WO2007004325A1 - S1-5を含有するタンパク質製剤 - Google Patents

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Toshihiro Nakajima
Naoko Yagishita
Tetsuya Amano
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Locomogene, Inc.
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Definitions

  • the present invention relates to a non-human knockout animal lacking the S1-5 gene and exhibiting an age-related disease or symptom, and a method for producing the same.
  • the present invention also relates to a method for screening a preventive or therapeutic agent for age-related diseases or symptoms, characterized by administering a candidate substance to the animal.
  • the present invention also relates to cells isolated from the non-human knockout animal and uses thereof, and further to S1-5 protein and uses thereof.
  • Rheumatoid arthritis (hereinafter abbreviated as RA) is a systemic chronic inflammatory disease in which abnormal proliferation is seen in the synovial tissue of the joint.
  • Synovial cells are fibroblast-like cells that form 1 to 6 epithelial-like layers in the synovium of the joint, and are supposed to supply oral theodorican and hyaluronic acid to the synovial fluid. Yes.
  • Various symptoms are observed in the joints of RA patients, such as the proliferation of synovial tissue, the resulting multilayer structure, and the infiltration of inflammatory cells.
  • S1-5 also known as EFEMP-1, FBNL, or FBLN-3
  • S1-5 is a protein isolated by the present inventors for the first time as a synoviolin binding factor.
  • S1-5 was overexpressed in human diploid fibroblasts and was isolated as a gene (Leucka-Czernik, B. et al., Mol. Cell). Biol. 15: 120-128, 1995). Structurally, an epidermal growth factor-like domain (EGF) -like domain that promotes DNA synthesis (cell proliferation) and a fibrin-like domain have been found. Recently, changes in S1-5 It has been reported that it is associated with different mosquito S, Malattia Leventinese (ML) and Doyne honeycomb retinal dystrophy (DHRD) (Non-patent Document 1).
  • EGF epidermal growth factor-like domain
  • ML Malattia Leventinese
  • DHRD Doyne honeycomb retinal dystrophy
  • Patent Document 1 International Publication No. WO02 / 052007 Pamphlet
  • Non-Patent Document 1 Stone, E.M. et al, Nature Genetics 22: 199-202, 1999
  • An object of the present invention is to provide a non-human knockout animal deficient in the S1-5 gene and exhibiting an age-related disease or symptom and a method for producing the same. It is another object of the present invention to provide a screening method for a preventive or therapeutic drug for age-related diseases or symptoms, which comprises administering a candidate substance to the animal. Another object of the present invention is to provide a cell isolated from the non-human knockout animal and its use, and further an S1-5 protein and its use.
  • S1-5 protein is a bone deformity, osteoporosis, Paget's disease, hyperparathyroidism, decreased bone density, cortical cancellous ossification, hair loss, tissue damage or necrosis, tumor, chest Hypertrophy, ascites, anemia, bleeding, skin aging (stains, dullness, sagging, fine lines, moles) Etc.) and the treatment and prevention of age-related diseases such as nail aging.
  • the present invention is as follows.
  • Age-related diseases or symptoms include bone deformity, osteoporosis, Paget's disease, hyperparathyroidism, decreased bone density, cortical cancellous ossification, hair loss, tissue damage or necrosis, tumor, breast
  • the animal according to [1] which is at least one selected from the group strength of partial hypertrophy, ascites, anemia, bleeding, skin aging and nail aging.
  • the animal is a zebrafish, mouse, rat, guinea pig, rabbit, chicken, pig, sheep, goat, inu, ushi, monkey, and any group force that also has chimpanzee power. [1] The animal according to [1].
  • the cell according to [5] which is a dermal papilla cell, hepatocyte, pigment cell, adipocyte, uterine endothelial cell, or alveolar epithelial cell.
  • Age-related diseases or symptoms include bone deformity, osteoporosis, Paget's disease, hyperparathyroidism, bone density, cortical cancellous ossification, hair loss, tissue damage or necrosis, tumor, chest hypertrophy, [7] The method according to [7], wherein at least one selected from the group strength of ascites, anemia, bleeding, skin aging and nail aging.
  • Animals are zebrafish, mice, rats, guinea pigs, rabbits, chickens, pigs, [7] The method according to [7], wherein the group force including the di, goat, inu, ushi, monkey, and chimpanzee force is also selected.
  • Cells are osteoclasts, keratinized epithelial cells, blood cells, cancer cells, bone marrow cells, fibroblasts, vascular endothelial cells, dermal cells, muscle cells, nerve cells, lymphocytes, vascular smooth muscle cells, [12]
  • Age-related diseases or symptoms include bone deformity, osteoporosis, Paget's disease, hyperparathyroidism, decreased bone density, cortical cancellous bone, hair loss, tissue damage or necrosis, tumor, breast
  • An osteoclast characterized by contacting an osteoclast derived from the non-human knockout animal according to any one of [1] to [4] with a candidate substance for an osteoclast function inhibitor. Function screening method for inhibitors.
  • amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4 comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and Z or added, and described in SEQ ID NO: 2 or 4
  • a preventive or therapeutic agent for an age-related disease or symptom comprising the protein according to [16] or the peptide according to [17] or [18].
  • Age-related diseases or symptoms include bone deformity, osteoporosis, bone pad disease, hyperparathyroidism, decreased bone density, cortical cancellous ossification, hair loss, tissue damage or necrosis, tumor
  • An osteoclast function inhibitor comprising the protein according to [16] or the peptide according to [17] or [18].
  • FIG. 1 is a diagram showing the structure of a targeting vector for deleting the Sl-5 gene.
  • 1 acZ gene was introduced into the translation start point of mouse S1-5 gene fragment (ATG codon that translates the first methionine; indicated by *), and neomycin resistance (neo) gene was introduced as a positive selection marker gene.
  • neo neomycin resistance
  • DT-A diphtheria toxin A
  • Individuals who have undergone homologous recombination express ⁇ -galatatosidase instead of losing the S1-5 gene, and the expression of the S1-5 gene from the promoter can be detected by lacZ staining using its enzymatic activity.
  • V The position of V and the probe is also shown.
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of genotype analysis of Sl-5 gene mutant mice.
  • A shows the results of Southern blot analysis using the probe shown in Fig. 1 after extracting DNA from the mouse tail, digesting with BamHI.
  • B shows the northern plot analysis result.
  • FIG. 3A is a photograph showing the phenotype of a 26-month-old S1-5 knockout mouse.
  • S1-5-/-male (animal number: 1101).
  • Spine is dorsal, hair loss, facial skin wound, nail necrosis, chest enlargement, ascites during dissection, tumor in liver during dissection.
  • FIG. 3B is a photograph showing the phenotype of a 26-month-old Sl-5 knockout mouse.
  • S1-5-/-female (animal number: 1097).
  • Spine is dorsal, difficult to stop, low hematocrit, nail necrosis, bleeding mass in the fundus, enlarged uterus during dissection, bleeding mass in adipose tissue during dissection.
  • FIG. 3C is a photograph showing the phenotype of a 26-month-old S1-5 knockout mouse. S1-5-/-female (animal number: 1103). The spine is dorsal.
  • FIG. 4 is an X-ray photograph showing bone deformation of wild type mice and S1-5 knockout mice.
  • FIG. 5 is an X-ray photograph showing bone deformation of wild type mice and S1-5 knockout mice.
  • FIG. 6 is an X-ray photograph showing bone deformation of an S1-5 knockout mouse.
  • FIG. 7A is a photograph showing the spinal curvature angle of S1-5 knockout mice.
  • B shows X-rays of each week-old mouse, then measures the angle of the spinal curve, and the incidence of the spinal curve angle of S1-5 knockout mice It is a figure compiled by age
  • FIG. 8 is a graph summarizing the spinal curvature angles of Sl-5 knockout mice by age.
  • FIG. 9 Figures and photos showing the bone density measurement results of the spine (thoracic vertebrae (10-12) and lumbar vertebrae (1-3) of Sl-5 knockout mice.
  • SB1-855 is the animal number, and the numbers in the bar graph are Age, the number in parentheses indicates the heel angle.
  • FIG. 10 is a graph showing the bone density measurement results of the spine (thoracic vertebrae (10-12) and lumbar vertebrae (1-3) of S1-5 knockout mice. Each bar graph represents the average value of each group. Numbers indicate n numbers.
  • FIG. Ll is a diagram and a photograph showing the bone density measurement results of the femur of Sl-5 knockout mice.
  • SB1-855 etc. indicate the animal number, and the numbers in the bar graph indicate the age of the week.
  • FIG. 12 shows the bone density measurement results of the femurs of Sl-5 knockout mice.
  • the numbers in the bar graph indicate n numbers.
  • FIG. 13 is a photograph showing a micro CT image of the spine (thoracic vertebrae (10-12) of Sl-5 knockout mice. SB1-855, LB594, etc. indicate animal numbers.
  • FIG. 14 is a graph showing the pQCT measurement results of Sl-5 knockout mice.
  • FIG. 15 is a graph showing urinary NTx values of S-5 knockout mice. One week of pooled urine was measured for each individual.
  • FIG. 16 is a graph summarizing urinary NTx values of Sl-5 knockout mice by age.
  • FIG. 17 is a photograph showing bone tissue in hard tissue stained specimens of femurs of female Sl-5 knockout mice and wild type mice. SB2-905, LB574, etc. indicate animal numbers.
  • FIG. 18 is an enlarged photograph of bone tissue in a hard tissue stained specimen of the femur for a representative example of the female S1-5 knockout mouse and wild type mouse shown in FIG. SB2-905, LB574 etc. indicate animal numbers.
  • FIG. 19 shows a photograph of osteoclasts in a tissue section of a Sl-5 knockout mouse and a figure and a photograph showing the number of TRAP positive cells.
  • FIG. 20 is a graph showing the results of measuring the area of osteoclasts in tissue sections of S1_5 knockout mice.
  • FIGS. 21A-C A shows the experimental process.
  • B and C are graphs showing the osteoclast-forming ability of S1-5 knockout mouse-derived bone marrow cells.
  • B shows the result of measuring the number of TRAP-positive multinucleated cells by TRAP staining.
  • C shows the results of the TRAP solution assembly.
  • FIG. 21D_E D is a graph showing the results of measuring the area of TRAP-positive multinucleated giant cells.
  • E is a photograph showing the osteoclast-forming ability of S1-5 knockout mouse-derived bone marrow cells.
  • FIG. 22 is a photograph showing the results of sucking with a filter paper the blood that swells every 10 seconds after cutting the tail of an Sl-5 knockout mouse.
  • SB1-727, LB438 etc. indicate animal numbers.
  • FIG. 23 is a photograph showing the hematocrit value of S1-5 knockout mice. SB1-739, LB438 etc. indicate animal numbers.
  • FIG. 24 is a graph showing a hematocrit value of S1-5 knockout mice. SB1-739, LB438, etc. indicate animal numbers.
  • FIG. 25 is a Giemsa-stained photograph of a blood smear prepared from the tail vein force of Sl-5 knockout mice.
  • LB438, LB487, etc. indicate animal numbers.
  • FIG. 26 is a photograph showing the expression of S1-5-His protein in CHO-K1 cell line (Balta). N shows CHO-Kl cells after transfection! /, NA! /, P shows CHO-K1 cells that transiently expressed SI-5-His protein.
  • FIG. 27 is a photograph showing the expression of S1-5-His protein in the cloned CHO-K1 cell line. N is transfusioned! /, Na! /, CHO-Kl cells
  • FIG. 28 is a photograph showing the expression of SI-5-His protein in the cloned CHO-K1 cell line. N indicates transfection-! /, NA! /, CHO-Kl cells.
  • FIG. 31 is a schematic diagram of S1-5 truncate protein.
  • FIG. 32A is a photograph showing the preparation results of Sl-5-His truncate protein.
  • FIG. 32B is a photograph showing the preparation results of Sl-5-FLAG truncate protein.
  • FIG. 33 FLAG-S1-5 protein (A) purified from cells using anti-FLAG antibody and FLAG-S1-5 protein purified from culture supernatant using anti-FLAG antibody (B), anti-S
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of detection by the Western plotting method using an AG antibody.
  • FIG. 35 is a photograph showing the results of detecting Sl-5-His protein treated with glycosylpeptidase F by Western plotting using anti-S1-5 antibody.
  • FIG. 36 is a photograph showing the results of detecting Western blotting method for GST-S1-5-His truncate protein purified from E. coli and treatment with precision protease the GST-S1-5 protein.
  • FIG. 37 is a photograph showing the results of detection of MBP-S1-5 protein purified from E. coli by CBB staining and Western blotting using anti-S1-5 antibody. 1 indicates GST-S1-5 protein and 2 indicates MBP-S1-5 protein.
  • FIG. 38 is a photograph showing the result of detection of precision protease-treated MBP-S1-5 protein purified also by E. coli ability by CBB staining.
  • FIG. 39A is a diagram showing an experimental process.
  • B is an osteoclast-forming ability of bone marrow cells derived from S1-5 knockout mice CHO-K1 cell-derived Sl-5-His protein suppresses B It is a graph to show. B graphed the number of TRAP-positive multinucleated cells.
  • FIG. 40 is a graph showing that osteoclast-forming ability of bone marrow cells derived from Sl-5 knockout mice is suppressed by CHO-K1 cell-derived S-to-5-His protein. The number of TRAP-positive multinucleated giant cells was graphed.
  • FIG. 41 is a photograph showing that the osteoclast-forming ability of bone marrow cells derived from Sl-5 knockout mice is suppressed by CHO cell-derived S1-5-His protein.
  • FIG. 42A is a graph showing that the area force of TRAP-positive multinucleated giant cells is decreased by CHO cell-derived S1-5-His protein.
  • FIG. 42B shows a photograph of a stained TRAP-positive multinucleated giant cell whose formation was suppressed in a CHO cell-derived Sl-5-His protein concentration-dependent manner.
  • FIG. 43 is a graph showing that osteoclast-forming ability of bone marrow cells derived from S1-5 knockout mice is suppressed by 1-5-His protein. The number of TRAP positive multinucleated cells was graphed.
  • FIG. 44 is a graph showing that osteoclast-forming ability of bone marrow cells derived from S1-5 knockout mice is suppressed by 1-5-His protein. Graphed the number of TRAP-positive multinucleated giant cells
  • FIG. 45 is a photograph showing that osteoclast-forming ability of bone marrow cells derived from Sl-5 knockout mice is suppressed by Sl-5-His truncate protein.
  • FIG. 46A is a diagram showing an experimental process.
  • B is a graph showing that the osteoclast shape performance of RAW264.7 cells is suppressed by S-5-His protein derived from CHO-K1 cells.
  • FIG. 47 is a photograph showing that osteoclast-forming ability of RAW264.7 cells is suppressed by Sl-5-His protein.
  • FIG. 48 is a graph showing that osteoclast-forming ability of RAW264.7 cells is suppressed by 293F floating cell-derived S1-5-FLAG protein.
  • FIG. 49 is a graph showing that osteoclast-forming ability of RAW264.7 cells is not suppressed by S1-5 protein in a cell-free expression system.
  • FIG. 50 is a graph showing that osteoclast-forming ability of RAW264.7 cells is suppressed by GST-S1-5 protein.
  • FIG.51 The osteoclast-forming ability of RAW264.7 cells is suppressed by GST-S1-5 protein. It is a photograph showing this.
  • FIG. 52 is a graph showing that osteoclast-forming ability of RAW264.7 cells is not suppressed by GST protein.
  • FIG. 53 is a photograph showing that osteoclast-forming ability of RAW264.7 cells is not suppressed by GST protein.
  • FIG. 54 is a graph showing that osteoclast-forming ability of RAW264.7 cells is suppressed by precision protease-treated GST-S1-5 protein.
  • FIG. 55 is a photograph showing that osteoclast-forming ability of RAW264.7 cells is suppressed by precision protease-treated GST-S1-5 protein.
  • FIG. 56 is a graph showing that the osteoclast-forming ability of RAW264.7 cells is not suppressed by the precision protease-treated GST protein.
  • FIG. 57 is a photograph showing that the osteoclast-forming ability of RAW264.7 cells is not suppressed by the precision protease-treated GST protein.
  • FIG. 58 is a graph showing that the bone density of the femur was restored by S1-5 protein administration in ovariectomized (OVX) rats.
  • FIG. 59 is a graph showing that the femoral bone strength recovered by administration of S1-5 protein in ovariectomized (OVX) rats.
  • FIG. 60 is a photograph showing that the bone mass of the femur was recovered by administration of S1-5 protein in ovariectomized (OVX) rats.
  • FIG. 61 is a photograph showing that the number of osteoclasts in the tissue was suppressed by administration of S1-5 protein in ovariectomized (OVX) rats.
  • B is the graph.
  • FIG. 62 is a graph showing that the bone density of the femur was recovered by administration of S1-5 protein in ovariectomized (OVX) mice.
  • the gene encoding S1-5 is known, accession number AAA65590 (nucleotide accession U03877), 138449, NP_061489 (nucleotide accession NM 018894), NP— 00409 6 (nucleotide accession NM 004105), or SI-5 protein specified in Q12805, and similar proteins that have activity to bind to human synoporin protein can be used (Leucka-Czernik) , B. et al., Mol. Cell. Biol. 15: 120-128, 1995; Heon, E. et al, Arch. Ophthalmol. 114: 193-198, 1996; Ikega wa, S.
  • the Sl-5 gene can also be obtained from genomic libraries such as mice and rats.
  • a target clone can be obtained from a bacterial artificial chromosome (BAC) library by a hybridization method. It can also be obtained by PCR.
  • BAC bacterial artificial chromosome
  • the present invention relates to a non-human knockout animal exhibiting an age-related disease or symptom that has lost the function of all or part of the D S1-5 gene, and 2) all or part of the S1-5 gene.
  • a method for producing a non-human knockout animal that causes an age-related disease, characterized by loss of function The loss of the function of all or part of the S1-5 gene can be exemplified by the disruption or mutation of the S1-5 gene.
  • a gene targeting method can be employed to produce a knockout animal in which all or part of the functions of S1-5 have been lost.
  • the S1-5 gene targeting vector is for losing the function of all or part of the gene by disrupting the S1-5 gene.
  • “to lose the function” means to completely lose the function of the gene or to make the function of the gene lower than that of the wild type.
  • the gene In order to lose the function, the gene is simply destroyed or deleted, or a modification is made such as introducing a mutation into the gene so that the reading frame is shifted at the translation stage. That's fine.
  • the "knockout animal" of the present invention can be prepared as follows.
  • a part or all of the base sequence of the S1-5 gene is modified into a totipotent cell, and a totipotent cell into which the modified S1-5 gene has been introduced is selected. Then selected One of the homologous chromosomes can be obtained by introducing chimeric tomatopotent cells into the fertilized egg by introducing the differentiated totipotent cells that have undergone genetic modification (deletion, destruction, mutation, etc.) and mating the resulting chimeric individuals or Create an individual that knocks out both S1-5 genes.
  • the type of animal used in the present invention is not particularly limited. Examples include zebrafish excluding humans, mice, rats, guinea pigs, rabbits, rabbits, pigs, hidges, goats, nu, sushi, monkeys, and chimpanzees. In the present invention, handling is easy and breeding is easy! /, Mice are preferred! /.
  • Modification refers to adding a mutation that causes deletion, substitution, or addition to a part of the DNA of the S1-5 gene.
  • these mutations include deletion (deletion) of part or all of the base sequence by genetic engineering techniques, or insertion or substitution of another gene or base sequence.
  • an S 1-5 deficient gene can be prepared by shifting the codon reading frame or destroying the function of the promoter or exon. As a result, the function of the S 1-5 protein, which is the expression product of the S1-5 gene, is not expressed.
  • the knockout mouse of the present invention can be prepared by a known gene recombination method (gene targeting method).
  • the gene targeting method is a well-known technique in this field, and is disclosed in various experiments in this field.
  • the site that causes a change in the structure of the S1-5 gene is not particularly limited as long as the function of the S1-5 gene is lost. However, in consideration of the function and structure of the S1-5 gene, it is particularly preferred to design so that the region of the EGF-like domain or fibrin-like domain of the S1-5 gene is deleted.
  • a recombinant into which a vector has been introduced may be selected by using a combination of screening using a drug resistance gene introduced by a targeting vector and screening using Southern blotting or PCR. preferable.
  • a marker gene for drug selection neomycin resistance gene, hygromycin B phosphotransferase gene and the like can be used.
  • HSV thymidine kinase gene, diphtheria toxin A gene, etc. can be used as the negative selection gene.
  • Homologous recombination is performed using the targeting vector prepared by the above method.
  • “homologous recombination” means that the modified S1-5 gene is artificially recombined with the DNA region of the S1-5 gene in the genome.
  • mouse ES cell lines have been established as mouse ES cells.
  • TT-2 cell line, AB-1 cell line, J1 cell line, R1 cell line, etc. can be used.
  • Which ES cell line to use can be appropriately selected depending on the purpose or method of the experiment.
  • blastocysts that are 3.5 days after fertilization are generally used, but in addition to this, an 8-cell embryo is collected and cultured until blastocysts are used. Many early embryos can be obtained well.
  • the ES cell line obtained in this manner is usually very proliferative, it tends to lose its regenerative ability, so it needs to be subcultured carefully.
  • a suitable feeder cell such as STO fibroblast
  • Wbitory factor (LIF) l ⁇ l OOOOU / ml
  • a carbon dioxide incubator preferably 5% carbon dioxide, 95% air Or 5% oxygen, 5% carbon dioxide, 90% air
  • trypsin / EDTA solution treatment to make a single cell and seed on a newly prepared feeder cell Method is adopted.
  • Such passage is usually performed every 1 to 3 days, and it is preferable to observe the morphology of the cells.
  • methods such as calcium phosphate coprecipitation method, electopore position method, lipofusion method, retrovirus infection method, aggregation method, microinjection method, particle gun method, etc. can be employed.
  • the electoral position method is preferred because it can easily process a large number of cells.
  • the obtained recombinant ES cells are screened for homologous recombination. That is, screening is first performed with a drug resistance factor into which neomycin or the like has been introduced.
  • drug resistance genes include neomycin resistance gene, hygromycin B phosphotransferase gene, diphtheria toxin A gene and the like, and reporter genes include, for example, j8-galactosidase gene, chloramphee-cholaseyltransferase gene and the like.
  • the obtained recombinant ES cells were used for Southern blot analysis using the DNA sequence on or near the S1-5 gene as a probe, or the DNA sequence on the targeting vector and the targeting vector.
  • a PCR method using a DNA sequence in a nearby region other than the mouse-derived S1-5 gene as a primer, it is possible to reliably screen for homologous recombination.
  • a chimeric embryo incorporated into the cell mass of the host embryo is formed.
  • methods for introducing ES cells into embryos such as blastocysts, the microinjection method and the aggregation method are known, but any method can be used and can be appropriately modified by those skilled in the art. .
  • mice In the case of mice, a hormone agent (for example, using a human chorionic gonadotrophs (hCG) that has a follicle stimulating hormone (FSH) -like action 3 ⁇ 4r3 ⁇ 4 pregnant mare's serum gonadotropin (PMSLr) and a loteinizing hormone (LH) action)
  • hCG human chorionic gonadotrophs
  • FSH follicle stimulating hormone
  • PMSLr pregnant mare's serum gonadotropin
  • LH loteinizing hormone
  • Female mice that have been superovulated are mated with male mice. Thereafter, early development from the uterus occurs on day 3.5 after fertilization when using blastocysts, and day 2.5 when using 8-cell stage embryos. Harvest embryos. The embryos thus recovered are injected in vitro with ES cells that have undergone homologous recombination using a targeting vector to produce chimeric embryos.
  • a chimeric mouse can be obtained by transplanting these to a foster parent and allowing them to develop and grow.
  • a pseudopregnant female mouse for use as a foster parent can be obtained by mating a female mouse having a normal cycle with a male mouse castrated by vagina ligation or the like.
  • a chimeric mouse can be prepared by transplanting the chimeric embryo produced by the above-mentioned method into the uterus to the produced pseudopregnant mouse and giving birth to a baby. In order to ensure the implantation and pregnancy of chimeric embryos, it is desirable to create a group of female mice that have the same sexual cycle between female mice that collect fertilized eggs and pseudopregnant mice that serve as foster parents. .
