC3 POSITIVE MALIGNANT CELLS
TW202346337A (zh) 2022-03-29 2023-12-01 美商恩格姆生物製藥公司 Ilt3及cd3結合劑以及其使用方法
WO2023227641A1 (en) 2022-05-27 2023-11-30 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Use of tnf-alpha binding proteins and il-7 binding proteins in medical treatment
WO2024003837A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Janssen Biotech, Inc. Use of anti-egfr/anti-met antibody to treat gastric or esophageal cancer
WO2024028732A1 (en) 2022-08-05 2024-02-08 Janssen Biotech, Inc. Cd98 binding constructs for treating brain tumors
WO2024028731A1 (en) 2022-08-05 2024-02-08 Janssen Biotech, Inc. Transferrin receptor binding proteins for treating brain tumors

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1176659A (zh) * 1995-03-01 1998-03-18 基因技术股份有限公司 制备异多聚体多肽的方法
WO2011028952A1 (en) * 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens

Family Cites Families (191)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4347935A (en) 1979-05-16 1982-09-07 The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy Method and apparatus for electrostatically sorting biological cells
US4714681A (en) 1981-07-01 1987-12-22 The Board Of Reagents, The University Of Texas System Cancer Center Quadroma cells and trioma cells and methods for the production of same
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
JP2532858B2 (ja) 1985-04-01 1996-09-11 セルテツク リミテツド 形質転換したミエロ―マ細胞系
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4880935A (en) 1986-07-11 1989-11-14 Icrf (Patents) Limited Heterobifunctional linking agents derived from N-succinimido-dithio-alpha methyl-methylene-benzoates
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
IL106992A (en) 1988-02-11 1994-06-24 Bristol Myers Squibb Co Noble hydrazonic history of anthracycline and methods for their preparation
US4925648A (en) 1988-07-29 1990-05-15 Immunomedics, Inc. Detection and treatment of infectious and inflammatory lesions
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
KR900005995A (ko) 1988-10-31 1990-05-07 우메모또 요시마사 변형 인터류킨-2 및 그의 제조방법
WO1990005144A1 (en) 1988-11-11 1990-05-17 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
AU641673B2 (en) 1989-06-29 1993-09-30 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
US5112946A (en) 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
FR2650598B1 (fr) 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
WO1991006570A1 (en) 1989-10-25 1991-05-16 The University Of Melbourne HYBRID Fc RECEPTOR MOLECULES
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
FI85768C (fi) 1990-07-04 1992-05-25 Valtion Teknillinen Foerfarande foer utfoerning av ytplasmonresonansmaetning samt i foerfarandet anvaendbar givare.
EP0553244B8 (en) 1990-10-05 2005-06-08 Celldex Therapeutics, Inc. Targeted immunostimulation with bispecific reagents
AU8727291A (en) 1990-10-29 1992-06-11 Cetus Oncology Corporation Bispecific antibodies, method of production, and uses thereof
DE69123241T2 (de) 1990-12-14 1997-04-17 Cell Genesys Inc Chimärische ketten zur transduktion von rezeptorverbundenen signalwegen
HUT66753A (en) 1991-04-26 1994-12-28 Surface Active Ltd Novel antibodies and methods for their use
EP0586505A1 (en) 1991-05-14 1994-03-16 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
DE69110032T2 (de) 1991-06-08 1995-12-21 Hewlett Packard Gmbh Verfahren und Gerät zur Feststellung und/oder Konzentrationsbestimmung von Biomolekülen.
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
FR2686901A1 (fr) 1992-01-31 1993-08-06 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides antithrombotiques, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
AU3737893A (en) 1992-03-05 1993-10-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Diagnostic and/or therapeutic agents, targeted to neovascular endothelial cells
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
AU668423B2 (en) 1992-08-17 1996-05-02 Genentech Inc. Bispecific immunoadhesins
EP0749475A4 (en) 1992-08-26 1997-05-07 Harvard College USE OF THE CYTOKIN IP-10 AS AN ANTI-TUMOR AGENCY
