MX2014006673A - Separacion de la isoforma de disulfuro de la igg2. - Google Patents

Abstract

Se describen métodos para producir una preparación de anticuerpo de la IgG2 enriquecida para una de varias isoformas estructurales de la IgG2 que difieren en la conectividad de disulfuro en la región bisagra del anticuerpo.

Description

SEPARACION DE LA ISOFORMA DE DISULFURO DE LA I6G2 ANTECEDENTES DE LA INVENCION Se ha mostrado que los anticuerpos de la IgG2 humana están compuestos por tres isoformas estructurales principales IgG2-A, -B y -A/B (Wypych et ál . , 2008; Dillon et ál . , 2008b) . Esta heterogeneidad estructural se debe a una conectividad diferente de cadena ligera a cadena pesada en cada isoforma. Estas isoformas estructurales son inherentes en anticuerpos monoclonales de IgG2 recombinantes (mAbs, por sus siglas en inglés) , así como IgG2 de origen natural en el cuerpo humano. Desde el descubrimiento de las isoformas de disulfuro de la IgG2 , se ha vuelto evidente que las isoformas individuales pueden tener propiedades estructurales y funcionales únicas y diferentes (Dillon et ál . , 2008b), incluyendo diferencias en la potencia u otros atributos de cualidad, incluyendo unión al receptor de Fcy, viscosidad, estabilidad y formación de partículas. Los requisitos de agencias reguladoras actuales indican que si las isoformas de disulfuro de la IgG2 tienen diferentes potencias (u otros atributos esenciales) , puede ser necesario supervisar y controlar su abundancia relativa (Cherney, 2010) . Por lo tanto, si las isoformas de disulfuro se consideran un atributo de calidad esencial para un mAb terapéutico, se pueden necesitar controles de supervisión del proceso. El Ref. 248841 análisis de HPLC de fase inversa se describió como uno de los métodos de supervisión de las isoformas de disulfuro de la IgG2 (Dillon et ál . , 2008a). Debido a que puede haber diferencias en los atributos de calidad de las isoformas de la IgG2, se ha vuelto más importante que cada una de las isoformas individuales se caracterice de forma temprana en el desarrollo clínico. El enriquecimiento de las isoformas individuales de la IgG2 es un requisito previo para la caracterización. Previamente, las isoformas de disulfuro de la IgG2 se enriquecían mediante tratamiento con redox (Dillon et ál., 2006b; Dillon et ál . , 2006b; Dillon et ál . , 2008b) o cromatografía por intercambio débil catiónico (Wypych et ál . , 2008) , que han producido cantidades pequeñas de fracciones moderadamente puras. No obstante, la caracterización y fabricación eficaces de las isoformas se beneficiarían de un mayor grado de pureza, así como mayores rendimientos de producción. Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de técnicas de separación que puedan producir fracciones de isoformas más altamente purificadas que las que producen los métodos resumidos anteriormente.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En un aspecto, la invención incluye un método para producir una preparación de anticuerpo de la IgG2 enriquecida al menos para una de las diversas variantes estructurales de la IgG2 que difiere en la conectividad de disulfuro en la región de bisagra, que comprende (A) poner en contacto una solución que contiene un anticuerpo de la IgG2 producido de forma recombinante con una primera matriz que se selecciona del grupo que consiste en una matriz de intercambio fuerte catiónico (SCX) , una matriz de afinidad a la IgG2 (p. ej . , HP-6014) y una matriz de proteína L, y (B) eluir dos o más fracciones de la primera elución de la primera matriz, donde (i) la solución de anticuerpo de la IgG2 que se somete al método se eluye de la primera matriz como dos o más formas separadas que se corresponden a dos o más variantes estructurales de la IgG2 y (ii) al menos una de las dos o más fracciones de la primera elución se enriquece al menos para una de las variantes estructurales de la IgG2 que difiere en la conectividad de disulfuro en la región de bisagra. En una modalidad, el método comprende adicionalmente poner en contacto al menos una de las dos o más fracciones de la primera elución con una segunda matriz que se selecciona del grupo que consiste en una matriz de SCX, una matriz de afinidad a la IgG2 (p. ej . , HP-6014) y una matriz de proteína L y eluir dos o más fracciones de la segunda elución de la segunda matriz, donde al menos una de las dos o más fracciones de la segunda elución se enriquece adicionalmente en al menos una de las variantes estructurales de la IgG2. En una modalidad, la primera matriz se selecciona del grupo que consiste en una matriz de SCX y una matriz de afinidad a la IgG2 (p. ej . , HP-6014) . En otra modalidad, la primera matriz es una matriz de SCX. En otra modalidad, la primera matriz es una matriz de afinidad a la IgG2 (p. ej . , HP-6014). En una modalidad más específica, la primera matriz es una matriz de SCX y la segunda matriz es una matriz de afinidad a la IgG2 (p. ej . , HP-6014). En otra modalidad más específica, la primera matriz es una matriz de SCX y la segunda matriz es una matriz de proteína L. En otra modalidad más específica, la primera matriz es una matriz de afinidad a la IgG2 (p. ej . , HP-6014) y la segunda matriz es una matriz de SCX.

En cualquiera de las modalidades anteriores, la matriz de SCX puede comprender SCX-YMC. En cualquiera de las modalidades precedentes, la elución de la primera o la segunda matriz se puede realizar utilizando un amortiguador con pH bajo, p. ej . , un amortiguador con un pH de entre alrededor de 2 y 3 , alrededor de 3 y 4, alrededor de 4 y 5 y alrededor de 5 y 6. En modalidades específicas, el amortiguador de elución tiene un pH menor o igual a 5, alrededor de 4.2, alrededor de 3.8 o alrededor de 2.8. En cualquiera de los aspectos y las modalidades precedentes, se puede utilizar una elución por etapa de pH o una elución por gradiente de pH, p. ej . , un gradiente de pH con un pH de ~7.2 ? -2.8. En cualquiera de los aspectos y las modalidades precedentes, se pueden utilizar una elución de etapa de sal o una elución de gradiente de sal, p. ej . , una elución de gradiente que aumente la concentración salina de -100 mM a -250 mM, p. ej . , NaCl . En cualquiera de los aspectos y las modalidades precedentes, la preparación de anticuerpo de la IgG2 se puede enriquecer en al menos una de las variantes estructurales de la IgG2 hasta un nivel de al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 % o al menos 50 % de pureza de una variante estructural de la IgG2 deseada.

En cualquiera de las modalidades precedentes, las matrices se pueden cargar en una columna de purificación de proteínas, p. ej . , una columna de escala analítica, una columna de escala semi-preparativa o una columna de escala preparativa. La columna puede tener un volumen de, por ejemplo, 1 mi o más, 2 mi o más, 3 mi o más, 4 mi o más, 5 mi o más, 6 mi o más, 7 mi o más, 8 mi o más, 9 mi o más, 10 mi o más, 15 mi o más, 25 mi o más, 50 mi o más, 100 mi o más, 200 mi o más, 500 mi o más, l i o más, 10 1 o más, 100 1 o más, 1000 1 o más. La columna puede utilizar perlas de resina con diámetros de 5 micrones o más, 10 micrones o más, 15 micrones o más, 20 micrones o más, 25 micrones o más, 26 micrones o más, 27 micrones o más, 28 micrones o más, 29 micrones o más, 30 micrones o más, 35 micrones o más o 40 micrones o más. El diámetro de la columna puede ser, p. ej . , de 1 cm o más, 2 cm o más, 3 cm o más, 4 cm o más, 5 cm o más, 6 cm o más, 7 cm o más, 8 cm o más, 9 cm o más, 10 cm o más, 20 cm o más, 30 cm o más, 40 cm o más, 50 cm o más o 100 cm o más. La columna puede utilizar velocidades de flujo de, p. ej . , 10 cm/hr o más, 25 cm/hr o más, 50 cm/hr o más, 100 cm/hr o más, 125 cm/hr o más, 150 cm/hr o más, 175 cm/hr o más, 200 cm/hr o más, 400 cm/hr o más, 600 cm/hr o más, 800 cm/hr o más o 1000 cm/hr o más. La cantidad de mAb que se carga a la columna puede ser de 0,1 g/L o más, 0,5 g/L o más, 1 g/L o más, 2 g/L o más, 4 g/L o más, 5 g/L o más, 6 g/L o más, 7 g/L o más, 8 g/L o más, 9 g/L o más, 10 g/L o más, 11 g/L o más, 12 g/L o más, 13 g/L o más, 14 g/L o más, 15 g/L o más, 20 g/L o más, 25 g/L o más o 30 g/L o más. La columna puede utilizar, p. ej . , un único gradiente de sal en aumento para la elución pico con, p. ej . , 20 o menos volúmenes de columna (CV) , 15 o menos CV, 14 o menos CV, 13 o menos CV, 12 o menos CV, 11 o menos CV, 10 o menos CV, 9 o menos CV, 8 o menos CV, 7 o menos CV, 6 o menos CV, 5 o menos CV, 4 o menos CV o 3 o menos CV. El gradiente de sal puede ser, p. ej . , menor a alrededor de un volumen de 0.5 mM de sal/columna, entre un volumen de alrededor de 0.5 mM de sal/columna y un volumen de alrededor de 5 mM de sal/columna, un volumen de alrededor de 0.5 mM de sal/columna, un volumen de 0.6 mM de sal/columna, un volumen de 0.7 mM de sal/columna, un volumen de 0.8 mM de sal/columna, un volumen de 0.9 mM de sal/columna, un volumen de 1 mM de sal/columna, un volumen de 1.2 mM de sal/columna, un volumen de 1.4 mM de sal/columna, un volumen de 1.6 mM de sal/columna, un volumen de 1.8 mM de sal/columna, un volumen de 2 mM de sal/columna, un volumen de 3 mM de sal/columna, un volumen de 4 mM de sal/columna, un volumen de 5 mM de sal/columna o mayor a un volumen de 5 mM de sal/columna.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Las figuras 1A y IB muestran una comparación de la separación de isoformas de disulfuro del mAbl mediante CEX con pH bajo (=5) usando el método estándar (WCX Dionex; fig. 1A) y el método de SCX descrito en la presente (fig. IB) . Esta comparación se realizó utilizando columnas por tamaño analíticas (4.6x300 mm para Dionex y 4.6x100 mm para SCX YMC) en un HPLC de Agilent 1100. Tal como se muestra, la columna de SCX YMC logró proporcionar una resolución adicional de las isoformas en relación a la columna de WCX Dionex.

