KR101931404B1

KR101931404B1 - 인간 유전자 유래 프로모터

Info

Publication number: KR101931404B1
Application number: KR1020147013459A
Authority: KR
Inventors: 겐지 무라카미
Original assignee: 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
Priority date: 2011-11-28
Filing date: 2012-11-27
Publication date: 2018-12-20
Also published as: TW201632624A; BR112014012682A2; IL232848A0; US20140342401A1; AU2012344855B2; SG11201402476XA; TW201329234A; EP2787080A1; TW201632625A; ES2670894T3; RU2014121383A; AU2012344855C1; WO2013080934A1; JP6025745B2; IN2014CN03882A; EP2787080A4; CA2857210A1; HK1199064A1; US9862969B2; AU2012344855A1

Abstract

본 발명은, 인간 유래 유전자 프로모터를 갖는 외래 유전자 발현 벡터를 사용함으로써, 외래 단백질 분비능이 증강된 포유 동물 형질 전환 숙주 세포, 및 이를 사용한 그 외래 단백질의 제조 방법에 관한 것이다. 포유 동물 배양 세포 등의 숙주 세포에 있어서, 단백질성 의약품이 되는 외래 단백질의 산생을 항진시키는 수단을 제공한다. 포유 동물 배양 세포 등의 숙주 세포에 있어서, 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 프로모터보다 강한 프로모터 활성을 갖는 인간 유래 유전자 프로모터를 제공한다.

Description

인간 유전자 유래 프로모터{PROMOTER DERIVED FROM HUMAN GENE}

본 발명은, 인간 유전자 유래 프로모터를 갖는 외래 유전자 발현 벡터를 사용함으로써, 외래 단백질의 전사 활성이 증강된 포유 동물 형질 전환 숙주 세포, 및 이를 사용한 그 외래 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.

유전자 재조합 기술의 발전에 의해, 치료용 단백질이나 항체 의약과 같은 단백질성 의약품이 급속히 그 시장을 확대하고 있다. 그 중에서도, 항체 의약은 인체에 투여해도 유해한 면역 반응을 일으키지 않아, 그 특이성의 높음으로부터 개발이 활발히 진행되고 있다.

항체 의약으로 대표되는 단백질성 의약을 생산시키는 숙주로서는, 미생물이나 효모, 곤충, 동식물 세포, 트랜스제닉 동식물 등을 들 수 있다. 단백질성 의약의 생리 활성이나 항원성에는, 폴딩이나 당사슬 수식과 같은 번역 후 수식이 필수이기 때문에, 복잡한 번역 후 수식을 실시할 수 없는 미생물이나 당사슬 구조가 상이한 식물은 숙주로서 부적합하다. 인간과 유사한 당사슬 구조를 가지며, 번역 후 수식이 가능, 나아가서는 안전성의 면을 고려하여, 인간과 근연 생물인 CHO 세포 (Chinese Hamster Ovary ： 차이니즈 햄스터의 난소) 등의 포유 동물 배양 세포가 현재의 주류가 되고 있다.

포유 동물 배양 세포를 숙주로 하는 경우, 미생물 등과 비교해서, 증식 속도의 낮음, 생산성의 낮음, 고가의 비용 등의 문제를 안고 있다 (비특허문헌 1). 또, 단백질성 의약품을 임상으로 이용하기 위해서는 대량의 투여가 필요해지기 때문에, 세계적으로도 그 생산 능력의 부족이 문제가 되고 있다. 포유류 배양 세포 발현계에서 단백질성 의약품을 제조하는 경우, 합성 저분자 의약품에 비해 제조 비용이 높기 때문에, 각 제조 공정의 개량에 의해 제조 비용의 저감이 도모되고 있지만, 포유류 배양 세포 발현계에 있어서의 생산량의 향상도 제조 비용 저감의 유력한 방법이다 (비특허문헌 2, 3). 그래서, 포유 동물 배양 세포에 있어서의 외래 유전자의 생산성을 향상시키기 위해서, 지금까지, 프로모터나 엔핸서, 약제 선택 마커, 유전자 증폭, 배양 공학적 수법 등 많은 어프로치가 시행 착오되어 오고 있다. CHO 세포를 숙주 세포로서 사용하는 경우, 외래 유전자의 발현, 즉 단백질성 의약품의 생산에는 바이러스 유래의 Human cytomegalovirus major immediate early promoter (이하 CMV 프로모터) 가 일반적으로 이용되고 있다 (비특허문헌 4, 5, 6). 또, CHO 세포에 있어서, 인간 리보솜 단백질 유전자인 RPL32 나 RPS11 의 전사 개시점의 상류역의 폴리뉴클레오티드를 DNA 엘리먼트로서 사용하고, 다른 이종 프로모터와 조합하여 단백질 발현에 사용할 수 있는 것이 알려져 있다 (비특허문헌 7, 특허문헌 1)

WO2006/123097

Florian M. Wurm., Nat. Biotechnol. 22(11) ： 1393－1398, 2004 Farid SS., J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 848 (1) ： 8－18, 2007 Werner RG. Economic aspects of commercial manufacture of biopharmaceuticals. J Biotechnol. 113 (1－3) ： 171－182, 2004 Durocher Y et al., Curr Opin Biotechnol. 20 (6) ： 700－707, 2009 Boshart M et al., Cell. 41 (2) ： 521－530, 1985 Foecking MK et al., Gene. 45 (1) ： 101－105, 1986 Hoeksema F. et al., Biotechnology Research International, Volume 2011, Article ID 492875, 11 pages

본 발명의 과제는, 포유 동물 배양 세포 등의 숙주 세포에 있어서, 높은 외래 유전자 발현 항진 활성을 갖는 프로모터를 사용하여, 단백질성 의약품이 되는 외래 단백질의 산생을 항진시키는 수단을 제공하는 것에 있다. CHO 세포 등에 있어서 CMV 프로모터와 동등 이상의 프로모터 활성을 갖는 프로모터를 찾아냄으로써, 포유 동물 세포가 안정적으로 외래 유전자의 고발현을 달성하는 수단을 제공하고, 포유류 배양 세포 발현계에 있어서의 단백질성 의약품의 생산량의 향상, 즉 제조 비용 저감에 공헌하는 수단을 제공할 수 있다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, 인간 리보솜 단백 유전자의 전사 개시점의 상류 약 2 kbp 의 뉴클레오티드로부터 개시 코돈에 대응하는 뉴클레오티드 배열 직전의 뉴클레오티드까지의 폴리뉴클레오티드가 우수한 프로모터 활성을 가지며, 포유 동물 배양 세포에 있어서 발현 대상이 되는 외래 단백질의 생산성을 현저하게 향상시키는 것이 가능한 것을 알아내어, 본 발명을 완성시켰다. 즉, 본 발명은 이하의 발명을 포함한다.

(1) 서열목록의 배열 번호 1 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.

(2) 서열목록의 배열 번호 2 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.

(3) 서열목록의 배열 번호 3 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.

(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 한 항에 기재된 뉴클레오티드 배열에 대해 95 ％ 이상 동일성을 갖는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드로서, 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드.

(5) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 한 항에 기재된 뉴클레오티드 배열에 대해 99 ％ 이상 동일성을 갖는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드로서, 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드.

(6) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 한 항에 기재된 뉴클레오티드 배열에 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드로서, 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드.

(7) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 이루어지는 외래 유전자 발현 유닛.

(8) 외래 유전자가 다량체 단백질을 코드하는 유전자인 상기 (7) 에 기재된 외래 유전자 발현 유닛.

(9) 외래 유전자가 헤테로 다량체 단백질을 코드하는 유전자인 상기 (7) 에 기재된 외래 유전자 발현 유닛.

(10) 외래 유전자가 항체 또는 그 기능성 단편을 코드하는 유전자인 상기 (7) 에 기재된 외래 유전자 발현 유닛.

(11) 상기 (7) 내지 (10) 중 어느 한 항에 기재된 외래 유전자 발현 유닛을 포함하는 외래 유전자 발현 벡터.

(12) 상기 (7) 내지 (10) 중 어느 한 항에 기재된 외래 유전자 발현 유닛 및 하기 A 군의 (a) 내지 (i) 에 기재된 폴리뉴클레오티드에서 선택되는 어느 1 개 또는 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 외래 유전자 발현 벡터.

A 군

(a) 서열목록의 배열 번호 10 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.

(b) 서열목록의 배열 번호 11 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.

(c) 서열목록의 배열 번호 12 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.

(d) 서열목록의 배열 번호 13 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.

(e) 서열목록의 배열 번호 14 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.

(f) 서열목록의 배열 번호 10 내지 14 중 어느 한 항에 기재된 뉴클레오티드 배열 중 적어도 3000 이 연속되는 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.

(g) 서열목록의 배열 번호 10 내지 14 중 어느 한 항에 기재된 뉴클레오티드 배열 중 적어도 2000 이 연속되는 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.

(h) 상기 (a) 내지 (g) 중 어느 한 항에 기재된 뉴클레오티드 배열에 대해 95 ％ 이상 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드로서, 외래 유전자 발현 항진 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드.

(i) 상기 (a) 내지 (g) 중 어느 한 항에 기재된 뉴클레오티드 배열에 대해 99 ％ 이상 동일성을 갖는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드로서, 외래 유전자 발현 항진 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드.

(13) 상기 (11) 또는 (12) 에 기재된 외래 유전자 발현 벡터가 도입된 형질 전환 세포.

(14) 상기 (11) 또는 (12) 에 기재된 외래 유전자 발현 벡터와 엘리먼트 벡터가 도입된 형질 전환 세포.

(15) 세포가 포유 동물 유래의 배양 세포인 상기 (13) 또는 (14) 에 기재된 형질 전환 세포.

(16) 포유 동물 유래의 배양 세포가 COS－1 세포, 293 세포, 또는 CHO 세포인 상기 (15) 에 기재된 형질 전환 세포.

(17) 상기 (13) 내지 (16) 중 어느 한 항에 기재된 형질 전환 세포를 배양하여, 배양물로부터 외래 유전자 유래의 단백질을 취득하는 것을 특징으로 하는 그 단백질의 제조 방법.

(18) 형질 전환 세포에 있어서 외래 유전자를 발현시키는 것을 목적으로 하는 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 배열의 사용.

(19) 형질 전환 세포에 있어서 외래 유전자를 발현시키는 것을 목적으로 하는 상기 (11) 또는 (12) 에 기재된 외래 유전자 발현 벡터의 사용.

본 발명의 인간 유전자 유래의 프로모터를 사용한 외래 유전자 발현 벡터를 포유 동물 숙주 세포에 도입함으로써, 치료용 단백질이나 항체 등의 외래 유전자의 발현을 현저하게 항진하는 것이 가능하게 된다. 또, 본 발명의 프로모터는, DNA 엘리먼트와 조합함으로써, 치료용 단백질이나 항체 등의 외래 유전자의 발현을 더욱 항진하는 것이 가능하게 된다

도 1 은 CHO－K1 폴리클로날 형질 전환 세포에 있어서의 SEAP 활성을 지표로 한 프로모터 활성의 평가. CMV 프로모터의 값을 1 로 하여 각 프로모터의 SEAP 활성을 나타냈다. 2 회의 독립된 실험 결과를 나타낸다. (n = 3, 평균 ± SD)
도 2 는 CHO－K1 폴리클로날 형질 전환 세포에 있어서의 SEAP 활성을 지표로 한 트런케이트형 프로모터 활성의 평가. CMV 프로모터의 값을 1 로 하여 각 프로모터의 활성을 나타냈다. (n = 3, 평균 ± SD)
도 3 은 ChIP on chip 을 실시한 샘플이 항아세틸화 히스톤 H3 항체 특이적으로 ChIP 된 것을 GAPDH 영역의 증폭에 의해 확인한 도면.
도 4 는 DNA 엘리먼트가 삽입된 SEAP 발현 벡터의 개략도.
도 5 는, CHO 형질 전환 세포주를 사용하여, DNA 엘리먼트 A2, A7, A18, B5, C14 의 발현 항진 효과에 대해, CMV 프로모터에 의해 발현된 SEAP 활성을 지표로 확인한 도면.
도 6 은, CHO 형질 전환 세포주를 사용하여, DNA 엘리먼트 A2, A7 의 발현 항진 효과에 대해, EF－1α 또는 SV40 프로모터에 의해 발현된 SEAP 활성을 지표로 확인한 도면.
도 7 은 DNA 엘리먼트가 삽입된 항체 발현 (항체 유전자 X 중사슬, 경사슬 공발현) 벡터의 개략도.
도 8 은, CHO 형질 전환 세포주를 사용하여, DNA 엘리먼트 A7 의 발현 항진 효과에 대해, CMV 또는 EF－1α 프로모터에 의해 발현된 항체 생산량을 지표로 ELISA 법에 의해 확인한 도면.
도 9 는 DNA 엘리먼트 A2 및 관련 배열의 배열 길이.
도 10 은, CHO 형질 전환 세포주를 사용하여, DNA 엘리먼트 A2 및 관련 배열의 발현 항진 효과에 대해, SEAP 활성을 지표로 확인한 도면.
도 11 은 DNA 엘리먼트 A7 및 관련 배열의 배열 길이.
도 12 는, CHO 형질 전환주를 사용하여, DNA 엘리먼트 A7 및 관련 배열의 발현 항진 효과에 대해, SEAP 활성을 지표로 확인한 도면.
도 13 은 DNA 엘리먼트 A18 및 관련 배열의 배열 길이.
도 14 는, CHO 형질 전환주를 사용하여, DNA 엘리먼트 A18 및 관련 배열의 발현 항진 효과에 대해, SEAP 활성을 지표로 확인한 도면.
도 15 는 DNA 엘리먼트 B5 및 관련 배열의 배열 길이.
도 16 은, CHO 형질 전환주를 사용하여, DNA 엘리먼트 B5 및 관련 배열의 발현 항진 효과에 대해, SEAP 활성을 지표로 확인한 도면.
도 17 은 DNA 엘리먼트 C14 및 관련 배열의 배열 길이.
도 18 은, CHO 형질 전환주를 사용하여, DNA 엘리먼트 C14 및 관련 배열의 발현 항진 효과에 대해, SEAP 활성을 지표로 확인한 도면.
도 19 는, HEK293 형질 전환주를 사용하여, DNA 엘리먼트 A2, A7, A18, B5, C14 의 발현 항진 효과에 대해, SEAP 활성을 지표로 확인한 도면.
도 20 은 DNA 엘리먼트 A2, A7, 또는 A18 의 전체 길이 배열을 기준으로 하여 시점과 종점이 되는 뉴클레오티드를 나타낸 도면.
도 21 은 DNA 엘리먼트 B5, 또는 C14 의 전체 길이 배열을 기준으로 하여 시점과 종점이 되는 뉴클레오티드를 나타낸 도면.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 명세서에 있어서, 「유전자」 란, mRNA 에 전사되어, 단백질로 번역되는 부분을 의미하고, DNA 뿐만 아니라 그 mRNA, cDNA 및 그 RNA 도 포함되는 것으로 한다.

본 명세서에 있어서, 「폴리뉴클레오티드」 란 핵산과 동일한 의미로 사용하고 있고, DNA, RNA, 프로브, 올리고 뉴클레오티드, 및 프라이머도 포함되어 있다.

본 명세서에 있어서, 「폴리펩티드」 와 「단백질」은 구별하지 않고 사용하고 있다.

본 명세서에 있어서, 「유전자 발현」 이란, 어느 유전자가 mRNA 에 전사되는 현상, 및/또는 그 mRNA 로부터 단백질이 번역되는 현상을 의미하고 있다.

본 명세서에 있어서, 「외래 유전자」 란, 인공적으로 숙주 세포에 도입되는 유전자를 의미하고 있다.

본 명세서에 있어서, 「외래 단백질」 이란, 외래 유전자에 코드되는 단백질을 의미하고 있다.

