JP2010538651A - 均質な抗体集団 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2007年9月14日に出願された米国仮特許出願第60/972,688号(この内容は、その全体において参考として本明細書に援用される)への優先権を主張する。
本発明は概して、好ましい形態のモノクローナル抗体の富化および/または回収における向上を生じる方法に関する。さらに詳細には、本発明は組み換えIgG2抗体タンパク質ヒンジの領域におけるジスルフィド異質性を排除するための方法に関する。
図1に示されるとおり、IgGサブタイプは特に、その重鎖結合間および重鎖/軽鎖結合において、予測されるジスルフィド結合構造を有する(Frangione,B.ら(1969)Nature 221,145〜148)。ヒンジ領域において、いくつかの例示されるIgGアイソタイプの間に多くの相違が見出され得る。表1は、コア・ヒンジ領域と名付けられたヒンジ領域のサブセット内のIgGアイソタイプの中の相違を例示する。表1に示されるとおり、IgG2コア・ヒンジは、IgG1のコア・ヒンジよりも3アミノ酸短い(Dangl,J.L.ら(1988)EMBO J.7,1989〜1994)。さらにIgG2コア・ヒンジはIgG1よりも多くのシステインを有する。
本発明の一実施形態は、構造的およびジスルフィド異質性を減少するように修飾されているIgG2抗体を含む。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするポリヌクレオチドへ適切なヌクレオチド変化を導入することによって調製される。あるいは、このアミノ酸変化は、抗体のペプチド合成の間になされてもよい。このような修飾としては例えば、抗体のポリペプチド配列からの欠失、および/またはその配列への挿入、および/またはその配列内の置換が挙げられる。欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせは、最終構築物で到達するように行われるが、ただしこの最終構築物は所望の同質性の特徴を保有する。このアミノ酸変更は、配列が作製される時点で本発明の抗体のアミノ酸配列に導入され得る。
(1)疎水性:met、ala、val、leu、ile;
(2)中性の親水性:cys、ser、thr;
(3)酸性:asp、glu;
(4)塩基性:asn、gln、his、lys、arg;
(5)鎖の方向に影響する残基:gly、pro;および
(6)芳香族:trp、tyr、phe。
当該分野で公知の任意の種々の配列決定反応を用いてアミノ酸修飾を有する抗体または抗体フラグメントをコードするヌクレオチド配列を直接配列決定してもよい。配列決定反応の例としては、Maxim and Gilbert(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:560,1977)またはSanger(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:5463,1977)によって開発された技術に基づく反応が挙げられる。任意の種々の自動化配列決定手順を利用することが可能であるということも考えられ(Bio/Techniques,19:448,1995)、これには、質量分析による配列決定が挙げられる(例えば、国際公開第94/16101号,Cohenら、Adv.Chromatogr.,36:127〜162,1996、およびGriffinら、Appl.Biochem.Biotechnol.,38:147〜159,1993を参照のこと)。
本発明の実施形態は、任意の適切な抗原結合特異性の抗体に適用可能である。好ましくは、本発明の抗体は、生物学的に関連のあるポリペプチドである抗原に特異的である。さらに好ましくは、本発明の抗体は、ヒトなどの哺乳動物における疾患または障害の治療または診断のために有用である。
上記抗原がポリペプチドである場合、それは、膜貫通分子(例えば、受容体)または成長因子などのリガンドであってもよい。例示的な抗原としては、分子、例えば、レニン;成長ホルモン、例としては、ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモン;成長ホルモン放出因子;副甲状腺ホルモン;甲状腺刺激ホルモン;リポタンパク質;α−1−アンチトリプシン;インスリンA鎖;インスリンB鎖;プロインスリン;卵胞刺激ホルモン;カルシトニン;黄体形成ホルモン;グルカゴン;アンジオポイエチン−1(Ang−1)、アンジオポイエチン−2(Ang−2)、アンジオポイエチン−4(Ang−4)、OX−40、GM−CSF、NGF、グルカゴン受容体、スクレロスチン、IL−17R、CD30、IL18、アクチビン、VEGF、IgE、CD11、CD18、CD40、組織因子(TF)、HER2、TrkC凝固因子、例えば、第VIIIC因子、第IX因子、組織因子(TF)、およびフォン・ヴィレブランド因子;凝固因子、例えば、プロテインC;心房性ナトリウム利尿因子;肺サーファクタント;プラスミノーゲンアクチベーター、例えばウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲンアクチベーター(t−PA);ボンベシン;トロンビン;造血成長因子;腫瘍壊死因子−αおよび−β;エンケファリナーゼ;RANTES(正常T細胞発現および分泌活性(regulated on activation normally T−cell expressed and secreted));ヒトマクロファージ炎症性タンパク質(MIP−1−α);血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン;ミュラー阻害物質;レラキシンA鎖;レラキシンB鎖;プロレラキシン;マウスゴナドトロピン関連ペプチド;微生物タンパク質、例えば、βラクタマーゼ;DNase;IgE;細胞傷害性Tリンパ球関連抗原(CTLA)、例えばCTLA−4;インヒビン;アクチビン;血管内皮成長因子(VEGF);ホルモンまたは成長因子の受容体、例えば、上皮成長因子受容体(EGFr);インターロイキン受容体、例えば、IL−1RおよびIL−4R;プロテインAまたはD;リウマチ因子;神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン−3、−4、−5、または−6(NT−3、NT−4、NT−5、またはNT−6)、または神経成長因子、例えば、NGF−β;血小板由来成長因子(PDGF);線維芽細胞成長因子、例えば、aFGFおよびbFGF;上皮成長因子(EGF);トランスフォーミング成長因子(TGF)例えばTGF−αおよびTGF−β、例としては、TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、TGF−β4、またはTGF−β5;インスリン様成長因子−Iおよび−II(IGF−IおよびIGF−II);des(1−3)−IGF−I(脳IGF−I)、インスリン様成長因子結合タンパク質;CDタンパク質、例えば、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20およびCD40;エリスロポイエチン;骨誘導因子;免疫毒素;骨形態形成タンパク質(BMP);核因子κBリガンド受容体活性化因子(Receptor Activator of Nuclear Factor Kappa B Ligand)(RANK−L);インターフェロン、例えば、インターフェロンα、−β、およびγ;コロニー刺激因子(CSF)、例えば、M−CSF、GM−CSF、およびG−CSF;インターロイキン(IL)、例えば、IL−1〜IL−10;スーパーオキシドディスムターゼ;T細胞受容体;表面膜タンパク質;分解促進因子;ウイルス抗原、例えば、HIVエンベロープの一部;輸送タンパク質;ホーミング受容体;アドレシン;調節性タンパク質;インテグリン、例えば、CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA−4およびVCAM;腫瘍関連抗原、例えば、HER2、HER3またはHER4受容体;ならびに上記の任意のポリペプチドのフラグメントが挙げられる。
