ES2670894T3

ES2670894T3 - Promotor derivado de un gen humano

Info

Publication number: ES2670894T3
Application number: ES12853220.7T
Authority: ES
Inventors: Kenji Murakami
Original assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Current assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date: 2011-11-28
Filing date: 2012-11-27
Publication date: 2018-06-01
Anticipated expiration: 2032-11-27
Also published as: TW201632624A; EP2787080A1; TW201632625A; US20140342401A1; KR20140100475A; US9862969B2; IL232848A0; BR112014012682A2; IN2014CN03882A; KR101931404B1; AU2012344855B2; AU2012344855A1; CN104066839A; JPWO2013080934A1; TW201329234A; SG11201402476XA; AU2012344855C1; EP2787080A4; EP2787080B1; JP6025745B2

Abstract

Un polinucleótido promotor que comprende una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 1 en el listado de secuencias.

Description

DESCRIPCIÓN

Promotor derivado de un gen humano Campo técnico

La presente invención se refiere a un polinucleótido promotor así como a vectores y unidades de expresión de genes 5 extraños que comprenden el promotor, así como a células transformadas cuya actividad transcripcional de proteínas extrañas se ha mejorado mediante la utilización del vector de expresión de genes extraños que tiene el promotor que procede de un gen humano y a un procedimiento para producir la proteína extraña utilizando la célula huésped.

Técnica antecedente

Debido al desarrollo de técnicas de recombinación genética, se ha expandido rápidamente el mercado de productos 10 farmacéuticos proteicos tales como proteínas terapéuticas y fármacos con anticuerpos. En particular, los fármacos con anticuerpos pueden tener alta especificidad sin causar una inmunorreacción adversa cuando se administran al cuerpo humano y, por lo tanto, se ha buscado activamente el desarrollo de los mismos.

Como un hospedador mediante el cual se produce un producto proteico farmacéutico tipificado mediante un fármaco con anticuerpos, se puede utilizar un microorganismo, una levadura, un insecto, una célula animal o vegetal, una 15 célula animal o vegetal transgénica o similares. Para que el producto proteico farmacéutico tenga actividad biológica o inmunogenicidad, es esencial una modificación postraduccional tal como plegamiento o glucosilación. Por lo tanto, un microorganismo, con el que no se puede realizar una modificación postraduccional complicada, o una planta, que tiene una estructura de glucano diferente, no es adecuado como el hospedador. El uso de una célula de mamífero cultivada tal como una célula CHO (ovario de hámster chino), que proviene de una especie estrechamente 20 relacionada con los seres humanos, es el estándar actual considerando que dicha célula tiene una estructura de glucano similar a las de los seres humanos y es segura, y se puede realizar la modificación postraduccional utilizando dicha célula.

En los casos en los que se utiliza una célula de mamífero cultivada como la huésped, existe el problema de que la tasa de crecimiento es baja, la productividad es baja, el coste es alto, etc., en comparación con un microorganismo o 25 similar (NPL 1). Además, para utilizar un producto proteico farmacéutico clínicamente, es necesario administrar una gran cantidad del producto. Por lo tanto, la falta de capacidad de producción del mismo es otro problema en el mundo. Cuando se produce un producto proteico farmacéutico en un sistema de expresión de células de mamífero cultivadas, el coste de producción es alto en comparación con un producto farmacéutico sintético de peso molecular bajo. En consecuencia, se han realizado intentos para reducir el coste de producción mejorando las fases de 30 producción respectivas. La mejora de la cantidad de producción en el sistema de expresión de células de mamífero cultivadas es un procedimiento eficaz para reducir el coste de producción (NPL 2 y NPL 3). Por consiguiente, para mejorar la productividad de un gen extraño en una célula de mamífero cultivada, se han investigado diversos enfoques basados en promotores, potenciadores, marcadores de selección de antibióticos, amplificación de genes, técnicas de ingeniería de cultivo y similares. En los casos en los que una célula CHO se utiliza como una célula 35 huésped para expresar un gen extraño, es decir, para producir un producto proteico farmacéutico, generalmente se utiliza un promotor temprano inmediato principal de citomegalovirus humano derivado de virus (en lo sucesivo denominado "promotor de CMV") (NPL 4, NPL 5 y NPL 6). Además, se sabe que un polinucleótido cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción de un gen de proteína ribosómica humana tal como RPL32 o RPS11 puede utilizarse como un elemento de ADN para la expresión de proteínas en una célula CHO, en combinación con otro 40 promotor heterólogo (NPL 7 y PLT 1).

Los números de acceso de base de datos AC108488, AC018836 y AC084209 revelan secuencias de varios genes que codifican proteínas, sin mencionar su función. Annilo y col. (1995) desvela el gen que codifica la proteína S7 ribosómica humana pero no revela ninguna actividad promotora significativa. El documento WO 2009/155950 desvela construcciones de indicadores lineales activos de expresión transcripcional y/o postranscripcionalmente 45 controlables.

Listado de citas

Referencias de Patente

PTL 1: documento WO 2006/123097 Referencias de No Patente

50 NPL 1: Florian M. Wurm., Nat. Biotechnol. 22(11): 1393-1398, 2004

NPL 2: Farid SS., J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 848(1): 8-18, 2007

NPL 3: Werner RG. Economic aspects of commercial manufacture of biopharmaceuticals. J Biotechnol. 113 (1-3): 171-182, 2004

NPL 4: Durocher Y y col., Curr Opin Biotechnol. 20(6): 700-707, 2009 55 NPL 5: Boshart M y col., Cell. 41(2): 521-530, 1985

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NPL 6: Foecking MK y col., Gene. 45(1): 101-105, 1986

NPL 7: Hoeksema F. y col., Biotechnology Research International, Volumen 2011, Artículo ID 492875, 11 páginas Sumario de la invención

Problema técnico

Un objeto de la invención es proporcionar un procedimiento para aumentar la producción de una proteína extraña para utilizarse en un producto proteico farmacéutico, utilizando un promotor que tiene una alta actividad para mejorar la expresión de genes extraños en una célula huésped tal como una célula de mamífero cultivada. Mediante la identificación de un promotor que tiene una actividad promotora equivalente a o mayor que la de un promotor de CMV en una célula CHO o similar, se proporciona un procedimiento para lograr establemente una alta expresión de genes extraños en una célula de mamífero, y un procedimiento para contribuir a la mejora de niveles de producción, en otras palabras, se puede proporcionar una reducción en los costes de producción de un producto proteico farmacéutico en un sistema de expresión de células de mamífero cultivadas.

Solución al problema

Los presentes inventores realizaron estudios intensivos para resolver los problemas anteriores y encontraron que un polinucleótido, que partía de un nucleótido situado aproximadamente 2 kpb cadena arriba del lugar de inicio de la transcripción y terminaba en un nucleótido inmediatamente cadena arriba de una secuencia de nucleótidos que corresponde al codón de inicio de un gen de proteína ribosómica humana, tiene una alta actividad promotora. Encontraron que la actividad promotora puede mejorar significativamente la producción de una proteína extraña que se va a expresar en una célula de mamífero cultivada y, así, completaron la invención. La invención incluye los siguientes aspectos.

(1) Un polinucleótido promotor que comprende una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 1 en el listado de secuencias.

(2) Una unidad de expresión de genes extraños que comprende el polinucleótido promotor de acuerdo con el punto anterior (1).

(3) La unidad de expresión de genes extraños de acuerdo con el punto anterior (2), en la que el gen extraño es un gen que codifica una proteína multimérica o una proteína heteromultimérica.

(4) La unidad de expresión de genes extraños de acuerdo con el punto anterior (2), en la que el gen extraño es un gen que codifica un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo.

(5) Un vector de expresión de genes extraños que comprende la unidad de expresión de genes extraños de acuerdo con uno cualquiera de los puntos anteriores (2) a (4).

(6) Un vector de expresión de genes extraños que comprende la unidad de expresión de genes extraños de acuerdo con uno cualquiera de los puntos anteriores (2) a (4) y uno o más polinucleótidos seleccionados a partir de los polinucleótidos descritos en (a) a (i) en el siguiente grupo A:

Grupo A

(a) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias;

(b) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias;

(c) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 12 en el Listado de Secuencias;

(d) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 13 en el Listado de Secuencias;

(e) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 14 en el Listado de Secuencias;

(f) un polinucleótido que comprende al menos 3000 nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos representada por una cualquiera de las SEQ ID NOS: 10 a 14 en el Listado de secuencias;

(g) un polinucleótido que comprende al menos 2000 nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos representada por una cualquiera de las SEQ ID NOS: 10 a 14 en el Listado de secuencias;

(h) un polinucleótido que comprende una secuencia polinucleotídica que tiene una identidad de 95 % o más con la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de acuerdo con uno cualquiera de los puntos anteriores (a) a (g) y que tiene la actividad de mejorar la expresión de genes extraños; y

(i) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de 99 % o más con la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de acuerdo con uno cualquiera de los puntos anteriores (a) a (g) y que tiene la actividad de mejorar la expresión de genes extraños.

(7) Una célula transformada en la que se ha introducido el vector de expresión de genes extraños de acuerdo con el punto anterior (5) o (6).

(8) Una célula transformada en la que se han introducido el vector de expresión de genes extraños de acuerdo con el punto anterior (5) o (6) y un vector de elemento.

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(9) La célula transformada de acuerdo con el punto anterior (7) u (8), en la que la célula es una célula cultivada que procede de un mamífero.

(10) La célula transformada de acuerdo con el punto anterior (9), en la que la célula cultivada que procede de un mamífero es una célula COS-1, una célula 293 o una célula CHO.

(11) Un procedimiento para producir una proteína caracterizado porque comprende cultivar la célula transformada de acuerdo con uno cualquiera de los puntos anteriores (7) a (10) y obtener una proteína que procede de un gen extraño a partir del producto de cultivo resultante.

(12) Uso de una secuencia polinucleotídica promotora de acuerdo con el punto anterior (1) para expresar un gen extraño en una célula transformada.

(13) Uso de una secuencia polinucleotídica promotora que tiene una identidad de 95 % o más con la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 para expresar un gen extraño en una célula transformada.

(14) Uso de una secuencia polinucleotídica promotora que tiene una identidad de 99% o más con la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 para expresar un gen extraño en una célula transformada.

(15) Uso del vector de expresión de genes extraños de acuerdo con el punto anterior (5) o (6) para expresar un gen extraño en una célula transformada.

Efectos ventajosos de la invención

Mediante la introducción de un vector de expresión de genes extraños utilizando un promotor que procede de un gen humano de la invención en una célula huésped de mamífero, se puede mejorar significativamente la expresión de un gen extraño de una proteína terapéutica, un anticuerpo o similar. Además, mediante la utilización del promotor de la invención en combinación con un elemento de ADN, se puede mejorar adicionalmente la expresión de un gen extraño de una proteína terapéutica, un anticuerpo o similar.

Breve descripción de los dibujos

[FIG. 1] La figura 1 muestra un gráfico en el que se evaluó la actividad de los promotores mediante la utilización de la actividad de SEAP como un índice en células policlonales CHO-K1 transfectadas. El gráfico muestra la actividad de SEAP para cada promotor, con el valor para un promotor de CMV normalizado a 1. Se muestran los resultados de dos experimentos diferentes (n = 3, media ± sD).

[FIG. 2] La figura 2 muestra un gráfico en el que se evaluó la actividad de promotores truncados mediante la utilización de la actividad de SEAP como un índice en células policlonales CHO-K1 transfectadas. El gráfico muestra la actividad de cada promotor, con el valor para un promotor de CMV normalizado a 1 (n = 3, media ± SD).

[FIG. 3] La figura 3 muestra un gráfico en el que se confirmó mediante la amplificación de una región GAPDH que una muestra sometida a ChIP-on-chip fue inmunoprecipitada con cromatina específicamente con un anticuerpo anti histona H3 acetilada.

[FIG. 4] La figura 4 es una vista esquemática de un vector de expresión de SEAP en el que se ha insertado un elemento de ADN.

[FIG. 5] La figura 5 muestra un gráfico en el que los efectos de mejora de la expresión de los elementos de ADN A2, A7, A18, B5 y C14 se confirmaron mediante la utilización de la actividad de SEAP expresada mediante un promotor de CMV como un índice en una línea celular CHO transfectada.

[FIG. 6] La figura 6 muestra gráficos en los que se confirmaron los efectos de mejora de la expresión de los elementos de ADN A2 y A7 mediante la utilización de la actividad de SEAP expresada mediante un EF-1a o un promotor de SV40 como un índice en una línea celular CHO transfectada.

[FIG. 7] La figura 7 es una vista esquemática de un vector de expresión de anticuerpos (coexpresión de cadena ligera y cadena pesada del gen X de anticuerpos) en el que se ha insertado un elemento de ADN.

[FIG. 8] La figura 8 muestra gráficos en los que se confirmó el efecto de mejora de la expresión del elemento de ADN A7 mediante la utilización del nivel de producción (medido por el procedimiento ELISA) de un anticuerpo expresado mediante un CMV o un promotor EF-1a como un índice en una línea celular CHO transfectada.

[FIG. 9] La figura 9 es una tabla que muestra las longitudes de secuencia del elemento de ADN A2 y secuencias relacionadas.

[Fig. 10] La figura 10 muestra gráficos en los que se confirmaron los efectos de mejora de la expresión del elemento de ADN A2 y secuencias relacionadas mediante la utilización de la actividad de SEAP como un índice en una línea celular CHO transfectada.

[FIG. 11] La figura 11 es una tabla que muestra las longitudes de secuencia del elemento de ADN A7 y secuencias relacionadas.

[FIG. 12] La figura 12 muestra gráficos en los que se confirmaron los efectos de mejora de la expresión del elemento de ADN A7 y secuencias relacionadas mediante la utilización de la actividad de SEAP como un índice en una línea celular cHo transfectada.

[FIG. 13] La figura 13 es una tabla que muestra las longitudes de secuencia del elemento de ADN A18 y secuencias relacionadas.

[FIG. 14] La figura 14 muestra un gráfico en el que se confirmaron los efectos de mejora de la expresión del elemento de ADN A18 y secuencias relacionadas mediante la utilización de la actividad de SEAP como un índice en una línea celular CHO transfectada.

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[FIG. 15] La figura 15 es una tabla que muestra las longitudes de secuencia del elemento de ADN B5 y secuencias relacionadas.

[FIG. 16] La figura 16 muestra un gráfico en el que se confirmaron los efectos de mejora de la expresión del elemento de ADN B5 y secuencias relacionadas mediante la utilización de la actividad de SEAP como un índice en una línea celular CHO transfectada.

[FIG. 17] La figura 17 es una tabla que muestra las longitudes de secuencia del elemento de ADN C14 y secuencias relacionadas.

[FIG. 18] La figura 18 muestra gráficos en los que se confirmaron los efectos de mejora de la expresión del elemento de ADN C14 y secuencias relacionadas mediante la utilización de la actividad de SEAP como un índice en una línea celular CHO transfectada.

[FIG. 19] La figura 19 muestra un gráfico en el que se confirmaron los efectos de mejora de la expresión de los elementos de ADN A2, A7, A18, B5 y C14 mediante la utilización de la actividad de SEAP como un índice en una línea celular HEK293 transfectada.

[FIG. 20] La figura 20 es una tabla que muestra nucleótidos en los puntos de inicio y final basándose en la secuencia de longitud completa del elemento de ADN A2, A7 o A18.

[FIG. 21] La figura 21 es una tabla que muestra nucleótidos en los puntos de inicio y final basándose en la secuencia de longitud completa del elemento de ADN B5 o C14.

Descripción de las realizaciones

En lo sucesivo en el presente documento, la invención se describirá específicamente.

El término “gen” como se usa en el presente documento se refiere a un segmento que se transcribe en un ARNm y, a continuación, se traduce en una proteína e incluye no solo un ADN, sino también un ARNm del mismo, ADNc del mismo y un ARN del mismo.

El término “polinucleótido” como se usa en el presente documento se utiliza con el mismo significado que ácido nucleico y también incluye ADN, ARN, sonda, oligonucleótido y cebador.

Los términos “polipéptido” y “proteína” como se usa en el presente documento se utilizan sin distinción.

La expresión “expresión genética” como se usa en el presente documento se refiere a un fenómeno en el que un ARNm se transcribe a partir de un gen y/o un fenómeno en el que una proteína se traduce a partir del ARNm.

La expresión “gen extraño” como se usa en el presente documento se refiere a un gen que se introduce artificialmente en una célula huésped.

La expresión “proteína extraña” como se usa en el presente documento se refiere a una proteína codificada mediante un gen extraño.

La expresión “unidad de expresión de genes” como se usa en el presente documento se refiere a un polinucleótido que tiene, en la dirección del marco de lectura de la transcripción, al menos una región promotora, un gen extraño y una región de terminación de la transcripción (señal de adición de poli(A)).

La expresión “actividad para mejorar la expresión de genes extraños” como se usa en el presente documento se refiere a la actividad para mejorar la producción de una proteína extraña en una célula huésped mediante la creación de un medio ventajoso para la transcripción en cualquier ADN alrededor de la unidad de expresión de genes que contiene un gen extraño y mejorar significativamente la eficacia de la transcripción.

