KR101442254B1

KR101442254B1 - 최적의 진핵 세포 발현 벡터의 개발

Info

Publication number: KR101442254B1
Application number: KR1020080016489A
Authority: KR
Inventors: 성영철; 박기석; 안소신
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2008-02-22
Filing date: 2008-02-22
Publication date: 2014-09-24
Also published as: KR20090090924A

Abstract

본 발명은 유전자 치료 및 DNA 백신에 있어서 최적의 조건을 가지는 벡터 (vector)의 개발에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 다양한 구성요소들을 조합함으로써 개발된 진핵세포 발현 벡터들에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 개발된 다양한 진핵 세포 발현 벡터들에 인터루킨-12 변형체 유전자를 삽입하였을 경우, 인터루킨-12 변형체 유전자의 발현을 높게 유도할 수 있는 pGX27 벡터 및 pGX28 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 최적의 벡터는 목적 유전자를 삽입하여 유전자 치료 또는 DNA 백신에 유용하게 사용될 수 있다.

플라스미드, 진핵 세포 발현 벡터, 유전자 치료, DNA 백신, 인터루킨-12 변형체, pGX27, pGX28

Description

최적의 진핵 세포 발현 벡터의 개발 {Development of Optimal Eukaryotic Expression Vector}

본 발명은 유전자 치료 및 DNA 백신에 있어서 최적의 조건을 가지는 벡터 (vector)의 개발에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 다양한 구성요소들을 조합함으로써 개발된 진핵세포 발현 벡터들에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 개발된 다양한 진핵 세포 발현 벡터들에 인터루킨-12 변형체 유전자를 삽입하였을 경우, 인터루킨-12 변형체 유전자의 발현을 높게 유도할 수 있는 pGX27 벡터 및 pGX28 벡터에 관한 것이다.

기존의 면역 치료제로 개발되어 사용되고 있는 여러 종류의 화학 약품들은 그 효과가 한시적이고 또한 여러 부작용이 수반되는 한계를 가지고 있으며, 주로 사이토카인(cytokine) 또는 항체들이 대부분인 단백질 제재들은 생체 외(in vitro)에서 대량 생산하는데 막대한 비용이 들 뿐 아니라, 오랜 기간 동안 인체에 대한 안전성 실험을 해야 한다는 점들이 개발의 큰 걸림돌이 되고 있다. 현재 다수의 난 치성 및 감염성 질환들의 치료에는 화학 요법 및 단백질 제재 등이 주로 사용되고 있으나 완치가 어려운 실정이다. 예를 들면 최근 완치가 가능하다고 여겨졌던 결핵이 급증하고 있는 이유도 어떤 종류의 화학 치료제에도 저항성을 가지는 새로운 종류의 결핵균이 발생하고 있기 때문이다.

이러한 화학 약품 및 단백질 제재 등의 단점을 극복할 수 있는 새로운 치료 방법이 DNA, 즉 유전자를 이용한 치료 및 예방법으로 이러한 방법은 내성이 생기지 않을 뿐 아니라, 저렴하면서도 효과적으로 감염성 질환 치료, 유전자 결손에 의한 질병 치료 및 예방 백신 등에 이용될 수 있는 가능성을 보여주고 있다. 특히 DNA를 이용하여 면역 치료에 사용하는 DNA 백신은 항원 특이적인 체액성 면역 반응 및 세포성 면역반응을 모두 유도할 수 있으며, 특히 강력한 Th1 및 CTL 반응을 일으킬 수 있어 치료를 위해서 세포성 면역 반응이 필수적으로 요구되는 여러 가지 만성 질환의 치료 및 예방에 응용될 수 있다.

일반적으로, DNA를 이용한 면역화 방법에 있어서 가장 중요한 요건은 발현시키고자 하는 목적 유전자(target gene)를 세포 내로 얼마나 효율적으로 전달할 수 있느냐이다. DNA 면역화 방법은 생체 내로의 전달 효율이 낮아 바이러스를 이용한 벡터 시스템이 각광받고 있으나, 현재 그 안전성 문제로 사용이 제한되고 있는 실정이다. 반면 네이키드(naked) DNA와 같은 비 바이러스성 벡터를 이용하는 시도는 안전하지만, 생체 내로의 전달 효율이 비교적 낮다. 따라서 이러한 비 바이러스성 벡터를 이용한 DNA 면역화 방법에 있어서 관건이 될 수 있는 것이 최적의 벡터의 개발을 통한 목적 유전자의 발현 증진과 그 안정성의 극대화 여부이다.