  • a chimeric mouse is selected from the pups born by the temporary parents. If a mouse individual derived from an ES cell-transplanted embryo is obtained, this chimeric mouse is mated with a wild-type mouse, and it is confirmed whether or not an ES cell-derived trait appears in the next-generation individual. When a trait derived from an ES cell appears in a next generation individual, it can be considered that the ES cell may have been introduced into the germ line of the chimeric mouse. In order to confirm that ES cells have been introduced into the germ line, it is preferable to use the coat color as an index, considering the ease of confirming the ability to use various traits as an index.
  • mice hair colors such as wild mouse color (agouti), black, ocher, chocolate and white are known. It is also possible to select the body part (eg tail tip) force by extracting chromosomal DNA and performing Southern plot analysis or PCR. Mice with a high chimera contribution rate are likely to have ES cells introduced into the chimeric mouse germline. After selecting a chimeric mouse as described above, the chimeric mouse is mated with a wild-type female to obtain F1 to establish a mutant mouse strain.
  • body part eg tail tip
  • the chimeric animal obtained as described above is obtained as a heterozygote having a gene deletion only in one of the homologous chromosomes.
  • RNA can be extracted from the tissue and tissue, and gene expression patterns can be analyzed by Northern plot analysis.
  • blood can be collected as necessary, and blood tests and serum biochemical tests can be performed.
  • a knockout animal that is a homozygote it may not be suitable as a model animal because it does not grow up to an adult, such as embryonic lethality. In that case, it is preferable to knock out when necessary. Further, in order to examine the function of a gene in a specific tissue in vivo, it is preferable to knock out the gene in a tissue-specific manner. Animals that have been knocked out only at a specific time, a specific cell line, and animals that have been knocked out only in a limited area of somatic cells are called conditional knockout animals (BioManual Series 8, Gene Targeting: ES cells). Mutated mice using a mouse, Shinichi Aizawa, Yodosha, 1995).
  • Cre-loxP As a method for producing a conditional knockout animal, for example, for gene targeting, a Cre-loxP system (R. Kuhn. Et al., Science 269), a recombination system derived from Batteriophage P1. : 1427-1429, 1995). Cre is a recombination enzyme that recognizes a 34-base sequence called ⁇ and allows recombination to occur at this site. Therefore, by inserting the gene to be targeted between the ⁇ sequence and the ⁇ sequence and incorporating the Cre recombinase gene downstream of the specific promoter, site-specific and time-specific Cre is produced and the gene is sandwiched between ⁇ .
  • the site that causes a change in the structure of the S1-5 gene is not particularly limited as long as the function of the S1-5 gene is lacking. Absent. However, in consideration of the function and structure of the S1-5 gene, it is particularly preferred to design it so that the EGF-like domain or fibrin-like domain region of the S1-5 gene is deleted.
  • the present invention also provides cells isolated from the knockout animal force of the present invention.
  • cells isolated from knockout animals can be used to prevent or treat drugs for age-related diseases or symptoms.
  • Examples of the cells include osteoclasts, keratinized epithelial cells, blood cells, cancer cells, bone marrow cells, fibroblasts, vascular endothelial cells, dermal cells, muscle cells, nerve cells, lymphocytes, vascular smooth muscle cells, synovium Examples include, but are not limited to, cells, dermal papilla cells, hepatocytes, pigment cells, adipocytes, uterine endothelial cells, or alveolar epithelial cells.
  • the non-human knockout animal of the present invention exhibits an age-related disease or symptom.
  • Known aging model mice include Klotho mutant mice (Kuro-0, M. et al., Nature, 6; 390 (6655): 18-19, 1997), senescence accelerated model mice (SAM) (Takeda, T et al., Mech Ageing Dev., 17 (2), 183-194, 1981), Werner syndrome model mouse (Chen, L. et al., J. Biomed BiotechnoL, 2 (2), 46-54, 2002) known force These mice show premature aging and short lifespan.
  • SAM senescence accelerated model mice
  • the non-human knockout animal of the present invention eg, S1-5 knockout mouse
  • aging disease or symptom refers to bone deformation, osteoporosis, Paget's disease of bone, hyperparathyroidium, decreased bone density, cancellous cortical bone, and alopecia.
  • Bone deformity means that bone and cartilage are deformed by aging, RA, and osteoporosis resulting in a decrease in bone and cartilage strength.
  • Ostoporosis refers to a condition in which bone components decrease as a whole, making it easier to fracture. Over 90% of osteoporosis is primary osteoporosis, for which no obvious causative disease is found, most of which are degenerative, occurring in middle-aged and older people. In addition, secondary osteoporosis, which is distinguished from it, is caused by Graves' disease, Cushing's syndrome, severe diabetes, RA, stomach surgery, alcohol drinking, steroid use, etc. To do.
  • Paget's disease refers to bone disease characterized by increased bone turnover and disordered bone remodeling (Merck Manual Encyclopedia homepage: http: ⁇ mmh.banyu.co.jp/mmhe2j/ sec05 / ch061 / ch061a.html). Paget's disease of bone resulted in excessive activation of osteoclasts and osteoblasts in some areas of the bone, resulting in bone resorption and remodeling (remodeling) and excessive activity. Some bones are known to be brittle compared to normal bones.
  • “Hyperparathyroidism” means a state in which the secretion of parathyroid hormone PTH is increased and its action is abnormally enhanced. In hyperparathyroidism, it is known that bone mass is decreased and osteoclasts are activated. “Hyperparathyroidism” refers to primary hyperparathyroidism that causes increased secretion of PTH due to a thyroid earthquake such as adenoma, chronic renal failure, pregnancy and other causes such as secondary hyperparathyroidism. Examples include, but are not limited to, secondary hyperparathyroidism.
  • Tumor means all tumorigenic cell growth and proliferation, whether malignant or benign, and all precancerous and cancerous cells and tissues.
  • the tumor of the present invention may be a primary tumor or a metastatic tumor.
  • cancer and “cancerous” refer to a physiological condition that is typically characterized by uncontrolled cell growth.
  • examples of “tumor” include carcinoma, sarcoma, leukemia and malignant lymphoma.
  • the carcinoma includes breast cancer, prostate cancer, colon cancer, squamous cell cancer, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, gastrointestinal cancer, spleen cancer, glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer, May include liver cancer, bladder cancer, hepatocytoma, colorectal cancer, endometrial cancer, salivary gland cancer, kidney cancer, spawning cancer, thyroid cancer, liver cancer and various types of head and neck cancer. it can.
  • examples of the sarcoma include malignant bone tumor, malignant soft tissue sarcoma, and more specifically osteosarcoma, chondrosarcoma, Ewing sarcoma, liposarcoma, leiomyosarcoma, or synovial sarcoma.
  • the present invention provides a screening method for a therapeutic or prophylactic agent for age-related diseases or symptoms, which comprises administering a candidate substance to a non-human knockout animal.
  • Knockout animal phenotypic complementation includes incomplete complementation as well as perfect complementation.
  • an index value having a correlation with a target disease in a non-human animal or a part thereof contacted with the candidate substance by contacting the knockout animal of the present invention or a part thereof with the candidate substance is evaluated.
  • the prevention / treatment / improvement effect of candidate substances is tested using as an index the increase of bone density, increase of bone strength, suppression of osteoclast function, antitumor effect, increase of blood cells, etc., improvement of hemostasis. be able to. It is also possible to test animals that cause skin aging (spots, dullness, sagging, fine lines, moles, etc.) to screen for cosmetic products that provide whitening and anti-chasing effects.
  • Knockout animal or a part thereof includes both the whole body of an animal body and limited tissues or organs. In the case of limited tissues or organs, this includes those removed from animals.
  • candidate substances include peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, and the like.
  • a compound may be sufficient and a well-known compound may be sufficient.
  • candidate substances may form salts, and salts with physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids) and bases (eg, organic acids) are used as the candidate substance salts.
  • physiologically acceptable acid addition salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid). Salts with acid, succinic acid, tartaric acid, succinic acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phospho
  • Examples of methods for treating a test animal with a candidate substance include oral administration, intravenous injection, coating, subcutaneous administration, intradermal administration, and intraperitoneal administration.
  • the symptoms of the test animal, the nature of the candidate substance, etc. Can be selected as appropriate.
  • the dosage of the candidate substance can be appropriately selected according to the administration method, the nature of the candidate substance, and the like.
  • a candidate substance is administered to the non-knock animal of the present invention, and the bone density value, bone strength value, X-ray photograph, etc. of the animal are obtained. By measuring over time, substances that have shown effectiveness can be screened.
  • osteoporosis and spinal dorsum are correlated, suggesting that the degree of kyphosis in knockout animals is an index for measuring the degree of progression of osteoporosis. From these, the candidate substance is administered to the knockout animal of the present invention.
  • the present invention provides a screening method for a prophylactic or therapeutic agent, comprising the step of bringing a candidate substance of a prophylactic or therapeutic agent for an age-related disease or symptom into contact with the isolated cell of the knockout animal power of the present invention. To do.
  • contacting can be performed, for example, by adding the candidate substance to a culture solution of cells isolated from the knockout animal of the present invention.
  • a vector containing DNA encoding the protein can be introduced into a cell isolated from a knockout animal.
  • a substance having an activity that complements the phenotype of a cell isolated from a knockout animal is selected from candidate substances for preventive or therapeutic agents for age-related diseases or symptoms.
  • the activity that complements the phenotype of cells isolated from knockout animals is not particularly limited.
  • osteoclasts suppress osteoclast activity
  • bone marrow cells suppress osteoclast formation, and keratinize.
  • epithelial cells keratinized epithelial cell proliferation, in the case of blood cells, blood cell differentiation promotion, in the case of cancer cells, cancer cell growth inhibition, in the case of fibroblasts, fibroblast proliferation, in the blood vessels of endothelial cells, blood vessels Endothelial cell proliferation, hair formation for dermal cells, correction of muscle cell degeneration for muscle cells, correction of nerve cell degeneration for nerve cells, suppression of lymphocyte activation for lymphocytes, vascular smooth muscle cells Growth inhibition, synovial cells functional normalization, hair papilla cells hair growth, hepatocytes functional normalization, pigment cells melanin production suppression, alveolar cells Correction of abnormal activation, suppression of differentiation and proliferation in the case of fat cells Endothelial cell growth inhibition, etc. as long as the child Imperial Household endothelial cells can be exemplified.
  • complementation of the phenotype of the cell includes incomplete complementation, not just perfect complementation.
  • the present invention also provides a method for screening an osteoclast function inhibitor, which comprises the step of contacting an osteoclast isolated from a knockout animal with a candidate substance for the osteoclast function inhibitor.
  • osteoclast function include, but are not limited to, resorption pit formation, TRAP production ability, acting ring formation ability, protease (catebucin K, ⁇ -9) production ability, and acid secretion ability.
  • TRAP resorption pit formation
  • TRAP acting ring formation ability
  • protease catebucin K, ⁇ -9 production ability
  • acid secretion ability As long as the function is a function that directly or indirectly leads to bone destruction, it is included in “function of osteoclast”.
  • the osteoclast function inhibitor is limited to this method, for example, the ability to screen using the degree, size, etc. of osteoclasts isolated from the knockout animal of the present invention as an indicator.
  • the isolated bone marrow cells of the knockout animal of the present invention are divided into multinucleated giant cells, and the number of TRAP-positive multinucleated giant cells, the size of TRAP-positive multinucleated giant cells, etc. It is possible to screen for indicators (Takahashi N. et a 1., Endocrinology, 123 (5): 2600-2, 1988, Yasuda H. et al, Proc Natl Acad Sci US A., 31; 95 (7 ), 3597-602, 1998).
  • osteoclast function inhibitors can be screened using resorption pit formation ability as an index (Hirayama, T. et al, J Endocrinol .: Octl75 (l): 155-63 2002, Udagawa, N. et al, Bone .: Nov; 25 (5): 517-23 1999).
  • the substance selected by the screening method can be used in the research field or the pharmaceutical field as an osteoclast function inhibitor. Furthermore, the osteoclast function inhibitor of the present invention can be applied as a prophylactic or therapeutic agent for age-related diseases or symptoms.
  • osteoclast function inhibitor of the invention can also be used as a preventive or therapeutic agent for RA.
  • Isolated S1-5 protein The present invention relates to 1) an isolated S1-5 protein encoded by DNA containing the coding region of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or 3, and 2) described in SEQ ID NO: 2 or 4 An isolated S 1-5 protein comprising the amino acid sequence of is provided.
  • isolated refers to a state in which the natural environment is removed.
  • the protein can also be prepared, for example, as a recombinant.
  • human S-5 protein can be used in cells expressing human S1-5 protein (for example, human diploid fibroblasts, RA patients recovered as synovial tissue or cultured cells).
  • a cDNA library is obtained based on the mRNA extracted from the derived synovial cells (Short, JM et al, Nucleic Acid Research, 16, 7583, 1988).
  • DNA encoding S1-5 protein can be isolated by screening this library to hybridize. .
  • the S1-5 protein encoded from the DNA can be obtained by using a protein expression system well known to those skilled in the art for IJ.
  • human S1-5 protein can be recovered and purified from cell cultures expressing human S1-5 protein.
  • the present invention also provides a protein functionally equivalent to the above S1-5 protein.
  • Species from which such proteins are derived are not particularly limited, for example, humans, zebrafish, mice, rats, monoremocks, usagis, dogs !; pigs, hidges, goats, nu , Sanore, chimpanzee and the like.
  • proteins functionally equivalent to the S1-5 protein include, for example, 1) substitution or deletion of one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4, deletion, insertion, and Z or An isolated protein functionally equivalent to the protein containing the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4, and 2) the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or 3 An isolated protein that is functionally equivalent to the protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 4
  • proteins functionally equivalent to the above S1-5 protein include proteins having a function of suppressing human age-related diseases or symptoms, Kkuauto animal or the onset, Light knockout animal powers Proteins that have the function of complementing the phenotype of isolated cells.
  • Examples of the protein functionally equivalent to the S1-5 protein include immunologically equivalent proteins.
  • the “protein that is immunologically equivalent to Sl-5 protein” is not particularly limited as long as it reacts with an antibody that specifically recognizes S1-5 protein.
  • an S1-5 protein epitope peptide, an S1-5 protein domain containing the epitope, or a protein containing the domain as a protein immunologically equivalent to the S1-5 protein Can do.
  • a fragment of the S1-5 protein can be obtained by digestion with a protease.
  • a DNA library encoding the S1-5 protein shown in SEQ ID NO: 1 or 3 is randomly cleaved and inserted into a phage vector to create a phage library displaying domain peptides. be able to.
  • Immunologically active domains can be determined by immunoscreening these libraries with antibodies that recognize the S1-5 protein. By determining the nucleotide sequence of the inserted fragment of the cloned phage, the amino acid sequence of the active domain can also be clarified.
  • Proteins functionally equivalent to the S1-5 protein according to the present invention are defined not only based on immunological properties but also based on binding properties with synopioline. That is, the present invention includes a fragment of S1-5 protein having affinity for synopioline. Such mutants can be easily selected by those skilled in the art by screening candidate proteins using Synopioline.
  • the S1-5 protein requires 120 amino acid residues corresponding to positions 1233-1592 in the Synoviolin cDNA as a region necessary for binding to Synoviolin. Therefore, a protein having an amino acid sequence ability constituting this region, or a protein that binds to a protein containing this amino acid sequence constitutes a protein functionally equivalent to the S1-5 protein according to the present invention.
  • a protein functionally equivalent to the S1-5 protein according to the present invention is also defined based on the biochemical activity of the S1-5 protein.
  • the biochemical activity of S1-5 protein can indicate, for example, osteoclast formation inhibitory activity and cell growth control activity (Leucka-Czernik, B. et al, Mol. Cell. Biol. 15: 120- 128, 1995).
  • Proteins functionally equivalent to these Sl-5 proteins can be fusion proteins with other proteins.
  • S1-5 protein is functionally A protein that maintains at least one property as an equivalent protein is included in the functionally equivalent protein. Even if the protein to be added has an activity different from that of the S1-5 protein, and if at least one function of the S1-5 protein is maintained, the fusion protein has the function of the present invention. Contained in equivalent proteins.
  • Proteins functionally equivalent to the above S1-5 protein can be isolated by a person skilled in the art by a method known in the art (Experimental Medicine separate volume 'Genetic Engineering Handbook, pp246-251, Yodosha, 1991). it can.
  • a target library is screened with the nucleotide sequence (or fragment thereof) shown in SEQ ID NO: 1 or 3 as a probe, DNA having a highly homologous base sequence can be cloned.
  • Examples of such a library include a library in which a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 is randomly mutated, a synovial tissue cDNA library derived from species other than human rabbits, and the like. Can do.
  • a circular double-stranded vector that clones the gene to be mutated is made into a single strand, and a synthetic oligonucleotide having a mutation at the target site is hybridized.
  • Complementary single-stranded DNA derived from a vector that has been cleaved with a restriction enzyme and linearized is annealed to the circular single-stranded vector, and the gap between the synthetic nucleotide is filled with DNA polymerase, Further, a complete double-stranded circular vector is obtained by ligation.
  • the number of amino acids to be modified is typically within 50 amino acids, preferably 30 amino acids And more preferably within 5 amino acids (eg, 1 amino acid).
  • the protein of the present invention is a protein in which a conservative substitution is added to the amino acid substitution described above and is functionally equivalent to the human S1-5 protein protein (SEQ ID NO: 2 or 4). Is included. Conservative substitution is considered to be important in the case of substituting amino acids in domains important for protein activity. Such amino acid conservative substitutions are well known to those skilled in the art.
  • amino acid groups corresponding to conservative substitutions include basic amino acids (eg, lysine, arginine, histidine), acidic amino acids (eg, aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar amino acids (eg, glycine, asparagine).
  • basic amino acids eg, lysine, arginine, histidine
  • acidic amino acids eg, aspartic acid, glutamic acid
  • uncharged polar amino acids eg, glycine, asparagine
  • Glutamine serine, threonine, tyrosine, cysteine
  • non-polar amino acids eg, alanine, parin, leucine, isoleucine, proline, ferrolanine, methionine, tryptophan
  • ⁇ -branched amino acids eg, threonine, parin, isoleucine
  • aromatic amino acids eg tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine
  • non-conservative substitutions can be avoided by further increasing the activity of proteins (including constitutively active proteins) or decreasing (including dominant negative).
  • amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4 one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added, so that the amino acid sequence has the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4
  • Proteins that are functionally equivalent to the proteins they include include naturally occurring proteins.
  • eukaryotic genes have a polymorphism, as is known for interferon genes and the like.
  • One or more amino acids may be substituted, deleted, inserted and Z or added due to changes in the base sequence caused by this polymorphism.
  • it is a naturally occurring protein, and in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4, one or more amino acids have a substitution, deletion, insertion, and Z or addition amino acid sequence.
  • the amino acid sequence may not change even if the base sequence changes due to the polymorphism.
  • Such a nucleotide sequence variation is called a silent variation.
  • a protein encoded by a DNA comprising a nucleotide sequence having a silent mutation is also included in the present invention.
  • the polymorphism referred to here means that a gene has a different base sequence among individuals within a population. Polymorphism is independent of the rate at which different genes are found.
  • a method for obtaining a protein functionally equivalent to the S1-5 protein a method using a hybridization can be mentioned. That is, a DNA encoding the S1-5 protein according to the present invention as shown in SEQ ID NO: 1 or 3 or a fragment thereof is used as a probe, and a DNA capable of hybridizing with this is isolated. When hybridization is performed under stringent conditions, high-homogeneous V and DNA sequences are selected as the base sequence, and as a result, the isolated protein includes proteins functionally equivalent to the S1-5 protein. Is likely to be increased.
  • a highly homologous base sequence can exhibit, for example, 70% or more, preferably 90% or more identity.
  • the stringent conditions specifically indicate, for example, conditions such as 6 X SSC, 40% formamide, hybridization at 25 ° C, and IX SSC, washing at 55 ° C. it can.
  • the stringency depends on conditions such as salt concentration, formamide concentration, and temperature, but those skilled in the art will readily set these conditions to obtain the required stringency.
  • DNA encoding the homologue of the S1-5 protein in animal species other than humans, for example. Encodes DNA that can also obtain animal species such as zebrafish, mice, rats, guinea pigs, rabbits, chickens, pigs, hidges, goats, nu, ushi, monkeys, and chimpanzees.
  • the homologue of the S1-5 protein constitutes a functionally equivalent protein in the present invention.
  • a protein obtained by introducing a mutation into the above S1-5 protein (SEQ ID NO: 2 or 4), or a DNA isolated using the above-described hybridization technique or the like encodes. Tan The protein usually has high homology in amino acid sequence with the above S1-5 protein (SEQ ID NO: 2 or 4). High homology refers to sequence identity of at least 30% or more, preferably 50% or more, more preferably 80% or more (eg, 95% or more).
  • the identity of the nucleotide sequence and amino acid sequence can be performed using a homology search site using the Internet [For example, in Japan DNA Data Bank (DDBJ), FASTA, BLAST, PSI-BLAST, and SSEARCH [For example, the search and analysis page of the Japan DNA Data Bank (DDBJ) website; http: ⁇ www.ddbj.nig.ac.jp/ii- maii / homology -j.html].
  • NCBI National Center for Biotectonology Information
  • the protein according to the present invention or a functionally equivalent protein thereof is subjected to various modifications such as physiological modifications such as sugar chains, labels such as fluorescent or radioactive substances, or fusion with other proteins.
  • the modification by the sugar chain varies depending on the host to be expressed.
  • any S1-5 protein or function according to the present invention can be used as long as it exhibits the same properties as the S1-5 protein protein disclosed in this specification.
  • the S1-5 protein can be obtained not only as a biomaterial but also as a gene recombinant by incorporating a gene encoding it into an appropriate expression system.
  • S1-5 protein In order to obtain the gene by genetic engineering, it is sufficient to incorporate the DNA encoding the S1-5 protein described above into an appropriate expression system for expression.
  • Examples of host Z vector systems applicable to the present invention include expression vector pGEX and E. coli.
  • pGEX can express foreign genes as a fusion protein with GST (Smith DB, et al., Gene, 67: 31-40, 1988), so the gene encoding S 1-5 protein was incorporated. Introduce pGEX into E.
  • the gene encoding the S1-5 protein can be obtained by amplifying a synovial cell cDNA library or the like in a saddle type by PCR or the like. Since GST according to the present invention is adsorbed to dartathione sepharose 4B, the expression product can be easily separated and purified by the affinity matrix.
  • Other host / vector systems for obtaining recombinant S1-5 protein include the following.
  • fusion protein expression vectors using a histidine tag, HA tag, FLAG tag, GST tag, MBP tag, etc. are commercially available.
  • yeast it is known that yeast of the genus Pichia is effective for the expression of proteins with sugar chains.
  • an expression system using a baculovirus vector hosted by insect cells is also useful (Bio / Technology, 6: 47-55, 1988).
  • mammalian cells are used for vector transfection using promoters such as CMV, RSV, or SV40. All of these host Z vectors are S1-5 protein.
  • the gene can be introduced using a viral vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, or an adeno-associated virus vector.
  • the obtained protein of the present invention can be isolated from the inside of a host cell or extracellular (such as a medium) and purified as a substantially pure and homogeneous protein.
  • the separation and purification of proteins is not limited in any way as long as the separation and purification methods used in normal protein purification are used. For example, select chromatography column, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. , If combined, protein Can be separated and purified.
  • chromatography examples include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, and adsorption chromatography (Marshak et al., Strategies). for Protein Purification a nd Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). These chromatography can be performed using liquid phase chromatography, for example, liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC.
  • the protein of the present invention is preferably a protein to which modifications such as physiological higher order structure, sugar chain addition, disulfide bond, lipid addition, methyl candy, etc. are added.
  • sugar chains in the present invention include N-linked sugar chains and 0-linked sugar chains.
  • N-linked sugar chains include high mannose, N-linked sugar chains such as hybrid and complex types, and 0-linked sugar chains include mucin-type (0-GalNAc), 0- Examples include 0-linked sugar chains such as Fuc type, 0-Man type, and 0-Glc type.
  • the protein of the present invention is preferably a substantially purified protein.
  • substantially purified means the degree of purification of the protein of the present invention (ratio of the protein of the present invention in the total protein components) force 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90 % Or more, 95% or more, 100% or close to 100%.
  • the upper limit close to 100% depends on the purification technique and analytical technique of those skilled in the art, and is, for example, 99.999%, 99.99%, 99.9%, 99%, etc.
  • a protein purified by any purification method is included in the substantially purified protein as long as it has the above-described degree of purification.