El término “promotor” como se usa en el presente documento se refiere a una región a la que puede unirse un factor de transcripción implicado en el inicio de la transcripción de ADN en ARN y, a veces, se denomina “región promotora” en esta descripción. Los ejemplos del promotor incluyen un polinucleótido que empieza en un nucleótido localizado aproximadamente 2 kpb cadena arriba de un sitio de inicio de la transcripción y termina en un nucleótido inmediatamente cadena arriba de una secuencia de nucleótidos que corresponde al codón de inicio y el promotor puede contener un 5' UTR y un intrón.

La expresión “actividad promotora” como se usa en el presente documento se refiere a una actividad en la que un factor de transcripción se une a un promotor e inicia la transcripción para producir una proteína codificada mediante un gen. Se puede analizar utilizando la actividad de una proteína codificada mediante un gen indicador tal como fosfatasa alcalina secretora (SEAP) como un índice.

La frase “que tiene una actividad promotora” como se usa en el presente documento se refiere a que tiene la actividad de expresar SEAP equivalente a o mayor que la de un promotor de CMV en las mismas condiciones que aquellas descritas a continuación (Ejemplo 3) para evaluar una actividad promotora mediante la utilización del nivel de expresión de SEAP como un índice.

La expresión “elemento de ADN” como se usa en el presente documento se refiere a un polinucleótido que tiene la actividad de mejorar la expresión de genes extraños en los casos en los que el polinucleótido se localiza en la

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proximidad de una unidad de expresión de genes o en un vector de expresión de genes extraños que contiene una unidad de expresión de genes.

La expresión “fragmento funcional de un anticuerpo” como se usa en el presente documento se refiere a un fragmento parcial de un anticuerpo que tiene una actividad de unión a antígeno e incluye Fab, F(ab')2, y similares. Sin embargo, la expresión no se limita a estas moléculas siempre que el fragmento tenga una afinidad de unión por un antígeno.

El término “identidad” como se usa en el presente documento se refiere a una relación entre las secuencias de dos o más secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos determinadas mediante la comparación de las secuencias, como se conoce en la técnica. En la técnica, el término “identidad” también puede referirse al grado de relación de secuencia entre moléculas de ácidos nucleicos o entre polipéptidos como se determina por la coincidencia entre cadenas de dos o más secuencias de nucleótidos o dos o más secuencias de aminoácidos. La “identidad” puede evaluarse mediante el cálculo del porcentaje de coincidencias idénticas entre la más pequeña de las dos o más secuencias con alineaciones vacías (si las hay) direccionadas mediante un modelo matemático específico o programa informático (es decir, “algoritmos”). Específicamente, la identidad se puede evaluar mediante la utilización de un software tal como Clustal W2 proporcionado por European Molecular Biology Laboratory- European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI), pero el software no se limita al mismo y se puede utilizar cualquiera siempre que sea utilizado por los expertos en la materia.

La frase “hibridado en condiciones rigurosas” como se usa en el presente documento se refiere a la hibridación en condiciones en las que se forma un denominado híbrido específico pero no se forma un híbrido no específico. Los ejemplos de las condiciones incluyen condiciones en las que una cadena complementaria de un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad del 80 % o más, preferentemente el 90 % o más, más preferentemente el 95% o más, lo más preferentemente el 99% o más con otro ácido nucleico se hibrida y una cadena complementaria de un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad menor no se hibrida. De manera más específica, significa que la hibridación se efectúa a 68 °C en una solución de hibridación disponible comercialmente ExpressHyb Hybridization Solution (fabricada por Clontech, Inc.) o la hibridación se efectúa en condiciones tales que la hibridación se realiza a 68 °C en presencia de NaCl 0,7 a 1,0 M utilizando un filtro que tiene ADN inmovilizado sobre el mismo, seguido de lavado a 68 °C utilizando solución SSC

0. 1 a 2 x (la solución SSC 1 x se compone de NaCl 150 mM y citrato de sodio 15 mM) o en condiciones equivalentes a estas.

1. Promotor a utilizar para mejorar la expresión de genes extraños

Como un promotor que procede de un gen humano de la invención (en lo sucesivo en el presente documento a veces también denominado "promotor de la invención"), se prefiere un polinucleótido que empieza en un nucleótido localizado aproximadamente 2 kpb cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción y termina en un nucleótido inmediatamente cadena arriba de una secuencia de nucleótidos que corresponde al codón de inicio de un gen de proteína ribosómica humana. El promotor que procede de un gen humano puede ser un polinucleótido que empieza en un nucleótido localizado aproximadamente 1 kpb o aproximadamente 0,5 kpb cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción y termina en un nucleótido inmediatamente cadena arriba de una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia del codón de inicio de un gen de proteína ribosómica humana.

El gen de proteína ribosómica humana es preferentemente un gen de proteína S7 ribosómica humana (en lo sucesivo en el presente documento denominado "RPS7"), un gen de proteína L32 ribosómica humana (en lo sucesivo en el presente documento denominado "RPL32") o un gen de proteína L34 ribosómica humana (en lo sucesivo en el presente documento denominado "RPL34").

El promotor de la invención comprende un polinucleótido representado por la SEQ ID NO: 1 en el listado de secuencias y el uso del mismo incluye un polinucleótido que tiene una identidad del 95 % o más, lo más preferentemente el 99% o más con la sEq ID NO: 1.

Las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NOS: 1, 2 y 3 son secuencias que empiezan en un nucleótido localizado aproximadamente 2 kpb cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción y terminan en un nucleótido inmediatamente cadena arriba de una secuencia de nucleótidos que corresponde al codón de inicio de RPS7, RPL32 y RPL34, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NOS: 4, 6 y 8 son secuencias que empiezan en un nucleótido localizado aproximadamente 1 kpb cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción y terminan en un nucleótido inmediatamente cadena arriba de una secuencia de nucleótidos que corresponde al codón de inicio de RPS7, RPL32 y RPL34, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NOS: 5, 7 y 9 son secuencias que empiezan en un nucleótido localizado aproximadamente 0,5 kpb cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción y terminan en un nucleótido inmediatamente cadena arriba de una secuencia de nucleótidos que corresponde al codón de inicio de RPS7, RPL32 y RPL34, respectivamente.

Además, el promotor desvelado en el presente documento puede ser un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad del 95 % o más, más preferentemente el 99 % o más con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y tiene una actividad promotora.

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El promotor desvelado en el presente documento puede hibridarse con un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a un polinucleótido representado por la SEQ ID NO: 1 en condiciones rigurosas y tiene una actividad promotora.

El promotor desvelado en el presente documento puede ser un polinucleótido que es un polinucleótido mutado que comprende una secuencia de nucleótidos en la que uno o más, por ejemplo, 1 a 300 o 1 a 30 nucleótidos se han eliminado, sustituido y/o añadido en la secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 1 y tiene actividad promotora.

La introducción de una mutación (eliminación, sustitución y/o adición) en la secuencia de nucleótidos anteriormente mencionada se puede realizar mediante un procedimiento conocido en la técnica tal como un procedimiento de Kunkel o un procedimiento de dúplex con huecos (gapped duplex) o un procedimiento equivalente. Por ejemplo, se puede utilizar un kit de introducción de mutaciones que utiliza un procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio tal como Mutant-K (fabricado por TaKaRa Bio, Inc.) o Mutant-G (fabricado por TaKaRa Bio, Inc.), un kit de la serie de mutagénesis in vitro LA PCR (fabricado por TaKaRa Bio, Inc.). Dicho polinucleótido mutado también se puede utilizar como el promotor de la invención.

La actividad del promotor de la invención para mejorar la expresión de genes extraños se puede analizar mediante la utilización, como un índice, de la actividad de una proteína codificada por un gen indicador tal como SEAP. En los casos en los que la actividad de una proteína indicadora, cuando se utiliza el promotor de la invención, es equivalente a o mayor que cuando se utiliza un promotor de CMV, preferentemente, la actividad aumenta 1,2 veces o más, más preferentemente 1,5 veces o más, se puede considerar que el promotor tiene la actividad de mejorar la expresión de genes extraños. Incluso en los casos en los que la actividad se aumenta aproximadamente 1,2 veces o más, se espera que esto reduzca la escala de cultivo celular, el tiempo de cultivo celular y el paso de purificación, haciendo posible aumentar el rendimiento y reducir el coste del cultivo celular. Si el rendimiento aumenta, entonces es posible suministrar de manera estable una proteína extraña para utilizarse como un producto farmacéutico. Además, si se reduce el coste del cultivo celular, se reduce el coste de la proteína extraña a utilizar como un producto farmacéutico.

Además, también se puede utilizar el promotor de la invención para mejorar la expresión de un gen endógeno de una célula huésped mediante la introducción del promotor en la célula huésped utilizando un procedimiento bien conocido por los expertos en la materia.

2. Unidad de expresión de genes extraños

La unidad de expresión de genes extraños de la invención (en lo sucesivo en el presente documento a veces también denominado "unidad de expresión de genes de la invención") tiene, opcionalmente, en la dirección del marco de lectura de la transcripción, al menos el promotor de la invención descrito en el anterior punto "1", un gen extraño y una región de terminación de la transcripción (señal de adición de poli(A)).

Además, la secuencia de adición de poli(A) puede ser una secuencia que tiene la actividad para causar la terminación de la transcripción para la transcripción a partir del promotor y puede ser una secuencia procedente de un gen idéntico a o diferente al del promotor.

3. Elemento de ADN a utilizar para mejorar la expresión de genes extraños

Mediante la utilización de la unidad de expresión de genes de la invención descrita en el punto anterior "2" y en combinación con un elemento de ADN, se puede mejorar además la expresión de un gen extraño. Se puede obtener el elemento de ADN para utilizarse en combinación mediante la utilización, como un índice, de la interacción entre la histona H3 acetilada y el elemento como se describe en el ejemplo 6. En general, se dice que la acetilación de histonas (H3 y H4) está asociada con la activación de la transcripción y se han defendido dos teorías principales. Una teoría es que la acetilación de histonas está asociada con un cambio en la conformación del nucleosoma de tal manera que las colas de las histonas se acetilan para ser neutralizadas eléctricamente, debilitando las interacciones ADN-histona (Mellor J. (2006) Dynamic nucleosomes and gene transcription. Trends Genet. 22 (6): 320-329). La otra teoría es que la acetilación de histonas está asociada con el reclutamiento de diversos factores de transcripción (Nakatani Y. (2001) Histone acetylases-versatile players. Genes Cells. 6(2): 79-86). De acuerdo con cualquiera de las dos teorías, hay una alta posibilidad de que la acetilación de histonas esté asociada con la activación de la transcripción y mediante la realización de inmunoprecipitación con cromatina (ChIP) utilizando un anticuerpo anti histona H3 acetilada, es posible concentrar un elemento de ADN que interactúa con la histona H3 acetilada.

A2 es un ejemplo del elemento de ADN para utilizarse en combinación con el promotor de la invención para mejorar la expresión de genes extraños. A2 se localiza en la región de 80966429 a 80974878 del cromosoma 15 humano y es un polinucleótido de 8450 pb que tiene un contenido de AT del 62,2 %. La secuencia nucleótidos de A2 está representada por la SEQ ID NO: 10 en el listado de secuencias.

A7, A18, B5 y C14 son ejemplos de elementos de ADN similares. A7 se localiza en la región de 88992123 a 89000542 del cromosoma 11 humano y es un polinucleótido de 8420 pb que tiene un contenido de AT del 64,52 %. La secuencia nucleótidos de A7 está representada por la SEQ ID NO: 11 en el listado de secuencias.

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A18 se localiza en la región de 111275976 a 111284450 del cromosoma 4 humano y es un polinucleótido de 8475 pb que tiene un contenido de AT del 62,54 %. La secuencia nucleótidos de A18 está representada por la SEQ ID NO: 12 en el listado de secuencias.

B5 se localiza en la región de 143034684 a 143043084 del cromosoma 1 humano y es un polinucleótido de 8401 pb que tiene un contenido de AT del 66,37 %. La secuencia nucleótidos de B5 está representada por la SEQ ID NO: 13 en el listado de secuencias.

Finalmente, C14 se localiza en la región de 46089056 a 46097482 del cromosoma 11 humano y es un polinucleótido de 8427 pb que tiene un contenido de AT del 63,81 %. La secuencia nucleótidos de C14 está representada por la SEQ ID NO: 14 en el listado de secuencias.

La actividad de mejorar la expresión de genes extraños del elemento de ADN para utilizarse en combinación con el promotor de la invención se puede analizar mediante la utilización, como un índice, de la actividad de una proteína codificada por un gen indicador tal como SEAP.

En los casos en los que el elemento de ADN se utiliza en combinación con el promotor de la invención, puede utilizarse uno cualquiera de los elementos de ADN anteriores solo o pueden utilizarse dos o más copias de un tipo del elemento de ADN. Como alternativa, pueden utilizarse en combinación dos o más tipos diferentes de los elementos de ADN anteriores.

A2, A7, A18, B5 y C14 son ejemplos preferidos del elemento de ADN para utilizarse en combinación con el promotor de la invención.

El elemento de ADN para utilizarse en la invención puede ser una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad del 95 % o más, más preferentemente del 99 % o más con cualquiera de las secuencias de nucleótidos representadas por las SEQ ID NOS: 10 a 14 y tiene la actividad de mejorar la expresión de genes extraños. La búsqueda de homología de secuencia de nucleótidos se puede realizar contra, por ejemplo, el banco de datos de ADN de Japón o similar utilizando un programa tal como FASTA o BLAST.

El elemento de ADN para utilizarse en combinación con el promotor de la invención puede hibridarse con un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a un polinucleótido representado por las SEQ ID NOS: 10 a 14 en condiciones rigurosas y tiene la actividad de mejorar la expresión de genes extraños.

Un experto en la materia puede obtener fácilmente dicho gen homólogo con referencia a la clonación molecular (Sambrook, J. y col., Molecular Cloning: a Laboratory Manual 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Skyline Drive Plainview, N.Y. (1989)) o similares. Además, la identidad de la secuencia de nucleótidos mencionada anteriormente se puede determinar mediante una búsqueda FASTA o búsqueda BLAST de la misma forma.

La introducción de una mutación (eliminación, sustitución y/o adición) en el polinucleótido mencionado anteriormente se puede realizar mediante un procedimiento conocido en la técnica tal como un procedimiento de Kunkel o un procedimiento de dúplex con huecos (gapped duplex) o un procedimiento equivalente. Por ejemplo, se puede utilizar un kit de introducción de mutaciones que utiliza un procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio tal como Mutant-K (fabricado por TaKaRa Bio, Inc.), Mutant-G (fabricado por TaKaRa Bio, Inc.), o un kit de series de mutagénesis in vitro LA PCR (fabricado por TaKaRa Bio, Inc.) o similares. También se puede utilizar dicho polinucleótido mutado como el elemento de ADN de la invención.

Como el elemento de ADN para utilizarse en combinación con el promotor de la invención, se puede utilizar un fragmento parcial que comprende al menos 3000 o al menos 2000 nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos representada por una cualquiera de las SEQ ID NOS: 10 a 14 en el listado de secuencias. Los ejemplos de dicho fragmento parcial incluyen: A2-1 a A2-17 que son fragmentos parciales de A2; A7-1 a A7-18 que son fragmentos parciales de A7; A18-1 a A18-4 que son fragmentos parciales de A18; B5-1 a B5-6 que son fragmentos parciales de B5; y C14-1 a C14-14 que son fragmentos parciales de C14. Sin embargo, el elemento de ADN no se limita a estos fragmentos parciales siempre que tenga la actividad de mejorar la expresión de genes extraños.

En la invención, uno cualquiera de los fragmentos parciales anteriores puede utilizarse solo y también pueden utilizarse dos o más copias de un tipo del fragmento parcial. Como alternativa, pueden utilizarse en combinación dos o más tipos diferentes de los fragmentos parciales. Además, pueden utilizarse en combinación una secuencia de longitud completa y un fragmento parcial de cualquiera de los elementos de ADN mencionados anteriormente. En la combinación anterior, la secuencia de longitud completa y el fragmento parcial pueden proceder del mismo elemento de ADN o de diferentes elementos de ADN.

En cuanto a las secuencias de polinucleótidos de los respectivos fragmentos de A2, A2-1 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 1 a 3000 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-2 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 2801 a 5800 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-3 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 5401 a 8450 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-4 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 701 a 2700 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-5 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos

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701 a 2200 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-6 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 701 a 3700 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-7 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 2001 a 5000 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-8 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 4001 a 7000 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-9 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 1 a 3700 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-10 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 2001 a 5800 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-11 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 2801 a 7000 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-12 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 701 a 5800 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-13 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 2001 a 7000 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-14 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 2801 a 8450 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-15 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 1 a 5800 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-16 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 701 a 7000 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-17 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 2001 a 8450 de la SEQ ID NO: 10 en el listado de secuencias.