DNA 면역화 방법에 사용되는 비 바이러스성 플라스미드(plasmid) 벡터의 효율에 영향을 주는 여러 가지 요인들이 보고 되어 왔다. 가장 중요한 요인은 벡터가 얼마나 안정적으로 많은 양의 목적 단백질을 생체 내에서 발현시킬 수 있느냐에 있다. 이러한 목적 유전자 발현 및 안정화에 영향을 줄 수 있는 요인들은 첫째, 바이러스 프로모터 (promoter)와 인핸서 (Enhancer)로서, 벡터 내 각각 목적 유전자의 전사 개시(transcription initiation) 조절 및 전사 효율 증진을 통해 그 발현을 향상시킬 수 있다. 둘째, 인트론 (intron) 및 poly(A) (poly adenylation) 서열은 mRNA의 안정화를 유도함으로써 목적 유전자의 발현을 증진시킬 수 있다. 높은 수준의 목적 유전자 발현은 강력한 면역 반응을 유도할 수 있다고 알려져 있으며 (Barry et al., Vaccine 15:788-91, 1997; Leitner et al., J. Immunol. 159:6112-9, 1997), 유전자 결손 질병 치료에 있어서도 필수적인 요소이다. 셋째, 번역 (translation) 효율이나 DNA 자체의 안정성을 증진시킴으로써 목적 유전자의 발현을 증진시킬 수 있는 서열이 벡터의 구성 요소가 될 수 있다. 이 외에도, 벡터 백본(backbone) 내에 존재하는 비메틸화 (unmethylated) CpG 디뉴클레오티드 (dinucleotide)로 구성된 DNA 모티프 (motif)가 면역 시스템을 자극할 수 있음이 알려져 있다 (Krieg et al., Nature, 374:546-9, 1995). 이러한 면역자극 서열 (immunostimulatory sequence: ISS)은 Th1 면역 반응을 유도함으로써 DNA 면역 치료 등의 효율을 높일 수 있다 (Roman et al., Nat. Med. 3:849-54, 1997; Chu et al., J. Exp. Med. 186:1623-31, 1997). 따라서, 이러한 여러 가지 요소들의 가장 적절한 조합이 이루어졌을 때 최적의 유전자 발현 효율 및 면역 치료 효율이 얻어 질 수 있을 것이다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 현재까지 알려진 다양한 프로모터/인핸서 서열, poly(A) 서열 및 인트론 서열 등을 조합하여 목적 유전자의 발현 수준을 증가시키고 생체 내에서 면역반응 유도에 적합한 벡터들을 개발하고자 예의 노력한 결과, pCMV, gIVS, MCS, SV40 poly(A), SV40 인핸서 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 pGX27 벡터 및 pCMV, TPL, MCS, bGH40 poly(A) 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 pGX28 벡터가 최적의 플라스미드 벡터로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은, 다양한 플라스미드 벡터 구성 요소들의 목적 유전자 발현 증진에 있어서의 효과를 비교하여 선별된 최적의 벡터 구성 요소를 제공하는 것이다.

구체적으로, 본 발명의 목적은, pCMV, gIVS, MCS, SV40 poly(A), SV40 인핸서 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 pGX27 벡터 및 pCMV, TPL, MCS, bGH40 poly(A) 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 pGX28 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은, 상기 재조합 벡터를 포함하는 백신 면역화 또는 유전자 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 하나의 양태로서, 본 발명은 pCMV, gIVS, MCS, SV40 poly(A), SV40 인핸서 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 pGX27 벡터 및 pCMV, TPL, MCS, bGH40 poly(A) 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 pGX28 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "pCMV" 란 사이토메갈로 바이러스 (Cytomegalovirus; CMV) 초기(early) 프로모터를 말한다. pCMV 는 가장 강력한 조절 요소로 알려져 왔고, 다양한 세포에서 활성을 지닌다 (Schmidt et al., Mol. Cell. Biol. 10:4406-11, 1990). 따라서, pCMV는 대부분의 포유동물 세포 발현 벡터에 사용되어 왔다.