La figura 2 muestra el porcentaje de isoformas de disulfuro del mAbl (especies de isoformas indicadas en la leyenda) en las fracciones de intercambio catiónico (número de la fracción en el eje x) recolectadas de una columna de SCX YMC de 500 mL. Las fracciones se recolectaron luego de una inyección de 1 gramo de material del mAbl y gradiente de sal/pH (aumento de sal y disminución del pH con un número de fracción mayor) . Tal como se muestra, el contenido de IgG2-B fue el más elevado en las primeras fracciones, mientras que el de IgG2-A/B y -A fue el mayor en las fracciones posteriores. El orden de elución del primero al último fue IgG2-B, IgG-A/B e IgG2-A. El porcentaje de las isoformas se determinó mediante la HPLC de fase inversa.

Las figuras 3A, 3B, 3C y 3D muestran cromatogramas de fase inversa de fracciones de CEX del mAbl separadas usando la columna de SCX YMC BioPro SP-F (fig. 2) . El volumen de mAbl se muestra en la Fig. 3A. Las fracciones de CEX con elución más temprana (figs. 3B y 3C) contenían picos altamente enriquecidos -1 y 2, respectivamente (IgG2-B e IgG2-A/B, respectivamente) , mientras que las fracciones con elución posterior (fig. 3D) contenían picos altamente enriquecidos -3 y 4 (especie IgG2-A) .

La figura 4 muestra cromatogramas de fase inversa del volumen de mAbl (línea continua) y la fracción de elución de la proteína L (línea cortada) . El material del volumen de mAbl se cargó en una columna de cromatografía Pierce semi-preparativa de 5 mL (PN-89929) y se eluyó con un amortiguador de 100 mM de glicina con un pH de 2.8. La fracción recolectada se inyectó en una columna de fase inversa. Se logró un enriquecimiento significativo de las especies de IgG2-A/B e IgG2-A utilizando el método de columna de afinidad a la proteína L.

La figura 5 muestra un diagrama de purificación mediante cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) para el mAbl, registrado en un sistema AKTA equipado con una columna de proteína L usando un método de unión y elución. El material del mAbl se cargó en una columna preparativa de proteína L de 24 mL. El mAbl se diluyó en PBS con un pH de 7.2 (1:1) y se cargó en la columna. El amortiguador del proceso fue PBS con un pH de 7.2 y el amortiguador de elución fue 100 mM de glicina con un pH de 2.8. El pH se muestra con la línea gris y corresponde a las unidades de pH en el eje y. Los datos muestran que la columna no retuvo la mayoría del mAbl y este se retiró mediante el lavado. El material del mAbl retenido se eluyó a un pH bajo (-4.2) y se recolectó para análisis.

Las figuras 6A y 6B muestran cromatogramas de fase inversa del volumen de mAbl (línea continua de color gris) y el material de flujo continuo de proteína L (fig. 6A, línea cortada) y el material de elución (fig. 6B, línea cortada; el volumen de mAbl se muestra en la fig. 6B como una línea continua de color negro) . El material del volumen de mAbl se cargó en una columna de FPLC preparativa con 24 mL de proteína L y se eluyó con un amortiguador de 100 mM de glicina con un pH de 2.8. Las fracciones recolectadas se intercambiaron con amortiguador y se inyectaron en una columna de fase inversa. Se logró un enriquecimiento significativo de las especies de IgG2-B e IgG2-A utilizando el método de columna de afinidad a la proteína L.

Las figuras 7A, 7B y 7C muestran cromatogramas de fase inversa de las fracciones de proteína L generadas mediante purificación por FPLC (AKTA) y separación de otro anticuerpo de la IgG2 mAb2. El material del mAb2 se cargó en una columna preparativa con 24 mL de proteína L luego de la dilución en PBS con un pH de 7.2 (1:1). El amortiguador del proceso fue PBS con un pH de 7.2 y el amortiguador de elución fue 100 mM de glicina con un pH de 2.8. A diferencia del caso del mAbl, no se detectó ninguna proteína en el flujo continuo, lo cual indica que se mantuvieron todas las isoformas de disulfuro del mAb2. Las fracciones eludidas se analizaron mediante HPLC de fase inversa. El material en volumen del mAb2 contenía las isoformas B, A/B, Al y A2 (fig. 7A) . Las IgG2-B y A/B se eluyeron primero a medida que se disminuyó el pH (fig. 7B) . Las especies de IgG2-A (Al y A2) se eluyeron cuando el pH alcanzó ~3 (fig. 7C) .

Las figuras 8A, 8B y 8C muestran cromatogramas de fase inversa de las fracciones de proteína L luego de la purificación por FPLC (AKTA) y separación del mAb3. El material del mAb3 se cargó en una columna de proteína L de 275 mL. El amortiguador del proceso fue 25 mM de MOPS con un pH de 6.5 y el amortiguador de elución fue 100 mM de glicina con un pH de 2.8. No se detectó ninguna proteína en el flujo continuo, lo cual muestra que se mantuvieron todas las isoformas de disulfuro del mAb3. Las fracciones eluidas se analizaron mediante análisis de fase inversa. El material en volumen de mAb2 contenía las isoformas B, A/B, Al y A2 (fig. 8A) . Las IgG2-B y A/B se eluyeron primero a medida que se disminuyó el pH (fig. 8B) . Las especies de IgG2-A (Al y A2) se eluyeron cuando el pH alcanzó ~3 (fig. 8C) .

Las figuras 9A, 9B y 9C muestran cromatogramas de fase inversa de las fracciones de proteína L luego de la purificación mediante FPLC (AKTA) y la separación del mAb3 , utilizando amortiguadores diferentes a los que se utilizaron en los experimentos que se muestran en las figuras 8A, 8B y 8C. El material del mAb3 se cargó en una columna preparativa grande de proteína L de 275 mL. Los amortiguadores del proceso fueron amortiguadores suaves de unión de Ag/Ab y elución que permiten una elución con pH casi neutro. No se detectó ninguna proteína en el flujo continuo, lo cual muestra que se mantuvieron todas las isoformas de disulfuro del mAb3. Las fracciones eluidas se analizaron mediante HPLC de fase inversa. El material en volumen del mAb3 contenía las isoformas B, A/B, Al y A2 (fig. 9A) . Las IgG2-B e IgG2-A/B se eluyeron primero a medida que se disminuyó el pH hasta pH levemente ácido (fig. 9B) . Las especies de IgG2-A (Al y A2) se eluyeron cuando el pH alcanzó ~3 (fig. 9C) .

La fig. 10 muestra un ensayo de unión por cromatografía de exclusión por tamaño para las fracciones enriquecidas del mAbl-B y mAbl-A y el material de control HP-6014 de la IgG2 anti -humano. El material del mAbl-B y mAbl-A es -65 % puro en comparación con cada isoforma. Tal como se muestra, el material enriquecido en la isoforma IgG2-A tiene una unión casi completa, mientras que el material enriquecido en IgG2-B se mantuvo principalmente sin unión.

La fig. 11 muestra un ensayo de unión por cromatografía de exclusión por tamaño para las fracciones enriquecidas del mAb2-B y mAb2-A y el material de control HP-6014 de la IgG2 anti-humano. El material del mAb2-B y mAb2-A es -65 % puro en comparación con cada isoforma. Tal como se muestra, el material enriquecido en la isoforma IgG2-A tiene una unión casi completa, mientras que el material enriquecido en IgG2-B se mantuvo principalmente sin unión.

La fig. 12 muestra un ensayo de unión por cromatografía de exclusión por tamaño para las fracciones enriquecidas del mAb7-B y mAb7-A y el material de control HP-6014 de la IgG2 anti-humano. El material del mA 7-B y mA 7-A es -65 % puro en comparación con cada isoforma. Tal como se muestra, el material enriquecido en la isoforma de la IgG2-A tiene una unión casi completa, mientras que el material enriquecido en la IgG2-B se mantuvo principalmente sin unión.

La fig. 13 muestra un ensayo de unión por cromatografía de exclusión por tamaño para la isoforma del mAbl-B, la isoforma del mAbl-A y el HP-6002 anti-IgG2. El material del mAbl-B y mAbl-A es -65 % puro en comparación con cada isoforma. Tal como se muestra, todas las isofor as tuvieron una unión similar al clon de IgG2 anti-humano HP-6002.

La fig. 14 muestra un ensayo de unión por cromatografía de exclusión por tamaño para la isoforma del mAb7-B, la isoforma del mAb7-A y el HP-6002 anti-IgG2. El material del mAb7-B y mAb7-A es ~65 % puro en comparación con cada isoforma. Tal como se muestra, todas las isoformas tuvieron una unión similar al clon de IgG2 anti-humano HP-6002.