  • a substantially purified protein can be exemplified by appropriate selection or combination, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a partial peptide (partial fragment) of the protein of the present invention described above. If the partial peptide is functionally equivalent to the protein of the present invention, the partial peptide There are no particular restrictions on the length or the like. Examples of the partial peptide of the present invention include a peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, which is shorter than the protein of the present invention. By using such a peptide, it is possible to prevent or treat an age-related disease or symptom, and to suppress the activity of osteoclasts.
  • the present invention provides a preventive or therapeutic agent for age-related diseases or symptoms, which comprises the protein of the present invention or a partial peptide thereof (hereinafter referred to as protein or the like). “Aging diseases or symptoms” are as described above. Furthermore, the present invention provides an osteoclast function inhibitor comprising the protein of the present invention. As long as the protein in these drugs is isolated, there is no particular limitation on the state thereof, so long as it can be used as the above drug, it can be used as a substantially purified protein or a protein in a crudely purified state. You can. Moreover, it is preferable that the protein in the drug is produced in an expression system other than the cell-free system.
  • These drugs are used as preventive or therapeutic agents for age-related diseases or symptoms in animals other than humans (eg, laboratory animals, livestock animals, pets, etc.) and as osteoclast function inhibitors. It can be used for IJ.
  • the protein of the present invention includes, for example, a pharmacologically acceptable carrier or medium, such as sterile water or physiological saline, a stabilizer, an excipient, an antiseptic, a surfactant, a chelating agent (EDTA, etc.)
  • a pharmacologically acceptable carrier or medium such as sterile water or physiological saline, a stabilizer, an excipient, an antiseptic, a surfactant, a chelating agent (EDTA, etc.)
  • EDTA chelating agent
  • the form (dosage form) of the drug of the present invention includes, but is not limited to, injection dosage forms, lyophilized dosage forms, solution dosage forms and the like.
  • the ability to administer to a patient can be either oral or parenteral administration! /, Or a deviation.
  • it is parenteral administration, and for example, injection administration is possible.
  • injection administration can be systemic or local administration by intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, intradermal injection, and the like.
  • the dose varies depending on the weight and age of the patient, the administration method, symptoms, etc., but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
  • the general dose varies depending on the effective blood concentration of the drug and the metabolic time, but the daily maintenance dose is about 0.1 mg / kg to about 1.0 g / kg. Preferably from about O.lmg / kg to about 10 mg / kg, more preferably from about O.lmg / kg to about 1.0 mg / kg.
  • Administration can be divided into several doses.
  • the present invention provides an antibody that recognizes S1-5 protein and the like.
  • an antibody such as the S1-5 protein can be obtained by a known method; ⁇ (Hariow, E. et al., Antioodies; A Laboratory Manual. Cold bpnng Harbor, New York, 1988, Kohler, G. et al., Nature 256: 495-7, 1975).
  • the immunized animal is immunized with the Sl-5 protein of the present invention or a fragment thereof together with a suitable adjuvant.
  • the S1-5 protein fragment can be combined with a carrier protein to be used as an immunogen.
  • a carrier protein for obtaining an immunogen mussel hemocyanin (KLH), sushi serum albumin (BSA), or the like can be used.
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • Immunization is added at appropriate intervals, and when an increase in antibody titer is confirmed, blood is collected to obtain antiserum. Furthermore, if the antibody fraction is purified, a purified antibody (polyclonal antibody) can be obtained.
  • monoclonal antibodies can be obtained by collecting antibody-producing cells and cloning them by a cell fusion method or the like. Monoclonal antibodies are important tools for achieving high sensitivity and specificity in immunoassays. Another method is to cut the DNA encoding synoviolin randomly and insert it into a phage vector to create a phage library displaying domain peptides. Can be obtained. Immunologically active domains can be determined by immunoscreening these libraries with antibodies that recognize Synoviolin.
  • antibody-producing cells those derived from immunized animals can also be used.
  • chimeric antibodies and humanized antibodies can be constructed based on the antibody genes of the monoclonal antibody-producing cells derived from the immunized animal thus obtained.
  • animal antibodies are undesirable because they are excluded as foreign matter. Therefore, the steady region of highly antigenic antibodies
  • a chimeric antibody in which the region is replaced with a human antibody or a humanized antibody in which not only the constant region but also the variable region framework is replaced with a human gene is required.
  • the chimeric antibody or humanized antibody that recognizes S 1-5 protein and the like provided based on the present invention is useful for a drug delivery system (DDS).
  • DDS drug delivery system
  • a substance that can be expected to be useful by linking to the antibody includes a substance that suppresses osteoclast function (bisphosphonate, osteoprotegerin), etc. Can be shown.
  • the antibody of the present invention can be used as a reagent for immunological detection of S1-5 protein and the like. Methods for immunologically detecting proteins and the like present in tissues and blood using antibodies are known.
  • the antibody of the present invention can be used for separation or detection of S1-5 protein or the like, or cells expressing S1-5 protein or the like. Methods for isolating and purifying proteins using antibodies are well known to those skilled in the art.
  • the S1-5 protein of the present invention can be used as a marker for synovial cells or human diploid fibroblasts. That is, synovial cells and human diploid fibroblasts can be detected and separated using the expression of S1-5 protein as an index.
  • the antibody is appropriately labeled with fluorescence or the like. For example, using an antibody against S1-5 protein V, cells expressing S1-5 protein can be isolated by cell sorting or the like.
  • coli (XL1-Blue MRF ') by incubating at 37 ° C for 20 minutes, mixed with Top agarose and spread on plates. After culturing at 42 ° C for 3.5 hours, a trocellose membrane immersed in 10 mM IPTG and dried was placed on a plate, and further cultured at 37 ° C for 3.5 hours. After collecting the membrane, the washing buffer [10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5% Skim milk, 0.1% TritonX-100,
  • S1-5 (also called EFEMP-1, FBNL, or FBLN-3) was found in the terminal portion of 100 bp [Lecka-Czernik, B. et al ., Molecular and ellular Biology, 15, 120—128, 1995; accession number U03 877 (cDNA), AAA65590 (protein), Stone, EM et al., Nature Genetics 22, 199—202, 1999; accession number Q12805 ( It became clear that it was a common sequence with a known gene called protein)]. Both genes and their translation products were almost the same size, suggesting that they were the same protein.
  • the cDNA sequence and amino acid sequence of human S1-5 are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively.
  • the lac Z gene was introduced into the translation start point of the mouse S1-5 gene fragment (ATG codon that translates the first methionine) to construct a targeting vector (Fig. 1).
  • a neomycin resistance gene was introduced as a marker gene, and a diphtheria toxin A gene was also linked so that non-homologous recombination cell lines could be excluded.
  • c of mouse S1-5 The DNA sequence, amino acid sequence, and genomic sequence are shown in SEQ ID NOs: 3, 4, and 5, respectively.
  • the targeting vector of Example 1 was introduced into the mouse TT-2 cell line by electoporation to select a cell line that produced homologous recombination.
  • the obtained cells were poured into 8-cell embryos and transplanted directly into the foster oviduct, or cells that had been cultured for one day and developed into blastocysts were transplanted into the foster parents.
  • the obtained heterozygous mutant mice (F1) were crossed to obtain heterozygous and homozygous mutant mice.
  • S1-5 should be expressed in the tissue, and the / 3-galatatosidase protein is expressed instead of S1-5.
  • the genotype was confirmed by Southern plot analysis. DNA was extracted from about 3 mm of the tail tip of a mouse about 2 weeks old, and the obtained DNA was digested with the restriction enzyme BamHI. Bands were detected at 2.4 kbp in the wild type, 5.4 kbp in the homozygous mouse, and in both positions in the heterozygous mouse (Fig. 2A). Further, when the expression of mRNA in the lung of S1-5 gene was confirmed by Northern plot analysis, the expression of mRNA of the gene was not confirmed (FIG. 2B).
  • mice S1-5 knockout mice aged 13 to 117 weeks (3 to 29 months old) were analyzed by necropsy and X-ray photography. Hair loss, facial skin wounds, nail necrosis, chest hypertrophy, ascites, liver tumors, bleeding mass in the fundus and adipose tissue, uterine hypertrophy ( Figures 3-6).
  • Micro CT images of S1-5 knockout mice and wild-type mice were taken, and a 3D image of the thoracic vertebrae microphone CT image (Fig. 13) showed that the vertebral body surface of wild-type mice was smooth, whereas knockout mice Surface irregularities were conspicuous.
  • peripheral quantitative computed tomography was measured and analyzed in detail.
  • pQCT peripheral quantitative computed tomography
  • a decrease in bone mineral density 'bone density was observed (Fig. 14). This phenomenon was particularly remarkable in female individuals.
  • the stress-strain coefficient (SSI) was significantly decreased in S1-5 knockout mice compared to wild-type mice, indicating that bone strength had decreased.
  • NTx type I collagen cross-linked N-telopeptide
  • TRAP staining of bone tissue specimens was performed to confirm the number of osteoclasts in the tissues.
  • images of each well photographed at the same magnification were taken into a computer, the portion corresponding to osteoclasts was surrounded by a line with Image J (distributed from NIH), and the area was calculated in pixels.
  • Image J distributed from NIH
  • M-CSF macrophage colony stimulating facter
  • Hematocrit Regular use 3 ⁇ 4 It is necessary to place one end of a micro tube (75 mm length heparinized, Drummond Scientific Co.) into the blood, keep the appropriate inclination, raise the blood by capillary action, and increase the length of the capillary 2 Blood was collected until it reached / 3. Next, one end from which blood was sucked was sealed with a putty. The capillary tube with one end sealed was centrifuged at 11000 rpm for 5 minutes using a centrifuge, and the percentage was read using a measuring plate. As a result, S1-5 knockout mice tended to have low hematocrit values, indicating that they were anemic ( Figures 23 and 24).
  • CHO-K1 cells that stably express S-to-His protein were prepared. Transfect 20 g of pCAGGS-SI-5-His and 0.7 g pcDNA3 at the same time using Lipofectamine 2000 to CHO-K1 cells (10 cm dish x 1). After 24 hours, dilute 10 times to obtain 6 10 cm dishes Sowing. Next, selection was started with 800 g / mL Geneticin 24 hours later, and colonies were picked up 11 days later. 16 colonies (96 clones in total) per 10 cm dish were seeded on a 96-well plate and scaled up to a 24-well plate and a 6-well plate.
  • Proteins contained in the 250 mM Imidazole elution fraction were separated by 10% SDS-PAGE, and then silver staining (Fig. 29A) was detected by Western blotting using anti-S1-5 antibody (Fig. 29B). As a result, a single band was detected by the anti-S1-5 antibody.
  • the eluted fraction was collected (approximately 4 ml), dialyzed against 1 L of PBS, and the sample was filtered (0.22 ⁇ m). Proteins contained in the 50 mM and 100 mM Imidazole elution fractions were separated by 10% SDS-PAGE and then detected by silver staining (FIG. 30). As a result, it was shown that an extra band disappeared in the fraction eluted with the purification buffer containing 100 mM Imidazole compared to 50 mM Imidazole, and a more purified S1-5 protein was obtained. It was.
  • S1-5 has 6 EGF-like domains in the sequence.
  • EGF-like domains were deleted one by one from the C-terminal, creating 6 constructs (Fig. 31).
  • Ni-agarose was washed 3 times with washing buffer (20 mM Tris (pH 7.5), 500 mM NaCl, 10% Glycerol, 10 mM Imidazole), and then elution buffer (20 mM Tris (pH 7.5), 500 mM Sl-5 protein was eluted using NaCl, 10% Glycerol, 250 mM Imidazole).
  • washing buffer (20 mM Tris (pH 7.5), 500 mM NaCl, 10% Glycerol, 10 mM Imidazole
  • elution buffer 20 mM Tris (pH 7.5), 500 mM Sl-5 protein was eluted using NaCl, 10% Glycerol, 250 mM Imidazole.
  • concentration of S1-5 protein was calculated by Western blotting (FIG. 32A).
  • SI-5-FLAG truncate protein and SI-5-FLAG protein were prepared (FIG. 32B), and each expression vector was transfected into CHO-K1 cells (6-well plate). After 4 hours, the medium was replaced with serum-free medium (lml), and after incubation for 24 hours, the culture supernatant (900 ⁇ 1) was subjected to TCA precipitation. Thereafter, Western blotting using an anti-FLA G antibody was performed using the TCA precipitate and the cell extract. As a result, all truncate proteins were found to have higher expression levels compared to the full-length S1-5 protein, particularly high expression levels of the Sl-5 (E3) -FLAG protein.
  • the FLAG-S1-5 truncate protein expressed in HEK293 cells was purified.
  • HEK293 cells were seeded in a 150 mm dish (IWAKI) so as to be 80-90% confluent. The next day, transfection was performed using FuGENE6. The operation method followed the attached protocol. Two more days later, the cells were collected and lysis buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 420 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl, 0.5 mM DTT, 1 mM PMSF) was added to 300.
  • lysis buffer 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 420 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl, 0.5 mM DTT, 1 mM PMSF
  • the supernatant is collected by centrifugation, 10-L of which is subjected to SDS-PAGE, identification of FLAG-Sl-5truncate protein purified by intracellular blotting by Western blotting ( Figure 33A), and concentration calculated by CBB staining did.
  • the culture supernatant was collected 48 hours after transfection, 100 ⁇ L of anti-FLAG antibody bound to agarose beads was added, and the mixture was incubated at 4 ° C while stirring with a rotator. Thereafter, the same operation as described above was performed to identify the FLAG-S 1-5 protein purified from the culture supernatant and calculate the concentration (FIG. 33B). As a result, it was shown that S1-5 protein was purified from intracellular and culture supernatants (FIG. 33AB).
  • the S1-5-FLAG protein forcedly expressed in 293F suspension cells was purified.
  • the S1-5-FLAG protein expressed in the 293F cytoplasm was purified by the following process. 293F cells transfected with pcDNA3-S1-5-precission-FLAG plasmid were suspended in 90 ml, and the cells were collected 48 hours later. Lysis buffer (50 mM Tris-HC1 (pH 7.4), 420 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl, 0.5 mM DTT, 1 mM PMSF, 0.
  • Lysis buffer 50 mM Tris-HC1 (pH 7.4), 420 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl, 0.5 mM DTT, 1 mM PMSF, 0.
  • the eluate was dialyzed against precision buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT). 20 U precision protease was added, and the reaction was performed at 4 ° C for 5 hours. 50 ⁇ L of glutathione sepharose beads were added and incubated at 4 ° C for 1 hour with stirring in a rotator. The supernatant was collected and subjected to SDS-PAGE with the sample at each stage of purification and identified by Western blotting. Next, the S1-5-FLAG protein from the culture supernatant transformed into 293F cells was purified.
  • precision buffer 50 mM Tris-HCl (pH 7.0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT. 20 U precision protease was added, and the reaction was performed at 4 ° C for 5 hours. 50 ⁇ L of glutathione sepharose beads were added and
  • S1-5 protein was actually subjected to glycosylation and examined.
  • S1-5-His protein stable expression CHO-K1 cell culture supernatant strength was also purified from S1-5-His protein, CHO-K1 cell extract, and HT1080 cell culture supernatant.
  • glycosyl peptidase F treatment 37 ° C, 17 hr
  • Western blotting with anti-S1-5 antibody was performed (Fig. 35).
  • a band shift of purified S-to-His protein (20 ng) was observed by glycosyl peptidase F treatment (left figure in Fig. 35).
  • S1-5 protein Similarly, a band shift of S1-5 protein was also observed in the S1-5 protein immunoprecipitated from the culture supernatant of HT1080 cells (right figure in FIG. 35). From these results, S1-5 was considered to undergo N-linked glycosylation. In fact, S1-5 protein has a common sequence (N X (S / T) X ⁇ P). In addition, when we examined a broad band that was difficult to detect at low concentrations by increasing the amount of protein (120 ng), an overall band shift was observed, but the disappearance of broadband was strong. There was a possibility that 5 proteins were also subjected to 0-linked sugar chain modification (center figure in Fig. 35).
  • a pGEX vector for expressing the GST-fused S-His protein was prepared, transformed into E. coli, and colonies were isolated. The isolated colonies were inoculated into 10 mL of LB-ampicillin medium (50 mg / mL ampicillin) and cultured at 37 ° C (preculture). The pre-cultured E. coli was added to 200 mL of LB-ampicillin medium, cultured at 37 ° C for 2 hours and a half (main culture), added with a final concentration of 0.5 mM IPTG, and further cultured at 30 ° C for 3 hours.
  • Centrifuge the cells BC500 (20 mM Tris—HC1 (pH 8.0), 0.5 mM EDTA.500 mM KC1, 20% glycerol, 1% NP-40, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF, 1 ⁇ g / mL of aprotinin, pepstatin, and leu peptin) Suspend 5 mL and 100 mg / mL lysozyme in a volume of 100 ⁇ L, and destroy the bacteria with a sonicator.
  • GSH glutathione S Transferase conjugated agarose beads
  • MBP-S1-5 protein was purified by the same extraction method as in Example 20. As a result, it became clear that the most efficient elution conditions were when 10 mM Maltose was used. When the yield was compared with GST-S1-5 protein, it became clear that MBP-S1-5 was obtained efficiently at 450 ⁇ g / 500 mL culture (Fig. 37). It was also confirmed that MBP was cleaved when precision protease treatment was performed in the liquid layer as in the case of precision protease treatment GST-S1-5 (Fig. 38).
  • Example 15 Using bone marrow cells derived from S 5 knockout mice and the protein purified in Example 15, the effect of the purified Sl-5-His protein on the osteoclast-forming ability in vitro was examined. Seed 5 x 10 5 bone marrow cells in a 96-well plate to obtain a final concentration of 50 ng / mL of M-CSF. After 2 days, RANKL was added to a final concentration of 100 ng / mL. S1-5 was diluted with PBS and continuously added to the culture solution at the final concentration of 0, 10, 30, and 100 ng / mL from the time M-CSF was added. Five days later, the cells were fixed and stained with TRAP to examine the effect of Sl-5-His protein on osteoclast formation.
  • n 5
  • the number of TRAP-positive multinucleated cells was significantly suppressed depending on the concentration of S-to-His protein (Fig. 39, 4 Do and the number of TRAP-positive multinucleated giant cells formed was also Sl-5-His. (Figs. 40 and 41)
  • the Sl-5-His protein was added at final concentrations of 0, 10, 30, 100, 200, and 500 ng / mL.
  • the area of TRAP-positive multinucleated giant cells was measured in the same manner, the size of TRAP-positive multinucleated giant cells was / J, depending on the Sl-5-His protein concentration (Fig. 42ABC).
  • Example 16 Using bone marrow cells derived from S 5 knockout mice and the protein purified in Example 16, the effect of purified S1-5-E1-2 protein on osteoclast-forming ability in vitro was examined.
  • the method is the same as that of Example 22 except that S1-5-E1-2 protein is added to a final concentration of 0,10 ng / mL.
  • Sl-5 truncate suppressed the number of TRAP-positive multinucleated cells (Figs. 43 and 45).
  • Figs. 44 and 45 The amino acid sequence of S1-5-E1-2 is shown in SEQ ID NO: 6.
  • Example 18 Using RAW264.7 cells and the protein purified in Example 18, the effect of the purified S 1-5-F LAG protein on osteoclast-forming ability was examined.
  • the method used was S1-5-FLAG protein derived from 293F suspension cells, cell-free expression (Abnova, Cat.No.H00002202-P01), and S1-5 protein at a final concentration of 0, 10, 30, 100, 200 ng / The same procedure as in Example 24 was performed, except that the amount was adjusted to mL.
  • the S1-5-FLAG protein purified in Example 18 was added, the osteoclast-forming ability was suppressed depending on the concentration of S1-5-FLAG protein (FIG. 48).
  • S1-5 protein with cell-free expression was added, the inhibitory effect was not observed (Fig. 49).
  • Example 20 Using RAW264.7 cells and the protein purified in Example 20, the effect of purified GST-S1-5 protein and precision protease-treated GST-S1-5 protein on osteoclast shape performance was examined.
  • the method consists of E. coli-derived GST-S1-5 protein and GST protein at final concentrations of 0, 1, 3, 10, 30, 100, 200 ng / mL, precision protease-treated GST-S1-5 protein and precision protease-treated GST protein.
  • the same procedure as in Example 24 was performed, except that the final concentration was 0, 1, 3, 10, 30 ng / mL.
  • the inhibitory effect of GST-S 1-5 protein and precision protease-treated GST-S1-5 protein was observed in a concentration-dependent manner (Figs.
  • GST protein and precision protease treatment GST protein had no effect on osteoclast-forming ability (Figs. 52, 53, 56, 57). Even if a protein is removed from the GST tag by treatment with precision protease, its activity is retained and the tag can be removed. As a result, the activity was further enhanced.
  • ovariectomy 7 weeks old Wister rats were subjected to ovariectomy (OVX), and subcutaneous administration of the protein purified in Example 20 was started. From OVX, 1.0 mg / kg / day was administered 5 times a week. Four weeks after the operation, the animals were sacrificed, the left and right femurs were removed and fixed with 70% ethanol, and the bone density was measured. Bone density was measured with DCS-600EX-IIIR (Aloka) by scanning the femur distal 1/4 at a slice thickness of 1 mm and a speed of 10 mm / s from the distal part to the proximal part in 20 sections. did.
  • DCS-600EX-IIIR Aloka
  • OVX-treated rats treated with GST and precision protease had about 10% lower bone density.
  • the OVX model is said to have been created if bone density decreased by more than 10% (Modder, UI. Et al., Endcrinology 145: 913-9 21, 2004).
  • increased bone density was observed in OVX-treated rats treated with precision protease-treated GST-Sl-5 protein. From these results, it was inferred that S1-5 protein improved osteoporosis (Fig. 58).
  • Bone strength was analyzed in the femur of the rat examined in Example 27. Bone strength is MZ
  • -500S (Malto Inc.) was measured by a three-point bending test with a load cell of 500N, a distance between fulcrums of 13mm, and a head speed of 10mm / min.
  • Example 27 The femur of the rat examined in Example 27 was removed, and the soft tissue around the bone was removed and fixed with 70 o / o ethanol. After that, a 10% micro CT image of the diaphysis was taken from the growth plate cartilage. Compared to Sham, cancellous bone decreased in OVX-treated rats treated with GST protein and precision protease, whereas the purified tannin purified in Example 20 In OVX-treated rats that received the noxia, the cancellous bone loss was improved (Fig. 60). From this image, it was suggested that S1-5 protein has an osteoclast inhibitory effect.
  • the rat tibia examined in Example 27 was removed, and the soft tissue around the bone was removed and fixed with 70% ethanol. Subsequently, bone tissue specimens were stained with TRAP, and the number of osteoclasts in the tissue was measured. As a result, the number of osteoclasts increased in the OVX-treated rats treated with GST protein and precision protease at the proximal tibia metaphysis, compared with Sham. The increase in osteoclast numbers was suppressed in OVX-treated rats treated with the protein (Fig. 61).
  • OVX treatment was performed on 7-week-old C57BL / 6j mice, and the protein purified in Example 20 was administered subcutaneously. From OVX, 1.0 mg / kg / day was administered 5 times a week. Eight weeks after the operation, the mice were sacrificed, the femurs of the mice were removed and fixed with 70% ethanol, and the bone density was measured. The bone density was measured by DCS-600EX-niR (Aloka), and the femur distal 1/4 was scanned 20 times from the distal part to the proximal part with a slice thickness of 1 mm and a speed of 10 mm / s. Measured.
  • the present invention provides a knockout animal that is deficient in the S1-5 gene and causes an age-related disease and a method for producing the same. Since the animal of the present invention exhibits various age-related diseases or symptoms such as bone deformation, hair loss, tissue damage, tumor development, etc., by administering a substance effective for the treatment or prevention of age-related diseases to the animal. It can be used as a model animal for screening a pharmaceutical composition that provides a therapeutic or ameliorating effect. The present invention also provides a cell isolated from the knockout animal. Using the cells Thus, a drug for treatment or prevention of age-related diseases can be screened.
  • the knockout animal power The isolated bone marrow cells have the ability to form tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) -positive multinucleated giant cells when separated into osteoclasts. Since it is higher than bone marrow cells, osteoclast function inhibitors can be screened using the number and / or size of TRAP-positive multinucleated giant cells as an index. Furthermore, isolated S1-5 proteins and antibodies that bind to S1-5 proteins are also provided. By using the isolated S1-5 protein, it becomes possible to treat or prevent age-related diseases and to suppress the function of osteoclasts.
