CN109355378B

CN109355378B - 标志物clptm1在癫痫诊断和治疗中的应用

Info

Publication number: CN109355378B
Application number: CN201811490995.9A
Authority: CN
Inventors: 姜玉武; 栗金亮; 高凯
Original assignee: Peking University First Hospital
Current assignee: Peking University First Hospital
Priority date: 2018-12-07
Filing date: 2018-12-07
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2038-12-07
Also published as: CN109355378A

Abstract

本发明公开了一种标志物CLPTM1在癫痫诊断和治疗中的应用，利用该生物标志物可以在发病之初评估样本是否为癫痫患者样本；或作为孕前预警，判断该突变型CLPTM1基因携带者的后代是否具有患有癫痫的风险，并且，利用本发明提供的生物标志物可以研发治疗或预防癫痫的药物，为治疗或预防癫痫提供了一种全新的思路和手段，解决了目前癫痫研究领域中不能在发病前进行诊断的技术问题。

Description

标志物CLPTM1在癫痫诊断和治疗中的应用

技术领域

本发明涉及基因生物领域，尤其涉及癫痫相关的CLPTM1基因突变及其应用。

背景技术

癫痫是一种常见的神经系统疾病。世界上，癫痫的总体发病率为50/10万。儿童期癫痫的发病率更高，中国的癫痫患者有60％起源于小儿时期，0-14岁儿童癫痫的年发病率为151/10万，患病率为3.45‰(Ma 2012)。目前，癫痫尚属于临床难诊治性疾病。癫痫疾病大多数需要长期治疗，有些甚至需要终身治疗，其死亡率也显著高于正常人群。癫痫患者常合并其他躯体和精神疾病，给患者及其家庭带来沉重负担。虽然癫痫的发病机制和临床诊疗一直是研究的热点所在，但是癫痫的发病机制仍远未阐明，目前癫痫疾病的诊治还存在很多问题，如癫痫治疗仍处于控制发作的层面，还不能从病因学角度控制特发性癫痫的发生。这与目前癫痫的诊断水平密切相关。目前癫痫的主要诊断包括：体格检查和生化检查，脑电(EEG)和脑成像(主要为MRI)，这些技术可以诊断病人是否罹患癫痫，却往往不能明确癫痫发病的真正病因。所以，目前的癫痫诊断急需揭示病因的诊断技术。

发明内容

为解决癫痫医学领域中存在的技术问题，本发明提供一种癫痫的生物标志物，利用该生物标志物可以在发病之初评估样本是否为癫痫患者样本；或作为孕前预警，判断该突变型CLPTM1基因携带者的后代是否具有患有癫痫的风险，并且，利用本发明提供的生物标志物可以研发治疗或预防癫痫的药物，为治疗或预防癫痫提供了一种全新的思路和手段，解决了目前癫痫研究领域中不能在发病前进行诊断的技术问题。

为实现本发明的技术目的，本发明一方面提供一种CLPTM1基因的应用，用于制备诊断癫痫产品。

其中，所述产品包括检测样本中CLPTM1基因序列突变的试剂，其通过检测样本中CLPTM1基因序列是否发生突变来确定是否为癫痫患者样本；

其中，所述CLPTM1基因序列突变位点为c.1703G>A或c.1361G>A中的任一一种。

特别是，所述试剂包括具有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的引物对。

特别是，所述试剂包括具有如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的引物对。

为实现本发明的技术目的，本发明第二方面提供一种应用CLPTM1基因及其突变位点制备诊断癫痫的基因芯片的用途；

其中，所述CLPTM1基因的突变位点为c.1703G>A或c.1361G>A中的任一一种。

其中，所述基因芯片为能够与突变型CLPTM1基因cDNA序列特异性结合的探针。

需要说明的是，基于本发明提供的CLPTM1基因及其突变位点、并采用本领域常规技术制备的能够与突变型CLPTM1基因cDNA序列特异性结合的探针序列均属于本发明的保护范围。