Las figuras 15A, 15B y 15C muestran cromatogramas de fase inversa de las fracciones del mAb3 luego de la purificación mediante FPLC (AKTA) y la separación mediante HP-6014 de IgG2 anti-Hu inmovilizado. El material del mAb3 se cargó en una columna de afinidad a la IgG2 anti-Hu. El amortiguador del proceso fue PBS con un pH de 7.2 y el amortiguador de elución fue 100 mM de glicina con un pH de 2.8. Las fracciones eluidas se analizaron mediante HPLC de fase inversa. El material en volumen del mAb2 contenía las isoformas B, A/B, Al y A2 (fig. 15B) . La mayoría del mAb3 no se mantuvo en la columna y se eluyó en el F/T (fig. 15A) . El material del mAb3 retenido se eluyó a un pH bajo (-3.8) y se recolectó para análisis. Las especies de IgG2-A (Al y A2) se eluyeron cuando el pH alcanzó -3.8 y fueron los principales componentes retenidos (fig. 15C) .

La figura 16 muestra un diagrama de flujo del enriquecimiento de las isoformas de disulfuro de la IgG2 del mAbl B, A/B, Al y A2.

La figura 17 muestra un diagrama de flujo del enriquecimiento de las isoformas de disulfuro de la IgG2 del mAb7 B, A/B y A.

La figura 18 muestra un cromatograma de elución de la IgG2 de una columna preparativa de intercambio catiónico de 7 cm (carga de resina de 12 g/L, detección a 280 nm) .

La figura 19 muestra la separación de la isoforma de disulfuro de la IgG2 mediante CEX preparativo. La línea continua corresponde a la concentración de la IgG2 en las fracciones de elución, las líneas cortadas y punteadas corresponden al área pico porcentual de las isoformas de disulfuro medida en cada fracción.

La figura 20 muestra un cromatograma de elución de la IgG2 de una columna preparativa de intercambio catiónico de 10 cm (carga de resina de 2.1 g/L, detección a 280 nm) .

La figura 21 muestra la separación de la isoforma de disulfuro de la IgG2 mediante CEX preparativo. La línea continua corresponde a la concentración de IgG2 en las fracciones de elución, las líneas cortadas y punteadas corresponden al área pico porcentual de las isoformas de disulfuro medida en cada fracción.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION De iniciones Los términos "polipéptido" o "proteína" se utilizan de manera intercambiable en la presente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos también se aplican a polímeros de aminoácidos donde uno o más residuos de aminoácidos es un análogo o mimético de un aminoácido de origen natural, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural. Los términos también comprenden polímeros de aminoácidos modificados, p. ej . , mediante la adición de residuos de carbohidratos para formar glicoproteínas , o fosforilados . Los polipéptidos y las proteínas se pueden producir mediante una célula de origen natural y no recombinante o se puede producir mediante una célula genéticamente modificada o recombinante y puede comprender moléculas con la secuencia de aminoácidos de la proteína natural o moléculas con supresiones, adiciones y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de la secuencia natural. Los términos "polipéptido" y "proteína" comprenden específicamente pepticuerpo, proteínas basadas en dominios y proteínas de unión a antígenos, p. ej . , anticuerpos y fragmentos de estos, así como secuencias con supresiones, adiciones y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de cualquiera de los precedentes .

El término "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina intacta de cualquier isotipo o un fragmento de unión al antígeno de esta que puede competir con el anticuerpo intacto por la unión específica al antígeno diana e incluye, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, humanizados, completamente humanos y biespecíficos . Un "anticuerpo" de tal tipo es una especie de proteína de unión a antígenos. Un anticuerpo intacto generalmente comprende al menos dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de longitud completa. Los anticuerpos pueden derivarse solamente de una única fuente o pueden ser "quiméricos", es decir, partes diferentes del anticuerpo se pueden derivar de dos anticuerpos diferentes. Las proteínas de unión a antígenos, anticuerpos o fragmentos de unión se pueden producir en hibridomas, mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos.

El término "material de intercambio catiónico" o "matriz de intercambio catiónico" se refiere a una fase sólida con carga negativa y tiene cationes libres para intercambio con cationes en una solución acuosa que pasa por o a través de la fase sólida. La carga se puede proporcionar mediante unión de uno o más ligandos cargados a la fase sólida, p. ej . , mediante enlace covalente. De manera alternativa o adicional, la carga puede ser una propiedad inherente de la fase sólida. La resina, la matriz o el material de intercambio catiónico se puede colocar o cargar en una columna útil para la purificación de proteínas.

El término "amortiguador" o "solución amortiguada" se refiere a soluciones que resisten los cambios en el pH mediante la acción de su espectro ácido-básico del conjugado.

El término "amortiguador de carga" o "amortiguador de equilibrio" se refiere al amortiguador que contiene la sal o sales que se mezcla con la preparación de proteína para cargar la preparación de proteína a una columna o matriz de cromatografía. Este amortiguador también se utiliza para equilibrar la matriz o columna antes de la carga y para lavar la matriz o columna luego de cargar la proteína.

El término "amortiguador de lavado" se utiliza en la presente para referirse al amortiguador que pasa por una columna o matriz de cromatografía luego de cargar una composición o solución y antes de la elución de la proteína o isoforma de interés. El amortiguador de lavado puede servir para retirar uno o más contaminantes o isoformas no deseadas de la columna o matriz de cromatografía, sin una elución sustancial de la proteína o isoforma deseada.

El término "amortiguador de elución" se refiere al amortiguador utilizado para eluir la proteína o isoforma deseada de una columna o matriz de cromatografía. El pH y/o la concentración de sal de un amortiguador de elución típicamente son diferentes del pH y/o la concentración de sal del amortiguador de carga y/o lavado que se utiliza para cargar o lavar una columna particular, para permitir la elución de las proteínas deseadas de la columna.

Tal como se usa en la presente, el término "solución" se refiere a una solución amortiguada o no amortiguada, incluyendo agua.

El término "lavado" de una matriz de cromatografía significa el pasaje de un amortiguador apropiado por o a través de la matriz de cromatografía.

El término "elución" de una molécula (p. ej . , una proteína, isoforma o contaminante particular) de una matriz de cromatografía significa retirar la molécula de tal material, típicamente mediante el pasaje de un amortiguador de elución por la matriz de cromatografía. El material se recoge típicamente en alícuotas o fracciones a medida que se eluye de la matriz.

El término "pH neutro", salvo que se defina lo contrario en la presente, se refiere a un pH de entre 6.0 y 8.0, preferentemente entre alrededor de 6.5 y alrededor de 7.5.

El término "leventemente ácido", cuando se utiliza en conexión con un amortiguador, solución o similar y salvo que se defina lo contrario en la presente, se refiere a un amortiguador o una solución con un pH de entre alrededor de 4.5 y alrededor de 6.5.

El término "pH bajo" o "ácido", cuando se utiliza en conexión con el pH, un amortiguador, solución o similar y salvo que se defina lo contrario en la presente, se refiere al pH o a un amortiguador o solución con un pH de entre alrededor de 1 y alrededor de 6.5.

El término "contaminante" o "impureza" se refiere a cualquier molécula extraña u objetable, particularmente una macromolécula biológica como un ADN, un ARN o una proteína sin ser la proteína que se purifica presente en la muestra de una proteína que se purifica. Los contaminantes incluyen, por ejemplo, otras proteínas de células que secretan la proteína que se purifica y proteínas.

El término "separado" o "aislado", tal como se utiliza en conexión con la purificación de proteínas, se refiere a la separación de una proteína o isoforma deseada de una segunda proteína o isoforma o contaminante en una mezcla que comprende tanto la proteína o isoforma deseada y una segunda proteína o isoforma o contaminante, de forma que se retiren al menos la mayoría de las moléculas de la proteína o isoforma deseada de esa parte de la mezcla que comprende al menos la mayoría de las moléculas de la segunda proteína o isoforma o contaminante. Más específicamente, el término "separado" o "aislado" también se utiliza en la presente en conexión con la purificación de proteínas para referirse a la separación de isoformas estructurales diferentes de un anticuerpo de la IgG2 , donde las diferentes isoformas estructurales están caracterizadas por patrones de unión de disulfuro diferentes.

El término "purificar" o "purificación" de una proteína o isoforma deseada de una composición o solución que comprende la proteína o isoforma deseada y uno o más contaminantes o isoforma(s) no deseada (s) significa un aumento del grado de pureza de la proteína o isoforma deseada en la composición o solución mediante eliminación (completa o parcial) de al menos un contaminante (p. ej . , isoforma no deseada) de la composición o solución.

El término "unir" o "unión" de una molécula a un material de intercambio iónico significa exponer la molécula al material o la matriz de intercambio iónico en condiciones apropiadas (p. ej . , pH y composición de sal/amortiguador seleccionada) , de forma que la molécula se inmovilice de forma reversible en el material o la matriz de intercambio iónico mediante interacciones iónicas entre la molécula y el grupo cargado o los grupos cargados del material o la matriz de intercambio iónico.

Cromatografía por intercambio catiónico La cromatografía por intercambio de iones separa los compuestos según su carga neta. Las moléculas iónicas se clasifican como aniones (con carga negativa) o cationes (con carga positiva) . Algunas moléculas (p. ej . , proteínas) pueden tener tanto grupos aniónicos como catiónicos. Un soporte con carga positiva (intercambiador de aniones) se une a un compuesto con carga general negativa. De manera inversa, un soporte con carga negativa (intercambiador catiónico) se une a un compuesto con carga general positiva. Los expertos en la técnica conocen los medios de intercambio catiónico. Ejemplos de medios de intercambio catiónico se describen, p. ej . , en Protein Purification Methods, A Practical Approach, Ed. Harris ELV, Angal S, IRL Press Oxford, Inglaterra (1989) ; Protein Purification, Ed. Janson J C, Ryden L, VCH-Verlag, Weinheim, Alemania (1989) ; Process Scale Bioseparations for the Biopharmaceutical Industry, Ed. Shukla A A, Etzel M R, Gadam S, CRC Press Taylor & Francis Group (2007), páginas 188-196; Protein Purification Handbook, GE Healthcare 2007 (18-1132-29) y Protein Purification, Principies, High Resolution Methods and Applications (suplemento 2a edición 1998), Ed. Janson J-C y Ryden L, cuyas divulgaciones se incorporan en la presente mediante referencia en su totalidad.

