JP5099856B2 - 代謝症候群の治療もしくは予防剤、検査方法、検査薬、及び代謝症候群の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
Shindo T et al. Circulation. 2000 Imai Y, Shindo T et al. ATVB 2002 Niu P, Shindo T et al. Circulation 2004 Shindo T et al. Circulation. 2001 Kato J et al. Hypertens Res. 2002 Numbu T et al. Regul Pept. 2005
(a)配列番号1記載の塩基配列を有するDNA
(b)配列番号1記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するDNA
(c)配列番号2記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び/又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA
(d)配列番号1記載の塩基配列と90%以上の相同性を有する塩基配列からなるDNA
被験者の細胞からDNAを抽出する抽出手順と、
抽出された前記DNAを鋳型とし、配列番号3記載の塩基配列からなるDNA又はその発現制御領域のDNAの一部又は全部を特異的に増幅できるプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う増幅手順と、
増幅されたDNAの塩基配列を解読する解読手順と、
解読された塩基配列を、配列番号3記載の塩基配列と比較する比較手順と、を含む検査方法。
配列番号2記載のアミノ酸配列、又は配列番号2記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び/又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドと被検物質とを接触させる手順と、
前記ポリペプチドと前記被検物質との結合を検出する手順と、を含むスクリーニング方法。
内在性RAMP2遺伝子が変異又はノックアウトされた動物に被検物質を投与する手順と、
代謝症候群の症状改善を検出する手順と、を含むスクリーニング方法。
配列番号1記載の塩基配列を有するDNA、配列番号1記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するDNA、又は配列番号1記載の塩基配列と90%以上の相同性を有する塩基配列からなるDNAを発現する細胞と被検物質とを接触させる手順と、
前記DNAの発現量の変化を検出する手順と、を含むスクリーニング方法。
配列番号1記載の塩基配列を有するDNA、配列番号1記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するDNA、又は配列番号1記載の塩基配列と90%以上の相同性を有する塩基配列からなるDNAを発現する細胞と被検物質とを接触させる手順と、
前記DNAから合成されるタンパク質の細胞内局在の変化を検出する手順と、を含むスクリーニング方法。
配列番号6記載のアミノ酸配列、又は配列番号6記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び/又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、このポリペプチドを分解可能な酵素、及び被検物質を共存させる手順と、
所定期間後における前記ポリペプチドの残存量を測定する手順と、
残存量の測定値を、前記被検物質の非存在下で測定された残存量と比較する手順と、を含むスクリーニング方法。
配列番号1記載の塩基配列を有するDNA、配列番号1記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するDNA、又は配列番号1記載の塩基配列と90%以上の相同性を有する塩基配列からなるDNAと、配列番号4を有するDNA、配列番号4記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するDNA、又は配列番号4記載の塩基配列と90%以上の相同性を有する塩基配列からなるDNAと、を発現する細胞と被検物質とを接触させる手順と、
配列番号5記載の塩基配列を有するDNAでコードされるリガンドの刺激に基づく細胞内シグナル伝達の誘導、又は前記リガンドの刺激に基づくGタンパク質の活性化を検出する手順を含むスクリーニング方法。
本発明の代謝症候群の治療又は予防薬は、受容体活性改変タンパク質(RAMP)2をコードする以下の(a)から(d)のいずれかに記載のDNA、又はこのDNAがコードするポリペプチドを有効成分として含有する。
(a)配列番号1記載の塩基配列を有するDNA
(b)配列番号1記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するDNA
(c)配列番号2記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び/又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA
(d)配列番号1記載の塩基配列と90%以上の相同性を有する塩基配列からなるDNA