본 명세서에 있어서, 「유전자 발현 유닛」 이란, 전사의 해독틀의 방향으로, 적어도 프로모터 영역, 외래 유전자, 전사 터미네이터 영역 (폴리 A 부가 시그널) 을 갖는 폴리뉴클레오티드를 의미하고 있다.

본 명세서에 있어서, 「외래 유전자 발현 항진 활성」 이란, 외래 유전자를 포함하는 유전자 발현 유닛 주변 DNA 에 전사에 유리한 환경을 만들어 내어, 전사 효율을 크게 향상시킴으로써, 외래 단백질의 숙주 세포에 있어서의 생산을 항진시키는 활성을 말한다.

본 명세서에 있어서, 「프로모터」 란, DNA 로부터 RNA 로의 전사의 개시에 관여하는 전사 인자가 결합하는 영역을 의미한다. 본 명세서에 있어서는, 「프로모터 영역」 이라고 하는 경우도 있다. 프로모터로서 예를 들어, 전사 개시점의 상류 약 2 kbp 의 뉴클레오티드로부터 개시 코돈에 대응하는 뉴클레오티드 배열 직전의 뉴클레오티드까지의 폴리뉴클레오티드를 예시할 수 있고, 5' UTR, 및 인트론을 포함해도 된다.

본 명세서에 있어서, 「프로모터 활성」 이란, 전사 인자가 프로모터에 결합하여, 전사를 개시하고, 유전자에 코드되는 단백질의 생산을 실시하는 활성을 말하며, 분비형 알칼리 포스파타아제 (SEAP) 등의 리포터 유전자에 코드되는 단백질의 활성을 지표로 하여 검정하는 것이 가능하다.

본 명세서에 있어서, 「프로모터 활성을 갖는다」 란, 후기 (실시예 3) 에 기재된 SEAP 발현량을 지표로 한 프로모터 활성의 평가와 동일한 조건에서, CMV 프로모터와 동등 이상의 SEAP 발현 활성을 갖는 것을 말한다.

본 명세서 중에 있어서, 「DNA 엘리먼트」 란, 유전자 발현 유닛의 근방 또는, 유전자 발현 유닛이 포함되는 외래 유전자 발현 벡터 상에 배치된 경우에, 외래 유전자 발현 항진 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.

본 명세서 중에 있어서, 「항체의 기능성 단편」 이란, 항원과의 결합 활성을 갖는 항체의 부분 단편을 의미하고 있고, Fab, F(ab')₂등을 포함하지만, 항원과의 결합능을 가지고 있는 한 이들의 분자로 한정되지 않는다.

본 명세서 중에 있어서, 「동일성」 이란, 당해 분야에서 공지된 바와 같이, 배열의 비교에 의해 결정되는, 2 개 이상의 뉴클레오티드 배열 또는 아미노산 배열의, 배열간의 관계를 말한다. 당해 분야에 있어서, 「동일성」 은 또, 경우에 따라, 1 열의 2 개 이상의 뉴클레오티드 배열간 또는 2 개 이상의 아미노산 배열간의 일치에 의해 결정했을 때의, 핵산 분자간 또는 폴리펩티드간의 배열 관련성의 정도를 의미한다. 「동일성」 은 2 개 이상의 배열 중 작은 것과, 특정의 수리적 모델 또는 컴퓨터 프로그램 (즉, 「알고리즘」) 에 의해 어드레스 지정되는 갭 얼라이먼트 (존재하는 경우) 와의 사이의 동일 일치의 퍼센트를 산출함으로써 평가할 수 있다. 구체적으로는, European Molecular Biology Laboratory－European Bioinformatics Institute (EMBL－EBI) 가 제공하는 ClustalW2 등의 소프트를 사용함으로써 평가할 수 있지만, 당업자에게 있어서 사용되는 것이면 이것으로 한정되지 않는다.

본 명세서 중에 있어서, 「스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈한다」 란, 이른바 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 예를 들어, 어느 핵산에 대한 동일성이 80 ％ 이상, 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상, 가장 바람직하게 99 ％ 이상의 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 핵산의 상보 사슬이 하이브리다이즈하고, 그보다 동일성이 낮은 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 핵산의 상보 사슬이 하이브리다이즈하지 않는 조건을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 시판되는 하이브리다이제이션 용액 ExpressHyb Hybridization Solution (크론텍크사 제조) 중, 68 ℃ 에서 하이브리다이즈하는 것, 또는, DNA 를 고정한 필터를 사용하여 0.7 내지 1.0 M 의 NaCl 존재하 68 ℃ 에서 하이브리다이제이션을 실시한 후, 0.1 내지 2 배 농도의 SSC 용액 (1 배 농도 SSC 란 150 mM NaCl, 15 mM 시트르산나트륨으로 이루어진다) 을 사용하여, 68 ℃ 에서 세정하는 조건 또는 그와 동등한 조건으로 하이브리다이즈하는 것을 의미한다.

1. 외래 유전자의 발현 항진에 사용되는 프로모터

본 발명의 인간 유전자 유래의 프로모터 (이하, 「본 발명의 프로모터」 라고 하는 경우도 있다) 로서, 인간 리보솜 단백질 유전자의 전사 개시점의 상류 약 2 kbp 의 뉴클레오티드로부터 개시 코돈에 대응하는 뉴클레오티드 배열의 직전의 뉴클레오티드까지의 폴리뉴클레오티드가 바람직하고, 전사 개시점의 상류 약 1 kbp 의 뉴클레오티드, 또는 0.5 kbp 로부터 개시 코돈 배열에 대응하는 뉴클레오티드 배열의 직전의 뉴클레오티드까지의 폴리뉴클레오티드이어도 된다.

그 인간 리보솜 단백질 유전자로서는, 바람직하게는, 인간 리보솜 단백질 S7 유전자 (이하, 「RPS7」이라고 한다), 인간 리보솜 단백질 L32 유전자 (이하, 「RPL32」 라고 한다), 인간 리보솜 단백질 L34 유전자 (이하, 「RPL34」라고 한다) 이다.

본 발명의 프로모터로서 바람직하게는, RPS7, RPL32, 또는 RPL34 의 프로모터이며, 더욱 바람직하게는 서열목록의 배열 번호 1 내지 9 에 기재된 폴리뉴클레오티드이며, 특히 바람직하게는 배열 번호 1 내지 3 의 폴리뉴클레오티드이다.

배열 번호 1 내지 3 의 뉴클레오티드 배열은 각각 RPS7, RPL32, RPL34 의 전사 개시점의 상류 약 2 kbp 의 뉴클레오티드로부터 개시 코돈에 대응하는 뉴클레오티드 배열의 직전의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이며, 배열 번호 4, 6 및 8 은, 각각, RPS7, RPL32, RPL34 의 전사 개시점의 상류 약 1 kbp 의 뉴클레오티드로부터 개시 코돈에 대응하는 뉴클레오티드 배열의 직전의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이며, 배열 번호 5, 7 및 9 는, 각각, RPS7, RPL32, RPL34 의 전사 개시점의 상류 약 0.5 kbp 의 뉴클레오티드로부터 개시 코돈에 대응하는 뉴클레오티드 배열의 직전의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이다.

또, 본 발명의 프로모터는 배열 번호 1 내지 9 에 나타내는 어느 하나의 뉴클레오티드 배열에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상, 가장 바람직하게는 99 ％ 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 배열로 이루어지고, 또한, 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드이어도 된다.

본 발명의 프로모터는 배열 번호 1 내지 9 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한, 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드이어도 된다.

본 발명의 프로모터는, 배열 번호 1 내지 9 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 배열에 있어서, 1 또는 복수, 바람직하게는 1 내지 300 개, 더욱 바람직하게는 1 내지 30 개의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 및/또는 부가된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 변이 폴리뉴클레오티드이고, 또한 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드이어도 된다.

상기 뉴클레오티드 배열의 변이 (결실, 치환, 및/또는 부가) 의 도입은 Kunkel 법 혹은 Gapped duplex 법 등의 당해 기술 분야에서 공지된 수법, 또는 이에 준하는 방법에 의해 실시할 수 있고, 예를 들어 부위 특이적 돌연변이 유발법을 이용한 변이 도입용 키트 (예를 들어 Mutant－K (다카라바이오사 제조) 혹은 Mutant－G (다카라바이오사 제조), 다카라바이오사의 LA PCR in vitro Mutagenesis 시리즈 키트 등을 이용할 수 있다. 이와 같은 변이 폴리뉴클레오티드도 본 발명의 프로모터로서 사용할 수 있다.

본 발명의 프로모터가 갖는 외래 유전자 발현 항진 활성은 SEAP 등의 리포터 유전자에 코드되는 단백질의 활성을 지표로서 검정하는 것이 가능하다. CMV 프로모터를 사용한 경우와 본 발명의 프로모터를 사용한 경우를 비교하여, 리포터 단백질의 활성이 동등 이상, 바람직하게는 1.2 배 이상, 보다 바람직하게는 1.5 배 이상으로 상승한 경우, 그 프로모터가 외래 유전자 발현 항진 활성을 갖는다고 판단할 수 있다. 1.2 배 정도 이상의 항진에 의해서도, 세포의 배양 스케일의 삭감, 배양 시간, 및 정제 공정의 단축이 기대되고, 결과적으로 수량의 향상과 배양 비용의 삭감이 가능해진다. 수량이 향상되면, 의약으로서의 외래 단백질을 안정적으로 공급하는 것이 가능해진다. 또, 배양 비용이 삭감되면, 의약으로서의 외래 단백질의 원가가 경감된다.

또, 본 발명의 프로모터는, 당업자에게 주지의 방법을 이용하여, 숙주 세포에 도입함으로써, 숙주 세포의 내재성 유전자의 발현 항진에 사용하는 것도 가능하다.

2. 외래 유전자 발현 유닛

본 발명의 외래 유전자 발현 유닛 (이하, 「본 발명의 유전자 발현 유닛」 이라고 하는 경우도 있다) 은, 전사의 해독틀의 방향으로, 적어도 상기 1. 에 기재된 본 발명의 프로모터, 외래 유전자, 및 전사 터미네이터 영역 (폴리 A 부가 시그널) 을 갖는 것이다.

또, 폴리 A 부가 배열은 프로모터로부터의 전사에 대해 전사 종결을 일으키는 활성을 갖는 배열이면 되고, 프로모터의 유전자와 동일하거나 또는 상이한 유전자의 것이어도 된다.

3. 외래 유전자의 발현 항진에 사용되는 DNA 엘리먼트

상기 2. 에 기재된 본 발명의 유전자 발현 유닛과 DNA 엘리먼트를 조합하여 사용함으로써, 외래 유전자의 발현을 더욱 항진할 수 있다. 조합하여 사용하는 DNA 엘리먼트는, 실시예 6 에 나타내는 바와 같이, 아세틸화 히스톤 H3 과의 상호 작용을 지표로서 취득하는 것이 가능하다. 일반적으로 히스톤 (H3, H4) 의 아세틸화는 전사의 활성화에 관여하고 있다고 일컬어지고 있고, 주로 2 개의 설이 생각되고 있다. 히스톤테일이 아세틸화함으로써 전하적으로 중화되고, DNA 와 히스톤의 결합이 느슨해진다는 뉴클레오솜의 입체 구조 변화가 관계하고 있는 설 (Mellor J. (2006) Dynamic nucleosomes and gene transcription. Trends Genet. 22 (6)：320－329) 과, 여러 가지 전사 인자의 리크루트에 관여한다는 설 (Nakatani Y. (2001) Histone acetylases－versatile players. Genes Cells. 6 (2)：79－86) 이다. 어느 설에 있어서도, 히스톤의 아세틸화가 전사 활성화에 관여하고 있을 가능성은 높고, 항아세틸화 히스톤 H3 항체를 사용한 크로마틴 면역 침강 (Chromatin Immunoprecipitation；ChIP) 에 의해, 아세틸화 히스톤 H3 과 상호 작용하는 DNA 엘리먼트를 농축하는 것이 가능하다.

본 발명의 프로모터와 조합하여 사용하는, 외래 유전자의 발현 항진에 사용되는 DNA 엘리먼트의 하나로서 A2 를 들 수 있다. A2 는 인간 15 번 염색체 80966429 ∼ 80974878 에 위치하고 있고, AT 함량 62.2 ％, 8450 bp 의 폴리뉴클레오티드이다. A2 의 뉴클레오티드 배열은 서열목록의 배열 번호 10 에 기재되어 있다.

동일한 DNA 엘리먼트로서 A7, A18, B5, C14 를 들 수 있다. A7 은 인간 11 번 염색체 88992123 ∼ 89000542 에 위치하고 있고, AT 함량 64.52 ％, 8420 bp 의 폴리뉴클레오티드이다. A7 의 뉴클레오티드 배열은 서열목록의 배열 번호 11 에 기재되어 있다.

A18 은 인간 4 번 염색체 111275976 ∼ 111284450 에 위치하고 있고, AT 함량 62.54 ％, 8475 bp 의 폴리뉴클레오티드이다. A18 의 뉴클레오티드 배열은 서열목록의 배열 번호 12 에 기재되어 있다.

B5 는 인간 1 번 염색체 143034684 ∼ 143043084 에 위치하고 있고, AT 함량 66.37 ％, 8401 bp 의 폴리뉴클레오티드이다. B5 의 뉴클레오티드 배열은 서열목록의 배열 번호 13 에 기재되어 있다.

마지막으로, C14 는 인간 11 번 염색체 46089056 ∼ 46097482 에 위치하고 있고, AT 함량 63.81 ％, 8427 bp 의 폴리뉴클레오티드이다. C14 의 뉴클레오티드 배열은 서열목록의 배열 번호 14 에 기재되어 있다.

본 발명의 프로모터와 조합하여 사용하는, DNA 엘리먼트가 갖는 외래 유전자 발현 항진 활성은 SEAP 등의 리포터 유전자에 코드되는 단백질의 활성을 지표로서 검정하는 것이 가능하다.

본 발명의 프로모터와 조합하여 사용하는 경우, 상기 DNA 엘리먼트의 어느 1 종을 단독으로 사용해도 되고, DNA 엘리먼트의 1 종을 2 카피 이상 사용해도 된다. 혹은 2 종 이상 DNA 엘리먼트를 조합하여 사용해도 된다.

본 발명의 프로모터와 조합하여 사용하는 DNA 엘리먼트의 바람직한 예로서 A2, A7, A18, B5, C14 를 들 수 있다.

본 발명에 있어서 사용되는 DNA 엘리먼트는 배열 번호 10 내지 14 에 나타내는 뉴클레오티드 배열에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상, 가장 바람직하게는 99 ％ 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 배열로 이루어지고, 또한 외래 유전자 발현 항진 활성을 갖는 뉴클레오티드 배열이어도 된다. 뉴클레오티드 배열의 호몰로지 검색은, 예를 들어, 일본 DNA 데이터 뱅크 (DNA Databank of JAPAN) 등을 대상으로, FASTA 나 BLAST 등의 프로그램을 사용하여 실시할 수 있다.

본 발명의 프로모터와 조합하여 사용되는 DNA 엘리먼트는 배열 번호 10 내지 14 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 외래 유전자 발현 항진 활성을 갖는 DNA 엘리먼트이어도 된다.

당업자이면, Molecular Cloning (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning：a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Skyline Drive Plainview, NY (1989)) 등을 참조함으로써, 이러한 호몰로그 유전자를 용이하게 취득할 수 있다. 또, 상기의 뉴클레오티드 배열의 동일성은, 마찬가지로, FASTA 검색이나 BLAST 검색에 의해 결정할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드의 변이 (결실, 치환, 및/또는 부가) 의 도입은 Kunkel 법 혹은 Gapped duplex 법 등의 당해 기술 분야에서 공지된 수법, 또는 이에 준하는 방법에 의해 실시할 수 있고, 예를 들어 부위 특이적 돌연변이 유발법을 이용한 변이 도입용 키트 (예를 들어 Mutant－K (다카라바이오사 제조) 혹은 Mutant－G (다카라바이오사 제조), 다카라바이오사의 LA PCR in vitro Mutagenesis 시리즈 키트 등을 이용할 수 있다. 이와 같은 변이 폴리뉴클레오티드도 본 발명의 DNA 엘리먼트로서 사용할 수 있다.

