CN107602690A - 肺动脉高压相关的ptgis基因突变及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了肺动脉高压相关的PTGIS基因突变及其应用，涉及肺动脉高压疾病领域。本发明通过全基因组测序，发现PTGIS基因上存在3种与肺动脉高压紧密相关的PTGIS罕见变异，分别是c.755G>A、c.1339G>A以及位于内含子‑外显子剪接位点的g.23867G>A。该发现一方面有助于解释肺动脉高压患者的病因，另一方面可将具有上述突变位点的突变型PTGIS基因以及相应的突变型PTGIS蛋白作为肺动脉高压的生物标志物，用于评估患者患肺动脉高压的风险；或者用于孕前预警指示该PTGIS突变基因携带者的后代患有肺动脉高压的风险；也可以上述变异位点作为靶点，为治疗肺动脉高压提供一种全新的思路和手段。

Description

肺动脉高压相关的PTGIS基因突变及其应用

技术领域

本发明涉及肺动脉高压疾病领域，具体而言，涉及肺动脉高压相关的PTGIS基因突变及其应用。

背景技术

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)是一类以肺动脉压力进行性升高、肺血管阻力逐渐增加为主要特征的心血管疾病，最终导致右心衰竭及死亡。PAH可以在任何年龄发病，症状隐匿，诊断棘手。PAH的病理机制很不清楚，患者预后恶劣，中位生存时间仅为2.8年，5年生存率仅为21％。PAH已经成为我国重要的公共健康问题，给社会和家庭带来沉重的负担。

遗传变异是影响PAH发生的重要因素。目前已经发现7个PAH致病基因，分别是骨形成蛋白受体2(Bone Morphogenetic Protein Receptor 2，BMPR2)、骨形成蛋白受体1B(BMPR1B)、Smad蛋白9(SMAD9)、小窝蛋白1(CAV1)、钾离子通道蛋白3(KCNK3)、活化素受体类激酶1(ACVRL1/ALK1)、血管细胞粘附分子(Endoglin，ENG)。BMPR2是目前已知最主要的肺动脉高压致病基因。西方人群中，约有20％-40％的特发性肺动脉高压(IPAH)携带BMPR2突变(Am J Respir Crit Care Med,2010,181(8):851-861)。中国人群，IPAH携带BMPR2的突变比例为15％(The European respiratory journal 2012:39(3):597-603)。另外的6个基因(ALK1、ENG和BMPR1B、SMAD9、CAV1、KCNK3)在患者中突变频率较低，总共可以解释约3％-5％的IPAH患者病因。

遗传变异与PAH临床表型、预后及药物治疗反应密切相关。以BMPR2基因为例，携带BMPR2基因突变的PAH患者与不携带突变的患者相比，血流运动学状态更差(平均肺动脉压高、心指数低、肺血管阻力大、混合静脉氧饱和度低)，从确诊到死亡或者肺移植的时间更短(Circulation Cardiovascular genetics 2012:5(5):511-518，American journal ofrespiratory and critical care medicine 2008:177(12):1377-1383)。基因突变也影响了患者的治疗效果和反应。无论是成人还是儿童，BMPR2突变携带者对于急性肺血管扩张试验的阳性比例均显著低于无突变患者，对钙离子通道抑制剂的治疗反应性更差(Circulation 2006:113(21):2509-2515)。

鉴于遗传变异在肺动脉高压发生发展中的重要作用，目前多个国际指南已经明确建议对PAH患者进行基因检测。遗传检测可以协助临床明确病因，为患者疾病诊断、危险分层提供重要支持。致病性遗传变异也是临床治疗的理想靶点。但是，现已知的致病基因远解释全部PAH患者的遗传病因，60％-80％的IPAH患者的病因完全未知。

因此，发现更多新的PAH致病基因和修饰基因，明确致病性遗传变异位点功能，是进行遗传检测、研发全新的靶向治疗药物的前提，对于扩大认知范围、加深对PAH遗传机制的认识至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肺动脉高压的生物标志物。

本发明的另一目的在于提供一种检测上述肺动脉高压的生物标志物的试剂。

本发明的另一目的在于提供一种检测上述肺动脉高压的生物标志物的试剂盒。

本发明的另一目的在于提供一种筛选用于治疗或预防肺动脉高压的药物的方法。

本发明的另一目的在于提供一种用于治疗或预防肺动脉高压的药物。

本发明的另一目的在于提供一种用于检测肺动脉高压的基因芯片。

本发明的另一目的在于提供一种患肺动脉高压风险的评估方法。

本发明的另一目的在于提供一种治疗肺动脉高压的方法。

本发明是这样实现的：

一种肺动脉高压的生物标志物，其包括：突变型PTGIS基因或突变型PTGIS蛋白；

其中，突变型PTGIS基因相对于野生型PTGIS基因具有以下突变位点中的任意一种：c.755G>A以及c.1339G>A，或者，突变型PTGIS基因相对于野生型PTGIS基因的基因组序列具有g.23867G>A突变；

其中，突变型PTGIS蛋白相对于野生型PTGIS蛋白具有以下突变位点中的任意一种：R252Q和A447T；

野生型PTGIS基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示，野生型PTGIS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，野生型PTGIS基因的基因组序列如SEQ ID NO.9所示。

检测上述肺动脉高压的生物标志物的试剂。

一种检测上述肺动脉高压的生物标志物的试剂盒，其包括上述的试剂。

一种筛选用于治疗或预防肺动脉高压的药物的方法，其包括：

将能够表达突变型PTGIS基因的第一生物样品置于存在候选药物的条件下培养；

将能够表达突变型PTGIS基因的第二生物样品置于不存在候选药物的条件下培养；

检测第一生物样品和第二生物样品中的6-keto PGF 1α表达水平；

如果第一生物样品的6-keto PGF 1α表达水平高于第二生物样品，则指示该候选药物可作为用于治疗或预防肺动脉高压的药物；

其中，突变型PTGIS基因相对于SEQ ID NO.1所示的野生型PTGIS基因的编码序列具有以下突变位点中的任意一种：c.755G>A以及c.1339G>A，或者，突变型PTGIS基因相对于SEQ ID NO.9所示的野生型PTGIS基因的基因组序列具有g.23867G>A突变。

一种用于治疗或预防肺动脉高压的药物，上述药物以患有肺动脉高压患者体内的突变型PTGIS基因或突变型PTGIS蛋白为靶点；

其中，突变型PTGIS基因相对于野生型PTGIS基因的编码序列具有以下突变位点中的任意一种：c.755G>A以及c.1339G>A，或者，突变型PTGIS基因相对于野生型PTGIS基因的基因组序列具有g.23867G>A突变；

其中，突变型PTGIS蛋白相对于野生型PTGIS蛋白具有以下突变位点中的一种或两种：R252Q和A447T；

野生型PTGIS基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示，野生型PTGIS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2，野生型PTGIS基因的基因组序列如SEQ ID NO.9所示。

一种用于检测肺动脉高压的基因芯片，上述基因芯片上含有与突变型PTGIS基因cDNA序列特异性结合的探针，突变型PTGIS基因相对于野生型PTGIS基因具有以下突变位点中的任意一种：c.755G>A以及c.1339G>A，或者，突变型PTGIS基因相对于野生型PTGIS基因的基因组序列具有G23867A突变；上述探针与突变型PTGIS基因特异性结合的区域涵盖选自以下位置中的任意一种：相对于野生型PTGIS基因的基因组序列23867位，相对于野生型PTGIS基因的编码序列的第755位以及第1339位；野生型PTGIS基因的编码序列如SEQ IDNO.1所示，野生型PTGIS基因的基因组序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明具有以下有益效果：

本发明通过全基因组测序，发现PTGIS基因上存在3种与PAH紧密相关的PTGIS罕见变异，分别是c.755G>A、c.1339G>A以及位于内含子-外显子剪接位点的g.23867G>A。本发明的结果一方面有助于解释肺动脉高压患者的病因，另一方面可将具有上述突变位点的突变型PTGIS基因以及相应的突变型PTGIS蛋白作为肺动脉高压的生物标志物，用于评估患者患肺动脉高压的风险；或者用于孕前预警，指示该突变型PTGIS基因携带者的后代患有肺动脉高压的风险；此外，本发明提供的筛选用于治疗或预防肺动脉高压的药物的方法和用于治疗或预防肺动脉高压的药物均以上变异位点为靶点，这为治疗或预防肺动脉高压提供了一种全新的思路和手段。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1提供的三种与PAH紧密相关的罕见变异对应与基因组序列上的位置的结构模式图；

图2为本发明实施例1提供的人PTGIS基因以及人PTGIS蛋白与其他物种的PTGIS基因和PTGIS蛋白的部分同源对比分析结果；

图3为本发明实施例2提供的分别对三名携带PTGIS基因突变患者的部分测序结果；

图4为本发明实施例3提供的PTGIS在PAH大鼠模型中的表达水平结果；

图5位本发明实施例4提供的p.R252Q和p.A447T变异影响PTGIS酶的功能验证结果；

图6为本发明实施例5提供的g.23867G>A变异影响PTGIS基因表达的功能验证结果；

图7为突变位点c.755G>A对应于基因组序列上的位置；

图8为突变位点c.1339G>A对应于基因组序列上的位置；

图9为突变位点g.23867G>A对应于基因组序列上的位置。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的肺动脉高压相关的PTGIS基因突变及其应用进行具体说明。

本发明以230例不携带BMPR2突变的IPAH患者和1920名健康对照进行研究。首先，利用全基因组测序的方法对42例IPAH患者测序，发现PTGIS基因的遗传变异在PAH患者中富集(enrichment)。进一步的，在全部230例IPAH患者和1920名健康对照中，对PTGIS基因进行检测，验证了PTGIS基因变异即g.23867G>A、c.755G>A以及c.1339G>A与PAH发病风险高度相关。

随后，对发现的上述三个变异(g.23867G>A，c.755G>A以及c.1339G>A)进行了功能学实验，证实剪接位点的突变g.23867G>A影响了基因转录，两个错义突变即c.755G>A和c.1339G>A影响了PTGIS蛋白功能，确定了PTGIS遗传变异位点的致病性。总体上，本发明确认了PTGIS是一个全新的PAH遗传易感基因，并提供了检测PTGIS基因突变的试剂盒及应用，将PTGIS基因与PAH药物治疗联系起来，为PAH的药物研发提供了新的靶点。

