JP4105523B2 - デルタ−サルコグリカン遺伝子の単独欠損ハムスター - Google Patents
デルタ−サルコグリカン遺伝子の単独欠損ハムスターInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、δ−ＳＧ遺伝子のみが欠損したシリアンハムスター、より詳細には、BIO14.6心筋症ハムスターと正常ゴールデンハムスターを交配させて得られるハムスターであって、チロシナーゼ遺伝子とβＢ１−クリスタリン遺伝子が正常であるδ−ＳＧ遺伝子のみが欠損したシリアンハムスター、及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ジストロフィン（dystrophin）は筋などに存在する重要なタンパク質であり、生体内では他のいくつかのタンパク質と複合体を形成し、心筋あるいは骨格筋の細胞膜を安定化させる役割を担っている。そして、ジストロフィン又はその結合タンパク質の遺伝子異常は、筋ジストロフィー症あるい心筋症の原因となることは良く知られている(非特許文献１参照)。また、網膜においてもジストロフィンは重要な役割を担っており、ジストロフィンの遺伝子異常は網膜における光感受性にも異常をきたすことが報告されている(非特許文献２参照)。しかし、網膜におけるジストロフィン遺伝子は、単にジストロフィンを産生するだけでなく、ジストロフィンに結合する結合タンパク質をも制御しており、ジストロフィン遺伝子の異常は結合タンパク質の二次的欠損を招くことが知られている。このため、ジストロフィン遺伝子の異常による網膜機能障害の原因が、ジストロフィン分子そのものなのか、あるいはそれに結合する結合タンパク質の欠損によるものなのかが不明であった。
【０００３】
一方、遺伝性心筋症のモデル動物であるBIO14.6ハムスターは、ジストロフィンに結合する結合タンパク質の一つであるδ‐ＳＧをコードする遺伝子が欠損している（非特許文献３及び非特許文献４参照）。この遺伝性心筋症のモデル動物BIO14.6ハムスターにおけるδ‐ＳＧタンパク質の欠損は、他の３つのサルコグリカン（ＳＧ）であるα−ＳＧ、β−ＳＧ、及びγ−ＳＧの欠損も伴っている。即ち、遺伝性心筋症のモデル動物BIO14.6ハムスターは、α−ＳＧ、β−ＳＧ、γ−ＳＧ、及びδ−ＳＧが欠損している。しかし、このBIO14.6ハムスターは、ジストロフィンのタンパク質の量には大きな変化がない。したがって、このB1014.6ハムスターは、ジストロフィンに異常がないことから、心筋あるいは骨格筋におけるＳＧ複合体の分子機能の解析には極めて適したモデル動物と言える。
また、このBIO14.6ハムスターは生まれた直後は赤眼であるが、加齢と共に徐々に黒眼になる。この原因として、従来心筋症により血色の異常が起こり、その血色の変化が黒眼としてみられるものと考えられていた。
しかし、本発明者はこのBIO14.6ハムスターの眼球の異常について検討し、この異常が心筋症による血色の異常ではなく、眼球の光の感知に関与する色素合成酵素であるチロシナーゼ（tyrosinase）に異常があるためであることを解明してきた（特許文献１参照）。
【０００４】
このように、遺伝性心筋症のモデル動物であるBIO14.6ハムスターは、ジストロフィン遺伝子には異常はなく、その結合タンパク質であるサルコグリカン（ＳＧ）に異常があり、ジストロフィン結合タンパク質の研究には適しているのであるが、眼球においてはチロシナーゼ（tyrosinase）やβＢ１−クリスタリン（βＢ１−crystallin）にも異常があり（本願と同日付の特許出願参照）、網膜におけるジストロフィン結合タンパク質であるＳＧ複合体の機能解析には適していないことがわかってきた。
【０００５】
【特許文献１】
特開２００１‐１１２４８３号公報
【非特許文献１】
Blake, D.J., et al., Physiol. Rev.. 2002, 82(2), 291‐329
【非特許文献２】
Pillers, D.A.. Mol. Genet. Metab., 1999, 68(2), 304‐309
【非特許文献３】
A.Sakamoto, et al.. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1997, 94, 13873‐13878
【非特許文献４】
A.Sakamoto, et al., FEBS Lett., 1999, 447, 124‐128
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、網膜における光情報の伝搬における、ジストロフィンおよびその結合タンパク質複合体の詳細な分子機構を解明するための実験動物、それを製造する方法、及びその利用方法を提供する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、遺伝性心筋症のモデル動物であるBIO14.6ハムスターにおける眼球に関連するチロシナーゼやβＢ１−クリスタリンには異常がないハムスターの創作について検討してきたところ、BIO14.6ハムスターと正常ゴールデンハムスターとを交配させることにより、チロシナーゼ遺伝子とβＢ１−クリスタリン遺伝子は正常で、δ−ＳＧ遺伝子のみ異常であるオスとメスのハムスターが得られることを見出した。