Las matrices de intercambio iónico se pueden dividir adicionalmente en categorías según sean intercambiadores fuertes o débiles. Las matrices de intercambio débil de iones contienen o se derivan de un ácido débil (como un grupo de carboximetilo, p. ej . , de ácido carboxílico (R-COO" ) , que pierde gradualmente su carga a medida que el pH desciende por debajo de 4 o 5. Los grupos iónicos de columnas de intercambio se unen de forma covalente a la matriz de gel y se compensan mediante concentraciones pequeñas de contraiones que están presentes en el amortiguador. Un ejemplo no taxativo del grupo funcional en una columna de CX sería - CH2CH2CH2 02" - Las matrices de intercambio fuerte de iones se cargan (ionizan) en una amplia variedad de niveles de pH debido a que contienen un ácido fuerte (como un grupo sulfopropilo) que se mantiene cargado en un pH entre 1-14. Por lo tanto, la cromatografía por intercambio fuerte catiónico (SCX) utiliza una resina con un grupo funcional derivado de un ácido fuerte, como ácido sulfónico (R-S03H) . Un ejemplo no taxativo del grupo funcional en una columna de SCX sería -CH2CH2CH2S03" .

La cromatografía por intercambio catiónico (CEX) se ha vuelto un método preferido para la purificación de la IgG. Las condiciones relativamente suaves de la solución de amortiguación del CEX ayudan a conservar la estructura natural de la IgG, a la vez que la purifican de las proteínas de la célula hospedadora y las variantes de IgG (Shukla, et ál . , 2006). Las condiciones óptimas para la cromatografía por intercambio iónico de proteínas se logran cuando el pH del amortiguador de elución se encuentra dentro de una unidad de pH del pl de la proteína. Con valores de pl promedio de las moléculas de IgG en el intervalo de 7 a 8.5, los amortiguadores relativamente suaves (pH entre levemente ácido y neutro) proporcionan condiciones óptimas para el CEX de las moléculas de IgG con carga positiva (catión) . El CEX se utiliza como una de las etapas de purificación corriente abajo para las moléculas de IgG recombinantes mediante eliminación de los contaminantes de la proteína de la célula hospedadora (células de ovario de hámster chino) (Shukla, et ál . , 2006) , especies desamidadas de la molécula de IgG (Harris, et ál., 2001; Basey, et ál., patente estadounidense n.° 7,074,404) y otras variantes de proteínas. Si bien el CEX se ha vuelto de uso común en la industria biotécnica para la purificación de mAbs de IgG, la purificación de isoformas de disulfuro de la IgG2 mediante CEX solo ha tenido un éxito marginal, especialmente a nivel analítico.

Las isoformas de disulfuro de la IgG2 se enriquecieron previamente para la caracterización bioquímica y biofísica utilizando un intercambio catiónico débil con pH bajo (~5) ( ypych, et ál . , 2008). En general, la cromatografía por CEX resuelve diferencias químicas y estructurales relativamente sutiles en las proteínas según las diferencias en la carga superficial general de la molécula. Para las isoformas de disulfuro de la IgG2, la estructura tridimensional de cada isoforma crea una carga superficial única que permite una resolución parcial mediante cromatografía por WCX. Uno de los desafíos de utilizar esta técnica para el enriquecimiento de la isoforma de disulfuro es que otras variantes de proteína o modificaciones postraducción (desamidación, adición, glicación, modificaciones en los extremos -C y -N, etc.) a menudo se separan y enriquecen en las mismas fracciones recogidas que las isoformas de disulfuro. Estudios anteriores identificaron al WCX como la única técnica de cromatografía no desnaturalizante que puede separar las isoformas de disulfuro de la IgG2 a una escala semi-preparativa. Si bien se ha mostrado que el WCX funciona marginalmente bien en la producción de fracciones moderadamente puras de las isoformas "A" y "B", esta técnica en general no logra resolver "A/B" y otras subespecies de las isoformas de disulfuro. Por ejemplo, los anticuerpos lambda de la IgG2 han demostrado estar compuestos principalmente (>95 %) por las isoformas "A/B" y "A" (Wypych, et ál . , 2008; Dillon, et ál . , 2008), por lo que hacen que sea especialmente difícil resolver la especie poco abundante "B" utilizando WCX.

Los experimentos detallados en la presente documentan el desarrollo de un nuevo proceso, basado en el SCX, que dio como resultado un mayor rendimiento de las isoformas de disulfuro de la IgG2 de alta pureza. El proceso de SCX luego se combinó con novedosas tecnologías de separación adicionales para aumentar el proceso de purificación corriente abajo. Los ejemplos de medios de intercambio catiónico fuerte (SCX) comerciales útiles con los métodos de la presente invención incluyen los siguientes de GE Healthcare: SP-Sepharose FF, SP-Sepharose BB, SP-Sepharose XL, SP-Sepharose HP, Mini S, Mono S, Source 15S, Source 30S, Capto S, MacroCap SP, Streamline SP-XL, Streamline CST-1 (una resina de modos múltiples, pero con un componente de CEX fuerte); resinas de Tosohaas : Toyopearl Mega Cap TI SP-550 EC, Toyopearl Giga Cap S-650M, Toyopearl 650S, Toyopearl SP650S, Toyopearl SP550C; resinas de JT Baker: Carboxi-Sulfón-5 , 15 y 40 um, Sulfónica-5 , 15 y 40 um; de Applied Biosystems : Poros HS 20 y 50 um, Poros S 10 y 20 um; de Pall Corp: S Ceramic Hyper D; resinas de Merck GgA: Fractogel EMD S03, Fractogel EMD SE Hicap, Fracto Prep S03; resina de Biorad: Unosphere S. Fuentes adicionales de materiales para cromatografía por intercambio catiónico fuerte incluyen, p. ej . , Mustang S (disponible de Pall Corporation, East Hills, N.Y., USA), Partisphere SCX (disponible de Whatman pie, Brentford, Reino Unido) , resina YMC-SCX 30 µt? de YMC Co . , Ltd., Allentown, PA. y cualquier metacrilato reticulado modificado con grupos S03 , como el Fractogel EMD S03 previamente mencionado.

Proteína L La proteína L es una proteína de la pared celular bacteriana de origen natural que presenta especificidad para la IgG (Kastern, W., et ál . , (1990), Infect . Immun. 58, 1217-1222) , similar a la proteína A (Forsgren, A. y Sjoquist, J. (1966)) y la proteína G (Bjorck, L. y Kronvall, G. (1984)). Si bien estas proteínas han desmostrado que se unen a las moléculas de IgG con gran afinidad, la proteína L es única en el sentido de que se une específicamente a la cadena ligera (LC) de la IgG muy próxima a la interfaz Fab - Fe (bisagra) . Esto difiere de la proteína A y G que se unen a la parte de Fe inferior de las cadenas pesadas en la interfaz CH2-CH3. Los estudios han mostrado que los principales sitios de unión de la proteína L se encuentran en los dominios variables de la LC de la IgG (Nilson, et ál . , 1992) . Más específicamente, la proteína L ha mostrado que se une solamente a la LC kappa de los subgrupos V I , VKIII y VKIV. Los experimentos detallados en la presente indican que la proteína L puede unirse de forma diferencial a las isoformas individuales de disulfuro de la IgG2.

En la práctica de los métodos detallados en la presente se puede utilizar cualquiera de una cantidad de columnas de proteína L diferentes, incluyendo, por ejemplo, la resina de afinidad a la proteína L de Pierce de Thermo Scientific Pierce, Rockford, Illinois) .

Matriz de afinidad a la IgG2 Comúnmente se desarrollan anticuerpos contra proteínas recientemente descubiertas para su uso como inmunorreactivos . Se crearon y analizaron múltiples clones específicos para la IgG2 para determinar la especificidad de dominio. Los experimentos realizados para avalar la presente invención indican que el anticuerpo HP-6014 (Harada, et ál . , 1991; Harada, et ál . , 1992) y los anticuerpos con un epítopo similar se pueden utilizar para diferenciar las isoformas de disulfuro de la IgG2 en relación con la purificación del anticuerpo de la IgG2.

Integración Los métodos descritos en la presente se crearon para separar de forma eficaz las isoformas de disulfuro de la IgG2 utilizando cromatografía por SCX, una columna de proteína L y/o una columna de afinidad a la isoforma de la IgG2 anti-humana novedosa que puede separar las isoformas de disulfuro de la IgG2. Estas técnicas proporcionaron mejoras significativas en la pureza de las isoformas individuales, así como un aumento considerable en el rendimiento. Para muchos estudios de caracterización es deseable contar con casi 100 % de pureza de la variante requerida. En los estudios descritos en la presente, cuando se utiliza una única técnica de purificación se puede obtener -75-85 % de pureza de una isoforma deseada. Cuando se combinan dos o tres de las técnicas, es posible obtener un 90-100 % de pureza de las isoformas. Los expertos en la técnica pueden utilizar los métodos tal como se detalla en la presente para purificar de forma similar las isoformas de cualquier mAb de la IgG2. A modo de ejemplo, el diagrama de flujo de la fig. 16 describe la aplicación combinada de estas tecnologías para producir fracciones de alta pureza de las isoformas de disulfuro del mAbl . Se implementaron diversas combinaciones diferentes de las tres columnas para mejorar la pureza de la isoforma deseada de la IgG2 (fig. 16) . Las combinaciones de estas columnas y técnicas de separación individuales se han aplicado con éxito a una cantidad de mAbs , incluyendo el mAbl, mAb2 , mAb3 , mAb4 , mAb5, mAb7, mAb9, mAblO y mAbll.

