TWI759742B - 新穎的經修飾之免疫球蛋白Ｆｃ融合蛋白及其用途 - Google Patents

新穎的經修飾之免疫球蛋白Ｆｃ融合蛋白及其用途 Download PDF

Info

Publication number
TWI759742B
TWI759742B TW109116084A TW109116084A TWI759742B TW I759742 B TWI759742 B TW I759742B TW 109116084 A TW109116084 A TW 109116084A TW 109116084 A TW109116084 A TW 109116084A TW I759742 B TWI759742 B TW I759742B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
protein
fusion protein
seq
domain
ntig
Prior art date
Application number
TW109116084A
Other languages
English (en)
Other versions
TW202100564A (zh
Inventor
陳炫卓
南銀珠
延濟仁
Original Assignee
南韓商普羅根有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 南韓商普羅根有限公司 filed Critical 南韓商普羅根有限公司
Publication of TW202100564A publication Critical patent/TW202100564A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI759742B publication Critical patent/TWI759742B/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5428—IL-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5437—IL-13
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Abstract

本發明係關於一種新穎免疫球蛋白Fc域突變蛋白及其用途，且當以與另一生物活性蛋白之融合蛋白形式表現時，根據本發明之一個實施例的免疫球蛋白Fc域突變蛋白可延長該生物活性蛋白之活體內半衰期以及有效地抑制諸如ADCC或CDC之效應功能以最小化出人意料的副作用。