本発明の免疫グロブリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組み換え技術を用いて得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列を単離して、ハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞から単離して配列決定してもよい。あるいは、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドシンセサイザーまたはPCR技術を用いて合成してもよい。一旦得られれば、免疫グロブリンをコードする配列を、宿主細胞中で異種ポリヌクレオチドを複製および発現し得る組み換えベクターに挿入する。当該分野で入手可能でありかつ公知である多くのベクターを本発明の目的に用いてもよい。適切なベクターの選択は主に、ベクターに挿入すべき核酸の大きさ、およびそのベクターで形質転換されるべき特定の宿主細胞に依存する。各々のベクターは、その機能(異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現、またはその両方)およびそのベクターが存在する特定の宿主細胞との適合性次第で、種々の成分を含む。このベクター成分としては一般には、限定するものではないが、以下が挙げられる:複製起点(特に、ベクターが原核生物細胞に挿入される場合)、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位(RBS)、シグナル配列、異種核酸挿入および転写終止配列。
哺乳動物細胞で組み換え抗体を作製するための方法は公知である。このような方法では、抗体産生は、タンパク質発現の誘導を包含する。IgG抗体またはIgG抗体フラグメントをコードする核酸は、プロモーター、好ましくは哺乳動物細胞で機能的なコントロール可能なプロモーターとの作動的な会合によって都合よく発現可能にされる。このような組み換え構築物は、適切な宿主(例えば、細菌、マウスまたはヒト)におけるIgG抗体タンパク質の発現のために設計される。本明細書においてタンパク質およびポリペプチドの発現のために適切なプロモーターが広範に利用可能であり、かつ当該分野で周知である。調節領域に連結されている誘導性プロモーターまたは構成的なプロモーター(例えば、転写または翻訳因子のためのエンハンサー、オペレーターおよび結合領域)が好ましい。「誘導性」プロモーターは、本明細書では制御可能なプロモーターと定義され、これには誘導性プロモーター(すなわち、アクチベーターまたはインデューサーの存在によって活性化または誘導されるまで不活性である正の調節を受けやすい)として、または活性化プロモーター(すなわち、レプレッサーが存在しない限り、不活性であり負の調節を受けやすく、リプレッサーの除去または活性化があれば、プロモーター活性の増大が生じる)として代表的には呼ばれるプロモーターである。本明細書に考慮されるプロモーターとしては例えば、限定するものではないが、当該分野で公知のようにtrp、lpp、tac、およびlacプロモーター、例えば、E.coli由来のlacUV5;バキュロウイルス/昆虫細胞発現系のP10またはポリヘドリン遺伝子プロモーター(例えば、米国特許第5,243,041号、同第5,242,687号、同第5,266,317号、同第4,745,051号、および同第5,169,784号を参照のこと)および他の真核生物発現系由来の誘導性プロモーターが挙げられる。タンパク質の発現のために、このようなプロモーターは、trpオペロンのオペレーター領域のようなコントロール領域との作動可能な連結においてプラスミド中に挿入される。
タンパク質の高次構造、および混合物中のタンパク質の高次構造の相対的な割合の決定は、任意の種々の分析技術および/または定量技術を用いて行ってもよい。タンパク質の高次構造の間の活性において相違が存在する場合、混合物中の高次構造の相対的な割合を決定することは、活性アッセイ(例えば、リガンドに対する結合、酵素活性、生物学的活性など)の方法によって行うことができる。タンパク質の生物学的活性も用いてもよい。あるいは、タンパク質1mgあたりの活性単位として活性を表現する結合アッセイを用いてもよい。
本発明の免疫グロブリンは、その物理的/化学的特性および生物学的機能について、当該分野で公知の種々のアッセイによって特徴づけられ得る。本発明の一局面では、参照(一般には野性型対応物)免疫グロブリンに対して本発明の変更された免疫グロブリンを比較することが重要である。特に、本発明の方法に従って発現される本発明の変更された免疫グロブリンの量は、類似の培養条件下で発現される参照免疫グロブリンのものに比較できる。タンパク質の定量のための方法は当該分野で周知である。例えば、発現されるタンパク質のサンプルは、クマシーブルー染色されたSDS−PAGE上でその定量的な強度について比較され得る。あるいは、目的の特定のバンド(単数または複数)(例えば、全長のバンド)は、例えば、ウエスタンブロットゲル分析および/またはAME5−RPアッセイによって検出され得る。
本発明はまた、化学療法剤(本明細書において上記で規定されかつ記載される)、毒素(例えば、細菌、真菌、植物または動物由来の低分子毒素または酵素的に活性な毒素であって、そのフラグメントおよび/または変異体を含むもの)、または放射性同位体(すなわち、放射性コンジュゲート)などの細胞傷害性剤に対してコンジュゲートされた本発明の免疫グロブリンポリペプチドを含んでいるイムノコンジュゲートに関する。
本発明の抗体および抗体変異体は、当該分野で公知であり、かつ容易に利用可能である追加の非タンパク質部分を含むように修飾されてもよい。好ましくは、抗体の誘導体化のために適切な部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例としては限定するものではないが、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ−1,3,6−トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか)、およびデキストランまたはポリ(n−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、およびそれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水におけるその安定性のおかげで製造に利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量のものであってもよく、分岐であっても、または未分岐であってもよい。抗体に結合されたポリマーの数は、変化してもよいし、2つ以上のポリマーが結合される場合は、それらは同じ分子であっても異なる分子であってもよい。一般には、誘導体化に用いられるポリペプチドの数またはタイプは、限定するものではないが、抗体誘導体が規定の条件下で治療に用いられるか否かにかかわらず、改良されるべき抗体の特定の特性または機能を含む考慮に基づいて決定され得る。
本明細書に提供される抗体修飾は、複数の高次構造に適合し得るか、および/または2つ以上のドメインを含み得る組み換えIgG2分子の異質性を効率的に減少することが見出されている。ドメインとは、ポリペプチド鎖のその領域に局在化され得る特定の三次構造および/または特定の活性に適合するポリペプチドの連続領域である。例えば、あるタンパク質の1つのドメインは、1つのリガンドに結合親和性を有し得、あるタンパク質の1つのドメインは別のリガンドに結合親和性を有し得る。熱安定性の意味では、ドメインは、タンパク質の協同的な変性ユニットを指してもよい。2つ以上のドメインを含むこのようなタンパク質は、1つのタンパク質として天然に存在することが見出されてもよいし、または融合タンパク質として遺伝的に操作されてもよい。さらに、ポリペプチドのドメインはサブドメインを有してもよい。
