ES2665493T3 - Nuevos promotores de la beta-actina y rpS21, y sus usos - Google Patents

Nuevos promotores de la beta-actina y rpS21, y sus usos Download PDF

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Abstract

Un promotor de rpS21 aislado que tiene la secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO: 39, o una variante de la misma que tiene actividad promotora, en el que la identidad de la variante y de la SEC ID NO: 39 es de al menos 95% a lo largo de toda la longitud de la SEC ID NO: 39.

Description

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dirección 3’ del sitio para insertar un ácido nucleico heterólogo. Los vectores que comprenden promotores de la invención también pueden contener elementos de ADN procariotas para la replicación bacteriana, y un marcador de selección por antibióticos para el crecimiento y selección del vector en células bacterianas, y elementos de ADN adicionales que controlan el procesamiento de transcritos, tales como, por ejemplo, señales de terminación. Los vectores pueden contener además secuencias de ADN para dirigir la secreción de una proteína fuera de las células hospedantes.
En ciertas realizaciones, un vector que contiene una secuencia promotora de la invención es un vector bicistrónico. Se diseñan vectores bicistrónicos de manera que dos ácidos nucleicos se puedan transcribir para producir un único transcrito. Tal transcrito contiene habitualmente una primera porción que es traducida en una proteína, y una segunda porción traducida en una segunda proteína. Una proteína puede ser una proteína de interés, tal como una proteína terapéutica, y una segunda proteína se puede usar como un marcador seleccionable. Los vectores bicistrónicos contienen habitualmente un promotor y un sitio interno de entrada al ribosoma o IRES situado entre dos ácidos nucleicos. Esto permite la transcripción de los dos ácidos nucleicos como un único ARNm bicistrónico. De esta manera, se puede construir un vector que incluye un promotor de -actina de la presente descripción, o una variante del mismo, y un IRES entre dos ácidos nucleicos heterólogos. Un vector bicistrónico que contiene un promotor de -actina de la presente descripción, o una variante del mismo, se puede usar para expresar una proteína terapéutica tal como, por ejemplo, esfingomielinasa ácida o -glucosidasa, junto con un gen informador.
La presente descripción proporciona además ensayos para identificar aquellas variantes de promotores de -actina y de rpS21 de la presente descripción que tienen actividad promotora. Por ejemplo, un promotor de la invención o variante del mismo se inserta en un vector adecuado en dirección 5’ de un gen informador, y la expresión del gen informador se usa como un determinante de la actividad promotora. Por ejemplo, para la identificación de variantes de promotores de la invención que tienen actividad promotora, tal variante se clona en dirección 5’ de un gen informador. Un gen informador puede codificar una enzima que cataliza una reacción que produce una señal visualmente detectable. Los ejemplos de tales genes informadores incluyen -galactosidasa y luciferasa. Los ejemplos de otros genes informadores incluyen fosfatasa alcalina, nopalina sintasa, octopina sintasa, glucoronidasa, cloranfenicol acetiltransferasa. En los Ejemplos expuestos más abajo, un gen informador que codifica una proteína fluorescente roja (RFP) de Discosoma striata se usa para medir la actividad promotora. Los expertos en la técnica, sin embargo, pueden usar cualquier gen informador y técnica de ensayo adecuados para determinar la actividad promotora. La expresión de un gen informador a partir del promotor se puede evaluar en un sistema de expresión in vitro, o puede ser intracelular (por ejemplo, in vivo).
La invención proporciona además células hospedantes que se han transfectado con un vector de la invención que comprende un promotor ligado operablemente a un gen heterólogo. Tal célula hospedante puede ser una célula procariota o una célula eucariota. Las células hospedantes pueden ser células en cultivo, o pueden estar presentes en un animal no humano. Los ejemplos de células hospedantes en cultivo incluyen, pero no se limitan a, células HeLa, células CHO, NS0, células HEK, células BHK, NIH-3T3, células MDCK, y células COS. Las células hospedantes en cultivo se pueden hacer crecer en suspensión o en microportadores, como se describe en los Ejemplos.