【０００８】
即ち、本発明は、δ−ＳＧ遺伝子のみが欠損したシリアンハムスター、より詳細には、BIO14.6心筋症ハムスターと正常ゴールデンハムスターを交配させて得られるハムスターであって、チロシナーゼ遺伝子とβＢ１−クリスタリン遺伝子が正常であり、δ−ＳＧ遺伝子のみが欠損したシリアンハムスターに関する。
また、本発明は、BIO14.6心筋症ハムスターと正常ゴールデンハムスターを交配させて、得られたハムスターの中からチロシナーゼ遺伝子とβＢ１−クリスタリン遺伝子が正常であるハムスターをスクリーニングすることからなるδ−ＳＧ遺伝子のみが欠損したシリアンハムスターを製造する方法に関する。さらに、それらを兄妹交配させ、新たなシリアンハムスターの疾患モデル系統を創出する方法に関する。
【０００９】
本発明者は、BIO14.6ハムスターと正常ゴールデンハムスターとを交配させてできた子の遺伝子を詳細に検討した。これらの子ハムスターのゲノムＤＮＡを抽出し、δ−ＳＧ遺伝子、チロシナーゼ遺伝子、及びβＢ１−クリスタリン遺伝子のジェノタイプ（genotype）をＰＣＲで検討した。
これらの遺伝子の検出に使用したプラーマーセットの塩基配列を以下に示す。
【００１０】
１．δ−サルコグリカン（δ−ＳＧ）遺伝子
正常アレル体の検出用のプライマー：
Ｇ−δＳＧ−Ｆ： ＡＡＣＣＧＴＴＧＡＣＴＡＴＴＴＡＴＧＣＣ
Ｇ−δＳＧ−Ｒ： ＧＣＡＴＴＡＣＡＣＣＡＣＡＣＧＴＴＣＡＣ
異常アレル体の検出用のプライマー：
Ｂ−δＳＧ−Ｆ： ＴＴＴＣＣＴＣＴＧＡＧＡＡＧＴＧＴＧＴＣＣ
Ｂ−δＳＧ−Ｒ： ＣＴＣＡＡＡＴＧＡＧＣＴＡＧＴＧＣＣＡＧＧ
【００１１】
２．チロシナーゼ遺伝子
正常な塩基配列を有するチロシナーゼ遺伝子（７８５Ｔ）の検出用のプライマー：
Ｇ−ＴＹＲ−Ｆ： ＣＴＡＴＧＡＴＴＴＧＡＧＴＧＴＣＣＣＡＧ
Ｇ−ＴＹＲ−Ｒ： ＧＡＡＧＧＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＧＡＧＴＡ
異常な塩基配列を有するチロシナーゼ遺伝子（７８５Ｃ）の検出用のプライマー：
Ｂ−ＴＹＲ−Ｆ： ＡＧＴＧＣＴＣＴＧＧＣＡＡＣＴＴＣＡＴＧ
Ｂ−ＴＹＲ‐Ｒ： ＧＡＡＧＧＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＧＡＧＴＧ
【００１２】
３．βＢ１−クリスタリン遺伝子
βＢ１−クリスタリン遺伝子は、正常ゴールデンハムスターに比べ、BIO14.6ハムスターでは４塩基が欠失分だけ小さいＤＮＡ断片を検出することができる。用いたプライマーは：
ＣＲＹ−Ｆ： ＴＡＣＡＧＡＧＡＡＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＧ
ＣＲＹ−Ｒ： ＡＧＣＡＡＡＴＡＴＧＡＧＡＴＴＣＡＣＧＣ
【００１３】
正常ゴールデンハムスター（Ｇ）、BIO14.6心筋症ハムスター（Ｂ）、及び本発明のハムスター（Ｘ）の遺伝子型決定の結果を図１〜図３にそれぞれ図面に代わる写真で示す。図１はδ−ＳＧ遺伝子についてのものであり、左側は正常アレルの結果を示し、右側は変異アレルの結果を示す。図２はチロシナーゼ遺伝子についてのものであり、左側は正常アレルの結果を示し、右側は変異アレルの結果を示す。図３はβＢ１−クリスタリン遺伝子についてのものであり、プレートの上側は正常アレルを示し、下側は変異アレルを示す。図１〜３におけるＧは正常ゴールデンハムスターを示し、ＢはBIO14.6心筋症ハムスターを示し、Ｘは本発明のδ−ＳＧ遺伝子のみが欠失したハムスターを示す。
この結果、δ−ＳＧ遺伝子では、正常アレルは正常ゴールデンハムスター（Ｇ）のみで検出されたのに対して、変異アレルはBIO14.6ハムスター（Ｂ）及び本発明のハムスター（Ｘ）で検出された（図１参照）。チロシナーゼ遺伝子については、正常アレルが正常ゴールデンハムスター（Ｇ）及び本発明のハムスター（Ｘ）で検出されたのに対して、変異アレルはBIO14.6ハムスター（Ｂ）のみで検出された（図２参照）。βＢ１−クリスタリン遺伝子についても、同様に正常アレルは正常ゴールデンハムスター（Ｇ）及び本発明のハムスター（Ｘ）で検出されたのに対して、変異アレルはBIO14.6ハムスター（Ｂ）のみで検出された（図３参照）。このことは、本発明のハムスター（Ｘ）は、δ−ＳＧ遺伝子のみに異常があり、チロシナーゼ遺伝子及びβＢ１−クリスタリン遺伝子は正常であることが示している。
【００１４】
次に、正常ゴールデンハムスター（Ｇ）、BIO14.6心筋症ハムスター（Ｂ）、及び本発明のハムスター（Ｘ）について、δ−ＳＧ遺伝子の発現を心臓と網膜について調べた。図４はδ−ＳＧ遺伝子のｍＲＮＡのブロットの結果を示す図面に代わる写真である。図４の左側は心臓（Heart）の場合を示し、右側は網膜（Retina）の場合を示す。それぞれのＧは正常ゴールデンハムスターを示し、ＢはBIO14.6心筋症ハムスターを示し、Ｘは本発明のδ−ＳＧ遺伝子のみが欠失したハムスターを示す。この結果、正常ゴールデンハムスターのみが、心臓及び網膜においてδ−ＳＧ遺伝子を発現していることがわかった。