  • TRAP tartrate-resistant acid phosphatase

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Abstract

　S1-5遺伝子の機能を失わせたノックアウトマウスが、加齢性の疾患又は症状を引き起こすことを見出した。また、該ノックアウトマウスの骨塩量、骨密度、骨強度が低下していること、並びに骨組織において破骨細胞数が増加していることが判明した。また、該ノックアウトマウス由来骨髄細胞を用いた破骨細胞形成能の解析を行った結果、該ノックアウトマウスでは、野生型マウスに比べ、破骨細胞形成能が亢進し、さらに破骨細胞の大きさも大きくなっていることが判明した。また、このin vitroの系に、精製したS1-5タンパク質を添加したところ、破骨細胞形成能が抑制されることが判明した。さらに、骨粗鬆症モデルマウスに、精製したS1-5タンパク質を投与したところ、骨粗鬆症改善効果を有することが判明した。以上の知見は、S1-5タンパク質が、骨粗鬆症などの加齢性の疾患の治療や予防に役立つことを示すものである。

Description

明 細 書
S 1-5を含有するタンパク質製剤
技術分野
[0001] 本発明は、 S1-5遺伝子を欠損させた、加齢性疾患又は症状を呈する非ヒトノックァ ゥト動物およびその製造方法に関する。また、本発明は、上記動物に候補物質を投 与することを特徴とする、加齢性疾患又は症状の予防又は治療薬のスクリーニング方 法に関する。また、本発明は、該非ヒトノックアウト動物から単離した細胞およびその 用途、さらに、 S1-5タンパク質およびその用途に関する。
背景技術
[0002] 関節リウマチ (rheumatoid arthritis,以下、 RAと省略する）は、関節の滑膜組織に異 常な増殖が見られる全身性の慢性炎症性疾患である。滑膜細胞 (synovial cell)は、 関節の滑膜で 1〜6層の上皮様層を形成する線維芽細胞様の細胞であり、滑液にプ 口テオダリカンやヒアルロン酸を供給するものとされている。 RA患者の関節では、滑膜 組織の増殖、その結果として引き起こされる多層構造、炎症性細胞の浸潤といった 種々の症状が観察される。
[0003] 本発明者らは、 RAの発症や進展の背後にある分子レベルの機序を解明する研究 の過程において、 RA患者の滑膜組織において強発現している遺伝子を見出した。こ の遺伝子によりコードされるタンパク質は、発現して 、る組織である滑膜細胞 (synovia 1 cell)にちなみ、シノビオリン (Synoviolin)と名づけた (特許文献 1)。
[0004] また本発明者らは、タンパク質の生化学的な結合実験により、シノビォリンの結合因 子である S1-5 (EFEMP-1、 FBNL、または FBLN-3などの別名がある）の存在を明らか にした。 S1-5は、シノビォリンの結合因子として本発明者らが初めて単離したタンパク 質である。
[0005] S1-5は、ヒト 2倍体線維芽細胞（human diploid fibroblast)で過剰発現して!/、る遺伝 子として単離された (Leucka- Czernik, B. et al.， Mol. Cell. Biol. 15: 120-128, 1995)。 構造的には、 DNA合成（細胞増殖）を促進する Epidermal Growth Factor-like domain (EGF)様ドメイン、およびフイブリン様ドメインが見出されている。また、最近 S1-5の変 異カ S、 Malattia Leventinese (ML)および Doyne honeycomb retinal dystrophy (DHRD )と関連して 、ることが報告されて 、る (非特許文献 1)。
[0006] しかしながら、 S1-5の詳細な機能は知られておらず、 S1-5を欠損させたときの個体 の表現型については明らかではない。
特許文献 1：国際公開第 WO02/052007号パンフレット
非特許文献 1 : Stone, E.M. et al, Nature Genetics 22: 199-202, 1999
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明は、 S1-5遺伝子を欠損させた、加齢性疾患又は症状を呈する非ヒトノックァ ゥト動物およびその製造方法を提供することを目的とする。また、上記動物に候補物 質を投与することを特徴とする、加齢性疾患又は症状の予防又は治療薬のスクリー ユング方法を提供することを目的とする。また、該非ヒトノックアウト動物から単離した 細胞およびその用途、さらに、 S1-5タンパク質およびその用途を提供することを目的 とする。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、 S1-5遺伝子の 機能を失わせたノックアウトマウスが、加齢性の疾患又は症状を引き起こすことを見 出した。また、該ノックアウトマウスの骨塩量、骨密度、骨強度が低下していること、並 びに、骨組織における破骨細胞数の増加が判明した。さらに、 in vitroにおいて、該ノ ックアウトマウス由来骨髄細胞を用いた破骨細胞形成能の検討を行った結果、該ノッ クアウトマウス由来骨髄細胞では、野生型マウスに比べ、破骨細胞形成能が亢進さ れ、さらに該細胞の大きさが大きくなつていた。また、この in vitroの系に、精製した S1 -5タンパク質を添加したところ、破骨細胞形成能が抑制され、該細胞の大きさが小さ くなつていた。さらに、骨粗鬆症モデルマウスおよびラットに、精製した S1- 5タンパク 質を投与したところ、 S1-5タンパク質は骨粗鬆症改善効果を有することが判明した。 以上の知見は、 S1- 5タンパク質が、骨変形、骨粗鬆症、骨パジェット病、副甲状腺 機能亢進症、骨密度の低下、皮質骨の海綿骨化、脱毛、組織の損傷又は壊死、腫 瘍、胸部肥大、腹水、貧血、出血、皮膚の老化 (シミ、くすみ、たるみ、小じわ、ほくろ 等）および爪の老化などの加齢性の疾患の治療や予防に役立つことを示すものであ る。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔1〕 S1-5遺伝子の全部又は一部の機能を喪失させた、加齢性の疾患又は症状を呈 する非ヒトノックアウト動物。
〔2〕 S1-5遺伝子の全部又は一部の機能の喪失が、 S1-5遺伝子の破壊又は変異によ るものである〔1〕記載の動物。
〔3〕加齢性の疾患又は症状が、骨変形、骨粗鬆症、骨パジェット病、副甲状腺機能 亢進症、骨密度の低下、皮質骨の海綿骨化、脱毛、組織の損傷又は壊死、腫瘍、胸 部肥大、腹水、貧血、出血、皮膚の老化および爪の老化力 なる群力 選択される 少なくとも 1つである〔1〕記載の動物。
〔4〕動物が、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット、モルモット、ゥサギ、ニヮトリ、ブタ、ヒッ ジ、ャギ、ィヌ、ゥシ、サル、およびチンパンジー力もなる群力も選択されるいずれか のものである〔1〕記載の動物。
〔5〕〔1〕〜〔4〕の 、ずれか 1項に記載の非ヒトノックアウト動物力 単離された細胞。 〔6〕破骨細胞、角化上皮細胞、血液細胞、癌細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、血管内 皮細胞、真皮細胞、筋細胞、神経細胞、リンパ球、血管平滑筋細胞、滑膜細胞、毛 乳頭細胞、肝細胞、色素細胞、脂肪細胞、子宮内皮細胞、または肺胞上皮細胞であ る〔5〕に記載の細胞。
〔7〕 S1-5遺伝子の全部又は一部の機能を喪失させることを特徴とする、加齢性疾患 を引き起こす非ヒトノックアウト動物の作製方法。
〔8〕 S1-5遺伝子の全部又は一部の機能の喪失が、 S1-5遺伝子の破壊又は変異によ るものである〔7〕記載の方法。
〔9〕加齢性の疾患又は症状が、骨変形、骨粗鬆症、骨パジェット病、副甲状腺機能 亢進症、骨密度、皮質骨の海綿骨化、脱毛、組織の損傷又は壊死、腫瘍、胸部肥大 、腹水、貧血、出血、皮膚の老化および爪の老化力 なる群力 選択される少なくと も 1つである〔7〕記載の方法。
〔10〕動物が、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット、モルモット、ゥサギ、ニヮトリ、ブタ、ヒッ ジ、ャギ、ィヌ、ゥシ、サル、およびチンパンジー力もなる群力も選択されるいずれか のものである〔7〕記載の方法。
〔11〕〔1〕〜〔4〕のいずれか 1項に記載の非ヒトノックアウト動物に加齢性の疾患又は 症状の予防又は治療薬の候補物質を投与することを特徴とする、当該予防又は治療 薬のスクリーニング方法。
〔12〕〔1〕〜〔4〕のいずれか 1項に記載の非ヒトノックアウト動物力 単離された細胞に 、加齢性の疾患又は症状の予防又は治療薬の候補物質を接触させることを特徴とす る、当該予防又は治療薬のスクリーニング方法。
〔13〕細胞が、破骨細胞、角化上皮細胞、血液細胞、癌細胞、骨髄細胞、線維芽細 胞、血管内皮細胞、真皮細胞、筋細胞、神経細胞、リンパ球、血管平滑筋細胞、滑 膜細胞、毛乳頭細胞、肝細胞、色素細胞、脂肪細胞、子宮内皮細胞、または肺胞上 皮細胞である〔12〕に記載の方法。
〔14〕加齢性の疾患又は症状が、骨変形、骨粗鬆症、骨パジェット病、副甲状腺機能 亢進症、骨密度の低下、皮質骨の海綿骨化、脱毛、組織の損傷又は壊死、腫瘍、胸 部肥大、腹水、貧血、出血、皮膚の老化および爪の老化力 なる群力 選択される 少なくとも 1つである〔11〕〜〔13〕のいずれか 1項に記載の方法。
〔15〕〔1〕〜〔4〕のいずれか 1項に記載の非ヒトノックアウト動物由来の破骨細胞に、 破骨細胞の機能抑制剤の候補物質を接触させることを特徴とする破骨細胞の機能 抑制剤のスクリーニング法。
〔16〕下記 (a)〜（d)の 、ずれかに記載の単離されたタンパク質。
(a)配列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質。
(b)配列番号： 1または 3に記載の塩基配列のコード領域を含む DNAによりコードされ るタンノ ク質。
(c)配列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配列にお 、て 1若しくは複数のアミノ酸が 置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列からなり、配列番号: 2また は 4に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
(d)配列番号： 1または 3に記載の塩基配列を含む DNAとストリンジェントな条件下で ハイブリダィズする DNAによりコードされるタンパク質であって、配列番号： 2または 4 に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
〔17〕〔16〕に記載のタンパク質の部分ペプチド。
〔18〕配列番号: 6に記載のアミノ酸配列を含む、〔17〕に記載のペプチド。
〔19〕〔16〕に記載のタンパク質、または〔17〕もしくは〔18〕に記載のペプチドを含有 する、加齢性の疾患又は症状の予防又は治療薬。
〔20〕加齢性の疾患又は症状が、骨変形、骨粗鬆症、骨パジ ット病、副甲状腺機能 亢進症、骨密度の低下、皮質骨の海綿骨化、脱毛、組織の損傷又は壊死、腫瘍、胸 部肥大、腹水、貧血、出血、皮膚の老化および爪の老化力 なる群力 選択される 少なくとも 1つである〔19〕に記載の予防又は治療薬。
〔21〕〔16〕に記載のタンパク質、または〔17〕もしくは〔18〕に記載のペプチドを含有 する、破骨細胞の機能抑制剤。
[22]〔16〕に記載のタンパク質、または〔17〕もしくは〔18〕に記載のペプチドに結合 する抗体。
図面の簡単な説明
[図 l]Sl-5遺伝子を欠損させるターゲテイングベクターの構造を示す図である。マウス S1-5遺伝子断片の翻訳開始点（第一メチォニンを翻訳する ATGコドン； *で示す）に 1 acZ遺伝子を導入し、ポジティブセレクションマーカー遺伝子としてネオマイシン耐性 ( neo)遺伝子を導入した。また、ジフテリア毒素 A(DT-A)遺伝子も結合させネガティブ マーカーとした。相同組換えを起こした個体は S1-5遺伝子が欠損する代わりに β -ガ ラタトシダーゼが発現し、その酵素活性を利用した lacZ染色により、 S1-5遺伝子のプ 口モーターからの発現を検出できる。遺伝子型確認のためのサザンプロット解析に用
V、たプローブの位置も図示した。
[図 2]Sl-5遺伝子変異マウスの遺伝子型の解析の結果を示す写真である。 Aは、マウ ス尾より DNAを抽出し、 BamHIで消化後、図 1に示したプローブを用いてサザンブロッ ト解析を行った結果を示す。 Bはノーザンプロット解析結果を示す。
[図 3A]26ヶ月齢の S1-5ノックアウトマウスの表現型を示す写真である。 S1-5-/-雄 (動 物番号 : 1101)。背骨が後弯、脱毛、顔面部の皮膚に傷、爪の壊死、胸部肥大、解剖 時に腹水、解剖時に肝臓に腫瘍。 [図 3B]26ヶ月齢の Sl-5ノックアウトマウスの表現型を示す写真である。 S1-5-/-雌 (動 物番号： 1097)。背骨が後弯、止血しにくい、へマトクリット値低い、爪の壊死、眼底に 出血塊、解剖時に子宮肥大、解剖時に脂肪組織内に出血塊。
[図 3C]26ヶ月齢の S1-5ノックアウトマウスの表現型を示す写真である。 S1-5-/-雌 (動 物番号 : 1103)。背骨が後弯。
[図 4]野生型マウスおよび S1-5ノックアウトマウスの骨変形を示す X線写真である。
[図 5]野生型マウスおよび S1-5ノックアウトマウスの骨変形を示す X線写真である。
[図 6]S1- 5ノックアウトマウスの骨変形を示す X線写真である。
[図 7]Aは、 S1-5ノックアウトマウスの背骨弯曲角度を示す写真である。 Bは、各週齢 のマウスの X線撮影を行った後、脊椎の弯曲の角度を計測し、 95° 以下を後弯の発 症とし、 S1-5ノックアウトマウスの背骨弯曲角度の発症率を週齢毎にまとめた図である
[図 8]Sl-5ノックアウトマウスの背骨弯曲角度を週齢毎にまとめたグラフである。
[図 9]Sl-5ノックアウトマウスの脊椎 (胸椎 (10-12)腰椎 (1-3》の骨密度測定結果を示す 図および写真である。 SB1-855等は動物番号、棒グラフ内の数字は週齢、（）内の数 字は後弯角度を示す。
[図 10]S1- 5ノックアウトマウスの脊椎 (胸椎 (10- 12)腰椎 (1-3》の骨密度測定結果を示 す図である。各棒グラフは各群の平均値を表し、棒グラフ内の数字は n数を示す。
[図 ll]Sl-5ノックアウトマウスの大腿骨の骨密度測定結果を示す図および写真である 。 SB1-855等は動物番号、棒グラフ内の数字は週齢を示す。
[図 12]Sl-5ノックアウトマウスの大腿骨の骨密度測定結果を示す図である。棒グラフ 内の数字は n数を示す。
[図 13]Sl-5ノックアウトマウスの脊椎 (胸椎 (10-12》のマイクロ CT画像を示す写真であ る。 SB1-855, LB594等は動物番号を示す。
[図 14]Sl-5ノックアウトマウスの pQCT測定結果を示すグラフである。
[図 15]Sト 5ノックアウトマウスの尿中 NTx値を示すグラフである。各個体につき 1週間 のプール尿を測定した。
[図 16]Sl-5ノックアウトマウスの尿中 NTx値を週齢毎にまとめたグラフである。 [図 17]雌の Sl-5ノックアウトマウスおよび野生型マウスの大腿骨の硬組織染色標本に おける骨組織を示す写真である。 SB2-905, LB574等は動物番号を示す。
[図 18]図 17で示した雌 S1-5ノックアウトマウスおよび野生型マウスの代表例について 大腿骨の硬組織染色標本における骨組織を拡大した写真である。 SB2-905, LB574 等は動物番号を示す。
[図 19]Sl-5ノックアウトマウスの組織切片中の破骨細胞の写真および TRAP陽性細胞 数を示した図および写真である。
[図 20]S1_5ノックアウトマウスの組織切片中の破骨細胞の面積を測定した結果を示す グラフである。
[図 21A-C]Aは、実験工程を示す図である。 B、 Cは、 S1-5ノックアウトマウス由来骨髄 細胞の破骨細胞形成能を示すグラフである。 Bは、 TRAP染色による TRAP陽性多核 細胞数の測定結果を示す。 Cは、 TRAPソリューションアツセィの結果を示す。
[図 21D_E]Dは、 TRAP陽性多核巨細胞の面積を測定した結果を示すグラフである。 Eは、 S1-5ノックアウトマウス由来骨髄細胞の破骨細胞形成能を示す写真である。
[図 22]Sl-5ノックアウトマウスのマウスの尾を切断して 10秒毎に湧出する血液を、ろ紙 で吸い取った結果を示す写真である。 SB1-727, LB438等は動物番号を示す。
[図 23]S1- 5ノックアウトマウスのへマトクリット値を示す写真である。 SB1- 739、 LB438等 は動物番号を示す。
[図 24]S1- 5ノックアウトマウスのへマトクリット値を示す図である。 SB1- 739、 LB438等は 動物番号を示す。
[図 25]Sl-5ノックアウトマウスの尾静脈力 採血した血液力 作製した血液塗抹標本 のギムザ染色写真である。 LB438、 LB487等は動物番号を示す。
[図 26]S1- 5- Hisタンパク質の安定発現 CHO- K1細胞株（バルタ）における S1- 5- Hisタ ンパク質の発現を示す写真である。 Nはトランスフエクシヨンを行って!/、な!/、CHO-Kl 細胞、 Pは一過性に SI- 5-Hisタンパク質を発現した CHO- K1細胞を示す。
[図 27]クローン化した S1- 5- Hisの安定発現 CHO-K1細胞株における S1- 5- Hisタンパ ク質の発現を示す写真である。 Nはトランスフエクシヨンを行って!/、な!/、CHO-Kl細胞
、 Pは一過性に Sl-5- Hisタンパク質を発現した CHO- K1細胞を示す。 [図 28]クローン化した SI- 5- Hisの安定発現 CHO-K1細胞株における SI- 5- Hisタンパ ク質の発現を示す写真である。 Nはトランスフエクシヨンを行って!/、な!/、CHO-Kl細胞 を示す。
[図 29]250 mM Imidazole溶出画分中に含まれるタンパク質を 10% SDS-PAGEにより分 離後、銀染色法 (A)および抗 S1-5抗体を用いたウェスタンプロティング法 (B)により 検出した結果を示す写真である。
[図 30]50 mM (A)および 100 mM (B) Imidazole溶出画分中に含まれるタンパク質を 10
% SDS-PAGEにより分離後、銀染色法により検出した結果を示す写真である。
[図 31]S1- 5 truncateタンパク質の模式図である。
[図 32A]Sl-5-His truncateタンパク質の調製結果を示す写真である。
[図 32B]Sl-5-FLAG truncateタンパク質の調製結果を示す写真である。
[図 33]抗 FLAG抗体を使用して細胞内から精製した FLAG- S1-5タンパク質 (A)、およ び抗 FLAG抗体を使用して培養上清カゝら精製した FLAG- S1-5タンパク質 (B)を、抗 S
1-5抗体を用いたウェスタンプロティング法により検出した結果を示す写真である。
[図 34]293F浮遊細胞力も精製した S1-5-FLAGタンパク質を抗 S1-5抗体および抗 FL
AG抗体を用 、たウェスタンプロティング法により検出した結果を示す写真である。
[図 35]グリコシルぺプチダーゼ F処理を行った Sl-5-Hisタンパク質を抗 S1-5抗体を用 いたウェスタンプロティング法により検出した結果を示す写真である。
[図 36]大腸菌から精製した GST- S1- 5- His truncateタンパク質およびプレシジョンプ 口テアーゼ処理 GST-S1-5タンパク質をウェスタンブロッテイング法により検出した結 果を示す写真である。
[図 37]大腸菌力も精製した MBP-S1-5タンパク質を CBB染色および抗 S1-5抗体を用 いたウェスタンブロティング法により検出した結果を示す写真である。 1は GST-S1-5 タンパク質、 2は MBP-S1-5タンパク質を示す。
[図 38]大腸菌力も精製したプレシジョンプロテアーゼ処理 MBP-S1-5タンパク質を CB B染色により検出した結果を示す写真である。
[図 39]Aは実験工程を示す図である。 Bは S1-5ノックアウトマウス由来骨髄細胞の破 骨細胞形成能力 CHO- K1細胞由来 Sl-5-Hisタンパク質によって抑制されることを 示すグラフである。 Bは TRAP陽性多核細胞数をグラフ化した。
[図 40]Sl-5ノックアウトマウス由来骨髄細胞の破骨細胞形成能力 CHO-K1細胞由 来 Sト 5-Hisタンパク質によって抑制されることを示すグラフである。 TRAP陽性多核巨 細胞数をグラフ化した。
[図 41]Sl-5ノックアウトマウス由来骨髄細胞の破骨細胞形成能が CHO細胞由来 S1-5 -Hisタンパク質によって抑制されることを示す写真である。
[図 42A]TRAP陽性多核巨細胞の面積力 CHO細胞由来 S1-5- Hisタンパク質によつ て減少することを示すグラフである。
[図 42B]CHO細胞由来 Sl-5-Hisタンパク質濃度依存的に形成が抑制された TRAP陽 性多核巨細胞の染色写真を示す。
[図 43]S1- 5ノックアウトマウス由来骨髄細胞の破骨細胞形成能力 1- 5- Hisタンパク質 によって抑制されることを示すグラフである。 TRAP陽性多核細胞数をグラフ化した。
[図 44]S1- 5ノックアウトマウス由来骨髄細胞の破骨細胞形成能力 1- 5- Hisタンパク質 によって抑制されることを示すグラフである。 TRAP陽性多核巨細胞数をグラフ化した
[図 45]Sl-5ノックアウトマウス由来骨髄細胞の破骨細胞形成能力 Sl-5-His truncate タンパク質によって抑制されることを示す写真である。
[図 46]Aは実験工程を示す図である。 Bは RAW264.7細胞の破骨細胞形性能が CHO -K1細胞由来 Sト 5-Hisタンパク質によって抑制されることを示すグラフである。
[図 47]RAW264.7細胞の破骨細胞形成能が、 Sl-5-Hisタンパク質によって抑制される ことを示す写真である。
[図 48]RAW264.7細胞の破骨細胞形成能力 293F浮遊細胞由来 S1-5-FLAGタンパ ク質によって抑制されることを示すグラフである。
[図 49]RAW264.7細胞の破骨細胞形成能力 無細胞発現系による S1-5タンパク質に よって抑制されな 、ことを示すグラフである。
[図 50]RAW264.7細胞の破骨細胞形成能が GST-S1-5タンパク質によって抑制される ことを示すグラフである。
[図 51]RAW264.7細胞の破骨細胞形成能が GST-S1-5タンパク質によって抑制される ことを示す写真である。
[図 52]RAW264.7細胞の破骨細胞形成能が GSTタンパク質によって抑制されないこと を示すグラフである。
[図 53]RAW264.7細胞の破骨細胞形成能が GSTタンパク質によって抑制されないこと を示す写真である。
[図 54]RAW264.7細胞の破骨細胞形成能がプレシジョンプロテアーゼ処理 GST- S1-5 タンパク質によって抑制されることを示すグラフである。
[図 55]RAW264.7細胞の破骨細胞形成能がプレシジョンプロテアーゼ処理 GST- S1-5 タンパク質によって抑制されることを示す写真である。
[図 56]RAW264.7細胞の破骨細胞形成能がプレシジョンプロテアーゼ処理 GSTタン ノ ク質によって抑制されないことを示すグラフである。
[図 57]RAW264.7細胞の破骨細胞形成能がプレシジョンプロテアーゼ処理 GSTタン ノ ク質によって抑制されな ヽことを示す写真である。
[図 58]卵巣摘除 (OVX)ラットにおいて、 S1-5タンパク質投与により大腿骨の骨密度が 回復したことを示すグラフである。
[図 59]卵巣摘除 (OVX)ラットにおいて、 S1-5タンパク質投与により大腿骨の骨強度が 回復したことを示すグラフである。
[図 60]卵巣摘除 (OVX)ラットにおいて、 S1-5タンパク質投与により大腿骨の骨量が回 復したことを示す写真である。
[図 61]Aは、卵巣摘除 (OVX)ラットにおいて、 S1- 5タンパク質投与により組織中の破 骨細胞数が抑制されたことを示す写真である。 Bはそのグラフである。
[図 62]卵巣摘除 (OVX)マウスにお 、て、 S1-5タンパク質投与により大腿骨の骨密度 が回復したことを示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 以下、本発明を詳細に説明する。
[0012] 1. Sト 5遣伝子
S1- 5をコードする遺伝子は公知であり、 accession number AAA65590 (nucleotide ac cession U03877)、 138449、 NP_061489(nucleotide accession NM 018894)、 NP— 00409 6(nucleotide accession NM 004105)、または Q12805に特定される SI- 5タンパク質 や、それらに類似したタンパク質であってヒトシノピオリンタンパク質に結合する活性 を有するタンパク質をも用いることができる (Leucka- Czernik, B. et al.， Mol. Cell. Biol . 15: 120-128, 1995; Heon, E. et al, Arch. Ophthalmol. 114: 193-198, 1996; Ikega wa, S. et al., Genomics 35: 590—592, 1996; Katsanis, N. et al., Hum. Genet. 106: 6 6-72, 2000; Giltay, R. et al" Matrix. Biol. 18: 469-480, 1999; Stone, E. M. et al., Nat. Genet.22: 199-202, 1999)。
[0013] Sl-5遺伝子は、マウス、ラット等のゲノムライブラリ一力も得ることができる。例えば、 細菌人工染色体 (BAC)ライブラリーから、ハイブリダィゼーシヨン法により目的クローン を得ることができる。また、 PCR法により得ることも可能である。
[0014] 2.非ヒトノックアウト動物
本発明は、 D S1-5遺伝子の全部又は一部の機能を喪失させた、加齢性の疾患又 は症状を呈する非ヒトノックアウト動物、および、 2) S1-5遺伝子の全部又は一部の機 能を喪失させることを特徴とする、加齢性疾患を引き起こす非ヒトノックアウト動物の作 製方法を提供する。 S1-5遺伝子の全部又は一部の機能の喪失は、 S1-5遺伝子の破 壊又は変異によるものを例示することができる。
本発明にお 、て、 S1-5の全部又は一部の機能を喪失させたノックアウト動物を作製 するためには、遺伝子ターゲティング法を採用することができる。
[0015] S1-5遺伝子のターゲテイングベクターは、 S1-5遺伝子を破壊することにより当該遺 伝子の全部又は一部の機能を喪失させるためのものである。ここで、「機能を喪失さ せる」とは、遺伝子の機能を完全に失わせること、あるいは遺伝子の機能が野生型と 比較して低下している状態にすることの両者を含む意味である。