本発明の治療又は予防剤で使用されるポリペプチドは、前述のDNAによりコードされ、例えば、配列番号2記載のアミノ酸配列を有し、又は配列番号2記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び/又は付加されたアミノ酸配列を有する。
発現ベクターは、適当なベクターに上述のDNAを挿入することにより、作製できる。「適当なベクター」とは、原核生物及び/又は真核生物の各種の宿主内で複製保持又は自己増殖できるものであればよく、使用の目的に応じて適宜選択できるものである。例えば、DNAを大量に取得したい場合には高コピーベクターを選択でき、ポリペプチドを取得したい場合には発現ベクターを選択できる。その具体例としては、特に限定されず、例えば、特開平11−29599号公報に記載された公知のベクターが挙げられる。
形質転換体は、前述のDNAを含むベクターを宿主に導入することにより、作製できる。このような宿主は、本発明のベクターに適合し形質転換され得るものであればよく、その具体例としては、特に限定されないが、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等の、公知の天然細胞もしくは人工的に樹立された細胞(特開平11−29599号公報参照)が挙げられる。
前述のDNAは、代謝症候群への罹患の有無についての検査に利用できる。本発明に係る代謝症候群の検査方法は、抽出手順、増幅手順、解読手順、及び比較手順を含む。
前述のDNAを変異又はノックアウトすることにより、非ヒト形質転換細胞、組織、器官、及び個体を作製できる。非ヒト動物としては、特に限定されないが、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ等が挙げられる。
本発明に係る代謝症候群の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法は、内在性RAMP2遺伝子がノックアウトされた動物に被検物質を投与する手順と、代謝症候群の症状改善を検出する手順と、を含む。
次の手順でターゲティングベクターを作製した。即ち、RMAP2を含むゲノムDNA配列のうち、5’側の相同配列として、RAMP2のエクソン1の上流から、イントロン1の途中までを含む約3kbの配列をPCRにて合成(5’ homology arm)し、中間の相同配列として、イントロン1の途中からエクソン4の下流までをPCRにて合成(loxP arm)し、3’側の相同配列として、エクソン4の下流、約3kbの配列をPCRにて合成(3’ homology arm)した。
試験例1で得たRAMP2ヘテロノックアウトマウス(RAMP2+/−)を、遺伝的肥満マウスであるレプチン欠損(ob/ob)マウスと交配し、子世代マウス(RAMP2+/−、wt/ob)をob/obマウスと戻し交配することで、孫世代マウス(RAMP2+/−、ob/ob)を作製した。
ob/obマウス及びRAMP2+/−、ob/obマウスから肝臓を採取し、その切片を染色した。ヘマトキシリン・エオシン(HE)による染色写真を図1(a)に、オイルレッドOによる染色写真を図1(b)にそれぞれ示す。
(形態学)
試験例1で得たRAMP2へテロノックアウトマウス(RAMP2+/−)、及び野生型マウス(RAMP2+/+)の大腿動脈周囲に、ポリエチレンチューブのカフを4週間留置することで、血管傷害による動脈硬化を誘導した。留置後のマウスの大腿部カフ留置部の標本切片をエラスティカファンギーソン染色にて染色した低倍率の写真を図2(a)に、大腿動脈部分の拡大写真を図2(b)に示す。
図2の結果を免疫学的観点でも確認するため、試験例3における留置後のマウスの大腿動脈におけるICAM1、VCAM1、MCP1、及びPCNAタンパク質の発現量を検討した。具体的には、各タンパク質に結合するモノクローナル抗体を用い、常法に従って大腿動脈を免疫染色し、この結果を図3(a)〜(d)に示す。
前述の留置前後のマウスについて、RAMP2、RAMP3、CRLR、及びAMの発現量について調査した。つまり、留置前後のマウスから大腿動脈近傍の組織を採取し、この組織から抽出した全RNAを鋳型とし、各遺伝子に特異的な配列のプライマーを用いて定量的リアルタイムPCRを行った。具体的な手順は常法に従った。この結果を図4に示す。
(形態学)
試験例1で得たRAMP2へテロノックアウトマウス(RAMP2+/−)、及び野生型マウス(RAMP2+/+)の大腿動脈の外周に、10%塩化鉄溶液を塗布し、塗布24時間後に各マウスの大腿部を採取した。その切片のHE染色写真を図5に示す。また、採取した大腿動脈の横断切片(n=5)にて、血栓の断面積を定量化した。更に、血栓の断面積と、血管内腔の全面積との比に基づいて血管の狭窄率を計算した。血栓サイズを図6に、血管の狭窄率を図7にそれぞれ示す。
試験例4における大腿動脈におけるMCP−1及びMac−1タンパク質の発現量を調査した。具体的には、各タンパク質に結合する抗体を用い、常法に従って大腿動脈を免疫染色し、この結果を図8に示す。
AM−RAMP2システムの病態生理学的意義を解明するためにはRAMP2ノックアウトマウスのホモ接合体が必要であるが、ホモ接合体(RAMP2−/−)は胎生致死である。そこで、Cre−loxPシステムを用いてRAMP2遺伝子のコンディショナルターゲティングを行い、RAMP2を各細胞系列特異的に欠損させることにした。
具体的には、常法に従って、RAMP2遺伝子座がFlox配列で挟まれたloxPマウスを樹立した。一方、血管内皮細胞特異的に発現するVEカドヘリン(Cdh5)のプロモータ配列がCre配列の5’側に位置するベクター(図9参照、Circulation Research. 2006;98:897−904)が導入されたCreマウスを樹立した。loxPマウス及びCreマウスを交配することで、血管内皮細胞特異的にRAMP2がノックアウトされたマウスを得た。