Para introducir ácidos nucleicos de la invención en una célula hospedante, se pueden usar muchos métodos adecuados. Los vectores que comprenden secuencias promotoras de la invención se pueden introducir en células procariotas o eucariotas. Los ejemplos de técnicas que se pueden usar para la introducción de ácidos nucleicos en células eucariotas incluyen, por ejemplo, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediante DEAE-dextrano, electroporación, transfección mediada por liposomas, transducción usando vectores víricos, etc.
Para la producción de proteínas usando promotores de la invención, se pueden emplear muchos sistemas de expresión adecuados. Uno de tales sistemas de expresión emplea un gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) que se introduce en el vector que comprende un promotor de la invención o una variante del mismo ligado operablemente a un ácido nucleico heterólogo. Como alternativa, un vector de expresión que expresa DHFR se puede cotransfectar en la célula hospedante, si se usa para la expresión una célula deficiente en DHFR. Cuando se aplican concentraciones crecientes de metotrexato (MTX), un inhibidor competitivo de la enzima esencial DHFR, a las células transfectadas, solamente sobreviven las células con mayores niveles de expresión de DHFR. A medida que se incrementan adicionalmente los niveles de MTX, solamente sobreviven las células que amplifican el número de copias del gen de DHFR. De esta manera, incrementando el número de copias del vector que comprende el promotor, se puede lograr una mayor expresión del ácido nucleico heterólogo, conduciendo de ese modo a mayor producción de proteína. Un segundo sistema de expresión emplea un gen de glutamina sintetasa (GS) que se introduce en el vector que comprende un promotor de la invención o una variante del mismo ligado operablemente a un ácido nucleico heterólogo. La adición de un inhibidor competitivo de GS, por ejemplo metionina sulfoximina (MSX), se usa para incrementar el número de copias del vector que conduce a una mayor producción de proteína.
Cualquier sistema para la expresión de proteínas usando promotores de la invención, se puede usar cualquier sistema de expresión procariota o eucariota adecuado. Los ejemplos de sistemas de expresión incluyen, pero no se limitan a, sistemas de expresión vegetales, de baculovirus, de levadura, bacterianos, de Drosophila, de mamíferos, y sistemas de expresión libres de células. Los métodos estándar para introducir vectores de expresión en células de
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Para la transfección transitoria, se colocaron células CHO-K1 en placas de 6 pocillos en medio 925 con 10% de suero fetal bovino (FBS) (Invitrogen). Las células se hicieron crecer hasta 50-75% de confluencia antes de la transfección usando Lipofectamine™ (Invitrogen). El plásmido pDsRED-1 (Clontech, Palo Alto, CA) se cotransfectó con el plásmido pSV40-CD20, que codifica un marcador CD20 de la superficie celular usado para identificar células transfectadas. Este plásmido pDsRED-1 codifica una proteína fluorescente roja (RFP) de Discosoma striata, cuya expresión se puede detectar mediante FACS. Las transfecciones se llevaron a cabo según las instrucciones del fabricante. De forma breve, las células se incubaron con complejos de lípido-ADN durante 16 h en medio Opti-MEM™ libre de suero (Invitrogen). El medio se renovó con medio 925 con 10% de FBS, y las células se cosecharon 48 horas después de la transfección.
D. Análisis de clasificación celular activada por fluorescencia
Para el análisis de FACS, 1 x 106 células se tripsinizaron y se lavaron con PBS fría que contiene 2% de FBS. Las células se incubaron subsiguientemente con un anticuerpo anti-CD20 marcado con FITC (Pharmingen, San Diego, CA) durante 30 minutos en hielo. Las células se lavaron entonces con PBS fría que contiene 2% de FBS, y se resuspendieron en 1 ml de PBS frío/2% de FBS. El análisis de FACS se llevó a cabo usando FACSCalibur™ (BD Biosciences, San Diego, CA). Todos los sucesos positivos para CD20 se evaluaron en busca de la intensidad de fluorescencia media de la proteína fluorescente roja, para evaluar la potencia del promotor.
E. Ensayo de ASM
Se incubaron a 37ºC medios de células transfectadas con un vector que codifica esfingomielinasa ácida (ASM) con el sustrato sintético 2-(N-hexadecanoilamino)-4-nitrofenilfosforilcloro (Calbiochem, San Diego, CA) a la concentración de 12,5 mM en acetato de sodio 250 mM, pH 5,5, que contiene acetato de cinc 0,1 mM, seroalbúmina bovina (BSA) 0,25 mg/ml, y Tween 20 al 0,15%. Las reacciones se detuvieron mediante adición de 0,2 M de glicina-NaOH que contiene 50% de etanol. La actividad o cantidad de ASM se midió mediante la cantidad de 2-(Nhexadecanoilamino)-4-nitrofenolato producida, usando un ensayo colorimétrico midiendo la densidad óptica a 415 nm.