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US5885573A (en) 1993-06-01 1999-03-23 Arch Development Corporation Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
US5464581A (en) 1993-08-02 1995-11-07 The Regents Of The University Of California Flow cytometer
US5483469A (en) 1993-08-02 1996-01-09 The Regents Of The University Of California Multiple sort flow cytometer
EP0647450A1 (en) 1993-09-09 1995-04-12 BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft Improved prodrugs for enzyme mediated activation
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US6165793A (en) 1996-03-25 2000-12-26 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
AU3382595A (en) 1994-07-29 1996-03-04 Smithkline Beecham Corporation Novel compounds
US5643796A (en) 1994-10-14 1997-07-01 University Of Washington System for sensing droplet formation time delay in a flow cytometer
US5602039A (en) 1994-10-14 1997-02-11 The University Of Washington Flow cytometer jet monitor system
JP2000503639A (ja) 1995-12-22 2000-03-28 ブリストル―マイヤーズ スクイブ カンパニー 分枝ヒドラゾンのリンカー類
WO1997033899A1 (en) 1996-03-14 1997-09-18 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule i
DE69731289D1 (de) 1996-03-18 2004-11-25 Univ Texas Immunglobulinähnliche domäne mit erhöhten halbwertszeiten
KR20030096450A (ko) 1996-03-22 2003-12-31 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 고사 유도 분자 ⅱ
US6096548A (en) 1996-03-25 2000-08-01 Maxygen, Inc. Method for directing evolution of a virus
US6218519B1 (en) 1996-04-12 2001-04-17 Pro-Neuron, Inc. Compounds and methods for the selective treatment of cancer and bacterial infections
EP0961619A4 (en) 1996-09-27 2001-09-26 Bristol Myers Squibb Co HYDROLYSABLE DRUGS FOR THE RELEASE OF ANTI-CANCER DRUGS IN METASTATIC CELLS
US6107540A (en) 1996-10-15 2000-08-22 The Regents Of The University Of California Mice models of human prostate cancer progression
US6759509B1 (en) 1996-11-05 2004-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Branched peptide linkers
GB9623820D0 (en) 1996-11-16 1997-01-08 Secr Defence Surface plasma resonance sensor
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US7951917B1 (en) * 1997-05-02 2011-05-31 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
CA2309541C (en) 1997-11-03 2011-01-11 Human Genome Sciences, Inc. Vegi, an inhibitor of angiogenesis and tumor growth
DE69922159T2 (de) 1998-01-23 2005-12-01 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Mehrzweck-antikörperderivate
US6211477B1 (en) 1998-02-26 2001-04-03 Becton Dickinson And Company Electrostatic deceleration system for flow cytometer
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
EP2180007B2 (en) 1998-04-20 2017-08-30 Roche Glycart AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
DE19923820C2 (de) 1998-05-20 2001-05-10 Graffinity Pharm Design Gmbh SPR-Sensor zur gleichzeitigen Erfassung einer Vielzahl von in fluider Form vorliegenden Proben
CA2333321A1 (en) 1998-05-22 1999-12-02 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Drug complex
US6289286B1 (en) 1998-05-29 2001-09-11 Biacore Ab Surface regeneration of biosensors and characterization of biomolecules associated therewith
HU230769B1 (hu) 1999-01-15 2018-03-28 Genentech Inc. Módosított effektor-funkciójú polipeptid-változatok
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP2264166B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
US6365410B1 (en) 1999-05-19 2002-04-02 Genencor International, Inc. Directed evolution of microorganisms
US6268488B1 (en) 1999-05-25 2001-07-31 Barbas, Iii Carlos F. Prodrug activation using catalytic antibodies
CA2388245C (en) 1999-10-19 2012-01-10 Tatsuya Ogawa The use of serum-free adapted rat cells for producing heterologous polypeptides
US20040052793A1 (en) 2001-02-22 2004-03-18 Carter Paul J. Caspase activivated prodrugs therapy
EP1832599A3 (en) 2000-04-12 2007-11-21 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
CN102311986B (zh) 2000-10-06 2015-08-19 协和发酵麒麟株式会社 产生抗体组合物的细胞