これらのハムスターの心臓の病理断片を取り、心臓における病変を調べた。結果を図５に図面に代わる写真で示す。図５は断片をマッソン−トリクローム（Masson-trichrome）で染色したものであり、Ｇは正常ゴールデンハムスターを示し、ＢはBIO14.6心筋症ハムスターを示し、Ｘは本発明のハムスターを示す。この結果、心臓においてδ−ＳＧ遺伝子が発現していないBIO14.6心筋症ハムスター（Ｂ）及び本発明のハムスター（Ｘ）では、強い組織変性が観察された。
【００１５】
次に、水晶体におけるβＢ１−クリスタリン遺伝子の発現を同様にして調べた。図６はβＢ１−クリスタリン遺伝子のｍＲＮＡのブロットの結果を示す図面に代わる写真である。図６のＧは正常ゴールデンハムスターを示し、ＢはBIO14.6心筋症ハムスターを示し、Ｘは本発明のハムスターを示す。この結果、βＢ１−クリスタリン遺伝子は、BIO14.6心筋症ハムスターの水晶体では発現していないが、正常ゴールデンハムスター及び本発明のハムスターでは正常に発現していることがわかった。
図７はこれらのハムスターを示す図面に代わるカラー写真である。図７のＧは正常ゴールデンハムスターを示し、ＢはBIO14.6心筋症ハムスターを示し、Ｘは本発明のハムスターを示す。この写真のように、BIO14.6心筋症ハムスターは赤眼であるが、正常ゴールデンハムスター及び本発明のハムスターは黒眼である。毛並みも正常ゴールデンハムスターとほとんど変化がない。
【００１６】
以上のことから、本発明のハムスターが期待通りの表現型を示すことが分かる。本発明のハムスターは、チロシナーゼ遺伝子及びβＢ１−クリスタリン遺伝子は正常であり、δ−ＳＧ遺伝子のみに異常がみられる。そして、BIO14.6心筋症ハムスターも正常ゴールデンハムスターも、ジストロフィン遺伝子には異常がないのであるから、本発明のハムスターは、ジストロフィンに結合するタンパク質であるδ−ＳＧのみに異常があるハムスターということになる。
したがって、本発明のハムスターは、ジストロフィンに結合するタンパク質であるδ−ＳＧのみの異常に起因する各種の疾患の病態モデル動物として極めて有用なものである。また、ジストロフィン遺伝子の異常による網膜機能障害の原因が、ジストロフィン分子そのものなのか、あるいはそれに結合する結合タンパク質の欠損によるものなのかが不明であったが、本発明のハムスターにより、その原因を解明することが可能となる。
また、本発明のハムスターを用いて、全身の様々な臓器における発現が変化する遺伝子、ｃＤＮＡならびにそれがコードするタンパク質を調べることもできる。
【００１７】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１８】
実施例１ 1.δ‐サルコグリカン遺伝子のみ異常なハムスターの創出と確認
BIO14.6ハムスターと正常ゴールデンハムスターとを交配させて数百匹の個体を得た。切除した各動物の耳介からＤＮＡ自動抽出装置(KURABO Pl‐50)を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、δ−ＳＧ遺伝子、チロシナーゼ遺伝子、及びβＢ１−クリスタリン遺伝子の各遺伝子のジェノタイプ（genotype）をＰＣＲで決定した。方法は坂本らの方法（非特許文献４参照）に準じて行った。酵素には、宝酒造のＥｘＴａｑを用いた。
δ−ＳＧ遺伝子の正常アレルの検出には次のプライマーを使用して、９４℃で１分間の後、９４℃で２０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の３５サイクルを行った。
Ｇ−δＳＧ−Ｆ： ＡＡＣＣＧＴＴＧＡＣＴＡＴＴＴＡＴＧＣＣ
Ｇ−δＳＧ−Ｒ： ＧＣＡＴＴＡＣＡＣＣＡＣＡＣＧＴＴＣＡＣ
【００１９】
δ−ＳＧ遺伝子の変異アレルの検出には次のプライマーを使用して、９４℃で１分間の後、９４℃で２０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の３５サイクルを行った。
Ｂ−δＳＧ−Ｆ： ＴＴＴＣＣＴＣＴＧＡＧＡＡＧＴＧＴＧＴＣＣ
Ｂ−δＳＧ−Ｒ： ＣＴＣＡＡＡＴＧＡＧＣＴＡＧＴＧＣＣＡＧＧ
【００２０】
チロシナーゼ遺伝子の正常塩基（７８５Ｔ）の検出は、特開２００１‐１１２４８３号に記載の方法に準じて、次のプライマーを用いて、９４℃で１分間の後、９４℃で２０秒、６７℃で３０秒、７２℃で３０秒の３５サイクルを行った。
Ｇ−ＴＹＲ−Ｆ： ＣＴＡＴＧＡＴＴＴＧＡＧＴＧＴＣＣＣＡＧ
Ｇ−ＴＹＲ−Ｒ： ＧＡＡＧＧＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＧＡＧＴＡ
同様にして、チロシナーゼ遺伝子の異常塩基（７８５Ｃ）の検出を、次のプライマーを用いて、９４℃で１分間の後、９４℃で２０秒、６８℃で３０秒、７２℃で３０秒の３５サイクルを行った。
Ｂ−ＴＹＲ−Ｆ： ＡＧＴＧＣＴＣＴＧＧＣＡＡＣＴＴＣＡＴＧ
Ｂ−ＴＹＲ‐Ｒ： ＧＡＡＧＧＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＧＡＧＴＧ
【００２１】
βＢ１−クリスタリン遺伝子は、正常ゴールデンハムスターに比べ、BIO14.6心筋症ハムスターでは４塩基が欠失しており、次のプライマーを用いて、４塩基分だけ小さいＤＮＡ断片を検出した。ＰＣＲのサイクルは、９４℃で１分間の後、９４℃で２０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒の３５サイクルであった。
ＣＲＹ−Ｆ： ＴＡＣＡＧＡＧＡＡＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＧ
ＣＲＹ−Ｒ： ＡＧＣＡＡＡＴＡＴＧＡＧＡＴＴＣＡＣＧＣ
【００２２】
正常ゴールデンハムスター、BIO14.6心筋症ハムスター、及び本発明のハムスターの遺伝子型を決定するために、各ＰＣＲ産物をδ−ＳＧ遺伝子、及びチロシナーゼ遺伝子についてはアガロースゲルで、またβＢ１−クリスタリン遺伝子についてはアクリルアミドゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。結果を図１〜３にそれぞれ示した。また、図４にδ−ＳＧ遺伝子の心臓及び網膜における発現を調べた結果を、図６に水晶体におけるβＢ１−クリスタリン遺伝子の発現を調べた結果を示す。図５にこれらのハムスターの心臓組織の断片をマッソン−トリクロム染色した結果を示す。さらに、図７にこれらのハムスターのカラー写真を示す。
以上のことから、本発明のハムスターが期待通りの表現型を示すことが分かった。
さらに、ここで得られた兄妹のハムスター同士を交配させて、新たなシリアンハムスターの疾患モデル系統を創出することができる。
【００２３】
【発明の効果】
視覚情報は、高等生物が外界を認識する上で極めて重要な役割を果たしている。 本発明は、新たな疾患モデル動物を提供するものであり、本発明のハムスターは、単にジストロフィン（dystrophin）関連遺伝子の網膜機能のみでなく、網膜から視神経を経て大脳後頭葉に到る視覚の情報伝達機構全般の解明を可能にするものである。またこの動物を用いることで、筋ジストロフィー症あるい心筋症に合併する視覚機能異常に対する新しい治療法の開発も期待される。このように、本発明は、ジストロフィン関連タンパク質の網膜における機能解明にも大いに役立つものである。
【００２４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、δ−サルコグリカン（δ−ＳＧ）遺伝子のＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す図面に代わる写真である。図１の左側は正常アレルの結果を示し、右側は変異アレルの結果を示す。図１中のＧは正常ゴールデンハムスターを示し、ＢはBIO14.6心筋症ハムスターを示し、Ｘは本発明のハムスターを示す。
【図２】図２は、チロシナーゼ遺伝子のＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す図面に代わる写真である。図２の左側は正常アレルの結果を示し、右側は変異アレルの結果を示す。図２中のＧは正常ゴールデンハムスターを示し、ＢはBIO14.6心筋症ハムスターを示し、Ｘは本発明のハムスターを示す。
【図３】図３は、βＢ１−クリスタリン遺伝子のＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す図面に代わる写真である。図３のプレートの上側は正常アレルを示し、下側は変異アレルを示す。図３中のＧは正常ゴールデンハムスターを示し、ＢはBIO14.6心筋症ハムスターを示し、Ｘは本発明のハムスターを示す。
【図４】図４は、δ−サルコグリカン（δ−ＳＧ）遺伝子のｍＲＮＡのブロットの結果を示す図面に代わる写真である。図４の左側は心臓（Heart）の場合を示し、右側は網膜（Retina）の場合を示す。それぞれのＧは正常ゴールデンハムスターを示し、ＢはBIO14.6心筋症ハムスターを示し、Ｘは本発明のハムスターを示す。
【図５】図５は、心臓の病理断片をマッソン−トリクローム（Masson-trichrome）で染色した結果を示す図面に代わる写真である。図５のＧは正常ゴールデンハムスターを示し、ＢはBIO14.6心筋症ハムスターを示し、Ｘは本発明のハムスターを示す。
【図６】図６は、βＢ１−クリスタリン遺伝子のｍＲＮＡのブロットの結果を示す図面に代わる写真である。図６のＧは正常ゴールデンハムスターを示し、ＢはBIO14.6心筋症ハムスターを示し、Ｘは本発明のハムスターを示す。
