JP5341350B2 - 高血圧および血管新生におけるエンドセリン−１／アンジオテンシンｉｉ二重レセプター（ｄｅａｒ）の役割 - Google Patents

Description

関連出願に対するクロスリファレンス
この出願は、２００４年１１月１６日に出願されたU.S.Provisional Patent Application Serial No.60/628,447および2005年6月27日に出願されたU.S.Provisional Patent Application Serial No.60/694,268の35U.S.C.119(e)の下の利益を請求する。その内容はそのまま参照により本願に組み込まれる。

政府の支援
本発明は、National Institute of Health により授与されたContract No.HL69937の下で政府の支援を伴ってなされた。政府は、本発明における一定の権利を有する。

本願は、高血圧に対する感受性を示すかまたは高血圧による現在の罹患を示すエンドセリン−１／アンジオテンシンＩＩ二重レセプター（Dual Endothelin-1/Angiotensin II Receptor）（Ｄｅａｒ）における突然変異および／または多型の同定を指向する。更に、本発明は、Ｄｅａｒの調節を介して血管新生（angiogenesis）のモデュレーションのための方法を開示する。

本発明の背景
エンドセリン−１／アンジオテンシンＩＩ二重レセプター（Ｄｅａｒ）は、ＡｎｇＩＩアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブを使用してそしてまた独立にＥＴ−１オリゴヌクレオチドを使用して、成獣ラット脳ｃＤＮＡライブラリーから始めて単離された。Molecular Medicine4:96-108-1998参照。このレセプターの構造解析は、推定された１つの予想される膜貫通ドメインならびに別のＥＴ−１およびＡｎｇＩＩ推定結合ドメインを示した。機能的解析は、ＥＴ−１およびＡｎｇＩＩの両方共Ｄｅａｒに結合しそしてＣａ２＋動員伝達システム（Ca2+ mobilizing transduction system）へのカップリングを誘導することを示した。

ＥＴ−１は多様な生理学的機能、例えば血圧調節、有糸分裂誘発（mitogenesis）およびアポトーシス（Lariviere, R. et al. Can J Physiol Pharmacol. 81, 607-621(2003)、および血管新生（Salani, D. et al. Am.J.Pathol. 157, 1537-1547(2000); Sullivan, D.C.& Bicknell, R. British Journal of Cancer 89, 228-231(2003) に関与する強力な血管収縮剤ペプチドであり、そしていくつかの病理生理学的状態、例えば高血圧、心不全 （Lariviere, R. et al. Can J Physiol Pharmacol. 81, 607-621(2003);Ikeda, T. et al. Hypertension 34, 514-519(1999);Touyz, R. M. & Schiffrin, E.L. Can J Physiol Pharmacol. 81, 533-541(2003)、ならびにより最近では腫瘍血管新生、浸潤および転移（Bagnato, A.& Spinella, F.Trends in Endocrinology and Metabolism 14, 44-50(2002);Grant, K., Loizidou, M.& Taylor,I.British Journal of Cancer 88,163-166(2003)に関係している。

ＡｎｇＩＩは、ＥＴ−１に類似した生理学的応答、例えば血圧調節、増殖、アポトーシスおよび血管新生（Watanabe, T. et al.Hypertension 45, 163-169(2005)を示し、そして腫瘍血管新生（Escobar, E. et al. Curr Vasc Pharmacol 2, 385-399(2004)にも関係している。観察された生理学的応答の責任を担うと考えられるＥＴ−１またはＡｎｇＩＩによる結合について、別個のレセプターが同定された。

従って、ＥＴ−１およびＡｎｇＩＩの役割が知られているにもかかわらず、Ｄｅａｒの役割はこれまでのところ知られていない。Ｄｅａｒは、それぞれ、ＥＴ_Ａ、ＥＴ_ＢまたはＡＴ１およびＡＴ２レセプターへのＥＴ−１またはＡｎｇＩＩの結合によりトリガーされる経路とは異なる経路を調節すると考えられる。しかしながら、ＥＴ−１およびＡｎｇＩＩに結合するその能力ならびに、これらの分子が血管新生、高血圧および腫瘍進行において果たす重要な役割により、Ｄｅａｒの役割のより良好な理解が必要である。本発明は、Ｄｅａｒの新規に発見された役割を開示し、そして種々の疾患および障害、例えば高血圧、病理的血管新生および腫瘍増殖／転移をスクリーニングし、診断し、予知しそして処置するための方法を提供する。

すべての生物のゲノムは、先祖の遺伝子配列の変異形態を発生させる、連続した進化の過程で自然に起こる突然変異を受ける（Gusella, Ann. Rev. Biochem. 55, 831-854(1996)）。変異体形態は、先祖の形態に対して進化の利点または欠点を与えることがありまたは何の変化ももたらさないことがある。ある例では、変異形態は、種に進化の利点を与え、最終的に種の多くのまたは大部分のメンバーのＤＮＡに組み込まれ、そして有効に先祖形態となる。しかしながら、しばしば変異形態は、個体をある疾患または障害に感受性にすることがある欠点を与える。これらの変異体の理解は、存在する疾患もしくは障害のより良好な診断、ある疾患または障害にかかる危険の予知および改良された、よりターゲティングされた処置を提供する。

疾患または障害関連の特異的突然変異および／または多型の知見は、特定の薬剤による治療に最も適した患者を鑑定するのを助ける（これはしばしば「薬理遺伝学」と呼ばれる）。薬理遺伝学は薬学的研究に使用されて薬物選択プロセスを支援することもできる。多型は、ヒトゲノムをマッピングする際に使用されそして疾患の遺伝的成分を解明するのに使用される。下記の参考文献は、薬理遺伝学に関するバックグラウンドの詳細および多型検出の他の使用を示す：Linder et al.(1997), Clinical Chemistry, 43, 254; Marshall(1997), Nature Biotechnology, 15, 1249; International Patent Application WO97/40462, Spectra Biomedical; and Schafer et al.(1998), Nature Biotechnology, 16,33。

Ｉ．高血圧
高血圧は、アメリカにおける最もありふれた慢性の病気である。American Heart Associationは、６千２百万人より多くの６歳以上のアメリカ人が高血圧に罹っておりそしてこれらの人々の少数の人しかその血圧をコントロールしていないと評価している。処置しないでいると、高血圧は、発作、心臓発作、腎臓損傷、充血性心不全および死亡をもたらすことがある。コントロールされていない軽度〜中程度の高血圧は、典型的な３５歳の人の寿命の期待可能な長さを１６歳減少させるであろう。最も軽い形態の高血圧、即ち「境界高血圧」ですら、人の寿命を数年短くすることができそしてクオリティーオブライフに負の影響を与えることができる。

高血圧に関する遺伝的成分の存在は、二卵生双生児におけるよりは一卵性双生児において血圧のより高い一致を示した双生児の研究から知られている。同様に、生物学的同胞は、同じ家庭で育てられた養子同胞よりも血圧のより高い一致を示す。このような研究は、集団における血圧の変動（variations）の４０％以下が遺伝的に決定されることを示唆した。しかしながら、今日まで、高血圧についての信頼できる遺伝的マーカーは同定されていない。処置に関して有意な利益が得られたけれども、高血圧は、心臓及び腎臓疾患、および処置を開始すべきＢＰレベルの低下を促す発作についての主要な危険因子として普及している。

従って、高血圧への人の感受性を予測するための遺伝的マーカーが必要であり、そして高血圧を診断するための信頼できる方法が必要である。更に、遺伝的高血圧（高血圧遺伝子）に寄与する突然変異体遺伝子の標準化（normalization）をターゲティングする処置ストラテジーが必要である。

ＩＩ 血管新生
血管新生は、新たに発生する血管の組織中への増殖（新生血管形成（neo-vascularization)）および現存する血管のターゲット部位への合併吸収（co-opting）の両方を含む組織血管形成（tissue vascularization）のプロセスである。血管は、酸素および栄養を生きている組織に供給しそして廃産物を生きている組織から除去する手段である。血管新生は、重要な生物学的プロセスであることができる。例えば、血管新生は再生、成長および傷の修復に必須である。反対に、不適切な血管新生は、重い負の結果を与えることがある。例えば、腫瘍が急速に成長しそして転移することを可能とする酸素および栄養を腫瘍が十分に供給されるのは、血管新生の結果として充実性腫瘍に血管が形成された後のみである。

血管新生依存性疾患および障害は、血管増殖により影響を受けるこれらの疾患および障害である。このような疾患は、医学的処置が求められる疾患の有意な部分を表し、そして炎症性傷害、例えば免疫及び非免疫炎症、慢性関節リウマチおよび乾癬、不適切なもしくは時期を失した血管の浸潤と関連した傷害、例えば、糖尿病性網膜症、黄班変性、血管新生緑内症、再発狭窄症、アテロー性動脈硬化プラークにおける毛細管増殖および骨粗鬆症、ならびに癌関連障害、例えば、充実性腫瘍、充実性腫瘍転移、血管線維腫、水晶体後方線維増殖症、血管腫、カポジ肉腫、腫瘍成長を支持するのに新生血管形成を必要とする癌等である。

望まれない血管新生を阻害するための方法は知られているが、小数の方法が臨床的に有用であることが証明された。例えば、異常な血管新生を阻害するためにＶＥＧＦの産生または効果を減少させようと試みる多数の治療ストラテジーがある。例えば、抗ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦレセプター抗体（Kim ES et al. (2002), PNAS USA 99.11399-11404）およびＶＥＧＦ結合のための内皮細胞レセプターと競合する可溶性ＶＥＧＦ「トラップ」（Holash J et al.(2002), PNAS USA 99: 11393-11398）が開発された。ＶＥＧＦ遺伝子発現に対して向けられた古典的ＶＥＧＦ「アンチセンス」またはアプタマー治療も提唱された（U.S. published application 2001/0021772 of Uhlmann et al）。これらおよび同様な非ＶＥＧＦターゲテッド治療（non-VEGF targeted therapies）に使用される抗血管新生剤は、典型的には成功しなかった。従って利用可能な抗血管新生治療で達成された結果は一般に不満足であった。

従って望まない血管新生を減少または排除するための方法が必要である。

反対に、血管新生が望まれる状況、例えば、再生、発達、傷の修復および虚血もしくは梗塞の区域においては、血管新生の刺激が有用である。血管新生を開始またはアップレギュレーションするための最近の方法も概して臨床的に成功しておらず、従って必要である。

更に、ＥＴ−１は乳癌成長および前悪性潜在力（pro-malignancy potential）とも関連しているので、Ｄｅａｒの阻害は、血管新生に対するその効果とは独立に、腫瘍成長および転移の可能性を減少させるのにも有効である。

発明の要約
本発明の発明者は、Ｄｅａｒの発現および／またはＤｅａｒへのＥＴ−１結合のアフィニティーを高めるＤｅａｒにおける突然変異および／または多型は、高血圧に対する感受性を正確に予測することができることを発見した。Ｄｅａｒおよびそのヒト相同体における突然変異および／または多型は本発明に包含される。従って、本発明の１つの態様では、Ｄｅａｒ遺伝子および／またはタンパク質を分析することにより高血圧に対する感受性を予測すること、目下の高血圧を診断することおよび／または高血圧の予後を提供することが可能である。野生型対照と比較して（１）Ｄｅａｒ発現を高めるおよび／または（２）ＤｅａｒへのＥＴ−１結合のアフィニティーを高める突然変異および／または多型の存在は、高血圧へのヒトの感受性および／または高血圧による目下の苦痛を示している。

更に、Ｄｅａｒは、血管新生、腫瘍成長および前悪性潜在力において役割を演じる。特に、本発明は、Ｄｅａｒの阻害剤、例えば抗Ｄｅａｒ抗体は、癌のラットおよびマウスモデルの両者において腫瘍進行および前悪性潜在力を減少させることを示した。従って、本発明の他の態様では，血管新生、および／または腫瘍成長および／または前悪性潜在力を阻害するための方法が開示される。この態様では、個体はＤｅａｒ活性化を阻害する化合物、例えば小分子阻害剤、競合的阻害剤、抗体、抗体フラグメント、ｓｉＲＮＡ、アプタマー等を投与される。好ましくは、これらは、他の血管新生関連作用物質、例えばＶＥＧＦ、胎盤成長因子等に対する阻害剤と共に使用される。

本発明の方法により処置される病理学的血管新生または障害の非限定的例は、炎症性障害、例えば免疫および非免疫炎症、慢性関節リューマチおよび乾癬、脈管（ｖｅｓｓｅｌｓ）の不適切なもしくは時期の悪い浸潤と関連した障害、例えば、糖尿病性網膜症、黄班変性、血管新生緑内症、再発狭窄症、アテローム性動脈硬化プラークにおける毛細管増殖および骨粗鬆症、ならびに癌関連障害、例えば、充実性腫瘍、充実性腫瘍転移、血管線維腫、水晶体後方線維増殖症、血管腫、カポジ肉腫および、腫瘍成長を支持するのに新生血管形成を必要とする同様な癌等を含む。本発明の好ましい態様では、本方法は、癌、例えば乳癌を有する哺乳動物における腫瘍血管新成および／または前悪性潜在力を阻害することに向けられる。

関連した態様では、本発明は、血管新成を必要としている組織において血管新成を刺激するための方法を開示する。この態様では、Ｄｅａｒのアクチベーター、例えば、小分子、抗体、抗体フラグメントまたは当業者に知られている他のアクチベーターを個体に投与する。

例として、血管新成の刺激は、糖尿病で誘導された虚血、劣悪な循環、心筋梗塞、大動脈瘤、下肢の動脈疾患、脳血管疾患等において有利でありうる。

発明の詳細な説明
Ｉ．高血圧
本発明の１つの態様では、個体の高血圧への感受性を決定するための方法が開示され、そして高血圧の状態を決定するための診断および／または予後方法が開示される。対照と比較して、ＡｎｇＩＩ、ＥＴ−１、ＶＥＧＦシグナルペプチド（ＶＥＧＦｓｐ）または他のＤｅａｒリガンドによるＤｅａｒの発現増加および／またはＤｅａｒ活性化もしくはＤｅａｒシグナリングの増強に相関するＤｅａｒにおける突然変異および／または多型について、個体をスクリーニングする。健常な対照と比較して試験サンプルにおけるこのような突然変異および／または多型の存在は、個体の高血圧への感受性を示す。健常な対照と比較して試験サンプルにおけるこのような突然変異および／または多型の存在は、高血圧の目下の状態を示すこともできる。

本明細書で使用された、用語Ｄｅａｒは、Ｄｅａｒおよびそのヒト相同体を包含する。１つの態様では、用語「Ｄｅａｒに対するヒト相同体」は、すべての合間の区間を含む（即ち、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％等）配列番号１に対する少なくとも約５０％相同性、更に好ましくは少なくとも約６０％相同性または同一性を有するＤＮＡ配列を指す。１つの態様では、用語「Ｄｅａｒタンパク質に対するヒト相同体」は、配列番号２に対する５０％相同性、更に好ましくは少なくとも約６０％相同性、なお更に好ましくは少なくとも約７０％相同性、なお一層好ましくは少なくとも約７５％相同性、その上更に好ましくは少なくとも約８０％相同性、なお更に好ましくは少なくとも約９０％相同性、更に好ましくは少なくとも約９５％相同性を有するアミノ酸配列を指し、その区間も包含される（即ち、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％等）。

「相同性］または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性および同一性は、各々、比較の目的でアラインメントさせることができる各配列における位置を比較することにより決定されうる。比較された配列における同等な位置が同じ塩基またはアミノ酸により占拠されるとき、分子はその位置で同一であり；同等な部位が同じまたは類似したアミノ酸残基（例えば立体的性質および／または電子的性質において類似した）により占められているとき、分子はその位置で相同性（類似性）と言うことができる。相同性／類似性または同一性の百分率としての表現は、比較された配列により共有された位置における同一または類似したアミノ酸の数の関数を指す。「無関係」または「非相同性」である配列は、本願の配列との４０％未満の同一性を共有し、好ましくは本願の配列との２５％未満の同一性を共有する。

２つの配列を比較する際に、残基（アミノ酸または核酸）の不存在または余分の残基の存在も、同一性および相同性／類似性を減少させる。用語「相同性」は、類似した機能またはモチーフを有する遺伝子またはタンパク質を同定するのに使用される配列類似性の数学的に基づいた比較を表す。本願の核酸およびタンパク質配列を、「クエリー配列（query sequence）」として使用して公表データベースに対するサーチを行って、例えば、他のファミリーメンバー、関連した配列または相同体を同定することができる。このようなサーチは、Altschul, et al.(1990) J Mol. Biol. 215:403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長さ＝１２を使用してＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチを行って、この出願の核酸分子に対して相同性のヌクレオチド配列を得ることができる。ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長さ＝３でＢＬＡＳＴタンパク質サーチを行って、この出願のタンパク質分子に対して相同性のアミノ酸配列を得ることができる。比較の目的でギャップ付きアラインメント（gapped alignments）を得るために、Altschul, et al.(1997) Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402に記載のとおりに、Gapped BLASTを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ）のデフォールトパラメーターを使用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照。