本発明の抗体を含んでいる治療用処方物は、水溶液、凍結乾燥処方物または他の乾燥処方物の形態で、所望の程度の純度を有する抗体を、必要に応じて生理的に許容される担体、賦形剤または安定剤(Remington’s Pharmaceutical Sciences 第16版 Osol,A.編集.(1980))と混合することによって貯蔵のために調製される。受容可能な担体、賦形剤または安定剤は、使用される投与量および濃度で受容者にとって無毒であり、これにはリン酸塩、クエン酸塩、ヒスチジンおよび他の有機酸などの緩衝液;アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤;防腐剤(例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン;カテコール;レソルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;およびm−クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;アミノ酸、例えば、グルタミン酸、プロリン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン;単糖類、二糖類および他の炭水化物、例としては、グルコース、マンノース、またはデキストリン;EDTAなどのキレート剤;糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール;ナトリウムなどの塩を形成する対イオン;金属錯体(例えば、Zn−タンパク質複合体)および/または非イオン性サーファクタントTWEEN(商標)、PLURONICS(商標)またはポリエチレングリコール(PEG)が挙げられる。
本発明の免疫グロブリンは、例えば、インビトロおよびインビボの診断方法および治療方法の両方を含む、その免疫グロブリンが認識する特定のポリペプチドを精製、検出および標的化するために用いられ得る。
本発明の別の実施形態では、上記の障害の処置のために有用な材料を含んでいる製品が提供される。製品は、容器、およびその容器に付随した表示または添付文書を含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどが挙げられる。その容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。その容器は、その条件を処置するのに有効な組成物を保持し、無菌のアクセスポートを備えてもよい(例えば、その容器は、皮下注射針で穿刺可能な栓を有している静脈内溶液バッグまたはバイアルであってもよい)。組成物中の少なくとも1つの活性剤は、本発明の免疫グロブリンである。この表示または添付文書は、この組成物が癌などの選ばれた状態を処置するのに用いられることを示す。さらに、この製品は(a)本明細書に含まれる組成物を含む第一の容器であって、その組成物が本発明の免疫グロブリンを含む第一の容器と;(b)そこに組成物が含まれる第二の容器であって、その組成物がさらなる細胞毒性剤を含む第二の容器とを備えてもよい。本発明のこの実施形態における製品はさらに、その第一および第二の免疫グロブリン組成物が癌を処置するために用いられ得ることを示している添付文書を備えてもよい。あるいは、またはさらに、その製品はさらに、注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル溶液、およびデキストラン溶液などの薬学的に受容可能な緩衝液を含んでいる第二(または第三)の容器を備えてもよい。他の緩衝液、希釈剤、フィルター、ニードルおよびシリンジを含んでいる商業的観点および使用者の観点から望まれる他の材料がさらに含まれてもよい。
IGG2のCH1およびヒンジ近接性のモデリング
IgG2抗体の三次元モデルを作製して、野性型抗体分子におけるジスルフィド結合の位置を研究した。このモデルでは、IgG2のCH1のCys残基(Cys−131)とヒンジ残基Cys−219およびCys−220の密接な空間近接性、ならびに鎖間ジスルフィド結合軽鎖Cys残基(Cys−214)を図示した。IgG2抗体の三次元モデルは以下のように構築した。
モノクローナル抗体である抗RANKLの変異
抗RANKLは、核因子κBリガンド受容体活性化因子(Receptor Activator of Nuclear Factor Kappa B Ligand)(RANK−L)に対するヒトモノクローナルIgG2抗体である。抗RANKLは、分子間ジスルフィド結合を通じて連結される2つのHCおよび2つのLCから構成される。各々のHCは、448個のアミノ酸を生じるようにコードされ、κサブタイプに属する各々のLCは、C末端でCys残基を有する215個のアミノ酸からなる。上記で考察されるとおり、溶液中のヒトIgG2抗体は、鎖間ジスルフィド架橋のなかに異質性を呈する。
抗RANKL突然変異体抗体の構造的特徴付け
抗RANKLのC131S変異型は、下に記載されるような種々の分析技術(SE−HPLC、CEX−HPLC、CE−SDS、SDS−PAGEおよびRP−HPLC)を用いて野性型抗RANKLと隣り合わせで特徴づけた。変異型のジスルフィド結合はまた、非還元性のペプチドマッピング技術で特徴づけた。
SE−HPLCは、非変性条件下でタンパク質の分子サイズまたは流体力学的容積を決定するための信頼できる技術である。抗RANKLのSE−HPLC分析を行って、その純度を決定した。この方法は、2つのToso Hass TSK−GEL G3000SWXLカラムを連続して、そして20mMのリン酸ナトリウム、250mMのNaCl、pH 7.0を移動相として利用して、凝集物および低分子量のクリップ型からモノマーの抗RANKLを識別した。この溶出プロフィールは、低濃度(3.8mg/mL)の抗RANKL Cys131Ser突然変異体に起因して280nmではなく215nmでモニターした。凝集物、Main Peakおよびクリップ型についての結果は、相対的な面積の割合として表した。
抗RANKLの荷電異質性は代表的には、CEX−HPLC分析を用いて評価される。抗RANKLの種々の表面荷電変異体は、pH7.5で弱い陽イオン荷電カラムに結合すること、続いて塩勾配を使用する溶出によって分離された。この方法は、抗RANKL結合およびNaCl含有勾配での溶出の間に215nmでプロフィールをモニタリングするとき、pH7.5で20mMのリン酸ナトリウムを用いて40℃でDionex ProPac WCX 10カラムを用いた。この流速は、0.6mL/分であって、注入量は180μgのタンパク質であった。この方法は、酸性の変異体をPre−Peaksとして、塩基性の変異体を特定のPost Shoulder、およびPost Peaksとして分離した。Pre−Peaks, Post ShoulderおよびPost Peaksについての結果、ならびにMain Peakは、面積の割合として表された。溶出の間の直線勾配は、1分あたり約1.25mMのNaClの流速で0〜79nMのNaClであった。
CE−SDSは最初、SDSでの処理後に非還元条件下で行い、70℃で加熱し、分子が変性された後にいずれの露出した遊離のチオール基もヨードアセトアミドで遮断する。抗RANKLをSDSでインキュベートした場合、そのタンパク質は全般的に負の電荷を呈し、陰極に向かって電場中を移動した。CE−SDSはSDS後の分子サイズ(流体力学的容積)に基づいて分離し、熱がそのタンパク質を変性した。この分析は、非還元条件および還元条件の両方を用いて行った。その分析は、UV/PDA検出を備えるAgilent HP3Dキャピラリー電気泳動システムで行った。そのキャピラリーは、CE標準のベアー融合シリカキャピラリであって、CE−SDSサンプルおよび泳動緩衝液はBio−Radから供給された。
両方の構築物についてLCに対するHCの比は、2.1という値を呈し、これは、HCおよびLCポリペプチドについての平均質量値を用いる計算に基づいた2.1という理論値とよく匹敵した。この結果によって、この突然変異体は野性型とちょうど同じく、2つのHCおよび2つのLCポリペプチド鎖でアセンブルされたということが強調された。
