JP2022536659A - 抗体の精製方法及びその組成物 - Google Patents

Abstract

本明細書では、哺乳動物細胞培養中で産生されたヒト化α４β７抗体、例えばベドリズマブを精製する方法、及び前記精製プロセスから得られる組成物について記載する。【選択図】なし

Description

本発明は、抗α４β７抗体、またはその断片を精製するための方法に関する。

関連出願
本出願は、２０１９年６月１０日に出願された、米国仮出願第６２／８５９，５８０号に基づく優先権を主張する。上記出願の全容を参照によって本明細書に援用するものである。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出される配列表を含み、その全容を参照によって本明細書に援用する。２０２０年６月５日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、Ｔ１０３０２２＿１１２０ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔの名前が付けられており、そのサイズは１０，０１５バイトである。

タンパク質の大規模で経済的な精製は、バイオテクノロジー産業において益々重要な課題となりつつある。一般的に、生物製剤は、目的の治療用タンパク質を大量に産生するように操作された、例えば、細菌細胞などの原核細胞株、または哺乳動物もしくは真菌細胞などの真核細胞株を用いた細胞培養によって製造される。使用される細胞株は生物であるため、糖類、アミノ酸、及び、場合により、動物血清の製剤から供給される成長因子を含む複雑な細胞培地を供給しなければならない。所望の組換え治療用タンパク質を、例えば、細胞培地成分、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、宿主核酸、及び／またはクロマトグラフィー材料などのプロセス関連不純物、ならびに凝集体、ミスフォールドした化学種、または目的のタンパク質の断片などの生成物関連不純物から、ヒトの治療薬として使用するうえで十分な純度にまで分離することは困難な課題であった。

凝集体をはじめとする生成物関連及びプロセス関連不純物は、精製プロセスを妨げ、保管時のタンパク質に影響を及ぼす可能性があり、かつ／または抗体を医薬品として対象に投与する際に有害反応の原因となるおそれがある（Ｓｈｕｋｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ａｎａｌｙｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，８４８（１），２８－３９）。

したがって、不純物を効果的に除去し、タンパク質の回収率を向上させ、治療上の要求条件を維持しつつ、例えば抗体などの治療用タンパク質を精製するための改善された方法が当該技術分野で引き続き求められている。

本発明は、例えば液体溶液から、ベドリズマブなどの抗α４β７抗体を精製するための方法を特に提供する。

一態様では、本発明は、抗α４β７抗体及び１つ以上の不純物を含む液体溶液から抗α４β７抗体を含む組成物を得るための方法であって、プロテインＡを含むマトリクスを、抗α４β７抗体及び１つ以上の不純物を含む液体溶液と接触させて、抗α４β７抗体をプロテインＡに結合させることと、プロテインＡを含むマトリクスを洗浄溶液で洗浄することと、マトリクスをｐＨ３．２～４の溶出溶液と接触させることにより、プロテインＡを含むマトリクスから抗α４β７抗体を溶出して、抗α４β７抗体を含む組成物を得ることと、を含み、抗α４β７抗体が、ヒト化抗体であり、ＩｇＧ１抗体であり、配列番号４に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号３に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号２に記載のＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号８に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６に記載のＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域とを含む、方法を特徴とする。

一実施形態では、方法は、１％未満の高分子量（ＨＭＷ）凝集体を含む組成物を、抗α４β７抗体及び１つ以上の不純物を含む液体溶液から得るために使用され、方法は、プロテインＡを含むマトリクスを、抗α４β７抗体及び１つ以上の不純物を含む液体溶液と接触させることで、抗α４β７抗体をプロテインＡに結合させることを含み、プロテインＡを含むマトリクスの洗浄溶液による前記洗浄、及びマトリクスをｐＨ３．２～４の溶出溶液と接触させることによる、プロテインＡを含むマトリクスからの抗α４β７抗体の前記溶出により、１％未満のＨＭＷ凝集体を含む組成物が得られる。