본 발명의 프로모터와 조합하여 사용되는 DNA 엘리먼트로서는, 서열목록의 배열 번호 10 내지 14 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 배열 중, 적어도 3000, 혹은, 적어도 2000 이 연속되는 뉴클레오티드로 이루어지는 부분 단편을 사용할 수 있다. 이와 같은 부분 단편의 예로서는, A2 의 부분 단편인 A2－1 내지 A2－17, A7 의 부분 단편인 A7－1 내지 A7－18, A18 의 부분 단편인 A18－1 내지 A18－4, B5 의 부분 단편인 B5－1 내지 B5－6, 또는 C14 의 부분 단편인 C14－1 내지 C14－14 를 들 수 있지만, 외래 유전자 발현 항진 활성을 가지고 있는 한 이들의 부분 단편으로 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서는, 상기 부분 단편 중 어느 1 종을 단독으로 사용해도 되고, 부분 단편의 1 종을 2 카피 이상 사용해도 된다. 혹은 2 종 이상 부분 단편을 조합하여 사용해도 된다. 또, 각 DNA 엘리먼트의 전체 길이 배열과 부분 단편을 조합하여 사용해도 된다. 그 조합에 있어서, 부분 단편은 조합을 구성하는 전체 길이 배열의 DNA 엘리먼트 유래이거나, 상이한 전체 길이 배열의 DNA 엘리먼트 유래이어도 된다.

A2 의 각 단편의 폴리뉴클레오티드 배열에 있어서는, A2－1 은 서열목록의 배열 번호 10 의 1 내지 3000 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A2－2 는 서열목록의 배열 번호 10 의 2801 내지 5800 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A2－3 은 서열목록의 배열 번호 10 의 5401 내지 8450 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A2－4 는 서열목록의 배열 번호 10 의 701 내지 2700 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A2－5 는 서열목록의 배열 번호 10 의 701 내지 2200 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A2－6 은 서열목록의 배열 번호 10 의 701 내지 3700 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A2－7 은 서열목록의 배열 번호 10 의 2001 내지 5000 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A2－8 은 서열목록의 배열 번호 10 의 4001 내지 7000 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A2－9 는 서열목록의 배열 번호 10 의 1 내지 3700 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A2－10 은 서열목록의 배열 번호 10 의 2001 내지 5800 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A2－11 은 서열목록의 배열 번호 10 의 2801 내지 7000 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A2－12 는 서열목록의 배열 번호 10 의 701 내지 5800 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A2－13 은 서열목록의 배열 번호 10 의 2001 내지 7000 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A2－14 는 서열목록의 배열 번호 10 의 2801 내지 8450 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A2－15 는 서열목록의 배열 번호 10 의 1 내지 5800 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A2－16 은 서열목록의 배열 번호 10 의 701 내지 7000 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, 그리고 A2－17 은 서열목록의 배열 번호 10 의 2001 내지 8450 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당한다.

A7 의 각 단편의 폴리뉴클레오티드 배열에 있어서는, A7－1 은 서열목록의 배열 번호 11 의 601 내지 3600 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A7－2 는 서열목록의 배열 번호 11 의 3601 내지 8420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A7－3 은 서열목록의 배열 번호 11 의 5401 내지 8420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A7－4 는 서열목록의 배열 번호 11 의 3401 내지 6400 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A7－5 는 서열목록의 배열 번호 11 의 1501 내지 4500 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A7－6 은 서열목록의 배열 번호 11 의 4401 내지 7400 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A7－7 은 서열목록의 배열 번호 11 의 2401 내지 5400 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A7－8 은 서열목록의 배열 번호 11 의 1 내지 3600 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A7－9 는 서열목록의 배열 번호 11 의 1501 내지 5400 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A7－10 은 서열목록의 배열 번호 11 의 2401 내지 6400 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A7－11 은 서열목록의 배열 번호 11 의 3401 내지 7400 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A7－12 는 서열목록의 배열 번호 11 의 4401 내지 8420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A7－13 은 서열목록의 배열 번호 11 의 1 내지 5400 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A7－14 는 서열목록의 배열 번호 11 의 1501 내지 6400 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A7－15 는 서열목록의 배열 번호 11 의 2401 내지 7400 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A7－16 은 서열목록의 배열 번호 11 의 3401 내지 8420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A7－17 은 서열목록의 배열 번호 11 의 1 내지 6400 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, 그리고 A7－18 은 서열목록의 배열 번호 11 의 1501 내지 7400 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당한다.

A18 의 각 단편의 폴리뉴클레오티드 배열에 있어서는, A18－1 은 서열목록의 배열 번호 12 의 1 내지 5040 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A18－2 는 서열목록의 배열 번호 12 의 1001 내지 6002 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, A18－3 은 서열목록의 배열 번호 12 의 2001 내지 7000 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, 그리고 A18－4 는 서열목록의 배열 번호 12 의 3000 내지 7000 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당한다.

B5 의 각 단편의 폴리뉴클레오티드 배열에 있어서는, B5－1 은 서열목록의 배열 번호 13 의 1 내지 4001 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, B5－2 는 서열목록의 배열 번호 13 의 1 내지 3200 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, B5－3 은 서열목록의 배열 번호 13 의 2491 내지 5601 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, B5－4 는 서열목록의 배열 번호 13 의 5373 내지 8401 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, B5－5 는 서열목록의 배열 번호 13 의 901 내지 4001 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, 그리고 B5－6 은 서열목록의 배열 번호 13 의 4001 내지 7000 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당한다.

C14 의 각 단편의 폴리뉴클레오티드 배열에 있어서는, C14－1 은 서열목록의 배열 번호 14 의 960 내지 4015 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, C14－2 는 서열목록의 배열 번호 14 의 1987 내지 5014 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, C14－3 은 서열목록의 배열 번호 14 의 4020 내지 7119 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, C14－4 는 서열목록의 배열 번호 14 의 960 내지 8141 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, C14－5 는 서열목록의 배열 번호 14 의 960 내지 6011 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, C14－6 은 서열목록의 배열 번호 14 의 4939 내지 8141 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, C14－7 은 서열목록의 배열 번호 14 의 960 내지 5014 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, C14－8 은 서열목록의 배열 번호 14 의 2994 내지 7119 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, C14－9 는 서열목록의 배열 번호 14 의 4020 내지 8141 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, C14－10 은 서열목록의 배열 번호 14 의 1 내지 5014 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, C14－11 은 서열목록의 배열 번호 14 의 1987 내지 7119 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, C14－12 는 서열목록의 배열 번호 14 의 2994 내지 8141 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, C14－13 은 서열목록의 배열 번호 14 의 960 내지 7119 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당하고, 그리고 C14－14 는 서열목록의 배열 번호 14 의 1987 내지 8141 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 배열에 상당한다.

4. 폴리뉴클레오티드의 취득

본 발명에 있어서, 후기의 산생 항진의 대상이 되는 외래 단백질을 코드하는 외래 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 이하에 나타내는 일반적인 방법에 의해 취득할 수 있다. 예를 들어, 외래 유전자가 발현하고 있는 세포나 조직에서 유래하는 cDNA 라이브러리를, 당해 유전자 단편을 기초로 하여 합성한 DNA 프로브를 사용하여 스크리닝함으로써 단리할 수 있다. mRNA 의 조제는 당해 기술 분야에 있어서 통상적으로 사용되는 수법에 의해 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 세포 또는 조직을, 구아니디닌 시약, 페놀 시약 등으로 처리하여 전체 RNA 를 얻고, 그 후, 올리고 (dT) 셀룰로오스 칼럼이나 세파로스 2B 를 담체로 하는 폴리 U-세파로스 등을 사용한 어피니티 칼럼법에 의해, 혹은 배치법에 의해 폴리 (A) ＋ RNA (mRNA) 를 얻는다. 또한, 수크로오스 밀도 구배 원심법 등에 의해 폴리 (A) ＋ RNA 를 추가로 분획해도 된다. 이어서, 얻어진 mRNA 를 주형으로서, 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 사용하여 한 개 사슬 cDNA 를 합성하고, 그 한 개 사슬 cDNA 로부터 DNA 합성 효소 I, DNA 리가아제 및 RNaseH 등을 사용하여 2 개 사슬 cDNA 를 합성한다. 합성한 2 개 사슬 cDNA 를 T4DNA 합성 효소에 의해 평활화 후, 어댑터 (예를 들어, EcoRI 어댑터) 의 연결, 인산화 등을 거쳐, λgt11 등의 λ 파지에 삽입하여 in vivo 패키징함으로써 cDNA 라이브러리를 제작한다. 또, λ 파지 이외에도 플라스미드 벡터를 사용하여 cDNA 라이브러리를 제작할 수도 있다. 그 후, cDNA 라이브러리로부터 목적으로 하는 DNA 를 갖는 주 (포지티브 클론) 를 선택하면 된다.

또, 단백질의 산생에 사용하는 상기 프로모터, 터미네이터 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 상기 DNA 엘리먼트, 또는 외래 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 게놈 DNA 로부터 단리하는 경우는, 일반적 수법 (Molecular Cloning (1989), Methods in Enzymology 194 (1991)) 에 따라, 채취원이 되는 생물의 세포주로부터 게놈 DNA 를 추출하고, 폴리뉴클레오티드를 선별함으로써 실시한다. 게놈 DNA 의 추출은, 예를 들어, Cryer 들의 방법 (Methods in Cell Biology, 12, 39－44 (1975)) 및 P. Philippsen 들의 방법 (Methods Enzymol., 194, 169－182 (1991)) 에 따라 실시할 수 있다.

목적으로 하는 프로모터, DNA 엘리먼트, 또는 외래 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 취득은, 예를 들어 PCR 법 (PCR Technology. Henry A. Erlich, Atockton press (1989)) 에 의해 실시할 수도 있다. PCR 법을 사용한 폴리뉴클레오티드의 증폭에는, 프라이머로서 20 ∼ 30 mer 의 합성 1 개 사슬 DNA 를, 주형으로서 게놈 DNA 를 사용한다. 증폭된 유전자는 폴리뉴클레오티드 배열을 확인한 후, 사용한다. PCR 의 주형으로서는, 박테리아 인공 염색체 (BAC) 등의 게놈 DNA 라이브러리를 사용하는 것이 가능하다.

한편, 배열 미지의 외래 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 취득은 (a) 통상적인 방법에 의해 유전자 라이브러리를 제작하고, (b) 제작된 유전자 라이브러리로부터 원하는 폴리뉴클레오티드를 선택하고, 당해 폴리뉴클레오티드를 증폭함으로써 실시할 수 있다. 유전자 라이브러리는 채취원이 되는 생물의 세포주로부터 통상적인 방법에 의해 얻은 염색체 DNA 를 적당한 제한 효소에 의해 부분 소화하여 단편화하고, 얻어진 단편을 적당한 벡터에 연결하고, 그 벡터를 적당한 숙주에 도입함으로써 조제할 수 있다. 또, 세포로부터 mRNA 를 추출하고, 여기에서 cDNA 를 합성 후, 적당한 벡터에 연결하고, 그 벡터를 적당한 숙주에 도입하는 것에 의해서도 조제할 수 있다. 이 때 사용되는 벡터로서는, 통상적으로 공지된 유전자 라이브러리 조제용 벡터로서 알려진 플라스미드를 사용할 수 있고, 파지 벡터 또는 코스미드 등도 널리 사용할 수 있다. 형질 전환 또는 형질 도입을 실시하는 숙주는 상기 벡터의 종류에 따른 것을 사용하면 된다. 외래 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 선택은, 상기 유전자 라이브러리로부터, 외래 유전자에 특유의 배열을 포함하는 표지 프로브를 사용하는 콜로니·하이브리다이제이션법, 플라크·하이브리다이제이션법 등에 의해 실시한다.

또 외래 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 화학적으로 전체 합성할 수도 있다. 예를 들어 상보적인 2 쌍의 올리고 뉴클레오티드를 제작하여 이들을 어닐시키는 방법이나, 몇 개의 어닐된 DNA 를 DNA 리가아제에 의해 연결하는 방법, 또는 일부 상보적인 몇 개의 올리고 뉴클레오티드를 제작하여 PCR 에 의해 갭을 메우는 방법 등에 의해, 유전자를 합성할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 배열의 결정은 통상적인 방법, 예를 들어 디데옥시법 (Sanger etal., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463－5467 (1977)) 등에 의해 실시할 수 있다. 또한 상기 폴리뉴클레오티드 배열의 결정은 시판되는 시퀀스 키트 등을 사용하는 것에 의해서도 용이하게 실시할 수 있다.

5. 외래 유전자 발현 벡터, 엘리먼트 벡터

본 발명의 외래 유전자 발현 벡터로서는, 상기 1. 에 기재된 본 발명의 프로모터를 포함하는 상기 2. 에 기재된 외래 유전자 발현 유닛을 포함하는 벡터가 제공된다. 본 발명의 외래 유전자 발현 벡터는 상기 3. 에 기재된 DNA 엘리먼트의 1 종, 상기의 DNA 엘리먼트의 1 종을 2 개 이상의 카피수, 또는 상기의 DNA 엘리먼트의 2 종 이상의 조합을 포함해도 된다. 상기의 외래 유전자 발현 벡터에 의해 외래 유전자를 숙주 세포 내에서 발현시킬 때에는, DNA 엘리먼트를 유전자 발현 유닛의 직전 또는 직후에 배치해도 되고, 또는 유전자 발현 유닛으로부터 떨어진 위치에 배치해도 된다. 또, 복수의 DNA 엘리먼트를 포함하는 1 개의 외래 유전자 발현 벡터를 사용해도 된다. 또한, DNA 엘리먼트의 방향은 유전자 발현 유닛에 대해 순방향 또는 역방향 중 어느 것이어도 된다.

또, 본 발명에서 사용되는 벡터로서는, 상기 DNA 엘리먼트의 1 종, 상기의 DNA 엘리먼트의 1 종을 2 개 이상의 카피수, 또는 상기의 DNA 엘리먼트의 2 종 이상의 조합을 포함하고, 또한 유전자 발현 유닛을 포함하지 않는 벡터 (이하, 「엘리먼트 벡터」 라고 한다.) 도 포함된다. 이와 같은 엘리먼트 벡터는 상기의 DNA 엘리먼트를 포함하는 외래 유전자 발현 벡터, 또는 외래 유전자 발현 유닛만을 포함하고 DNA 엘리먼트는 포함하지 않는 외래 유전자 발현 벡터와 조합하여 사용하는 것이 가능하다. 엘리먼트 벡터를 병존시킴으로써, 외래 유전자 발현 벡터를 단독으로 사용하는 경우에 비해 외래 유전자의 발현이 항진되기 때문에, 상기의 벡터의 조합도 본 발명의 외래 유전자 발현 벡터에 포함된다.

외래 유전자로서는, 특별히 한정은 되지 않지만, 분비형 알칼리 포스파타아제 (SEAP), 녹색 형광 단백질 (GFP), 루시페라아제 등의 리포터 유전자, α－아밀라아제 유전자, α－갈락토시다아제 유전자 등의 각종 효소 유전자, 의약상 유용한 생리 활성 단백질인 인터페론 α, 인터페론 γ 등의 각종 인터페론 유전자, IL1, IL2 등의 각종 인터류킨 유전자, 에리트로포이에틴 (EPO) 유전자, 과립구 콜로니 자극 인자 (G－CSF) 유전자 등의 각종 사이토카인 유전자, 성장 인자 유전자, 또는 다량체 단백질을 코드하는 유전자, 예를 들어 항체 또는 그 기능성 단편인 헤테로 다량체를 코드하는 유전자 등을 들 수 있다. 이들 유전자는 어떠한 수법에 의해 얻어지는 것이어도 된다.