Description

新穎的經修飾之免疫球蛋白Fc融合蛋白及其用途 相關申請案之交叉參考
本申請案根據保護工業產權巴黎公約主張2019年5月14日申請之美國專利申請案第62/847,470號之優先權，其內容以全文引用之方式併入。
本發明係有關於新穎的經修飾之免疫球蛋白Fc融合蛋白及其用途。
發明背景
本發明係關於新穎的經修飾之免疫球蛋白Fc融合蛋白及其用途，且更特定言之係關於具有增加之半衰期且能夠最小化副作用，諸如ADCC及CDC(其可由抗體Fc片段引起)之新穎的經修飾之免疫球蛋白Fc融合蛋白；及其用途。
免疫球蛋白(抗體)Fc域廣泛用作各種治療及診斷蛋白之載體蛋白。抗體包括二個功能獨立部分，亦即結合至抗原且稱為「Fab」之可變域，及與諸如補體活化之效應功能相關且被吞噬細胞攻擊且稱為「Fc」之恆定域。Fc具有長血清半衰期，且Fab具有短壽命(Capon等人，Nature 337：525-531,1989)。在與治療蛋白或肽組合時，Fc域可提供較長半衰期，或整合功能，諸如結合Fc受 體、結合蛋白A、固定補體及轉移胎盤。特定言之，此類Fc域之較長半衰期係由於新生兒Fc受體(在下文中稱為「FcRn」)結合親和力。
迄今為止已開發融合Fc域及生物活性蛋白之許多技術，以提高生物活性蛋白之半衰期。作為其代表性實例，提及依那西普(etanercept，商品名：Enbrel®)，其為其中TNFα受體2連接至IgG1抗體之Fc域的融合蛋白(美國專利第5,447,851號)。除了該實例以外，亦存在一些與IgG抗體之Fc域融合的細胞介素及生長激素。
然而，不同於細胞表面受體與細胞外域之融合，水溶性蛋白與IgG之融合使得生物活性相比於非融合細胞介素或生長因子降低。嵌合蛋白以二聚體形式存在，且由於存在二個彼此接近之活性蛋白而在結合至諸如受體之目標分子中造成位阻。因此，有必要克服此類問題以產生有效Fc融合蛋白。
Fc融合技術之另一限制為非預期的免疫反應。免疫球蛋白之Fc域亦具有效應功能，諸如抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)。特定言之，四種人類IgG同功異型物以不同親和力結合至活化Fcγ受體(FcγR，包括FcγRI、FcγRIIa及FcγRIIIa)、抑制性FcγRIIb受體及補體第一因子(C1q)，以產生極不同的效應功能(Bruhns,P.等人，Blood 113(16)：3716-3725,2009)。IgG與FcγR或C1q之結合視位於鉸鏈區及CH2域中之殘基而定。然而，當向個體活體內投與融合至Fc域之治療蛋白時，Fc域之效應功能引起個體之細胞凋亡、細胞介素分泌或發炎，且因此必需抑制效應功能以減少非所需反應，除非為絕對需要的。
為了解決以上鑑別之問題，已開發出一些經修飾之Fc域蛋白，包括以下各者中所述之彼等：US2006/0074225A1；Armour,K.L.等人(Eur.J.Immunol.,29(8)：2613-2624,1999)；Shields,R.L.等人(J.Biol.Chem.276(9)：6591-6604,2001)；及Idusogie,EE.等人(J.Immunol.164(8)：4178-4184,2000)。
另外，儘管半衰期得以改良，但仍需要進一步改良融合至Fc域之治療蛋白的半衰期。
發明概要
然而，上述先前技術具有未實現令人滿意的延長水準之半衰期或具有其他副作用之缺點。
因此，本發明欲解決上述各種問題，且本發明之一個目標為提供新穎的經修飾之Fc域蛋白，其不影響生物活性蛋白之生產及活性，而在無效應功能，諸如ADCC及CDC之情況下融合的治療蛋白展現較長半衰期。然而，此類目標為例示性的且不限制本發明之範疇。
根據本發明之一態樣，提供免疫球蛋白Fc域突變蛋白，其中包括選自由SEQ ID NO：1至4組成之群的胺基酸序列之經修飾之IgG4 Fc域蛋白之第18及第196胺基酸係突變成其他胺基酸。
根據本發明之另一態樣，提供融合蛋白，其中至少一個生物活性蛋白(API，活性醫藥成分)連接至免疫球蛋白Fc域突變蛋白之N端及/或C端。
根據本發明之另一態樣，提供聚核苷酸，其編碼免疫球蛋白Fc域突變蛋白或融合蛋白。
根據本發明之另一態樣，提供含有融合蛋白之均二聚體或雜二聚體。
根據本發明之另一態樣，提供一種組合物，其含有融合蛋白、編碼融合蛋白之聚核苷酸或均二聚體或雜二聚體作為活性成分。
根據本發明之另一態樣，提供一種延長生物活性蛋白之活體內半衰期之方法，該方法包括向個體投與融合蛋白或含有融合蛋白之均二聚體或雜二聚體之步驟，該融合蛋白藉由將生物活性蛋白融合至免疫球蛋白Fc域突變蛋 白而獲得。
藉由融合至另一生物活性蛋白，根據本發明之一個例示性實施例之免疫球蛋白Fc域突變蛋白可增加生物活性蛋白之半衰期且不活化抗體Fc域依賴性效應功能，諸如ADCC及CDC，其為使用基於抗體之蛋白質治療劑時引起之副作用。然而，本發明之效應不限於此。
10,20,30,40:融合蛋白
11:生物活性蛋白，活性醫藥成分
11a:第一生物活性蛋白
11b:第二生物活性蛋白
11c,11d:生物活性蛋白
12:免疫球蛋白Fc域突變蛋白
13:鉸鏈區
14:連接肽
100,200:均二聚體
300,400:雜二聚體
500,600,700,800:均二聚體或雜二聚體
圖1至圖3為展示根據本發明之一個例示性實施例之單特異性融合蛋白之結構的示意圖；圖4為展示根據本發明之一個例示性實施例之雙特異性融合蛋白之結構的示意圖；圖5為展示根據本發明之一個例示性實施例的由雙特異性融合蛋白構成之均二聚體之結構的示意圖；圖6為展示根據本發明之一個例示性實施例之單特異性融合蛋白之均二聚體之結構的示意圖；圖7為展示根據本發明之一個例示性實施例之二種不同單特異性融合蛋白之雜二聚體之結構的示意圖；圖8為展示由根據本發明之一個例示性實施例之二種不同雙特異性融合蛋白構成之雜二聚體之結構的示意圖；圖9為展示根據本發明之一個例示性實施例之單特異性融合蛋白(其具有IgG1之鉸鏈區及連接肽)之均二聚體之結構的示意圖；圖10為展示根據本發明之一個例示性實施例的由二種不同單特異性融合蛋白構成之雜二聚體之結構的示意圖；圖11為展示根據本發明之一個例示性實施例之單特異性融合蛋白(其在C端處具有生物活性蛋白)之均二聚體之結構的示意圖； 圖12為展示根據本發明之一個例示性實施例的由二種不同雙特異性融合蛋白(其在C端處具有生物活性蛋白)構成之雜二聚體之結構的示意圖；圖13為示意性展示藉由FcRn再循環抗體之過程的示意圖；圖14a為展示SDS-PAGE分析結果之照片，該分析展示根據本發明之一個例示性實施例之融合蛋白(PG-11)的樣品生產結果，且圖14b為展示藉由尺寸排阻高效液相層析(SEC-HPLC)分析生產之PG-11之結果的層析圖；圖15a為展示SDS-PAGE分析結果之照片，該分析展示根據本發明之一個例示性實施例之融合蛋白(PG-22)的樣品生產結果，且圖15b為展示藉由尺寸排阻高效液相層析(SEC-HPLC)分析生產之PG-22之結果的層析圖；圖16a為展示SDS-PAGE分析結果之照片，該分析展示根據本發明之一個例示性實施例之融合蛋白(PG-088)的樣品生產結果，且圖16b為展示藉由尺寸排阻高效液相層析(SEC-HPLC)分析生產之PG-088之結果的層析圖；圖17a為展示SDS-PAGE分析結果之照片，該分析展示根據本發明之一個例示性實施例之融合蛋白(PG-088m)的樣品生產結果，且圖17b為展示藉由尺寸排阻高效液相層析(SEC-HPLC)分析生產之PG-088m之結果的層析圖；圖18a為展示SDS-PAGE分析結果之照片，該分析展示根據本發明之一個例示性實施例之融合蛋白(PG-075)的樣品生產結果，且圖18b為展示使用抗IgG抗體對產生之PG-075進行西方墨點分析之結果的照片；圖19a為展示SDS-PAGE分析結果之照片，該分析展示根據本發明之一個例示性實施例之融合蛋白(PG-110)的樣品生產結果，且圖19b為展示藉由尺寸排阻高效液相層析(SEC-HPLC)分析生產之PG-110之結果的層析圖；圖20a為展示SDS-PAGE分析結果之照片，該分析展示根據本發明之一個例示性實施例之融合蛋白(PG-129)的樣品生產結果，且圖20b為展示藉由尺寸排阻高效液相層析(SEC-HPLC)分析生產之PG-129之結果的層析圖； 圖21a為展示SDS-PAGE分析結果之照片，該分析展示根據本發明之一個例示性實施例之融合蛋白(PG-400)的樣品生產結果，且圖21b為展示藉由尺寸排阻高效液相層析(SEC-HPLC)分析生產之PG-400之結果的層析圖；圖22a為展示SDS-PAGE分析結果之照片，該分析展示根據本發明之一個例示性實施例之融合蛋白(PG-410)的樣品生產結果，且圖22b為展示藉由尺寸排阻高效液相層析(SEC-HPLC)分析生產之PG-410之結果的層析圖；圖23為展示SDS-PAGE分析結果之照片，該分析展示根據本發明之一個例示性實施例之雜二聚體蛋白MG12-4(左側)及MG12-5(右側)的樣品生產結果；圖24a為展示SDS-PAGE分析結果之照片，該分析展示根據本發明之一個例示性實施例之融合蛋白(PG-50-1)的樣品生產結果；圖24b為展示SDS-PAGE分析結果之照片，該分析展示根據本發明之一個例示性實施例之融合蛋白(PG-50-2)的樣品生產結果；圖24c為展示SDS-PAGE分析結果之照片(左側)，該分析展示根據本發明之一個例示性實施例之融合蛋白(PG-073)的樣品生產結果，及展示基於SDS-PAGE分析結果估計之融合蛋白之各種裂解形式之結構的示意圖(右側)；圖24d為展示SDS-PAGE分析結果之照片(上部)，該分析展示根據本發明之一個例示性實施例之融合蛋白(PG-210-5)的樣品生產結果，及展示藉由尺寸排阻高效液相層析(SEC-HPLC)分析生產之PG-210-5之結果的層析圖(下部)；且圖24e為展示SDS-PAGE分析結果之照片(上部)，該分析展示根據本發明之一個例示性實施例之融合蛋白(PG-210-6)的樣品生產結果，及展示藉由尺寸排阻高效液相層析(SEC-HPLC)分析生產之PG-210-6之結果的層析圖(下部)；圖25為展示藉由使用表面電漿子共振(SPR)分析來分析根據本發明之一個例示性實施例製備之融合蛋白(PG-11)與重組人類新生兒Fc受體 (rhFcRn)之結合親和力之結果的一系列圖，且三個圖中之每一者展示獨立測試之結果；圖26為展示相比於使用IgG4 Fc域之Trulicity(下部)之情況，藉由使用表面電漿子共振(SPR)分析來分析根據本發明之一個例示性實施例製備之融合蛋白(PG-11，上部)與重組人類新生兒Fc受體(rhFcRn)之結合親和力之結果的一系列圖，且左側、中間及右側之圖分別展示三個獨立測試之結果；圖27為展示相比於利妥昔單抗(下部)(其為含有IgG1 Fc域之重組人類化抗體)之情況，藉由使用表面電漿子共振(SPR)分析來分析根據本發明之一個例示性實施例製備之融合蛋白(PG-11，上部)與重組人類新生兒Fc受體(rhFcRn)之結合親和力之結果的一系列圖，且左側、中間及右側之圖分別展示三個獨立測試之結果；圖28為展示經由SPR分析，使用rhFcRn作為配位體且使用二種物質作為樣品，對rhFcRn與雙特異性融合蛋白(左側)(其中抗PD-L1 scFv及IL-2蛋白分別連接至根據本發明之一個例示性實施例之NTIG蛋白的N端及C端)及作為對照組之雙特異性融合蛋白(右側)(其中抗PD-L1 scFv及IL-2蛋白分別連接至SEQ ID NO：2之經修飾之IgG4 Fc蛋白的N端及C端)中之每一者之結合親和力之比較性分析之結果的一系列圖；圖29為展示經由SPR分析，使用二種物質作為配位體且使用rhFcRn作為樣品，以與圖28相反的方式對rhFcRn與雙特異性融合蛋白(左側)(其中抗PD-L1 scFv及IL-2蛋白分別連接至根據本發明之一個例示性實施例之NTIG蛋白的N端及C端)及作為對照組之雙特異性融合蛋白(右側)(其中抗PD-L1 scFv及IL-2蛋白分別連接至SEQ ID NO：2之經修飾之IgG4 Fc蛋白的N端及C端)中之每一者之結合親和力之比較性分析之結果的一系列圖；圖30為展示經由BLI分析來分析相比於利妥昔單抗(其為基於 IgG1之人類化抗體)之情況，根據本發明之一個例示性實施例之融合蛋白(PG-11)與Fcγ受體I(FcγR1，左側)或Fcγ受體IIIa(FcγR3a，右側)之結合親和力之結果的一系列圖，且上部、中間及下部之圖分別展示三個獨立測試之結果；圖31為展示經由BLI分析來分析相比於利妥昔單抗(其為基於IgG1之人類化抗體)之情況，根據本發明之一個例示性實施例之融合蛋白(PG-11)與其他各種Fcγ受體(FcγRIIa、FcγIIb及FcγRIIIb)之結合親和力之結果的一系列圖，且PBS係用作對照組；圖32為展示分析相比於利妥昔單抗之情況，根據本發明之一個例示性實施例之融合蛋白(PG-11)與補體C1q之結合親和力之結果的圖；圖33為展示根據本發明之各種例示性實施例之含有GLP-2類似物之融合蛋白(PG-22、PG-201-5、PG-201-6、MG12-4及MG12-5)之GLP-2活性之比較性分析之結果的一系列圖，且上部及下部之二個圖式分別展示二個獨立測試之結果；圖34為展示藉由BLI分析，根據根據本發明之實例2-3之二聚IL-10突變融合蛋白(左側)及實例2-4之單體IL-10突變融合蛋白(右側)之處理濃度來檢查與IL-10R1之親和力之結果的一系列圖；圖35a為展示藉由ELISA分析，根據根據本發明之一個例示性實施例之融合蛋白PG-210-6之濃度來定量分析巨噬細胞中TNF-α之釋放水準的圖；圖35b為展示藉由ELISA分析，根據根據本發明之一個例示性實施例之融合蛋白PG-410之處理濃度來定量分析巨噬細胞中TNF-α之釋放水準的圖；且圖35c為展示藉由ELISA分析，根據根據本發明之一個例示性實施例之融合蛋白PG-110及PG-088m之處理濃度來定量分析巨噬細胞中TNF-α之釋放水準的圖；圖36a為展示藉由BLI分析來分析作為比較實例之FcεRIα修飾之IgG4 Fc(上部)及本發明之實例3-3之融合蛋白FcεRIα-NTIG-IL-10Vm(下部)與 小鼠IgE之親和力之結果的一系列圖，且圖36b為展示藉由BLI分析來分析本發明之實例3-3之融合蛋白FcεRIα-NTIG-IL-10Vm與人類IgE之親和力之結果的圖；圖37為展示經由β-己糖苷酶釋放分析來分析根據本發明之一個例示性實施例之融合蛋白RG-110及FcεRIα修飾之IgG4之IgE抑制活性之結果的圖；圖38為展示藉由BLI分析來分析根據本發明之一個例示性實施例之融合蛋白PG-400(左側)及PG-410(右側)與CD40L之結合親和力之結果的圖；且圖39為展示根據根據本發明之一個例示性實施例之融合蛋白PG-110之各種投與途徑(SC、IV、IP及IM)分析藥物動力學概況之結果的圖。
較佳實施例之詳細說明
根據本發明之一態樣，提供免疫球蛋白Fc域突變蛋白，其中包括選自由SEQ ID NO：1至4組成之群的胺基酸序列之經修飾之IgG4 Fc域蛋白之第18及第196胺基酸係突變成其他胺基酸。
如本文所用，術語「經修飾之IgG4免疫球蛋白Fc域蛋白」或「經修飾之IgG4 Fc域蛋白」係指重組抗體Fc域蛋白，其藉由將鉸鏈、CH2及CH3(其為免疫球蛋白之Fc域之構成元件)之全部或一部分與衍生自不同類型的抗體分子(亦即IgG、IgD、IgE及IgM)之彼等組合製備。作為代表性經修飾之IgG4免疫球蛋白Fc域蛋白，提及韓國專利第897938號中揭露之彼等。
如本文所用，術語「免疫球蛋白Fc域突變蛋白」或「Fc域突變蛋白」係指其中經修飾之IgG4 Fc域蛋白中之至少一個胺基酸經取代、缺失或添加之突變蛋白。
在免疫球蛋白Fc域突變蛋白中，第18胺基酸之突變可為選自由T18N、T18K及T18Q組成之群的突變，第196胺基酸之突變可為選自由M196A、M196F、M196I、M196L、M196V、M196P及M196W組成之群的突變，第18胺基酸之突變更佳為T18Q，且第196胺基酸之突變較佳為M196L。
免疫球蛋白Fc域突變蛋白之C端處之離胺酸(K)可移除或可不移除。可根據另一API是否連接至C端來確定是否移除離胺酸。舉例而言，當API連接至本發明之免疫球蛋白Fc域突變蛋白之C端時，離胺酸移除可就蛋白質生產而言有利，且當API不連接至C端時，則無需移除離胺酸。
免疫球蛋白Fc域突變蛋白可包含選自由SEQ ID NO：5至9組成之群的胺基酸序列。
根據本發明之另一態樣，提供融合蛋白，其中至少一個生物活性蛋白(API，活性醫藥成分)連接至免疫球蛋白Fc域突變蛋白之N端及/或C端(圖1至圖4)。
如本文所用，術語「生物活性蛋白」為區別於結構蛋白(其為構成人體組織及器官之蛋白)之概念，且係指執行人體中出現之特定功能，諸如代謝及細胞間或細胞內信號傳輸，且可用於診斷及/或治療由蛋白質缺乏或過量引起之疾病的蛋白質。
如圖1至圖4中所示，在本發明之融合蛋白(10至40)中，生物活性蛋白或活性醫藥成分(API，11)可經由IgG1之鉸鏈區(13)及/或連接肽(14)，諸如G4S連接子連接至免疫球蛋白Fc域突變蛋白(12)之N端或C端。然而，鉸鏈區(13)對二聚化至關重要。當生物活性蛋白(11)直接連接至IgG1之鉸鏈區(13)時，鉸鏈區(亦即SEQ ID NO：20及21)可被視為如圖3中所示之連接子。鉸鏈區提供可撓性且二聚化部分能夠經由半胱胺酸殘基形成分子間二硫鍵。
根據本發明之一個例示性實施例的融合蛋白可包含一或二種生物 活性蛋白。當融合蛋白含有二種生物活性蛋白時，融合蛋白自身展現雙特異性(圖4)。如圖4a中所示，第一生物活性蛋白(11a)經由IgG1之鉸鏈區(13)連接至免疫球蛋白Fc域突變蛋白(12)之N端，且第二生物活性蛋白(11b)經由連接肽(14)連接至免疫球蛋白Fc域突變蛋白(12)之C端。另外，如圖4b中所示，連接肽(14)，諸如G4S連接子另外連接至IgG1之鉸鏈區(13)之N端，第一生物活性蛋白(11a)連接至連接肽(14)之N端，第二生物活性蛋白(11b)經由連接肽(14)連接至免疫球蛋白Fc域突變蛋白(12)之C端。在此情況下，連接至N端之連接肽(14)及連接至C端之連接肽(14)可具有相同序列，或連接肽具有與G4S連接子相同的特性，但可就特定序列而言部分地不同。
在融合蛋白中，生物活性蛋白可為細胞介素、酶、凝血因子、膜受體之細胞外域、生長因子、肽激素或抗體模擬劑。
在融合蛋白中，連接肽之長度可為2至60a.a.、4至55a.a.、5至50a.a.、5至46a.a.、5至45a.a.或5至30a.a.。在連接肽中，將API連接至免疫球蛋白Fc域突變蛋白之N端的連接肽可包括IgG1抗體之重鏈之鉸鏈區的一部分或全部，且其中連接肽包括鉸鏈區之一部分的情況可為其中將人工連接肽添加至鉸鏈區之一部分之N端或C端的情況。此外，鉸鏈區可為雜交型鉸鏈區，其中抗體之二條或更多條重鏈之鉸鏈區的一部分經混合。特定言之，連接肽可為選自由以下組成之群的一或多者之組合：GGGGSGGGGSGGGGSEKEKEEQEERTHTCPPCP(SEQ ID NO：14)、RNTGRGGEEKKGSKEKEEQEERETKTPECP(SEQ ID NO：15)、GGGGSGGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：16)、GSGGGSGTLVTVSSESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：17)、GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：18)、EPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：19)、EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：20)、 GGGGSGGGGSGGGGSAKNTTAPATTRNTTRGGEEKKKEKEKEEQEERTHTCPPCP(SEQ ID NO：21)、A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(SEQ ID NO：22)、(G4S)n(n為1至10之整數，單元序列：SEQ ID NO：23)、(GSSGGS)n(單元：SEQ ID NO：24，n為1至10之整數)、SGGGSGGGGSGGGGSGGEEQEEGGS(SEQ ID NO：25)、AAGSGGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：26)、KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO：27)、EGKSSGSGSESKST(SEQ ID NO：28)、GSAGSAAGSGEF(SEQ ID NO：29)、(EAAAK)n(單元：SEQ ID NO：30，n為1至10之整數)、CRRRRRREAEAC(SEQ ID NO：31)、GGGGGGGG(SEQ ID NO：32)、GGGGGG(SEQ ID NO：33)、PAPAP(SEQ ID NO：34)、(Ala-Pro)n(n為1至10之整數)、VSQTSKLTRAETVFPDV(SEQ ID NO：35)、PLGLWA(SEQ ID NO：36)、TRHRQPRGWE(SEQ ID NO：37)、AGNRVRRSVG(SEQ ID NO：38)、RRRRRRRR(SEQ ID NO：39)、GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE(SEQ ID NO：40)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：41)、AEAAAKEAAAAKA(SEQ ID NO：42)、GFLG(SEQ ID NO：43)、AKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECP(SEQ ID NO：44)、GGSGG(SEQ ID NO：45)、GGSGGSGGS(SEQ ID NO：46)、GGGSGG(SEQ ID NO：47)及GSTSGSGKPGSGEGS(SEQ ID NO：48)。
在此情況下，細胞介素可為趨化因子、干擾素、介白素、群落刺激因子或腫瘤壞死因子，趨化因子可為CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL16、XCL1、XCL2或CX3CL1，干擾素可為干擾素-α、干擾素-β、干擾素-ε、干擾素-κ、干擾 素-δ、干擾素-γ、干擾素-tau、干擾素-ω、干擾素-nu或干擾素-ζ，介白素可為IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12α、IL-12β、IL-13、IL-15或IL-21，群落刺激因子可為巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、顆粒球巨噬細胞刺激因子(GM-CSF)、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)或普美格亭(promegapoietin)，且腫瘤壞死因子可為TNFα、TNFβ、CD40配位體(CD40L)、Fas配位體(FasL)、TNF相關凋亡誘導配位體(TRAIL)或LIGHT。