본 발명에서 용어, "gIVS" 란 일종의 인트론 서열(intron sequence) 중의 하나로, 토끼의 베터 글로빈 유전자의 인트론을 말한다. 일반적으로 인트론 서열은 유전자 발현에 있어서 긍정적 효과를 가지고 있다고 시험관내(in vitro)에서 뿐만 아니라 (Buchman and Berg , 1988, Mol . Cell . Bilol . 8, 4395-4405; Huang and Gorman , 1990, Nucleic Acid Res . 18, 937-947)) 형질전환(transgenic) 생쥐내(in vivo)에서도 보고되었다 (Brinster et al .. 1988, Proc Natl . Acad . Sci . USA 85, 836-840).

본 발명에서 용어, "TPL" 은 아데노바이러스의 삼부 리더(tripartite leader, TPL) 서열을 말한다. 아데노바이러스의 TPL은 번역(translation) 효율을 증가시키는 것으로 알려져 있다 (Logan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81:3655-9, 1984).

본 발명에서 용어, "SV40 poly(A)" 란 시미안 바이러스 (Simian virus 40; SV40)의 후기(late) 폴리 아데닐 신호를 말한다. SV40 후기 poly(A) 는 SV40 초기(early) poly(A) 서열보다 RNA를 5배 더 안정화시킬 수 있다고 알려져 있다(Carswell et al ., Mol . Cell . Biol . 9:4248-58, 1989).

본 발명에서 용어, "bGH40 poly(A)" 란 소 성장인자 (bovine growth hormone; bGH) 폴리 아데닐 신호를 말한다. bGH40 poly(A) 서열은 SV40 초기 poly(A)나 인간 콜라겐(human collagen) poly(A) 보다 3배 더 높은 목적 유전자 발현을 나타내었다 (Pfarr et al ., DNA 5:115-22, 1986).

본 발명에서 용어, "SV40 인핸서" 는 시미안 바이러스 (Simian virus 40 ; SV40)의 인핸서를 말하며, DNA에 결합하는 RNA 중합효소 II (RNA polymerase II)의 수를 증가시킴으로써 전사효율을 높이는 것으로 알려져 있다 (Treisman et al., Nature , 315:73-5, 1985).

본 발명에서 용어, "항생제 저항성 유전자" 항생제에 대하여 저항성을 가지는 유전자로서, 이것을 가지고 있는 세포는 해당 항생제를 처리한 환경에서도 생존하므로, 대장균에서 대량으로 플라스미드를 얻는 과정에 선별 마커로서 유용하게 사용된다. 본 발명에서 항생제 저항성 유전자는 본 발명의 핵심적 기술인 벡터의 최적의 조합에 따른 발현 효율에 크게 영향을 미치는 요소가 아니므로, 선별 마커로서 일반적으로 사용되는 항생제 저항성 유전자를 제한 없이 사용할 수 있다. 구체적인 예로는, 앰피실린(ampicilin), 테트라사이클린(tetracyclin), 카나마이신(kanamycin), 클로람페니콜(chloroamphenicol), 스트렙토마이신(streptomycin), 또는 네오마이신(neomycin)에 대한 저항 유전자 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 카나마이신(kanamycin) 저항성 유전자(Kan)를 사용할 수 있다. 인간의 난치성 질환을 치료하는데 쓰일 네이키드 DNA 벡터 개발을 위하여는 인간 임상에서 사용될 수 있는 카나마이신 유전자가 널리 사용되어 왔다.

본 발명에서 용어, "MCS" 란 목적 단백질을 코딩하는 핵산 클로닝 부 위(Multiple cloning site)를 말한다. MCS는 특정 제한효소로 인지되어 절단되는 부위로, 절단된 부위에 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 간편하게 삽입될 수 있다.