「항체의 기능성 단편」 이란, 항원과의 결합 활성을 갖는 항체의 부분 단편을 의미하고 있고, Fab, F(ab')2, Fv, scFv, diabody, 선상 항체, 및 항체 단편으로 형성된 다특이성 항체 등을 포함한다. 또, F(ab')2 를 환원 조건하에서 처리한 항체의 가변 영역의 1 가의 단편인 Fab' 도 항체의 기능성 단편에 포함된다. 단, 항원과의 결합능을 가지고 있는 한 이들의 분자로 한정되지 않는다. 또, 이들의 기능성 단편에는, 항체 단백질의 전체 길이 분자를 적당한 효소로 처리한 것 뿐만아니라, 유전자 공학적으로 개변된 항체 유전자를 사용하여 적당한 숙주 세포에 있어서 산생된 단백질도 포함된다.

또, 본 발명의 외래 유전자 발현 벡터 및 엘리먼트 벡터에는, 형질 전환체를 선발하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세룰레닌, 오레오바시딘, 제오신, 카나바닌, 시클로헥시미드, 하이그로마이신, 퓨로마이신, 블라스티시딘, 테트라사이클린, 카나마이신, 암피실린, 네오마이신 등의 약제에 대해 내성을 부여하는 약제 내성 마커 등을 사용함으로써, 형질 전환체의 선발을 실시하는 것이 가능하다. 또, 에탄올 등에 대한 용제 내성이나, 글리세롤이나 염 등에 대한 침투압 내성, 구리 등의 금속 이온 내성 등을 부여하는 유전자를 마커로 함으로써, 형질 전환체의 선발을 실시하는 것도 가능하다.

본 발명의 외래 유전자 발현 벡터 및 엘리먼트 벡터는 염색체 DNA 에 삽입되지 않는 벡터이어도 된다. 일반적으로, 외래 유전자 발현 벡터는 숙주 세포에 유전자 도입된 후, 랜덤하게 염색체에 삽입되지만, simian virus 40 (SV40) 이나 papillomavirus (BPV, HPV), EBV 등의 포유 동물 바이러스 유래의 구성 성분을 사용함으로써, 도입된 숙주 세포 중에서 자기 복제가 가능한 episomal vector 로서 사용할 수 있다. 예를 들어, SV40 유래의 복제 기점 및 trans－acting factor 인 SV40 large T 항원을 코드한 배열을 갖는 벡터나 EBV 유래의 oriP 및 EBNA－1 을 코드한 배열을 갖는 벡터 등이 널리 사용되고 있다. DNA 엘리먼트의 효과는 벡터의 종류, 혹은 염색체에의 삽입 유무를 불문하고, 외래 유전자 발현 항진 활성을 나타내는 것이 가능하다.

6. 형질 전환 세포

본 발명의 형질 전환 세포는 상기 5. 의 외래 유전자 발현 벡터를 사용하여 도입한 형질 전환 세포이다. 외래 유전자 발현 벡터로서, (A) DNA 엘리먼트를 포함하지 않는 외래 유전자 발현 벡터만을 도입해도 되고, 또는 (B) DNA 엘리먼트를 포함하지 않는 외래 유전자 발현 벡터와 엘리먼트 벡터를 조합하여 도입해도 된다. 혹은, (C) DNA 엘리먼트를 포함하는 외래 유전자 발현 벡터를 도입해도 되고, 또는 (D) DNA 엘리먼트를 포함하는 외래 유전자 발현 벡터와 엘리먼트 벡터를 조합하여 도입해도 된다.

상기 (B) 또는 (D) 의 조합에 의한 외래 유전자의 숙주 세포 내에서의 발현은, 예를 들어, Girod 들의 방법 (Biotechinology and Bioengineering, 91, 2－11 (2005)) 및 Otte 들의 방법 (Biotechnol. Prog., 2007, 23, 801－807 (2007)) 에 따라 실시할 수 있다.

형질 전환시키는 숙주 세포로서는, 진핵 세포, 바람직하게는 포유 동물 세포, 더욱 바람직하게는 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 원숭이, 또는 소 유래의 세포이다. 포유 동물 세포로서는, COS－1 세포, 293 세포, CHO 세포 (CHO－K1, DG44, CHO dhfr－, CHO－S) 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, 숙주 세포에의 발현 벡터의 도입 방법으로서는, 도입 유전자가 숙주 내에서 안정적으로 존재하고, 또한 적절히 발현시킬 수 있는 방법이면 어떠한 방법이어도 되고, 일반적으로 이용되고 있는 방법, 예를 들어, 인산칼슘법 (Ito et al., (1984) Agric. Biol. Chem., 48, 341), 일렉트로포레이션법 (Becker, D. M. et al. (1990) Methods. Enzymol., 194, 182－187), 스페로플라스트법 (Creggh et al., Mol. Cell. Biol., 5, 3376 (1985)), 아세트산리튬법 (Itoh, H. (1983) J. Bacteriol. 153, 163－168), 리포펙션법 등을 들 수 있다.

7. 외래 단백질의 제조 방법

본 발명에 있어서의 외래 단백질의 제조는, 외래 단백질을 코드하는 유전자를, 상기 6. 의 항목에 기재된 형질 전환 세포를 공지된 방법에 의해 배양하고, 그 배양물로부터 채취하여, 정제함으로써 실시할 수 있다. 「배양물」 이란, 배양 상청 외에, 배양 세포, 또는 세포의 파쇄물 모두를 의미하는 것이다. 또한, 6. 의 항목에 기재된 형질 전환 세포를 사용하여 산생할 수 있는 외래 단백질로서는, 단량체 단백질뿐만 아니라 다량체 단백질을 선택하는 것도 가능하다. 상이한 복수의 서브유닛으로 구성되는 헤테로 다량체 단백질의 생산을 실시하는 경우, 이들의 서브유닛을 코드하고 있는 복수의 유전자를, 각각 6. 의 항목에 기재된 숙주 세포에 도입할 필요가 있다.

형질 전환 세포를 배양하는 방법은 그 숙주 세포의 배양에 사용되는 통상적인 방법에 따라 실시할 수 있다.

형질 전환 세포가 포유 동물 세포인 경우에는, 예를 들어 37 ℃, 5 ％ 또는 8 ％ CO₂ 조건하에서 배양하고, 배양 시간은 24 ∼ 1000 시간 정도이며, 배양은 정치, 진탕, 교반, 통기하의 회분 배양이나 유가 배양 또는 연속 배양 등에 의해 실시할 수 있다.

상기의 배양물 (배양액) 로부터 외래 단백질 유전자의 발현 산물의 확인은 SDS－PAGE, 웨스턴 해석, ELISA 등에 의해 실시할 수 있다. 생산된 단백질을 단리 정제하기 위해서는, 통상적인 단백질의 단리, 정제법을 이용하면 된다. 배양 후, 목적 단백질이 세포 내에 생산되는 경우에는, 세포를 초음파 파쇄기, 프렌치 프레스, 만톤가우린 호모게나이저, 다이노밀 등에 의해 파쇄함으로써, 목적 단백질을 채취한다. 또, 목적 단백질이 세포 외에 생산되는 경우에는, 배양액을 그대로 사용하거나, 원심분리 등에 의해 세포를 제거한다. 그 후, 유기 용매에 의한 추출 등에 의해 목적 단백질을 채취하여, 필요에 따라 각종 크로마토그래피 (소수성 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피법, 이온 교환 크로마토그래피 등), 분자체를 사용한 겔 여과법, 폴리아크릴아미드겔 등을 사용하는 전기 영동법 등의 수법을 단독 혹은 조합하여 사용하여 단리 정제하면 된다.

상기의 배양법, 정제법은 일례로서, 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, 정제된 유전자 산물이 갖는 아미노산 배열의 확인은 공지된 아미노산 분석, 예를 들어 에드만 분해법에 의한 자동 아미노산 배열 결정법 등에 의해 실시할 수 있다.

8. 항체 단백질의 제조 방법

상기 7. 의 항목에 기재된 제조 방법을 사용하여 제조되는 헤테로 다량체 단백질로서는 항체 단백질을 들 수 있다. 항체 단백질은 2 분자의 중사슬 폴리펩티드 및 2 분자의 경사슬 폴리펩티드로 이루어지는 4 량체 단백질이다. 따라서, 항원 결합능을 유지한 형태로 항체 단백질을 취득하기 위해서는, 상기 6. 의 항목에 기재된 형질 전환 세포에 있어서, 중사슬 및 경사슬의 유전자의 쌍방이 도입되어 있을 필요가 있다. 이 경우에, 중사슬 및 경사슬의 유전자 발현 유닛은 동일한 발현 벡터 상에 존재해도 되고, 혹은 상이한 발현 벡터 상에 존재하고 있어도 된다.

본 발명에 있어서 제조되는 항체로서는, 토끼, 마우스, 래트 등 실험 동물을 원하는 항원으로 면역하여 제작된 항체를 들 수 있다. 또, 상기의 항체를 원료로 하는 키메라 항체, 및 인간화 항체도 본 발명에 있어서 제조되는 항체로서 들 수 있다. 또한, 유전자 개변 동물 또는 파지 디스플레이법에 의해 취득되는 인간 항체에 대해서도, 본 발명에 있어서 제조되는 항체이다.

항체 제조에 사용하는 항체 유전자로서는, 그 항체 유전자로부터 전사·번역되는 중사슬 폴리펩티드와 경사슬 폴리펩티드의 조합이, 임의의 항원 단백질과 결합하는 활성을 유지하고 있는 한, 특정의 폴리뉴클레오티드 배열을 가지는 항체 유전자로 한정되지 않는다.

또, 항체 유전자로서는, 반드시 항체의 전체 길이 분자를 코드하고 있을 필요는 없고, 항체의 기능성 단편을 코드하고 있는 유전자를 사용할 수 있다. 이들의 기능성 단편을 코드하는 유전자는 항체 단백질의 전체 길이 분자를 코드하는 유전자를 유전자 공학적으로 개변함으로써 취득할 수 있다.

9. 그 밖의 외래 단백질의 제조 방법

본 발명의 제조 방법의 대상이 되는 외래 단백질로서는, 전술한 항체에 더하여, 인간 또는 비인간 동물 유래의 각종 단백질, 그 기능성 단편, 그 개변체 등을 들 수 있다. 그러한 단백질 등으로서는, 심방성 나트륨이뇨펩티드 (ANP), 뇌성 나트륨이뇨펩티드 (BNP), C 형 나트륨이뇨펩티드 (CNP), 바소프레신, 소마토스타틴, 성장 호르몬 (GH), 인슐린, 옥시토신, 그레린, 렙틴, 아디포넥틴, 레닌, 칼시토닌, 오스테오프로테제린, 인슐린양 성장 인자 (IGF) 등의 펩티드 호르몬, 인터류킨, 케모카인, 인터페론, 종양 괴사 인자 (TNFα／β 외 TNF 수퍼 패밀리 등), 신경 성장 인자 (NGF), 세포 증식 인자 (EGF, FGF, PDGF, HGF, TGF 등), 조혈 인자 (CSF, G－CSF, 에리트로포이에틴 등), 아디포카인 등의 사이토카인, ТNF 수용체 등의 수용체, 리소자임, 프로테아제, 프로테이나제, 펩티다아제 등의 효소, 그 기능성 단편 (원래의 단백질의 생물 활성을 일부 또는 전부 유지하고 있는 단편), 그들의 단백질을 포함하는 것으로 이루어지는 융합 단백질 등을 들 수 있지만, 그들로 한정되는 것은 아니다.

실시예

10. 실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명한다. 단, 이들의 실시예는 본 발명의 기술적 범위를 전혀 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 실시예에서 사용하는 플라스미드, 제한 효소, DNA 수식 효소 등은 시판되는 것이며, 통상적인 방법에 따라 사용할 수 있다. 또, DNA 의 클로닝, 폴리뉴클레오티드 배열의 결정, 숙주 세포의 형질 전환, 형질 전환 세포의 배양, 얻어지는 배양물로부터의 단백질의 채취, 정제 등에 사용한 조작에 대해서도 당업자에게 잘 알려져 있는 것이나, 문헌에 의해 알 수 있는 것이다.

(실시예 1) 프로모터 활성 평가용 벡터 CMV/pSeapIRESpuro 의 구축

프로모터 활성의 평가는 SEAP 의 발현을 지표로 하여 실시하는 것으로 하고, 평가용 벡터의 구축을 실시했다.

1－1) SEAP 의 cDNA 의 PCR 에 의한 증폭이라는 제한 효소 부위의 부가

SEAP 의 cDNA 는 개시 코돈의 ATG 의 직전에 NheI 부위, 종지 코돈의 직후에 BglII 를 부가한 프라이머와 KOD－Plus (TOYOBO) 를 사용한 PCR 에 의해 증폭했다. 템플릿으로서는, pSEAP2－control (Clontech) 을 사용했다. 얻어진 프래그먼트를 NheI 및 BglII 로 소화하고, minelute reaction kit (QIAGEN) 로 정제했다.

사용한 프라이머

1－2) CMV/pSeapIRESpuro 의 구축

pIRESpuro3 (Clontech) 을, NheI―BamHI 로 소화 후, 1－1) 에서 조제한 SEAP 프래그먼트를 ligation 반응에 의해 삽입했다. 얻어진 플라스미드를 CMV/pSeapIRESpuro 명명했다.

(실시예 2) RPS7, RPL32, 및 RPL34 의 프로모터 영역의 클로닝

mRNA 량을 지표로 하여, 전사 활성이 높은 프로모터를 갖는다고 생각되는 인간 유전자로서 EEF2, YBX1, PPIA, PSAP, RAN, RPL32, RPL34, RPLP1, RPS7, RPS24, TMSB4X, UBC, YWHAE, ARPC2, SERBP1 을 선출하고, 각 유전자의 프로모터 영역의 클로닝을 실시하여, 실시예 3 의 프로모터 활성의 평가에 제공했다.

2－1) RPS7 의 프로모터 영역의 클로닝

RPS7 의 프로모터 영역으로서는, GenBank 에 NM＿001011.3 으로 등록되어 있는 mRNA 의 배열을 참고로 하여, RPS7 의 전사 개시점의 상류 약 2 kbp 의 뉴클레오티드로부터 개시 코돈 배열에 대응하는 뉴클레오티드 배열의 직전의 뉴클레오티드까지의 배열을 사용했다.

RPS7 의 프로모터 영역은, 대장균 인공 염색체의 클론 RP11－644P19 (GenoTechs) 를 템플릿으로 하여, 이하에 나타내는 프라이머 세트와 KOD－Plus (TOYOBO) 를 사용한 PCR 로 증폭하고, minelute reaction kit (QIAGEN) 로 정제했다. CMV/pSeapIRESpuro 를 SpeI－NheI 소화하여, CMV 프로모터를 제거한 후에, SpeI－NheI 부위에 RPS7 의 프로모터 영역을 In－Fusion Advantage PCR 클로닝 키트 (Clontech) 를 사용하여 삽입하고, RPS7/pSeapIRESpuro 를 구축했다. 클로닝한 RPS7 의 프로모터 영역의 뉴클레오티드 배열을 서열목록의 배열 번호 1 에 나타낸다.

RPS7 의 프라이머 세트

2－2) RPL32 의 프로모터 영역의 클로닝

RPL32 의 프로모터 영역으로서는, GenBank 에 NM＿000994.3 으로 등록되어 있는 mRNA 의 배열을 참고로 하여, RPL32 의 전사 개시점의 상류 약 2 kbp 의 뉴클레오티드로부터 개시 코돈 배열에 대응하는 뉴클레오티드 배열의 직전의 뉴클레오티드까지의 배열을 사용했다.