在融合蛋白中，酶可為組織型纖維蛋白溶酶原活化子(tPA)、尿激酶、阿替普酶(alteplase)、瑞替普酶(reteplase)、替奈普酶(tenecteplase)、鏈激酶(streptokinase)、阿尼普酶(anlsteplase)、葡激酶(taaphylokinase)、納豆激酶(nattokinase)、蚓激酶(limbrokinase)、膠原蛋白酶(collagenase)、麩質酶(glutenase)、阿糖腦苷酶(alglucerase)、維拉苷酶(velaglucerase)、伊米苷酶(imiglucerase)、塔利苷酶(taliglucerase)-α,β-葡糖腦苷脂酶(glucocerebrosidase)、α-半乳糖苷酶(galactosiase)A、α-葡糖苷酶(glucosiase)、α-L-艾杜糖醛酸酶(iduroniase)、芳基硫酸酯酶(arylsulphatase)B、阿加糖酶(agalsidase)、腺苷脫胺酶(adenosine deaminase)、苯丙胺酸氨裂解酶(phenylalanine ammonia lyase)、鏈道酶(dornase)、拉布立酶(rasburicase)、培羅替酶(pegloticase)、穀卡匹酶(glucarpidase)或奧克纖溶酶(ocriplasmin)，但不限於此。
在融合蛋白中，凝血因子可為因子VIII或因子IX。
在融合蛋白中，膜受體可為受體酪胺酸激酶(RTK)超家族、T細胞受體、Fc受體、趨化因子受體、Toll樣受體家族、鳥苷酸環化酶連接受體(GCCR)或受體絲胺酸/蘇胺酸激酶，受體酪胺酸激酶可為EGFR家族、胰島素受體家族、血小板源性生長因子受體(PDGFR)家族、血管內皮生長因子受體(VEGFR)家族、纖維母細胞生長因子受體(FGFR)家族、結腸癌激酶(CCK)家族、神經生長因子受體(NGFR)家族、肝細胞生長因子受體(HGFR)家族、產紅血球生成素人類肝細胞 受體(EphR)家族、酪胺酸蛋白激酶受體(AXL)家族、血管生成素受體(TIER)家族、受體酪胺酸激酶相關受體(RYKR)家族、盤狀域受體(DDR)家族、轉染重排(RET)家族、白血球受體酪胺酸激酶(LTK)家族、受體酪胺酸激酶樣孤兒受體(ROR)家族、肌肉特異性激酶(MuSK)家族、CD80(B7.1)或CD83，Fc受體可為Fcγ受體、Fcα受體或Fcε受體，細胞介素受體可為1型細胞介素受體、2型細胞介素受體、腫瘤壞死因子受體家族、趨化因子受體或TGF-β受體家族，Toll樣受體家族可為TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12或TLR13，鳥苷酸環化酶連接受體可為利鈉因子受體1(NPR1)、NPR2或NPR3，且受體絲胺酸/蘇胺酸激酶可為TGF-β超家族受體、骨形態生成蛋白(BMP)受體或活化素受體樣激酶(ALK)。
在融合蛋白中，生長因子可為腎上腺髓質素、血管生成素、骨形態生成蛋白、睫狀神經營養因子、白血病抑制因子、表皮生長因子(EGF)、艾普瑞林(ephrin)、紅血球生成素(EPO)、纖維母細胞生長因子(FGF)、膠細胞株源性神經營養因子(GDNF)家族、生長分化因子-9(GDF9)、肝細胞生長因子(HGF)、肝癌源性生長因子(HDGF)、胰島素、胰島素樣生長因子(IGF)、角質細胞生長因子(KGF)、促移行因子(MSF)、巨噬細胞刺激因子、神經調節蛋白、神經營養蛋白、胎盤生長因子(PGF)、血小板源性生長因子(PDGF)、T細胞生長因子(TCGF)、血小板生成素(TPO)、轉型生長因子(TGF)家族或血管內皮生長因子(VEGF)。
在融合蛋白中，肽激素可為人類生長激素(hGH)、GLP-1類似物、GLP-2類似物、胰島素、促腎上腺皮質激素、澱粉素、血管緊張素、神經肽Y、腦啡肽、神經調壓素、心房利鈉肽、降鈣素、膽囊收縮素(choloecystokinin)、胃泌素、飢餓肽(ghelin)、升糖素、促卵泡激素、瘦素、黑色素細胞刺激激素(MSH)、催產素、副甲狀腺激素、促乳素、腎素、生長抑素、甲狀腺刺激激素(TSH)、促甲狀腺激素釋放激素(TRH)、升壓素或血管活性腸道肽。
在融合蛋白中，抗體模擬劑可為scFv、VNAR、VHH、親和抗體(affibody)、阿菲林(affilin)、親和體(affimer)、阿菲亭(affitin)、阿爾法抗體(alphabody)、抗運載蛋白(anticalin)、高親和性多聚體(avimer)、錨蛋白重複蛋白(DARPin)、菲諾體(Fynomer)、孔尼茲(Kunitz)域肽、單功能抗體(monobody)、重複抗體(repebody)、VLR或nanoCLAMP。
在融合蛋白中，IL-10蛋白可為IL10突變蛋白，其中異白胺酸(其為第87胺基酸)經丙胺酸取代，或單體IL-10突變蛋白，其中長度為6至10a.a.之連接肽插入天冬醯胺(其為第134胺基酸)與離胺酸(其為第135胺基酸)之間，且可包括SEQ ID NO：54或56中所闡述之胺基酸序列。
如本文所用，術語「融合蛋白」係指重組蛋白，其中負責蛋白質中之特定功能的二個或更多個蛋白質或域經連接以使得各蛋白質或域負責其原始功能。具有可撓性結構之連接肽可總體上插入二個或更多個蛋白質或域之間。作為連接肽，可提及GGGGSGGGGSGGGGSEKEKEEQEERTHTCPPCP(SEQ ID NO：14)、RNTGRGGEEKKGSKEKEEQEERETKTPECP(SEQ ID NO：15)、GGGGSGGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：16)、GSGGGSGTLVTVSSESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：17)、GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：18)、EPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：19)、EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：20)、GGGGSGGGGSGGGGSAKNTTAPATTRNTTRGGEEKKKEKEKEEQEERTHTCPPCP(SEQ ID NO：21)、A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(SEQ ID NO：22)、(G4S)n(n為1至10之整數，單元序列：SEQ ID NO：23)、(GSSGGS)n(單元：SEQ ID NO：24，n為1至10之整數)、SGGGSGGGGSGGGGSGGEEQEEGGS(SEQ ID NO：25)、AAGSGGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：26)、KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO：27)、EGKSSGSGSESKST(SEQ ID NO： 28)、GSAGSAAGSGEF(SEQ ID NO：29)、(EAAAK)n(單元：SEQ ID NO：30，n為1至10之整數)、CRRRRRREAEAC(SEQ ID NO：31)、GGGGGGGG(SEQ ID NO：32)、GGGGGG(SEQ ID NO：33)、PAPAP(SEQ ID NO：34)、(Ala-Pro)n(n為1至10之整數)、VSQTSKLTRAETVFPDV(SEQ ID NO：35)、PLGLWA(SEQ ID NO：36)、TRHRQPRGWE(SEQ ID NO：37)、AGNRVRRSVG(SEQ ID NO：38)、RRRRRRRR(SEQ ID NO：39)、GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE(SEQ ID NO：40)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：41)、AEAAAKEAAAAKA(SEQ ID NO：42)、GFLG(SEQ ID NO：43)、AKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECP(SEQ ID NO：44)、GGSGG(SEQ ID NO：45)、GGSGGSGGS(SEQ ID NO：46)、GGGSGG(SEQ ID NO：47)、and GSTSGSGKPGSGEGS(SEQ ID NO：48)。
如本文所用，術語「抗體」係指免疫球蛋白分子，其為由結合二條相同重鏈及二條相同輕鏈產生之雜四聚體蛋白，且經由由輕鏈可變區(VL)及重鏈可變區(VH)構成之抗原結合位點進行抗原特異性結合，由此引起抗原特異性體液性免疫反應。作為抗體，取決於其起源，提及IgA、IgG、IgD、IgE、IgM、IgY或其類似者。
如本文所用，術語「抗體之抗原結合片段」係指具有衍生自抗體之抗原結合能力的片段，且包括由用蛋白裂解酶裂解抗體產生之片段以及以重組方式產生之單鏈片段，且其實例包括Fab、F(ab')2、scFv、雙功能抗體、三功能抗體、sdAb或VHH。
如本文所用，術語「Fab」係指抗原結合抗體片段(抗原結合片段)，其由用木瓜蛋白酶裂解抗體分子產生，木瓜蛋白酶為一種蛋白酶且為VH-CH1及VL-CL之二個肽的二聚體，且由木瓜蛋白酶產生之另一片段係稱為Fc(可結晶片段)。
如本文所用，術語「F(ab')2」係指由用胃蛋白酶裂解抗體產生之片段中包括抗原結合位點之片段，胃蛋白酶為一種蛋白酶且呈其中二個Fab藉由二硫鍵連接之四聚體形式。由胃蛋白酶產生之另一片段係稱為pFc'。
如本文所用，術語「Fab」係指與由在弱還原條件下分離上述F(ab')2產生之Fab具有類似結構的分子。
如本文所用，術語「scFv」為「單鏈可變片段」之縮寫，且係指如下片段：並非實際抗體之片段，而是藉由經由大小為約25a.a.之連接肽將抗體之重鏈可變區(VH)連接至輕鏈可變區(VL)製備之一類融合蛋白，且已知其具有抗原結合能力，儘管該片段不為獨特抗體片段(Glockshuber等人，Biohem.29(6)：1362-1367,1990)。
如本文所用，術語「雙功能抗體」及「三功能抗體」分別係指呈藉由連接子連接之二個及三個scFv形式的抗體片段。
如本文所用，術語「單域抗體(sdAb)」係指抗體片段，其亦稱為奈米抗體且由抗體之單一可變區片段組成。主要使用衍生自重鏈之sdAb，但亦報導衍生自輕鏈之單一可變區片段特異性結合至抗原。由鯊魚抗體之可變區片段構成之VNAR及由駱駝抗體之可變區片段構成之VHH(其僅由與由重鏈及輕鏈構成之習知抗體不同的單鏈二聚體組成)亦包括於sdAb中。
如本文所用，術語「抗體模擬劑」為包括如下蛋白質之概念：與由非抗體源性蛋白質支架製備之抗體，諸如單功能抗體及可變淋巴細胞受體(VLR)具有類似功能，亦即具有抗原結合能力，與其中二條重鏈及二條輕鏈形成雜四聚體之四級結構以展現功能的正常全長抗體不同。此類抗體模擬劑之實例包括衍生自蛋白A之Z域的親和抗體(Nygren,P.A.,FEBS J.275(11)：2668 to 2676,2008)、衍生自γ-B晶狀體球蛋白或泛素之阿菲林(Ebersbach等人，J.Mol.Biol.372(1)：172-185,2007)、衍生自胱抑素之親和體(Johnson等人，Anal.Chem.84(15)： 6553-6560,2012)、衍生自Sac7d之阿菲亭(Krehenbrink等人，J.Mol.Biol.383(5)：1058-1068,2008)、衍生自三螺旋捲曲螺旋蛋白之阿爾法抗體(Desmet等人，Nat.Commun.5：5237,2014)、衍生自脂質運載蛋白之抗運載蛋白(Skerra等人，FEBS J.275(11)：2677-2683,2008)、衍生自各種膜受體之域的高親和性多聚體(Silverman等人，Nat.Biotechnol.23(12)：1556-1561,2005)、衍生自錨蛋白重複模體之錨蛋白重複蛋白(Stumpp等人，Drug Discov.Today.13(15-16)：695-701,2008)、衍生自Fyn蛋白之SH3域的菲諾體(Grabulovski等人，J.Biol.Chem.282(5)：3196-3204,2007)、衍生自各種蛋白抑制劑之孔尼茲域的孔尼茲域肽(Nixon及Wood,Curr.Opin.Drug Discov.Dev.9(2)：261-268,2006)、衍生自纖連蛋白之第10個3型域的單功能抗體(Koide及Koide,Methods Mol.Biol.352：95-109,2007)、衍生自碳水化合物結合模組32-2之nanoCLAMP(Suderman等人，Protein Exp.Purif.134：114-124,2017)、衍生自八目鰻之可變淋巴細胞受體(VLR)(Boehm等人，Ann.Rev.Immunol.30：203-220,2012)及基於VLR的經工程化以增強抗原親和力之重複抗體(Lee等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,109：3299-3304,2012)。
根據本發明之另一態樣，提供編碼免疫球蛋白Fc域突變蛋白或融合蛋白之聚核苷酸。
聚核苷酸可為任何聚核苷酸，只要該聚核苷酸為編碼含有選自由SEQ ID NO：5至9組成之群的胺基酸序列之蛋白質的聚核苷酸，且可具有針對用於產生蛋白質之宿主細胞類型最佳化之密碼子。根據宿主細胞最佳化密碼子之此類技術為此項技術中熟知的(Fuglsang等人，Protein Expr.Purif.31(2)：247-249,2003)。聚核苷酸更佳含有選自由SEQ ID NO：10至13組成之群的核酸序列。
根據本發明之另一態樣，提供含有聚核苷酸之重組載體。
在重組載體中，聚核苷酸可以可操作地連接於調節序列之基因構 築體形式包含在內。
如本文所用，術語「可操作地連接於」意謂目標核酸序列(例如活體外轉錄/轉譯系統或在宿主細胞中)以使得可表現目標核酸序列之方式連接至調節序列。
如本文所用，術語「調節序列」意欲包括啟動子、強化子及其他調節元件(例如聚腺苷酸化信號)。調節序列之實例包括導引以使得目標核酸不斷表現於許多宿主細胞中之序列，導引以使得目標核酸僅表現於特定組織細胞中之序列(例如組織特異性調節序列)，及導引以使得表現係由特定信號誘導之序列(例如誘導性調節序列)。熟習此項技術者可理解表現載體之設計可取決於諸如以下之因素而變化：待轉型之宿主細胞的選擇及蛋白質表現之所需位準。本發明之表現載體可引入至宿主細胞中以表現融合蛋白。使得能夠表現於真核細胞及原核細胞中之調節序列已為熟習此項技術者所熟知。如上文所述，此等調節序列大體上包括負責轉錄起始之調節序列及任擇地負責轉錄終止及轉錄物穩定化之poly-A信號。除了轉錄調節因子以外，額外調節序列可包括轉譯增強因子及/或天然組合或異源啟動子區。舉例而言，使得能夠表現於哺乳動物宿主細胞中之可能的調節序列包括CMV-HSV胸苷激酶啟動子、SV40、RSV啟動子(勞氏肉瘤病毒)、人腎尿素1α啟動子、糖皮質激素誘導型MMTV啟動子(莫洛尼小鼠(Moloney mouse)腫瘤病毒)、金屬硫蛋白或四環素誘導型啟動子或擴增劑，諸如CMV擴增劑及SV40擴增劑。考慮對於神經細胞中之表現，可使用神經絲啟動子、PGDF啟動子、NSE啟動子、PrP啟動子或thy-1啟動子。上述啟動子為此項技術中已知的，且描述於文獻中(Charron,J.Biol.Chem.270：25739至25745,1995)。對於原核細胞中之表現，已揭露多種啟動子，包括lac啟動子、tac啟動子或trp啟動子。除了能夠起始轉錄之因子以外，調節序列可在根據本發明之一個例示性實施例的聚核苷酸下游包括轉錄終止信號，諸如SV40-poly-A位點及TK-poly-A位 點。在本說明書中，適合之表現載體為此項技術中已知的，且其實例包括Okayama-Berg cDNA表現載體pcDV1(Parmacia)；pRc/CMV；pcDNA1；pcDNA3(Invitrogene)；pSPORT1(GIBCO BRL)；pGX-27(韓國專利第1442254號)；pX(Pagano等人，Science 255：1144-1147,1992)；酵母雙雜交載體，諸如pEG202及dpJG4-5(Gyuris等人，Cell 75：791-803,1995)及原核表現載體，諸如λ gt11及pGEX(Amersham Pharmacia)。除了本發明之核酸分子以外，載體可進一步包括編碼分泌信號之聚核苷酸。分泌信號為熟習此項技術者所熟知。此外，取決於使用之表現系統，可將根據本發明之一個例示性實施例的融合蛋白導引至細胞區室的前導序列係與根據本發明之一個例示性實施例之聚核苷酸的編碼序列，且較佳為能夠將解碼蛋白或其蛋白直接分泌至細胞質周或細胞外基質中的前導序列組合。
另外，本發明之載體可例如藉由標準重組DNA技術製備，且標準重組DNA技術之實例包括將平滑末端與黏附末端連接、限制酶處理以得到適當末端、藉由鹼性磷酸酶處理移除磷酸基以防止不當結合及藉由T4 DNA連接酶進行酶聯。可如下地製備本發明之載體：藉由將編碼藉由化學合成或基因重組技術獲得之信號肽的DNA、根據本發明之一個例示性實施例的免疫球蛋白Fc域突變蛋白或編碼含有其之融合蛋白的DNA與含有適當調節序列之載體再組合。含有調節序列之載體可為商業購買或製備的，且在本發明之一個例示性實施例中，pBispecific主鏈載體(Genexine,Inc.,Korea)、pAD15載體、pGP30(Genexine,Inc.Korea)或pN293F載體(Y-Biologics,Inc.,Korea)係用作骨架載體。
表現載體可進一步包括編碼分泌信號序列之聚核苷酸，且分泌信號序列誘導細胞中表現之重組蛋白的細胞外分泌，且可為組織纖維蛋白溶酶原活化因子(tPA)信號序列、單純疱疹病毒醣蛋白Ds(HSV gDs)信號序列或生長激素信號序列。
根據本發明之一個例示性實施例的表現載體可為能夠表現宿主細胞中之蛋白質的表現載體，且表現載體可呈任何形式，諸如質體載體、病毒載體、黏質體載體、噬菌質體載體或人工人染色體。
根據本發明之另一態樣，提供含有融合蛋白之均二聚體或雜二聚體。
在如圖5所示之均二聚體中，當不同生物活性蛋白(11a及11b)分別連接至免疫球蛋白Fc域突變蛋白(12)之N端及C端時，製備之均二聚體(100)展現雙特異性。然而，如圖6中所示，當僅一種含有生物活性蛋白(11)之單特異性融合蛋白經二聚時，產生之均二聚體(200)仍展現單一特異性(圖6)。在雜二聚體之情況下，如圖7中所示，當二種不同的分別含有生物活性蛋白(11a及11b)之單特異性融合蛋白經二聚時，製備之雜二聚體(300)展現雙特異性。如圖8中所示，當二種不同的各含有二種不同生物活性蛋白(11a、11b、11c及11d)之雙特異性融合蛋白經二聚時，產生之雜二聚體(400)展現四特異性。
任擇地，根據本發明之一個例示性實施例的均二聚體或雜二聚體(500、600、700及800)可在生物活性蛋白(11、11a、11b、11c及11d)與鉸鏈區(13)之間或在免疫球蛋白Fc域突變蛋白(12)與生物活性蛋白的區域之間包含一或多個連接肽(14)。此等融合搭配物可經由連接肽(14)連接至免疫球蛋白Fc域突變蛋白之N端或C端(圖9至圖12)。
特定言之，連接至融合蛋白之N端的生物活性蛋白(11a)可為充當目標部分之配位體，且連接至相同融合蛋白之C端的另一生物活性蛋白(11b)可為具有所需生物活性之功能蛋白(圖5及圖8)。相反，功能蛋白可連接至N端，且配位體可連接至C端。此等雙特異性融合蛋白可藉由分子間二硫鍵經由鉸鏈區(13)中存在之半胱胺酸殘基形成均二聚體，且免疫球蛋白Fc域突變蛋白之間的選擇性疏水相互作用可促進二聚化。二種不同雙特異性融合蛋白可形成雜二 聚體。以此方式，根據本發明之一個例示性實施例的均二聚體或雜二聚體蛋白可包含一至四種生物活性蛋白，且可藉由將連接肽添加至各末端處存在之生物活性蛋白而添加更多類型之蛋白。
當意欲製備根據本發明之一個例示性實施例的雜二聚體時，為了最小化均二聚體形成，可使用此項技術中熟知之杵臼(KIH)技術。
如本文所用，術語「杵-臼(KIH)」係指在雙特異性IgG抗體生產中用於使重鏈異二聚化之抗體工程化的一種設計策略。在KIH技術中，當形成雜二聚體之二個融合蛋白分成第一融合蛋白及第二融合蛋白時，在第一融合蛋白之經修飾之IgG4 Fc區中，絲胺酸(其為CH3域之第10胺基酸)可經半胱胺酸(C)取代，且蘇胺酸(T)(其為第22胺基酸)可經色胺酸(W)取代(杵結構)，且在第二融合蛋白之Fc區中，酪胺酸(Y)(其為CH3域之第5胺基酸)可經半胱胺酸(C)取代，蘇胺酸(其為第22胺基酸)可經絲胺酸(S)取代，白胺酸(L)(其為第24胺基酸)可經丙胺酸(A)取代，且酪胺酸(Y)(其為第63胺基酸)可經纈胺酸(V)取代(臼結構)。相反，在第一融合蛋白之Fc區中，酪胺酸(Y)(其為CH3域之第5胺基酸)可經半胱胺酸(C)取代，蘇胺酸(其為第22胺基酸)可經絲胺酸(S)取代，白胺酸(L)(其為第24胺基酸)可經丙胺酸(A)取代，且酪胺酸(Y)(其為第63胺基酸)可經纈胺酸(V)取代(臼結構)，且在第二融合蛋白之經修飾之IgG4 Fc區中，絲胺酸(其為CH3域之第10胺基酸)可經半胱胺酸(C)取代，且蘇胺酸(T)(其為第22胺基酸)可經色胺酸(W)取代(杵結構)。
在此情況下，出現突變之胺基酸位置係基於參考序列(SEQ ID NO：77之人類IgG1 CH3域之胺基酸序列)。即使當胺基酸之額外突變，諸如添加、缺失或取代出現於CH域上獨立於杵-臼結構之位點時，亦可使用其中對應於該位點位置之胺基酸基於參考序列而突變的融合蛋白。任擇地，杵-臼結構可經由此項技術中熟知之其他胺基酸突變引入。此類突變具體描述於先前文獻中(Wei 等人，Oncotarget 8(31)：51037-51049,2017；Ridgway等人，Protein Eng.9(7)：617-621,1996；Carter,P.,J.Immunol.Methods 48(1-2)：7-15,2001；Merchant等人，Nat.Biotechnol.16(7)：677-681,1998)。可經由此類選擇性突變，例如杵結構(其中蘇胺酸(其為第一融合蛋白之CH3域的第22胺基酸)經酪胺酸取代)及臼結構(其中酪胺酸(其為第二融合蛋白之CH3域的第63胺基酸)經蘇胺酸取代)之組合產生雙特異性二聚體融合蛋白。相反，可藉由將臼結構引入至第一融合蛋白且將杵結構引入至第二融合蛋白而形成杵-臼結構。
根據本發明之另一態樣，提供含有融合蛋白、編碼融合蛋白之聚核苷酸或均二聚體或雜二聚體作為活性成分的組合物。