本明細書で使用された「同一性」は、配列をアラインメントさせて配列マッチングを最大にする（即ち、ギャップおよび挿入を考慮に入れて）とき、２つ以上の配列の対応する位置における同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の百分率を意味する。同一性は、（Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ea., Oxford University Prerss, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and -14 Genome Projectss, Smith, D.W., ea., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, PartI, Griffrin,A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Prrss, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskow, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carillo, H., and Lipmann, D., SLAM J. Applied Math., 48:1073(1988)）に記載されたそれらを含むがそれらに限定されない既知の方法により容易に計算されうる。同一性を決定するための方法は、試験された配列間の最大のマッチを与えるようにデザインされる。更に、同一性を決定するための方法は、公的に入手可能なコンピュータープログラムにより集大成される。２つの配列間の同一性を決定するためのコンピュータープログラム方法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research I 12(1): 387(1984)), BLASTP, BLASTNおよびFASTA(Altschul,S.F. et al., J. I Molec. Biol. 215: 405-410(1990)および Altschul,S.F. et al.,et al.(1997) Nucl.Acids Res.25:3389-3402(1997)）を含むがそれに限定されない。ＢＬＡＳＴ Ｘ プログラムは、ＮＣＢＩおよび他のソースから公的に入手可能である。（BLAST Mannual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Betheseda, Md. 20894; Altshul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)）。周知のSmith Waterman algorithmを使用して同一性を決定することもできる。

一旦個体が高血圧に対して感受性であることが知られると、血圧の上昇を減少または阻止するための現在利用可能な方法を使用することができる。高血圧を減少および／または予防するための現在利用可能な方法は、例えば、食事、訓練、抗高血圧剤、例えばβ遮断薬、ジウレティック、カルシウムアンタゴニスト、アンジオテンシンＩＩ活性剤、心拍数減少性非ジヒドロピリジンカルシウムアンタゴニストおよびアンジオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）阻害剤の組合せを含む多重薬物治療計画を含む。または、Ｄｅａｒ機能をモデュレーションする化合物を投与することができる。個体が既に高血圧を有する場合には、その高血圧について基礎を知ることは、処置計画を決定するのに使用することができる。

Ｄｅａｒなどの遺伝子における突然変異および／または多型の存在または不存在を検出するための方法は、当業者に知られておりそしてある態様は下記のとおりである：

サンプルの調製
突然変異および／または多型は、分析されるべき個体からのターゲット核酸において検出される。例えば、ゲノムＤＮＡのアッセイのために、実質的にいかなる生物学的サンプル（純粋な赤血球以外の）も適当である。例えば、好都合な組織サンプルは、全血、精液、唾液、涙、尿、胎児物質、汗、頬、皮膚および髪を含む。ｃＤＮＡおよびｍＲＮＡのアッセイのために、組織サンプルは、ターゲット核酸が発現される器官から得ることができ、例えば心臓、脳、腎臓、肝臓、脾臓、肺、大動脈、睾丸および子宮におけるＤｅａｒ発現を示す図５Ｂ参照。

下記した方法の多くは、ターゲットサンプルからのＤＮＡの増幅を必要とする。これは、例えばＰＣＲにより達成されうる。一般に、PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification(ed. H. A. Erlich, Freeman Press, NY, N. Y.., 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(eds. Innis, et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1990); Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19,4967(1991); Eckert et al., PCR Methods and Applications 1, 17(1991); PCR(eds. McPherson et al., IRL Press, Oxford); およびU.S.Pat.No.4,683,202（その各々は、すべての目的で参照により組み込まれる）を参照されたい。

他の適当な増幅方法は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Wu and Wallace, Genomics 4,560(1989), Landegren et al., Science 241, 1077(1988)，転写増幅（Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)および自己持続性配列複製（Guatelli et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87,1874(1990)）および核酸をベースとする配列増幅（ＮＡＳＢＡ）を含む。後者の２つの増幅方法は、それぞれ、約３０または１００対１の割合で増幅産物として一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）および二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の両方を産生する等温転写に基づく等温反応を含む。

ターゲットＤＮＡにおける突然変異および／または多型の検出
突然変異した部位または多型部位を占める塩基の同一性は、以下に記載されるいくつかの方法により個体（例えば、分析されるべき患者）において決定されうる。

アレル特異的プローブ
突然変異および／または多型を解析するためのアレル特異的プローブのデザインおよび使用は、例えば、Saiki et al., Nature 324, 163-166(1986); Dattagupta, EP235,726, Saiki, WO89/11548により記載されている。アレル特異的プローブは、２つの個体からのそれぞれのセグメントにおいて異なる突然変異形態または多型形態の存在により、１つの個体からのターゲットＤＮＡのセグメントにはハイブリダイゼーションするが、他の個体からの対応するセグメントにはハイブリダイゼーションしないようにデザインされうる。ハイブリダイゼーション条件は、アレル間のハイブリダイゼーション強度の有意な差、好ましくはプローブがアレルの１つのみにハイブリダイゼーションする本質的に二者択一な応答（binary response）があるように、十分にストリンジェントであるべきである。あるプローブは、多型部位がプローブの中心位置（例えば、１５マーにおいては７位置、１６マーでは８または９位置において）とアラインメントするようにターゲットＤＮＡのセグメントにハイブリダイゼーションするようにデザインされる。プローブのこのデザインは、異なるアレル形態間のハイブリダイゼーションにおける良好な識別を達成する。

アレル特異的プローブはしばしばペアーで使用され、ペアーの１つのメンバーはターゲット配列の標準形態への好ましいマッチを示しそして他のメンバーは変異体形態への完全なマッチを示す。プローブのいくつかのペアーは、次いで同じターゲット配列内の多重突然変異および／または多型の同時分析のための同じ支持体上に固定化されうる。

タイルアッセイ（tiling assay）
突然変異および／または多型は、核酸アレーへのハイブリダイゼーションにより同定することができ、そのいくらかの例はＷＯ９５／１１９９５により記載されている（これらはすべての目的でそのまま参照により組み込まれる）。特徴付けられた突然変異および／または多型の解析のために同じアレーまたは異なるアレーを使用することができる。ＷＯ９５／１１９９５は、前以て特徴付けられた突然変異および／または多型の変異体形態の検出のために最適化されるサブアレーも記載している。このようなサブアレーは、第１基準配列のアレル変異体である第２基準配列に対して相補性であるようにデザインされたプローブを含有する。プローブの第２グループは、プローブが第２基準配列に相補性を示すことを除いて上記したのと同じ原理によりデザインされる。第２グループ（または更なるグループ）を包含することは、多重突然変異がプローブの長さに対応する短い距離内で起こる（即ち、９〜２１塩基内に２つ以上の突然変異）ことが期待される一次基準配列の短いサブ配列を解析するために特に有用でありうる。

アレル特異的プライマー
アレル特異的プライマーは、突然変異および／または多型にオーバーラッピングするターゲットＤＮＡ上の部位にハイブリダイゼーションし、そして該プライマーが完全な相補性を示すアレル形態の増幅のみをプライミングする。Gibbs, Nucleic Acid Res. 17, 2427-2448(1989)参照。このプライマーは、遠位部位でハイブリダイゼーションする第２プライマーと共に使用される。増幅は、特定のアレル形態が存在することを意味する検出可能な産物をもたらす２つのプライマーから進行する。対照は、通常第２のプライマーの ペアーで行い、その１つは多型部位において一塩基ミスマッチを示しそしてその他方は遠位部位に対して完全に相補性を示す。一塩基ミスマッチは増幅を阻止しそして検出可能な産物が形成されない。この方法は、ミスマッチが突然変異および／または多型とアラインメントされたオリゴヌクレオチド３’の大部分の位置に含まれるとき、最善に働く。何故ならば、この位置はプライマーからの伸びに対して最も不安定化しているからである。例えば、ＷＯ９３／２２４５６を参照されたい。

直接配列決定
本発明の突然変異および／または多型の配列の直接分析は、ジデオキシチェインターミネーター法またはマクサム−ギルバート法を使用して達成することができる（Sambrock et al., Molecular Cloning, A Laboratory manual(2^nd Ed., CSHP, New York 1989); Zyskind et al., Recombinant DNA Laboratory Manual,(Acad. Press, 1988)）。

変性剤濃度勾配ゲル電気泳動
ポリメラーゼ連鎖反応を使用して発生された増幅産物を、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動の使用により解析することができる。異なるアレルは異なる配列依存性溶融性および溶液中のＤＮＡの電気泳動移動に基づいて同定されうる。Erlich, ed., PCR Technology, Principles and Applications for DNA Amplification,(W.H.Freeman and Co, New York, 1992), Chapter 7.。

一本鎖コンフォメーション突然変異および／または多型解析
Orita et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 86, 2766-2770(1989)に記載されたとおり、一本鎖ＰＣＲ産物の電気泳動移動の変化により塩基の差を同定する一本鎖コンフォメーション突然変異および／または多型解析を使用して、ターゲット配列のアレルを区別することができる。増幅されたＰＣＲ産物を上記のように発生させることができ、そして加熱またはそうでなければ変性して一本鎖増幅産物を形成させることができる。一本鎖核酸を折りたたむかまたは塩基配列に部分的に依存している二次構造を形成することができる。一本鎖増幅産物の異なる電気泳動移動度は、ターゲット配列のアレル間の塩基配列の差に関係することができる。

抗体検出方法
本発明の他の局面に従えば、ヒトＤｅａｒポリペプチドのアレル変異体（突然変異および／または多型）に対して特異的な抗体を使用して、Ｄｅａｒ突然変異および／または多型の存在または不存在を検出することができる。

抗体は、任意の適当な方法を使用して調製することができる。例えば、精製したポリペプチドを利用して特異的抗体を調製することができる。用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および種々のタイプの抗体構築物、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂおよび一本鎖Ｆｖを含むことを意味する。抗体は、それらが約１０⁷Ｍ−１以上のＫａでＤｅａｒのアレル変異体に結合するならば、特異的に結合していると定義される。結合のアフィニティーは、慣用の技術、例えばScatchard et al., Ann. N.Y.Acad.Sci., 51: 660(1949)により記載された技術を使用して決定することができる。

ポリクローナル抗体は、当技術分野で周知の手順を使用して、種々のソース、例えばウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウスまたはラットから容易に生成させることができる。一般に、抗原を、典型的には非経口注入によりホスト動物に投与する。抗原の免疫原性は、アジュバント、例えば完全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジュバントの使用により増強させることができる。追加免疫感作（booster immunization）の後、少量の血清のサンプルを採集しそして抗原に対する反応性について試験する。このような決定のために有用な種々のアッセイの例は、：Antibodies: A Laboratory Mannual, Harlow and Lane(eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998; に記載のアッセイならびに、向流免疫電気泳動（ＣＩＥＰ）、ラジオイムノアッセイ、放射免疫沈降法、酵素結合イムノソーベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイおよびサンドイッチアッセイの如き手法を含む。U.S.Pat.Nos. 4,376,110および4,486,530を参照されたい。

モノクローナル抗体は、周知の手順を使用して容易に調製することができ、例えばU.S.Pat.No.4,902,614, 4,543,439および4,411,993; Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Bioligical Analyse, Plenum Press, Kennet, McKearn, and Bechtol(eds),(1980)に記載の手順参照。

Ｄｅａｒの変異体形態に対するモノクローナル抗体は、別の技術、例えば、Alting- Mees et al., " Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas", Strategies in Molecular Biology 3: 1-9(1990)（これらは参照により本明細書に組み込まれる）により記載された技術を使用して産生することができる。同様に、リコンビナントＤＮＡ技術を使用して結合パートナーを構築して、特異的結合抗体をコードする遺伝子の可変領域に組み込むことができる。このような技術は、Larricker et al., Biotechnology, 7:394(1989)に記載されている。

一旦単離および精製されると、抗体は、確立されたアッセイプロトコールを使用してサンプルにおける変異体Ｄｅａｒの存在を検出するのに使用することができる。例えば"A Practical Guide to ELISA" by D. M. Kemeny, Pergamon Press, Oxford, England参照。当業者に知られているとおり、適当な対照サンプル、即ち、野生型または非突然変異および／または多型Ｄｅａｒを有するサンプルを対照として使用する。

発現レベルの決定のための方法も包含される。例えば、Ｄｅａｒの過発現は、個体が高血圧に対して感受性であるかまたは高血圧に現在苦しんでいるという指示である。発現レベルを解析するための方法は当業者に知られている。本発明の１つの局面では、生物学的試験サンプルに存在するＤｅａｒレベルは、試験サンプルにおけるＤｅａｒ ｍＲＮＡのレベルを分析しそしてこのレベルを対照サンプルにおけるＤｅａｒのレベルと比較することにより測定される。他の態様では、生物学的試験サンプルに存在するＤｅａｒレベルは、試験サンプルまたはその調製物を内在性対照１８ＳｒＲＮＡと接触させることにより測定される。本発明の好ましい態様は、組織サンプルからのＤｅａｒ ｍＲＮＡの分析のためのレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（laser capture microdissection）およびＲＴ−ＰＣＲの使用である。レーザーキャプチャーマイクロダイセクションは、当業者に知られておりそして例えばSimon et al. (1998) Trends in Genetics 14:272 およびEmmert- Buck et al. (1996) Science 274: 998-1001に記載されている。

本発明の他の局面では、生物学的試験サンプルに存在するＤｅａｒレベルは、試験サンプルまたはその調製物を、Ｄｅａｒタンパク質またはその一部に特異的に結合する抗体をベースとする結合部分と接触させることにより測定される。抗体をベースとする結合部分は、検出されうるＤｅａｒとの複合体を形成し、それによりＤｅａｒのレベルを測定することを可能とする。

当業者に知られているいかなる手段もＤｅａｒレベルを評価するのに使用することができる。例えば、ある態様では、Ｄｅａｒ発現レベルは、質量分析法、ＥＬＩＳＡ、ＭＲ、ＣＴ、ＤｅａｒをターゲッティングするＰＥＴまたは免疫組織化学によりＤｅａｒのレベルを測定することによりアッセイされる。

更なる態様では、本発明は、生物学的サンプルにおけるＤｅａｒを測定するための手段を含むキットを提供する。

定義
本明細書でそして全体にわたって使用された「Ｄｅａｒ」、「ＤＥＡＲ」または「Ｄｅａｒ」は、エンドセリン−１／アンジオテンシンＩＩ二重レセプターである。

多型は、集団における２つ以上の遺伝的に決定された別の配列またはアレルの存在を指す。多型マーカーまたは部位は、ダイバージェンスが生じるローカスである。好ましいマーカーは、少なくとも２つのアレルを有し、各々は選ばれた集団の１％より多く、更に好ましくは１０％または２０％より多くの頻度で起こる。多型ローカスは１塩基対と同じく小さくてもよい。多型マーカーは、制限断片長多型、可変数のタンデム反復（ＶＮＴＲ’ｓ）、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、単純配列反復および挿入エレメント、例えばＡｌｕを含む。第１の同定されたアレル形態は、基準形態として任意に命名されそして他のアレル形態は、別のアレルまたは変異体アレルと名づけられる。

選ばれた集団で最も頻繁に生じるアレル形態は、ときには野生型形態と呼ばれる。二倍体生物は、アレル形態についてホモ接合体またはヘテロ接合体であることができる。ジアレル多型は２つの形態を有する。トリアレル多型は、３つの形態を有する。

一塩基多型は、アレル配列間の変動の部位である１つのヌクレオチドにより占められた多型部位で起こる。この部位は、アレルの高度に保存された配列（例えば、集団の部分｛１／１００｝または｛部分（１／１０００）｝未満のメンバーにおいて変化する配列）により先行されそして後続される。

一塩基多型は、通常多型部位における１つのヌクレオチドの他のヌクレオチドによる置換により生じる。トランジッションは、１つのプリンの他のプリンによる置換または１つのピリミジンの他のピリミジンによる置換である。トランスバージョンはプリンのピリミジンによる置換またはその逆である。一塩基多型は、基準アレルに対するヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの挿入からも生じうる。

ＩＩ．血管新生
Ａ．血管新生を阻害すること
本発明の他の態様では、血管新生に依存するかまたは該血管新生によりモデュレーションされる疾患または障害を有する個体の組織において血管新生を阻害する方法であって、疾患または障害を血管新生の阻害により処置する方法が開示される。一般に、この方法は、血管新生阻害量のＤｅａｒ阻害剤を含む組成物を組織に投与することを含む。

関連した態様では、本発明の方法は、血管新生性（angiogenic）疾患または障害を発生する危険がある個体の組織における血管新生を阻害する方法を提供する。

新規な血管の成長が疾患と関連した病理の原因であるかまたは該病理に寄与する場合には、血管新生の阻害は、疾患の有害な効果を減少させるであろう。例は、腫瘍、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症、炎症性疾患、再発狭窄症等を含む。有害な組織の成長を支持するのに、新規な血管の成長が必要である場合には、血管新生の阻害は、組織への血液供給を減少させ、それにより血液供給要求に基づく組織質量の減少に寄与するであろう。例は、腫瘍が厚さ数ミリメートルを超えて増殖するためにそして充実性腫瘍転移の確立のために新生血管形成が連続的に要求される腫瘍の成長を含む。他の例は、冠プラーク拡大（coronary plaque enlargement）である。

本発明は、組織における血管新生を阻害し、それにより血管新生に依存する組織における事象を阻害するための方法を提供する。

この処置は、Ｄｅａｒ阻害剤の投与を含むであろう。処置は、他の血管新生阻害剤、化学療法、放射線、外科、または血管新生を阻害することが知られている当業者に知られている他の処置と併用するＤｅａｒ阻害剤を含むがそれらに限定されない、処置の併用を含むことができる。本発明のＤｅａｒ阻害剤と併用されうる血管新生阻害剤の例は、：直接血管新生阻害剤、アンジオスタチン、ベバシズマブ（アバスチン）、アレステン、カンスタチン、コンブレタスタチン、エンドスタチン、ＮＭ−３、トロンボスポンジン、タムスタチン、２−メトキシステラジオールおよびビタキシン；ならびに間接血管新生阻害剤：ＺＤ１８３９（イレッサ）、ＺＤ６４７４、ＯＳＩ７７４（タルセバ）、ＣＩ１０３３、ＰＫＩ１６６６、ＩＭＣ２２５（エルビタックス）、ＰＴＫ７８７、ＳＵ６６６８、ＳＵ１１２４８、ハーセプチンおよびＩＦＮ−α、ＣＥＲＥＢＲＥＸ（登録商標）（セレコキシブ）、ＴＨＡＬＯＭＩＤ（登録商標）（サリドマイド）およびＩＦＮ−αである。

