JP4119061B2 - 眼皮膚白子症１ｂの原因遺伝子とその応用 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、チロシナーゼのふたつの銅結合領域の間にあるアミノ酸のすくなくともひとつが、他のアミノ酸に変異している変異チロシナーゼ、それをコードする遺伝子、その断片、その遺伝子が導入された安定発現細胞株及びトランスジェニック動物、並びにその検出、診断剤に関する。本発明の変異チロシナーゼは、眼皮膚白子症、より詳細には眼皮膚白子症１Ｂの発症原因となるものであり、本発明の変異チロシナーゼは眼皮膚白子症の治療、予防又は診断などに有用である。さらに本発明の遺伝子は眼皮膚白子症のモデル動物の作製にも有用であり、かつ本発明のトランスジェニック動物又は心筋症ハムスター（ＣＭハムスター）を用いて網膜色素細胞層及び脈絡膜における色素沈着と視機能との関係を調べるのにも有用である。
【０００２】
【従来の技術】
眼皮膚白子症（Oculo Cutaneus Albinism : ＯＣＡ）は、眼および皮膚におけるメラニン色素が欠損する疾患であり、病理学的には、眼（網膜色素上皮及び脈絡膜）ならびに皮膚表皮に存在するメラノサイトにメラニン色素の沈着を認めない。眼皮膚白子症は、メラミン色素が沈着しないために、皮膚や毛髪などは白く、眼は動脈血の赤色が見えて赤眼となる。眼の網膜組織に色素が沈着しないために、網膜上で光を受けることができず、その結果正常な視機能を得ることができず、重篤な疾患のひとつである。
ヒトおよびマウスの遺伝性眼皮膚白子症の原因として、メラニン色素の生合成における律速酵素であるチロシナーゼ遺伝子の塩基変異が知られている。既知のチロシナーゼ遺伝子のほとんどの塩基変異では、いずれも個体の一生を通じて眼および皮膚における色素沈着は認めない。すなわち、眼は赤眼で皮膚は白いままである。
【０００３】
メラニンは、メラノサイト（メラニン（色素）細胞）中のメラノソームでチロシンから生合成され、ドーパやインドールキノンを経て生合成されるユーメラニン（Eumelanin）、ドーパキノンとシステインから生合成されるフェオメラニン（Pheomelanin）及びトリコクロム（Trichochrome）の３種が知られている。
メラノソーム中でのメラニンの生合成の過程を模式的に示すと図１のようになる。即ち、メラノソーム膜蛋白質によりチロシンがメラノソームに取り込まれる第一の段階、メラノソームに取り込まれたチロシンがチロシナーゼの作用によりドーパ（ＤＯＰＡ）を経てドーパキノン（ＤＯＰＡquinone）に返還される第二の段階、さらに生成したドーパキノンがチロシナーゼ関連蛋白質−１の作用により、
ユーメラニン（Eumelanin）やフェオメラニン（Pheomelanin）などのメラニンを生成する第三の段階によりメラニンの沈着が起こるとされている。
【０００４】
ところで、眼皮膚白子症は、症状や発症原因に応じて、ＯＣＡ１、ＯＣＡ２及びＯＣＡ３の３種に分類され、さらにＯＣＡ１はＯＣＡ１Ａ、ＯＣＡ１Ｂ及びＯＣＡ１−ＳＴに分類されている。次の表１に眼皮膚白子症の分類を示す。
【０００５】
【表１】
【０００６】
ＯＣＡ２は、メラノソームにチロシンを取り込むメラノソーム膜蛋白質の異常によるものであり、そのモデル動物としてはピンクアイダイリューションマウスが知られている。ＯＣＡ３は、メラノソーム中で生成したドーパキノンをメラミンに返還するチロシナーゼ関連蛋白質−１の異常にものであり、そのモデル動物としてはブラウンマウスが知られている。
一方、ＯＣＡ１はいずれも前記したメラニン生合成過程の第二段階のチロシナーゼ活性の異常に起因するものであり、そのサブタイプとしてＯＣＡ１Ａ、ＯＣＡ１Ｂ及びＯＣＡ１−ＴＳの３種に分類されている。ＯＣＡ１Ａは、チロシナーゼ活性が全く無いものであり、そのモデル動物としてはアルビノ（ＢＡＬＢ／ｃ）マウスが知られている。また、ＯＣＡ１−ＴＳは３５℃以上でチロシナーゼの活性が失活するものであり、３５℃以下の状態では正常な色素の沈着が起こるが、３５℃以上になるとチロシナーゼが失活し色素の沈着が起こらない。そのモデル動物としてはシアミーズキャット（Siamese cat）が知られている。
【０００７】
ＯＣＡ１Ｂは、生まれた直後は色素の沈着がないが、加齢と共に色素が沈着してくるが、多くの場合充分な色素の沈着までには至らない。ＯＣＡ１Ｂは、ＯＣＡ１Ａのようにチロシナーゼの活性が全くないのではなく、チロシナーゼ活性は有しているがその程度が極めて弱く、充分な色素沈着が得られないのである。そして、眼皮膚白子症の他の分類のものは前述してきたように、そのモデル動物が既に確立されているのであるが、このＯＣＡ１Ｂについてはモデル動物が確立されていないのが現状である。
したがって、眼皮膚白子症のなかでもＯＣＡ１Ｂについては、モデル動物の確立もされておらず、その原因や治療方法などについて充分な研究開発がされていないおらず、この開発が望まれている。また、ＯＣＡ１Ｂモデル動物は、眼における後天的な色素沈着と視機能の関係、あるいは最近開発されつつある網膜色素上皮移植の妥当性を検討する上で極めて重要である。
【０００８】
一方、心筋症シリアンハムスター（Cardiomyopathic Hamster：以下、ＣＭハムスターという。）は、遺伝性の心筋症や筋ジストロフィーのモデル動物として使用されている。これは、ＣＭハムスターは、そのゲノムにおいてδ−ザルコグリカン（δ−sarcoglycan）遺伝子を欠損していることに起因しているとされている（Sakamoto, et al., FEBS Lett., 447: 124-8 (1999) ; Sakamoto, et al., Proc.Natl.Acad. Sci. U.S.A., 94: 13873-13878(1997)）。
また、このＣＭハムスターは生まれた直後は赤眼であるが、加齢と共に徐々に黒眼になる。この原因として、従来心筋症により血色の異常が起こり、その血色の変化が黒眼としてみられるものと考えられており、ＣＭハムスターの色素の沈着や遺伝的な解明は今まで行われおらず、ＣＭハムスターにおける眼皮膚白子症の確認とその原因の究明が望まれていた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＣＭハムスターにおける眼皮膚白子症の病変部の観察、原因遺伝子の解明、及びその作用機構の３次元的な解析を行うことにより、ＯＣＡ１Ｂのモデル動物を確立すると共に、その治療方法、及び網膜における色素沈着と視機能との関連性を明確にすることを目的とするものである。
本発明は、個体の加齢と共に網膜色素上皮及び脈絡膜にメラニンが沈着し、赤眼から黒眼に変化する特異な眼皮膚白子症を引き起こす原因遺伝子の単離ならびにその遺伝子を用いて作られるタンパク質、細胞株ならびにトランスジェニック動物を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、遺伝的に心筋症を発症するハムスターが、前述の特異な眼皮膚白子症を呈することに着目した。加齢と共に色素沈着を起こす眼皮膚白子症は従来報告がなく、ＣＭハムスターが加齢と共に色素沈着を起こす眼皮膚白子症であることを確認することから研究をはじめた。その結果、ＣＭハムスターは加齢と共に色素沈着を起こす眼皮膚白子症であることが判明し、そしてその原因遺伝子として、従来報告のない塩基変異を有するチロシナーゼｃＤＮＡを単離することに成功した。
【００１１】
本発明は、チロシナーゼのふたつの銅結合領域の間にあるアミノ酸の少なくともひとつが、他のアミノ酸に変異している変異チロシナーゼ、好ましくは正常なハムスターのチロシナーゼの２６２番目のアミノ酸に相当するアミノ酸が、他のアミノ酸に変異している変異チロシナーゼ、より好ましくはアミノ酸がプロリンに変異している変異チロシナーゼに関する。本発明はこれらの変異チロシナーゼの部分配列からなるペプチドにも関する。好ましくは本発明のペプチドは、前記した変異チロシナーゼのアミノ酸の変異した部分を含む少なくとも５アミノ酸残基からなるペプチドに関する。
また、本発明は、前記した本発明の変異チロシナーゼのいずれかをコードする遺伝子、好ましくは正常なハムスターのチロシナーゼの７８５番目のチミンに相当する塩基が、シトシン塩基に変異している遺伝子に関する。本発明はこれらの遺伝子の部分配列からなるポリヌクレオチドにも関する。好ましくは本発明は、前記した遺伝子の塩基の変異した部分を含む少なくとも１４塩基からなるポリヌクレオチドに関する。また、変異した部分を増幅することができるプライマーに関する。
【００１２】
また、本発明は、前記した本発明の遺伝子が導入された安定発現細胞株又はトランスジェニック動物に関する。
さらに、本発明は、心筋症ハムスター（ＣＭハムスター）の眼皮膚白子症のモデル動物としての使用に関する。