En cuanto a las secuencias de polinucleótidos de los respectivos fragmentos de A7, A7-1 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 601 a 3600 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; A7-2 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 3601 a 8420 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; A7-3 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 5401 a 8420 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; A7-4 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 3401 a 6400 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; A7-5 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 1501 a 4500 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; A7-6 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 4401 a 7400 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; A7-7 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 2401 a 5400 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; A7-8 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 1 a 3600 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; A7-9 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 1501 a 5400 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; A7-10 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 2401 a 6400 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; A7-11 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 3401 a 7400 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; A7-12 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 4401 a 8420 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; A7-13 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 1 a 5400 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; A7-14 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 1501 a 6400 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; A7-15 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 2401 a 7400 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; A7-16 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 3401 a 8420 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; A7-17 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 1 a 6400 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; y A7-18 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 1501 a 7400 de la SEQ ID NO: 11 en el listado de secuencias.

En cuanto a las secuencias de polinucleótidos de los respectivos fragmentos de A18, A18-1 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 1 a 5040 de la SEQ ID NO: 12 en el Listado de Secuencias; A18-2 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 1001 a 6002 de la SEQ ID NO: 12 en el Listado de Secuencias; A18-3 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 2001 a 7000 de la SEQ ID NO: 12 en el Listado de Secuencias; y A18-4 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 3000 a 7000 de la SEQ ID NO: 12 en el listado de secuencias.

En cuanto a las secuencias de polinucleótidos de los respectivos fragmentos de B5, B5-1 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 1 a 4001 de la SEQ ID NO: 13 en el Listado de Secuencias; B5-2 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 1 a 3200 de la SEQ ID NO: 13 en el Listado de Secuencias; B5-3 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 2491 a 5601 de la SEQ ID NO: 13 en el Listado de Secuencias; B5-4 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 5373 a 8401 de la SEQ ID NO: 13 en el Listado de Secuencias; B5-5 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 901 a 4001 de la SEQ ID NO: 13 en el Listado de Secuencias; B5-6 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 4001 a 7000 de la SEQ ID NO: 13 en el listado de secuencias.

En cuanto a las secuencias de polinucleótidos de los respectivos fragmentos de C14, C14-1 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 960 a 4015 de la SEQ ID NO: 14 en el Listado de Secuencias; C14-2 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 1987 a 5014 de la SEQ ID NO: 14 en el Listado de Secuencias; C14-3 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 4020 a 7119 de la SEQ ID NO: 14 en el Listado de Secuencias; C14-4 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 960 a 8141 de la SEQ ID NO: 14 en el Listado de Secuencias; C14-5 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 960 a 6011 de la SEQ ID NO: 14 en el Listado de Secuencias; C14-6 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 4939 a 8141 de la SEQ ID NO: 14 en el Listado de Secuencias; C14-7 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 960 a 5014 de la SEQ ID NO: 14 en el Listado de Secuencias; C14-8 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 2994 a 7119 de la SEQ ID NO: 14 en el Listado de Secuencias; C14-9 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 4020 a 8141 de la SEQ ID NO: 14 en el Listado de Secuencias; C14-10 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 1 a 5014 de la SEQ

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4. Adquisición de polinucleótidos

En la invención, un polinucleótido que contiene un gen extraño que codifica una proteína extraña, cuya producción debe ser aumentada, que se describirá más adelante, se puede obtener mediante procedimientos comunes como se describe a continuación. Por ejemplo, se puede aislar dicho polinucleótido mediante la identificación de una biblioteca de ADNc que procede de células o tejidos que expresan el gen extraño utilizando una sonda de ADN sintetizada a partir de un fragmento del gen extraño. El ARNm para los mismos se puede preparar mediante procedimientos utilizados normalmente en la técnica. Por ejemplo, se tratan células o tejidos con un reactivo de guanidina, un reactivo de fenol, etc., obteniendo, de este modo, ARN total y, a continuación, se obtiene poli (A) + ARN (ARNm) mediante un procedimiento de columna de afinidad utilizando una columna de oligo (dT) celulosa o una columna de poli U-Sepharose que contiene Sepharose 2B o similar, como un vehículo o mediante un procedimiento discontinuo. Además, el poli(A) + ARN puede fraccionarse adicionalmente mediante centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa o similar. Después, se sintetiza ADNc de cadena simple utilizando el ARNm así obtenido como un molde, cebadores oligo (dT) y una transcriptasa inversa. A partir del ADNc de cadena simple así obtenido, se sintetiza ADNc de doble cadena utilizando ADN polimerasa I, ADN ligasa, RNasa H y similares. El ADNc de doble cadena así sintetizado se recorta utilizando la ADN polimerasa T4, seguido de ligadura a un adaptador (tal como el adaptador de EcoRI), fosforilación y similares, y el ADN resultante se incorpora en un fago lambda tal como Agt11 para lograr el empaquetado in vivo, con lo que se prepara una biblioteca de ADNc. También es posible preparar una biblioteca de ADNc utilizando un vector plasmídico en lugar del fago lambda. A continuación, puede seleccionarse un clon que contiene el ADN diana (un clon positivo) a partir de la biblioteca de ADNc.

En los casos en los que el promotor mencionado anteriormente, un polinucleótido que contiene una región de terminación, el elemento de ADN mencionado anteriormente o un polinucleótido que contiene un gen extraño a utilizar para producir una proteína, se aísla del ADN genómico, de acuerdo con un procedimiento común (Molecular Cloning (1989), Methods in Enzymology 194 (1991)), se extrae ADN genómico de una línea celular de un organismo para utilizarse como una fuente de recogida, y se selecciona y aísla el polinucleótido. La extracción de ADN genómico se puede realizar de acuerdo con, por ejemplo, el procedimiento de Cryer y col. (Methods in Cell Biology, 12, 39-44 (1975)) o el procedimiento de P. Philippsen y col. (Methods Enzymol., 194, 169-182 (1991)).

El promotor diana, elemento de ADN o polinucleótido que contiene un gen extraño también se puede obtener mediante, por ejemplo, el procedimiento de PCR (PCR Technology. Henry A. Erlich, Atockton press (1989)). En la amplificación de un polinucleótido utilizando el procedimiento de PCR, se utilizan ADN de cadena simple sintéticos de 20 a 30 meros como cebadores y se utiliza ADN genómico como un molde. El gen amplificado se utiliza después de que se confirma la secuencia polinucleotídica del gen. Como el molde para PCR, se puede utilizar una biblioteca de ADN genómico tal como una biblioteca de cromosomas artificiales de bacteria (BAC).

Por otra parte, se puede obtener el polinucleótido que contiene un gen extraño cuya secuencia no se conoce mediante (a) la preparación de una biblioteca de genes de acuerdo con un procedimiento común y (b) la selección de un polinucleótido deseado a partir de la biblioteca de genes preparada y la amplificación del polinucleótido. Se puede preparar la biblioteca de genes mediante la digestión parcial del aDn cromosómico obtenido mediante un procedimiento común a partir de una línea celular de un organismo para utilizarse como una fuente de recogida utilizando una enzima de restricción apropiada para fragmentar el ADN cromosómico, uniendo los fragmentos obtenidos a un vector apropiado e introduciendo el vector en un hospedador apropiado. También se puede preparar la biblioteca de genes mediante la extracción de ARNm de las células, la síntesis de ADNc a partir del ARNm, la unión del ADNc a un vector apropiado y la introducción del vector en un hospedador apropiado. Como el vector para utilizarse en dicha preparación, se puede utilizar un plásmido normalmente conocido como un vector para la preparación de la biblioteca de genes y también se pueden utilizar un vector fago, un cósmido o similares. Como el hospedador para transformarse o transfectarse, puede utilizarse un hospedador adecuado para el tipo de vector mencionado anteriormente. El polinucleótido que contiene el gen extraño se selecciona a partir de la biblioteca de genes mencionada anteriormente mediante un procedimiento de hibridación de colonias, un procedimiento de hibridación de placas o similares utilizando una sonda marcada que contiene una secuencia específica para el gen extraño.

Además, el polinucleótido que contiene el gen extraño también puede producirse mediante síntesis química total. Por ejemplo, se puede sintetizar el gen mediante un procedimiento en el que se preparan y alinean dos pares de oligonucleótidos complementarios, un procedimiento en el que se ligan varias cadenas de ADN hibridadas mediante una ADN ligasa, un procedimiento en el que se preparan diversos oligonucleótidos parcialmente complementarios y se rellenan espacios mediante PCR o similares.

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La determinación de una secuencia polinucleotídica se puede realizar mediante una técnica convencional, por ejemplo, un procedimiento didesoxi (Sanger y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463-5467 (1977)), o similar. Además, la anterior determinación de una secuencia polinucleotídica también se puede realizar fácilmente utilizando un kit de secuenciación comercialmente disponible o similares.

5. Vector de expresión de genes extraños, Vector de elemento

Como un vector de expresión de genes extraños de la invención, se proporciona un vector que contiene la unidad de expresión de genes extraños descrita en el anterior punto "2" que contiene el promotor de la invención descrito en el anterior punto "1". El vector de expresión de genes extraños de la invención puede contener, opcionalmente, un tipo de los elementos de ADN descritos en el anterior punto "3", dos o más copias de uno de los tipos de los elementos de ADN mencionados anteriormente o dos o más tipos diferentes de los elementos de ADN mencionados anteriormente en combinación. Cuando se expresa un gen extraño en una célula huésped utilizando el vector de expresión de genes extraños mencionado anteriormente, el elemento de ADN puede localizarse inmediatamente cadena arriba o cadena abajo de la unidad de expresión de genes o puede localizarse en una posición lejos de la unidad de expresión de genes. Además, puede utilizarse un vector de expresión de genes extraños que contiene una pluralidad de dichos elementos de ADN. En relación con esto, el elemento de ADN se puede insertar en orientación directa o inversa con respecto a la unidad de expresión de genes.

Además, como el vector para utilizarse en la invención, también se incluye un vector que contiene un tipo de los elementos de ADN mencionados anteriormente, dos o más copias de un tipo de los elementos mencionados anteriormente o dos o más tipos diferentes de los elementos de ADN mencionados anteriormente en combinación y que no contiene unidad de expresión de genes (en lo sucesivo en el presente documento denominado "vector de elemento"). Dicho vector de elemento se puede utilizar en combinación con el vector de expresión de genes extraños mencionado anteriormente que contiene el elemento de ADN o un vector de expresión de genes extraños que no contiene el elemento de ADN y que contiene solo la unidad de expresión de genes extraños. Al permitir que el vector de elemento coexista con el vector de expresión de genes extraños, la expresión del gen extraño se mejora en comparación con los casos en los que se utiliza el vector de expresión de genes extraños solo y, por lo tanto, la combinación de los vectores mencionados anteriormente también se incluye dentro del vector de expresión de genes extraños de la invención.

El gen extraño no está particularmente limitado, pero los ejemplos del mismo incluyen genes indicadores tales como los genes de fosfatasa alcalina secretora (SEAP), una proteína fluorescente verde (GFT) y luciferasa; diversos genes enzimáticos tales como un gen a-amilasa y un gen a-galactosidasa; genes de diversos interferones que son proteínas farmacéuticamente útiles y fisiológicamente activas tales como interferón a e interferón y; genes de diversas interleucinas tales como IL-1 e IL-2; diversos genes de citocina tales como un gen de eritropoyetina (EPO) y un gen del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF); un gen del factor de crecimiento; y un gen que codifica una proteína multimérica tal como un gen que codifica un heteromultímero que es un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo. Estos genes pueden obtenerse por cualquier procedimiento.

El "fragmento funcional de un anticuerpo" se refiere a un fragmento parcial de un anticuerpo que tiene una actividad de unión a antígeno e incluye Fab, F(ab')2, Fv, scFv, diacuerpos, anticuerpos lineales, anticuerpos poliespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos y similares. El fragmento funcional de un anticuerpo también incluye Fab' que es un fragmento monovalente en una región variable de un anticuerpo obtenido tratando F(ab')2 en condiciones reductoras. Sin embargo, el fragmento funcional no está limitado a estas moléculas siempre que el fragmento tenga una afinidad de unión por un antígeno. Además, estos fragmentos funcionales incluyen no solamente un fragmento obtenido tratando una molécula de longitud completa de una proteína de anticuerpo con una enzima apropiada, sino también una proteína producida en una célula huésped apropiada utilizando un gen de anticuerpo genéticamente modificado.

Además, el vector de expresión de genes extraños y el vector de elemento de la invención pueden contener cada uno un marcador de selección para seleccionar un transformante. Mediante la utilización de, por ejemplo, un marcador resistente a antibiótico que imparte resistencia a un antibiótico tal como cerulenina, aureobasidina, Zeocina, canavanina, cicloheximida, higromicina, puromicina, blasticidina, tetraciclina, kanamicina, ampicilina o neomicina, se puede seleccionar un transformante. Además, también se puede seleccionar un transformante cuando se utiliza como un marcador un gen que imparte resistencia a un disolvente tal como etanol, resistencia a la presión osmótica de glicerol, una sal o similares, resistencia a un ion metálico tal como un ion de cobre o similares.

El vector de expresión de genes extraños y el vector de elemento de la invención pueden ser cada uno un vector que no se incorpora en el ADN cromosómico. En general, el vector de expresión de genes extraños transfecta a una célula huésped y, por lo tanto, se incorpora aleatoriamente en el cromosoma. Sin embargo, mediante la utilización de un componente constituyente que procede de un virus de mamífero tal como el virus 40 de simio (SV40), un papilomavirus (VPB, VPH) o VEB, el vector se puede utilizar como un vector episómico que es autorreplicable en la célula huésped transfectada. Por ejemplo, se utilizan ampliamente un vector que contiene un origen de replicación que procede de SV40 y una secuencia que codifica un antígeno T grande de SV40 que es un factor de acción trans, un vector que contiene un oriP que procede de VEB y una secuencia que codifica EBNA-1 y similares. El elemento de ADN puede exhibir eficazmente la actividad de mejorar la expresión de genes extraños independientemente del

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tipo de vector o la presencia o ausencia de incorporación del mismo en el cromosoma.

6. Célula transformada

La célula transformada de la invención es una célula transformada en la que se ha introducido el vector de expresión de genes extraños descrito en el anterior punto "5". Como el vector de expresión de genes extraños, (A) puede introducirse solo un vector de expresión de genes extraños que no contiene elemento de ADN o (B) puede introducirse en combinación un vector de expresión de genes extraños que no contiene elemento de ADN y un vector de elemento. Como alternativa, (C) puede introducirse un vector de expresión de genes extraños que contiene un elemento de ADN o (D) puede introducirse en combinación un vector de expresión de genes extraños que contiene un elemento de ADN y un vector de elemento.

La expresión de un gen extraño en una célula huésped mediante la combinación descrita en el anterior (B) o (D) se puede realizar de acuerdo con, por ejemplo, el procedimiento de Girod y col. (Biotechnology and Bioengineering, 91,

2-11 (2005)) y el procedimiento de otte y col. (Biotechnol. Prog., 2007, 23, 801-807 (2007)).

Los ejemplos de la célula huésped para ser transformada incluyen una célula eucariota, los ejemplos preferentes de la misma incluyen una célula de mamífero y los ejemplos más preferentes incluyen una célula que procede de seres humanos, ratones, ratas, hámsteres, monos o ganado. Los ejemplos de dicha célula de mamífero incluyen una célula COS-1, una célula 293 y una célula CHO (CHO-K1, DG44, CHO dhfr-, CHO-S), pero la célula huésped no se limita a estas.

En la invención, puede utilizarse cualquier procedimiento para introducir el vector de expresión en la célula huésped siempre que el procedimiento permita que el gen introducido esté presente de manera estable en la célula huésped y se exprese adecuadamente en la misma. Los ejemplos del procedimiento que se utiliza normalmente incluyen un procedimiento de fosfato de calcio (Ito y col., (1984) Agric. Biol. Chem., 48, 341), un procedimiento de electroporación (Becker, D. M. y col., 1990; Methods. Enzymol., 194, 182-187), un procedimiento de esferoplastos (Creggh y col., Mol. Cell. Biol., 5, 3376 (1985)), un procedimiento de acetato de litio (Ito, H. (1983) J. Bacteriol. 153, 163-168), y un procedimiento de lipofección.

7. Procedimiento para la producción de proteínas extrañas

En la invención, se puede producir una proteína extraña mediante el cultivo de la célula transformada descrita en el anterior punto "6", en la que se ha introducido un gen que codifica la proteína extraña, mediante un procedimiento conocido, la recolección de la proteína del producto de cultivo resultante, seguida de la purificación de la proteína. La expresión "producto de cultivo" como se utiliza en el presente documento se refiere a células cultivadas o un homogeneizado de células además de un sobrenadante de cultivo. En relación con esto, como la proteína extraña que se puede producir utilizando la célula transformada descrita en el anterior punto "6", se puede seleccionar no solo una proteína monomérica, sino también una proteína multimérica. En los casos en los que se produce una proteína heteromultimérica formada de una pluralidad de diferentes subunidades, es necesario introducir una pluralidad de genes que codifican estas subunidades en la célula huésped descrita en el anterior punto "6", respectivamente.