상기 벡터의 클로닝 부위로 삽입 가능한 의학적으로 유용한 목적 단백질의 예에는 호르몬, 사이토카인, 효소, 응고인자, 수송 단백질, 수용체, 조절 단백질, 구조 단백질, 전사 인자, 항원, 항체 등이 있다.

목적 단백질은, 바람직하게는, 인간 인터루킨-12 변형체 유전자 (hp35/IRES/hp40-N222L; hIL-12m)이다. 인간 인터루킨-12 변형체 유전자(hIL-12m)는 인간 IL-12p40 소 단위체의 당쇄화 부분인 Asn-222 아미노산이 돌연변이화된 유전자로 이 유전자의 발현은 활성형의 IL-12p70의 발현을 증가시키면서 IL-12p40의 분비는 감소시키는 것으로 알려져 있으며, 국내등록특허 제10-0399728호에 개시되어 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 인간 인터루킨-12 변형체 유전자(hIL-12m)에 상응하는 생쥐 인터루킨-12 변형체 유전자(mp35/IRES/mp40-N220Q; mIL-12m)를 사용하였다. mIL-12m 은 쥐 IL-12p40 소단위체의 당쇄화 부분인 Asn-220 아미노산이 돌연변이화된 유전자로 이 유전자의 발현은 활성형의 IL-12p70의 발현을 증가시키면서 IL-12p40의 분비는 감소시키는 것으로 알려져 있으며 소동물(small animal) 모델인 생쥐에 HCV E2 유전자와 함께 면역화 하였을 경우 최적의 세포 매개성 면역 반응 특히 오랜 기간이 지난 뒤에도 이러한 면역반응이 지속적으로 유도되는 사실이 보고되었다 (Ha et al ., Nat . Biotechnol . 20:381-6, 2002).

본 발명에서, 상기 요소들은 인위적으로 합성 또는 유전적 재조합 방법을 통하여 제조할 수 있으며, 이를 발현할 수 있는 벡터에 작동적으로 연결시켜 제공된다.

본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 본 발명에서 용어, "작동가능하게 연결된(operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질을 코딩하는 핵산서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명에서는 현재까지 알려진 다양한 프로모터/인핸서 서열, poly(A) 서열 및 인트론 서열 등을 조합하여 목적 유전자의 발현 수준을 증가시키고 생체 내에서 면역반응 유도에 적합한 벡터들을 개발하고자, 기존의 여러 보고들을 토대로 하여 pCMV, gIVS, SV40 poly(A), SV40 인핸서, RSV 인핸서, bGH poly(A), Kan과 같은 플라스미드 벡터의 구성 요소들을 선별하고, 여러 가지 제한 효소를 이용하여 다음과 같이 다양한 조합의 플라스미드 벡터를 제조하였다 (도 1). 제작된 플라스미드 벡터는 구성 요소의 순서대로 배열되어 있다.

pVAX1-mIL-12m : pCMV, mIL-12m, bGH poly(A), Kan

pGX23-mIL-12m : pCMV, mIL-12m, SV40 poly(A), Kan

pGX24-mIL-12m : pCMV, gIVS, mIL-12m, SV40 poly(A), Kan

pGX25-mIL-12m : pCMV, gIVS, mIL-12m, SV40 poly(A), RSV 인핸서, Kan

pGX26-mIL-12m : pCMV, gIVS, mIL-12m, bGH poly(A), Kan

pGX27-mIL-12m : pCMV, gIVS, mIL-12m, SV40 poly(A), SV40 인핸서, Kan

pGX10-mIL-12m : pCMV, TPL, mIL-12m, SV40 poly(A), SV40 인핸서, Kan

pGX28-mIL-12m : pCMV, TPL, mIL-12m, bGH40 poly(A), Kan

또한, 이러한 플라스미드 벡터들 중 최적의 조합을 통해 높은 수준의 목적 유전자 발현을 나타내는 플라스미드 벡터를 선별하기 위하여, 본 발명에서는 쥐 인터루킨 12 변형체 유전자를 개발된 각 플라스미드 벡터에 삽입하고 각 벡터를 포유동물 세포인 COS-7 세포 및 Hela 세포에 형질전환 시킨 후, 이로부터 얻은 세포 상층액을 이용하여 쥐 인터루킨 12 p70에 대한 ELISA 분석을 수행하였다 (도 11).