基于此，第一方面，本发明提供了一种肺动脉高压的生物标志物，其包括：突变型PTGIS基因或突变型PTGIS蛋白；其中，突变型PTGIS基因相对于野生型PTGIS基因具有以下突变位点中的任意一种：c.755G>A以及c.1339G>A，或者，突变型PTGIS基因相对于野生型PTGIS基因的基因组序列具有g.23867G>A突变；其中，突变型PTGIS蛋白相对于野生型PTGIS蛋白具有以下突变位点中的一种或两种：R252Q和A447T。野生型PTGIS基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示，野生型PTGIS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，野生型PTGIS基因的基因组序列如SEQ ID NO.9所示。

基因突变c.755G>A理解为：与SEQ ID NO.1所示的野生型PTGIS基因的编码序列相比，突变型PTGIS基因的编码序列在第755位由碱基G突变为碱基A；该突变位置对应于染色体上的位置为chr20:48140495-48140895，对应的基因组序列上的位置如图7下划线所示，rs号为rs759344518。

基因突变c.1339G>A理解为：与SEQ ID NO.1所示的野生型PTGIS基因的编码序列相比，突变型PTGIS基因的编码序列在第1339位由碱基G突变为碱基A；该突变位置对应的rs编号为rs146531327，其在对应的基因组序列上的位置如图8中下划线所示。

基因突变g.23867G>A理解为：相对于SEQ ID NO.9所示的野生型PTGIS基因全基因组序列第23867位，由碱基G突变为A。该位置对应于野生型PTGIS基因的编码序列的位置，是第4号内含子的第一个核苷酸(c.521+1G>A)该突变位点对应在基因组序列上的位置如图9中下划线所示，该突变位置对应于染色体上的位置为chr20:48160841。需要说明的是，SEQID NO.9所示的是野生型PTGIS基因全基因组序列第1-23880位的序列，野生型PTGIS基因全基因组序列全长64297bp，第23880-64297位的序列可通过NCBI数据库中查询。蛋白突变R252Q理解为：与SEQ ID NO.2所示的野生型PTGIS蛋白相比，突变型PTGIS蛋白的氨基酸序列在第252位由氨基酸残基R突变为氨基酸残基Q；蛋白突变A447T理解为：与SEQ ID NO.2所示的野生型PTGIS蛋白相比，突变型PTGIS蛋白的氨基酸序列在第447位由氨基酸残基A突变为氨基酸残基T。

本发明第一方面提供的突变型PTGIS基因或其相应的突变型PTGIS蛋白可作为一种全新的肺动脉高压的生物标志物，可用于评估患者患肺动脉高压的风险；或者用于孕前预警，指示突变型PTGIS基因携带者后代患有肺动脉高压的风险。

第二方面，本发明提供了检测上述肺动脉高压的生物标志物的试剂。

进一步地，在本发明本方面的一些实施方案中，上述试剂含有用于检测上述突变型PTGIS基因的引物对。进一步地，在本发明本方面的一些实施方案中，上述引物对选自如下的一组或两组：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；以及SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。进一步地，在本发明本方面的一些实施方案中，上述试剂含有用于检测突变型PTGIS蛋白的特异性抗体。

第三方面，本发明提供了一种检测上述肺动脉高压的生物标志物的试剂盒，其包括本发明第二方面的试剂。

第四方面，本发明提供了一种筛选用于治疗或预防肺动脉高压的药物的方法，其包括：

将能够表达突变型PTGIS基因的第一生物样品置于存在候选药物的条件下培养；

将能够表达突变型PTGIS基因的第二生物样品置于不存在候选药物的条件下培养；

检测第一生物样品和第二生物样品中的6-keto PGF 1α表达水平；如果第一生物样品的6-keto PGF 1α表达水平高于第二生物样品，则指示候选药物可作为用于治疗或预防肺动脉高压的药物；其中，突变型PTGIS基因相对于SEQ ID NO.1所示的野生型PTGIS基因的编码序列具有以下突变位点中的任意一种：c.755G>A以及c.1339G>A，或者，突变型PTGIS基因相对于SEQ ID NO.9所示的野生型PTGIS基因的基因组序列具有g.23867G>A突变。

进一步地，在本发明本方面一些实施方案中，上述生物样品为肺微血管内皮细胞。当然，肺微血管内皮细胞可以是人肺微血管内皮细胞或者是鼠肺微血管内皮细胞，或者是其他哺乳动物的肺微血管内皮细胞。

第五方面，本发明提供了一种用于治疗或预防肺动脉高压的药物，该药物以患有肺动脉高压患者体内的突变型PTGIS基因或突变型PTGIS蛋白为靶点；

其中，突变型PTGIS基因相对于野生型PTGIS基因的编码序列具有以下突变位点中的任意一种：c.755G>A以及c.1339G>A，或者，突变型PTGIS基因相对于野生型PTGIS基因的基因组序列具有g.23867G>A突变；其中，突变型PTGIS蛋白相对于野生型PTGIS蛋白具有以下突变位点中的一种或两种：R252Q和A447T；野生型PTGIS基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示，野生型PTGIS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，野生型PTGIS基因的基因组序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明提供的筛选用于治疗或预防肺动脉高压的药物的方法和用于治疗或预防肺动脉高压的药物均以上变异位点为靶点，这为治疗或预防肺动脉高压提供了一种全新的思路和手段。

第六方面，本发明提供了一种用于检测肺动脉高压的基因芯片，该基因芯片上含有与突变型PTGIS基因cDNA序列特异性结合的探针，突变型PTGIS基因相对于野生型PTGIS基因具有以下突变位点中的任意一种：c.755G>A以及c.1339G>A，或者，突变型PTGIS基因相对于野生型PTGIS基因的基因组序列具有g.23867G>A突变；

探针与突变型PTGIS基因特异性结合的区域涵盖选自以下位置中的任意一种：相对于野生型PTGIS基因的基因组序列23867位，相对于野生型PTGIS基因的编码序列的第755位以及第1339位；野生型PTGIS基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示，野生型PTGIS基因的基因组序列如SEQ ID NO.9所示。

第七方面，本发明提供了一种患肺动脉高压风险的评估方法，其包括：检测来自主体的生物样品中的待测PTGIS基因的编码序列相对于野生型PTGIS基因的编码序列是否存在以下突变中的任意一种：c.755G>A以及c.1339G>A，或者检测来自主体的生物样品中的待测PTGIS基因的基因组序列相对于野生型PTGIS基因的基因组序列是否存在g.23867G>A突变；如果检测结果显示待测PTGIS基因的编码序列存在c.755G>A以及c.1339G>A中任意一种突变，或者是待测PTGIS基因的基因组序列存在g.23867G>A突变，则指示主体患肺动脉高压的风险高于携带正常PTGIS基因的主体。其中，野生型PTGIS基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示，野生型PTGIS基因的基因组序列如SEQ ID NO.9所示。

需要说明的是，生物样品可以是包括但不限于来自主体任意部位的生物样品，例如可以是组织型样本如头发、细胞组织、指甲以及骨组织等；也可以是液体型样本如血液、尿液、唾液、黏液以及精液等。

另外，检测的方法包括但不限于：毛细管电泳-限制性片段长度多态性分析技术、RNase法、PCR技术、单链构象异构多态分析技术(SSCP)、RNA单链构象多态性检测技术(PCR-rSSCP)、双脱氧测序单链片段构象多态性分析技术(PCR-ddF)、限制性内切酶指纹技术(PCR-REF)、限制性片段长度多态性分析技术(RFLP)、PCR-寡核苷酸探针斑点杂交技术(PCR-ASb)、异质性双链构象多态性分析技术(HTX)以及基因芯片技术等。

进一步地，在本发明本方面一些实施方案中，主体为人。

第八方面，本发明提供了一种治疗肺动脉高压的方法，其包括：向患有肺动脉高压的患者施用以突变型PTGIS基因或突变型PTGIS蛋白为靶点的药物；

其中，突变型PTGIS基因的编码序列相对于野生型PTGIS基因的编码序列具有以下突变位点中的任意一种：c.755G>A以及c.1339G>A，或者，突变型PTGIS基因的基因组序列相对于野生型PTGIS基因的基因组序列具有g.23867G>A突变；其中，突变型PTGIS蛋白相对于野生型PTGIS蛋白具有以下突变位点中的一种或两种：R252Q和A447T。野生型PTGIS基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示，野生型PTGIS基因的基因组序列如SEQ ID NO.9所示，野生型PTGIS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

研究人群

患者组：从同济大学附属上海市肺科医院和中国医学科学院阜外医院入选肺动脉高压患者。所有患者均接受右心导管检查，PAH的诊断标准为：休息时平均肺动脉压(mPAP)≥25mm Hg并且肺毛细血管楔压(PCWP)≤15mm Hg和肺血管阻力(PVR)>3单位。排除所有已知引起PAH的继发因素后，病人确诊为特发性PAH。用Snager测序法检测BMPR2基因的点突变，用多重连接探针扩增技术法检测BMPR2大片段重排，排除所有携带BMPR2基因突变的患者，最终入选230名不携带BMPR2突变的IPAH患者。将230名患者分为两个“发现(discovery)”和“验证(validation)”两个队列，其中发现队列包括42个患者，验证队列包括188个患者。

对照组：从首都医科大学附属北京世纪坛医院体检中心入选460例健康对照，从诺禾致源公司的内部数据库入选508例健康对照，共计968例对照。患者组和对照组均为中国汉族人，且无血缘关系。从患者和对照的外周血白细胞提取基因组DNA。

研究方法：

发现队列包含42个IPAH患者，使用Illumina HiSeq X系统进行全基因组测序(Whole genome sequencing)，在全基因组范围内检测罕见变异。入选位于外显子区或外显子-内含子剪接区、影响蛋白编码、经生物信息学软件预测有害、等位基因频率极低(MAF<0.5％)的罕见变异，评测特定基因上罕见变异在42个患者中的聚集程度，得到可能与PAH存在潜在关联的新的遗传易感基因。

验证队列包含188名IPAH患者，用Sanger法测序验证潜在易感基因PTGIS的遗传变异。对北京世纪坛医院体检中心入选的460例健康对照，用Sanger法测序验证PTGIS的遗传变异。对诺禾致源内部数据库的508例对照，用全外显子测序检测PTGIS的遗传变异。用卡方检验比较患者和正常对照之间的基因型频率差异，验证并确定遗传变异的危害性，计算危险等位基因的相对危险度(Odds ratio，OR)和95％可信区间。

结果如下：

1PTGIS基因三个罕见变异位点与IPAH紧密相关。

42个IPAH患者经过全基因组测序(WGS)，平均每人产生117.3GB的原始数据，平均测序覆盖率为99.2％，平均测序深度是38.9。由于IPAH是一种由罕见变异引起的罕见遗传性疾病，因此本发明主要关注位于外显子、功能上可能有害的罕见变异。从42个患者中，共发现了分布在1772个候选基因上的1986个罕见变异。这些候选基因中，只有15个基因的变异在42个患者出现次数≥3。

用公共基因组数据库(GeneCards，PubMed，OMIM)对初步纳入的基因做进一步的生物信息功能注释，发现前列环素合酶(PTGIS)是15个基因中唯一在肺表达且和PAH有密切关联的基因。因此，在后续研究中，将PTGIS作为重点研究对象。

在全部230例IPAH患者和968名健康对照中，共发现了3种与PAH紧密相关的PTGIS罕见变异，具体见表1，这三种突变包括：相对于正常的PTGIS基因的编码序列(SEQ IDNO.1)的c.755G>A和c.1339G>A两种突变，以及相对于正常的PTGIS基因的基因组序列(SEQID NO.9)的g.23867G>A突变。

表1 PTGIS突变显著增加PAH发病风险

其中，(1)g.23867G>A是内含子-外显子剪接位点突变，1名患者携带，正常对照中无一人携带。

(2)c.755G>A是外显子错义突变，危险等位基因A在PAH患者中的频率显著高于正常对照(2.2％vs0.2％)，使发生PAH的相对风险升高10.7倍(95％CI，2.1-55.7，P＝0.00043)。

该位点的基因突变导致PTGIS蛋白(SEQ ID NO.2)发生p.R252Q突变。

(3)c.1339G>A是外显子错义突变，危险等位基因A在PAH患者中的频率显著高于正常对照(3.5％vs 0.6％)，使发生PAH的相对风险升高5.8倍(95％CI，2.0-16.8，P＝2E-4)。

该位点的基因突变导致PTGIS蛋白(SEQ ID NO.2)发生p.A447T突变。

(4)总体基因水平，PTGIS基因上三个罕见变异的频率在IPAH患者显著高于对照(6.1％vs 0.8％)，使发生PAH的相对风险升7.8倍(95％CI，3.2-18.8，P＝9.2E-8)。

2上述三个突变位点在基因组序列上发生的位置见图1，由图1可知，在基因组序列上，PTGIS基因有10个外显子，变异g.23867G>A发生在内含子-外显子4剪接位点，对应于PTGIS基因的基因组序列SEQ ID NO.9上的第23687位；变异c.755G>A的位置对应于基因组序列上rs759344518位点，对应于PTGIS基因的编码序列SEQ ID NO.1的第755位；变异c.1339G>A的位置对应于基因组序列上rs146531327位点，对应于PTGIS基因的编码序列SEQID NO.1的第1339位。其中，c.755G>A和c.1339G>A两种突变发生在PTGIS基因的外显子上，可在SEQ ID NO.1编码序列上体现。

3经同源对比分析，结果图2所示(图中：human代表人、chimpanzee代表黑猩猩、mouse代表小鼠、rat代表大鼠、dog代表狗)，剪接位点变异g.23867G>A位于核苷酸保守区，两个错义突变R252Q和A447T均位于蛋白保守区域。

实施例2

采用Sanger测序的方法，检测PTGIS基因的三个突变位点。

1试剂：(1)人血基因组DNA纯化试剂盒DP318-02(天根生化科技，北京，中国)；(2)10％SDS：10.0g SDS溶于90ml水中，调pH7.2，加水定容至100ml；(3)TE：10mM Tris-HCl(pH8.0),1mM EDTA-Na2(pH 8.0)；(4)50X TAE电泳缓冲液：242.0g Tris-HCl，27.5ml冰乙酸，100ml 0.5mM EDTA-Na2，终体积1L；(5)制性内切酶均购自美国New England Biolabs公司；(6)有引物均购自北京奥科生物公司。

2仪器及设备：(1)PCR仪：DNA engine美国Bio-Rad公司；(2)冷冻离心机：RC-5C美国SORVALL公司；(3)天平：JA5003上海天平仪器厂；(4)凝胶电泳槽：北京六一仪器厂。

3操作步骤：

3.1使用血基因组DNA纯化试剂盒(DP318-02)从4ml外周血中提取基因组DNA，所有步骤均按照说明书进行。

3.2聚合酶链式反应－Sanger测序法对上述三个罕见变异进行基因分型，具体如下：

3.2.1 PCR扩增目的片段：对BMP9基因的两个外显子区域进行PCR扩增的引物及产物长度见表2。

表2检测PTGIS罕见变异位点的PCR引物

PCR反应体系如下：

选用相应引物对即可分别扩增出含有上述变异位点的产物。

PCR反应条件如下：

步骤	温度(℃)	时间
			1	94.0	5min
2	94.0	30s
			3	60.0	30s
4	72.0	30s(返回第二步，重复35个循环)
			5	72.0	10min
6	4.0	终止反应

3.2.2对得到的PCR扩增产物进行Sanger测序，结果如图3所示。

图3的结果显示(图中箭头所指为突变位点)，分别携带g.23867G>A、c.755G>A以及c.1339G>A变异的患者均为杂合型。

实施例3

动物模型实验，在PAH大鼠模型中PTGIS表达水平研究。

用两个PAH大鼠模型(野百合碱(MCT)和缺氧)来研究PTGIS的表达和肺血管重构之间的关系，以正常大鼠作为对照，检测平均肺动脉压、右室肥厚指数以及PTGIS mRNA表达水平，结果如图4所示(图中：A为平均肺动脉压(mPAP)在缺氧和MCT模型大鼠中的变化(n＝4-10)；B为右室肥厚指数在缺氧和MCT模型大鼠中的变化(n＝4-10)；C为RT-PCR检测PTGIS基因mRNA在缺氧和MCT大鼠肺组织的表达水平(n＝3-4)；图中，“***”表示P<0.001，差异极显著；“**”表示P<0.01，差异显著)。

图4-A显示，与对照组相比，平均肺动脉压力在MCT大鼠和缺氧大鼠分别上升了60％和116％；

图4-B显示，与对照组相比，RV/(LV+S)在缺氧和MCT大鼠分别增加了84％和77％(***P<0.001,**P<0.01，独立样本t检验)；

图4-C显示，与对照组比较，PTGIS mRNA表达水平在缺氧大鼠肺组织下降41％(P＜0.05)，在MCT大鼠肺组织下降50％(P＜0.05)；

上述结果提示PTGIS表达下降与PAH发病密切相关。

实施例4

细胞学实验验证p.R252Q和p.A447T变异影响PTGIS酶的正常功能。

PTGIS编码P450超家族蛋白酶，是合成PGI2代谢途径通路上的关键酶。为了探究上述的两个变异(p.R252Q和p.A447T变异)引起的两个单氨基酸替换对PTGIS功能的影响，本实施例分别构建了野生型(WT)和两种可表达具有R252Q或A447T突变位点的突变型质粒(c.755G>A：p.R252Q和c.1339G>A：p.A447T)，并用构建的质粒瞬时转染人肺微血管内皮细胞(PMECS)。在用免疫印迹实验确定构建质粒成功转入PMECS后，进一步测量PGI2稳定的代谢产物6-keto PGF 1α水平来评估突变对酶活性的影响。

3.1突变型质粒的构建：人工合成人源PTGIS基因cDNA(1503bp，SEQ ID NO.1)并且亚克隆到质粒pCMV HA SalI/KpnI位点。通过定点诱导突变试剂盒(Stratagene,La Jolla,CA,USA)构建出两种突变型质粒(c.755G>A：p.R252Q和c.1339G>A：p.A447T)。对野生型和突变型质粒测序，确保质粒完整以及位点突变正确。

3.2转染：使用Lipofectamine 3000转染试剂(Invitrogen)，将4种质粒(空载体(CTRL)，野生型质粒(WT)和两种突变质粒(R252Q和A447T))转染人肺微血管内皮细胞(PMEC)。

3.3检测：转染质粒24h后，分别在常氧环境(20％氧浓度)和缺氧环境(1％氧浓度)，用含10μL花生四烯酸(Sigma,USA)的1％培养基(1％胎牛血清和青霉素/链霉素)处理PMECs，24h后检测6-keto-PGF1α水平。

3.4结果如图5所示，图中：A为采用蛋白印迹检测PMECs转染野生型和突变型质粒48h后的PTGIS蛋白表达结果，其中，Ctrl代表空载体作为阴性对照，GAPDH作为内参；B为PMECS转染野生和突变质粒，经花生四烯酸处理24小时后收取的细胞上清中的PGI2稳定产物6-keto PGF 1α的表达水平，其中，Normoxia表示常氧条件，Hypoxia表示缺氧条件；所有实验均独立重复三次。独立样本t检验。误差条用平均值±标准误表示。

图5-A的结果显示，野生型和突变型质粒成功转染PMECs，在PMECs中能够正常表达PTGIS蛋白，野生型和突变型蛋白表达水平没有显著差异；

图5-B的结果显示，野生型质粒(WT)上清中6-keto PGF 1α的水平明显高于空载体组(常氧：1441.8pg/ml vs 29.4pg/ml，P＜0.0001；缺氧：1107.5pg/ml vs 17.3pg/ml，P＜0.001)。PMECS转染两突变体质粒(R252Q和A447T)后，上清中6-keto PGF 1α的水平明显低于野生型质粒组(P＜0.001)。

R252Q突变在常氧条件下使上清6-keto PGF 1α下降43％(P＜0.001)，缺氧条件下下降33％(P＜0.001)。A447T突变在常氧和缺氧条件下使6-keto PGF 1α水平分别下降50％(P＜0.001)和34％(P＜0.001)。

上述结果说明，p.R252Q和p.A447T两种变异均能够影响PTGIS酶的正常功能，导致发生PAH。

实施例5

Minigene实验验证PTGIS基因剪接位点突变(g.23867G>A)功能

方法：用引物对ptgis-infu-ex3-f：5’-aagaagtgcaggatccagtcctagtcctgccacttctc-3’和ptgis-infu-ex5-r：5’-tcaaaacaagacgcgttctgggtctttccatcctcc-3’，从携带PTGIS基因g.23867G>A杂合突变的患者基因组中扩增DNA片段。该DNA片段长8762bp，包含PTGIS基因外显子3-外显子5基因组序列。将PCR产物纯化，BamHI和MLUI双酶切，克隆入pCAS2载体，分别得到野生型和突变型质粒(图6A)。Sanger测序验证序列正确。将空载体质粒、野生型质粒和突变型质粒分别转染HEK293T细胞，48小时后，收获细胞，提取总RNA。利用引物对(5’-gtgatgaaaaggccaggatg-3’)和(5-ttgaggaggctctatcccac-3’)进行RT-PCR，凝胶电泳法对剪接产物进行可视化，对目标DNA片段凝胶纯化和Sanger测序验证。

结果如图6所示，图中：图6-A，从正常对照的基因组DNA和g.23867G>A突变携带者的基因组DNA，分别扩增出的野生型PTGIS基因和突变型基因序列，包含外显子3-外显子5区间的全部DNA序列，总长8762bp。扩增出的片段克隆入pCAS2载体，得到两个质粒pCAS2-PTGIS-Ex3-5-WT and pCAS2-PTGIS-Ex3-5-MU；图6-B，为逆转录PCR实验结果，该结果表明，g.23867G>A突变引起两个异常的基因剪接；图6C和图6D为Sanger测序结果，该结果表明，pCAS2-PTGIS-Ex3-5-MU引起的两个异常剪接中，较短的片段是完全外显子4跳跃异常转录(图C)，较长的片段是由内含子4的一个隐蔽剪接位点的活化(图D)。

PTGIS的内含子突变g.23867G>A位于典型的剪接供体位点。G到A的核苷酸改变，使高度保守的GU变为了AU。为了检测g.23867G>A突变对PTGIS基因mRNA剪接模式的影响，本实施例构建了野生型minigene质粒(pCAS2-PTGIS-Ex3-5-WT)和突变型质粒(pCAS2-PTGIS-Ex3-5-MU)，瞬时转染HEK293T细胞，利用RT-PCR检测基因转录情况(图6A)。

相比于野生型转录本，突变体发生了产生了两个异常的基因转录本(图6B)。通过Sanger测序的PCR产物，本实施例证实了两种不同的剪接事件g.23867G>A一个突变，包括4号外显子跳跃(图6B中突变体，较亮的条带)和内含子4内被激活的一个隐蔽剪接位点(图6B中突变体，相对较暗的条带)。

第4号外显子跳跃造成了144bp的PTGIS基因表达框删除(inframe deletion)(图6C)，进一步导致48个氨基酸残基缺失(p.Thr127_Arg174del)。这个被删除的蛋白片段位于PTGIS蛋白的CATH结构域，很可能导致酶的失活。

除了使第4号外显子跳跃，g.23867G>A突变还使第4号外显子下游371位点的一个隐性供体位点被激活，导致第4号外显子和第5号外显子之间插入了371个核苷酸，并在第4号外显子后引入一个提前终止密码子(premature termination codon，PTC)(图6D)。从电泳图上观察，该转录本表达量较低，可能与无义介导的mRNA降解效应(NMD)相关。

因此，该g.23867G>A突变会导致2种异常的mRNA的转录，使完整的4外显子跳跃或部分包括内含子4。这两个异常的转录本均会导致PTGIS蛋白功能完全丧失。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国医学科学院阜外医院

<120> 肺动脉高压相关的PTGIS基因突变及其应用

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1503

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggcttggg ccgcgctcct cggcctcctg gccgcactgt tgctgctgct gctactgagc 60

cgccgccgca cgcggcgacc tggtgagcct cccctggacc tgggcagcat cccctggttg 120

gggtatgcct tggactttgg aaaagatgct gccagcttcc tcacgaggat gaaggagaag 180

cacggtgaca tctttactat actggttggg ggcaggtatg tcaccgttct cctggaccca 240

cactcctacg acgcggtggt gtgggagcct cgcaccaggc tcgacttcca tgcctatgcc 300

atcttcctca tggagaggat ttttgatgtg cagcttccac attacagccc cagtgatgaa 360

aaggccagga tgaaactgac tcttctccac agagagctcc aggcactcac agaagccatg 420

tataccaacc tccatgcagt gctgttgggc gatgctacag aagcaggcag tggctggcac 480

gagatgggtc tcctcgactt ctcctacagc ttcctgctca gagccggcta cctgactctt 540

tacggaattg aggcgctgcc acgcacccat gaaagccagg cccaggaccg cgtccactca 600

gctgatgtct tccacacctt tcgccagctc gaccggctgc tccccaaact ggcccgtggc 660

tccctgtcag tgggggacaa ggaccacatg tgcagtgtca aaagtcgcct gtggaagctg 720

ctatccccag ccaggctggc caggcgggcc caccggagca aatggctgga gagttacctg 780

ctgcacctgg aggagatggg tgtgtcagag gagatgcagg cacgggccct ggtgctgcag 840

ctgtgggcca cacaggggaa tatgggtccc gctgccttct ggctcctgct cttccttctc 900

aagaatcctg aagccctggc tgctgtccgc ggagagctcg agagtatcct ttggcaagcg 960

gagcagcctg tctcgcagac gaccactctc ccacagaagg ttctagacag cacacctgtg 1020

cttgatagcg tgctgagtga gagcctcagg cttacagctg cccccttcat cacccgcgag 1080

gttgtggtgg acctggccat gcccatggca gacgggcgag aattcaacct gcgacgtggt 1140

gaccgcctcc tcctcttccc cttcctgagc ccccagagag acccagaaat ctacacagac 1200

ccagaggtat ttaaatacaa ccgattcctg aaccctgacg gatcagagaa gaaagacttt 1260

tacaaggatg ggaaacggct gaagaattac aacatgccct ggggggcggg gcacaatcac 1320

tgcctgggga ggagttatgc ggtcaacagc atcaaacaat ttgtgttcct tgtgctggtg 1380

cacttggact tggagctgat caacgcagat gtggagatcc ctgagtttga cctcagcagg 1440

tacggcttcg gtctgatgca gccggaacac gacgtgcccg tccgctaccg catccgccca 1500

tga 1503

<210> 2

<211> 500

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ala Trp Ala Ala Leu Leu Gly Leu Leu Ala Ala Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Ser Arg Arg Arg Thr Arg Arg Pro Gly Glu Pro Pro Leu

20 25 30

Asp Leu Gly Ser Ile Pro Trp Leu Gly Tyr Ala Leu Asp Phe Gly Lys

35 40 45

Asp Ala Ala Ser Phe Leu Thr Arg Met Lys Glu Lys His Gly Asp Ile

50 55 60

Phe Thr Ile Leu Val Gly Gly Arg Tyr Val Thr Val Leu Leu Asp Pro

65 70 75 80

His Ser Tyr Asp Ala Val Val Trp Glu Pro Arg Thr Arg Leu Asp Phe

85 90 95

His Ala Tyr Ala Ile Phe Leu Met Glu Arg Ile Phe Asp Val Gln Leu

100 105 110

Pro His Tyr Ser Pro Ser Asp Glu Lys Ala Arg Met Lys Leu Thr Leu

115 120 125

Leu His Arg Glu Leu Gln Ala Leu Thr Glu Ala Met Tyr Thr Asn Leu

130 135 140

His Ala Val Leu Leu Gly Asp Ala Thr Glu Ala Gly Ser Gly Trp His

145 150 155 160

Glu Met Gly Leu Leu Asp Phe Ser Tyr Ser Phe Leu Leu Arg Ala Gly

165 170 175

Tyr Leu Thr Leu Tyr Gly Ile Glu Ala Leu Pro Arg Thr His Glu Ser

180 185 190

Gln Ala Gln Asp Arg Val His Ser Ala Asp Val Phe His Thr Phe Arg

195 200 205

Gln Leu Asp Arg Leu Leu Pro Lys Leu Ala Arg Gly Ser Leu Ser Val

210 215 220

Gly Asp Lys Asp His Met Cys Ser Val Lys Ser Arg Leu Trp Lys Leu

225 230 235 240

Leu Ser Pro Ala Arg Leu Ala Arg Arg Ala His Arg Ser Lys Trp Leu

245 250 255

Glu Ser Tyr Leu Leu His Leu Glu Glu Met Gly Val Ser Glu Glu Met

260 265 270

Gln Ala Arg Ala Leu Val Leu Gln Leu Trp Ala Thr Gln Gly Asn Met

275 280 285

Gly Pro Ala Ala Phe Trp Leu Leu Leu Phe Leu Leu Lys Asn Pro Glu

290 295 300

Ala Leu Ala Ala Val Arg Gly Glu Leu Glu Ser Ile Leu Trp Gln Ala

305 310 315 320

Glu Gln Pro Val Ser Gln Thr Thr Thr Leu Pro Gln Lys Val Leu Asp

325 330 335

Ser Thr Pro Val Leu Asp Ser Val Leu Ser Glu Ser Leu Arg Leu Thr

340 345 350

Ala Ala Pro Phe Ile Thr Arg Glu Val Val Val Asp Leu Ala Met Pro

355 360 365

Met Ala Asp Gly Arg Glu Phe Asn Leu Arg Arg Gly Asp Arg Leu Leu

370 375 380

Leu Phe Pro Phe Leu Ser Pro Gln Arg Asp Pro Glu Ile Tyr Thr Asp

385 390 395 400

Pro Glu Val Phe Lys Tyr Asn Arg Phe Leu Asn Pro Asp Gly Ser Glu

405 410 415

Lys Lys Asp Phe Tyr Lys Asp Gly Lys Arg Leu Lys Asn Tyr Asn Met

420 425 430

Pro Trp Gly Ala Gly His Asn His Cys Leu Gly Arg Ser Tyr Ala Val

435 440 445

Asn Ser Ile Lys Gln Phe Val Phe Leu Val Leu Val His Leu Asp Leu

450 455 460

Glu Leu Ile Asn Ala Asp Val Glu Ile Pro Glu Phe Asp Leu Ser Arg

465 470 475 480

Tyr Gly Phe Gly Leu Met Gln Pro Glu His Asp Val Pro Val Arg Tyr

485 490 495

Arg Ile Arg Pro

500

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gatgggaact attgttgacg a 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctacagtctt tgctttgggt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agtgacattc agaagaccct 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

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<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acaggcatac acacaacaca 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cctctgccaa accattctcc 20

<210> 9

<211> 64297

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggagtgggcc aggccgccag ccccgccagc cccgccagcc ccgccagccc cgcgatggct 60

tgggccgcgc tcctcggcct cctggccgca ctgttgctgc tgctgctact gagccgccgc 120

cgcacgcggt gagtgtcctg ctccgctcgg ccccgccaga caaagggggc ggctcccgcc 180

cgggctgcag cccaagggtc tcggagcccg cggccggccc ggcccgagtc ccgctccagt 240

atcccgggca aggcgagacc ctcggaggtg ggagtcccgg ggccccgcac gtgggtgagg 300

gggccaggcc gtgctccccc tgccaagaag gtgcaaggtg ggaaggtgcg gggtccggta 360

ggtcccccgg ggcgaatcgc ccaccgcgac aagtccgagt ctggccctta gcgcgacggc 420

agggacctag gagggggttt caggtgagga ccgagggttt gtgggtgggg agccgtgcgg 480

ggacagcctc tgcgtggccc gggtggaaga agcgctctcc actctccagc ctctgcctgc 540

acctggcacc cacctacgcg ctgtcaaacc ctgccttgct ttcggcagtc ctatagggat 600

agcctcgctc ctcaacccat tacacagatg ggagtgttga gccagcggag tgtagagccc 660

ctgggggatg tcttgatcat gccctggaac cacccacccc gggattcccc gtctggaaga 720

cgggggtcgg tgggcttagt aatttcattt gccagggaga aactgaggcc tatgaagtct 780

ctaccttccc ctgaggtccc acagcctgga cagaacggag ccagggtcag atgtcacagc 840

ctcctggtcc caaaggtttt ccagctccat tgagcatctg tgatttagga gaaaaagtaa 900

agacagcctc aaatcaagga gatagctgta gctctccttt tcataaaata ttttttaagt 960

taacttgaat tgcataagga atagctgaat acattcgact taacacaaat atttatcctg 1020

ttataggtaa gaccgaagcc ccttaaccct cccccagccc ctgaagtcta gtcctctctc 1080

cctctctggg cctctcctgt tgctgagtct gggtagaacc ttccatattt aaaaaaatat 1140

actttttatt tgagactagt ttgggattta cagaaagttg caaagatagt acaaaaagtt 1200

cctgtatttc tctcaccccg ttttccctat tgttaacatc ttacattgtt atgggacatt 1260

tgtcgccact aaaaaccaac actggtccgt tactcttaac taaacttcaa acttcacggg 1320

attttatcca gtttcccatt actgtcctct tttgttccag gatccggccc caagttacca 1380

cattgccttt agttttcata cctcctcagt ctcccagatg ttttaaaaat tactcttaca 1440

taaaaattac tcttacatac atagacatga gcttgtagct aatacagagc cacgtaagag 1500

agagttagtt tacattcgtg tctgaaaatt ccggaaacct tgggaacttt ttgattttta 1560

aacaatatgg tagttgaatt ttcaaacaat aagctcactg tatttttctt caacctccag 1620

acatcttttc agctgaaatt tacaactgtg tagtcaatca tttgccttaa aacaagaaaa 1680

gaaaaagaca gtgaataaat gtctcaggga agaaatgaat tatttttcct gtcaggcttt 1740

ctcaatacac tgtatagaaa tgttttcaga cattatgttg cttgctcttt tcactccaga 1800

ttttagtttt gacatctgtt ctttttgcta caagcagatc tttttgctac aaggagatcg 1860

aatccattct tttgatcctc tctggagtct tccatcatgt gaatacgtta tgggctcttt 1920

ttttgtttgt ttgtttgttt gagatggatc ttccctcttg ttgcccaggc tggagtgcaa 1980

tggcacgatc tcggctcacc gcaacctctg cctcctgggt tcaagtgatt ctcctgcctc 2040

agcctcccca gtagctggga ttacaggcat gtgccaccat gcccagctaa tttttgtatt 2100

tttagtagag acaggatttc tccatgttgg ccaggctggt ctcgaactcc tgacctcagg 2160

tgatctgcct gcctcggcct cccaaggtgc tgagattaca ggcgtgagtc accgcgccct 2220

gctgagcctt tgatttttat acctgtgggc accttggaag ggtcaacagt gggtagtggg 2280

gagaagtgtg ggaatgaggg tcactggcag cttgagggta ggtgcatgga ccctggggac 2340

cccagtttag atccccaatc tcactttctc cttccagttc agctagggac actctggtta 2400

tctccatttt acagaggagg aaacaggctc agaaaggcta agcaacttgc tcaaggtctg 2460

tctggattaa aactctgggc tgtaagaatt tttagctttt acttttagtg ataggatctc 2520

acactgtggc ccaggctgga gtgcagtgta caattatagc ttactggagc cttgaactcc 2580

tgggctcagg tgatcctctc atcttagcct cctgagtagg tgggactaca ggtgtgtgcc 2640

accatgccca gttaatttta aaaattttgt agagatggca tcttgccatg ttgtccagga 2700

tggtctcaaa ctcagctcaa gcgatcctcc caccgcagcc tcccaaagtg ctggaattac 2760

cggtgtgaac caccacgcct ggctttgcaa gaatttttaa ttcacaggaa gaatgaattc 2820

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cttttagata ctaagaaatg caactacaag caaaaaattc ttaaagaagg acaatggccg 2940

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tcgctactaa aaaaaaaaaa aatacaaaaa aaattagccg ggcgtggtgg caggcgcctg 3060

tagtctcagc tactcaggag actgaggcag gagaatggca tgaagccggg agatggaggt 3120

tgcagtgagc tgagatcctg ccactgcact ccagcctggg cgacagagcg actccatctc 3180

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aatggtgatc cagtttgggt taaaataagc aaggctctcc agctcccttg tctcatttct 3300

ttatcctgac caagccttga ggtaatttcc atcaccctta tcatacagct gaggtttaaa 3360

aagatgaagt gactttccca aggtcataca aaaattatac tccacatcta ggcccctcca 3420

aaattcatgc ttatcccagt aagacaccac tacttctggg agtgagcaac tccgtcttta 3480

cctttagaat ttaatttaaa acttttaaat taggaaacat ttcaactata cagaaaaaga 3540

aaaagaatac ggtaagaagc cccatgtacc tataccttga tttgacagtc attaacatta 3600

tttaaaaaat attagacata ggctgggcac ggtggctcac acctataatt ccagcacttt 3660

gggaggctga ggcgggccga tcaagaggtc aggagatcga gaccatcctg gctaacacga 3720

tgaaaccccg tctctactaa aaatacagaa aattagccag gcgtggtggc aggcacctgt 3780

agtcccagct actcaggagg ctgaggcagg agaatggcgt gaacccagga ggcggagctt 3840

gcagtgagcg gagcttgcgc cattgcactc cagcctgggc aacagagcga gactccatct 3900

caaaaaaaaa aaattagatg tcatgatatt ccacccttga atatttcaga atgcatataa 3960

aactgacaac tacaattcta ttttcttgcc tgagaatata aaaagataat tcttaatgtc 4020

atgtagttcc cagttcaaat tcaaatttct gcaattacag caagaatttt cgagccccat 4080

tcggtgaaca tgagggtggt gagctgagag ttaggagtat ggcttgtggg ccccttgaaa 4140

ctaattgatt tgccttgtga gtatcagaag cattcttcct gcttcccagg cctcagttta 4200

tctgtacttc gaggtggctc atggaggtgg tctctcaagc cccagccata tcaccaggct 4260

actgcatctc ttcctttggg cttgtgtgac caccacaggg agcactgaga gagatctctt 4320

ggttgggagg ctccttttct gggggtccgg aaggcatagt ggcatcaagc gagggtcact 4380

gtggcccagt ggctggtctg ggcccttgca ggatgcagaa tttgtaggca caaataaatc 4440

tgtctcattc taacatgcac tgaccagagg tcacccaaca gtggtccgtg actggattca 4500

gccctggatg ggctgggttt gtgctgtgtg ggacatgggg agaaaattgg gggattccat 4560

acacaaaaat ctagatttcc aacttcttct gaaaaatggg aagatctagc aatactttcc 4620

tgggactcag tggtagcacc ctctctaaat cttgccacag tccccactac tccctattgc 4680

ctctccagca tgcagctatt ctagttacca ctgtacttcc tctgctgttt tttcctgtgt 4740

tgagaaataa ttctgtgaat ttgtgtctat ttcaaaaacc agaaaacaaa aactagggca 4800

aggccacgtg ctttttatgc acagtggtag cagtgcgggg caggtatgga agagcatctg 4860

ggaaaccctg ttaatggcag actgaaaacc ctggaggcct gtgggtgagc cctgggggaa 4920

gaatgggtta agcaggttaa acagaatttt gggttgctcc agctcacctg tgcaactaag 4980

cccccttttg ttccccatta aatcctccca gagcttaagg ccctgcattg agttgaaatg 5040

attgaacaga gaggttgggc agtctaccca acattgcaca gctgaaccat gccagcctct 5100

gctctggaca atctagaaga tggactctgt gtcaagtgct taacctgcat tggctttctt 5160

aaccctctca gcaactctgg gaggcaggtg ctgcccattg agcaccgact gcatacatga 5220

ttcattcaga ccagccactg ttctgagtgc tggagtgaac aacacgccct cccttcatgg 5280

ctcttccatc tagtgaagat gcgatacgtc agggggcatg gaggcgggtg acatcccatc 5340

cttgactcct ttccctggtt cacaaagggt caagtgggag agagatccag ggcaggcgac 5400

aggggtcagt gagtgaggaa taggccgttt ttagaggaac ccatgtgatg gggctccagt 5460

cggaaatcag aaaagatgcc ttgggatctg acccagggtg ggcaggaaac cggctgtgtg 5520

ggcaggagcc ggggatggaa aggtcagggc ccaccgccct gcccgccagg gcctggcagt 5580

acctaaaaaa aagtgagagt gtccgtgggt ggggctagag cccacagtcc ccaaaacaga 5640

gcctccttcg cccccgctgg ctgcaggctg agtcaccctg gaatgtgacc acggcctgag 5700

ttggattgag ggcccaaggc tggaggagcc aacatcaggg gtcaggcgcc tgggctccgg 5760

gcttcctgcc tttgtctgcg cctccttggg acttttctgg ggaaagagga aagctgccag 5820

gaataacacc tggctcgctg gggagctccg gccacagcca ggagaaaggc aggggaagaa 5880

agcctgctcc cgcctgcaaa gatgttttag gagaaaattt cagggcctgc atttgagtag 5940

gtctctggaa tatctctgca aaatggaggt gaaaatgccc acttagggtg actgggggcc 6000

agggtagtgt caagagggtg ggcactgcag ccagacctgt ctggattaga aacccaagtc 6060

ctctatgttg gaccctctgg catgtgactt agccctctgc acctcagttt cctcctctgt 6120

aaaatgggcc tggcagtaat aattgcttcc tcataaggtt agggggagga ttcattgagt 6180

cactgggata aagtcctcag tgtggtgtct cccacaccat cagcgttcat taaatgttag 6240

ccattatttc caaacaagga aacgtttgga aaatgccaag tatagctcct gatgtgtagt 6300

tggcactagg taaatggtgc ccaggaatct tactgctcct gcttctcagc tgcttcccag 6360

ctactaggtg ccaggtgctc tgtaactccc ctcatccttg gcacagccca atgcagtcag 6420

tagcattatt gcttccattt tacagatgag gaaatagagg catggagaag ctaagtcaca 6480

cagccagcaa gaagcgtggc tgggatttga agccaggaag tatggtgcta aagtttgggc 6540

tcatcgtgac catgccctcc tgcctcttat gcaaaaatca ctgcttctgg gtccagtctg 6600

ccaggctctg acctgggctg gaagggggct gccatgaacc agttattcca aggctacttg 6660

ggcagcacga cacgtggaga cttcaggaga agtggcctta gcccaggggc tcacaaaaag 6720

atgaggcaca aggcaaggcc ctgcacctcc ttagactcac agagctcaaa tttgcaagtc 6780

tcctctttga ctagagaagc cgggatgggc tggggagagg agggaatggt tgggagaggc 6840

acttcctagg ccctcaaatt tcatctttgc ttctgctccc atccttccca gccttggccc 6900

tcaaatctgg ccatttgctc ctgcccacga gctgtcccac cctttgggtt atactggggg 6960

cagccaggta gagggaaaaa gggagcagga gacaggggca gagggaggta gagagggagg 7020

gggaaaggag gaagagaagt ggctgcttcc ctgaactgct gggtgtggaa caaaaggccc 7080

tgtgctgaaa gtgggagact cagatgttag gtctggctcc ccggggacca tggccattgc 7140

ttccaccaca ttgctctcct gggggggtca cggtagttcc ctgacacatc tccttccttc 7200

ctcttgtctt tctctggtat gaccctttaa aggtgtggtc acatcactta ctggctcctg 7260

ctgcaaaccc tccagtggat ccctgccacg cgtggcatag gagccggact cccaccttgg 7320

ccttggccct cgtggtccac aaagtcatct ccagcatcat cgcctacgtc tcgtccccac 7380

attctccact ccagccacgc tggctcctgc tgtctcgaaa acctcaccga gcatgctccc 7440

accccagtac ctttgcactt gctgttgcct ctgcctgtaa cactcttctc cctgcccctc 7500

ccagagcact cccttcacat ccttctggtc tttgctcacg tggcatctcc tgaggaggcc 7560

ctccttgacc accttttgta aaccagcccc cctcactgtc tcacaccacc ctgttttctt 7620

ttttctttaa tggaatataa ttcatatccc atttagttca cccttttggg ctgggcatag 7680

tggctcatgc ctgtaatccc agcactatgg gaggctgaga cagggagtgc ttgagcccaa 7740

gagttaagat caacctaggc aacacatcaa gaccctgtct ctataaaaaa atagaaaaac 7800

aaagtcaggt gtgatggcat gtgcctatat atagtgccag ctactcggga ggctgaggct 7860

ggaggattgc gtgagtccaa acgtttgagg ttatagtcaa ctatgatcat gccacggccc 7920

tccagctccc cttttaaagt gtataattcg gccgggcatg gtggctcacg cctgtaatcc 7980

cagcactttg ggaggctgag gcagatggat cacaaggtca ggagttcaag accagcctgg 8040

ccaagatggt gaaacccatc tctactaaaa atacaaaaaa ttggccgggc gtggtggcgg 8100

gtgcctgtaa tcccagctac tcggcaggct gaggcagaga attgcttgaa cccgggaggt 8160

gcaggttgca gtgagccaag atcgcgccat tgcactccag ccttggcgac agaccaagat 8220

tccgtctcaa aaaaaaaaaa aaaagtgtat aattcaatag tttctagtat atccaccggg 8280

ttgtgcaatc atcaccatca tctaattcca gaatattttc atcaccccta aaagaaacca 8340

tgtacccatt agcagtcact ccccatttcc ccctcctcca gccctgggca accactaatg 8400

tactttctat ctctattgat ttcccaattc tggacagttc atataaatga attaatacaa 8460

tatgtggcct tttgtgtctg gcttctttca ctgggcttaa tgtttttaag gttcacccac 8520

atcgtagcat gaatcagtac ttcattcctt tttgtggctg agtaacgttt cgtggcattg 8580

atacaccaca ttctgtttat ccgttcgtca ctcaacgaac acttgagttg ttttcacttt 8640

tcagctatta cgaataatgc tgctgtcacc cgaaagcggt cctgatccag accccaagag 8700

agggttcttg gatctcaggc aagaaataat ttagagtgag ttcacagagt aacgtgaaag 8760

caagtttatt aagaaggtaa aggaacgaaa gagtggccac accatagaca gaccagggcg 8820

tttccgaagg caagaggagg aatgtgtctg ccttagttac aattcttctt gtttatatag 8880

aagataaaaa tcatgggaga ggtgtgctct tctaccacaa gggctgggga caaaagattg 8940

ttacctaaca atcttccata agaatctata ttattatctt taaagcaaaa cttattctta 9000

aactaagaag gcttttgttc ataaaatatc gggacagcag gatgtttcct gggtctgtta 9060

agtcctggat ctgttaagtc ttgggtctgt tgggtaagca tgatttaacg tgttcccttg 9120

atcgtaaaca tcctgcgctt aagaatgcct agcttcctgg cccagcatgg tggttcacgc 9180

ctctaatccc agcacttggt gaagcggagg caggtggatc acctgagatc aggagttcga 9240

gaccagcctg accaacatga tgaaatcctg tctctactaa aaatacaaaa ctagccgggc 9300

atggttgttc attcctgtaa tcccagctac ttgggaggct gaggcaggag aatcacttga 9360

acctgggagg cggaggttgc agtgagctga gatcgcgcca ttgcactcca gcctgggcaa 9420

taagagcaaa actccatctc aaaaaaaaaa aaaaaaattg tctaacttct tcttgggatt 9480

gcagcccagc aagtctcagc ctcattttac ccagctccta ttcaacatgg agtcactctg 9540

gtttgaacac ctctgacact gcttacgaat aatagtgtat acatttgtat aagatccaac 9600

gttttcaatt ctttagggta cattgctggg tcttgtagta agtctatgct tgacgttttg 9660

aggaactgcc agactgcatt ccaaagcagc tgcacgattt tacattccca ccagcaatgt 9720

atgagggttc tcacttctcc acatccttgc taacacttat tttcttccct tttttggtgg 9780

tgggaacagg gtctcgttct cttgcttagg ttgtagtcca gtggcacagt cacagctcat 9840

tatagcttcc acctcccagg ctcaagtgat cccccaaact cagcctcctg agtagctggg 9900

actacaggtg cacaccacca cacctggcta atttttgtat tttttgtaga gacagggtct 9960

caccatgttg cccaggctgg tcttgaactc ctaggatcaa gagatcctcc cactttggcc 10020

tcccagagtg ttgggattat aggcatgaga caccatgccc agccttattt tcctttttta 10080

aaatttttgt ttttattatg gccatcctgg tgggtgaagt ggtacctgta aaccaaaaag 10140

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agtagagagg tctgtgcctt tctccaaaga cgactttgag ggtttcaata cttaaagcgg 10260

gggaaaggtg ggctgtaaga gaaagaggga aggtatggta atccccatgt cacaagagaa 10320

aaggaacggg tagggcgata gtcaatgatg tatttctctc atgcacagta aatcagcact 10380

ttacataaaa taaggtgaac atagagtagc tgcctatgga gatactgaaa cttttatctg 10440

tagctatctg cttaggaata gtaggaaagg cagcttcttg catgactcag ctttcagttt 10500

aattttttcc tcatggcaga gtgaattggt gtcctgagtt tttattttcc tttctccccg 10560

gttttctttt ctccctggtt ttcttttctt ttcttctttt tttttttctt ttctttcttc 10620

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cctccctagt agctgggact acagacatgt gctaccatgc tgggctaatt tttttaattt 10740

ttagtagaga cggggtctca ctctgtttcc caggctggtc ttgaactcct aggctcaagt 10800

gatcctcctg tctcagcctc ccaaagtgct gggattacag gcatgaacca ccatgtatgc 10860

ctgcccccct tttctattta agatcttttg gagaaagcat tttagaagaa aatgaatctc 10920

cggtctcagg ttttgtctga tctctcatgt ctaggatggt ttatttctag acgaataggt 10980

cccacattgt taggaaagct cagttttagt aggttgtgaa gtctcacatc acacaaagaa 11040

aataagagag aaagaaaaca ggaaaaaagg aggaagtaag cagataaaca aaaaagaaag 11100

aacgaacctg gaaaactgat agaggccata ttactctcaa gtccgtatat cagtaggcag 11160

gtatgaaaat gatttctgca tataaagaga ttgcttttat tttcttccaa agtttaagtt 11220

cagtttatag ggctttaaga aaagcacagc ttaactttta gtgatttcac atcaggaaaa 11280

atgaggggag gaaaaaaaaa agaagggaaa acattgaaaa cattcttttg gagacttgga 11340

gccaggagaa tttttagaat tcagtccaaa ttgtggaaaa taataaaaat ggaaaaacat 11400

tagacaagtc tagactctaa taacaggtgt actatagtta attttgaaac atgacttttc 11460

tctctccaat tccccaattt tattaaagac aaaatcatag taggaccaac ttatttgtaa 11520

aataagtttt agttatatta tacttggctt gattattttc ataaaatgca gcaagactga 11580

tcatttgcca tatgagctct ctcttctttt taaaattggc tttgctggaa gcttttccat 11640

aaggaatctg agtctagacc tttttaaaag cctcacaccc agccaaggat ttagctgtgc 11700

ctgcagatac ctgtatgaat tgagtgaatt caaaaagtga cattctttgc tttccacagg 11760

tcaggaccct gtaaacgaca gggtatatga agccagtttt tccaaggtgc ttttattagc 11820

tctatagttc agccttattt tctcaaagta gtctgaaaat atgtcattcc agttaaagcc 11880

ttggtaaaat aaccagtgtc tccaattatg ccctgttata aaagaaaaaa gatacttagg 11940

caaataacta cattgccata aattaagaat actcacaaat agtttccaag ttttggaaaa 12000

aataggtaaa gagaaagaaa ttctgtttta aatttttctc atgagagtat actttactga 12060

attgttaaaa gctataaata gcttaaaaga agagaaagtt ttcttgactc tgtaaaacaa 12120

aacaaaaaga atcaacaaat gttttaaaca aaaactcata aaagattatt tcaatctcct 12180

gttagttcag ttcatgcaat taactcctgt tctgctcaag atgggattag cagtcctcat 12240

gaatacatca gttctccatg acagtcctgg aagtttttct ccctattcca atggcacaat 12300

ctctaaggtt gtcagaagcc catgtttaag agtactcctc agagttctat agctgattat 12360

aaatcaccta taaaaagatc aaactaaaac aactgtggat gacaaaagtc ttagaacagc 12420

catagttaaa gacacaattg acaaggaaat ttggttacgt ctgtggtatt caatagtttt 12480

acataataat cataattact actgatgatg tatactaagt catatcagaa tcacaggaat 12540

ctcatacaat tttggaacac atactcattt atataagcaa ctcatttata taaatataat 12600

ccaaagaaga ttaaacacca tttcatattt gacaatgctt cctgtatgat tttattttac 12660

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ggtcaaaagg actgaattga ctattttatt ttggaaagtt tgtcaaatat agaaagttta 12780

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caaaggtata actcagagat ttcagaaaaa aggcaaaaac ctttattctt tttttttttc 12900

gagacactct cactttgtcg cccaggttgg agtgcagtgg tgcaatcttg gctcactgca 12960

acctccacct cccaggttca agcaattctt gtgcctcaga ctcccgacta gctgggatta 13020

taggcacctg ccaccacacc cagccaattt ttttgtattt ttagtagaaa cggggtttca 13080

ccatgttggc caggctggtc ttgaactcct gacctcaagt gatccacccg cttcagcttc 13140

ccaaagtgct gggattacag gcatgagcca ccacacctgg cctaaaaacc tttattcttt 13200

gagagaggag acttaatttt ccaaataata agctctaata aatacagcat gaggccaatt 13260

aaatcctgtt tctcaaatct tataaacaaa tctattaaat tttaatcatc ttgaccctaa 13320

gatgtaattt ccataaacca ttttctaaac ttttataatt ttttaaaggg tgggataatg 13380

cttcaagaaa accttgttaa tctgacacag gagcccagat gctggtcttg catcagtgtg 13440

cctttgatgt taatgtttaa ttaatagaga aactctgaac taatttaatc tctcagaatc 13500

agcccttaca atctcatatg cccacctctt ccatgatagt ccctgggcct agagaggttg 13560

aatagttttc atttctggct ccatgtctca caaatgcagc ttattttgaa tgtcatctcc 13620

tcctaggtct gaagatgatg ctttaactgc tgtcagtgtt taagatttag caggactcag 13680

tgtccttttt agacccagga gtcaaagccc tgtaactaaa cagcaccagg actttaaaaa 13740

cattacagaa agttacaagg atgtaataac cttcattaaa aattttttta tatcagcttt 13800

cctaggcaaa tcaaaacaca gaacaattta gacatattaa gaaatgccag gagcacagaa 13860

tgttatattg gatgaaaaca tttcctttag acctttatga taaagcattt ttagcatcag 13920

gctacaacag ttaggacctg agggaaaaaa tttatatgag ctgacgaaaa tgttgatgga 13980

gagaattatt ctctcagtcc ttctcaaaga ggagagaaag ctgaaaatag caagatgcaa 14040

taaaagttga acttttgagt taaaaaaatt aaaatctcat gtaatgttat taacagtaaa 14100

ataatacctt aagaaaattt tgttctaacc aattctttag tgtattagtg catttttaat 14160

atcaaaaccc aatctctaga aagactatta taaataattt ccttttaatt atagtcaact 14220

tgttcacata aaatgttttt cataaattct ctttttataa accttattat gacttacaca 14280

aaccatttac aacatgcttc ctgttttatc ctaaacatct ctctttcgta aatgatcaat 14340

cattttattt taggacaaaa aatttttacg ggattctttc catatacaat tatttttctt 14400

ttaacctttc ttgccaaaga taccccttta taattttctt tacatgcttc ttatttactt 14460

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ttacctagat tacttatgaa aactgtgata gtcactattt aaagttattt ccctgttaat 14760

catttttata gctgtgaatt tcagatgttt acttaagtaa gaactttaaa gttaaataca 14820

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atagcttcat aatcctcatg ccaaattttg tcaccttata atatctagca gagataaata 15000

tataacccct tgactaatac atataaaaca ataatgtata ttgacaattc tgaaaccatt 15060

tctaatttta ttttaccaat aattttaaaa ccagcttatt tgttaaagat ttacttaagt 15120

catgtgagct tgaaaaacca tttgggctta aagtttctat ttttctgata aagtatttga 15180

tttttttctt taagccaatt tattagacct cttatgtatt tttttgtagt gaaacattat 15240

atacaggaca tataaataca tagacagaca ggcagcagta gatctgataa gattcataag 15300

accccttttt ttctcctgtt ataaagctcc tggcttttct taatatgtct aagttgtttt 15360

atgtttttat ttgcctagga aagctgatat aaaacaattt taaataaaag ttattacatc 15420

catgtgactt tctgtatcgt ttttaagtcc tggtgctgtt aagttatagt gtttgactcc 15480

tgggtctaaa aaggacaact atcttagact tccaatttct tgataacctg tttcattacc 15540

ctaggcaatt gtcagccaaa cttgcatact aaaggaacaa ctcttgggtg aaaatcagat 15600

agggaaatgt atatctctaa agagagagag agacagacag agagagagag agaaagaaag 15660

agggagagag agactgggtg tgttagaggg agattaaaaa tggatgccaa gccacaagcc 15720

aaacataaaa ttatagaaat cttctgtagg attttatgag gagacaaact ttatttagat 15780

aggtagattt aaatttagtc tctgtctttt aactggacct ctgagctctg ggcagagtcc 15840

acactgaatc ctgggtctct aaaaggagag agatatcatg agactaagcc atgtaatgct 15900

tttacagtgc actttgttac aaaagcattt ctctaagtat tttaaccact ccctctctta 15960

aacacacaag agtagttcct gtagtaatag ctattttagt taataaaaaa aaaagaaatc 16020

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tgacaaaaag agttaaactc tgtaaaatat ttgaggagat ttattctgag ccaaatatga 16500

gtgaccatgg cctacaacac agcctcagga gatcctgatg acatgtgccc aacgtggtca 16560

aggcacagct cggtttgtac attttaggga gacaggagat atcaatcaaa tacattgaca 16620

atatacattt gtccagtcca gaaagacagg acaacttgat gtggggggtg cttccaggtt 16680

ataggtggat tttaaaactt tctgattggc aattggttgc aagagttatt gtcaatagaa 16740

ataaatgtct gggttataat aagaggttgt gaagaccaaa gttttctcat gcagatgaag 16800

cctccaggta gcaggcttca gagcgaatag atgtaaaggt ttcttatcag acttaaggtc 16860

tgtgttgata tgaatgctgg agggtataat gagtcatgtc tgacccccac ttcccaccac 16920

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ttgtcgccct ggctggagtg caatggagca atctcagctc actgcaacct cctcctcctg 17040

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attacaggca tcagccactg tgcctggcct gcactttacc atctacaaag caggaaaaaa 17280

aacttcaaac ttgccttcct tgttggaagt gagttgaaac tccagaaggg agttacgtgc 17340

tctccatcgt catggaagca ggaaaacttg ccttccttgt tggaagcaag taatactcca 17400

gaaaaggagt tgtacaacaa aataaaactt agctctcaaa ttgtagctct cttagatctc 17460

aaattttcag agattcggga ttctctgcag cagggagctc ccagccctac tggtttgacc 17520

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ccacctacat ggagtccctt catggtcgcc aatttgtaaa ctaaaaagta tctaagctag 17640

gtctcaatca atttagatgt ttattttacc aaggttaagg acaatgccag ggagaagaaa 17700

aaccacagaa tcacagaaac agtctgtggt ctgtgccttt cttcaaagat gactctgagg 17760

gtttcagtat ttaaaggggg aaaagtgggc tggaggggaa agagggaggg tgtggtcatc 17820

cacatgttac aagagaaaag gagcaggtga ggcaatagtc cccgagtgct ccattcagat 17880

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atacttgtat atccatgcag ctgacctcca tctatccatt ccatttccat ccgttcaaca 18420

tccatcttcc catcccattc ttctgcctgt ccacctggtg tctactaagc gtccttccat 18480

ccttatatct actcagcatt cattcgtcaa cctccgtcta tccactcacc catcagtttt 18540

tccatagatt cacccgacat ctgtcaattc atttatccat cttctatccc ttcatgtgtc 18600

tgcccagatc tacccagagt tcttccactc atggatccaa tgttcatcca actttcatct 18660

gtatacagtt ggccccctgt atccatgggt gggttccata tctctggatt caaccggcca 18720

cgaattgaaa atatttgggg gaaaatgtgt tggtactaaa cttttttaga cttttttgtt 18780

gtaattcttc cctaaaaata tagtttaaca actatttatt tagcatttac attgtgttag 18840

gtattataag taatctagag atgacttaaa gtatatggga ggatgcatgt aggttatttg 18900

caaatattat gccattttaa atcaaggact tgagcatcca tagattttgg tatctgcagg 18960

aggtcctgga accaatcctc catggatact gagggataac tggtcagttt ccaccaactt 19020

tcatttttct gtttatctac gcatctttct gttcatctgc cactatccac ccaacactca 19080

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cttccatcca atcaacattc atccttcact ttacccagta tctacctagc attctctcat 19260

ccatgtaccc aacatttatt ggtacatttg gtttccaacc aacctctagc tgcccttcca 19320

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catccatgta tccattcatt cttccttcca tccatccatc cattctttca tccatccatc 19620

catccaccca tccattcatc catctactta tccatccatc cttccttcca tccatccatc 19680

catccattct tccatccaac catccatcca tctatccatt catccatcca ttcatccatc 19740

catccatgat gtgcacagga tccatctgcc gccttctctc ctggctactg gagatatggc 19800

aataaccaag ataatcatgg caggtgctta agagtgaggt ggtagagaac acagtctttg 19860

attttaaaaa gcctcaatat tcccaaattc cagtcctagt cctgccactt ctcagctatg 19920

agatcttggg cacatttctt ctcctttcta agcctcactt tttcagctat aaatgggtga 19980

gtgatggtcc ctacctcaca gggtggtagg tggtagtgag gcatagataa gagaacatag 20040

tgtgttactg tccagtgggg cagtgcctgg cacacagtaa ggccctgacc actgagagcg 20100

gctgctgttc acagtgacac tcctcactct atccctggca acttcccaca gatactggtt 20160

gggggcaggt atgtcaccgt tctcctggac ccacactcct acgacgcggt ggtgtgggag 20220

cctcgcacca ggctcgactt ccatgcctat gccatcttcc tcatggagag gatttttgat 20280

gtgcagcttc cacattacag ccccagtgat gaaaaggcca ggatgaaact gtgagtggct 20340

ggagatggca cctgtgggag ggccagggtg ggcgactcat ttctactcat gtggcccaag 20400

ttattcttgg ttccaaagca aatgttcggt aaagacattt tgtcttgaga acacaaacag 20460

aaacaaaaca aaaaacaacc caaaagaatt gggtggaaga agaactcttt gtctctcatc 20520

tctggcgggt ttttttgttt gtttgtttgt ttgtttgttt gtttggaggc agccctgatt 20580

ttagtaggag gagaccaggg tttgggtcag ccacacctaa attcaaatcc cagccccatc 20640

actccctagc tttgtgactt tggacaaacc tctttccctc tctgagcctc tgtttcctcc 20700

tctgtaaaat gaaggagaga ggtggaatga tgaatatttc tgagtccata ctctgccagg 20760

cagcatgcat tatctcatta gtcttcacaa caatgctgga ggctaagtaa cttacagccc 20820

catttcatag atgcagccac tggatctcag agaagtgact tgtctcaggc cacatagcca 20880

gaagtggtac agctcctgaa acatatggag gaatcatttt attttattta tttatttttg 20940

agacagagtc tctctctgtt gcccaggcca gagtgcagtg gcataatctt ggctcactgt 21000

aacctccgcc tcccgggttc aggcgattct cctgcctcag cctcccaggt agctgggatt 21060

acaggcacgt gccaccacac ctggctaatt tttgtatttt tagtagagac aggatttcat 21120

catgttgtcc aggcaggtct cgaactcctg acctcaggtg gtctgcccgc ctcagcttcc 21180

caaagtgctg ggattacagg catgagccac catgcccagc cacatatgga gtcatcatat 21240

caataagaga acagatgaac atgtttgctc tgcattcatt cagcagacat ctgaggaccc 21300

attgtaccct ggtcattgcc ctggatgtag ggtgtgcaga acggtgccaa ccaccatttg 21360

aaggcagcta ttataggcca ggtgtctgat aggctcactt tcatatctgt gcattagcct 21420

aaagaggtgg gcatttttat ccttatttta cagatgagga cactgaggct cagagaggtg 21480

aagtgacttg ctcaaagtct actgctagta agtggcagga ctgggatttg aacccaggtc 21540

cactgacttc acagcgcatt ctccttcatc taagatacca aggctgataa gaccctgtgt 21600

ccgcccctgc agagttcaca cagtccaatg gcgatcttca gtgatctgtc tccaggagga 21660

ataccctctg gaggttagga agagcatcta ggaaactgtt ttgcaagata gttaaggctg 21720

aagcaaggcc agcatgatga agtggatgtt gatgagacat gatgcctcct ctgaaccttg 21780

gcctgggggc agctgcttgg agcctgagtg tcctgggtcc tgacattcca gggggaccct 21840

gggggtccca ttagcaatag gaatccacag ctcactgaat ctgcccctgc tacccaggga 21900

ggatcccagt ttccttcagt gtttgcctca ggaattttct ggaatttctt acaagctggc 21960

gtgatgtctt ctgggcacag cagccacatc tgttgagggc ttgtctctgc tgaggaccag 22020

cgcttggagt ggggtgggga gaagagctgg gtcagggtcc attgaaggcc agatcccatg 22080

tattgagcac ttacaatgtg ccaggcaccg tgcggaaccc ttcacatgca ttgtcataca 22140

tgagtcatga gccatgtctg tcgtttttcc cactatgttc caacttgaac atcccaaacc 22200

ttttcatacc caggagttca tggacgccct gtgcaaaccc tgccctggtg gattacccag 22260

gcacttctgg cttactcagt ctaaaggtgt ccatcctact tcccaaacag cagtccatcc 22320

tacttcccaa acagcaggca tgacagatca gggccctgat tggcactctc ccactgttct 22380

tgttgctgcc actaggtgtt gctgttgacc atgggctgtg caccgcccat ggacacccca 22440

cttcacttgc tgtagggata tcctttttgg tccagatcct acacaaggag cagagaggcc 22500

ttagacttag atgcaagata cccctttctt ggcttctaat catatcctca gtcatggctc 22560

agtgtagact ccatatcatg gaggctcagt ataggggagc ttccagcttc tgccacactc 22620

ttccagacgg ggcctctcct cactctgtgc aggtccacac gatgggacca gatctccagc 22680

ccacatccct ttttccttgt gtcactctca tgtgaggtca tgtctttttt ttttttcttt 22740

tcttttttta agacacagag tctcactctg ttgcctaggc tggagtgcag tggtgtgatc 22800

atagctcact gcagcttcaa actcctggac tcaagcaatc ctccccacct cagcctcctg 22860

agtagctggg actacaggca cctactacac atctggctag tgattctttg tgtatttatt 22920

ctatttttgt aaaggcagaa tctcactatg ttgcccaggc tggtcttgaa ctcttagact 22980

caggcgatcc tcccacctca gcttctcgag tagctgagac tacaggtgtg agccaccacc 23040

cctggctaat attttatttt ttgttgagat ggagtctcac tatgttgccc aggctggtct 23100

tgaactcatg gacttaagtg attctcccac cttggcctcc cagagtgctg ggattacagg 23160

tgggagccac catgcctggc cagggtcaca tcttattggc agtcctgagt cagggaacac 23220

cacagctatt ccaacagatc ttcctatctt tagatttcag ggagagatga gttgcttttc 23280

agttccttct cttccagaac gctatgggtc ccttatccaa gctgtgtgcc ttagggaggg 23340

aaagactctc ctggttaaga attcagatgc tggagttggg cagaccagga tttcagtccc 23400

gctttggctg tgtgaccttg ggcaagtcac tttcctctct gtttctgagt ttctccatct 23460

gtaaaatggg tgtcataata gtaactctta ttcccaggtt tgtctgaaga cgaaatgaga 23520

ttaggctcag tataacagat gggaactatt gttgacgatg acagtcataa taatatcctc 23580

ttatttaagc tactcttccg caggacctct ttgccaatgg ggagcttgag ctctgggacc 23640

cttaggtttg gggagggagg tgcctgtagg tgtgtatttc cctttggaag ccaaattttc 23700

atgcttttgt ttcctgcctc aggactcttc tccacagaga gctccaggca ctcacagaag 23760

ccatgtatac caacctccat gcagtgctgt tgggcgatgc tacagaagca ggcagtggct 23820

ggcacgagat gggtctcctc gacttctcct acagcttcct gctcaggtga ggctgtgcag 23880

Claims (10)

1.一种肺动脉高压的生物标志物，其特征在于，其包括：突变型PTGIS基因或突变型PTGIS蛋白；

其中，突变型PTGIS基因相对于野生型PTGIS基因的编码序列具有以下突变位点中的任意一种：c.755G>A以及c.1339G>A，或者，所述突变型PTGIS基因相对于野生型PTGIS基因的基因组序列具有g.23867G＞A突变；

其中，突变型PTGIS蛋白相对于野生型PTGIS蛋白具有以下突变位点中的任意一种：R252Q和A447T；

野生型PTGIS基因编码序列如SEQ ID NO.1所示，野生型PTGIS蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.2所示，野生型PTGIS基因的基因组如SEQ ID NO.9所示。

2.检测权利要求1所述的肺动脉高压的生物标志物的试剂。

3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述试剂含有用于检测所述突变型PTGIS基因的引物对。

4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述引物对选包括如下的至少一组：SEQID NO.3和SEQ ID NO.4；SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；以及SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。

5.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述试剂含有用于检测突变型PTGIS蛋白的特异性抗体。

6.一种检测如权利要求1所述的肺动脉高压的生物标志物的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求2-5中任一项所述的试剂。

7.一种筛选用于治疗或预防肺动脉高压的药物的方法，其特征在于，其包括：

将能够表达突变型PTGIS基因的第一生物样品置于存在候选药物的条件下培养；

将能够表达突变型PTGIS基因的第二生物样品置于不存在所述候选药物的条件下培养；

检测所述第一生物样品和所述第二生物样品中的6-keto PGF 1α表达水平；

如果所述第一生物样品的6-keto PGF 1α表达水平高于所述第二生物样品，则指示所述候选药物可作为用于治疗或预防肺动脉高压的药物；

其中，突变型PTGIS基因相对于SEQ ID NO.1所示的野生型PTGIS基因的编码序列具有以下突变位点中的任意一种：c.755G>A以及c.1339G>A，或者，所述突变型PTGIS基因相对于SEQ ID NO.9所示的野生型PTGIS基因的基因组序列具有g.23867G>A突变。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述生物样品为肺微血管内皮细胞。

9.一种用于治疗或预防肺动脉高压的药物，其特征在于，所述药物以患有肺动脉高压患者体内的突变型PTGIS基因或突变型PTGIS蛋白为靶点；

其中，突变型PTGIS基因相对于野生型PTGIS基因的编码序列具有以下突变位点中的任意一种：c.755G>A以及c.1339G>A，或者，所述突变型PTGIS基因相对于野生型PTGIS基因的基因组序列具有g.23867G>A突变；

其中，突变型PTGIS蛋白相对于野生型PTGIS蛋白具有以下突变位点中的一种或两种：R252Q和A447T；

野生型PTGIS基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示，野生型PTGIS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，野生型PTGIS基因的基因组序列如SEQ ID NO.9所示。

10.一种用于检测肺动脉高压的基因芯片，其特征在于，所述基因芯片上含有与突变型PTGIS基因cDNA序列特异性结合的探针，突变型PTGIS基因相对于野生型PTGIS基因具有以下突变位点中的任意一种：c.755G>A以及c.1339G>A，或者，所述突变型PTGIS基因相对于野生型PTGIS基因的基因组序列具有g.23867G>A突变；

所述探针与突变型PTGIS基因特异性结合的区域涵盖选自以下位置中的任意一种：相对于野生型PTGIS基因的基因组序列23867位，相对于野生型PTGIS基因的编码序列的第755位以及第1339位；

野生型PTGIS基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示，野生型PTGIS基因的基因组序列如SEQ ID NO.9所示。