AU2001294175A1 (en) 2000-10-06 2002-04-22 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Method of purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US20040018194A1 (en) 2000-11-28 2004-01-29 Francisco Joseph A. Recombinant anti-CD30 antibodies and uses thereof
DK1355919T3 (da) 2000-12-12 2011-03-14 Medimmune Llc Molekyler med længere halveringstider, sammensætninger og anvendelser deraf
JP2004536786A (ja) 2001-03-02 2004-12-09 メディミューン，インコーポレイテッド インテグリンαｖβ３拮抗薬を他の予防薬もしくは治療薬と組み合わせて投与することによる炎症性疾患または自己免疫疾患の予防または治療方法
EP1243276A1 (en) 2001-03-23 2002-09-25 Franciscus Marinus Hendrikus De Groot Elongated and multiple spacers containing activatible prodrugs
US20060073141A1 (en) 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
PT2279753E (pt) 2001-10-10 2016-01-15 Novo Nordisk As Remodelação e glicoconjugação de péptidos
ITMI20012110A1 (it) 2001-10-12 2003-04-12 Keryos Spa Vettori multi-cistronici utilizzabili in protocolli di trsferimento genico
US20050069549A1 (en) 2002-01-14 2005-03-31 William Herman Targeted ligands
EP1487492A4 (en) 2002-03-04 2008-10-01 Medimmune Inc PREVENTION OR TREATMENT OF CANCER USING INTEGRIN ALPHAVBETA3 ANTAGONISTS COMBINED WITH OTHER AGENTS
US7332580B2 (en) 2002-04-05 2008-02-19 The Regents Of The University Of California Bispecific single chain Fv antibody molecules and methods of use thereof
EP1575514A2 (en) 2002-07-31 2005-09-21 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
CA2499816C (en) 2002-09-27 2013-07-30 Xencor, Inc. Optimized fc variants and methods for their generation
US7960512B2 (en) 2003-01-09 2011-06-14 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
US7461263B2 (en) 2003-01-23 2008-12-02 Unspam, Llc. Method and apparatus for a non-revealing do-not-contact list system
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
WO2004082640A2 (en) 2003-03-19 2004-09-30 New Century Pharmaceuticals, Inc. Human serum albumin conjugates with therapeutic compounds
ES2408582T3 (es) 2003-05-30 2013-06-21 Merus B.V. Biblioteca de Fab para la preparación de una mezcla de anticuerpos
EP1629012B1 (en) 2003-05-31 2018-11-28 Amgen Research (Munich) GmbH Pharmaceutical compositions comprising bispecific anti-cd3, anti-cd19 antibody constructs for the treatment of b-cell related disorders
AU2003264053A1 (en) 2003-08-12 2005-03-10 William M. Yarbrough Treatment for acne vulgaris and method of use
US20050227324A1 (en) 2003-12-19 2005-10-13 Genentech, Inc. Monovalent antibody fragments useful as therapeutics
US20060074225A1 (en) * 2004-09-14 2006-04-06 Xencor, Inc. Monomeric immunoglobulin Fc domains
US7563443B2 (en) 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
US8150634B1 (en) 2004-11-12 2012-04-03 Bristol-Myers Squibb Company Protein-ligand NOE matching for high-throughput structure determination
US20060106905A1 (en) 2004-11-17 2006-05-18 Chren William A Jr Method for reducing memory size in logarithmic number system arithmetic units
WO2006105062A2 (en) 2005-03-29 2006-10-05 Verenium Corporation Altered antibody fc regions and uses thereof
CN101198698B (zh) 2005-03-31 2014-03-19 中外制药株式会社 通过调节多肽缔合制备多肽的方法
EP1945674A2 (en) 2005-11-03 2008-07-23 Genentech, Inc. Therapeutic anti-her2 antibody fusion polypeptides
NZ591252A (en) 2006-03-17 2012-06-29 Biogen Idec Inc Methods of designing antibody or antigen binding fragments thereof with substituted non-covarying amino acids
US20070278170A1 (en) 2006-03-17 2007-12-06 John Wiebe Audio equipment storage device
PT1999154E (pt) 2006-03-24 2013-01-24 Merck Patent Gmbh Domínios proteicos heterodiméricos modificados
EP3345616A1 (en) 2006-03-31 2018-07-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody modification method for purifying bispecific antibody
ES2469676T3 (es) 2006-05-25 2014-06-18 Bayer Intellectual Property Gmbh Complejos moleculares dim�ricos
US7769573B2 (en) 2006-05-26 2010-08-03 Zymeworks Inc. System and method for modeling interactions
US20070274985A1 (en) 2006-05-26 2007-11-29 Stefan Dubel Antibody
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
US7684247B2 (en) 2006-09-29 2010-03-23 Sandisk Corporation Reverse reading in non-volatile memory with compensation for coupling