El procedimiento para cultivar la célula transformada se puede realizar de acuerdo con procedimientos convencionales para el cultivo de células huésped.

En los casos en los que la célula transformada es una célula de mamífero, se cultiva la célula en condiciones de, por ejemplo, 37 °C y CO2 al 5 % u 8 % durante un tiempo de cultivo de aproximadamente 24 a 1000 horas. El cultivo se puede realizar a través de un cultivo discontinuo, un cultivo discontinuo alimentado, un cultivo continuo o similares en condiciones estáticas, de sacudida, de agitación o de aireación.

Se puede realizar la confirmación del producto de expresión del gen que codifica la proteína extraña a partir del producto de cultivo mencionado anteriormente (solución de cultivo) mediante SDS-PAGE, un análisis Western, ELISA o similares. Para aislar y purificar la proteína producida, puede utilizarse un procedimiento convencional de aislamiento y purificación de proteínas. Después de completarse el cultivo, en los casos en los que se produce la proteína diana en las células, se homogeneízan las células utilizando un homogeneizador ultrasónico, una prensa francesa, un homogeneizador Manton-Gaulin, DYNO-MILL o similares, obteniendo de este modo la proteína diana. Además, en los casos en los que se produce la proteína diana fuera de las células, la solución de cultivo se utiliza como tal o se eliminan las células mediante centrifugación o similar. A continuación, se recoge la proteína diana mediante extracción o similar utilizando un disolvente orgánico y, a continuación, puede aislarse y purificarse la proteína diana recogida mediante la utilización de técnicas tales como diversas técnicas de cromatografía (cromatografía hidrófoba, cromatografía de fase inversa, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, etc.), filtración en gel utilizando un tamiz molecular o electroforesis utilizando un gel de poliacrilamida o similares, solas o en combinación de acuerdo con las necesidades.

Los procedimientos de cultivo y procedimientos de purificación mencionados anteriormente son solo ejemplos y los procedimientos no se limitan e ellos. La secuencia de aminoácidos del producto génico purificado se puede confirmar mediante una técnica de análisis de aminoácidos conocida tal como secuenciación de aminoácidos

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automatizada utilizando el procedimiento de degradación de Edman.

8. Procedimiento para la producción de proteínas de anticuerpo

Se puede ejemplificar como la proteína heteromultimérica a producir utilizando el procedimiento de producción descrito en el anterior punto "7", una proteína de anticuerpo. La proteína de anticuerpo es una proteína tetramérica que comprende dos moléculas de polipéptidos de cadena pesada y dos moléculas de polipéptidos de cadena ligera. Por consiguiente, para obtener dicha proteína de anticuerpo en un estado de mantenimiento de una afinidad de unión a antígeno, es necesario introducir los genes de cadena pesada y ligera en la célula transformada descrita en el anterior punto "6". En este caso, las unidades de expresión de genes de cadena pesada y ligera pueden presentarse en el mismo vector de expresión o diferentes vectores de expresión.

Se puede ejemplificar como el anticuerpo para producirse en realizaciones de la invención, un anticuerpo preparado mediante inmunización de un animal experimental tal como un conejo, un ratón o una rata, con un antígeno deseado. Además, también se puede ejemplificar como el anticuerpo para producirse en la invención, un anticuerpo quimérico y un anticuerpo humanizado obtenidos mediante la utilización del anticuerpo mencionado anteriormente como material de inicio. Además, también se incluye un anticuerpo humano obtenido utilizando un animal modificado genéticamente o un procedimiento de presentación en fagos, en el anticuerpo a producir en realizaciones de la invención.

El gen de anticuerpo a utilizar para la producción del anticuerpo no se limita a un gen de anticuerpo que tiene una secuencia polinucleotídica específica siempre que la combinación del polinucleótido de cadena pesada y el polinucleótido de cadena ligera para transcribirse y traducirse a partir del gen de anticuerpo tengan la actividad de unión a una proteína de antígeno dada.

Además, no es necesario que el gen de anticuerpo codifique la molécula de longitud completa del anticuerpo y se puede utilizar un gen que codifica un fragmento funcional del anticuerpo. Se puede obtener dicho gen que codifica un fragmento funcional del mismo mediante modificación genética de un gen que codifica la molécula de longitud completa de una proteína de anticuerpo.

9. Procedimiento de producción para otras proteínas extrañas

Los ejemplos de la proteína extraña a producir utilizando el procedimiento de producción de la invención incluyen, además de los anticuerpos mencionados anteriormente, diversas proteínas que proceden de seres humanos o no humanos, fragmentos funcionales de las mismas y productos modificados de las mismas. Los ejemplos de dichas proteínas y similares incluyen hormonas peptídicas tales como péptido natriurético auricular (ANP), péptido natriurético cerebral (BNP), péptido natriurético de tipo C (CNP), vasopresina, somatostatina, hormona del crecimiento (GH), insulina, oxitocina, ghrelina, leptina, adiponectina, renina, calcitonina, osteoprotegerina y factor de crecimiento similar a la insulina (IGF); citoquinas tales como interleuquina, quimiocina, interferón, factores de necrosis tumoral (tal como TNF-a, TNF-p y la superfamilia de TNF), factores de crecimiento nervioso (tales como NGF), factores de crecimiento celular (tales como EGF, FGF, PDGF, HGF y TGF), factores de crecimiento hematopoyéticos (tales como CSF, G-CFS y eritropoyetina) y adipoquina; receptores tales como receptores de TNF; enzimas tales como lisozima, proteasa, proteinasa y peptidasa; fragmentos funcionales de las mismas (fragmentos que tienen parte o toda la actividad biológica de la proteína original) y proteínas de fusión que comprenden cualquiera de estas proteínas. Sin embargo, las proteínas no se limitan a éstas.

Ejemplos

10. Ejemplos

En lo sucesivo en el presente documento, la invención se describirá específicamente con referencia a los ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos no limitan el ámbito técnico de la invención. Son productos comercialmente disponibles y se pueden utilizar de acuerdo con procedimientos comunes, los plásmidos, enzimas de restricción, enzimas de modificación de ADN y similares para utilizarse en los ejemplos de la invención. Además, también son bien conocidos por los expertos en la materia o se pueden encontrar en las referencias los procedimientos utilizados para clonar ADN, secuenciar polinucleótidos, transformar una célula huésped, cultivar una célula huésped transformada, recoger una proteína del producto de cultivo resultante, purificar una proteína y similares.

(Ejemplo 1) Construcción del vector CMV/pSeapIRESpuro para su uso en evaluación de actividad promotora

La evaluación de actividad promotora se realizó mediante la utilización de la expresión de SEAP como un índice y se construyó un vector para su uso en la evaluación.

1-1) Amplificación de ADNc de SEAP mediante PCR y adición de sitio de enzima de restricción

Se amplificó el ADNc de SEAP mediante PCR utilizando cebadores en los que se añadió un sitio Nhel inmediatamente cadena arriba del codón de inicio ATG y se añadió un sitio Bglll inmediatamente cadena abajo del codón de terminación y KOD -Plus- (TOYOBO). Como molde, se utilizó el control pSEAP2 (Clontech). Se digirió el

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fragmento obtenido con Nhel y Bglll y, a continuación, se purificó utilizando un kit de reacción MinElute (Qiagen).

Los cebadores utilizados:

SEAPF: AAAGCTAGCATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGGCC SEAPR: AAAAGATCTTCATGTCTGCTCGAAGCGGCCGGCCGC

1- 2) Construcción de CMV/pSeapIRESpuro

Después de digerirse un vector pIRESpuro3 (Clontech) con Nhel y BamHl, se integró el fragmento de SEAP preparado en 1-1) en el mismo mediante una reacción de ligadura. El plásmido obtenido se nombró "CMV/pSeapIRESpuro".

(Ejemplo 2) Clonación de regiones promotoras de RPS7, RPL32 y RPL34

Se seleccionaron como genes humanos que se consideraba que contenían un promotor que tiene una alta actividad transcripcional, EEF2, YBX1, PPIA, PSAP, RAN, RPL32, RPL34, RPLP1, RPS7, RPS24, TMSB4X, UBC, YWHAE, ARPC2 y SERBP1 mediante la utilización, como un índice, del nivel de ARNm y se realizó la clonación de la región promotora de cada gen. Se utilizaron los plásmidos obtenidos para la evaluación de la actividad promotora en el ejemplo 3.

2- 1) Clonación de la región promotora de RPS7

Se utilizó como la región promotora de RPS7, con referencia a la secuencia de ARNm registrada con el número de referencia NM_001011.3 en GenBank, una secuencia que empieza en un nucleótido localizado aproximadamente 2 kpb cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción y termina en un nucleótido inmediatamente cadena arriba de la secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia del codón de inicio de RPS7.

Se amplificó la región promotora de RPS7 mediante PCR utilizando el clon RP11-644P19 del cromosoma artificial de E. coli (GenoTechs) como un molde y también utilizando el siguiente conjunto de cebadores y KOD -Plus- (TOYOBO) y, a continuación, se purificó utilizando el kit de reacción MinElute (Qiagen). Después se digirió CMV/pSeapIRESpuro con Spel y Nhel y se eliminó el promotor de CMV, se integró la región promotora de RPS7 al sitio Spel-Nhel utilizando un kit de clonación de la PCR In-Fusion Advantage (Clontech), con lo que se construyó RPS7/pSeapIRESpuro. La secuencia de nucleótidos de la región promotora clonada de RPS7 se representa mediante la SEQ ID NO: 1 en el listado de secuencias.

Conjunto de cebadores para RPS7:

RPS7-F: TTGATTATTGACTAGTATTTATGTATATTAACAGCACATTAACAGC RPS7-R: GCAGCAGCATGCTAGCGGCTTTCTCCTGGGAGAACTGAAGGCACAGCGG

2-2) Clonación de la región promotora de RPL32

Como la región promotora de RPL32, con referencia a la secuencia de ARNm registrada en el número de referencia NM_000994.3 en GenBank, se utilizó una secuencia que empieza en un nucleótido localizado aproximadamente 2 kpb cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción y termina en el nucleótido inmediatamente cadena arriba de la secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia del codón de inicio de RPL32.

Se amplificó la región promotora de RPL32 mediante PCR utilizando el clon RP11-767C1 del cromosoma artificial de E. coli (GenoTechs) como un molde y también utilizando el siguiente conjunto de cebadores y KOD -Plus- (TOYOBO) y, a continuación, se purificó utilizando un kit de reacción MinElute (Qiagen). Después se digirió CMV/pSeapIRESpuro con Spel y Nhel y se eliminó el promotor de CMV, se integró la región promotora de RPL32 al sitio Spel-Nhel utilizando un kit de clonación de la PCR In-Fusion Advantage (Clontech), con lo que se construyó RPL32/pSeapIRESpuro. La secuencia de nucleótidos de la región promotora clonada de RPL32 se representa mediante la SEQ ID NO: 2 en el listado de secuencias.

Conjunto de cebadores para RPL32:

RPL32-F: TTGATTATTGACTAGTCTAAAGTGATTCCTAAAGAATTCTTCCC RPL32-R: GCAGCAGCATGCTAGCGATGCCTTTTGGGGAAGAAGCGGCCCC

2-3) Clonación de la región promotora de RPL34

Como la región promotora de RPL34, con referencia a la secuencia de ARNm registrada en el número de referencia NM_033625.2 en GenBank, se utilizó una secuencia que empieza en un nucleótido localizado aproximadamente 2 kpb cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción y termina en el nucleótido inmediatamente cadena arriba de la secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia del codón de inicio de RPL34.

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Se amplificó la región promotora de RPL34 mediante PCR utilizando el clon RP11-462C24 del cromosoma artificial de E. coli (GenoTechs) como un molde y también utilizando el siguiente conjunto de cebadores y KOD -Plus- (TOYOBO) y, a continuación, se purificó utilizando un kit de reacción MinElute (Qiagen). Después se digirió CMV/pSeapIRESpuro con Spel y Nhel y se eliminó el promotor de CMV, se integró la región promotora de RPL34 al sitio Spel-Nhel utilizando un kit de clonación de la PCR In-Fusion Advantage (Clontech), con lo que se construyó RPL34/pSeapIRESpuro. La secuencia de nucleótidos de la región promotora clonada de RPL34 se representa mediante la SEQ ID NO: 3 en el listado de secuencias.

Conjunto de cebadores para RPL34:

RPL34-F: TTGATTATTGACTAGTATGGTGGCACAATCATGGTTCACTGCAGCC RPL34-R: GCAGCAGCATGCTAGCTCTGAGTGCCTAAATTAAGAATAGAGTAACATC

2-4) Clonación de regiones promotoras de otros genes humanos

La clonación de cada una de las regiones promotoras de EEF2, YBX1, PPIA, PSAP, RAN, RPLP1, RPS24, TMSB4X, UBC, YWHA, ARPC2 y SERBP1 se realizó de acuerdo con el procedimiento descrito en el punto anterior

2- 1) mediante el cual se construyó pSeapIRESpuro que contiene el polinucleótido clonado.

(Ejemplo 3) Evaluación de actividad promotora utilizando el nivel de expresión de SEAP en células policlonales CHO-K1 transfectadas como índice 3-1) Transfección

Se subcultivaron células CHO-K1 (ATCC) en CO2 al 5 % a 37 °C utilizando el medio de mezcla de nutrientes F-12 (GIBCO) que contiene FBS de IgG ultrabaja (GIBCO) al 10 %.

Se sembraron las células CHO-K1 en una placa de 6 pocillos (IWAKI) con 5 x 105 células/pocillo. Al día siguiente, se introdujeron por transfección 2 |jg de cada CMV/pSeapIRESpuro, RPS7/pSeapIRESpuro, RPL32/pSeapIRESpuro, RPL34/pSeapIRESpuro o similares construidos en los ejemplos 1) y 2) utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

3- 2) Selección de antibiótico con puromicina

Dos días después de la transfección, se recogieron las células de la placa de 6 pocillos mediante un tratamiento de tripsina, se sembró la cantidad total de las células recogidas en una placa de 6 cm (Nunc) y se añadió también puromicina (Clontech) al medio a una concentración final de 8 jg/ml para iniciar la selección con antibióticos.

3- 3) Evaluación utilizando una línea celular policlonal transfectada

Después de 11 días del inicio de la selección de antibióticos, se recogió la línea celular policlonal transfectada con tripsina y se contó el número de células. Después, se sembraron las células en una placa de 24 pocillos (IWAKI) con 1 x 105 células/ml/pocillo. Después de 24 horas, se recogió el sobrenadante del cultivo y se midió la actividad de SEAP en el sobrenadante del cultivo utilizando el ensayo indicador de fosfatasa alcalina secretada pNPP SensoLyte™ (ANASPEC). La actividad de SEAP fue mayor bajo el control de cada una de las regiones promotoras de RPS7, RPL32 y RPL34 que bajo el control del promotor de CMV (CMV/pSeapIRESpuro) que sirve como el control, y la actividad de SEAP fue 1,7 veces o más, 2,0 veces o más y 2,5 veces o más mayor que la del control, respectivamente (figura 1). Paralelamente, la actividad de SEAP fue menor bajo el control de cada una de las regiones promotoras de EEF2, YBX1, PPIA, PSAP, RAN, RPLP1, RPS24, TMSB4X, UBC, YWHA, ARPC2 y SERBP1 que bajo el control del promotor de CMV.

(Ejemplo 4) Clonación de un promotor truncado

Se realizó la clonación de los promotores truncados utilizando como los promotores truncados de RPS7, RPL32 y RPL34, una secuencia de nucleótidos (T1) que empieza en un nucleótido localizado aproximadamente 1 kpb cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción y termina en el nucleótido inmediatamente cadena arriba de la secuencia de nucleótidos que corresponde al codón de inicio de cada gen, y una secuencia de nucleótidos (T2) que empieza en un nucleótido localizado aproximadamente 0,5 kpb cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción y termina en el nucleótido inmediatamente cadena arriba de la secuencia de nucleótidos que corresponde al codón de inicio de cada gen.

4- 1) Clonación de RPS7T1 y RPS7T2

Se amplificaron RPS7T1 y RPS7T2 mediante PCR utilizando RPS7/pSeapIRESpuro construido en 2-1) como un molde y utilizando también el siguiente conjunto de cebadores y KOD -Plus- (TOYOBO) y, a continuación, se purificaron utilizando un kit de reacción MinElute (Qiagen). Después se digirió CMV/pSeapIRESpuro con Spel y Nhel y se eliminó el promotor de CMV, se integró cada una de las regiones promotoras de RPS7T1 y RPS7T2 al sitio Spel-Nhel utilizando un kit de clonación de la PCR de In-Fusion Advantage (Clontech), con el que se construyeron RPS7T1/pSeapIRESpuro y RPS7T2/pSeapIRESpuro. Las secuencias de nucleótidos de las regiones promotoras clonadas de RPS7T1 y RPS7T2 se representan mediante las SEQ ID NOS: 4 y 5 en el Listado de secuencias, respectivamente.