根據本發明之另一態樣，提供一種延長生物活性蛋白之活體內半衰期的方法，該方法包括向個體投與融合蛋白或含有融合蛋白之均二聚體或雜二聚體的步驟，該融合蛋白藉由將生物活性蛋白融合至免疫球蛋白Fc域突變蛋白獲得。
根據本發明之另一態樣，提供含有融合蛋白或含有融合蛋白之均二聚體或雜二聚體作為活性成分的組合物，該融合蛋白藉由將生物活性蛋白融合至免疫球蛋白Fc域突變蛋白獲得。
組合物可包含醫藥學上可接受之載劑，且除了載劑以外，可進一步包括醫藥學上可接受之佐劑、賦形劑或稀釋劑。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受之」係指組合物為生理學上可接受的且當向人類投與時一般不引起過敏反應，諸如胃腸道病症及頭暈，或類似反應。載劑、賦形劑及稀釋劑之實例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藻糖醇、麥芽糖醇、澱粉、阿拉伯膠、海藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、水、甲基羥基苯甲酸酯、丙基羥基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸鎂及礦物油。此外，可進一步含有填充劑、抗 聚集劑、潤滑劑、濕潤劑、芳香劑、乳化劑及防腐劑。
此外，當向哺乳動物投與根據本發明之一個例示性實施例的醫藥組合物時，可使用此項技術中已知之方法調配醫藥組合物以允許快速、持續或延遲釋放活性成分。調配物之實例包括粉末、顆粒、錠劑、乳液、糖漿、氣溶膠、軟或硬明膠膠囊、無菌可注射溶液及無菌粉末形式。
根據本發明之一個例示性實施例的組合物可藉由各種途徑投與，諸如經口投與及非經腸投與，例如栓劑、經皮、靜脈內、腹膜內、肌肉內、病灶內、經鼻或椎管內投與，且可使用植入裝置投與以持續釋放或連續或重複釋放。投與可一天進行一次或若干次(在所需範圍內)，且可以一定時間間隔進行，諸如一週一次、一週二次及每月一次，且投與之持續時間亦不受特定限制。
根據本發明之一個例示性實施例的組合物可藉由常用之醫藥學上可接受之載劑以適合之形式調配。醫藥學上可接受之載劑之實例包括用於非經腸投與之載劑，諸如水、適合之油、鹽水溶液、水性葡萄糖及二醇，且可進一步含有穩定劑及防腐劑。適合之穩定劑之實例包括抗氧化劑，諸如亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉或抗壞血酸。適合之防腐劑之實例包括苯紮氯銨、甲基-或丙基-對羥基苯甲酸酯及氯丁醇。此外，取決於投與方法或配方，根據本發明之組合物可在必要時適當地含有懸浮劑、增溶劑、穩定劑、等張劑、防腐劑、吸附抑制劑、界面活性劑、稀釋劑、賦形劑、pH調節劑、無痛劑、緩衝劑、抗氧化劑或其類似物。適合於本發明之醫藥學上可接受之載劑及調配物，包括以上例示之彼等詳細描述於文獻[Remington's Pharmaceutical Sciences最新版]中。
用於患者之組合物劑量取決於許多因素，包括患者身高、體表面積、年齡、投與之特定化合物、性別、投與時間及途徑、一般健康及同時投與之其他藥物。醫藥學活性蛋白質可以100ng/體重(kg)至10mg/體重(kg)，更佳1至500μg/kg(體重)，且最佳5至50μg/kg(體重)之量投與，但劑量可考慮上述因素 調節。
根據本發明之另一態樣，提供一種治療個體疾病之方法，該方法包括向個體投與治療有效量之融合蛋白或含有融合蛋白之均二聚體或雜二聚體的步驟，該融合蛋白藉由將生物活性蛋白融合至免疫球蛋白Fc域突變蛋白獲得。
如本文所用，術語「治療有效量」係指足以在適用於醫療之合理效益/風險比下治療疾病的量，且有效劑量水準可根據包括以下之因素來確定：個體類型、嚴重度、年齡、性別、藥物活性、藥物敏感性、投與時間、投與途徑、排泄率、治療持續時間、同時使用之藥物及醫學領域中熟知之其他因素。根據本發明之組合物之治療有效量為0.1mg/kg至1g/kg且更佳為1mg/kg至500mg/kg，但有效劑量可根據患者之年齡、性別及健康狀況而適當地調節。
上述疾病為需要投與生物活性蛋白之疾病，例如當生物活性蛋白為GLP-1類似物時，待治療之疾病可為糖尿病或代謝症候群，當生物活性蛋白為GLP-2類似物時，待治療之疾病可為短腸侯症群或發炎性腸病，當生物活性蛋白為IL-2時，待治療之疾病可為惡性腫瘤，當生物活性蛋白為FcεRIa時，待治療之疾病可為IgE介導之過敏性疾病，諸如哮喘及異位性皮炎，且當生物活性蛋白為抗CD40L抗體模擬劑時，待治療之疾病可為自體免疫疾病或器官移植排斥反應。
在下文中，將藉由實例及實驗實例更詳細地描述本發明。然而，本發明不限於下文所述之實例及實驗實例，且可以各種其他形式實施，且提供下文所述之實例及實驗實例以使得能夠完成本發明之揭露內容且將本發明之範疇完全傳達給本發明所屬領域之技術人員。
實例1：免疫球蛋白Fc域突變蛋白之設計
將抗體之Fc域連接至生物活性蛋白或活性醫藥成分(API)以增加API之半衰期的技術為廣泛使用之技術。然而，當在抗體之Fc域部分中時，將 N鍵聯糖鏈添加至天冬醯胺，其為第297胺基酸，糖鏈模式不同於人類抗體之糖鏈模式或不均一且以非均質形式產生，其取決於宿主細胞關於抗體產量之特徵。因此，API所連接之融合蛋白之活性可不恆定，且展現在一些情況下不必要的效應，諸如抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)以引起副作用。此外，已知活體內投與抗體之後半衰期增加之原因為抗體由於藉由血管內皮細胞之內飲作用而經活體內吸收，接著由於內體狀態下之低pH而結合至新生兒Fc受體(「在下文中稱為「FcRn」」)以避免被溶酶體降解，且在細胞外生理pH條件下在內體再循環至細胞膜之過程中與FcRn分離(圖13)。已知抗體被FcRn再使用展現延長抗體半衰期至多大約21天之效應(Raghavan,M.等人，Biochem,34(45)：14649-14657,1995)。
然而，由於取決於IgG之類型，現有抗體Fc域與FcRn之親和力不同，因此改良API之半衰期存在限制。
因此，本發明人設計了不具有ADCC及CDC活性，同時增加現有Fc域蛋白與FcRn之親和力的Fc域蛋白突變體。
因此，本發明人設計了一種突變體(SEQ ID NO：6至9)，其中蘇胺酸(T)(其為具有SEQ ID NO：1至4中所闡述之胺基酸序列的經修飾之IgG4 Fc蛋白之第18胺基酸)經麩醯胺酸(Q)取代，且甲硫胺酸(M)(其為第196胺基酸)經白胺酸(L)取代，且將突變體命名為「NTIG(SEQ ID NO：5)」。
實例2：製備單特異性融合蛋白構築體
隨後，本發明人製備各種融合蛋白，其中各種生物活性蛋白連接至實例1中製備之免疫球蛋白Fc域突變蛋白(NTIG)的N端及/或C端。
2-1：GLP-1E-NTIG之設計及生產
本發明人設計了一種融合蛋白(GLP-1E-NTIG，SEQ ID NO：50)，其中實例1中製備之NTIG蛋白(SEQ ID NO：7)經由以雜交形式含有鉸鏈區的連 接肽((G4S)3-IgD/IgG1雜交鉸鏈，SEQ ID NO：14)連接至GLP-1/腸促胰島素類似物-4雜交肽(SEQ ID NO：49)之C端，該雜交肽為GLP-1及腸促胰島素類似物-4之雜交肽，且將融合蛋白命名為「PG-11」。GLP-1E-NTIG經設計以添加用於自宿主細胞分泌之tPA信號序列(SEQ ID NO：51)。同時，編碼PG-11之聚核苷酸係使用寡核苷酸合成、PCR擴增及定點突變誘發技術合成，且接著插入至pGP30表現載體(Genexine,Inc.,Korea)中。製備之載體使用由Thermo Fisher Scientific Solutions LLC製造之ExpiCHO套組暫時表現。特定言之，將如上製備之載體及套組中所含之ExpiFectamine試劑在ExpiCHO-S細胞中混合，且將所得物在條件為8% CO2及37℃之培育箱中培養1天，接著將溫度降至32℃，且進行培養直至第7天。
此後，進行蛋白A之捕捉及純化，經由非還原及還原條件下之SDS-PAGE分析對其檢查候選材料是否經純化，且藉由調配物緩衝溶液根據候選材料之pI值進行調配。使用Nano drop定量調配之材料，且使用SEC-HPLC檢查最終純度(圖14a及圖14b)。
2-2：GLP-2-2G-NTIG之設計及生產
本發明人設計了一種融合蛋白(GLP-2-2G-NTIG，SEQ ID NO：53)，其中NTIG(SEQ ID NO：7)經由連接肽(SEQ ID NO：14)連接至GLP-2類似物(GLP-2-2G，SEQ ID NO：52)之C端，該類似物為突變體，其中丙胺酸(A)(其為人類GLP-2肽之第2胺基酸)經甘胺酸(G)取代，且將融合蛋白命名為「PG-22」。類似地，PG-22亦經設計以添加用於分泌之tPA信號序列(SEQ ID NO：51)。與實例2-1類似，製備編碼PG-22之聚核苷酸且插入至pGP30表現載體(Genexine,Inc.,Korea)中以使用ExpiCHO系統產生蛋白質，且接著檢查最終純度(圖15a及圖15b)。
2-3：NTIG-IL-10V之設計及生產
本發明人設計了一種融合蛋白(NTIG-IL-10V，SEQ ID NO：55)，其中IL-10突變體(SEQ ID NO：54)經由連接肽(SEQ ID NO：26)連接至NTIG之C端，且將融合蛋白命名為「PG-088」。與實例2-1類似，製備編碼PG-088之聚核苷酸且插入至pBispec表現載體(Genexine,Inc.,Korea)中以使用ExpiCHO系統產生蛋白質，且接著檢查最終純度(圖16a及圖16b)。
2-4：NTIG-IL-10V單體之設計及生產
本發明人設計了一種融合蛋白(NTIG-IL-10Vm，SEQ ID NO：57)，其中IL-10單體突變體(SEQ ID NO：56)經由連接肽(SEQ ID NO：26)連接至NTIG之C端，且將融合蛋白命名為「PG-088m」。與實例2-1類似，製備編碼PG-088m之聚核苷酸且插入至pBispec表現載體中以使用ExpiCHO系統產生蛋白質，且接著檢查最終純度(圖17a及圖17b)。藉由引入選擇性抑制IL-10蛋白之免疫刺激活性的突變而獲得IL-10單體突變體(IL-10Vm)，IL-10蛋白具有免疫刺激活性及免疫抑制活性之二種不同活性，且為藉由在蛋白質生產過程中間插入GGSGGSGGS(SEQ ID NO：46)之連接子以解決由於該過程中之自二聚化形成產生之聚集體問題，以單體形式產生之單體突變蛋白。
實例3：製備雙特異性融合蛋白基因構築體
3-1：製備抗PD-L1-NTIG-IL-2
使用SEQ ID NO：2之經修飾之IgG4 Fc域蛋白而非NTIG編碼融合蛋白(抗PD-L1-NTIG-IL-2)(其中靶向scFv之PD-L1連接至NTIG(SEQ ID NO：7)之N端且IL-2連接至C端)及融合蛋白(抗PD-L1修飾之IgG4 Fc-IL-2)中之每一者的聚核苷酸係插入至pBispec表現載體中，且使用ExpiCHO系統產生各蛋白。
3-2：FcεRIα-NTIG-IL-10V之設計及生產
本發明人設計了一種雙特異性融合蛋白(FcεRIα-NTIG-IL-10V， SEQ ID NO：59)，其中FcεRIα(其為特異性結合至IgE之受體)之細胞外域(SEQ ID NO：58)經由連接肽(SEQ ID NO：18)連接至實例2-3中設計之NTIG-IL-10V之N端，將雙特異性融合蛋白命名為「PG-075」，且製備編碼融合蛋白之聚核苷酸且插入至pBispec表現載體中。亦設計PG-075構築體以使用ExpiCHO系統產生tPA信號序列(SEQ ID NO：51)，其位於N端，用於分泌，且經受SDS-PAGE及西方墨點法(圖18a及圖18b)。
3-3：FcεRIα-NTIG-IL-10Vm之設計及生產
本發明人設計了一種雙特異性融合蛋白(FcεRIα-NTIG-IL-10Vm，SEQ ID NO：60)，其中FcεRIα(其為特異性結合至IgE之受體)之細胞外域(SEQ ID NO：58)經由連接肽(SEQ ID NO：18)連接至實例2-4中設計之NTIG-IL-10Vm之N端，將雙特異性融合蛋白命名為「PG-110」，且製備編碼融合蛋白之聚核苷酸且插入至pAD15表現載體中。亦設計PG-110構築體以使得tPA信號序列(SEQ ID NO：51)位於N端，用於分泌。將插入至pAD15表現載體中之基因轉染至CHO DG44細胞中，接著經受甲胺喋呤(MTX)擴增，且經受單選殖分選操作以製備高效表現細胞株，且接著自高效表現細胞株產生及純化PG-110蛋白(圖19a及圖19b)。
實例4：製備抗CD40L雜交抗體
4-1：製備嵌合抗CD40L抗體
本發明人製備了一種抗CD40L抗體，其藉由將FcγRIIα結合抑制突變體引入至抗體(C10)之重鏈CH2及CH3域中獲得，其中WO2016/182335A1中所述之小鼠源性抗CD40L(抗CD154)抗體之Fc區經人類IgG1 Fc區取代，且將抗CD40L抗體命名為「C10M」。
4-2：製備嵌合抗CD40L-NTIG雜交抗體
本發明人設計了一種雜交重鏈蛋白，其中C10M抗體之Fab部分 中之重鏈部分連接至實例1中製備之NTIG蛋白之N端，不結合至FcγR，且將雜交重鏈蛋白命名為「PG-129」。
製備編碼雜交重鏈蛋白之雜交重鏈的聚核苷酸，其中C10M抗體之Fab中之重鏈部分(VH-CH1，SEQ ID NO：61)連接至NTIG(SEQ ID NO：7)，且將該聚核苷酸插入至pAD15表現載體中(WO2015/009052A)。此外，將編碼C10M抗體之Fab中之輕重部分(VL-CL，SEQ ID NO：62)的聚核苷酸插入至pAD15表現載體中，以使得可在雙重啟動子下調節聚核苷酸。此後，使用Neon-轉染系統將載體共轉染至CHO DG44(獲自Dr.Chasin,Columbia University,USA)細胞中。
亦使用由Thermo Fisher Scientific Solutions LLC製造之ExpiCHO套組暫時表現如上完成之表現載體。特定言之，將如上製備之載體構築體及套組中所含之ExpiFectamine試劑在ExpiCHO-S細胞中混合，且將所得物在條件為8% CO2及37℃之培育箱中培養1天，接著將溫度降至32℃，且進行培養直至第7天。
此後，進行蛋白A之捕捉及純化，經由非還原及還原條件下之PAGE分析及西方墨點分析對其檢查候選材料是否經純化，且藉由調配物緩衝溶液根據候選材料之pI值進行調配。使用Nano drop定量調配之材料，且使用SEC-HPLC檢查最終純度。
結果，如圖20a及圖20b中所示，輕鏈及重鏈通常經表現，在非還原條件下呈現單一帶，且因此可發現形成正常雜四聚體。此外，由於SEC-HPLC分析，純度為97.9%，其為極高的。
4-3：製備人類化抗CD40L-NTIG雜交抗體
藉由引入本發明之NTIG技術(免疫球蛋白Fc域突變蛋白)，嵌合抗體充分改良習知人類抗體之缺點，但本發明人已確定抗原結合位點仍為小鼠源性抗體且因此可發生人體中之不必要免疫反應，且為了製備更安全的雜交抗 體，設計了人類化抗體(抗CD40L Fab-NTIG)，其中除了Fab(其為作為本發明之基礎的抗體之抗原結合片段)之抗原決定子以外的構架部分經人類抗體之序列(表1及2)取代，且將人類化抗體命名為「PG-400」。
此外，本發明人設計製備雙特異性雜交抗體(抗CD40L Fab-NTIG-IL-10Vm)，其中IL-10單體突變蛋白(SEQ ID NO：56)(其為具有免疫抑制活性之細胞介素)連接至雜交抗體之重鏈C端(表3)，且將雙特異性雜交抗體命名為「PG-410」。雙特異性雜交抗體之輕鏈的結構與表2中所示相同。
Figure 109116084-A0305-02-0033-1
Figure 109116084-A0305-02-0033-2
Figure 109116084-A0305-02-0034-3
為了產生人類化抗CD40L雜交抗體(PG-400及PG-410)，製備編碼抗體之重鏈及輕鏈中之每一者的聚核苷酸，且接著為了在動物細胞中暫時表現，使用N293F載體系統(Y-BIOLOGICS)將質體DNA轉染至HEK293F細胞中。為了製備核酸，將25μg質體DNA添加至3ml培養基中且與其混合，且接著向其中添加25μl的2mg/ml聚乙烯亞胺(PEI，PolyPlus，USA)，接著混合。使反應溶液在室溫下靜置15分鐘，且接著放入40ml以1×106個細胞/毫升培養之培養液中，且將所得物在120rpm、37℃及8% CO2之條件下培養24小時。在DNA轉染後24小時，添加營養補充培養基組分(大豆蛋白腖，BD，USA)以使得最終濃度為10g/L。在培養7天之後，將細胞培養溶液以5000rpm離心10分鐘以收集上清液。
隨後，蛋白A樹脂填充管柱且用1×DPBS洗滌，將收集之上清液與樹脂在4℃下以0.5ml/min之速率組合，且用0.1M甘胺酸溶離蛋白質。為了更換緩衝溶液，將溶離溶液放入透析管(GeBAflex管，Geba，Israel)中且在4℃下 用1×DPBS透析。使用Superdex 200樹脂對獲得之物質進行凝膠過濾，且接著用PBS(pH為7.4)緩衝溶液調配。
對於純化之雜交抗體，雜交抗體之產率及純度係經由SDS-PAGE分析、尺寸排阻FPLC及尺寸排阻HPLC分析進行分析。
結果，如圖21a、圖21b、圖22a及圖22b中所示，可發現施加本發明之人類化抗CD40L雜交抗體的PG-400及PG-410係以高純度產生。
4-4：抗CD40L scFv-NTIG-IL-10融合蛋白之設計
本發明人挑選出人類化抗CD40L抗體之Fab中之可變區部分，使用挑選出的可變區部分設計scFv，藉由插入scFv而非實例4-3中所用之抗CD40L抗體之重鏈構築體的VH-CH1部分而設計基於單鏈之抗體結合片段融合蛋白，且設計雙特異性融合蛋白，其中實例4-3中所用之IL-10單體突變體(SEQ ID NO：56)係經由連接肽(SEQ ID NO：26)(表4)連接至抗CD40L scFv-NTIG之C端。在本發明實例中，抗CD40L scFv係由輕鏈可變區(VL)、連接子、重鏈可變區(VH)以此次序構成，但相反，可使用抗CD40L scFv，其由VH、連接子及VL以此次序構成，因為即使在使用後一種抗CD40L scFv之情況下亦維持CD40L結合能力，以及關於連接子之類型，可使用各種類型。
Figure 109116084-A0305-02-0036-4
實例5：製備雜二聚體
本發明人設計含有GLP-1類似物及GLP-2類似物二者的雙特異性融合蛋白，如表5中所示。在此等雙特異性融合蛋白中，引入杵-臼(KIH)結構以藉由第一融合蛋白與第二融合蛋白之間的分子間二硫鍵及疏水相互作用形成雜二聚體。
實例5-1與5-2之間的差別為是否包括N鍵聯糖鏈連接位點以使得N-聚糖糖鏈可連接至連接子，該連接子將第一融合蛋白之GLP-1類似物連接至NTIG。此係因為GLP-1以及腸促胰島素類似物4(Ex4)、調酸素(OXM)、GLP-2全部結合至GLP-1R，其為GLP-1受體，而僅GLP-2結合至GLP-2R，且GLP-1R表現於各種器官中，諸如大腦、心臟、肝臟、肌肉及胰臟外加胃腸道(gastrointestinal tract/GI tract)，且因此有必要略微降低與GLP-1R之親和力以便 允許GLP-1在胃腸道中特異性地起作用。因此，為了略微降低GLP-1類似物與GLP-1R之結合力，本發明人使用添加聚糖連接域之蛋白質以使得聚糖可連接至GLP-1類似物之連接部分(包括IgD/IgG1雜交鉸鏈)(實例5-1)。
Figure 109116084-A0305-02-0037-5
使用由Thermo Fisher Scientific Solutions LLC製造之ExpiCHO套組暫時表現如上製備之載體構築體。特定言之，將如上製備之載體構築體及套組中所含之ExpiFectamine試劑在ExpiCHO-S細胞中混合，且將所得物在條件為8% CO2及37℃之培育箱中培養1天，接著將溫度降至32℃，且進行培養直至第7天。
經由培養獲得之上清液以及經由蛋白A管柱及第二管柱純化之實例5-1及5-2之雜二聚體蛋白(分別命名為『MG12-4』及『MG12-5』)係用4×LDS樣品緩衝溶液及注射用水適當稀釋，以製備樣品以使得最終濃度為3至10μg/20μL。在還原條件下之樣品之情形下，待分析之各物質，4×LDS樣品緩衝溶液、10×還原劑及注射用水經適當稀釋以製備樣品以使得最終濃度為3至10μg/20μL，且將樣品在70℃加熱組中加熱10分鐘。製備之樣品以20μL之量負載於事先安裝之電泳裝置中固定之凝膠的各孔中。對於大小標記，樣品以3至5微升/孔負載。在將電源裝置設定為120V及90分鐘之後，進行電泳。將經受電泳之凝膠分離，且接著使用染色溶液及去染溶液染色，且分析結果。結果，如圖23中所示，可確認正常地產生根據本發明之一個例示性實施例的雜二聚體。
實例6：分析鉸鏈於融合蛋白生產中之效應
本發明人研究當API連接至NTIG蛋白之N端，而各種類型的API連接至本發明之NTIG蛋白之N端及/或C端時，蛋白之生產效率如何取決於鉸鏈的類型而變化。
6-1：製備FcεRIα-NTIG-IL-13α2
本發明人設計了一種雙特異性融合蛋白(FcεRIα-NTIG-IL-13Rα2)，其中FcεRIα(SEQ ID NO：58)連接至NTIG(SEQ ID NO：7)之N端，且IL-13Rα2(SEQ ID NO：74)連接至C端，且將雙特異性融合蛋白命名為「PG-50」。在產生PG-50時，研究當使用IgD鉸鏈(SEQ ID NO：15)或(G4S)3連接子及IgG1鉸鏈之組合(SEQ ID NO：16)時，將FcεRIα連接至NTIG之鉸鏈區的蛋白質產率。以此方式，將使用IgD鉸鏈之融合蛋白命名為「PG-50-1」，且將使用(G4S)3連接子/IgG1鉸鏈之融合蛋白命名為「PG-50-2」。在IgD鉸鏈之情形下，形成一個分子間二硫鍵，且在(G4S)3連接子/IgG1鉸鏈之情形下，形成二個分子間二硫鍵。
結果，如圖24a及圖24b中所示，發現相比於含有IgD鉸鏈之PG-50-1，含有IgG1鉸鏈之融合蛋白(PG-50-2)之目標物質的產品產率增加了約15%。
6-2：製備GLP-2-2G-NTIG-IL-10wt
本發明人分析了使用不同類型的API，各種類型的鉸鏈對蛋白質產品產率之效應。對於該分析，特定言之，製備一構築體，其中GLP-2-2G(SEQ ID NO：52)連接至NTIG(SEQ ID NO：7)之N端且IL-10wt(SEQ ID NO：75)連接至NTIG之C端。此處，藉由使用(G4S)3連接子+IgD/IgG1雜交鉸鏈((SEQ ID NO：14)將GLP-2-2G連接至NTIG，及使用由SEQ ID NO：26中所闡述之胺基酸序列組成之連接肽將IL-10wt連接至NTIG之C端而設計雙特異性融合蛋白(GLP-2-2G-NTIG-IL-10wt)，且將其命名為「PG-073」。製備編碼如上設計之融合蛋白的 聚核苷酸，且接著插入至pBispec表現載體中，使用ExpiCHO系統根據實例2-1中所用之方法表現融合蛋白，且接著藉由SDS-PAGE檢查培養上清液中之蛋白質表現位準。IgD/IgG1雜交鉸鏈形成二個分子間二硫鍵。