本発明は、前記したポリヌクレオチド及び／又はプライマーを含有してなる変異チロシナーゼの検出、診断剤に関する。
【００１３】
本発明者は、まず、ＣＭハムスターが加齢と共に色素沈着を起こす眼皮膚白子症であること確認する実験を行った。
図２は、ＣＭハムスターの図面に代わる写真である。なお、図２の写真は本来カラーであるが、方式上の制限から白黒として提出されているが、カラーの原本をいつでも利用することができる。図２のＡの１は、正常な生後６週のゴールデンハムスター（図２のＡの１）とＣＭハムスター（図２のＡの２〜４）の写真である。ＣＭハムスターは全体に白くなっていることがわかる。図２のＡの２は生後６週のＣＭハムスターの写真である。眼が赤く色素が無いことがわかる。図２のＡの３及び４は、それぞれ生後２６週、４５週のＣＭハムスターの写真であり、眼が少しづつ黒くなってきている様子がわかる。
図２のＢは、ゴールデンハムスター（図２のＢの１）とＣＭハムスター（図２のＢの２〜４）の網膜をホルマリンで固定し、そのスライスを光学顕微鏡でみたものである。図２のＢの１では、色素上皮に色素が正常に沈着していることがわかる。一方、生後直後のＣＭハムスター（図２のＢの２）では、色素の沈着が全く無いことがわかる。そして、ＣＭハムスターの加齢と共に色素上皮に少しづつ色素の沈着が生じてきていることが、図２のＢの３及び４からわかる。
【００１４】
図２のＢの３及び４では、ＣＭハムスターの加齢と共に、黒い顆粒が色素上皮付近に生じてきていることはわかるが、これがメラニンの沈着であるか否かを確定することはできない。そこで、この部分をさらに拡大して、電子顕微鏡で観察することにより、図２のＢの３及び４における黒色の沈着物がメラニンであることを明らかにしたのが図２のＣの１及び２の写真である。図２のＣの１及び２では、色素上皮を含めてその周囲の組織はいずれも正常な形態を保持しており、黒色の沈着物が色素上皮の周囲の組織の凝集物でないことは明らかである。そして、メラニンの存在している部分が明確に染色されている。
以上の実験から、ＣＭハムスターにおける加齢に伴う色素沈着がメラニンの沈着によるものであることが判明した。このことは本発明者が初めて明らかにしたことである。
【００１５】
次に、６週齢のＣＭハムスターの眼球をスライスし、これに０．１％のＬ−ＤＯＰＡ（Ｌ−３，４−dihydroxyphenylalanine）水溶液を加えて３７℃で４時間インキュベートした後の網膜色素細胞層（ＲＰＥ）の様子を位相差顕微鏡で観察した結果が図３である。図３は図２と同様に本来カラー写真である、図面に代わる写真である。Ｌ−ＤＯＰＡの添加により、極僅かではあるがドーパ−メラニンの沈着がはっきりと見られた。
これは、ＣＭハムスターにはチロシナーゼ活性があるが、その活性が低いことを示している。
【００１６】
チロシナーゼが存在していることを確認するために、チロシナーゼの免疫反応を行った。２６週齢のＣＭハムスターの眼球の凍結切片を作製し、これに抗チロシナーゼ抗体を加え、ＨＲＰ／ＡＥＣ系で可視化したときの網膜色素細胞層及び脈絡膜の写真を図４に示す。図４も図２と同様に本来カラー写真である、図面に代わる写真である。この結果、ＣＭハムスターにチロシナーゼ（赤色に染色。）が存在していることが判明した。
さらに、ＲＮＡのノーザンブロットを行った。ゴールデンハムスター（Ｎ）及びＣＭハムスター（ＣＭ）の眼球及び皮膚から全ＲＮＡを抽出し（レーン当たり２０μｇ）、全長のチロシナーゼｃＤＮＡをプローブとしてノーザンブロットを行った結果を図５に示す。図５は図面に代わる写真である。この結果、ＣＭハムスターにも正常なゴールデンハムスターとほぼ同程度の量のチロシナーゼＲＮＡが発現していることがわかった。
以上のことから、ＣＭハムスターは眼及び皮膚においても正常なハムスターと同程度の量のチロシナーゼが発現しているが、ＣＭハムスターのチロシナーゼ活性は正常のハムスターに比べて極めて低いことがわかった。
【００１７】
心筋症ハムスター（ＣＭハムスター）は、心筋症の他に特異な眼皮膚白子症（Oculo Cutaneus Albinism：ＯＣＡ）を合併し、ＣＭハムスターは生直後の赤眼が加齢と共に黒眼になってゆくことが知られていた。しかし、その原因も機構も知られていなかったが、以上の実験により本発明者が初めてこれを明らかにした。即ち、これは生直後の網膜色素細胞層（ＲＰＥ）及び脈絡膜にはメラニン色素は存在せず赤眼であったものが、加齢と共にＲＰＥにメラニン色素の沈着が起こり黒眼になる。そして、このメラニン色素の沈着はＬ−ＤＯＰＡのドーパキノンへの変換に寄与しているチロシナーゼの活性の低下に起因しているが、ＣＭハムスターのチロシナーゼの発現量自体は正常なハムスターと変わっていないのである。
したがって、ＣＭハムスターのＯＣＡの遺伝的原因が、チロシナーゼの発現量に起因するものではなく、チロシナーゼそのものの活性の低下、即ちチロシナーゼの変異に起因するものであると考えられた。
【００１８】
そこで、本発明者は、正常及び変異チロシナーゼｃＤＮＡの単離を試みた。
まず、ヒト及びマウスのチロシナーゼｃＤＮＡで保存した塩基配列を元に設計したプライマーセットでReverse-transcription PCR（ＲＴ−ＰＣＲ）を行い、正常シリアンハムスターの眼球からチロシナーゼｃＤＮＡの断片を増幅した。次に、このｃＤＮＡ断片をプローブに用い、正常シリアンハムスターの眼球から作成したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、全長のチロシナーゼｃＤＮＡを単離し、全塩基配列を決定した。タンパク質翻訳領域は１，５９０塩基からなり、５３０残基のタンパク質をコードする。
この塩基配列を配列表の配列番号１に示し、それをコードする蛋白質を配列番号２に示す。また、図６にこの塩基配列およびそれによりコードされる蛋白質をアミノ酸の一文字表記で示す。図６は正常なハムスターから得られた正常なチロシナーゼのｃＤＮＡの塩基配列を示す。推定されるシグナル配列（ＳＳ）及び膜貫通領域（ＴＭＤ）の上に線を引いている。チロシナーゼのふたつの銅結合領域（ＣｕＡ及びＣｕＢ）を四角枠で囲っている。
【００１９】
得られたハムスターのチロシナーゼは、ヒトあるいはマウスのチロシナーゼとはアミノ酸レベルで、それぞれ８５．７％あるいは９０．１％の相同性を有していた。この全長チロシナーゼをプローブとしてＲＮＡブロット解析を行ったところ、心筋症ハムスターの眼球でも大きさ量共に正常ハムスターと同様なバンドを検出した。そこで、同様に単離した眼皮膚白子症ハムスターのチロシナーゼｃＤＮＡの塩基配列を解析したところ、７８５番目の塩基（図６で矢印で示されている箇所。）がチミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）に置換され、その結果２６２番目のアミノ酸がロイシンからプロリンに変化していることを見出した。
【００２０】
チロシナーゼにおける２６２番目のロイシンは、既知のあらゆる種のチロシナーゼで保存されており、本発明のプロリン変異体は初めて見出されたものである。また、ヒトおよびマウスの眼皮膚白子症でも、これに対応する変異を伴ったチロシナーゼ遺伝子の異常に関する報告はない。
さらに、本発明者は、これらのハムスターのチロシナーゼの３次元的モデルを作成した。これを図７に示す。図７は図２と同様に本来カラー写真である、図面に代わる写真である。図７に示される３次元モデルは、銅結合蛋白質であるヘモシアニンの３次元モデルを基にして、ジーンマインデータマイニングシステム（GeneMine Data Mining system (Molecular Applications Group, Palo Alto, CA)）ソフトを用いて、本発明のハムスターのチロシナーゼの親水性領域（アミノ酸の１９位から４０６位）の３次元モデルを作成したものである。図７において、ふたつの銅結合領域は緑色（ＣｕＡ）と黄色（ＣｕＢ）で示されている。ここに２個の銅原子が固定され、チロシン及びドーパの酸化反応を促進することになる。
図７で球状（ファンデルワールスの半径）で示されているのが２６２番目のアミノ酸である。このアミノ酸は銅結合領域ではないが、ふたつの銅結合領域の距離及び角度を適正に保つためにの重要な位置となっていることがわかる。即ち、正常なチロシナーゼにおけるロイシンでは銅を結合するに適正なものとなるが、このアミノ酸がプロリンになるとふたつの銅結合領域の角度が変化し、銅原子をしっかりと保持することができなる。これがチロシナーゼの活性の低下となる原因であると考えられる。
【００２１】
