JP2001521372A - ヒトＰ２ｘ４レセプタースプライス−変異体 - Google Patents

ヒトＰ２ｘ４レセプタースプライス−変異体

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト脳P2x4レセプターのスプライス−変異体につきコードするポリヌクレオチド配列を開示する。また、本発明は、該レセプターの組換え発現およびアンタゴニストのスクリーニングのためのそれらの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトP2x4レセプタースプライス−変異体 本発明は新たに同定されたポリヌクレオチド、かかるポリヌクレオチドにより コードされるポリペプチド、かかるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用 ならびにかかるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生産に関する。より詳細 には、本発明のポリペプチドは新規なヒト脳P2xレセプターおよびそのスプライ ス変異体である。また、本発明は、かかるポリペプチドの作用の変調およびかか るポリペプチドの作用を変調する薬剤の同定にも関する。 P2プリノセプターはリガンドとしてATPを有する。P2xサブタイプは直接的に依 存性イオンチャンネルを形成する。P2xレセプターのラット成体脳(Seguda，P.ら .，1996，J．Neuroscience 16:448-455)、ラット精管(Valera，S.ら1994，Natur e，371:516-519およびWO95/33048)、ヒト膀胱(WO95/33048)、ラットPC12(Brake, A．J.ら.，1994，Nature 371:519-523)およびラット知覚神経節(Chen,C-Cら.，1 995,Nature，377:428-431,WO95/33048)形態はクローニングされている。 本発明の態様により、 (a) 配列番号３または４に示される推定アミノ酸を有するか； (b) 配列番号５に示される推定アミノ酸配列により特徴付けられるか； (c) 配列番号３の残基１ないし45を含むアミノ酸配列により特徴付けられる か； (d) あるいは、配列番号３の残基240-388を含むアミノ酸配列により特徴付け られる； ヒト脳Ｐ2xレセプターポリペプチド、またはその断片、アナログまたは誘導体で あるポリペプチドが提供される。 以後、ポリペプチドなる語はヒト脳P2xレセプターおよびその断片、アナログ または誘導体をいうために用いる。本明細書では、配列番号３に示される推定ア ミノ酸配列を有するポリペプチドは、P2x-1レセプターといい、配列番号４は P2x-2レセプターといい、配列番号５に示される推定アミノ酸配列により特徴付 けられるヒト脳P2xレセプターポリペプチドはP2x-3という。 本発明のもう一つの態様により、かかるポリペプチドをコードするポリヌクレ オチド（DNAまたはRNA）が提供される。 本発明の好ましい態様により、配列番号３または４に示されるポリペプチドを コードする、または配列番号５に示される推定アミノ酸配列により特徴付けられ るポリヌクレオチドが提供される。 特に、本発明は配列番号１または２に示されるDNA配列を有するポリヌクレオ チドを提供する。 P2x-1レセプターをコードするmRNAはヒト前頭皮質mRNAから単離された。P2x-1 レセプターの予測アミノ酸配列は388個のアミノ酸を有し、P2xレセプターのラッ ト成体脳(Seguela,P.ら.,1996,J.Neuroscience 16:448-455)、ラット精管(Valer a,S.ら.,1994,Nature:371：516-519)、ラットPC12(Brake,A.J.ら.,1994,Nature 371:519-523)およびラット知覚神経節(Chen，C-Cら.,1995,Nature,377:428-431) 形態と87、51、47および47％同一である。疎水性のパターンは、このヒト脳P2x レセプターに対し、２つの膜貫通領域および大きな細胞外領域を示す。これは他 のP2xレセプターのそれと一致し、比較的短い細胞内N-およびC-末端のモデルと 矛盾しない。開始コドン(ATG)の位置は、翻訳開始につきコザック(Kozak)コンセ ンサス配列(Kozak，M．1984，Nudeic Acid Reseach 12:857-872)内にある。最初 の28アミノ酸内にある荷電した残基は分泌リーダーの不存在を示唆する。 P2x-2レセプターをコードするmRNAはヒト脳前頭皮質から単離された。P2x-2レ セプターは、ATG開始コドンからヌクレオチド135および136の間への48塩基対の 挿入によりP2x-1と区別される。P2x-2mRNAはアミノ酸残基45および46の間におけ る16アミノ酸の枠内挿入をコードする。新しい挿入配列は[CYHLHLAEVEMESPRR]で ある。これは、算出される分子量43.37Kdaを持つヒト脳P2x-2レセプターのイソ 形態の発現を示唆する。この16アミノ酸挿入のN-末端はヒトP2x-1レセプターの 第一の推定膜貫通領域の細胞外末端に向 かって起こる。第一の膜貫通領域の末端および細胞外ドメインとの連結部をカバ ーする配列を整列させると、全P2xレセプター間の配列保存の強い度合が明らか となる。この位置でのこれら付加的なアミノ酸の挿入は、ATP結合部位のコンフ ォメーションおよび数に重要な効果を有し、従って、ヒト脳P2xレセプターの薬 理学的および生理学的性質に重要な効果を有する。 イーエスティー・ジェンバンク(EST Genbank)データベース受け入れ番号R6072 2は、生後73日の女性の全脳cDNAライブラリーから単離された。EST(R60722)のコ ードされるアミノ酸残基はヒト脳P2x-1(残基1〜233)と高い同一性を有する。残 基４６ないし１７５は、ヒト脳P2x-1レセプターと比較してEST(R60722)から欠失 される。このP2xスプライス変異体のさらなる試験により興味深い下記の点が明 らかになる； 1) ヒト脳P2x-2スプライス挿入およびEST（R60722）スプライス欠失のN-末端 位は第一の推定膜貫通ドメイン内の正確に同一の残基(YVIG↓WFV)で同時に起こ る。これは可変領域が第一の膜貫通ヘリックス内に位置し、分子の細胞外部分ま で伸長しているという事実を強調する。この領域でのスプライシングの結果、新 規なP2xレセプターが生じ、これは、レセプターの薬理学および生理学に十分な 効果を有するだろう。 2) EST(R60722)欠失は、推定ATP結合部位の構造的完全さの維持に関わる10の 保存されたシステイン残基の内６を含む細胞外領域の実質的な部分を除去する。 ヒト脳P2xレセプターにおける配列の変異性（挿入または欠失）の発見は特異 性の高い新規なレセプターアゴニストまたはアンタゴニストの設計および新規な 診断薬の開発に有用であろう。 公知のレセプターと本発明のヒト脳P2xレセプターの予測アミノ酸配列の配列 を整列させると、いくつかの鍵となる保存された特徴が明らかとなる： 1) 大きな細胞外領域：ヒト脳P2x-1レセプターは、〜270アミノ酸にわたる大 きな細胞外領域を含み、これはレセプターの三次元構造を維持するにおける重要 な役割を示唆する。この領域は全P2xレセプターに存在する10の保存された システイン残基を含む。細胞外領域は12の保存されたグリシンおよび７の保存さ れたリジン残基を含む。これら残基は、通例、ヌクレオチド-結合部位と関連す る(Traut,Ｔ．Ｗ.,1994,Eur.J.Biochem.222,9-19)。変異のデータ[Buell,G.ら., EMBO J.,15,55-62(1996)]およびこれらの残基のクラスター形成は細胞外領域が 結合に関わるという点を支持する。 2) ヌクレオチド結合モチーフ：本発明のヒト脳P2x配列はウォーカー(NValke r)タイプ-A ATP-結合モチーフ(Walker,J.ら.,1982 EMBO J.,1,945-951)と類似し た配列を含む。これらのヒト脳P2xレセプターはATP-結合モチーフを含む［Ｇ（ ＫＡ）ＧＫ（ＦＤＩＩＰＴＭ）Ｉ］（下線部の残基は公知のP2xレセプター全て において保存されている)。 