抗RANKL(Cys131Ser)を、非還元SDS−PAGEによって抗RANKL野性型と隣り合わせで分析して、SDSおよび熱変性後に抗RANKLおよび変異体のサイズ分布をモニターした。この方法は、完全にアセンブルされていない分子であってもよいし(1つまたは2つのLCのいずれかを欠く)、またはペプチド結合切断によって断片化されてもよい、共有結合したマルチマーまたは潜在的なフラグメントの検出に有用な非還元条件下でプレ・キャストした4〜20%のポリアクリルアミドゲルを用いた。遊離のLCおよびHCはまた、非還元条件下で検出され得る。抗RANKLは、非還元条件下で、116.25〜200kDaという分子量マーカーの位置で、約150kDaというみかけの分子量を有するインタクトな分子として移動した。低レベルの共有結合した二量体もこの方法によって検出された。
RP−HPLCを用いてIgG2サブクラスに固有の構造的アイソフォームを部分的に分離した。サンプルを、64℃で移動相A(0.1%のTFAが95/3.9/1.1(v/v/v)のH2O/n−プロパノール/ACN中に含有される)中で平衡にしたZorbax 300 SB C8 カラム(5μ,2.1×150mm)上に注入して、0.5mL/分の流速で溶出した。溶出の与えられた勾配は、移動相B(0.1%のTFAが10/70/20(v/v/v)のH2O/n−プロパノール/ACN/の中に含有される)で25〜30%で23分にわたり、溶出されたタンパク質は215nmでモニターした。図16は、野性型のクロマトグラムと比較した抗RANKL突然変異体のクロマトグラムを示す。示されるとおり、RP−HPLCによって、野性型構築物よりも数分遅く溶出された突然変異体の疎水性の増大した性質が実証された。構造的アイソフォームに相当し、かつ野性型に存在した、十分規定された4つのピーク1、2、3および4は、突然変異体のプロフィールには明らかに存在しなかった。
HCにおけるCys131の除去は、ヒンジ領域に関するジスルフィド接続性を簡単にすることが期待された。ジスルフィド接続性を試験する最も直接的な方法は、非還元条件下でペプチドマッピングを行うことであった。エンドプロテイナーゼLys−Cを用いる非還元性のペプチドマッピングを、突然変異体および野性型抗RANKL構築物に適用した。抗RANKLのペプチドマッピングは、非還元条件について下に概説されるように行い、Cys残基を含んでいるペプチドの間のジスルフィド接続性を確立した。この確立された非還元性の消化はまた、下に概説されるようなTCEPでの処置によって還元して、配列を特定する目的のための還元マッピングを得た。
Lys−C消化。 3μLのサンプルを30〜60mg/mLで7μLの8MのGuHCl、0.1MのNaOAc、20mMのNEM、pH5.0の緩衝液と混合し、これを37℃で3時間インキュベートし、続いて4Mの尿素、20mMのNH2OH、0.1Mのリン酸ナトリウム、pH7.0の緩衝液中に30倍希釈した。エンドプロテイナーゼLys−Cを添加して、酵素対基質の比が1:10(w/w)まで添加し、その消化を37℃で一晩行った。非還元性ペプチドマッピング分析については、TFAをこのサンプル消化物に0.1%(v/v)の最終濃度まで添加して、反応をクエンチし、そのペプチドを液体クロマトグラフィー/エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析(LC/ESI−MS/MS)によって直接分析した。還元されたペプチドマッピング分析については、TECPを消化したサンプルに対して10mMという最終濃度まで添加して、サンプルを室温で約30分間インキュベートして、ジスルフィド連結ペプチドを還元した。TFAを分析前に0.1%(v/v)という最終濃度まで添加した。
SE−HPLC、CE−SDSおよびSDS−PAGEによる抗RANKL(Cys131Ser)変異体の評価によって、構築された分子は、ジスルフィド結合によって一緒に保持されるLCおよびHCの各々の2つのコピーを含んでいる4つのポリペプチド抗体として発現および精製されることが確認された。SE−HPLCによる溶出位置によって、野性型抗RANKLに比較した場合、変異体についてわずかに大きい流体力学半径が示唆された。pH7.5のCEX−HPLCによる、および非還元性CE−SDSによるプロフィールは、抗RANKL野性型について観察されるプロフィールよりも抗RANKL(Cys131Ser)変異体についてさらに均一でかつ簡単であった。非還元性CE−SDS、CEX−HPLC(pH5)およびRP−HPLC分析によって、代表的なIgG2サブタイプ抗体を示す、野性型抗RANKLについて観察されるよりも抗RANKL(Cys131Ser)変異体についてジスルフィド媒介性の構造的アイソフォームの複雑性の少ないアレイが示された。非還元性のペプチドマッピングによって、HCのCys131がSer残基によって置換されるとき、LCはLCのCys215(EdelmanのナンバリングではCys214)およびHCの4つのCys残基のうちの1つを通じてHCのヒンジ領域に接続されることが示された。まとめると、これらの結果によって、Cys131の変異体は、IgG2抗体における構造的な相同性の増大を生じることが確認される。
抗RANKL変異体抗体の力価分析
抗RANKLの変異型は、均一時間分解蛍光(HTRF)アッセイによってインビトロで力価を評価するために野性型抗RANKLと隣り合わせで特徴づけた。抗RANKLの力価は、それが、RANK−Lのその同族の受容体である「核因子κB受容体活性化因子」(RANK)に対する結合をブロックする能力によって定量される。均一時間分解蛍光(HTRF)アッセイを利用して、定量的な結果を得た。要するに、RANK−Lを、337nmの光で励起させた場合620nmで光を発光するユーロピウム+3(Eu+3)で標識した。この受容体は、組み換え技術RNAK−FLAGを用いて融合タンパク質として産生され、これはアロフィコシアニン(APC)に結合された抗FLAG抗体で標識された。APCは、620nmで光によって励起されるとき665nmの光を発光する発蛍光団である。従って、Eu+3標識されたRANK−LがRANK−FLAG/抗−FLAG−APC複合体に結合するとき、三次の複合体は337nmの光で励起されたとき635nmの光を発光する。抗RANKLをEu+3、RANK−LおよびRANK−FLAG/抗FLAG−APCとともにインキュベートした場合、665nmの蛍光強度は用量依存性の様式で減少した。
抗IL−1R抗体の変異体
IgG2抗体におけるジスルフィド結合形成システインに対する変異体の効果をさらに理解するために、2つの変異体抗IL−1R抗体を作製して、下に示されるように特徴づけた(図19Aを参照のこと)。第一の変異体(C219S)は、ジスルフィド構造3型について富化されていると予想され、ここではLCジスルフィド結合がC131に強制されている(図19Bを参照のこと)。第二の変異体(C131S)は、ジスルフィド構造1型について富化されていると予想され、ここではLCジスルフィド結合がHCヒンジ領域に強制されている(図19Bを参照のこと)。この抗IL−1Rのヌクレオチドおよびコードされたアミノ酸配列は、米国特許出願公開第2004/097712号、Varnumら、(その全体が参照によって本明細書に援用される)に示される。C219SおよびC131S変異体は、上記の実施例2に記載されるような標準的な部位指向性の変異誘発を用いて作製された。その変異体は、DNA配列決定によって確認され、その変異した発現構築物をCOS細胞に一過性にトランスフェクトした。分泌された抗体を精製し、次いで次の2つの実施例に記載されるように特徴づけた。
抗IL−1R変異体抗体の構造的特徴付け
実施例5で作製されるC219およびC131S変異体抗体を、RP−HPLCで分析して、安定にトランスフェクトされたCHO細胞および一過性にトランスフェクトされたCHO細胞由来の野性型抗IL−1Rと比較した。RP−HPLC手順は以下のとおり行った。
抗IL−1R変異体抗体の力価