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Conjunto de cebadores para RPS7T1

RPS7-T1: TTGATTATTGACTAGTCCTAGTGTGGCTTCTGCATTTTTCACAGTGC RPS7-R: GCAGCAGCATGCTAGCGGCTTTCTCCTGGGAGAACTGAAGGCACAGCGG

Conjunto de cebadores para RPS7T2

RPS7-T2: TTGATTATTGACTAGTCCTCGGCTCACGGCAGCCTCGACCTTTCGGC RPS7-R: GCAGCAGCATGCTAGCGGCTTTCTCCTGGGAGAACTGAAGGCACAGCGG

4-2) Clonación de RPL32T1 y RPL32T2

Se amplificaron RPL32T1 y RPL32T2 mediante PCR utilizando RPL32/pSeapIRESpuro construido en 2-2) como un molde y utilizando también el siguiente conjunto de cebadores y KOD -Plus- (TOYOBO) y, a continuación, se purificaron utilizando un kit de reacción MinElute (Qiagen). Después se digirió CMV/pSeapIRESpuro con Spel y Nhel y se eliminó el promotor de CMV, se integró cada una de las regiones promotoras de RPL32T1 y RPL32T2 al sitio Spel-Nhel utilizando un kit de clonación de la PCR de In-Fusion Advantage (Clontech), con el que se construyeron RPL32T1/pSeapIRESpuro y RPL32T2/pSeapIRESpuro. Las secuencias de nucleótidos de las regiones promotoras clonadas de RPL32T1 y RPL32T2 se representan mediante las SEQ ID NOS: 6 y 7 en el Listado de secuencias, respectivamente.

Conjunto de cebadores para RPL32T1

RPL32T1: TTGATTATTGACTAGTCCTCTCGAGTAACTGGGACTACAGGCATGC RPL32-R: GCAGCAGCATGCTAGCGATGCCTTTTGGGGAAGAAGCGGCCCC

Conjunto de cebadores para RPL32T2

RPL32T2: TTGATTATTGACTAGTGCAGTTTCGCCCAGTGGTTAGAAGCGTGG RPL32-R: GCAGCAGCATGCTAGCGATGCCTTTTGGGGAAGAAGCGGCCCC

4- 3) Clonación de RPL34T1 y RPL34T2

Se amplificaron RPL34T1 y RPL34T2 mediante PCR utilizando RPL34/pSeapIRESpuro construido en 2-3) como un molde y utilizando también el siguiente conjunto de cebadores y kOd -Plus- (TOYOBO) y, a continuación, se purificaron utilizando un kit de reacción MinElute (Qiagen). Después se digirió CMV/pSeapIRESpuro con Spel y Nhel y se eliminó el promotor de CMV, se integró cada una de las regiones promotoras de RPL34T1 y RPL34T2 al sitio Spel-Nhel utilizando un kit de clonación de la PCR de In-Fusion Advantage (Clontech), con el que se construyeron RPL34T1/pSeapIRESpuro y RPL34T2/pSeapIRESpuro. Las secuencias de nucleótidos de las regiones promotoras clonadas de RPL34T1 y RPL34T2 se representan mediante las SEQ ID NOS: 8 y 9 en el Listado de secuencias, respectivamente.

Conjunto de cebadores para RPL34T1

RPL34T1: TTGATTATTGACTAGTGCTTCCTGGAGGTGCATTCTAAGAGCGCTCCCC RPL34-R: GCAGCAGCATGCTAGCTCTGAGTGCCTAAATTAAGAATAGAGTAACATC

Conjunto de cebadores para RPL34T2

RPL34T2: TTGATTATTGACTAGTGTAAAGCTTGTGCTCTGAATAAATGACAAGG RPL34-R: GCAGCAGCATGCTAGCTCTGAGTGCCTAAATTAAGAATAGAGTAACATC

(Ejemplo 5) Evaluación de actividad de promotor truncado utilizando el nivel de expresión de SEAP en células policlonales CHO-K1 transfectadas como índice

5- 1) Transfección

Se sembraron las células CHO-K1 en una placa de 6 pocillos (IWAKI) con 2 x 105 células/pocillo. Al día siguiente, se introdujeron por transfección 2 |jg de cada CMV/pSeapIRESpuro, RPS7/pSeapIRESpuro, RPS7T1/pSeapIRESpuro, RPS7T2/pSeapIRESpuro, RPL32/pSeapIRESpuro, RPL32T1/pSeapIRESpuro, RPL32T2/pSeapIRESpuro, RPL34/pSeapIRESpuro, RPL34T1/pSeapIRESpuro y RPL34T2/pSeapIRESpuro construidos en los ejemplos 1), 2) y 4) utilizando Fugene 6 (Roche Applied Science).

5-2) Selección de antibiótico con puromicina

Dos días después de la transfección, se recogieron las células de la placa de 6 pocillos mediante un tratamiento con tripsina y se sembró la cantidad total de células recogidas en una placa de 6 cm (Nunc) y se añadió también

puromicina al medio a una concentración final de 8 |jg/ml para iniciar la selección de antibióticos.

5-3) Evaluación utilizando una línea celular policlonal transfectada

Después de 11 días del inicio de la selección de antibióticos, se recogió cada línea celular policlonal transfectada con tripsina y se contó el número de células. Después, se sembraron las células en una placa de 24 pocillos (IWAKI) 5 con 1 x 105 células/ml/pocillo. Después de 24 horas, se recogió el sobrenadante del cultivo y se midió la actividad de SEAP en el sobrenadante del cultivo utilizando el ensayo de indicador de fosfatasa alcalina secretada pNPP SensoLyte (marca registrada) (ANASPEC). Los resultados de la medición se muestran en la figura 2. La actividad de SEAP fue mayor bajo el control de cada uno de los promotores truncados que bajo el control del promotor de CMV (CMV/pSeapIRESpuro) que sirve como el control y, de este modo, se demostró que estos promotores tienen una 10 actividad promotora mayor que el promotor de CMV.

(Ejemplo 6) Extracción de elemento de ADN

(6-1) Inmunoprecipitación con cromatina utilizando el anticuerpo anti histona H3 acetilada

Se realizó ChIP utilizando un anticuerpo anti histona acetilada que utiliza EZ ChIP (Upstate) de acuerdo con el siguiente procedimiento. En relación con esto, a menos que se indique otra cosa, se utilizaron productos de Upstate 15 como los anticuerpos, tampones o similares en el siguiente procedimiento.

En primer lugar, se cultivaron células 293F (Invitrogen) utilizando el medio FreeStyle™ 293 GIBCO (marca registrada) (Invitrogen) en condiciones de 37 °C y CO2 al 8 %, seguido de centrifugación (1000 rpm, 5 min a temperatura ambiente), con lo que se recogieron células en la fase de crecimiento. Después se agitaron 2 x 107 células en un medio que contenía formaldehido al 1 % durante 10 minutos, se añadió glicina 10x al mismo, seguido 20 de agitación a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de la centrifugación (3000 rpm, 5 min, 4°C), se eliminó el sobrenadante y se añadió PBS al sedimento celular para suspender las células. Después, se centrifugó la suspensión celular de nuevo para eliminar PBS y, a continuación, se añadió un tampón de lisis de SDS al sedimento celular para suspender y lisar las células. Cada muestra obtenida mediante lisis celular se sometió a fragmentación de ADN utilizando un homogeneizador ultrasónico (BRANSON) mientras se refrigeraba la muestra con hielo y se 25 añadió a la misma un tampón de dilución que contenía un cóctel de inhibidores de proteasas y agarosa inmovilizada con proteína G. La mezcla resultante se agitó a 4 °C durante 1 hora, seguido de centrifugación y, a continuación, se recogió el sobrenadante. Posteriormente, se añadieron a la misma 10 jg de IgG de conejo normal o un anticuerpo de a-acetil histona H3, seguido de agitación durante la noche a 4 °C. A la solución resultante, se le añadió agarosa inmovilizada con proteína G y la mezcla resultante se agitó a 4 °C durante 1 hora, seguido de centrifugación y, a 30 continuación, se recogió el sedimento. Se lavó el sedimento así obtenido dos veces con el tampón de lavado Low Salt Immune Complex, dos veces con el tampón de lavado High Salt Immune Complex, dos veces con el tampón de lavado LiCl Immune Complex y, finalmente, cuatro veces con tampón TE. A continuación, se añadió al mismo un tampón de elución (que contenía 20 jl de hidrogenocarbonato de sodio 1 M, 10 jl de SDS y 170 jl de agua estéril). Después de 30 minutos, se centrifugó la mezcla y se recogió el sobrenadante.

35 Posteriormente, se añadió cloruro de sodio 5 M al sobrenadante y se calentó la mezcla resultante durante la noche a 65 °C. A continuación, se añadió a la misma RNasa A y se incubó la mezcla resultante a 37 °C durante 30 minutos. A continuación, se añadieron a la misma EDTA 0,5 M, Tris-HCl 1 M y proteinasa K, y se incubó la mezcla resultante a 45 °C durante 2 horas. Finalmente, se añadieron a la misma reactivos A, B y C en una cantidad 5 veces superior que la de la solución obtenida mediante el tratamiento con proteinasa K, seguido de centrifugación (10000 rpm, 30 40 segundos a temperatura ambiente) utilizando un filtro de centrifugación, con lo que se purificó ADN inmunoprecipitado con cromatina.

(6-2) Análisis de micromatriz

Mediante la utilización de un kit de amplificación genómica completa (WGA) Genomeplex (Sigma), se amplificó cada muestra ChIP obtenida en (6-1). El procedimiento fue de acuerdo con el protocolo de Sigma que acompaña al kit.

45 Para confirmar ChIP, mediante la utilización de 320 ng de cada ADN amplificado mediante WGA como un molde y utilizando también los siguientes cebadores y SYBR (marca registrada) Premix Ex Taq™ (Perfect Real Time) (TAKARA), se amplificó internamente un gen de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) mediante el procedimiento de PCR (95 °C durante 5 segundos y 60 °C durante 20 segundos x 45 ciclos). En relación con esto, GAPDH es un gen constitutivo para utilizarse como un control positivo para confirmar si un elemento de ADN se 50 enriquece mediante ChIP y se realizó el procedimiento PCR utilizando cebadores unidos a un EZ ChIP (Upstate).

5'-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3'

5'-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3'

Como resultado, se confirmó que GAPDH se amplificaba especialmente en la muestra sometida a inmunoprecipitación con un anticuerpo anti histona H3 acetilada (figura 3). Se sometió cada una de las muestras de 55 ADN amplificadas mediante WGA a análisis de micromatriz (NimbleGen) para realizar inmunoprecipitación con cromatina en chips (ChIP-on-chip). "ChIP-on-chip" es una técnica para identificar cada elemento de ADN sometiendo

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ADN enriquecido en (6-1) a análisis de micromatriz.

(6-3) Extracción de un elemento de ADN

Basándose en los resultados del análisis ChIP-on-chip obtenido en (6-2), se extrajeron 5 secuencias que tenían un contenido de AT del 62% o más.

A2: cromosoma 15 (80966429 a 80974878)

A7: cromosoma 11 (88992123 a 89000542)

A18: cromosoma 4 (111275976 a 111284450)

B5: cromosoma 1 (143034684 a 143043084)

C14: cromosoma 11 (46089056 a 46097482)

(Ejemplo 7)

Efecto del elemento de ADN utilizando la expresión de la fosfatasa alcalina secretora (SEAP) como índice (7-1) Construcción del vector de expresión SEAP

Mediante la utilización del control pSEAP2 (Clontech) como un molde, se amplificó el gen SEAP mediante el procedimiento de PCR (94 °C durante 30 segundos y 68 °C durante 2 min x 40 ciclos) utilizando los siguientes cebadores y KOD -Plus- (TOYOBO).

5'-AAAGCTAGCATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGGCC-3'

5'-AAAAGATCTTCATGTCTGCTCGAAGCGGCCGGCCGC-3'

Posteriormente, se separó el fragmento SEAP amplificado mediante electroforesis en gel de agarosa y se cortó del gel, seguido de purificación utilizando un kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen). El fragmento de ADN así obtenido se utilizó como un inserto. Se digirió el inserto con las enzimas de restricción Nhel y Bglll y se digirió un vector plRES hyg3 (Clontech) con las enzimas de restricción Nhel y BamHl. Los fragmentos de ADN resultantes se sometieron a electroforesis en gel de agarosa para separar los fragmentos diana, respectivamente, y se cortaron los fragmentos diana del gel, seguido de purificación. Después, se realizó una reacción de ligadura y transformación. La reacción de ligadura se realizó utilizando el sistema de ligadura de ADN rápido LigaFast (Promega). La transformación se realizó del siguiente modo. En primer lugar, se descongelaron células JM109 competentes congeladas (TAKARA), se añadieron 10 pl de una solución obtenida después de la reacción de ligadura a una solución de las células descongeladas y la mezcla resultante se dejó en reposo en hielo durante 30 minutos. A continuación, se aplicó un choque térmico a la mezcla (42 °C, 45 segundos) y la mezcla se enfrió en hielo durante 5 minutos. A esta suspensión celular, se le añadió 1 ml de medio LB y la mezcla resultante se agitó a 37 °C durante 1 hora. Después, la mezcla se colocó en una placa LB que contenía 0,1 mg/ml de ampicilina y la placa se incubó a 37 °C durante 14 a 16 horas. A continuación, mediante lisis alcalina, se recogió un plásmido diana de colonias cultivadas en la placa LB. Finalmente, se determinó la secuencia polinucleotídica de SEAP en el plásmido obtenido mediante lisis alcalina, con lo que se construyó pCMV/SEAP ires Hygro.

(7-2) Clonación de elemento de ADN

Posteriormente, cada uno de los elementos de ADN extraídos en el ejemplo 6 se clonó a partir de un cromosoma artificial bacteriano (BAC) que contenía una secuencia polinucleotídica que corresponde al elemento de ADN en el vector de expresión de sEaP obtenido en (7-1) utilizando un kit BAC SUBCLONInG (Gene Bridges).

En primer lugar, se digirió pCMV/SEAP ires Hygro obtenido en (7-1) con la enzima de restricción Spel durante varias horas, seguido de precipitación con etanol y el precipitado se disolvió en agua estéril. Mediante la utilización del vector digerido con Spel como un molde, se realizó el procedimiento de PCR (94 °C durante 15 segundos, 55 °C durante 30 segundos y 68 °C durante 10 minutos x 30 ciclos) utilizando los siguientes cebadores y KOD -Plus- (TOYOBO).

A2D:

5'-GGAAATTGAGAAGTATCATTCACAACAGTACCACAAACATGAAATAAATGTGGAT

CCTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A2R:

5'-CTCATTCTGTGGGTTGTCATTTCACTTCCTTGATGCTATCCTTTCAAGCAAAATC CTAGTCAATAATCAATGTCAACG-3'

5

10

15

A7D:

5'-CTTATTTTCTAAGTAGTATAGACTTAATTGTGAGAACAAAATAAAAACTTGGATC

CTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A7R:

5'-CTCTTCCCATTCTCATTTGAATCTACTTCAAAAGGTTTACCATACTAAGACCTAG

TCAATAATCAATGTCAACG-3'

A18D:

5'-CGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCTGAGGCGGGTGGATCACCTGAGGTCGA

TCCTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A18R:

5' -CATACAGAAGCCAGTTTGAACTGAGACCTCACTCCATTTCTTACAAGTTATGCCC

TAGTCAATAATCAATGTCAACG-3'

B5D:

5'-ACCGTTTTATATTGTTTAAGCATTTCCTAGACATATTTGGCTACAAATCTAGATC

CTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

B5R:

5'-GATCTTAGGGGGGCTGATTATATAAAACAATAGAAATGTAGTCTTAGATGAAACC

TAGTCAATAATCAATGTCAACG-3'

C14D:

5'-CACAAAGTTCACTGTCAAGGCCAGGTGATGAGGCCCACACATGCCCGGACCTTGA

TCCTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

C14R:

5'-CAAAACCTCATCTCTACTGAAAATAGAAAATTAGCTGGGCGTGGTGGCAGGTGCC CTAGTCAATAATCAATGTCAACG-3'

Después de que la amplificación se confirmara mediante electroforesis en gel de agarosa utilizando una porción de la solución de reacción, el resto de la solución de reacción se sometió a precipitación con etanol. El precipitado se disolvió en agua estéril y la solución resultante se utilizó como ADN para transformación.