【図７】図７は、これらのハムスターの状態を示す図面に代わるカラー写真である。図７のＧは正常ゴールデンハムスターを示し、ＢはBIO14.6心筋症ハムスターを示し、Ｘは本発明のハムスターを示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、δ−ＳＧ遺伝子のみが欠損したシリアンハムスター、より詳細には、BIO14.6心筋症ハムスターと正常ゴールデンハムスターを交配させて得られるハムスターであって、チロシナーゼ遺伝子とβＢ１−クリスタリン遺伝子が正常であるδ−ＳＧ遺伝子のみが欠損したシリアンハムスター、及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ジストロフィン（dystrophin）は筋などに存在する重要なタンパク質であり、生体内では他のいくつかのタンパク質と複合体を形成し、心筋あるいは骨格筋の細胞膜を安定化させる役割を担っている。そして、ジストロフィン又はその結合タンパク質の遺伝子異常は、筋ジストロフィー症あるい心筋症の原因となることは良く知られている(非特許文献１参照)。また、網膜においてもジストロフィンは重要な役割を担っており、ジストロフィンの遺伝子異常は網膜における光感受性にも異常をきたすことが報告されている(非特許文献２参照)。しかし、網膜におけるジストロフィン遺伝子は、単にジストロフィンを産生するだけでなく、ジストロフィンに結合する結合タンパク質をも制御しており、ジストロフィン遺伝子の異常は結合タンパク質の二次的欠損を招くことが知られている。このため、ジストロフィン遺伝子の異常による網膜機能障害の原因が、ジストロフィン分子そのものなのか、あるいはそれに結合する結合タンパク質の欠損によるものなのかが不明であった。
【０００３】
一方、遺伝性心筋症のモデル動物であるBIO14.6ハムスターは、ジストロフィンに結合する結合タンパク質の一つであるδ‐ＳＧをコードする遺伝子が欠損している（非特許文献３及び非特許文献４参照）。この遺伝性心筋症のモデル動物BIO14.6ハムスターにおけるδ‐ＳＧタンパク質の欠損は、他の３つのサルコグリカン（ＳＧ）であるα−ＳＧ、β−ＳＧ、及びγ−ＳＧの欠損も伴っている。即ち、遺伝性心筋症のモデル動物BIO14.6ハムスターは、α−ＳＧ、β−ＳＧ、γ−ＳＧ、及びδ−ＳＧが欠損している。しかし、このBIO14.6ハムスターは、ジストロフィンのタンパク質の量には大きな変化がない。したがって、このB1014.6ハムスターは、ジストロフィンに異常がないことから、心筋あるいは骨格筋におけるＳＧ複合体の分子機能の解析には極めて適したモデル動物と言える。
また、このBIO14.6ハムスターは生まれた直後は赤眼であるが、加齢と共に徐々に黒眼になる。この原因として、従来心筋症により血色の異常が起こり、その血色の変化が黒眼としてみられるものと考えられていた。
しかし、本発明者はこのBIO14.6ハムスターの眼球の異常について検討し、この異常が心筋症による血色の異常ではなく、眼球の光の感知に関与する色素合成酵素であるチロシナーゼ（tyrosinase）に異常があるためであることを解明してきた（特許文献１参照）。
【０００４】
このように、遺伝性心筋症のモデル動物であるBIO14.6ハムスターは、ジストロフィン遺伝子には異常はなく、その結合タンパク質であるサルコグリカン（ＳＧ）に異常があり、ジストロフィン結合タンパク質の研究には適しているのであるが、眼球においてはチロシナーゼ（tyrosinase）やβＢ１−クリスタリン（βＢ１−crystallin）にも異常があり（本願と同日付の特許出願参照）、網膜におけるジストロフィン結合タンパク質であるＳＧ複合体の機能解析には適していないことがわかってきた。
【０００５】
【特許文献１】
特開２００１‐１１２４８３号公報
【非特許文献１】
Blake, D.J., et al., Physiol. Rev.. 2002, 82(2), 291‐329
【非特許文献２】
Pillers, D.A.. Mol. Genet. Metab., 1999, 68(2), 304‐309
【非特許文献３】
A.Sakamoto, et al.. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1997, 94, 13873‐13878
【非特許文献４】
A.Sakamoto, et al., FEBS Lett., 1999, 447, 124‐128
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、網膜における光情報の伝搬における、ジストロフィンおよびその結合タンパク質複合体の詳細な分子機構を解明するための実験動物、それを製造する方法、及びその利用方法を提供する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、遺伝性心筋症のモデル動物であるBIO14.6ハムスターにおける眼球に関連するチロシナーゼやβＢ１−クリスタリンには異常がないハムスターの創作について検討してきたところ、BIO14.6ハムスターと正常ゴールデンハムスターとを交配させることにより、チロシナーゼ遺伝子とβＢ１−クリスタリン遺伝子は正常で、δ−ＳＧ遺伝子のみ異常であるオスとメスのハムスターが得られることを見出した。
【０００８】
即ち、本発明は、δ−ＳＧ遺伝子のみが欠損したシリアンハムスター、より詳細には、BIO14.6心筋症ハムスターと正常ゴールデンハムスターを交配させて得られるハムスターであって、チロシナーゼ遺伝子とβＢ１−クリスタリン遺伝子が正常であり、δ−ＳＧ遺伝子のみが欠損したシリアンハムスターに関する。