SV40 poly(A)를 가지는 발현 플라스미드 벡터들의 형질 전환 후 세포 상층액에서 얻어지는 인터루킨 12 발현을 비교해 보면, pGX23-mIL-12m은 가장 낮은 인터루킨 12 발현 수준을 나타내었다. 이 발현 플라스미드 벡터에 gIVS가 더 첨가된 pGX24-mIL-12m은 pGX23-mIL-12m에 비해 높은 발현 수준을 보여주었으며 이는 gIVS의 영향임을 예상할 수 있다. 또한 pGX24-mIL-12m에서 RSV 인핸서를 첨가한 pGX25-mIL-12m은 pGX24-mIL-12m과 유사한 발현 수준을 보여주었으며 이는 RSV40 인핸서가 이 조합의 구성에서는 발현수준 향상에 영향을 미치지 않음을 예상할 수 있다. 하지만 pGX25-mIL-12m에서 RSV 인핸서 대신 SV40 인핸서로 치환한 pGX27-mIL-12m은 pGX24-mIL-12m와 pGX25-mIL-12m에 비해 더 증가된 발현 수준을 보여주었으며 이 조합의 구성이 가장 높은 발현 수준을 보여줌을 알 수 있다. pGX27 벡터의 조합이 최적의 구성임을 증명하는 또 다른 예로 pGX27-mIL-12m에서 gIVS대신 TPL로 치환된 pGX10-mIL-12m의 경우 pGX27-mIL-12m보다 상당히 낮은 발현 수준을 보여주었다.

bGH poly(A)를 가지는 발현 플라스미드 벡터들의 형질 전환 후 세포 상층액에서 얻어지는 인터루킨 12 발현을 비교해 보면, 현재 판매되고 있는 pVAX1 (invitrogen사) 벡터에 삽입된 pVAX1-mIL-12m이 가장 낮은 인터루킨 12 발현 수준을 나타내었다. 이 발현 플라스미드 벡터에 gIVS가 더 첨가된 pGX26-mIL-12m은 pVAX1-mIL-12m에 비해 높은 발현 수준을 보여주었으며 이는 gIVS의 영향임을 예상할 수 있다. 또한 pGX26-mIL-12m에서 gIVS를 TPL로 치환한 pGX28-mIL-12m은 pGX26-mIL-12m보다 높은 발현 수준을 보여주었으며 이는 bGH poly(A)의 경우 gIVS가 아닌 TPL이 더 최적의 조합임을 알 수 있다.

Hela 세포 상층액을 이용한 ELISA에서도 유사한 결과를 얻을 수 있는데, 이러한 결과들을 통해 SV40 poly(A)를 포함한 벡터들 중에서 pGX27 벡터가, bGH poly(A)를 포함한 벡터들 중에서는 pGX28 벡터가 쥐 인터루킨 12 변형체 유전자의 발현에 최적의 플라스미드 벡터라는 사실을 알 수 있다.

따라서, pGX27 및 pGX28 벡터는 이것에 제한되는 것은 아니지만, AIDS, C형 및 B형 간염, 암, 독감, 결핵, 말라리아 등 인체 내 면역력 증가에 의해 치유될 수 있는 질병의 예방 및 치료에 있어 항원 유전자나 면역 조절 인자 유전자 등을 삽입할 수 있는 벡터로 유용하게 사용될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.

본 발명의 벡터로 형질전환되는 세포는, 바람직하게는 동물세포 또는 동물 유래의 세포이다.