F. Ensayo de GAA
Se incubaron a 37ºC medios procedentes de células transfectadas con un vector que codifica -glucosidasa (GAA) con el sustrato sintético p-nitrofenil-D--glucopiranósido (Sigma, St. Louis, MO) a una concentración de 40 mM en acetato de sodio 50 mM, pH 4,3, que contiene seroalbúmina bovina (BSA) al 0,1%. Las reacciones se detuvieron mediante adición de glicina 0,3 M, pH 10,6. La actividad o cantidad de GAA se midió mediante la cantidad de pnitrofenilo producida, usando un ensayo colorimétrico midiendo la densidad óptica a 400 nm.
Ejemplo 1: Identificación del promotor de -actina en células CHO-K1
Se usó el Análisis en Serie de Expresión Génica (SAGE) para analizar todo el perfil de transcripción de células CHO-K1 que se hicieron crecer en cultivo de agitación perfundido libre de suero.
La primera etapa en SAGE implicó la síntesis de ADN bicatenario a partir de ARNm aislado de células CHO-K1 usando técnicas estándar. El ADNc se escindió subsiguientemente con la endonucleasa de restricción NlaIII, también denominada una enzima de anclaje, que se espera que escinda la mayoría de los transcritos al menos una vez. La porción de 3’ de cada ADNc escindido se aisló mediante unión a perlas de estreptavidina. El conjunto de ADNc se dividió entonces a la mitad y se ligó vía el anclaje del sitio de restricción a un ligador que contiene un sitio de endonucleasa de restricción de tipo II (por ejemplo, FokI). Las endonucleasas de restricción de tipo II escinden a una distancia definida hasta 20 pares de bases lejos de sus sitios de reconocimiento asimétricos. La enzima de tipo II se denomina típicamente una enzima etiquetadora. La escisión del producto de ligación con la enzima etiquetadora da como resultado la liberación de un ligador con trozos cortos del ADNc. Una combinación de las enzimas de anclaje y etiquetadoras produce una etiqueta de 10 pares de bases que es única para un gen.
Usando este enfoque, se representaron etiquetas de secuencias para cada gen mediante el sitio NlaIII mayoritariamente 3’ seguido de una secuencia de 10 pb única. En los casos en los que las etiquetas no se pudieron asignar a genes conocidos, un ADNc de biblioteca de SAGE se amplificó mediante PCR usando la etiqueta de SAGE y un cebador directo M13 usado habitualmente (GTTTTCCCAGTCACGAC, SEC ID NO:18). Los productos de la PCR se clonaron subsiguientemente en el vector pCR2.1 (Invitrogen) y se secuenciaron usando técnicas estándar. La identificación de los genes se basó en la homología de la secuencia de productos de PCR con secuencias conocidas en GenBank® (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank).
Se llevó a cabo un alineamiento de BLAST® (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) de secuencias nucleotídicas con sus contrapartes de ratón y/o rata para identificar el gen a partir del que se obtuvo la etiqueta. De las dieciséis etiquetas más abundantes identificadas en este análisis (Tabla 2), se identificó los genes para todas las etiquetas menos una. De los quince genes identificados, cinco tuvieron origen mitocondrial, y tres fueron elementos repetitivos nucleares. La aparición de múltiples copias de estos genes en cada célula fue la causa probable de su abundancia en el resultado de SAGE. Tales secuencias no se consideraron para una evaluación posterior.