一実施形態では、プロテインＡは、固相上に固定化される。一実施形態では、固相は、ビーズ、ゲル、及び樹脂のうちの１つ以上を含む。

一実施形態では、洗浄溶液は、約７のｐＨを有する。一実施形態では、溶出溶液は、クエン酸を含む。

一実施形態では、溶出溶液は、３．２～３．７のｐＨを有する。

別の態様では、本発明は、抗α４β７抗体及び１つ以上の不純物を含む液体溶液から抗α４β７抗体を含む組成物を得るための方法であって、抗α４β７抗体及び少なくとも１つの不純物を含む溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂と、ＨＩＣ樹脂を通じた抗α４β７抗体のフロースルーを可能とする条件下で接触させることにより、抗α４β７抗体を含む組成物が得られ、ＨＩＣ樹脂は高疎水性ＨＩＣ樹脂として特徴付けられ、抗α４β７抗体が、ヒト化抗体であり、ＩｇＧ１抗体であり、配列番号４に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号３に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号２に記載のＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域を含み、かつ、配列番号８に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６に記載のＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域を含む、方法を特徴とする。

一実施形態では、本方法は、抗α４β７抗体及び１つ以上の不純物を含む液体溶液から抗α４β７抗体及び０．６％未満のＨＭＷ凝集体を含む組成物を得るためのものであり、前記方法は、前記抗α４β７抗体及び少なくとも１つの不純物を含む溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂と、ＨＩＣ樹脂を通じた抗α４β７抗体のフロースルーを可能とする条件下で前記接触させることにより、抗α４β７抗体及び０．６％未満のＨＭＷ凝集体を含む組成物が得られ、抗α４β７抗体が、ヒト化抗体であり、ＩｇＧ１抗体であり、配列番号４に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号３に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号２に記載のＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域を含み、かつ、配列番号８に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６に記載のＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。

一実施形態では、ＨＩＣ樹脂は、約７．２未満のｐＨを有するリン酸塩バッファーで平衡化される。一実施形態では、リン酸塩バッファーは、約０．３５ｍＭ～約０．１５ｍＭのリン酸カリウムを含む。

一実施形態では、樹脂ロードは約５５～７５ｍｇ／ｍｌである。

一実施形態では、組成物は、約０．２２ｐｐｍ未満の残留プロテインＡを含む。

一実施形態では、組成物は、約０．３ｐｐｍ未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含有する。

一実施形態では、高疎水性ＨＩＣ樹脂は、約５０～１５０μｍの平均孔径を有する。

一実施形態では、高疎水性ＨＩＣ樹脂は、約１００ｎｍの平均孔径及び／または約１００μｍの孔径を有する。

別の態様では、本発明は、抗α４β７抗体及び１つ以上の不純物を含む液体溶液から抗α４β７抗体を含む製剤を生成するための方法であって、抗α４β７抗体及び１つ以上の不純物を含む液体溶液を混合モードクロマトグラフィー樹脂と接触させることにより、抗α４β７抗体を樹脂に結合させることと、混合モードクロマトグラフィー樹脂を洗浄溶液で洗浄することと、ｐＨ３．９以上のｐＨを有する溶出溶液と樹脂を接触させることにより混合モードクロマトグラフィー樹脂から抗α４β７抗体を溶出することによって精製された抗α４β７抗体を含む製剤を得ることと、抗α４β７抗体が、配列番号１に記載の重鎖可変領域と、配列番号２に記載の軽鎖可変領域とを含む、方法を特徴とする。

上記の態様の一実施形態では、方法は、抗α４β７抗体及び１つ以上の不純物を含む液体溶液から１％未満の高分子量（ＨＭＷ）凝集体を含む製剤を得るためのものであり、前記方法は、抗α４β７抗体及び１つ以上の不純物を含む液体溶液を混合モードクロマトグラフィー樹脂と接触させることにより、抗α４β７抗体を樹脂に結合させることと、前記混合モードクロマトグラフィー樹脂を洗浄溶液により前記洗浄することと、ｐＨ３．９以上のｐＨを有する溶出溶液と樹脂を接触させることにより混合モードクロマトグラフィー樹脂から抗α４β７抗体を前記溶出することにより、１％未満のＨＭＷ凝集体を含む製剤が得られることと、を含む。