また、本発明は、BIO14.6心筋症ハムスターと正常ゴールデンハムスターを交配させて、得られたハムスターの中からチロシナーゼ遺伝子とβＢ１−クリスタリン遺伝子が正常であるハムスターをスクリーニングすることからなるδ−ＳＧ遺伝子のみが欠損したシリアンハムスターを製造する方法に関する。さらに、それらを兄妹交配させ、新たなシリアンハムスターの疾患モデル系統を創出する方法に関する。
【０００９】
本発明者は、BIO14.6ハムスターと正常ゴールデンハムスターとを交配させてできた子の遺伝子を詳細に検討した。これらの子ハムスターのゲノムＤＮＡを抽出し、δ−ＳＧ遺伝子、チロシナーゼ遺伝子、及びβＢ１−クリスタリン遺伝子のジェノタイプ（genotype）をＰＣＲで検討した。
これらの遺伝子の検出に使用したプラーマーセットの塩基配列を以下に示す。
【００１０】
１．δ−サルコグリカン（δ−ＳＧ）遺伝子
正常アレル体の検出用のプライマー：
Ｇ−δＳＧ−Ｆ： ＡＡＣＣＧＴＴＧＡＣＴＡＴＴＴＡＴＧＣＣ
Ｇ−δＳＧ−Ｒ： ＧＣＡＴＴＡＣＡＣＣＡＣＡＣＧＴＴＣＡＣ
異常アレル体の検出用のプライマー：
Ｂ−δＳＧ−Ｆ： ＴＴＴＣＣＴＣＴＧＡＧＡＡＧＴＧＴＧＴＣＣ
Ｂ−δＳＧ−Ｒ： ＣＴＣＡＡＡＴＧＡＧＣＴＡＧＴＧＣＣＡＧＧ
【００１１】
２．チロシナーゼ遺伝子
正常な塩基配列を有するチロシナーゼ遺伝子（７８５Ｔ）の検出用のプライマー：
Ｇ−ＴＹＲ−Ｆ： ＣＴＡＴＧＡＴＴＴＧＡＧＴＧＴＣＣＣＡＧ
Ｇ−ＴＹＲ−Ｒ： ＧＡＡＧＧＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＧＡＧＴＡ
異常な塩基配列を有するチロシナーゼ遺伝子（７８５Ｃ）の検出用のプライマー：
Ｂ−ＴＹＲ−Ｆ： ＡＧＴＧＣＴＣＴＧＧＣＡＡＣＴＴＣＡＴＧ
Ｂ−ＴＹＲ‐Ｒ： ＧＡＡＧＧＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＧＡＧＴＧ
【００１２】
３．βＢ１−クリスタリン遺伝子
βＢ１−クリスタリン遺伝子は、正常ゴールデンハムスターに比べ、BIO14.6ハムスターでは４塩基が欠失分だけ小さいＤＮＡ断片を検出することができる。用いたプライマーは：
ＣＲＹ−Ｆ： ＴＡＣＡＧＡＧＡＡＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＧ
ＣＲＹ−Ｒ： ＡＧＣＡＡＡＴＡＴＧＡＧＡＴＴＣＡＣＧＣ
【００１３】
正常ゴールデンハムスター（Ｇ）、BIO14.6心筋症ハムスター（Ｂ）、及び本発明のハムスター（Ｘ）の遺伝子型決定の結果を図１〜図３にそれぞれ図面に代わる写真で示す。図１はδ−ＳＧ遺伝子についてのものであり、左側は正常アレルの結果を示し、右側は変異アレルの結果を示す。図２はチロシナーゼ遺伝子についてのものであり、左側は正常アレルの結果を示し、右側は変異アレルの結果を示す。図３はβＢ１−クリスタリン遺伝子についてのものであり、プレートの上側は正常アレルを示し、下側は変異アレルを示す。図１〜３におけるＧは正常ゴールデンハムスターを示し、ＢはBIO14.6心筋症ハムスターを示し、Ｘは本発明のδ−ＳＧ遺伝子のみが欠失したハムスターを示す。
この結果、δ−ＳＧ遺伝子では、正常アレルは正常ゴールデンハムスター（Ｇ）のみで検出されたのに対して、変異アレルはBIO14.6ハムスター（Ｂ）及び本発明のハムスター（Ｘ）で検出された（図１参照）。チロシナーゼ遺伝子については、正常アレルが正常ゴールデンハムスター（Ｇ）及び本発明のハムスター（Ｘ）で検出されたのに対して、変異アレルはBIO14.6ハムスター（Ｂ）のみで検出された（図２参照）。βＢ１−クリスタリン遺伝子についても、同様に正常アレルは正常ゴールデンハムスター（Ｇ）及び本発明のハムスター（Ｘ）で検出されたのに対して、変異アレルはBIO14.6ハムスター（Ｂ）のみで検出された（図３参照）。このことは、本発明のハムスター（Ｘ）は、δ−ＳＧ遺伝子のみに異常があり、チロシナーゼ遺伝子及びβＢ１−クリスタリン遺伝子は正常であることが示している。
【００１４】
次に、正常ゴールデンハムスター（Ｇ）、BIO14.6心筋症ハムスター（Ｂ）、及び本発明のハムスター（Ｘ）について、δ−ＳＧ遺伝子の発現を心臓と網膜について調べた。図４はδ−ＳＧ遺伝子のｍＲＮＡのブロットの結果を示す図面に代わる写真である。図４の左側は心臓（Heart）の場合を示し、右側は網膜（Retina）の場合を示す。それぞれのＧは正常ゴールデンハムスターを示し、ＢはBIO14.6心筋症ハムスターを示し、Ｘは本発明のδ−ＳＧ遺伝子のみが欠失したハムスターを示す。この結果、正常ゴールデンハムスターのみが、心臓及び網膜においてδ−ＳＧ遺伝子を発現していることがわかった。
これらのハムスターの心臓の病理断片を取り、心臓における病変を調べた。結果を図５に図面に代わる写真で示す。図５は断片をマッソン−トリクローム（Masson-trichrome）で染色したものであり、Ｇは正常ゴールデンハムスターを示し、ＢはBIO14.6心筋症ハムスターを示し、Ｘは本発明のハムスターを示す。この結果、心臓においてδ−ＳＧ遺伝子が発現していないBIO14.6心筋症ハムスター（Ｂ）及び本発明のハムスター（Ｘ）では、強い組織変性が観察された。
【００１５】
次に、水晶体におけるβＢ１−クリスタリン遺伝子の発現を同様にして調べた。図６はβＢ１−クリスタリン遺伝子のｍＲＮＡのブロットの結果を示す図面に代わる写真である。図６のＧは正常ゴールデンハムスターを示し、ＢはBIO14.6心筋症ハムスターを示し、Ｘは本発明のハムスターを示す。この結果、βＢ１−クリスタリン遺伝子は、BIO14.6心筋症ハムスターの水晶体では発現していないが、正常ゴールデンハムスター及び本発明のハムスターでは正常に発現していることがわかった。
図７はこれらのハムスターを示す図面に代わるカラー写真である。図７のＧは正常ゴールデンハムスターを示し、ＢはBIO14.6心筋症ハムスターを示し、Ｘは本発明のハムスターを示す。この写真のように、BIO14.6心筋症ハムスターは赤眼であるが、正常ゴールデンハムスター及び本発明のハムスターは黒眼である。毛並みも正常ゴールデンハムスターとほとんど変化がない。
【００１６】
以上のことから、本発明のハムスターが期待通りの表現型を示すことが分かる。本発明のハムスターは、チロシナーゼ遺伝子及びβＢ１−クリスタリン遺伝子は正常であり、δ−ＳＧ遺伝子のみに異常がみられる。そして、BIO14.6心筋症ハムスターも正常ゴールデンハムスターも、ジストロフィン遺伝子には異常がないのであるから、本発明のハムスターは、ジストロフィンに結合するタンパク質であるδ−ＳＧのみに異常があるハムスターということになる。
したがって、本発明のハムスターは、ジストロフィンに結合するタンパク質であるδ−ＳＧのみの異常に起因する各種の疾患の病態モデル動物として極めて有用なものである。また、ジストロフィン遺伝子の異常による網膜機能障害の原因が、ジストロフィン分子そのものなのか、あるいはそれに結合する結合タンパク質の欠損によるものなのかが不明であったが、本発明のハムスターにより、その原因を解明することが可能となる。
また、本発明のハムスターを用いて、全身の様々な臓器における発現が変化する遺伝子、ｃＤＮＡならびにそれがコードするタンパク質を調べることもできる。
【００１７】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１８】
実施例１ 1.δ‐サルコグリカン遺伝子のみ異常なハムスターの創出と確認
BIO14.6ハムスターと正常ゴールデンハムスターとを交配させて数百匹の個体を得た。切除した各動物の耳介からＤＮＡ自動抽出装置(KURABO Pl‐50)を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、δ−ＳＧ遺伝子、チロシナーゼ遺伝子、及びβＢ１−クリスタリン遺伝子の各遺伝子のジェノタイプ（genotype）をＰＣＲで決定した。方法は坂本らの方法（非特許文献４参照）に準じて行った。酵素には、宝酒造のＥｘＴａｑを用いた。
δ−ＳＧ遺伝子の正常アレルの検出には次のプライマーを使用して、９４℃で１分間の後、９４℃で２０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の３５サイクルを行った。
Ｇ−δＳＧ−Ｆ： ＡＡＣＣＧＴＴＧＡＣＴＡＴＴＴＡＴＧＣＣ
Ｇ−δＳＧ−Ｒ： ＧＣＡＴＴＡＣＡＣＣＡＣＡＣＧＴＴＣＡＣ
【００１９】
δ−ＳＧ遺伝子の変異アレルの検出には次のプライマーを使用して、９４℃で１分間の後、９４℃で２０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の３５サイクルを行った。
Ｂ−δＳＧ−Ｆ： ＴＴＴＣＣＴＣＴＧＡＧＡＡＧＴＧＴＧＴＣＣ
Ｂ−δＳＧ−Ｒ： ＣＴＣＡＡＡＴＧＡＧＣＴＡＧＴＧＣＣＡＧＧ
【００２０】
チロシナーゼ遺伝子の正常塩基（７８５Ｔ）の検出は、特開２００１‐１１２４８３号に記載の方法に準じて、次のプライマーを用いて、９４℃で１分間の後、９４℃で２０秒、６７℃で３０秒、７２℃で３０秒の３５サイクルを行った。
Ｇ−ＴＹＲ−Ｆ： ＣＴＡＴＧＡＴＴＴＧＡＧＴＧＴＣＣＣＡＧ
Ｇ−ＴＹＲ−Ｒ： ＧＡＡＧＧＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＧＡＧＴＡ
同様にして、チロシナーゼ遺伝子の異常塩基（７８５Ｃ）の検出を、次のプライマーを用いて、９４℃で１分間の後、９４℃で２０秒、６８℃で３０秒、７２℃で３０秒の３５サイクルを行った。
Ｂ−ＴＹＲ−Ｆ： ＡＧＴＧＣＴＣＴＧＧＣＡＡＣＴＴＣＡＴＧ
Ｂ−ＴＹＲ‐Ｒ： ＧＡＡＧＧＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＧＡＧＴＧ
【００２１】
βＢ１−クリスタリン遺伝子は、正常ゴールデンハムスターに比べ、BIO14.6心筋症ハムスターでは４塩基が欠失しており、次のプライマーを用いて、４塩基分だけ小さいＤＮＡ断片を検出した。ＰＣＲのサイクルは、９４℃で１分間の後、９４℃で２０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒の３５サイクルであった。