RPL32 의 프로모터 영역은, 대장균 인공 염색체의 클론 RP11－767C1 (GenoTechs) 을 템플릿으로 하여, 이하에 나타내는 프라이머 세트와 KOD－Plus (TOYOBO) 를 사용한 PCR 로 증폭하고, minelute reaction kit (QIAGEN) 로 정제했다. CMV/pSeapIRESpuro 를 SpeI－NheI 소화하여, CMV 프로모터를 제거한 후에, SpeI－NheI 부위에 RPL32 의 프로모터 영역을 In－Fusion Advantage PCR 클로닝 키트 (Clontech) 를 사용하여 삽입하고, RPL32/pSeapIRESpuro 를 구축했다. 클로닝한 RPL32 의 프로모터 영역의 뉴클레오티드 배열을 서열목록의 배열 번호 2 에 나타낸다.

RPL32 의 프라이머 세트

2－3) RPL34 의 프로모터 영역의 클로닝

RPL34 의 프로모터 영역으로서는, GenBank 에 NM＿033625.2 로 등록되어 있는 mRNA 의 배열을 참고로 하여, RPL34 의 전사 개시점의 상류 약 2 kbp 의 뉴클레오티드로부터 개시 코돈 배열에 대응하는 뉴클레오티드 배열의 직전의 뉴클레오티드까지의 배열을 사용했다.

RPL34 의 프로모터 영역은, 대장균 인공 염색체의 클론 RP11－462C24 (GenoTechs) 를 템플릿으로 하여, 이하에 나타내는 프라이머 세트와 KOD－Plus (TOYOBO) 를 사용한 PCR 로 증폭하고, minelute reaction kit (QIAGEN) 로 정제했다. CMV/pSeapIRESpuro 를 SpeI－NheI 소화하여, CMV 프로모터를 제거한 후에, SpeI－NheI 부위에 RPL34 의 프로모터 영역을 In－Fusion Advantage PCR 클로닝 키트 (Clontech) 를 사용하여 삽입하고, RPL34/pSeapIRESpuro 를 구축했다. 클로닝한 RPL34 의 프로모터 영역의 뉴클레오티드 배열을 서열목록의 배열 번호 3 에 나타낸다.

RPL34 의 프라이머 세트

2－4) 다른 인간 유전자의 프로모터 영역의 클로닝

상기 2－1) 에 기재된 방법에 준하여, EEF2, YBX1, PPIA, PSAP, RAN, RPLP1, RPS24, TMSB4X, UBC, YWHA, ARPC2, SERBP1 의 프로모터 영역의 클로닝을 실시하여, 클로닝된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 pSeapIRESpuro 를 구축했다.

(실시예 3) CHO－K1 폴리클로날 형질 전환 세포에 있어서의 SEAP 발현량을 지표로 한 프로모터 활성의 평가

3－1) 트랜스펙션

CHO―K1 세포 (ATCC) 는 10 ％ Ultra－Low IgG FBS (GIBCO) 를 포함하는 F－12 Nutrient Mixture 배지 (GIBCO) 를 사용하여 5 ％ CO₂, 37 ℃ 에서 계대 배양했다.

6 well plate (IWAKI) 에 5 × 10⁵ cells/well 로 CHO－K1 세포를 파종하고, 다음날에 2 ㎍ 의 실시예 1), 및 2) 에서 제작한 CMV/pSeapIRESpuro, RPS7/pSeapIRESpuro, RPL32/pSeapIRESpuro, 및 RPL34/pSeapIRESpuro 등을 각각 lipofectamine 2000 (Invitrogen) 을 사용하여 트랜스펙션했다.

3－2) Puromycin 에 의한 약제 선택

트랜스펙션의 2 일 후에, 6 well plate 로부터 세포를 트립신 처리에 의해 회수하고, 전체량을 6 cm dish (Nunc) 에 파종함과 함께 배지에 최종농도 8 ㎍/㎖ 의 Puromycin (Clontech) 을 첨가하여 약제 선택을 개시했다.

3－3) 폴리클로날 형질 전환 세포주에 의한 평가

약제 선택 개시부터 11 일 후에 폴리클로날 형질 전환 세포주를 트립신으로 회수하여 세포수를 측정하고, 1 × 10⁵ cells/㎖/well 로 24 well plate (IWAKI) 에 파종하고, 24 시간 후에 배양 상청을 회수하여 상청의 SEAP 활성을 SensoLyte^TMpNPP Secreted Alkaline Phosphatase Reporter Assay (ANASPEC) 를 사용하여 측정했다. 대조로 한 CMV 프로모터 (CMV/pSeapIRESpuro) 의 SEAP 활성과 비교해서 강한 것은 RPS7, RPL32, RPL34 의 프로모터 영역으로, 각각 1.7 배 이상, 2.0 배 이상, 2.5 배 이상의 SEAP 활성이었다 (도 1). EEF2, YBX1, PPIA, PSAP, RAN, RPLP1, RPS24, TMSB4X, UBC, YWHA, ARPC2, SERBP1 의 프로모터 영역은 CMV 프로모터의 SEAP 활성과 비교해서 약했다.

(실시예 4) 트런케이트형 프로모터의 클로닝

RPS7, RPL32, 및 RPL34 의 트런케이트형 프로모터로서, 각 유전자의 전사 개시점의 약 1 kb 상류의 뉴클레오티드로부터 개시 코돈에 대응하는 뉴클레오티드 배열의 직전의 뉴클레오티드까지의 뉴클레오티드 배열 (T1), 및 전사 개시점의 약 0.5 kb 상류의 뉴클레오티드로부터 개시 코돈까지 대응하는 뉴클레오티드 배열의 직전의 뉴클레오티드까지의 뉴클레오티드 배열 (T2) 를 사용하여, 그 트런케이트형 프로모터의 클로닝을 실시했다.

4－1) RPS7T1, 및 RPS7T2 의 클로닝

RPS7T1, 및 RPS7T2 는, 2－1) 에서 제작한 RPS7/pSeapIRESpuro 를 템플릿으로 하여, 이하에 나타내는 프라이머 세트와 KOD－Plus (TOYOBO) 를 사용한 PCR 로 증폭하고, minelute reaction kit (QIAGEN) 로 정제했다. CMV/pSeapIRESpuro 를 SpeI－NheI 소화하여, CMV 프로모터를 제거한 후에, SpeI－NheI 부위에 RPS7T1, 및 RPS7T2 의 프로모터 영역을 In－Fusion Advantage PCR 클로닝 키트 (Clontech) 를 사용하여 삽입하고, RPS7T1/pSeapIRESpuro, 및 RPS7T2/pSeapIRESpuro 를 구축했다. 클로닝한 RPS7T1, 및 RPS7T2 의 프로모터 영역의 뉴클레오티드 배열을 서열목록의 배열 번호 4, 및 배열 번호 5 에 나타낸다.

RPS7T1 의 프라이머 세트

RPS7T2 의 프라이머 세트

4－2) RPL32T1, 및 RPL32T2 의 클로닝

RPL32T1, 및 RPL32T2 는, 2－2) 에서 제작한 RPL32/pSeapIRESpuro 를 템플릿으로 하여, 이하에 나타내는 프라이머 세트와 KOD－Plus (TOYOBO) 를 사용한 PCR 로 증폭하고, minelute reaction kit (QIAGEN) 로 정제했다. CMV/pSeapIRESpuro 를 SpeI－NheI 소화하여, CMV 프로모터를 제거한 후에, SpeI－NheI 부위에 RPL32T1, 및 RPL32T2 의 프로모터 영역을 In－Fusion Advantage PCR 클로닝 키트 (Clontech) 를 사용하여 삽입하고, RPL32T1/pSeapIRESpuro, 및 RPL32T2/pSeapIRESpuro 를 구축했다. 클로닝한 RPL32T1, 및 RPL32T2 의 프로모터 영역의 뉴클레오티드 배열을 서열목록의 배열 번호 6, 및 배열 번호 7 에 나타낸다.

RPL32T1 의 프라이머 세트

RPL32T2 의 프라이머 세트

4－3) RPL34T1, 및 RPL34T2 의 클로닝

RPL34T1, 및 RPL34T2 는, 2－3) 에서 제작한 RPL34/pSeapIRESpuro 를 템플릿으로 하여, 이하에 나타내는 프라이머 세트와 KOD－Plus (TOYOBO) 를 사용한 PCR 로 증폭하고, minelute reaction kit (QIAGEN) 로 정제했다. CMV/pSeapIRESpuro 를 SpeI－NheI 소화하여, CMV 프로모터를 제거한 후에, SpeI－NheI 부위에 RPL34T1, 및 RPL34T2 의 프로모터 영역을 In－Fusion Advantage PCR 클로닝 키트 (Clontech) 를 사용하여 삽입하고, RPL34T1/pSeapIRESpuro, 및 RPL34T2/pSeapIRESpuro 를 구축했다. 클로닝한 RPL34T1, 및 RPL34T2 의 프로모터 영역의 뉴클레오티드 배열을 서열목록의 배열 번호 8, 및 배열 번호 9 에 나타낸다.

RPL34T1 의 프라이머 세트

RPL34T2 의 프라이머 세트

(실시예 5) CHO－K1 폴리클로날 형질 전환 세포에 있어서의 SEAP 발현량을 지표로 한 트런케이트형 프로모터의 활성의 평가

5－1) 트랜스펙션

6 well plate (IWAKI) 에 2 × 10⁵ cells/well 로 CHO－K1 세포를 파종하고, 다음날에 2 ㎍ 의 실시예 1), 2) 및 4) 에서 제작한 CMV/pSeapIRESpuro, RPS7/pSeapIRESpuro, RPS7T1/pSeapIRESpuro, RPS7T2/pSeapIRESpuro, RPL32/pSeapIRESpuro, RPL32T1/pSeapIRESpuro, RPL32T2/pSeapIRESpuro, RPL34/pSeapIRESpuro, RPL34T1/pSeapIRESpuro, 및 RPL34T2/pSeapIRESpuro 를 각각 Fugene6 (Roche Applied Science) 을 사용하여 트랜스펙션했다.

5－2) Puromycin 에 의한 약제 선택

5－3) 폴리클로날 형질 전환 세포주에 의한 평가

약제 선택 개시부터 11 일 후에 폴리클로날 형질 전환 세포주를 트립신으로 회수하여 세포수를 측정하고, 1 × 10⁵ cells/㎖/well 로 24 well plate (IWAKI) 에 파종하고, 24 시간 후에 배양 상청을 회수하여 상청의 SEAP 활성을 SensoLyte (등록상표) pNPP Secreted Alkaline Phosphatase Reporter Assay (ANASPEC) 를 사용하여 측정했다. 측정 결과를 도 2 에 나타낸다. 각 트런케이트형 프로모터에 있어서도, 대조로 한 CMV 프로모터 (CMV/pSeapIRESpuro) 의 SEAP 활성을 상회하는 SEAP 활성이 얻어지고, 이들의 프로모터가 CMV 보다 강한 프로모터 활성을 갖는 것이 나타났다.

(실시예 6) DNA 엘리먼트의 추출

(6－1) 항아세틸화 히스톤 H3 항체를 사용한 크로마틴 면역 침강

항아세틸화 히스톤 항체를 사용한 ChIP 는 하기 순서에 의해 EZ ChIP (Upstate) 를 사용하여 실시했다. 또한, 특기가 없는 한, 하기 순서 중에서 사용한 항체, buffer 등은 Upstate 사 제품을 사용했다.

먼저, 293F 세포 (Invitrogen) 를 GIBCO (등록상표) FreeStyle^TM 293 Medium (Invitrogen) 을 사용하여 37 ℃, 8 ％ CO₂ 조건하에서 배양을 실시하고, 원심분리 (1000 rpm, 5 분, 실온) 에 의해 증식기에 있는 세포를 회수했다. 2 × 10⁷개의 세포를 1 ％ 포름알데히드를 넣은 배지에서 10 분간 교반한 후, 10 × 글리신을 첨가하여 5 분간 실온에서 교반을 실시했다. 원심분리 (3000 rpm, 5 분, 4 ℃) 에 의해 상청을 제거하고, PBS 를 첨가하여 세포 현탁 후에 재차, 원심분리에 의해 PBS 를 제거하고, SDS lysis buffer 를 첨가하여 세포의 현탁·용해를 실시했다. 용해한 샘플을 빙수로 냉각시키면서 초음파 호모게나이저 (BRANSON) 를 사용하여 DNA 의 단편화를 실시하고, protease inhibitor cocktail 을 넣은 dilution buffer 및 Protein G 고정화 아가로오스를 첨가하고, 4 ℃ 에서 1 시간 교반하여, 원심분리 후에 상청의 회수를 실시했다. 다음으로, 10 ㎍ 의 normal rabbit IgG, 또는 α―acetyl Histone H3 항체를 첨가하여, 4 ℃ 에서 하룻밤 교반을 실시했다. 그 용액에 protein G 고정화 아가로오스를 첨가하고, 4 ℃ 에서 1 시간 교반 후, 원심분리에 의해 펠릿의 회수를 실시했다. 그 펠릿을 Low Salt Immune Complex Wash Buffer 로 2 회, High Salt Immune Complex Wash Buffer 로 2 회, LiCl Immune Complex Wash Buffer 로 2 회, 마지막으로 TE Buffer 로 4 회 세정하고, elution buffer (20 ㎕ 의 1 M 탄산수소나트륨, 10 ㎕ 의 SDS, 170 ㎕ 의 멸균수) 를 첨가하여 30 분 후에 원심분리를 실시하고, 상청의 회수를 실시했다.

다음으로, 그 상청에 5 M 염화나트륨을 첨가하여 65 ℃ 에서 하룻밤 가열하고, 추가로, RNase A 를 첨가하여 37 ℃ 에서 30 분간 인큐베이트했다. 0.5 M EDTA, 1 M Tris－HCl, Ptoteinase K 를 첨가하여 45 ℃ 에서 2 시간 가만히 정지시켰다.

마지막으로, Ptoteinase K 로 처리한 용액의 5 배량의 Reagent A, B, C 를 첨가하고, Spin filter 에 의한 원심분리 (10000 rpm, 30 초, 실온) 에 의해 크로마틴 면역 침강된 DNA 의 정제를 실시했다.

(6－2) 마이크로 어레이 해석

GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit (Sigma) 를 사용하여, (6－1) 의 각 ChIP 샘플의 증폭을 실시했다. 순서는 Kit 부속의 Sigma 사의 프로토콜에 따라 실시했다.

ChIP 의 확인을 실시하기 위해, WGA 에 의해 증폭된 각 DNA320ng 를 주형으로서, 하기 프라이머 및 SYBR (등록상표) Premix Ex Taq^TM (Perfect Real Time) (TAKARA) 을 사용하여, PCR 법 (95 ℃ 5 초, 60 ℃ 20 초 × 45 cycle) 에 의해 글리셀알데히드 3 인산 탈수소 효소 (glycelaldehyde－3－phosphate dehydrogenase ： GAPDH) 유전자 내부의 증폭을 실시했다. 또한, GAPDH 는 ChIP 에 의해 DNA 엘리먼트가 농축된 것을 확인하기 위한 양성 컨트롤이 되는 하우스키핑 유전자이며, EZ ChIP (Upstate) 에 부속 프라이머를 사용하여 PCR 법을 실시했다.

그 결과, 항아세틸화 히스톤 H3 항체로 면역 침강을 실시한 샘플 특이적으로 GAPDH 의 증폭이 확인되었다 (도 3). WGA 에 의해 증폭된 각 DNA 샘플을 마이크로 어레이 해석 (NimbleGen) 에 부가함으로써, Chromatin immunoprecipitation on Chip (ChIP on chip) 를 실시했다. ChIP on chip 는, (6－1) 에서 농축된 DNA 를 마이크로 어레이 해석에 제공함으로써, 각 DNA 엘리먼트의 동정을 실시하는 수법이다.