US20080147360A1 (en) 2006-10-16 2008-06-19 Anthony Peter Fejes System and method for simulating the time-dependent behaviour of atomic and/or molecular systems subject to static or dynamic fields
US8580263B2 (en) 2006-11-21 2013-11-12 The Regents Of The University Of California Anti-EGFR family antibodies, bispecific anti-EGFR family antibodies and methods of use thereof
NZ614857A (en) 2007-03-29 2015-04-24 Genmab As Bispecific antibodies and methods for production thereof
US20080260738A1 (en) 2007-04-18 2008-10-23 Moore Margaret D Single chain fc, methods of making and methods of treatment
CA2588106A1 (en) 2007-05-18 2008-11-18 Nrc - Institute For Biological Sciences Single-domain antibodies and heavy chain antibody against egfr and uses thereof
MX2009012650A (es) 2007-05-24 2010-02-18 Ablynx Nv Secuencias de aminoacido dirigidas contra rank-l y polipeptidos que comprenden lo mismo para el tratamiento de enfermedades y trastornos de huesos.
LT2592148T (lt) 2007-10-12 2018-12-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Baltymų ekspresavimas iš kelių nukleorūgščių
BRPI0819693A2 (pt) 2007-11-30 2020-08-18 Glaxo Group Limited Construção de ligação de antígeno, método para tratar um paciente que sofre de câncer ou uma doença inflamatória, sequência de polinucleotídeo, polinucleotídeo, célula hospedeira transformada ou transfectada recombinante, método para produziruma construção de ligação de antígeno, e, composição farmacêutica
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8592562B2 (en) 2008-01-07 2013-11-26 Amgen Inc. Method for making antibody Fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
US9175078B2 (en) 2008-01-25 2015-11-03 Amgen Inc. Ferroportin antibodies and methods of use
US9404928B2 (en) 2008-02-05 2016-08-02 Zymeworks Inc. Methods for determining correlated residues in a protein or other biopolymer using molecular dynamics
AU2009299794B2 (en) 2008-10-01 2015-08-13 Amgen Research (Munich) Gmbh Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody
JP5677972B2 (ja) 2008-11-18 2015-02-25 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド ヒト血清アルブミンリンカーおよびそのコンジュゲート
US8775090B2 (en) 2008-12-12 2014-07-08 Medimmune, Llc Crystals and structure of a human IgG Fc variant with enhanced FcRn binding
JP2012515556A (ja) * 2009-01-23 2012-07-12 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 低下したエフェクタ機能を有する安定化Ｆｃポリペプチドおよび使用方法
AU2010230563A1 (en) 2009-04-02 2011-09-22 Roche Glycart Ag Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain Fab fragments
BRPI1014449A2 (pt) 2009-04-07 2017-06-27 Roche Glycart Ag anticorpos biespecíficos anti-erbb-2/ anti-c-met.
CA2757897A1 (en) 2009-04-08 2010-10-14 Anna M. Wu Human protein scaffold with controlled serum pharmacokinetics
CN102448985B (zh) 2009-05-27 2015-08-05 霍夫曼-拉罗奇有限公司 三或四特异性抗体
US8703132B2 (en) 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
KR101904065B1 (ko) 2009-06-26 2018-10-04 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 천연 면역글로불린 포맷을 가지는 용이하게 분리된 이중특이성 항체
EP2451840B1 (en) * 2009-07-08 2018-12-26 Amgen Inc. Design of stable and aggregation free antibody fc molecules through ch3 domain interface engineering
US9345661B2 (en) 2009-07-31 2016-05-24 Genentech, Inc. Subcutaneous anti-HER2 antibody formulations and uses thereof
EP2496598B1 (en) 2009-11-04 2017-08-02 Affibody AB Her3 binding polypeptides
MX340971B (es) 2009-11-23 2016-08-02 Amgen Inc * Fragmento cristalizable (fc) de anticuerpo monomerico.
CA2782465C (en) 2009-12-02 2018-03-20 Zymeworks Inc. Combined on-lattice/off-lattice optimization method for rigid body docking
AR080793A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos
AU2011235569B2 (en) 2010-03-29 2016-06-30 Zymeworks Bc Inc. Antibodies with enhanced or suppressed effector function
CN102946906B (zh) 2010-04-23 2015-07-15 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 生产异源多聚体蛋白质
US9527926B2 (en) 2010-05-14 2016-12-27 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
EP2575880B1 (en) 2010-05-27 2019-01-16 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2 epitope