20 Posteriormente, se realizó una preparación de Escherichia coli para transformación.

Los clones de BAC correspondientes a las 5 secuencias extraídas en el Ejemplo 6 son los siguientes.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

[Tabla 11

Secuencia extraída: Clon de BAC correspondiente

A2: RP11-152F13

A7: RP11-643G5

A18: RP11-115A14

B5: RP11-640M9

C14: RP11-702F3

Se inocularon 10 |jl del clon BAC mencionado anteriormente (Advanced GenoTechs Co.), que había sido descongelado, en 1 ml de un medio (que contenía cloranfenicol a una concentración final de 15 jg/ml) y se incubó durante la noche a 37 °C. Se transfirieron 30 jl de la solución de cultivo a 1,4 ml de un medio (que contenía cloranfenicol a una concentración final de 15 jg/ml) y se incubó a 37 °C durante 2 horas. Se repitieron centrifugación y lavado con agua estéril dos veces y se suspendieron las células en 20 jl de agua estéril. A una cubeta enfriada (0,1 cm), se le añadieron 1 jl de pRED/ET (Gene Bridges) y Escherichia coli, seguido de electroporación (1350 V, 10 jF). Después, a esto se le añadió 1 ml de medio SOC, y la mezcla resultante se incubó a 30 °C durante 70 minutos. 100 jl de la solución de cultivo se colocaron en una placa LB (que contenía tetraciclina y cloranfenicol a concentraciones finales de 3 jg/ml y 15 jg/ml, respectivamente) y se incubaron durante la noche a 30 °C. Al día siguiente, cada colonia así obtenida se inoculó en 1 ml de un medio (que contenía tetraciclina y cloranfenicol a concentraciones finales de 3 jg/ml y 15 jg/ml, respectivamente) y se incubó durante la noche a 30 °C. Se transfirieron 30 jl de la solución de cultivo a 1,4 ml de un medio (que contenía tetraciclina y cloranfenicol a concentraciones finales de 3 jg/ml y 15 jg/ml, respectivamente) y se incubaron a 30 °C durante 2 horas. Después, a esto se le añadieron 50 jl de L-arabinosa al 10 % y se realizó incubación adicional a 37 °C durante 1 hora. A continuación, se repitió el lavado con agua estéril dos veces y se añadieron a una cubeta enfriada (0,1 cm) Escherichia coli, que estaba suspendida en 30 jl de agua estéril, y 1 jl del ADN para la transfección, seguido de electroporación (1350 V, 10 jF). Después, a esto se le añadió 1 ml de medio SOC, y la mezcla resultante se incubó a 37 °C durante 90 minutos. La cantidad total de la solución de cultivo se colocó en una placa LB (que contenía 100 jg/ml de ampicilina) y se incubó la placa. A continuación, se obtuvo un plásmido diana mediante lisis alcalina. Finalmente, se confirmaron la secuencia del plásmido obtenido y los sitios de la enzima de restricción del mismo, con lo que se construyó un plásmido diana (figura 4).

(7-3) Evaluación utilizando la expresión de SEAP como índice

Cada plásmido construido en (7-2) se evaluó utilizando la célula huésped CHO-K1 (ATCC) y el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

Se realizó una selección con antibióticos con higromicina a 800 jg/ml durante aproximadamente 2 semanas empezando 2 días después de la transfección, con lo que se estabilizó una línea celular policlonal que expresaba de manera estable. La línea celular así establecida se sometió a reemplazo de medio el día antes de la medición, y se sembraron un número dado de células en una placa de 24 pocillos (IWAKI). A las 24 horas del cultivo en placas de las células, se recogió el sobrenadante del cultivo y se midió la actividad de SEAP. La actividad de SEAP en el sobrenadante del cultivo se midió utilizando un ensayo indicador de fosfatasa alcalina secretada pNPP SensoLyte™

(ANASPEC).

Los resultados de la medición se muestran en la figura 5. Cuando la actividad de SEAP en el control sin ningún elemento se normalizó a 1, la actividad de SEAP en el sobrenadante del cultivo de la línea celular CHO que expresaba de manera estable que tenía el elemento de ADN A2, A7, A18, B5 o C14 mostró un valor numérico cinco veces o más mayor que el del control. Según estos resultados, se confirmó que los 5 tipos de elementos de ADN mejoran espectacularmente la expresión de SEAP. En relación con esto, las secuencias de polinucleótidos de los anteriores 5 tipos de elementos de ADN se representan mediante las SEQ ID NOS: 10 a 14 en el listado de secuencias, respectivamente.

(Ejemplo 8) Generalidad del promotor a utilizar en combinación

El promotor del vector utilizado en la evaluación de los elementos de ADN en el ejemplo 7 es un promotor de CMV y, de ese modo, se estudió el uso de elementos de ADN en combinación con otros promotores generales.

(8-1) Construcción del vector de expresión SEAP utilizando promotores SV40 y EF-1a

Mediante la utilización del control pSEAP2 (Clontech) como un molde, se amplificó el gen SEAP mediante el procedimiento de PCR (94 °C durante 30 segundos y 68 °C durante 2 min x 40 ciclos) utilizando los cebadores descritos en (7-1) y KOD -Plus-. Se preparó el gen SEAp amplificado como un inserto de la misma forma que en (71). Se digirió el inserto con las enzimas de restricción Nhel y Bglll y se digirió un vector pIRES puro3 (Clontech) con

5

10

15

20

25

30

35

las enzimas de restricción Nhel y BamHl y se construyó pCMV/SEAP ires Puro de la misma forma que en (7-1).

Posteriormente, mediante la utilización de pEF1/V5-His A (Invitrogen) como un molde, se amplificó un promotor EF- 1a mediante el procedimiento de PCR (94 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 30 segundos y 68 °C durante 2 min x 30 ciclos) utilizando los siguientes cebadores y KOD -Plus-.

5'-AAAACTAGTCAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATGGACC-3'

5'-AAAGATATCCCTAGCCAGCTTGGGTGGTACCAAGC-3'

Mediante la utilización de pCMV/SEAP ires Puro construido anteriormente como un vector, se realizó la digestión con las enzimas de restricción Spel y EcoRV para el vector y el promotor, y se construyó pEF/SEAP ires Puro de acuerdo con el procedimiento descrito en (7-1).

De manera análoga, mediante la utilización de pcDNA3.1+ (Invitrogen) como un molde, se amplificó un promotor SV40 mediante el procedimiento de PCR (94 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 30 segundos y 68 °C durante 1 min x 30 ciclos) utilizando los siguientes cebadores y KOD -Plus-.

5'-AAAACTAGTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTG-3'

5'-AAAGATATCAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGGCCTC-3'

Mediante la utilización de pCMV/SEAP ires Puro construido anteriormente como un vector, se realizó la digestión con las enzimas de restricción Spel y EcoRV para el vector y el promotor y se construyó pSV40/SEAP ires Puro de acuerdo con el procedimiento descrito en (7-1).

(8-2) Clonación del elemento de ADN A2 o A7

Posteriormente, se realizó la clonación del elemento de ADN A2 o A7 utilizando los pEF/SEAP ires Puro y pSV40/SEAP ires Puro construidos en (8-1) como estructuras básicas.

En primer lugar, se digirieron pEF/SEAP ires Puro y pSV40/SEAP ires Puro con la enzima de restricción Spel durante varias horas, seguido de precipitación con etanol y el precipitado se disolvió en agua estéril. Mediante la utilización de los respectivos vectores digeridos con Spel como moldes, se preparó ADN para transfección mediante el procedimiento de PCR (94 °C durante 15 segundos, 55 °C durante 30 segundos y 68 °C durante 10 min x 30 ciclos) utilizando los siguientes cebadores y KOD -Plus-.

A2 (EF/D):

5'-GGAAATTGAGAAGTATCATTCACAACAGTACCACAAACATGAAATAAATGTGCTA

GTCAGAGAGGAATCTTTGCAGC-3'

A2 (SV40/D):

5'-GGAAATTGAGAAGTATCATTCACAACAGTACCACAAACATGAAATAAATGTGCTA

GTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAG-3'

A2 (EF y SV40/R):

5' -CTCATTCTGTGGGTTGTCATTTCACTTCCTTGATGCTATCCTTTCAAGCAAAATT

TTAAAACTTTATCCATCTTTGCA-3'

A7 (EF/D):

5'-CTTATTTTCTAAGTAGTATAGACTTAATTGTGAGAACAAAATAAAAACTTGCTAG

T CAGAGAGGAATC T T T GCAGC-3'

A7 (SV40/D):

5'-CTTATTTTCTAAGTAGTATAGACTTAATTGTGAGAACAAAATAAAAACTTGCTAG TCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAG-3'

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

A7 (EF y SV40/R):

5'-CTCTTCCCATTCTCATTTGAATCTACTTCAAAAGGTTTACCATACTAAGAACTAG TTTTAAAACTTTATCCATCTTTGCA-3'

Mediante la utilización del ADN así preparado para transfección y un BAC transfectado con pRed/ET, se clonó el elemento de ADN A2 o A7 en el vector descrito en (8-1). En relación con esto, se realizó el procedimiento de acuerdo con el procedimiento descrito en (7-2).

(8-3) Evaluación utilizando la expresión de SEAP como índice

Cada plásmido construido en (8-2) se evaluó utilizando la célula huésped CHO-K1 (ATCC) y el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

Se realizó selección de antibióticos con puromicina a 8 |jg/ml durante aproximadamente 2 semanas empezando 2 días después de la transfección, con lo que se estabilizó una línea celular policlonal que expresaba de manera estable. La línea celular así establecida se sometió a reemplazo de medio el día antes de la medición y se sembraron un número dado de células en una placa de 24 pocillos. A las 24 horas del cultivo en placas de las células, se recogió el sobrenadante del cultivo y se midió la actividad de SEAP. La actividad de SEAP en el sobrenadante del cultivo se midió utilizando el ensayo indicador de fosfatasa alcalina secretada pNPP SensoLyte™ (ANASPEC).

Los resultados de la medición se muestran en la figura 6. Cuando la actividad de SEAP en el control sin ningún elemento se normalizó a 1, el elemento de ADN A2 o A7 exhibió un efecto de mejora de la expresión de tal manera que la actividad de SEAP fue dos veces o más mayor en el caso del uso con el promotor EF-1a y cuatro veces o más mayor en el caso del uso con el promotor SV40 que la del control. Según estos resultados, se confirmó que estos elementos de ADN exhiben el efecto de mejorar la expresión del gen extraño cuando se utilizan en combinación con un promotor general.

(Ejemplo 9) Evaluación utilizando la expresión de anticuerpos como índice

(9-1) Construcción del vector de expresión de cadena ligera humano pEF6KCL

Mediante la utilización del plásmido pEF6/V5-HisB (Invitrogen) como un molde, un fragmento de ADN entre la posición 2174 (inmediatamente corriente abajo de BGHpA) y la posición 2958 (Smal) (un fragmento de ADN que contiene un origen f1 de replicación y un promotor SV40 y origen de replicación, denominado en lo sucesivo "fragmento A", viniendo representada la secuencia polinucleotídica del fragmento A por la SEQ ID NO: 15 en el listado de secuencias) se obtuvo mediante el procedimiento de PCR utilizando los siguientes cebadores y KOD - Plus-.

5-CCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGC-3'

5'-AAACCCGGGAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGG-3'

El fragmento A obtenido y un fragmento de ADN que contiene una secuencia de ADN que codifica una señal secretora de cadena k humana, una región constante de cadena k humana, y una señal de adición de poli(A) humana (en lo sucesivo en el presente documento denominado "fragmento B") se ligaron mediante PCR solapadas. Se digirió el fragmento de ADN así obtenido, en el que el fragmento A y el fragmento B se ligaron, con las enzimas de restricción Kpnl y Smal y el fragmento resultante se ligó al plásmido pEF6/V5-HisB (Invitrogen) que se digirió con las enzimas de restricción Kpnl y Smal, con lo que se construyó un vector de expresión de cadena ligera humano pEF6KCL que tenía una secuencia señal, un sitio de clonación, una región constante de cadena k humana y una secuencia señal de adición de poli(A) humana corriente abajo del promotor EF-1a.

Se ligó un fragmento de ADN, obtenido mediante la digestión del pEF6KCL preparado mediante el procedimiento mencionado anteriormente con las enzimas de restricción Kpnl y Smal, a pEF1/myc-HisB (Invitrogen) que se digirió con Kpnl y Smal, seguido de transformación, lisis alcalina y secuenciación, con lo que se construyó el plásmido pEF1KCL.

(9-2) Construcción del vector de expresión de cadena pesada humano pEF1FCCU

Un fragmento de ADN (la secuencia polinucleotídica de este fragmento de ADN se representa por la SEQ ID NO: 16 en el listado de secuencias) que comprende una secuencia de ADN que codifica una secuencia señal IgG1 humana y una secuencia de aminoácidos de región constante se digirió con las enzimas de restricción NheI y PmeI y el fragmento resultante se ligó al plásmido pEF1KCL que se digirió con NheI y PmeI, con lo que se construyó el vector de expresión de cadena pesada humano pEF1FCCU que tenía una secuencia señal, un sitio de clonación, una región constante de cadena pesada humana y un secuencia señal de adición de poli(A) humana corriente abajo del promotor EF-1a.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

(9-3) Construcción de un vector de expresión de gen X de anticuerpo humanizado único (Gen de anticuerpo humanizado X/pEF_LHN#)

Ligando el vector de expresión de cadena H o cadena L construidos en (9-1) o (9-2), se construyó un vector de expresión de anticuerpo único (pEF_LHN (que carece de una región variable)).

Se añadió un sitio de enzima de restricción Sall mediante el procedimiento de PCR a ambos extremos de la unidad de expresión de genes: uno cadena arriba del promotor y el otro cadena abajo del poli(A) de pEF1KCL. Se realizó, a continuación, electroforesis en gel de agarosa, corte de un fragmento de ADN deseado del gel y purificación del fragmento de ADN, con lo que se preparó un inserto. Mediante la digestión del vector pEF1FCCU construido en (9-2) con la enzima de restricción Sall, se linealizó el vector en el sitio Sall localizado cadena arriba de la unidad de expresión de genes. Después, se ligó el vector linealizado al inserto anterior, seguido de transformación, lisis alcalina y secuenciación, con lo que se construyó un vector de expresión de anticuerpo humanizado único (pEF_LHN (que carece de región variable)).

Posteriormente, se introdujeron los siguientes oligonucleótidos en un sitio Aatll del vector pEF_LHN (que carece de una región variable).

5'-CGCGGCCGCACTAGTGACGT-3'

5'-CACTAGTGCGGCCGCGACGT-3'

Se diluyeron los oligonucleótidos respectivos a 5 pmol y mediante la utilización de quinasa polinucleotídica T4 (TAKARA), se dejó que la reacción continuara a 37 °C durante 1 hora. Después, se añadió a ello tampón H 10x (TAKARA) y se realizó hibridación mediante una reacción a 96 °C durante 1 minuto y, a continuación, a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se ligaron estos oligonucleótidos y el vector pEF_LHN que se digirió con la enzima de restricción Aatll, seguido de transformación, lisis alcalina y secuenciación, con lo que se construyó pEF_LHN# (que carece de una región variable).

Mediante la integración de una región variable de gen X de anticuerpo humanizado en el vector universal construido anteriormente (pEF_LHN# (que carece de una región variable)), se completó la construcción de un vector de expresión del gen X de anticuerpo humanizado único (gen de anticuerpo humanizado X/pEF_LHN#).

En primer lugar, mediante la utilización de los siguientes cebadores y KOD -Plus-, se amplificó una región variable de cadena L del gen X de anticuerpo humanizado mediante el procedimiento de PCR (94 °C durante 15 segundos, 55 °C durante 30 segundos y 68 °C durante 1 min x 30 ciclos). Región variable de cadena L:

5'-AAACATATGGCGACATCCAGATGAC-3'

5'-AAACGTACGCTTGATCTCCACCTTGG-3'

El fragmento de región variable de cadena L amplificado y el vector universal (pEF_LHN# (que carece de una región variable)) se digirieron con las enzimas de restricción Ndel y BsiWi, seguido de electroforesis en gel de agarosa, corte de un fragmento deseado del gel, purificación, reacción de ligadura, transformación, lisis alcalina y secuenciación, con lo que se integró la región variable de cadena L en el vector. De la misma manera, mediante la utilización de los siguientes cebadores y KOD -Plus-, se amplificó una región variable de cadena H de gen X de anticuerpo humanizado mediante el procedimiento de PCR (94 °C durante 15 segundos, 55 °C durante 30 segundos y 68 °C durante 1 min x 30 ciclos).

Región variable de cadena H:

5'-AAAGCTGAGCCAGGTGCAGCTGCAGG-3'

5'-AAAGCTGAGCTCACGGTCACCAGGGTTC-3'

Se digirieron el fragmento de región variable de cadena H amplificado y el vector que tiene la región variable de cadena L insertada en el mismo con la enzima de restricción Blpl, seguido de electroforesis en gel de agarosa, corte de un fragmento deseado del gel, purificación, reacción de ligadura, transformación, lisis alcalina y secuenciación, con lo que se integró la región variable de cadena H en el vector y se construyó un vector de expresión de gen X de anticuerpo humanizado único (gen de anticuerpo humanizado X/pEF_LHN#).

(9-4) Construcción de un vector de expresión de gen X de anticuerpo humanizado único (gen de anticuerpo humanizado X/pCMV_LHN#)

Mediante la utilización del vector de expresión de gen X de anticuerpo humanizado único (gen de anticuerpo humanizado X/pEF_LHN#) construido en (9-3) como una estructura de vector básica, se construyó otro vector de expresión de gen X de anticuerpo humanizado único (gen de anticuerpo humanizado X/pCMV_LHN#) mediante reemplazo del promotor de acuerdo con el siguiente proceso.