(6－3) DNA 엘리먼트의 추출

(6－2) 로부터 얻어진 ChIP on chip 해석 결과를 기초로, 62 ％ 이상의 AT 함량을 갖는 5 개의 배열의 추출을 실시했다.

A2 ； 15 번 염색체 (80966429 ∼ 80974878)

A7 ； 11 번 염색체 (88992123 ∼ 89000542)

A18 ； 4 번 염색체 (111275976 ∼ 111284450)

B5 ； 1 번 염색체 (143034684 ∼ 143043084)

C14 ； 11 번 염색체 (46089056 ∼ 46097482)

(실시예 7)

분비형 알칼리 포스파타아제 (SEAP) 의 발현을 지표로 한, DNA 엘리먼트의 효과

(7－1) SEAP 발현 벡터의 구축

pSEAP2－control (Clontech) 을 주형으로, 하기 프라이머 및 KOD－plus－(TOYOBO) 를 사용한 PCR 법 (94 ℃ 30 초, 68 ℃ 2 분 × 40 cycle) 에 의해, SEAP 유전자의 증폭을 실시했다.

다음으로, 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 증폭된 SEAP 단편을 분리 후, 겔로부터 잘라내어, QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) 에 의해 정제하고, 이 DNA 단편을 인서트로 했다. 인서트를 제한 효소 NheI, BglII, 벡터 pIRES hyg3 (clontech) 을 제한 효소 NheI, BamHI 로 처리 후, 아가로오스 전기 영동에 의해 각각의 목적 단편을 분리 후, 겔로부터 잘라내어, 정제 후에, ligation 반응, transformation 을 실시했다. Ligation 반응은 LigaFast Rapid DNA Ligation System (Promega) 을 사용하여 실시했다. Transformation 은, 먼저, 동결되어 있는 콘피텐트셀 JM109 (TAKARA) 를 융해하고, 그 용액에 ligation 반응 후의 용액 10 ㎕ 를 첨가하여 빙상에서 30 분 가만히 정지시켰다. 그 후, heat shock (42 ℃, 45 초) 를 실시하고, 5 분 빙랭했다. 이 균체 현탁액에 1 ㎖ 의 LB 배지를 첨가하여, 37 ℃ 에서 1 시간 진탕하고, 0.1 mg/㎖ 암피실린을 넣은 LB 플레이트에 뿌려, 37 ℃ 에서 14 ∼ 16 시간 배양했다. 그 후, 알칼리법에 의해 LB 플레이트 상에서 배양한 콜로니로부터 목적 플라스미드의 회수를 실시했다. 마지막으로, 알칼리법으로 얻어진 플라스미드 중의 SEAP 의 폴리뉴클레오티드 배열을 결정함으로써, pCMV/SEAP ires Hygro 를 구축했다.

(7－2) DNA 엘리먼트의 클로닝

다음으로, 실시예 6 에서 추출한 DNA 엘리먼트를, 각각의 폴리뉴클레오티드 배열을 갖는 박테리아 인공 염색체 (BAC) 로부터 BAC SUBCLONING Kit (Gene Bridges) 를 사용하여 (7－1) 의 SEAP 발현 벡터에 클로닝을 실시했다.

먼저, (7－1) 의 pCMV/SEAP ires Hygro 를 제한 효소 SpeI 로 수시간 처리하고, 에탄올 침전을 실시하여, 멸균수로 용해했다. SpeI 처리한 상기 벡터를 주형으로, 하기 프라이머 및 KOD－plus－(TOYOBO) 를 사용한 PCR 법 (94 ℃ 15 초, 55 ℃ 30 초, 68 ℃ 10 분 × 30 cycle) 을 실시했다.

반응 용액의 일부를 사용하여 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 증폭의 확인을 실시한 후, 나머지 용액은 에탄올 침전을 실시하고, 멸균수로 용해하여, 형질 전환용 DNA 로 했다.

다음으로, 형질 전환용 대장균의 조제를 실시했다.

실시예 6 에서 추출된 5 배열과 대응하는 BAC 클론은 이하와 같다.

융해된 상기 BAC (주식회사 제노텍스) 10 ㎕ 를 배지 1 ㎖ (최종 농도 chloramphenicol 15 ㎍/㎖ 포함한다) 에 식균하여, 37 ℃ 에서 하룻밤 배양을 실시했다. 그 배양액 30 ㎕ 를 1.4 ㎖ 의 배지 (최종 농도 chloramphenicol 15 ㎍/㎖ 포함한다) 로 옮기고, 37 ℃ 에서 2 시간 배양을 실시하여, 원심 및 멸균수에 의한 세정을 2 회 반복하고, 20 ㎕ 의 멸균수로 현탁했다. 냉각시킨 큐벳트 (0.1 cm) 에 pRED/ET (Gene Bridges) 1 ㎕ 및 대장균을 첨가하고, Electroporation (1350 V, 10 μF) 을 실시한 후, SOC 배지 1 ㎖ 를 첨가하여, 30 ℃ 에서 70 분간의 배양을 실시하고, 배양액 100 ㎕ 를 LB 플레이트 (최종 농도 tetracyclin 3 ㎍/㎖, chloramphenicol 15 ㎍/㎖ 포함한다) 에 파종하고, 30 ℃ 에서 하룻밤 인큐베이트했다. 다음 날에 얻어진 콜로니를 배지 1 ㎖ (최종 농도 tetracyclin 3 ㎍/㎖, chloramphenicol 15 ㎍/㎖ 포함한다) 에 식균하고, 30 ℃ 에서 하룻밤 배양을 실시했다. 배양액 30 ㎕ 를 1.4 ㎖ 배지 (최종 농도 tetracyclin 3 ㎍/㎖, chloramphenicol 15 ㎍/㎖ 포함한다) 로 옮기고, 30 ℃ 에서 2 시간 배양을 실시하여, 50 ㎕ 의 10 ％ L-arabinose 를 첨가하고, 다시 37 ℃ 에서 1 시간의 배양을 실시했다. 그 후, 멸균수에 의한 세정을 2 회 반복하고, 30 ㎕ 의 멸균수로 현탁한 대장균 및, 형질 전환용 DNA 1 ㎕ 를, 식힌 큐벳트 (0.1 cm) 에 첨가하여, Electroporation (1350 V, 10 μF) 을 실시했다. SOC 배지 1 ㎖ 를 첨가하여, 37 ℃ 에서 90 분 배양을 실시하고, 배양액 전체량을 LB 플레이트 (암피실린 100 ㎍/㎖ 포함한다) 에의 파종, 플레이트 배양, 알칼리법에 의한 목적 플라스미드의 취득을 실시했다. 마지막으로, 취득된 플라스미드의 배열 확인 및 제한 효소 확인의 실시에 의해, 목적 플라스미드의 구축을 실시했다 (도 4).

(7－3) SEAP 발현을 지표로 한 평가

숙주 세포 CHO―K1 세포 (ATCC), 유전자 도입 시약 Lipofectamine2000 (Invitrogen) 을 사용하여, (7－2) 에서 구축된 각 플라스미드의 평가를 실시했다.

유전자 도입 2 일 후부터 hygromycin 800 ㎍/㎖ 에 의한 약제 선택을 약 2 주간 실시하여, 폴리클로날 안정 발현주의 구축을 실시했다. 수립된 세포주는, 측정 전날에 배지 교환을 실시하여, 일정 세포수를 24 구멍 플레이트 (IWAKI) 에 파종했다. 파종 24 시간 후에 배양 상청의 회수를 실시하여, SEAP 활성의 측정을 실시했다. 배양 상청 중의 SEAP 활성은, SensoLyte^TM pNPP Secreted Alkaline Phosphatase Reporter Assay (ANASPEC) 를 사용하여, 측정했다.

측정 결과를 도 5 에 나타낸다. No element 인 컨트롤의 SEAP 활성을 1 로 했을 때, DNA 엘리먼트 A2, A7, A18, B5, C14 를 갖는 CHO 안정 발현주의 배양 상청 중의 SEAP 활성은 5 배 이상의 수치를 나타냈다. 이에 따라, DNA 엘리먼트 5 종류 모두는 SEAP 발현을 극적으로 항진하는 것이 확인되었다. 또한, 상기의 5 종류의 폴리뉴클레오티드 배열은 서열목록의 배열 번호의 10 내지 14 에 기재되어 있다.

(실시예 8) 병용 프로모터의 일반성

실시예 7 에 있어서 DNA 엘리먼트의 평가에 사용한 벡터의 프로모터는 CMV 프로모터였지만, 다른 일반적인 프로모터와의 병용에 대해 검토를 실시했다.

(8－1) EF－1α 및 SV40 프로모터를 사용한 SEAP 발현 벡터의 구축

pSEAP2－control (Clontech) 을 주형으로, (7－1) 에 기재된 프라이머 및 KOD－plus－ 를 사용한 PCR 법 (94 ℃ 30 초, 68 ℃ 2 분 × 40 cycle) 에 의해, SEAP 유전자의 증폭을 실시했다. 증폭된 SEAP 는 (7－1) 과 동일한 방법에 의해 인서트로서 조제했다. 인서트를 제한 효소 NheI, BglII, 벡터 pIRES puro3 (clontech) 을 제한 효소 NheI, BamHI 로 처리하고, (7－1) 과 동일한 방법으로 pCMV/SEAP ires Puro 를 구축했다.

다음으로, pEF1/V5－His A (Invitorogen) 를 주형으로서, 하기 프라이머 및 KOD－plus－ 를 사용하여 PCR 법 (94 ℃ 15 초, 60 ℃ 30 초, 68 ℃ 2 분 × 30 cycle) 에 의해, EF－1α 프로모터의 증폭을 실시했다.

상기에서 구축한 pCMV/SEAP ires Puro 를 벡터로 하여, 각각을 제한 효소 SpeI, EcoRV 로 처리하고, (7－1) 에 기재된 방법에 준하여 pEF/SEAP ires Puro 의 구축을 실시했다.

마찬가지로, pcDNA 3.1 ＋ (Invitrogen) 을 주형으로, 하기 프라이머 및 KOD－plus－ 를 사용하여 PCR 법 (94 ℃ 15 초, 60 ℃ 30 초, 68 ℃ 1 분 × 30 cycle) 에 의해, SV 40 프로모터의 증폭을 실시했다.

상기에서 구축한 pCMV/SEAP ires Puro 를 벡터로 하여, 각각을 제한 효소 SpeI, EcoRV 로 처리하고, (7－1) 에 기재된 방법에 준하여 pSV40/SEAP ires Puro 의 구축을 실시했다.

(8－2) DNA 엘리먼트 A2 또는 A7 의 클로닝

(8－1) 에서 구축한 pEF/SEAP ires Puro 및 pSV40/SEAP ires Puro 를 기본 골격으로 하여, DNA 엘리먼트 A2 또는 A7 의 클로닝을 실시했다.

먼저, pEF/SEAP ires Puro 및 pSV40/SEAP ires Puro 를 제한 효소 SpeI 로 수시간 처리하고, 에탄올 침전을 실시하여, 멸균수로 용해했다. SpeI 처리한 각각의 벡터를 주형으로, 하기 프라이머 및 KOD－plus－ 를 사용하여 PCR 법 (94 ℃ 15 초, 55 ℃ 30 초, 68 ℃ 10 분 × 30 cycle) 에 의해, 형질 전환용 DNA 의 조제를 실시했다.

조제한 형질 전환용 DNA 및 pRed/ET 를 형질 전환한 BAC 를 사용하여, DNA 엘리먼트 A2, A7 를 (8－1) 에 기재된 벡터에 클로닝을 실시했다. 또한, 조작은 (7－2) 에 기재된 방법에 준하여 실시했다.

(8－3) SEAP 발현을 지표로 한 평가

숙주 세포 CHO―K1 세포 (ATCC), 유전자 도입 시약 Lipofectamine2000 (Invitrogen) 을 사용하여, (8－2) 에서 구축된 각 플라스미드의 평가를 실시했다.

유전자 도입 2 일 후부터 puromycin 8 ㎍/㎖ 에 의한 약제 선택을 약 2 주간 실시하여, 폴리클로날 안정 발현주의 구축을 실시했다. 수립된 세포주는 측정 전날에 배지 교환 후에 일정 세포수를 24 구멍 플레이트에 파종했다. 파종 24 시간 후에 배양 상청의 회수를 실시하여, SEAP 활성의 측정을 실시했다. 배양 상청 중의 SEAP 활성은, SensoLyte^TM pNPP Secreted Alkaline Phosphatase Reporter Assay (ANASPEC) 를 사용하여, 측정했다.

측정 결과를 도 6 에 나타낸다. No element 인 컨트롤의 SEAP 활성을 1 로 했을 때, DNA 엘리먼트 A2 또는 A7 은 EF－1α 프로모터와 병용함으로써 2 배 이상, SV 40 프로모터와 병용함으로써 4 배 이상의 발현 항진 효과를 나타냈다. 이로부터, 이들의 DNA 엘리먼트는 일반적인 프로모터와의 병용에 의해 외래 유전자의 발현 항진 효과를 나타내는 것이 확인되었다.

(실시예 9) 항체 발현을 지표로 한 평가

(9－1) 인간 경사슬 발현 벡터 pEF6KCL 의 구축

플라스미드 pEF6/V5－HisB (Invitrogen) 를 주형으로서 하기 프라이머 및 KOD－plus－ 를 사용하여 PCR 법을 실시함으로써, BGHpA 의 직후 (Sequence Position 2174) 부터, SmaI (Sequence Position 2958) 까지의 DNA 단편 (f1 origin of replication 및 SV 40 promoter and origin 을 포함하는 DNA 프래그먼트, 이하, 「프래그먼트 A」라고 한다. 또한, 프래그먼트 A 의 폴리뉴클레오티드 배열은 서열목록의 배열 번호 15 에 기재되어 있다.) 을 취득했다.

얻어진 프래그먼트 A 와 인간 κ 사슬 분비 시그널, 인간 κ 사슬 정상 영역 및 인간 polyA 부가 시그널을 코드하는 DNA 배열을 포함하는 DNA 프래그먼트 (이하, 「프래그먼트 B」 라고 한다) 를 오버랩 PCR 에 의해 결합했다. 얻어진 프래그먼트 A 와 프래그먼트 B 가 결합한 DNA 단편을 제한 효소 KpnI 및 SmaI 로 소화하고, 제한 효소 KpnI 및 SmaI 로 소화한 플라스미드 pEF6/V5－HisB (Invitrogen) 와 라이게이션하여, EF－1α 프로모터의 하류에 시그널 배열, 클로닝 사이트, 인간 κ 사슬 정상 영역, 및 인간 polyA 부가 시그널 배열을 가지는, 인간 경사슬 발현 벡터 pEF6KCL 을 구축했다.

상기 방법으로 얻어진 pEF6KCL 로부터 제한 효소 KpnI 및 SmaI 로 잘린 DNA 단편을, KpnI 및 SmaI 로 소화한 pEF1/myc－HisB (Invitrogen 사) 와 ligation 하여, transformation, 알칼리법, 배열 확인에 의해 플라스미드 pEF1KCL 을 구축했다.

(9－2) 인간 중사슬 발현 벡터 pEF1FCCU 의 구축

인간 IgG1 시그널 배열 및 정상 영역의 아미노산을 코드하는 DNA 배열을 포함하는 DNA 단편 (이 DNA 단편이 갖는 폴리뉴클레오티드 배열은 서열목록의 배열 번호 16 에 기재되어 있다) 을 제한 효소 NheI 및 PmeI 로 소화하고, NheI 및 PmeI 로 소화한 플라스미드 pEF1KCL 과 결합하여, EF－1α 프로모터의 하류에 시그널 배열, 클로닝 사이트, 인간 중사슬 정상 영역, 및 인간 polyA 부가 시그널 배열을 가지는 인간 중사슬 발현 벡터 pEF1FCCU 를 구축했다.