[0016] 機能を喪失させるためには、単純に遺伝子を破壊又は欠損させたり、あるいは、遺 伝子に変異を導入して翻訳の段階で読み枠がずれるように操作する等の改変を施 せばよい。
[0017] 本発明の「ノックアウト動物」は、以下の通り作製することができる。
[0018] まず、 S1-5遺伝子の塩基配列の一部または全てを改変したものを分ィ匕全能性細胞 に導入し、改変 S1-5遺伝子が導入された分化全能性細胞を選択する。次に、選択さ れた遺伝子改変 (欠損、破壊、変異等)が施された分化全能性細胞を受精卵に導入 してキメラ個体を作製し、得られたキメラ個体を交配することにより相同染色体上の一 方又は双方の S1-5遺伝子をノックアウトした個体を作出する。
[0019] 本発明に用いられる動物の種類は、特に限定されるものではない。たとえば、ヒトを 除くゼブラフィッシュ、マウス、ラット、モルモット、ゥサギ、 -ヮトリ、ブタ、ヒッジ、ャギ、 ィヌ、ゥシ、サル、およびチンパンジーなどが挙げられる。本発明では取り扱いが容易 で繁殖しやす!/、マウスが好まし!/、。
[0020] 本明細書において、 S1-5遺伝子の機能を失わせるために、 S1-5遺伝子の塩基配 列の一部または全部を改変することができる。「改変」とは、 S1-5遺伝子の DNAの一 部に、欠損、置換または付加を生じさせる変異を加えることをいう。これらの変異とし ては、例えば、遺伝子工学的手法による塩基配列の一部又は全部の削除 (欠失）、 あるいは他遺伝子又は塩基配列の挿入または置換があげられる。例えば、コドンの 読み取り枠をずらすか、プロモーターあるいはェキソンの機能を破壊することにより、 S 1-5欠損遺伝子を作製することができる。これにより、 S1-5遺伝子の発現産物である S 1-5タンパク質の機能が発現しなくなる。
[0021] 本発明のノックアウトマウスは、公知の遺伝子組換え法 (遺伝子ターゲティング法） により作製することができる。遺伝子ターゲティング法は、当分野においてはよく知ら れた技術であり、本分野の種々の実験書に開示されている。
[0022] ターゲテイングベクターを設計するにあたり、 S1-5遺伝子の構造に変化をもたらす 部位は、 S1-5遺伝子の機能が欠損する限り、特に限定されるものではない。但し、 S1 -5遺伝子の機能および構造を考慮して、 S1-5遺伝子の EGF様ドメイン、またはフイブ リン様ドメインの領域を欠失させるように設計することが特に好ましい。
[0023] また、ベクターを導入した組換え体は、ターゲテイングベクターにより導入した薬剤 耐性遺伝子を用いたスクリーニングと、サザンブロット法や PCR法を用いたスクリー二 ングとを併用して選抜することが好ましい。薬剤選択のマーカー遺伝子として、ネオ マイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン Bホスホトランスフェラーゼ遺伝子等を使用す ることができる。また、ネガティブ選択用遺伝子には、 HSVチミジンキナーゼ遺伝子、 ジフテリア毒素 A遺伝子等を使用することができる。 [0024] 上記の方法により作製したターゲテイングベクターを使用して、相同組換えを行う。 本明細書において、「相同組換え」とは、改変された S1-5遺伝子を、ゲノム中の S1-5 遺伝子の DNA領域に、人工的に組換えさせることをいう。
[0025] 目的とする相同組換え体を得るためには、多数の組換え体をスクリーニングする必 要がある。しかし、受精卵では多数のスクリーニングを行うことが技術的に困難である 。そこで、受精卵と同様に多分化能を有し、かつ in vitroで培養することができる細胞 を使用することが好ましい。分化全能性細胞としては、マウス（Nature 292:154-156, 1 981)、ラット（lannaccone, P.M. et al, Dev. Biol. 163(1): 288-292, 1994)、サル（Thom son, J.A. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92(17): 7844-7848, 1995)、ゥサギ（Sch oonjans, L. et al, Mol. Reprod. Dev. 45(4) :439-443, 1996)【こつ!ヽて ίま embryonic ste m(ES)細胞等が確立している。また、ブタについては embryonic germ (EG)細胞が確 立している（Shim H. et al, Biol. Reprod 57(5):1089- 1095, 1997)。
[0026] 従って本発明にお 、ては、これらの動物種を対象に作製することが好ま 、が、特 にノックアウト動物の作製に関して技術が整って 、るマウスが最適である。マウス ES細 胞としては、現在マウス由来の ES細胞株がいくつ力確立されており、例えば TT-2細 胞株、 AB-1細胞株、 J1細胞株、 R1細胞株等を使用することができる。これらのどの ES 細胞株を用いるかは、実験の目的又は方法により適宜選択することができる。
[0027] ES細胞を榭立する場合、一般には受精後 3.5日目の胚盤胞を使用するが、これ以 外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより、効率よく多数の初期 胚を取得することができる。
[0028] このようにして得られた ES細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生でき る再生能を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、 STO 線維芽細胞のような適当なフィーダ一細胞上で leukemia inWbitory factor(LIF)(l〜l OOOOU/ml)存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、 5%炭酸ガス、 95%空気または 5% 酸素、 5%炭酸ガス、 90%空気)で約 37°Cで培養し、継代時には、例えば、トリプシン/ E DTA溶液処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダ一細胞上に播種する方法 などが採用される。このような継代は、通常 1〜3日毎に行なうとともに、細胞の形態的 観察を行うことが好ましい。 [0029] ES細胞への遺伝子導入は、リン酸カルシウム共沈殿法、エレクト口ポレーシヨン法、 リポフエクシヨン法、レトロウイルス感染法、凝集法、マイクロインジェクション法、パー ティクルガン法などの方法を採用することができるが、簡便に多数の細胞を処理でき る点でエレクト口ポレーシヨン法が好まし 、。
[0030] 得られた組換え ES細胞につき、相同組換えが起こっているかどうかのスクリーニング を行う。即ち、まずネオマイシン等を導入した薬剤耐性因子によりスクリーニングを行 う。薬剤耐性遺伝子としては、例えばネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン Bホ スホトランスフェラーゼ遺伝子、ジフテリア毒素 A遺伝子などが挙げられ、レポーター 遺伝子としては、例えば j8 -ガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフエ-コールァセチルト ランスフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。
[0031] さらに、得られた組換え ES細胞について、 S1-5遺伝子上またはその近傍の DNA配 列をプローブとしたサザンブロット解析、あるいは、ターゲティングベクター上の DNA 配列と、ターゲテイングベクターに使用したマウス由来の S1-5遺伝子以外の近傍領 域の DNA配列とをプライマーとした PCR法を行うことにより、相同組換えが起こってい るかを確実にスクリーニングすることが出来る。
[0032] これらのアツセィにより、染色体上に存在する野生型 S1-5遺伝子と導入した S1-5遺 伝子断片の間で正しく相同遺伝子組換えが起こり、染色体上の S1-5遺伝子に変異 が移った細胞を選択することができる。
[0033] 導入遺伝子の組込みが確認された ES細胞を同種の非ヒト哺乳動物由来の胚内に 戻すことにより、宿主胚の細胞塊に組み込まれたキメラ胚が形成される。 ES細胞を胚 盤胞等の胚に導入する方法としては、マイクロインジェクション法や凝集法が知られ ているが、いずれの方法を用いることも可能であり、当業者が適宜改変することがで きる。
[0034] マウスの場合には、ホルモン剤（例えば、 follicle stimulating hormone (FSH)様作用 ¾r¾する pregnant mare's serum gonadotropin (PMSLr)および loteinizing hormone (L H)作用を有する human chorionic gonadotrophs (hCG)を使用）により過排卵処理を 施した雌マウスを、雄マウスと交配させる。その後、胚盤胞を用いる場合には受精か ら 3.5日目に、 8細胞期胚を用いる場合には 2.5日目に、それぞれ子宮から初期発生 胚を回収する。このようにして回収した胚に対して、ターゲテイングベクターを用いて 相同組換えを行った ES細胞を in vitroにおいて注入し、キメラ胚を作製する。あるいは マウス 2日胚 (8細胞期胚)の透明帯を取り除き、 ES細胞と一緒に培養して凝集塊を作 らせる。その凝集塊を一日培養すると胚盤胞になる。これらを仮親に移植して発生お よび生育させることにより、キメラマウスが得られる。仮親とするための偽妊娠雌マウス は、正常性周期の雌マウスを、精管結紮などにより去勢した雄マウスと交配することに より得ることができる。作出した偽妊娠マウスに対して、上記の方法により作製したキメ ラ胚を子宮内移植し、妊娠'出産させることによりキメラマウスを作製することができる 。キメラ胚の着床、妊娠がより確実に起こるようにするため、受精卵を採取する雌マウ スと仮親となる偽妊娠マウスとを、同一の性周期にある雌マウス群力も作出することが 望ましい。
[0035] そして、仮親カゝら産まれた仔のうちキメラマウスを選ぶ。 ES細胞移植胚に由来する マウス個体が得られた場合、このキメラマウスを野生型のマウスと交配し、そして次世 代個体に ES細胞由来の形質が表れるか否かを確認する。次世代個体に ES細胞由 来の形質が表れた場合に、 ES細胞がキメラマウス生殖系列へ導入された可能性があ るとみなすことができる。 ES細胞が生殖系列へ導入されたことを確認するには、様々 な形質を指標として用いることができる力 確認の容易さを考慮して、好ましくは被毛 色を指標とすることが望ましい。マウスにおいては野ネズミ色 (ァグーチ色）、黒色、黄 土色、チョコレート色および白色などの被毛色が知られている。また、体の一部（例え ば尾部先端)力も染色体 DNAを抽出し、サザンプロット解析や PCR法を行うことにより 、選抜を行うこともまた可能である。キメラの寄与率が高いマウスは、 ES細胞がキメラ マウス生殖系列へ導入された可能性が高い。上記のようにして、キメラマウスを選抜し た後に、該キメラマウスを野生型の雌と交配し、 F1を得て変異マウス系統を榭立する
[0036] 上記のようにして得られるキメラ動物は、相同染色体の一方にのみ遺伝子欠損を有 するヘテロ接合体として得られる。相同染色体上の双方の S1-5遺伝子が欠損したホ モ接合体であるノックアウト動物を得るには、 F動物のうち相同染色体の一方にのみ
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遺伝子欠損を有するヘテロ接合体同士を交雑すればょ 、。 [0037] ノックアウト動物が得られたことの確認は、組織力も染色体 DNAを抽出し、サザンブ ロット解析あるいは PCR法で行う。また解剖を行った際の諸組織、臓器の異常を観察 することもできる。さら〖こ、組織力も RNAを抽出し、ノザンプロット解析により遺伝子の 発現パターンを解析することもできる。さら〖こ、必要に応じて血液を採取し、血液検査 や血清生化学的検査を実施することも可能である。
[0038] ここで、ホモ接合体であるノックアウト動物を作製すると、胎性致死に至るなど、成体 まで成長せずにモデル動物として適切でない場合がある。その場合は、必要な時期 にノックアウトさせることが好ま 、。また生体内でのある特定の組織における遺伝子 の機能を調べるには組織特異的に遺伝子をノックアウトすることが好ましい。このよう に特定の時期，特定の細胞系列だけをノックアウトさせた動物、および体細胞の限定 された領域のみでノックアウトさせた動物を、コンデイショナルノックアウト動物という ( バイオマニュアルシリーズ 8,ジーンターゲティング： ES細胞を用いた変異マウスの作 製,相沢慎一著,羊土社, 1995)。
[0039] コンデイショナルノックアウト動物を作製するための手法として、例えば遺伝子ター ゲティング法のためにバタテリオファージ P1由来の組換えシステムである Cre-loxPシ ステム（R.Kuhn. et al.， Science 269: 1427-1429, 1995)を使用することができる。 Cre は組換え酵素であり、 ΙοχΡと呼ばれる 34塩基の配列を認識して、この部位で組換えを 起こさせることが可能となる。従って、ターゲテイングしたい遺伝子を ΙοχΡ配列と ΙοχΡ配 列との間にはさみ、 Creリコンビナーゼ遺伝子を特異的プロモーター下流に組み込む ことにより、部位特異的および時期特異的に Creが産生されて ΙοχΡで挟んだ遺伝子を 切り取る（すなわち、特定の部位、時期において目的遺伝子の機能を喪失させる）こ とができる。本発明において、 Cre-loxPのシステムを用いてターゲテイングベクターを 設計するにあたり、 S1-5遺伝子の構造に変化をもたらす部位は、 S1-5遺伝子の機能 が欠損する限り、特に限定されるものではない。但し、 S1-5遺伝子の機能および構造 を考慮して、 S 1-5遺伝子の EGF様ドメイン、またはフイブリン様ドメインの領域を欠失さ せるように設計することが特に好ま 、。
[0040] 3. 非ヒトノックアウト動物から単離された細胞
本発明は、本発明のノックアウト動物力ゝら単離された細胞もまた提供する。本発明の ノックアウト動物から単離された細胞は、後述のように、加齢性の疾患又は症状の予 防又は治療薬のスクリーニングに用いることができる。
該細胞としては、破骨細胞、角化上皮細胞、血液細胞、癌細胞、骨髄細胞、線維 芽細胞、血管内皮細胞、真皮細胞、筋細胞、神経細胞、リンパ球、血管平滑筋細胞 、滑膜細胞、毛乳頭細胞、肝細胞、色素細胞、脂肪細胞、子宮内皮細胞、または肺 胞上皮細胞が例示できるが、これらに限定されない。
これら細胞は、当業者に周知の方法によって、該ノックアウト動物から単離すること が可能である。
4.加齢性疾患
本発明の非ヒトノックアウト動物は、加齢性の疾患又は症状を呈するものである。既 知の老化モデルマウスとしては、 Klotho変異マウス（Kuro- 0, M. et al., Nature,6;390( 6655):18- 19, 1997)、老化促進モデルマウス（SAM) (Takeda, T. et al., Mech Ageing Dev., 17(2), 183-194, 1981)、ウェルナー症候群モデルマウス (Chen, L. et al., J. Bi omed BiotechnoL, 2(2), 46-54, 2002 )が知られている力 これらのマウスは早期老化 を示し、その寿命も短い。本発明の非ヒトノックアウト動物（例えば S1- 5ノックアウトマウ ス）の一つの特徴としては、野生型マウスと比べ、寿命は変わらないが、多彩な加齢 性の疾患又は症状の重篤化がみられることを挙げることが出来る。本発明にお 、て「 加齢性の疾患又は症状」とは、骨変形、骨粗鬆症、骨パジェット病、副甲状腺機能亢 進症 (Hyperparathyroidium)、骨密度の低下、皮質骨の海綿骨化、脱毛、組織の損 傷又は壊死、腫瘍、胸部肥大、腹水、貧血、出血、皮膚の老化 (シミ、くすみ、たるみ 、小じわ、ほくろ等が挙げられるが、これらに限定されない）および爪の老化などが挙 げられ、これらの疾患又は症状が単独で又は併発して表れることを意味する。
「骨変形」とは、加齢、 RA、骨粗鬆症により骨軟骨の強度が低下し、骨および軟骨 が変形することを意味する。「骨粗鬆症」とは骨成分が全体として減少し、骨折しやす くなつた状態をいう。骨粗鬆症の 90%以上を占めるのは明らかな原因疾患が見つから ない原発性骨粗鬆症であり、そのほとんどが中高年に起こる退行期性のものである。 また、それとは区別される続発性骨粗鬆症は、バセドウ氏病、クッシング症候群、重 症糖尿病、 RA、胃の手術、アルコール多飲、ステロイド剤服用などが原因となり発症 する。
「骨パジェット病」とは骨代謝回転の増加と無秩序な骨の再構築を特徴とする骨疾 患を意味する (メルクマニュアル医学百科のホームページ： http：〃 mmh.banyu.co.jp/ mmhe2j/sec05/ch061/ch061a.html)。骨パジェット病では、骨の一部の領域で破骨細 胞と骨芽細胞とが過度に活性化し、骨吸収と骨の再構築 (リモデリング)が起こり、過 度の活性ィ匕が起きた部分の骨は、正常な骨と比べてもろくなることが知られて 、る。
「副甲状腺機能亢進症」とは副甲状腺ホルモン PTHの分泌が亢進し、その作用が 異常に増強された状態を意味する。副甲状腺機能亢進症では、骨量が減少すること 、破骨細胞が活性化されていること等が知られている。「副甲状腺機能亢進症」として は、腺腫など甲状腺地震で PTHの分泌亢進を起こす原発性副甲状腺機能亢進症、 慢性腎不全、妊娠などその他の原因により副甲状腺の機能が続発的に亢進する二 次性副甲状腺機能亢進症などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
「腫瘍」とは、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞成長および増殖、お よび全ての前癌性および癌性細胞および組織を意味する。本発明の腫瘍は、原発 性腫瘍であってもよいし、転移性腫瘍であってもよい。「癌」および「癌性」という用語 は、典型的には制御できなくなった細胞成長を特徴とする生理学的状態をいう。本発 明において、「腫瘍」の例としては、癌腫、肉腫、白血病および悪性リンパ腫を挙げる ことが出来る。本発明において、癌腫としては、乳癌、前立腺癌、大腸癌、扁平上皮 細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、脾臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸 管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、結腸直腸癌、子宮体癌、唾液腺癌、腎 臓癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌および様々な種類の頭部および頸部の癌を挙げ ることができる。本発明において、肉腫としては、悪性骨腫瘍、悪性軟部肉腫、より具 体的には、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、脂肪肉腫、平滑筋肉腫、または滑 膜肉腫等を挙げることが出来る。
5.加齢件疾患の治療蓉または予防薬のスクリーニング
本発明は、非ヒトノックアウト動物に候補物質を投与することを特徴とする、加齢性 疾患又は症状の治療薬または予防薬のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法では、加齢性の疾患又は症状の予防又は治療薬の候補物質 の中から、ノックアウト動物の表現型を相補する活性を有する物質を選択する。ノック アウト動物の表現型の相補には、完全な相補だけでなぐ不完全な相補も含まれる。
[0043] 具体的には、本発明のノックアウト動物又はその一部に候補物質を接触させ、前記 候補物質を接触させた非ヒト動物又はその一部において標的とする疾患と相関関係 を有する指標値を測定し、対照と比較し、この比較結果に基づき、候補物質の所望 の加齢性疾患に対する効果を評価する。例えば、骨密度の上昇、骨強度の上昇、破 骨細胞の機能抑制、抗腫瘍効果、血液細胞等の増加、止血能の向上等を指標とし て候補物質の予防'治療 ·改善効果を試験することができる。また、皮膚の老化 (シミ 、くすみ、たるみ、小じわ、ほくろ等）を引き起こした動物に、美白およびアンチェイジ ング効果をもたらすィ匕粧品をスクリーニングするために試験することも可能である。
[0044] 「ノックアウト動物又はその一部」とは、動物の生体の全身、および限定された組織 又は臓器の両者を含む。限定された組織又は臓器の場合は、動物から摘出されたも のも含む。
[0045] 候補物質としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物 、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、 これら化合物は新規の化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。これ ら候補物質は塩を形成していてもよぐ候補物質の塩としては、生理学的に許容され る酸 (例、無機酸など)や塩基 (例、有機酸など)などとの塩が用いられ、とりわけ生理 学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸 (例え ば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸 (例えば、酢酸、ギ 酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クェン酸、リンゴ酸、蓚 酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
[0046] 試験動物を候補物質で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射、塗 布、皮下投与、皮内投与、腹腔投与などが用いられ、試験動物の症状、候補物質の 性質などにあわせて適宜選択することができる。また、候補物質の投与量は、投与方 法、候補物質の性質などにあわせて適宜選択することができる。
[0047] 例えば、骨粗鬆症の予防 '治療 ·改善薬をスクリーニングする場合、本発明のノック ァ外動物等に候補物質を投与し、該動物の骨密度値、骨強度値、 X線写真などを 経時的に測定することにより、有効性を示した物質をスクリーニングすることができる。 特に本発明により、ノックアウト動物では骨粗鬆症と背骨の後弯が相関を持つことか ら、ノックアウト動物における後弯の程度が骨粗鬆症の進行度を測る一つの指標とな ることが示唆された。これらのことから、本発明のノックアウト動物に候補物質を投与し
、該動物の背骨の後弯の程度を X線写真等で経時的に測定することにより、候補物 質が骨粗鬆症に有効性を示す力否かを非侵襲的に効率良く判断することが出来る。
[0048] また、本発明のノックアウト動物力も単離された細胞を使用することで、加齢性の疾 患又は症状の予防又は治療薬のスクリーニングが可能である。具体的には、本発明 のノックアウト動物力 単離された細胞に、加齢性の疾患又は症状の予防又は治療 薬の候補物質を接触させる工程を含む、当該予防又は治療薬のスクリーニング方法 を提供する。
[0049] 本発明において、「接触」は、例えば、本発明のノックアウト動物から単離された細 胞の培養液に、該候補物質を添加することにより行うことができる。また、該候補物質 力 Sタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードする DNAを含むベクターを、 ノックアウト動物から単離された細胞へ導入することで行うことも可能である。
[0050] 本発明では、加齢性の疾患又は症状の予防又は治療薬の候補物質の中から、ノッ クアウト動物から単離された細胞の表現型を相補する活性を有する物質を選択する。 ノックアウト動物から単離された細胞の表現型を相補する活性としては、特に制限は ないが、破骨細胞であれば破骨細胞活性抑制、骨髄細胞であれば破骨細胞形成抑 制、角化上皮細胞であれば角化上皮細胞増殖、血液細胞であれば血液細胞分化促 進、癌細胞であれば癌細胞増殖抑制、線維芽細胞であれば線維芽細胞増殖、血管 内皮細胞であれば血管内皮細胞増殖、真皮細胞であれば毛髪形成、筋細胞であれ ば筋細胞変性の是正、神経細胞であれば神経細胞変性の是正、リンパ球であればリ ンパ球活性化抑制、血管平滑筋細胞であれば増殖抑制、滑膜細胞であれば機能正 常化、毛乳頭細胞であれば発毛、肝細胞であれば機能正常化、色素細胞であれば メラニン産生抑制、肺胞細胞であれば活性化異常是正、脂肪細胞であれば分化増 殖抑制、子宫内皮細胞であれば内皮細胞増殖抑制等が例示できる。また、該細胞の 表現型の相補には、完全な相補だけでなぐ不完全な相補も含まれる。 [0051] 6.破骨細胞の機能抑制剤のスクリーニング
本発明は、ノックアウト動物から単離された破骨細胞に、破骨細胞の機能抑制剤の 候補物質を接触させる工程を含む、当該破骨細胞の機能抑制剤のスクリーニング方 法もまた提供する。「破骨細胞の機能」としては、吸収窩形成、 TRAP産生能、ァクチ ンリング形成能、プロテアーゼ (カテブシン K、 ΜΜΡ-9)産生能、酸分泌能が例示でき るが、これらに限定されるものではなぐその機能が直接的又は間接的に骨の破壊を 導く機能である限り、「破骨細胞の機能」に含まれる。
[0052] 破骨細胞の機能抑制剤は、例えば、本発明のノックアウト動物から単離された破骨 細胞の形成数の程度、大きさ等を指標にスクリーニングすることができる力 この方法 に限定されず、例えば、実施例に示すように、本発明のノックアウト動物力 単離した 骨髄細胞を多核巨細胞に分ィ匕させて TRAP陽性多核巨細胞数および TRAP陽性多 核巨細胞の大きさ等を指標にスクリーニングすることが可能である（Takahashi N. et a 1., Endocrinology, 123(5):2600-2, 1988、 Yasuda H. et al, Proc Natl Acad Sci U S A. , 31;95(7), 3597-602, 1998)。
[0053] また、破骨細胞の機能抑制剤は、吸収窩形成能を指標にスクリーニングすることが 可能である（Hirayama, T. et al, J Endocrinol.:Octl75(l):155- 63 2002, Udagawa, N. et al, Bone.: Nov;25(5):517— 23 1999)。
[0054] 該スクリーニング方法によって選択される物質は、破骨細胞の機能抑制剤として、 研究分野や医薬分野において使用できる。また、本発明の破骨細胞の機能抑制剤 は、加齢性の疾患又は症状の予防又は治療薬として応用可能である。