상기 세포 내로 본 발명의 벡터를 도입 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 일렉트로포레이션 (electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전 (calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염 (retroviral infection), 미세주입법 (microinjection), DEAE-덱스트란 (DEAE-dextran), 양이온 리포좀 (cationic liposome) 법 등이 있고, 이로 제한되지 않는다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 포함하는 백신 면역화 또는 유전자 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 벡터를 DNA 백신으로 사용하는 경우, 치료학적 유효량의 외래 유 전자를 함유하는 본 발명의 DNA 백신 벡터 성분과 함께, 바람직하게는, 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들면, 인산염 완충용액(PBS), 염수, 포도당, 물, 글리세롤, 에탄올 또는 이들의 혼합물이 포함될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 벡터는 인산염 완충용액과 함께 사용할 수 있다. 그외에 당해 분야에 공지된 보조제 성분들을 추가로 사용할 수 있다.

DNA 백신 벡터 및 이를 포함하는 백신 조성물은 다양한 방식 예를 들어, 경구, 비내, 폐, 근육내, 피하내 또는 피내 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는 경로로 투여될 수 있다. 이들은 주입가능한 조성물로서, 예를 들어, 멸균 수성 현탁액, 바람직하게는 등장액으로서 개체에 투여될 수 있다.

본 발명의 벡터를 함유하는 백신 조성물의 적용 방식은 처리되는 동물의 크기 및 종, 투여되는 DNA 백신 벡터의 구성물 또는 조성물의 양, 투여 경로, 사용된 보조제 화합물의 효능과 용량, 및 당해 분야의 숙련자에게 자명한 기타 요인에 따라 변화될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

본 발명은 유전자 치료 또는 DNA 백신에 있어서 최적의 조건을 가지는 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명의 개발된 다양한 진핵 세포 발현 벡터들에 인터루킨-12 변형체 유전자를 삽입하는 경우, 여러 진핵 세포 발현 벡터들 중 인터루킨-12 변형체 유전자의 발현을 높게 유도할 수 있다. 또한, 본 발명의 최적의 벡터는 목적 유전자를 삽입하여 유전자 치료 또는 DNA 백신에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 좀더 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

실시예 1. 일반 분자생물학적 기술

제한효소의 처리 (모든 제한효소는 New England Biolab (브니엘)사의 제품을 사용하였다.), 아가로즈 겔 전기영동, 겔 적출 키트 (Solgent상의 gel extraction kit), 페놀/클로로포름을 이용한 단백질 적출, 에탄올 침전, DNA 절편의 접합 및 대장균의 형질전환, 플라스미드 DNA 순수 정제, 중합연쇄반응 (모든 프라이머는 제노마인 사로부터 합성함.) 등과 같은 분자생물학에서 일반적으로 사용되어지는 방법들은 Sambrook 등의 Molecular Cloning (2판)에 소개된 방법들에 최소한의 변형을 가하여 실시하였다.

실시예 2. 다양한 플라스미드 벡터의 제조

A. pGX26 의 제조

벡터 pcDNA6/TR (Invitrogen사)를 주형으로 하여 프라이머로 PCR 증폭방법으로 PCR하고 그 증폭된 산물을 NheI 및 HindⅢ로 자른 후 얻어진 DNA 단편 (0.58kb)을, 벡터 pVAX1 (Invitrogen사)를 같은 제한효소로 절단한 부위에 삽입함으로써 pGX26 (3.56kb)를 제조하였다 (도 2).

5'-gIVS (NheI): 5'-gctggctagcgtgagtttggggacccttgat-3' (서열번호 1, 센스)

3'-gIVS (HindⅢ) : 5'-taccaagcttcaattcgccctatagtgagtc-3' (서열번호 2, 안티센스)

B. pGX28 의 제조

벡터 pGX10 (Ha et al., Nat.Biotechnol. 20:381-6, 2002)을 제한효소 NdeI 및 Asp718으로 자른 후 두 개의 절편 중 적은 크기 (0.86kb)의 DNA 절편을 같은 제한효소로 처리한 벡터 pGX26의 두 개의 절편 중 큰 크기 (2.56kb)의 DNA 절편과 결합하여 벡터 pGX28 (3.42kb) 를 얻었다 (도 3 및 도 4).

C. pGX27 의 제조

벡터 pGX26를 제한효소 NdeI과 Asp718로 절단하여 생성된 DNA 절편 (1kb)을, 벡터 pGX10를 같은 제한효소로 처리하여 생기는 DNA 절편 (2.78kb)과 결합시킴으로써 벡터 pGX27 (3.77kb) 를 얻었다(도 5 및 도 6).