結果，如圖24c中所示，在PG-073之情形下，主帶在非還原條件下之大小為110kDa，且確認形成與GLP-2-2G及IL-10二者連接之雙特異性融合蛋白。然而，在主帶以下發現GLP-2中之一或二者裂解之帶。因此，發現在GLP-2與NTIG之間使用之(G4S)3連接子+IgD/IgG1雜交鉸鏈連接子略微不穩定。此外，基於100ml培養液產生之融合蛋白的量僅為0.5mg(PG-073)，且因此蛋白質產率降低，且純度亦為約66%，其為較低的。
6-3及6-4：製備GLP-2-2G(3點)-NTIG-IL-10Vm
因此，本發明人設計了融合蛋白(GLP-2V(3點)-NTIG-IL-10Vm)，其中在GLP-2-2G-NTIG-IL-10wt融合蛋白中，將GLP-2-2G變為含有3點突變之突變體(SEQ ID NO：76)，鉸鏈部分經不同類型的連接子或鉸鏈(各為SEQ ID NO：17或18)替換，且IL-10wt經實例2-4中製備之IL-10Vm替換，且將融合蛋白分別命名為「PG210-5(實例6-3)」及「PG210-6(實例6-4)」。
在將編碼融合蛋白中之每一者的聚核苷酸插入至pBispec表現載體中之後，使用ExpiCHO系統根據實例2-1中所用之方法表現融合蛋白，且接著藉由SDS-PAGE檢查培養上清液中之蛋白質表現位準。
結果，如圖24d及圖24e中所示，在PG-210-5之情形下，基於200ml培養液發現3.48mg蛋白質且發現純度為約88.3%，且在PG-210-6之情形下，發現5mg蛋白質且發現純度為90.7%。
實驗實例1：分析FcRn結合親和力
本發明人比較本發明之NTIG蛋白與FcRn對IgG4 Fc及IgG1抗體之結合親和力。
為進行比較，特定言之，將重組FcRn(rhFcRn，R&D systems，USA)(其為配位體)以5μg/ml之濃度溶解於乙酸鹽緩衝液中，且接著使用胺偶合固定至生物感測器晶片(Series S CM5感測器晶片，GE Healthcare，USA)。
隨後，為了比較本發明之NTIG的FcRn結合親和力及IgG4 Fc之FcRn結合親和力，本發明人經由表面電漿子共振(SPR)分析實例2-1中製備之pg-11及度拉糖肽(商品名Trulicity)(其為其中商業GLP-1連接至IgG4 Fc的融合蛋白)與FcRn之結合親和力。作為分析儀，使用Biocore 8K(GE Healthcare，USA)，且該分析中所用之所有試劑係購自GE Healthcare。PG-11及Trulicity係溶解於操作緩衝溶液(PBST，pH為6.0)中，接著自1,000nM以1/2依序進行稀釋，且進行多循環動力學分析。在25℃下以30μl/min之流動速率進行實驗，進行分析物締合60秒，且接著進行解離60秒。基於實驗結果，選擇最佳抗體濃度(Trulicity：8,000nM及PG-11：2,000nM)，進行多循環動力學分析，且使用Biacore Insight程式(GE Healthcare，USA)來量測平衡解離常數(KD)。此時，緩衝溶液在再生期間經pH為7.4之PBS緩衝溶液替換。
如表6及圖25及圖26中所示，由於穩態親和力KD之比較性分析，Trulicity之KD值為2,090nM且PG-11之KD值為199nM，且結果指示根據本發明之一個例示性實施例的PG-11與FcRn之親和力比Trulicity高約5.3倍。已知與FcRn之結合親和力涉及Fc融合蛋白之藥代動力學，且因此，預期相比於Trulicity，PG-11之活體內半衰期更長(Mackness等人，MAbs.11(7)：1276-1288,2019)。
Figure 109116084-A0305-02-0040-7
另外，為了比較本發明之NTIG之FcRn結合親和力及IgG4 Fc之 FcRn結合親和力，本發明人經由表面電漿子共振(SPR)分析PG-11及利妥昔單抗(Rituximab，其為IgG1家族之商業重組嵌合抗CD20抗體)與FcRn之結合親和力。將PG-11及利妥昔單抗溶解於各種濃度(對於PG-11為2,000nM至1.96nM，且對於利妥昔單抗為4,000nM至3.9nM)之操作PBST緩衝溶液(pH為6.0)中，且接著與PG-11及Trulicity之比較性分析類似，在針對締合60秒、針對解離60秒及針對再生30秒之條件下進行締合、解離及再生。在再生期間，使用pH為7.4之PBS緩衝溶液。
如表7及圖27中所示，由於穩態親和力KD之比較性分析，利妥昔單抗之KD值為2,390nM且PG-11之KD值為256nM，且結果指示根據本發明之一個例示性實施例的PG-11與FcRn之親和力比利妥昔單抗高約9.3倍。
Figure 109116084-A0305-02-0041-8
如上文所述，相比於習知IgG1或IgG4之Fc區，根據本發明之一個例示性實施例的NTIG具有與FcRn之高親和力，且因此當活體內投與NTIG時，預期半衰期顯著改良。
隨後，本發明人意欲基於根據本發明之一個例示性實施例的NTIG(SEQ ID NO：7)比較SEQ ID NO：2之經修飾之IgG4 Fc域蛋白與FcRn之親和力。
為進行比較，替代計算簡單的KD值，本發明人藉由在pH 6.0處締合蛋白質且在pH 7.3處進行解離計算穩態親和力(KD)(Piche-Nicholas等人，MAbs.10(1)：81-94,2018)。特定言之，對於實例3-1中製備之抗PD-L1-NTIG-IL-2及抗PD-L1修飾之IgG4 Fc-IL-2與rhFcRn之結合親和力，藉由改變如上文所述之締合及解離期間的pH條件來進行SPR分析。
結果，如表8及圖28中所示，可發現施用NTIG之抗PD-L1-NTIG-IL-2與FcRn之親和力傾向於比使用經修飾之IgG4 Fc的抗PD-L1修飾之IgG4 Fc-IL-2更高。然而，在結合緩衝溶液之交換過程中，在抗PD-L1修飾之IgG4 Fc-IL-2蛋白樣品中產生大量蛋白聚集體，且因此存在結果可靠性不佳之問題。因此，藉由將測試材料變為配位體及將FcRn變為樣品再次進行相同實驗。
此等結果表明相比於先前已知的施用SEQ ID NO：2之經修飾之IgG4 Fc，施用NTIG展現經由增強所產生蛋白之FcRn結合力而增強活體內半衰期之效應以及對蛋白之物理特性及穩定性的優良效應。
Figure 109116084-A0305-02-0042-9
作為用於分析之緩衝溶液，使用操作緩衝溶液(1×PBST，pH為7.3)、樣品稀釋緩衝溶液(1×PBST，pH為6.0)、解離緩衝溶液(1×PBST，pH為7.3)及再生緩衝溶液(1×PBS，pH為8.0)。
作為分析之結果，如表9及圖29中所示，發現二種蛋白均展現快速結合及快速解離模式，二種蛋白均傾向於在中性條件(pH為7.3)下自與FcRn之結合充分解離，但在pH為6.0之情況下，抗PD-L1-NTIG-IL-2蛋白之親和力比抗PD-L1修飾之IgG4 Fc-IL-2蛋白之親和力高5.06倍。因此，相比於抗PD-L1修飾之IgG4 Fc-IL-2蛋白，抗PD-L1-NTIG-IL-2蛋白在pH為6.0之條件下展示甚至快速結合至較低濃度之FcRn的傾向。考慮到藉由內飲作用吸收至細胞中之含Fc蛋白在內體之低pH條件下結合至FcRn，結果強有力地表明含有NTIG之融合蛋白將藉由FcRn更有效地再循環。
Figure 109116084-A0305-02-0043-10
實驗實例2：分析與各種Fcγ受體之結合親和力
已知IgG1之Fc區與FcγRI及FcγRIIIa具有結合親和力。此等Fc受體與諸如ADCC及CDC之效應功能相關，且在使用抗體或Fc融合蛋白進行抗癌治療時在抗癌治療中有幫助，但缺點為出於治療除抗癌療法以外之其他疾病之目的使用API時引起副作用。
因此，本發明人經由生物層干涉量測術分析(BLI)來分析相比於IgG1抗體，根據本發明之一個例示性實施例的NTIG融合蛋白與FcγRI及FcγRIIIa的親和力程度。
結果，如圖30中所示，發現利妥昔單抗(其為基於IgG1之抗體)特異性結合至FcγRI及FcγRIIIa，而PG-11(其為根據本發明之一個例示性實施例的含NTIG之融合蛋白)不特異性結合至此等抗體受體。
此外，本發明人進行利妥昔單抗及根據本發明之一個例示性實施例的PG-11與FcγRIIa、FcγRIIb及FcγRIIIb之結合親和力的比較性分析。
結果，如圖31中所示，發現利妥昔單抗特異性結合至三種Fc受體。同時，根據本發明之一個例示性實施例的PG-11展示弱結合，但考慮到感測器圖譜之形狀，將該結合視為非特異性結合。
實驗實例3：分析與補體C1q之結合
抗體Fc區可藉由結合至補體C1q而誘導補體依賴性細胞毒性(CDC)，且因此可在Fc融合蛋白用於治療除癌症治療以外之一般疾病的臨床應 用中引起嚴重問題。因此，相比於利妥昔單抗(其為基於IgG1之抗體)分析根據本發明之一個例示性實施例的含NTIG之融合蛋白與補體C1q之結合親和力程度。
為進行比較，特定言之，PG-11及利妥昔單抗各用塗佈緩衝溶液(0.1M Na2HPO4，pH為9.6)稀釋以使得各濃度為2μg/ml。隨後，將100μl之各稀釋樣品裝載至各孔中且在4℃下反應隔夜。隨後，藉由每次添加300μl洗滌緩衝溶液至盤中而進行洗滌三次，將200μl封閉緩衝溶液(2% BSA/PBS)添加至各孔中且在室溫下反應2小時。將300μl洗滌緩衝溶液添加至盤中，接著反覆進行洗滌三次，將抗C1q抗體用分析緩衝溶液以1/3稀釋至10、3、1、0.3及0.1μg/ml，且以各孔中50μl之量混合(重複)，且接著將所得物在室溫下反應2小時。接著，將洗滌緩衝溶液以每次300μl在盤中混合且反覆進行洗滌八次。將C1q-HRP結合物稀釋400倍，且將50μl所得物添加至各孔中且在室溫下反應1小時。將洗滌緩衝溶液以每次300μl添加至盤中，反覆進行洗滌八次，混合50μl作為受質之TMB，且將所得物在室溫下反應。當顯色反應呈現藍色時，將50μl終止溶液添加至各孔中以終止反應，且接著使用設定為450nm之微量盤讀取器來量測光學密度。
作為分析之結果，如圖32中所示，發現利妥昔單抗以濃度依賴性方式結合至C1q，而根據本發明之一個例示性實施例的PG-11不結合至C1q。
因此，確認根據本發明之一個例示性實施例的NTIG為能夠最小化由Fc區所致之副作用，諸如ADCC或CDC，同時改良API之半衰期的安全蛋白載體。
實驗實例4：分析GLP-2活性
藉由cAMP HunterTM eXpress GPCR分析來研究就上文所述之實例中之多種含GLP-2之融合蛋白而言，是否恰當地展現GLP-2活性(表10)。
Figure 109116084-A0305-02-0045-11
作為分析之結果，如圖33及表11中所示，發現根據本發明之一個實例製備之融合蛋白中之PG-210-6展現與作為比較實例之PG-22幾乎類似的GLP-2活性，且本發明之另一實例之PG-210-5展現PG-210-6之活性大約一半的活性。亦發現MG12-4及MG12-5(其為雜二聚體)展現PG-22之GLP-2活性僅約一半的GLP-2活性，但由於MG12-4及MG12-5各含有一個GLP-2分子，在MG12-4及MG12-5之情況下，可預測相比於其中二個GLP-2分子結合之PG-22，活性降低50%。PG-210-5為施加先前專利文獻(US7812121B2)中所用之連接肽的蛋白，且發現使用本發明中所用之(G4S)3+IgG1鉸鏈之混合連接肽之PG-210-6的活性極佳。
Figure 109116084-A0305-02-0045-12
實驗實例5：分析IL-10Vm融合蛋白之免疫抑制活性
5-1：分析與IL-10受體之親和力
本發明人經由生物層干涉量測術分析(BLI)來分析實例2-3及2-4之融合蛋白與IL-10受體1(IL-10R1)之親和力。
對於該分析，本發明人使用Dip and ReadTM Amine反應性第2代(AR2G)試劑套組(forteBio，目錄號18-5092)將IL-10R His標籤蛋白連接至96孔盤。特定言之，將200μl D.W.分配至96孔盤中，且插入套組中所包括之胺生物 感測器以進行水合10分鐘。隨後，在另外將200μl D.W.分配至新的96孔盤中之後，以所需樣品量之1/20之量1：1混合EDC及NHS且接著用D.W.稀釋，且將200μl所得物分配至96孔盤中。隨後，將IL-10R His標籤蛋白在pH為5.0之10mM乙酸鹽溶液中稀釋至10μg/ml，且接著將200μl所得物添加至96孔盤中。在將200μl 1M乙醇胺添加至96孔盤中之後，將生物感測器盤及樣品盤置於Octet®-K2儀器中且量測。在量測完成之後，將200μl之1×動力學緩衝溶液添加至樣品盤中，且接著確定基線。此後，將製備之NTIG-IL-10融合蛋白用1×動力學緩衝溶液稀釋至各種濃度(0、62.5、125、250、500及1,000nM)，且將200μl所得物分配至樣品盤，且接著使用Octet®-K2儀器來量測生物層干涉量測術(BLI)。
Figure 109116084-A0305-02-0046-14
結果，如圖34及表12中所示，根據本發明之實例2-4之融合蛋白(NTIG-IL-10Vm)的KD值為29.2nM，其為實例2-3之二聚IL-10融合蛋白之KD值(11.1nM)的約三倍。結果可解釋單體IL-10突變融合蛋白具有比二聚IL-10蛋白更低的受體親和力，但可預測親和力可由於單體形成而降低。
5-2：分析IL-10Vm融合蛋白之免疫抑制活性
本發明人分析含有根據本發明之一個例示性實施例的單體IL-10突變蛋白(IL-10Vm)的各種融合蛋白(PG-088m、PG-110、PG-410及PG-210-6)之活體外免疫抑制活性。
對於該分析，特定言之，在自包括培養之巨噬細胞Raw264.7的T75燒瓶移除上清液之後，用PBS進行一次洗滌，接著添加3ml TrypLETM Select酶，且將所得物在37℃下反應3至5分鐘。此後，將10ml新鮮培養基添加至 T75燒瓶中，且將來自燒瓶底部之細胞懸浮液轉移至50ml錐形管中且接著以1,500rpm離心5分鐘。隨後，移除上清液且平緩地輕拍管以釋放細胞。接著混合5ml新鮮培養基且對細胞計數。將細胞濃度調節至1×105個細胞/毫升，且將100μl所得物分配至96孔平底盤中。
此後，將實例2-4中製備之PG-088m、實例3-3中製備之PG-110、實例4-3中製備之PG-410及實例6-4中製備之PG-210-6依序稀釋至各種濃度(針對PG-210-6及PG-410為0至1,000nM，且針對pg-110及PG-088m為0至1,507nM)，且接著將50μl之各蛋白分配至96孔盤中，該盤中分配有巨噬細胞Raw264.7。20分鐘後，以50μl增量處理脂多醣(LPS)以使得最終濃度為400ng/ml，且在36℃下培養所得物16小時。次日，收集上清液，且接著根據製造商之方案進行TNF-α ELISA(Biolegend，USA)分析。
結果，如圖35a至圖35c中所示，發現所有含有根據本發明之一個例示性實施例之IL-10Vm的融合蛋白均以濃度依賴性方式抑制巨噬細胞中之TNF-α分泌。未發現根據融合蛋白類型之顯著差異。結果指示根據本發明之一個例示性實施例的單體IL-10突變蛋白(IL-10Vm)即使在單體IL-10突變蛋白連接至NTIG蛋白之C端時亦適當地起作用。
5-3：分析IgE結合能力
本發明人經由生物層干涉量測術分析(BLI)來分析實例3-3中製備之融合蛋白(FcεRIα-NTIG-IL-10Vm)與小鼠IgE及人類IgE之親和力。
對於該分析，本發明人首先使用Dip and ReadTM胺反應性第2代(AR2G)試劑套組(forteBio，目錄號18-5092)將作為對照組的不具有IL-10Vm之FcεRIα-NTIG蛋白及實例3-3中製備之融合蛋白連接至96孔盤。特定言之，將200μl D.W.分配至96孔盤中，且接著插入套組中所包括之胺生物感測器以進行水合10分鐘。隨後，在另外分配200μl D.W.之後，以所需樣品量之1/20之量 1：1混合EDC及NHS且接著用D.W.稀釋，且將200μl所得物分配至96孔盤中。隨後，將FcεRIα修飾之IgG4 Fc蛋白及FcεRIα-NTIG-IL-10Vm融合蛋白在pH為5.0之10mM乙酸鹽溶液中稀釋至10μg/ml，且接著將200μl所得物添加至96孔盤中。在將200μl 1M乙醇胺添加至96孔盤中之後，將生物感測器盤及樣品盤置於Octet®-K2儀器中且量測。在量測完成之後，將200μl之1×動力學緩衝溶液添加至樣品盤中，且接著確定基線。此後，抗DNP小鼠IgE(Sigma)用1×動力學緩衝溶液稀釋至各種濃度(50pM至3.125nM)，且將200μl所得物分配至樣品盤，且接著使用Octet®-K2儀器來量測生物層干涉量測術(BLI)。
Figure 109116084-A0305-02-0048-16
結果，如圖36a及表13中所示，根據本發明之一個例示性實施例之融合蛋白(FcεRIα-NTIG-IL-10Vm)的KD值為0.284nM，其略微低於作為對照組之FcεRIα修飾之IgG4 F的KD值。然而，該差異並非顯著差異，且因此發現未藉由添加單體IL-10蛋白降低與IgE之結合能力。
除了以上結果以外，為了量測本發明中使用之人類FcεRIα及人類IgE之結合程度，本發明人使用上述BLI方法分析實例3-3之融合蛋白(PG-110)與人類IgE之親和力。
Figure 109116084-A0305-02-0049-17
結果，如圖36b及表14中所示，根據本發明之一個例示性實施例的融合蛋白與人類IgE之親和力亦類似於與小鼠IgE之親和力。
5-4：分析針對IgE之抑制活性
隨後，本發明人藉由活體外實驗來研究實例3-3中製備之融合蛋白(FcεRIα-NTIG-IL-10Vm)是否展現針對IgE之抑制活性。
對於該研究，特定言之，將作為對照組之FcεRIα修飾之IgG4 Fc及作為實驗材料之實例3-3之融合蛋白(PG-110)依序稀釋至各種濃度以製備樣品，且將樣品與1μl/ml之抗DNP小鼠IgE混合且在室溫下反應30分鐘。接著，將獲自小鼠之骨髓源性肥大細胞用HBSS緩衝溶液洗滌，調節以使得濃度為5×105個細胞/60微升，且接著分配至96孔盤中。將20μl樣品與IgE反應且將測試藥物添加至先前製備之肥大細胞中，且在培育箱中以37℃及5% CO2之條件培養所得物25分鐘。隨後，添加20μl DNP BSA(500ng/ml)，且再次將所得物在培育箱中以37℃及5% CO2之條件培養30分鐘且在4℃下以1,500rpm之速率離心，且分離30μl上清液。將30μl分離之上清液及30μl受質(4-硝苯基N-乙醯基-β-胺基葡糖苷，5.84mM)混合且在培育箱中以37℃及5% CO2之條件培養25分鐘。400μl之0.1M碳酸鈉緩衝溶液(pH為10)經混合且反應終止。此後，藉由量測405nm處之吸光度來比較自肥大細胞分泌之β-己醣胺酶的相對量，且檢查根據各藥物濃度之肥大細胞抑制效應。獨立地進行該分析三次且獲得其平均值。
結果，如圖37及表15中所示，根據本發明之一個例示性實施例 的融合蛋白PG-110以濃度依賴性方式抑制IgE之活性，其程度與作為對照組之FcεRIα修飾之IgG4 Fc類似，但根據本發明之一個例示性實施例之融合蛋白PG-110之IC50略微低於FcεRIα修飾之IgG4 Fc。
Figure 109116084-A0305-02-0050-18
實驗實例6：分析與CD40L之結合
本發明人經由BLI分析來研究分別在本發明之實例4-2及4-3中製備之PG-400及PG-410與人類CD40L的結合親和力。
對於該研究，特定言之，將200μl蒸餾水分配至96孔黑色平底盤上，將biocenter托盤置於水合之黑色盤上，且接著插入胺生物感測器以進行水合10分鐘。接著，將200μl蒸餾水分配至新的96孔黑色樣品盤上，以所需量之1/20之量1：1混合EDC及NHS且接著用蒸餾水稀釋，且將200μl所得物分配至96孔黑色樣品盤中。隨後，將人類CD40L(Peptrotech，Korea)在10mM乙酸鹽溶液(pH為6.0)中稀釋至5μg/ml，且接著將200μl所得物添加至96孔黑色樣品盤中。將200μl 1M乙醇胺添加至盤中，將生物感測器盤及樣品盤置於Octet®-K2儀器中，且在胺感測器上量測CD40L之結合程度。在量測完成之後，將96孔黑色樣品盤自量測儀器取出，200μl之1×動力學緩衝溶液經混合，且設定基線。PG-410及PG-400(其為分析物)依序用1×動力學緩衝溶液稀釋以使得濃度為200至12.5nM，且接著將200μl所得物分配至96孔黑色樣品盤中。再次將樣品盤置於Octet®-K2儀器中，且接著藉由BLI分析來量測與CD40L之結合程度。
Figure 109116084-A0305-02-0050-28
Figure 109116084-A0305-02-0051-20
結果，如圖38及表16中所示，根據本發明之一個例示性實施例的融合蛋白(PG-410)對於CD40L之Kon值比對於PG-400低4.3倍，但KD值為fM或更小(<1E-12)，其指示極高結合親和力，且因此，確認PG-400及PG-410蛋白可充分結合至人類CD40L。此處，發現PG-410(其為根據本發明之一個例示性實施例的融合蛋白(抗CD40L-NTIG-IL-10Vm)以極高結合親和力結合至CD40L。
實驗實例7：PG-110之藥物動力學分析
本發明人藉由比較根據實例3-3之上文所製備之雙特異性融合蛋白(PG-110)之半衰期、曲線下面積(AUC)、血液最高濃度(Cmax)及其類似物來檢查藥物動力學概況(PK)。
特定言之，藉由皮下(SC)、靜脈內(IV)、腹膜內(IP)及肌肉內(IM)途徑以1mg/kg之劑量向每組三隻雄性史泊格多利(Sprague Dawley，SD)大鼠投與待測試之融合蛋白(PG-110)。在注射前及注射後0.5、1、5、10、24、48、72、120、168、240及336小時之後獲得血液，且接著儲存於室溫下30分鐘以使其聚集。聚集之血液以3,000rpm離心10分鐘，且接著獲得各樣品之血清且儲存於低溫冷凍器中。使用可特異性偵測所投與蛋白質中之Fc的IgG-Fc定量裝置(Bethyl，目錄號E80-104，批次號E80-104-30)分析根據本發明之一個例示性實施例的融合蛋白於血清中之濃度。
結果，如圖39中所示，發現NTIG所融合之生理學活性蛋白可不管投與途徑而長期維持於體內。
已參考上述實例及實驗實例描述本發明，但該描述僅為例示性的，且熟習此項技術者可理解，可自其得出各種修改及其他等效實施例。因此，本發明之實際技術保護範疇應由所附申請專利範圍之技術精神來確定。
工業可用性
根據本發明之一個例示性實施例的NTIG蛋白為各種生物活性蛋白之融合搭配物，且藉由有效增加生物活性蛋白之半衰期而增加生物活性蛋白之治療效果，以及藉由最小化諸如ADCC及CDC之效應功能(其為Fc融合蛋白之缺點)而使得能夠更安全地遞送藥物。因此，根據本發明之一個例示性實施例的NTIG蛋白可有效地用於製備蛋白藥物。