各々の抗IL−1R変異体の力価を、下に記載されるように軟骨細胞および全血のバイオアッセイを用いて野性型と比較した。
抗EGFR抗体の変異
実施例1に示さるとおり、近い空間的近接性(図6)の、位置(HC)131、219、220および(LC)214の4つのシステインの抗体位置の三次元構造に基づくIgG2抗体配列のモデリングによって、これらの残基の可変性の配列がIgG2の構造的アイソフォームを生じ得ることが示唆されている。空間的に近いシステインの変異がこれらの形態を排除し得る可能性を以下のとおり試験した。
抗EGFR変異体抗体の構造の特徴付け
変異体抗EGFr抗体を次に、非還元性CE−SDSおよび天然ペプチドマッピングによって以下のように比較して分析した。
第一に、抗体の見かけの大きさを非還元性のキャピラリー電気泳動のドデシル硫酸ナトリウム(nrCE−SDS)によって評価し、完全に変性した分子でゲル篩い分け法を行った。
野性型およびC219S抗EGFrのジスルフィド構造は、非還元性ペプチドマッピングによって検討した。遊離のシステインは、(Bures ら,1998,Biochemistry 37:12172)によって記載されるとおり酸性pHでN−エチルマレイミド(NEM)でアルキル化された。NEMアルキル化後、その溶液を緩衝液交換して、酵素消化を非還元性分子で行った。要するに、NEM標識材料を、10%w/wのトリプシン含有0.1MのTris/2Mの尿素pH8.3を1mg/mLの濃度で用いて37℃で4時間、消化した。その消化反応を10%TFAの10μLの添加でクエンチした。次いで、このトリプシン消化サンプルを60℃で加熱するカラムを備えたRP−HPLCを介して分析した。移動相は、(A)水に含まれる0.12%のTFA(w:v)、および(B)40:40:20のアセトニトリル:イソプロパノール:水(w:v)に含まれる0.11%のTFAから構成された。分離は、移動相A中で調整した、Jupiter C5(2.1×250mm)カラム上で20分間行った。100μgの消化物を注入して、ペプチドフラグメントを0〜65%のBの勾配で0.2mL/分の流速で、165分溶出させた。ペプチド溶出は、214nmのUV吸収およびオンラインの質量獲得によってモニターした。
抗EGFr変異体抗体の生物学的活性の特徴付け
変異体のC219S、C220Sおよび野性型の抗EGFrの力価を、以下のように行うEGFrリガンドおよびリン酸化バイアッセイによって比較する。抗EGFrは、ヒト上皮成長因子受容体(EGFr)に対する完全ヒト組み換えIgG2モノクローナル抗体である。従って、力価は、その抗体が細胞表面でリガンド−受容体結合を阻害し、それによってシグナル伝達経路のリガンド誘導性活性を妨げる能力によって測定する。2つの力価アッセイを用いて、EGF媒介性のEGFrの自己リン酸化の遮断、またはレポーター遺伝子発現アッセイによる細胞増殖の阻害のいずれかを測定する。EGFr自己リン酸化の阻害を測定するために、96ウェルの組織培養プレートにA431細胞を播種する。参照標準および試験サンプルの連続希釈を行って、0.1125mg/ml〜0.02μg/mlにおよぶ濃度範囲を得る。50μlの各々の連続希釈をA431細胞を含んでいる組織培養プレートに添加する。各々の細胞にまた、作業希釈範囲まで希釈した50μlのrhEGFを添加する。そのプレートを37℃でかつ10%のCO2で60分間インキュベートする。その上清を廃棄して、細胞を1ウェルあたり105μlの緩衝液(10mMのTris,150mMの塩化ナトリウム、5mMのEDTA、1%のTriton X−100)で溶解した。そのプレートを2〜8℃で60分間インキュベートする。85μlのこの細胞の溶解液を、E752 EGF抗体でコーティングしたELISAプレートに添加する。そのプレートを室温でかつ暗野で90分間インキュベートする。次いで、そのプレートを洗浄して100μlのHRPコンジュゲートした検出抗体を各々のウェルに添加する。そのプレートを60分間インキュベートし、次いで洗浄した後に100μlの基質の添加をする。そのプレートを15〜25分間発色する。その発色は、50μlの2M H2SO4を添加することによって停止して、そのプレートを450nmおよび650nmで読み取る。各々の試験サンプルの力価は、三通り計算して、平均値を報告する。
IgG2抗体のヒンジ領域における挿入変異によるジスルフィド異質性の排除
上で考察したとおり、ヒトIgG2抗体は、ヒンジでのジスルフィド異質性に起因して構造的改変を有する。ジスルフィド異質性は、IgG2抗体の重鎖でのみ生じる、ヒンジ中での反応性でかつ固有のシステイン219−システイン220(C219C220)モチーフによって誘導される。この例では、ジスフルフィド異質性は、図25に示されるように重鎖の残基C219とC220の間、または上に1、2またはそれ以上のアミノ酸残基を挿入することによって排除される。
酸化還元変換によるIgG2抗体高次構造のアイソフォームの富化
酸化還元変換
封入体状態からタンパク質の酸化的再折り畳みは、組み換えタンパク質の微生物産生においては通常の手順であるが、哺乳動物の細胞産生では通常は行われない。しかし、IgG2の異質性は、ジスルフィドに関連すると考えられ、酸化還元処理に対するその型の反応性を試験した。野性型の抗IL−1R抗体(その全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第2004/097712に記載される)を、グアニジンHCl(GuHCl)の有無において種々の酸化還元条件に供した。
酸化還元再折り畳みIgG2抗体高次構造アイソフォームの生理活性
IgG2酸化還元再折り畳み高次構造アイソフォームの生理活性を試験して各々のアイソフォームがバルクの未処理の抗体の力価を保持していたか否かを決定した。
IgG2抗体の挿入変異の構造の特徴付け
実施例11に記載のヒンジ領域挿入変異体を、抗IL−1R抗体で作製した。変異体は、配列2(配列番号14)のアラニンの挿入によって作製して、ヒンジ領域配列CACVECPPC(配列番号32)を有するIgG2抗体を作製し、配列3(配列番号15)の2つのプロリンの挿入によって、ヒンジ領域配列CPPCVECPPC(配列番号33)を有するIgG2抗体を作製した。
IgG2抗体の軽鎖のC末端領域における挿入変異によるジスルフィド異質性の排除
上記で考察されるとおり、ヒトIgG2抗体は、ヒンジでのジスルフィドの異質性に起因して構造的変異体を有する。このジスルフィド異質性は、IgG2抗体の軽鎖のC末端システイン残基(C214)と反応するヒンジにおける反応性および固有のシステイン219−システイン220(C219C220)モチーフによって誘導される。この実施例では、ジスルフィド異質性は、図33および34に示されるように軽鎖の残基C214およびC215の後ろに1、2またはそれ以上のアミノ酸残基を挿入することによって排除される。
追加の抗EGFR抗体の変異および特徴付け
実施例8で作製され、かつ実施例9および10で特徴づけられた抗EGFR抗体変異体に加えて、抗EGFR抗体に対する他の変異を作製した。本実施例は、変異体の作製ならびにそれらの構造的および生物学的活性の特徴付けを記載する。
IgG2抗体の挿入変異体の構造、安定性および生物学的活性の特徴付け
実施例14に記載される結果に基づいて確認および拡張するために、以下の実験を行った。この実施例では、ジスルフィド異質性を、重鎖のC219およびC220の残基の間に2つのアミノ酸残基を挿入することによって2つの異なるmAb中で排除した。さらに、抗IL−1R1の挿入変異体を処方安定性、酸化還元環境でのジスルフィド安定性、および生物学的活性について試験した。下に示されるとおり、挿入変異体は、異質性が少なく、血液様の酸化還元環境においてさらに安定であって、力価の有意な増大を示した。試験したいくつかの挿入残基のなかでも、cPPc挿入変異体は、生物学的活性の増大および酸化還元処理に対する非反応性に加えて、野性型mAbに対して、全体的な最大の処方安定性を示した。