3) H5-様ポア領域：本発明のヒト脳P2x配列は先行し重複する第二の疎水性の 潜在的膜貫通領域において８アミノ酸の配列を含む。ヒト脳P2x配列[TMINIGSG] は、全P2xレセプターの中で保存されたモチーフと酷似している。さらに、この いわゆるH5ポア領域は、全ての電圧依存性カリウムチャンネル、内向き整流カリ ウムチャンネルおよび環状-ヌクレオチド依存性カチオンチャンネル(Ashford,M. L.ら.,1994,NATURE 370:456-459)において保存される。 本発明のポリヌクレオチドはRNA形態でもよく、あるいはcDNA、ゲノムDNAおよ び合成DNAを含むDNA形態でもよい。DNAは二本鎖または一本鎖でもよく、一本鎖 の場合にはコード鎖または非-コード（アンチ-センス）鎖でもよい。成熟ポリペ プチドをコードする暗号配列は配列番号１または２に示された暗号配列と同一で あってもよく、あるいは遺伝暗号の重複性または縮重の結果として暗号配列が配 列番号１または２に示されるDNAと同一の成熟ポリペプチドをコードする異なっ た暗号配列でもよい。 本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチ ドの暗号配列のみ；成熟ポリペプチドの暗号配列およびリーダーまたは分泌配列 またはプロタンパク質配列のごとき付加的暗号配列；成熟ポリペプチドの暗号配 列（および所望により付加的暗号配列）および成熟ポリペプチドの暗号配列の５ ’および／または３’側のイントロンまたは非−暗号配列5'のごとき非-暗号配 列：を含み得る。 従って、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」なる語はポリペプチ ドの暗号配列のみを含むポリヌクレオチドならびに付加的暗号配列および/また は非-暗号配列を含むポリヌクレオチドを含む。 さらに、本発明は、成熟ポリペプチドの断片、アナログおよび誘導体をコード する前記ポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は該ポ リヌクレオチドの天然の対立遺伝子変異体であってもよく、あるいは該ポリヌク レオチドの非-天然の変異体であってもよい。 従って、本発明は同一の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド類な らびに成熟ポリペプチドの断片、誘導体またはアナログをコードするかかるポリ ヌクレオチドの変異体を含む。かかるヌクレオチド変異体は欠失変異体、置換変 異体および付加または挿入変異体を含む。 前記したごとく、ポリヌクレオチドは配列番号１または２に示される暗号配列 の天然の対立遺伝子変異体である暗号配列を有することができる。当該分野で知 られているごとく、対立遺伝子変異体は、コードされるポリペプチドの機能を実 質的には変化させない、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し てもよいポリヌクレオチド配列の別の形態である。 また、本発明は、ポリヌクレオチドを含み、ここに、成熟ポリペプチドの暗号 配列が、宿主細胞由来のポリペプチド、例えば、細胞からのポリペプチドの輸送 を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列の発現および分泌におい て手助けするポリヌクレオチド配列に同一のリーディングフレームにて融合され てもよいポリヌクレオチドを含む。リーダー配列を有するポリペプチドは、プレ タンパク質であり、宿主細胞により切断されてポリペプチドの成熟形を形成する リーダー配列を有してもよい。また、ポリヌクレオチドは成熟タンパク質プラス 付加的5'アミノ酸残基であるプロタンパク質をコードできる。プロ配列を有する 成熟タンパク質はプロタンパク質でありタンパク質の不活性形である。ひとたび プロタンパク質が切断されると活性な成熟タンパク質が残る。 従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは成熟タンパク質、またはプロ配 列を有するタンパク質またはプロ配列およびプレ配列（リーダー配列）共に有す るタンパク質をコードできる。 また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドを精製させるマー カー配列に枠内にて融合した暗号配列も有してもよい。マーカー配列は、細菌宿 主の場合にはマーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製のために提供される pQE-9ベクターにより供給されるヘキサ-ヒスチジンタグであってもよく、あるい は、例えば、マーカー配列は、哺乳動物宿主、例えば、COS-7細胞が用いられた 場合にはヘマグルチニン(HM)タグでもよい。HAタグはインフルエンザへマグルチ ニンタンパク質由来のエピトープに対応する(Wilson,I.ら,Cell，37:767(1984)) 。 さらに、本発明は、前記のポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下で 前記の配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中にて用 いるごとく、「ストリンジェントな条件」なる語は、ハイブリダイゼーションが 、配列間で少なくとも95％、好ましくは少なくとも97％の同一性がある場合にの み起こることを意味する。好ましい具体例における前記ポリヌクレオチドとハイ ブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の成熟ポリヌクレオチドと実質的に 同様の生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコードする。 本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成 ポリペプチドであってもよく、好ましくは組換えポリペプチドである。 「断片」、「誘導体」および「アナログ」なる語は、本発明の成熟ポリペプチ ドに言及する場合は、かかるポリペプチドと実質的に同様の生物学的機能または 活性を保持するポリペプチドを意味する。従って、アナログは、プロタンパク質 の部分を分解して活性な成熟ポリペプチドを産生することにより活性化され得る プロタンパク質を含む。 本発明の成熟ポリペプチドの断片、誘導体またはアナログは、(i)1つ以上のア ミノ酸残基が、保存または非-保存のアミノ酸残基（好ましくは保存されたアミ ノ酸残基）と置換され、かかる置換されたアミノ酸残基が遺伝暗号によりコード されていてもいなくてもよいというもの、(ii)1つ以上のアミノ酸残基が置換基 を含むもの、または(iii)成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を伸長す る化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のごとき別の化合物と融合されて いるもの、または、(iv)付加アミノ酸が、リーダーもしくは分泌配列または成熟 ポリペプチドまたはプロタンパク質配列の精製に用いられる配列のごとき、成熟 ポリペプチドに融合されたものであってもよい。かかる断片、誘導体およびアナ ログは本明細書中の教示から当業者の範囲内にあると考えられる。 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは好ましくは単離された形態で 提供され、好ましくは均質となるまで精製される。 「単離された」なる語は、物質がその元来の環境（例えばそれが天然のもので あれば自然環境）から取り出されることを意味する。例えば、生きている動物内 に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、 天然系では共存するいくつかのまたは全ての物質から分離された同じポリヌクレ オチドまたはポリペプチドは単離されている。