Adicionalmente , el experto en la técnica puede aplicar tales combinaciones a cualquier mAb de la IgG2. Por ejemplo, se utilizó un enfoque un tanto diferente en el caso del mAb7, ya que la proteína L tenía la capacidad de unirse al mAb con cadena ligera Vkll. Tal como se muestra en la Tabla 1 a continuación, el mAb7 utilizó intercambio catiónico como columna de partida para la purificación de las isoformas B y A/B y la columna de afinidad a la IgG2 anti-hu para la isoforma A. La uso de las diferentes propiedades de unión de cada columna permitió que se preparara material con una pureza extremadamente alta (95-100 %) relativamente a gran escala. En resumen, la estrategia de columnas múltiples descrita en la presente funcionó bien para todos los mAb de la IgG2 analizados, pero el experto en la técnica puede utilizar algún método de optimización cuando se aplican los métodos a otros mAb de la IgG2.

La tabla 2 a continuación muestra un resumen cualitativo de los datos descritos en la presente en un formato que se puede utilizar como referencia para las propiedades generales de unión de la isoforma de disulfuro de la IgG2.

Tabla 2. Especi icidad de reconocimiento de las isoformas de disulfuro de la IgGl, IgG2 e IgG2 humana para la cromatografía por intercambio catiónico (CEX) y las diferentes proteínas y anticuerpos. +/- se observaron la unión y no unión para las diferentes IgG'2 Una de las aplicaciones o los usos de las técnicas descritas es para obtener isoformas de mayor pureza para evaluar su potencia y otros parámetros. Otra aplicación o uso es para obtener material en volumen con porcentajes predeterminados definidos de las isoformas. Esto es útil para permitir una mejor capacidad de comparación de los materiales en volumen para los ensayos clínicos, el uso comercial y los diferentes procesos de producción. Por ejemplo, los métodos descritos en la presente se pueden utilizar en relación con columnas de intercambio catiónico a gran escala preparativa (Shukla et ál . , 2006; Shukla et ál . , 2004) en el procesamiento corriente abajo durante la producción del mAb, con el fin de controlar la abundancia relativa de las isoformas de disulfuro de la IgG2. Para producir material en volumen con porcentajes de isoformas definidos, el proceso de purificación puede dar como resultado la recolección de fracciones limitadas de CEX. El volumen de elución límite o tiempo límite se puede ajustar posteriormente, p. ej . , una medición en línea de la abundancia de isoformas mediante un ensayo de RP-HPLC. El uso combinado, p. ej . , de un ensayo rápido de RP-HPLC (p. ej . , procesamientos de 2-3 minutos) y CEX durante el proceso de purificación corriente abajo es una forma de implementar un control de fabricación para las isoformas de la IgG2.

Los métodos de la presente invención se pueden utilizar durante la producción para separar y purificar las isoformas individuales de disulfuro de la IgG2-A e IgG2-B, p. ej . , en gramos y kilogramos. Los métodos también se pueden utilizar para reconocer y medir la abundancia de las isoformas individuales de la IgG2, p. ej . , en la sangre de pacientes, con fines diagnósticos en nanogramos y microgramos. Adicionalmente, las isoformas diferentes de disulfuro (p. ej . , B, A/B, Al, A2 ) se pueden aislar de forma que la potencia, estabilidad, tendencia a la adición, otras características de las isoformas de disulfuro se puedan evaluar, p. ej . , durante la producción de proteínas.

La proporción general de isoformas de disulfuro del mAb (p. ej . , sustancia de fármaco) se puede modificar, p. ej . , de la siguiente forma: (a) comenzando la recolección en un punto posterior en el pico de elución del intercambio catiónico para cambiar la proporción a menos de la forma B y más de las formas Al, A2 + la forma A/B, (b) deteniendo la recolección en un punto anterior en el pico de elución del intercambio catiónico para cambiar la proporción a menos de las formas Al, A2 y más de la forma B + la forma A/B, (c) comenzando la recolección en un punto posterior y deteniendo la recolección en un punto anterior, recolectando la parte media del pico de elución del intercambio catiónico para tener más de la forma A/B y menos de las formas B, Al y A2 , y/o recolectando y agrupando las fracciones frontal y trasera del pico de elución del intercambio catiónico para tener menos de la forma A/B y más de las formas B, Al y A2.

También se pueden retirar los reactivos de redox agregados al mAb en solución para cambiar la proporción de las isoformas de disulfuro uniendo el mAb a la resina de intercambio catiónico, lavando para retirar los reactivos de redox sin unión restantes y luego eluyendo. De manera alternativa o adicional, el mAb se puede unir a la resina de intercambio catiónico, lavar con reactivos de redox en condiciones de amortiguación para permitir cambios en las isoformas de disulfuro, luego lavar para retirar los reactivos de redox y finalmente eluir.

Adaptación de métodos de SCX a escala preparativa a diferentes anticuerpos La producción a escala preparativa puede incluir columnas con un volumen mayor a, p. ej . , 5 mi, un mayor tamaño de perla de resina (p. ej . , perlas de 30 micrones) , columnas con diámetros mayores (p. ej . , 7 cm o mayores), mayores velocidades de flujo (p. ej . , -100 cm/hr) , mayor carga (p. ej . , > 2 g/L, > 12 g/L) , un gradiente único, relativamente corto (p. ej . , 10 CV o menos) y/o superficial a muy superficial (p. ej . , volumen de sal/columna de 1 a 2 mM) de mayor sal para la elución pico. En algunas modalidades, la producción a escala preparativa se caracteriza mediante un gradiente único, relativamente corto, superficial de mayor sal y mayor carga de resina (p. ej . , >2 g de mAb/L, > 4 g de mAb/L, > 6 g de mAb/L, >8 g de mAb /L, >10 g de mAb/L, > 12 g de mAb/L, >15 g de mAb/L o >30 g de mAb/L) .

Tal como se sugiere en los ejemplos 10 y 11, el gradiente de elución utilizado en una aplicación a escala preparativa de la invención se puede optimizar para diferentes mAbs . A continuación describe un método que permite lograr esto. El gradiente se puede explorar primero en una columna de intercambio catiónico a escala de laboratorio (p. ej . , diámetro de 1 cm o menor, con una altura de lecho similar a la columna preparativa) utilizando un amortiguador con un pH de 5.0 a 5.2 sin adición de sal como amortiguador A y un amortiguador con un pH de 5.2 a un pH de 4.5 con 250 mM o 400 mM de NaCl o más agregado como amortiguador B. Debe buscarse que el pH del amortiguador A sea similar al pH de la carga de anticuerpo monoclonal (sustancia de fármaco o grupo anterior del proceso) y podría ser algo mayor o menor a un pH 5 si resulta necesario o si se desea. Luego de equilibrar con el amortiguador A, la columna de exploración se puede cargar con 0.5 a 2 mg de mAb por itiL de lecho de resina cargado. El mAb se puede diluir según sea necesario con amortiguador A hasta un volumen conveniente para la carga, p. ej . , volumen de columna (CV) de uno o según sea necesario para reducir la conductividad y permitir la unión a la resina de intercambio catiónico. Luego de la carga, la columna de exploración se puede lavar brevemente (1 a 3 CV) con el amortiguador A, luego se puede aplicar a la columna un gradiente largo (20 a 50 CV) de 0 % a 100 % de B (o 10 % a 90 % de B o 20 % a 80 % de B) . Si el gradiente largo comienza a un % de B mayor al 0 %, el lavado luego de la carga en la etapa anterior se realiza típicamente como un gradiente corto (1 a 3 CV) de 0 % de B hasta el % de B de partida deseado para el gradiente largo, por ejemplo, de 0 % de B a 10 % de B en 2 CV para un gradiente largo que comience en 10 % de B.

La detección de la elución pico del mAb se realiza mediante absorbancia de 280 nm. El % de amortiguador B al que comienza a eluirse el mAb se fija como inicio del gradiente de elución para la columna preparativa. El % de amortiguador B al que se eluye la mayoría o todo el mAb (el lado trasero del pico) se fija como el % de B final para el gradiente de elución de la columna preparativa. El objetivo es determinar un gradiente superficial de alrededor de 1 a 2 mM de NaCl por CV para la elución de la columna preparativa. Si se desea, luego del procesamiento de exploración de elución prolongado se puede realizar un procesamiento de prueba del gradiente de elución preparativo en la columna de exploración utilizando los mismos amortiguadores y carga que para el primer procesamiento de exploración descrito anteriormente. En el procesamiento de prueba, luego de la carga se realiza un lavado corto (1 a 3 CV) del 0 % de B al % de B de partida diana, seguido por un gradiente de 10 CV (que podría ser más breve o más prolongado según se desee) desde el % de B de partida hasta el % de B final para la elución del mAb, para proporcionar un gradiente de alrededor de 1 a 2 mM de NaCl por CV. Si se desea una elución isocrática, esa concentración de amortiguador de elución también se podría determinar a partir del gradiente de exploración. Es posible que para algunos mAb y condiciones un gradiente más pronunciado (mayor a 2 mM de NaCl por CV) también proporcionaría la resolución deseada de las isoformas de disulfuro.