<110> 南韓商普羅根有限公司(PROGEN CO.,LTD.)
<120> 新穎的經修飾之免疫球蛋白Fc融合蛋白及其用途
<140> TW 109116084
<141> 2020-05-14
<150> US 62/847470
<151> 2019-05-14
<160> 77
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修飾之IgG4 Fc，C端離胺酸經缺失
<400> 1
Figure 109116084-A0305-02-0053-29
Figure 109116084-A0305-02-0054-30
<210> 2
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修飾之IgG4 Fc
<400> 2
Figure 109116084-A0305-02-0054-31
Figure 109116084-A0305-02-0055-32
<210> 3
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修飾之IgG4 Fc杵
<400> 3
Figure 109116084-A0305-02-0055-33
Figure 109116084-A0305-02-0056-34
<210> 4
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修飾之IgG4 Fc臼
<400> 4
Figure 109116084-A0305-02-0056-35
Figure 109116084-A0305-02-0057-36
<210> 5
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NTIG共同序列
<220>
<221> VARIANT
<222> (18)
<223> 天冬醯胺、離胺酸或麩醯胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (196)
<223> 丙胺酸、苯丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、纈胺酸、脯胺酸或色胺酸
<400> 5
Figure 109116084-A0305-02-0057-38
Figure 109116084-A0305-02-0058-39
<210> 6
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NTIG，C端離胺酸經缺失
<400> 6
Figure 109116084-A0305-02-0058-40
Figure 109116084-A0305-02-0059-42
<210> 7
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NTIG
<400> 7
Figure 109116084-A0305-02-0059-43
Figure 109116084-A0305-02-0060-44
<210> 8
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NTIG杵
<400> 8
Figure 109116084-A0305-02-0060-47
Figure 109116084-A0305-02-0061-48
<210> 9
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NTIG臼
<400> 9
Figure 109116084-A0305-02-0061-50
Figure 109116084-A0305-02-0062-51
<210> 10
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼NTIG之聚核苷酸，C端離胺酸經缺失
<400> 10
Figure 109116084-A0305-02-0063-54
<210> 11
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼NTIG之聚核苷酸
<400> 11
Figure 109116084-A0305-02-0063-55
Figure 109116084-A0305-02-0064-56
<210> 12
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼NTIG杵之聚核苷酸
<400> 12
Figure 109116084-A0305-02-0064-57
<210> 13
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼NTIG臼之聚核苷酸
<400> 13
Figure 109116084-A0305-02-0064-59
Figure 109116084-A0305-02-0065-60
<210> 14
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 14
Figure 109116084-A0305-02-0065-61
<210> 15
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 15
Figure 109116084-A0305-02-0066-63
<210> 16
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 16
Figure 109116084-A0305-02-0066-64
<210> 17
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 17
Figure 109116084-A0305-02-0066-65
<210> 18
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 18
Figure 109116084-A0305-02-0067-66
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 19
Figure 109116084-A0305-02-0067-69
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 20
Figure 109116084-A0305-02-0067-71
<210> 21
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 21
Figure 109116084-A0305-02-0067-72
Figure 109116084-A0305-02-0068-73
<210> 22
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 22
Figure 109116084-A0305-02-0068-74
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 23
Figure 109116084-A0305-02-0068-75
<210> 24
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 24
Figure 109116084-A0305-02-0069-76
<210> 25
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 25
Figure 109116084-A0305-02-0069-79
<210> 26
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 26
Figure 109116084-A0305-02-0069-81
<210> 27
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 27
Figure 109116084-A0305-02-0070-82
<210> 28
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 28
Figure 109116084-A0305-02-0070-83
<210> 29
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 29
Figure 109116084-A0305-02-0070-84
<210> 30
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 30
Figure 109116084-A0305-02-0070-85
<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 31
Figure 109116084-A0305-02-0071-86
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 32
Figure 109116084-A0305-02-0071-87
<210> 33
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 33
Figure 109116084-A0305-02-0071-88
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 34
Figure 109116084-A0305-02-0072-89
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 35
Figure 109116084-A0305-02-0072-90
<210> 36
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 36
Figure 109116084-A0305-02-0072-91
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 37
Figure 109116084-A0305-02-0072-92
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 38
Figure 109116084-A0305-02-0073-93
<210> 39
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 39
Figure 109116084-A0305-02-0073-94
<210> 40
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 40
Figure 109116084-A0305-02-0073-95
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 41
Figure 109116084-A0305-02-0074-96
<210> 42
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 42
Figure 109116084-A0305-02-0074-97
<210> 43
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 43
Figure 109116084-A0305-02-0074-98
<210> 44
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 44
Figure 109116084-A0305-02-0075-99
<210> 45
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 45
Figure 109116084-A0305-02-0075-100
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 46
Figure 109116084-A0305-02-0075-101
<210> 47
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 47
Figure 109116084-A0305-02-0075-102
<210> 48
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽
<400> 48
Figure 109116084-A0305-02-0076-103
<210> 49
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-1/腸促胰島素類似物(Exendin)雜交肽
<400> 49
Figure 109116084-A0305-02-0076-104
<210> 50
<211> 287
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-1E-NTIG
<400> 50
Figure 109116084-A0305-02-0076-106
Figure 109116084-A0305-02-0077-107
<210> 51
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tPA信號肽
<400> 51
Figure 109116084-A0305-02-0078-108
<210> 52
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-2-2G(替度魯肽(Teduglutide))
<400> 52
Figure 109116084-A0305-02-0078-109
<210> 53
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-2-2G-NTIG
<400> 53
Figure 109116084-A0305-02-0078-110
Figure 109116084-A0305-02-0079-22
<210> 54
<211> 160
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-10V
<400> 54
Figure 109116084-A0305-02-0080-111
<210> 55
<211> 425
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NTIG-IL-10V
<400> 55
Figure 109116084-A0305-02-0081-114
Figure 109116084-A0305-02-0082-115
<210> 56
<211> 169
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-10Vm
<400> 56
Figure 109116084-A0305-02-0082-118
Figure 109116084-A0305-02-0083-119
<210> 57
<211> 403
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NTIG-IL-10Vm
<400> 57
Figure 109116084-A0305-02-0083-120
Figure 109116084-A0305-02-0084-23
Figure 109116084-A0305-02-0085-121
<210> 58
<211> 180
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FceRIa
<400> 58
Figure 109116084-A0305-02-0085-122
Figure 109116084-A0305-02-0086-123
<210> 59
<211> 605
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FceRIa-NTIG-IL-10V
<400> 59
Figure 109116084-A0305-02-0086-124
Figure 109116084-A0305-02-0087-24
Figure 109116084-A0305-02-0088-125
<210> 60
<211> 613
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FceRIa-NTIG-IL-10Vm
<400> 60
Figure 109116084-A0305-02-0088-126
Figure 109116084-A0305-02-0089-25
Figure 109116084-A0305-02-0090-26
<210> 61
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合抗CD40L重鏈VH-CH1
<400> 61
Figure 109116084-A0305-02-0091-129
<210> 62
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合抗CD40L輕鏈
<400> 62
Figure 109116084-A0305-02-0092-130
<210> 63
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1重鏈信號序列
<400> 63
Figure 109116084-A0305-02-0093-131
<210> 64
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化抗CD40L重鏈VH-CH1
<400> 64
Figure 109116084-A0305-02-0093-135
Figure 109116084-A0305-02-0094-136
<210> 65
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鉸鏈+NTIG
<400> 65
Figure 109116084-A0305-02-0094-137
Figure 109116084-A0305-02-0095-138
<210> 66
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1輕鏈信號序列
<400> 66
Figure 109116084-A0305-02-0095-139
<210> 67
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化抗CD40L輕鏈
<400> 67
Figure 109116084-A0305-02-0096-140
<210> 68
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鉸鏈+NTIG，離胺酸經缺失
<400> 68
Figure 109116084-A0305-02-0097-141
<210> 69
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化抗CD40L VL
<400> 69
Figure 109116084-A0305-02-0098-142
<210> 70
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化抗CD40L VH
<400> 70
Figure 109116084-A0305-02-0098-144
Figure 109116084-A0305-02-0099-145
<210> 71
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-1E-NTIG杵聚糖連接子
<400> 71
Figure 109116084-A0305-02-0099-146
Figure 109116084-A0305-02-0100-147
<210> 72
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-2-2G-NTIG臼非聚糖連接子
<400> 72
Figure 109116084-A0305-02-0100-148
Figure 109116084-A0305-02-0101-149
<210> 73
<211> 287
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-1E-NTIG杵非聚糖連接子
<400> 73
Figure 109116084-A0305-02-0102-150
Figure 109116084-A0305-02-0103-151
<210> 74
<211> 314
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-13Rα2
<400> 74
Figure 109116084-A0305-02-0103-152
Figure 109116084-A0305-02-0104-153
<210> 75
<211> 160
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-10wt
<400> 75
Figure 109116084-A0305-02-0104-155
Figure 109116084-A0305-02-0105-156
<210> 76
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-2-2(3點突變)
<400> 76
Figure 109116084-A0305-02-0105-160
<210> 77
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 CH3
<400> 77
Figure 109116084-A0305-02-0105-158
Figure 109116084-A0305-02-0106-27
10:融合蛋白
11:生物活性蛋白，活性醫藥成分
12:免疫球蛋白Fc域突變蛋白
13:鉸鏈區