かかるポリヌクレオチドはペクタ ーの一部となり得、かつ/あるいは、かかるポリヌクレオチドまたはポリペプチ ドは組成物の一部となり得、かかるベクターまたは組成物が自然環境の一部では ない点で依然として単離されている。 また、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクタ ーにより遺伝子工学的に作成される宿主細胞および組換え技術による本発明のポ リペプチドの生産にも関する。 本発明のさらなる態様により、それ故に、宿主内で該ポリペプチドをコードす るポリヌクレオチドを発現させ、発現した産物を回収することによる、組換え技 術による本発明のポリペプチドの生産方法を提供する。別法として、本発明のポ リペプチドは慣用的なペプチド合成機により合成的に生産できる。 宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであってもよ い本発明のベクターによって遺伝子工学的に作成される（形質導入または形質転 換またはトランスフェクションされる）。ベクターは、例えばプラスミド、ウィ ルス粒子、ファージなどの形態であってもよい。作成された宿主細胞は、プロモ ーターの活性化、形質転換体の選択またはヒトP2xレセプター遺伝子の増幅 に適当な修飾された慣用的な栄養培地で培養できる。温度、pHなどのごとき培養 条件は、発現につき選択された宿主細胞で以前に用いられたものであり、当業者 には明白であろう。 本発明のポリヌクレオチドは組換え技術によるポリペプチドの生産に用いるこ とができる。従って、例えば、該ポリヌクレオチドはポリペプチドの発現用のい ずれか１種類の発現ベクターに含ませることができる。かかるベクターは、染色 体、非染色体および合成DNA配列、例えばSV40の誘導体；細菌性プラスミド；フ ァージDNA；バキュロウィルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージDNA の組み合わせ、ワクシニア、アデノウィルス、鶏痘ウィルス、および仮性狂犬病 のごときウィルス性DNAに由来するベクターを含む。しかしながら、他のいずれ のベクターも宿主中で複製可能であり生存可能である限り用いることができる。 適当なDNA配列を種々の方法によりベクター内に挿入できる。一般に、DNA配列 は当該分野において知られている方法により適当な制限エンドヌクレアーゼ部位 に挿入される。かかる方法および他の方法は、当業者の範囲内と思われる。 発現ベクターのDNA配列は、mRNA合成を指示するように、適当な発現制御配列 （プロモーター）に作動可能に連結される。かかるプロモーターの代表的な例と して、LTRまたはSV40プロモーター、イー・コリ(E ．coli)lacまたはtrp、ファー ジラムダPLブロモーターおよび原核細胞または真核細胞またはそのウィルス中に て遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターが挙げられる。 また、発現ベクターは翻訳開始のためのリボゾーム結合部位および転写ターミネ ーターを含む。また、ベクターは発現を増幅するための適当な配列を含む。 さらに、好ましくは発現ベクターは、真核細胞培養にはジヒドロ葉酸レダクタ ーゼまたはネオマイシン耐性のごとき、または、イー・コリ(E.coli)中ではテト ラサイクリンまたはアンピシリン耐性のごとき形質転換宿主細胞の選択のための 表現型特性を供する１種類以上の選択マーカー遺伝子を含む。 前記したごとき適当なDNA配列、ならびに適当なプロモーターまたは制御配列 を含むベクターを用いて、適当な宿主にタンパク質を発現させるよう該宿主を形 質転換することができる。 適当な宿主の代表的な例として、イー・コリ(E.coli)、ストレプトミセス(Str eptomyces )、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)のごとき細 菌細胞；酵母のごとき真菌細胞；ショウジョウバエ(Drosophila)およびSf9のご とき昆虫細胞；CHO、COS、またはウシ黒色腫のごとき動物細胞；植物細胞、など が挙げられる。適当な宿主の選択は本明細書中の教示から当業者の範囲内と思わ れる。 より好ましくは、また本発明は前記に広く記載のごとき１つ以上の配列を含む 組換え構築体も含む。該構築体は、その中に、順もしくは逆方向に本発明の配列 が挿入されているプラスミドまたはウィルスベクターのごときベクターを含む。 この具体例の好ましい態様において、構築体はさらに例えば、配列に作動可能に 連結されたプロモーターを含む調節配列を含む。多数の適当なベクターおよびプ ロモーターが当業者に知られており、商業的に入手できる。下記のベクターを例 として供される。細菌性：pQE70、pQE60、pQE-9、(クイアジェン(Qiagen))、pbs 、pD10、phagescript、psiX174、pbluscriptSK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A 、pNH46A（ストラタジーン(Stratagene)）；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3。pDR 540、pRIT5(ファルマシア(Pharmacia))。真核生物：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、p XT1、pSG（ストラタジーン(Stratagene)）pSVK3、pBPV、pMSG、pSLV(ファルマシ ア(Pharmacia))。しかしながら、他のいずれのプラスミドまたはベクターでも、 宿主内で複製可能であり、生存可能である限り用いられる。 プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベク ターまたは選択マーカーを持った他のベクターを用いて、いずれの所望の遺伝子 からでも選択できる。２つの適当なベクターはpKK232-8およびPCM7である。特に 命名された細菌性プロモーターはlacI、lacZ、T3、T7、gpt、ラムダPR、PLおよ びtrpである。真核生物のプロモーターはCMV即時型、HSVチミ ジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウィルスからのLTR、およびマウス メタロチオネイン-Iを含む。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、当業 者のレベルの範囲内である。 さらなる具体例において、本発明は前記の構築体を含む宿主細胞に関する。該 宿主細胞は哺乳動物細胞のごとき高等真核生物細胞であっても、酵母細胞のごと き下等真核生物細胞であっても、あるいは細菌細胞のごとき原核生物細胞であっ てもよい。構築体の宿主内への導入はリン酸カルシウムトランスフェクション、 DEAE-デキストラン介在トランスフェクションまたはエレクトロポレーションに より行うことができる(Davis,L.,Dibner,M.,Battey,I.,Basic Methods in Molec ular Biology,(1986))。 宿主細胞中の構築体を用い、常法により、組換え配列によりコードされる遺伝 子産物を生産することができる。別法として、本発明のポリペプチドは慣用的な ペプチド合成機により合成的に生産される。 成熟タンパク質は、適当なプロモーターの制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌 または他の細胞中にて発現される。また、無細胞翻訳系を用いて、本発明のDNA 構築体由来のRNAを使用し、かかるタンパク質を生産することもできる。原核生 物および真核生物宿主中で使用される適当なクローニングおよび発現ベクターは 、Sambrookら,Molecular Cloning:A Labotratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor,N.Y,(1989)に記載されており、出典明示してこの開示を本明細書 の一部とみなす。 