したがって、Ｄｅａｒ阻害剤の投与と共に、血管新生を阻害する化合物は、臨床的に適切な方式での投与が、患者の少なくとも統計的に有意な一部について有利な効果、例えば、症候群の改善、治癒、疾患の重荷の減少、腫瘍質量もしくは細胞数の減少、寿命の延長、クオリティーオブライフの改善または特定のタイプの疾患または状態を処置することに慣れている医師によりポジティブと一般に認識された他の効果をもたらすことを示す。

Ｄｅａｒ阻害剤の例は、ＡｎｇＩＩ、ＥＴ−１および／または他のＥＴ−１もしくＡｎｇＩＩ様リガンドのＤｅａｒへの結合をブロッキングする分子、Ｄｅａｒの下流シグナリング事象を妨害する化合物、またはレセプターの活性化を阻害する他の化合物もしくは作用物質を含むがそれらに限定されない。このような化合物は、Ｄｅａｒに結合しそしてＡｎｇＩＩ、ＥＴ−１または他の模倣リガンドの結合を阻止する抗体を含む。好ましくは、抗体はヒト化抗体である。好ましくは、抗体は、一本鎖抗体またはＦ（ａｂ）２フラグメントである。他の阻害剤は、ＥＴ−１に結合するＤｅａｒドメインに結合する小分子、可溶性Ｄｅａｒレセプター、ＤｅａｒＥＴ−１および／またはＡｎｇＩＩ結合ドメインを含有するペプチド等を含む。

血管新生が、炎症性障害、例えば免疫および非免疫炎症、慢性関節リューマチおよび乾癬、血管の不適切なもしくは時期の悪い浸潤と関連した障害、例えば、糖尿病性網膜症、血管新生緑内症、再発狭窄症、アテロー性動脈硬化プラークにおける毛細管増殖および骨粗鬆症、ならびに癌関連障害、例えば、充実性腫瘍、充実性腫瘍転移、血管線維腫、水晶体後方線維増殖症、血管腫、カポジ肉腫、腫瘍成長を支持するのに新生血管形成を必要とする同様な癌を含むがそれらに限定されない病理的血管新生と呼ばれるネガティブな結果をもたらすと考えられる種々の疾患または傷害がある。本発明の好ましい態様では、本方法は、癌を有する哺乳動物における血管新生を阻害することに向けられる。

本明細書に記載された、種々の組織または組織化された組織からなる器官のいずれもが、皮膚、筋肉、腸、連結組織、関節、骨および血管が血管新生刺激により浸潤することができる同様な組織を含む疾患状態における血管新生に対応することができる。

本発明で処置された個体は、その多くの態様において、望ましくはヒト患者であるが、本発明の原理が、用語「患者」に含まれることを意図するすべての哺乳動物に関して有効であることを示すことは理解されるべきである。これに関連して、動物は、血管新生と関連した疾患の処置が望ましいいかなる哺乳動物種、特に農業用および家畜哺乳動物種も含むと理解されるべきである。

好ましい態様では、本発明は、癌、特に乳癌における如き病理的血管新生を有する哺乳動物の組織における血管新生を阻害する方法、および癌の存在を排除または減少させるＤｅａｒ阻害剤の投与を指向する。

Ｂ．血管新生の増強
本発明の別の態様では、新生血管形成または追加の血液供給を必要としている組織または器官における血管新生を刺激するのにＤｅａｒアクチベーターを使用する。これらの場合に、Ｄｅａｒアクチベーター単独の送達または他の血管新生刺激剤との併用の送達は有利でありうる。

例えば壊疽、糖尿病、劣悪な循環、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈疾患、心筋虚血、心筋梗塞、大動脈瘤、下肢の動脈疾患、脳血管疾患等のごとき、血流が増加すると有利になるいかなる状態も包含される。この方法では、本発明の方法は、Ｄｅａｒアクチベーターを投与して血管形成（vascularization）を促進することにより、末梢血管疾患を処置するのに使用することができる。同様に、Ｄｅａｒ活性化は、特に心臓への血管が部分的または完全に閉塞された、疾患のある心臓または低酸素心臓を処置するのに有用である。動脈硬化症を有する他の器官は、Ｄｅａｒ活性化から利益を得ることができる。同様に、その機能がより高い血管形成により増強されうる器官は、Ｄｅａｒの活性化により改善されうる。これは、機能の改善を必要としている腎臓または他の器官を含む。同じく、増加した血流から利益を得ることができる他の障害は、虚血性腸疾患、脳血管疾患、血管に基づく不能等を含む。更に、心臓における新規な血管の形成は、冠閉塞の結果から心筋を保護するのに決定的に重要である。虚血性心筋へのＤｅａｒアクチベーターの投与は、側枝の発生を増強することができ、壊死組織の治癒を促進することができそして梗塞の拡大および心不全を防止することができる。

更に、Ｄｅａｒアクチベーターは、新生血管形成を増加させることにより関心のある組織または器官について移植部位を調製するのに有用である。このような器官移植片は、膵臓、腎臓、心臓、肺、肝臓等を含むがそれらに限定されない。Ｄｅａｒアクチベーターは、外科手術癒着バリアーとして他の移植片と併用して使用することができる。

体外受精の後、胚を妊娠のためにメスに移植する。本発明の方法は、胚移植のための子宮血管形成床（uterine vascularized bed）を形成するのに使用することができる。この態様では、Ｄｅａｒアクチベーターを移植前に導入して、胚の移植前に子宮壁における血管形成を促進し、かくして胎児−母体血管叢（fetal-maternal vascular plexus）を促進する。同様に、Ｄｅａｒアクチベーターは、胎児−母体血管叢形成を増強させることもでき、および／または自然および体外受精した胚の両方の妊娠（pregnancy/gestation）を成功させるための強い胎盤脈管構造を増強することもできる。

当業者は、治療が有益であるときおよび治療が禁忌を示す場合を決定することができる。一般に、既知の腫瘍または病理的血管新生を有する患者は、本発明のＤｅａｒアクチベーターを与えられるべきではない。

ＩＩＩ．腫瘍前悪性潜在力：腫瘍の前悪性潜在力を減少させること。本発明の他の態様では、腫瘍の前悪性潜在力を減少させる方法が開示される。一般に、この方法は、核多型性（nuclear pleomorphism）、核過染色症、血管浸潤（vascular invasion）、モザイク腫瘍脈管（mosaic tumor vessels）、無秩序腫瘍脈管（chaotic tumor vessela）、腫瘍転移等などの前悪性パラメーター（しかしすべてを含むわけではない）を減少させる用量でＤｅａｒ阻害剤を含む組成物を全身にまたは局所的に、腫瘍に投与することからなる。

処方
本発明のＤｅａｒアクチベーターおよび阻害剤は、静脈内（Ｉ．Ｖ）、筋肉内（Ｉ．Ｍ）、皮下（Ｓ．Ｃ）、皮内（Ｉ．Ｄ）、腹腔内（Ｉ．Ｐ）、鞘内（Ｉ．Ｔ）、胸膜内、子宮内、直腸、膣アクチベーターまたは阻害剤）は、注射によるか、長時間にわたる緩やかな注入（gradual infusion）により非経口的に投与することができ、そして蠕動手段により送達することができる。

投与は、経粘膜または経皮手段によることができる。経粘膜または経皮投与のために、透過されるべきバリアーに適切な透過剤を処方において使用する。このような透過剤は当技術分野で公知でありそして、例えば経粘膜投与胆汁塩およびフシジン酸誘導体を含む。更に、洗剤を使用して透過を促進させることができる。経粘膜投与は、例えば鼻内噴霧または坐剤を使用することによることができる。経口投与のためには、本発明の化合物は、慣用の経口投与形態、例えばカプセル剤、錠剤および強壮剤に処方することができる。

局所投与のために、医薬組成物（Ｄｅａｒ活性の阻害剤またはアクチベーター）は、当技術分野で公知の、軟膏剤、膏剤（salves）、ゲル剤またはクリーム剤に処方される。

Ｄｅａｒアクチベーターおよび阻害剤は、例えば単位量の注射によるなど、普通に静脈内に投与される。治療組成物に関して使用されるとき用語「単位量」は、被験体のための単位投与量（unitary dosage）として適当な物理的に分離した単位を指し、各単位は、必要な希釈剤、即ち、担体またはビヒクルと共同して所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の有効物質を含有する。

組成物は、投与処方（dosage formulation）に適合する方式でそして治療的に有効な量で投与される。投与されるべき量及びタイミングは、処置されるべき被験体、被験体のシステムの有効成分を利用する能力および所望の治療効果の程度に依存する。投与されるのに必要な有効成分の正確な量は、医師の判定に依存しておりそして各個体に特徴的である。

本発明の方法を実施するために有用なＤｅａｒアクチベーターおよび阻害剤は、当業者に公知のとおり、意図する使用に適当な有効成分を含有する任意の処方または薬物送達システムである。経口、直腸、局所または非経口的（吸入、皮下、腹腔内、筋肉内および静脈内を含む）投与のための適当な薬学的に許容されうる担体は、当業者に知られている。担体は、処方の他の成分と適合性でありそしてそのレシピエントに有害ではないという意味で薬学的に許容されうるものでなければなない。

本明細書で使用された、組成物、担体、希釈剤および試薬について言及される用語「薬学的に許容されうる」、「生理学的に許容されうる」およびその標準語法にかなう変異表現は、交換可能に使用されそして、その物質を、望ましくない生理学的効果を生じることなく哺乳動物に投与することができまたは哺乳動物に対して投与することができることを示す。

非経口投与に適当な処方は、便利には、レシピエントの血液と好ましくは等張性である有効化合物の無菌の水性調製物を含む。したがって、このような処方は、好都合には蒸留水、蒸留水中の５％デキストロースまたは生理的食塩水を含有することができる。有用な処方は、適当な溶媒で希釈すると上記非経口投与に適当な溶液剤を生じる、上記化合物を含有する濃厚溶液剤または固体剤も含む。

腸内投与のために、各々所定の量の有効化合物を含有する、カプセル剤、カシェ剤、錠剤またはトローチ剤の如き分離した単位において；散剤もしくは顆粒剤として；あるいは水性液体もしくは非水性液体中の懸濁剤もしくは溶液剤、例えば、シロップ剤、エリキシル剤、乳剤または頓服水剤において、不活性担体中に配合されうる。適当な担体は、デンプンもしくは糖であることができそして滑剤、矯味・矯臭剤、結合剤および同じ性質の他の物質を含むことができる。

錠剤は、場合により１種以上の補助成分と共に圧縮または成形により製造されうる。圧縮された錠剤は、有効化合物を、適当な機械で、場合により補助成分、例えば、結合剤、滑剤、不活性希釈剤、界面活性剤または分散剤と混合された易流動性形態、例えば散剤または顆粒剤の形態において圧縮成形することにより調製することができる。成形された錠剤は、任意の適当な担体との散剤状の有効化合物の混合物を適当な機械で成形することにより製造されうる。

シロップ剤または懸濁剤は、任意の補助成分を加えられていてもよい糖、例えばスクロースの濃厚水性溶液に有効化合物を加えることにより製造することができる。このような補助成分は、矯味・矯臭剤、糖の結晶化を遅らせる作用物質または任意の他の成分の溶解度を増加させる作用物質、例えば多価アルコール、例えばグリセロールまたはソルビトールを含むことができる。

直腸投与のための処方は、坐剤基剤用の慣用の担体、例えば、カカオバターまたはWitepsol S55（Dynamite Nobel Chemical, Germanyの商標）を有する坐剤として提供されうる。

経口投与用の処方は、エンハンサーと共に提供されうる。経口的に許容されうる吸収エンハンサーは、界面活性剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム、パルミトイルカルニチン、ラウレス−９、ホスファチジルコリン、シクロデキストリンおよびその誘導体；胆汁塩、例えばデオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウムおよびフシジン酸ナトリウム；ＥＤＴＡを含むキレート剤、クエン酸およびサリチレート；ならびに脂肪酸（例えば、オレイン酸、ラウリン酸、アシルカルニチン、モノ−およびジグリセリド）を含む。他の経口吸収エンハンサーは、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ＣＨＡＰＳ（３−（３−コールアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート）、Ｂｉｇ−ＣＨＡＰＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−コールアミド）、クロロブタノール、オクトキシノール−９、ベンジルアルコール、フェノール、クレゾールおよびアルキルアルコールを含む。本発明のための特に好ましい経口吸収エンハンサーは、ラウリル硫酸ナトリウムである。

あるいは、化合物は、リポソーまたはミクロスフェア（またはミクロパーティクル）において投与することができる。患者に投与するためのリポソームおよびミクロスフェアを製造する方法は当業者に周知である。U.S.Pat.No.4,789,734（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）は、リポソーム中に生物学的物質をカプセル化するための方法を記載する。本質的に、物質を水性溶液に溶解し、適切なリン脂質および脂質を必要ならば界面活性剤と共に加え、そして物質を必要に応じて透析および超音波処理する。既知の方法の概説は、G.Gregoriadis, Chapter 14, "Liposomes," Drug Carriers in Biology and Medicine, pp. 287-341(Academic Press, 1979)により提供される。

ポリマーまたはタンパク質から形成されるミクロスフェアは、当業者に周知でありそして直接血流中へと胃腸管を通して送るように要求に合わせることができる。または、化合物は、日〜月の範囲の期間にわたり除放するために移植されたミクロスフェアまたはミクロスフェアの複合体に組み込むことができる。例えば、U.S.Pat.Nos. 4,906,474, 4,925,673 and 3,625,214 and Jein, TIPS 19: 155-157(1998)参照されたい。これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる。

１つの態様では、本発明のＤｅａｒアクチベーターまたは阻害剤は、静脈内投与の後毛細細管床（capillary beds）に入れるのに適当なサイズのリポソーム、ミクロスフェア、ナノパーテイクル中に処方することができる。リポソーム、ミクロスフェアまたはナノパーテイクルが虚血組織を取り囲んでいる毛細管床に入れられるとき、作用物質は、それらが最も有効な部位に局所的に投与されうる。虚血組織をターゲティングするための適当なリポソームは、一般に約２００ナノメートル未満であり、そして例えば、"Liposomal targeting of ischemic tissue"と題するBaldeschweilerへのU.S.Pat.No.5,593,688（その内容は参照により本明細書に組みこまれる）に開示されたとおり典型的には、単層小胞（unilamellar vesicles）でもある。

好ましい粒子は、生物分解性ポリマー、例えば、ポリグリコリド、ポリラクチドおよびそのコポリマーから製造された粒子である。当業者は、所望の薬物放出速度及び所望の投薬量を含む種々のファクターに依存して適切な担体システムを容易に決定することができる。

１つの態様では、処方は、直接血管の内側にカテーテルを介して投与される。投与は、例えば、カテーテルの穴を通して行うことができる。有効化合物が相対的に長い半減期（１日〜４週間以上のオーダーの）を有するこれらの態様では、処方は、Hubbell et al へのU.S.Pat.No.5,410,016に開示されたヒドロゲルの如き生物分解性ポリマーヒドロゲルに含ませることができる。これらのポリマーヒドロゲルは、組織内腔の内側に送達させることができそして有効化合物はポリマーが分解するにつれて経時的に放出されうる。所望ならば、ポリマーヒドロゲルは、有効化合物のコントロールされた放出のための他の機序を与える、ミクロパーティクルまたはリポソームであってその中に分散された有効化合物を含むミクロパーティクルまたはリポソームを有することができる。

処方は、好都合には単位剤形で提供することができ、そして薬学の分野で周知の方法のいずれかにより調製されうる。すべての方法は、有効化合物を、１種以上の補助成分を構成する担体と混合する段階を含む。一般に、処方は、有効化合物を液体担体または微細に分割された固体担体と均一に且つ緊密に混合させ、次いで必要ならば、生成物を所望の単位剤形に成形することにより調製される。

処方は、製剤処方の分野で利用される１種以上の任意の補助成分、例えば、希釈剤、バッファー、矯味・矯臭剤、結合剤、界面活性剤、粘稠化剤、滑剤、懸濁化剤、保存剤（酸化防止剤を含む）等を更に含むことができる。

本方法の化合物は、噴霧器のための嗅剤、またはエアゾル剤もしくは溶液剤としてまたは通気のためのミクロファイン散剤として、単独でまたはラクトースの如き不活性担体と組み合わせて、気道に投与するために提供されうる。このような場合に、有効化合物の粒子は、適当には５０ミクロン未満も好ましくは１０ミクロン未満、更に好ましくは２〜５ミクロンの直径を有する。

一般に、鼻内投与のために、軽い酸性pHが好ましいであろう。好ましくは、本発明の組成物は、約３〜５、更に好ましくは、約３．５〜約３．９、最も好ましくは３．７のpHを有する。pHの調節は、適当な酸、例えば塩酸の添加により達成される。