TABLA 2
Abundancia
Etiqueta Gen SEC ID NO: Identificado
38
CATGGAAGCAGAAT Repetición Alu 19 J00052
33
CATGCAGGAGCTTC COX I Mito 20 PCR
27
CATGGGGGAGCGTT Proteína ribosómica S21 21 PCR
27
CATGGTACTGACAC COX III Mito 22 PCR
20
CATGGCCTCCAAGG GAPDH 23 X52123
20
CATGATAATACGTA ATPasa 6 Mito 24 M14311
19
CATGCCTTTAATCC Repetición B-1 25 PCR
18
CATGAATCGGAGGC Citocromo B Mito 26 J01436
18
CATGAGGCAGACAG EF-1 27 D00522
18
CATGGCGGCAGACG Galectina (L-14) 28 M96676
16
CATGGTGGCTCACA Repetición Alu 29 J00056
15
CATGTTGGCTGCCG Cadena pesada de ferritina 30 M99692
14
CATGCCCTGTGCCG Ninguna coincidencia 31
13
CATGAGAGCGAAGT Proteína ribosómica L41 32 X82550
13
CATGAGGAGGCCTA NADH deshidrogenasa mitocondrial 33 PCR
12
CATGCCCTGAGTCC -Actina 34 AF014363
Usando este enfoque, los promotores de cuatro genes se identificaron como los más activos en células CHO-K1. Estos promotores fueron: -actina, proteína ribosómica S21 (rpS21), factor de alargamiento 1 (EF-1), y 5 gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). Los niveles elevados de estos ARNm en células CHO-K1 podrían ser debido a la actividad promotora de sus promotores respectivos, o debido a la estabilidad innata de los ARNm. Aunque el análisis de SAGE proporciona una cuantificación de los niveles globales en el estado estacionario para los ARNm para genes, no distingue entre actividad promotora del gen y estabilidad del ARNm como la base de la expresión elevada del ARNm. De este modo, a fin de distinguir entre las dos posibilidades, se midió la semivida
10 de los ARNm. De forma breve, la expresión de los genes candidatos se evaluó mediante análisis de transferencia Northern de células CHO-K1 en cultivos con agitación en puntos variables tras el tratamiento de células con actinomicina D.
Inicialmente, se analizaron los genes de rpS21, GAPDH y EF-1, y se encontró que todos ellos tienen ARNm relativamente estables con semividas mayores que 8 horas. Estos resultados sugieren que la mayor abundancia de
15 estos ARNm resultó de la mayor estabilidad de los ARNm y no necesariamente mayores actividades de los promotores respectivos.
También se midió mediante análisis de transferencia Northern la semivida de los ARNm de galectina, ferritina, y actina, como se describe anteriormente, a 0, 4, 8, 10, y 15 horas después del tratamiento de las células con actinomicina D. En la Figura 6A se muestra una transferencia Northern representativa. Los niveles de ARNm 20 relativos se representan gráficamente en la Figura 6B. Estos datos muestran que aunque tanto galectina como ferritina tuvieron semividas mayores que 8 horas, el ARNm de -actina se dio la vuelta más rápidamente, con una semivida de aproximadamente 6 horas. De este modo, la contribución relativa de la potencia del promotor a los niveles de ARNm globales en el estado estacionario fue mayor para -actina que para los otros candidatos en células CHO-K1. En consecuencia, en estas condiciones, el promotor de -actina se puede caracterizar como un
25 promotor fuerte.
Ejemplo 2: Aislamiento y caracterización de promotores de -actina y de rpS21 de hámster
A la luz de los resultados descritos en el Ejemplo 1, para el estudio posterior, se seleccionó el candidato con la mayor abundancia (rpS21) y aquel con el recambio de ARNm más rápido (-actina). Para aislar ADN genómicos para promotores de -actina de hámster y de rpS21, se identificó una biblioteca genómica CHO-K1 en  FIX II
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(Stratagene, La Jolla, CA).
A fin de aislar los clones genómicos de -actina y rpS21, las cepas bacterianas de E. coli XL1-Blue MRA (P2) se hicieron crecer en medio LB que contiene sulfato de magnesio 10 mM y maltosa al 0,2%. Las células bacterianas se peletizaron y se resuspendieron en sulfato de magnesio 10 mM a una lectura de absorbancia de 0,5 a 600 nm. Se incubaron aproximadamente un millón de fagos de la biblioteca con las células bacterianas durante 15 minutos a 37ºC. Se añadió agarosa fundida a la mezcla de fagos/bacterias, y las bacterias se recubrieron sobre placas BioAssay que contienen agar (Nunc, Rochester, NY). Tras el endurecimiento de la agarosa superior, las placas se invirtieron y se hicieron crecer a 30ºC toda la noche. Las placas se enfriaron subsiguientemente y se cubrieron dos veces con filtros de nailon Genescreen Plus™ (Perkin Elmer Life Sciences, Wellesley, MA). Los filtros de nailon se desnaturalizaron durante 2 minutos en hidróxido de sodio 0,1 M con cloruro de sodio 1,5 M, y se neutralizaron subsiguientemente. Los filtros se reticularon mediante UV y se sondaron.