La columna preparativa se puede cargar desde alrededor de 2 g de mAb por L de resina cargada hasta 12 g de mAb por L de resina cargada o más, por ejemplo, dependiendo de las características del mAb o la resolución de isoformas de disulfuro necesaria, la columna se podría cargar con una cantidad mayor de mAb (como 30 g/L o más) o se podría ciclar. La columna preparativa se equilibra y procesa con las mismas composiciones de amortiguador A y B que se utilizaron en los procesamientos de gradiente de prueba y exploración de gradiente prolongado. En general, la columna se preequilibra primero con algunos volúmenes de 100 % de amortiguador B, luego se equilibra con suficiente 100 % de amortiguador A. La carga de mAb se diluye con amortiguador A hasta un volumen conveniente para la manipulación de líquidos o hasta una conductividad suficientemente baja para la unión a la resina de intercambio catiónico. La carga de mAb también se puede preparar para carga mediante otros métodos como ultrafiltración/diafiltración para intercambio de amortiguadores si se necesita o prefiere. Luego de la carga, la columna se lava con un gradiente de 1 a 3 CV desde 0 % de amortiguador B hasta el % de partida diana de amortiguador B para la elución. Luego el gradiente de elución determinado en el procesamiento de prueba o exploración de gradiente prolongado se puede aplicar a la columna. Este gradiente es generalmente de alrededor de 1 a 2 mM de NaCl por volumen de columna. La elución del mAb se detecta mediante absorbancia a 280 nm. Las fracciones se pueden recolectar para un ensayo posterior mediante RPHPLC para las isoformas de disulfuro o el inicio y la pausa de la recolección se puede controlar mediante A280nm o PAT. Si se desea, las fracciones específicas se pueden diluir con amortiguador A y volver a aplicar a la columna de intercambio catiónico para un enriquecimiento adicional de una isoforma de disulfuro particular.

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Los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos que se llevaron a cabo y los resultados obtenidos, se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitación del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

EJEMPLO 1 Comparación de resinas de WCX y SCX para el enriquecimiento de isoformas de la IgG2 de mAbl usando columnas analíticas Se realizó una comparación entre una columna de WCX estándar (ProPac WCX-10, 250 x 4.6 mm, P/N 54993, Dionex Corp., Sunnyvale, CA) y una columna de SCX (BioPro-SP, 100 x4.6 mm, 5 um, P/N SF00S05-1046WP, YMC Co., Ltd., Allentown, PA) usando amortiguadores con pH bajo (~5) utilizados en un sistema analítico de HPLC Agilent 1100. La proteína se cargó a un pH de ~5 y se eluyó usando una sal y gradiente de pH. La resina de SCX proporcionó una mejor resolución de isoformas de disulfuro de mAbl usando estas columnas de escala analítica (fig. 1) . De hecho, se logró la separación superior de las isoformas de disulfuro de la IgG2 usando una columna YMC-SCX de 4.6x100 mm con resina de 5 µp? versus una columna Dionex de 4.6x250 mm con resina de 10 µ??. Este fue un resultado sorprendente e inesperado ya que generalmente se espera que las columnas más largas mejoren la resolución cromatográfica de las biomoléculas . En este ejemplo, la columna más corta (100 mm) con resina de SCX mostró resultados superiores en comparación con la columna más larga (250 mm) con la resina de CX. Esto se atribuyó a una mayor capacidad y fuerza de separación de la columna de SCX YMC BioPro SP-F en comparación con la resina de WCX descrita anteriormente.

EJEMPLO 2 Reconocimiento y separación de CEX de isoformas de disulfuro de la IgG2 usando columna preparativa Para evaluar si la resina de SCX podría proporcionar resolución similar de isoformas de disulfuro de la IgG2 a una escala preparativa, se cargó una columna FPLC de 500 mL más grande usando la resina de YMC-SCX de 30 µp? (YMC-BioPro S30, P/N SPA0S30, YMC Co . , Ltd., Allentown, PA) . La proteína se cargó usando una concentración apropiada de sal de NaCl de 100 mM y pH 5.2. Luego se usó una elución de gradiente con mayor concentración de sal hasta -250 mM y se disminuyó el pH hasta -4.5. La isoforma IgG2-B del mAbl fue la que menos se retuvo y se eluyó en primer lugar de la columna (fig. 2) . A medida que aumentó la concentración de sal y disminuyó el pH, la IgG2-A/B comenzó a eluirse, seguida por la IgG2-A. Se analizaron las fracciones de intercambio catiónico recolectadas mediante un ensayo de HPLC de fase inversa para mostrar un enriquecimiento significativo de isoformas de disulfuro mediante la columna de FPLC con la resina YMC-SCX (fig. 3) . Se ha demostrado que el análisis de fase inversa resuelve las isoformas de disulfuro de la IgG2 en función de sus propiedades hidrofóbicas . En general, se observan cuatro picos distintos para la fase inversa de la IgG2. El orden de elución de las isoformas de disulfuro a partir de la fase inversa es IgG2-B (Pico-1) , IgG2-A/B (Pico-2) e IgG2-A (Pico-3 y 4) . Si bien se ha demostrado que los Picos-3 y -4 contienen la misma conectividad de disulfuro entre cadenas, se cree que la existencia de dos especies mediante fase inversa es el resultado de menores diferencias en la estructura bisagra del núcleo. En esta descripción, las dos especies de IgG-A se diferenciaron indicándolas como Al y A2, con respecto a su orden de elución de NR-RP (fig. 3) . Se cree que este es el primer ejemplo de una isoforma de disulfuro de la IgG2 enriquecida hasta más de 50 % de pureza usando CEX a escala preparativa y carga de IgG2 al nivel de gramos.

EJEMPLO 3 Reconocimiento y separación de proteína L de isoformas de disulfuro de la IgG2 - columna semi -preparativa de 5 mi Se adquirió un cartucho de cromatografía Pierce de 5 mL (PN- 89929) y se instaló en un HPLC Agilent 1100. Los amortiguadores del proceso fueron PBS a pH 7.2 (carga) y 100 mM de glicina a pH 2.8 (elución) . Las muestras se diluyeron en PBS (1:1) y se inyectaron en la columna. La proteína se cargó a pH 7.2 y se eluyó usando un gradiente de pH. La columna de proteína L de 5 mL proporcionó enriquecimiento de las isoformas de disulfuro del mAbl, según se controló mediante HPLC de fase inversa (fig. 4) . La proteína L retuvo con mayor fuerza las especies IgG2-A, por lo que requirió un amortiguador con menor pH para la elución.

EJEMPLO 4 Reconocimiento y separación de proteína L de isoformas de disulfuro de la IgG2 - columna preparativa de 24 mi Se adquirió la resina de afinidad de la proteína L Pierce (24 mL) (Agarosa de proteína L, P/N 20512, Thermo Scientific Pierce, Rockford, Illinois) y se cargó en una columna XK16/20 (columna de cromatografía líquida Bio, P/N 19-0315-01, GE Healthcare, Pittsburgh, PA) . La columna se instaló en un sistema de FPLC AKTA y se utilizó usando los amortiguadores enumerados anteriormente. En una aplicación, se cargó material del mAbl en una columna de proteína L de 24 mL, se eluyó con control mediante detección UV a 214 y 280 nm. No se retuvo una parte grande del material y se lavó rápidamente con el amortiguador utilizado. Se retuvo una parte más pequeña del material del mAbl y luego se eluyó usando un gradiente de pH de pH 7.2 ? 2.8. Las fracciones se recogieron durante toda la separación de la proteína L y se analizaron mediante fase inversa (fig. 6) . Como se observó anteriormente con la columna de la proteína L de 5 mL, las especies de IgG2-A se retuvieron y luego se eluyeron a medida que el pH disminuyó usando la columna de 24 mL (fig. 6B) .

Asimismo, las fracciones de flujo continuo (F/T) mostraron eliminación de las especies IgG2-A del mAbl y, por lo tanto, enriquecimiento del material de la IgG2-B (fig. 6A) . Se encontró la isoforma IgG2-A/B tanto en F/T como en las fracciones eluidas, demostrando propiedades de unión intermedias .

También se analizó el mAb2 usando el mismo procedimiento de separación, como se describe anteriormente para el mAbl. El mAb2 demostró unión a la proteína L pero, a diferencia del mAbl, se retuvieron todas las isoformas. El material del mAb2 comenzó a eluirse de la columna de proteína L a aproximadamente pH 4 (fig. 7B) , con una fracción posterior eluyendo a aproximadamente pH 3 (fig. 7B) . Se analizaron las fracciones mediante HPLC de fase inversa, mostrando la misma tendencia de elución que el mAbl. La IgG2-B fue la que menos se retuvo, seguida de la IgG2-A/B, donde las especies de IgG2-A muestran la mayor afinidad con la proteína L.

EJEMPLO 5 Reconocimiento y separación de proteína L de isoformas de disulfuro de la IgG2 - columna preparativa grande de 300 mi Se cargó una columna de proteína L a mayor escala (~300 mL) y se analizó nuevamente usando mAbl y mAb2 , demostrando resultados comparables. Este formato de columna más grande proporcionó una mayor capacidad de carga de >100 mg de carga, a la vez que separa eficazmente las isoformas de disulfuro de la IgG2. El mAb3 (IgG2- VI) fue otra molécula de IgG2 utilizada para analizar la columna de proteína L a mayor escala.

EJEMPLO 6 Selección del amortiguador óptimo para la purificación de la proteína L Este ejemplo demuestra alcances para seleccionar amortiguadores para purificar y eluir las isoformas de disulfuro deseadas con relación al método de proteína L descrito anteriormente. Por ejemplo, un objetivo fue que no se uniera la forma IgG2-B del mAb2 , de modo que pudiera recogerse en el flujo continuo. Otro objetivo fue alcanzar una elución de pH mayor para la especie IgG2-A, como se observó para el mAbl .