その中に溶解もしくは分散した有効成分を含有する薬理学的組成物の調製は、当技術分野で十分に理解されそして処方に基づいて限定される必要はない。典型的には、このような組成物は、液体溶液剤または懸濁剤として注射可能物として調製されるが、使用の前に液体とする、溶液剤または懸濁剤用の適当な固体剤形態を調製することもできる。調製物は乳化させることもできる。

下記はラットＤｅａｒの配列である：
Rattus norvegicus エンドセリン１，アンジオテンシンＩＩレ二重セプター（Ｄｅａｒ）、ｍＲＮＡ：
GeneID：446170 Locus tag： RGD：1303105

実施例１
近親交配したＤａｈｌ／ＪＲラットモデルは、その先祖が同じの食塩抵抗性正常血圧の対照系統（Ｄａｈｌ Ｒ）（５２）と共に食塩感受性高血圧系統（Ｄａｈ１ Ｓ）からなるヒト本態性高血圧の確立されたモデルである。高血圧病因におけるＤｅａｒの関与を調査するために、我々は、Ｄａｈｌ ＳおよびＤａｈｌ Ｒレセプターの両方についての全体アミノ酸コード領域に及ぶｃＤＮＡｓを得た。２つの非保存性アミノ酸置換をもたらす２つのヌクレオチドの相違が検出された：Ｓ４４Ｐ置換をもたらすＴ²⁸¹⁴（Ｄａｈｌ Ｓ）／Ｃ²⁸¹⁴（Ｄａｈｌ Ｒ）ヌクレオチドトランジッションおよびＭ７４Ｔ置換をもたらすＴ²⁹⁰¹（Ｄａｈｌ Ｓ）／Ｃ²⁹⁰¹（Ｄａｈｌ Ｒ）ヌクレオチドトランジッション（図１Ａ、１Ｂ）。Ｓ４４Ｐ置換は、細胞外ドメインにおける推定ＡｎｇＩＩ結合部位に位置しており；一方Ｍ７４Ｔ置換は推定膜貫通ドメインに位置している（図１Ｂ）。Ｄａｈｌ Ｓ ｃＤＮＡヌクレオチド配列は、先に報告されたスプグレーグ−ドーリーラット脳ＤｅａｒｃＤＮＡ（１）と同一である。我々は、Ｄａｈｌ ＳおよびＤａｈｌ Ｒラット株の両方共スプレーグ−ドーリー株に由来している（５２）ことを指摘する。

Ｓ４４Ｐ置換は、Ｄａｈｌ Ｒ Ｄｅａｒ変異体（１）（図１Ｂ）内の予想されたＡｎｇＩＩ結合ドメインに及び、これは、ＡｎｇＩＩ結合が、Ｄａｈｌ ＳレセプターとＤａｈｌ Ｒレセプターとで異なる可能性が極めて高いという仮説を示唆する。この仮説を検査するために、我々は、Ｄａｈｌ ＳおよびＤａｈｌ Ｒ腎臓膜を比較するウエスタンブロット分析により検出して、雄及び雌ラットの両方において１２週齢のＤａｈｌ ＳラットとＤａｈｌ Ｒラット間のＤｅａｒ発現レベルに有意な差はないことを最初に決定した（図１Ｃ）。ホルモン結合を検査するために、ＤａｈｌＳおよびＤａｈｌＲ レセプターをそれぞれＣｏｓ１細胞において一過性で発現させそしてＡｎｇＩＩおよびＥＴ−１結合について試験した。直接放射性リガンド結合（図２および表１）ならびに、ＤａｈｌＳおよびＤａｈｌＲラット腎臓膜ならびにＤａｈｌＳおよびＤａｈｌＲ Ｄｅａｒ Ｃｏｓ１トランスフェクタント細胞膜のウエストウエスタンブロット分析（ウエスタンブロット上のレセプターポリペプチドへの標識されたリガンド（ウエスト）結合）（図２Ｃ）により示されたとおり、ＤａｈｌＲ Ｄｅａｒは、ＡｎｇＩＩ結合を示さないが、正常なＥＴ−１結合を示す。これらのデータは、Ｄａｈｌ Ｓ Ｄｅａｒ変異体は、最初に特徴付けられた（１）脳由来のクローンと同様なＥＴ−１及びＡｎｇＩＩの両方に結合する二重レセプターであるが、Ｄａｈｌ Ｒ Ｄｅａｒ変異体はＥＴ−１刺激にのみ応答することを証明する。ＥＴ−１についての２つのアフィニティー結合部位は、Ｄａｈｌ Ｓ及びＤａｈｌ Ｒレセプターにおいて検出され（図３、表１）、そしてＤａｈｌ ＳレセプターにおけるＡｎｇＩＩについての２つのアフィニティー結合部位（図３、表１）は先の特徴付け（１）と一致している。更に、Ｄａｈｌ Ｒ Ｄｅａｒ Ｓ４４Ｐ／Ｍ７４Ｓ変異体と比較して、Ｄａｈｌ Ｓ Ｄｅａｒ Ｓ４４／Ｍ７４変異体は、ＥＴ−１に対する３倍増加したアフィニティーを示し（Ｄａｈｌ Ｒ：Ｓ４４Ｐ／Ｍ７４Ｔ Ｋ_HＥＴ−１ ＝１２．０±１．１２ｐＭ；； Ｄａｈｌ Ｓ： Ｓ４４／Ｍ７４ Ｋ_HＥＴ−１ ＝ ４．４２±０．８９ｐＭ，Ｐ＜０．００１、表１）、これはＤａｈｌ Ｒレセプターに比較してＥＴ−１刺激に対するＤａｈｌ Ｓレセプターの増強された応答を示唆する。

予想されたＡｎｇＩＩ結合部位へのその局在化に基づくと、Ｓ４４Ｐ置換は、Ｄａｈｌ Ｒ ＤｅａｒにおいてＡｎｇＩＩ結合が存在しないことが観察されたことの原因であるようである。興味深いことに、このＳ４４Ｐ置換および得られるディファレンシャルＡｎｇＩＩ結合は、分子認識理論により予想されるペプチド−リガンド結合ドメイン内の自然に起こる突然変異を始めて明らかにする（１）。

Ｄａｈｌ ＳおよびＤａｈｌ Ｒ Ｄｅａｒ遺伝子間の機能的に有意な変異体を発見したので、次いで我々は、それぞれ高い食塩（８％ＮａＣｌ）チャレンジの８および１２週間後にラジオテレメトリーにより血圧についてフェノタイピングされた雄（ｎ＝１０６）および雌（ｎ＝１０２）Ｆ２［Ｒ×Ｓ］相互交配ラットの両方に関する独立のＱＴＬ解析を行うことにより高血圧感受性への潜在的遺伝的寄与を調べた（表２）。高食塩食事チャレンジを、Ｆ２［Ｒ×Ｓ］相互交配雌ラットについて４週間延長した。何故ならば、雌ＢＰ表現型は、雄Ｆ２［Ｒ×Ｓ］相互交配ラットにおけるよもはるかに低かったからである（高食塩食事の８週間後の平均Ｆ２［Ｒ×Ｓ］相互交配雄ＳＢＰ＝１５７．２±１４．２mmHg；高食塩食事の１２週間後の平均Ｆ２［Ｒ×Ｓ］相互交配雌ＳＢＰ＝１４５．０±１１．４mmHg、表２）。ＳＳＣＰをベースとするＤｅａｒ遺伝子特異的マーカー（図４Ａ）を使用して、我々は、ラットＤｅａｒを染色体２（ラットゲノムの現在のアセンブリーにおける物理的位置：２ｑ３４，１７６．６８７Ｍｂ）、α１−Ｎａ−，Ｋ−ＡＴＰアーゼローカス、ＡＴＰ１Ａ１に対して４．５cMセントロメリックである、にマッピングした。次いで、Ｄａｈｌ Ｒ及びＤａｈｌ Ｓ系統を区別する１１の情報提供マーカーにより全染色体２スキャンを行った。マーカー回帰（marker regression）およびインターバルマッピング解析は、Ｆ２［Ｒ×Ｓ］雄コホートにおいてＡＴＰ１Ａ１＋２cM（ＬＯＤ＝１．７０）にピークを有する、平均、収縮期および拡張期ＢＰに対して示唆的連鎖を有する一つの染色体領域を検出する（図４Ｂ、表２）。対照的に、Ｆ２［Ｒ×Ｓ］相互交配雌の染色体２スキャン解析は、染色体２上の２つのＱＴＬｓを示し、１つはＤ２Ｒａｔ１４３）に中心を有し（ＬＯＤ＝２．４３、有意な連鎖）そして他方は、Ｄｅａｒ−５cMに中心を有する（ＬＯＤ＝３．６１、高度に有意な連鎖）（図４Ｃ、表２）。病理生理学的関係を評価するため、Ｄｅａｒアレル特異的寄与の解析（表３）は、ＢＰパラメーター−収縮期、拡張期または平均動脈圧（平均動脈圧における変化が最も大きい）にかかわりなく、高血圧への感受性を増加させることを示す（ＡＮＯＶＡ Ｐ＜１０⁻³〜１０⁻⁴）。異なる血圧パラメーターにおける結果の一致は、Ｆ２［Ｒ×Ｓ］相互交配雌ラットにおける高血圧感受性のための遺伝子としてＤｅａｒローカスを正確に叙述する証拠を提供する。

今日まで、Ｄｅａｒ（ここに示された）およびＡＴＰ１Ａ１（３８、４３）遺伝子のみが高血圧に対する占めされた病因性関係を伴ってＤａｈｌ ＳおよびＤａｈｌ Ｒラット間の機能的に有意な変異体を示す。これらのデータは、高血圧遺伝子のための４パラメーター解析フレームワークに基づく雌Ｆ２［Ｒ×Ｓ］相互交配ラットにおけるＢＰに影響を与える染色体２上のＤｅａｒ−５cM ＱＴＬ領域の候補遺伝子として前記２つのローカスを促進する（３７、５４）。高血圧におけるＡＴＰ１Ａ１の原因的役割は、雄及び雌Ｄａｈｌ Ｓラットの両方においてトランスジェネシスにより示された（３８）。推定遺伝子相互作用は、Ｄｅａｒについて研究される必要があるが、ＡＴＰ１Ａ１−Ｎａ，Ｋ，２Ｃｌコトランスポーター（ＮＫＣＣ）遺伝子相互作用は、Ｆ２［Ｒ×Ｓ］相互交配ラットの共分離解析において高血圧への感受性を増加させることが検出された（３９）。ＢＰに対するＡＴＰ１Ａ１効果のこの優位性は、この染色体２スキャンならびに先のＦ２相互交配および類似遺伝子の研究（３４、５３）においてなされたように単一ローカスとして解析されるとき、ＡＴＰ１Ａ１で検出されたＢＰへの連鎖の減少した統計的有意の説明となることができよう。

Ｄｅａｒローカスに及ぶＢＰのための染色体２ＱＴＬｓを報告する先の遺伝的ラットモデルの研究に関してＤｅａｒローカスを更に解析するために、我々は、ＳＳＣＰ解析により前記研究で使用されたＷＫＹ、ＳＨＲ、ＢＮおよびＬＥＷラット系統に関してＤｅａｒ変異体を評価した。図４Ａに示されたとおり、Ｄａｈｌ Ｒ Ｄｅａｒ Ｓ４４Ｐ／Ｍ７４Ｔ変異体は、Ｄａｈｌ Ｒ及びＤａｈｌ Ｓ系統で検出されるが、Ｄａｈｌ Ｓ Ｄｅａｒ Ｓ４４／Ｍ７４変異体は、ＳＨＲ、ＷＫＹおよびＢＮ系統で検出される。異なる系統における変異体特異的アレルの検出は、全アミノ酸コード領域に及ぶ２つの独立したＤｅａｒ ｃＤＮＡクローンの直接ヌクレオチド配列決定により確証された（データは示されていない）。ＳＨＲ、ＷＫＹおよびＢＮラット系統はＳ４４／Ｍ７４ Ｄａｈｌ Ｓ Ｄｅａｒアレルを有するので、Ｄｅａｒローカスは、これらの系統に由来するＦ２相互交配研究においてＢＰについての染色体２ＱＴＬのための候補遺伝子として演繹的に排除される（３１、４１、５１、５９）。Ｄｅａｒローカスは、雄のみを調査したＦ２［Ｄａｈｌ Ｓ×ＬＥＷ］相互交配研究において報告された染色体２ＢＰ ＱＴＬのための候補遺伝子としても排除される。何故ならばＤｅａｒ Ｓ変異体は雌における高血圧と共分離しているからである。

したがって、遺伝的、分子および病理生理学的解析からの観察は、変異体ＤｅａｒによるＡｎｇＩＩおよびＥＴ−１レセプターシステムのバランスの改変は、雌Ｆ２［Ｒ×Ｓ］相互交配ラットにおける高血圧感受性に寄与することを示唆する。データは、高血圧感受性における性特異的因子の重要性およびＡｎｇＩＩ−ＥＴ−１応答バランスにおけるＤｅａｒの役割をあらためて表明している。

材料および方法
Ｄａｈｌ ＳおよびＤａｈｌ Ｒ Ｄｅａｒ ｃＤＮＡｓの特徴付け
Ｄａｈｌ ＳおよびＤａｈｌ Ｒ Ｄｅａｒ ｃＤＮＡｓは、それぞれＤａｈｌ Ｓ／ＪＲＨｓｄおよびＤａｈｌ Ｒ／ＪＲＨｓｄラット腎臓ポリＡ^＋ＲＮＡｓからのＲＴ−ＰＣＲであり（フォワードプライマー：５’−ＡＡＧ−ＡＡＡ−ＧＣＡ−ＧＣＡ−ＣＣＴ−ＴＧＧ−Ｔ−３’（配列番号３）；リバースプライマー：５’−ＣＧＴ−ＧＧＡ−ＣＡＧ−ＡＧＡ−ＣＣＴ−ＴＧＴ−ＣＴ−３’（配列番号４））、次いでＰＴ−ベクター系（Clontech, Palo Alto, CA）にサブクローニングした。プライマー配列は、先に報告されたスプレーグ−ドーリーＤｅａｒ ｃＤＮＡ（Genbank アクセッションナンバー ＡＹ６６４４９２）から得られた。次いで、全Ｄｅａｒアミノ酸コード領域を含むｃＤＮＡｓ（４３２ｂｐ）を両鎖に関して配列決定した。６匹のＤａｈｌ Ｓラットおよび６匹のＤａｈｌ Ｒラットを配列決定して、系統内配列不均一性を示さなかった。

一本鎖コンフォメーション多型（ＳＳＣＰ）解析によるＤｅａｒ遺伝子Ｓ４４Ｐ／Ｍ７４Ｔ変異体の検出
Ｄａｈｌ Ｓ／ｊｒＨｓｄ、Ｄａｈｌ Ｒ／ｊｒＨｓｄ、ＬＥＷ／ＳｓＮＨｓｄ、ＷＫＹ／ＮＨｓｄ、ＳＨＲ／ＮＨｓｄ、およびＢＮ／ＨｓｄラットをHarlan Inc.（Indianapolis, IN）から購入した。ＳＳＣＰ解析を、本質的に記載された（６０）異なるラット系統から単離されたゲノムＤＮＡで行った。ＳＳＣＰマーカーは、ＤｅａｒｃＤＮＡのアミノ酸コード領域以内のヌクレオチド２７７４〜２９１１（Ｓ４４Ｐ置換に及ぶ）を含むＰＣＲ産物に基づいている（フォワードプライマー：５‘−ＧＣＴ−ＡＴＧ−ＴＡＴ−ＣＴＧ−ＧＡＣ−ＡＧＣ−ＡＧＣ−３’（配列番号５）；リバースプライマー：５’ＡＧＴ−ＧＡＡ−ＧＣＡ−ＣＡＴ−ＧＡＴ−ＧＣＡ−ＡＧＴ−３’（配列番号６）；産物：１３７ｂｐ）（１）。ＳＳＣＰマーカーは、６％非変性ポリアクリルアミドにより検出された。

レセプター発現および膜調製
Ｄａｈｌ ＳおよびＤａｈｌ Ｒ Ｄｅａｒ ｃＤＮＡｓをｐｃＤＮＡ（＋）発現ベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）に指向的に（５’から３’へ）サブクローニングし、そしてＣｏｓ１細胞（ＡＴＣＣ）において一過性で発現させた。Ｃｏｓ１細胞をリポフェクチン媒介遺伝子トランスファーにより発現ベクターでランスフェクションし、そして細胞膜をホルモン結合のためにトランスフェクションの７２時間後に単離した。ラット腎臓膜を実質的に記載されたとおりに調製した（４２）。ＣＯＳ１細胞膜を記載のとおりに単離した（３６）。簡単に言えば、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水中で２回洗浄しそして１０倍の氷冷バッファー（０．２５Ｍスクロース、１mMＥＤＴＡ、５０μg／mlアプロチニン、１０μg／mlロイペプチン、１００μMフェニルメチルスルホニルフルオリド、２５mMイミダゾール／ＨＣｌ、pH７．４）中でホモジナイズした。ホモジネートを５，０００ｇで１５分間遠心し、そしてペレットを捨てた。次いで上清を２７，５００ｇで３０分間遠心し、そして得られるペレットを氷冷懸濁バッファー（５mMＭｇＣｌ₂、０．２mMＥＤＴＡ、５０mMＨｅｐｅｓ、pH７３４）中で２回洗浄した。採集のペレットを適切なアッセイバッファーに再懸濁させそして液体窒素中で迅速に凍結させた。膜調製物を使用まで−８０℃で保存した。膜のタンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＰＩＥＲＣＥ）により決定された。

放射性リガンド結合アッセイ
［¹²⁵Ｉ］Ｔｙｒ⁴−アンジオテンシンＩＩおよび［¹²⁵Ｉ］Ｔｙｒ¹³−エンドセリン−１のＣＯＳ−１膜への結合を、急速濾過法により行った（３２、５０）。簡単に言えば、［¹²⁵Ｉ］Ｔｙｒ⁴−アンジオテンシンＩＩ（０．２５〜６．５nM）または［¹²⁵Ｉ］Ｔｙｒ¹³−エンドセリン−１（０．０４５〜１．４６nM）を１００μlバッファーＡ（５mM ＭｇＣｌ₂、０．２mMＥＤＴＡ、１０mg／mlＢＳＡ、１０mMＨｅｐｅｓ、pH７．４）中で３７℃で２０分間膜（１００μg）とインキュベーションした。結合反応を、１ml氷冷バッファーＡの添加により終結させそして直ちに、ワットマンＧＦ／Ｃフィルター（１０mg／mlＢＳＡ中で４℃で一夜予備浸漬した）を通して直ちに濾過し、次いで１５ml氷冷バッファーＡで洗浄した。膜に結合した総放射能と１μMＡｎｇＩＩまたは１μMＥＴ−１を含有するブランクに結合した放射能との差として特異的結合を決定した。解離定数（Ｋｄ）および最大リガンド結合部位（Ｂ_max）をＨｉｌｌプロット解析（５５）を使用して決定した。Ｈｉｌｌ係数値（ｈ）は、
関係式 Ｉｎ［Ｂ／（Ｂ_max−Ｂ］］＝ｈＩｎ［遊離放射性リガンド］−ＩｎＫ_d
から計算された。Ｆ検定（Ｐ＜０．０５）を使用して、飽和結合曲線が１つまたは２つの独立した結合部位に最善に適合しているかどうかを決定した。データは、スキャッチャードプロット解析により決定された２つのアフィニティー状態により最善に適合しており；Ｋ_HおよびＫ_Lはそれぞれレセプターの高アフィニティー状態および低アフィニティー状態を意味する（４４）。大部分の結果は、３〜５の独立した実験からの平均±ＳＥ（標準誤差）として表される。

ウエスタンおよびウエストウエスタンブロッティング分析
合成ペプチドＰ₅₁ＬＬＴＳＬＧＳＫＥ₆₀（配列番号７）に対して生じたポリクローナルウサギ抗ペプチド抗体を、ウエスタンブロット分析のために利用した（１）。形質膜（４０μgタンパク質／レーン）を、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そして分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜上にエレクトロトランスファーし、これをブロッキングバッファー（０．３％Ｔｗｅｅｎ−２０、５％脱脂牛乳、１３７mMＮａＣｌ、２．７mMＫＣｌ、８．１mMＮａ₂ＨＰＯ₄および１．５mMＫＨ₂ＰＯ₄、pH７．４）と室温で２時間インキュベーションし、次いで一次抗体（１：５００）と４℃で１６時間インキュベーションした。次いで、ＰＶＤＦ膜を順次にビオチニル化ヤギ抗ウサギＩｇＧとインキュベーションし、続いてセイヨウワサビペルオキシダーゼ連結ストレプトアビジンで免疫染色した。Ｄｅａｒとリガンドとの相互作用を確かめるために、我々はウエストウエスタンブロット分析を行った（６２）。簡単にいえば、腎臓およびＣＯＳ−１細胞膜のタンパク質ブロットを、バッファーＡ中で放射性リガンド（１０ml中の０．５μＣｉ）と３７℃で１６時間インキュベーションした。次いでＰＶＤＦ膜をバッファーＡで３７℃で１５分間３回洗浄しそして−８０℃で１〜３日間Ｘ線フイルムに露光させた。

遺伝的交配
Ｄａｈｌ Ｓ／ｊｒＨｓｄおよびＤａｈｌ Ｒ／ｊｒＨｓｄラット株（Harlan, Indianapolis, Indiana）を使用してＦ２コホートを発生させた。このＦ２コホートは、Ｆ１（Ｒ雌×Ｓ雄）雑種の兄弟−姉妹交配から誘導されて、Ｆ２雄（ｎ＝１０６、Ｄａｈｌ Ｓ遺伝的バッグラウンドからのＹ染色体のみを有する）およびＦ２雌（ｎ＝１０２）分離集団を産生させた。

Ｆ２コホートの表現型特徴付け
すべての動物処置を協会のガイドラインに従って行った。動物を、離乳から１２週齢で高食塩食が始まるまで０．４％ＮａＣｌを含有するＬａｂＤｉｅｔ５００１げっ歯類食事（Harlan Teklad, Madison WI）に維持した。食物ペレットおよび水を随意に摂取可能とした。血圧（ＢＰ）は、大動脈内腹部ラジオテレメトリー移植片（ＤＡＴＡＳＣＩＥＮＣＥ）を使用して実質的に記載された（３８）とおりに測定して、２４時間５分毎に１０秒にわたる平均値をとる非ストレス下の血圧測定値を得た。収縮期（ＳＢＰ）、拡張期（ＤＢＰ）および平均動脈圧（ＭＡＰ）を、心拍数及び活性度と共に得られた。Ｆ２ラットについてのプロトコールは下記のとおりであった：１０週齢での移植手術；手術後に合併症を有していないラットのみを使用し；１２日後ベースラインＢＰレベルを得た。高食塩（８％ＮａＣｌ）チャレンジを１２週齢で始め、雄Ｆ２相互交配ラットでは８週間維持しそして雌Ｆ２相互交配ラットでは１２週間維持し；雌のＢＰはより低いので雌が同様なＦ２平均ＢＰに達するためにより長い高食塩チャレンジが必要であった。表現型について使用されたＢＰ値は、非ストレスＢＰを確かめる立ち入り禁止日の期間中２４時間の記録から食塩ローディングの最終週に得られた平均である。我々は、ＳＢＰ、ＤＢＰおよびＭＡＰのためのベースラインＢＰ平均は、同等であり、異なるＤｅａｒ遺伝子型の間ですべての３つのＢＰパラメーターについて±１mmHg範囲であった（Ｐ＞０．５）ことを指摘する。

相互交配連鎖解析
我々のＤａｈｌ［Ｒ×Ｓ］相互交配について情報提供する１０の染色体２マイクロサテライトマーカーおよび１つのＳＳＣＰをベースとするＤｅａｒマーカー（上記した）を使用してジェノタイピングを行った。マーカー回帰およびＱＴＬ解析を、量的形質としてＭＡＰを使用するＭａｐ Ｍａｎａｇｅｒ ＱＴＸｂ１７（ＭＮＱＴＸｂ１７）プログラム（４６）により行った。ＭＭＱＴＸｂ１７は、可能なＱＴＬの有意の目安として尤度比統計量（likelihood ratio statistics）（ＬＲＳ）をもたらす。遺伝的距離は、Ｋｏｓａｍｂｉマッピング関数を使用して計算した（遺伝的距離はcMで表される）。連鎖についての限界有意値（critical significance values）（ＬＲＳ値）は、Kosambiマッピング関数および自由回帰モデル（free regression model）を使用して我々の雄および雌の子孫に関する並べ替え検定（１０cM間隔で２０００並べ替え）により決定された。従って、Ｆ２雄コホートについての最小ＬＲＳ値は、示唆的連鎖では＝４．１（ＬＯＤ＝０．８９）；有意な連鎖では＝１０．６（ＬＯＤ＝２．３０）；高度に有意な連鎖では＝１８．４（ＬＯＤ＝４．００）でありそしてＦ２雌コホートでは、示唆的連鎖では＝３．９（ＬＯＤ＝０．８５）；有意な連鎖では＝９．９（ＬＯＤ＝２．１５）；高度に有意な連鎖では＝１６．６（ＬＯＤ＝３．６１）である。ＬＲＳ４．６は、ＬＯＤ１支持区間を正確に叙述する。ＱＴＬ位置についての信頼区間は、ヒストグラム単一ピークがＱＴＬを正確に叙述し、ピーク幅がＱＴＬについての信頼区間を定める、ブーツストラップリサンプリング法により評価された。１つより多くのピ―クを示すヒストグラムは、ＱＴＬについての位置が十分明確にされていないことを警告するか、または多重連鎖したＱＴＬｓ（QTL Map Manager）（４６）がありうることを警告する（４６）。

実施例２
我々は、１２９ＳＶＪマウスゲノムライブラリーからのマウスＤｅａｒ遺伝子を単離した。分子の特徴付けは、１エキソン転写単位を検出する（図５Ａ）。マウスレセプターポリペプチドは、ラットレセプターとの７８％相同性を示す１２７アミノ酸を含有し、そして最近特徴付けられたＤａｈｌ Ｒ Ｄｅａｒ Ｓ４４Ｐ／Ｍ７４Ｔラット変異体（２）に類似するＥＴ−１のみに結合し（データは示されていない）、そしてＤｅａｒ^-/-マウスにおける観察が多分ＡｎｇＩＩ媒介されていないことを示唆している。マウスＤｅａｒ ｍＲＮＡは試験されたすべての組織において検出され、腎臓および大動脈において発現は最高レベルである（図５Ｂ）。

ＥＳ細胞におけるＤｅａｒ^-/-のターゲティングされた不活性化は、Ｄｅａｒのアミノ酸８１〜１２７に及ぶゲノム領域のＰＧＫ−ネオマイシンカセットによる置換によりなされ（図５ａ）、これは、推定Ｇタンパク質相互作用ドメイン（１）を含む、Ｄｅａｒポリペプチドの最後の４７アミノ酸の欠失をもたらす。相同性組換えについてのスクリーニングは、サザーンブロット分析（図５．５Ｃ）により１９６のＧ４１８抵抗性コロニーに関してなされた。ターゲティング事象は、ネオマイシン特異的プライマーおよび組み込み部位にフランキングするプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により確認された。予想されたサイズフラグメント（５．５Kb）の産生は、ターゲティング事象を示した（図５Ｄ）。ターゲティングされたＤｅａｒ突然変異を有する５つのＥＳ細胞クローンは、１２９ＳＶＪ杯盤胞に注入しそして偽妊娠養母に移植した。我々は、１４のキメラマウスを得た（２つの独立したターゲティングされたＥＳ細胞クローンを代表する）。キメラは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに交配されそして生殖細胞系伝達して（germ line transmit）、Ｆ１子孫を産生することが示された。

ヘテロ接合Ｄｅａｒ欠失（Ｄｅａｒ^+/-）雄および雌マウス（戻し交雑−１０近交Ｃ５７ＢＬ／６マウス系統）は、抗マウスＤｅａｒ抗ペプチド特異的抗体を使用して検出されたマウス腎臓タンパク質ブロット解析における５０％未満のＤｅａｒタンパク質（図５Ｆ；Ｐ＜０．０５、ｔ検定）、５及び６ヶ月齢でのより少ない体重（雄：Ｐ＝０．００７；雌：Ｐ＝０．０００６）（図５Ｉ）および雌において減少した血圧（Ｄｅａｒ^+/+：１３４±４．０mmHg対Ｄｅａｒ^+/-：１１２．３±６．１；Ｐ＜０．０１）を示し、しかし雄マウスでは血圧は減少していないが心拍数は同等である（図５Ｇ−Ｈ）。性特異的血圧効果は、Ｄｅａｒ変異体が雌において高血圧と共分離したが、雄Ｆ２相互交配ラットにおいてそうではない、ラット遺伝的高血圧の最近の研究と一致している（２）。

遺伝子ターゲティング事象の潜在的胚致死性を評価するために、我々は、ターゲティングされたＤｅａｒアレルの存在／不存在についてジェノタイピングされたＦ１Ｄｅａｒ^+/-雄および雌交配からの子孫を解析した。下記の遺伝子型分布：２９野生型（^+/+）、３９ヘテロ接合体（^+/-）、０ヌル（^-/-）を示す６８匹の子（ｐｕｐ）を１７匹の同腹子から産生させた。Ｆ２子孫にヌル遺伝子型が存在しないのは、Ｄｅａｒヌル突然変異が胚致死性であることを示す。

Ｄｅａｒ^+/- 胚における胚致死性を調べるために、我々は、発達の異なる段階でＤｅａｒ^+/- マウスに由来する時間を定めた妊娠（timed pregnancy）からの胚を解析して致死性が起こる正確な発達段階を決定した。我々は、１２９の胚（Ｅ９．６からＥ１２．５まで）を産生して、３３（^-/-）、６７（^+/-）および２９野生型（^+/+）遺伝子型を産生した（図５Ｄ）。これは、標準（^+/-）×（^+/-）相互交配について予測された分離比１（^+/+）：２（^+/-）：１（^-/-）に一致する。胚の解析は、致死性がＥ１２．５辺りで起こることを示した。

Ｅ９．５−Ｅ１２．５胚の解剖解析は、ホモ接合Ｄｅａｒ^-/-欠失と関連した卵黄嚢集合脈管（yolk-sac collecting vessels）の不存在を示し（図６Ａ−Ｆ）；ヘテロ接合体Ｄｅａｒ^+/-欠失胚は正常な卵黄嚢血管形成（yolk-sac vascularizatin）示す（データは示されていない）。卵黄嚢集合脈管が存在しないすべての胚は、遺伝子型によりＤｅａｒ^-/-であり；ヘテロ接合体Ｄｅａｒ^+/-欠失胚は、Ｄｅａｒ^+/+胚から区別できない（データは示されていない）。出血性の、再吸収された胚は、Ｅ１０．５という早期にしかし主としてＥ１２．５において検出された（図６Ｄ）。Ｄｅａｒ^+/+およびＤｅａｒ^+/-胚より小さくそして顕著に青白いけれども、Ｄｅａｒ^-/-胚は、２つのサイズの表現型：第２の発育不全の表現型（図６Ｅ−Ｆ）より相対的に大きいＥ１０．５−Ｅ１２．５で検出された（図６Ａ−Ｃ）異形性（dysmorphic）表現型を示す。遺伝的変化がヌル表現型に影響を与えるがどうかを決定するために、Ｃ５７ＢＬ／６ｊ遺伝的バックグラウンドにスピードコンジェニック（speed congenics）を行い、そして戻し交配−１０匹のヌルマウスを発生させそして解析して致死性の胚範囲、卵黄嚢集合脈管の存在しないことおよびＤｅａｒ^-/-胚における両方の胚形態表現型を確めた（図６Ａ−Ｆ）。

Ｅ１０．５およびＥ１１．５において、血液充満したポンピンク心臓は、より大きな異形性Ｄｅａｒ^-/-マウスにおいて検出されたが（図６Ｂ、６Ｃ）、発育不全のＤｅａｒ^-/-マウス（図６Ｅ、Ｆ）においては明らかではなかった。Ｄｅａｒ^-/-Ｅ１０．５胚は、顕著な血液充満した背側大動脈（図６Ｇ）により特徴付けられた血管網およびＥ９．５Ｄｅａｒ^+/+胚（図６Ｇ左パネル）に特徴的な正常な特徴である頭部領域における血管を欠いている。更に、Ｅ１０．５Ｄｅａｒ^-/-胚は、血管網形成の欠如にもかかわらずポンピングする（データは示されていない）ことが観察された血液充満した心臓（図６Ｇ）への明らかな連結なしに頭部領域において組織化されていない血液充満したプールを示す。Ｅ１１．５Ｄｅａｒ^+/+胚と対照的に、Ｅ１１．５異形性タイプＤｅａｒ^-/-胚は、頭部及び尾部領域の両方における最小の且つ変化した血管網、血液充満しているが拡張した心臓及び変化した脳の発生を示す（図６Ｈ）。更に、Ｄｅａｒ^-/-およびＤｅａｒ^+/+Ｅ１１．５心臓の両方ともポンピングするが、心臓ポンピングの観察は、Ｅ１１．５Ｄｅａｒ^+/+胚における心室の明確な充満およびポンピング（データは示されていない）とは対照的に、Ｄｅａｒ^-/-胚における単一室充満および収縮を示す。Ｅ１０．５およびＥ１１．５発育不全Ｄｅａｒ^-/-胚では、最小の心臓血管発生が検出される（図６Ｅ−Ｆ）。清浄化され、固定されたＥ１１．５胚の解析において、変化した脳及び心臓発達が確認され、これは脳領域、特に終脳及び心室形成の劣った輪郭描写（delineation）を示す（図６Ｉ）。

要約すると、Ｅ１０．５およびＥ１１．５における異形性Ｄｅａｒ^-/-胚の解析は、血液充満した心臓への明らから連結なしに頭部領域における組織化されていない血液充満したプール（図６Ｇ）により代表される異常な血管形成、または頭部及び尾部領域の両方における最小の血管網および拡張した血液充満した心臓（図６Ｈ）にもかかわらず、収縮した血液充満した心臓を検出する（図６Ｇ−Ｈ）。これは、Ｅ９．５Ｄｅａｒ^+/+胚の特徴である（図６Ｇ）頭部領域における血液充満した背側大動脈及び血管により特徴付けられた顕著な血管網と対照的である。更に、固定されたＥ１１．５胚の解析は、Ｄｅａｒ^-/-胚における異常な脳および心臓発生を示す（図６Ｉ）。