Una sonda usada para el aislamiento del promotor de -actina de hámster se obtuvo mediante PCR aleatoria a partir del extremo 5’ del gen de -actina (nt 238-381 de nº de acceso GenBank® U20114). Una sonda usada para el aislamiento del promotor de rpS21 de hámster se obtuvo mediante PCR usando los cebadores expuestos en SEC ID NOs:12 y 13. El fago hibridante para ambos promotores de -actina y rpS21 se purificaron usando técnicas estándar. El ADN del fago aislado a partir de los lisados de fago se purificó mediante extracciones secuenciales con cloroformo, fenol, fenol/cloroformo (1:1), y finalmente, cloroformo.
Para el aislamiento de promotores del gen de -actina de hámster, tras la precipitación con etanol, se digirió ADN con enzimas de restricción que tuvieron sitios en la porción 5’ del gen de -actina de hámster, y se sometió a transferencia Southern usando la misma sonda que se usó para identificar la genoteca.
Usando este enfoque, se generó un fragmento de AvrlI de aproximadamente 7 kb y un fragmento de SalI de aproximadamente 5,5 kb, los cuales se hibridaron a la sonda. Estos se clonaron subsiguientemente con el plásmido pBluescript II KS (Stratagene). El fragmento de AvrlI de 7 kb tiene el número de referencia ATCC PTA-5309, depositado el 3 de julio de 2003 en la American Tissue Culture Collection, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108,
U.S.A.
Los plásmidos que contienen los fragmentos de AvrlI y SalI se digirieron con SfoI para eliminar el extremo 3’ de los fragmentos que contenían una porción del marco de lectura abierto del gen de -actina. Estos fragmentos se clonaron entonces en el plásmido pDsRED-1 (Clontech) para crear los constructos denominados pDsRED-Avr (6,5 kb) y pDsRED-Avr (5,1 kb). A fin de generar un constructo que contiene todo el intrón 1 del gen de -actina, se llevó a cabo la PCR usando los siguientes cebadores:
Directo: AGGCCCAGCTTGGGACCAAGACAGAA (SEC ID NO:35)
Inverso: CGCGGATCCGGCGAACTATATCAGGGC (SEC ID NO:36).
El fragmento de la PCR generó dos productos: un producto predilecto de aproximadamente 7 kb, y un producto de 3 kb inesperado más pequeño. Estos dos productos de la PCR se clonaron en el plásmido pDsRED-1 (Clontech) para generar los constructos pDsRED-Avr(1)-7 y pDsRED-Avr(1)-3.
Cada uno de los fragmentos del promotor de -actina de hámster que se clonó en el plásmido pDsRED-1 (Clontech) se transfectó en células CHO-K1. Las potencias relativas de los promotores de cada uno de los fragmentos del promotor de -actina de hámster se midieron usando FACS como se describió anteriormente. Los resultados de los ensayos de actividad se resumen más abajo.
El fragmento de Avr(1)-3 del promotor de -actina que abarca desde nt -1970 hasta nt +1037 mostró la mayor actividad promotora. El fragmento de Avr(1)-7 que abarca desde nt -6000 hasta nt +1037 mostró una actividad que fue 47% de la actividad mostrada por Avr(1)-3. Los fragmentos de Avr (6,5 Kb), Sal (5,1Kb), actina (3 kb), y actina-P (2,8 kb) mostraron solamente 2%, 2%, 2%, y 0% de actividad promotora, respectivamente, en comparación con el fragmento de Avr(1)-3.
El fragmento de Avr(1)-3 se secuenció subsiguientemente, y la secuencia se expone en SEC ID NO:1. Adicionalmente, también se secuenció la región de 660 nt en dirección 5’ de fragmento de Avr(1) 3. Esta secuencia más larga desde nt -2622 hasta nt +1037 se expone en SEC ID NO:7.