Se evaluaron distintos amortiguadores utilizados en un intento de ajustar las propiedades de unión y elución de las isoformas individuales y reducir las interacciones de proteína no específicas, donde la matriz de columna da como resultado formación de cola de pico. Por ejemplo, era ideal no retener la isoforma IgG2-B del mAb2 en la columna de proteína L y, por lo tanto, recogerla en el flujo continuo. Esto permitió la remoción parcial de esta isoforma del material de elución. Además, era ideal utilizar una elución con H mayor para la especie IgG2-A, ya que un mayor tiempo con pH bajo puede provocar desnaturalización irreversible de la proteína. La selección de amortiguador óptimo para el mAb3 fue: A) 25 mM de MOPS, pH 6.5; B) 100 mM de glicina, pH 2.8. Usando estos amortiguadores, se observó buena resolución de isoforma para el mAb3 (fig. 8) , pero la elución de pH más bajo todavía no era óptima. Por lo tanto, se adquirieron amortiguadores de unión y elución Ag/Ab suaves con composiciones patentadas de Pierce y se analizaron usando el mAb3. Los amortiguadores se enumeraron para proporcionar elución con pH casi neutro a partir de las columnas de proteína L. Tal como se muestra en la figura 9, los amortiguadores de unión y elución Ag/Ab suaves proporc onaron una mayor unión y elución con pH más alto a partir de la columna de proteína L con buena pureza de las fracciones de isoforma. Una desventaja de los amortiguadores de unión y elución Ag/Ab suaves fue mayor contrapresión del sistema de FPLC.

EJEMPLO 7 Reconocimiento y separación de afinidad usando anticuerpos específicos de las isoformas de disulfuro de la IgG2 y SEC Se analizaron clones de mAb IgG2 HP-6002 (específico de Fe; Abcam, Cambridge, MA) y HP-6014 específico de (F(ab)2; Acris Antibodies Inc., San Diego, CA) , para determinar su capacidad de unirse a isoformas de disulfuro de la IgG2 del mAb7, mAb2 y mAbl .

Se compararon fracciones de las isoformas de disulfuro de la IgG2 enriquecido obtenidas usando el método de renaturalización de redox de acuerdo con la patente estadounidense número 7,928,205 (IgG2-A (-65 %) e IgG2-B (-65 %) ) , así como control no enriquecido del material de la IgG2. Las muestras de IgG2 se diluyeron en PBS y se mezclaron con los mAbs de IgG2 anti-humanos a una relación molar de aproximadamente 1:2.5. La relación se eligió para proporcionar al menos dos mAbs anti-humano para una única molécula de la IgG2.

Se dejó que las muestras reaccionaran durante al menos 1 hora antes del análisis. Las muestras se analizaron usando cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) . En SEC, las especies más grandes se eluyen en primer lugar de la columna debido a las menores interacciones con los poros de la fase inmóvil. Por lo tanto, los complejos de las moléculas de IgG2 y IgG2 anti -humano de ratón se eluyeron antes que las moléculas de IgG2 monoméricas que no interactuaban con el anticuerpo de ratón. Los experimentos de unión por SEC usando el clon HP-6014 revelaron la especificidad de este clon para la especie IgG2-A (figs. 10-12) e indicaron la no unión de la especie IgG2-B. Por otro lado, el clon HP-6002 no pudo diferenciar las isoformas de disulfuro, como se muestra mediante los perfiles de SEC similares cuando los materiales enriquecidos con IgG2-A e IgG2-B se incubaron con HP-6002 (figs. 13-14). SEC resolvió las especies que formaron complejo que se eluyen en primer lugar del monómero de IgG que se eluye en último lugar de la siguiente manera. Cuando se incubó el material de IgG2-A del mAb2 , mAb7 y mAbl con HP-6014, la cantidad de especies que forman complejos (fig. 10-14, eluyendo a 30-40 minutos) aumentó con respecto a la incubación de HP-6014 con material de la IgG2 de control. Cuando se incubaron los materiales de la IgG2-B con HP-6014, se observó una disminución significativa de las especies que forman complejos con respecto a la incubación de HP -6014 con el material de IgG2 de control.

Estos resultados indican que hay poca a ninguna unión de IgG2-B a HP-6014 y fuerte unión de IgG2-A a HP-6014. No se reconocieron las propiedades de unión de la IgG2-A/B a partir de estos datos. Una fracción enriquecida con IgG2-A/B no estuvo disponible para el estudio dado que esta isoforma de la IgG2 no se había enriquecido anteriormente mediante el procedimiento de redox (Dillon et ál., 2006b; Dillon et ál . , 2008b). La incubación de todas las muestras con HP-6002 mostró unión equivalente y, por lo tanto, ninguna especificidad para las isoformas de disulfuro de la IgG2 (figs. 13-14) .

EJEMPLO 8 Purificación de la columna de afinidad a HP-6014 Para analizar adicionalmente la capacidad de IgG2 anti-humano HP-6014 de separar las isoformas de disulfuro de IgG2 , se preparó una columna de afinidad usando el protocolo del fabricante de la siguiente manera. Se colocaron 18 mL de Affinity-Gel 15 (agarosa de éster activo 25 mL, Bio-Rad Labs Cat#153-6051) activado con HP-6014 inmovilizado en un tubo de 50 mi y se intercambió con agua desionizada fría tres veces para retirar cualquier posible conservante residual. La matriz de columna se lavó dos veces con 32 mL de 25 mM de HEPES, pH 8.0, y se volvió a suspender (mezclando bien) con 15 mL de 25 mM de HEPES, pH 8.0.

Se preparó un conjunto de columnas con IgG2-UNLB anti- Hu (Clon HP6014; Southern Biotech Cat# 9080-01), 0.5 mg/mL x 20 ea = 10 mg /20 mL en total. Se preparó otro conjunto con reactivo de hibridoma de laboratorio HP6014P (Fab de la IgG2 anti -humana del mAb de la IgGl de ratón) como recipiente de 2 mg/mL x 18 = 36 mg/ 18 mL en total.

Las reacciones se llevaron a cabo en un total de 51 mL, que incluyen 18 mL de Gel Affi-15 + 15 mL de 25 mM de HEPES (pH 8.0) + 36 mg/18 mi de IgG2 anti-Hu, y se incubaron a 4 °C durante dos horas (con mezclado ocasional) . Se dejó reposar la mezcla a temperatura ambiente durante otras dos horas (con mezclado ocasional) . Se controló la eficacia de acoplamiento en cada etapa mediante RP-HPLC de alta resolución rápida (tiempo de gradiente de 10 minutos) . Luego, la reacción se inactivo con 0.1 M de Tris, H 8.0. Los datos representativos se muestran a continuación.

Luego, las columnas se cargaron y enjuagaron con DPBS a pH 7.2 durante ~ 1 hora antes de su uso.

Se acopló IgG2 anti -humana monoclonal de murino (clon HP-6014; Sigma-Aldrich n° de cat . 15635) a medio de cromatografía Affi-Gel como se describe anteriormente y se cargó en una columna XK16/20 (columna de cromatografía líquida Bio, P/N 19-0315-01, GE Healthcare, Pittsburgh, PA) . La columna se instaló en un sistema de FPLC AKTA (GE Healthcare, Pittsburgh, PA) y se procesó a temperatura ambiente. Las muestras se diluyeron en PBS pH 7.2 (1:1), se inyectaron en la columna y se lavaron usando PBS hasta que se alcanzó un nivel inicial estable. La proteína se eluyó usando un gradiente de pH (100 mM de glicina pH 2.8) . El pH de las fracciones recogidas se elevó hasta = 5.0 inmediatamente después de la elución usando un amortiguador apropiado. Se analizó la pureza de las fracciones usando análisis de HPLC de fase inversa (Dillon et ál . , 2008a; Dillon et ál., 2006a).

EJEMPLO 9 Reconocimiento y separación de afinidad usando anticuerpos inmovilizados específicos de las isoformas de disulfuro de la IgG2 - columna preparativa de 24 mL En una aplicación, se cargó material del mAb3 en una columna de afinidad HP-6014 de 24 mL, y se eluyó con control mediante detección UV a 214 y 280 nm (fig. 15) . No se retuvo una parte grande del material y se lavó rápidamente con el amortiguador ejecutado (fig. 15A) . Se retuvo una parte más pequeña del material del mAb3 y luego se eluyó usando un gradiente de pH de pH 7.2 -? 2.8 (fig. 15C) . Las fracciones se recogieron en toda la separación de afinidad IgG2 anti-hu y se analizaron mediante análisis de fase inversa (figs. 15A y 15C) . De manera similar a la 3 separación de la proteína L de mAbl (fig. 5) , las especies de la IgG2-A se retuvieron y luego se eluyeron a medida que el pH disminuyó usando la columna de 24 mL (fig. 15C) . No se observó una cantidad detectable de IgG2-B en la fracción de IgG2-A enriquecida, lo que indica que HP-6014 no presentaba unión o unión leve a la especie de IgG2-B. De manera similar a la Proteína L, las fracciones F/T IgG2 ant i-humana mostraron eliminación de la especie IgG2-A de mAb3 y, por lo tanto, enriquecimiento del material IgG2-B (fig. 15A) . Se observó la isoforma de la IgG2-A/B mayormente en las fracciones F/T, lo que mostró unión leve con respecto a la IgG2-A.

El desarrollo adicional de esta columna ha demostrado que las dos especies IgG2-A (Al y A2) presentan una unión significativamente distinta a la columna de afinidad IgG2 anti-hu. Esto se demostró inyectando (por debajo de la capacidad de la columna) material de IgG2-A de alta pureza (que contiene 60-90 % de Al) en la columna de afinidad de IgG2 anti-hu y recolectando las fracciones de F/T y de elución a pH bajo. El análisis por fase inversa demostró que la IgG2-A2 no se retuvo significativamente cuando hay altos niveles de IgG2-Al presentes. Se cree que la columna de afinidad de IgG2 anti-hu descrita anteriormente es la única técnica que puede separar eficazmente las subespecies IgG2-A Al y A2.