为实现本发明的技术目的，本发明第三方面突变型CLPTM1蛋白用于制备诊断癫痫的特异性抗体的应用，所述特异性抗体能够检测样本中突变型CLPTM1蛋白，进而判断样本是否为癫痫患者样本。

其中，所述突变型CLPTM1蛋白对于野生型CLPTM1蛋白具有以下突变位点中的任意一种：R568Q或R454H。

需要说明的是，基于本发明提供的突变型CLPTM1蛋白、并采用本领域常规技术制备的能够与突变型CLPTM1蛋白发生特异性结合的抗体均属于本发明的保护范围。

为实现本发明的技术目的，本发明第四方面提供一种检测癫痫的试剂盒，包括具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的引物对。

其中，所述引物对还可以是具有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的引物对。

其中，所述试剂盒中还包括本领域常规使用的能够检测基因的试剂，例如用RT-PCR、实时定量PCR、新一代测序、原位杂交、芯片或免疫测定技术检测CLPTM1的试剂。

为实现本发明的技术目的，本发明第五方面提供一种初级筛选治疗或预防癫痫的药物的方法，包括：

将能够表达突变型CLPTM1基因的第一生物样品置于存在候选药物的条件下培养，获得待测第一生物样本；

将能够表达突变型CLPTM1基因的第二生物样品置于不存在所述候选药物的条件下培养，获得待测第二生物样本；

检测所述待测第一生物样品和所述待测第二生物样品中的GABA电流水平；

如果所述待测第一生物样品的GABA电流水平高于所述待测第二生物样品，则指示所述候选药物可作为用于治疗或预防癫痫的药物；

其中，突变型CLPTM1基因相对于野生型CLPTM1基因的编码序列具有以下突变位点中的任意一种：c.1703G>A以及c.1361G>A；

其中，所述第一生物样品与第二生物样品均来源于神经元细胞。

其中，所述候选药物为基于CLPTM1基因、或CLPTM1基因的突变位点或突变型CLPTM1蛋白位靶点所研发的药物。

特别是，所述药物包括但不限于能够抑制FIBCD1基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物；或特异性与CLPTM1编码的蛋白结合的结合分子(如能够抑制CLPTM1蛋白活性的抗体或配体)。

本发明具有以下有益效果：

本发明通过研究发现发现CLPTM1基因上存在2种与癫痫紧密相关的CLPTM1罕见变异，分别是c.1703G>A、c.1361G>A，上述变异一方面有助于解释癫痫患者的病因，另一方面可作为癫痫的生物标志物，利用该生物标志物可以在发病之初评估样本是否为癫痫患者样本；或作为孕前预警，判断该突变型CLPTM1基因携带者的后代是否具有患有癫痫的风险，并且，利用本发明提供的生物标志物可以研发治疗或预防癫痫的药物，为治疗或预防癫痫提供了一种全新的思路和手段，解决了目前癫痫研究领域中不能在发病前进行诊断的技术问题。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1提供的2种与癫痫紧密相关的罕见变异对应与基因组序列上的位置的结构模式图；

图2为本发明实施例1提供的人CLPTM1蛋白R568位点与其他物种的CLPTM1蛋白的部分同源对比分析结果；

图3为本发明实施例1提供的人CLPTM1蛋白R454位点与其他物种的CLPTM1蛋白的部分同源对比分析结果；

图4为本发明实施例2提供的分别对携带CLPTM1 c.1703G>A基因突变患者的部分测序结果；

图5为本发明实施例2提供的分别对携带CLPTM1 c.1361G>A基因突变患者的部分测序结果；

图6位本发明实施例4提供的p.R568Q和p.R454H变异影响GABA电流的功能验证结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的癫痫相关的CLPTM1基因突变及其应用进行具体说明。

本发明以200例基因诊断阴性的癫痫患者和1000名健康对照进行研究。首先，利用全外显子测序的方法对200例癫痫患者测序，发现CLPTM1基因的遗传变异在癫痫患者中富集(enrichment)。进一步的，在全部200例癫痫患者和1000名健康对照中，对CLPTM1基因进行检测，验证了CLPTM1基因变异c.1703G>A以及c.1361G>A与癫痫发病风险高度相关。