心筋細胞特異的に発現するα−MHCのプロモータ配列がCre配列の5’側に位置し、且つCreの両側にタモキシフェンが結合する変異型エストロゲンレセプター(Mer)配列が位置するベクター(図14参照、Circ Res. 2001;89:20−25.)が導入されたCreマウスを樹立した。このCreマウスを用いた点を除き、上記と同様の手順で、心筋細胞特異的にRAMP2がノックアウトされたマウスを得た。
Claims (9)
- 受容体活性改変タンパク質(RAMP)2をコードする以下の(a)から(c)のいずれかに記載のDNA、又はこのDNAがコードするポリペプチドを有効成分として含有する代謝症候群の治療又は予防剤。
(a)配列番号1記載の塩基配列を有するDNA
(b)配列番号1記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するDNA
(c)配列番号1記載の塩基配列と90%以上の相同性を有する塩基配列からなるDNA - 代謝症候群の検査方法であって、
被験者の細胞からDNAを抽出する抽出手順と、
抽出された前記DNAを鋳型とし、配列番号3記載の塩基配列からなるDNA又はその発現制御領域のDNAの一部又は全部を特異的に増幅できるプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う増幅手順と、
増幅されたDNAの塩基配列を解読する解読手順と、
解読された塩基配列を、配列番号3記載の塩基配列と比較する比較手順と、を含む検査方法。 - 配列番号3記載の塩基配列からなるDNA又はその発現制御領域のDNAの一部又は全部を特異的に増幅できるプライマー、又は、配列番号2記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントを有効成分とする代謝症候群の検査薬。
- 代謝症候群の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法であって、
配列番号2記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと被検物質とを接触させる手順と、
前記ポリペプチドと前記被検物質との結合を検出する手順と、を含むスクリーニング方法。 - 代謝症候群の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法であって、
内在性RAMP2遺伝子が変異又はノックアウトされた動物に被検物質を投与する手順と、
代謝症候群の症状改善を検出する手順と、を含むスクリーニング方法。 - 代謝症候群の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法であって、
配列番号1記載の塩基配列を有するDNA、配列番号1記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するDNA、又は配列番号1記載の塩基配列と90%以上の相同性を有する塩基配列からなるDNAを発現する細胞と被検物質とを接触させる手順と、
前記DNAの発現量の変化を検出する手順と、を含むスクリーニング方法。 - 代謝症候群の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法であって、
配列番号1記載の塩基配列を有するDNA、配列番号1記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するDNA、又は配列番号1記載の塩基配列と90%以上の相同性を有する塩基配列からなるDNAを発現する細胞と被検物質とを接触させる手順と、
前記DNAから合成されるタンパク質の細胞内局在の変化を検出する手順と、を含むスクリーニング方法。 - 代謝症候群の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法であって、
配列番号6記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、このポリペプチドを分解可能な酵素、及び被検物質を共存させる手順と、
所定期間後における前記ポリペプチドの残存量を測定する手順と、
残存量の測定値を、前記被検物質の非存在下で測定された残存量と比較する手順と、を含むスクリーニング方法。 - 代謝症候群の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法であって、
配列番号1記載の塩基配列を有するDNA、配列番号1記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するDNA、又は配列番号1記載の塩基配列と90%以上の相同性を有する塩基配列からなるDNAと、配列番号4を有するDNA、配列番号4記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するDNA、又は配列番号4記載の塩基配列と90%以上の相同性を有する塩基配列からなるDNAと、を発現する細胞と被検物質とを接触させる手順と、
配列番号5記載の塩基配列を有するDNAでコードされるリガンドの刺激に基づく細胞内シグナル伝達の誘導、又は前記リガンドの刺激に基づくGタンパク質の活性化を検出する手順を含むスクリーニング方法。
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