高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするDNAの転写は、エンハ ンサー配列をベクターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、その転 写を増加させるプロモーターに作用する、通常約10ないし300bpのDNAのシス−作 用性エレメントである。例として、複製起点の後期側bp100ないし270上のSV40エ ンハンサー、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の 後期側のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが含まれる 。 一般に、組換え発現ベクターは宿主細胞を形質転換させる複製起点および選択 マーカー、例えば、イー・コリ（E.coli）のアンビシリン耐性遺伝子およびエス ・セレビシエ(S ．cerevisiae)TRP1遺伝子、および下流構造配列の転写を指示す る高-発現遺伝子由来のプロモーターを含むだろう。かかるプロモーターは、数 ある中で、3-ホスホグリセレートキナーゼ(PGK)、−因子、酸性ホスファターゼ 、または熱ショックタンパク質のごとき解糖系酵素をコードするオペロン由来で あってもよい。異種の構造配列は、翻訳開始および終結配列、好ましくは翻訳さ れたタンパク質のペリプラズム空間または細胞外培地への分泌指示することがで きるリーダー配列と共に適当な段階で組み立てられる。所望により、異種配列は 、所望の性質、例えば発現された組換え産物の安定化または簡便化された精製を 付加するN-末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードできる。 細菌で使用するための有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする 構造DNA配列を、機能的プロモーターでの実施可能な読みとり段階における適当 な翻訳開始および終結シグナルと一緒に挿入することによって構築される。ベク ターは、１種類以上の表現型選択マーカーおよびベクターの維持を確実にし、所 望であれば、宿主内での増幅を提供できる複製起点を含むだろう。形質転換に適 当な原核生物宿主は、他のものもまた選択して用いることができるが、イー・コ リ(E.coli）、バチラス．スブチリス(Bacillus subtilis)、サルモネラ・チフィ ムリウム(Salmonella typhimurium)、シュードモナス属、ストレプトミセス属お よびブドウ球菌属内の種々の種を含む。 代表的ではあるがそれに限定されない例として、細菌で用いるための有用な発 現ベクターは、よく知られているクローニングベクターpBR322(ATCC37017)の遺 伝子エレメントを含む商業的に入手できるプラスミド由来の選択マーカーおよび 細菌の複製起点を含み得る。かかる商業的ベクターは、例えば、pKK223-3（スウ ェーデン、ウプサラのファルマシア・ファイン・ケミカルズ(Pharmacia Fine Ch emicals))、およびGEM1（米国、ウィスコンシン州、マジソンのプロメガ・バイ オテック(PromegaBiotec)）を含む。これらpBR322の「骨格」部分は、適当なプ ロモーターおよび発現されるべき構造配列とが組み合わされる。 適当な宿主株の形質転換および適当な細胞密度までの宿主株の増殖に続き、選 択されたプロモーターは適当な手段（例えば温度シフトまたは化学的誘導）によ り誘導され、細胞をさらに一定時間培養する。 細胞は、典型的には、遠心分離により収穫し、物理的または化学的方法により 破壊し、得られた粗抽出物をさらなる精製用に保持する。 タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結-解凍サイクル、音 波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含むいずれの慣用的方法によっ ても破壊でき、かかる方法は当業者によく知られている。 また、種々の哺乳動物細胞培養系を用いて組換えタンパク質を発現させること もできる。哺乳動物発現系の例は、Gluzman,Cell,23:175(1981)記載のサル腎繊 維芽細胞のCOS-7系、および適合ベクター、例えばC127，3T3，CHO、HeLaおよびB HK細胞系を発現することができる他の細胞系を含む。哺乳動物発現ベクターは、 複製起点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、ならびにいずれの必要なリ ボゾーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与および受容部位、翻訳 終結配列、および5'フランキング非転写配列を含むだろう。SV40スプライス由来 のDNA配列およびポリアデニル化部位を用いて必要とされる非転写遺伝子エレメ ントを提供することができる。 該ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオ ンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィ ー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、 ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを 含む方法によって組換え細胞培養液から回収および精製できる。必要な場合は、 成熟タンパク質の立体配置を完成させるのにタンパク質再折り畳み工程を用いる ことができる。最終的には、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を最終精製段 階で用いることができる。 本発明のポリペプチドは、自然に精製される産物であっても、あるいは化学合 成方法の産物であってもよく、あるいは原核生物または真核生物宿主から組換え 技術により（例えば、培養中の細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞 により）生産される。組換え生産方法において用いられる宿主に応じて、本発明 のポリペプチドはグリコシル化されていてもグリコシル化されていなくてもよい 。また、本発明のポリペプチドは開始メチオニンアミノ酸残基も含ませることが できる。 また、本発明のポリペプチドは同様の生物学的活性を有し得る他の分子を同定 することにも有用である。本発明の遺伝子の配列と相補的な配列を有する標識化 オリゴヌクレオチドを用いて、ヒトcDNA、ゲノムDNAまたはmRNAのライブラリー をスクリーニングし、いずれのライブラリーのメンバーにプローブがハイブリダ イズするかを決定する。 また、該ポリペプチドは、本発明に従って、しばしば「遺伝子治療」といわれ る、かかるポリペプチドのインビボ(in vivo)での発現によっても用いられる。 従って、例えば、エキソビボ(ex vivo)でポリペプチドをコードするポリヌク レオチド（DNAまたはRNA）で患者由来の細胞を処理し、次いで処理された細胞を 該ポリペプチドによって治療されるべき患者に供することができる。かかる方法 は当該分野ではよく知られている。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコ ードするRNAを含むレトロウィルス粒子の使用による当該分野で知られた方法に よって処理することができる。 同様に、細胞は、例えば当該分野で知られた方法によってインビボ(in vivo) でのポリペプチドの発現用にインビボ(in vivo)で処理することができる。当該 分野において知られているごとく、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含 むレトロウィルス粒子を産生する産生細胞を、インビボ(in vivo)で細胞を作成 するためにおよびインビボ(in vivo)でポリペプチドを発現させるために患者に 投与することができる。本発明のポリペプチドをかかる方法により投与するこれ らのおよび他の方法は、本発明の教示から当業者に明白である。