Claims (11)

  1. 一種免疫球蛋白Fc域突變蛋白，其中包括選自由SEQ ID NO：1至4組成之群的一胺基酸序列之一經修飾之IgG4 Fc域蛋白之第18及第196胺基酸係分別突變成麩醯胺酸及白胺酸。
  2. 如請求項1之免疫球蛋白Fc域突變蛋白，其包含選自由SEQ ID NO：6至9組成之群的一胺基酸序列。
  3. 一種融合蛋白，其中至少一個生物活性蛋白連接至如請求項1之免疫球蛋白Fc域突變蛋白之一N端及/或一C端。
  4. 如請求項3之融合蛋白，其中該生物活性蛋白係經由一連接肽或一抗體之一鉸鏈區連接至該免疫球蛋白Fc域突變蛋白之該N端或該C端。
  5. 如請求項3之融合蛋白，其中該生物活性蛋白為一細胞介素、一酶、一凝血因子、一膜受體之一細胞外域、一生長因子、一肽激素或一抗體模擬劑。
  6. 一種聚核苷酸，其編碼如請求項1之免疫球蛋白Fc域突變蛋白或如請求項3之融合蛋白。
  7. 一種重組載體，其包含如請求項6之聚核苷酸。
  8. 一種均二聚體(homodimer)，其包含如請求項3之融合蛋白。
  9. 一種雜二聚體(heterodimer)，其包含如請求項3之融合蛋白。
  10. 如請求項9之雜二聚體，其中該免疫球蛋白Fc域突變蛋白具有一杵-臼結構(a knobs-into-holes structure)。
  11. 一種組合物，其包含選自由以下組成之群之至少一者作為活性成分：如請求項3之融合蛋白、如請求項8之均二聚體及如請求項9之雜二聚體。
TW109116084A 2019-05-14 2020-05-14 新穎的經修飾之免疫球蛋白Ｆｃ融合蛋白及其用途 TWI759742B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962847470P 2019-05-14 2019-05-14
US62/847,470 2019-05-14

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW202100564A TW202100564A (zh) 2021-01-01
TWI759742B true TWI759742B (zh) 2022-04-01

Family

ID=73290271

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW109116084A TWI759742B (zh) 2019-05-14 2020-05-14 新穎的經修飾之免疫球蛋白Ｆｃ融合蛋白及其用途

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20230174617A1 (zh)
EP (1) EP3995508A4 (zh)
JP (1) JP7445678B2 (zh)
KR (2) KR102408608B1 (zh)
CN (1) CN114144428A (zh)
AU (1) AU2020273903A1 (zh)
CA (1) CA3140561A1 (zh)
TW (1) TWI759742B (zh)
WO (1) WO2020231199A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114302891A (zh) * 2019-07-08 2022-04-08 普罗根有限公司 新的il-10变体蛋白及其用途
US20220259278A1 (en) * 2019-07-08 2022-08-18 Progen Co., Ltd. Novel fusion protein and use of same
WO2021182928A1 (ko) * 2020-03-12 2021-09-16 주식회사 에스엘메타젠 신규 이중 특이성 단백질 및 그의 용도
KR20220099656A (ko) * 2021-01-07 2022-07-14 주식회사 프로젠 신규 il-10 변이체 융합단백질 생산용 세포주 및 그의 용도

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2635607A1 (en) * 2010-11-05 2013-09-11 Zymeworks, Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the fc domain
CN104080811A (zh) * 2011-11-04 2014-10-01 酵活有限公司 在Fc结构域中具有突变的稳定异源二聚的抗体设计

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
PT1562972E (pt) 2002-10-15 2010-11-10 Facet Biotech Corp Alteração de afinidades de ligação ao fcrn ou semi-vidas séricas de anticorpos por mutagénese
US7217797B2 (en) * 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
CA2545539A1 (en) 2003-10-15 2005-04-28 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of fc-fusion protein serum half-lives by mutagenesis of positions 250, 314 and/or 428 of the heavy chain constant region of ig
US20060074225A1 (en) 2004-09-14 2006-04-06 Xencor, Inc. Monomeric immunoglobulin Fc domains
JP5290177B2 (ja) 2006-08-31 2013-09-18 セントカー・インコーポレーテツド Ｇｌｐ−２ミメティボディ、ポリペプチド、組成物、方法および用途
KR20080095141A (ko) * 2007-04-23 2008-10-28 포항공과대학교 산학협력단 인간 알부민 링커를 통하여 면역글로불린의 Ｆｃ에 결합된생리학적 활성 폴리펩티드의 융합 폴리펩티드, 및 이의제조방법
CN103626875B (zh) * 2007-05-30 2016-01-13 浦项工科大学校产学协力团 免疫球蛋白融合蛋白
KR101442254B1 (ko) 2008-02-22 2014-09-24 포항공과대학교 산학협력단 최적의 진핵 세포 발현 벡터의 개발
US8883134B2 (en) * 2010-10-20 2014-11-11 Handok Pharmaceuticals, Inc. Human interleukin-1 receptor antagonist—hybrid Fc fusion protein
US10106624B2 (en) * 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
WO2015009052A1 (ko) 2013-07-16 2015-01-22 일동제약 주식회사 하이브리드 면역글로불린 fc와 효소의 융합단백질
KR101825048B1 (ko) * 2014-12-31 2018-02-05 주식회사 제넥신 GLP 및 면역글로불린 하이브리드 Fc 융합 폴리펩타이드 및 이의 용도
KR20160132694A (ko) 2015-05-11 2016-11-21 주식회사 프로젠 Cd154에 특이적으로 결합하는 항체
KR101873201B1 (ko) * 2015-06-11 2018-07-02 주식회사 제넥신 변형된 인터루킨-7 단백질 및 이의 용도
KR102346336B1 (ko) * 2017-04-05 2022-01-04 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd1 및 lag3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체
KR20180119135A (ko) * 2017-04-24 2018-11-01 주식회사 제넥신 4-1bbl 변이체 및 이를 포함하는 융합 단백질
JP2018138022A (ja) * 2018-02-23 2018-09-06 ゲンマブ ビー．ブイ． ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域変異体およびその使用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2635607A1 (en) * 2010-11-05 2013-09-11 Zymeworks, Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the fc domain
CN104080811A (zh) * 2011-11-04 2014-10-01 酵活有限公司 在Fc结构域中具有突变的稳定异源二聚的抗体设计

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
期刊韕Schlothauer et al.,韕 韕"Novel human IgG1 and IgG4 Fc-engineered antibodies with completely abolished immune effector functions"韕vol. 29, no. 10,韕Protein Engineering, Design & Selection,韕2016,韕pp. 457–466韕 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3995508A4 (en) 2023-09-27
KR102408608B1 (ko) 2022-06-15
KR20210155395A (ko) 2021-12-22
AU2020273903A1 (en) 2022-01-06
CA3140561A1 (en) 2020-11-19
JP7445678B2 (ja) 2024-03-07
WO2020231199A1 (ko) 2020-11-19
CN114144428A (zh) 2022-03-04
KR20220080221A (ko) 2022-06-14
JP2022532414A (ja) 2022-07-14
TW202100564A (zh) 2021-01-01
US20230174617A1 (en) 2023-06-08
EP3995508A1 (en) 2022-05-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI759742B (zh) 新穎的經修飾之免疫球蛋白Ｆｃ融合蛋白及其用途
US11208459B2 (en) Constructs having a SIRP-alpha domain or variant thereof
AU2018201901B2 (en) Single domain binding molecule
JP7450535B2 (ja) 単一特異性抗体から多重特異性抗体を生成させるための方法
KR102095096B1 (ko) 다중특이적 항체 플랫폼 및 관련 방법
KR20200020703A (ko) 이종이량체화 Ig 도메인
CN115667305A (zh) 修饰的免疫球蛋白fc区
JP2020503873A (ja) 多重特異的抗体を調製するためのポリペプチドリンカー
JP2023519776A (ja) 多重特異性抗原結合分子を製造するための方法
JP2021526026A (ja) 翻訳後修飾が低減したペプチドリンカー
JP7076571B2 (ja) 細胞エンゲージ結合分子
RU2800919C2 (ru) Новый модифицированный слитый белок fc-фрагмента иммуноглобулина и его применение
WO2019197979A1 (en) Cell engaging binding molecules
TW202321312A (zh) 包含基於ｍｈｃ或ｍｈｃ樣蛋白的異源二聚體的二價雙特異性嵌合抗體
JP2023554515A (ja) エフェクターレスｆｃ分子
WO2023242319A1 (en) Variant antibodies that bind gamma-delta t cell receptors
JP2021530989A (ja) ＰＤ−Ｌ１を標的とした改変されたＦｃ抗原結合ドメイン構築体に関する組成物および方法
CN117964732A (zh) 具有SIRP-α结构域或其变体的构建体