[0055] また、 RA患者の骨破壊部にぉ 、て、増殖した滑膜が骨内へと侵入して 、く最前線 を病理学的に検討すると、多数の多核巨細胞が観察される。この細胞は、 TRAP陽性 、すなわち、破骨細胞としての表現型をみたすことが明らかになっており、 RA骨破壊 において破骨細胞が重要な役割を果たしていることが推察される（Urushibara, M. et al" Arthritis Rheum. Mar;50(3):794- 804, 2004、 Takayanagi, H. et al. Biochem Biop hys Res Commun. Nov 17;240(2):279-86, 1997)。従って、本発明の破骨細胞の機能 抑制剤は、 RAの予防又は治療薬としても利用することができる。
[0056] 7.単離された S1-5タンパク質 本発明は、 1)配列番号： 1または 3に記載の塩基配列のコード領域を含む DNAによ りコードされる単離された S1-5タンパク質、および、 2)配列番号： 2または 4に記載の アミノ酸配列を含む単離された S 1-5タンパク質を提供する。ここで「単離」とは、天然 の環境カゝら取り出された状態を指す。
[0057] 上記タンパク質は、例えば、組換え体として調製することもできる。例えば、ヒト Sト 5 タンパク質であれば、ヒト S1-5タンパク質を発現している細胞 (例えば、ヒト 2倍体線維 芽細胞 (human diploid fibroblast)、滑膜組織や培養細胞として回収した RA患者に由 来する滑膜細胞)から抽出した mRNAをもとに cDNAライブラリーを得る（Short, J.M. et al, Nucleic Acid Research, 16, 7583, 1988)。配列番号： 1に示した塩基配列に基づ いて設定したプローブを用いて、このライブラリ一力 ハイブリダィズするクローンをス クリーニングすることによって、 S1-5タンパク質をコードする DNAを単離することができ る。該 DNAからコードされる S1-5タンパク質は、当業者に周知のタンパク質発現系を 禾 IJ用することで得ることができる。また、ヒト S1- 5タンパク質は、ヒト S1- 5タンパク質を発 現して 、る細胞の培養物から回収 ·精製できる。
[0058] 本発明はまた、上記 S1-5タンパク質と機能的に同等なタンパク質も提供する。この ようなタンパク質が由来する生物種は、特に制限はなぐ例えば、ヒト、ゼブラフイツシ ュ、マウス、ラッ卜、モノレモッ卜、ゥサギ、ニヮ卜!;、ブタ、ヒッジ、ャギ、ィヌ、ゥシ、サノレ、 およびチンパンジー等が例示できる。
[0059] 上記 S1-5タンパク質と機能的に同等なタンパク質としては、例えば、 1)配列番号： 2 または 4に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入 、および Zまたは付加したアミノ酸配列力もなり、配列番号： 2または 4に記載のァミノ 酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な単離されたタンパク質、および、 2)配列 番号： 1または 3に記載の塩基配列を含む DNAとストリンジェントな条件下でノ、イブリ ダイズする DNAによりコードされるタンパク質であって、配列番号： 2または 4に記載の アミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な単離されたタンパク質が挙げられる 上記 S1-5タンパク質と機能的に同等なタンパク質としては、ヒトの加齢性の疾患又 は症状を抑制する機能を有するタンパク質、本発明のノックアウト動物、または本発 明のノックアウト動物力 単離された細胞の表現型を相補する機能を有するタンパク 質が挙げられる。
[0060] また、上記 S1-5タンパク質と機能的に同等なタンパク質としては、免疫学的に同等 なタンパク質を挙げることが出来る。本発明にお 、て「Sl-5タンパク質と免疫学的に 同等なタンパク質」とは、 S1-5タンパク質を特異的に認識する抗体と反応するもので あれば、特に限定されない。例えば、 S1-5タンパク質のェピトープペプチド、該ェピト ープを含有する S1-5タンパク質のドメイン、あるいは該ドメインを含むタンパク質を、 S 1-5タンパク質と免疫学的に同等なタンパク質として挙げることができる。
[0061] S1-5タンパク質の断片は、プロテアーゼを使った消化により得ることができる。また、 配列番号： 1または 3に示した S1-5タンパク質をコードする DNAをランダムに切断し、 それをファージベクターに挿入してドメインペプチドを提示したファージライブラリーを 作成すること〖こよっても得ることができる。これらのライブラリーを、 S1-5タンパク質を認 識する抗体でィムノスクリーニングすれば、免疫学的に活性なドメインを決定すること ができる。クローニングしたファージについて、挿入断片の塩基配列を決定すれば、 活性ドメインのアミノ酸配列も明らかにすることができる。
[0062] 本発明による S1- 5タンパク質と機能的に同等なタンパク質は、免疫学的な特性の みならずシノピオリンとの結合特性に基づいても定義される。すなわち本発明は、シノ ピオリンとの親和性を備える S1-5タンパク質の断片を含む。このような変異体は、シノ ピオリンを使って候補タンパク質をスクリーニングすることによって当業者であれば容 易に選択することができる。たとえば、 S1-5タンパク質は、シノビォリンの cDNAにおい て 1233-1592番目に相当する 120アミノ酸残基をシノビォリンとの結合に必要な領域と して要求する。したがって、この領域を構成するアミノ酸配列力もなるタンパク質、ある いはこのアミノ酸配列を含むタンパク質に結合するタンパク質は、本発明による S1-5 タンパク質と機能的に同等なタンパク質を構成する。
[0063] 加えて本発明による S1-5タンパク質と機能的に同等なタンパク質は、 S1-5タンパク 質が有する生化学的な活性に基づ ヽても定義される。 S1-5タンパク質の生化学的な 活性とは、たとえば破骨細胞形成抑制活性、細胞増殖制御活性を示すことができる（ Leucka- Czernik, B. et al, Mol. Cell. Biol. 15: 120-128, 1995)。 [0064] これらの Sl-5タンパク質に機能的に同等なタンパク質は、他のタンパク質との融合 タンパク質とすることができる。たとえば、 FLAGタグ、 HAタグ、あるいはヒスチジン（His )タグ、グルタチオン Sトランスフェラーゼ (GST)タグ、マルトース結合タンパク質 (MBP) タグなどの付加的なアミノ酸配列が付加され、前記 S1-5タンパク質に機能的に同等 なタンパク質としての少なくとも一つの性状を維持したタンパク質は、前記機能的に 同等なタンパク質に含まれる。付加するタンパク質が、 S1-5タンパク質とは異なる活 性を有している場合も、 S1-5タンパク質が有する少なくとも一つの機能を維持してい る場合には、その融合タンパク質は、本発明における機能的に同等なタンパク質に 含まれる。
[0065] 上記 S1-5タンパク質と機能的に同等なタンパク質は、当業者によって公知の方法（ 実験医学別冊'遺伝子工学ハンドブック， pp246-251、羊土社、 1991年発行)で単離 することができる。たとえば所望のライブラリーを対象に、配列番号： 1または 3に示す 塩基配列（またはその断片）をプローブとしてスクリーニングすれば、相同性の高い塩 基配列を持った DNAをクローニングすることが可能である。このようなライブラリ一とし ては、配列番号： 1または 3の塩基配列に対してランダムに変異を入れたもの、ヒトゃヒ ト以外の種に由来する滑膜組織の cDNAライブラリ一等を示すことができる。
[0066] 与えられた塩基配列に対してランダムに変異をカ卩える方法としては、たとえば DNA の亜硝酸処理による塩基対の置換が知られている (Hirose, S. et al.， Proc. Natl. Aca d. Sci. USA. 79: 7258-7260, 1982)。この方法では、変異を導入したいセグメントを亜 硝酸処理することにより、特定のセグメント内にランダムに塩基対の置換を導入するこ とができる。あるいはまた、 目的とする変異を任意の場所にもたらす技術としては gapp ed duplex法等がある (Keamer, W. et al.， Methods in Enzymol. 154: 350-367, 1987) 。変異を導入すべき遺伝子をクローユングした環状 2本鎖のベクターを 1本鎖とし、 目 的とする部位に変異を持つ合成オリゴヌクレオチドをハイブリダィズさせる。制限酵素 により切断して線状ィ匕させたベクター由来の相補 1本鎖 DNAを、前記環状 1本鎖べク ターにァニールさせ、前記合成ヌクレオチドとの間のギャップを DNAポリメラーゼで充 填し、更にライゲーシヨンすることにより完全な 2本鎖環状ベクターとする。
[0067] 改変されるアミノ酸の数は、典型的には 50アミノ酸以内であり、好ましくは 30アミノ酸 以内であり、さらに好ましくは 5アミノ酸以内（例えば、 1アミノ酸)であると考えられる。
[0068] アミノ酸を人為的に置換する場合、性質の似たアミノ酸に置換すれば、もとのタンパ ク質の活性が維持されやすいと考えられる。本発明のタンパク質には、上記アミノ酸 置換にお 、て保存的置換が加えられたタンパク質であって、ヒト S1-5タンパク質タン ノ^質 (配列番号: 2または 4)と機能的に同等なタンパク質が含まれる。保存的置換 は、タンパク質の活性に重要なドメインのアミノ酸を置換する場合などにぉ 、て重要 であると考えられる。このようなアミノ酸の保存的置換は、当業者にはよく知られている
[0069] 保存的置換に相当するアミノ酸のグループとしては、例えば、塩基性アミノ酸 (例え ばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばァスパラギン酸、グルタミン 酸）、非荷電極性アミノ酸（例えばグリシン、ァスパラギン、グルタミン、セリン、スレオ ニン、チロシン、システィン）、非極性アミノ酸（例えばァラニン、パリン、ロイシン、イソ ロイシン、プロリン、フエ-ルァラニン、メチォニン、トリプトファン）、 β分岐アミノ酸（例 えばスレオニン、パリン、イソロイシン）、および芳香族アミノ酸（例えばチロシン、フエ 二ルァラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などが挙げられる。
また、非保存的置換によりタンパク質の活性などをより上昇 (例えば恒常的活性ィ匕 型タンパク質などを含む)または下降 (例えばドミナントネガティブなどを含む）させる ことち考免られる。
[0070] 配列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置 換、欠失、挿入および Ζまたは付加したアミノ酸配列力もなり、配列番号: 2または 4 に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質は、天然に存在 するタンパク質を含む。一般に真核生物の遺伝子は、インターフェロン遺伝子等で知 られているように、多型現象 (polymorphism)を有する。この多型現象によって生じた塩 基配列の変化によって、 1または複数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入および Zま たは付加される場合がある。このように自然に存在するタンパク質であって、かつ配 列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸が、置換 、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列を有し、配列番号： 2または 4に 記載のアミノ酸配列力もなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質は、本発明に含 まれる。
[0071] あるいは多型現象によって塩基配列に変化はあっても、アミノ酸配列が変わらない 場合もある。このような塩基配列の変異は、サイレント変異と呼ばれる。サイレント変異 を有する塩基配列カゝらなる DNAよりコードされるタンパク質も、本発明に含まれる。な おここで言う多型現象とは、集団内において、ある遺伝子が個体間で異なる塩基配 列を有することを言う。多型現象は、異なる遺伝子が見出される割合とは無関係であ る。
[0072] この他、 S1-5タンパク質と機能的に同等なタンパク質を得る方法として、ハイブリダ ィゼーシヨンを利用する方法を挙げることができる。すなわち、配列番号： 1または 3に 示すような本発明による S1-5タンパク質をコードする DNA、あるいはその断片をプロ ーブとし、これとハイブリダィズすることができる DNAを単離するのである。ハイブリダ ィゼーシヨンをストリンジ ントな条件下で実施すれば、塩基配列としては相同性の高 V、DNAが選択され、その結果として単離されるタンパク質には S1-5タンパク質と機能 的に同等なタンパク質が含まれる可能性が高まる。相同性の高い塩基配列とは、たと えば 70%以上、望ましくは 90%以上の同一性を示すことができる。
[0073] なおストリンジヱントな条件とは、具体的には例えば 6 X SSC、 40%ホルムアミド、 25°C でのハイブリダィゼーシヨンと、 I X SSC、 55°Cでの洗浄といった条件を示すことができ る。ストリンジエンシーは、塩濃度、ホルムアミドの濃度、あるいは温度といった条件に 左右されるが、当業者であればこれらの条件を必要なストリンジエンシーを得られるよ うに設定することは自明である。
[0074] ノ、イブリダィゼーシヨンを利用することによって、たとえばヒト以外の動物種における S1-5タンパク質のホモログをコードする DNAの単離が可能である。ヒト以外の動物種 、すなわちゼブラフィッシュ、マウス、ラット、モルモット、ゥサギ、ニヮトリ、ブタ、ヒッジ、 ャギ、ィヌ、ゥシ、サル、およびチンパンジー等の動物種力も得ることができる DNAが コードする S1-5タンパク質のホモログは、本発明における機能的に同等なタンパク質 を構成する。
[0075] 上記 S1-5タンパク質 (配列番号： 2または 4)に変異を導入して得たタンパク質や、上 記のようなハイブリダィゼーシヨン技術等を利用して単離される DNAがコードするタン ノ ク質は、通常、上記 S1-5タンパク質 (配列番号： 2または 4)とアミノ酸配列において 高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも 30%以上、好ましくは 50%以上、さ らに好ましくは 80%以上 (例えば、 95%以上）の配列の同一性を指す。塩基配列ゃァ ミノ酸配列の同一性は、インターネットを利用したホモロジ一検索サイトを利用して行 うことができる [例えば日本 DNAデータバンク（DDBJ)において、 FASTA、 BLAST, PSI -BLAST,および SSEARCH等の相同性検索が利用できる [例えば日本 DNAデータ バンク（DDBJ)のウェブサイトの相同性検索（Search and Analysis)のページ； http：〃 www.ddbj.nig.ac.jp/ii- maii/homology- j.html]。ま 7こ、 National Center for Biotecnnolo gy Information (NCBI)において、 BLASTを用いた検索を行うことができる [例えば NC BIのホームページのウェブサイトの BLASTのページ； http://www.ncbi.nlm.nih.gOv/B LAST/; Altschul.S. F. et al., J. Mol. Biol. 215(3): 403—10, 1990; Altschul, S. F. et a 1., Meth. Enzymol. 266:460-480, 1996; Altschul, S. F. et al., Nucleic Acids. Res. 25 ： 3389-3402, 1997)]。
[0076] 例えば Advanced BLAST 2.1におけるアミノ酸配列の同一性の算出は、プログラム に blastpを用い、 Expect値を 10、 Filterは全て OFFにして、 Matrixに BLOSUM62を用 い、 Gap existence cost、 Per residue gap cost、およひ Lambda ratioをてれてれ 11、 1 、 0.85 (デフォルト値）に設定して検索を行 ヽ、同一性 (identity)の値 (％)を得ることが できる（Karlin, S. et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264—68 1990, Karlin, S. et a 1., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7 1993)。
[0077] 本発明によるタンパク質、またはその機能的に同等なタンパク質は、糖鎖等の生理 的な修飾、蛍光や放射性物質のような標識、あるいは他のタンパク質との融合といつ た各種の修飾をカ卩えたタンパク質であることができる。ことに後に述べる遺伝子組換 え体においては、発現させる宿主によって糖鎖による修飾に差異が生じる可能性が ある。しかしたとえ糖鎖の修飾に違いを持っていても、本明細書中に開示された S1-5 タンパク質タンパク質と同様の性状を示すものであれば、いずれも本発明による S1-5 タンパク質、または機能的に同等なタンパク質である。
[0078] S1-5タンパク質は、生体材料のみならず、これをコードする遺伝子を適当な発現系 に組み込んで遺伝子組換え体 (recombinant)として得ることもできる。 S1-5タンパク質 を遺伝子工学的な手法によって得るためには、先に述べた S1-5タンパク質をコード する DNAを適当な発現系に組み込んで発現させれば良 、。本発明に応用可能なホ スト Zベクター系としては、例えば、発現ベクター pGEXと大腸菌を示すことができる。 pGEXは外来遺伝子を GSTとの融合タンパク質として発現させることができる（Smith D B, et al.， Gene, 67:31-40, 1988)ので、 S 1-5タンパク質をコードする遺伝子を組み込 んだ pGEXをヒートショックで BL21のような大腸菌株に導入し、適当な培養時間の後 に isopropylthio- β - D- galactoside (IPTG)を添カ卩して GST融合 SI- 5タンパク質の発 現を誘導する。 S1-5タンパク質をコードする遺伝子は、滑膜細胞の cDNAライブラリー 等を铸型として PCR法等で増幅することにより得ることができる。本発明による GSTは ダルタチオンセファロース 4Bに吸着するため、発現生成物はァフィ-テイク口マトダラ フィ一によつて容易に分離 '精製することが可能である。
[0079] S1-5タンパク質の recombinantを得るためのホスト/ベクタ一系としては、この他に も次のようなものを応用することができる。まず細菌をホストに利用する場合には、ヒス チジンタグ、 HAタグ、 FLAGタグ、 GSTタグ、 MBPタグ等を利用した融合タンパクの発 現用ベクターが市販されている。酵母では、 Pichia属酵母が糖鎖を備えたタンパク質 の発現に有効なことが公知である。糖鎖の付加という点では、昆虫細胞をホストとする バキュロウィルスベクターを利用した発現系も有用である（Bio/Technology, 6:47-55, 1988)。更に、哺乳動物の細胞を利用して、 CMV、 RSV、あるいは SV40等のプロモー ターを利用したベクターのトランスフエクシヨンが行われており、これらのホスト Zベクタ 一系は、いずれも S1-5タンパク質の発現系として利用することができる。また、レトロゥ ィルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター等のウィルスべ クタ一を利用して遺伝子を導入することもできる。
[0080] 得られた本発明のタンパク質は、宿主細胞内または細胞外 (培地など)から単離し、 実質的に純粋で均一なタンパク質として精製することができる。タンパク質の分離、精 製は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよぐ 何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾 過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気 泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればタンパク質 を分離、精製することができる。
[0081] クロマトグラフィーとしては、例えばァフィユティークロマトグラフィー、イオン交換クロ マトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着ク 口マトグラフィ一等が挙げられる (Marshak et al.， Strategies for Protein Purification a nd Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Cold Spring Harbo r Laboratory Press, 1996)。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例 えば HPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
[0082] 本発明のタンパク質は、無細胞系以外の発現系を用いることが好ま 、。
また、本発明のタンパク質は、生理的な高次構造、糖鎖付加、ジスルフイド結合、脂 質付加、メチルイ匕等の修飾が加えられたものが好ましい。本発明における糖鎖として は、例えば、 N結合型糖鎖、 0結合型糖鎖などが挙げられる。また、 N結合型糖鎖とし ては、高マンノース型、混成型、複合型カゝらなる N結合型糖鎖など、 0結合型糖鎖とし ては、ムチン型（0- GalNAc)、 0- Fuc型、 0- Man型、 0- Glc型などからなる 0結合型 糖鎖などが例示できる。
また、本発明のタンパク質は、実質的に精製されたタンパク質であることが好ましい 。ここで「実質的に精製された」とは、本発明のタンパク質の精製度 (タンパク質成分 全体における本発明のタンパク質の割合）力 50%以上、 60%以上、 70%以上、 80 %以上、 90%以上、 95%以上、 100%若しくは 100%に近いことを意味する。 100%に 近い上限は当業者の精製技術や分析技術に依存するが、例えば、 99.999%、 99.99 %、 99.9%、 99%などである。
[0083] また、上記の精製度を有するものであれば、如何なる精製方法によって精製された ものでも、実質的に精製されたタンパク質に含まれる。例えば、上述のクロマトグラフィ 一力ラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、 SDS -ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、 または組み合わせることにより、実質的に精製されたタンパク質を例示できるが、これ らに限定されるものではない。
[0084] また、本発明は、上述した本発明のタンパク質の部分ペプチド (部分断片)もまた提 供する。該部分ペプチドは、本発明のタンパク質と機能的に同等なものであれば、そ の長さ等は特に制限されない。本発明の部分ペプチドとしては、配列番号: 6に記載 のアミノ酸配列を含むペプチドであって、本発明のタンパク質より短 、ペプチドが例 示できる。このようなペプチドを利用することで、加齢性の疾患又は症状の予防又は 治療を行うことができ、また破骨細胞の活性を抑制することもできる。
[0085] 8.纏 I
本発明は、本発明のタンパク質またはその部分ペプチド（以下タンパク質等と称す る）を含有する、加齢性の疾患又は症状の予防又は治療薬を提供する。「加齢性の 疾患又は症状」は上記の通りである。さらに、本発明は、本発明のタンパク質等を含 有する、破骨細胞の機能抑制剤を提供する。これら薬剤におけるタンパク質等は、単 離されたものであれば、その状態に特に制限はなぐ上記薬剤として使用できる限り 、実質的に精製されたタンパク質等でも、粗精製状態のタンパク質等でも使用するこ とができる。また、薬剤におけるタンパク質等は、無細胞系以外の発現系で生産され ることが好ましい。
[0086] これら薬剤は、ヒトゃヒト以外の動物（例えば実験動物、畜産動物、愛玩動物等）の 加齢性の疾患又は症状の予防又は治療薬として、また破骨細胞の機能抑制剤として 禾 IJ用することがでさる。
[0087] 本発明のタンパク質は、例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、例えば、 滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤 (EDTA等) 、結合剤等などと適宜組み合わせて製剤化して投与することが考えられる。
[0088] 本発明の薬剤の形態 (剤形)としては、注射剤形、凍結乾燥剤形、溶液剤形などが 例示できる力 これらに限定されるものではない。
[0089] 患者への投与は経口、非経口投与の!/、ずれでも可能である力 好ましくは非経口 投与であり、例えば、注射投与が可能である。注射投与の例としては、例えば、静脈 内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、皮内注射などにより全身または局部 的に投与することができる。
[0090] 投与量は、患者の体重や年齢、投与方法、症状などにより変動するが、当業者であ れば適当な投与量を適宜選択することが可能である。一般的な投与量は、薬剤の有 効血中濃度や代謝時間により異なるが、 1日の維持量として約 0.1mg/kg〜約 1.0g/kg 、好ましくは約 O.lmg/kg〜約 10mg/kg、より好ましくは約 O.lmg/kg〜約 1.0mg/kgであ ると考えられる。投与は 1回力 数回に分けて行うことができる。
[0091] 9.抗体
本発明は、 S1-5タンパク質等を認識する抗体を提供する。本発明による S1-5タンパ ク質ある 、はその断片を免疫原として、公知の方法により S1-5タンパク質等の抗体を 得ること;^でさる (Hariow, E. et al., Antioodies; A Laboratory manual. Cold bpnng H arbor, New York, 1988、 Kohler, G. et al., Nature 256: 495—7, 1975)。
[0092] 免疫には、本発明の Sl-5タンパク質またはその断片を適当なアジュバントとともに 免疫動物に免疫する。 S1-5タンパク質の断片は、担体蛋白質と結合させて免疫原と することも可能である。免疫原を得るための担体蛋白質には、スカシガイへモシァ- ン (KLH)、あるいはゥシ血清アルブミン (BSA)等を用いることができる。