Para el aislamiento del promotor de rpS21, tras el aislamiento de ADN del fago hibridante, se amplificó el ADN mediante PCR usando los siguientes cebadores:
Directo: AGCTCTAATACGACTCACTATAGGGC (SEC ID NO:40)
Inverso: CTCTAGGCCAGCGGAGCGCAG (SEC ID NO:41).
El producto de la PCR se clonó en el vector PCR2.1 (Invitrogen) y se secuenció subsiguientemente. La secuencia nucleotídica del promotor de rpS21 de hámster se expone en SEC ID NO:39. El promotor se cortó usando sitios de
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EcoRI que flanquean a los sitios de clonación, y se clonó en el vector pDsRED1-1 (Clontech).
Ejemplo 3: Comparación funcional de los promotores de -actina de hámster y de CMV
La actividad promotora de Avr (1)-3 se comparó con la del promotor temprano inmediato de CMV (Invitrogen) y el promotor de EF-1 humano (Invivogen).
Células CHO-K1 se transfectaron transitoriamente con el plásmido pDsRED-1 que contiene Avr (1)-3, el promotor temprano inmediato de CMV en dirección 5’, o el promotor de EF-1 humano, cada uno ligado operablemente al gen de RFP. La expresión de RFP se evaluó mediante FACS 48 horas después de la transfección.
Como se muestra en la Figura 7A, en células transfectadas con Avr (1)-3, la secuencia del promotor de -actina (SEC ID NO:1) mostró un mayor nivel de expresión de RFP en comparación con cualquiera de los promotores de CMV o de EF-1. En particular, la expresión fue aproximadamente dos veces mayor con Avr (1)-3 que con el promotor de CMV.
A fin de determinar si este perfil de expresión observado es sostenible en transfectantes estables, células CHO-K1 transfectadas se seleccionaron durante dos semanas con G418™. Entonces se evaluó la expresión de RFP en los conjuntos supervivientes de células. Como se representa en la Figura 7B, de forma similar a las células transfectadas transitoriamente, la expresión de RFP más elevada se observó en células transfectadas con Avr(1)-3, la secuencia del promotor de -actina expuesta en SEC ID NO:1.
Ejemplo 4: Actividad del promotor de -actina de hámster en células BHK-21 y HEK293
La actividad del promotor de -actina de hámster se comparó con la del promotor de CMV en células BHK-21 (ATCC nº CCL 10) y HEK293 (ATCC nº CRL-1573) usando ensayos de transfección estable como se describe en el Ejemplo 3. Como se observa previamente en células CHO-K1, la expresión de RFP en células BHK-21 fue significativamente mayor cuando se usa el promotor de -actina en lugar del promotor de CMV (Tabla 3). En células HEK293, el promotor de -actina de hámster dio como resultado expresión de RFP a niveles aproximadamente equivalentes a los del promotor de CMV.
TABLA 3
Estirpe celular
Promotor de CMV Promotor de -actina
BHK-21
8,3 ± 0,4 121 ± 99,8
HEK293
139 ± 9,9 102 ± 8,3
Ejemplo 5: Promotores de -actina de rata y de ratón
Se investigaron bases de datos públicamente disponibles de secuencias nucleotídicas usando ajustes por defecto en busca de homólogos potenciales de la secuencia del promotor de -actina de hámster expuesta en SEC ID NO:1.
La porción 5’ de un gen de -actina de hámster (nº de acceso GenBank® U21104; SEC ID NO:4) exhibe 98% de identidad con la porción 3’ de la secuencia del promotor de -actina de hámster. Sin embargo, esta homología es solamente 40% a lo largo de toda la longitud de la secuencia del promotor de -actina de hámster expuesta en SEC ID NO:1. No se conoce ninguna actividad promotora para esta porción.
Los promotores de -actina previamente conocidos, humano (nº de acceso GenBank® gi28337A) y de pollo (nº de acceso GenBank® gi2170437), se alinearon con el promotor de -actina de hámster para la determinación de la homología con el programa BLAST® usando los ajustes por defecto. Las secuencias del promotor de -actina humano y de pollo tuvieron solamente 10% y 1% de identidad, respectivamente, con el promotor de -actina de hámster (SEC ID NO:1).