Mediante la utilización de pIRES puro3 como un molde, se amplificó un fragmento de promotor de CMV mediante el procedimiento de PCR (94 °C durante 30 segundos y 68 °C durante 3 min x 40 ciclos) utilizando los siguientes cebadores y KOD -Plus-.

5

10

15

20

25

30

35

Cadena arriba de cadena H:

5'-CTTTTGCAAAAAGCTTCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCC-3'

5'-TTCATGGTGGCGCTAGCCCGCAGATATCGATCCGAGCTCGGTA-3'

Cadena arriba de cadena L:

5'-TGACGTCGACAAGCTTCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCC-3'

5'-CTGGATGTCGCCATATGCGCCGGAGATCCACAGCAGCAGGGAGATGAACACCTGG

GTCTGCAGCACCATGGTGGCGCTAGCCCGCAGATATCGATCCGAGCTCGGTA-3'

A la solución de reacción de PCR, se añadió la enzima de restricción Dpnl y se dejó que la reacción continuara a 37 °C durante 1 hora, seguida de purificación utilizando un kit MinElute reaction Cleanup (Qiagen), con el que se preparó una muestra para su uso en In-Fusion. Paralelamente, se digirió el gen de anticuerpo humanizado X/pEF_LHN# con las enzimas de restricción Hindlll, NheI, NdeI y FseI, seguido de electroforesis en gel de agarosa, con lo que se separaron dos fragmentos grandes entre los fragmentos resultantes. Cada uno de los fragmentos se cortó del gel y se extrajo el ADN del gel, con el que se preparó una muestra para su uso en In-Fusion. Todas las muestras para su uso en In-Fusion se colocaron juntas y se realizó la clonación utilizando un kit de clonación de la PCR In-Fusion™ Advantage (TAKARA), seguido de transformación, lisis alcalina y secuenciación, con lo que se construyó un vector de expresión de gen X de anticuerpo humanizado (gen de anticuerpo humanizado X/pCMV_LHN#).

(9-5) Clonación del elemento de ADN A7

Se seleccionó A7 a partir de los 5 tipos de elemento de ADN que, según se había confirmado, tenían el efecto de mejorar la expresión de SEAP y se clonaron en un vector de expresión de anticuerpo.

De la misma forma que en (7-2), mediante la utilización de cada uno de los vectores de expresión de gen X de anticuerpo humanizado único (gen de anticuerpo humanizado X/pEF_LHN# y gen de anticuerpo humanizado X/pCMV_LHN#) digeridos con la enzima de restricción Notl como un molde, se preparó ADN para transfección mediante el procedimiento de PCR (94 °C durante 15 segundos, 55 °C durante 30 segundos y 68 °C durante 11 min x 30 ciclos) utilizando los siguientes cebadores y KOD -Plus-.

Gen de anticuerpo humanizado X/pEF_LHN# D:

5'-CTCTTCCCATTCTCATTTGAATCTACTTCAAAAGGTTTACCATACTAAGACTCGA GGCACTAGTGACGTCAGGTGGCACT-3'

Gen de anticuerpo humanizado X/pEF_LHN# R:

5'-CTCTTCCCATTCTCATTTGAATCTACTTCAAAAGGTTTACCATACTAAGAGCACT

AGTGACGTCAGGTGGCACTTTTCGG-3'

Gen de anticuerpo humanizado X/pCMV_LHN# D:

Se utilizó gen de anticuerpo humanizado X/pEF_LHN# D.

Gen de anticuerpo humanizado X/pCMV_LHN# R:

Se utilizó gen de anticuerpo humanizado X/pEF_LHN# R.

Mediante la utilización del ADN preparado anteriormente para transfección y un BAC transfectado con pRed/ET, se clonó el elemento de ADN A7 en el vector de expresión de gen X de anticuerpo humanizado único descrito en (9-3) y (9-4). Una vista esquemática del vector de construcción se muestra en la Figura 7. En relación con esto, se realizó el procedimiento de acuerdo con el procedimiento descrito en (7-2).

(9-6) Evaluación utilizando la expresión de anticuerpo como índice

Cada plásmido construido en (9-5) se evaluó utilizando la célula huésped CHO-K1 (ATCC) y el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

Se realizó selección de antibióticos con Geneticin (Roche) a 800 pg/ml durante aproximadamente 2 semanas empezando 2 días después de la transfección, con lo que se estabilizó una línea celular policlonal que expresaba de

5

10

15

20

25

30

35

40

manera estable. La línea celular así establecida se sometió a reemplazo de medio el día antes de la medición y se sembraron un número dado de células en una placa de 24 pocillos. A las 24 horas del cultivo en placas de las células, se recogió el sobrenadante del cultivo y se midió el nivel de expresión del anticuerpo en el sobrenadante del cultivo mediante el procedimiento ELISA. En relación con esto, se realizó ELISA del siguiente modo. En una placa de 96 pocillos revestida con anticuerpo anti-cadena ligera kappa a 50 ng/pocillo, se añadió a cada pocillo l0o pl del sobrenadante del cultivo libre de células y se incubó la placa a 37 °C durante 1 hora. Posteriormente, se eliminó la muestra (sobrenadante de cultivo) y se lavó cada pocillo con 200 pl de PBS-Tween (0,05%). Después, se añadió a cada pocillo 100 pl de anti-IgG humana (Fc) marcada con HRP y se incubó la placa a 37 °C durante 1 hora más. A continuación, se eliminó el anticuerpo anti-IgG humana (Fc) marcado con HRP y se lavó cada pocillo con PBS- Tween (0,05%). Después, se desarrolló un color utilizando un kit POD Substrate ABTS (Nacalai) y se midió la absorbancia a una longitud de onda de medición de 405 nm. Para la dilución del anticuerpo anti-cadena ligera kappa, se utilizó el anticuerpo anti-IgG humana (Fc) y la muestra, PBS-Tween (0,05%). Mediante la utilización de IgG humana diluida en serie a 12 ng, 6 ng, 3 ng, 1,5 ng, 0,75 ng, 0,375 ng y 0,1875 ng como un patrón, se calculó la concentración de la muestra.

Los resultados se muestran en la figura 8. Se confirmó que la muestra que tiene el elemento de ADN A7 tiene un efecto mayor de mejora de la producción de anticuerpos en comparación con un control sin ningún elemento cuando se utilizaron el promotor EF-1a o el promotor de CMV en el vector de expresión de anticuerpos.

(Ejemplo 10) Longitud de secuencia que exhibe actividad de mejora de la expresión de genes extraños

(10-1) Clonación de elementos de ADN que tienen diferentes longitudes de secuencia

Basándose en la longitud de la secuencia utilizada en el ejemplo 7, se construyeron vectores que contienen cada uno de los elementos de ADN pero que tienen diferentes longitudes de secuencia.

Los detalles de los elementos de ADN que tienen diferentes longitudes de secuencia que se diseñaron según la longitud completa de cada uno de los elementos de ADN A2, A7, A18, B5 y C14 se muestran en las figuras 9, 11, 13, 15 y 17, respectivamente. Se digirió el pCMV/SEAP ires Hygro descrito en (7-1) con la enzima de restricción Spel durante varias horas, seguido de precipitación con etanol y el precipitado se disolvió en agua estéril. Mediante la utilización del vector digerido con Spel como un molde, se preparó ADN para transfección mediante el procedimiento de PCR (94 °C durante 15 segundos, 55 °C durante 30 segundos y 68 °C durante 10 min x 30 ciclos) utilizando los siguientes cebadores y KOD -Plus-. Mediante la utilización del ADN así preparado para transfección y el BAC correspondiente transfectado con pRed/ET, se clonó cada elemento de ADN que tiene una longitud de secuencia diferente en el pCMV/SEAP ires Hygro descrito en (7-1). En relación con esto, se realizó el procedimiento de acuerdo con el procedimiento descrito en (7-2).

A2-1D:

5'-CATGCACAGATTAGCCATTTAGTACTTACTAAATCAAACTCAATTTCTGAAGTCT

AGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A2-1R:

5'-CTCATTCTGTGGGTTGTCATTTCACTTCCTTGATGCTATCCTTTCAAGCAAAATT

CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3'

A2-2D:

5'-ACACTGGTCAAAGGGACAGGTCATTGTTATGCTGGCAATGCAGGCTGCTGAAAAC

TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A2-2R:

5'-ACTGTAGCTTCTTATTTTTTACCTGCAGTGCATTCCTGTAAAAGTAGTGTGGAGT CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3'

5

10

15

5'-C T GGAAAT T GAGAAGTAT CAT T CACAACAGTAC CACAAACAT GAAATAAAT GT GC

TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A2-3R:

5'-CCAAGCTTGTCCAACCGCGGCCTGCAGGCTGCATGCAGCCTGTGAAGGCTTTGAT

CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3'

A2-4D:

5'-TCAATCATTTATCAATTTTATCTTCAAAGTCCCTCACTTCAGGGAGATGATATAC

TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A2-4R:

5'-ATATATAAAAGTTCATGTATATATAAAATCATGCAATACACGGCCTTTTGTGACT

CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3'

A2-5D:

5'-CGCATAAAAGGAAAAGCATCCTTAAAATAAACACCATCAATGGCTCCTCGGTGGC

TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A2-5R:

se utilizó A2-4R.

A2-6D:

5'-GGGAGGCTACAGCTTGCCTCTCTAACCACTAAAAGGCATGACCCTCCTCAAAGCT

AGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A2-6R:

se utilizó A2-4R.

A2-7D:

5'-TCTGGCTTCCCTGGGCCACGCTGGAAGAAGAATTGTCTTGCGCCACACATAAAAC

TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A2-7R:

5'-AGCTGATTTTTACGTTAAATGTAACATGTAAAGAAATATATGTGTGTTTTTAGAT

CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3'

A2-8D:

5'-GTGAAGAGGAGGAGATGTCAAAATTCAAAGTCTTAAATGATGTAGTTTTAAGTAC TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

5

10

15

20

25

30

5'-ATGACACTTGATATTGTTGTTTATATTGCTGGTTAGTATGTGCCTTCATTTACCT

CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3'

A2-9D:

se utilizó A2-6D.

A2-9R:

se utilizó A2R.

A2-10D:

se utilizó A2-2D.

A2-10R:

se utilizó A2-7R.

A2-11D:

se utilizó A2-8D.

A2-11R:

se utilizó A2-2R.

A2-12D:

se utilizó A2-2D.

A2-12R:

se utilizó A2-4R.

A2-13D:

se utilizó A2-8D.

A2-13R:

se utilizó A2-7R.

A2-14D:

se utilizó A2D.

A2-14R:

se utilizó A2-2R.

A2-15D:

se utilizó A2-2D.

A2-15R:

se utilizó A2R.

A2-16D:

se utilizó A2-8D.

A2-16R:

5

10

15

20

se utilizó A2D.

A2-17R:

se utilizó A2-7R.

A7-1D:

5'-AAAAACAAAACTGGAGTAAACAAGATGAATTGTTTTAATAGAGGCACTGTATTAC

TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A7-1R:

5'-ATACAATGTTCCATGTATTCTGTGCCTGAACCTATGCAGCTGATGTAGCTGAAGT

CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3 '

A7-2D:

5' -GATCTTATTTTCTAAGTAGTATAGACTTAATTGTGAGAACAAAATAAAAACTTGC

TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A7-2R:

5'-TGTTGTTTTCAGCCACTAAGTTTGAGGTGATTTGTTCTGGCAGTCCTAGGAAACT

CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3'

A7-3D:

se utilizó A7-2D.

A7-3R:

5'-AGCCTACACTACCCTTTGCAGCCTTTGGTAACTATCCTTCTGCTGTCTACCTCCT

CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3'

A7-4D:

5'-AGGAGCTCCTGAATGAAGGACATCACTCAGCTGTGTTAAGTATCTGGAACAATAC

TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A7-4R:

5'-GACATAAAATGTAAGATATGATATGCTATGTAAGATATGATACCTGCCTTAAAAT

CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3'

A7-5D:

5'-CACTGCTTGATACTTACTGTGGACTTTGAAAATTATGAATGTGTGTGTGTGTGTC TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

5

10

15

20

25

5'-CAATTACATTCCAGTGATCTGCTACTTAGAATGCATGACTGAACTCCTGGGTGGT

CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3'

A7-6D:

5'-TTATTTTGAAGAGAAACTCCTGGTTCCCACTTAAAATCCTTTCTTGTTTCCAAGC

TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A7-6R:

5'-AAGCAGTGTGTGTTTACCTGCATGTGTATGTGAATTAACTCTGTTCCTGAGGCAT

CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3'

A7-7D:

5'-ATTGCATGTTCTCATTTATTTGTGGGATGTAAAAATCAAAACAATAGAACGTATC

TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A7-7R:

5'-TTGGGAGGCCGCAGCTGGTAGATCACTTGAGGCCACGAATTTGACACCAGCAGGT

CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3'

A7-8D:

se utilizó A7-1D.

A7-8R:

se utilizó A7R.

A7-9D:

se utilizó A7-7D.

A7-9R:

se utilizó A7-5R.

A7-10D:

se utilizó A7-4D.

A7-10R:

se utilizó A7-7R.

A7-11D:

se utilizó A7-6D.

A7-11R:

se utilizó A7-4R.

A7-12D:

5

10

15

20

25

30

A7-12R:

A7-13D:

se utilizó A7-7D.

A7-13R:

se utilizó A7R.

A7-14D:

se utilizó A7-4D.

A7-14R:

se utilizó A7-5R.

A7-15D:

se utilizó A7-6D.

A7-15R:

se utilizó A7-7R.

A7-16D:

se utilizó A7-2D.

A7-16R:

se utilizó A7-4R.

A7-17D:

se utilizó A7-4D.

A7-17R:

se utilizó A7R.

A7-18D:

se utilizó A7-6D.

A7-18R

se utilizó A7-5R.

A18-1:

5'-ATCCCCTGCTCTGCTAAAAAAGAATGGATGTTGACTCTCAGGCCCTAGTTCTTGA

TCCTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A18-1R:

se utilizó A18R.

A18-2D:

5'-CTAAAGTGCTGGGATTACAGGCATAAGCCACCGTGCCCGGCTGGAGCATTGGGAT CCTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

5

10

15

20

5'-ACTACTTACACATTTCGAGTTTTAAATAAGGCGTTCAATATAGAGTGAACACCTA

GTCAATAATCAATGTCAACG-3'

A18-3D:

5'-CAGGCATAAGCCACCGCACCCGGCCACCCCTTACTAATTTTTAGTAACGTCGATC

CTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A18-3R:

5'-CTGATTGACTTTGACCTCTGCTTTCCAACTTTGCCCCAAAGAAAGTTAGTCACCT

AGTCAATAATCAATGTCAACG-3'

A18-4D:

se utilizó A18-3D.

A18-4R:

5'-TTCAATGAAACAAGCTCTGTGAGGCTCATTTGTACCCATTTTGTTCAGTACTGCC TAGTCAATAATCAATGTCAACG-3'

B5-1D:

-ACATACCCAGAGACACTGAGAGAGACAGACAGACAGTAAACAGAGGAGCACGATC

CTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

B5-1R:

se utilizó B5R.

B5-2D:

5'-GCTCAATTGTATCTTATGAAAACAATTTTTCAAAATAAAACAAGAGATATGATCC

TATTAATAGTAATCAATTACG-3'

B5-2R:

se utilizó B5R.

B5-3D:

5'-CCTGTGCTGAATACCGTCTGCATATGTATAGGAAAGGGTTAACTCAGCAGGGATC

CTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

B5-3R:

5'-TATGTGAATGGAAATAAAATAATCAAGCTTGTTAGAATTGTGTTCATAATGACCC

TAGTCAATAATCAATGTCAACG-3'

B5-4D:

5

10

15

20

5'-GAAAGTCTACAATTTTTTCAGTTTAAAATGGTATTTATTTGTAACATGTACCCTA

GTCAATAATCAATGTCAACG-3'

B5-5D:

se utilizó B5-1D.

B5-5R:

5'-CAAAGATGAAGGATGAGAGTGACTTCTGCCTTCATTATGTTATGTGTTCATATCC

TAGTCAATAATCAATGTCAACG-3'

B5-6D:

5'-CAGTGAATTATTCACTTTGTCTTAGTTAAGTAAAAATAAAATCTGACTGTGATCC

TATTAATAGTAATCAATTACG-3'

B5-6R:

5'-GAACAGACAGGTGAATGAGCACAGAGGTCATTTGTAAACCGTTTGTGGTTAGCCT

AGTCAATAATCAATGTCAACG-3'

C14-1D:

5'-CTTTTTGGCTTCTGTGTTTAAGTTATTTTTCCCCTAGGCCCACAAACAGAGTCGA

TCCTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

C14-1R:

5'-AACCTTGGAAAAATTCTGTTGTGTTTAGAAGCATGTACCAATCTATCACTCCTAG

TCAATAATCAATGTCAACG-3'

C14-2D:

5'-CTATTCACTGTCTGTAGGATGAAAAAGTTAATAACACCCTGAGAGGTTTCGATCC

TATTAATAGTAATCAATTACG-3'

C14-2R:

5'-CCTTAGATTAGTTTATTGTATTTTTTATCAGCTACTATAAGGTTTACACACCCTA

GTCAATAATCAATGTCAACG-3'

C14-3D:

-CAAGACCCTCAAAATTCAAAAATTTCCTTTATCTTGCTGTAGCACCTCCTGCGAT

CCTATTAATAGTAATCAATTACG-3;

5

10

15

20

25

5'-GGAGGGGATAGGAAGGGGATGAGGCCTAACAGGTTGATGATCTAGGCTTTACCTA

GTCAATAATCAATGTCAACG-3'

C14-4D:

5'-CTCAAAAAGGAGATAATTCCAGCCCCTCGCCTTAAAGAATCCCTATCAAGTGATC

CTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

C14-4R:

se utilizó C14-1R.