EJEMPLO 10 Cromatografía de intercambio catiónico a escala preparativa - mAb7 cargado a resina cargada de 12 g/L columna de 7 cm de diámetro Se produjo el anticuerpo monoclonal mAb7 a una escala preparativa de la siguiente manera. Se cargó resina de intercambio catiónico S30 YMC BioPro a 21.5 cm de altura de lecho en una columna de 7 cm de diámetro (volumen de columna de 0.83 L) . La columna se equilibró con 3 volúmenes de columna de 250 mM de cloruro de sodio, 10 mM de acetato de sodio pH 5.2 (amortiguador B) seguido de 4 columnas de 10 mM de acetato de sodio pH 5.2 (amortiguador A) . Se cargaron aproximadamente 10.2 g de IgG2 en alrededor de un volumen de columna de amortiguador A en la columna. Luego de la carga, se aplicó a la columna un gradiente de dos volúmenes de columna desde 0 % de amortiguador B hasta 33 % de amortiguador B.

La IgG2 se eluyó con un gradiente de 10 volúmenes de columna desde 33 % de amortiguador B hasta 41 % de amortiguador B, que corresponde a una pendiente de gradiente de 2 mM de cloruro de sodio por volumen de columna. Se recogieron fracciones de 0.3 volúmenes de columna. La fig. 18 muestra un cromatograma de los resultados.

Se analizaron la carga y las muestras de cada fracción para determinar el contenido proteico mediante medición de absorbancia a 280 nm y para las isoformas de disulfuro mediante RPHPLC no reducida. La carga contenía alrededor de 31 % de isoformas de disulfuro B, 36 % de A/B, 22 % de Al y 11 % de A2. La fig. 19 muestra una superposición de la concentración de IgG2 total y las áreas de picos porcentuales para las isoformas de disulfuro B, A/B, Al y A2 para cada fracción. Cabe destacar que las isoformas B están enriquecidas en las fracciones en la parte delantera del pico (fracciones 10 a 15) , y las formas Al y A2 están enriquecidas en las fracciones de la parte trasera del pico (fracciones 18 a 26) . Las propiedades generales de B, A/B, Al y A2 se pueden ajustar en el conjunto eluido seleccionando las fracciones que se agrupan o mediante los criterios de recolección inicial o recolección final para la elución. Las fracciones enriquecidas para determinadas isoformas se pueden seleccionar para obtener enriquecimiento adicional mediante recromatografía en una columna de intercambio catiónico, como el que se usó anteriormente o usando cromatografía adicional mediante otros modos, como cromatografía de afinidad, cromatografía de interacción hidrofóbica o cromatografía de fase inversa.

EJEMPLO 11 Cromatografía de intercambio catiónico a escala preparativa - mAb cargado a resina cargada de 2.1 g/L; columna de 10 cm de diámetro Se produjo un anticuerpo monoclonal a escala preparativa de la siguiente manera. Se cargó resina de intercambio catiónico S30 YMC BioPro a 27 cm de altura de lecho en una columna de 10 cm de diámetro (volumen de columna de 2.12 L) . La columna se equilibró con 3 volúmenes de columna de 400 mM de cloruro de sodio, 10 mM de acetato de sodio pH 4.5 (amortiguador B) seguido de 4 volúmenes de columna de 10 mM de acetato de sodio pH 5.2 (amortiguador A) . Se cargaron aproximadamente 4.5 g de IgG2 en alrededor de 1 volumen de columna de amortiguador A en la columna. Luego de la carga, se aplicó a la columna un gradiente de 2 volúmenes de columna desde 0 % de amortiguador B hasta 55.5 % de amortiguador B.

La IgG2 se eluyó con un gradiente de 7 volúmenes de columna desde 55.5 % de amortiguador B hasta 58.7 % de amortiguador B. Esto corresponde a una pendiente de gradiente de 1.8 mM de cloruro de sodio por volumen de columna. Luego de que se eluyó el pico principal, se procesó un gradiente de 1.8 volúmenes de columna corto de hasta 83 % de amortiguador B, seguido por un salto de hasta 100 % de amortiguador B. Se recogieron las fracciones de alrededor de 0.1 volúmenes de columna. La fig. 20 muestra el cromatograma de intercambio catiónico preparativo.

Se analizaron la carga y las muestras de cada fracción para determinar el contenido proteico mediante medición de absorbancia a 280 nm y para las isoformas de disulfuro mediante RPHPLC no reducida. La carga contenida alrededor de 32 % de isoformas de disulfuro B, 33 % de A/B, 20 % de Al y 15 % de A2. La fig. 21 muestra una superposición de la concentración de IgG2 total y las áreas de picos porcentuales para las isoformas de disulfuro B, A/B, Al y A2 para cada fracción. Se ha demostrado a partir de la fig. 21 que las isoformas B están enriquecidas en las fracciones en la parte delantera del pico (fracciones 3 a 15) , y las formas Al y A2 están enriquecidas en las fracciones de la parte trasera del pico (fracciones 25 a 50) . Las propiedades generales de B, A/B, Al y A2 en el conjunto eluido se pueden ajustar seleccionando las fracciones que se agrupan o mediante los criterios de recolección inicial o recolección final para la elución. Las fracciones enriquecidas para determinadas isoformas se pueden seleccionar para obtener enriquecimiento adicional mediante recromatografía en una columna de intercambio catiónico o usando cromatografía adicional mediante otros modos, como cromatografía de afinidad, cromatografía de interacción hidrofóbica o cromatografía de fase inversa.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (22)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para producir una preparación de anticuerpo de la IgG2 enriquecida para una de varias isoformas estructurales de la IgG2 que difieren por conectividad de disulfuro en la región bisagra del anticuerpo, caracterizado porque comprende (A) poner en contacto una solución que contiene un anticuerpo de la IgG2 producido de forma recombinante con una primera matriz que se selecciona del grupo que consiste en una matriz de intercambio catiónico fuerte (SCX) , una matriz de afinidad a la IgG2 anti-humana y una matriz de proteína L, y (B) eluir dos o más primeras fracciones de elución desde la primera matriz, donde la solución de anticuerpo de la IgG2 que se someterá al método se eluye la primera matriz ya que dos o más formas separadas que corresponden a dos o más isoformas estructurales de la IgG2 , y al menos una de las dos o más primeras fracciones de elución es enriquecida durante al menos una de las isoformas estructurales de la IgG2 que difieren en la conectividad de disulfuro en la región bisagra .

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la matriz de afinidad a la IgG2 antihumana es una matriz de afinidad a HP-6014, que comprende adicionalmente poner en contacto al menos una de las dos o más primeras fracciones de elución con una segunda matriz que se selecciona del grupo que consiste en una matriz SCX, una matriz de afinidad HP-6014 y una matriz de proteína L, y eluir dos o más segundas fracciones de elución de la segunda matriz, donde al menos una de las dos o más segundas fracciones de elución es enriquecida adicionalmente en al menos una de las isoformas estructurales de la IgG2.

3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la primera matriz es una matriz de SCX y la segunda matriz es una matriz de afinidad a HP-6014.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la primera matriz es una matriz de SCX y la segunda matriz es una matriz de proteína L.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la primera matriz es una matriz de afinidad a HP-6014 y la segunda matriz es una matriz de SCX.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la resina de SCX se encuentra en una columna y las isoformas estructurales se aislan en fracciones de eluido de la columna.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque las isoformas estructurales se identifican sometiendo las fracciones a un ensayo de fase inversa.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la matriz de SCX es una resina de SCX YMC de alta capacidad.

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque las isoformas estructurales se seleccionan del grupo que consiste en IgG2-A, IgG2-A/B e IgG2-B.

10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la elución de la primera o segunda matriz se realiza usando un amortiguador de pH bajo.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el amortiguador tiene un pH que se selecciona del grupo que consiste en entre 2 y 3, entre 3 y 4, entre 4 y 5, entre 5 y 6 y entre 6 y 7.

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque los pasos de elución se llevan a cabo usando una elución de pH en etapas.

13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque los pasos de elución se realizan usando una elución de gradiente de pH.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el gradiente de pH varía de un pH de entre 7 y 7.5 hasta un pH de entre 2.5 y 3.

15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque los pasos de elución se llevan a cabo usando una elución de sal en etapas.

16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque los pasos de elución se llevan a cabo usando una elución de sal en gradiente .

17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el gradiente de sal aumenta la concentración de sal de alrededor de 100 mM hasta alrededor de 250 mM.

18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-17, caracterizado porque la sal es NaCl .

19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizado porque la preparación de anticuerpo de la IgG2 es enriquecida para al menos una de las isoformas estructurales de la IgG2 hasta un nivel de al menos entre 20 % y 50 % de pureza de la isoforma estructural de la IgG2 deseada.

20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizado porque la preparación de anticuerpo de la IgG2 se produce a una escala preparativa.

21. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la matriz de SCX emplea un gradiente de sal de entre 1 y 2 mM de sal por volumen de columna.

22. Un método para producir una preparación de anticuerpo de la IgG2 enriquecida para una de varias isoformas estructurales de la IgG2 que difieren en la conectividad de disulfuro en la región bisagra del anticuerpo, caracterizado porque comprende someter una preparación que comprende un anticuerpo de la IgG2 con una cadena ligera kappa de las subclases VKI, VKIII O VKIV a una resina de proteína L, donde el anticuerpo de la IgG2 en la preparación se eluye de la resina de proteína L como dos o más isoformas de la IgG2 estructurales.