つぎに、心筋症ハムスターと正常ハムスターを交配させ、この塩基置換と症状が連鎖するか否かを検討した。正常な遺伝子７８５Ｔを有する親（図８のＩ−１）と変異遺伝子７８５Ｃを有する親（図８のＩ−２）を交配させて子（図８のII−１及びII−２）を作り、これらをさらに交配させて孫（図８のIII−１、III−２、III−３及びIII−４）を作った。そして、これらの親、子及び孫が有する遺伝子の対を調べた。
【００２２】
遺伝子７８５Ｔについては次のプライマーを用いた。
CTATGATTTGAGTGTCCCAG / GAAGGATGCTGGACTGAGTA
また、遺伝子７８５Ｃについては次のプライマーを用いた。
AGTGCTCTGGCAACTTCATG / GAAGGATGCTGGACTGAGTG
結果を図８に示す。図８は図面に代わる写真である。また、これらの親、子及び孫の写真を図９に示す。図９は図２と同様に本来カラー写真である、図面に代わる写真である。
図８にも示されるように、親においては７８５Ｔ遺伝子か７８５Ｃ遺伝子のいずれかしか持っていないが、その子（Ｆ１）はいずれも両方の遺伝子を持つ雑種となっている。そして孫のうちの１匹は７８５Ｃ遺伝子のみを持つもの（III−２）が出現してきており、このものはＯＣＡ１Ｂが発症している（図９の下段）。この結果、法則どおりの遺伝をしていることがわかった。
したがって、眼皮膚白子症のハムスターは突然変異によって起こるものではなく、チロシナーゼｃＤＮＡの７８５番目のチミンがシトシンに置換することが、特異な眼皮膚白子症の遺伝的原因であることが証明された。
【００２３】
さらに、正常あるいは塩基変異を有するハムスターチロシナーゼｃＤＮＡを哺乳類発現ベクターに組み込こんだコンストラクトを作成し、Ｇ４１８抵抗性遺伝子と共にヒト由来のＨｅｌａ細胞に遺伝子導入し、Ｇ４１８存在下で培養し、標的遺伝子を安定発現する細胞株を樹立した。即ち、ＳＲαプロモーターを有する発現ベクターｐＭＥ、チロシナーゼ遺伝子を組み込んだコンストラクトとＧ４１８耐性遺伝子を有する発現コンストラクトであるｐＳＶ２ｎｅｏを同時にリポソーム法（ベーリンガーマンハイム社製）によりヒトＨｅｌａ細胞に導入し、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ含有するＤＭＥＭ１０％ＦＣＳ培地で培養してスクリーニングして、標的遺伝子を安定発現する細胞株を得た。なお、対照として、ベクターｐＭＥのみを組み込んだ細胞（Ｍｏｃｋ）を作製した。
【００２４】
図１０にその結果を示す。図１０は図２と同様に本来カラー写真である、図面に代わる写真である。図１０のモック（Ｍｏｃｋ）はベクターのみを導入した細胞株であり、２６２Ｌｅｕは正常チロシナーゼをベクターに組み込んで導入した細胞株であり、２６２Ｐｒｏは変異チロシナーゼをベクターに組み込んで導入した細胞株である。図１０のＡは抗チロシナーゼ抗体を用いて染色したときの写真であり、図１０のＢは０．１％ドーパを添加したときの写真である。各写真の左側のフェイズコントラストは位相差によるものであり、ブライトは明視野のものである。
Ａの免疫反応では、２６２Ｐｒｏにも２６２Ｌｅｕと同等のチロシナーゼタンパク質の発現を認めるが、Ｂのドーパ試験では２６２Ｐｒｏには明瞭なドーパメラニンの沈着は認められない。しかし、これをさらに拡大してみると（図１０のＢの下段）２６２Ｐｒｏのほうにもわずかにドーパメラニンの沈着が認められる（図１０Ｂの下段の写真の矢印参照）。
したがって、変異チロシナーゼを安定して発現することができる安定発現細胞株を確立することができることが示された。
【００２５】
同様な手法により本発明の変異チロシナーゼの遺伝子を動物に導入することも可能であり、本発明の変異チロシナーゼを有するトランスジェニック動物を作製することができる。具体的な方法としては、癌遺伝子を導入するのと同様な方法により本発明の変異チロシナーゼが導入されたトランスジェニック動物、例えトランスジェニックマウス、トランスジェニックラット、トランスジェニックハムスターを作製することができる。
【００２６】
本発明の変異チロシナーゼｃＤＮＡを発見したことの意義は、１）加齢と共に網膜に色素沈着を起こす特異なＯＣＡの遺伝的原因を解明したこと、２）作成した安定発現細胞はチロシナーゼタンパク質の構造活性相関の研究に有用であること、３）正常ハムスターと掛け合わせたハムスターの遺伝子診断が可能になり、心筋症遺伝子は正常だがチロシナーゼ遺伝子に点変異を有するハムスターを作成できる。この新規ハムスターは、愛玩動物として稀少価値があるのみでなく、網膜色素の視機能に及ぼす影響を研究する上で有用な実験モデル動物としての価値もある。さらに、このようなモデル動物を使用することにより、網膜色素細胞層（ＲＰＥ）における色素沈着と視力との関係を確立することが可能となり、眼皮膚白子症などのよる色素沈着の低下による視機能の低下に対する治療方法を確立してゆくことができるようになる。
【００２７】
また、本発明はチロシナーゼの変異体を提供するのみならず、その３次元的構造と活性との関係を明らかにしたことから、ポイントミューテーション技術を利用して種々のチロシナーゼの変異体の作製を可能とし、それらの３次元的構造と活性との相関を研究開発することを可能としたものである。
したがって、本発明の変異体は、ハムスターの２６２番目のアミノ酸に限定されるものではなく、種々種の位置のアミノ酸の変異体を包含するものである。
また、本発明の変異チロシナーゼに関する知見は、ハムスターに限らず、ヒト、マウスなどの哺乳動物についても同様であり、本発明はハムスターに限定されるものではない。
【００２８】
本発明の変異チロシナーゼは正常なチロシナーゼに比べてその活性は弱いが、チロシナーゼ活性を有するものであり、チロシナーゼの変異体となるものであれば、１個又はそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換され、他のアミノ酸が付加され、アミノ酸が欠失し、又はこれらが組み合わされた結果できるものであってもよい。
また、本発明の遺伝子は、ＲＮＡでもＤＮＡでもよいが、好ましくはＤＮＡであり、その塩基配列は前記した本発明の変異チロシナーゼをコードできるものであればよい。本発明の遺伝子は前記した遺伝子の相補的ものであってもよく、さらに前記した本発明の遺伝子にストリージェントな条件下でハイブリダイズし得るものであってもよい。
【００２９】
本発明のポリヌクレオチドは、変異部分を含む塩基配列を有し、少なくとも１４塩基、好ましくは２０塩基以上の塩基を有するものであり、これらの相補鎖であってもよい。本発明のポリヌクレオチドは、放射性元素、蛍光物質、化学発光物質などで標識化することもできる。このようなポリヌクレオチドは、プローブやプライマーとして利用することができ、遺伝子の診断などの有用である。
また、本発明のペプチドは、変異した部分のアミノ酸を含む少なくとも５アミノ酸残基、好ましくは７アミノ酸残基以上からなるものである。このようなペプチドはモノクローナル抗体を作製するときの抗原などとして利用することも可能である。
【００３０】
本発明のプライマーとしては、前記したものが好ましいがこれに限定されるものではなく、本発明のチロシナーゼの特徴部分をＰＣＲなどの方法により増幅することができるものであればよい。
【００３１】
【実施例】
次に、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３２】
実施例１（網膜及び脈絡膜における色素の沈着）
正常ゴールデンハムスター（ＳＬＣ社（静岡））と心筋症シリアンハムスター（ＣＭハムスター）（カナディアンハイブリッドファーム社（ノバスコティア、カナダ））のそれぞれの眼球を、４％パラホルムアルデヒド、１．５％ＰＦＡ／０．５％グルタルアルデヒドリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ；０．１Ｍ，ｐＨ７．４）で固定し、包埋して、スライスし、切片を光学顕微鏡及び位相差顕微鏡で観察した。結果を図２に図面に代わるカラー写真で示す。
光学顕微鏡による観察（図２のＢ）では、正常ゴールデンハムスター及び加齢したＣＭハムスターの網膜色素上皮及び脈絡膜において色素の沈着がみられた。また、位相差顕微鏡による観察では（図２のＣ）、正常ゴールデンハムスター及び加齢したＣＭハムスターにおいてメラノソームに内包されている色素（メラニン）が検出された。
【００３３】
実施例２（ドーパ試験）
ＣＭハムスターの眼球を凍結切片を作製し、２％ＰＦＡ／０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ６．８）を用いて４℃で１０分間で固定した後、０．１％Ｌ−ＤＯＰＡ（Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニル−アラニン，シグマ社）のＰＢＳ（ｐＨ６．８）溶液で３７℃で５時間インキュベートした。これを顕微鏡で観察した結果を図３に示す。図３はその顕微鏡写真であり、図面に代わる写真である。