(9－3) 인간화 항체 유전자 X 발현 싱글 벡터 (인간화 항체 유전자 X/pEF＿LHN＃) 의 구축

(9－1), (9－2) 에서 구축한 L 사슬 또는 H 사슬 발현 벡터를 결합시킴으로써, 인간화 항체 발현 싱글 벡터 (pEF＿LHN (가변 영역 없음)) 의 구축을 실시했다.

pEF1KCL 의 프로모터 상류 및 polyA 의 하류까지의 유전자 발현 유닛의 양단에 PCR 법에 의해 제한 효소 SalI 사이트의 부가를 실시하고, 아가로오스 겔 전기 영동, 잘라냄, DNA 단편의 정제를 실시하고, 인서트로 했다. (9－2) 에서 구축된 pEF1FCCU 를 제한 효소 SalI 로 처리함으로써, 유전자 발현 유닛으로부터 상류에 존재하는 SalI 사이트에서 벡터를 리니어로 하고, 상기 인서트와 ligation 반응을 실시하여, transformation, 알칼리법, 배열 확인에 의해 인간화 항체 발현 싱글 벡터 (pEF＿LHN (가변 영역 없음) 의 구축을 실시했다.

다음으로, pEF＿LHN (가변 영역 없음) 의 AatII 사이트에 하기 올리고의 도입을 실시했다.

각각의 올리고를 5 pmol 에 희석하고, T4 Polynucleotide Kinase (TAKARA) 를 사용하여, 37 ℃ 에서 1 시간 반응 후, 10 × H buffer (TAKARA) 를 첨가하고, 96 ℃ 1 분, 실온 30 분의 반응에 의해 어닐링을 실시했다. 이 올리고와, 제한 효소 AatII 처리한 벡터 pEF＿LHN 을 ligation 하여, transformation, 알칼리법, 배열 확인에 의해, pEF＿LHN＃ (가변 영역 없음) 을 구축했다.

상기에서 구축한 범용 벡터 (pEF＿LHN＃ (가변 영역 없음)) 에 인간화 항체 유전자 X 의 가변 영역의 삽입을 실시함으로써, 인간화 항체 유전자 X 발현 싱글 벡터 (인간화 항체 유전자 X/pEF＿LHN＃) 의 구축을 완성시켰다.

먼저, 하기 프라이머 및 KOD－plus－ 를 사용하여 PCR 법 (94 ℃ 15 초, 55 ℃ 30 초, 68 ℃ 1 분 × 30 cycle) 에 의해, 인간화 항체 유전자 X 의 L 사슬 가변 영역의 증폭을 실시했다.

L 사슬 가변 영역 ；

증폭된 L 사슬 가변 영역 단편 및 범용 벡터 (pEF＿LHN＃ (가변 영역 없음)) 를 제한 효소 NdeI, BsiWI 처리하여, 아가로오스 겔 전기 영동에 의한 목적 단편의 잘라냄, 정제, ligation 반응, transformation, 알칼리법, 배열 확인에 의해 L 사슬 가변 영역의 삽입을 실시했다. 마찬가지로, 하기 프라이머 및 KOD－plus－ 를 사용하여 PCR 법 (94 ℃ 15 초, 55 ℃ 30 초, 68 ℃ 1 분 × 30 cycle) 에 의해, 인간화 항체 유전자 X 의 H 사슬 가변 영역의 증폭을 실시했다.

H 사슬 가변 영역 ；

증폭된 H 사슬 가변 영역 단편 및 L 사슬 가변 영역이 삽입된 벡터를 제한 효소 BlpI 로 처리하고, 아가로오스 겔 전기 영동에 의한 목적 단편의 잘라냄, 정제, ligation 반응, transformation, 알칼리법, 배열 확인에 의해 H 사슬 가변 영역의 삽입을 실시하여, 인간화 항체 유전자 X 발현 싱글 벡터 (인간화 항체 유전자 X/pEF＿LHN＃) 를 구축했다.

(9－4) 인간화 항체 유전자 X 발현 싱글 벡터 (인간화 항체 유전자 X/pCMV＿LHN＃) 의 구축

(9－3) 에서 구축한 인간화 항체 유전자 X 발현 싱글 벡터 (인간화 항체 유전자 X/pEF＿LHN＃) 를 벡터 기본 골격으로 하여, 하기 순서에 의해 프로모터의 교환을 실시하고, 인간화 항체 유전자 X 발현 싱글 벡터 (인간화 항체 유전자 X/pCMV＿LHN＃) 의 구축을 실시했다.

pIRES puro3 을 주형으로서, 하기 프라이머 및 KOD－plus－ 를 사용하여 PCR 법 (94 ℃ 30 초, 68 ℃ 3 분 × 40 cycle) 에 의해 CMV 프로모터 단편의 증폭을 실시했다.

H 사슬 상류 ；

L 사슬 상류 ；

PCR 반응 용액에 제한 효소 DpnI 를 첨가하여 37 ℃, 1 시간 반응시키고, miniElute reaction Cleanup kit (Qiagen) 에 의해 정제를 실시하여, In―Fusion 용의 샘플로 했다. 한편, 인간화 항체 유전자 X/pEF＿LHN＃ 을 제한 효소 HindIII, NheI, NdeI, FseI 로 처리하고, 아가로오스 겔 전기 영동을 실시함으로써, 단편 중에서 큰 단편 2 개의 분리를 실시했다. 겔로부터 각각을 잘라내고, 겔로부터 DNA 의 추출을 실시하여, In―Fusion 용의 샘플로 했다. 모든 IN―Fusion 용 샘플을 모아서, In―Fusion^TM Advantage PCR 클로닝 키트 (TAKARA), transformation, 알칼리법, 배열 확인에 의해, 인간화 항체 유전자 X 발현 싱글 벡터 (인간화 항체 유전자 X/pCMV＿LHN＃) 를 구축했다.

(9－5) DNA 엘리먼트 A7 의 클로닝

SEAP 의 발현 항진 효과가 확인된 5 종류의 DNA 엘리먼트 중에서 A7 을 선택하여, 항체 발현 벡터에의 클로닝을 실시했다.

(7－2) 와 동일한 방법으로, 제한 효소 NotI 처리한 인간화 항체 유전자 X 발현 싱글 벡터 (인간화 항체 유전자 X/pEF＿LHN＃, 인간화 항체 유전자 X/pCMV＿LHN＃) 각각을 주형으로서, 하기 프라이머 및 KOD－plus－ 를 사용하여 PCR 법 (94 ℃ 15 초, 55 ℃ 30 초, 68 ℃ 11 분 × 30 cycle) 에 의해, 형질 전환용 DNA 의 조제를 실시했다.

인간화 항체 유전자 X/pEF＿LHN＃ D ；

인간화 항체 유전자 X/pEF＿LHN＃ R ；

인간화 항체 유전자 X/pCMV＿LHN＃ D ；

인간화 항체 유전자 X/pEF＿LHN＃ D 를 사용.

인간화 항체 유전자 X/pCMV＿LHN＃ R ；

인간화 항체 유전자 X/pEF＿LHN＃ R 을 사용.

조제한 형질 전환용 DNA 및 pRed/ET 를 형질 전환한 BAC 를 사용하여, DNA 엘리먼트 A7 을 (9－3), (9－4) 에 기재된 인간화 항체 유전자 X 발현 싱글 벡터에 클로닝을 실시했다. 도 7 에 벡터의 개략도를 나타낸다. 또한, 조작은 (7－2) 에 기재된 방법에 준하여 실시했다.

(9－6) 항체 발현을 지표로 한 평가

숙주 세포 CHO―K1 세포 (ATCC), 유전자 도입 시약 Lipofectamine2000 (Invitrogen) 을 사용하여, (9－5) 에서 구축된 각 플라스미드의 평가를 실시했다.

유전자 도입 2 일 후부터 Geneticin (Roche) 800 ㎍/㎖ 에 의한 약제 선택을 약 2 주간 실시하여, 폴리클로날 안정 발현주의 구축을 실시했다. 수립된 세포주는, 측정 전날에 배지 교환 후, 일정 세포수를 24 구멍 플레이트에 파종하고, 파종 24 시간 후에 배양 상청의 회수를 실시하여, ELISA 법에 의해 배양 상청 중의 항체 발현량의 측정을 실시했다. 또한, ELISA 는 이하의 방법으로 실시했다. Anti－kappa Light Chain 을 50 ng/well 로 코팅한 96 구멍 플레이트에, 제(除)세포한 배양 상청 100 ㎕ 를 첨가하여, 37 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 다음으로, 샘플 (배양 상청) 을 제거하고, PBS－Tween (0.05 ％) 200 ㎕ 로 각 well 을 씻은 후, HRP 표지된 anti－human IgG(Fc) 100 ㎕ 를 well 에 첨가하고, 다시 37 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 그 후, HRP 표지된 anti－human IgG(Fc) 를 제거하고, PBS－Tween (0.05 ％) 으로 각 well 을 씻은 후, POD 기질 A. B. T. S. 키트 (nacalai) 를 사용하여 발색시켜, 측정 파장 405 nm 의 흡광도를 측정했다. anti－kappa Light Chain, anti－human IgG(Fc) 및 샘플의 희석에는 PBS－Tween (0.05 ％) 을 사용했다. 단계 희석 (12 ng, 6 ng, 3 ng, 1.5 ng, 0.75 ng, 0.375 ng, 0.1875 ng) 한 human IgG 를 스탠다드로, 샘플 농도를 산출했다.

결과를 도 8 에 나타낸다. EF－1α 프로모터 또는 CMV 프로모터를 갖는 항체 발현 벡터에 있어서, DNA 엘리먼트 A7 을 갖는 샘플은 no element 인 컨트롤보다 큰 항체 생산 항진 효과를 나타내는 것이 확인되었다.

(실시예 10) 외래 유전자 발현 항진 활성을 나타내는 배열 길이

(10－1) 배열 길이가 상이한 DNA 엘리먼트의 클로닝

실시예 7 에서 사용한 배열 길이를 기초로, 각 DNA 엘리먼트의 상이한 배열 길이를 갖는 벡터의 구축을 실시했다.

DNA 엘리먼트 A2, A7, A18, B5, C14 의 full length 를 기초로 설계한 상이한 배열 길이를 갖는 엘리먼트의 상세를 도 9, 11, 13, 15, 17 에 나타낸다. (7－1) 의 pCMV/SEAP ires Hygro 를 제한 효소 SpeI 로 수시간 처리하고, 에탄올 침전을 실시하여, 멸균수로 용해했다. SpeI 처리한 상기 벡터를 주형으로, 하기 프라이머 및 KOD－plus－ 를 사용한 PCR 법 (94 ℃ 15 초, 55 ℃ 30 초, 68 ℃ 10 분 × 30 cycle) 을 실시하여, 형질 전환용 DNA 의 조제를 실시했다. 조제한 형질 전환용 DNA 및 pRed/ET 를 형질 전환한 각각의 BAC 를 사용하여, 배열 길이가 상이한 각 DNA 엘리먼트를 (7－1) 의 pCMV/SEAP ires Hygro 에 클로닝을 실시했다. 또한, 조작은 (7－2) 에 기재된 방법에 준하여 실시했다.

각 단편의 전체 길이 배열 상의 시점과 종점은 도 20 및 도 21 에서도 나타내고 있다.

(10－2) 배열 길이가 상이한 DNA 엘리먼트의 평가

숙주 세포 CHO―K1 세포 (ATCC), 유전자 도입 시약 Lipofectamine2000 을 사용하여, (10－1) 에서 구축된 각 플라스미드의 평가를 실시했다.

(7－3) 방법과 마찬가지로, 유전자 도입 후부터 hygromycin 에 의한 약제 선택을 실시하여, 폴리클로날 안정 발현주의 수립을 실시했다. 수립된 세포주는, 측정 전날에 배지 교환 후, 일정 세포수를 24 구멍 플레이트에 파종하고, 파종 24 시간 후에 배양 상청의 회수를 실시하여, SEAP 활성의 측정을 실시했다.

측정 결과를 도 10, 12, 14, 16, 18 에 나타낸다. full length 의 DNA 엘리먼트 뿐만이 아니라, full length 보다 짧은 배열 길이를 갖는 클론에 있어서도 발현 항진 효과가 확인되었다. 이로부터, DNA 엘리먼트 A2, A7, A18, B5, C14 는 full length 에 비해 짧은 배열 길이를 갖는 경우에 있어서도 외래 유전자 발현 항진 활성을 나타내지만, 배열 길이가 full length 의 경우에 가장 큰 효과를 발휘하는 것이 확인되었다.

(실시예 11) CHO 세포 이외에서의 효과

실시예 7 ∼ 10 에 있어서의 평가 세포에는 CHO 세포가 사용되어 왔지만, CHO 세포 이외의 세포주로서 HEK293 세포를 선택했다. HEK293 세포는 10 ％ FCS 를 넣은 DMEM 배지 (Invitrogen) 를 사용하여 37 ℃, 5 ％ CO₂ 존재하에서 정치 배양을 실시하고, 유전자 도입 전날에 일정 세포수를 6 구멍 플레이트에 파종했다. (8－2) 에서 구축된 각 DNA 엘리먼트를 갖는 SEAP 발현 벡터의 평가를 실시하기 위해, 각 플라스미드 및 유전자 도입 시약 Lipofectamine2000 (Invitrogen) 을 사용하여 유전자 도입을 실시하고, 유전자 도입 2 일 후부터 hygromycin 에 의한 약제 선택을 약 2 주간 실시하여, 폴리클로날 안정 발현주의 수립을 실시했다. 수립된 세포주는 측정 전날에 배지 교환 후에 일정 세포수를 24 구멍 plate 에 파종하고, 파종 24 시간 후에 배양 상청의 회수를 실시하여, SEAP 활성의 측정을 실시했다. 배양 상청 중의 SEAP 활성은, SensoLyte^TM pNPP Secreted Alkaline Phosphatase Reporter Assay (ANASPEC) 를 사용하여, 측정했다.

측정 결과를 도 19 에 나타낸다. 실시예 3 에 있어서의 결과와 마찬가지로, 각 DNA 엘리먼트는 HEK293 세포에 있어서도 외래 유전자 (SEAP) 의 높은 발현 항진 효과를 갖는 것이 확인되었다.

산업상 이용가능성

본 발명의 프로모터를 사용한 외래 유전자 발현 유닛 또는 본 발명의 외래 유전자 발현 벡터를 포유 동물 숙주 세포에 도입함으로써, 치료용 단백질이나 항체 등의 외래 유전자의 생산성을 향상시키는 것이 가능해진다.