例えば、細胞を 処理するための発現ビヒクルは、レトロウィルス以外のもの、例えば、適当なデ リバリビヒクルと組み合わせた後にインビボ(in vivo)で細胞を処理するのに用 いることができるアデノウィルスであってもよい。 本発明により、P2xレセプター活性を変調する必要のある患者の治療方法が提 供され、該方法は、例えば、本発明のポリペプチドをコードするDNAを患者 に供することによって治療上有効量の該ポリペプチドを投与し、次いで該ポリペ プチドをインビボで発現させることを含む。 また、本発明の配列は、染色体同定にも有用である。該配列は特異的に標的と なり、個々のヒト染色体上の特定位置とハイブリダイズできる。さらに、現在、 染色体上の特定部位を同定する必要がある。現実の配列データ（繰り返し多形） に基づく2-3の染色体マーキング剤は、現在、染色体位置のマーキング用に入手 できる。本発明により染色体にDNAをマッピングすることは、それらの配列を疾 患に関連した遺伝子と関係付けるにおいて重要な第一段階である。 略言すると、配列は、cDNAからPCRプライマー（好ましくは15-25bp）を調製す ることにより染色体にマッピングできる。cDNAのコンピューター解析を用いて、 ゲノムDNA中の１を超えるエキソンにまたがらず、従って、増幅過程を複雑化す るプライマーが迅速に選択される。次いで、これらのプライマーは個々のヒト染 色体を含む体細胞ハイブリッドをスクリーニングするPCRに用いられる。プライ マーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅された断片を生成する であろう。 体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定の染色体に特定のDNAを割り当て る迅速な方法である。同一オリゴヌクレオチドプライマーにて本発明を用い、同 様の方法で、特異的染色体由来の断片のパネル、または大きなゲノムクローンの プールにて補充的位置決めを達成することができる。その染色体にマッピングす るのに同様に用いることができる他のマッピング方法は、インサイチュ(in situ )ハイブリダイゼーション、標識化したフロー-ソート処理染色体による予備スク リーニングおよび染色体特異的-cDNAライブラリー構築体へのハイブリダイゼー ションによる予備選択を含む。 分裂中期染色体スプレッドへのcDNAクローンの蛍光インサイチュ(in situ)ハ イブリダイゼーション(FISH)を用いて、一工程にて、正確な染色体位置を提供す ることができる。この技術は500または600塩基と短いcDNAに用いることができる ；しかしながら、2,000bpよりも大きなクローンは、単純な検出には十分なシグ ナル強度を伴って特有の染色体位置に結合する高い可能性を有する。 FISHにはESTがそこから由来するクローンの使用が必要であり、長ければ長い程 良い。例えば、2,000bpは良好であり、4,000はより良好であり、4,000を超える ものはおそらく良好な結果、時間の妥当なパーセンテージを得るには必要ない。 この技術の総説として、Vermaら.,Human Chromosomes:a Manual of Basic Techn iques,Pergamon Press,New Yorl(1988)を参照されたい。 ひとたび、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、配列の染色体上で の物理的位置を遺伝子地図データに関連付けることができる。かかるデータは、 例えば、V.McKusick，Mendehan Inheritance in Man（ジョンズホプキンス大学 ウェルチ医学図書館(Johns Hopkins University Welch Medical Library)を介し てオンラインで入手できる）に見出される。次いで、同一の染色体領域にマッピ ングされた遺伝子および疾患の関係は連鎖分析を介して同定される(物理的に隣 り合った遺伝子の共遺伝)。 次に、罹患したまたは罹患していない個体間でcDNAまたはゲノム配列の違いを 決定することが必要である。罹患した個体のいくつかまたは全てに変異が認めら れるが、いずれの正常な個体にも認められない場合は、突然変異が疾患の原因で ある可能性がある。 物理的マッピングおよび遺伝子マッピング技術の現在の分解能では、疾患に関 連した染色体領域に正確に位置付けられたcDNAは、可能性のある原因遺伝子50な いし500間の１つであるだろう（このことから１メガ塩基マッピング分解能およ び20kbあたり１遺伝子と考えられる。） 一般に、罹患したおよび罹患していない個体の比較には、cDNA配列に基づくPC Rを用いて染色体スプレッドから可視のまたは検出可能な欠失または転座のごと き染色体における構造的改変を探すことが含まれる。結局、いくつかの個体由来 の遺伝子の完全な配列決定が、突然変異の存在を確認し、突然変異を多形から区 別するために必要である。 ポリペプチド、その断片または他の誘導体、またはそのアナログ、またはそれ らを発現する細胞はそれに対する抗体を産生する免疫原として使用できる。これ らの抗体は、例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってよい。ま た、本発明は、キメラ、単一鎖であってヒト化した抗体ならびにFab断片、また はFab発現ライブラリー産物も含む。当該分野において知られている種々の方法 をかかる抗体および断片の生産で用いることができる。 本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生じた抗体は、ポリペプチドを 好ましくはヒトではない動物へ直接注射することによって、あるいは動物にポリ ペプチドを投与することにより得られる。ゆえに、かくして得られた抗体は該ポ リペプチド自体と結合するだろう。このようにして、該ポリペプチドの断片のみ をコードする配列さえも、本来のポリプチド全体と結合する抗体を生じさせるた めに用いることができる。次いで、かかる抗体を、該ポリペプチドを発現する組 織由来のポリペプチドを単離するのに用いることができる。 モノクローナル抗体の調製には、連続細胞系培養により産生された抗体を提供 するいずれの技術も用いることができる。例は、ハイブリドーマ技術(Kohlerお よびMilstein.,1975,Nature,256:495-497)、トリオーマ技術、ヒトB-細胞ハイブ リドーマ技術(Kozborら.,1983,Immunology Today 4:72)およびヒトモノクローナ ル個体を生産するEBV-ハイブリドーマ技術(Cole，ら.，1985,Monoclinal Antibo dies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)を含む。 単鎖抗体の生産に記載された技術（米国特許第4,946,778号）は、本発明の免 疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生産するために採用できる。 本発明は、本発明のヒト脳P2xレセプターとリガンドとの機能的相互作用を阻 害する（アンタゴニスト）ものを同定するための薬物をスクリーニングする方法 を提供し、該方法は、レセプターとリガンド（通常ATPまたは安定なそのアナロ グ）との相互作用を阻害する供試化合物の能力を測定することを含む。例として 、P2xレセプターを発現する哺乳動物細胞または膜調製物を、薬物の存在下、標 識化リガンドとインキュベートする。次いで、この相互作用を阻害する薬物の能 力が測定できるだろう。かかるアッセイの例は、レセプターと結合した放射標識 化分子の数が、可能性のあるアンタゴニスト/インヒビターの有効性を測定でき るように競合阻害アッセイに適当な条件下、適当な放射標識化されたリガ ンド、例えば、[35S]-dATPαSおよび可能性のあるアンタゴニスト/インヒビター を、膜-結合したP2xレセプターまたはP2xの組換え形態と組み合わせる。別法と して、リガンドおよびレセプターの相互作用に続く公知のセカンド（またはサー ド）メッセンジャー系の反応を、薬物の存在または不存在下で比較し測定する。 