マッソントリクローム染色されたＥ１０．５−Ｅ１１．５胚切片の組織学的解析は、Ｅ１０．５におけるＤｅａｒ^+/+（図７Ｂ）と比較してＤｅａｒ^-/-胚（図７Ａ）の卵黄嚢において最小の集合脈管または集合脈管が存在しないことを確認する。卵黄嚢のより小さい脈管の叢が、より少数の有核赤血球（図７Ｂ）を伴って存在する。少数を拡大する（図７Ａ）。血島が存在するが、有核赤血球の数は、Ｄｅａｒ^+/+胚（図７Ｂ）と比較してＤｅａｒ^-/-胚（図７Ａ）では減少している。Ｅ１２．５では、比較組織学的解析は、Ｄｅａｒ^+/+（図７Ｄ）と比較して異形性タイプＤｅａｒ^-/-胚（図７Ｃ）において明らかな器官発生の欠如した無定形細胞状の区域を示す。高い倍率は、血管または認識可能な肝臓組織に含まれない腹側中央部（ventral midportion）における有核赤血球の大きな区域を示す（図７Ｃ）。心臓は、Ｄｅａｒ^-/-胚では薄い壁状で、拡張しておりそして室の不十分な輪郭描写を伴っており、これは解剖学的観察（図６）を裏付ける。少数の有核赤血球を有する血管は、Ｄｅａｒ^+/+（図７Ｄ）胚と比較して、Ｄｅａｒ^-/-（図７Ｃ）において未発達であり、薄い壁でありそしてまばらであり、これは頭部領域において最も明白である。有核赤血球で満たされそして脈管周囲鞘を有する神経周囲血管を示す（図７Ｄ，Ｆ）Ｄｅａｒ^+/+胚と対照的に、未発達の薄い壁の血管が、Ｄｅａｒ^-/-のまばらな有核赤血球を有する神経周囲において検出され（図７Ｅ）、従って解剖学的解析（図６）において明白な観察された血管網欠失を裏付ける。まばらな神経周囲脈管と一致して、Ｄｅａｒ^+/+胚（図７Ｈ）と対照的に、少数の透過性毛細管のみがＤｅａｒ^-/-胚神経上皮において明らかである（図７Ｇ）。散在した有核赤血球が神経上皮において検出され（図７Ｇ）、これは可能な血管漏洩（vascular leakiness）または脈管形成（vasculogenesis）の失敗を示唆する。Ｅ１２．５Ｄｅａｒ^+/+およびＤｅａｒ^-/-胚を比較する免疫組織学的解析は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦレセプター２ｆｌｋ−１またはアンジオポエチン−１および−２発現のアップレギュレーションを検出しない（データは示されていない）。

血管欠落を更に解析するために、平滑筋細胞（ｓｍｃ）α−アクチンの免疫組織化学的染色は、Ｅ１２．５Ｄｅａｒ^-/-胚における散在した発現および胚−胎盤血管連結部における強い染色（図９Ａ−Ｆ）を示す。神経周囲血管は、Ｄｅａｒ^-/-胚におけるα−アクチン免疫染色を示すが、血管新生発芽（angiogenic sprouting）が明白な（図９Ａ−Ｆ）Ｄｅａｒ^+/+胚と対照的に最小の血管新生分枝（angiogenic-branching）を有する。より細かい組織学的解析は、Ｄｅａｒ^-/-胚におけるα−アクチン染色された単一細胞血管壁により不完全に境界を定められた散在性血島を示す（図９Ａ−Ｆ）。

マウスＤｅａｒ一過性および空間的発現パターンを調査するために、我々は、Ｄｅａｒポリペプチドを検出することが実証された抗マウスＤｅａｒ特異的抗ペプチド抗体を使用してＥ９．５−Ｅ１２．５野生型胚におけるＤｅａｒ発現を解析した（図１０）。Ｅ９．５日に、我々は、主として心臓、卵黄嚢中胚葉層および内皮、胎盤における胎仔血管内皮、背側大動脈および神経管の上衣層におけるＤｅａｒ発現を検出する（図１０Ａ）。これらの発現パターンは、Ｅ１２．５日に持続しており、その際我々は卵黄嚢血島におけるいくらかの血管芽細胞における増加した発現ならびに神経上皮の上衣層および神経周囲血管壁における更に顕著な発現（図１０Ｂ）を検出する。観察された一過性および空間的発現パターンは、Ｄｅａｒ^-/-欠失マウスで観察された血管、心臓および神経上皮表現型と一致している。

卵黄嚢における最小の血島と対照的に、我々は、Ｄｅａｒ^-/-胚において散在した血島を検出し、しかし顕著に発育不良の背側大動脈および末梢脈管構造（peripheral vasculature）を検出し、これは、血島の存在にもかかわらず一次血管形成（primary vascularization）の欠如を示唆している（図８Ａ−Ｆ）。隣接同腹子における心臓発生の解析は、Ｄｅａｒ^-/-心臓が不十分な心室形成および心臓内隆起形成を伴うことを示し（図８Ａ−Ｆ）、これは全胚の解析に関して観察された不完全な心ループ形成（図６）と一致している。

Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ遺伝的バックグラウンド（ＢＣ１０）におけるＤｅａｒ^-/-突然変異体血管及び心臓表現型は、ＶＥＧＦ^+/-欠失胚で観察された表現型に類似しているが（１８、１９）、先に報告されたＥＴ−１、ＥＴ−_ＡおよびＥＴ−_Ｂレセプターヌル胚（１０−１２，２４）ならびにＡｎｇＩＩ、ＡＴ１ａ、ＡＴ１ｂおよびＡＴ２レセプターヌル突然変異体（１４−１７）で観察された表現型とは極めて異なる。ＶＥＧＦ^+/-欠失マウス血管表現型（１８，１９）への類似性は、ＶＥＧＦおよびＤｅａｒ媒介シグナリングの両方が、血管新生および血管網発生のために必要であり、そして血島形成をモデュレーションすることを示唆する。ＶＥＧＦおよびＤｅａｒヌル突然変異の両方共、トランスフォーミング増殖因子−β１（２５）などの他の同様な血管表現型ヌル突然変異体と共に、胚致死性であるという事実は、多重経路が血管網形成に関与している−すべて必要であるが十分ではない、ことを示唆する。僅かに後のまたは重なっている範囲の胚致死性は、Ｄｅａｒ媒介経路がＶＥＧＦ媒介経路より下流にあることを示す。ＶＥＧＦ^+/-及びＤｅａｒ^+/-欠失の両方における血管網欠落および心臓発達の阻止の関連は、血管由来のシグナリングが、心臓の多重室ポンプへの複雑な発達の進行において役割を演じることを示唆する。ＥＴ−１^-/-不活性化は血管網形成を妨害しないが（１０）、Ｄｅａｒ-/-欠失が胚致死的血管網異常をもたらすという発見は、周知のＰｒｅ−ｐｒｏ−ＥＴ−１経路（２６）とは独立に産生される別のＥＴ−１ソースの存在または、Ｄｅａｒを活性化しそしてＤｅａｒ媒介血管新生の役割の基礎をなす［ＥＴ−１］様リガンドの存在を暗示する。

方法
ノーザンブロット解析
全ＲＮＡは、解析された異なる組織からのＴＲＩｚｏｌ（Invitrogen, Life technologies, Inc.,）で抽出された。次いで、ポリＡ^＋ＲＮＡを全ＲＮＡから、製造者の規定のとおりにＤｙｎａｂｅａｄｓ ｍＲＮＡ精製キット（Dynal Biotech）を使用して単離した。ポリＡ^＋ＲＮＡ（３μg）を１％ホルムアルデヒド変性アガロースゲル上に流し、Ｚｅｔａ−Ｐｒｏｂｅブロッティング膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にトランスファーしそしてＵＶ架橋して後ハイブリダイゼーションさせた。５×ＳＳＣ、２０mM Ｎａ₂ＨＰＯ₄、７％ＳＤＳ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、１００ug/ml変性された仔ウシＤＮＡを含有するバッファー中で５０℃で２４時間ハイブリダイゼーションを行った。γ−³²Ｐ−端部標識されたアンチセンスマウスＤｅａｒオリゴヌクレオチド（５’−ＡＧＴ−ＧＡＴ−ＡＧＡ−ＧＣＣ−ＣＣＡ−ＧＴＴ−ＣＣＡ−ＧＣＧ−ＡＧＡ−ＣＴＴ−ＣＡＴ−ＣＴＣ−ＣＴＴ−ＧＣ−３’）（配列番号８）をプローブとして使用した。膜を３×ＳＳＣ、５％ＳＤＳで５０℃で２回各３０分間および１ＸＸＳＳＣ、１％ＳＤＳで５０℃で３０分間順次に洗浄した。強化スクリーンにより−８０℃でオートラジオグラフィーを行った。

１２９ＳＶＪマウスＤｅａｒ遺伝子の特徴付
λＦＩＸＩＩ １２９ＳＶＪマウスゲノムライブラリーからの１００万の独立したリコンビナントを、プローブとして完全長３２７４ｂｐラットＤｅａｒ ｃＤＮＡ¹でスクリーニングした。第４ラウンドのスクリーニングの後に６つの独立したゲノムクローンを同定しそしてプラーク精製した。それらの１つ、λ１９１を更に制限消化及びその後のサザーンブロット分析により特徴付けた。１つの８kbＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩ制限フラグメント（３２７４ｂｐラットＤｅａｒ ｃＤＮＡプローブにハイブリダイゼーションした）をｐｓｐ７３プラスミドベクターにサブクローニングしそして配列決定した。

マウスにおけるＤｅａｒのターゲティングされた妨害およびキメラマウスの産生
すべての動物処置は、教示ガイドラインに従って行った。Ｄｅａｒのアミノ酸８１〜１２７を有効に欠失させるＰＧＫＮｅｏカセット（図５）でＤｅａｒの３’端部を含有する３００ｂｐピースを置換することにより、ターゲティングベクターを構築した。ターゲティングベクターを１２９ＳＶＪ ＥＳ細胞にエレクトロポレーションしそしてＧ４１８耐性細胞クローンを単離した。各ＥＳ細胞クローンからゲノムＤＮＡを得、そしてＳｐｈＩで制限しそしてサザンブロット分析に供した。Ｄｅａｒの１．５Kbフラグメントをプローブとして使用した（図５）。８Kb内在性バンドおよび５．２Kbバンドの存在は、相同性組換えを示した（図５）。相同性組換えは、ターゲティングベクターの５’−端部から１７１ｂｐ上流に位置した上流プライマー（Ｐ１：５’−ＴＧＴＧＡＧＧＣＴＡＧＡＡＧＧＣＴＧＣ−３’（配列番号９））およびＰＧＫＮｅｏカセット内に位置したリバースプライマー（Ｐ２：５’−ＧＡＧＣＡＡＧＧＴＧＡＧＡＴＧＡＣＡＧＣ−３’（配列番号１０）を使用してＰＣＲ分析により更に証明された。サザンブロット分析（図５）において使用した同じプローブにハイブリダイゼーションさせた５．５Kbフラグメントの増幅は相同性組換えを示した。次いで５つのポジティブＥＳ細胞クローンを１２９ＳＶＪ胚盤胞にマイクロインジェクションして１４のキメラマウスを発生させ、これをＤｅａｒノックアウトされた系統を樹立するために使用した。Ｃ５７ＢＬ／６遺伝的バックグラウンド上に同系交配するためのスピードコンジェニック戻し交配繁殖を１０世代より多くの世代、≧ＢＣ１０、にわたって行い、分析のためのすべてのＤｅａｒ^+/-およびＤｅａｒ^-/-マウスを得た（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドにおける＞９９．９５％コンジェニック系統）。

マウスＤｅａｒ ｃＤＮＡの特徴付けおよび発現研究
Ｃ５７ＢＬ／６マウス腎臓ポリＡ^＋ＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲ（フォワードプライマー、５’−ＣＡＣＡＣＡＡＡＧＣＣＴＴＡＣＴＴＴＡＴＣＣ−３’（配列番号１３）；リバースプライマー、５’−ＡＡＡＧＣＣＡＧＣＣＴＴＴＡＧＡＴＡＡＣＣ−３’（配列番号１４））によりマウスＤｅａｒ ｃＤＮＡを得、ＰＴ−ベクターシステム（Clontech,Palo Alto,CA）にサブクローニングし、次いで配列決定した（GenBank accession no.DQ009865）。ＰｏｌｙＡ^＋ＲＮＡ（３μg）、プローブとしてγ−³²Ｐ−端部標識されたアンチセンスマウスＤｅａｒオリゴヌクレオチド（５’−ＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＴＴＣＣＡＧＣＧＡＧＡＣＴＴＣＡＴＣＴＣＣＴＴＧＣ−３’）（配列番号１５）を使用して、記載された（１）とおりにＲＮＡブロット分析を行った。レセプター発現研究、膜への¹²⁵Ｉ−ＥＴ−１−１および¹²⁵Ｉ−ＡｎｇＩＩ結合、を記載のとおりに（２）行った。

マウス胚のジェノタイピング
胚外膜から単離されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析によりジェノタイピングを行った。Ｄｅａｒのアミノ酸コード領域内に位置したＳａｃＩ部位にフランキングするプライマー（上流プライマー：５’−ＡＡＣＴＴＣＴＣＴＧＧＴＣＣＧＣＴＣＣ−３’（配列番号１１）；下流プライマー：５’−ＡＣＴＧＣＴＧＡＡＡＣＴＡＡＡＡＣＣＴＧＣ−３’（配列番号１２））を使用して野生型アレル（ＰＣＲ産物＝野生型アレルの存在を示す１５３ｂｐ）を検出し、そしてプライマーＰ１およびＰ２（上記した）を使用して突然変異したアレル（ＰＣＲ産物＝突然変異したアレルの存在を示す５．５Kb）を検出した。

ヘテロ接合体Ｄｅａｒ ^+/- 表現型の解析
我々は、マウス腎臓膜からの等量のタンパク質（４０μg）およびマウスＤｅａｒ特異的合成ペプチド：Ｌ₁₆ＳＫＣＮＨＮＥＱＤＴＡ₂₇（配列番号１６）に対して発生させたウサギＩｇＧ抗マウスＤｅａｒ抗ペプチド特異的抗体（１：５００希釈）を使用するウエスタンブロット分析によりＤｅａｒタンパク質レベルについて戻し交雑ＢＣ１０［Ｃ５７ＢＬ／６］Ｄｅａｒ^+/-を解析して、Ｄｅａｒ特異的ポリペプチドを検出した。我々は、３００〜５００拍動／分の範囲の心拍数を有する期間にＢＰ測定を限定することにより、同等な生理学的状態を保証する軽い麻酔の下でテイルスカッフ血圧計（Visitech BP2000, Visitech CA）により６ヶ月齢マウスにおいて血圧を測定した。我々はマウス当たり３組の１０回の連続した読み取りを得、そして規定された正常な心拍数範囲内での少なくとも２０回の読み取りの平均を取った。

組織学
時間を決めた妊娠マウス（膣栓が検出される日の正午を０．５Ｅとみなす）から胚Ｅ９．５−Ｅ１２．５日に胚を収集し；胚外膜組織ＤＮＡのＰＣＲ分析により遺伝子型を決定した。胚を解析し、そしてそれらの卵黄嚢の範囲内で写真を撮り、次いで４％の調製したばかりのＰＢＳ緩衝化パラホルムアルデヒド中に固定した。組織学的処理およびマッソントリクローム染色を確立された手順に従って行った。それぞれ、Nikon立体顕微鏡およびZeis Axioskop顕微鏡を使用してディジタル立体顕微鏡写真法および明視野顕微鏡写真法を行った。本質的に記載されたとおりに（２７）、免疫組織化学を行った。

実施例３
血圧測定
ＤｅａｒＫＯおよび野生型（Ｎ１０戻し交雑世代）の雄及び雌コホートを使用してＢＰを測定した。１２匹（+/-）および１１匹（+/+）雌マウスおよび１４匹（+/-）および１４匹（+/+）雄マウスを調べた。試験は６ヶ月齢で行った。

マウスを規則的なげっ歯類食事および１２時間明／暗サイクルに維持した。測定を行う１時間前にマウスを処置室に輸送しそして落着かせた。心拍数と共に収縮期ＢＰを、プログラム可能なテイルカッフ血圧計（Visitech BP2000, Visitech, NC）により測定した。マウスを腹腔内ケタミン（８０mg／kg）およびキシラジン（１８mg／kg）で軽く麻酔しそして２分の間隔の後に加熱したプラットホーム上に置いた。マウス当たり３組の各々１０回の連続読み取りを行った。データは３００〜５００bpmの心拍数範囲に及んでマウス当たり少なくとも２０回の読み取りの平均として表される。

結果
図１０Ａに示されたとおり、ＳＢＰは、６ヶ月齢でＷＴおよびＫＯ雄マウス間で異ならなかった（ＷＴ，１３７．２±５．１；ＫＯ，１３８．６±３．７，ｔ＝０．０５，Ｐ＞０．８）。対照的に、ＳＢＰは、ＷＴ雌マウスと比較するとＫＯ雌マウスでは有意により低い（ＷＴ，１３４．９±４．０；ＫＯ，１１２．３±６．１；ｔ＝３．０３，Ｐ＜０．０１）。平均心拍数は、ＷＴ雌マウスとＫＯ雌マウス間で観察されるＳＢＰ差を断言する対比グループ（図１０Ｂ）間で差はなかった。したがって、Ｄｅａｒローカスにおけるヘテロ接合性は、雌のみに影響を与えるＢＰに関する性特異的効果を示す。この結果は、Ｄａｈｌ ラットモデルにおける食塩感受性高血圧におけるＤｅａｒ変異体の雌特異的効果を示唆している最近のデータと一致している。