挿入変異のジスルフィド接続性を、非還元性Lys−Cペプチドマッピングに加えてESI−MSをタンデムで用いて非還元性逆相(RP)分析によって評価した。前の実施例に考察されるとおり、IgG2 mAbのインタクトなRP分析は、IgG2ジスルフィドアイソフォームを評価するための鋭敏かつ選択的な方法である。野性型の(WT)抗IL−1RIのIgG2のmAbは、RP−HPLCによって代表的な4つのピークの異質IgG2プロフィールを提示した。RP分析による挿入変異体の分析では、ジスルフィドアイソフォーム分布上の重鎖(HC)のCys219/Cys220の前および間にアミノ酸を挿入することの影響が示された。4つの挿入変異体(cAc、PNcc、およびANcc)のうちの3つが複数のピークを呈したが、異なる分布では、WTに匹敵していた。Cys219/Cys220の前に作製された2つの挿入によって、RPのピーク2の量の顕著な増大および他のピークの量の引き続く減少が示された。これによって、2つのアミノ酸の距離によりヒンジ領域を低下することによって、ジスルフィド分布が中間アイソフォーム(RPピーク2)へシフトすることが可能であるが、ジスルフィド異質性を完全には排除しないことが示唆される。他方では、2つのタンデムシステイン(Cys219/Cys220)の間のアミノ酸の挿入は、ジスルフィド異質性を排除した。2つのタンデムシステインの間の1つのアミノ酸(cAc)の挿入は、システイン上に作製された挿入に匹敵する結果を生じ、これによって単一アラニンアミノ酸挿入が、ジスルフィド異質性を排除するのに最も有効ではない場合もあることが示唆される。しかし、アラニンより大きい単一アミノ酸の異なる選択によって、ジスルフィド異質性を停止することが可能である。その後の質量分析によって、IgG2のRPピークの間の有意な質量の相違が示された。
抗IL−1RI挿入変異体の安定性を、PBS(pH7.2)に2mg/mLで含有されるタンパク質を処方すること、およびそのサンプルを上昇した温度(37℃および45℃)でインキュベートすること、およびサイズ排除クロマトグラフィーによってモニタリングすることによって試験した。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)は、連続した(2つのTosoh Bioscience TSK−Gel G3000 SW×1(カラム7.8内径×30cm、5μmの粒子)で、Agilent 1100 HPLCシステム(Agilent Technologies,Inc.,Palo Alto CA USA)で行った。この装置に20μgをロードして2mg/mLでサンプルを分析した。移動相は、100mMのリン酸ナトリウム、500mMの塩化ナトリウム、5%のエタノール(pH7.0)を含んだ。この流速は、0.5mL/minであって、カラム温度は25℃で制御した。そのシグナルは、215nmおよび280nmの波長での吸光度によってモニターした。
以前に考察したとおり、IgG2ジスルフィドアイソフォームは、酸化還元環境におかれた場合、不安定でかつ不活性変換される。この抗IL−1RIのcPPc挿入変異体を酸化還元の安定性について試験した。なぜならこれは、単一のIgG2ジスルフィドアイソフォームから構成されることが示されたからである。このサンプルを、4μMのシステインの出発濃度を含有しているPBS(pH7.2)溶液中で約1mg/mLでインキュベートした。このシステイン濃度は、定常状態の酸化還元環境では維持されなかった。なぜなら、システインは水溶液中では急速にシスチンに変換するからである。このサンプルを最大144時間までインキュベートして、ジスルフィド変換についてRPクロマトグラフィーによってモニターした。この抗体を、Zorbax 300SB C8カラム(150×2.1mm、5μmまたは50×1mm、3.5μm)を用いて、インタクトなRP−HPLCによって分析した。そのカラム温度は75℃であって、その流速は0.5mL/分であった。移動相Aは4%のIPA/1%のACN/0.11%のTFAであり、移動相Bは70%のIPA/20%のACN/0.10%のTFAであった。
抗IL−1RI挿入変異体の力価は、軟骨細胞のバイオアッセイを用いてWTと比較した。この抗IL−1RIのIgGサンプルをアッセイ培地で400nMから1.5pMまで連続希釈した。希釈された試験抗体(50μl)を、100μlの容積に10,000細胞/ウェルの密度でヒト軟骨細胞を播種された96−ウェルプレートのウェルに添加した。最終抗体濃度は、100nMから0.38pMまでにおよんだ。30分のインキュベーション後、50μlの組み換え体ヒトIL−1βを最終濃度10pMまで添加した。一晩のインキュベーション後、電気化学発光検出(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD)によるIL−6のイムノアッセイを用いて抗体活性を分析した。IL−6産生の阻害は、最大IL−1β活性の割合として算出した。各々の試験抗体の阻害応答曲線を確立して、対応するIC50値(シグナルを50%まで低下する抗体の濃度)は、GraphPad Prismソフトウェアを用いて導いた。
Claims (90)
- モノクローナルIgG2抗体であって:
軽鎖ポリペプチドと;
ヒンジ領域を有する重鎖ポリペプチドと、を含み、
前記抗体が前記重鎖または軽鎖ポリペプチドにおいてアミノ酸修飾を含み、その結果、前記修飾が、前記軽鎖ポリペプチドの最もC末端側のシステイン残基を通じて前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域におけるアミノ酸とのみ主に鎖間ジスルフィド結合を形成する軽鎖ポリペプチドを提供する、モノクローナルIgG2抗体。 - 前記修飾が重鎖ポリペプチド修飾を含む、請求項1に記載のモノクローナルIgG2抗体。
- 前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのEu位置131にシステイン残基の置換を含む、請求項2に記載のモノクローナルIgG2抗体。
- 前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのEu位置131にシステイン残基の欠失を含む、請求項2に記載のモノクローナルIgG2抗体。
- 前記ヒンジ領域が、前記重鎖ポリペプチドのEuアミノ酸200〜238を含む、請求項1に記載のモノクローナルIgG2抗体。
- 前記軽鎖の前記最もC末端側のシステイン残基が前記軽鎖のEu位置214のシステイン残基である、請求項1に記載のモノクローナルIgG2抗体。
- 前記軽鎖ポリペプチドが常に、前記軽鎖ポリペプチドの最もC末端側のシステイン残基を通じて前記重鎖ポリペプチドの前記ヒンジ領域のアミノ酸でのみ鎖間ジスルフィド結合を形成する、請求項1に記載のモノクローナルIgG2抗体。
- モノクローナルIgG2抗体であって:
軽鎖ポリペプチドと;
ヒンジ領域を有する重鎖ポリペプチドと、を含み、
前記抗体が前記重鎖または軽鎖ポリペプチドにおいてアミノ酸修飾を含み、その結果、前記修飾が、前記軽鎖ポリペプチドの最もC末端側のシステイン残基を通じて前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域の外側のアミノ酸とのみ主に鎖間ジスルフィド結合を形成する軽鎖ポリペプチドを提供する、モノクローナルIgG2抗体。 - 前記ヒンジ領域の外側の前記アミノ酸が前記重鎖ポリペプチドのEu位置131のシステイン残基である、請求項8に記載のモノクローナルIgG2抗体。
- 前記重鎖ポリペプチド修飾が前記ヒンジ領域内にシステイン残基の変異を含む、請求項8に記載のモノクローナルIgG2抗体。
- システイン残基の前記変異が、前記重鎖ポリペプチドのEu位置219にシステイン残基の変異を含む、請求項10に記載のモノクローナルIgG2抗体。
- システイン残基の前記変異が、前記重鎖ポリペプチドのEu位置220にシステイン残基の変異を含む、請求項10に記載のモノクローナルIgG2抗体。
- 前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドの前記ヒンジ領域に1つ以上のアミノ酸の挿入を含む、請求項8に記載のモノクローナルIgG2抗体。