かかるメッセンジャー系はcAMPグアニル酸シクラーゼ、イオンチャンネル、また はホスホイノシチド加水分解を含むがそれに限定されない。また、それらは総じ ての細胞機能の指標として細胞外pHの測定も含む。 また、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む トランスジェニック非ヒト動物も提供する。また、突然変異およびSAR（構造/活 性の相関）評価のためのならびに薬物スクリーニングにおけるモデルとして、該 トランスジェニック動物を使用する方法も提供する。 また、本発明は、本発明のポリペプチドのアンタゴニスト/インヒビター分子 、およびポリペプチドの機能の低下または排除におけるその使用に指向される。 さらに本発明は、治療上有効量の本発明のアンタゴニスト/インヒビターを患 者に投与することを含む、該ポリペプチドの機能を低下させまたは排除する必要 のある患者の治療方法を提供する。 アンタゴニストの例は抗体であるか、あるいはいくつかの場合にはポリペプチ ドと結合するオリゴヌクレオチドである。アンタゴニストは、天然のタンパク質 のレセプター部位を認識しそれと結合するごとき密接に関連したタンパク質であ ってもよいが、それらは、ポリペプチドの不活性形態であり、それによって、レ セプター部位が占有されるためATPの作用を阻害する。 インヒビターの例は、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンス構築 体である。アンチセンス技術を用いて三重らせん形成またはアンチセンスDNAも しくはRNAを介して遺伝子発現を制御することができ、その方法は共にポリヌク レオチドのDNAまたはRNAとの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチド をコードするポリヌクレオチド配列の5'-暗号部分を用いて、長さ約10ないし40 塩基対のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計する。DNAオリゴヌクレオチ ドは転写に関わる遺伝子の領域と相補的に設計され（三 重らせん−Leeら.,Nucl.Acids Res.,6:3073(1979);Cooneyら，Science,241:456( 1988);およびDervanら.,Science,251:1360(1991)を参照されたい。)、それによ って成熟ポリペプチドの転写および産生を妨げる。アンチセンスRNAオリゴヌク レオチドはインビボ(in vivo)でmRNAとハイブリダイズし、mRNA分子のP2xレセプ ターへの翻訳を阻害する（アンチセンス−Okano,J.Neurochem.,56:560(1991);Ol igodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression CRC Press ,Boca Raation,FL(1988))。また、前記のオリゴヌクレオチドは、アンチセンスR NAまたはDNAがインビボ(in vivo)で発現されてP2xレセプターの産生を阻害でき るように細胞へ送達することができる。 アンタゴニスト/インヒビターのもう一つの例は、レセプター結合部位に結合 し、それを占有し、そのことによって該部位をその天然リガンドに到達しがたく するか、あるいは、正常な生物学的活性が妨害されるようにアロステリック様式 でATPの機能に影響する関連部位に結合する小さな分子である。小さな分子の例 は小さなペプチドまたはペプチド-様分子を含むがそれに限定されない。 アンタゴニスト/インヒビターは、不適当に多量なATPの存在に関連した疾患を 治療できる。これらは、神経伝達物質として通常ATPを含む機能亢進したニュー ロンからATPが過剰放出される疾患を含む。また、それらは、損傷された細胞か らATPが放出されて、周囲のニューロンへ影響する。これらの作用は、素早いシ ナプスの事象の擬似物ならびに、アポトーシスおよび細胞死を誘導するATPの既 知の能力(Zhengら，1991,J Cell Biol.,112,279-288)に基づくおよび少なくとも １つの型のラットP2xレセプター(Valeraら.,1994上記)およびラット胸腺細胞に よりアポトーシスの間発現されるアポトーシス遺伝子産物RP-2(Owensら.,1991,M ol Cell Biol.,11,4177-4188)間の高配列相同性に基づくアポトーシスまたは細 胞死滅の誘導を含む。 前頭皮質、扁桃、尾状核、小脳、海馬、黒質、視床および脊髄を含む脳の種々 の領域内におけるP2x-1レセプターおよび/またはP2x-2レセプターの局在は、こ れらのレセプターを変調する治療剤が、脳卒中、脳または脊髄外傷、感染および 炎症、認識障害、癲癇、鬱病を含む一般に情動および気分障害、パーキンソン病 、 ハンチントン舞踏病を含む運動障害および精神分裂病ならびに慢性または急性形 態の痛みの発生に関連するこれらの疾患を含む多数の重要な臨床的疾患用に示さ れるだろうということを意味する。 本発明のP2xレセプターの可変的分布は、P2xレセプターの特定のスプライス変 異体に影響する薬物の臨床的な徴候が脳内のその正確な位置に依存するであろう ということを示唆する。 また、本発明のP2xレセプターは、そこで組織損傷例えば、心無酸素症に関連 した種々の疾患において役割を担うであろう、心臓および肝臓のごとき脳外のあ る組織にも存在する。 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびアンタゴニスト/インヒビタ ーは適当な医薬担体と組み合わせて用いることができる。本発明の一部を形成す るかかる組成物は、治療的または予防的に有効な量の活性物質および医薬上許容 できる担体または賦形剤を含む。かかる担体はセーライン、緩衝化セーライン、 デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびその組み合わせを含むが 、それに限定されない。処方は投与法に適合すべきである。 また、本発明は、本発明の医薬組成物の１種類以上の成分を充填した１つ以上 の容器を含む医薬パックまたはキットも提供する。医薬品または生物学的製品の 製造、使用または販売を規制する政府機関により規定された形式の注意書をかか る容器と組み合わせることができ、その注意書は、ヒトへの投与用の製造、使用 または販売の当局による承認に影響する。さらに、本発明の活性物質は他の治療 化合物と組み合わせて用いることができる。 医薬組成物は、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮 内経路のごとき慣用的方法によって投与することができる。特定の徴候の治療お よび/または予防に有効な量で活性物質を投与する。患者に投与される活性物質 の量および用法は、投与様式、治療されるべき患者の疾患の性質および処方する 医師の判断のごとき多数の因子に依存する。一般に、活性物質は少なくとも約ｘ mg/kg体重で投与され、ほとんどの場合において、投与経路、症状などを考慮に 入れて、１日あたり約ｙmg/kg体重の過剰ではない量にて投与されるであろう。 さらに、下記の実施例を参照して本発明を記載する：しかしながら、本発明は かかる実施例に限定されないと理解されるべきである。特記しなければ、全ての 部または量は重量による。 以下の実施例の理解を容易にするために、ある頻繁にでてくる方法および/ま たは用語を記載する。 「プラスミド」は小文字ｐが先行し、および/あるいは大文字および/または数 字が続くという具合に示される。本明細書中の出発プラスミドは、商業的に入手 できるか、非制限の下に公に入手できるかのどちらかであり、あるいは開示され る方法に従って入手できるプラスミドから構築できる。さらに、記載されたもの と同等のプラスミドは当該分野において知られており、当業者には明白であろう 。 DNAの「消化」は、DNAを該DNA中のある配列においてのみ作用する制限酵素で 触媒的に分解することをいう。本明細書で用いられる種々の制限酵素は商業的に 入手でき、その反応条件、補助因子および他の要件は当業者に知られているであ ろうごとく用いた。