<110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED <120> Promoters of human genes <130> DSPCT-FP1232 <160> 16 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 2348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atttatgtat attaacagca cattaacagc taaaaagaaa aactcacata atcatattag 60 ttcatagaaa caatgcattt gacatactcc aacatccatt catgatttta ttttattttg 120 tatttatata ttttttttga gatggagtct cgctgtcacc caggctggag tgcaatggct 180 cgatctcggc tcactgcagg ctccgccccc ggcggttcac gccattctcc tgcctcagcc 240 tcccgagtag ctgggactac aggcgcccgc cacctcgccc agctaatttt ttgtattttt 300 agtagagacg gggtttcacc gtgttagcca ggatggtctc gatctcctga cctcgtgatc 360 cacccgcctc ggcctcccaa agtgctggga ttacaggcgt gagccaccgt gcccggccca 420 tgattttaaa aaaacctctc agaaatagaa acagagggaa cttcctgaat ttgattaaaa 480 atacctgcaa aatcctagag ctaatattat acttaatggt gaaagactga atggttttcc 540 cctaagatgg agaacaaggc acggatgtcc ttgctcacca ctcctattca acaaaggact 600 ggaaaccaga aataacttta attttttttt ttctcaagtg ataggttcac agagaaaaag 660 ctttactgga tgaactttta gattactact tttatagagc agcagagata aaagccaggt 720 cgaaaagtgc atgtggagta aggaaatgga cctagttcga caaaagggct cagaacgact 780 gcccagatga gattgtagac gcagctgtag tttactttct atctggaaga aacttcaagt 840 tatccttaat tttccaagga gacagtcact taccttttaa aaaacattat tagagaagca 900 ccgggcggga gcatatctag cattaaaaat gtgggatgaa taccatctct gcttggtaaa 960 ggtggttggg aatcctgaga gagggcacct agtgtggctt ctgcattttt cacagtgcct 1020 ggaccacggc tgaaagtaac tcttgcatga catttgacag aagaggaaac cgaagctcag 1080 attaaattcc ctgtccacag cgggatcatt cggcacgagt tcctccctgt ctggaatgct 1140 cttccccagc aatagatcct gcggctcttc cgtgtctcag tctaatgtca ttccgttcca 1200 ggattcccga cttcttaaag cataaataat ccctccccac cctctcattg tactgttatg 1260 taacttatta caatatgtca ttatatattt agtcatactg ctttaggtaa tgtcttctcc 1320 actgaactgt aagctccatg agggcaagag ttcagtcggt tttacttaat aattagcacc 1380 tagtacagta ctagcataga atgaaggcct cgcaattttt tttaaattta tttttagaca 1440 gggtcttgcg ctgtcgccca ggctggagtg cagtggtgca acctcggctc acggcagcct 1500 cgacctttcg gctccagcga tcctcccgcg tcggcctccg gggtagctgg gactgcaggc 1560 gcgcaccacc atgactggct aatttttttt tttttttttt tgtagacatg gggtctcgcc 1620 atgttgccca ggctggttcc tgagctcaag tgatcctcct gcctcggcct cccaaagtgc 1680 tgggattaca ggcgtgagcc tcagcgccca gccaagttag ccttttttaa acgtcctgtc 1740 tccggaggtt gccgaagttg gttttcttcg gcctccttct ctctcccagg cccagggctg 1800 ggacgaggcc ggttcccgcc tgcaacctgc actgaagacg ggaaccttgg gagccggtac 1860 cggaacgctc ggaaacggca ccaaagtacg aatcctaggg cggaaaagcg ttaccaagac 1920 actcgtcccc agagccgctt cctgggactc tctagcctcc taccgcttct cagtgatgtt 1980 ccggtttccg ccctcctcct cgcgctgttt ccgcctcttg ccttcggacg ccggattttg 2040 acgtgctctc gcgagatttg ggtctcttcc taagccggcg ctcggcaagg taggttggcg 2100 gcctgctctc cgacagaact tttcttcttg ggttgaggaa aacgcctttt ggagtcaggc 2160 cctggagggg cgagccttgc tcacagggtg gggatacagc cgattacccg ccctgtgctt 2220 tccgatggct tctgcggggc gagcggggcc tggccggggg gtgcgggcgg gagggcgagc 2280 cagcggcgcc tgcagcccgg gccgcgtaac gctgaccgct gtgccttcag ttctcccagg 2340 agaaagcc 2348 <210> 2 <211> 3345 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ctaaagtgat tcctaaagaa ttcttccctt ttatcacttc cagtaggcct ctgtgaaacc 60 aaatctacct ccgcttacaa gaaagatgct gggctggcct tctctcaaag tctttccaaa 120 cttttcttgg cattgactta gacaccctag gaatctaact tgagaaaatg ttttcattaa 180 aaaaaatctc aggaagtaaa acctcctgaa tgattactga gttgacataa atcttatgtg 240 tatattctta tcagaaaaaa agtatcttca ttttgtggga caccaattca tgtattatta 300 ttattttgag acaaagtttc gctcttgttg cccaggctgg agtgcaatgg cgcgatctcc 360 acttactgca acctccacct cctgagttca agtgattctc gtgcctcagc ctccctagta 420 gctggaacta caggcatgtg ccaccacacc cagctaattt tttgtaactt tagtagagat 480 ggggtttcac catgttggcc aggatggact cgaactcctg accacaggtg atctgcccac 540 ctcagcttcc caaagtgctg ggattacagg catgagccac cgcgcccagt cgctgggtct 600 tacagtaact ttatgtttaa cattttgagg aaatgctatt cttttccaaa gtgactgcac 660 catttcatat ttgcactagc actgtacgga cattcccatt tctctgtcct agtgagtgtg 720 aaatggtatc tcactgcagt tccagtttgt atttccctga tggctaatga tgtggatcat 780 ttcatgtgtt cattggccac agagaaatgt ctatttggat tctttaccca tttttcaatt 840 gggttatttg tctttatagg tttgttgttg ttgagacaga gtcttgctct gtcactcagg 900 ctggagtgca gtggcattat cacagctaac tgcagtctag aactgctggg ctcacgtgat 960 catcccagct cagcctctcg agtaactggg actacaggca tgcgccacca gccccagcta 1020 attattttat tttttgtaga gacagggtct tactatgttg cctaggccgg tcttgaactc 1080 ctgggctcaa gcaaatctcc cacctcagac tcccaaagta ttggaattat aggtgtgaac 1140 catagtgctc agccaatttg cacaataatc ttaaatacaa aagctaagca aaacaaatca 1200 agagcatctt taaaaactag gcagtctggg aggcaggggc tgccgtgagc cgtgagatgg 1260 cacctttgca ttccagccta ggtgacagag ggaggccctg tctaaaaaaa accaaaaacc 1320 aaaaaacaaa acaaaacaaa aaacatctag gcagtagctc gtgcccgtaa tcccagctac 1380 tcaggaggct gaggcgagag aatcgtttga gcccaggagt tcaagaccag cctgggcaac 1440 agagtgagac cccatttcta aaaaatgaac aaagaaaaac taggcagttt cgcccagtgg 1500 ttagaagcgt ggagtttgga gtcaagtctc caaatttcat cttccacata tgcaaaatgg 1560 agacaataat aggggtacgt tatagaattg tggtaggcat agtgaactcc atcgcatgtt 1620 agctgttttc gttactattt actgtctaaa ttcggtgatg aaattattag gaagtctctg 1680 tcttgttctc ttctgaccac taagaggcgc acttcggagt agaagaaacg cgggcggaaa 1740 tagcccaaaa gcggattggc ttcgacttct ggcggaagta aattcctccc tccaccaggt 1800 cttattagct cagaaagaat tccaaatttc tacgtagtcc caaggatagg tagaatacat 1860 ttctcagtcc tattcctagt tattattgtc tattaaaaca tgtatactca gaatttttgc 1920 ggcattattt tttgacgtgt ctttatttta tttaaaagag ccggagccgg aagtgcttgc 1980 ctttttccct gctaggaccc aggggttacg acccatcagc ccttgcgcgc caccgtccct 2040 tctctcttcc tcggcgctgc ctacggaggt ggcagccatc tccttctcgg taagtgttaa 2100 tccgtggcaa tccgcattcc tgcgggattc atctggcccc gtcgcccagt ggtgcggagg 2160 cctccccttc agcgcggtag tgtctgtggg tattgttatt gtcagcttac tggagcgtgt 2220 acaggaacag aacgaagccg ccgagttgat agggctttgc gtcccagagc ctcctgccct 2280 ccgcctgtat tcagagctgc gggctgcttg tttgttcctt ggcggtggag ggtgctagtt 2340 gaggccagac ttcggggtct cctgggggcc gtgggacgac caggggtggc ccagcttgac 2400 agctttcagc tgggatctgt ggatcccagc gctcaccaat gtcggcccac gtgtattcgt 2460 tcatgccatg gccggcttct tccgctgcag tctctggccc gagggctgct gctgcgggac 2520 cgccaaggaa 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<213> Homo sapiens <400> 3 atggtggcac aatcatggtt cactgcagcc tcaaacttct aggctcaagt gatcctccag 60 cctcagcctc ctgagtaggt gggactaaag gtgtgtgcta caacacctgg ctaattaaaa 120 aaaaaaaatt tgtagagatg ggcgtctcgc tatgttgccc aggctgatct ttaactacag 180 gtctcagtga tctttctgta tcagcctccc gaagtgctag gattaacagg catgggccac 240 tgtacctggc tgtctttgaa gtttttaata agattgccat atctctctca agactgatca 300 agaaaaaatg caaatacaaa tttaaagaga gggaaaaata gtattatgga actgggttaa 360 gtaccttaag ggaaaactac aacaatgaga ccactattct tatctacttg ggtgggggaa 420 ggcacggaca gagacgtaaa caacagcata gtgtgccaag ggctcccatc tcctgttctc 480 ttctgctctg caaagtctct cttaaaatat agagaacata ttgcaagtaa atacattcat 540 tagtgcattt attcaaaaac cacatttgtc tctctatgca agcttccatc tcaatgcctg 600 gcacagagac gaaaaggatt tcagaggaca aaaatcaaag gactggaaag gagggaagta 660 gctgatgaca aggtcggggg agaagcagct atttgagagt gagcagaggg aaggatataa 720 ccagagcctt ccatctggtg ttgtgacaaa gatggcagtg atgtgaggct tgatagaatc 780 aataggcctc acagttcaag acagactaca tgccctcagt cacttgcctg ctttcttggt 840 ttgctagatg gattagaaat actagaagga aagttgagtg ggtactggga tatcctatcc 900 aaatcctctc ttctggggca atgcagctgc ctcacagcaa ccacgttgtg gatcacctga 960 ccccgccttt ctcagcttcc tggaggtgca ttctaagagc gctccccata agccaacact 1020 caagtctctt cgaggtgtgt ttccagggag cctgatctaa gattaaaaac ttaaaggccc 1080 cttttagaat tgtcttttac agcccaggca aagagttctt tactttttta gaggtcatga 1140 atccctttga caaggtgatg aaagccaggg accctcttct cagaaaaata cacacgtgcg 1200 cttaatgtaa aattttacat actgttttaa aggttaaact ttaccaccca tgaaaagcct 1260 caagtagttc tttgtacata atcataagat tagcaaccat ttactgagca cttcctctct 1320 ataagaccct gtgctaagtg ctttaacttc ataatgcctt tgatcatgac ataacatggc 1380 acggtagttc ctaatatctt ccttttagag atttaagggc ttgctcaaag taacatagct 1440 aataattagc agacactgga ttaaaatccc aatttgtttg taaagcttgt gctctgaata 1500 aatgacaagg aaagagaagg gaaggttgaa gaagggaagg ttcttgaagg tccctggtcc 1560 ttgaaggtcc cttaaccata aatgtcaaga gttgggattt aaacccaggt ctaacgccag 1620 agctggcgcc ctttagatta aaagtgcagt gtccatgaca acgaaagaag 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ctcctggccc tggaagttgc cactccagtg cccaccagcc ttgtcctaat 540 aaaattaagt tgcatcattt tgtctgacta ggtgtccttc tataatatta tggggtggag 600 gggggtggta tggagcaagg ggcaagttgg gaagacaacc tgtagggcct gcggggtcta 660 ttgggaacca agctggagtg cagtggcaca atcttggctc actgcaatct ccgcctcctg 720 ggttcaagcg attctcctgc ctcagcctcc cgagttgttg ggattccagg catgcatgac 780 caggctcacc taatttttgt ttttttggta gagacggggt ttcaccatat tggccaggct 840 ggtctccaac tcctaatctc aggtgatcta cccaccttgg cctcccaaat tgctgggatt 900 acaggcgtga accactgctc cacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg 960 tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt 1020 tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc 1080 tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg 1140 gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 1200 agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct 1260 cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg 1320 agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt aattctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg 1380 tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc 1440 agcaaccagg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca 1500 tctcaattag tcagcaacca tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc 1560 gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc 1620 cgaggccgcc tctgcctctg agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct 1680 aggcttttgc aaaaagctcc cggg 1704 <210> 16 <211> 1120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human IgG1 signal + human IgG1 constant <400> 16 tgctagcgcc accatgaaac acctgtggtt cttcctcctg ctggtggcag ctcccagatg 60 ggtgctgagc caggtgcaat tgtgcaggcg gttagctcag cctccaccaa gggcccaagc 120 gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctggcg gcacagccgc cctgggctgc 180 ctggtcaagg actacttccc cgaacccgtg accgtgagct ggaactcagg cgccctgacc 240 agcggcgtgc acaccttccc cgctgtcctg cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 300 gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 360 aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagccca aatcttgtga caaaactcac 420 acatgcccac cctgcccagc acctgaactc ctggggggac cctcagtctt cctcttcccc 480 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 540 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 600 cataatgcca agacaaagcc ccgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg ggtggtcagc 660 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 720 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg ccagccccgg 780 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 840 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 900 ggccagcccg agaacaacta caagaccacc cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 960 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcagggcaa cgtcttctca 1020 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacaccc agaagagcct ctccctgtct 1080 cccggcaaat gagatatcgg gcccgtttaa acgggtggca 1120

Claims

서열목록의 배열 번호 1 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
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제 1 항에 기재된 폴리뉴클레오티드, 외래 유전자 및 전사 터미네이터 영역을 포함하는 외래 유전자 발현 유닛.
제 5 항에 있어서,
외래 유전자가 다량체 단백질을 코드하는 유전자인 외래 유전자 발현 유닛.
제 5 항에 있어서,
외래 유전자가 헤테로 다량체 단백질을 코드하는 유전자인 외래 유전자 발현 유닛.
제 5 항에 있어서,
외래 유전자가 항체 또는 그 기능성 단편을 코드하는 유전자인 외래 유전자 발현 유닛.
제 5 항에 기재된 외래 유전자 발현 유닛을 포함하는 외래 유전자 발현 벡터.
제 5 항에 기재된 외래 유전자 발현 유닛 및 하기 A 군의 (1) 내지 (7) 에 기재된 폴리뉴클레오티드에서 선택되는 어느 1 개 또는 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 외래 유전자 발현 벡터.
A 군
(1) 서열목록의 배열 번호 10 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
(2) 서열목록의 배열 번호 11 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
(3) 서열목록의 배열 번호 12 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
(4) 서열목록의 배열 번호 13 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
(5) 서열목록의 배열 번호 14 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
(6) 서열목록의 배열 번호 10 내지 14 중 어느 한 항에 기재된 뉴클레오티드 배열 중 적어도 3000 개의 연속되는 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
(7) 서열목록의 배열 번호 10 내지 14 중 어느 한 항에 기재된 뉴클레오티드 배열 중 적어도 2000 개의 연속되는 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제 9 항에 기재된 외래 유전자 발현 벡터가 도입된 형질 전환 세포.
제 9 항에 기재된 외래 유전자 발현 벡터와 엘리먼트 벡터가 도입된 형질 전환 세포.
제 11 항에 있어서,
세포가 포유 동물 유래의 배양 세포인 형질 전환 세포.
제 13 항에 있어서,
포유 동물 유래의 배양 세포가 COS－1 세포, 293 세포, 또는 CHO 세포인 형질 전환 세포.
제 11 항에 기재된 형질 전환 세포를 배양하여, 배양물로부터 외래 유전자 유래의 단백질을 취득하는 것을 특징으로 하는, 외래 유전자 유래의 단백질의 제조 방법.
제 1 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 외래 유전자 발현 유닛으로서, 상기 폴리뉴클레오티드의 배열이 형질 전환 세포에 있어서 외래 유전자를 발현시키는데 사용되는 외래 유전자 발현 유닛.
제 9 항에 있어서,
외래 유전자 발현 벡터가 형질 전환 세포에 있어서 외래 유전자를 발현시키는데 사용되는 외래 유전자 발현 벡터.
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