Se identificó un supercóntigo genómico de rata (Rattus norvegcus) (nº de acceso GenBank® NW_042778) en el cromosoma 12 del genoma de rata por contener una secuencia nucleotídica que tiene un 67% de identidad a lo largo de toda la longitud de SEC ID NO:1.
De forma similar, se identificó un cóntigo (nº de acceso GenBank® NT_039324) en el cromosoma 5 del genoma de ratón (Mus musculus) por tener una identidad de 80% a lo largo de toda la longitud de SEC ID NO:1.
Los alineamientos de secuencias de la secuencia del promotor de -actina de hámster (SEC ID NO:1) con la secuencia del gen de hámster, y promotores de -actina de ser humano, pollo, rata y ratón se representan en las Figuras 3, 4, 5, 1, y 2, respectivamente.
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Ejemplo 6: Actividades de los promotores de -actina de rata y de ratón
Las secuencias de los promotores de rata y de ratón expuestas en SEC ID NOs:2 y 3, respectivamente, se clonaron en el plásmido pDsRED-1 (Clontech). El promotor de CMV también se clonó en dirección 5’ del gen de RFP en el plásmido pDsRED-1. Estos plásmidos se transfectan en célula CHO-K1, u otra estirpe celular. La expresión de la RFP se evalúa mediante FACS 48 horas después de la transfección.
Se espera que las células transfectadas con el promotor de -actina de rata o de ratón muestren una expresión de RFP mayor que el promotor de CMV en condiciones similares.
Ejemplo 7: Expresión de proteínas usando promotor de -actina de hámster
Para evaluar adicionalmente la actividad del promotor de -actina de hámster, se usó un sistema de expresión que utiliza selección mediante dihidrofolato reductasa (DHFR) y amplificación mediante metotrexato (MTX). El vector pGZ6 se derivó del plásmido pCLHAXSV2DHFR para contener el promotor de -actina de hámster de 3 kb (SEC ID NO:1) además de un gen de DHFR bajo el control del promotor temprano de SV40. El plásmido pCLHAXSV2DHFR se ha descrito previamente por Cole et al. (1993) Biotechnology, 11:1014-1024. De forma breve, el promotor de metalotionina (MT) en el vector pCLHAXSV2DHFR se sustituyó por el promotor de -actina para crear el vector pGZ6. Los ADNc para dos proteínas de interés terapéutico, esfingomielinasa ácida (ASM) y -glucosidasa (GAA), se ligaron operablemente al promotor de -actina de hámster. El ADNc de ASM se obtuvo a través del consorcio IMAGE™ (nº de acceso GenBank® AI587087). El ADNc para GAA se obtuvo de Dr. Martinuik en la New York University School of Medicine. Las secuencias nucleotídicas de los ADNc de ASM y de GAA se exponen en SEC ID NOs:37 y 38, respectivamente. De forma similar, los dos ADNc se clonaron también en dirección 3’ del promotor de CMV en un vector que contiene el mismo casete de expresión de DHFR. La estirpe celular CHO-K1 deficiente en DHFR, DXB11, se transfectó por triplicado con ambos conjuntos de vectores de expresión. Después de dos semanas de selección en medio deficiente en nucleótidos que contiene MTX 20 nM, se lavó un conjunto no clonado heterogéneo de células con PBS y se transfirió a medio libre de suero. Veinticuatro horas más tarde, se midieron los niveles de ASM o GAA en el medio.
Los resultados de uno de tales experimentos se demuestran en las Figuras 8A y 8B. Los niveles de ASM generados a partir del promotor de -actina de hámster en los conjuntos estables fueron 2 a 15 veces mayores que con el promotor de CMV, y en el caso de los conjuntos de GAA, 2 a 5 veces mayores.