[0093] 免疫動物には、ゥサギ、マウス、ラット、ャギ、あるいはヒッジなどが一般に利用され る。アジュバントとしては、フロイントのコンプリートアジュバント（FCA)等が一般に用い られる（Freund, J., Adv. Tubercl. Res., 1:130-148, 1956)。適当な間隔で免疫を追 加し、抗体価の上昇を確認したところで採血し抗血清を得ることができる。更にその 抗体画分を精製すれば、精製抗体 (ポリクローナル抗体)とすることもできる。
[0094] あるいはまた、抗体産生細胞を採取して細胞融合法などによりクローニングすれば 、モノクローナル抗体を得ることもできる。モノクローナル抗体はィムノアッセィにおい て高い感度と特異性を達成するための重要なツールである。また、別の方法として、 シノビオリンをコードする DNAをランダムに切断し、それをファージベクターに挿入し てドメインペプチドを提示したファージライブラリーを作成することによつても S1-5タン ノ ク質等を認識する抗体を得ることが出来る。これらのライブラリーを、シノビオリンを 認識する抗体でィムノスクリーニングすれば、免疫学的に活性を持つドメインを決定 することが出来る。
[0095] 抗体産生細胞としては、免疫動物に由来するものを利用することもできる。更に、こ うして得られた免疫動物に由来するモノクローナル抗体産生細胞の抗体遺伝子をも とに、キメラ抗体やヒト化抗体の構築が可能である。抗体をヒトに投与する場合、動物 の抗体は異物として排除されるため望ましくない。そこで抗原性の強い抗体の定常領 域をヒトの抗体で置換したキメラ抗体や、ある 、は定常領域のみならず可変領域のフ レームワークまでヒトの遺伝子で置換したヒト化抗体が必要になる。
[0096] 本発明に基づ ヽて提供される S 1-5タンパク質等を認識するキメラ抗体、あるいはヒト 化抗体は、薬物移送システム（Drug Delivery System; DDS)に有用である。本発明に よる S1-5タンパク質等を認識する抗体を使った DDSにおいて、抗体とリンクさせること により有用性が期待できる物質としては、破骨細胞の機能を抑制する物質 (ビスフォ スフォネート、 osteoprotegerin)などを示すことができる。
[0097] また、本発明の抗体は、 S1- 5タンパク質等の免疫学的検出用試薬とすることができ る。組織や血中に存在するタンパク質等を、抗体を用いて免疫学的に検出する方法 は公知である。
[0098] また本発明の抗体は、 S1-5タンパク質等、または S1-5タンパク質等を発現する細胞 の分離あるいは検出に利用することができる。抗体を用いたタンパク質等の単離精製 方法は、当業者に周知である。また、本発明の S1-5タンパク質等は、滑膜細胞ゃヒト 2 倍体線維芽細胞のマーカーとして使用されうる。すなわち S1-5タンパク質等の発現を 指標に、滑膜細胞ゃヒト 2倍体線維芽細胞を検出したり分離したりすることができる。 抗体は適宜蛍光等により標識される。例えば、 S1-5タンパク質等に対する抗体を用 V、、セルソーティング等により S1-5タンパク質等を発現する細胞を分離することができ る。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
[0099] 以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施 例に限定されるものではない。
実施例 1
[0100] S1-5遺伝子のクローユングおよびターゲテイングベクターの作製
RA患者滑膜細胞由来の cDNA発現ライブラリーを用いて、シノビォリンに結合する 因子のスクリーニングを行った (竹縛忠臣、渡邊俊榭編、バイオマニュアル UPシリー ズ"タンパク質の分子間相互作用実験法"、 pp. 66-67、羊土社； Kaelin, W. G. et al.， Cell 70, 351-364, 1992; Skolnik, E. Y. et al" Cell 65, 83—90, 1991; Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, a laboratory manual second edition, Cold Spring Harbor Lab oratory Press 12.16-12.20, 1989)。ライブラリーファージを大腸菌（XL1- Blue MRF') に 37 °Cで 20分間インキュベートして感染させ、 Topァガロースと混和後プレートに広 げた。 42 °Cで 3.5時間培養後、 10mM IPTGに浸漬した後乾燥させた-トロセルロー スメンブレンをプレートに載せ、さらに 37°Cで 3.5時間培養を行った。メンブレンを回 収後、洗浄バッファー [10 mM Tris-HCl (pH8.0), 0.5% Skim milk, 0.1% TritonX- 100,
150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl , 1 mM DTT, protease inhibitor (complete
2
, Boehringer Mannheim社）]で 5分間の洗浄を 5回行った後、ブロッキングバッファー [ 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5% Skim milk, 0.1% Triton X— 100, 150 mM NaCl, 1 mM E DTA, 5 mM MgCl , 1 mM DTT, 5% glycerol, protease inhibitor (complete, Boehringe
2
r Mannheim社) ]に 1時間浸漬した。洗浄バッファーで 5分間の洗浄を 5回行った後、 プロテインキナーゼ Aで 32Pラベルした GST-シノビオリンをプローブとして加え（約 106 cpm/ml)、インキュベートした。メンブレン 1枚のカウントが約 1 kcpmになるまで洗浄バ ッファーを変えながら洗浄を繰り返し、オートラジオグラフィ一によりシグナルを検出し た。その結果、シノビォリンに結合するクローンが得られた。この cDNAについて、その 5'末端付近の 100 bp、ならびに 3'末端付近の 100 bpについて塩基配列を決定した。 得られた塩基配列情報を基にデータベースの検索を行ったところ、末端部分の 100b pにおいては S1-5 (EFEMP-1、 FBNL、または FBLN-3とも呼ばれる） [Lecka-Czernik, B. et al., Molecular andし ellular Biology, 15, 120—128, 1995; accession number U03 877 (cDNA), AAA65590 (protein), Stone, E. M. et al., Nature Genetics 22, 199—202 , 1999; accession number Q12805 (protein)]と呼ばれる公知の遺伝子と共通の配列 であることが明ら力となった。両者の遺伝子とその翻訳産物の大きさはほぼ同じであり 、同一のタンパク質であることが示唆された。本発明において、ヒト S1-5の cDNA配列 およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号： 1および 2に示す。
マウス S1-5遺伝子断片の翻訳開始点（第一メチォニンを翻訳する ATGコドン）に lac Z遺伝子を導入し、ターゲテイングベクターを構築した（図 1)。マーカー遺伝子として ネオマイシン耐性遺伝子を導入し、またジフテリア毒素 A遺伝子も結合させ非相同的 な組換えを起こした細胞株を排除できるようにした。本発明において、マウス S1-5の c DNA配列、アミノ酸配列およびゲノム配列を、それぞれ、配列番号： 3、 4および 5に示 す。
実施例 2
[0102] S1- 5ノックアウトマウスの作製
実施例 1のターゲティングベクターをマウスの TT-2細胞株にエレクト口ポレーシヨン により導入し相同組換えを生じた細胞株を選抜した。得られた細胞を 8細胞期胚に注 入し直接仮親の卵管に移植するか、または一日培養して胚盤胞まで発生したものを 仮親の子官に移植した。得られたヘテロ変異マウス (F1)同士を交配させ、ヘテロお よびホモ変異マウスを得た。こうして得られた変異マウスにおいては、本来 S1-5が発 現すべき組織で、 S 1-5に代わって /3 -ガラタトシダーゼタンパク質が発現する。
[0103] 遺伝子型はサザンプロット解析により確認した。生後 2週齢ほどのマウスの尾先端 3 mm程度から DNAを抽出し、得られた DNAを制限酵素 BamHIで DNAを消化したものを 用いた。野生型では 2.4 kbp、ホモ変異マウスでは 5.4 kbp、ヘテロ変異マウスでは両 方の位置にバンドが検出された（図 2A)。また、ノーザンプロット解析により、 S1-5遺 伝子の肺における mRNAの発現を確認したところ、該遺伝子の mRNAの発現は確認さ れなかった（図 2B)。
実施例 3
[0104] S1-5ノックアウト動物の解析
13〜117週齢（3〜29ヶ月齢）の S1- 5ノックアウトマウスにつ!、て、剖検および X線写 真による解析を行なったところ、高齢マウス (8ヶ月〜）において、背骨の後弯、脱毛、 顔面部の皮膚に傷、爪の壊死、胸部肥大、腹水、肝臓の腫瘍、眼底および脂肪組織 内の出血塊、子宮肥大が見られた（図 3〜6)。
実施例 4
[0105] S1-5ノックアウトマウスの背骨後弯の解析
Sト 5ノックアウトマウスにぉ 、て背骨の弯曲を数値ィ匕するために、 X線写真を用いて 弯曲している角度を計測した。その結果、野生型マウスでは 95° 以下の角度を示す 個体は少なかったのに対し、 S1-5ノックアウトマウスでは 95° 以下の角度を示す個体 が頻出していた。そこで 95° 以下を後弯発症と定義し、 21週齢毎に発症率をまとめた 。雄と比較して雌の方がより発症頻度が高ぐまた発症時期も 22週齢頃からと早期か ら認められ、加齢とともに重篤化していた (図 7、 8)。
実施例 5
[0106] S1- 5ノックアウトマウスの骨密度の測定およびマイクロ CTによる解析
S1-5ノックアウトマウスの骨組織に異常が認められたため、さらに詳細な解析を行つ た。野生型マウスおよび S1- 5ノックアウトマウスより脊椎 (胸椎 (10- 12)腰椎 (1-3》、大腿 骨を摘出し 70%エタノールにて固定した後、骨密度の測定を行った。骨密度は DCS-6 00EX-IIIR型 (Aloka社製)にてスライス厚 1 mm、速度 10 mm/sでスキャンした値の平均 を用いた。
その結果、脊椎 (胸椎 (10- 12)腰椎 (1-3》では、 Sト 5ノックアウトマウスにおいて雌雄 ともに骨密度の低下が認められた。また部位別に計測した結果、 S1-5雄ノックアウト マウスでは特に胸椎 (10-12)での骨密度の低下力 逆に S1-5雌ノックアウトマウスでは 特に腰椎 (1-3)での骨密度の低下が認められた（図 9、 10)。
大腿骨では、 Sト 5ノックアウトマウスにおいて雌雄ともに骨密度の低下が認められ た。また部位別に計測した結果、 S1-5雄ノックアウトマウスでは特に大腿骨骨幹 1/2で の低下が認められ、逆に S1-5雌ノックアウトマウスでは、すべての部位での低下が認 められた（図 11、 12)。
S1- 5ノックアウトマウスおよび野生型マウスのマイクロ CT画像撮影し、胸椎のマイク 口 CT画像を 3D構築したところ（図 13)、野生型マウスの椎体表面が滑らかであるのに 対し、ノックアウトマウスでは表面の凹凸が目立った。
実施例 6
[0107] S1- 5ノックアウトマウスの pQCTによる解析
さらに peripheral quantitative Computed Tomography(pQCT)を測定し詳細な解析を 行った。その結果、 S1-5ノックアウトマウスにおいては骨塩量'骨密度の低下が認めら れた（図 14)。この現象は特に雌個体において顕著であった。また、応力一歪み係数 (SSI)は野生型マウスに比べ S1-5ノックアウトマウスで顕著に減少しており、骨強度が 低下していることが明ら力となった。
実施例 7 [0108] Sl-5ノックアウトマウスの尿中 NTxの解析
尿中あるいは血清中の type I collagen cross-linked N-telopeptide(NTx)は骨密度と 逆相関を示し、かつ骨吸収の亢進を反映することが知られている（Taguchi Y et al, Calcif Tissue Int 62; 395-399, 1998)。そこで、 SI- 5ノックアウトマウスの骨密度低下が 骨吸収の亢進によるものかを調べるため、尿中の NTxを測定した。その結果、 S1-5ノ ックアウトマウス雌において 43週齢以降にこの値が高値を示すことが明ら力となり (図 1 5、 16)、 S1-5ノックアウトマウスでは骨吸収が亢進していることが示唆された。
実施例 8
[0109] S1-5ノックアウトマウスの大腿骨の組織学的解析
S1-5ノックアウトマウスおよび野生型マウスの大腿骨を摘出後、骨周囲の軟部組織 を除去し 70%エタノールにて固定し、組織標本、硬組織染色標本の作製および骨組 織観察を行った。その結果、 S1-5ノックアウトマウスでは皮質骨の海綿骨化が観察さ れた（図 17、 18)。一般的に、副甲状腺機能亢進症になると血中 PTHが上昇し、その 結果高代謝回転骨となり皮質骨が海綿骨化を起こすことが知られている。また、骨代 謝回転の増加と無秩序なリモデリングを特徴とする骨パジェット病においても、皮質 骨の海綿骨化が見られることが知られて 、る。
実施例 9
[0110] S1- 5ノックアウトマウスの TRAP染色による解析
骨組織標本の TRAP染色を行い、組織中における破骨細胞数の確認を行った。ま た、等倍で撮影した各ゥエルの画像をコンピューターに取り込み、 Image J (NIHより配 布）にて破骨細胞に相当する部分を線で囲み、その面積をピクセルで算出した。その 結果、 S1-5ノックアウトマウスにおいては破骨細胞数が増加し（図 19)、その大きさも 大きくなつていた（図 20)
実施例 10
[0111] S1-5ノックアウトマウス由来骨髄細胞における破骨細胞形成能の解析
S1-5ノックアウトマウス由来骨髄細胞を用いて、 in vitroでの破骨細胞形成能の解析 を行った。骨髄細胞 1 X 105個を 96ゥエルプレートに播種し、 macrophage colony stimul ating facter (M- CSF)を終濃度 50 ng/mLとなるように添カ卩し、 2日後に Receptor Activa tor of NF- K B Ligand (1¾^^1し)を終濃度10,30,100 ng/mLとなるよう添カ卩した。 7日後 に細胞を固定し、 TRAP染色を行い破骨細胞形成能を検討した (図 21 A)。試験は n=6 で実施した。その結果、 RANKL終濃度 30、 100 ng/mL存在下で破骨細胞形成数が 有意に上昇していることが確認された (図 21B)。 TRAPソリューションアツセィを行った ところ、 S1-5ノックアウトマウスにおいて TRAP活性値が上昇していた（図 21C)。また、 RANKLを終濃度 100 ng/mLで添加した際の TRAP染色の結果、野生型と比較し、 S1- 5ノックアウトマウスでは TRAP陽性多核巨細胞の大きさがより大きくなつていた（図 21 Dおよび E)。これらの結果から、 S1-5が破骨細胞の分ィ匕抑制に関与していることが 示唆された。
実施例 11
[0112] S1-5ノックアウト動物の止血の解析
8週齢〜 111週齢 (26ヶ月齢）の S1- 5ノックアウトマウスについて、尾部を切断し、 10 秒ごとに湧出する血液をろ紙にて吸い取り、止血の程度を検討した。その結果、 S1-5 ノックアウトマウスにぉ 、ては、止血されにくい傾向にあることがわかった（図 22)。 実施例 12
[0113] S1- 5ノックアウト動物のへマトクリット値解析
へマトクリット 定用 ¾糸田管 (し apiliary tubes for microhematocnts 75 mm length heparinized, Drummond Scientific Co.)の一端を血液の中に入れ、適当な傾斜を保 ち、毛細管現象で血液を上げ、毛細管全長の 2/3に達するまで採血した。次いで、パ テにて、血液を吸引した一端を封じた。一端を封じた毛細管を、遠心器で、 11000 rp m、 5分間遠心した後、計測板を用いて割合（％)を読んだ。その結果、 S1-5ノックァゥ トマウスでは、へマトクリット値が低い傾向にあり、貧血状態であることがわ力つた（図 2 3、 24)。
実施例 13
[0114] S1-5ノックアウト動物の末梢血のギムザ染色
15〜110週齢の31-5ノックァゥトマゥスを用ぃて、尾静脈から採血後、 PBSにて 1000 倍希釈し、サイトスピン (800 rpm、 5分)を行ない、末梢血のギムザ染色を行なった。 その結果、 S1-5ノックアウトマウスにおいては貧血がみられ、具体的には、赤血球数 の減少、赤血球の異常 (環状赤血球)、染色性の違いが観察された（図 25)。
実施例 14
Sl-5-Hisタンパク質の安定発現 CHO- K1細胞の作製
Sト 5- Hisタンパク質の大量精製を行うことを目的とし、 Sト 5- Hisタンパク質の安定 発現 CHO- K1細胞の作製を行った。 CHO- K1細胞（10 cm dish x 1)に Lipofectamine 2000を用いて 20 gの pCAGGS- SI- 5- Hisおよび 0.7 g pcDNA3を同時にトランスフ クシヨンし、 24時間後に 10倍希釈にて 10 cm dish 6枚に播種した。次いで 24時間後 に 800 g/mLの Geneticinにてセレクションを開始し、 11日後にコロニーのピックアツ プを行った。 10 cm dish 1枚につき 16個のコロニー（合計 96クローン）を 96- well plate に播種し、 24- well plate, 6- well plateへとスケールアップしていった。同時にバルタ 6 種類を 10 cm dishにそれぞれ播種し、コンフルェントに達したバルタ 6種類を無血清 培地に交換した後、 24時間後に細胞抽出液および培養上清中の Sl-5-Hisの発現チ エックをウェスタンブロッテイング法にて行った。抗体は S1-5ペプチド（42-56 : 15ァミノ 酸 CKDIDEC YE CK:下線部は T細胞ェピトープの予測）を抗原とし、ゥサギに免 疫して作製後、ウェスタンブロッテイング法で S 1-5タンパク質を認識することを確認し たものを用いた。一方、 6-well plateにてコンフルェントに達したクローン化した細胞も 同様に Sl-5-Hisタンパク質の発現チェックを行った。 6-well plateの 1 wellに対して、 無血清培地 1 mLを用い、その TCA沈殿物の半量を発現チェックに用いた。その結果 、 6種類のバルタはいずれも、 Sl-5-Hisタンパク質の発現が細胞抽出液および培養 上清において確認され、特にバルタ No.l、 2、 3において強い発現が認められた。さら に、 CHO-K1細胞内在性の S1-5タンパク質が培養上清中に分泌されていることが認 められた (図 26)。一方、ピックアップした 96クローンのうち、増殖が認められた 90クロ ーンにつ 、て培養上清中の Sl-5-Hisタンパク質の発現チェックを行った（図 27)。こ のうち、クローン No.l、 6、 10、 11、 13、 25、 38、 43、 44、 61、 96に対して、再度 Sl-5-His タンパク質の発現チェックを行った（図 28)。その結果、クローン No.l、 6、 44、 96にお いて、 Sト 5- Hisタンパク質の発現がバルタはりも強く検出された。最終的にクローン No.96を選択し、以降の実験に用いた。
実施例 15 [0116] SI- 5- Hisタンパク質の安定発現 CHO-K1細胞培養上清からの精製
Sl-5-Hisタンパク質の安定発現 CHO- K1細胞培養上清 60 mLをフィルターろ過後 、 Centriplusにより約 10 mLに濃縮した。濃縮した試料を精製用バッファー (20 mM Tri s- HCl(pH 7.5),500 mM NaCl,10% glycerol)に透析した。透析後の試料を 1 mLの HisT rapカラムに添加し、カラムを 10 mLの精製用バッファーで洗浄した。吸着したタンパク 質を 10 mMおよび 250 mM Imidazoleを含む精製用バッファーで溶出した（1 mL/フラ クシヨン)。 250 mM Imidazole溶出画分中に含まれるタンパク質を 10% SDS-PAGEによ り分離後、銀染色法（図 29A)ある ヽは抗 S1-5抗体を用いたウェスタンブロッテイング 法により検出した（図 29B)。その結果、抗 S1-5抗体により、一本のバンドが検出され た。
[0117] さらに、 Sl-5-Hisタンパク質の安定発現 CHO- K1細胞培養上清 280 mLをフィルタ 一ろ過 (0.22 m)後、 1 mLの HisTrapカラムに添カ卩した。カラムを 10 mLの精製用緩衝 液 (20 mM Tris— HCKpH 7.5),500 mM NaCl,10% glycerol)および 10 mM Imidazoleを含 む精製用緩衝液で洗浄し、吸着したタンパク質を 50 mMおよび 100 mM Imidazoleを 含む精製用緩衝液で溶出した（1 mL/フラクション)。溶出画分を回収し (約 4 ml), 1 L の PBSに対してー晚透析後、試料をフィルターろ過 (0.22 μ m)した。 50 mMおよび 100 mM Imidazole溶出画分中に含まれるタンパク質を 10% SDS-PAGEにより分離後、銀 染色法により検出した（図 30)。その結果、 50 mM Imidazoleと比較して、 100 mM Imid azoleを含む精製用緩衝液での溶出画分では余分なバンドが消失し、より精製された S1- 5タンパク質が得られたことが示された。
実施例 16
[0118] CHO- K1細胞力らの S1- 5- His truncateタンパク質の調製
S1-5は 6個の EGF様ドメインを配列中に有する。 S1-5の機能を調べるため、 EGF様 ドメインを C末端側から 1個ずつ削除し、 6個のコンストラクトを作製した (図 31)。
[0119] CHO- K1細胞に FuGENE6 (ロシュ）を用いて S1- 5- El- His/pME18S、 SI- 5- El- 2- Hi s/pME18S、 SI- 5- El- 3- His/pME18S、 SI- 5- El- 4- His/pME18S、 SI- 5- El- 5- His/p ME18S、 SI- 5- El- 6- His/pME18S、 SI- 5 foU- His/pME18Sをトランスフエクシヨンした。 トランスフ クシヨンより 8時間後、培地を無血清培地に交換し、 24時間培養を行った。 培養上清を回収し、 Ni-ァガロースを加え、 4°Cで 8時間回転させた。 Ni-ァガロースを 洗浄バッファー（20 mM Tris(pH7.5)、 500 mM NaCl、 10% Glycerol, 10 mM Imidazole )で 3回洗浄し、その後、溶出バッファー（20 mM Tris(pH7.5)、 500 mM NaCl、 10% Gl ycerol, 250 mM Imidazole)を用いて Sl-5タンパク質を溶出させた。溶出画分は透析 によりバッファーを PBSに置換し、ウェスタンブロッテイング法により S1-5タンパク質の 濃度を算出した (図 32A)。
同様に SI- 5- FLAG truncateタンパク質および SI- 5- FLAGタンパク質を作製し（図 3 2B)、それぞれの発現ベクターを CHO- K1細胞（6-well plate)にトランスフエクシヨンし た。 4時間後に無血清培地 (lml)に交換し、 24時間インキュベートした後、培養上清 (9 00 μ 1)を TCA沈殿に供した。その後、 TCA沈殿物および細胞抽出液を用い、抗 FLA G抗体によるウェスタンブロッテイング法を行った。その結果、いずれの truncateタンパ ク質も全長 S1-5タンパク質に比較し発現量が高ぐ特に Sl-5 (Eト 3)-FLAGタンパク 質の発現量が高く認められた。
実施例 17
HEK293細胞からの FLAG- S1- 5 truncateタンパク質の調製
HEK293細胞（大日本製薬）に発現させた FLAG-S1-5 truncateタンパク質の精製を 行った。 HEK293細胞を 80- 90 %コンフルェントになるように 150 mm dish (IWAKI)に播 種した。翌日、 FuGENE6を用いてトランスフエクシヨンを行った。操作方法は添付プロ トコールに従った。さらに 2日後、細胞を回収し、溶解バッファー (50 mM Tris-HCl (p H 7.4), 420 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl , 0.5 mM DTT, 1 mM PMSF)を 300
2
μ Lカ卩えて氷上で 20分間インキュベーションした。ァガロースビーズに結合させた抗 FLAG抗体 (SIGMA)を 100 Lカロえ、 4°Cでローテ一ターにて撹拌しながらー晚インキ ュペートした。洗浄バッファー (50 mM Tris-HCl (pH7.4), 150 mM NaCl, 0.5 mM DTT , 1 mM PMSF)にて 5回ビーズを洗浄した後に、 100 μ g/mL FLAGペプチド（SIGMA ) 100 μ Lをカ卩えて 4°Cでローテ一ター上にて撹拌しながら 2時間インキュベートした。 遠心にて上清を回収し、そのうち 10 Lについて SDS-PAGEを行い、ウェスタンブロ ッティング法により細胞内力 精製した FLAG-S l-5truncateタンパク質の同定（図 33 A)および CBB染色にて濃度を算出した。 [0121] 一方、トランスフエクシヨン 48時間後に培養上清を回収し、ァガロースビーズに結合 させた抗 FLAG抗体 100 μ Lを加え、 4°Cでローテ一ターにて撹拌しながらー晚インキ ュペートした。その後上記と同様の操作を行って培養上清中より精製された FLAG- S 1-5タンパク質を同定し濃度を算出した（図 33B)。その結果、細胞内および培養上 清から S1- 5タンパク質が精製されたことが示された（図 33AB)。
実施例 18
[0122] 293F浮遊細胞からの S1-5-FLAGタンパク質およびプレシジョンプロテアーゼ処理 S1 -5-FLAGタンパク質の精製
293F浮遊細胞に強制発現させた S1-5-FLAGタンパク質の精製を行った。まず、 29 3F細胞質内に発現させた S1-5-FLAGタンパク質の精製を次に示すような過程で行 つた。 pcDNA3- S1- 5- precission- FLAGプラスミドをトランスフエクシヨンした 293F細胞 を 90 mlで浮遊培養し 48時間後に細胞を回収した。溶解バッファー (50 mM Tris- HC1 (pH 7.4), 420 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl , 0.5 mM DTT, 1 mM PMSF, 0.