随后，对发现的上述2个变异(c.1703G>A以及c.1361G>A)进行了功能学实验两个错义突变即c.1703G>A和c.1361G>A影响了GABA受体的电流，确定了CLPTM1遗传变异位点的致病性。总体上，本发明确认了CLPTM1是一个全新的癫痫遗传易感基因，并提供了检测CLPTM1基因突变的试剂盒及应用，将CLPTM1基因与癫痫药物治疗联系起来，为癫痫的药物研发提供了新的靶点。

基于此，第一方面，本发明提供了一种癫痫的生物标志物，其包括：突变型CLPTM1基因或突变型CLPTM1蛋白；其中，突变型CLPTM1基因相对于野生型CLPTM1基因具有以下突变位点中的任意一种：c.1703G>A以及c.1361G>A；其中，突变型CLPTM1蛋白相对于野生型CLPTM1蛋白具有以下突变位点中的一种或两种：R568Q和R454H。野生型CLPTM1基因的编码序列如SEQ ID NO.5所示，野生型CLPTM1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

基因突变c.1703G>A理解为：与SEQ ID NO.5所示的野生型CLPTM1基因的编码序列相比，突变型CLPTM1基因的编码序列在第1703位由碱基G突变为碱基A；该突变位置对应于染色体上的位置为chr19:45495638G>A。

基因突变c.1361G>A理解为：与SEQ ID NO.5所示的野生型CLPTM1基因的编码序列相比，突变型CLPTM1基因的编码序列在第1361位由碱基G突变为碱基A其在对应的基因组序列上的位置。

需要说明的是，野生型CLPTM1基因全基因组序列第1-38762位的序列，野生型CLPTM1基因全基因组序列全长38762bp。蛋白突变R568Q理解为：与SEQ ID NO.6所示的野生型CLPTM1蛋白相比，突变型CLPTM1蛋白的氨基酸序列在第568位由氨基酸残基R突变为氨基酸残基Q；蛋白突变R454H理解为：与的野生型CLPTM1蛋白相比，突变型CLPTM1蛋白的氨基酸序列在第454位由氨基酸残基R突变为氨基酸残基H。

本发明第一方面提供的突变型CLPTM1基因或其相应的突变型CLPTM1蛋白可作为一种全新的癫痫的生物标志物，可用于评估患者患癫痫的风险；或者用于孕前预警，指示突变型CLPTM1基因携带者后代患有癫痫的风险。

第二方面，本发明提供了检测上述癫痫的生物标志物的试剂。

进一步地，在本发明本方面的一些实施方案中，上述试剂含有用于检测上述突变型CLPTM1基因的引物对。进一步地，在本发明本方面的一些实施方案中，上述引物对选自如下的一组或两组：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。进一步地，在本发明本方面的一些实施方案中，上述试剂含有用于检测突变型CLPTM1蛋白的特异性抗体。

第三方面，本发明提供了一种检测上述癫痫的生物标志物的试剂盒，其包括本发明第二方面的试剂。

第四方面，本发明提供了一种筛选用于治疗或预防癫痫的药物的方法，其包括：

将能够表达突变型CLPTM1基因的第一生物样品置于存在候选药物的条件下培养；

将能够表达突变型CLPTM1基因的第二生物样品置于不存在候选药物的条件下培养；

检测第一生物样品和第二生物样品中的GABA电流水平；如果第一生物样品的GABA电流水平高于第二生物样品，则指示候选药物可作为用于治疗或预防癫痫的药物；其中，突变型CLPTM1基因相对于SEQ ID NO.5所示的野生型CLPTM1基因的编码序列具有以下突变位点中的任意一种：c.1703G>A以及c.1361G>A。