C14-5D:

5'-CGCTTGAACCTGGGAGGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCGTTGGATCC

TATTAATAGTAATCAATTACG-3'

C14-5R:

se utilizó C14-1R.

C14-6D:

se utilizó C14-4D.

C14-6R:

5'-TTAACTTTTTCATCCTACAGACAGTGAATAGTAAAGCTTTCTGTGAAGACATACC

CTAGTCAATAATCAATGTCAACG-3'

C14-7D:

se utilizó C14-2D.

C14-7R:

se utilizó C14-1R.

C14-8D:

se utilizó C14-3D.

C14-8R:

5'-AAATTATTTCCTGGTGGGCAATATTAGAATATGGGGAATGTTTGCTTCTGAGCCT

AGTCAATAATCAATGTCAACG-3'

C14-9D:

se utilizó C14-4D.

C14-9R:

se utilizó C14-3R.

C14-10D:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

C14-10R:

C14-11D:

se utilizó C14-3D.

C14-11R:

se utilizó C14-2R.

C14-12D:

se utilizó C14-4D.

C14-12R:

se utilizó C14-8R.

C14-13D:

se utilizó C14-3D.

C14-13R:

se utilizó C14-1R.

C14-14D:

se utilizó C14-4D.

C14-14R:

se utilizó C14-2R.

En cuanto a las secuencias de polinucleótidos de los respectivos fragmentos de A2, A2-1 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 1 a 3000 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-2 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 2801 a 5800 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-3 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 5401 a 8450 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-4 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 701 a 2700 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-5 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 701 a 2200 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-6 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 701 a 3700 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-7 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 2001 a 5000 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-8 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 4001 a 7000 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-9 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 1 a 3700 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-10 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 2001 a 5800 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-11 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 2801 a 7000 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-12 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 701 a 5800 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-13 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 2001 a 7000 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-14 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 2801 a 8450 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-15 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 1 a 5800 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-16 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 701 a 7000 de la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias; A2-17 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 2001 a 8450 de la SEQ ID NO: 10 en el listado de secuencias.

En cuanto a las secuencias de polinucleótidos de los respectivos fragmentos de A7, A7-1 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 601 a 3600 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; A7-2 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 3601 a 8420 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; A7-3 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 5401 a 8420 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; A7-4 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 3401 a 6400 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; A7-5 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 1501 a 4500 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; A7-6 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 4401 a 7400 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; A7-7 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 2401 a 5400 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; A7-8 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 1 a 3600 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; A7-9 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 1501 a 5400 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Secuencias; A7-10 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 2401 a 6400 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; A7-11 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 3401 a 7400 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; A7-12 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 4401 a 8420 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; A7-13 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 1 a 5400 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; A7-14 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 1501 a 6400 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; A7-15 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 2401 a 7400 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; A7-16 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 3401 a 8420 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; A7-17 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 1 a 6400 de la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias; y A7-18 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 1501 a 7400 de la SEQ ID NO: 11 en el listado de secuencias.

En cuanto a las secuencias de polinucleótidos de los respectivos fragmentos de C14, C14-1 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 960 a 4015 de la SEQ ID NO: 14 en el Listado de Secuencias; C14-2 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 1987 a 5014 de la SEQ ID NO: 14 en el Listado de Secuencias; C14-3 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 4020 a 7119 de la SEQ ID NO: 14 en el Listado de Secuencias; C14-4 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 960 a 8141 de la SEQ ID NO: 14 en el Listado de Secuencias; C14-5 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 960 a 6011 de la SEQ ID NO: 14 en el Listado de Secuencias; C14-6 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 4939 a 8141 de la SEQ ID NO: 14 en el Listado de Secuencias; C14-7 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 960 a 5014 de la SEQ ID NO: 14 en el Listado de Secuencias; C14-8 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 2994 a 7119 de la SEQ ID NO: 14 en el Listado de Secuencias; C14-9 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 4020 a 8141 de la SEQ ID NO: 14 en el Listado de Secuencias; C14-10 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 1 a 5014 de la SEQ ID NO: 14 en el Listado de Secuencias; C14-11 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 1987 a 7119 de la SEQ ID NO: 14 en el Listado de Secuencias; C14-12 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 2994 a 8141 de la SEQ ID NO: 14 en el Listado de Secuencias; C14-13 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 960 a 7119 de la SEQ ID NO: 14 en el Listado de Secuencias; y C14-14 corresponde a la secuencia polinucleotídica de los nucleótidos 1987 a 8141 de la SEQ ID NO: 14 en el listado de secuencias.

Los puntos de inicio y final de los respectivos fragmentos en la secuencia de longitud completa también se muestran en las figuras 20 y 21.

(10-2) Evaluación de elementos de ADN que tienen diferentes longitudes de secuencia

Se evaluó cada plásmido construido en (10-1) utilizando la célula huésped CHO-K1 (ATCC) y el reactivo de transfección Lipofectamine 2000.

De la misma forma que en (7-3), se realizó selección de antibióticos con higromicina después de la transfección, con lo que se estabilizó una línea celular policlonal que expresaba de manera estable. La línea celular así establecida se sometió a reemplazo de medio el día antes de la medición y se sembraron un número dado de células en una placa de 24 pocillos. A las 24 horas del cultivo en placas de las células, se recogió el sobrenadante del cultivo y se midió la actividad de SEAP.

Los resultados de la medición se muestran en las figuras 10, 12, 14, 16 y 18. Se confirmó que no solo los elementos de ADN de longitud completa, sino también clones que tienen una longitud de secuencia más corta que los de longitud completa, tienen en efecto en la mejora de expresión. Según estos resultados, se confirmó que los elementos de ADN A2, A7, A18, B5 y C14 tienen la actividad de mejorar la expresión de genes extraños incluso en los casos en los que tienen una longitud de secuencia más corta que los de longitud completa. Sin embargo, exhiben el mayor efecto cuando la longitud de secuencia es la longitud completa.

5

10

15

20

25

30

Se utilizó la línea celular CHO como la línea celular en la evaluación en los ejemplos 7 a 10. Sin embargo, en el Ejemplo 11, se seleccionó una línea celular HEK293 como una línea celular diferente de la línea celular CHO. La línea celular HEK293 se sometió a cultivo estático a 37 °C en presencia de CO2 al 5 % utilizando el medio DMEM (Invitrogen) que contiene FCS al 10 % y se sembraron un número dado de células en una placa de 6 pocillos el día antes de la transfección. Para evaluar el vector de expresión SEAP que contenía cada elemento de ADN construido en (8-2), se realizó transfección utilizando cada plásmido y el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Se realizó la selección de antibióticos con higromicina durante aproximadamente 2 semanas empezando 2 días después de la transfección, con lo que se estabilizó una línea celular policlonal que expresaba de manera estable. La línea celular así establecida se sometió a reemplazo de medio el día antes de la medición y se sembraron un número dado de células en una placa de 24 pocillos. A las 24 horas del cultivo en placas de las células, se recogió el sobrenadante del cultivo y se midió la actividad de SEAP. Se midió la actividad de SEAP en el sobrenadante del cultivo utilizando el ensayo indicador de fosfatasa alcalina pNPP SensoLyte™ (ANASPEC).

Los resultados de la medición se muestran en la figura 19. De la misma manera que en el ejemplo 3, se confirmó que cada elemento de ADN es también altamente efectivo en la mejora de la expresión de un gen extraño (SEAP) en la línea celular HEK293.

Aplicabilidad industrial

Mediante la introducción de la unidad de expresión de genes extraños utilizando un promotor de acuerdo con la invención o el vector de expresión de genes extraños de acuerdo con la invención, en células huésped de mamífero, se hace posible mejorar la producción de un gen extraño de una proteína terapéutica, un anticuerpo o similar.

Listado de secuencias

<110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED <120> Promotores de genes humanos <130> DSPCT-FP1232 <160> 16

<170> Versión 3.4 de PatentIn

<210> 1 <211> 2348 <212> ADN <213>Homo sapiens

<400> 1

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

1. Un polinucleótido promotor que comprende una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 1 en el listado de secuencias.
2. Una unidad de expresión de genes extraños que comprende el polinucleótido promotor de acuerdo con la reivindicación 1.
3. La unidad de expresión de genes extraños de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el gen extraño es un gen que codifica una proteína multimérica o una proteína heteromultimérica.
4. La unidad de expresión de genes extraños de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el gen extraño es un gen que codifica un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo.
5. Un vector de expresión de genes extraños que comprende la unidad de expresión de genes extraños de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.
6. Un vector de expresión de genes extraños que comprende la unidad de expresión de genes extraños de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, y uno o más polinucleótidos seleccionados a partir de los polinucleótidos descritos en (1) a (9) en el siguiente grupo A:

Grupo A

(1) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 10 en el Listado de Secuencias;

(2) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 11 en el Listado de Secuencias;

(3) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 12 en el Listado de Secuencias;

(4) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 13 en el Listado de Secuencias;

(5) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 14 en el Listado de Secuencias;

(6) un polinucleótido que comprende al menos 3000 nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos representada por una cualquiera de las SEQ ID NOS: 10 a 14 en el Listado de secuencias;

(7) un polinucleótido que comprende al menos 2000 nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos representada por una cualquiera de las SEQ ID NOS: 10 a 14 en el Listado de secuencias;

(8) un polinucleótido que comprende una secuencia polinucleotídica que tiene una identidad del 95 % o más con la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de acuerdo con uno cualquiera de los puntos anteriores (1) a (7) y que tiene la actividad de mejorar la expresión de genes extraños; y

(9) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad del 99 % o más con la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de acuerdo con uno cualquiera de los puntos anteriores (1) a (7) y que tiene la actividad de mejorar la expresión de genes extraños.
7. Una célula transformada en la que se ha introducido el vector de expresión de genes extraños de acuerdo con la reivindicación 5 o 6.
8. Una célula transformada en la que se han introducido el vector de expresión de genes extraños de acuerdo con la reivindicación 5 o 6 y un vector de elemento.
9. La célula transformada de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en la que la célula es una célula cultivada que procede de un mamífero.
10. La célula transformada de acuerdo con la reivindicación 9, en la que la célula es una célula COS-1, una célula 293 o una célula CHO.
11. Un procedimiento para producir una proteína caracterizado porque comprende cultivar la célula transformada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 y obtener una proteína que procede de un gen extraño a partir del producto de cultivo resultante.
12. Uso de la secuencia polinucleotídica promotora de acuerdo con cualquier reivindicación 1 para expresar un gen extraño en una célula transformada.
13. Uso de una secuencia polinucleotídica promotora que tiene una identidad del 95 % o más con la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 para expresar un gen extraño en una célula transformada.
14. Uso de una secuencia polinucleotídica promotora que tiene una identidad del 99% o más con la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 para expresar un gen extraño en una célula

transformada.
15. Uso del vector de expresión de genes extraños de acuerdo con la reivindicación 5 o 6 para expresar un gen extraño en una célula transformada.

imagen1

CMV

RPS7

RPL32

RPL34

imagen2

co

% de entrada

Inmunoprecipitación con cromatina

imagen3

11 GAPDH

imagen4

Elemento de ADN

imagen5

GDI: Gen de interés (SEAP)

8

o

c

CD

E

Z5

<

6

4 -

2

0

m

Ap

Promotor de CMV

Aumento

imagen6

Aumento

imagen7

"0

O

3

0

1 i

o

—I

co

<

O

imagen8

gen de resistencia promotor a neomicina

00

imagen9

Promotor EF-1a

00

en

ID

Localización Localización Longitud (pb)

A2

80966429 80974878 8450

A2-1

80966429 80969428 3000

A2-2

80969229 80972228 3000

A2-3

80971829 80974878 3050

A2-4

80967129 80969128 2000

A2-5

80967129 80968628 1500

A2-6

80967129 80970128 3000

A2-7

80968429 80971428 3000

A2-S

80970429 80973428 3000

A2-9

80966429 80970128 3700

A2-10

80968429 80972228 3800

A2-11

80969229 80973428 4200

A2-12

80967129 80972228 5100

A2-13

80968429 80973428 5000

A2-14

80969229 80974878 5650

A2-15

80966429 80972228 5800

A2-16

80967129 80973428 6300

A2-17

80968429 80974878 6450

Aumento

%

o o P P P ->■

imagen10

imagen11

[FIG. 10]

ID

Localización Localización Longitud (pb)

A7

88992123 89000542 8420

A7-1

88992723 88995722 3000

A7-2

88995723 89000542 4820

A7-3

88997523 89000542 3020

A7-4

88995523 88998522 3000

A7-5

88993623 88996622 3000

A7-6

88996523 88999522 3000

A7-7

88994523 88997522 3000

A7-8

88992123 88995722 3600

A7-9

88993623 88997522 3900

A7-10

88994523 88998522 4000

A7-11

88995523 88999522 4000

A7-12

88996523 89000542 4020

A7-13

88992123 88997522 5400

A7-14

88993623 88998522 4900

A7-15

88994523 88999522 5000

A7-16

88995523 89000542 5020

A7-17

88992123 88998522 6400

A7-18

88993623 88999522 5900

imagen12

imagen13

\

Aumento

imagen14

[FIG. 12]

00 co

imagen15

ID

Localización Localización Longitud (pb)

A18

111275976 111284450 8475

A18-1

111275976 111281015 5040

A18-2

111276976 111281977 5002

A18-3

111277976 111282975 5000

A18-4

111278975 111282975 4001

imagen16

[FIG. 15]

ID

Localización Localización Longitud (pb)

B5

143034684 143043084 8401

B5-1

143034684 143038684 4001

B5-2

143034684 143037883 3200

B5-3

143037174 143040284 3111

B5-4

143040056 143043084 3029

B5-5

143035584 143038684 3101

B5-6

143038684 143041683 3000

imagen17

imagen18

ID

Localización Localización Longitud (pb)

C14

46089056 46097482 8427

C14-1

46090015 46093070 3056

C14-2

46091042 46094069 3028

C14-3

46093075 46096174 3100

C14-4

46090015 46097196 7182

C14-5

46090015 46095066 5052

C14-6

46093994 46097196 3203

C14-7

46090015 46094069 4055

C14-8

46092049 46096174 4126

C14-9

46093075 46097196 4122

C14-10

46089056 46094069 5014

C14-11

46091042 46096174 5133

C14-12

46092049 46097196 5148

C14-13

46090015 46096174 6160

C14-14

46091042 46097196 6155

imagen19

imagen20

P

00

imagen21

imagen22

Punto de inicio Punto final

A2

1 8450

A2-1

1 3000

A2-2

2801 5800

A2-3

5401 8450

A2-4

701 2700

A2-5

701 2200

A2-6

701 3700

A2-7

2001 5000

A2-8

4001 7000

A2-9

1 3700

A2-10

2001 5800

A2-11

2801 7000

A2-12

701 5800

A2-13

2001 7000

A2-14

2801 8450

A2-15

1 5800

A2-16

701 7000

A2-17

2001 8450

Puntos de inicio y final basándose en A7

A7

Punto de inicio 1 Punto final 8420

A7-1

601 3600

A7-2

3601 8420

A7-3

5401 8420

A7-4

3401 6400

A7-5

1501 4500

A7-6

4401 7400

A7-7

2401 5400

A7-8

1 3600

A7-9

1501 5400

A7-10

2401 6400

A7-11

3401 7400

A7-12

4401 8420

A7-13

1 5400

A7-14

1501 6400

A7-15

2401 7400

A7-16

3401 8420

A7-17

1 6400

A7-18

1501 7400

Punto de inicio Punto final

A18

1 8475

A18-1

1 5040

A18-2

1001 6002

A18-3

2001 7000

A18-4

3000 7000

Punto de inicio Punto final

B5

1 8401

B5-1

1 4001

B5-2

1 3200

B5-3

2491 5601

B5-4

5373 8401

B5-5

901 4001

B5-6

4001 7000

C14

Punto de inicio 1 Punto final 8427

C14-1

960 4015

C14-2

1987 5014

C14-3

4020 7119

C14-4

960 8141

C14-5

960 6011

C14-6

4939 8141

C14-7

960 5014

C14-8

2994 7119

C14-9

4020 8141

C14-10

1 5014

C14-11

1987 7119

C14-12

2994 8141

C14-13

960 7119

C14-14

1987 8141