2
5 % NP-40)を 1 ml加えて氷上で 20分間インキュベーションし、ァガロースビーズに結 合させた抗 FLAG抗体 (SIGMA)を 100 Lカロえ、 4°Cでローテ一ターにて撹拌しながら ー晚インキュベートした。洗浄バッファー (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0 .5 mM DTT, 1 mM PMSF, 0.5% NP- 40)にて 5回ビーズを洗浄した後に、 minト column に移し、 200 μ g/ml FLAGペプチド（SIGMA) 100 μ Lで 3回溶出を行った。溶出液を プレシジョンバッファー (50mM Tris-HCl (pH7.0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT)でー晚透析を行った。 20Uのプレシジョンプロテアーゼを加え、 4°Cで 5時間反 応を行った。グルタチオンセファロースビーズを 50 μ L加え、 4°Cでローテ一ターにて 撹拌しながら 1時間インキュベートした。上清を回収し、精製の各段階のサンプルとと もに SDS-PAGEを行い、ウェスタンブロッテイング法により同定を行った。次に、 293F 細胞にトランスフエクシヨンした培養上清力ゝらの S1-5-FLAGタンパク質の精製を行つ た。トランスフエクシヨン 48時間後に培養上清を回収し、ァガロースビーズに結合させ た抗 FLAG抗体 100 μ Lを加え、 4°Cでローテ一ターにて撹拌しながらー晚インキュべ ートした。その後上記と同様の操作により精製を行い、 SDS-PAGE、ウェスタンブロッ ティング法を行った。結果を（図 34)に示した。細胞質内の S1-5-FLAGタンパク質は ァガロースビーズに結合させた抗 FLAG抗体により精製できた。また、最終溶出液中 の S1-5が抗 S1-5抗体での検出に比べて抗 FLAG抗体ではほとんど検出できないこと から、プレシジョンプロテアーゼによって切断されていることも示唆された。一方、培養 上清からはどの精製段階においてもウェスタンブロッテイング法でバンドが検出できな かった。これらの結果よりこの方法で細胞質力 FLAGタグがはずれた S1-5タンパク 質が精製できることが示された。
実施例 19
[0123] S1- 5タンパク質の糖鎖修飾に関する検討
S1- 5タンパク質が実際に糖鎖修飾を受けて 、る力検討した。 S1- 5- Hisタンパク質の 安定発現 CHO-K1細胞の培養上清力も精製された S1- 5- Hisタンパク質、 CHO- K1細 胞の細胞抽出液、および HT1080細胞の培養上清から免疫沈降された S1-5タンパク 質を用いて、グリコシルぺプチダーゼ F処理 (37°C, 17 hr)を行い、抗 S1-5抗体による ウェスタンブロッテイング法を行った（図 35)。その結果、グリコシルぺプチダーゼ F処 理により、精製 Sト 5- Hisタンパク質 (20 ng)のバンドシフトが認められた（図 35の左図） 。同様に、 HT1080細胞の培養上清力 免疫沈降された S1-5タンパク質においても、 S1-5タンパク質のバンドシフトが認められた（図 35の右図）。これらの結果より、 S1-5 は N結合型糖鎖修飾を受けると考えられた。実際に S1-5タンパク質には共通配列 (N X(S/T) X≠P)がー箇所存在している。また、低濃度では検出しにくかったブロードな バンドをタンパク質量を増加して検討したところ (120 ng)、全体的なバンドシフトが認 められたが、ブロードバンドの消失はな力つたため、 S1-5タンパク質は 0結合型糖鎖 修飾も受けている可能性が考えられた（図 35の中央図）。
実施例 20
[0124] 大腸菌からの S1- 5- His truncateタンパク質の調製
GST融合 Sト 5-Hisタンパク質を発現させる pGEXベクターを作製し、大腸菌にトラン スフオーム後、コロニーを単離した。単離したコロニーは 10 mLの LB-アンピシリン培 地 (50 mg/mLアンピシリン)に植菌し、 37°Cにてー晚培養した (前培養)。前培養した 大腸菌を 200 mLの LB-アンピシリン培地に加え、 37°Cで 2時間半培養後（本培養）、 最終濃度 0.5 mM IPTGを加えて 30°Cでさらに 3時間培養を行った。遠心にて菌体を 回収し、 BC500 (20 mM Tris— HC1 (pH 8.0), 0.5 mM EDTA.500 mM KC1, 20% glycer ol, 1% NP-40, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF, 1 μ g/mL of aprotinin, pepstatin, and leu peptin) 5 mLおよび 100 mg/mLリゾチームを 100 μ Lカ卩えて懸濁し、ソニケ一ターにて 菌を破碎し 7こ。 、により上清を回収し、 glutathione S Transferase conjugated agaro se beads (GSH)(Amersham Pharmacia)GSHレジンを 500 μ Lカ卩えて 4°Cにてローテ一 ター上でー晚インキュベートした。 GSHレジンを BC500にて 5回洗滌した後、マイクロ カラム（バイオラッド）にアプライし、プレシジョンプロテアーゼ溶液 (10U prescission p rotease, 50 mM Tris- HC1 (pH7.0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) 500 μ Lをカ卩えてキャップを閉め、静置して 4°Cで 24時間インキュベートした。カラム力も溶出 した溶液を切断された Sト 5-Hisタンパク質溶液として回収し、ウェスタンブロッテイン グ法にて同定（図 36)および CBB染色にて濃度を測定した。その結果、大腸菌から S 1-5タンパク質が精製されたことが示された（図 36)。
実施例 21
[0125] 大腸菌からの MBP-S1-5タンパク質、プレシジョンプロテアーゼ処理 MBP_S1_5タンパ ク質の精製
MBP融合 S1-5タンパク質を発現させる pGEXベクターを用いた他、 MBP-S1-5タンパ ク質の精製を実施例 20と同様の抽出法にて行った。その結果、 Elutionの条件として は、 10 mM Maltoseを用いた場合が最も効率が良いことが明ら力となった。収量を GS T-S1-5タンパク質と比較した場合、 MBP-S1-5は 450 μ g/500 mL cultureと効率よく 得られることが明ら力となった（図 37)。また液層でプレシジョンプロテアーゼ処理を行 つた場合にもプレシジョンプロテアーゼ処理 GST- S1-5と同様に MBPが切断されること が確認された（図 38)。
実施例 22
[0126] Sト 5ノックアウトマウス由来骨髄細胞における CHO- K1細胞培養上清由来 Sl-5-His タンパク質が破骨細胞形成能に与える影響
Sト 5ノックアウトマウス由来骨髄細胞および実施例 15で精製したタンパク質を用 Vヽ て、精製した Sl-5-Hisタンパク質が in vitroでの破骨細胞形成能に与える影響を検討 した。骨髄細胞 1 X 105個を 96ゥエルプレートに播種し、 M-CSFを終濃度 50 ng/mLとな るように添加し、 2日後に RANKLを終濃度 100 ng/mLとなるよう添カ卩した。 S1-5は PBS で希釈し、培養液に終濃度 0,10,30, 100 ng/mLとなるように M-CSF添カ卩時より継続的 に添加した。 5日後に細胞を固定し、 TRAP染色を行い Sl-5-Hisタンパク質が破骨細 胞形成能に与える影響を検討した。試験は n=5で実施した。その結果、 Sト 5-Hisタン パク質の濃度依存的に TRAP陽性多核細胞数の有意な抑制が確認された (図 39、 4 Doまた、 TRAP陽性多核巨細胞形成数も Sl-5-Hisタンパク質の濃度依存的に抑制 されていた（図 40、 41)。さらに、 Sl-5-Hisタンパク質を終濃度 0、 10、 30、 100、 200、 5 00 ng/mLで添加した他は上記と同様に検討を行 、TRAP陽性多核巨細胞の面積を 測定したところ、 Sl-5-Hisタンパク質濃度依存的に TRAP陽性多核巨細胞の大きさが /J、さくなつて 、た（図 42ABC)。
実施例 23
[0127] S1-5ノックアウトマウス由来骨髄細胞における S1-5- His truncateタンパク質の破骨細 胞形成能に与える影響
Sト 5ノックアウトマウス由来骨髄細胞および実施例 16で精製したタンパク質を用い て、精製した S1-5-E1-2タンパク質が in vitroでの破骨細胞形成能に与える影響を検 討した。方法は、 S1-5-E1-2タンパク質を終濃度 0,10 ng/mLとなるように添カ卩している 他は、実施例 22と同様である。その結果、 Sl-5 truncateによる TRAP陽性多核細胞 数の抑制が確認された (図 43、 45)。また、 TRAP陽性多核巨細胞形成数もさらに顕 著に抑制されることが確認された（図 44、 45)。 S1-5-E1-2のアミノ酸配列を配列番号 : 6に示す。
実施例 24
[0128] RAW264.7細胞における CHO- K1細胞培養上清由来 Sl-5-Hisタンパク質の破骨細 胞形成能に与える影響
RAW264.7細胞（マウスマクロファージ由来細胞）および実施例 15で精製したタンパ ク質を用いて、精製した CHO- K1細胞培養上清由来 Sト 5-Hisタンパク質が in vitroで の破骨細胞形成能に与える影響を検討した。 RAW264.7細胞 2.5 X 105個を 96ゥエル プレートに播種し、 RANKLを終濃度 100 ng/mLとなるよう添カ卩した。 S1- 5- Hisタンパク 質は PBSで希釈し、培養液に終濃度 0,10,30, 100,200,500 ng/mLとなるように継続的 に添加した。 3日後に細胞を固定し、 TRAP染色を行い Sl-5-Hisタンパク質が破骨細 胞形成能に与える影響を検討した。試験は n=5で実施した。その結果、 Sト 5-Hisタン パク質の濃度依存的に TRAP陽性多核細胞数の抑制が確認された (図 46、 47)。 実施例 25
[0129] RAW264.7細胞における 293F浮遊細胞由来 S1-5-FLAGタンパク質の破骨細胞形成 能に与える影響
RAW264.7細胞におよび実施例 18で精製したタンパク質を用 、て精製した S 1-5-F LAGタンパク質が破骨細胞形成能に与える影響を検討した。方法は、 293F浮遊細胞 由来 S1-5-FLAGタンパク質、無細胞系発現 (Abnova社、 Cat.No.H00002202-P01)に よる S1-5タンパク質を終濃度 0, 10, 30, 100, 200 ng/mLとなるよう添カ卩した以外は実 施例 24と同様に行った。その結果、実施例 18で精製した S1-5-FLAGタンパク質を 添加した場合、 S1-5-FLAGタンパク質の濃度依存的に破骨細胞形成能の抑制が認 められた (図 48)。し力しながら、無細胞系発現による S1-5タンパク質を添加した場合 にはその抑制効果は認められな力つた（図 49)。
実施例 26
[0130] RAW264.7細胞における大腸菌由来 GST- S1-5タンパク質およびプレシジョンプロテ ァーゼ処理 GST-S 1-5タンパク質の破骨細胞形成能に与える検討
RAW264.7細胞および実施例 20で精製したタンパク質を用いて、精製した GST-S1-5 タンパク質およびプレシジョンプロテアーゼ処理 GST-S1-5タンパク質が破骨細胞形 性能に与える影響を検討した。方法は、大腸菌由来 GST-S1-5タンパク質および GST タンパク質を終濃度 0, 1, 3, 10, 30, 100, 200 ng/mL,プレシジョンプロテアーゼ処理 GST- S1-5タンパク質およびプレシジョンプロテアーゼ処理 GSTタンパク質を終濃度 0, 1, 3, 10, 30 ng/mLとなるよう添カ卩した以外は実施例 24と同様に行った。その結果、 GST-S 1-5タンパク質、プレシジョンプロテアーゼ処理 GST-S1-5タンパク質の添カロで は、濃度依存的にその抑制効果が認められたのに対し（図 50、 51、 54、 55)、 GSTタ ンパク質およびプレシジョンプロテアーゼ処理 GSTタンパク質は破骨細胞形成能に 影響を及ぼさなかった（図 52、 53、 56、 57)。プレシジョンプロテアーゼ処理により GS Tタグがはずれたタンパク質でも、その活性は保持されるだけでなぐタグをはずすこ とによって活¾がさらに増強されることが明ら力となった。
実施例 27
[0131] 骨粗鬆症モデルラットの骨密度低下に対する S1-5タンパク質の効果の検討
定法に従 、7週齢の Wisterラットに卵巣摘除術（Ovarectomy;OVX)を施術し、実施 例 20で精製したタンパク質の皮下投与を開始した。 OVX施術時より 1.0 mg/kg/day で週 5回投薬した。術後 4週間経過後屠殺し、ラット左右大腿骨を摘出し 70%エタノー ルにて固定したのち、骨密度の測定を行った。骨密度は DCS-600EX-IIIR型 (Aloka 社製)にて大腿骨遠位 1/4をスライス厚 1 mm、速度 10 mm/sで遠位部から近位部へ 2 0分割スキャンして測定した。 Shamと比較して GSTおよびプレシジョンプロテアーゼを 投与した OVX施術ラットは約 10%骨密度が低下していた。骨密度が 10%以上低下す れば OVXモデルは作製されたとされる (Modder, UI. Et al., Endcrinology 145: 913-9 21, 2004)。それに対しプレシジョンプロテアーゼ処理 GST- Sl-5タンパク質を投与し た OVX施術ラットでは、骨密度の増加が認められた。これらの結果から、 S1-5タンパ ク質は骨粗鬆症を改善したと推察された（図 58)。
実施例 28
[0132] 骨粗鬆症モデルラットの骨密度減少に対する S1-5タンパク質の効果の検討
実施例 27で検討を行ったラットの大腿骨にて骨強度の解析を行った。骨強度は MZ
-500S (マルトー社）にてロードセルを 500N、支点間距離を 13mm、へットスピードを 10 mm/minで 3点曲げ試験により測定した。
その結果、 Shamと比較して GSTおよびプレシジョンプロテアーゼを投与した OVX施 術ラットは骨強度が減少していたが、実施例 20で精製したタンパク質投与により、骨 強度の改善が認められた（図 59)。
実施例 29
[0133] 骨粗鬆症モデルラットに対する S1-5タンパク質の効果のマイクロ CTによる解析
実施例 27で検討を行ったラットの大腿骨を摘出し骨周囲の軟部組織を除去して 70 o/oエタノールにて固定した。その後、成長板軟骨より 10%骨幹側のマイクロ CT画像を 撮影した。 Shamと比較して、 GSTタンパク質およびプレシジョンプロテアーゼ投与を行 つた OVX施術ラットで海綿骨が減少して 、たのに対して、実施例 20で精製したタン ノ ク質を投与した OVX施術ラットでは海綿骨の減少が改善されて 、た（図 60)。この 画像から、 S1-5タンパク質が破骨細胞の抑制効果を示すことが示唆された。
実施例 30
[0134] 骨粗鬆症モデルラットに対する S1-5タンパク質の効果の組織学的解析
実施例 27で検討を行なったラットの脛骨を摘出し骨周囲の軟部組織を除去して 70 %エタノールにて固定した。その後、骨組織標本の TRAP染色を行い、組織中におけ る破骨細胞数の測定を行った。その結果、脛骨近位骨幹端部において、 Shamと比較 して、 GSTタンパク質およびプレシジョンプロテアーゼ投与を行った OVX施術ラットで 破骨細胞数が増カロしていたのに対して、実施例 20で精製したタンパク質を投与した OVX施術ラットでは破骨細胞数の増加が抑制されて 、た（図 61)。
実施例 31
[0135] 骨粗鬆症モデルマウスに対する S1-5タンパク質の効果の検討
定法に従 、7週齢の C57BL/6jマウスに OVX施術を行 、、実施例 20で精製したタン ノ ク質の皮下投与を行った。 OVX施術時より 1.0 mg/kg/dayで週 5回投薬した。術後 8 週間経過後屠殺し、マウス大腿骨を摘出し 70%エタノールにて固定した後、骨密度の 測定を行った。骨密度は DCS-600EX-niR型 (Aloka社製)にて大腿骨遠位 1/4をスライ ス厚 1 mm、速度 10 mm/sで遠位部力ゝら近位部へ 20分割スキャンして測定した。その 結果、ラットと同様に、 Shamと比較して OVX施術マウスは約 10%骨密度が低下してい た。それに対し実施例 20で精製したタンパク質を投与した OVX施術マウスでは、骨 密度の増加が認められた。これらの結果から、 S 1-5タンパク質は骨粗鬆症を改善した と推察された (図 62)。
産業上の利用可能性
[0136] 本発明により、 S1-5遺伝子を欠損させた、加齢性疾患を引き起こすノックアウト動物 およびその製造方法が提供される。本発明の動物は骨変形、脱毛、組織損傷、腫瘍 発生など、種々の加齢性疾患又は症状を呈するため、当該動物に加齢性疾患の治 療または予防に有効な物質を投与することにより治療又は改善効果をもたらす医薬 組成物をスクリーニングするためのモデル動物として使用することができる。また、本 発明により、該ノックアウト動物から単離された細胞も提供される。該細胞を用いること で、加齢性疾患の治療または予防のための薬剤をスクリーニングできる。該ノックァゥ ト動物力 単離した骨髄細胞は、破骨細胞に分ィ匕させた際の酒石酸耐性酸性ホスフ ァターゼ（tartrate-resistant acid phosphatase： TRAP)陽性多核巨細胞の形成能が野 生型マウスの骨髄細胞よりも高いため、 TRAP陽性多核巨細胞の数および/もしくは 大きさを指標として破骨細胞の機能抑制剤のスクリーニングを行うことができる。 さら〖こ、単離された S1-5タンパク質や S1-5タンパク質に結合する抗体も提供される。 単離された S1-5タンパク質を利用することにより、加齢性疾患の治療または予防、お よび破骨細胞の機能抑制が可能となる。

Claims

請求の範囲
[1] S1-5遺伝子の全部又は一部の機能を喪失させた、加齢性の疾患又は症状を呈する 非ヒトノックアウト動物。
[2] S1-5遺伝子の全部又は一部の機能の喪失力 S1-5遺伝子の破壊又は変異によるも のである請求項 1記載の動物。
[3] 加齢性の疾患又は症状が、骨変形、骨粗鬆症、骨パジェット病、副甲状腺機能亢進 症、骨密度の低下、皮質骨の海綿骨化、脱毛、組織の損傷又は壊死、腫瘍、胸部肥 大、腹水、貧血、出血、皮膚の老化および爪の老化力 なる群力 選択される少なく とも 1つである、請求項 1記載の動物。
[4] 動物が、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット、モルモット、ゥサギ、ニヮトリ、ブタ、ヒッジ、 ャギ、ィヌ、ゥシ、サル、およびチンパンジーからなる群力も選択されるいずれかのも のである、請求項 1記載の動物。
[5] 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の非ヒトノックアウト動物から単離された細胞。
[6] 破骨細胞、角化上皮細胞、血液細胞、癌細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、血管内皮 細胞、真皮細胞、筋細胞、神経細胞、リンパ球、血管平滑筋細胞、滑膜細胞、毛乳 頭細胞、肝細胞、色素細胞、脂肪細胞、子宫内皮細胞、または肺胞上皮細胞である
、請求項 5に記載の細胞。
[7] S1-5遺伝子の全部又は一部の機能を喪失させることを特徴とする、加齢性疾患を引 き起こす非ヒトノックアウト動物の作製方法。
[8] S1-5遺伝子の全部又は一部の機能の喪失力 S1-5遺伝子の破壊又は変異によるも のである請求項 7記載の方法。
[9] 加齢性の疾患又は症状が、骨変形、骨粗鬆症、骨パジェット病、副甲状腺機能亢進 症、骨密度、皮質骨の海綿骨化、脱毛、組織の損傷又は壊死、腫瘍、胸部肥大、腹 水、貧血、出血、皮膚の老化および爪の老化力 なる群力 選択される少なくとも 1つ である、請求項 7記載の方法。
[10] 動物が、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット、モルモット、ゥサギ、ニヮトリ、ブタ、ヒッジ、 ャギ、ィヌ、ゥシ、サル、およびチンパンジーからなる群力も選択されるいずれかのも のである、請求項 7記載の方法。
[11] 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の非ヒトノックアウト動物に加齢性の疾患又は症 状の予防又は治療薬の候補物質を投与することを特徴とする、当該予防又は治療薬 のスクリーニング方法。
[12] 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の非ヒトノックアウト動物から単離された細胞に、 加齢性の疾患又は症状の予防又は治療薬の候補物質を接触させることを特徴とす る、当該予防又は治療薬のスクリーニング方法。
[13] 細胞が、破骨細胞、角化上皮細胞、血液細胞、癌細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、血 管内皮細胞、真皮細胞、筋細胞、神経細胞、リンパ球、血管平滑筋細胞、滑膜細胞 、毛乳頭細胞、肝細胞、色素細胞、脂肪細胞、子宮内皮細胞、または肺胞上皮細胞 である、請求項 12に記載の方法。
[14] 加齢性の疾患又は症状が、骨変形、骨粗鬆症、骨パジェット病、副甲状腺機能亢進 症、骨密度の低下、皮質骨の海綿骨化、脱毛、組織の損傷又は壊死、腫瘍、胸部肥 大、腹水、貧血、出血、皮膚の老化および爪の老化力 なる群力 選択される少なく とも 1つである、請求項 11〜13のいずれか 1項に記載の方法。
[15] 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の非ヒトノックアウト動物由来の破骨細胞に、破骨 細胞の機能抑制剤の候補物質を接触させることを特徴とする破骨細胞の機能抑制 剤のスクリーニング法。
[16] 下記 (a)〜（d)の 、ずれかに記載の単離されたタンパク質。
(a)配列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質。
(b)配列番号： 1または 3に記載の塩基配列のコード領域を含む DNAによりコードされ るタンノ ク質。
(c)配列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配列にお 、て 1若しくは複数のアミノ酸が 置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列からなり、配列番号: 2また は 4に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
(d)配列番号： 1または 3に記載の塩基配列を含む DNAとストリンジェントな条件下で ハイブリダィズする DNAによりコードされるタンパク質であって、配列番号： 2または 4 に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
[17] 請求項 16に記載のタンパク質の部分ペプチド。
[18] 配列番号: 6に記載のアミノ酸配列を含む、請求項 17に記載のペプチド。
[19] 請求項 16に記載のタンパク質、または請求項 17もしくは 18に記載のペプチドを含有 する、加齢性の疾患又は症状の予防又は治療薬。
[20] 加齢性の疾患又は症状が、骨変形、骨粗鬆症、骨パジェット病、副甲状腺機能亢進 症、骨密度の低下、皮質骨の海綿骨化、脱毛、組織の損傷又は壊死、腫瘍、胸部肥 大、腹水、貧血、出血、皮膚の老化および爪の老化力 なる群力 選択される少なく とも 1つである、請求項 19に記載の予防又は治療薬。
[21] 請求項 16に記載のタンパク質、または請求項 17もしくは 18に記載のペプチドを含有 する、破骨細胞の機能抑制剤。
[22] 請求項 16に記載のタンパク質、または請求項 17もしくは 18に記載のペプチドに結 合する抗体。
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