进一步地，在本发明本方面一些实施方案中，上述生物样品为神经元细胞。当然，神经元细胞可以是人神经元细胞或者是鼠神经元细胞，或者是其他哺乳动物的神经元细胞。

第五方面，本发明提供了一种用于治疗或预防癫痫的药物，该药物以患有癫痫患者体内的突变型CLPTM1基因或突变型CLPTM1蛋白为靶点所研发的药物。

其中，所述药物包括但不限于能够抑制CLPTM1基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物；或特异性与CLPTM1编码的蛋白结合的结合分子(如能够抑制CLPTM1蛋白活性的抗体或配体)。

其中，突变型CLPTM1基因相对于野生型CLPTM1基因的编码序列具有以下突变位点中的任意一种：c.1703G>A以及c.1361G>A；其中，突变型CLPTM1蛋白相对于野生型CLPTM1蛋白具有以下突变位点中的一种或两种：R568Q和R454H。

其中，野生型CLPTM1基因的编码序列如SEQ ID NO.5所示，野生型CLPTM1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明提供的筛选用于治疗或预防癫痫的药物的方法和用于治疗或预防癫痫的药物均以上变异位点为靶点，这为治疗或预防癫痫提供了一种全新的思路和手段。

第六方面，本发明提供了一种用于检测癫痫的基因芯片，该基因芯片上含有与突变型CLPTM1基因cDNA序列特异性结合的探针，突变型CLPTM1基因相对于野生型CLPTM1基因具有以下突变位点中的任意一种：c.1703G>A以及c.1361G>A；

探针与突变型CLPTM1基因特异性结合的区域涵盖选自以下位置中的任意一种：相对于野生型CLPTM1基因的基因组序列chr19:45495638和chr19:chr19:45494145位，相对于野生型CLPTM1基因的编码序列的第1703位以及第1361位；野生型CLPTM1基因的编码序列如SEQ ID NO.5所示。

第七方面，本发明提供了一种患癫痫风险的评估方法，其包括：检测来自主体的待测样品中的待测CLPTM1基因的编码序列相对于野生型CLPTM1基因的编码序列是否存在以下突变中的任意一种：c.1703G>A以及c.1361G>A；如果检测结果显示待测CLPTM1基因的编码序列存在c.1703G>A以及c.1361G>A中任意一种突变，则指示主体患癫痫的风险高于携带正常CLPTM1基因的主体。其中，野生型CLPTM1基因的编码序列如SEQ ID NO.5所示。

需要说明的是，待测样品可以是包括但不限于来自主体任意部位的待测样品，例如可以是组织型样本如头发、细胞组织、指甲以及骨组织等；也可以是液体型样本如血液、尿液、唾液、黏液以及精液等。

另外，检测的方法包括但不限于：毛细管电泳-限制性片段长度多态性分析技术、RNase法、PCR技术、单链构象异构多态分析技术(SSCP)、RNA单链构象多态性检测技术(PCR-rSSCP)、双脱氧测序单链片段构象多态性分析技术(PCR-ddF)、限制性内切酶指纹技术(PCR-REF)、限制性片段长度多态性分析技术(RFLP)、PCR-寡核苷酸探针斑点杂交技术(PCR-ASb)、异质性双链构象多态性分析技术(HTX)\基因芯片技术以及各种新一代测序方法等。

进一步地，在本发明本方面一些实施方案中，主体为人。

第八方面，本发明提供了一种治疗癫痫的方法，其包括：向患有癫痫的患者施用以突变型CLPTM1基因或突变型CLPTM1蛋白为靶点的药物；

其中，突变型CLPTM1基因的编码序列相对于野生型CLPTM1基因的编码序列具有以下突变位点中的任意一种：c.1703G>A以及c.1361G>A；其中，突变型CLPTM1蛋白相对于野生型CLPTM1蛋白具有以下突变位点中的一种或两种：R568Q和R454H。野生型CLPTM1基因的编码序列如SEQ ID NO.5所示，野生型CLPTM1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