実施例４
我々は、次に２つの確立されたげっ歯類腫瘍モデルにおけるＤｅａｒ阻害の役割を調べた。最初に、ヘテロ接合体Ｄｅａｒ^+/-欠失マウスおよび野生型Ｄｅａｒ^+/+同腹子を比較して、我々は、ヘテロ接合Ｄｅａｒ^+/-欠失雌（ｔ検定、Ｐ＜０．０２）マウスでＢ１６−Ｆ１０メラノーマ細胞誘導腫瘍モデル（７４）において腫瘍質量の有意な低下（図１１Ａ−Ｂ）および腫瘍容積の有意な低下（図１１Ｃ−Ｄ）を検出したが、雄マウスでは検出しなかった。第２に、効果は雌Ｄｅａｒ^+/-マウスでのみ見られたので、我々は次に、Ｄｅａｒ阻害が、３ヶ月未満の腫瘍潜伏期を有する雌ラットにおいて１３７Ｃｓ放射線誘導乳癌モデル（７０）における腫瘍増殖を減少させるかどうかを試験した。２つの独立した阻害方法、照射の４週間後に開始された抗ラットＤｅａｒ抗ペプチド特異的抗体（図１１Ｃ）および照射の２週間後に開始された抗ラットＤｅａｒＤＮＡワクチン（図１１Ｄ）、を使用して、我々は６週間の観察期間中腫瘍の増殖の有意な減少を検出する。それぞれの対照グループとは対照的に、両抗Ｄｅａｒ処置は、腫瘍増殖を阻止し、腫瘍出現の４〜６週間後から検出された腫瘍容積の％変化において有意な減少を伴った（ａｂ−Ｒｘ：Ｐ＜０．０５〜０．０１；ＤＮＡ−ｖ：Ｐ＜０．０２〜０．００１）。更に、我々は、抗ＤｅａｒＤＮＡワクチン接種したラットにおける腫瘍容積の６８％減少を伴う有意な腫瘍退縮を検出する（図１１Ｄ、Ｐ＜０．０１）。腫瘍増殖の阻害は、年齢が一致した無処置対照ラットと比較して、抗Ｄｅａｒ抗体およびＤＮＡワクチン処置したラットの両方における腫瘍パターン、核グレードおよび血管浸潤に基づく悪性潜在力の減少と関連している（図１１Ｅ）。更に、無秩序脈管およびモザイク脈管の数の減少も抗Ｄｅａｒ処置の結果として検出された。

腫瘍研究およびＤｅａｒ特異的阻害
我々は、１０週齢Ｄｅａｒ^+/-および同腹子Ｄｅａｒ^+/+雄および雌マウス（ｎ＝５／グループ）において本質的にも記載されたとおり（７４）Ｂ１６−Ｆ１０（ＡＴＣＣ）メラノーマ細胞誘導皮下腫瘍モデルを発生させた。腫瘍誘導の１３日後に、我々は腫瘍を切り出しそして腫瘍重量及び容積を測定した。我々は、４０日齢の本質的に記載された（７０）４８匹のスプレーグ−ドーリーラット（ｎ＝１２／グループ）におけるラット乳腺腫瘍を¹²⁷Ｃｓ放射能により誘導した。３ヶ月未満の腫瘍潜伏期を有するラットのみを研究のために使用した（抗Ｄｅａｒ抗ペプチド抗体ではｎ＝４；対照抗体ではｎ＝３；抗ＤｅａｒＤＮＡワクチンではｎ＝３；対照ｐＣＤＮＡではｎ＝３）。我々は照射の６週間後に１２週齢で抗体処置を開始した。我々は、合成ペプチドＰ₅₁ＬＬＴＳＬＧＳＫＥ₆₀（１）（配列番号７）に対して生じたアフィニティー精製したウサギＩｇＧ抗Ｄｅａｒ抗ペプチド抗体を使用した。対照として、我々は、ウサギＩｇＧ（sc-2027, Santa Cruz Biologicals, Santa Cruz CA）を使用した。試験および対照抗体を腫瘍出現の６週間後の研究の終わりまで毎週３回腹腔内に注射した（６μg／注射）。平行して、我々は、抗Ｄｅａｒ（pCDNA-Dear）ＤＮＡワクチンおよび対照発現ベクター（pCDNA,Invitrogen, Carlsbad, CA）模造（mock）ワクチンを使用して、８週例で照射の２週間後に試験ワクチン及び模造ＤＮＡワクチンを注射し、次いで腫瘍出現から６週間まで隔週に注射した（５００μg／用量、筋肉内）。式（４／３πｒ₁ ²×ｒ₂）（式中、ｒ₁は記載された（７１）より小さい半径でありそしてｒ₂はより大きい半径である）を使用して測定した。我々は、ｔ検定、二元反復測定分散分析（two-way repeated measures ANOVA）および統計的解析用の多重対比較のためのテューキーのポスト検定（Tukey's post test for multiple pairwise comparisons）を適切に使用した。