【００３４】
実施例３（免疫学的試験）
正常ゴールデンハムスター及びＣＭハムスターの眼球を凍結切片を作製し、２％ＰＦＡ／０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ６．８）を用いて４℃で１０分間で固定した後、最初の抗体（ヒツジ抗チロシナーゼ抗体）、次いで第二の抗体（ウサギ抗ヒツジＩｇＧ／ＨＲＰ複合体）とインキュベートした。これをＡＥＣで検出した。
結果を図４に示す。図４は図面に代わるカラー写真である。図４の（＋）は正常ゴールデンハムスターの場合を、（−）はＣＭハムスターの場合を示す。
【００３５】
実施例４（チロシナーゼＲＮＡのノーザンブロッティング）
正常ゴールデンハムスター及びＣＭハムスターの眼球及び背面の皮膚からの全ＲＮＡ抽出物２０μｇを、１．２％ホルムアルデヒド／アガロースゲルにそれぞれ取り、これをナイロン膜に移し、３２Ｐでラベルした全長のハムスターチロシナーゼｃＤＮＡをプローブとしてハイブリダイズさせた。
結果を図５に示す。図５は図面に代わる写真である。図５のＥｙｅは眼を、Ｓｋｉｎは皮膚を示し、Ｎは正常ゴールデンハムスターを示し、ＣＭはＣＭハムスターを示す。
【００３６】
実施例５（チロシナーゼのｃＤＮＡのクローニング）
λＺＡＰＩＩファージを用いて正常ゴールデンハムスター及びＣＭハムスターののｃＤＮＡライブラリーを構築した。プライマーのセットとして、
CTTTCAGGCAGAGGTTCCTG / TGCCTGAGCACTGGCAGGTC
を用いてＲＴ−ＰＣＲ法によりｃＤＮＡフラグメントを増幅し、ライブラリーをスクリーニングした。
その結果、正常ゴールデンハムスターのライブラリーから図６に示す塩基配列を有するｃＤＮＡを得た。また、ＣＭハムスターのライブラリーからその７８５番目のチミンがシトシンに変異したｃＤＮＡを得た。
【００３７】
実施例６（チロシナーゼの３次元構造）
銅結合蛋白質の１種であるヘモシアニンの３次元モデルを基にして、ジーンマインデータマイニングシステム（GeneMine Data Mining system (Molecular Applications Group, Palo Alto, CA)）ソフトを用いて、ハムスターのチロシナーゼの親水性領域（アミノ酸の１９位から４０６位）の３次元モデルを作成した。
結果を図７に示す。図７は図面に代わるカラー写真である。
【００３８】
実施例７（チロシナーゼ遺伝子の連鎖実験）
雌の正常ゴールデンハムスター（７８５Ｔ）と雄のＣＭハムスター（７８５Ｃ）をかけ合わせて、子を作り、その子をかけ合わせて孫を作った。
これらのハムスターの肝臓からゲノムＤＮＡを調製し、遺伝子７８５Ｔについては次のプライマーセットを用い、
CTATGATTTGAGTGTCCCAG / GAAGGATGCTGGACTGAGTA
また、遺伝子７８５Ｃについては次のプライマーセットを用い、
AGTGCTCTGGCAACTTCATG / GAAGGATGCTGGACTGAGTG
それぞれの遺伝子型を決定した。
結果を図８に示す。図８は図面に代わる写真である。また、これらの親、子及び孫の写真を図９に示す。図９は図面に代わるカラー写真である。
【００３９】
実施例８（変異チロシナーゼの安定発現細胞株の調製）
ＳＲαプロモーターを有する発現ベクターｐＭＥに、７８５番目の塩基がシトシンである変異チロシナーゼのｃＤＮＡを組み込んだ構築物、及び、Ｇ４１８耐性遺伝子を有する発現構築物ｐＳＶ２ｎｅｏをそれぞれ構築した。
これらの構築物を、リポソーム法のキット（ベーリンガーマンハイム社製）を用いてヒトＨｅｌａ細胞に同時に注入した。形質転換された細胞を、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ含むＤＭＥＭ１０％ＦＣＳ培地で培養してスクリーニングして、安定発現細胞株を得た。
また、７８５番目の塩基がシトシンである変異チロシナーゼのｃＤＮＡの代わりに、正常チロシナーゼのｃＤＮＡを用いた細胞株（２６２Ｌｅｕ）、及び対照として発現ベクターｐＭＥのみで形質転換した細胞株（Ｍｏｃｋ）を調製した。
これらの細胞株を、実施例３と同様な方法により免疫学的に染色した。結果を図１０のＡに示す。図１０は図面に代わるカラー写真である。
また、これらの細胞株を、実施例２と同様な方法によりＤＯＰＡ試験を行った。結果を図１０のＢに示す。図１０のＢの下段の写真は、２６２Ｐｒｏ細胞株の位相差顕微鏡写真である。
【００４０】
【発明の効果】
チロシナーゼは、網膜色素上皮及び脈絡膜あるいは表皮におけるメラニン合成の最も重要な酵素である。しかし、タンパク質の立体構造と酵素活性との相関関係に関する厳密な研究はない。今回発明した変異チロシナーゼを発現させた細胞株を用いた酵素活性の測定、あるいは変異チロシナーゼｃＤＮＡから合成させたタンパク質の結晶解析は、チロシナーゼの構造・活性相関関係に関する新たな知見をもたらすはずである。
眼皮膚白子症の患者さんは視機能が弱いことは古くから知られている。今回発明した変異ハムスターチロシナーゼｃＤＮＡまたは、対応する部位を人工的に変異させたヒトあるいはマウスのチロシナーゼｃＤＮＡを、眼皮膚白子症を呈するマウス（例えばＢＡＬＢ／ｃマウス）の受精卵に遺伝子導入させて作出したトランスジェニックマウスは、加齢に伴う網膜色素の沈着と視機能との相関関係の研究に有用である。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、メラノソーム中でのメラニンの生合成の過程を模式的に示したものである。
【図２】図２は、正常ゴールデンハムスター及びＣＭハムスター（図２のＡ）、それらの網膜をホルマリンで固定し、そのスライスを光学顕微鏡でみたもの（図２のＢ）、及びそれを位相差顕微鏡でみたものの、図面に代わる写真である。
【図３】図３は、６週齢のＣＭハムスターの眼球をＬ−ＤＯＰＡ試験に供したときの網膜色素細胞層の様子を位相差顕微鏡で観察した、図面に代わる写真である。
【図４】図４は、２６週齢のＣＭハムスターの眼球の凍結切片を抗チロシナーゼ抗体で処理し、ＨＲＰ／ＡＥＣ系で可視化したときの網膜色素細胞層及び脈絡膜を観察した、図面に代わる写真である。
【図５】図５は、ゴールデンハムスター（Ｎ）及びＣＭハムスター（ＣＭ）の眼球及び皮膚からの全ＲＮＡを抽出物のノーザンブロットを行った結果を示す、図面に代わる写真である。
【図６】図６は、正常なハムスターから得られた正常なチロシナーゼのｃＤＮＡの塩基配列を示す。推定されるシグナル配列（ＳＳ）及び膜貫通領域（ＴＭＤ）の上に線を引いている。チロシナーゼのふたつの銅結合領域（ＣｕＡ及びＣｕＢ）を四角枠で囲っている。７８５番目の変異の位置に矢印が付されている。
【図７】図７は、ハムスターのチロシナーゼの３次元的モデルを示す、図面に代わる写真である。
【図８】図８は、心筋症ハムスターと正常ハムスターを交配させ、この塩基置換と症状が連鎖するか否かを試験した結果を示す、図面に代わる写真である。
【図９】図９は、心筋症ハムスターと正常ハムスターを交配させ、この塩基置換と症状が連鎖するか否かを試験した結果、生まれてきたハムスターを示す、図面に代わる写真である。
【図１０】図１０は、チロシナーゼ遺伝子が導入された発現細胞株を用いてメラニンの生成を試験した結果を示す、図面に代わる写真である。図１０のモック（Ｍｏｃｋ）はベクターのみを導入した細胞株であり、２６２Ｌｅｕは正常チロシナーゼ遺伝子を導入した細胞株であり、２６２Ｐｒｏは変異チロシナーゼ遺伝子を導入した細胞株である。図１０のＡは抗チロシナーゼ抗体を用いて染色したときのものであり、図１０のＢは０．１％ドーパを添加したときのものである。各々の左側のフェイズコントラストは位相差によるものであり、ブライトは明視野のものである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、チロシナーゼのふたつの銅結合領域の間にあるアミノ酸のすくなくともひとつが、他のアミノ酸に変異している変異チロシナーゼ、それをコードする遺伝子、その断片、その遺伝子が導入された安定発現細胞株及びトランスジェニック動物、並びにその検出、診断剤に関する。本発明の変異チロシナーゼは、眼皮膚白子症、より詳細には眼皮膚白子症１Ｂの発症原因となるものであり、本発明の変異チロシナーゼは眼皮膚白子症の治療、予防又は診断などに有用である。さらに本発明の遺伝子は眼皮膚白子症のモデル動物の作製にも有用であり、かつ本発明のトランスジェニック動物又は心筋症ハムスター（ＣＭハムスター）を用いて網膜色素細胞層及び脈絡膜における色素沈着と視機能との関係を調べるのにも有用である。
【０００２】
【従来の技術】
眼皮膚白子症（Oculo Cutaneus Albinism : ＯＣＡ）は、眼および皮膚におけるメラニン色素が欠損する疾患であり、病理学的には、眼（網膜色素上皮及び脈絡膜）ならびに皮膚表皮に存在するメラノサイトにメラニン色素の沈着を認めない。眼皮膚白子症は、メラミン色素が沈着しないために、皮膚や毛髪などは白く、眼は動脈血の赤色が見えて赤眼となる。眼の網膜組織に色素が沈着しないために、網膜上で光を受けることができず、その結果正常な視機能を得ることができず、重篤な疾患のひとつである。
ヒトおよびマウスの遺伝性眼皮膚白子症の原因として、メラニン色素の生合成における律速酵素であるチロシナーゼ遺伝子の塩基変異が知られている。既知のチロシナーゼ遺伝子のほとんどの塩基変異では、いずれも個体の一生を通じて眼および皮膚における色素沈着は認めない。すなわち、眼は赤眼で皮膚は白いままである。
【０００３】
メラニンは、メラノサイト（メラニン（色素）細胞）中のメラノソームでチロシンから生合成され、ドーパやインドールキノンを経て生合成されるユーメラニン（Eumelanin）、ドーパキノンとシステインから生合成されるフェオメラニン（Pheomelanin）及びトリコクロム（Trichochrome）の３種が知られている。
メラノソーム中でのメラニンの生合成の過程を模式的に示すと図１のようになる。即ち、メラノソーム膜蛋白質によりチロシンがメラノソームに取り込まれる第一の段階、メラノソームに取り込まれたチロシンがチロシナーゼの作用によりドーパ（ＤＯＰＡ）を経てドーパキノン（ＤＯＰＡquinone）に返還される第二の段階、さらに生成したドーパキノンがチロシナーゼ関連蛋白質−１の作用により、
ユーメラニン（Eumelanin）やフェオメラニン（Pheomelanin）などのメラニンを生成する第三の段階によりメラニンの沈着が起こるとされている。
【０００４】
ところで、眼皮膚白子症は、症状や発症原因に応じて、ＯＣＡ１、ＯＣＡ２及びＯＣＡ３の３種に分類され、さらにＯＣＡ１はＯＣＡ１Ａ、ＯＣＡ１Ｂ及びＯＣＡ１−ＳＴに分類されている。次の表１に眼皮膚白子症の分類を示す。
【０００５】
【表１】
ＯＣＡ２は、メラノソームにチロシンを取り込むメラノソーム膜蛋白質の異常によるものであり、そのモデル動物としてはピンクアイダイリューションマウスが知られている。ＯＣＡ３は、メラノソーム中で生成したドーパキノンをメラミンに返還するチロシナーゼ関連蛋白質−１の異常にものであり、そのモデル動物としてはブラウンマウスが知られている。
一方、ＯＣＡ１はいずれも前記したメラニン生合成過程の第二段階のチロシナーゼ活性の異常に起因するものであり、そのサブタイプとしてＯＣＡ１Ａ、ＯＣＡ１Ｂ及びＯＣＡ１−ＴＳの３種に分類されている。ＯＣＡ１Ａは、チロシナーゼ活性が全く無いものであり、そのモデル動物としてはアルビノ（ＢＡＬＢ／ｃ）マウスが知られている。また、ＯＣＡ１−ＴＳは３５℃以上でチロシナーゼの活性が失活するものであり、３５℃以下の状態では正常な色素の沈着が起こるが、３５℃以上になるとチロシナーゼが失活し色素の沈着が起こらない。そのモデル動物としてはシアミーズキャット（Siamese cat）が知られている。
【０００７】
ＯＣＡ１Ｂは、生まれた直後は色素の沈着がないが、加齢と共に色素が沈着してくるが、多くの場合充分な色素の沈着までには至らない。ＯＣＡ１Ｂは、ＯＣＡ１Ａのようにチロシナーゼの活性が全くないのではなく、チロシナーゼ活性は有しているがその程度が極めて弱く、充分な色素沈着が得られないのである。そして、眼皮膚白子症の他の分類のものは前述してきたように、そのモデル動物が既に確立されているのであるが、このＯＣＡ１Ｂについてはモデル動物が確立されていないのが現状である。
したがって、眼皮膚白子症のなかでもＯＣＡ１Ｂについては、モデル動物の確立もされておらず、その原因や治療方法などについて充分な研究開発がされていないおらず、この開発が望まれている。また、ＯＣＡ１Ｂモデル動物は、眼における後天的な色素沈着と視機能の関係、あるいは最近開発されつつある網膜色素上皮移植の妥当性を検討する上で極めて重要である。
【０００８】
一方、心筋症シリアンハムスター（Cardiomyopathic Hamster：以下、ＣＭハムスターという。）は、遺伝性の心筋症や筋ジストロフィーのモデル動物として使用されている。これは、ＣＭハムスターは、そのゲノムにおいてδ−ザルコグリカン（δ−sarcoglycan）遺伝子を欠損していることに起因しているとされている（Sakamoto, et al., FEBS Lett., 447: 124-8 (1999) ; Sakamoto, et al., Proc.Natl.Acad. Sci. U.S.A., 94: 13873-13878(1997)）。
また、このＣＭハムスターは生まれた直後は赤眼であるが、加齢と共に徐々に黒眼になる。この原因として、従来心筋症により血色の異常が起こり、その血色の変化が黒眼としてみられるものと考えられており、ＣＭハムスターの色素の沈着や遺伝的な解明は今まで行われおらず、ＣＭハムスターにおける眼皮膚白子症の確認とその原因の究明が望まれていた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＣＭハムスターにおける眼皮膚白子症の病変部の観察、原因遺伝子の解明、及びその作用機構の３次元的な解析を行うことにより、ＯＣＡ１Ｂのモデル動物を確立すると共に、その治療方法、及び網膜における色素沈着と視機能との関連性を明確にすることを目的とするものである。
本発明は、個体の加齢と共に網膜色素上皮及び脈絡膜にメラニンが沈着し、赤眼から黒眼に変化する特異な眼皮膚白子症を引き起こす原因遺伝子の単離ならびにその遺伝子を用いて作られるタンパク質、細胞株ならびにトランスジェニック動物を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、遺伝的に心筋症を発症するハムスターが、前述の特異な眼皮膚白子症を呈することに着目した。加齢と共に色素沈着を起こす眼皮膚白子症は従来報告がなく、ＣＭハムスターが加齢と共に色素沈着を起こす眼皮膚白子症であることを確認することから研究をはじめた。その結果、ＣＭハムスターは加齢と共に色素沈着を起こす眼皮膚白子症であることが判明し、そしてその原因遺伝子として、従来報告のない塩基変異を有するチロシナーゼｃＤＮＡを単離することに成功した。
【００１１】
本発明は、チロシナーゼのふたつの銅結合領域の間にあるアミノ酸の少なくともひとつが、他のアミノ酸に変異している変異チロシナーゼ、好ましくは正常なハムスターのチロシナーゼの２６２番目のアミノ酸に相当するアミノ酸が、他のアミノ酸に変異している変異チロシナーゼ、より好ましくはアミノ酸がプロリンに変異している変異チロシナーゼに関する。本発明はこれらの変異チロシナーゼの部分配列からなるペプチドにも関する。好ましくは本発明のペプチドは、前記した変異チロシナーゼのアミノ酸の変異した部分を含む少なくとも５アミノ酸残基からなるペプチドに関する。
また、本発明は、前記した本発明の変異チロシナーゼのいずれかをコードする遺伝子、好ましくは正常なハムスターのチロシナーゼの７８５番目のチミンに相当する塩基が、シトシン塩基に変異している遺伝子に関する。本発明はこれらの遺伝子の部分配列からなるポリヌクレオチドにも関する。好ましくは本発明は、前記した遺伝子の塩基の変異した部分を含む少なくとも１４塩基からなるポリヌクレオチドに関する。また、変異した部分を増幅することができるプライマーに関する。
【００１２】
また、本発明は、前記した本発明の遺伝子が導入された安定発現細胞株又はトランスジェニック動物に関する。
さらに、本発明は、心筋症ハムスター（ＣＭハムスター）の眼皮膚白子症のモデル動物としての使用に関する。
本発明は、前記したポリヌクレオチド及び／又はプライマーを含有してなる変異チロシナーゼの検出、診断剤に関する。
【００１３】
本発明者は、まず、ＣＭハムスターが加齢と共に色素沈着を起こす眼皮膚白子症であること確認する実験を行った。
図２は、ＣＭハムスターの図面に代わる写真である。なお、図２の写真は本来カラーであるが、方式上の制限から白黒として提出されているが、カラーの原本をいつでも利用することができる。図２のＡの１は、正常な生後６週のゴールデンハムスター（図２のＡの１）とＣＭハムスター（図２のＡの２〜４）の写真である。ＣＭハムスターは全体に白くなっていることがわかる。図２のＡの２は生後６週のＣＭハムスターの写真である。眼が赤く色素が無いことがわかる。図２のＡの３及び４は、それぞれ生後２６週、４５週のＣＭハムスターの写真であり、眼が少しづつ黒くなってきている様子がわかる。
図２のＢは、ゴールデンハムスター（図２のＢの１）とＣＭハムスター（図２のＢの２〜４）の網膜をホルマリンで固定し、そのスライスを光学顕微鏡でみたものである。図２のＢの１では、色素上皮に色素が正常に沈着していることがわかる。一方、生後直後のＣＭハムスター（図２のＢの２）では、色素の沈着が全く無いことがわかる。そして、ＣＭハムスターの加齢と共に色素上皮に少しづつ色素の沈着が生じてきていることが、図２のＢの３及び４からわかる。
【００１４】
図２のＢの３及び４では、ＣＭハムスターの加齢と共に、黒い顆粒が色素上皮付近に生じてきていることはわかるが、これがメラニンの沈着であるか否かを確定することはできない。そこで、この部分をさらに拡大して、電子顕微鏡で観察することにより、図２のＢの３及び４における黒色の沈着物がメラニンであることを明らかにしたのが図２のＣの１及び２の写真である。図２のＣの１及び２では、色素上皮を含めてその周囲の組織はいずれも正常な形態を保持しており、黒色の沈着物が色素上皮の周囲の組織の凝集物でないことは明らかである。そして、メラニンの存在している部分が明確に染色されている。
以上の実験から、ＣＭハムスターにおける加齢に伴う色素沈着がメラニンの沈着によるものであることが判明した。このことは本発明者が初めて明らかにしたことである。
【００１５】
次に、６週齢のＣＭハムスターの眼球をスライスし、これに０．１％のＬ−ＤＯＰＡ（Ｌ−３，４−dihydroxyphenylalanine）水溶液を加えて３７℃で４時間インキュベートした後の網膜色素細胞層（ＲＰＥ）の様子を位相差顕微鏡で観察した結果が図３である。図３は図２と同様に本来カラー写真である、図面に代わる写真である。Ｌ−ＤＯＰＡの添加により、極僅かではあるがドーパ−メラニンの沈着がはっきりと見られた。
これは、ＣＭハムスターにはチロシナーゼ活性があるが、その活性が低いことを示している。
【００１６】
チロシナーゼが存在していることを確認するために、チロシナーゼの免疫反応を行った。２６週齢のＣＭハムスターの眼球の凍結切片を作製し、これに抗チロシナーゼ抗体を加え、ＨＲＰ／ＡＥＣ系で可視化したときの網膜色素細胞層及び脈絡膜の写真を図４に示す。図４も図２と同様に本来カラー写真である、図面に代わる写真である。この結果、ＣＭハムスターにチロシナーゼ（赤色に染色。）が存在していることが判明した。
さらに、ＲＮＡのノーザンブロットを行った。ゴールデンハムスター（Ｎ）及びＣＭハムスター（ＣＭ）の眼球及び皮膚から全ＲＮＡを抽出し（レーン当たり２０μｇ）、全長のチロシナーゼｃＤＮＡをプローブとしてノーザンブロットを行った結果を図５に示す。図５は図面に代わる写真である。この結果、ＣＭハムスターにも正常なゴールデンハムスターとほぼ同程度の量のチロシナーゼＲＮＡが発現していることがわかった。
以上のことから、ＣＭハムスターは眼及び皮膚においても正常なハムスターと同程度の量のチロシナーゼが発現しているが、ＣＭハムスターのチロシナーゼ活性は正常のハムスターに比べて極めて低いことがわかった。
【００１７】
心筋症ハムスター（ＣＭハムスター）は、心筋症の他に特異な眼皮膚白子症（Oculo Cutaneus Albinism：ＯＣＡ）を合併し、ＣＭハムスターは生直後の赤眼が加齢と共に黒眼になってゆくことが知られていた。しかし、その原因も機構も知られていなかったが、以上の実験により本発明者が初めてこれを明らかにした。即ち、これは生直後の網膜色素細胞層（ＲＰＥ）及び脈絡膜にはメラニン色素は存在せず赤眼であったものが、加齢と共にＲＰＥにメラニン色素の沈着が起こり黒眼になる。そして、このメラニン色素の沈着はＬ−ＤＯＰＡのドーパキノンへの変換に寄与しているチロシナーゼの活性の低下に起因しているが、ＣＭハムスターのチロシナーゼの発現量自体は正常なハムスターと変わっていないのである。
したがって、ＣＭハムスターのＯＣＡの遺伝的原因が、チロシナーゼの発現量に起因するものではなく、チロシナーゼそのものの活性の低下、即ちチロシナーゼの変異に起因するものであると考えられた。
【００１８】
そこで、本発明者は、正常及び変異チロシナーゼｃＤＮＡの単離を試みた。
まず、ヒト及びマウスのチロシナーゼｃＤＮＡで保存した塩基配列を元に設計したプライマーセットでReverse-transcription PCR（ＲＴ−ＰＣＲ）を行い、正常シリアンハムスターの眼球からチロシナーゼｃＤＮＡの断片を増幅した。次に、このｃＤＮＡ断片をプローブに用い、正常シリアンハムスターの眼球から作成したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、全長のチロシナーゼｃＤＮＡを単離し、全塩基配列を決定した。タンパク質翻訳領域は１，５９０塩基からなり、５３０残基のタンパク質をコードする。
この塩基配列を配列表の配列番号１に示し、それをコードする蛋白質を配列番号２に示す。また、図６にこの塩基配列およびそれによりコードされる蛋白質をアミノ酸の一文字表記で示す。図６は正常なハムスターから得られた正常なチロシナーゼのｃＤＮＡの塩基配列を示す。推定されるシグナル配列（ＳＳ）及び膜貫通領域（ＴＭＤ）の上に線を引いている。チロシナーゼのふたつの銅結合領域（ＣｕＡ及びＣｕＢ）を四角枠で囲っている。
【００１９】
得られたハムスターのチロシナーゼは、ヒトあるいはマウスのチロシナーゼとはアミノ酸レベルで、それぞれ８５．７％あるいは９０．１％の相同性を有していた。この全長チロシナーゼをプローブとしてＲＮＡブロット解析を行ったところ、心筋症ハムスターの眼球でも大きさ量共に正常ハムスターと同様なバンドを検出した。そこで、同様に単離した眼皮膚白子症ハムスターのチロシナーゼｃＤＮＡの塩基配列を解析したところ、７８５番目の塩基（図６で矢印で示されている箇所。）がチミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）に置換され、その結果２６２番目のアミノ酸がロイシンからプロリンに変化していることを見出した。
【００２０】
チロシナーゼにおける２６２番目のロイシンは、既知のあらゆる種のチロシナーゼで保存されており、本発明のプロリン変異体は初めて見出されたものである。また、ヒトおよびマウスの眼皮膚白子症でも、これに対応する変異を伴ったチロシナーゼ遺伝子の異常に関する報告はない。
さらに、本発明者は、これらのハムスターのチロシナーゼの３次元的モデルを作成した。これを図７に示す。図７は図２と同様に本来カラー写真である、図面に代わる写真である。図７に示される３次元モデルは、銅結合蛋白質であるヘモシアニンの３次元モデルを基にして、ジーンマインデータマイニングシステム（GeneMine Data Mining system (Molecular Applications Group, Palo Alto, CA)）ソフトを用いて、本発明のハムスターのチロシナーゼの親水性領域（アミノ酸の１９位から４０６位）の３次元モデルを作成したものである。図７において、ふたつの銅結合領域は緑色（ＣｕＡ）と黄色（ＣｕＢ）で示されている。ここに２個の銅原子が固定され、チロシン及びドーパの酸化反応を促進することになる。
図７で球状（ファンデルワールスの半径）で示されているのが２６２番目のアミノ酸である。このアミノ酸は銅結合領域ではないが、ふたつの銅結合領域の距離及び角度を適正に保つためにの重要な位置となっていることがわかる。即ち、正常なチロシナーゼにおけるロイシンでは銅を結合するに適正なものとなるが、このアミノ酸がプロリンになるとふたつの銅結合領域の角度が変化し、銅原子をしっかりと保持することができなる。これがチロシナーゼの活性の低下となる原因であると考えられる。
【００２１】
つぎに、心筋症ハムスターと正常ハムスターを交配させ、この塩基置換と症状が連鎖するか否かを検討した。正常な遺伝子７８５Ｔを有する親（図８のＩ−１）と変異遺伝子７８５Ｃを有する親（図８のＩ−２）を交配させて子（図８のII−１及びII−２）を作り、これらをさらに交配させて孫（図８のIII−１、III−２、III−３及びIII−４）を作った。そして、これらの親、子及び孫が有する遺伝子の対を調べた。
【００２２】
遺伝子７８５Ｔについては次のプライマーを用いた。
CTATGATTTGAGTGTCCCAG / GAAGGATGCTGGACTGAGTA
また、遺伝子７８５Ｃについては次のプライマーを用いた。
AGTGCTCTGGCAACTTCATG / GAAGGATGCTGGACTGAGTG
結果を図８に示す。図８は図面に代わる写真である。また、これらの親、子及び孫の写真を図９に示す。図９は図２と同様に本来カラー写真である、図面に代わる写真である。
図８にも示されるように、親においては７８５Ｔ遺伝子か７８５Ｃ遺伝子のいずれかしか持っていないが、その子（Ｆ１）はいずれも両方の遺伝子を持つ雑種となっている。そして孫のうちの１匹は７８５Ｃ遺伝子のみを持つもの（III−２）が出現してきており、このものはＯＣＡ１Ｂが発症している（図９の下段）。この結果、法則どおりの遺伝をしていることがわかった。
したがって、眼皮膚白子症のハムスターは突然変異によって起こるものではなく、チロシナーゼｃＤＮＡの７８５番目のチミンがシトシンに置換することが、特異な眼皮膚白子症の遺伝的原因であることが証明された。
【００２３】
さらに、正常あるいは塩基変異を有するハムスターチロシナーゼｃＤＮＡを哺乳類発現ベクターに組み込こんだコンストラクトを作成し、Ｇ４１８抵抗性遺伝子と共にヒト由来のＨｅｌａ細胞に遺伝子導入し、Ｇ４１８存在下で培養し、標的遺伝子を安定発現する細胞株を樹立した。即ち、ＳＲαプロモーターを有する発現ベクターｐＭＥ、チロシナーゼ遺伝子を組み込んだコンストラクトとＧ４１８耐性遺伝子を有する発現コンストラクトであるｐＳＶ２ｎｅｏを同時にリポソーム法（ベーリンガーマンハイム社製）によりヒトＨｅｌａ細胞に導入し、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ含有するＤＭＥＭ１０％ＦＣＳ培地で培養してスクリーニングして、標的遺伝子を安定発現する細胞株を得た。なお、対照として、ベクターｐＭＥのみを組み込んだ細胞（Ｍｏｃｋ）を作製した。
【００２４】
図１０にその結果を示す。図１０は図２と同様に本来カラー写真である、図面に代わる写真である。図１０のモック（Ｍｏｃｋ）はベクターのみを導入した細胞株であり、２６２Ｌｅｕは正常チロシナーゼをベクターに組み込んで導入した細胞株であり、２６２Ｐｒｏは変異チロシナーゼをベクターに組み込んで導入した細胞株である。図１０のＡは抗チロシナーゼ抗体を用いて染色したときの写真であり、図１０のＢは０．１％ドーパを添加したときの写真である。各写真の左側のフェイズコントラストは位相差によるものであり、ブライトは明視野のものである。
Ａの免疫反応では、２６２Ｐｒｏにも２６２Ｌｅｕと同等のチロシナーゼタンパク質の発現を認めるが、Ｂのドーパ試験では２６２Ｐｒｏには明瞭なドーパメラニンの沈着は認められない。しかし、これをさらに拡大してみると（図１０のＢの下段）２６２Ｐｒｏのほうにもわずかにドーパメラニンの沈着が認められる（図１０Ｂの下段の写真の矢印参照）。
したがって、変異チロシナーゼを安定して発現することができる安定発現細胞株を確立することができることが示された。
【００２５】
同様な手法により本発明の変異チロシナーゼの遺伝子を動物に導入することも可能であり、本発明の変異チロシナーゼを有するトランスジェニック動物を作製することができる。具体的な方法としては、癌遺伝子を導入するのと同様な方法により本発明の変異チロシナーゼが導入されたトランスジェニック動物、例えトランスジェニックマウス、トランスジェニックラット、トランスジェニックハムスターを作製することができる。
【００２６】
本発明の変異チロシナーゼｃＤＮＡを発見したことの意義は、１）加齢と共に網膜に色素沈着を起こす特異なＯＣＡの遺伝的原因を解明したこと、２）作成した安定発現細胞はチロシナーゼタンパク質の構造活性相関の研究に有用であること、３）正常ハムスターと掛け合わせたハムスターの遺伝子診断が可能になり、心筋症遺伝子は正常だがチロシナーゼ遺伝子に点変異を有するハムスターを作成できる。この新規ハムスターは、愛玩動物として稀少価値があるのみでなく、網膜色素の視機能に及ぼす影響を研究する上で有用な実験モデル動物としての価値もある。さらに、このようなモデル動物を使用することにより、網膜色素細胞層（ＲＰＥ）における色素沈着と視力との関係を確立することが可能となり、眼皮膚白子症などのよる色素沈着の低下による視機能の低下に対する治療方法を確立してゆくことができるようになる。
【００２７】
また、本発明はチロシナーゼの変異体を提供するのみならず、その３次元的構造と活性との関係を明らかにしたことから、ポイントミューテーション技術を利用して種々のチロシナーゼの変異体の作製を可能とし、それらの３次元的構造と活性との相関を研究開発することを可能としたものである。
したがって、本発明の変異体は、ハムスターの２６２番目のアミノ酸に限定されるものではなく、種々種の位置のアミノ酸の変異体を包含するものである。
また、本発明の変異チロシナーゼに関する知見は、ハムスターに限らず、ヒト、マウスなどの哺乳動物についても同様であり、本発明はハムスターに限定されるものではない。
【００２８】
本発明の変異チロシナーゼは正常なチロシナーゼに比べてその活性は弱いが、チロシナーゼ活性を有するものであり、チロシナーゼの変異体となるものであれば、１個又はそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換され、他のアミノ酸が付加され、アミノ酸が欠失し、又はこれらが組み合わされた結果できるものであってもよい。
また、本発明の遺伝子は、ＲＮＡでもＤＮＡでもよいが、好ましくはＤＮＡであり、その塩基配列は前記した本発明の変異チロシナーゼをコードできるものであればよい。本発明の遺伝子は前記した遺伝子の相補的ものであってもよく、さらに前記した本発明の遺伝子にストリージェントな条件下でハイブリダイズし得るものであってもよい。
【００２９】
本発明のポリヌクレオチドは、変異部分を含む塩基配列を有し、少なくとも１４塩基、好ましくは２０塩基以上の塩基を有するものであり、これらの相補鎖であってもよい。本発明のポリヌクレオチドは、放射性元素、蛍光物質、化学発光物質などで標識化することもできる。このようなポリヌクレオチドは、プローブやプライマーとして利用することができ、遺伝子の診断などの有用である。
また、本発明のペプチドは、変異した部分のアミノ酸を含む少なくとも５アミノ酸残基、好ましくは７アミノ酸残基以上からなるものである。このようなペプチドはモノクローナル抗体を作製するときの抗原などとして利用することも可能である。
【００３０】
本発明のプライマーとしては、前記したものが好ましいがこれに限定されるものではなく、本発明のチロシナーゼの特徴部分をＰＣＲなどの方法により増幅することができるものであればよい。
【００３１】
【実施例】
次に、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３２】
実施例１（網膜及び脈絡膜における色素の沈着）
正常ゴールデンハムスター（ＳＬＣ社（静岡））と心筋症シリアンハムスター（ＣＭハムスター）（カナディアンハイブリッドファーム社（ノバスコティア、カナダ））のそれぞれの眼球を、４％パラホルムアルデヒド、１．５％ＰＦＡ／０．５％グルタルアルデヒドリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ；０．１Ｍ，ｐＨ７．４）で固定し、包埋して、スライスし、切片を光学顕微鏡及び位相差顕微鏡で観察した。結果を図２に図面に代わるカラー写真で示す。
光学顕微鏡による観察（図２のＢ）では、正常ゴールデンハムスター及び加齢したＣＭハムスターの網膜色素上皮及び脈絡膜において色素の沈着がみられた。また、位相差顕微鏡による観察では（図２のＣ）、正常ゴールデンハムスター及び加齢したＣＭハムスターにおいてメラノソームに内包されている色素（メラニン）が検出された。
【００３３】
実施例２（ドーパ試験）
ＣＭハムスターの眼球を凍結切片を作製し、２％ＰＦＡ／０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ６．８）を用いて４℃で１０分間で固定した後、０．１％Ｌ−ＤＯＰＡ（Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニル−アラニン，シグマ社）のＰＢＳ（ｐＨ６．８）溶液で３７℃で５時間インキュベートした。これを顕微鏡で観察した結果を図３に示す。図３はその顕微鏡写真であり、図面に代わる写真である。
【００３４】
実施例３（免疫学的試験）
正常ゴールデンハムスター及びＣＭハムスターの眼球を凍結切片を作製し、２％ＰＦＡ／０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ６．８）を用いて４℃で１０分間で固定した後、最初の抗体（ヒツジ抗チロシナーゼ抗体）、次いで第二の抗体（ウサギ抗ヒツジＩｇＧ／ＨＲＰ複合体）とインキュベートした。これをＡＥＣで検出した。
結果を図４に示す。図４は図面に代わるカラー写真である。図４の（＋）は正常ゴールデンハムスターの場合を、（−）はＣＭハムスターの場合を示す。
【００３５】
実施例４（チロシナーゼＲＮＡのノーザンブロッティング）
正常ゴールデンハムスター及びＣＭハムスターの眼球及び背面の皮膚からの全ＲＮＡ抽出物２０μｇを、１．２％ホルムアルデヒド／アガロースゲルにそれぞれ取り、これをナイロン膜に移し、３２Ｐでラベルした全長のハムスターチロシナーゼｃＤＮＡをプローブとしてハイブリダイズさせた。
結果を図５に示す。図５は図面に代わる写真である。図５のＥｙｅは眼を、Ｓｋｉｎは皮膚を示し、Ｎは正常ゴールデンハムスターを示し、ＣＭはＣＭハムスターを示す。
【００３６】
実施例５（チロシナーゼのｃＤＮＡのクローニング）
λＺＡＰＩＩファージを用いて正常ゴールデンハムスター及びＣＭハムスターののｃＤＮＡライブラリーを構築した。プライマーのセットとして、
CTTTCAGGCAGAGGTTCCTG / TGCCTGAGCACTGGCAGGTC
を用いてＲＴ−ＰＣＲ法によりｃＤＮＡフラグメントを増幅し、ライブラリーをスクリーニングした。
その結果、正常ゴールデンハムスターのライブラリーから図６に示す塩基配列を有するｃＤＮＡを得た。また、ＣＭハムスターのライブラリーからその７８５番目のチミンがシトシンに変異したｃＤＮＡを得た。
【００３７】
実施例６（チロシナーゼの３次元構造）
銅結合蛋白質の１種であるヘモシアニンの３次元モデルを基にして、ジーンマインデータマイニングシステム（GeneMine Data Mining system (Molecular Applications Group, Palo Alto, CA)）ソフトを用いて、ハムスターのチロシナーゼの親水性領域（アミノ酸の１９位から４０６位）の３次元モデルを作成した。
結果を図７に示す。図７は図面に代わるカラー写真である。
【００３８】
実施例７（チロシナーゼ遺伝子の連鎖実験）
雌の正常ゴールデンハムスター（７８５Ｔ）と雄のＣＭハムスター（７８５Ｃ）をかけ合わせて、子を作り、その子をかけ合わせて孫を作った。
これらのハムスターの肝臓からゲノムＤＮＡを調製し、遺伝子７８５Ｔについては次のプライマーセットを用い、
CTATGATTTGAGTGTCCCAG / GAAGGATGCTGGACTGAGTA
また、遺伝子７８５Ｃについては次のプライマーセットを用い、
AGTGCTCTGGCAACTTCATG / GAAGGATGCTGGACTGAGTG
それぞれの遺伝子型を決定した。
結果を図８に示す。図８は図面に代わる写真である。また、これらの親、子及び孫の写真を図９に示す。図９は図面に代わるカラー写真である。
【００３９】
実施例８（変異チロシナーゼの安定発現細胞株の調製）
ＳＲαプロモーターを有する発現ベクターｐＭＥに、７８５番目の塩基がシトシンである変異チロシナーゼのｃＤＮＡを組み込んだ構築物、及び、Ｇ４１８耐性遺伝子を有する発現構築物ｐＳＶ２ｎｅｏをそれぞれ構築した。
これらの構築物を、リポソーム法のキット（ベーリンガーマンハイム社製）を用いてヒトＨｅｌａ細胞に同時に注入した。形質転換された細胞を、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ含むＤＭＥＭ１０％ＦＣＳ培地で培養してスクリーニングして、安定発現細胞株を得た。
また、７８５番目の塩基がシトシンである変異チロシナーゼのｃＤＮＡの代わりに、正常チロシナーゼのｃＤＮＡを用いた細胞株（２６２Ｌｅｕ）、及び対照として発現ベクターｐＭＥのみで形質転換した細胞株（Ｍｏｃｋ）を調製した。
これらの細胞株を、実施例３と同様な方法により免疫学的に染色した。結果を図１０のＡに示す。図１０は図面に代わるカラー写真である。
また、これらの細胞株を、実施例２と同様な方法によりＤＯＰＡ試験を行った。結果を図１０のＢに示す。図１０のＢの下段の写真は、２６２Ｐｒｏ細胞株の位相差顕微鏡写真である。
【００４０】
【発明の効果】
チロシナーゼは、網膜色素上皮及び脈絡膜あるいは表皮におけるメラニン合成の最も重要な酵素である。しかし、タンパク質の立体構造と酵素活性との相関関係に関する厳密な研究はない。今回発明した変異チロシナーゼを発現させた細胞株を用いた酵素活性の測定、あるいは変異チロシナーゼｃＤＮＡから合成させたタンパク質の結晶解析は、チロシナーゼの構造・活性相関関係に関する新たな知見をもたらすはずである。
眼皮膚白子症の患者さんは視機能が弱いことは古くから知られている。今回発明した変異ハムスターチロシナーゼｃＤＮＡまたは、対応する部位を人工的に変異させたヒトあるいはマウスのチロシナーゼｃＤＮＡを、眼皮膚白子症を呈するマウス（例えばＢＡＬＢ／ｃマウス）の受精卵に遺伝子導入させて作出したトランスジェニックマウスは、加齢に伴う網膜色素の沈着と視機能との相関関係の研究に有用である。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、メラノソーム中でのメラニンの生合成の過程を模式的に示したものである。
【図２】図２は、正常ゴールデンハムスター及びＣＭハムスター（図２のＡ）、それらの網膜をホルマリンで固定し、そのスライスを光学顕微鏡でみたもの（図２のＢ）、及びそれを位相差顕微鏡でみたものの、図面に代わる写真である。
【図３】図３は、６週齢のＣＭハムスターの眼球をＬ−ＤＯＰＡ試験に供したときの網膜色素細胞層の様子を位相差顕微鏡で観察した、図面に代わる写真である。
【図４】図４は、２６週齢のＣＭハムスターの眼球の凍結切片を抗チロシナーゼ抗体で処理し、ＨＲＰ／ＡＥＣ系で可視化したときの網膜色素細胞層及び脈絡膜を観察した、図面に代わる写真である。
【図５】図５は、ゴールデンハムスター（Ｎ）及びＣＭハムスター（ＣＭ）の眼球及び皮膚からの全ＲＮＡを抽出物のノーザンブロットを行った結果を示す、図面に代わる写真である。
【図６】図６は、正常なハムスターから得られた正常なチロシナーゼのｃＤＮＡの塩基配列を示す。推定されるシグナル配列（ＳＳ）及び膜貫通領域（ＴＭＤ）の上に線を引いている。チロシナーゼのふたつの銅結合領域（ＣｕＡ及びＣｕＢ）を四角枠で囲っている。７８５番目の変異の位置に矢印が付されている。
【図７】図７は、ハムスターのチロシナーゼの３次元的モデルを示す、図面に代わる写真である。
【図８】図８は、心筋症ハムスターと正常ハムスターを交配させ、この塩基置換と症状が連鎖するか否かを試験した結果を示す、図面に代わる写真である。
【図９】図９は、心筋症ハムスターと正常ハムスターを交配させ、この塩基置換と症状が連鎖するか否かを試験した結果、生まれてきたハムスターを示す、図面に代わる写真である。
【図１０】図１０は、チロシナーゼ遺伝子が導入された発現細胞株を用いてメラニンの生成を試験した結果を示す、図面に代わる写真である。図１０のモック（Ｍｏｃｋ）はベクターのみを導入した細胞株であり、２６２Ｌｅｕは正常チロシナーゼ遺伝子を導入した細胞株であり、２６２Ｐｒｏは変異チロシナーゼ遺伝子を導入した細胞株である。図１０のＡは抗チロシナーゼ抗体を用いて染色したときのものであり、図１０のＢは０．１％ドーパを添加したときのものである。各々の左側のフェイズコントラストは位相差によるものであり、ブライトは明視野のものである。
Claims (13)
- 正常なシリアンハムスターのチロシナーゼの２６２番目のアミノ酸に相当するアミノ酸が、プロリンに変異している変異チロシナーゼ。
- 変異チロシナーゼがハムスター由来のものである請求項１に記載の変異チロシナーゼ。
- 請求項１又は２に記載の変異チロシナーゼをコードする遺伝子。
- 正常なハムスターのチロシナーゼの７８５番目のチミンに相当する塩基が、シトシン塩基に変異している請求項３に記載の遺伝子。
- 請求項３又は４に記載の遺伝子の塩基の変異した部分を含む少なくとも２０塩基からなるポリヌクレオチド。
- 標識されたポリヌクレオチドである請求項５に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項５又は６に記載されたポリヌクレオチドからなるプローブ又はプライマー。
- 次の塩基配列、
AGTGCTCTGGCAACTTCATG / GAAGGATGCTGGACTGAGTG
からなるＰＣＲ用のプライマー、又はさらに次の塩基配列、
CTATGATTTGAGTGTCCCAG / GAAGGATGCTGGACTGAGTA
を含むＰＣＲ用のプライマー。 - 請求項３又は４に記載の遺伝子が導入された安定発現細胞株。
- 細胞が、ヒトＨｅｌａ細胞である請求項９に記載の安定発現細胞株。
- 請求項３又は４に記載の遺伝子を、眼皮膚白子症を呈するアルビノ (albino) モデル動物に対して遺伝子導入した、非ヒトトランスジェニック動物。
- 請求項４に記載の変異チロシナーゼ遺伝子をホモで有している心筋症ハムスター（ＣＭハムスター）、もしくはその子孫の眼皮膚白子症のモデル動物としての使用。
- 請求項７又は８に記載されたプローブ又はプライマーを含有してなる変異チロシナーゼの検出、診断剤。
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