1、研究人群

为了研究CLPTM1基因与癫痫患者的关系，设置了两个组别进行分析，分别为患者组和对照组，具体如下：

1.1患者组

患者组以北京大学第一医院入选小儿癫痫患者为研究对象，具体纳入标准如下：

1)无明确围产期脑损伤史；

2)无明确的脑缺氧、缺血、中枢神经系统感染及头颅外伤史；

3)排除已知遗传代谢性疾病及遗传性神经变性病；

4)常规染色体核型正常；

5)已知癫痫基因检测为阴性。

收集入组患儿临床资料并与患儿监护人签署知情同意书，同时采集患儿及其父母外周血，使用QIAGEN试剂盒提取基因组DNA，共收集了200例核心家系的样本

对照组：千人基因组信息。

上述患者组和对照组的样本来源均为来自于人体，且无血缘关系。

需要说明的是，基因组DNA的提取还可以采用市售的任意一种能够实现基因提取的试剂盒。

2、全基因组分析

本申请利用Illumina HiSeq2500系统对患者组的200例样本进行全外显子测序，在全外显子组范围内检测罕见变异。尤其是对位于外显子区或外显子-内含子剪接区、影响蛋白编码、经生物信息学软件预测有害(Mutationtaster,SIFT,PloyPhen2)、等位基因频率极低(MAF<0.5％)的罕见变异进行分析，评测特定基因上罕见变异在200个患者中的聚集程度，得到可能与癫痫存在潜在关联的新的遗传易感基因。然后利用公共基因组数据库(GeneCards，PubMed，OMIM)对初步纳入的基因做进一步的生物信息功能注释，从而找到可能导致癫痫的基因。

经过全外显子组测序(WES)的200个癫痫患者样本中，平均每个样本产生4.3G的原始数据，平均测序覆盖率为99.2％，平均测序深度是100X，质控合格。由于癫痫是一种由罕见变异引起的罕见遗传性疾病，因此本发明主要关注位于外显子、功能上可能有害的罕见变异。并且在利用公共基因组数据库(GeneCards，PubMed，OMIM)对初步纳入的基因做进一步的生物信息功能注释时发现CLPTM1是膜蛋白，且调节GABA能神经元的活性，可能是和癫痫有密切关联的基因。因此，在后续研究中，将CLPTM1作为重点研究对象。

3、CLPTM1基因分析

经分析发现，患儿的CLPTM1基因中存在：(1)外显子错义突变c.1703G>A是，危险等位基因A在癫痫患者中的频率显著高于正常对照(0.5％vs0％)。

该位点的基因突变导致CLPTM1蛋白(SEQ ID NO.6)发生p.R568Q突变。

(2)外显子错义突变c.1361G>A，危险等位基因A在癫痫患者中的频率显著高于正常对照(0.5％vs0％)。

该位点的基因突变导致CLPTM1蛋白(SEQ ID NO.6发生p.R454H突变。

(3)总体基因水平，CLPTM1基因上2个罕见变异的频率在I癫痫患者显著高于对照(1％vs0％)。

其中，上述2个外显子错义突变的位点在基因组序列上发生的位置如图1所示，根据图1所示的基因组序列可知，CLPTM1基因有14个外显子，变异c.1703G>A的位置对应于CLPTM1基因的编码序列SEQ ID NO.5的第1703位；变异c.1361G>A的位置对应于CLPTM1基因的编码序列SEQ ID NO.5的第1361位。其中，c.1703G>A和c.1361G>A两种突变发生在CLPTM1基因的外显子上，可在SEQ ID NO.5编码序列上体现。

将CLPTM1蛋白的错义突变R568Q和R454H位点分别与其他物种的CLPTM1蛋白的部分进行同源对比，如图2和图3所示两个错义突变R568Q和R454H均位于蛋白保守区域。

因此，判断CLPTM1基因2个罕见变异位点与癫痫紧密相关。

实施例2序列验证

采用Sanger测序的方法，验证检测CLPTM1基因的2个突变位点，验证结果如图4和图5所示，根据图4、5所示的验证结果可知，患有癫痫的病人的CLPTM1基因发生了外显子错义突变c.1703G>A和c.1361G>A。

实施例3细胞学实验验证

GABA能神经元是中枢神经系统中主要的抑制性神经元，与癫痫有着密切的联系。GABA能神经元功能的下降将导致神经元网络的过度放电，从而引起癫痫，因此，本发明应用细胞学实验方法验证p.R568Q和p.R454H变异对GABA电流的影响，从而判断该变异与癫痫的关系。