D. pGX25 의 제조

벡터 pRc/RSV (Invitrogen사)를 주형으로 하여 프라이머로 PCR 증폭방법으로 PCR하고 그 증폭된 산물을 ClaI 및 SalI으로 자른 후 얻어진 DNA 단편 (0.32kb)을, 같은 제한효소로 벡터 pGX27를 처리한 후 얻은 DNA 절편 (3.53kb)과 결합하여 벡터 pGX25 (3.85kb)를 얻었다 (도 7).

5'-RSV 인핸서 (ClaI): 5'-atctatcgatacgatgtacgggccagatata-3' (서열번호 3, 센스)

3'-RSV 인핸서 (SalI) : 5'-atctgtcgaccaattatctctgcaatgcgg-3' (서열번호 4, 안티센스)

E. pGX24 의 제조

벡터 pGX27을 ClaI 및 SalI으로 자르고 Klenow 단편 처리하여 평활 말단을 만든 뒤 결합하여 벡터 pGX24 (3.5kb)를 얻었다 (도 8).

F. pGX23 의 제조

벡터 pGX24를 제한효소 NheI 및 HindⅢ로 자르고 Klenow 단편 처리하여 평활 말단을 만든 뒤 결합시킴으로써 벡터 pGX23 (2.9kb)을 얻었다 (도 9).

실시예 3. 쥐 인터루킨 12 변형체 ( mIL -12m) 유전자 삽입된 벡터의 제조

벡터 pGX10-mIL-12m을 XhoI으로 절단하여 생기는 mIL-12m 유전자 단편 (2.3kb)을, 각 벡터 (pGX23, pGX24, pGX25, pGX26, pGX27 and pVAX1)를 같은 제한 효소로 절단하여 생기는 DNA 절편과 결합시킴으로써 쥐 인터루킨 12 변형체 (mIL-12m) 유전자 삽입된 벡터를 얻었다 (도 10).

실시예 4. 플라스미드 벡터의 시험관 내 ( in vitro ) 효능 분석

제작된 벡터들에는 쥐 인터루킨 12 변형체 유전자가 삽입되어 이 유전자의 발현수준을 in vitro cell culture system에서 조사하기 위하여 포유 동물 세포에 형질 전환한 뒤 ELISA를 통해 쥐 인터루킨 12의 발현 수준을 조사하였다.

열로 비 활성화된 FBS (fetal bovine serum, GIBCO-BRL사) 10%를 함유하고 있는 DMEM 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium, GIBCO-BRL사)로 배양된 COS-7 세포 (ATTC) 및 Hela 세포 (ATCC)로의 형질전환은 리포펙타민(lipofectamine, Invitrogen사)을 이용해 이루어졌다. 형질전환 하루 전 5 ×10⁵개의 COS-7 세포 및 1x10¹⁰개의 Hela 세포 (ATCC)를 60mm dish (SARSTED사)에 배양한 후 다음날 쥐 인터루킨 12 변형체 유전자가 삽입된 다양한 플라스미드 벡터 각 2 ㎍, 그리고 대조구의 역할을 할 수 있는 pNEB-EGFP (pNEB-Enhanced Green Fluorescence Protein) 0.5 ㎍을 FBS가 함유되지 않은 DMEM 배지 100㎕에 넣은 후 리포펙타민(lipofectamine) 10 ㎍을 FBS가 함유되지 않은 DMEM 배지 100㎕에 넣고 두 용액을 혼합 한 후 30분간 실온에 두었다. 그 사이 어제 배양해둔 세포를 FBS가 함유되지 않은 DMEM 배지로 2번 세척하고 다시 배지를 채운 후 배양기에 두었다. 30분 후 세포의 배지를 모두 흡입한 후에 FBS가 함유되지 않은 DMEM 배지 2.8㎖을 plasmid DNA와 리포펙타민(lipofectamine)이 혼합된 용액에 넣은 후 세포에 넣고 4-6시간 배양기에서 배양하였다. 그 후 FBS 10%가 함유된 DMEM 배지로 교체하고 24-48시간 배양하고 세포를 수확하여 원심분리한 후 상층액은 그대로 회수하였고 펠렛 (pellet)은 FACS 분석을 통해 EGFP 발현 정도를 비교하여 형질전환 효율 비교 를 위해 측정하였다. 상층액에 존재하는 쥐 인터루킨 12 변형체의 수준은 쥐 인터루킨 12를 측정할 수 있는 ELISA로 측정하였다 (Phamingen사). 도 11의 수치는 ELISA를 통해 측정된 pVAX1-mIL-12m로 형질 전환된 COS-7 세포 배양액에서의 쥐 인터루킨 12의 발현 정도를 100%로 보았을 때 상대적인 발현 양을 나타낸 것이다.