分析目的では、典型的には、１μgのプラスミドまたはDNA断 片を約20μlの緩衝液中の約２単位の酵素と共に用いる。プラスミド構築体のた めにDNA断片を単離する目的では、典型的には、５ないし50μgのDNAをより大き い体積中にて20ないし250単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に適当な緩衝 液または基質量は製造業者により明示される。37℃における約１時間のインキュ ベート時間が通常用いられるが、供給会社の指示に従い、変えることもできる。 消化後、反応物は所望の断片を単離するためにポリアクリルアミドゲル上にて直 接電気泳動に付される。 切断された断片のサイズ分離は、Goeddel，D.ら，Nudeic Acids Res.,8:4057( 1980)に記載された８パーセントのポリアクリルアミドゲルを用いて行う。 「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成できる一本鎖ポリデオキシヌクレオ チドまたは二本の相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖のどちらかをいう。かかる 合成オリゴヌクレオチドは5'リン酸を有しないため、キナーゼ存在下、ATPでリ ン酸基を付加しなければ別のオリゴヌクレオチドと連結しないであろう。合成オ リゴヌクレオチドは脱リン酸化されていない断片に連結されるであろう。 「連結」は、２つの二本鎖核酸断片間にホスホジエステル結合を形成する過程 をいう(Maniatis,T.,ら,Id.,p.146)。特記しなければ、連結は、適当な等モル量 の連結すべきDNA断片0.5μgあたり10単位のT4DNAリガーゼ(「リガーゼ」)にて公知 の緩衝液および条件を用いて行う。 特記しなければ、形質転換はGraham,F．およびVan der Eb,A.,Vlrlogy,52:456 -457(1973)の方法に記載されたごとく行った。 実施例１ P2xcDNAクローンの単離およびDNA配列決定 部分的cDNAをヒト脳前頭皮質（精神分裂病患者から採取）cDNAライブラリーか ら得た。公表されたラットP2xレセプターとの配列比較は、前記にて述べたが、 このEST配列が全長cDNA配列の約300bp短いことを示唆した。残りの5'暗号配列を 得るために、成人ヒト前頭皮質RNAから合成されたマラソン-レディー(Marathon- Ready)cDNA(クローンテック・ラボラトリーズ・インク(Clonethch Laboratories ,Inc)、4030 Fabian way,Palo Alto，CA 94303-40607USA))を得、標準的RACE技 術を、マラソンルディーcDNAキット（カタログ番号PT1156-1）に概説される方法 に記載されたごとく用いた。マラソン-レディーキットに供給される5'オリゴヌ クレオチド(AP1 5'-CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC-3')および部分的cDN A配列の5'末端に相補的な3'オリゴヌクレオチド(番号1，5'-ACA CAC AGT GGT CG C ATC TGG AAT C-3')を用いて、RACEを行った。 マラソン-レディーcDNA（20ng）は、下記の標準的PCRプロトコルに従い、Don ら1991(Nudeic Asid Research Vol 19，4008)に記載のタッチダウン(touch down )PCRにおけるTaqDNAポリメラーゼ（アプライド・バイオシステムズ(Applied Bio systems)、Warrington UK)を用いて増幅した。タッチダウンPCRの初期アニーリ ング温度は60℃で開始し、10サイクルの間、１サイクル毎に1℃ずつ下げ(最終ア ニーリング温度は50℃)、次いでさらに20サイクル行った。また、各サイクルは 重合(72℃、１分)および変性（94℃、１分）工程を含 み、PCRは最終10分72℃の仕上げ工程で終了した。次いで、増幅産物をpGEMTベク ター（プロメガ・コープ(Promega Corp.))にサブクローニングし、標準的製造会 社のプロトコルを用い、標準的な青/白選択のために、DH5アルファー細胞（ベテ ズダ・リサーチ・ラボラトリーズ(Bethesda Research Laboratories);BRL)に形 質転換した。白色コロニーを（XgalおよびIPTGを含む）LBampプレートから選択 し、標準的ミニプレップアルカリ性溶解(Molecular cloning,A laboratory manu al,Maniatisら1982 Cold Spring Harbor Laboratory,NY)を用いるプラスミドDNA の抽出のために一晩増殖させた。DNA配列決定には、Snutchら1991(Neuron,Vol 7 ，45-57)に記載の修飾ジデオキシヌクレオチドプロトコルを利用した。 最初の鎖の配列は、AP2(5-ACT CAC TAT AGG GCT CGA GCG GC-3';クロンテック (Clontech))およびBRLより購入のSP6プライマーを用いて得られた。最初の鎖の 配列の決定後、オリゴヌクレオチドプライマー番号8(5'-CCT TCC TGT TCG AGT A CG AC-3')および番号9((5-TCC CAG ATC CGG AAT CCA AG-3')のセットを合成し、 これを用いてP2x-1（配列番号１）P2x-2（配列番号２）の配列の残りを得た。 実施例２ PCR位置決定 ポリA+mRNAはクローンテック(Clonetedl)より購入するか、あるいはトリゾー ル(Trizol)(BRLより供給される方法)を用いて正常なヒト脳組織から単離した。 ヒトゲノムDNAはプロメガ(Promega)より購入した。 ヒト脳組織、心臓および肝臓中におけるP2x-1およびP2x-2の発現パターンを決 定するため、25ngの各ヒト組織由来のポリA+mRNAをポリdTオリゴヌクレオチドプ ライマーと混合し、BRLによって供給されたプロトコルに従い、スーパースクリ プトII(Superscript II)を用いて逆転写した。次いで、前記に概説したPCRプロ トコルに従い、0.2μＭの上流プライマー番号8(5-CCT TCC TGT TCG AGT ACG AC-3')および下流プライマー番号9(5−TCC CAG ATC CGG AAT CCA A G-3')を含む50μlの反応混合物中にて混合物全体を増幅した。産物の予想サイズ は、P2x-1およびP2x-2にそれぞれ対応する226bpおよび274bpであった。ゲノムコ ンタミネーションの対照として、逆転写酵素または100ngのゲノムDNAを含まない RNAサンプルを用いて同一の反応を行った。反応産物は、臭化エチジウムを含む1 .2％アガロースゲル上で分離し、視覚化した。次いで、Snutchら1991（Neuron， Vol 7，45-57）におけるごとくDNAをナイロン膜に移し、P2x-1およびP2x-2イン サート特異的32P標識化オリゴヌクレオチドプローブ番号7(5-CCC ACA CAA ACA C CC ACC CGA TGA CGT AGG CCA GGA TGA-3')および番号6(5'-GAC TCC ATT TCC ACT TCT GCC AAA TGG AGA TGG TAG CAC-3')で、各々、ブローブした(図６および7) 。ハイブリダイゼーションは、Snutchら1991(Neuron，Vol 7，45-57)におけるご とき、標準的なプロトコルで、0.5xSSC中、最終洗浄温度60℃にて行った。次い で、サザンブロットを直接的に、X-Omat Ｒフィルムに72時間曝露した。フィル ムを現像し、像をオプティマス・イメージング・システム(optimus imaging sys tem)で調べた。 結果:PCR反応に用いたプライマー--オリゴ８およびオリゴ9--はP2x-1およびP2 x -2のスプライス部位にかけて増幅するように設計された。ヒト脳領域からのポ リA+RNAに対するこれらのプライマーを用いてのRT-PCRから、それぞれP2xイソ形 態を表す226bpおよび274bpの２つの産物が得られた。