为了探究上述的两个变异(p.R568Q和p.R454H变异)引起的两个单氨基酸替换对GABA能神经元的影响，本实施例分别构建了野生型(WT)和两种可表达具有R568Q或R454H突变位点的突变型质粒(c.1703G>A：p.R568Q和c.1361G>A：p.R454H)，并用构建的质粒瞬时转染CRL-2029细胞。在用单细胞膜片钳实验确定构建质粒成功转入CRL-2029细胞后，进一步测量GABA电流来评估突变对GABA能神经元活性的影响，具体步骤如下。

1、突变型质粒的构建

人工合成人源CLPTM1基因cDNA和突变体，并且插入到EGFP-N1中。对野生型和突变型质粒测序，确保质粒完整以及位点突变正确。

2、转染

使用Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)，将43种质粒(野生型质粒(WT)和两种突变质粒(R568Q和R454H))转染人神经元细胞CRL-2029细胞。

3、检测

转染质粒48h后，用检测GABA电流的水平。

4、结果分析

检测结果如图6所示，p.R568Q和p.R454H两种变异均能够使GABA电流的降低，显示其可以导致发生癫痫。

需要说的是，上述突变型质粒的构建、转染、检测等步骤均采用常规的生物学方法，所用试剂均为现有技术中能够实现上述步骤的试剂。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 北京大学第一医院

<120> 标志物CLPTM1在癫痫诊断和治疗中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtcctcgacc aaagtgtatg 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtcagcagga agccgtag 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtcagcgtct tcattggg 18

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcatcataca ctttggtcg 19

<210> 5

<211> 2010

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggcggcgg cgcaggaggc ggacggggcc cgcagcgccg tggtggcggc cgggggaggc 60

agctccggtc aggtgaccag caatggcagc atcgggaggg acccgccagc ggagacccag 120

cctcagaacc caccggccca gccggcaccc aatgcctggc aggtcatcaa aggtgtgctg 180

tttaggatct tcatcatctg ggccatcagc agttggttcc gccgagggcc ggcccctcag 240

gaccaggcgg gccccggagg agctccacgc gtcgccagcc gcaacctgtt ccccaaagac 300

actttaatga acctgcatgt gtacatctca gagcacgagc actttacaga cttcaacgcc 360

acgtcggcac tcttctggga acagcacgat cttgtgtatg gcgactggac tagcggcgag 420

aactcagacg gctgctacga gcactttgct gagctcgata tcccacagag cgtccagcag 480

aacggctcca tctacatcca cgtttacttc accaagagtg gcttccaccc agacccccgg 540

cagaaggccc tgtaccgccg gcttgccaca gtccacatgt cccggatgat caacaaatac 600

aagcgcagac gatttcagaa aaccaagaac ctgctgacag gagagacaga agcggaccca 660

gaaatgatca agagggctga ggactatggg cctgtggagg tgatctccca ttggcacccc 720

aacatcacca tcaacatcgt ggacgaccac acgccgtggg tgaagggcag tgtgccccct 780

cccctggatc aatatgtgaa gttcgacgcc gtgagcggtg actactatcc catcatctac 840

ttcaatgact actggaacct gcagaaggac tactacccca tcaacgagag cctggccagc 900

ctgccgctcc gcgtctcctt ctgcccactc tcgctttggc gctggcagct ctatgctgcc 960

cagagcacca agtcgccctg gaacttcctg ggtgatgagt tgtacgagca gtcagatgag 1020

gagcaggact cggtgaaggt ggccctgctg gagaccaacc cctacctgct ggcgctcacc 1080

atcatcgtgt ctatcgttca cagtgtcttc gagttcctgg ccttcaagaa tgatatccag 1140

ttctggaaca gccggcagtc cctggagggc ctgtccgtgc gctccgtctt cttcggcgtt 1200

ttccagtcat tcgtggtcct cctctacatc ctggacaacg agaccaactt cgtggtccag 1260

gtcagcgtct tcattggggt cctcatcgac ctctggaaga tcaccaaggt catggacgtc 1320

cggctggacc gagagcacag ggtggcagga atcttccccc gcctatcctt caaggacaag 1380

tccacgtata tcgagtcctc gaccaaagtg tatgatgata tggcattccg gtacctgtcc 1440

tggatcctct tcccgctcct gggctgctat gccgtctaca gtcttctgta cctggagcac 1500

aagggctggt actcctgggt gctcagcatg ctctacggct tcctgctgac cttcggcttc 1560

atcaccatga cgccccagct cttcatcaac tacaagctca agtctgtggc ccaccttccc 1620

tggcgcatgc tcacctacaa ggccctcaac acattcatcg acgacctgtt cgcctttgtc 1680

atcaagatgc ccgttatgta ccggatcggc tgcctgcggg acgatgtggt tttcttcatc 1740

tacctctacc aacggtggat ctaccgcgtc gaccccaccc gagtcaacga gtttggcatg 1800

agtggagaag accccacagc tgccgccccc gtggccgagg ttcccacagc agcaggggcc 1860

ctcacgccca cacctgcacc caccacgacc accgccacca gggaggaggc ctccacgtcc 1920

ctgcccacca agcccaccca gggggccagc tctgccagcg agccccagga agcccctcca 1980

aagccagcag aggacaagaa aaaggattag 2010

<210> 6

<211> 669

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Ala Ala Ala Gln Glu Ala Asp Gly Ala Arg Ser Ala Val Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gln Val Thr Ser Asn Gly Ser Ile Gly

20 25 30

Arg Asp Pro Pro Ala Glu Thr Gln Pro Gln Asn Pro Pro Ala Gln Pro

35 40 45

Ala Pro Asn Ala Trp Gln Val Ile Lys Gly Val Leu Phe Arg Ile Phe

50 55 60

Ile Ile Trp Ala Ile Ser Ser Trp Phe Arg Arg Gly Pro Ala Pro Gln

65 70 75 80

Asp Gln Ala Gly Pro Gly Gly Ala Pro Arg Val Ala Ser Arg Asn Leu

85 90 95

Phe Pro Lys Asp Thr Leu Met Asn Leu His Val Tyr Ile Ser Glu His

100 105 110

Glu His Phe Thr Asp Phe Asn Ala Thr Ser Ala Leu Phe Trp Glu Gln

115 120 125

His Asp Leu Val Tyr Gly Asp Trp Thr Ser Gly Glu Asn Ser Asp Gly

130 135 140

Cys Tyr Glu His Phe Ala Glu Leu Asp Ile Pro Gln Ser Val Gln Gln

145 150 155 160

Asn Gly Ser Ile Tyr Ile His Val Tyr Phe Thr Lys Ser Gly Phe His

165 170 175

Pro Asp Pro Arg Gln Lys Ala Leu Tyr Arg Arg Leu Ala Thr Val His

180 185 190

Met Ser Arg Met Ile Asn Lys Tyr Lys Arg Arg Arg Phe Gln Lys Thr

195 200 205

Lys Asn Leu Leu Thr Gly Glu Thr Glu Ala Asp Pro Glu Met Ile Lys

210 215 220

Arg Ala Glu Asp Tyr Gly Pro Val Glu Val Ile Ser His Trp His Pro

225 230 235 240

Asn Ile Thr Ile Asn Ile Val Asp Asp His Thr Pro Trp Val Lys Gly

245 250 255

Ser Val Pro Pro Pro Leu Asp Gln Tyr Val Lys Phe Asp Ala Val Ser

260 265 270

Gly Asp Tyr Tyr Pro Ile Ile Tyr Phe Asn Asp Tyr Trp Asn Leu Gln

275 280 285

Lys Asp Tyr Tyr Pro Ile Asn Glu Ser Leu Ala Ser Leu Pro Leu Arg

290 295 300

Val Ser Phe Cys Pro Leu Ser Leu Trp Arg Trp Gln Leu Tyr Ala Ala

305 310 315 320

Gln Ser Thr Lys Ser Pro Trp Asn Phe Leu Gly Asp Glu Leu Tyr Glu

325 330 335

Gln Ser Asp Glu Glu Gln Asp Ser Val Lys Val Ala Leu Leu Glu Thr

340 345 350

Asn Pro Tyr Leu Leu Ala Leu Thr Ile Ile Val Ser Ile Val His Ser

355 360 365

Val Phe Glu Phe Leu Ala Phe Lys Asn Asp Ile Gln Phe Trp Asn Ser

370 375 380

Arg Gln Ser Leu Glu Gly Leu Ser Val Arg Ser Val Phe Phe Gly Val

385 390 395 400

Phe Gln Ser Phe Val Val Leu Leu Tyr Ile Leu Asp Asn Glu Thr Asn

405 410 415

Phe Val Val Gln Val Ser Val Phe Ile Gly Val Leu Ile Asp Leu Trp

420 425 430

Lys Ile Thr Lys Val Met Asp Val Arg Leu Asp Arg Glu His Arg Val

435 440 445

Ala Gly Ile Phe Pro Arg Leu Ser Phe Lys Asp Lys Ser Thr Tyr Ile

450 455 460

Glu Ser Ser Thr Lys Val Tyr Asp Asp Met Ala Phe Arg Tyr Leu Ser

465 470 475 480

Trp Ile Leu Phe Pro Leu Leu Gly Cys Tyr Ala Val Tyr Ser Leu Leu

485 490 495

Tyr Leu Glu His Lys Gly Trp Tyr Ser Trp Val Leu Ser Met Leu Tyr

500 505 510

Gly Phe Leu Leu Thr Phe Gly Phe Ile Thr Met Thr Pro Gln Leu Phe

515 520 525

Ile Asn Tyr Lys Leu Lys Ser Val Ala His Leu Pro Trp Arg Met Leu

530 535 540

Thr Tyr Lys Ala Leu Asn Thr Phe Ile Asp Asp Leu Phe Ala Phe Val

545 550 555 560

Ile Lys Met Pro Val Met Tyr Arg Ile Gly Cys Leu Arg Asp Asp Val

565 570 575

Val Phe Phe Ile Tyr Leu Tyr Gln Arg Trp Ile Tyr Arg Val Asp Pro

580 585 590

Thr Arg Val Asn Glu Phe Gly Met Ser Gly Glu Asp Pro Thr Ala Ala

595 600 605

Ala Pro Val Ala Glu Val Pro Thr Ala Ala Gly Ala Leu Thr Pro Thr

610 615 620

Pro Ala Pro Thr Thr Thr Thr Ala Thr Arg Glu Glu Ala Ser Thr Ser

625 630 635 640

Leu Pro Thr Lys Pro Thr Gln Gly Ala Ser Ser Ala Ser Glu Pro Gln

645 650 655

Glu Ala Pro Pro Lys Pro Ala Glu Asp Lys Lys Lys Asp

660 665

Claims

1.检测 CLPTM1 基因突变的试剂在制备诊断癫痫产品中的应用，其特征在于，所述产品包括检测样本中编码序列如SEQ ID NO.5所示的 CLPTM1 基因序列突变的试剂，其通过检测样本中所述 CLPTM1 基因是否发生突变来确定是否为癫痫患者样本；

其中，所述 CLPTM1 基因序列突变位点为 c.1703G>A 或 c.1361G>A；

所述试剂具有如SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2 所示的核苷酸序列的引物对；或具有如 SEQ ID NO.3 和 SEQ ID NO.4 所示的核苷酸序列的引物对。

2.检测 CLPTM1 基因突变的试剂在制备诊断癫痫的基因芯片的用途，其特征在于，其通过检测样本中所述 CLPTM1 基因是否发生突变来确定是否为癫痫患者样本；

所述 CLPTM1 基因的编码序列如SEQ ID NO.5所示，所述 CLPTM1 基因突变位点为c.1703G>A 或 c.1361G>A。