ＣＲＹ−Ｆ： ＴＡＣＡＧＡＧＡＡＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＧ
ＣＲＹ−Ｒ： ＡＧＣＡＡＡＴＡＴＧＡＧＡＴＴＣＡＣＧＣ
【００２２】
正常ゴールデンハムスター、BIO14.6心筋症ハムスター、及び本発明のハムスターの遺伝子型を決定するために、各ＰＣＲ産物をδ−ＳＧ遺伝子、及びチロシナーゼ遺伝子についてはアガロースゲルで、またβＢ１−クリスタリン遺伝子についてはアクリルアミドゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。結果を図１〜３にそれぞれ示した。また、図４にδ−ＳＧ遺伝子の心臓及び網膜における発現を調べた結果を、図６に水晶体におけるβＢ１−クリスタリン遺伝子の発現を調べた結果を示す。図５にこれらのハムスターの心臓組織の断片をマッソン−トリクロム染色した結果を示す。さらに、図７にこれらのハムスターのカラー写真を示す。
以上のことから、本発明のハムスターが期待通りの表現型を示すことが分かった。
さらに、ここで得られた兄妹のハムスター同士を交配させて、新たなシリアンハムスターの疾患モデル系統を創出することができる。
【００２３】
【発明の効果】
視覚情報は、高等生物が外界を認識する上で極めて重要な役割を果たしている。 本発明は、新たな疾患モデル動物を提供するものであり、本発明のハムスターは、単にジストロフィン（dystrophin）関連遺伝子の網膜機能のみでなく、網膜から視神経を経て大脳後頭葉に到る視覚の情報伝達機構全般の解明を可能にするものである。またこの動物を用いることで、筋ジストロフィー症あるい心筋症に合併する視覚機能異常に対する新しい治療法の開発も期待される。このように、本発明は、ジストロフィン関連タンパク質の網膜における機能解明にも大いに役立つものである。
【００２４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、δ−サルコグリカン（δ−ＳＧ）遺伝子のＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す図面に代わる写真である。図１の左側は正常アレルの結果を示し、右側は変異アレルの結果を示す。図１中のＧは正常ゴールデンハムスターを示し、ＢはBIO14.6心筋症ハムスターを示し、Ｘは本発明のハムスターを示す。
【図２】図２は、チロシナーゼ遺伝子のＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す図面に代わる写真である。図２の左側は正常アレルの結果を示し、右側は変異アレルの結果を示す。図２中のＧは正常ゴールデンハムスターを示し、ＢはBIO14.6心筋症ハムスターを示し、Ｘは本発明のハムスターを示す。
【図３】図３は、βＢ１−クリスタリン遺伝子のＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す図面に代わる写真である。図３のプレートの上側は正常アレルを示し、下側は変異アレルを示す。図３中のＧは正常ゴールデンハムスターを示し、ＢはBIO14.6心筋症ハムスターを示し、Ｘは本発明のハムスターを示す。
【図４】図４は、δ−サルコグリカン（δ−ＳＧ）遺伝子のｍＲＮＡのブロットの結果を示す図面に代わる写真である。図４の左側は心臓（Heart）の場合を示し、右側は網膜（Retina）の場合を示す。それぞれのＧは正常ゴールデンハムスターを示し、ＢはBIO14.6心筋症ハムスターを示し、Ｘは本発明のハムスターを示す。
【図５】図５は、心臓の病理断片をマッソン−トリクローム（Masson-trichrome）で染色した結果を示す図面に代わる写真である。図５のＧは正常ゴールデンハムスターを示し、ＢはBIO14.6心筋症ハムスターを示し、Ｘは本発明のハムスターを示す。
【図６】図６は、βＢ１−クリスタリン遺伝子のｍＲＮＡのブロットの結果を示す図面に代わる写真である。図６のＧは正常ゴールデンハムスターを示し、ＢはBIO14.6心筋症ハムスターを示し、Ｘは本発明のハムスターを示す。
【図７】図７は、これらのハムスターの状態を示す図面に代わるカラー写真である。図７のＧは正常ゴールデンハムスターを示し、ＢはBIO14.6心筋症ハムスターを示し、Ｘは本発明のハムスターを示す。
Claims (2)
- BIO14.6 心筋症ハムスターと正常ゴールデンハムスターを交配させて得られるハムスター系統であって、チロシナーゼ遺伝子とβＢ１−クリスタリン遺伝子が正常であり、かつα−、β−、γ−、δ−サルコグリカン（ sarcoglycan ）遺伝子のうちδ−サルコグリカン（δ-ＳＧ）遺伝子のみが欠損したシリアンハムスター系統。
- BIO14.6心筋症ハムスターと正常ゴールデンハムスターを交配させて、得られたハムスターの中からチロシナーゼ遺伝子とβＢ１−クリスタリン遺伝子が正常であるハムスターをスクリーニングすることからなる請求項１に記載のシリアンハムスター系統を製造する方法。
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