EA201291482A1 (ru) 2010-07-09 2013-10-30 Байоджен Айдек Хемофилия Инк. Химерные факторы коагуляции
US20120054115A1 (en) 2010-08-31 2012-03-01 Baird-Smith Anselm P Social network supporting management of posts to followers
JP5937077B2 (ja) 2010-09-24 2016-06-22 ザイムワークス，インコーポレイテッド 分子パッキング計算システム
AU2011308042B2 (en) 2010-09-30 2015-07-16 Zymeworks Inc. Simplifying residue relationships in protein design
WO2012058768A1 (en) * 2010-11-05 2012-05-10 Zymeworks Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the fc domain
CA2828811C (en) 2011-03-03 2021-09-21 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs
CA2832387A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Genmab A/S Bispecifc antibodies against her2
RU2641256C2 (ru) 2011-06-30 2018-01-16 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Гетеродимеризованный полипептид
DK2748201T3 (en) 2011-08-23 2018-02-12 Roche Glycart Ag BISPECIFIC T-CELL ACTIVATING ANTIGIN BINDING MOLECULES
EP3674320A3 (en) 2011-10-27 2020-08-12 Genmab A/S Production of heterodimeric proteins
BR112014010580B1 (pt) 2011-11-04 2021-01-12 Zymeworks, Inc. constructo de fc heteromultimérico isolado, composição, uso de um constructo de fc heteromultimérico isolado, composição de ácido nucléico e método para expressar o constructo de fc heteromultimérico isolado
AU2012355415B2 (en) 2011-12-20 2017-07-06 Medimmune, Llc Modified polypeptides for bispecific antibody scaffolds
EP2828779B1 (en) 2012-03-21 2019-05-08 Zymeworks Inc. Systems and methods for making two dimensional graphs of macromolecules
KR20150008171A (ko) 2012-05-10 2015-01-21 자임워크스 인코포레이티드 단일군 일가 항체 구조물 및 그의 용도
ES2843054T3 (es) 2012-05-10 2021-07-15 Zymeworks Inc Construcciones heteromultiméricas de cadenas pesadas de inmunoglobulina con mutaciones en el dominio Fc
US11031093B2 (en) 2012-06-21 2021-06-08 Zymeworks Inc. Systems and methods for identifying thermodynamically relevant polymer conformations
WO2014004586A1 (en) 2012-06-25 2014-01-03 Zymeworks Inc. Process and methods for efficient manufacturing of highly pure asymmetric antibodies in mammalian cells
BR112015000798A2 (pt) 2012-07-13 2017-06-27 Zymeworks Inc heterodímeros assimétricos biespecíficos compreendendo construtos anti-cd3
WO2014012082A2 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design an constructs
IN2015DN01299A (zh) 2012-07-23 2015-07-03 Zymeworks Inc
WO2014026296A1 (en) 2012-08-17 2014-02-20 Zymeworks Inc. Systems and methods for sampling and analysis of polymer conformational dynamics
CA2886422C (en) 2012-10-03 2022-12-13 Jason Baardsnes Methods of quantitating heavy and light chain polypeptide pairs
EP2914634B1 (en) 2012-11-02 2017-12-06 Zymeworks Inc. Crystal structures of heterodimeric fc domains
JP6571527B2 (ja) 2012-11-21 2019-09-04 ウーハン ワイゼットワイ バイオファルマ カンパニー リミテッドＷｕｈａｎ Ｙｚｙ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． 二重特異性抗体
EP2925785A4 (en) 2012-11-28 2016-11-16 Zymeworks Inc MANIPULATED IMMUNOGLOBULIN HEAVY CHAIN LIGHT CHAIN COUPLES AND USES THEREOF
US9914785B2 (en) 2012-11-28 2018-03-13 Zymeworks Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
CA2910945A1 (en) 2013-05-08 2014-11-13 Zymeworks Inc. Bispecific her2 and her3 antigen binding constructs
CA2913363A1 (en) 2013-05-24 2014-11-27 Zymeworks Inc. Modular protein drug conjugate therapeutic
EP3019622A4 (en) 2013-07-12 2017-06-14 Zymeworks Inc. Bispecific cd3 and cd19 antigen binding contructs
EP3068430A4 (en) 2013-11-13 2017-07-05 Zymeworks Inc. Methods using monovalent antigen binding constructs targeting her2
WO2015077891A1 (en) 2013-11-27 2015-06-04 Zymeworks Inc. Bispecific antigen-binding constructs targeting her2
EA201692476A1 (ru) 2014-05-28 2017-07-31 Займворкс Инк. Модифицированные антигенсвязывающие полипептидные конструкции и их применение
CN105596361A (zh) 2015-09-30 2016-05-25 王松灵 硝酸盐防治骨质疏松的新用途
US11392902B2 (en) 2017-06-06 2022-07-19 United Parcel Service Of America, Inc. Systems, methods, apparatuses and computer program products for providing notification of items for pickup and delivery