- 1つ以上のアミノ酸の前記挿入が、前記重鎖ポリペプチドのEu位置219と220との間である、請求項13に記載のモノクローナルIgG2抗体。
- 1つ以上のアミノ酸の前記挿入が、前記重鎖ポリペプチドのEu位置218と219との間である、請求項13に記載のモノクローナルIgG2抗体。
- 前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドの前記ヒンジ領域に1つ以上のアミノ酸の欠失を含む、請求項8に記載のモノクローナルIgG2抗体。
- 前記ヒンジ領域が、前記重鎖ポリペプチドのEuアミノ酸200〜238を含む、請求項8に記載のモノクローナルIgG2抗体。
- 前記軽鎖の前記最もC末端側のシステイン残基が前記軽鎖のEu位置214のシステイン残基である、請求項8に記載のモノクローナルIgG2抗体。
- 前記軽鎖ポリペプチドが常に、前記軽鎖ポリペプチドの最もC末端側のシステイン残基を通じて前記重鎖ポリペプチドの前記ヒンジ領域の外側のアミノ酸とのみ鎖間ジスルフィド結合を形成する、請求項8に記載のモノクローナルIgG2抗体。
- 前記軽鎖修飾が、前記軽鎖ポリペプチドのC末端領域に1つ以上のアミノ酸の挿入を含む、請求項1または8のいずれかに記載のモノクローナルIgG2抗体。
- 1つ以上のアミノ酸の前記挿入が、前記軽鎖ポリペプチドのEu位置214と215との間である、請求項20に記載のモノクローナルIgG2抗体。
- 前記軽鎖修飾が、前記軽鎖ポリペプチドの最もC末端側のシステイン残基の後に1つ以上のアミノ酸の追加を含む、請求項20に記載のモノクローナルIgG2抗体。
- 前記軽鎖修飾が、Eu位置215にセリン残基の置換変異を含み、前記置換がセリンよりもかさ高いアミノ酸を提供する、請求項1または8のいずれかに記載のモノクローナルIgG2抗体。
- 治療用抗体処方物であって:
目的の治療標的に結合し、かつ少なくとも1つのアミノ酸修飾を含み、ここで前記修飾が単一の高次構造のアイソフォームを生じる、複数のIgG2抗体と、
薬学的に受容可能なキャリアと、を含む治療用抗体処方物。 - 前記修飾が前記抗体の重鎖ポリペプチド修飾を含む、請求項24に記載の治療用抗体処方物。
- 前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのEu位置131にシステイン残基の置換を含む、請求項25に記載の治療用抗体処方物。
- 前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのEu位置131にシステイン残基の欠失を含む、請求項25に記載の治療用抗体処方物。
- 前記重鎖ポリペプチド修飾が前記ヒンジ領域内にシステイン残基の変異を含む、請求項25に記載の治療用抗体処方物。
- システイン残基の前記変異が前記重鎖ポリペプチドのEu位置219にシステイン残基の変異を含む、請求項28に記載の治療用抗体処方物。
- システイン残基の前記変異が前記重鎖ポリペプチドのEu位置220にシステイン残基の変異を含む、請求項28に記載の治療用抗体処方物。
- 前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域に1つ以上のアミノ酸の挿入を含む、請求項25に記載の治療用抗体処方物。
- 1つ以上のアミノ酸の前記挿入が前記重鎖ポリペプチドのEu位置219と220との間である、請求項31に記載の治療用抗体処方物。
- 1つ以上のアミノ酸の前記挿入が前記重鎖ポリペプチドのEu位置218と219との間である、請求項31に記載の治療用抗体処方物。
- 前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域に1つ以上のアミノ酸の欠失を含む、請求項31に記載の治療用抗体処方物。
- 修飾されたIgG2抗体を作製する方法であって:
IgG2抗体の重鎖または軽鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を修飾し、その結果、少なくとも1つのコードされたアミノ酸を修飾する工程と;
前記核酸を宿主細胞に導入する工程と;
前記宿主細胞を培養して、その結果複数の修飾されたIgG2抗体を発現および分泌させる工程と、を包含し、
前記複数の修飾されたIgG2抗体が主に単一の高次構造のアイソフォームである、方法。 - 前記修飾が前記抗体の重鎖ポリペプチド修飾を含む、請求項35に記載の方法。
- 前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのEu位置131にシステイン残基の置換を含む、請求項36に記載の方法。
- 前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのEu位置131にシステイン残基の欠失を含む、請求項36に記載の方法。
- 前記重鎖ポリペプチド修飾が前記ヒンジ領域内にシステイン残基の変異を含む、請求項36に記載の方法。
- システイン残基の前記変異が、前記重鎖ポリペプチドのEu位置219にシステイン残基の変異を含む、請求項39に記載の方法。
- システイン残基の前記変異が、前記重鎖ポリペプチドのEu位置220にシステイン残基の変異を含む、請求項39に記載の方法。
- 前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域に1つ以上のアミノ酸の挿入を含む、請求項36に記載の方法。
- 1つ以上のアミノ酸の前記挿入が、前記重鎖ポリペプチドのEu位置219と220との間である、請求項42に記載の方法。
- 1つ以上のアミノ酸の前記挿入が、前記重鎖ポリペプチドのEu位置218と219との間である、請求項42に記載の方法。
- 前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域に1つ以上のアミノ酸の欠失を含む、請求項36に記載の方法。
- 前記修飾が、軽鎖修飾であり、かつ前記軽鎖ポリペプチドのC末端領域に1つ以上のアミノ酸の挿入を含む、請求項35に記載の方法。
- 前記修飾が、前記軽鎖ポリペプチドのC末端での1つ以上のアミノ酸の追加である、請求項35に記載の方法。
- 請求項1〜23のいずれかに記載のモノクローナルIgG2抗体をコードする核酸。
- 請求項48の核酸分子を含むベクター。
- 請求項49に記載のベクターを含んでいる宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、CHO、VERO、NSO、BK、HeLa、CV1、Cos、MDCK、293、3T3、PC12およびWI38細胞からなる群より選択される、請求項50に記載の宿主細胞。
- 請求項1〜23のいずれかに記載のIgG2抗体を発現するハイブリドーマ細胞。
- 上皮成長因子受容体(EGFR)に標的化されたモノクローナルIgG2抗体であって、前記抗体は:
配列番号49を含む軽鎖ポリペプチド49;および
配列番号57を含む重鎖ポリペプチドであって、ヒンジ領域を有する重鎖ポリペプチド、を含み、
前記抗体が前記重鎖または軽鎖ポリペプチドにおいてアミノ酸修飾を含み、その結果、前記修飾が、前記軽鎖ポリペプチドの最もC末端側のシステイン残基を通じて前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域におけるアミノ酸とのみ主に鎖間ジスルフィド結合を形成する軽鎖ポリペプチドを提供する、モノクローナルIgG2抗体。 - 前記修飾が重鎖ポリペプチド修飾を含み、前記重鎖ポリペプチド修飾が前記重鎖ポリペプチドのEu位置131でシステイン残基の置換または欠失を含む、請求項53に記載のモノクローナルIgG2抗体。
- 上皮成長因子受容体(EGFR)に標的化されたモノクローナルIgG2抗体であって、前記抗体は:
配列番号49を含む軽鎖ポリペプチド;および
配列番号57を含む重鎖ポリペプチドであって、ヒンジ領域を有する重鎖ポリペプチド、を含み、