本明細書に記載されたすべての参考文献は、そのまま参照により本明細書に組みこまれる。

Ｄａｈｌ ＳおよびＤａｈｌ Ｒ Ｄｅａｒ変異体の分子特徴付け。（図１Ａ）Ｔ²⁸¹⁴（Ｄａｈｌ Ｓ）／Ｃ²⁸¹⁴（Ｄａｈｌ Ｒ）およびＴ²⁹⁰¹（Ｄａｈｌ Ｓ）／Ｃ²⁹⁰¹（Ｄａｈｌ Ｒ）ヌクレオチドトランジッションに及ぶＤａｈｌ ＳおよびＤａｈｌ Ｒ ｃＤＮＡｓの比較ヌクレオチド配列。対応するヌクレオチドトランジッションから生じアミノ酸置換は、Ｄａｈｌ Ｒ ＤｅａｒにおけるＰ４４によるＳ４４の置換およびＤａｈｌ Ｒ ＤｅａｒにおけるＴ７４によるＭ７４の置換（Ruiz-Opazo et al. 1998に従うアミノ酸番号付け）を検出した。（図１Ｂ）Ｄａｈｌ Ｒ Ｄｅａｒの略構造。下記の機能的ドメインは強調されている：推定ＡｎｇＩＩ結合部位、ＡｎｇＩＩ（ａａ４１〜４８）；ＥＴ−１結合部位、ＥＴ−１（ａａ６０〜６７）；それぞれＰ４４およびＴ７４によりＤａｈｌ Ｓ Ｄｅａｒにおける置換されたアミノ酸Ｓ４４およびＭ７４；潜在的ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼリン酸化部位（緑色のＳ９１、Ｔ１０８）；潜在的インターナリゼーション認識配列（ＩＲＳ）。（図１Ｃ）ウエスタンブロット分析は、雄および雌ラットから単離されたＤａｈｌ ＳおよびＤａｈｌ Ｒラット腎臓膜における同等なレベルのＤａｈｌ Ｓ（Ｓ）およびＤａｈｌ Ｒ（Ｒ）Ｄｅａｒ変異体を検出する。ＭＷ、１４．４kDa分子量マーカー。 Ｄａｈｌ ＳおよびＤａｈｌ Ｒ Ｄｅａｒ変異体の機能的特徴付け。放射能標識された¹²⁵Ｉ−ＡｎｇＩＩ（図２Ａ）および¹²⁵Ｉ−ＥＴ−１（図２Ｂ）によるＣｏｓ１細胞で発現されたＤａｈｌ Ｓ（○）およびＤａｈｌ Ｒ（●）Ｄｅａｒのリガンド結合研究の飽和結合曲線。値は、５つの独立した実験からの平均±標準偏差として表される。（図２Ｃ）Ｄａｈｌ Ｒ（Ｋｉｄ−Ｒ）およびＤａｈｌ Ｓ（Ｋｉｄ−Ｓ）腎臓（Ｋｉｄ）膜のウエスタンブロット分析（ａｂ）による１４kDa Ｄｅａｒタンパク質の検出
；トランスフェクションされていない対照Ｃｏｓ１細胞膜（Ｃｏｓ１−ｃ）、Ｄａｈｌ Ｒ Ｓ４４Ｐ／Ｍ７４Ｔ変異体を発現するＣｏｓ１細胞膜（Ｃｏｓ１−Ｒ）およびＤａｈｌ Ｓ Ｓ４４／Ｍ７４変異体を発現するＣｏｓ１細胞膜（Ｃｏｓ１−Ｓ）。¹²⁵Ｉ−ＡｎｇＩＩウエストウエスタンブロット分析（＊ＡｎｇＩＩ）は、Ｄａｈｌ Ｓ腎臓膜（Ｋｉｄ−Ｓ）およびＤａｈｌ Ｓ Ｓ４４／Ｍ７４変異体を発現するＣｏｓ１細胞膜（Ｃｏｓ１−Ｓ）にのみの結合を検出するが、¹²⁵Ｉ−ＥＴ−１ウエストウエスタンブロット分析（＊ＥＴ−１）は、Ｄａｈｌ Ｒ（Ｋｉｄ−Ｒ）およびＤａｈｌ Ｓ（Ｋｉｄ−Ｓ）腎臓膜の両方ならびにＤａｈｌ Ｒ Ｓ４４Ｐ／Ｍ７４Ｔ（Ｃｏｓ１−Ｒ）およびＤａｈｌ Ｓ Ｓ４４／Ｍ７４（Ｃｏｓ１−Ｓ）分子変異体を発現するＣｏｓ１細胞膜への結合を示す。
Ｄａｈｌ ＳおよびＤａｈｌ Ｒ Ｄｅａｒ変異体についての飽和データのスキャッチャードプロット。Ｃｏｓ１細胞に発現されたＤａｈｌ Ｓ（○）およびＤａｈｌ Ｒ（●）Ｄｅａｒの¹²⁵Ｉ−ＡｎｇＩＩ（図３Ａ）および ¹²⁵Ｉ−ＥＴ−１（図３Ｂ、図３Ｃ）飽和結合データのスキャッチャードプロット。図３Ｄ：Ｃｏｓ１細胞に発現されたマウスＤｅａｒのリガンド結合研究の飽和結合曲線。○、平均±ｓｅｍ¹²⁵Ｉ−ＥＴ−１結合；●、平均±ｓｅｍ¹²⁵Ｉ−ＡｎｇＩＩ結合。 Ｄａｈｌ ＳおよびＤａｈｌ Ｒ Ｄｅａｒ変異体についての飽和データのスキャッチャードプロット。Ｃｏｓ１細胞に発現されたＤａｈｌ Ｓ（○）およびＤａｈｌ Ｒ（●）Ｄｅａｒの¹²⁵Ｉ−ＡｎｇＩＩ（図３Ａ）および ¹²⁵Ｉ−ＥＴ−１（図３Ｂ、図３Ｃ）飽和結合データのスキャッチャードプロット。図３Ｄ：Ｃｏｓ１細胞に発現されたマウスＤｅａｒのリガンド結合研究の飽和結合曲線。○、平均±ｓｅｍ¹²⁵Ｉ−ＥＴ−１結合；●、平均±ｓｅｍ¹²⁵Ｉ−ＡｎｇＩＩ結合。 Ｄａｈｌ ＳおよびＤａｈｌ Ｒ Ｄｅａｒ変異体についての飽和データのスキャッチャードプロット。Ｃｏｓ１細胞に発現されたＤａｈｌ Ｓ（○）およびＤａｈｌ Ｒ（●）Ｄｅａｒの¹²⁵Ｉ−ＡｎｇＩＩ（図３Ａ）および ¹²⁵Ｉ−ＥＴ−１（図３Ｂ、図３Ｃ）飽和結合データのスキャッチャードプロット。図３Ｄ：Ｃｏｓ１細胞に発現されたマウスＤｅａｒのリガンド結合研究の飽和結合曲線。○、平均±ｓｅｍ¹²⁵Ｉ−ＥＴ−１結合；●、平均±ｓｅｍ¹²⁵Ｉ−ＡｎｇＩＩ結合。 Ｄａｈｌ ＳおよびＤａｈｌ Ｒ Ｄｅａｒ変異体についての飽和データのスキャッチャードプロット。Ｃｏｓ１細胞に発現されたＤａｈｌ Ｓ（○）およびＤａｈｌ Ｒ（●）Ｄｅａｒの¹²⁵Ｉ−ＡｎｇＩＩ（図３Ａ）および ¹²⁵Ｉ−ＥＴ−１（図３Ｂ、図３Ｃ）飽和結合データのスキャッチャードプロット。図３Ｄ：Ｃｏｓ１細胞に発現されたマウスＤｅａｒのリガンド結合研究の飽和結合曲線。○、平均±ｓｅｍ¹²⁵Ｉ−ＥＴ−１結合；●、平均±ｓｅｍ¹²⁵Ｉ−ＡｎｇＩＩ結合。 Ｄｅａｒ変異体の検出および遺伝的解析。 （図４Ａ）異なるラツト系統における一本鎖コンフォメーション多型（ＳＳＣＰ）解析によるＤｅａｒ遺伝子変異体の検出。Ｓ４４Ｐ置換に及ぶ１３７ｂｐＰＣＲ産物は、Ｄａｈｌ Ｒ（Ｒ）およびＬＥＷ系統におけるＳ４４Ｐ／Ｍ７４Ｔ変異体を示すが、Ｓ４４／Ｍ７４変異体はＤａｈｌ Ｓ（Ｓ）、ＢＮ、ＷＫＹおよびＳＨＲゲノムＤＮＡｓにおいて検出される。Ｆ１はＦ１［ＲｘＳ］被験体を示す。Ｍａｐ Ｍａｎａｇｅｒ ＱＴＸｂ１７プログラムを使用する雄（図４Ｂ）および雌（図４Ｃを）コホートにおける染色体２のブーツストラツプ解析によるインターバルマッピング。水平線（――）は連鎖の有意性についてのＬＲＳ値を示す。（図４Ｂ）について上から下へ：高度に有意であるでは、ＬＲＳ＝１８．４（ＬＯＤ＝４．００）、有意であるではＬＲＳ＝１０．６（ＬＯＤ＝２．３０）、示唆的であるではＬＲＳ＝４．１（ＬＯＤ＝０．８９）；（図４Ｃ）について上から下へ：高度に有意であるでは、ＬＲＳ＝１６．６（ＬＯＤ＝３．６１）、有意であるではＬＲＳ＝９．９（ＬＯＤ＝２．１５）、示唆的であるではＬＲＳ＝３．９（ＬＯＤ＝０．８５）。――尤度比統計量（likelifood ratio statistic）；――相加的効果についての回帰係数；――優性効果についての回帰係数。ヒストグラムは、検出されたＱＴＬｓについてのブーツストラップに基づく信頼区間を表す。 ターゲティングベクターのＤｅａｒ発現および略図。図５Ａは、野生型１２９ＳＶＪマウスＤｅａｒ（ＷＴアレル）、相同性組換えのためのＤｅａｒターゲティングベクター（ＫＯ構築物）および突然変異体アレルの制限マップを示す。（１）はサザンブロット分析用のプローブであり、これはターゲティングされたアレルにおける５．２kbＳｐｈＩ制限消化フラグメント（２）および野生型アレルにおける８．０kbフラグメント（３）を検出する１．５kbＳ−Ｂ制限フラグメントであり；Ｐ１（４）は組み込み部位にフランキングするフォアードプライマーであり；Ｐ２（５）はリバースｐＧＫＮｅｏ特異的プライマーであり；成功したターゲティング事象（successful targeting event）は予測された５．５kbＰ１−Ｐ２ＰＣＲ産物を生成する。ＳはＳａｃＩ制限酵素であり；ＢはＢａｍＨＩ制限酵素であり；ＮはＮｓｉｌ制限酵素である。 図５Ｂは、試験されたすべての組織におけるマウスＤｅａｒ ｍＲＮＡを腎臓および大動脈においてより高いレベルで検出するノーザンブロット分析を示す。３つの異なるサイズのＤｅａｒ ｍＲＮＡは多分異なるポリアデニル化シグナルを表している。２８Ｓおよび１８Ｓリボソームマーカーは左側に示される。Ｈ、心臓、Ｂ、脳、Ｋ、腎臓、Ｌｉ、肝臓、Ｓｐ、脾臓、Ｌｕ、肺、Ａｏ、大動脈、Ｔｅ、睾丸、Ｕｔ、子宮。 図５Ｃは、相同性組換えによるマウスにおけるＤｅａｒ不活性化の検出のためのサザンブロット分析を示す。不活性化の証拠は、野生型（^+/+）サンプルに存在しないことと比較して、ヘテロ接合体（^+/-）ＤＮＡサンプルでより低いハイブリダイゼーションバンドとして検出されたゲノムＤＮＡの予測された５．２kbＳｐｈＩ制限消化フラグメントにより特徴付けられる。 図５Ｄは、Ｅ１１．５マウス胚のＰＣＲジェノタイピングを示す。結果（下部パネル）は、野生型、Ｄｅａｒ^+/+（+/+）およびヘテロ接合体Ｄｅａｒ^+/-（+/-）において１５３ｂｐアレルを示すが、Ｄｅａｒ^-/-（-/-）胚では示さない。上部パネルは、Ｄｅａｒ^+/-およびＤｅａｒ^-/-において不活性化された（５．３５kb）アレルを示すが、Ｄｅａｒ^+/+胚では示さない。 図５Ｅは、ラットＤｅａｒ配列と比較したマウスＤｅａｒ ｃＤＮＡについての推定されたアミノ酸配列（下部配列）、Ａｂ、抗Ｄｅａｒ抗体のために使用されるペプチド配列；ＡｎｇＩＩ、アンジオテンシンＩＩ結合部位¹、ＥＴ−１、エンドセリン−１結合部位¹、ＴＭ−１、予測された膜貫通ドメイン；ＩＲＳ、インターナリゼーション認識配列；（−）、同一配列；（＊）、より良いアラインメントのための調節されたギャップ；肉太文字は非保存性アミノ酸相違を示す。 図５Ｆは、抗マウスＤｅａｒ特異的抗ペプチド抗体を使用するＤｅａｒ^+/+（+/+）およびＤｅａｒ^+/-（+/-）欠失マウス腎臓膜のウエスタンブロット分析（上部パネル）；非特異的交差反応性高分子量タンパク質の存在は、等量の分析されたタンパク質を証明する（下部パネル）。 図５Ｇ〜５Ｉ：ヘテロ接合体Ｄｅａｒ^+/-成獣マウスにおける血圧（図５Ｇ）、心拍数（図５Ｈ）および体重（図５Ｉ）の分析。Ｄｅａｒ^+/+（□）およびＤｅａｒ^+/-（■）欠失雄（Ｍ）および雌（Ｆ）マウスにおける収縮期血圧（ＳＢＰ、mmHg）および平均心拍数（bpm、拍動／分）。４〜６ヶ月（ｍ）齢の雄Ｄｅａｒ^+/+（◇）およびＤｅａｒ^+/-（◆）ならびに雌Ｄｅａｒ^+/+（○）およびＤｅａｒ^+/-（●）マウスを比較するグラム（ｇ）で表した体重。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１。 図５Ｇ〜５Ｉ：ヘテロ接合体Ｄｅａｒ^+/-成獣マウスにおける血圧（図５Ｇ）、心拍数（図５Ｈ）および体重（図５Ｉ）の分析。Ｄｅａｒ^+/+（□）およびＤｅａｒ^+/-（■）欠失雄（Ｍ）および雌（Ｆ）マウスにおける収縮期血圧（ＳＢＰ、mmHg）および平均心拍数（bpm、拍動／分）。４〜６ヶ月（ｍ）齢の雄Ｄｅａｒ^+/+（◇）およびＤｅａｒ^+/-（◆）ならびに雌Ｄｅａｒ^+/+（○）およびＤｅａｒ^+/-（●）マウスを比較するグラム（ｇ）で表した体重。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１。 図５Ｇ〜５Ｉ：ヘテロ接合体Ｄｅａｒ^+/-成獣マウスにおける血圧（図５Ｇ）、心拍数（図５Ｈ）および体重（図５Ｉ）の分析。Ｄｅａｒ^+/+（□）およびＤｅａｒ^+/-（■）欠失雄（Ｍ）および雌（Ｆ）マウスにおける収縮期血圧（ＳＢＰ、mmHg）および平均心拍数（bpm、拍動／分）。４〜６ヶ月（ｍ）齢の雄Ｄｅａｒ^+/+（◇）およびＤｅａｒ^+/-（◆）ならびに雌Ｄｅａｒ^+/+（○）およびＤｅａｒ^+/-（●）マウスを比較するグラム（ｇ）で表した体重。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１。 Ｄｅａｒ^+/+（左側）およびＤｅａｒ^-/-（右側）マウス胚の比較解剖学的解析。図６Ａは、Ｄｅａｒ^+/+（左側）において顕著な卵黄嚢集合脈管を示すが、より小さいＤｅａｒ^-/-（右側）に存在しない、隣接したＥ１２．５杯を示し：両胚はまだそれぞれ胎盤に付着している。図６Ｂは、Ｄｅａｒ^+/+において、良く発達した卵黄嚢集合脈管を示すが、Ｄｅａｒ^-/-胚には存在しない、隣接したＥ１１．５マウス胚を示す。図６Ｃは、Ｅ１０．５ Ｄｅａｒ^+/+に比較して、Ｅ１０．５Ｄｅａｒ^-/-マウス胚は、卵黄嚢集合脈管の欠如を示し；胚半透明性は、不完全な血管網、血液充満した心臓およびいくらかの頭部領域血管形成（vascularization）の検出を可能とする。図６Ｄは、暗色化した再吸収されたＤｅａｒ^-/-胚から正常なＤｅａｒ^+/+を区別する隣接したＥ１２．５マウス胚を示す。図６Ｅは、図６Ｂにおける年齢が一致したより大きい異形性ヌル表現型と比較した発育不全表現型を示すＥ１１．５ Ｄｅａｒ^-/-マウス胚を示す。図６Ｆは、図６Ｃにおける僅かにより大きいＥ１０．５異形性ヌル表現型と比較した発育不全表現型を示すＥ１０．５ Ｄｅａｒ^-/-マウス胚を示す。図６Ｇは、頭部領域における未発達の且つ異常な血管叢、隔離された血液充満した心臓（→）を有しそして血液充満した背側大動脈が検出されないＥ１０．５ Ｄｅａｒ^-/-胚（右パネル）と対照的に、顕著な血液充満した背側大動脈（▽）および心臓（→）を有する頭部領域から尾部領域までの血管網発達を示す高倍率のＥ９．５ Ｄｅａｒ^+/+（左パネル）マウス胚を示す。図６Ｈは、拡張した単一室の血液充満した心臓、最小の末梢血管網を有し、眼の色素沈着が存在せずそして異常な脳領域発達を有するＤｅａｒ^-/-胚とは対照的に、Ｄｅａｒ^+/+胚における明白な血液充満した心室およびより大きな身体全体にわたり血管網を示すマウス胚の解析を示す。図６Ｉは、特に脳領域の発達および心室形成においてＤｅａｒ^-/-胚における顕著な発達遅延を示す、図６Ｂに示された清浄化され、固定されたＥ１１．５マウス胚を示す。 マッソントリクローム染色されたマウス胚の組織学的解析を示す。図７Ａ：拡張した脈管（→）を有するが集合脈管が存在しない一次血管叢（primary vascular plexus）中にまばらな血島を示すＥ１０．５ Ｄｅａｒ^-/-卵黄嚢。図７Ｂ：大きな血島が充満した集合脈管（→）および一次血管叢を示すＥ１０．５ Ｄｅａｒ^+/+胚卵黄嚢。図７Ｃ：Ｅ１２．５ Ｄｅａｒ^-/-胚の解析は、主要脳領域の無秩序な分画（disorderly demarcation）を伴う異常な過度に入り組んだ神経上皮（abnormal hyper-convoluted neuroepithelium）を示す。中心の腹側区域（central ventral section）は、器官発生がなく、認識可能な肝臓および腸分化を伴わない。図７Ｄ：同腹子Ｅ１２．５ Ｄｅａｒ^+/+胚の解析は、Ｄｅａｒ^-/-突然変異体における異形性表現型と対照的である。顕著な器官形成：腸、肝臓、心臓、脳および背側大動脈に留意されたい。図７Ｅ：薄い壁の神経周囲脈管（→）および過度に細胞状の（hyper-cellular）神経上皮を示す高倍率のＤｅａｒ^-/-神経上皮セグメント（図７Ｃにおいて近位＊）。図７Ｆ：対照的に、血島で満たされそして相対的に厚い壁を示す神経周囲脈管（→）を示す高倍率のＤｅａｒ^+/+神経上皮セグメント（図７Ｃにおいて近位＊）。図７Ｇ：少数の有核赤血球が神経上皮内に検出されるけれども、不十分なディファレンシャルな層化（differential layering）を有する顕著な細胞性を示す高倍率のＤｅａｒ^-/-神経上皮セグメントは、透過性毛細管が存在しない（図７Ｃにおいて遠位＊）。図７Ｈ：ディファレンシャル層化及び多数の透過性毛細管（→）および有核赤血球を示す高倍率のＤｅａｒ^+/+神経上皮（図７Ｄにおいて遠位＊）。図７Ｉ〜Ｊ胎仔−胎盤連結部（fetal-placental connections）（f-pl con/xn）の解析（バー＝１６０μm）および図７Ｋ−Ｌ：Ｅ１１．５胚における胎仔−胎盤接合部（fetal-placental junctions）（f-pl jxn）は、Ｄｅａｒ^-/-における異常な血管発達および減少した胚血球（embryonic blood cells）を示す（バー＝２０μm）。 Ｄｅａｒ^+/+（+/+）（図８Ａ、８Ｃおよび８Ｅ）およびＤｅａｒ^-/-（-/-）マウス胚（図８Ｂ、８Ｄおよび８Ｆ）の組織学的解析。Ｄｅａｒ^-/-における背側大動脈（ｄａ）、脈管構造（vasc）および卵黄嚢ならびに心臓および脳の欠陥のある発達を示すマッソントリクローム染色されたＥ１１．５胚（バー＝１６０μm）。 神経周囲領域における血管新生（angio；図９Ｃ〜Ｄ）および尾部領域における血管網（vasc net；図９Ｅ〜Ｆ）の形成の境界線を定めるＥ１２．５マウス胚（embryo（図９Ａ−Ｂ）；バー＝１６０μm）の平滑筋細胞α−アクチン免疫染色は、Ｄｅａｒ^-/-胚における欠陥のある血管発達を検出する；バー＝２０μm。 野生型（+/+）Ｅ９．５およびＥ１２．５胚におけるマウスＤｅａｒ発現パターンの解析は、心臓、胚外および胚脈管構造および神経管におけるＤｅａｒ発現を検出する。ｓｃ、脊椎、ａｏ、大動脈、ｂｉ、血島；neuroepith、神経上皮；バー＝２０μm。 腫瘍増殖に対するＤｅａｒ阻害の解析。Ｄｅａｒ^+/-マウス（■）において、年齢が一致したＤｅａｒ^+/+対照マウス（□）と比較して、メラノーマ細胞で誘導された皮下腫瘍の減少した腫瘍質量（mg）（図１１Ａ）および腫瘍容積（ｍｍ³）（図１１Ｂ）が雌で観察されたが、オスでは観察されなかった。図１１Ｃ：抗ラットＤｅａｒ抗ペプチド特異的抗体処置（○）は、放射線で誘導されたラット乳癌の腫瘍容積を減少させる。図１１Ｄ：抗ラットＤｅａｒＤＮＡワクチン処置（◇）も放射線で誘導されたラット乳癌の腫瘍容積を減少させる。図１１Ｅ：モック処置された（mock-treated）（ｍｏｃｋ−Ｒｘ）ベクター対照、抗Ｄｅａｒ抗ペプチド特異的抗体処置（ａｂ−Ｒｘ）および抗ラットＤｅａｒＤＮＡワクチン（ＤＮＡ−ｖａｃ）を比較する、マッソントリクローム染色された腫瘍切片の代表的組織化学的解析は、抗Ｄｅａｒ処置された腫瘍における腫瘍パターン、マイクロ血管浸潤（Microvascular invasion）および核グレードの変化を示す；バー＝２０μm。値は、平均±ｓｅｍとして表される。＊Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１。 腫瘍増殖に対するＤｅａｒ阻害の解析。Ｄｅａｒ^+/-マウス（■）において、年齢が一致したＤｅａｒ^+/+対照マウス（□）と比較して、メラノーマ細胞で誘導された皮下腫瘍の減少した腫瘍質量（mg）（図１１Ａ）および腫瘍容積（ｍｍ³）（図１１Ｂ）が雌で観察されたが、オスでは観察されなかった。図１１Ｃ：抗ラットＤｅａｒ抗ペプチド特異的抗体処置（○）は、放射線で誘導されたラット乳癌の腫瘍容積を減少させる。図１１Ｄ：抗ラットＤｅａｒＤＮＡワクチン処置（◇）も放射線で誘導されたラット乳癌の腫瘍容積を減少させる。図１１Ｅ：モック処置された（mock-treated）（ｍｏｃｋ−Ｒｘ）ベクター対照、抗Ｄｅａｒ抗ペプチド特異的抗体処置（ａｂ−Ｒｘ）および抗ラットＤｅａｒＤＮＡワクチン（ＤＮＡ−ｖａｃ）を比較する、マッソントリクローム染色された腫瘍切片の代表的組織化学的解析は、抗Ｄｅａｒ処置された腫瘍における腫瘍パターン、マイクロ血管浸潤（Microvascular invasion）および核グレードの変化を示す；バー＝２０μm。値は、平均±ｓｅｍとして表される。＊Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１。 腫瘍増殖に対するＤｅａｒ阻害の解析。Ｄｅａｒ^+/-マウス（■）において、年齢が一致したＤｅａｒ^+/+対照マウス（□）と比較して、メラノーマ細胞で誘導された皮下腫瘍の減少した腫瘍質量（mg）（図１１Ａ）および腫瘍容積（ｍｍ³）（図１１Ｂ）が雌で観察されたが、オスでは観察されなかった。図１１Ｃ：抗ラットＤｅａｒ抗ペプチド特異的抗体処置（○）は、放射線で誘導されたラット乳癌の腫瘍容積を減少させる。図１１Ｄ：抗ラットＤｅａｒＤＮＡワクチン処置（◇）も放射線で誘導されたラット乳癌の腫瘍容積を減少させる。図１１Ｅ：モック処置された（mock-treated）（ｍｏｃｋ−Ｒｘ）ベクター対照、抗Ｄｅａｒ抗ペプチド特異的抗体処置（ａｂ−Ｒｘ）および抗ラットＤｅａｒＤＮＡワクチン（ＤＮＡ−ｖａｃ）を比較する、マッソントリクローム染色された腫瘍切片の代表的組織化学的解析は、抗Ｄｅａｒ処置された腫瘍における腫瘍パターン、マイクロ血管浸潤（Microvascular invasion）および核グレードの変化を示す；バー＝２０μm。値は、平均±ｓｅｍとして表される。＊Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１。 腫瘍増殖に対するＤｅａｒ阻害の解析。Ｄｅａｒ^+/-マウス（■）において、年齢が一致したＤｅａｒ^+/+対照マウス（□）と比較して、メラノーマ細胞で誘導された皮下腫瘍の減少した腫瘍質量（mg）（図１１Ａ）および腫瘍容積（ｍｍ³）（図１１Ｂ）が雌で観察されたが、オスでは観察されなかった。図１１Ｃ：抗ラットＤｅａｒ抗ペプチド特異的抗体処置（○）は、放射線で誘導されたラット乳癌の腫瘍容積を減少させる。図１１Ｄ：抗ラットＤｅａｒＤＮＡワクチン処置（◇）も放射線で誘導されたラット乳癌の腫瘍容積を減少させる。図１１Ｅ：モック処置された（mock-treated）（ｍｏｃｋ−Ｒｘ）ベクター対照、抗Ｄｅａｒ抗ペプチド特異的抗体処置（ａｂ−Ｒｘ）および抗ラットＤｅａｒＤＮＡワクチン（ＤＮＡ−ｖａｃ）を比較する、マッソントリクローム染色された腫瘍切片の代表的組織化学的解析は、抗Ｄｅａｒ処置された腫瘍における腫瘍パターン、マイクロ血管浸潤（Microvascular invasion）および核グレードの変化を示す；バー＝２０μm。値は、平均±ｓｅｍとして表される。＊Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１。 腫瘍増殖に対するＤｅａｒ阻害の解析。 Ｄｅａｒ^+/-マウス（■）において、年齢が一致したＤｅａｒ^+/+対照マウス（□）と比較して、メラノーマ細胞で誘導された皮下腫瘍の減少した腫瘍質量（mg）（図１１Ａ）および腫瘍容積（ｍｍ³）（図１１Ｂ）が雌で観察されたが、オスでは観察されなかった。図１１Ｃ：抗ラットＤｅａｒ抗ペプチド特異的抗体処置（○）は、放射線で誘導されたラット乳癌の腫瘍容積を減少させる。図１１Ｄ：抗ラットＤｅａｒＤＮＡワクチン処置（◇）も放射線で誘導されたラット乳癌の腫瘍容積を減少させる。図１１Ｅ：モック処置された（mock-treated）（ｍｏｃｋ−Ｒｘ）ベクター対照、抗Ｄｅａｒ抗ペプチド特異的抗体処置（ａｂ−Ｒｘ）および抗ラットＤｅａｒＤＮＡワクチン（ＤＮＡ−ｖａｃ）を比較する、マッソントリクローム染色された腫瘍切片の代表的組織化学的解析は、抗Ｄｅａｒ処置された腫瘍における腫瘍パターン、マイクロ血管浸潤（Microvascular invasion）および核グレードの変化を示す；バー＝２０μm。値は、平均±ｓｅｍとして表される。＊Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１。

Claims (10)

1. エンドセリン−１／アンジオテンシンＩＩ二重レセプター（Ｄｅａｒ）に結合し、そしてＥＴ−１リガンドの結合を阻止する、抗Ｄｅａｒ抗体または抗体フラグメントを含む、個体における血管新生を阻害するための医薬。
2. 抗体または抗体フラグメントが、ヒト化抗体またはヒト化抗体フラグメントである、請求項１に記載の医薬。
3. 血管新生は、免疫および非免疫炎症、慢性関節リューマチ、乾癬、糖尿病性網膜症、血管新生緑内症、再発狭窄症、黄班変性、アテローム性動脈硬化プラークにおける毛細管増殖、骨粗鬆症、癌、充実性腫瘍、充実性腫瘍転移、血管線維腫、水晶体後方線維増殖症、血管腫およびカポジ肉腫からなる群より選ばれる疾患または障害と関連している、請求項１に記載の医薬。
4. 抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬。
5. 血管新生が、癌と関連している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬。
6. 癌が、充実性腫瘍である、請求項５に記載の医薬。
7. 癌が、充実性腫瘍転移である、請求項５に記載の医薬。
8. 血管新生が、血管線維腫と関連している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬。
9. 血管新生が、血管腫と関連している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬。
10. 血管新生が、カポジ肉腫と関連している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬。