MXPA01000481A - Metodos y materiales relacionados con polipeptidos tipo cd39 novedosos. - Google Patents

Abstract

La invencion proporciona polinucleotidos novedosos aislados, de bibliotecas de cDNA de un higado-bazo fetal humano y macrofago asi como los polipeptidos codificados por estos polinucleatidos y mutantes o variantes de estos. Los polipeptidos corresponden a una proteina tipo CD30 humana, novedosa. Otros aspectos de la invencion incluyen vectores que contienen polinucleotidos de la invencion y celulas hospederas relacionadas asi como los procesos para producir los polipeptidos tipo CD39 novedosos, y los anticuerpos especificos para estos polipeptidos.

Description

MÉTODOS Y MATERIALES RELACIONADOS CON POLIPEPTIDOS TIPO CD39, NOVEDOSOS 1. SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud de patente es una continuación en parte de la solicitud de Patente Estadounidense Serie No. 09/350,836 [Expediente del apoderado No. 28110/35761] / presentada el 9 de julio de 1999, que es una continuación en / / parte de la Solicxtud de Patente Estadounidense Serie No. 10 09/273,447, presentada el 19 de marzo de 1999, que es una continuación en parte de la Solicitud de la Patente Estadounidense Serie No. 09/122,449 presentada el 24 de julio de 1998 y también es una continuación en parte de la Solicitud de Patente Estadounidense Serie No. 09/244,444 15 presentada el 4 de febrero de 1999, que a su vez es una continuación de la Solicitud de Patente Estadounidense Serie No. 09/118,205 presentada el 6 de julio de 1998, las descripciones de todas las cuales se incorporan como referencia en la presente en sus enterezas. 20 2. CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere, en general, a los polinucleótidos novedosos aislados de bibliotecas de cDNA de higado-vaso fetal humano y macrofagos y a los polipéptidos 25 codificados por estos polinucleótidos. En particular, la invención se refiere a una proteina tipo CD39 humana con homologías para ATP difosfohidrolasas y variantes de éstas. 3. ANTECEDENTES La CD39 (agrupamiento o closter de diferenciación 39) es una molécula de la superficie celular reconocida por un "closter" de anticuerpos monoclonales que pueden utilizarse para identificar el linaje o la etapa de diferenciación de los linfocitos y de este modo para distinguir una clase de linfocitos de otra. Esta molécula CD39 fue definida originalmente como un marcador de linfocitos B (Rowe, M., y col., Int. J. Cáncer 29: 373 (1982)). Estudios posteriores han mostrado que CD39 es un marcador para una subserie distinta de linfocitos activados dentro de las células citotóxicas positivas para CD8 halo sensibilizadas (Gouttefangeas C, y col., Eur. J. Immunol . 22: 2681 (1992)). Fuera del tejido linfoide, la CD39 puede encontrarse en células endoteliales vasculares inactivas (Kansas, G. S., y col., J. Im unol 146: 2235 (1991)) y en todo el cerebro ratas en las neuronas de la corteza cerebral, el hipocampo y el cerebelo, asi como en células gliales (Wang, T-F. y Guidotti, G., Brain Res. 790:318 (1988) ) . La CD39 es una proteina de 510 aminoácidos con una masa molecular pronosticada de 57 kDa. No obstante, debido a su alta glucosilación en residuos de asparagina (seis sitios de glucosilación N potenciales) la molécula muestra una movilidad más cercana a 100 kDa (Maliszewski, C. R. y col., J. I munol. 153: 3574 (1994)). La CD39 contiene dos regiones hidrofóbicas, una cerca del amino terminal y la otra cerca del carboxilo terminal que son consideradas como regiones de transmembrana . Los informes que algunas ATP difosfohidrolasas (ATPDasas) comparten la homología en la secuencia de aminoácidos con CD39 han sido substanciados por la demostración que la propia CD39 es una ATPDasa (Wang, T-F., y col., J. Biol. Chem. 271: 9898 (1996); Kaczmarek, E.,y col., J. Biol. Chem. 271: 33116 (1996)). Dado que la CD39 es una enzima que se une a la membrana plasmática, la CD39 ha sido denominada una "ecto-ATPasa", pero la CD39 con más frecuencia es conocida como una "ecto-apyrasa" por la velocidad de hidrólisis reducida del ATP cuando se compara con las ecto-ATPasas . Esta actividad ha mostrado modular la reactividad y agregación de las plaquetas en respuesta a lesión vascular. Durante la lesión vascular, las plaquetas activadas se agregan formando un trombo oclusivo. La acumulación excesiva de las plaquetas en sitios de lesión vascular puede contribuir a oclusión de los vasos. Las células endoteliales responden a los efectos potencialmente oclusivos de la agregación de las plaquetas por diferentes mecanismos. Uno de estos mecanismos da origen a la eliminación de ATP mediado por ecto-apyrasa, que a su vez elimina la reactividad y el reclutamiento plaquetario. Ahora se sabe que la ecto-apyrasa endotelial responsable de esta eliminación de ATP es la CD39 (Marcus, A. J. y col., J. Clin. Invest. 99: 1351 (1997)). En la actualidad, la CD39 fue manipulada para producir una forma soluble de la molécula. Esta CD39 soluble mostró la misma actividad de nucleotidasa como la molécula unida a la membrana (Gayle, R. B. y col., J. Clin. Invest. 101: 1851 (1988) ) . La CD39 soluble, administrada por via intravenosa, también sigue siendo activa en ratones durante tiempo prolongado, indicando que la CD39 soluble puede ser útil como inhibidor de la agregación plaquetaria en la profilaxis o tratamiento de condiciones trombóticas medidas por plaquetas . Los inhibidores de la agregación plaquetaria (agentes antitrombóticos) disminuyen la formación o la acción de las señales químicas que favorecen la agregación de las plaquetas. Los agentes antitrombóticos actualmente disponibles incluyen aspirina, ticlopidina y dipiridamol. Estos agentes han mostrado ser benéficos en la prevención y tratamiento de enfermedades cardiovasculares oclusivas, incluido el infarto de miocardio, isquemia cerebral, angina.

El tratamiento antitrombótico también ha sido utilizado en el mantenimiento de injertos vasculares. El infarto de miocardio es el desarrollo de necrosis del miocardio (la capa muscular media de la pared del corazón) debido a un desequilibrio crucial entre la demanda de oxígeno y del miocardio [sic]. La causa más común de infarto de miocardio agudo es el estrechamiento de los vasos sanguíneos epicardiales debido a las placas ateromatosas. La ruptura de la placa con exposición subsiguiente de la membrana basal da origen a la agregación de las plaquetas y la formación del trombo, lo cual puede dar origen a una oclusión parcial o completa del vaso y posterior isquemia de miocardio. En la isquemia cerebral, el flujo sanguíneo inadecuado resulta de una oclusión en un vaso sanguíneo o hemorragia. En este último caso, el sangrado excesivo en un área del cerebro depriva otra área de sangre. Si ocurre daño en una sola área pequeña, se ocasiona isquemia cerebral "transitoria" o "localizada". Cuando se bloquea una arteria principal (arteria carótida, resulta isquemia global o difusa. La estrategia médica primordial para la prevención secundaria de accidente cerebro vascular es el tratamiento antiplaqueta. Actualmente se emplea aspirina para reducir el riesgo de ataques isquémicos transitorios o accidente cerebro vascular recurrentes en hombres que tienen isquemia transitoria de cerebro debido a coágulos de fibrina. Cada año, miles de pacientes sufren una disminución en el flujo sanguíneo hacia uno o más miembros. Sin flujo sanguíneo suficiente y, a menos que el flujo sanguíneo pueda ser reestablecido con el tiempo, el miembro debe ser amputado. En algunos casos, injertos de venas de pacientes pueden utilizarse para formar nuevas arterias. Sin embargo, en casos donde la calidad de las venas es deficiente, por lo común se utilizan injertos vasculares poliméricos. Los injertos poliméricos son inherentemente trombogénicos a medida que los constituyentes de la sangre pasan a través de los injertos éstos se activan y tienden a formar coágulos. Los esfuerzos para revestir los injertos con células endoteliales puede reducir la coagulación sanguínea, pero se obtienen mejores resultados cuando se emplea terapia antitrombótica . La' "angina de pecho es un dolor de pecho característico causado por flujo sanguíneo inadecuado a través de los vasos sanguíneos del miocardio. El desequilibrio entre suministro de oxígeno y su utilización puede resultar de un espasmo del músculo liso vascular o de obstrucción de los vasos sanguíneos causado por lesiones ateroscleróticas. Tres clases de medicamentos han demostrado ser eficaces en el tratamiento de angina: nitratos, bloqueadores beta y bloqueadores del canal de calcio. En la actualidad se emplean los antitrombóticos dipirida ol y aspirina para tratar de manera profiláctica la angina de pecho. Las ecto-apyrasas, como CD39, ofrecen numerosas ventajas sobre algunos de los antitrombóticos normales. Por ejemplo, el tratamiento con aspirina controla la acción protrombótica del tromboxano; sin embargo, la aspirina también evita la formación de prostaciclina antitrombótica, la cual limita la eficacia de la aspirina. Otro factor de relajación antitrombótico, proveniente del endotelio (óxido nítrico; "EDRF/NO") es inhibido in vi tro e in vivo por hemoglobina después de su difusión rápida en los eritrocitos. Por el contrario, la CD39 es insensible a la aspirina e inhibe completamente la reactividad de las plaquetas aún cuando se bloquea la producción de eicosanoide y EDRF/NO. La actividad ATPDasa de la CD39 también implica que la CD39 en la modulación de la neurotransmisión. El ATP es un neurotransmisor purinérgico importante que con frecuencia es co-liberado en el espacio sináptico con diferentes neurotransmisores. Las respuestas al ATP son mediadas por receptores de membrana plasmática específicos, denominados receptores purinérgicos P2 (Dubyak, G. R. y El-Montassim, C. Am J. Physiol. 34: C577-C606 (1993)). La distribución de CD39 en "el cerebro indica que la CD39 desempeña una función en la terminación de la neurotransmisión purinérgica P2 (Wang, T. F. GuicLotti, G. , Brain Res. 790: 318 (1998)).

Además, se considera que una disminución en la actividad de la ecto-apyrasa origina una acumulación del neurotransmisor excitatorio, el ATP extracelular, así como una deficiencia de la adenosina extracelular anticonvulsivante, endógena. La localización cromosómica de la CD39 ofrece apoyo adicional para una función en la modulación de la neurotransmisión. Más específicamente, la CD39 ha sido mapeada para el cromosoma lOq 23.1-24.1 (Maliszewski, C. R., y col., J. Immunol. 153: 3574 (1994)), y este sitio se superpone con el locus de susceptibilidad para epilepsia parcial humana con síntomas audiogénicos (Ottman, R. y col., Nature Genet. 10: 56 (1995)). Esta co-localización del gen de CD39 y el locus de susceptibilidad han originado la hipótesis que la disminución en la actividad de la ecto-apyrasa en cerebro es la causa primordial de la epilepsia parcial (Wang, T-F., y col., Mol. Brain Res. 47: 295 (1997) ) . Una exploración para los cDNA humanos que hibridan a cósmidos a partir de la región 9q34 del cromosoma humano dan origen a la identificación de un transcrito con alta homología para una ecto-ATPasa de músculo de pollo (60% de identidad) y la ecto-apyrasa CD39 (41% de identidad de aminoácidos) (Chadwick, B. P., Mamm. Genome 8 668 (1997)). Este gen, denominado el "gen 1 tipo CD39" (CD39L1) , tiene un mayor grado de homología para CD39 que la ecto-ATPasa de mus"culo de pollo. La actividad biológica de esta proteína no ha s'ido probada, pero con base en la alta homología de los aminoácidos, se considera que la CD39L1 es un nuevo miembro de J_á familia de las ecto-ATPasas. Recientemente, un gen de rat j^ ¿p homología para NTPasas fue clonado y secuenciado (Número de Acceso AF006482) por Chadwick y col., (Mamm. Gen. 9: 162-164 (1998) .) 4. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La invención se basa en los polinucleótidos aislados de las bibliotecas de cDNA preparadas a partir de hígado-vaso fetal humano y macrofagos. Las composiciones de la presente invención incluyen polipéptidos aislados, novedosos, con actividad apirasa y/o NDPasa, en particular polipéptidos tipo CD39 humanos, novedosos, y las variantes activas de estos, polinucleótidos aislados que codifican para estos polipéptidos, incluidas las moléculas de DNA recombinante, genes clonados o variantes degeneradas de estos, especialmente variantes que ocurren en la naturaleza como variantes alélicas, moléculas de polinucleótidos antisentido y anticuerpos que reconocen específicamente uno o más epítopes presentes en estos polipéptidos, así como hibridomas productores de estos anticuerpos. Las composiciones de la invención además incluyen vectores, incluidos los vectores de expresión que contienen polinucleótidos de la invención, células genéticamente manipuladas para contener estos polinucleótidos y células genéticamente manipuladas para expresar estos polinucleótidos . Los polinucleótidos aislados de la invención incluyen DNA natural o total o parcialmente sintético, por ejemplo, cDNA y DNA genómico, y RNA, por ejemplo, mRNA. ün polinucleótido de acuerdo con la invención codifica una proteína tipo CD39 novedosa teniendo la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2 (SEQ ID NO: 3), que ha sido denominada CD39-L4. En otra modalidad, un polinucleótido de acuerdo con la invención codifica una proteína tipo CD39 novedosa teniendo la longitud completa o la secuencia de aminoácidos madura establecida en la SEQ ID NO: 25, la cual ha sido denominada CD39-L66, y es una isoforma de CD39-L4. Los polinucleótidos aislados de la invención, incluyen un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 ó 24. Los polinucleótidos de la invención también incluyen polinucleótidos que codifican los polipéptidos con actividad biológica del polipéptido de la SEQ ID NO: 3 (incluida la actividad apirasa ó NDPasa) como puede ser: (a) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 ó 24, o (b) una secuencia de nucleótidos que codifica la longitud completa o la secuencia de aminoácidos madura de la SEQ ID NO: 3 ó 25; (c) un polinucleótido que es una variante alélica de cualquier polinucleótido antes mencionado; (d) un polinucleótido que hibride bajo condiciones estrictas a (a) ó (b) ; (e) o un polinucleótido que codifique para un polipéptido que consista en cuando menos un dominio tipo CD39, por ejemplo, el dominio catalítico. Los polinucleótidos de la invención además incluyen el complemento de cualquiera de los polinucleótidos antes mencionados . La invención también proporciona un polinucleótido que incluye una secuencia de nucleótidos que es substancialmente equivalente a este polinucleótido. Los polinucleótidos de acuerdo con la invención pueden tener cuando menos aproximadamente 80%, más normalmente cuando menos cerca de 90% y aún más normalmente cuando menos cerca de 95% identidad de secuencia para un polinucleótido de SEQ ID NO: 2 ó 24, y específicamente incluyen un polinucleótído human que tiene cuando menos 80% de identidad de secuencia para un polinucleótido de SEQ ID NO: 2 ó 24; o un polinucleótido que tiene cuando menos 90% de identidad de secuencia para un polinucleótido de la SEQ ID NO: 2 ó 24. Del mismo modo, los polipéptidos de la invención incluyen polipéptidos teniendo actividad de apirasa o NDPasa y cuando menos cerca de 80%, 90% ó 95% identidad de secuencia para SEQ ID NO: 3 ó 25. Otro aspecto de la invención es el desarrollo de las variantes novedosas ole CD39-L4 que de preferencia tienen mejorada la actividad ADPasa ó NDPasa en comparación con la CD39-L4 tipo silvestre (SEQ ID NO: 5) . Este aspecto de la invención incluye polipéptidos que consiste en cuando menos una sustitución de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en: D168-T, S170-Q y L175-F, en donde la(s) sustitución (es) da origen mayor actividad de ADPasa del polipéptido. Una modalidad preferida es el polipéptido teniendo la secuencia de aminoácidos que se establece en la SEQ ID NO: 7 (codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 6), que se una CD39-L4 variante que contiene las tres sustituciones que han sido denominadas ACRIII. ün plásmido que contiene este DNA fue depositado con la American Type Culture Collection (ATCC) 10801 University Avenue, Manassas, Virginia, en julio 13 de 1999 bajo los términos del tratado de Budapest (ATCC Número de Acceso PTA 346) . De otro modo, en lugar de preparar la(s) sustitución (es) de D168-T, S170-Q y/o L175-F específicas, se contempla la sustitución de los aminoácidos con propiedades similares. Además se contemplan las sustituciones conservativas adicionales en las posiciones de los aminoácidos diferentes de D168, S170 y/o L175. Por ejemplo, todos los aminoácidos correspondientes de CD39 pueden ser sustituidos por aminoácidos 167-181 de CD39-L66 ó CD39-L4.

Los polínucleótidos que codifican estos polipéptidos, los vectores y células hospederas que contienen tales polinucleótidos, los métodos de uso de estas células hospederas para producir polinucleótidos y otros productos terapéuticos que contienen los polinucleótidos (incluidas las proteínas de fusión en las cuales se fusiona el polipéptido tipo CD39 a un péptido o polipéptido heterólogo, como puede ser una región constante de inmunoglobulina con derivados en los que se modifica el polipéptido tipo CD39 mediante polímeros solubles en agua para incrementar su vida media) también están comprendidos por la invención, como son los métodos de tratamiento a un individuo que sufra de un trastorno relacionado con trombosis, coagulación o agregación plaquetaria administrando estos productos terapéuticos. Las técnicas de terapia génica también se proporcionan para modular estados de enfermedad asociados con expresión y/o actividad biológica de la CD39-L4. el suministro de un gen de CD39-L4 funcional a las células adecuadas se efectúa ex vivo, in si tu ó in vivo mediante el uso de vectores, y más específicamente vectores virales (por ejemplo, adenovirus, virus adenoasociados o un retrovirus) , o ex vivo mediante métodos de transferencia de DNA físicos (por ejemplo, liposomas o tratamientos químicos) . La invención también se refiere a los métodos para producir los polipéptidos de la invención que consisten en hacer crecer un cultivo de células de la invención en un medio de cultivo adecuado bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido deseado, y purificar la proteína de las células o el medio de cultivo. Las modalidades preferidas incluyen aquellas en las que la proteína producida por este proceso es una forma madura de la proteína. Las composiciones de proteína de la presente invención, que incluyen las composiciones terapéuticas, contienen polipéptidos de la invención y opcionalmente un portador aceptable, como puede ser un portador o vehículo hidrofílico (por ejemplo, aceptable para uso farmacéutico) . Los polinucleótidos de acuerdo con la invención tienen diversas aplicaciones en una variedad de técnicas conocidas por los expertos de la biología molecular. Estas técnicas incluyen el uso como sondas de hibridación, el uso como oligómeros para PCR, el uso para mapeo de cromosomas y genes, el uso en la producción recombinante de proteínas y el uso en la generación de DNA ó RNA antisentido, sus análogos químicos y similares. Por ejemplo, debido a que la expresión de mRNA para CD39-L4 esta restringida en gran medida a macrófagos, los polinucleótidos de la invención pueden utilizarse como sondas de hibridación para detectar la presencia de mRNA de macrófago en una muestra utilizando, por ejemplo, hibridación in si tu . En otras modalidades ejemplares, los polinucleótidos se utilizan en diagnósticos como etiquetas de secuencia expresadas para identificar genes expresados o, como es bien sabido en la técnica y ejemplificado por Vollrath y col., Science 258: 52-59 (1992), como etiquetas de secuencias expresadas para el mapeo físico del genoma humano. Un polinucleótido de acuerdo con la invención puede ser unido a cualquiera de una variedad de otras secuencias de nucleótidos por las técnicas del DNA recombinante bien establecidas (véase Sambrook, J. y col., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY) . Las secuencias de nucleótidos útiles para la unión a los polipéptidos incluyen un ordenamiento de vectores, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, derivados de fago lambda, fagénidos y similares, que son bien conocidos en la técnica. Por consiguiente, la invención también ofrece un vector que incluye un polinucleótido de la invención y una célula hospedera que contiene el polinucleótido. En general, el vector contiene un origen de replicación funcional en cuando menos un organismo, sitios de la endonucleasa de restricción convenientes y un marcador seleccionable para la célula hospedera. Los vectores de acuerdo con la invención incluyen vectores de expresión, vectores de replicación, vectores para la generación de sondas y vectores de secuenciación.

Una célula hospedera de acuerdo con la invención puede ser una célula procariótica o eucariótica y puede ser un organismo unicelular o parte de un organismo multicelular. Los polipéptidos de acuerdo con la invención pueden utilizarse en una variedad de procedimientos y métodos tradicionales que actualmente se aplican a otras proteínas. Por ejemplo, un polipéptido de la invención puede ser utilizado para generar un anticuerpo que se una específicamente al polipéptido. Los polipéptidos de la invención teniendo actividad de ATPDasa también son útiles para inhibir la agregación de plaquetas y por tanto pueden emplearse en la profilaxis o tratamiento de los estados patológicos causados por la respuesta inflamatoria. Los polipéptidos de la invención también pueden utilizarse como marcadores del peso molecular, y como un complemento alimenticio. Otro aspecto de la invención es un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de la invención. Tales anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales o policlonales, así como fragmentos de estos y las formas humanizadas o las formas completamente humanas, como aquellas producidas en animales transgénicos. La invención además ofrece un hibridoma que produce un anticuerpo de acuerdo con la invención y los anticuerpos anti-idiotipo. Los anticuerpos de la invención son útiles para la detección y/o purificación de los polipéptidos de la invención. También se proporcionan los métodos para la prevención, tratamiento o mejoría de un estado médico, que incluye las enfermedades trombóticas, que consiste en la administración a un individuo mamífero, que incluye pero no se limita a los humanos, una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que contiene un polipéptido de la invención o una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que contiene una contraparte de unión de (por ejemplo, el anticuerpo específicamente reactivo para) los polipéptidos tipo CD39 de la invención. La mecánica del estado o patología específico dictará si los polipéptidos de la invención o las contrapartes de unión (o inhibidores) de estos serian benéficos para el individuo en necesidad de tratamiento. La invención también ofrece un método para inhibir la función de las plaquetas consistiendo en la admisión de un polipéptido CD39-L4 de la invención a un medio que contenga plaquetas. De acuerdo con este método, los polipéptidos de la invención pueden ser administrados para producir una inhibición in vi tro o in vivo de la función plaquetaria. Un polipéptido de la invención puede ser administrado in vivo como agente antitrombótico solo o como un coadyuvante para otros tratamientos.

También se proporcionan los métodos para hidrolizar los nucleótido difosfatos consistiendo en la administración de los polipéptidos CD39-L4 de la invención a un medio que contenga los nucleótido difosfatos. De acuerdo con este método, los polipéptidos de la invención pueden ser administrados para producir hidrólisis in vi tro o in vivo de los nucleótido difosfatos. Un polipéptido de la invención puede ser administrado in vivo solo o como coadyuvante para otros tratamientos. La invención además ofrece los métodos de fabricación de medicamentos útiles en los métodos antes descritos relacionados con la agregación de plaquetas y trombosis. La invención también proporciona los métodos para detectar o cuantificar la presencia de los polinucleótidos o polipéptidos de la invención en un tejido o muestra de fluido, y los equipos correspondientes que contienen las sondas polinucleótidas o anticuerpos, junto con un estándar cuantitativo opcional. Estos métodos y equipos pueden ser utilizados como parte del pronóstico y diagnóstico en la evaluación de pacientes y para la identificación de individuos que presenten una predisposición a los estados mediados por plaquetas. La invención también proporciona los métodos para la identificación de los compuestos que modulan (es decir, aumentan o disminuyen) la expresión o actividad de los polinucleótidos y/o polipéptidos de la invención. Estos métodos pueden ser utilizados, por ejemplo, para la identificación de los compuestos y otras sustancias que interactúen con (por ejemplo, se unan a) los polipéptidos de la invención, y los ensayos para identificar los compuestos y otras sustancias que mejoren o inhiban la actividad de los polipéptidos de la invención, como pueden ser los ensayos que comprenden los pasos de medición de la actividad de estos polipéptidos en presencia y ausencia de los compuestos de prueba. 5. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra las secuencias de polinucleótidos de acuerdo con la invención. La SEQ ID NO: 1 fue obtenida de la biblioteca de cDNA b2HFLS20W utilizando la PCR normal, la secuenciación por análisis de señalización por hibridación y la tecnología de la secuenciación en gel de un solo paso. A-adenosina; C-citosina; G-guanosina, T-timina. Las posiciones ambiguas están designadas como sigue: R indica A ó G; M indica A ó C, W indica A ó T; Y indica C ó T; S indica C ó G; K indica G ó T; V indica A ó C ó G; H indica A ó C ó T; D indica A ó G ó T; B indica C ó G ó T; y N indica cualquiera de las cuatro bases. SEQ ID NO: 2 es una versión extendida de la SEQ ID NO: 1 que fue obtenida como se- describe en el Ejemplo 2.

La Figura 2 muestra una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 2. Esta secuencia esta designada como la SEQ ID NO: 3. El marco de lectura abierto que codifica la SEQ ID NO: 3 comienza en el nucleótido 246 (numerado a partir del extremo 5') de la SEQ ID NO: 2. A-alanina; R-arginina; N-asparagina; D-ácido aspártico; C-cisteína; E-ácido glutámico; Q-glutamina; G-glicina; H-histidina; I-isoleucina L-leucina; K-lisina; M-metionina; F-fenilalanina; P-prolina; S-serina; T-treonina; W-triptofano; Y-tirosina; V-valina; X-cualquiera de los 20 aminoácidos. La Figura 3 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 (identificada como "246 prot") y la CD39 humana ("CD39 Human. seq"). los residuos aminoácidos están designados como para la Figura 2. El alineamiento fue generado utilizando el método de Jotun Hein con la tabla de peso del residuo PAM250. Los espacios están indicados por rayas; los residuos que son idénticos entre las dos secuencias (dentro de una unidad de distancia) están entre cuadros. La Figura 4 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 (identificada como "264 prot") y la NTPasa de murino (mur ntpasa") . Los residuos de aminoácidos están designados como para la Aigura 2. El alineamiento fue generado como se describe para la Figura 3.

Los espacios están indicados por rayas; los residuos que son idénticos entre las dos secuencias (dentro de una unidad de distancia) están entre cuadros. La Figura 5 muestras las regiones conservadas apirasa (ACR) en CD39-L4 en negritas. La ACR I comienza en Phe 53, la ACR II comienza en Pro 124 y ACR III comienza en Met 167. Las secciones en cuadros destacan las sustituciones de aminoácidos que fueron hechas en la secuencia de aminoácidos de la CD39-L4 tipo silvestre para formar mutantes denominados ACR I, ACR II, y ACR III. La Figura 6 (SEQ ID NOS: 6 y 7) muestra el nucleótido y las secuencias de aminoácidos correspondientes de un mutante ACR III preferido que contiene las siguientes sustituciones en la secuencia de aminoácidos de CD39-L4 tipo silvestre: D168-T, S170-Q y L175-F. La Figura 7 muestra la actividad ADPasa de las variantes de CD39-L4 ACRI, ACRII, y ACRIII en comparación con CD39-L4 tipo silvestre: (1) CD39-L4 ACR I mutante; (2) CD39-L4 ACR II mutante; (3) CD39-L^ ACR III mutante; (4) CD39-L4 tipo silvestre; (5) sCD39; y (6) pSecTag2 vector (Invitrogen) . La Figura 8 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 25 (anteriormente identificada como SEQ ID NO: 5 en la Figura 5 de USSN 09/122,449) y CD39 humana ("CD39 human. seq"). El alineamiento fue generado utilizando el método de Jotun Hein con la tabla de peso de residuos PAM250. Los espacios están indicados por rayas; los residuos son idénticos entre las dos secuencias (dentro de una distancia unitaria) están en cuadros . La Figura 9 muestra el alineamiento de la secuencia de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 25 (anteriormente identificada como SEQ ID NO: 5 en la Figura 6 de USSN 09/122,449) y la NTPasa ("mur ntpasa") . El alineamiento fue generado como se describió para la Figura 8. Los espacios están indicados por rayas; los residuos que son idénticos entre las dos secuencias (dentro de una unidad de distancia) están en cuadros . 6. DESCRIPCIÓN DETALLADA 6.1 Definiciones El término "secuencia de nucleótidos" se refiere a un heteropolímero de nucleótidos o la secuencia de estos nucleótidos. Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" también se utiliza de manera indistinta en la presente para referirse a un heteropolímero de nucleótidos. En general, los segmentos de ácido nucleico proporcionado por esta invención pueden ser ensamblados a partir de fragmentos del genoma y ligadores oligonucleótidos cortos, o a partir de una serie de_ oligonucleótidos, para proporcionar un ácido nucleico sintético que sea capaz de ser expresado en una unidad transcripcional recombinante que contenga elementos reguladores provenientes de un operon microbiano o viral. Un "fragmento oligonucleótido" o un "fragmento polinucleótido", "porción" o "segmento" es una extensión de residuos de polipéptido nucleótido que es bastante larga para utilizar en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o diferentes procedimientos de hibridación para identificar o amplificar partes idénticas o relacionadas de moléculas de mRNA ó DNA. "Oligonucleótidos" o "sondas de ácido nucleico" se preparan con base en la secuencia de cDNA proporcionadas en la presente invención. Los oligonucleótidos contienen porciones de la secuencia de DNA teniendo cuando menos aproximadamente 15 nucleótidos y normalmente cuando menos cerca de 20 nucleótidos. Las sondas de ácido nucleico contienen porciones de la secuencia teniendo menos nucleótidos que aproximadamente 6 kb, por lo común menos que aproximadamente 1 kb. Después de las pruebas adecuadas para eliminar los falsos positivos, estas sondas pueden ser utilizadas para determinar si los mRNA están presentes en una célula o tejido o para aislar secuencias de ácido nucleico similares a partir de DNA cromosómico como esta descrito por Walsh, P. S. y col., (1992 PCR Methods Appl 1:241-250).

El término "sondas" incluye ácidos nucleicos naturales o recombinantes mono o bicatenarios o ácidos nucleicos químicamente sintetizados. Estos pueden ser etiquetados por traducción de la muesca, la reacción de Klenow, PCR u otros métodos bien conocidos en la técnica. Las sondas de la presente invención, su preparación y/o etiquetado se elaboran en Sambrook, J. y col., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold, Spring Harbor Laboratory, NY; o Ausubel, F. M. y col., (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, ambas incorporadas en la presente como referencia. El término "restrictivo" se utiliza para referirse a las condiciones que normalmente se entienden en la técnica como restrictivas. Una serie de condiciones ejemplares incluyen una temperatura de 60-70 °C (de preferencia aproximadamente 65°C) y una concentración de sal de 0.70 M a 0.80 M (de preferencia aproximadamente 0.75 M) . Otras condiciones ejemplares incluyen condiciones de hibridación que: (1) emplean baja concentración iónica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo, NaCl, 0.015 M/citrato de sodio 0.0015 M/SDS al 0.1% a 50°C; (2) emplear durante la hibridación un agente desnaturalizante como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (vol/vol) con albúmina de suero bovino al 0.1%/Ficoll al 0.1%/polivinilpirroli ona al' 0.1%/solución amortiguadora de fosfato de sodio 50 mM a pH 6.5 con NaCl 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42°C; o (3) emplear formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0.75 M pirofosfato de sodio 0.075 M, 5 x solución de Denhardt, DNA de esperma de salmón sonificado (50 g/ml), SDS al 0.1% y sulfato de dextran al 10% a 42°C, con lavados a 42°C en 0.2 x SSC y SDS al 0.1%. El término "recombinante" como se utiliza en la presente significa que un polipéptido o proteína proviene de sistemas de expresión recombinantes (por ejemplo, microbiano o de mamífero) . "Microbiano" se refiere a los polipéptidos o proteínas recombinantes preparados en sistemas de expresión bacterianos o micóticos (por ejemplo, levadura). Como un producto, "microbiano recombinante" define un polipéptido o proteína prácticamente libre de _ sustancias endógenas naturales y no acompañadas por glucosilación nativa, asociada. Los polipéptidos o proteínas expresados en la mayor parte de los cultivos bacterianos, por ejemplo, E. coli serán libres de modificaciones por glucosilación; los polipéptidos o proteínas expresados en levadura tendrán un patrón de glucosilación diferente del que se expresa en células de mamífero. El término "vehículo o vector de expresión recombinante" se refiere a un plásmido o fago o virus o vector, para expresar un polipéptido a partir de una secuencia de DNA (RNA) . El vehículo de expresión puede comprender una unidad transcripcional que consiste en un ensamble de: (1) un elemento o elementos genéticos teniendo una función reguladora en la expresión del gen, por ejemplo, promotores o potenciadores, (2) una secuencia estructural o codificante que sea transcrita en el mRNA y traducida en proteína, y (3) secuencias de iniciación y terminación de la transcripción adecuadas. Las unidades estructurales propuestas para uso en sistemas de expresión de levadura o eucarióticos de preferencia incluyen una secuencia líder que permite la secreción extracelular de la proteína traducida mediante una célula hospedera. De otro modo, donde la proteína recombinante se exprese sin una secuencia líder o de transporte, puede incluir un residuo de metionina N-terminal. Este residuo puede o no posteriormente ser disociado o desdoblado de la proteína recombinante expresada para proporcionar un producto final. "Sistema de expresión recombinante" significa células hospederas que tienen unidad transcripcional establemente integrada o recombinante en el DNA cromosómico o que lleva la unidad transcripcional recombinante extra cromosómicamente. Las células pueden ser procarióticas o eucarióticas. Los sistemas de expresión recombinante como se define en la presente expresará polipéptidos o proteínas heterólogos con la inducción de , elementos reguladores ligados al segmento del DNA o gen sintético que va a ser expresado.

El término "marco de lectura abierto", ORF, significa una serie de tripletes que codifican para los aminoácidos sin codones de terminación y es una secuencia que puede traducirse en proteína. El término "fragmento modulador de la expresión", EMF, significa una serie de moléculas de nucleótidos que modulan la expresión de un ORF ó EMF ligado de manera operante. Cuando se utiliza en la presente, se dice que una secuencia "modula la expresión de una secuencia ligada de manera operante" cuando la expresión de la secuencia se altera por la presencia del EMF. Los EMF incluyen, pero no se limitan a, promotores, y secuencias moduladoras del promotor (elementos inducibles) . Una clase de EMF son los fragmentos que inducen la expresión de un ORF ligado de manera operante en respuesta a un factor de regulación específico o suceso fisiológico. Cuando se utiliza en la presente, un "fragmento modulador de la captación", UMF, significa una serie de moléculas de nucleótidos que media la captación de un fragmento de DNA ligado en una célula. Los UMF pueden ser identificados fácilmente utilizando los UMF conocidos como una secuencia elegida o motivo elegido con los sistemas a base de computo conocidos en la técnica. La presencia y actividad de un UMF puede confirmarse mediante la unión del UMF sospechado a una secuencia marcadora. La molécula de ácido nucleico resultante entonces se incuba con un hospedero adecuado bajo condiciones apropiadas y se determina la captación de la secuencia marcadora. Como ya se describió, ~ un UMF aumentará la frecuencia de la captación de una secuencia marcadora ligada. "Activo" se refiere a aquellas formas del polipéptido que conservan las actividades biológicas y/o inmunológicas de algún polipéptido que ocurre en la naturaleza. "Polipéptido que ocurre en la naturaleza" se refiere a los polipéptido producidos por células que no han sido genéticamente manipuladas y contempla específicamente algunos polipéptidos que surgen de las modificaciones post-traduccionales del polipéptido que incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glucosilación, fosforilación, lipidación y acilación. "Derivado" se refiere a los polipéptidos químicamente modificados mediante técnicas como ubiquitinación, etiquetado (por ejemplo con radionúclidos o algunas enzimas", pegilación (derivación con polietilen glicol) e inserción o sustitución por síntesis química de aminoácidos como ornitina que no ocurren normalmente en las proteínas humanas . "Variante recombinante" se refiere a algún polipéptido diferente de los polipéptidos que ocurren en la naturaleza por inserciones, deleciones y sustituciones de aminoácidos creadas utilizando las técnicas del DNA recombinante. Los lineamientos en la determinación de los residuos de aminoácidos que pueden ser reemplazados, adicionados o delecionados sin abolir las actividades de interés, como el tráfico celular, pueden encontrarse comparando la secuencia del polipéptido específico con la de los péptidos homólogos y reduciendo al mínimo el número de cambios en la secuencia de aminoácidos hechas en las regiones de alta homología. De preferencia, las "sustituciones" de aminoácidos son el resultado de reemplazar un aminoácido con otro aminoácido teniendo propiedades estructurales y/o químicas similares, como puede ser el reemplazo de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato o una treonina con una serina, es decir, con sustituciones conservativas de aminoácidos. Las "inserciones o "deleciones" normalmente son en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida puede determinarse por medio de experimento marcando sistemáticamente las inserciones, deleciones o sustituciones de los aminoácidos en una molécula polipéptido utilizando las técnicas del DNA recombinante y ensayando la actividad de las variantes recombinantes resultantes. Cuando se utiliza en la presente, "substancialmente equivalente" puede referirse a las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos, por ejemplo una secuencia mutante, que varía de una secuencia de referencia por una o más sustituciones, deleciones o adiciones, el efecto neto de lo cual no conducirá a una desigualdad funcional adversa entre las secuencias de referencia y objeto. Por lo común, una secuencia mutante así varía de una de las listadas en la presente por no más que aproximadamente 20% (es decir el número de sustituciones, adiciones y/o deleciones en una secuencia mutante, en comparación con la secuencia listada correspondiente, dividida por el número total de residuos en la secuencia mutante es aproximadamente 0.2 o menos) . Se dice que una secuencia mutante así tiene 80% de identidad de secuencia con la secuencia listada. En una modalidad, una secuencia mutante de la invención varía de una secuencia listada por no más que 10% (90% de identidad de la secuencia) , en una variación de esta modalidad, por no más que 5% (identidad de secuencia 95%) , y en otra variación de esta modalidad, por no más de 2% (98% de identidad de la secuencia) . Las secuencias de aminoácidos mutantes de acuerdo con la invención generalmente tienen cuando menos 95% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos listada, mientras que la secuencia de nucleótidos mutante de la invención puede tener un porcentaje inferior de identidades de secuencia. Para los propósitos de la presente invención, las secuencias que tengan actividad biológica substancialmente equivalente y características de expresión substancialmente equivalentes son consideradas substancialmente equivalentes. Para los propósitos de determinación de la equivalencia, no debe considerarse la truncación de la secuencia madura. Cuando sea necesario, un vector de expresión puede ser designado para contener una "secuencia señal o líder" que dirija el polipéptido a través de la membrana de una célula. Una secuencia así puede estar presente en forma natural en los polipéptidos de la presente invención o proporcionado a partir de fuentes de proteínas heterólogas por las técnicas del DNA recombinante. Un "fragmento", "porción" o "segmento" de polipéptido es una extensión de residuos de aminoácidos de cuando menos aproximadamente 5 aminoácidos, con frecuencia cuando menos cerca de 7 aminoácidos, por lo común cuando menos cerca de 13 aminoácidos y, en las diferentes modalidades, cuando menos aproximadamente 17 o más aminoácidos. Para ser activo, cualquier polipéptido debe tener suficiente longitud para mostrar actividad biológica y/o inmunológica. De otro modo, las variantes recombinantes que codifican estos polipéptidos iguales o similares pueden ser sintetizados o seleccionados haciendo uso de "redundancia" en el código genético. Diversas sustituciones de codones, como las de los cambios silenciosos que producen diferentes sitios de restricción, pueden ser introducidos para optimizar la clonación en un plásmido o vector viral o expresión en un sistema procariótico o eucariótico específico. Las mutaciones en la secuencia de polipéptido pueden ser reflejadas en el polipéptido o los dominios de otros polipéptidos adicionados al polipéptido para modificar las propiedades de cualquier parte del polipéptido, para cambiar las características como afinidades de unión al ligando, afinidades entre cadenas o la velocidad de degradación/producción. Las células "activadas" cuando se utiliza en esta solicitud son aquellas que están involucradas en el tráfico extracelular o intracelular de membrana, que incluye la exposición de moléculas neurosecretoras o enzimáticas como parte de un proceso normal o de enfermedad. El término "purificada" cuando se utiliza en la presente determina que el ácido nucleico o polipéptido indicado esta presente en ausencia substancial de otras macromoléculas biológicas, por ejemplo, polinucleótidos, proteínas y similares. En una modalidad, el polinucleótido o polipéptido se purifica de modo que constituya cuando menos 95% en peso, de mayor preferencia cuando menos 99.8% en peso, de las moléculas biológicas indicadas presentes (pero pueden estar presentes agua, soluciones amortiguadoras y otras moléculas pequeñas, especialmente moléculas que tengan peso molecular menor que 1000 daltons) . El término "aislado" cuando se utiliza en la presente se refiere a un ácido nucleico o polipéptido separado de cuando menos otro componente (por ejemplo, ácido nucleico o polipéptidos) presente con el ácido nucleico o polipéptido en su fuente natural. En una modalidad, el ácido nucleico o polipéptido se encuentra en presencia de (si es que hay algo) solo un solvente, solución amortiguadora, ion u otro componente normalmente presente en una solución del mismo. Los términos "aislado" y "purificado" no comprende los ácidos nucleicos o polipéptidos presentes en su fuente natural. El término "infección" se refiere a la introducción de ácidos nucleicos en una célula hospedera conveniente mediante el uso de un virus o vector viral. El término "transformación" significa introducir DNA en una célula hospedera adecuada de modo que el DNA sea replicable, como un elemento extracromosómico o por integración al cromosoma. El término "transfección" se refiere a la captación de un vector de expresión mediante una célula hospedera conveniente, ya sea que alguna de las secuencias codificantes estén o no de hecho expresadas. El término "fragmento intermedio" significa un ácido nucleico entre 5 y 1000 bases de longitud, y de preferencia entre 10 y 40 pares de bases de longitud. Cada uno de los términos anteriores se entiende que comprende todos para los que esta descrito, a menos que el contexto dicte de otro modo 6.2 Condiciones de hibridación Las condiciones de hibridación adecuadas pueden ser determinadas de manera rutinaria mediante procedimientos de optimización o estudios piloto. Estos procedimientos y estudios se realizan de manera habitual por los expertos en la técnica para establecer protocolos para uso en el laboratorio. Véase, por ejemplo, Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1-2, John Wiley & Sons (1989); Sambrook, y col., Molecular Cloning A Laboratory Manual. 2nd Ed., vols. 1-3, Cold Springs Harbor Press (1989); y Maniatis, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor, New York (1982), todas las cuales se incorporan en la presente como referencia. Por ejemplo, las condiciones como temperatura, concentración de los componentes, hibridación y tiempos de lavado, componentes amortiguadores y sus pH y concentración iónica pueden variar. 6.3 cidos nucleicos de la invención Las secuencias que entran dentro del alcance de la presente invención no están limitadas a las secuencias específicas descritas en la presente, sino también incluyen variaciones alélicas de éstas. Las variaciones alélicas pueden determinarse de manera habitual comparando la secuencia proporcionada en las SEQ ID NOS: 1-2 ó 24, un fragmento representativo de estas o una secuencia de nucleótidos cuando menos 99.9% idéntica a la SEQ ID NO: 1-2 ó 24 con una secuencia de otro aislado de la misma especie.

Además, para acomodar la variabilidad del codón, la invención incluye moléculas de ácido nucleico que codifican para las mimas secuencias de aminoácidos como los ORF específicos aquí descritos. En otras palabras, en la región codificante de un ORF, la sustitución de un codón por otro que codifique el mismo aminoácido se contempla expresamente.

Cualquier secuencia específica en la presente descrita puede ser fácilmente detectada para errores mediante resecuenciación de un fragmento específico, como puede ser un ORF, en ambas direcciones (es decir, secuencia de ambas hebras) . La presente invención además proporciona construcciones recombinantes que contienen un ácido nucleico teniendo la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOS: ' 1-2 ó 24, la secuencia codificante de la proteína madura o un fragmento de esta. Las construcciones recombinantes de la presente invención comprenden un vector, como puede ser un plásmido o un vector viral, en el cual se inserta un ácido nucleico teniendo la secuencia de alguna de las SEQ ID NOS: 1-2 ó 24 o un fragmento de estas, en una orientación hacia adelante o inversa. En el caso de un vector que contenga uno de los ORF de la presente invención, el vector puede además contener secuencias reguladoras, que incluye, por ejemplo, un promotor, ligado de manera operante al ORF. Para vectores que contengan los EMF y UMF de la presente invención, el vector puede además contener una secuencia marcadora o ORF heterólogo ligado de manera operante- al EMF o UMF. Grandes cantidades de vectores y promotores adecuados son conocidos para los expertos en la técnica y están a la disposición en el comercio para generar las construcciones recombinantes de la presente invención. Se proporcionan los siguientes vectores a manera de ejemplo. Bacterianos: pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNHl6a, pNHlda, pNH46a (Stratagene); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia) . Eukaryotic: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXTI, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia) . Es posible seleccionar regiones promotoras a partir de algún gen deseado utilizando vectores CAT (cloranfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables. Dos vectores adecuados son pKK232-8 y pCM7. Promotores bacterianos mencionados particulares incluyen lacl, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, y trc. Los promotores eucarióticos incluyen CMV inmediato temprano, HSV timidina cinasa, SV40 temprano y tardío, los LTR de retrovirus y metalotioneina-I de ratón. La selección del vector promotor adecuados esta dentro del nivel del experto en la técnica. En general, los vectores de expresión recombinantes incluirán los orígenes de replicación y marcadores seleccionables que permitan la transformación de la célula hospedera, por ejemplo, el gen de resistencia a ampicilina de E. coli y S. cerevisiae el gen TRP1, y un promotor proveniente de un gen altamente expresado para dirigir la trascripción de una secuencia estructural corriente abajo. Tales promotores pueden ser obtenidos de operones que codifican las enzimas glucoliticas como 3-fosfoglicerato cinasa (PGK) , a-factor, ácido fosfatasa o proteínas de choque térmico, entre otras. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en la fase adecuada con secuencias de iniciación y terminación de la traducción, y de preferencia, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida hacia el espacio periplásmico o el medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluya un péptido de identificación N-terminal que imparta las características deseadas, por ejemplo, estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado. Los vectores de expresión útiles para uso bacteriano se construyen insertando una secuencia de DNA estructural que codifica para una proteína deseada junto con señales de iniciación y terminación de la traducción convenientes en la fase de lectura operable con un promotor funcional. El vector consistirá en uno o más marcadores seleccionables, fenotípicos y un origen de replicación para garantizar el mantenimiento del vector y para, si se desea, proporcionar amplificación dentro de los hospederos. Los hospederos procarióticos convenientes para la transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diferentes especies dentro del genero Pseudomonas , Streptomyces , y Staphylococcus , aunque también es posible emplear otras a elección. Como un ejemplo representativo pero no limitante, los vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden consistir en un marcador seleccionable y el origen de replicación bacteriano proveniente de plásmidos disponibles en el comercio consistes en elementos genéticos del vector de clonación pBR322 (ATCC 37017) bien conocido. Estos vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y GEM 1 (Promega Biotec, Madison Wl, EU) . Estas secciones "esqueleto" pBR322 están combinadas con promotor adecuado y la secuencia estructural que va a ser expresada. Después de la transformación de una cepa hospedera adecuada y del crecimiento de la cepa hospedera a una densidad celular adecuada, el promotor seleccionado se induce o desreprime por los medios adecuados (por ejemplo, el desplazamiento de la temperatura o inducción química) y las células se cultivan durante un periodo adicional. Las células normalmente se cosechan por centrifugación, se sometan a disrupción por medios químicos o físicos y el extracto crudo resultante se conserva para otra purificación. Incluidas dentro del alcance de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención están las secuencias de ácidos nucleicos que hibridan bajo condiciones restrictivas a un fragmento de las secuencias de DNA en la Figura 1, cuyo fragmento es mayor que aproximadamente 10 pb, de preferencia 20-50 pb, y aún mayores que 100 pb, incluidas 200 pb o mayor, 300 pb o mayor, 400 pb o mayor y 500 pb o mayor. De acuerdo con la invención, las secuencias de nucleótidos que codifican los ácido nucleico novedosos, o los equivalentes funcionales de estos, pueden utilizarse para generar moléculas de DNA recombinante que dirijan la expresión de este ácido nucleico, o un equivalente funcional de este en células hospederas adecuadas. Las secuencias de ácidos nucleicos de la invención además se dirigen a las secuencias que codifican variantes de los ácidos nucleicos descritos. Estas variantes de las secuencias de aminoácidos pueden prepararse por los métodos conocidos en la técnica introduciendo los cambios de los nucleótidos adecuados en un polinucleótido nativo o variante. Hay dos variables en la construcción en las variantes de las secuencias de aminoácidos: la localización de la mutación y la naturaleza de la mutación. Las variantes de las secuencias de aminoácidos de los ácido nucleico de preferencia se construyen mutando el polinucleótido para dar una secuencia de aminoácidos que no ocurra en la naturaleza. Estas alteraciones de aminoácidos pueden hacerse en sitios que digieran en los ácidos" nucleicos de diferentes especies (posiciones variables) o en regiones altamente conservadas (regiones constantes) . Los sitios de estas localizaciones normalmente serán modificados en serie, por ejemplo, sustituyendo primero con elecciones conservativas (por ejemplo, aminoácido hidrofóbico para un aminoácido hidrofóbico diferente) y luego con más elecciones distantes (por ejemplo, aminoácido hidrofóbico a un aminoácido con carga) , y luego las deleciones o inserciones pueden hacerse al sitio elegido. Las deleciones en la secuencia de aminoácidos generalmente abarcan desde aproximadamente 1 á 30 residuos, de preferencia cerca de 1 a 10 residuos, y por lo común son adyacentes, las inserciones de apnea incluyen fusiones amino y/o carboxilo terminales abarcando en longitud desde 1 hasta 100 o más residuos, así como inserciones intra secuencias de residuos de aminoácidos individuales o múltiples. Las inserciones intra secuencias pueden abarcar generalmente desde aproximadamente 1 hasta 10 residuos amino, de preferencia desde 1 hasta 5 residuos. Los ejemplos de las inserciones terminales incluyen las secuencias de señales heterólogas necesarias para la secreción o para la elección intracelular en diferentes células hospederas. En un método preferido, los polinucleótidos que codifican los ácidos nucleicos novedosos se cambian por mutagénesis dirigida al sitio. Este método utiliza secuencias de oligonucleótidos que codifican la secuencia del polinucleótido de la variante de aminoácidos deseada, así como un nucleótido bastante adyacente en ambos lados del aminoácido que cambio para formar un dúplex estable en cualquier lado del sitio que va a ser cambiado. En general, las técnicas de mutagénesis dirigida al sitio son bien conocidas para los expertos en la técnica y esta técnica se ejemplifica mediante publicaciones como, Edelman y col., DNA 2: 183 (1983) . Un método muy práctico y eficiente para producir cambio específicos del sitio en una secuencia de polinucleótidos fue publicada por Zoller y Smith, Nucleic Acids Res. 10: 6487-6500 (1982).

También es posible utilizar la PCR para crear variantes de secuencias de aminoácidos de los ácidos nucleicos. Cuando se utilizan cantidades pequeñas del DNA plantilla como materia prima, el (los) iniciador (es) que difiere ligeramente en la secuencia de la región correspondiente en el DNA plantilla puede generar la variante de aminoácidos deseada. La amplificación de la PCR conduce a una población de fragmentos de DNA producto que difieren de la plantilla del polinucleótido que codifica el polipéptido en la posición especificada por el iniciador. Los fragmentos de DNA producto reemplazan la región correspondiente en el plásmido y esto da la variante de aminoácidos deseada. Otra técnica para generar variantes de aminoácidos es la técnica de mutagénesis de casetes descrita en Wells y col., Gene 34: 315 (1985); y otras técnicas de mutagénesis bien conocidas, como pueden ser, por ejemplo, las técnicas n Sambrook y col., supra, and Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, y col., Debido a la degeneración inherente del código genético, otras secuencias de DNA que codifiquen substancialmente la misma secuencia de aminoácidos _-o una funcionalmente equivalente pueden utilizarse en la práctica de la invención para la clonación y expresión de estos ácidos nucleicos novedosos. Estas secuencias de DNA incluyen aquellas que son capaces de hibridar a la secuencia de ácido nucleico novedosa adecuada bajo condiciones restrictivas. Además, el conocimiento de la secuencia de DNA proporcionada por la presente invención permite la modificación de células para permitir, o incrementar, la expresión de polipéptidos tipos CD39 endógenos. Las células pueden ser modificadas (por ejemplo, por recombinación homologas) para proporcionar mayor expresión tipo CD39 sustituyendo, en todo o en parte, el promotor tipo CD39 que ocurre en la naturaleza con todo o parte de un promotor heterólogo de modo que las células expresen polipéptidos tipo CD39 a una mayor concentración. El promotor heterólogo se inserta de tal manera que se liga de manera operante a las secuencias codificantes tipo CD39. Véase, por ejemplo, la Publicación Internacional del PCT No. WO 94/12650, la Publicación Internacional del PCR No. WO 92/20808 y la Publicación Internacional del PCR No. WO 91/09955. También se contempla que, además del DNA promotor heterólogo, el DNA marcador amplificable (por ejemplo, el gen ADA, DHR y el CAD multifuncional que codifica carbamil fosfato cintaza, aspartato transcarbamilasa, y dihidroorotasa) y/o el DNA intron pueden ser insertados junto con el DNA promotor heterólogo. Si se liga a la secuencia codificante tipo CD39, la amplificación del DNA marcador por los métodos de selección normales conducirá a las co-amplificación de las secuencias codificantes tipo CD39 en las células.

Los polinucleótidos de la presente invención también hacen posible el desarrollo, a través de, por ejemplo, recombinación homologa o estrategias knockout de animales que fallan en expresar polipéptidos tipo CD39 funcionales o que expresan una variante de un polipéptido tipo CD39. Estos animales son útiles como modelos para estudiar las actividades in vivo de los polipéptidos tipo CD39 así como para estudiar los moduladores de los polipéptidos CD39. 6.4 Identificación de los polimorfismos Los polimorfismos pueden ser identificados de diferentes maneras conocidas en la técnica las cuales todas generalmente incluyen la obtención de una muestra de un paciente, analizar el DNA de la muestra, opcionalmente involucrando el aislamiento o amplificación del DNA, e identificar la presencia del polimorfismo en el DNA. Por ejemplo, es posible utilizar la PCR para amplificar un fragmento del DNA genómico adecuado que luego pueda ser secuenciado. De otro modo, el DNA puede ser sometido a hibridación de oligonucleótidos específicos del alelo (en los cuales se hibridan los oligonucleótidos adecuados al DNA bajo condiciones que permitan la detección de un solo desacoplamiento de la base) o para un ensayo de extensión de un solo nucleótido (en el cual un oligo?ucleótido que híbrida inmediatamente adyacente a la posición del polimorfismo se extiende con uno o más nucleótidos marcados) . Además, el análisis del polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción tradicional (utilizando enzimas de restricción que proporcionan digestión diferencial del DNA genómíco dependiendo de la presencia o ausencia del polimorfismo) puede realizarse. De otro modo, un polimorfismo que conduzca a un cambio en la secuencia de aminoácidos podría también ser detectado detectando un cambio correspondiente en la secuencia de aminoácidos de la proteína, por ejemplo, mediante un anticuerpo especifico para la secuencia variante. 6.5 Hospederos La presente invención además proporciona células hospederas que contienen las SEQ ID NOS: 1-2 ó 24 de la presente invención, en donde el ácido nucleico ha sido introducido en la célula hospedera utilizando los métodos conocidos de transformación, transfección o infección. La célula hospedera puede ser una célula hospedera eucariótica superior como una célula de mamífero, una célula hospedera eucariótica inferior, como puede ser una célula de levadura, o la célula hospedera puede ser una célula procariótica, como puede ser una célula bacteriana La introducción de la construcción recombinante en la célula ho'spedera puede efectuarse mediante la transfección ~"de fosfato de calcio, DEAE, transfección mediada por dextrano o electroporación (Davis, L., y col., Basic Methods in Molecular Biology (1986)) . Las células hospederas que contiene una de las SEQ ID NOS: 1-2 ó 24 de la presente invención pueden utilizarse de modo tradicional para producir el producto génico codificado por el fragmento aislado (en el caso de un ORF) o puede utilizarse para producir una proteína heteróloga bajo el control del EMF. Es posible utilizar cualquier sistema hospedero/vector para expresar uno o más de los ORF de la presente invención. Estos incluyen, pero no se limitan a, hospederas eucarióticos como células HeLa, células Cv-1, células COS y células Sf9, así como hospederos procarióticos como E. coli y B. subtilis. Las células más preferidas son aquellas, que normalmente no expresan el polipéptido o proteína particular o que expresan el polipéptido o proteína a una concentración natural baja. Las proteínas maduras pueden ser expresadas en células de mamífero, levadura, bacterias, células de insecto u otras células bajo el control de los promotores adecuados. Los sistemas de traducción sin células también pueden emplearse para producir tales proteínas utilizando los RNA provenientes de las construcciones de DNA de la presente invención. La clonación y los vectores de expresión adecuados para uso con hospederos procarióticos y eucarióticos están descritos por Sambrook y col., en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold, Spring Harbor, Mew York (1989) , la descripción de la cual se incorpora en la presente como referencia. Diversos sistemas de cultivo de células de mamífero también pueden emplearse para expresar la proteína recombinante. Los ejemplos de los sistemas de expresión d mamífero incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñon de mono, descritos por Gluzman, Cell 23: 175 (1981), y otras líneas celulares capaces de expresión de un vector compatible, por ejemplo, las líneas de células C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamífero contendrán un origen de replicación, un promotor conveniente y también algunos sitios de unión al ribosoma necesarios, sitios de poliadenilación, sitios del donador y aceptor de empalme, secuencias de terminación transcripcional y secuencias no transcritas flanqueando en 5' . Las secuencias de DNA provenientes del genoma viral SV40, por ejemplo, el origen, el promotor temprano, el potenciador, empalme y sitios de poliadenilación de SV40 pueden utilizarse para proporcionar los elementos genéticos no transcritos necesarios . Los polipéptidos y proteínas recombinantes producidos en cultivos bacterianos normalmente se aislan por extracción inicial a partir de paquetes celulares, seguidos por uno o más pasos de salación, intercambio iónico acuoso o cromatografía de exclusión por tamaño. Los pasos de plegado de la proteína pueden utilizarse, según sea necesario, para completar la configuración de la proteínas madura. Por último, es posible emplear la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para los pasos finales de purificación. Las células microbianas que se emplean en la expresión de proteínas pueden ser sometidas a disrupción por cualquier método tradicional, que incluye el sitio de congelamiento-descongelamiento, sonificación, disrupción mecánica o el uso de agentes usantes de células. 6.6 Péptidos La presente invención además proporciona los polipéptidos aislados codificados por los fragmentos de ácidos nucleicos de la presente invención o por variantes degeneradas de los fragmentos de ácidos nucleicos de la presente invención. Los fragmentos pueden ser fusionados a moléculas portadoras como inmunoglobulinas para muchos propósitos, que incluyen el incremento de la valencia de los sitios de unión a la proteína. Por ejemplo, los fragmentos de la proteina pueden ser fusionados mediante secuencias "ligadoras" a la porción Fc de una inmunoglobülina. Para una forma bivalente de la proteína, como una fusión puede ser la porción Fc de una molécula IgG. También es posible utilizar otros , isotipos de inmunoglobulina para generar tales fusiones, por ejemplo, una fusión de proteína-IgM generaría una forma decavalente de la proteína de la invención. Los análogos de los polipéptidos de la invención pueden ser fusionados a otra porción o porciones, por ejemplo, la porción orientadora u otro agente terapéutico. Estos análogos pueden presentar propiedades mejoradas como actividad y/o estabilidad. Por "variante degenerada" se propone' fragmentos de nucleótidos que difieren de un fragmento de ácido nucleico de la presente invención (por ejemplo, un ORF) por secuencia de nucleótidos pero, debido a la degeneración del código genético, codifica una secuencia de polipéptidos idéntica. Los fragmentos de ácido nucleico preferidos de la presente invención son los ORF que codifican proteínas. La invención también proporciona las formas de longitud completa y maduras (por ejemplo, sin una secuencia individual o secuencia precursora) de polipéptidos tipo CD39. la forma de longitud completa de estas proteínas esta definida en el listado de secuencias por la traducción de la secuencia de nucleótidos de cada clon descrito. La forma madura de tal proteina puede obtenerse mediante la expresión del polinucleótido de longitud completa en 'una célula de mamífero u otra células hospedera conveniente. La secuencia de la forma madura de la proteínas también puede determinarse a partir de la secuencia de aminoácidos de la forma de longitud completa. Es posible utilizar una variedad de metodologías conocidas en la técnica para obtener cualquiera de los polipéptidos o proteínas aislados de la presente invención. A nivel más sencillo, la secuencia de aminoácidos puede ser sintetizada utilizando los sintetizadores de péptidos disponibles en el comercio, esto es particularmente útil en la producción de péptidos pequeños y fragmentos de péptidos más grandes. Los fragmentos son útiles, por ejemplo, en la generación de anticuerpos contra el polipéptido natural. En un método alternativo, el polipéptido o proteína se purifica a partir de células bacterianas que producen naturalmente el polipéptido o la proteina. Un experto en la técnica puede fácilmente seguir los métodos conocidos para aislar polipéptidos y proteínas a fin de obtener uno de los polipéptidos o proteínas aislados de la presente invención. Estos incluyen, pero no se limitan a inmunocromatografía, HPLC, cromatografía por exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de inmunoafinidad. Véase, por ejemplo, Scopes, Protein Purification: Principies and Practice, Springer-Verlag (1994); Sambrook y col., en Molecular Cloning: A Laboratory Manual: Aus'ubel, y col., Current Protocols In Molecular Biology.

Los polipéptidos y proteínas de la presente invención pueden, de otro modo ser purificados a partir de células que hayan sido alteradas para expresar el polipéptido o proteína deseada. Cuando se utiliza en la presente, se dice que una célula que va a ser alterada para expresar un polipéptido o proteína deseada cuando la célula, mediante la manipulación genética, se hace que produzca un polipéptido o proteína que normalmente no produce o el cual la célula normalmente no produce a un nivel inferior. Un experto en la técnica puede adaptar fácilmente los procedimientos para introducir y expresar secuencias recombinantes o sintéticas en células eucarióticas o procarióticas para generar una célula que produzca uno de los polipéptidos o proteínas de la presente invención. Los polipéptidos purificados se utilizan en ensayos de unión in vi tro que son bien conocidos en la técnica para identificar moléculas que se unen a los polipéptidos. Estas moléculas incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, moléculas pequeñas, moléculas de bibliotecas combinatorias, anticuerpos u otras proteínas. Las moléculas identificadas en el ensayo de unión entonces prueban para actividad antagonista o agonista en cultivos tisulares in vivo o modelos animales que son bien conocidos en la técnica. En resumen, las moléculas son tituladas en una pluralidad de cultivos celulares o animales y luego se prueban para muerte celular/animal o supervivencia prolongada del animal/células . Además, las moléculas de unión pueden ser acomplejadas con toxinas, por ejemplo, ricin o cólera, o con otros compuestos que sean tóxicos a las células. El complejo molécula de unión-tóxica entonces se orienta al tumor u otra célula mediante la especificidad de la molécula de unión para las SEQ ID NOS: 3-4. 6.7 Terapia génica Las mutaciones en el gen de tipo CD39 que conduce a la pérdida de la función normal del producto de gen de tipo CD39 fundamenta estados de enfermedad en humanos relacionados con CD39. La invención comprende los tratamientos génicos para restaurar la actividad tipo CD39 que de esta modo sería indicada en el tratamientos de estados de enfermedad. El suministro de un gen tipo CD39 funcional a las células adecuadas se efectúa ex vivo, in situ, o in vivo mediante el uso de vectores y, más específicamente vectores virales (por ejemplo, adenovirus, virus adenoasociados o retrovirus) o ex vivo mediante el uso de los métodos físicos para la transferencia del DNA (por ejemplo liposomas o tratamientcs químicos) . Véase, por ejemplo Anderson, Nature, suplemento del volumen 392, no 6679, pp.25-30 (1998). Para revisiones adicionales, de la tecnología de tratamientos génicos, véase Friedmann, Science, 244: 1275-1281 (1989); Verma, Scientific American: 68-84 (1990); y Miller, Nature, 357: 455-460 (1992). De otro modo, se contempla que en otros estados de enfermedad en humanos, la prevención de la expresión de o la inhibición de la actividad de polipéptidos tipo CD39 será útil en el tratamiento de estados de enfermedad. Se contempla que la terapia antisentido o terapia génica puede aplicarse para regular negativamente la expresión de los polipéptidos tipo CD39. 6.8 Depósito del clon Un plásmido conteniendo el DNA que codifica para el mutante ACR III fue depositado con la American Type Culture Collection (ATCC), 1081 University Avenue, Manassas, Virginia, el 13 de Julio de 1999 bajo el tratado de Budapest (ATCC número de acceso PTA 346) . 6.9 Anticuerpos En general, las técnicas para la preparación de anticuerpos polipéptidos y monoclonales, así como hibridomas capaces de producir el anticuerpo deseado son bien conocidos en la técnica (Campbell, A. M. Monoclonal Antibodies Technology: Laboratory Techniques in Bióchemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Ámsterdam, Holanda (1984); St. Groth y col., J. Immunol. 35: 1-21 (1990); Kohler y Milstein, Nature 256: 495-497 (1975)), la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor, y col., Immunology Today 4: 72 (1983); Colé, y col., Monoclonal Antibodies and Cáncer Theraphy, Alan R. Liss, Inc. (1985), pp. 77-96). Además, las técnicas para la preparación de anticuerpos quiméricos y humanizados (incluyendo los péptidos que contienen CDR y/o las secuencias que se unen al antígeno de los anticuerpos (son bien conocidas en la técnica. Cualquier animal (ratón, conejo, etc.) que se conozca para producir anticuerpos puede ser un inmunizado con un péptido o polipéptido de la invención. Los métodos para la inmunización son bien conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen la inyección subcutánea o intraperitoneal del polipéptido. Un experto en la técnica se da cuenta que la cantidad de la proteína codificada por el ORF de la presente invención utilizada para la inmunización variará con base en el animal que se inmunice, la antigenicidad del péptido y el sitio de inyección. La proteína que se utiliza como un inmunógeno puede ser modificada o administrada en un coadyuvante para aumentar la antigenicidad de la proteína. Los métodos para aumentar la antigenicidad de la proteína son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, el acoplamiento del antígeno con una proteína heteróloga (como globulina o gálactosidasa) o mediante la inclusión de un coadyuvante durante la inmunización. Para anticuerpos monoclonales, las células esplénicas de animales inmunizados se retiran, se fusionan con células de mieloma, como pueden ser las células de mieloma SP2/0-Agl4, y se deja que se convierta en células de hibridoma productoras de anticuerpos monoclonales. Es posible utilizar algunos de los numerosos métodos bien conocidos en la técnica para identificar la célula de hibridoma que produce un anticuerpo con las características deseadas. Estas incluyen la detección de hibridomas con un ensayo ELISA, análisis western blot o radioinmunoensayo (Lutz, y col., Exp. Cell Research. 175: 109-124 (1988)). Los hibridomas secretores de anticuerpos deseados se clonan y la clase y subclase se determina utilizando los procedimientos conocidos en la técnica (Campbell, A. M. Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques Ámsterdam, Holanda (1984)). Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (Patente Estadounidense 4,946,778) pueden ser adaptadas para producir anticuerpos monocatenarios para las proteínas de la presente invención. Para los anticuerpos policlonales, se aisla antisuero que contenga anticuerpos de animales inmunizados y se detecta la presencia de anticuerpos con la especificidad deseada utilizando uno de los procedimientos antes descritos . La presente invención además proporciona los anticuerpos antes descritos en forma marcada que pueda ser detectada. Los anticuerpos pueden ser marcados de manera detectable mediante el uso de radio isótopos, marcas de afinidad (como biotina, avidina, etc.), marcas enzimáticas (como peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, etc.) marcas fluorescentes (como FITC o rodamina, etc.), átomos paramagnéticos, etcétera. Los procedimientos para llevar a cabo estas marcas son bien conocidas en la técnica, por ejemplo, véase (Sternberger, L. A. y col., J. Histochem. Cytochem. 18: 315 (1970); Bayer, E. A. y col., Meth. Enzym. 62: 308 (1979); Engval, E. y col., Immunol. 109: 129 (1972); Goding, J. W. J. Immunol. Meth. 13: 215 (1976)). Los anticuerpos marcados de la presente invención pueden ser utilizados para ensayos in vivo, in vi tro e in si tu para identificar células o tejidos en los cuales se exprese un fragmento del polipéptido de interés, los anticuerpos también pueden ser utilizados directamente en tratamientos u otros diagnósticos. La presente invención además proporciona los anticuerpos andes descritos inmovilizados en un soporfe sólido. Los ejemplos de estos soportes sólidos incluyen plásticos como policarbonato, carbohidratos complejos como agarosa y sefarosa, resinas acrílicas y perlas de poliacrilamida y látex. Las técnicas para acoplar los anticuerpos a estos soportes sólidos son bien conocidas en la técnica (Weir, D. M. y col., "Handbook of Experimental Immunology" 4a edición, Blackwell Scientific Publications, Oxford, Inglaterra, capítulo 10 (1986); Jacob, W. D. y col., Meth. Enzym. 34 Academic Press, N. Y. (1974)). Los anticuerpos inmovilizados de la presente invención pueden ser utilizados para ensayos in vitro in vivo e in situ así como para purificación por inmunoafinidad de las proteínas de la presente invención. 6.10 Secuencias que pueden ser leidas por computador En una aplicación de esta modalidad, una secuencia de nucleótidos de la presente invención puede ser registrada en un medio legible por cómputo. Como se utiliza en la presente, "medio legible por cómputo" se refiere a cualquier medio que pueda ser leído y accesado directamente por una computadora. Tal medio incluye, pero no se limita a: medio de almacenamiento magnético, como pueden ser discos flexibles, medio de almacenamiento en disco duro, y cintas magnéticas; el medio de almacenamiento óptico, como puede ser el CD-ROM; medio de almacenamiento eléctrico como RAM o ROM; e híbridos de estas categorías como puede ser el medio de almacenamiento magnético/óptico. Un experto puede fácilmente apreciar como cualquiera de los medios legibles por cómputo actualmente conocidos puede utilizarse para crear una manufactura que contenga el medio legible por cómputo teniendo registrado en este una secuencia de nucleótidos de la presente invención. Cuando se utiliza en la presente, "registrado" se refiere a un proceso para almacenar información en un medio legible por cómputo. Un experto puede fácilmente adoptar cualquiera de los métodos actualmente conocidos para registrar información en un medio legible por cómputo para generar manufacturas conteniendo la información de la secuencia de nucleótidos de la presente invención. Una variedad de estructuras de almacenamiento de datos a la disposición para los artesanos expertos para crear un medio legible por cómputo teniendo registrado en este una secuencia de nucleótidos de la presente invención. La elección de la estructura para el almacenamiento de datos generalmente se basará en los medios elegidos para tener acceso a la información almacenada. Además, es posible utilizar una variedad de programas procesadores de datos y formatos para almacenar información de la secuencia de nucleótidos de la presente invención en un medio legible por cómputo. La información de las secuencias puede representarse en un archivo de texto de procesamiento de palabras, formateado en un programa o software disponible en el comercio como puede ser WordPerfect y Microsoft Word, o representado en la forma de un archivo ASCII, almacenado en una aplicación de base de datos, como puede ser DB2, Sybase, Oracle, o similares. El experto puede fácilmente adaptar cualquier número de formatos de estructuración del procesador de datos (por ejemplo, archivo de texto o base de datos) para obtener el medio legible por cómputo teniendo registrado en este la información de la secuencia de nucleótidos de la presente invención. Al proporcionar la secuencia de nucleótidos de las SEQ * ID NOS: 1-2 ó 24, o un fragmento representativo de este, o una secuencia de nucleótidos cuando menos 99.9% idéntica a las SEQ ID NOS: 1-2 ó 24 en una forma legible por cómputo, un experto puede tener acceso de manera habitual a la información de la secuencia para diferentes propósitos. El software de cómputo esta disponible al público lo cual permite a un experto tener acceso a la información de las secuencias proporcionadas en un medio legible por cómputo. El software que implementa el BLAST (Altschul, y col., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)) y BLAZE (Brutlag, y col., Comp. Chem. 17: 2D3-207 (1983)) busca algoritmos en un sistema Sybase puede utilizarse para identificar los marcos de lectura abiertos (los ORF) dentro de una secuencia de ácido nucleico. Estos ORF pueden ser fragmentos que codifican proteína y pueden ser útiles en la_ producción de proteínas comercialmente importantes como enzimas utilizadas en reacciones de fermentación y en la producción de metabolitos útiles en el comercio. Cuando se utiliza en la presente, "sistema a base de computo" se refiere al medio hardware, al medio software y al medio de almacenamientos de datos utilizado para analizar la información de la secuencia de nucleótidos de la presente invención. El medio hardware mínimo de los sistemas basados en computo de la presente invención consiste en una unidad de procesamiento central (CPU) , el medio de entrada, los medios de salida y medios de almacenamiento de datos. Un experto puede fácilmente apreciar que cualquiera de los sistemas a base de computo actualmente disponibles es conveniente para uso en la presente invención. Como se establece en lo anterior, los sistemas basados en computo de la presente invención contienen medios de almacenamiento de datos teniendo almacenados en estos una secuencia de nucleótidos de la presente invención y los medios hardware y los medios software necesarios para dar soporte e implementar un medio de búsqueda. Cuando se utiliza en la presente, "medio de almacenamiento de datos" se refiere a la memoria que puede almacenar la información de la secuencia de nucleótidos de la presente invención, o un medio de acceso a la memoria que pueda tener acceso a las manufacturas habiendo registrado en estas la información de la secuencia de nucleótidos de la presente invención. Cuando se utiliza en la presente, "medio de búsqueda" se refiere a uno o más programas que se implementan en el sistema a base de computo para comparar una secuencia 5 elegida o motivo estructural elegido con la información de la secuencia almacenada dentro de los medios de almacenamiento de datos. Los medios de búsqueda se utilizan para identificar fragmentos o regiones de una secuencia conocida que coincida con una secuencia elegida específica o ftF 10 motivo elegido. Una variedad de algoritmos conocíaos esta descrito públicamente y una variedad de software disponible en el comercio para realizar medios de búsqueda están y pueden ser utilizados en los sistemas a base de computo de la presente invención. Los ejemplos de estos software 15 incluyen, pero no se limitan a, MacPattern (EMBL) , BLASTN y BLASTA (NPOLYPEPTIDEIA) . Un experto puede fácilmente darse cuenta que cualquiera de los algoritmos disponibles o paquetes de software para implementación para realizar búsquedas de homologías puede ser adaptado para uso en los 20 sistemas de computo presentes. Cuando se utiliza en la presente, una "secuencia elegida" puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico o aminoácidos de seis o más nucleótidos o dos o más aminoácidos. El experto puede fácilmente darse cuenta que 25 cuanto mayor sea la secuencia elegida menos probabilidad existe de que una secuencia elegida estará presente como una ocurrencia a la aleatoria en la base de datos. La longitud de la secuencia más preferida de la secuencia elegida es de aproximadamente 10 a 100 aminoácidos o de aproximadamente 30 a 300 residuos de nucleótidos [sic] . No obstante, se reconocerá que las búsquedas para fragmentos comercialmente importantes, como los fragmentos de las secuencias involucradas en la expresión génica y el procesamiento de proteínas, puede ser longitud más corta. Cuando se utiliza en la presente, "un motivo estructural elegido", o "motivo elegido", se refiere a cualquier secuencia racionalmente seleccionada o combinación de secuencias en las cuales la(s) secuencia (s) se eligen con base en la configuración tridimensional que se forma con el dobles del motivo elegido. Hay una variedad de motivos elegidos conocidos en la técnica. Los motivos elegidos de proteínas incluyen, pero no se limitan a, sitios activos de enzimas y secuencias de señales. Los motivos elegidos de ácidos nucleótidos incluyen, pero no se limitan a, secuencias promotoras, estructuras de orquilla y elementos de expresión inducibles (secuencias de unión a proteínas) . 6.11 Secuencias moduladoras de la expresión Las secuencias EMF pueden ser identificadas dentro de un genoma por su proximidad a los ORF. Un segmento intergénico, o un fragmento de segmento intergénico, de aproximadamente 10 a 200 nucleótidos de longitud, tomado en 5' a partir de cualquier ORF modulará la expresión de un ORF 3' ligado de manera operante en un modo similar al que se encuentra con la secuencia del ORF ligado en forma natural. Cuando se utiliza en la presente, un "segmento intergénico" (se refiere a los fragmentos de un genoma que están entre 2 ORF(S) en la presente descritos. De otro modo, los EMF pueden ser identificados utilizando los EMF conocidos como una secuencia elegida o motivo elegido en los sistemas de computo de la presente invención. La presencia y actividad de un EMF puede ser confirmada utilizando un vector trampa EMF. Un vector trampa EMF contiene un sitio de clonación 5' a una secuencia marcadora. Una secuencia marcadora codifica un genotipo identificable, como puede ser la resistencia a antibióticos a un factor auxotrófico de nutrición de complemento, que puede ser identificado o ensayado cuando el vector trampa EMF se coloca dentro de un hospedero adecuado bajo condiciones adecuadas. Como ya se describió, _ un EMF modulará la expresión de una secuencia marcadora ligada de manera operante. Una discusión más detallada de las diferentes secuencias marcadoras se proporciona a continuación. Una secuencia que se sospecha es un EMF se clona en los tres marcos de lectura en uno o más sitios de restricción corriente arriba de la secuencia marcadora en el vector trampa EMF. El vector entonces se transforma en un hospedero adecuado utilizando los procedimientos conocidos y el fenotipo del hospedero transformado se examina bajo condiciones adecuadas. Como se describe en lo anterior, un EMF modulará la expresión de una secuencia marcadora ligada de manera operante. 6.12 Formación de la triple hélice Además, los fragmentos de la presente invención, como se describió ampliamente, pueden ser utilizados para controlar la expresión génica a través de la formación de la triple hélice o DNA o RNA antisentido, ambos de estos métodos se basan en la unión de una secuencia de pollnucléotidos al DNA o RNA. Los polinucléotidos convenientes para uso en estos métodos por lo coinún son 20 a 40 bases de longitud y están diseñados para ser complementarios a una región de gen involucrada en la transcripción (triple hélice-véase Lee y col., Nucí. Acids Res. 6: 3073 (1979); Cooney, y col., Science 15241: 456 (1988); y Dervan, y col., Science 251: 1360 (1991) ; o para el propio mRNA (antisentido-Olmno, J. Neurochem. 56: 560 (1991); Oligodeoxinucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Ratón, FL (1988) ) . La formación de la triple hélice conduce en su forma óptima a una interrupción de la transcripción del RNA a partir del DNA, mientras que la hibridación del RNA antisentido bloquea la traducción de una molécula mRNA en el polipéptido. Ambas técnicas han sido demostradas como eficaces en los sistemas modelo. La información contenida en las secuencias de la presente invención es necesaria para el diseño de un oligonucleótido antisetido o de triple hélice. 5.13 Ensayos de diagnóstico y equipos La presente invención además ofrece los métodos para identificar la expresión de uno o más de los ORF de la presente invención, u homólogo de estos, en una muestra de prueba, utilizando una sonda de ácidos nucleótidos o anticuerpos de la presente invención. En detalle, estos métodos consisten en incubar una muestra de prueba con uno o más de los anticuerpos o uno o más de las sondas de ácidos nucleicos de la presente invención y ensayar la unión de las sondas de ácidos nucleidos o anticuerpos a los componentes dentro de la muestra de prueba. Las condiciones para incubar una sonda de ácido nucleico o anticuerpo con una muestra de prueba pueden variar. Las condiciones de incubación dependen del formato empleado en el ensayo, los métodos de detección„empleados y el tipo y naturaleza de la sonda de ácido nucleico o anticuerpo utilizado en el ensayo. Un experto en la técnica se dará cuenta que cualquiera de los formatos de ensayo de hibridación, amplificación o ensayo inmunológico pueden ser fácilmente adaptados para emplear las sondas de ácido nucleico o anticuerpos de la presente invención. Los ejemplos de estos ensayos pueden encontrarse en Chard, T., An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, Elsevier Science Publishers, Amasterdam, The Netherlands (1986); Bullock, G. R. y col., Techniques in Immunocytochemistry, Academic Press, Orlando FL vol. 1 (1982), vol 2 (1983), vol 3 (1985); Tijssen, P., Practice and Theory of immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1985) . Las muestras de la presente invención incluyen células, proteínas o extractos de membrana de células, o fluidos biológicos como esputo, sangre, suero, plasma u orina. La muestra de prueba utilizada en el métodos antes descrito variará con base en el formato del ensayo, la naturaleza del métodos de detección y los tejidos, célula o extractos que se utilicen como la muestra para ser ensayados. Los métodos para preparar extractos de proteina o extractos de membrana de célula son bien conocidos en la y pueden ser fácilmente adaptados para obtener una muestra que sea compatible con el sistema que se utilice.

Las muestras de la prueba de la presente invención incluyen células proteínas o extractos de membrana de células, o fluidos biológicos como esputo, sangre, suero, plasma u orina. La muestra de prueba utilizada en el método antes descrito variará con base en el formato del ensayo, la naturaleza del método de detección y los tejidos, células o extractos que se utilicen como la muestra para ser ensayada. Los métodos para preparar extractos de proteína o extractos de membrana de células son bien conocidos en la técnica y pueden ser fácilmente adaptados para obtener una muestra que sea compatible con el sistema que utilice. En otra modalidad de la presente invención, se proporcionan los equipos que contienen ' los reactivos necesarios para llevar a cabo los ensayos de la presente invención. Específicamente, la invención proporciona un equipo con compartimientos para recibir, en un confinamiento cerrado, uno o más recipientes que, el cual consiste en: (a) un primer recipiente que contiene una de las sondas o anticuerpos de la presente invención; y (b) uno o más de otros recipientes que contenga uno o más de lo siguiente: reactivos de lavado, reactivos capaces de detectar la presencia de una sonda o anticuerpo unido. Con detalles un equipo de compartimientos incluye cualquier equipo en el que los reactivos están contenidos en recipientes separados. Estos recipientes incluyen recipientes de vidrios pequeños, recipientes de plástico o tiras de plástico o papel. Estos recipientes permiten transferir de manera eficaz los reactivos de un compartimiento a otro compartimiento de modo que las muestras y reactivos no presenten contaminación cruzada, y los agentes o soluciones de cada recipiente pueden ser adicionados en un modo cuantitativo de un compartimiento a otro. Estos recipientes incluirán un recipiente que aceptara la muestra de prueba, un recipiente que contiene los anticuerpos utilizados en el ensayo, recipientes que contienen reactivos de lavado (como salina amortiguada con fosfato, soluciones amortiguadoras tris, etc.) y recipientes que contienen los reactivos utilizados para detectar el anticuerpo o sonda unida. Los tipos de reactivos de detección incluyen sondas de ácido nucleicos marcados, anticuerpos secundarios marcados o, en la alternativa, si el anticuerpo primario esta marcado, los reactivos enzimáticos o de unión al anticuerpo que son capaces de reaccionar con el anticuerpo marcado. Un experto en la técnica fácilmente reconocerá que las sondas y anticuerpos descritos de la presente invención pueden ser fácilmente incorporados en uno de los formatos de equipos establecidos que son bien conocidos en la técnica. 6.14 Ensayos de detección Utilizando las proteínas aisladas de la presente invención, la presente invención además ofrece los métodos para la obtención e identificación de los agentes que se unen a una proteína codificada por uno de los ORF a partir de un ácido nucleico con una secuencia de una de las SEQ ID NOS: 1-12 ó 24, o a un ácido nucleico con una secuencia de una de las SEQ ID NOS: 1-2 ó 24. En detalle, el método consiste en los pasos de: (a) poner en contacto un agente con una proteína aislada codificada por uno de los ORF de la presente invención, o ácido nucleico de la invención; y (b) determinar si el agente se une a la proteína o ácido nucleico. Los agentes detectados en el ensayo anterior, pueden ser, pero no se limitan a, péptidos, carbohidratos, derivados de vitaminas u otros compuestos farmacéuticos. Los agentes pueden ser seleccionados y detectados al azar o racionalmente seleccionados o designados utilizando técnicas de modelado de proteínas. Para la detección al azar, los agentes como péptidos, carbohidratos, compuestos farmacéuticos y similares se seleccionan al azar y se enseñan para su capacidad para unirse a la proteína codificada por el ORF de la presente invención. De otro modo, los agentes pueden ser seleccionados o designados de manera racional. Como se utiliza en la presente, se dice que un agente "se selecciona o designa racionalmente" cuando el agente es elegido con base en la configuración de la proteína específica, por ejemplo, un experto en la técnica puede fácilmente adaptar los procedimientos actualmente disponibles para generar péptidos, compuestos farmacéuticos y similares capaces de unión a una secuencia de péptidos específica para generar los péptidos antipéptidos racionalmente designados, por ejemplo, véase Hurby y col., Application of Synthetic Peptides: Antisense Peptides "In Synthetic Peptides, A User's Guide, W. H. Freeman, NY (1992), pp. 289-307, y Kaspczak, y col., Biochemistry 28: 9230-8 (1989), o los compuestos farmacéuticos, o similares. Además de lo anterior, una clase de agentes de la presente invención, como ya se describió ampliamente, puede ser utilizada para la controlar la expresión génica mediante la unión a uno de los ORF o EMF de la presente invención. Como ya se describió, estos agentes pueden ser detectados al azar o designados/seleccionados racionalmente. La elección del ORF ó EMF permite a un experto diseñar la secuencia específica o agentes específicos del elemento, modular la expresión de un ORF individual o los ORF múltiples que dependen del mismo EMF para el control de la expresión. Una clase de agentes de unión al DNA son los agentes que contienen residuos base que hibridan o forman una formación de triple hélice mediante la unión al DNA o RNA. Estos agentes pueden pasarse en el fosfodiéster clásico, el esqueleto de ácido ribonucleico o puede ser una variedad de derivados sulfhidrilo o poliméricos que tienen capacidad de unión a la base. Los agentes convenientes para uso en estos métodos por lo común contienen de 20 a 40 bases y están diseñados para ser complementarios a una región del gen involucrada en la transcripción (triple hélice- véase Lee y col., Nucí. Acids. Res. 6: 3073 (1979); Cooney, y col., Science 241: 456 (1988); y Dervan, y col., Science 251: 1360 (1991)) o al propio mRNA (antisentido-Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991) ; Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Ratón, FL (1988)). La formación de la triple hélice resulta en su forma óptima en una interrupción de la transcripción del RNA a partir del DNA, mientras que la hibridación del RNA antisentido bloquea la traducción de una molécula de mRNA en el polipéptido. Ambas técnicas han demostrado ser eficaces en los sistemas modelo. La información contenida en las secuencias de la presente invención es necesaria para el diseño de un oligonucleótido antisentido de triple hélice y los demás agentes de unión al DNA. Los agentes que se unen a una proteína codificada por uno de los ORF de la presente invención pueden ser utilizados como un agente de diagnóstico, en el control de infección bacteriana modulando la actividad de la proteína codificada por el ORF. Los agentes que se unen a una proteína codificada por uno de los ORF de la presente invención pueden ser formulados utilizando las técnicas conocidas para generar una composición farmacéutica. 6.15 Uso de ácidos nucleicos como sondas Otro aspecto del tema de la invención es proporcionar sondas de hibridación de ácidos nucleicos específicas de polipéptido capaces de hibridar con secuencias de nucleótidos que ocurren en la naturaleza. Las sondas de hibridación del tema de la invención pueden ser provenientes de la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NOS: 1-2 ó 24. debido a que el gen correspondiente se expresa en solo uno de los 18 tejidos probados, a saber, macrófagos, una sonda de hibridación proveniente de las SEQ ID NOS: 1-2 ó 24 puede ser utilizada como un indicador de la presencia del RNA del macrófago en una muestra. Cualquiera de las técnicas de hibridación convenientes puede emplearse como puede ser, por ejemplo, la hibridación in si tu. La PCR como se describe en las Patentes Estadounidenses Nos. 4,683,195 y 4,965,188 proporcionan los usos adicionales para los oligonucleótidos basados en las secuencias del nucleótido. Estas sondas utilizadas en la PCR pueden ser de origen recombinante, pueden ser sintetizadas químicamente o una mezcla de ambas. La sonda contendrá una secuencia pequeña de nucleótidos para la detección de secuencias idénticas o una combinación degenerada de posibles secuencias para la identificación de secuencias genómicas estrechamente relacionadas. Otro medio para producir sondas de hibridación específicas para ácidos nucleicos incluye la clonación délas secuencias de ácidos nucleicos en vectores para la producción de sondas de mRNA. Estos vectores son conocidos en la técnica y están disponibles en el comercio y pueden utilizarse para sintetizar sondas de RNA in vitro por medio de la adición de la RNA polimerasa adecuada como T7 o SP6 RNA polimerasa y los nucleótidos marcados radioactivamente, adecuados . Las secuencias de nucleótidos pueden ser utilizadas para construir sondas de hibridación para mapear sus secuencias genómicas respectivas. La secuencia de nucleótidos proporcionada en la presente puede ser mapeada para un cromosoma o regiones específicas de un cromosoma utilizando las técnicas de mapeo genético y/o cromosómico bien conocidas. Estas técnicas incluyen la hibridación in si tu, análisis de ligamiento contra marcadores cromosómicos conocidos, detección de hibridación con bibliotecas o preparaciones cromosómicas clasificadas por flujo específicas para los cromosomas conocidos, y similares. La técnica de hibridación in situ fluorescente de dispersiones de cromosoma han sido descritas entre otros lugares, en Verma y col., (1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York NY. La hibridación in situ fluorescente de preparaciones cromosómicas y otras técnicas físicas de mapeo de cromosomas pueden ser correlacionadas con datos de mapa genético adicionales. Los ejemplos de los datos de mapas genéticos pueden encontrarse en 1994 Genome Issue of Science (265: 1981f) . La correlación entre la localización de un ácido nucleico sobre un mapa cromosómico físico y una enfermedad específica (o predisposición a una enfermedad específica) puede ayudar a delimitar la región del DNA asociado con esta enfermedad genética. Las secuencias de nucleótidos de la invención presente pueden utilizarse para detectar diferencias en las secuencias de genes entre individuos normales, portadores o afectados . La secuencia de nucleótidos puede ser utilizada para producir polipéptidos purificados utilizando los métodos bien conocidos de la tecnología del DNA recombinante. Entre las múltiples publicaciones que enseñan los métodos para la expresión de genes después de haber sido aislados esta Goeddel, (1990) gene Expresión Technology, Methods and Enzylomogy, vol 185, Academic Press, San Diego. Los polipéptidos pueden ser expresados en diferentes células hospederas, procarióticas o eucarióticas. Las células hospederas pueden ser de la misma especie de la cual una secuencia de nucleótidos polipéptidos particular fue aislada o de una especie diferente. Las ventajas de producir polipéptidos por la tecnología del DNA recombinante incluyen la obtención de cantidades adecuadas de la proteína para purificación y la disponibilidad de los procedimientos de purificación simplificados. Cada secuencia así obtenida fue comparada con las secuencias en GenBank utilizando un algoritmo de búsqueda desarrollado por Applied Biosystems e incorporado en el INHERIT™ 670 Sequence Análisis System. En este algoritmo, se utilizo el lenguaje Pattern Specification Language (developed by TRW Inc. Los Ángeles, CA) para determinar las regiones de homología. Los tres parámetros que determinan como corren las comparaciones de las secuencias fueron el tamaño de ventana, desplazamiento de ventana y tolerancia de error. Al utilizar una combinación de estos tres parámetros, la base de datos DNA fue buscada para secuencias que contengan regiones de homología para la secuencia consultada, y las secuencias adecuadas fueron registradas con un ' valor inicial. Posteriormente, estas regiones homologas fueron examinadas utilizando gráficas de homología en matriz de punta para distinguir las regiones de homología a partir de coincidencias casuales. Se utilizaron los alineamientos de Smith-Waterman para mostrar los resultados de la búsqueda de homología. Las homologías en la secuencia del péptido y proteína fueron investigadas utilizando el INHERIT™ 670 Sequence Analysis System en una forma semejante a la utilizada en las homologías de la secuencia del DNA. El lenguaje Pattern Specificacition Language y las ventanas de parámetros fueron utilizados para buscar bases de datos de proteínas para las secuencias conteniendo las regiones de homología que fueron clasificadas con un valor inicial. Las gráficas de homología por matriz de puntos fueron examinadas para distinguir regiones de homología significativa a partir de las coincidencias casuales. De otro modo, BLAST que significa Basic Local Alignment Search Tool, se utiliza para buscar alineamientos de secuencia locales (Altschul, S. F., (1993) J Mol. Evol 36: 290-300; Altschul S. F. y col., (1990) J Mol Biol. 215: 403-10) . BLAST " produce alineamientos de secuencias de nucleótidos y de ácidos nucleicos para determinar similitud de secuencias. Debido a la naturaleza local de los alineamientos, BLAST es especialmente útil para determinar coincidencias exactas o identificar homólogos. Auque es ideal para coincidencias que no contengan huecos, es inadecuada para realizar búsqueda de estilos de motivos. La unidad fundamental de la salida o resultado del algoritmo BLAST es el High-scoring Segment Pair (HSP, par de segmentos con clasificación alta) . Un HSP consiste en dos fragmentos de secuencia de longitudes arbitrarias pero iguales cuyo alineamiento es localmente máximo y para el cual el registro del alineamiento cumple o excede un umbral o registro límite establecido por el usuario. El enfoque de BLAST es buscar los HSP entre una secuencia investigada y una secuencia en la base de datos, para evaluar la importancia estadística de cualquiera de las coincidencias encontradas, y reportar solo aquellas coincidencias que cumplan con el umbral de importancia seleccionada por el usuario. El parámetro E establece el umbral estadísticamente significativo para reportar coincidencias de secuencias en la base de datos. E se interpreta como la unión superior de la frecuencia esperada de ocurrencia casual de un HSP (o serie de HSP) dentro del contexto de toda la búsqueda en la base de datos. Cualquier secuencia de base de datos cuya coincidencia satisfaga E es reportada en la salida del programa. Además, se utilizó el análisis BLAST para buscar moléculas relacionadas dentro de las bibliotecas de la base de datos LIFESEQ™. Este proceso, un análisis "northern electrónico" es análogo al análisis northern Blot en cuanto a que utiliza una secuencia de celubrevina en el momento de la búsqueda para moléculas idénticas u homologas a una severidad establecida. La severidad del Norther electrónico se basa en el "registro del producto". El registro del producto se define como (el % del nucleótido o aminoácido [entre las secuencias consultadas y de referencia] en Blast multiplicado por el % máximo posible del registro BLAST [con base en las longitudes de las secuencias consultadas y de referencia]) dividido en 100. En un registro de producto de 40, la coincidencia será dentro de un 1-2% de error; y en 70, la coincidencia será exacta. Las moléculas homologas o relacionadas pueden ser identificadas seleccionando aquellas que muestran registros de producto entre aproximadamente 15 y 30. 6.16 SEQ ID NOS: 1-8 23-24 Cón relación a la Figura 1, la SEQ ID NO: 1 es la secuencia de nucleótidos de una etiqueta de secuencia expresada correspondiente a un polinucleótido aislado a partir de una biblioteca de cDNA de hígado-vaso fetal humano. La SEQ ID NO: 2 es una versión extendida de la SEQ ID NO: 1 contenida como se describe en el Ejemplo 2, y el polipéptido codificado en SEQ ID NO: 3 es mencionado en la presente como CD39-L4. La SEQ ID NO: 2 codifica un polipéptido teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (mostrada en la Figura 2) . El marco de lectura abierto correspondiente a la SEQ ID NO: 3 inicia en el nucleótido 246, según se enumera a partir del extremo 5' de la SEQ ID NO: 2. Este marco de lectura abierto codifica un polipéptido de 428 aminoácidos de longitud. El peso molecular estimado del polipéptido no glucosilado es de aproximadamente 47.52 kDa. Las búsquedas de la proteína en la base de datos con el algoritmo BLAST indica que la SEQ ID NO: 3 es homologa a la familia CD39. La Figura 3 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos entre SEQ ID NO: 3 (identificada como "246 prot") y CD39 humana ' ("CD39 Human. seq"), indicando que las dos secuencias comparten 30% de identidad en la secuencia de aminoácidos. Además, se observa un mayor grado de homología entre las regiones conservadas apidasa (Kaczmarek y col., J. Biol. Chem. 271: 33116-33122 (1996). En particular, se encontró una coincidencia casi perfecta con una región de unión al ATP putativa a partir de los aminoácidos 54-58, DAGST (DAGSS en CD39) . Además, el motivo DLGGASTQ (DLGGASTQ en CD39) , el cual esta muy bien conservado entre las ATPDasas, se encontró a partir de los aminoácidos 199-206 en la SEQ ID NO: 3. otras regiones conservadas en las apirasas fueron encontradas a partir de los aminoácidos 129-134, ATAGLR (TAGMR en CD39) y de los aminoácido 169-173, GSDEG (GQEEG en CD39) .

La SEQ ID NO: 3 difiere de CD39 en cuanto a que la SEQ ID NO: 3 contiene una extensión hidrofóbica de 22 aminoácidos en su amino terminal, lo cual es un indicio de un péptido líder. La SEQ ID NO: 3 también carece de dominio transmembrana encontrado en el carboxilo terminal de CD39. Estas características indican que la SEQ ID NO: 3 es una ATPDasa soluble. La SEQ ID NO: 3 comparte un grado aún mayor de homología (86% de identidad) con una NTPasa de murino, como se muestra en el alineamiento de las secuencias de aminoácidos presentado en la figura 4 (SEQ ID NO: 3 se identifica como "246 prot", y CD39 de ratón como "mur ntpasa") . El mensaje que codifica la SEQ ID NO: 3 esta estrechamente regulado en una forma específica del tejido. Un estudio de expresión utilizando un método semiquantitativo PCR/Southern blot revelo un nivel significativo de expresión en el macrofago. Por el contrario, la CD39 humana se expresa en tejidos como placenta, pulmón, músculo esquelético, riñon y corazón. La SEQ ID NO: 4 es la secuencia de polinucleótidos para la CD39-L4. La SEQ ID NO: 5 es la secuencia de aminoácidos correspondientes. La SEQ ID NO: 6 es la secuencia de polinucleótidos para una variante de CD39-L4 denominada ACR III, en donde se han hecho las siguientes sustituciones de aminoácidos: D168-T, S170-Q y L175-F; SEQ ID NO: 7 es la secuencia de aminoácidos correspondiente . La SEQ ID NO: 8 es la secuencia genómica para el gen de CD39-L4 humana; los exones aparecen en los nucleótidos 1-288 (exon 1), 1281-1580 (exon 2), 1820-1855 (exon 3), 2467-2555 (exon 4), 2863-2942 (exon 5), 3889-3950 (exon 6), 4894-4995 (exon 7), 5847-5987 (exon 8), 6966-7138 (exon 9) y 8556-9365 (exon 10) . La SEQ ID NO: 24 en [sic] la secuencia de polinucleótidos para una variante de empalme de CD39-L4 que crea una isoforma denominada CD39-L66. La SEQ ID NO: 25 es la secuencia de aminoácidos correspondiente. 6.17 Uso de los polipéptidos tipo CD39 novedosos y anticuerpos Los polipéptidos de la invención teniendo actividad de ATPDasa, incluida NDPasa, son útiles para inhibir la función plaquetaria y por tanto pueden emplearse en la profilaxis o tratamiento de los estados patológicos causados por o que involucran trombosis o coagulación excesiva o agregación plaquetaria excesiva, como puede ser infarto de miocardio, isquemia cerebral, angina y similares. Los polipéptidos de la invención, también pueden utilizarse en el mantenimiento de injertos vasculares. La función plaquetariá puede medirse por cualquiera de los diferentes ensayos normales, como pueden ser, por ejemplo, el ensayo de agregación de plaquetas descrito en el Ejemplo 5. Estos estados patológicos incluyen estados causados por o que involucran trombosis arterial, como puede ser trombosis de arteria coronaria y el infarto de miocardio resultante, trombosis de arteria cerebral o trombosis intra cardiaca (debida a, por ejemplo, fibrilación atrial) y el accidente cerebro vascular resultante, y otras trombosis arteriales periféricas y oclusión; estados asociados con trombosis venosa, como puede ser trombosis venosa profunda y embolia pulmonar; los estados asociados con exposición de la sangre del paciente a una superficie de tejido extraño o lesionado, incluidas las válvulas cardiacas enfermas, válvulas cardiacas mecánicas, injertos vasculares y otros dispositivos extra corporales como cánulas intravasculares, derivaciones para acceso vascular en pacientes con hemodiálisis, máquinas de hemodiálisis y máquinas para derivación cardiopulmonar; y estados asociados con coagulopatías como puede ser hipercoagulabilidad y coagulopatía intravascular diseminada. La co-administración de otros compuestos adecuados para el tratamiento de los estados patológicos, por ejemplo, otros agentes anticoagulantes también se contempla. En particular, las variantes tipo el m?tante ACR III descritos en la paciente se esperan que sean terapéuticos superiores para el tratamiento de estos estados patológicos debido a que: (1) ACR III presenta actividad seis veces mayor en comparación con CD39-L4 tipo silvestre, y (2) ACR III, al igual que CD39-L4 únicamente específica para ADP y no hidroliza ATP. Así pues, se evitan los efectos colaterales adversos de la hidrólisis del ATP circulante. Por ejemplo, se sabe que el ATP actúa como una señal extracelular en múltiples tejidos. En el corazón, el ATP extracelular modula los procesos iónicos y la función contráctil (para una revisión véase Burnstock, G., Neuropharmacology 36: 1127) . En la actualidad, se ha demostrado que el ATP extracelular inhibe notablemente el transporte de glucosa en cardiomiocitos de rata (Fisher, Y. y col., J. Biol. Chem. 274: 755-761. Otra fuente de ATP extracelular es la liberada de células del parénquima bajo condiciones de hipoxia o isquemia (Skobel, E. y Kammermeier, H. Biochim. Biophys. Acta 1362: 128-134). El ATP también esta involucrado en la modulación de la liberación de histamina inducida por anti-IgE de mastocitos de pulmón humano (Schulman, E. S. y col., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 20: 520-537) . Además, la capacidad de CD39-L4 para hidrolizar los NDP además del ADP tienen aplicaciones fuera de sistema circulatorio. Por ejemplo, se ha reportado qué el UDP es el agonista más potente para el receptor P2Y6 humano. Communi, y col., Bioch Bioph Res Com 222: 303-308 (1996). Este receptor se expresa en algunos tejidos que incluyen células T infiltrantes presentes en la enfermedad de intestino inflamado. Somers y col., Lab Invest 78: 1375-1383 (1998). En este micro ambiente, una molécula con la propiedades enzimáticas de CD39-L4 puede influir en las respuestas de las células T modificando la vida media extracelular del UDP. Otra función para la CD39-L4 ha sido sugerida por el reporte que la CD39-L4 de ratón mapea estrechamente un locus asociado con convulsiones audigénicas de cerebro en ratón. Véase Chadwick y col., Genomics 50: 357-367 (1988); Seyfried, y col., Genetics 99: 117-126 (1981). Se considera que este locus, conocido como Asp-1, esta ligado o corresponde a un factor que influye en la actividad de la ATPasa-CaA Neumann, y col., Behav . Genetics 20: 307-323 (1990) . Además, los polipéptidos de la invención pueden utilizarse como marcadores de peso molecular, como complemento alimenticio. Un polipéptido que consiste en la SEQ ID NO: 3, por ejemplo, tiene una masa molecular de aproximadamente 47.52 kD en su forma no glucosilada. Los complementos alimenticios proteínicos son bien conocidos y la formulación de los complementos alimenticios convenientes que incluyen los polipéptidos de la invención esta dentro del nivel del experto en la preparación de alimentos.

Los polipéptidos de la invención también son útiles para preparar sustancias anticuerpos que sean específicamente inmuno-reactivas con las proteínas tipo CD39. los anticuerpos y porciones de estos (por ejemplo, los fragmentos Fab) que se unen a los polipéptidos de la invención pueden utilizarse para identificar la presencia de estos polipéptidos en una muestra. Por ejemplo, el nivel de la proteína natural correspondiente a la SEQ ID NO: 3 en una muestra de sangre puede determinarse como un indicio del estado vascular. Estas determinaciones se realizan utilizando cualquier formato de inmunoensayo conveniente, y cualquier polipéptido de la invención que sea específicamente unido por el anticuerpo puede emplearse como un control positivo. Los polipéptidos de la invención se administran mediante cualquier vía que proporcione una dosis eficaz en el sitio de acción deseado. La determinación de la vía de administración conveniente y una dosificación eficaz para una indicación específica esta dentro de las habilidades del experto en la técnica. Para el tratamiento de enfermedad vascular, los polipéptidos de acuerdo con la invención generalmente se administran por vía intravenosa. Estudios in vivo en murino con CD39 humana soluble han mostrado que ratones inyectados por vía intravenosa con 50 mg de la CD39 humana soluble, recombinante en 100 ml de solución estéril tuvieron CD39 biológicamente activa en sus sueros durante un tiempo prolongado, con una vida media de eliminación de casi dos días (Gayle, R. B. y col., J. Clinical Invest. 101: 1851-1859 (1988)). Los intervalos de dosificación convenientes para los polipéptidos de la invención pueden extrapolarse a partir de estas dosis o a partir de estudios similares en modelos de animales adecuados. Las dosis entonces pueden ser sometidas según sea necesario por el clínico para proporcionar beneficio terapéutico máximo. 6.18 FORMULACIONES FARMACÉUTICAS Y VÍAS DE ADMINISTRACIÓN Una proteína de la presente invención (proveniente de cualquier fuente, incluidos sin limitación de las fuentes recombinantes y no recombinantes) puede administrarse a un paciente en necesidad, por si mismo, o en composiciones farmacéuticas donde se mezcla con los portadores o excipiente (s) adecuados en dosis para tratar o aminorar una variedad de trastornos. Tal composición también puede contener (además de la proteína y un portador) diluyentes, materiales de carga, sales, soluciones amortiguadoras, estabilizadores, solubilizadores y otros materiales bien conocidos en la técnica. El término "farmacéuticamente aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica del (los) ingrediente (s) activo (s). Las características del portador dependerá de la vía de administración. La composición farmacéutica de la invención también puede contener citocinas, linfocinas u otros factores hematopoyéticos como M-CSF, GM-CSF, TNF, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IFN, TNFO, TNFl, TNF2, G-CSF, Meg-CSF, trombopoyetina, factor de células primordiales y eritropoyetina. La composición farmacéutica además puede contener otros agentes que mejoren la actividad de la proteína o complementen su actividad o su en el tratamiento. Tales factores y/o agentes adicionales pueden incluirse en la composición farmacéutica para producir un efecto sinérgico con la proteína de la invención, o para reducir al mínimo los efectos laterales. Por el contrario, la proteína de la presente invención puede ser incluida en formulaciones de la citosina particular, linfocina, otro factor hematopoyético, factor trombolítico o antitrombótico, o agente antiinflamatorio para reducir al mínimo los efectos colaterales de la citosina, linfocina, otro factor hematopoyético, factor trombolítico o antitrombótico, o agente antiinflamatorio. Una proteína de la presente invención puede ser activa en multímeros (por ejemplo, heterodímeros u homodímeros) o complejos consigo mismas u otras proteínas, como resultado, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden consistir en una proteína de la invención en una forma multimérica o acomplejada. Las técnicas para la formulación y administración de los compuestos de la solicitud presente ' pueden encontrarse en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición. Una dosis terapéuticamente eficaz además se refiere a aquella cantidad del compuesto suficiente para aminorar los síntomas, por ejemplo, el tratamiento, sanación, prevención o mejoría del estado médico pertinente, o un incremento en la velocidad del tratamiento, sanación, prevención o mejoría de tales condiciones. Cuando se aplica a un ingrediente activo individual, administrado solo, una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a este ingrediente solo. Cuando se aplica a una combinación, una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a cantidades combinadas de los ingredientes activos que dan origen al efecto terapéutico, bien sea administrado en combinación, en serie o en forma simultánea. Durante la práctica del método del tratamiento o uso de la presente invención, una cantidad terapéuticamente eficaz de proteína de la presente invención se administra un mamífero teniendo un estado para ser tratado. La proteína de la presente invención puede ser administrada de acuerdo con el método de la invención sola o en combinación con otras terapias como pueden ser los tratamientos empleando citacinas, linfocinas u otros factores hematopoyéticos.

Cuando se co-administra con una o más citocinas linfocinas u otros factores hematopoyéticos, la proteína de la presente invención puede administrarse simultáneamente con la(s) citocina (s), linfocina (s) , otros (s) factor (es) hematopoyético, factores trombolítico-s o antitrombóticos, o en forma secuencial. Si se administra en forma secuencial, el médico asistente decidirá sobre la secuencia adecuada para administrar la proteína de la presente invención en combinación con citocina (s), linfocina (s) , otro(s) factor (es) hematopoyético, factores trombolíticos o antitrombóticos . 6.18.1 VÍAS DE ADMINISTRACIÓN Las vías de administración convenientes pueden, por ejemplo, incluir oral, rectal, transmucosa o administración -intestinal; suministro parenteral, incluidas las inyecciones intramuscular, subcutánea, inyecciones intramedulares así, como inyecciones intratecal, intraventicular directa, intravenosa, intraperitoneal, intranasal o infraocular. La administración de proteína de la presente invención utilizada en la composición farmacéutica o para practicar el método de la presente invención puede llevarse a cabo en diferentes formas tradicionales, como puede ser la ingestión oral, inhalación tópica o cutánea, subcutánea, inyección intraperitoneal, parenteral o intravenosa. La administran intravenosa al paciente es la preferida. De otro modo, es posible administrar el compuesto en una forma local en lugar de sistémica, por ejemplo, por inyección del compuesto directamente en una articulación artrítica o tejido fibrótico, con frecuencia en un depósito o formulación de liberación prolongada. Para prevenir el proceso de cicatrización que con frecuencia ocurre como complicación con cirugía de glaucoma, los compuestos pueden ser administrados por vía tópica, por ejemplo, como gotas oftálmicas. Además, es posible administrar el medicamento en un sistema de suministro de medicamentos dirigido, por ejemplo, en un liposoma revestido con un anticuerpo específico, eligiendo, por ejemplo, el tejido artrítico o fibrótico. Los liposomas serán dirigidos a y captados selectivamente por un tejido afectado. 6.18.2 COMPOSICIONES/FORMULACIONES Las composiciones farmacéuticas para uso de acuerdo con la presente invención pueden ser así formuladas en una forma convencional utilizando uno o más portadores fisiológicamente aceptables consistiendo en excipientes auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en las preparaciones que pueden ser utilizadas farmacéuticamente. Estas composiciones farmacéuticas pueden ser fabricadas en una forma bien conocida, por ejemplo, por medio de los procesos tradicionales de mezclado, disolución, granulación, fabricación de grageas, pulverización emulsificación, encapsulación, liofilización. La formulación adecuada depende de la vía de administración elegida. Cuando una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de la presente invención se administra por vía oral, la proteína de la presente invención estará en la forma de una tableta, cápsula, polvo, solución o elixir. Cuando se administra en forma de tableta, la composición farmacéutica de la invención además puede contener un portador sólido como gelatina o un coadyuvante. La tableta, cápsula o polvo contienen desde aproximadamente 5 hasta 95% del de la proteína de la presente invención y, de preferencia, desde aproximadamente 25 hasta 90% de proteína de la presente invención. Cuando se administra en forma líquida, es posible adicionar un portador líquido como agua, petróleo aceites de origen animal o vegetal como aceite de cacahuate, aceite mineral, aceite de soya o aceite de sésamo, o aceites sintéticos. La forma líquida de la composición farmacéutica puede además contener solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacáridos, o glicoles como etilen glicol, propilen glicol o polietilen glicol. Cuando se administra en forma líquida, la composición farmacéutica contiene desde aproximadamente 0.5 hasta 90% en peso de la proteína de la presente invención, y de preferencia desde aproximadamente 1 hasta 50% de la proteína de la presente invención. Cuando una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteina de la presente invención se administra por inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, la proteína de la presente invención estará en la forma de una solución acuosa aceptable para uso parenteral, sin pirógenos. La preparación de estas soluciones de proteína aceptables para uso parenteral, teniendo debido al pH, isotonicidad, estabilidad y similares, esta dentro de las habilidades en la técnica. Una composición farmacéutica preferida para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea debe contener, además de la proteína de la presente invención, un vehículo isotónico como Inyección de Cloruro de Sodio [sic] , inyección de ringer [sic] , inyección de dextrosa [sic] inyección de dextrosa y cloruro de sodio [sic] , inyección de ringer lactosada [sic] u otro vehículo como es sabido en la técnica. La composición farmacéutica de la presente invención también puede contener estabilizadores, preservadores, soluciones amortiguadoras, antioxidantes u otros aditivos conocidos para los expertos en la técnica. Para inyección, los agentes de la invención pueden ser formulados en soluciones acuosas, de preferencia en soluciones amortiguadoras fisiológicamente compatibles como solución de Hanks, solución de Ringer o solución amortiguadora salina fisiológica. Para administración transmucosa, se utiliza en la formulación los penetrantes adecuados para la barrera que va a ser permeada. Estos penetrantes generalmente son conocidos en la técnica. Para administración oral, los compuestos pueden ser formulados fácilmente combinando los compuestos activos con portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Estos portadores permiten a los compuestos de la invención ser formulados como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lechadas, suspensiones y similares, para ingestión oral por un paciente que va a ser tratado. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral puede obtenerse excipiente sólido [sic] , opcionalmente triturando una mezcla resultante, y procesando la mezcla de granulos, después de adicionar los auxiliares convenientes, si se desea, para obtener tabletas o núcleos de grageas. Los excipientes convenientes son, en particular, materiales de carga como azúcares, incluida la lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa como por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de papa, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio y/o polivinilpirrolidona (PVP) . Si se desea es posible adicionar agentes desintegradores como polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal de este como alginato de sodio. Los núcleos de grageas se proporciona con revestimientos adecuados. Para este propósito, es posible utilizar soluciones de azúcar concentradas que opcionalmente pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilen glicol y/o dióxido de titanio, soluciones de lacas y solventes orgánicos adecuados o mezclas de solventes. Es posible adicionar colorantes o pigmentos a las tabletas o recubrimientos de grageas para la identificación o caracterización de las combinaciones diferentes de las dosis de los compuestos activos. Las preparaciones farmacéuticas que pueden ser utilizadas por vía oral incluyen cápsulas de ajuste a presión hechas de gelatina, así como las cápsulas blandas, selladas hechas de gelatina y un plastificador, como puede ser glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste a presión pueden contener los ingredientes activos en mezcla con materiales de carga como lactosa, aglomerantes como almidones y/o lubricantes como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden estar disueltos o suspendidos en líquidos adecuados como aceites grasos, parafina líquida o polietilen glicoles líquidos. Además, es posible adicionar estabilizadores. Todas las formulaciones para administración oral deben estar en dosis adecuadas para tal administración. Para administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de tabletas o grageas formuladas en la forma tradicional. Para administración por inhalación, los compuestos para uso de acuerdo con la presente invención se suministran convenientemente en la forma de una presentación de rocío para aerosol a partir de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas conveniente. En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para el suministro de una cantidad dosificada. Las cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para uso en un inhalador o insuflador pueden ser formuladas conteniendo una mezcla de polvos del compuesto y una base en polvo adecuada como lactosa o almidón. Los compuestos pueden ser formulados para administración parenteral por inyección, por ejemplo, por inyección en un bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden estar presentadas en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampolletas o en recipientes de múltiples dosis con un preservador adecuado. Las composiciones pueden tomar forma tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación como suspensores, estabilizadores y/o dispersantes. Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Además, las suspensiones de los compuestos activos pueden ser preparadas como suspensiones oleosas para inyecciones adecuadas. Los solventes o vehículos lipofílicos convenientes incluyen aceites grasos como aceites de sésamo, o esteres de ácidos grasos sintéticos como oletato de etilo o triglicéridos o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumenten la viscosidad de la suspensión, como puede ser carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores o agentes convenientes que aumenten la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. De otro modo, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril sin pirógenos, antes de su uso. Los compuestos también pueden ser formulados en composiciones rectales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, conteniendo bases para supositorios tradicionales como manteca de cacao u otros glicéridos. Además de las formulaciones anteriormente descritas, los compuestos también pueden ser formulados como una preparación en depósito. Estas formulaciones de acción prolongada pueden ser administradas por implantación (por ejemplo, en forma subcutáneas o intramuscular) o por inyección intramuscular. Así pues, por ejemplo, los compuestos pueden ser formulados con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo, como una 'emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como una sal escasamente soluble. Un portador o vehículo farmacéutico para los compuestos hidrofóbicos de la invención es un sistema de co-solventes consistiendo en alcohol bencílico, un surfactante no polar, un polímero orgánico miscible en agua y una fase acuosa. El sistema de co-solventes puede ser el sistema de co-solventes VPD. El VPD es una solución de 3% p/v alcohol bencílico, 8% p/v de polisorbato 80 surfactante no polar y 65% p/v polietilen glicol 300, hasta un volumen en etanol absoluto. El sistema de co-solventes VPD (VPD: 5W) consiste en VPD diluido 1:1 con una solución al 5% de dextrosa en agua. Este sistema co-solvente disuelve compuestos hidrofóbicos bien, y en sí mismo produce baja toxicidad en la administración sistémica. Naturalmente, las proporciones de un sistema cosolvente pueden variar considerablemente sin destruir sus características de solubilidad y toxicidad. Además, la identidad de los componentes co-solventes puede variar: por ejemplo, es posible utilizar otros surfactantes no polares de baja toxicidad en lugar de polisorbato 80; el tamaño de fracción de polietilen glicol puede variar; otros polímeros biocompatibles pueden sustituir polietilenglicol, por ejemplo, polivinilpirrolidona; y _ otros azúcares o polisacáridos pueden sustituir dextrosa. De otro modos, otros sistemas de suministro para compuestos farmacéuticos hidrofóbicos pueden emplearse. Los liposomas y emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehículos o portadores de suministro para medicamentos hidrofóbicos. Ciertos solventes orgánicos como dimetiisulfóxido también pueden ser empleados, aunque normalmente a costa de mayor toxicidad. Además, los compuestos pueden ser suministrados utilizando un sistema de liberación prolongada, como puede ser en matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos conteniendo el agente terapéutico. Diferentes materiales de liberación prolongada han sido establecidos y son bien conocidos por los expertos en la técnica. Las cápsulas de liberación prolongada pueden, dependiendo de su naturaleza química, liberar los compuestos durante algunas semanas hasta más o menos 100 días. Dependiendo de la naturaleza química y la estabilidad biológica del reactivo terapéutico, es posible emplear estrategias adicionales para la estabilización de la proteína. Las composiciones farmacéuticas también pueden contener portadores o excipientes en fase sólida o gel convenientes. Los ejemplos de estos portadores o excipientes incluyen, pero no se limitan a carbonato de calcio, fosfato de calcio, diferentes azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros como polietilen glicoles. Muchos de los compuestos inhibidores de la proteinaza de la invención pueden estar provistos como sales con contrai9ones farmacéuticamente compatibles. Estas sales de adición básica farmacéuticamente aceptables son aquellas sales que conservan la eficacia biológica y las propiedades de los ácidos libres y que se obtienen por reacción con bases inorgánicas u orgánicas como hidróxido de sodio, hidróxido de magnesio, amoniaco, trialquilamina, dialquílamina, monoalquilamina, aminoácidos dibásicss, acetato de sodio, benzoato de potasio, trietanolamina y similares. La composición farmacéutica de la invención puede estar en la forma de un complejo de la(s) proteína (s) de la presente invención junto con antígenos proteína o péptido. El antígeno proteína y/o péptido suministrará una señal estimuladora a los linfocitos B y T. Los linfocitos B responderán al antígeno a través de su receptor de inmunoglobulina superficial. Los linfocitos T responderán al antígeno a través del receptor de células T (TCR) después de la presentación del antígeno por las proteínas MHC. Las proteínas MHC y las estructuralmente relacionadas incluyendo aquellas codificadas por los genes de MHC clase I y clase II en células hospederas servirán para presentar el (los) antígeno (s) péptido a los linfocitos T. Los componentes antígenos también pueden ser suministrados como complejos MHC-péptido purificados solos o con molécula coestimuladoras que pueden señalar directamente células T. De otro modo, los anticuerpos capaces de unirse a la inmunoglobulina superficial y otras moléculas en células B así como los anticuerpos capaces de unirse a TCR y otras moléculas en las células T pueden ser combinados con la composición farmacéutica de la invención. La composición farmacéutica de la invención puede estar en la forma de un liposoma en el que la proteína de la presente invención se combina, además de otros portadores farmacéuticamente aceptables, con agentes anfipáticos como lípidos que existen en forma agregada como micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos o capas lamerales en solución acuosa. Los lípidos convenientes para la formulación liposomal incluyen, sin limitación, monoglicéridos, diglicéridos, sulfátídos, lisolecitina, fosfolípidos saponinas, ácidos biliares y similares. La preparación de estas formulaciones liposomales están dentro de las habilidades del experto en la técnica, según esta descrito, por ejemplo, en la Patentes Estadounidenses Nos. 4,235,871; 4,501,728; 4,837,0218; y 4,737,323, todas las cuales se incorporan en la presente como referencia. La cantidad de proteína de la presente invención en la composición farmacéutica de la presente invención dependerá de la naturaleza y gravedad del estado que se trate, y de la naturaleza de los tratamientos anteriores a los que el paciente se haya sometido. Por último, el médico asistente decidirá la cantidad de proteína de la presente invención con la cual tratar cada paciente individual. Inicialmente, el médico asistente administrará dosis bajas de proteína de la presente invención y observará la respuesta del paciente. Dosis más grandes de la proteína de la presente invención pueden ser administradas hasta que se obtenga el efecto terapéutico óptimo para el paciente, y en este punto la dosis no se incrementa más. Se contempla que las diferentes composiciones farmacéuticas utilizadas para practicar el método de la invención deben contener aproximadamente 0.01 µg hasta aproximadamente 100 mg (de preferencia aproximadamente 0.1 µg hasta aproximadamente 10 mg, de mayor preferencia cerca de 0.1 µg a aproximadamente 1 mg) de la proteína de la presente invención por kg de peso corporal . Para las composiciones de la presente invención que son útiles para regeneración de hueso, cartílago, tendón o ligamento, el "método terapéutico incluye la administración de la composición en forma tópica, sistémica o local como un implante o dispositivo. Cuando se administra, la composición terapéutica para uso en esta invención es, desde luego, en una forma fisiológicamente aceptable, sin pirógenos. Además, la composición puede ser encapsulada o inyectada en una forma viscosa para el suministro al sitio del daño del ^^ hueso, cartílago o tejido. La administración tópica puede ser conveniente para sanar heridas y reparar tejidos. Los 5 agentes terapéuticamente útiles además de una proteína de la invención que también pueden opcionalmente estar incluidos en la composición como ya se describió, pueden alternativa o adicionalmente, ser administrados al mismo tiempo o en forma secuencial con la composición en los métodos de la F 10 invención. De preferencia, para formación de hueso y/o cartílago, la composición debe incluir una matriz capaz de suministrar la composición conteniendo la proteína en el sitio del daño del hueso y/o cartílago, proporcionando una estructura para el desarrollo del hueso y cartílago y capaz 15 de ser reabsorbido en el cuerpo. Matrices así pueden ser formadas de materiales actualmente en uso para otras aplicaciones médicas implantadas. La elección del material de la matriz se basa en la biocompatibilidad, biodegradabilidad, propiedades mecánicas, 20 apariencia cosmética y propiedades de interfaz. La aplicación particular de las composiciones definirá la formulación adecuada. Las matrices potenciales para las composiciones pueden ser sulfato de calcio, fosfato tricálcico, hidroxiapatita, ácido poliláctico, ácido 25 poliglicólico y polianhídridos biodegradables y químicamente definidos. Otros materiales potenciales son biodegradables y biológicamente bien definidos como hueso o colágena dérmica. Otras matrices están compuestas de proteínas puras o componentes de matriz extracelular. Otras matrices potenciales son no biodegradables y químicamente definidas como hidroxiapatita sinterizada, bioglass, aluminatos u otras cerámicas, las matrices pueden estar compuestas de combinaciones de cualquiera de los tipos de materiales antes mencionados como ácido poliláctico e hidroxiapatita o colágena y fosfato tricálcico. Las biocerámicas pueden ser modificadas en su composición como puede ser en calcio-aluminato-fosfato y procesamiento para alterar el tamaño del poro, el tamaño de partícula, la forma de la partícula y su biodegradabilidad. Actualmente se prefiere un copolímero 50:50 (peso mol) de ácido láctico y ácido glicólico en la forma de partículas porosas teniendo diámetros en el intervalo desde 150 a 800 µ. En algunas aplicaciones, será útil utilizar un agente secuestrante, como carboximetilcelulosa o coágulos de sangre autólogos para prevenir que las composiciones de proteína se disocien de la matriz. Una familia preferida de agentes secuestrantes son los materiales celulósicos como alquilcelulosa (incluidas hidroxialquilcelulosas) , que incluye metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropil-metilcelulosa y carboximetilcelulosa, las más preferidas siendo las sales catiónicas de carboximetilcelulosa (CMC) . Otros agentes secuestrantes preferidos incluyen ácido hialurónico, alginato de sodio, poli (etilen glicol), óxido de polioxietileno, polímero carboxivinilo y poli (alcohol vinílico). La cantidad del agente secuestrante útil en la presente es 0.5-20% en peso, de preferencia 1-10% en peso, con base en el peso total de la formulación, que representa la cantidad necesaria para prevenir la desorción de la proteína de la matriz polimérica y" para proporcionar manejo de la composición adecuado, pero no tanta que se impida que las células progenitoras infiltren la matriz, proporcionando por este medio a la proteína la oportunidad de ayudar en la actividad osteogénica de las células progenitoras [sic] . En otras composiciones, las proteínas de la invención pueden estar combinadas con otros agentes benéficos para el tratamiento del defecto óseo y/o de cartílago, heridas o tejidos en cuestión. Estos agentes incluyen diferentes factores de crecimiento como factor de crecimiento epidérmico (EGF) , el factor de crecimiento proveniente de plaquetas (PDGF) , factores de crecimiento de transformación (TGF-alfa y TGF-beta) y el factor de crecimiento tipo insulina (IGF). Las composiciones terapéuticas también actualmente son valiosas para aplicaciones veterinarias. Los animales particularmente domésticos y caballos de pura sangre, además de humanos, son pacientes deseados para estos tratamientos con proteínas de la presente invención. El esquema de dosis de la composición farmacéutica que contiene la proteína para ser utilizado en la regeneración de tejido se determinará por el medico asistente considerando factores diversos que modifican la acción de las proteínas, por ejemplo, la cantidad de peso de tejido que se desea formar, el sitio del daño, el estado del tejido dañado, el tamaño de una herida, el tipo de tejido dañado (por ejemplo, hueso), la edad del paciente, sexo y dieta, la gravedad de alguna infección, el tiempo de administración y otros factores químicos. La dosis puede variar con el tipo de matriz utilizada en la reconstitución y con inclusión de otras proteínas en la composición farmacéutica. Por ejemplo, la adición de otros factores de crecimiento conocidos, como IGF I (factor de crecimiento tipo insulina I) , a la composición final, también puede efectuar [sic] la dosis. El progreso puede verificarse por valoración periódica del crecimiento y/o reparación del tejido/hueso, por ejemplo, por rayos X, determinaciones histomorfométricas 'y marcado con tetraciclina. Los polinucleótidos de la presente invención también pueden ser utilizados para tratamiento génico. Estos polinucleótidos puede ser introducidos in vivo o ex vivo en las células para expresión en un individuo mamífero. Los polinucleótidos de la invención también pueden ser administrados por otros métodos - conocidos para la introducción de ácido nucleico en una célula u organismo (incluido, sin limitación, en la forma de vectores virales o DNA desnudos) . Las células también pueden ser cultivadas ex vivo en presencia de proteínas de la presente invención para proliferar o para producir un efecto deseado o actividad en estas células. Las células tratadas pueden entonces ser introducidas in vivo para propósitos terapéuticos. 6.18.3 DOSIS EFICAZ Las composiciones convenientes para uso en la presente invención incluyen las composiciones en donde los ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz para obtener su propósito propuesto. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad eficaz para prevenir el desarrollo o para alimentar los síntomas existentes del individuo siendo tratado. La determinación de las cantidades eficaces esta dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada en la presente. Para cualquier compuesto utilizado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz puede calcularse inicialmente a partir de ensayos en cultivos de células, por ejemplo, una dosis puede ser formulada en modelos animales para obtener un rango de concentración circulante que incluya la IC5o determinada en el cultivo celular (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra una inhibición semimáxima de la actividad de la C-proteinasa) . Tal información puede utilizarse para determinar precisamente la dosis útil en humanos. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a aquella cantidad del compuesto que da origen a mejoría de los síntomas o a una prolongación de la supervivencia en un paciente. La toxicidad y la eficacia terapéutica de estos compuestos puede determinarse por procedimientos farmacéuticos normales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para la determinación de la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en 50% de la población) . La relación de la dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede ser expresado como la relación entre LD50 y ED50. Los compuestos que prefieran altos índices terapéuticos son preferidos. Los datos obtenidos a partir de estos ensayos en cultivos celulares y estudios en animales pueden ser utilizados en la formulación de un rango de dosis para uso en humanos. La dosis de estos compuestos de preferencia se encuentran dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración que se utilice. La formulación exacta, la vía de administración y la dosis pueden ser elegidas por el médico en vista del estado del paciente. Véase, por ejemplo, Fingí y col., 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", C. 1 p. 1. La cantidad e intervalo de la dosis puede ajustarse en forma individual para proporcionar concentraciones en plasma de la porción activa que sea suficiente para mantener los efectos inhibidores de la C-proteinasa, o la concentración mínima eficaz (MEC) . La MEC variará para cada compuesto pero puede calcularse a partir de datos in vitro; por ejemplo, la concentración necesaria para obtener 50-90% de inhibición de la C-proteinasa utilizando los ensayos descritos en la presente. Las dosis necesarias para obtener la MEC dependerán de las características individuales y la vía de administración. No obstante, los ensayos de HPLC o los bioensayos pueden utilizarse para determinar las concentraciones en plasma. Los intervalos de dosis también pueden determinarse utilizando el valor MEC. Los compuestos deben ser administrados utilizado un esquema que mantenga las concentraciones en plasma por encima de la MEC durante 10-90% del tiempo, de preferencia entre 30-90% y de mayor preferencia entre 50-90%. En casos de administración local o captación selectiva, la concentración local eficaz del medicamento puede no estar relacionado con la concentración en plasma. La cantidad de la composición administrada, desde luego, dependerá del individuo que se trate, del peso del individuo, la gravedad de la aflicción, la forma de administran y el juicio del médico que prescribe. 6.18.4 ENVASADO Las composiciones pueden, si se desea, ser presentadas en un envase o dosificador que puede contener una o más formas de dosificación unitaria conteniendo el ingrediente activo. El envase puede, por ejemplo, consistir en hoja metálica o plástico, como puede ser un blister pack. El paquete o dispositivo dosificador puede ser acompañado por las instrucciones para la administración. Las composiciones que contienen un compuesto de la invención formulado en un portador farmacéutico compatible también pueden ser preparadas, colocadas en un recipiente adecuado y etiquetadas para tratamiento de un estado indicado. La presente invención se ilustra en los siguientes ejemplos. Con la consideración de la presente descripción, un experto en la técnica apreciará que es posible hacer múltiples modalidades y variaciones en el alcance de la presente invención. Por consiguiente, se pretende que los aspectos más amplios de la presente invención no sean limitados a la descripción de los siguientes ejemplos.

EJEMPLO 1 Aislamiento de la SEQ ID NO: l a partir de una biblioteca de cDNA de higado-vaso fetal humano Se obtuvo una pluralidad de ácidos nucleicos novedosos a partir de una biblioteca de cDNA b2HFLS20W preparada de hígado-vaso fetal humano, como esta descrito esta Bonaldo y col., Genome Res. 6: 791-806 (1996), utilizando la PCR estándar, secuenciación mediante el análisis de señalización de la secuencia de hibridación y las técnicas de secuenciación de Sanger. Los insertos de la biblioteca fueron amplificados con PCR utilizando iniciadores específicos para secuencias del vector flanqueando los insertos. Estas muestras fueron analizadas en membrana de nailon e interrogadas con sondas de oligonucleótidos para obtener las señales de las secuencias. Los clones fueron agrupados en secuencias similares o idénticas, los clones individuales, representativos fueron seleccionados de cada grupo por secuenciación en gel. La secuencia 5' de los insertos amplificados fue luego deducida utilizando el iniciador de la secuenciación M13 inverso en un protocolo de secuenciación Sanger común. Los productos de la PCR fueron purificados y sometidos a secuenciación del ciclo terminado con colorante fluorescente. La secuenciación en gel de un solo paso fue realizada utilizando el secuenciador 377 Applied Biosystems (ABI) . Uno de estos insertos fue identificado como una secuencia novedosa no obtenida anteriormente a partir de esta biblioteca y no reportada anteriormente en bases de datos públicas. Esta secuencia se muestra en la Figura 1 como la SEQ ID NO: 1.

EJEMPLO 2 Aislamiento de la SEQ ID NO : 2 y determinación de una secuencia de nusleótidos que codifica para una proteina de 428 aminoácidos con homología de secuencia para CD39 La secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1, y etiquetada SEQ ID NO: 2 codifica la secuencia de aminoácidos traducida SEQ ID NO: 3, la cual se muestra en la Figura 2.

La secuencia de nucleótidos extendida fue obtenida aislando colonias generadas a partir de bancos de clones de una biblioteca de cDNA de macrófago humano. (Invitrogen, catálogo # A550-25) . En resumen, la biblioteca de cDNA de macrófago fue plaqueada sobre placas LB/Amp (conteniendo 100 mg/ml de ampicilina) a una densidad de aproximadamente 40,000 colonias/placa. Las coloniasvfueron levantadas en filtros de nitrocelulosa e hibridadas con una sonda radio marcada generada del clon original (es decir, la SEQ ID NO: 1) - Se confirmó que los clones identificados correspondieron a las SEQ ID NOS: 1 y 2 utilizando los iniciadores específicos del gen: (5'-GCTACCTCACTTCCTTTGAG-3' [SEQ ID NO: 9] y 5'-CTGGCTGGTGAAGTTTTCCTC-3' [SEQ ID NO: 10]), y un ensayo a base de PCR. Entonces la PCR utilizando iniciadores específicos del vector y del gen fue empleada para amplificar la porción 5' del cDNA. Se utilizaron iniciadores anidados para generar la secuencia a partir del producto (s) amplificado (s) . Se utilizó el programa Láser Gene™ para evitar y "contig" las secuencias parciales en una secuencia de longitud completa. Como ya se describió, la secuencia de aminoácidos tuvo una homología perfecta para CD39, la cual esta involucrada en la modulación de la reactividad plaquetaria durante la información vascular. En parte, con base en la similitud de la secuencia observada para CD39, el polipéptido codificado por SEQ ID NO: 2 fue denominado CD39- L4.

EJEMPLO 3 A. Expresión de la SEQ ID NOS: 3 y 5 en células COS-7 Se hicieron crecer células COS-7 en DMEM (ATCC) y 10% de suero bovino fetal (FBS) (Gibco) para confluencia de 70%. Antes de la transfección el medio fue cambiado a DMEM y 0.5% FCS. Las células fueron transfectadas con cDNA para las SEQ ID NOS 3 y 5 o con el vector pBGal mediante el reactivo de transfección FuGENE-6 (Boehringer) . Se diluyó 4 µl de FuGENE-6 en 100 µl de DMEM y se incubo durante 5 minutos. Después, este fue adicionado a 1 µg de DNA e incubado durante 15 minutos antes de adicionarlo una caja de 35 mm de células COS-7. Las células COS-7 fueron incubadas a 37 °C con 5% C02. Después de 24 horas, los medios y lisados celulares fueron recolectados, centrifugados y dialisados contra solución amortiguadora para ensayo (Tris 15 mM pH 7.6, NaCl 134 mM, glucosa 5 mM, CaCL2 y MgCl2. La expresión más robusta puede obtenerse utilizando el protocolo descrito en el Ejemplo 6 siguiente.

B. Estudio de expresión utilizando la SEQ ID NO: 2 La expresión de la SEQ ID NO: 2 en diferentes tejidos fueron analizadas utilizando una técnica semicuantitativa basada en la reacción en cadena de la polimerasa. Las bibliotecas de cDNA humano fueron utilizadas como fuentes de genes expresados a partir de tejidos de interés (cerebro adulto, corazón adulto, riñon adulto, ganglio linfático adulto, hígado adulto, pulmón adulto, ovario adulto, placenta de adulta, vaso de adulto, testículos de adulto, médula ósea, riñon fetal, hígado fetal, hígado-vaso fetal, piel fetal, cerebro fetal, leucocito y macrofago fetal) . Los iniciadores específicos del gen: (5'GCTACCTCACTTCCTTTGAG-3' [SEQ ID NO: 9] y 5'-GCAGGTCTCCAAGGAAGTACG-3' [SEQ ID NO: 11] fueron utilizados para amplificar porción de la secuencia SEQ ID NO: 2 a partir de las muestras. Los productos amplificados fueron separados en gel de agarosa, transferidos y ligados químicamente a un filtro de nailon. El filtro fue luego hibridado con sonda bicatenaria marcada radioactivamente ( 33 P-dCTP) generada a partir de secuencia SEQ ID NO: 2 de longitud completa utilizando un iniciador aleatorio, Klenow polimerasa. Los filtros fueron lavados (alta restricción) y utilizados para exponer una pantalla formadora de imagen con fósforo durante varias horas. Las bandas indicaron la presencia de cDNA incluyendo las secuencias de la SEQ ID NO: 2 en una biblioteca específica, y de este modo la expresión de mRNA en el tipo de células o tejido correspondiente. Los 18 tejidos humanos probados, el macrófago fue la única muestra que proporciono una señal, indicando que la expresión de la SEQ ID NO: 2 esta estrechamente regulada. Por el contrario, la molécula CD39 ha sido encontrado en tejidos como placenta, pulmón, músculo esquelético, riñon y corazón.

EJEMPLO 4 Localización cromosómica del gen correspondiente a las SEQ ID NOS: 1 y 2 Las tecnologías de mapeo del cromosoma permite a los investigadores ligar genes a las regiones específicas de los cromosomas. La asignación al cromosoma 14 fue realizada con el panel #2 monocromosómico depositario de las células de Coriell (depositario de células NIGMS) . Este panel híbrido de células somáticas de roedor y humano [sic] consiste en DNA aislado de 24 cultivos celulares híbridos conservando un cromosoma humano cada uno. El panel fue detectado con iniciadores específicos del gen: (5'-GCTACCTCACTTCCTTTGAG-3' [SEQ ID NO: 9] y 5'-CTGGCTRGGTGAAGTTTTCCTC-30 [SEQ ID NO: 10]), que genero un sitio etiqueta de la secuencia (STS) . También se detecto el panel híbrido de radiación Genbridge 4 (Research Genectics) , y los resultados de la detección por PCR fueron presentados al servidor del correo electrónico de mapeo Whithead/MIT Radiation Hybrid en: http://www-genome.wi.mit.edu.

EJEMPLO 5 Ensayo de agregación de plaquetas La sangre se anticoagula con 0.1 volumen de citrato de sodio al 3.2%. Se prepara plasma rico en plaquetas (PRP) con una centrifugación inicial de sangre total (200 x g, 15 min, 25°C) y una segunda centrifugación del PRP (90 x g, 10 min) para eliminar eritrocitos y leucocitos residuales. La suspensión patrón del PRP se mantiene a temperatura ambiente en 5% C02-air. El ensayo de agregación de plaquetas utiliza dos muestras, un Whole Blood Lumi-Aggregometor, de cuatro canales, modelo 560 (Chronolog Corp. Havertown, PA) . El PRP conteniendo 1.22 x 108 plaquetas se preincuba con la muestra que va a ser probada para inhibición de la agregación durante 10 minutos a 37 °C en una cubeta de vidrio síliconizado conteniendo una barra de agitación, seguido por estimulación con ADP (5 mm) , colágena (5 mg/ml) o trombina (0.1 unídades/ml) . La agregación de plaquetas se registra durante cuando menos 10 minutos. Los datos se expresan como el porcentaje de la transmisión de luz con plasma pobre en plaquetas igual a 100%.

EJEMPLO 6 CD39-L4 es una apirasa soluble La ectoapirasa CD39 de mamífero es una proteína de membrana integral con dos dominios transmembranales (uno en cada extremo de la proteína) (Maliszewski, C. R. y col., J.

Immunol. 153: 3574-3583). Los perfiles de hidrofobicidad para la secuencia de aminoácidos deducida de otros miembros de la familia, como CD39-L1 y CD39-L3, son muy similares a CD39 (Chadwick, B. P. y Fríshauf A. M. Genomics 50: 357-367) , sugiriendo que estas proteínas también tienen dos dominios que abarcan la membrana. Sin embargo, CD39-L4 no parece tener un segundo ' dominio transmembranal en su C-terminal, sugiriendo que la región hidrofóbica N-terminal puede codificar para una señal secretora. Para probar esta hipótesis, la CD39-L4 subclonada en el vector de expresión del mamífero pCDNA3.1 y la etiqueta 6-histidina fue insertada en la secuencia codificante. La secuencia de cDNA para CD39-L4 fue inicialmente aislada de una biblioteca de cDNA de macrofago, (Invitrogen). El iniciador sentido (5'- TTAAGCTTGGGAAAAGAATGGCCACTTC-3' , SEQ ID NO: 20) con un sitio HindIII y el iniciador antisentido (5'- AGACTCGAGGTGGCTCAATGGGAGATGCC-3' , SEQ ID NO: 21) con un sitio Xhol fueron utilizados para subclonar las secuencias codificantes en el vector de expresión de mamífero pcDNA3.1 (Invitrogen) . La secuencia de nucleótidos del inserto se establece en la SEQ ID NO: 4. Para detectar de manera inmunológica la proteína, la región codificante además fue modificada de modo que incluyera una etiqueta epítope Gly-Ser-6-His inmediatamente después de Arg24. En resumen, dos oligonucleótidos complementarios parcialmente traslapados (5 ' -GCGCTGTCTCCCACAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACAACCAGCAGACTTGGTT-3' -(SEQ ID NO: 22) y 5' -AACCAAGTCTGCTGGTTGTGATGGTGATGGTGATGCGATCCTCTGTGG^ ' (SEQ ID NO: 23)) fueron utilizados en la plantilla CD39-L4 pcDNA3.1. Los iniciadores fueron extendidos en direcciones opuestas alrededor del plásmido utilizando un programa PCR de 12 ciclos (95°C, 1 minuto; 60°C, 1 minuto; 72°C, 15 minutos) (Stratagene) . La reacción fue tratada con Dpnl para digerir el DNA parental metilado y luego transformado en E. coli. Las colonias fueron detectadas para el inserto. Para valorar si se secreto CD39-L4-6His, la región codificante de la proteína CD39-L4-6His fue insertada en el vector de expresión cpDNA3.1 y transfectada de manera transitoria en células COS-7. las células COS-7 obtenidas del American Tissue Type Culture Collection fueron crecidas en DMEM complementad con 10Z% FBS y 100 unidades/ml de penicilina G y 100 µg/ml de sulfato de estreptomicina a 37 °C en C02 al 10%. Las transfecciones fueron realizadas a 75% de confluencia en placas de 10 cm con Fugene-6 de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Las células en 7 ml de medio fueron incubadas con 16 µl de fugene-6 en 8 µg de DNA durante 14-18 horas. Al término de la transfección, el medio fue sustituido con medio DMEM conteniendo poco suero (1% FBS) . Las células luego fueron incubadas durante 24-48 horas antes de la cosecha. La CD39-L4-6His fue concentrada tratando los lisados celulares y el medio con Níquel-NTA agarosa (Qiagen) seguido por SDS/PAGE y análisis de inmunoabsorbente con un anticuerpo contra el epítope Arg-Gly-Ser-6His . Las células fueron lavadas dos veces con PBS conteniendo 0.5 µg/ml de leupeptina, 0.7 µg/ml de pepstatlna y 0.2 µg/ml de aprotinina. Después de un breve paso de sonificación y centrifugación para aclarar el lisado, las muestras fueron luego incubadas con una resina níquel-NTA a 4°C durante 2-3 horas. La proteína etiquetada con histidina acomplejada a la resina fue lavada tres veces con PBS antes de cargar sobre un gel SDS/PAGE al 10% para análisis Western blot. La CD39-L4 fue detectada en el lisado celular y el medio de la célula transfectadas con el vector de expresión CD39-L4-6His, pero no de las células control. Aunque el peso molecular pronosticado de la CD39-L4-6His es 46 kDa, la proteína inmunorreactiva presento una movilidad por SDS/PAGE correspondiente a un masa molecular de aproximadamente 51 kDa en el medio y aproximadamente 48 kDa en el lisado celular. La diferencia en el peso molecular aparente se debió a las modificaciones post-traduccionales de tres sitios de N-glucosilación potenciales en la secuencia de aminoácidos pronosticada de la CD39-LÍ. La secreción de la CD39-L4 también fue examinada por tratamiento de las células transfectadas con brefeldin A, un inhibidor de la translocación de las proteínas secretoras del retículo endoplásmico al aparato de Golgi. Chadwick y col., Genomics 50: 357-367 (1998) A La brefeldin A fue disuelto en etanol y adicionada a las células transfectadas 48 horas después de la transfección. Tanto el control como las células tratadas con brefeldin A fueron lavadas una vez con PBS e incubadas durante 8 horas en medio sin o variando las dosis de brefeldin A. Al aumentar las dosis de brefeldin A se bloqueo la secreción de CD39-L4-6His y se origino acumulación extracelular masiva.