Los conjuntos estables se usaron adicionalmente para evaluar la capacidad del promotor de -actina para sostener la expresión proteica a largo plazo. Típicamente, para la producción industrial de proteínas, la expresión elevada se logra seleccionando células con un mayor número de copias de genes a través de un procedimiento que implica incrementar el número de etapas de selección y/o la concentración de MTX. A fin de determinar si se podría lograr una mayor expresión vía esta estrategia con el promotor de -actina (SEC ID NO:1), los conjuntos de ASM seleccionados inicialmente en MTX 20 nM se amplificaron mediante selección durante dos semanas en niveles de MTX (200 nM) mayores de diez veces. Como se resume en la Tabla 4, dos de los tres conjuntos de -actina mostraron niveles de ASM mayores de 2 a 3 veces tras la amplificación con respecto a los conjuntos de 20 nM de partida. Por el contrario, solamente uno de los conjuntos de CMV ensayados mostró niveles mayores que el conjunto de 20 nM, del que deriva. Entre los seis conjuntos de ASM generados con cualquiera de los dos promotores, el conjunto de -actina que se expresa de forma más elevada generó seis veces la cantidad de ASM obtenida con el conjunto que se expresa de forma más elevada generado con el promotor de CMV. Esto demuestra que, al menos en las condiciones ensayadas, el promotor de -actina de hámster es superior al promotor de CMV.
TABLA 4
Conjunto
Expresión de ASM en MTX 20 nM Expresión de ASM en MTX 200 nM
Conjunto A de CMV-ASM
4,3 8,2
Conjunto B de CMV-ASM
16,9 9,5
Conjunto C de CMV-ASM
3,6 3,7
Conjunto A de -actina-ASM
33,5 100,0
Conjunto B de -actina-ASM
59,3 27,9
Conjunto C de -actina-ASM
45,6 90,5
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A continuación, se describen los casos preferidos de la presente descripción y se hace referencia a ellos como los
casos E1 a E36. E1. Un promotor de β-actina de roedor aislado que se escoge entre las secuencias nucleotídicas expuestas en SEC ID NOs: 1, 2 y 3, o una variante de las mismas que tiene actividad promotora.
E2. Una secuencia nucleotídica de un promotor de β-actina de hámster aislado que se expone en SEC ID NO: 1, o
una variante de la misma que tiene actividad promotora. E3. Una secuencia nucleotídica de un promotor de β-actina de rata aislado que se expone en SEC ID NO: 2, o una variante de la misma que tiene actividad promotora.
E4. Una secuencia nucleotídica de un promotor de β-actina de ratón aislado que se expone en SEC ID NO: 3, o una
variante de la misma que tiene actividad promotora. E5. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia nucleotídica que se expone en SEC ID NO: 1, o una variante de la misma que tiene actividad promotora.
E6. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia nucleotídica que se expone en SEC ID NO: 2, o una
variante de la misma que tiene actividad promotora. E7. Un vector que comprende el promotor de SEC ID NO: 1, o una variante del mismo que tiene actividad promotora.
E8. Un vector que comprende el promotor de SEC ID NO: 2, o una variante del mismo que tiene actividad
promotora. E9. Un vector que comprende el promotor de SEC ID NO: 3, o una variante del mismo que tiene actividad promotora.
E10. El vector de cualquiera de E7-9, en el que el promotor está ligado operablemente a un ácido nucleico heterólogo.
E11. El vector de E10, en el que el ácido nucleico heterólogo codifica una proteína terapéutica. E12. El vector de E11, en el que la proteína terapéutica se escoge entre esfingomielinasa ácida, -glucosidasa, y activador de plasminógeno tisular.
E13. Una célula hospedante transfectada con un vector de cualquiera de E7-12. E14. La célula hospedante de E13, en la que la célula es una célula CHO. E15. Un método para producir una proteína que comprende:
(a)
cultivar una célula transfectada con un vector que comprende un promotor de β-actina de hámster, o una variante del mismo, ligado operablemente a una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína; y
(b)
recuperar la proteína. E16. El método de E15, en el que la proteína es un anticuerpo. E17. El método de E16, en el que el anticuerpo se une a un miembro de la familia de TGF-. E18. El método de E15, en el que la proteína es una proteína terapéutica. E19. El método de E18, en el que la proteína terapéutica se escoge entre esfingomielinasa ácida, -glucosidasa, y
activador de plasminógeno tisular. E20. Un animal transgénico que comprende el promotor como en uno cualquiera de E1-6. E21. El animal transgénico de E20, en el que el animal es un mamífero. E22. Un promotor de rpS21 aislado que tiene la secuencia nucleotídica que se expone en SEC ID NO: 39, o una
variante de la misma que tiene actividad promotora. E23. Un vector que comprende la secuencia nucleotídica que se expone en SEC ID NO: 39, o una variante de la misma que tiene actividad promotora.

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  1. imagen1
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