226bp（図６）産物はP2x-1 を表し、全脳、扁桃、尾状核、小脳、海馬、黒質、視床、脊髄および心臓mRNAか ら増幅された。 （図７）に示した結果により、P2x-2を表す274bpの増幅産物は、試験した全領 域；全脳、扁桃、尾状核、小脳、海馬、黒質、視床、視床下部、前頭皮質、脊髄 、心臓および肝臓で産生された。 予想サイズの産物に加えて、種々の長さの産物が、異なった脳の領域全体で別 様に発現された。余分の産物は、長さ〜150bp、〜340bp、〜825bpおよび〜996bp である。PCR反応において用いたプライマーセット--オリゴ８およびオリゴ９-- はP2x遺伝子の公知のスプライス連結部の逆側にあるため、これら他の産物はさ らに、ヒト脳P2x-2レセプターの可能性のある別のスプライス変異体を表す。 実施例３ インサイチュ(in situ)位置決定 ラット脳におけるP2x-1およびP2x-2の領域的発現パターンを測定するために、35 Ｓ標識化インサート特異的オリゴヌクレオチド（番号７および番号６）を、10 μＭ PFA固定ラット脳組織切片上でのインサイチュ(in situ)ハイブリダイゼー ションに用いた。インサイチュ(in situ)ハイブリダイゼーションは、Steaら199 4(PNAS Vol．91，10576-10580)のごとき標準的なプロトコルを用い、ハイブリダ イゼーションおよび0.5xSSC中最終洗浄温度42℃にて行った。 組織切片を直接X-OmatＲフィルムに10日間曝露した。フィルムを現像し、像を オプティマス・イメージング・システム(optimus imaging system)で調べた。ス ライドを写真感光乳剤（コダック(Kodak)）に浸し、さらに６週間曝露した。 結果：P2x-1およびP2x-2双方に共通のプローブを用いることにより、cDNAは、 これらのレセプターが、小脳に関してはより強いシグナルで、ラット脳のほとん どの領域で弱く検出されることが示された。しかしながら、P2x-2に特異的なオ リゴヌクレオチドプローブを用ると、強い標識化は、海馬の線条体、前頭皮質お よび歯状回に対応する特異的ラット脳領域にのみ検出された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｐ 25/14 25/08 25/16 25/14 25/24 25/16 25/28 25/24 Ｃ０７Ｋ 14/705 25/28 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 14/705 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/10 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 5/00 Ａ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 マクヘイル，マーク・トーマス イギリス、シーエム19・５エイダブリュ ー、エセックス、ハーロウ、サード・アベ ニュー、ニュー・フロンティアーズ・サイ エンス・パーク・サウス、スミスクライ ン・ビーチャム・ファーマシューティカル ズ (72)発明者 トムリンソン，ウィリアム・ジェフリー イギリス、シーエム19・５エイダブリュ ー、エセックス、ハーロウ、サード・アベ ニュー、ニュー・フロンティアーズ・サイ エンス・パーク・サウス、スミスクライ ン・ビーチャム・ファーマシューティカル ズ (72)発明者 リビングストーン，クレイグ・デイビッド イギリス、シーエム19・５エイダブリュ ー、エセックス、ハーロウ、サード・アベ ニュー、ニュー・フロンティアーズ・サイ エンス・パーク・サウス、スミスクライ ン・ビーチャム・ファーマシューティカル ズ (72)発明者 カーペンター，デイビッド・ジェイムズ イギリス、シーエム19・５エイダブリュ ー、エセックス、ハーロウ、サード・アベ ニュー、ニュー・フロンティアーズ・サイ エンス・パーク・サウス、スミスクライ ン・ビーチャム・ファーマシューティカル ズ (72)発明者 イ，リ アメリカ合衆国20878メリーランド州 ゲ イザーズバーグ、ハワード・ランディン グ・ドライブ16125番

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １． （a）配列番号３または４に示される推定アミノ酸を有するか； （b）配列番号５に示される椎定アミノ酸配列により特徴付けられるか； （c）配列番号３の残基１ないし45を含むアミノ酸配列により特徴付けられる か；あるいは （d）配列番号３の残基240-388を含むアミノ酸配列により特徴付けられる； ヒト脳P2xレセプターポリペプチドであるポリペプチドまたはその断片、アナロ グまたは誘導体をコードするポリヌクレオチド。 ２． ポリヌクレオチドがDNAである請求項１記載のポリヌクレオチド。 ３． ポリヌクレオチドがRNAである請求項１記載のポリヌクレオチド。 ４． ポリヌクレオチドがゲノムDNAである請求項２記載のポリヌクレオチド。 ５． 該ポリヌクレオチドが配列番号３または４に示されるポリペプチドをコー ドするか、あるいは配列番号５に示される推定アミノ酸配列により特徴付けられ る前記請求項いずれか１項記載のポリヌクレオチド。 ６． 配列番号１または２に示されるDNA配列を有する請求項２記載のポリヌク レオチド。 ７． 単離された形態の前記請求項いずれか１項記載のポリヌクレオチド。 ８． 請求項2、4、5、6または7いずれか１項記載のDNAを含むベクター。 ９． 請求項８記載のベクターにて遺伝子工学的に作成された宿主細胞。 １０． 該DNAによりコードされるポリペプチドを請求項９記載の宿主細胞から 発現させることを特徴とするポリペプチドの生産方法。 １１． 請求項８記載のベクターにて細胞を遺伝子工学的に作成することを特徴 とするポリペプチドを発現できる細胞の生産方法。 １２． 配列番号３または４に示されるポリペプチドと実質的に同一の生物学的 機能または活性を有するか、あるいは配列番号５に示される推定アミノ酸配列に より特徴付けられるポリペプチドをコードする、請求項１ないし７いずれか１項 記載のポリヌクレオチドにハイブリダイズできるポリヌクレオチド。 １３． （a）配列番号３または４に示される推定アミノ酸を有するか； （b）配列番号５に示される推定アミノ酸配列により特徴付けられるか； （c）配列番号３の残基１ないし45を含むアミノ酸配列により特徴付けられる か；あるいは （d）配列番号３の残基240-388を含むアミノ酸配列により特徴付けられる； ヒト脳Ｐ2xレセプターポリペプチドまたはその断片、アナログまたは誘導体。 １４． ポリペプチドが配列番号３または４に示されるか、あるいは配列番号５ に示される推定アミノ酸配列により特徴付けられるアミノ酸配列を有する請求項 13記載のポリペプチド。 １５． 単離された形態の請求項13または14記載のポリペプチド。 １６． レセプターとリガンドとの相互作用を阻害する供試化合物の能力を測定 することを特徴とする、請求項13または14記載のヒト脳Ｐ2xレセプターとリガン ドの機能的相互作用を阻害する薬物を同定する薬物のスクリーニング方法。 １７． 請求項16記載の方法により同定される化合物。 １８． 請求項13または14記載のポリペプチドのアンタゴニスト/インヒビター 。 １９． 請求項１または12に記載のポリヌクレオチド、請求項13記載のポリペプ チド、請求項17記載の化合物または請求項18記載のアンタゴニストおよび医薬上 許容される担体を含む医薬組成物。 ２０． 治療的有効量の請求項17記載の化合物または請求項17記載のアンタゴニ スト/インヒビターを患者に投与することを特徴とする、請求項13または14記載 のポリペプチドの機能を低下させるかあるいは排除する必要を有する患者の治療 方法。 ２１． 治療で使用する医薬品の製造のための、請求項16記載の化合物または請 求項17記載のアンタゴニスト/インヒビターの使用。
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