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1176659A (zh) * 1995-03-01 1998-03-18 基因技术股份有限公司 制备异多聚体多肽的方法
WO2011028952A1 (en) * 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MERCHANT A M等: "An efficient route to human bispecific IgG", 《NATURE BIOTECHNOLOGY》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021136227A1 (zh) * 2019-12-31 2021-07-08 周易 Ch3 结构域改造诱导形成的异源二聚体及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
BR112014010580A2 (pt) 2017-05-02
BR112014010580B1 (pt) 2021-01-12
WO2013063702A1 (en) 2013-05-10
MX2014005348A (es) 2014-11-12
US9732155B2 (en) 2017-08-15
AU2017245451B2 (en) 2019-08-22
RU2675319C2 (ru) 2018-12-18
US20200087414A1 (en) 2020-03-19
CY1124872T1 (el) 2022-11-25
AU2012332021A1 (en) 2014-06-19
CN104080811B (zh) 2019-09-27
US10457742B2 (en) 2019-10-29
JP6326371B2 (ja) 2018-05-16
AU2017245451B9 (en) 2019-08-29
US9988460B2 (en) 2018-06-05
CA2854233C (en) 2020-05-12
RS62689B1 (sr) 2021-12-31
AU2017245451A1 (en) 2017-11-02
ES2899956T3 (es) 2022-03-15
EP2773671A1 (en) 2014-09-10
US20150284470A1 (en) 2015-10-08
US20130195849A1 (en) 2013-08-01
KR102052774B1 (ko) 2019-12-04
DK2773671T3 (da) 2021-11-15
AU2012332021A8 (en) 2017-10-12
PL2773671T3 (pl) 2022-01-24
AU2012332021B8 (en) 2017-10-12
KR20140092370A (ko) 2014-07-23
RU2018142832A (ru) 2019-03-21
EP2773671A4 (en) 2015-06-03
CA2854233A1 (en) 2013-05-10
HK1200465A1 (zh) 2015-08-07
EP2773671B1 (en) 2021-09-15
PT2773671T (pt) 2021-12-14
US20180016347A1 (en) 2018-01-18
RU2014121832A (ru) 2015-12-10
HUE056462T2 (hu) 2022-02-28
AU2012332021B2 (en) 2017-07-20
US20180030150A1 (en) 2018-02-01
US9574010B2 (en) 2017-02-21
MX358862B (es) 2018-09-06
JP2014533243A (ja) 2014-12-11
HRP20211773T1 (hr) 2022-03-04
CN104080811A (zh) 2014-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104080811B (zh) 在Fc结构域中具有突变的稳定异源二聚的抗体设计
CN103429620B (zh) 在Fc结构域中具有突变的稳定异源二聚的抗体设计
US20220251242A1 (en) Modified antigen binding polypeptide constructs and uses thereof
JP6351572B2 (ja) Ｆｃドメインに突然変異を有する免疫グロブリン重鎖のヘテロ多量体構築物
CN106661121A (zh) 经修饰的抗原结合多肽构建体及其用途
RU2810540C2 (ru) РАЗРАБОТКА СТАБИЛЬНОГО ГЕТЕРОДИМЕРНОГО АНТИТЕЛА С МУТАЦИЯМИ В ДОМЕНЕ Fc

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: British Columbia

Applicant after: Yeast Biopharmaceutical Co.,Ltd.

Address before: British Columbia

Applicant before: ZYMEWORKS Inc.

CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: British Columbia

Applicant after: Enzymatic British Columbia Ltd.

Address before: British Columbia

Applicant before: Yeast Biopharmaceutical Co.,Ltd.