EJEMPLO 7 Ensayo para la actividad de la ATPasa Se determinó la actividad de apirasa midiendo la cantidad de [33P] P- liberado de [Y33P]ATP. En resumen, 50 µl fueron incubados en presencia de 10 µCi de [Y33P]ATP durante 1 hora a 37 °C. El [33P] P- y el [Y33P]ATP fueron separados mediante placas de cromatografía en capa fina (TLC) (EM Science) . El sistema de solventes consistió en KH2P04 1M. Los compuestos separados fueron detectados para reactividad con un Phosphoimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) y cuantificados por el programa ImageQuant Software. Las células COS-7 transfectadas con las SEQ ID NOS: 3y 25 tuvieron cuando menos cuatro veces aumento en actividad sobre las células transfectadas con el vector solo. Aunque la actividad ATPasa estuvo presente, el Ejemplo 13 demuestra que la CD39-L4 tuvo significativamente más actividad de NDPasa.

EJEMPLO 8 Mutagénesis dirigida al sitio de CD39-L4 Se empleo mutagénesis dirigida al sitio para aumentar la actividad enzimática de CD39-L4. Las comparaciones de las secuencias de aminoácidos entre los miembros de la familia CD39 revela cuatro regiones altamente homologas en los cinco miembros humanos (Chadwick y Frischauf, Genomics 50: 357-367 1998) . Estas regiones, denominas regiones apirasa conservadas (ACR) no están presentes solo en los miembros de la familia CD39 sino otras apirasas de especies tan distintas como levadura y plantas. El examen de similitudes y diferencias en las ACR de la CD39 dieron origen al diseño de tres mutantes de CD39-L4 (véase la Figura 5) . En estas mutantes, los codones que codifican residuos específicos ACR de CD39 fueron utilizados para sustituir los codones de la secuencia ACR tipo silvestre de CD39-L4. Solo residuos con propiedades estructurales o químicas significativamente diferentes fueron reemplazados. Se utilizo un método basado en PCR para producir estas mutaciones. En resumen, el vector de expresión pCDNA3.1 [sic] (Invitrogen) conteniendo la secuencia de longitud completa del gen de CD39-L4 (con una etiqueta 6 histidina insertada después de ARG 24 en la secuencia codificante para permitir la purificación de la forma madura secretada de la proteína) fue sometido a un método de mutagénesis dirigida al sitio basada en PCR utilizando oligonucleótidos traslapantes [CD39-L4 ACR I mutante (nt 177-148 y 160-204): 5' -TCT AGT GCT CCC TGC ATC TAA CAT AAT TCC-3' (SEQ ID NO: 12) y 5' -GAT GCA GGG AGC ACT CAC ACT AGT ATT CAT GTT TAC ACC TTT GTG-3' (SEQ ID NO: 13); CD39L4 ACR I mutante (nt 402-359 y 385-415): 5'GCG TAG TCC TGC TGT TGC CCC TAG GTA CAC TGG GGT CTT TTT CC-3' (SEQ ID NO: 14) y 5' -GCA ACA GCA GGA CTA CGC TTA CTG CCA GAA C-3' (SEQ ID NO: 15); y CD39L4 ACR III mutante (nt 532-485 y 513-540): 5' -CCC AAG CGA ATA TGC CTT CGT CTT GTC CAG TCA TGA TGC TAA CAC TGC-3' (SEQ ID NO: 16) y 5' -CGA AGG CAT ATT CGC TTG GGT TAC TGT G-3' (SEQ ID NO: 17)]. Después de la amplificación del plásmido completo con Pfu DNA polimerasa (Stratagen) (95°C/1 minuto; 60°C/1 minuto; 72°C/15 minutos durante 12 ciclos), el DNA parental metilado fue digerido con la enzima de restricción Dpnl, dejando solo los productos amplificados de la PCR no metilados. Los productos con muesca bicatenarios, templados, resultantes fueron luego transformados en bacterias y las colonias resultantes fueron detectadas para las mutaciones deseadas por secuenciación. Las construcciones subsiguiente fueron completamente secuenciadas para verificar que las mutaciones estuvieran efectivamente introducidas y que no se generaran mutaciones extrañas.

EJEMPLO 9 El mutante ACR III aumenta la actividad ADPasa Plásmidos conteniendo las formas mutadas tipo silvestre del gen de CD39-L4 fueron transfectados en células COS-7. Después de dos días, la proteína fue purificada del medio de cultivo utilizando el método níquel-NTA resina para concentrarlos las proteínas etiquetadas. Estas proteínas fueron luego ensayadas para la actividad ATPasa y ADPasa midiendo el fosfato inorgánico liberado (Wang, T. F. y col., J. Biol. Chem. 273: 24814-24821, 1998). Las proteínas fueron incubadas en solución amortiguadora de apirasa (15 mM Tris pH 7.4, 135 mM NaCl, EGTA 2 mM y glucosa 10 mM) durante una hora a 37 °C con o sin CaCl2 2 mM o MgCl2. Las reacciones de la fosfatasa fueron iniciadas mediante la adición de ADP o ATP a una concentración final de 1 mM. La reacción del fósforo inorgánico con molibdato de amonio en presencia de ácido sulfúrico produce un completo fosfomolibdato no reducido. La absorbancia de este complejo a 340 nm ese directamente proporcional a la concentración de fósforo inorgánico- (Daly, J. A. y Ertingshausen G . , Clin. Chem. 18: 263 (1972) (Sigma Diagnostics) ) . Como se puede observar en la Figura 7, las mutaciones en ACR I y II elimina la actividad, mientras que las mutaciones en ACR III aumenta la actividad seis veces sobre el tipo silvestre.' Esta actividad incrementada, por tanto, ofrece un mayor potencial terapéutico, a medida que menos proteína puede ser administrada para ofrecer el mismo efecto farmacológico. El reemplazo de tres aminoácidos en la región III (aminoácidos 167 a 181 en CD39-L4) y el aumento resultante en la actividad ADPasa predice que la sustitución de los aminoácidos adicionales dentro de esta región por aminoácidos de la región equivalente de la CD39 también puede mejorar la actividad de la proteína sobre la CD39-L4 tipo silvestre. El incremento en la actividad ADPasa sobre el tipo silvestre también puede deberse a la sustitución de solo uno o dos de los tres aminoácidos; esto se puede confirmar sustituyendo uno o dos aminoácidos a la vez. Las secuencias de polinucleótidos y aminoácidos de una variante CD39-L4 denominada ACR III y teniendo las sustituciones de aminoácidos de 168-T, S170-Q y L175-F en comparación con CD39-L4 tipo silvestre (SEQ ID NO: 5) se establecen en las SEQ ID NO: 6 y 7, respectivamente en la Figura 6.

EJEMPLO 10 Las formas mutante ACR III y tipo silvestre son especificas para ADP y no para ATP La CD39-L4 tipo silvestre y la variante de CD39-L4 con mutaciones en la región ACR III hidrolizan el ADP. No obstante, cuando se probo ATP como sustrato, ni la CD39-L4 ni la CD39-L4 mutante, ACR III, catalizaron la hidrólisis. Por el contrario, la CD39 como molécula de unión a membrana (Marcus y col., The Journal of Clinical Investigation, 99: 1351-1360) o como una forma soluble genéticamente modificada (Gayle y col., The Journal of Clinical Investigation, 101: 1851-1858, 1998) pueden hidrolizar ambos sustratos ADP y ATP con eficiencia. La especificidad que tiene' la CD39-L4 tipo silvestre y la CD39-L4 ACR III mutante para el ADP es una característica ventajosa que hace a estas moléculas tipo CD39-L4 mejores candidatos terapéuticos antiplaquetas en comparación con CD39, a medida que el ADP es agonista que causa la agregación plaquetaria. Los terapéuticos que tienen actividades ADPeasa y ATPeasa potencialmente podrían crear efectos colaterales adversos interfiriendo con las concentraciones del ATP en la circulación.

EJEMPLO 11 Organización del gen de CD39-L4 humano La biblioteca genómica CITB BAC humana (Research Genetics) fue detectada con iniciadores específicos del gen [246-16 (nt 5522-5543), 5' -CTTCCTTCACTGGGAATTCAGG-3' (SEQ ID NO: 18) y 246-K4 (nt 4922-4945), 5' -CTGTTACCGAGATGGTTGGAAGC- 3' (SEQ ID NO: 19)] utilizando un ensayo a base de PCR. En resumen, los iniciadores específicos del gen fueron utilizados para detectar combinaciones de DNA de BAC. Las combinaciones BAC que produjeron un fragmento de DNA amplificado del tamaño pronosticado fueron buscados hasta que se identifico un BAC individual. El BAC 63-1 18 fue aislado y secuenciado con iniciadores específicos del gen para el cDNA de la CD39-L4, así como los iniciadores específicos del intron. La secuencia codificante de la CD39-L4 se encontró distribuida sobre 10 exones abarcando 9.3 kb del DNA genómico como se establece en la SEQ ID NO: 8.

EJEMPLO 12 La CD39-L4 es estimulada por cationes equivalentes El alto grado de concentración en las regiones conservadas de la apirasa de la CD39-L4 sugiere función similar para otras apirasas. Para probar esta hipótesis, células COS-7 fueron transfectadas con la construcción CD39-L4-6His como ya se describió. El medio de las células transfectadas fue incubado con níquel-NTA resina (Qiagen) para captura la proteína etiquetada con 6His, la resina fue lavada con buffer de ensayo (buffer A, Tris 15 mM pH 7.5, NaCl 134 mM y glucosa 5 mM) y la proteína todavía pegada a la resina en una suspensión fue ensayada para la actividad de la ADPasa. La actividad nucleotidasa fue determinada midiendo la cantidad de fosfato inorgánico liberado de los sustratos nucleótidos utilizando la técnica de Dlay y Ertingshusen, Clin. Chem. 18: 263-265 (1972). En esta reacción, el complejo del fósforo inorgánico con el reactivo de fósforo (molibdato de amonio en presencia de ácido sulfúrico) produce un compuesto fosfomolibdato no reducido. La absorbancia de este complejo a 340 nm es directamente proporcional a la concentración del fósforo inorgánico. La proteína todavía pegada a la resina como una suspensión al 30% en solución amortiguadora fue ensayada por la adición de nucleótido a una concentración final de 1 mM e incubada a 37 °C durante 30 minutos. La reacción fue interrumpida adicionando 100 volúmenes en reactivo de fósforo. La cantidad de fosfato liberada de la reacción fue cuantificada utilizando un estándar combinando calcio/fósforo (sigma) . La cantidad de proteína CD39-L4 utilizada en los ensayos fue calculada comparando la intensidad de la banda de la CD39-L4 en Western blot con las de una serie de estándares de cantidad conocida. La proteína CD39-L4 de células transfectadas mostró un aumento 2.3 veces la actividad sobre las células transfectadas con el vector solo. Cuando se adicionaron Ca2+ y Mg2+, la actividad aumento 3.6 veces y 6 veces, respectivamente.

EJEMPLO 13 Caracterización de la actividad de la CD39-L4 La proteína CD39-L4 fue ensayada para la actividad de ADPasa en presencia de diferentes clases de inhibidores de las ADPasas. La actividad ecto-apirasa control fue determinada con proteína pegada a la resina níquel-NTA. Ambos ensayados fueron realizados como ya se describió salvo que la proteína estuvo en una solución amortiguadora A conteniendo CaCl2 2 mM y MgCl2 2 mM. Como se muestra en la tabla 1 siguiente, los inhibidores fosfatasas (F~) y la adenilato cinasa (Ap5A) no inhibieron la actividad. Los inhibidores de las AtPasas vacuolares (NEM) , las ATPasas mitocondriales (N3~) y Na+, K+ ATPasa (ouabaina) no inhibió significativamente la actividad estimulada por Ca2+ y Mg2+. No obstante, los queladores metálicos (EDTA y EGTA) inhibieron significativamente la actividad. Estos resultados muestran que la gran mayoría de la actividad en los ensayos se origina de una proteína unida a la resina con característica de una apirasa tipo E.

Tabla 1 Inhibición de la actividad de la CD39-L4 Se copian los datos de la tabla como se muestra en la Tabla 2 siguiente, la especificidad del nucleótido de CD39-L4 también fue ensayada como ya se describió. La actividad de la CD39-L4 fue determinada con proteína unida a la resina Ni-NTA. La proteína estaba en buffer A conteniendo EGTA 1 mM, así como CaCl2 y MgCl2 2 mM. El ensayo fue comenzado adicionando los nucleótidos a una concentración final de 1 mM. Los valores siguientes se expresan con relación al ADP. La actividad relativa de los nucleótido trifosfatos varía casi siete veces con ATP siendo el sustrato más pobre. Ningún fosfato liberado fue detectado con AMP, y el ADP fue hidrolizado a una tasa aproximadamente 20 veces mayor que ATP. Los demás nucleótido difosfato (GDP y UDP) también fueron muy eficazmente hidrolizados por la CD39-L4. Estos resultados indican que la CD39-L4 define una nueva clase de apirasa tipo E en humanos con una especificidad para los NDP como sustratos enzimáticos.

Tabla 2 Especificidad de la CD39-L4 con el sustrato EJEMPLO 14 La glusosilación no es esencial para la astividad de la CD39-L4 Modificaciones post-traduccionales como la glucosilación ligada a N son comunes en proteínas de mamífero secretadas y unidas a membrana. Estas modificaciones pueden ser importantes para el dobles correcto de la ' proteína o la actividad enzimática y no son fácilmente reproducidas cuando las proteínas se expresan en otros organismos como bacterias. Para probar si la CD39-L4 se glucosila, células COS-7, transfectadas como se describe en el ejemplo 6, fueron tratadas con tunicamicina (Sigma) , que bloque la formación de enlaces N-glucosídicos . Las células COS-7 fueron crecidas hasta 75% de confluencia y transfectadas con la construcción CD39-L4-6His. Después de 24 horas, una fracción de las células COS-7 fueron tratadas con tunicamicina a una concentración de 5 µg/ml. El medio fue sustituido nuevamente después de 24 horas con tunicamicina fresca y cos'echado después de 48 horas. La proteína CD39-L4-6HÍS fue concentrada tratando el medio con níquel-NTA agarosa (Qiagen) . La resina fue lavada con solución amortiguadora para ensayo y la proteína todavía adherida a la resina en una suspensión fue ensayada para un desplazamiento en la movilidad electroforética así como para su actividad ADPasa. El análisis western blot utilizando un anticuerpo contra el epítope 6-His revelo que la proteína CD39-L4 glucosilada aislada de células control tuvo un tamaño aproximado de 51 kDa. No obstante, las células tratadas con tunicamicina tuvieron un peso molecular de aproximadamente 46 kDa indicando que la proteína estaba deglucosilada. La actividad de la ADPasa de las células tratadas con tunicamicina fue ensayada como se describen en el ejemplo 12 anterior. La proteína CD39-L4 deglucosilada tuvo actividad ADPasa comparable con una cantidad igual de la proteína glucosilada aislada de las células control. Esto demuestra que la glucosilación de la proteína no es importante para la actividad ADPasa. La presente invención no se limita en su alcance por las modalidades e emplificadas que se sugieren como ilustraciones de aspecto sencillos de la invención, y las composiciones y métodos que son funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención. En realidad, numerosas modificaciones y variaciones en la práctica de la invención se espera que perciba los expertos en la técnica con la consideración de las modalidades actualmente preferidas. En consecuencia, las únicas limitaciones que deben ponerse en el alcance de la invención son aquellas que aparecen en las cláusulas anexas. Todas las referencias mencionadas dentro del cuerpo de la especificación presente se incorporan como referencia en sus enterezas.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Hyseq Ford, John (inventor) Mulero, Julio ( inventor) <120> MÉTODOS Y MATERIALES RELACIONADOS CON POLI PÉPTI DOS TI PO CD39 NOVEDOSOS <130> 28110/35836 <140> <141> <150> 09/273,447 <151> 1999-03-19 <150> 09/118,205 <151> 1998-07-16 <150> 09/122,449 <151> 1998-07-24 <150> 09/244,444 <151> 1999-02-04 <150> XX/XXX,XXX <151> 1999-07-09 <160> 25 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 300 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggcatattag cttgggttac tgtgaatttt ctgacaggtc agctgcatgg ccacagacag 60 gagactgtgg ggaccttgga cctaggggga gcctccaccc aaatcacgtt cctgccccag 120 tttgagaaaa ctctggaaca aactcctagg ggctacctca cttcctttga gatgtttaac 180 agcacttata agctctatac acatagttac ctgggatttg gattgaaagc tgcaagacta 240 gcaaccctgg gagccctgga gacagaaggg actgatgggc acactttccg gagtgcctgt 300 <210> 2 <211> 1799 Í34 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (246) (1529) <220> <221> misc_característica <222> (1718) <223> n = adenina o guanina o citosina o timina <400> 2 gcgggctgcc gcgcaagggt ggcgcgcgcg cgttttcctt gttcctggtc aacaaagaaa 60 tgtggagtgt cttggctgaa tcctcataca gacaagatca tta,tggtgct .gttaggttga 120 aaaagtgata taataaagga accaaggaga aaattcagaa ggaaagaaaa aattgcctct 180 gcaggtgtgc gagcaggatt gcttctgcaa caaaagcctc cacccagcca catcttggga 240 aaaga atg gcc act tet tgg ggc acá gtc ttt ttc atg ctg gtg gta tec 290 Met Ala Thr Ser Trp Gly Thr Val Phe Phe Met Leu Val Val Ser 1 5 " - 10 15 tgt gtt tgc age gct gtc tec cae agg aac cag cag; act tgg ttt gag 338 Cys Val Cys Ser Ala Val Ser His Arg Asn Gln Gln Thr Trp Phe Glu 20 25 30 ggt ate ttc ctg tet tec atg tgc ccc ate aat gtc age gcc age acc 386 Gly Tie Phe Leu Ser Ser Met Cys Pro lie Asn Val Ser Ala Ser Thr 35 40 45 ttg tat gga att atg ttt gat gca ggg age act gga act cga att cat 434 Leu Tyr Gly lie Met Phe Asp Ala Gly Ser Thr Gly Thr Arg lie His 50 55 60 gtt tac acc ttt gtg cag aaa atg cea gga cag ctt cea att cta gaa 482 Val Tyr Thr Phe Val Gln Lys Met Pro Gly Gln Leu Pro lie Leu Glu 65 70 75 ggg gaa gtt ttt gat 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Gly Leu Leu Glu Val Ala Lys 100 105 --- 110 Asp Ser He Pro Arg Ser His Trp Lys Lys Thr Pro Val Val Leu Lys 115 120 125 Ala Thr Ala Gly Leu Arg Leu Leu Pro Glu His Lys Ala Lys Ala Leu 130 13-5 14Q Leu Phe Glu Val Lys Glu He Phe Arg Lys Ser Pro Phe Leu Val Pro 145 150 155 160 Lys Gly Ser Val Ser He Met Asp Gly Ser Asp Glu Gly He Leu Ala 165 170 * 175 Trp Val Thr Val Asn Phe Leu Thr Gly Gln Leu His Gly His Arg Gln 180 185 190 Glu Thr Val Gly Thr Leu Asp Leu Gly Gly Ala Ser Thr Gln He Thr 195 200 205 Phe Leu Pro Gln Phe Glu Lys Thr Leu Glu Gln Thr- Pro Arg Gly Tyr 210 215 22<X- Leu Thr Ser Phe Glu Met Phe Asn Ser Thr Tyr Lys Leu Tyr Thr His 225 230 " 235 240 Ser Tyr Leu Gly Phe Gly Leu Lys Ala Ala Arg Leu Ala Thr Leu Gly 245 250 255 Ala Leu Glu Thr Glu Gly Thr Asp Gly His Thr Phe Arg Ser Ala Cys 260 265 270 Leu Pro Arg Trp Leu Glu Ala Glu Trp He Phe Gly Gly Val Lys Tyr 275 280 285 Gln Tyr Gly Gly Asn Gln Glu Gly Glu Val Gly Phe Glu Pro Cys Tyr 290 295 300 Ala Glu Val Leu Arg Val Val Arg 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(1284) <400> 4 atg gcc act tet tgg ggc acá gtc ttt ttc atg ctg gtg gta tec tgt 48 Met Ala Thr Ser Trp Gly Thr Val Phe Phe Met Leu Val Val Ser Cys 1 5 10 15 gtt tgc age gct gtc tec cae agg aac cag cag act tgg ttt gag ggt 96 Val Cys Ser Ala Val Ser His Arg Asn Gln Gln Thr Trp Phe Glu Gly 20 25 30 ate ttc ctg tet tec atg tgc ccc ate aat gtc age gcc age acc ttg 144 He Phe Leu Ser Ser Met Cys Pro He Asn Val Ser Ala Ser Thr Leu 35 40 45 tat gga att atg ttt gat gca ggg age act gga act cga att cat gtt 192 Tyr Gly He Met Phe Asp Ala Gly Ser Thr Gly Thr Arg He His Val 50 55 60 tac acc ttt gtg cag aaa atg cea gga cag ctt cea att cta gaa ggg 240 Tyr Thr Phe Val Gln Lys Met Pro Gly Gln Leu Pro He Leu Glu Gly 65 70 75 80 gaa gtt ttt gat tet gtg aag cea gga ctt tet gct ttt gta gat caá 288 Glu Val Phe Asp Ser Val Lys Pro Gly Leu Ser Ala. Phe Val Asp Gln 85 90 95 ect aag cag ggt gct gag acc gtt ca ggg etc tta gag gtg gcc aaa 336 Pro Lys Gln Gly Ala Glu Thr Val Gln Gly Leu Leu Glu Val Ala Lys 100 105 110 gac tea ate ccc cga agt cae tgg aaa aag acc cea gtg gtc cta aag 384 Asp Ser He Pro Arg Ser His Trp Lys Lys Thr Pro Val Val Leu Lys 115 120 125 gca acá gca gga cta cgc tta ctg cea gaa cae aaa gcc aag gct ctg 432 Ala Thr Ala Gly Leu Arg Leu Leu Pro Glu His Lys Ala Lys Ala Leu 130 135 140' etc ttt gag gta aag gag ate ttc agg aag tea ect ttc ctg gta cea 180 Leu Phe Glu Val Lys Glu He Phe Arg Lys Ser Pro Phe Leu Val Pro 145 150 155 160 aag ggc agt gtt age ate atg gat gga tec gac gaa ggc ata tta gct 528 Lys Gly Ser Val Ser He Met Asp Gly Ser Asp Glu Gly He Leu Ala 165 170 175 tgg gtt act gtg aat ttt ctg acá ggt cag ctg cat ggc cae aga cag 576 Trp Val Thr Val Asn Phe Leu Thr Gly Gln Leu His Gly His Arg Gln 180 185 190 gag act gtg ggg acc ttg gac cta ggg gga gcc tec acc ca ate acg 624 Glu Thr Val Gly Thr Leu Asp Leu Gly Gly Ala Ser Thr Gln He Thr 195 200 205 ttc ctg ccc cag ttt gag aaa act ctg gaa caá act ect agg ggc tac 672 Phe Leu Pro Gln Phe Glu Lys Thr Leu Glu Gln Thr Pro Arg Gly Tyr 210 215 220 etc act tec ttt gag atg ttt aac age act tat aag etc tat acá cat 720 Leu Thr Ser Phe Glu Met Phe Asn Ser Thr Tyr Lys Leu Tyr Thr His 225 230 235 240 agt tac ctg gga ttt gga ttg aaa gct gca aga cta gca acc ctg gga 768 Ser Tyr Leu Gly Phe Gly Leu Lys Ala Ala Arg Leu Ala Thr Leu Gly 245 250 255 gcc ctg gag acá gaa_ ggg act gat ggg cae act tt-c- cgg agt gcc tgt 816 Ala Leu Glu Thr Glu Gly Thr Asp Gly His Thr Phe Arg Ser Ala Cys 260 265 270 tta ceg aga tgg ttg gaa gca sag tgg ate ttt ggg ggt gtg aaa tac 864 Leu Pro Arg Trp Leu Glu Ala Glu Trp He Phe Gly Gly Val Lys Tyr 275 280 285 cag tat ggt ggc aac caá gaa ggg gag gtg ggc ttt gag ccc tgc tat 912 Gln Tyr Gly Gly Asn Gln Glu Gly Glu Val Gly Phe Glu Pro Cys Tyr 290 295 300 gcc gaa gtg ctg agg gtg gta cga gga aaa ctt cae cag cea gag gag 960 Ala Glu Val Leu Arg Val Val Arg Gly Lys Leu His Gln Pro Glu Glu 305 310 315 320 gtc cag aga ggt tec ttc tat gct ttc tet tac tat- tat gac cga gct 1008 Val Gln Arg Gly Ser Phe Tyr Ala Phe Ser Tyr Tyr Tyr Asp Arg Ala 325 330 335 gtt gac acá gac atg att gat tat gaa aag ggg ggt att tta aaa gtt 1056 Val Asp Thr Asp Met He Asp Tyr Glu Lys Gly Gly He Leu Lys Val 340 345 350 gaa gat ttt gaa aga aaa gcc agg gaa gtg tgt gat aac ttg gaa aac 1104 Glu Asp Phe Glu Arg Lys Ala Arg Glu Val Cys Asp Asn Leu Glu Asn 355 360 365 ttc acc tea ggc agt ect ttc ctg tgc atg gat etc age tac ate acá 1152 Phe Thr Ser Gly Ser Pro Phe Leu Cys Met Asp Leu Ser Tyr He Thr 370 375 380 gcc ctg tta aag gat ggc ttt ggc ttt gca gac agg aca gtc tta cag 1200 Ala Leu Leu Lys Asp Gly Phe Gly Phe Ala Asp Ser Thr Val Leu Gln 385 390 395 -. 400 Ctc acá aag aaa gtg aac aac ata gag acg ggc tgg gcc ttg ggg gcc 1248 Leu Thr Lys Lys Val Asn Asn He Glu Thr Gly Trp Ala Leu Gly Ala 405 410 415 acc ttt cae ctg ttg cag tet ctg ggc ate tec cat tga 1287 Thr Phe His Leu Leu Gln Ser Leu Gly He Ser His 420 425 <210> 5 <211> 428 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Ala Thr Ser Trp Gly Thr Vaí Phe Phe Met Leu Val Val Ser Cys 1 5 10 15 Val Cys Ser Ala Val Ser His Arg Asn Gln Gln Thr Trp Phe Glu Gly 20 25 30 He Phe Leu Ser Ser Met Cys Pro He- Asn Val Ser Ala Ser Thr Leu 35 40 45 Tyr Gly He Met Phe Asp Ala Gly Ser Thr Gly Thr Arg He His Val 50 55 60 Tyr Thr Phe Val Gln Lys Met Pro Gly Gln Leu Pro He Leu Glu Gly 65 70 75 80 Glu Val Phe Asp Ser Val Lys Pro Gly Leu Ser Ala Phe Val Asp Gln 85 90 95 Pro Lys Gln Gly Ala Glu Thr Val Gln Gly Leu Leu Glu Val Ala Lys 100 105 110 Asp Ser He Pro Arg Ser His Trp Lys Lys Thr Pro Val Val Leu Lys 115 120 125 Ala Thr Ala Gly Leu Arg Leu Leu Pro Glu His Lys Ala Lys Ala Leu 130 135 140 Leu Phe Glu Val Lys Glu He Phe Arg Lys Ser Pro Phe Leu Val Pro 145 150 155 160 Lys Gly Ser Val Ser He Met Asp Gly Ser Asp Glu Gly He Leu Ala 165 170 175 Trp Val Thr Val Asn Phe Leu Thr Gly Gln Leu His Gly His Arg Gln 180 185 190 Glu Thr Val Gly Thr Leu Asp Leu Gly Gly Ala Ser Thr Gln He Thr 195 200 - 205 Phe Leu Pro Gln Phe Glu Lys Thr Leu Glu Gln Thr Pro Arg Gly Tyr 210 215 220 Leu Thr Ser Phe Glu Met Phe Asn Ser Thr Tyr Lys Leu Tyr Thr His 225 230 235 _ 240 Ser Tyr Leu Gly Phe Gly Leu Lys Ala Ala Arg Leu"Ala Thr Leu Gly 245 250 255 Ala Leu Glu Thr Glu Gly Thr Asp Gly His Thr Phe Arg Ser Ala Cys 260 265 270 Leu Pro Arg Trp Leu Glu Ala Glu Trp He Phe Gly Gly Val Lys Tyr 275 280 285 Gln Tyr Gly Gly Asn Gln Glu Gly Glu Val Gly Phe Glu Pro Cys Tyr 290 295 300 Ala Glu Val Leu Arg Val Val Arg Gly Lys Leu His Gln Pro Glu Glu 305 310 -. 315 _ 320 Val Gln Arg Gly Ser Phe Tyr Ala Phe Ser Tyr Tyr Tyr Asp Arg Ala 325 330 335 Val Asp Thr Asp Met He Asp Tyr Glu Lys Gly Gly. He Leu Lys Val 340 345 350 Glu Asp Phe Glu Arg Lys Ala Arg Glu Val Cys Asp Asn Leu Glu Asn 355 360 365 Phe Thr Ser Gly Ser Pro Phe Leu Cys Met Asp Leu Ser Tyr He Thr 370 37-5 380 Ala Leu Leu Lys Asp Gly Phe Gly Phe Ala Asp Ser Thr Val Leu Gln 385 390 ' 395 400 Leu Thr Lys Lys Val Asn Asn He Glu Thr Gly Trp Ala Leu Gly Ala 405 410 415 Thr Phe His Leu Leu Gln Ser Leu Gly He Ser His 420 425 <210> 6 <211> 1287 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) .. 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Ala Leu Leu Phe Glu Val Lys 135 140 145 gag ate ttc agg aag tea ect ttc ctg gta cea aag ggc agt gtt age 1558 Glu He Phe /Arg Lys Ser Pro Phe Leu Val Pro Lys Gly Ser Val Ser 150 155 160 165 ate atg gat gga tec gac gaa g gtgggagag gtgttgatat gcgttccagg 1609 He Met Asp Gly Ser Asp Glu 170 gggagagggg caggatcagt gaaagatcta actaaaggaa ctggggccag gaataaacag 1669 aaggaatgag atageaggaa atagaagaca gggagaaggg aacatgtgct ctagacatgg 1729 aatttagaga ggaaaaaaaa aaaacaaggt tggggccagg aaagagaaaa aatgctctgg 1789 gatetaatec ttgtctttct ttctttttag gc ata tta gct tgg gtt act gtg 1842 Gly He Leu Ala Trp Val Thr Val 175 180 aat ttt ctg acá g gtaatacat cctcaagttt atctttagag ettaactage 1894 Asn Phe Leu Thr ttttacatgc atagtcagag gagtaaaagc ctcttctttc attctgtatt gtttcttctt 1954 ctttaaaaaa ggaaaagagg ctgggtgtgg cagttcatgc ctgttaattc cagcgctttg 2014 ggaggctgag ttgggcagat cacttgaggc caggagttca agaccagcct ggccaacatg 2074 gcgaaactcc gtctctacca aaaatacaaa aatagctggg catggtggtg tgtacctgta 2134 gtcccagcta ctcaggaggc 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tacatgeagg tggaacaaca gagtaactec attgatctct 4342 tcacaggtca ggcagaactg ggttcagtcc cagtgttgtg atatgaggcr agtaaectat 4402 ctgtgcccct ttcctcacat taaatgagaa tttgcattta aggcactttg tacagtaatc 4462 tgttattggg atgacatcta ttttgcattt cagagtatac aaaacatctt caagtatatt 4522 taattgaagc ctctcagcaa ccagtgagga aggtagcata gcatttcttt cctgttttta 4582 taaaggggaa agttgctgta kgaaggttyk rgatctcttw ragatgtgat raaagccatg 4642 gacccctctg acaaaageac atatgeatga aaatttgett ctggtttcag ggggttcacc 4702 aaccccacaa agectatett tgaaccctga gttaaggatt cctgtcacag gatgttgtca 4762 tggaattaat ttcataggat tttaaggccc agcccccatg gtgaytcttt tccacctcac 4822 tggcttcttg cttgccttcc tccctctctc teaettaett acctcttacc ttgtgccctg 4882 gattctttcag gg act gat ggg cae act ttc cgg agt gcc tgt tta ceg 4931 Thr Asp Gly His Thr Phe Arg Ser Ala Cys Leu Pro 265 270- aga tgg ttg gaa gca gag tgg ate ttt ggg ggt gtg aaa tac cag tat 4979 Arg Trp Leu Glu Ala Glu Trp He Phe Gly Gly Vaí Lys Tyr Gln Tyr 275 280 285 290 ggt ggc aac caá gaa g gcaagtgat 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atggaattat gtttgatgca gggagcactg 420 gaactcgaat tcatgtttac acctttgtgc agaaaatgcc aggacagctt ecaattetag 480 aaggggaagt ttttgattct gtgaagccag gactttctgc ttttgtagat caacctaagc 540 agggtgctga gaccgttcaa gggctcttag aggtggccaa agáctcaatc ccccgaagtc 600 actggaaaaa gaccccagtg gtcctaaagg caacageagg actaegetta ctgccagaac 660 acaaagccaa ggctctgctc tttgaggtaa aggagatctt caggaagtca cctttcctgg 720 taccaaaggg cagtgttagc atcatggatg gatcegaega aggcatatta gcttgggtta 780 ctgtgaattt tctgacaggt cagctgcatg gccacagaca ggagactgtg gggaccttgg 840 acctaggggg agcctccacc caaatcacgt tcctgcccca gtttgagaaa actctggaac 900 aaactcctag gggctacctc acttcctttg agatgtttaa cageaettat aagetetata 960 cacatagtta cctgggattt ggattgaaag ctgcaagact agcaaccctg ggagccctgg 1020 agacagaagg gactgatggg cacactttcc ggagtgcctg tttacegaga tggttggaag 1080 cagagtggat ctttgggggt gtgaaatacc agtatggtgg caaccaagaa ggggaggtgg 1140 gctttgagcc ctgctatgcc gaagtgetga gggtggtaeg aggaaaactt caccagccag 1200 aggaggtcca gagaggttcc ttctatgctt tetettacta ttatgaccga gctgttgaca 1260 cagacatgat tgattatgaa aaggggggta ttttaaaagt tgaagatttt gaaagaaaag 1320 ccagggaagt gtgtgataac ttggaaaact tcacctcagg cagtcctttc ctgtgcatgg 1380 atctcagcta catcacagcc ctgttaaagg atggctttgg ctttgcagac agcacagtct 1440 tacaggctgc cgtactgagg tgatgggcca agctggagat atccccaaag cccatgttga 1500 caccctgtcc tgcaagcgga tggactctgt gggctgcatc ectaagaata aagcagagtt 1560 caggtgtgac ctctggcagc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1601 <210> 25 <211> 405 <212> PRT <213> Ho o sapiens <400> 25 Met Ala Thr Ser Trp Gly Thr Val Phe Phe Met Leu Val Val Ser Cys 1 5 10 15 Val Cys- Ser Ala Val Ser His Arg Asn Gln Gln Thr Trp Phe Glu Gly 20 25 30 He Phe Leu Ser Ser Met Cys Pro He Asn Val Ser Ala Ser Thr Leu 35 40 45 Tyr Gly He Met Phe Asp Ala Gly Ser Thr Gly Thr Arg He His Val 50 55 60 Tyr Thr Phe Val Gln Lys Met Pro Gly Gln Leu Pro He Leu Glu Gly 65 70 75 80 Glu Val Phe Asp Ser Val Lys Pro Gly Leu Ser Ala Phe Val Asp Gln 85 90 95 Pro Lys Gln Gly Ala Glu Thr Val Gln Gly Leu Leu Glu Val Ala Lys 100 105 110 Asp Ser He Pro Arg Ser His Trp Lys Lys Thr Pro Val Val Leu Lys 115 120 125 Ala Thr Ala Gly Leu Arg Leu Leu Pro Glu His Lys Ala Lys Ala Leu 130 135 140 Leu Phe* Glu Val Lys Glu He Phe Arg Lys Ser Pro Phe Leu Val Pro 145 " 150 155 160 Lys Gly Ser Val Ser He Met Asp Gly Ser Asp Glu Gly He Leu Ala 165 170 175 Trp Val Thr Val Asn Phe Leu Thr Gly Gln Leu His Gly His Arg Gln 180 185 190 Glu Thr Val Gly Thr Leu Asp Leu Gly Gly Ala Ser" Thr Gln He Thr 195 200 205 Phe Leu Pro Gln Pt-e Glu Lys Thr Leu Glu Gln Thr Pro Arg Gly Tyr 210 215 220-Leu Thr Ser Phe Glu Met Phe Asn Ser Thr Tyr Lys Leu Tyr Thr His 225 230 235 240 Ser Tyr Leu Gly Phe Gly Leu Lys Ala Ala Arg leu Ala Thr Leu Gly 245 250 255 Ala Leu Glu Thr Glu Gly Thr Asp Gly His Thr Phe Arg Ser Ala Cys 260 265 270 Leu Pro Arg Trp Leu Glu Ala Glu Trp He Phe Gly Gly Val Lys Tyr 275 280 _285 Gln Tyr Gly Gly Asn Gln Glu Gly Glu Val Gly Phe Glu Pro Cys Tyr 290 295 300 Ala Glu Val Lea Arg Val Val Arg Gly Lys Leu His Gln Pro Glu Glu 305 310 315 320 Val Gln Arg Gly Sex Phe Tyr Ala Phe Ser Tyr Tyr Tyr Asp Arg Ala 325 330 335 Val Asp Thr Asp Met He Asp Tyr Glu Lys Gly Gly He Leu Lys Val 340 345 350 Glu Asp Phe Glu Arg Lys Ala Arg Glu Val Cys sp Asn Leu Glu Asn 355 360 -365 Phe Thr Ser Gly Ser Pro Phe Leu Cys Met Asp leu Ser Tyr He Thr 370 375 380 Ala Leu Leu Lys Asp Gly Phe Gly Phe Ala Asp Ser Thr Val Leu Gln 385 390 395 400 Ala Ala Val Leu Arg 405

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Ün polinucleótido humano aislado que codifica una apirasa y/o NDPasa y que consiste en una secuencia de nucleótidos teniendo cuando menos aproximadamente 80% de identidad de la secuencia para un polinucleótido seleccionado de: (a) Un polinucleótido teniendo la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2; y (b) un polinucleótido teniendo la secuencia de nucleótidos que codifica la proteina madura de la secuencia de polinucleótido (a) . 2. Un polinucleótido aislado que codifica una apirasa y/o NDPasa y que consiste en una secuencia de nucleótidos teniendo cuando menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia para un polinucleótido seleccionado de: (a) Un polinucleótido teniendo la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2; y (b) un polinucleótido teniendo la secuencia de nucleótidos que codifica la proteina madura de la secuencia de polinucleótido (a) . 3 Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido con actividad apirasa y/o ÑDPasa y que consiste en un polinucleótido seleccionado de: (a) polinucleótido que codifican la secuencia de aminoácidos de la proteina madura de la SEQ ID NO: 3; y (b) polinucleótidos que hibridan bajo condiciones restrictivas al complemento de (a) . 4. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido con actividad apirasa y/o NDPasa que híbrida bajo condiciones restrictivas al complemento de un polinucleótido de la SEQ ID NO: 2. 5. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que es un DNA. 6. El DNA de la reivindicación 5, el cual es una molécula DNA total o parcialmente sintetizada por medios químicos . 7. un polinucleótido antisentido que híbrida específicamente con el complemento del polinucleótido de la reivindicación 4. 8. El polinucleótido de la reivindicación 4 que consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 ó 24 o porciones de este que codifican la proteina madura. 9. Un polinucleótido aislado que consiste en un complemento del polinucleótido de la reivindicación 1. 10. Un vector de expresión que consiste en el DNA de la reivindicaciones 5. 11. Dna célula hospedera que contiene el DNA de la reivindicación 5. 12. Una célula hospedera genéticamente manipulada para expresar el DNA de la reivindicación 5 u 8. 13. Un polipéptido humano aislado con actividad apirasa y/o NDPasa que consiste en: (a) la secuencia de la proteina madura de la SEQ ID NO: 3; o (b) una secuencia de aminoácidos teniendo cuando menos aproximadamente 80% de identidad de la secuencia con la SEQ ID NO: 3. 14. Un polipéptido aislado con actividad apirasa y/o NDPasa que comprende: (a) la secuencia de la proteina madura tipo CD39 de la SEQ ID NO: 3; o (b) una secuencia de aminoácidos teniendo cuando menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3. 15. El polipéptido de la reivindicación 13 ó 14 que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 ó 25 o porciones de este de la proteina madura. 16. El polipéptido de la reivindicación 13 o 14, en donde el polipéptido comprende cuando menos una sustitución de aminoácidos seleccionados de grupo que consiste en: D168?T, S170-Q y L175?F. 17. El polipéptido de la reivindicación 16" consiste en un polipéptido teniendo la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 7 o la porción de este de la proteina madura. 18. Un método para producir un polipéptido tipo CD39 consistiendo en los pasos de: (a) hacer crecer un cultivo de células de acuerdo con la reivindicación 11 o 12 .bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido tipo CD39; y (b) aislar el polipéptido tipo CD39 de la célula hospedera o su medio de crecimiento. 19. Una composición que contiene el polipéptido de la reivindicación 13, 14 ó 15 y un portador farmacéuticamente aceptable. 20. Un anticuerpo específicamente inmuno-reactivo con un polipéptido codificado por el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1. 21. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 20, el cual es un anticuerpo monoclonal. 22. Un hibridoma que secreta el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 21. 23. Un anticuerpo anti-idiotipo específicamente inmuno-reactivo con el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 21. 24. Un método para detectar un polinucleótido de la reivindicación 1, 2 ó 3 en una muestra, comprende los pasos de: (a) poner en contacto las muestra con un compuesto que se une específicamente y forma un complejo con el polinucleótido durante un periodo suficiente para detectar el complejo; y (b) detectar el complejo de modo que si se detecta un complejo, se detecte el polinucleótido. 25. Un método para detectar un polinucleótido de la reivindicación 1, 2 ó 3 en una muestra, comprende los pasos de: (a) poner en contacto la muestra bajo condiciones de hibridación restrictivas con iniciadores de ácidos nucleicos que templen el polinucleótido bajo tales condiciones; y (b) amplificar el polinucleótido de modo que si se amplifica un polinucleótido, se detecta el polinucleótido . 26. El método de la reivindicaciones 24, en donde el polinucleótido es una molécula de RNA que codifica un polipéptido de la reivindicaciones 13 ó 14 ó 15, y el método además comprende la transcripción inversa de una molécula de RNA templada en un polinucleótido de cDNA. 27. Un método para detectar un polinucleótido de la reivindicación 13, 14 ó 15 en una muestra, comprende: (a) poner en contacto las muestra con un compuesto que se une específicamente a y forma un complejo con el polipéptido durante un periodo suficiente para detectar el complejo; y (b) detectar el complejo de modo que si se detecta el complejo, se detecta el polipéptido. 28. Un método para identificar un compuesto que se une a un polipéptido de la reivindicación 13, 14 ó 15, que consiste en: (a) poner en contacto un compuesto con el polipéptido durante un tiempo suficiente para formar un complejo polipéptido/compuesto; y (b) detectar el complejo de modo que si se detecta el complejo polipéptido/compuesto, se detecta un compuesto que se une al polipéptido. 29. Un método para identificar un compuesto que se une a un polipéptido de la reivindicación 13, 14 ó 15, consiste en: (a) poner en contacto un compuesto con el polipéptido, en una célula, durante un tiempo suficiente para formar un complejo polipéptido/compuesto, en donde el complejo dirige la expresión de una secuencia de gen reportero en la célula; y (b) detectar el complejo detectando la expresión de la secuencia del gen reportero de modo que si se detecta el complejo polipéptido/compuesto, se identifica el compuesto que se une al polipéptido. 30. Un método para identificar un compuesto modulador de un polipéptido tipo CD39 con actividad apirasa, comprende los pasos de: (a) poner en contacto el polipéptido tipo CD39 codificado por el polinucleótido de la reivindicación 1, 2 ó 3 como un sustrato en presencia y ausencia de un compuesto de prueba; (b) comparar la actividad apirasa del polipéptido tipo CD39 en presencia y ausencia del compuesto de prueba; y (c) identificar el compuesto de prueba como un compuesto modulador cuando la actividad biológica del polipéptido tipo CD39 incrementa o disminuye en presencia del compuesto de prueba. 31. Un método para identificar un compuesto modulador de un polipéptido tipo CD39 con actividad NDPasa, comprende los pasos de: (a) poner en contacto el polipéptido tipo CD39 codificado por el polinucleótido de la reivindicación 1, 2 ó 3 con un sustrato en presencia "y ausencia de un compuesto de prueba; (b) comparar la actividad NDPasa del polipéptido tipo CD39 en presencia y ausencia del compuesto de prueba; y (c) identificar el compuesto de prueba como un compuesto modulador cuando la actividad biológica del polipéptido tipo CD39 aumenta o disminuye en presencia del compuesto de prueba. 32. Un polipéptido quimérico que comprende uno o más dominios de un polipéptido tipo CD39 fusionado a uno o más dominios del péptido o polipéptido heterólogo, por ejemplo, una región constante de inmunoglobulina. 33. Un método de tratamiento que consiste en administrar a un individuo mamífero en necesidad de éste una cantidad terapéutica de una composición que contiene un polipéptido de la reivindicación 13, 14 ó 15 y un portador farmacéuticamente aceptable. 34. Un método de tratamiento que consiste en administrar a un invididuo mamífero en necesidad de éste una cantidad terapéutica de una composición que contiene un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido de la reivindicación 13, 14 ó 15 y un portador farmacéuticamente aceptable . 35. Un método para inhibir la función de plaquetas consistiendo en administrar el -polipéptido de la reivindicación 13, 14 ó 15 a un medio que contiene plaquetas. 36. Un método de tratamiento de enfermedades trombóticas consiste en administrar una cantidad- terapéutica del polipéptido de la reivindicación 13, 14 ó 15 a un Individuo mamífero en necesidad de éste. 37. Un método para hidrolizar nucleótido difosfatos que consiste en administrar el polipéptido de la reivindicación 13, 14 ó 15 a un medio que contenga nucleótido difosfatos. 38. El uso del polipéptido de la reivindicación 13, 14 ó 15 en la preparación o fabricación de un medicamento para uso en un método para inhibir la agregación plaquetaria. 39. El uso del polipéptido de la reivindicación 13, 14 ó 15 en la preparación o fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de enfermedades trombóticas. 40. El uso del polipéptido de la reivindicación 13, 14 ó 15 en la preparación o fabricación de un medicamento para uso en un método de hidrólisis de nucleótido difosfatos.