前記抗体が前記重鎖または軽鎖ポリペプチドにおいてアミノ酸修飾を含み、その結果、前記修飾が、前記軽鎖ポリペプチドの最もC末端側のシステイン残基を通じて前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域の外側のアミノ酸とのみ主に鎖間ジスルフィド結合を形成する軽鎖ポリペプチドを提供する、モノクローナルIgG2抗体。 - 前記重鎖ポリペプチド修飾が前記ヒンジ領域内にシステイン残基の変異を含む、請求項55に記載のモノクローナルIgG2抗体。
- 前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域に1つ以上のアミノ酸の挿入を含む、請求項55に記載のモノクローナルIgG2抗体。
- 前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域に1つ以上のアミノ酸の欠失を含む、請求項55に記載のモノクローナルIgG2抗体。
- 核因子κBリガンド受容体活性化因子(RANKL)に標的化されたモノクローナルIgG2抗体であって、前記抗体は:
配列番号61を含む軽鎖ポリペプチド;および
配列番号60を含む重鎖ポリペプチドであって、ヒンジ領域を有する重鎖ポリペプチド、を含み、
前記抗体が前記重鎖または軽鎖ポリペプチドにおいてアミノ酸修飾を含み、その結果、前記修飾が、前記軽鎖ポリペプチドの最もC末端側のシステイン残基を通じて前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域におけるアミノ酸とのみ主に鎖間ジスルフィド結合を形成する軽鎖ポリペプチドを提供する、モノクローナルIgG2抗体。 - 前記修飾が重鎖ポリペプチド修飾を含み、前記重鎖ポリペプチド修飾が前記重鎖ポリペプチドのEu位置131でシステイン残基の置換または欠失を含む、請求項59に記載のモノクローナルIgG2抗体。
- 核因子κBリガンド受容体活性化因子(RANKL)に標的化されたモノクローナルIgG2抗体であって、前記抗体は:
配列番号61を含む軽鎖ポリペプチド;および
配列番号60を含む重鎖ポリペプチドであって、ヒンジ領域を有する重鎖ポリペプチド、を含み、
前記抗体が前記重鎖または軽鎖ポリペプチドにおいてアミノ酸修飾を含み、その結果、前記修飾が、前記軽鎖ポリペプチドの最もC末端側のシステイン残基を通じて前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域の外側のアミノ酸とのみ主に鎖間ジスルフィド結合を形成する軽鎖ポリペプチドを提供する、モノクローナルIgG2抗体。 - 前記重鎖ポリペプチド修飾が前記ヒンジ領域内にシステイン残基の変異を含む、請求項61に記載のモノクローナルIgG2抗体。
- 前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域に1つ以上のアミノ酸の挿入を含む、請求項61に記載のモノクローナルIgG2抗体。
- 前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域に1つ以上のアミノ酸の欠失を含む、請求項61に記載のモノクローナルIgG2抗体。
- 修飾されたIgG2抗体の処方された安定性およびインビボの安定性を向上する方法であって、前記方法は:
IgG2抗体の重鎖または軽鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を修飾し、その結果、少なくとも1つのコードされたアミノ酸を修飾する工程と;
前記核酸を宿主細胞に導入する工程と;
前記宿主細胞を培養して、その結果複数の修飾されたIgG2抗体を発現および分泌させる工程と、を包含し、
前記複数の修飾されたIgG2抗体が主に単一の高次構造のアイソフォームである、方法。 - 前記修飾が前記抗体の重鎖ポリペプチド修飾を含む、請求項65に記載の方法。
- 前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのEu位置131にシステイン残基の置換を含む、請求項66に記載の方法。
- 前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのEu位置131にシステイン残基の欠失を含む、請求項66に記載の方法。
- 前記重鎖ポリペプチド修飾が前記ヒンジ領域内にシステイン残基の変異を含む、請求項66に記載の方法。
- システイン残基の前記変異が、前記重鎖ポリペプチドのEu位置219にシステイン残基の変異を含む、請求項69に記載の方法。
- システイン残基の前記変異が、前記重鎖ポリペプチドのEu位置220にシステイン残基の変異を含む、請求項69に記載の方法。
- 前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域に1つ以上のアミノ酸の挿入を含む、請求項66に記載の方法。
- 1つ以上のアミノ酸の前記挿入が、前記重鎖ポリペプチドのEu位置219と220との間である、請求項72に記載の方法。
- 1つ以上のアミノ酸の前記挿入が、前記重鎖ポリペプチドのEu位置218と219との間である、請求項72に記載の方法。
- 前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域に1つ以上のアミノ酸の欠失を含む、請求項66に記載の方法。
- 前記修飾が、軽鎖修飾であり、かつ前記軽鎖ポリペプチドのC末端領域に1つ以上のアミノ酸の挿入を含む、請求項65に記載の方法。
- 前記修飾が、前記軽鎖ポリペプチドのC末端での1つ以上のアミノ酸の追加である、請求項65に記載の方法。
- 修飾されたIgG2治療用抗体の効力を増大させる方法であって:
IgG2抗体の重鎖または軽鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を修飾し、その結果、少なくとも1つのコードされたアミノ酸を修飾する工程と;
前記核酸を宿主細胞に導入する工程と;
前記宿主細胞を培養して、その結果複数の修飾されたIgG2抗体を発現および分泌させる工程と、を包含し、
前記複数の修飾されたIgG2抗体が主に単一の高次構造のアイソフォームである、方法。 - 前記修飾が前記抗体の重鎖ポリペプチド修飾を含む、請求項78に記載の方法。
- 前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのEu位置131にシステイン残基の置換を含む、請求項79に記載の方法。
- 前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのEu位置131にシステイン残基の欠失を含む、請求項79に記載の方法。
- 前記重鎖ポリペプチド修飾が前記ヒンジ領域内にシステイン残基の変異を含む、請求項79に記載の方法。
- システイン残基の前記変異が、前記重鎖ポリペプチドのEu位置219にシステイン残基の変異を含む、請求項82に記載の方法。
- システイン残基の前記変異が、前記重鎖ポリペプチドのEu位置220にシステイン残基の変異を含む、請求項82に記載の方法。
- 前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域に1つ以上のアミノ酸の挿入を含む、請求項79に記載の方法。
- 1つ以上のアミノ酸の前記挿入が、前記重鎖ポリペプチドのEu位置219と220との間である、請求項85に記載の方法。
- 1つ以上のアミノ酸の前記挿入が、前記重鎖ポリペプチドのEu位置218と219との間である、請求項85に記載の方法。
- 前記重鎖ポリペプチド修飾が、前記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域に1つ以上のアミノ酸の欠失を含む、請求項79に記載の方法。
- 前記修飾が、軽鎖修飾であり、かつ前記軽鎖ポリペプチドのC末端領域に1つ以上のアミノ酸の挿入を含む、請求項78に記載の方法。
- 前記修飾が、前記軽鎖ポリペプチドのC末端での1つ以上のアミノ酸の追加である、請求項78に記載の方法。
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