도 1은 본 발명에서 사용된 다양한 진핵 세포 발현 벡터들의 모식도이다.

도 2는 본 발명의 진핵 세포 발현 벡터로 사용된 벡터 pGX26의 제작과정을 나타낸 모식도이다.

도 3은 본 발명의 진핵 세포 발현 벡터로 사용된 벡터 pGX28의 제작과정을 나타낸 모식도이다.

도 4는 본 발명의 진핵 세포 발현 벡터로 사용된 벡터 pGX28의 개열지도를 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명의 진핵 세포 발현 벡터로 사용된 벡터 pGX27의 제작과정을 나타낸 모식도이다.

도 6은 본 발명의 진핵 세포 발현 벡터로 사용된 벡터 pGX27의 개열지도를 나타낸 것이다.

도 7은 본 발명의 진핵 세포 발현 벡터로 사용된 벡터 pGX25의 제작과정을 나타낸 모식도이다.

도 8은 본 발명의 진핵 세포 발현 벡터로 사용된 벡터 pGX24의 제작과정을 나타낸 모식도이다.

도 9는 본 발명의 진핵 세포 발현 벡터로 사용된 벡터 pGX23의 제작과정을 나타낸 모식도이다.

도 10은 본 발명에서 목적 유전자로 사용한 쥐 인터루킨-12 변형체 유전자(mp35/IRES/mp40-N220Q; mIL-12m)가 삽입된 벡터의 모식도이다.

도 11은 본 발명에서 쥐 인터루킨-12 변형체(mIL-12m) 유전자를 포함한 발현 벡터들의 세포 내 형질전환 후 얻어진 세포 배양 상층액(supernatant)에서 수행한 인터루킨-12에 대한 ELISA 결과를 상대적으로 도시한 것이다. X 축은 세포 배양 상층액에서의 쥐 인터루킨-12의 상대적 발현도(%)를, Y 축은 다양한 진핵 세포 발현 벡터를 나타낸다.

<110> POSTECH FOUNDATION <120> Development of Optimal Eukaryotic Expression Vector <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for amplification of gIVS <400> 1 gctggctagc gtgagtttgg ggacccttga t 31 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for amplification of gIVS <400> 2 taccaagctt caattcgccc tatagtgagt c 31 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for amplification of RSV enhancer <400> 3 atctatcgat acgatgtacg ggccagatat a 31 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for amplification of RSV enhancer <400> 4 atctgtcgac caattatctc tgcaatgcgg 30

Claims

CMV 프로모터 (pCMV), 토끼의 베터 글로빈 유전자의 인트론 (gIVS), 목적 단백질을 코딩하는 핵산 클로닝 영역(MCS), SV40 바이러스의 후기 폴리 아데닐 신호 (SV40 poly(A)), SV40 바이러스의 인핸서 (SV40 enhancer) 및 항생제 저항성 유전자를 5'말단에서부터 순서대로 포함하는, 외래 유전자 발현용 재조합 벡터.
제1항에 있어서, 상기 항생제 저항성 유전자는 카나마이신 저항 유전자(Kan)인 벡터.
제1항에 있어서, 상기 벡터는 도 6에 개시된 pGX27 인 벡터.
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제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
제9항에 있어서, 상기 세포는 동물세포 또는 동물 유래의 세포인 숙주세포.
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