一実施形態では、溶出溶液は、ｐＨ４．１またはそれよりも高いｐＨを有する。別の実施形態では、溶出溶液は、約ｐＨ３．９～約ｐＨ４．４のｐＨを有する。

いくつかの実施形態では、溶出溶液は、３０ｍＳ／ｃｍ以下の導電率を有する。特定の実施形態では、溶出溶液は、約２０ｍＳ／ｃｍ～約３０ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。

いくつかの実施形態では、溶出溶液は、約１６０ｍＭ～約２４０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む。

特定の実施形態では、混合モードクロマトグラフィー樹脂は、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓである。

上記の態様のいくつかの実施形態では、方法は、カチオン交換（ＣＥＸ）樹脂を用いて抗α４β７抗体を精製することをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、ＣＥＸ樹脂は、結合／溶出モードで操作される。

別の態様では、本発明は、抗α４β７抗体及び１つ以上の不純物を含む液体溶液から抗α４β７抗体を含む製剤を生成するための方法であって、抗α４β７抗体及び１つ以上の不純物を含む液体溶液を混合モードクロマトグラフィー樹脂と接触させることにより、抗α４β７抗体を樹脂に結合させることと、混合モードクロマトグラフィー樹脂を洗浄溶液で洗浄することと、ｐＨ４．２以下のｐＨ及び２８ｍＳ／ｃｍ以下の導電率を有する溶出溶液と樹脂を接触させることにより混合モードクロマトグラフィー樹脂から抗α４β７抗体を溶出することによって、精製された抗α４β７抗体を含む製剤を得ることと、抗α４β７抗体が、配列番号１に記載の重鎖可変領域と、配列番号２に記載の軽鎖可変領域とを含む、方法を特徴とする。

上記の態様のいくつかの実施形態では、方法は、抗α４β７抗体及び１つ以上の不純物を含む液体溶液から高い収率の抗α４β７抗体を含む製剤を得るためのものであり、前記方法は、抗α４β７抗体及び１つ以上の不純物を含む液体溶液を混合モードクロマトグラフィー樹脂と前記接触させることにより、抗α４β７抗体を樹脂に結合させることと、前記混合モードクロマトグラフィー樹脂を洗浄溶液により前記洗浄することと、ｐＨ４．２以下のｐＨ及び２８ｍＳ／ｃｍ以下の導電率を有する溶出溶液と樹脂を接触させることにより混合モードクロマトグラフィー樹脂から抗α４β７抗体を前記溶出することにより、高い収率の抗α４β７抗体を含む製剤が得られることと、を含む。

いくつかの実施形態では、溶出溶液は、４．０以下のｐＨを有する。他の実施形態では、溶出溶液は、約ｐＨ４．２～約ｐＨ３．８のｐＨを有する。

いくつかの実施形態では、溶出溶液は、約１８ｍＳ／ｃｍ～約２８ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。

いくつかの実施形態では、溶出溶液は、約１６０ｍＭ～約２４０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む。

上記の態様のいくつかの実施形態では、混合モードクロマトグラフィー樹脂は、樹脂１Ｌ当たり少なくとも５５ｇの抗α４β７抗体と接触させられる。特定の実施形態では、混合モードクロマトグラフィー樹脂は、樹脂１Ｌ当たり約５５ｇ～約８０ｇの抗α４β７抗体と接触させられる。

上記の態様のいくつかの実施形態では、混合モードクロマトグラフィー樹脂は、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓである。

上記の態様のいくつかの実施形態では、方法は、カチオン交換（ＣＥＸ）樹脂を用いて抗α４β７抗体を精製することをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、ＣＥＸ樹脂は、結合／溶出モードで操作される。

別の態様では、本発明は、抗α４β７抗体及び１つ以上の不純物を含む液体溶液から抗α４β７抗体を含む製剤を生成するための方法であって、抗α４β７抗体及び１つ以上の不純物を含む液体溶液をカチオン交換（ＣＥＸ）樹脂と接触させることにより、抗α４β７抗体を樹脂に結合させることと、ＣＥＸ樹脂を洗浄溶液で洗浄することと、１６ｍＳ／ｃｍ以下の導電率を有する溶出溶液と樹脂を接触させることによりＣＥＸ樹脂から抗α４β７抗体を溶出することによって、精製された抗α４β７抗体を含む製剤を得ることと、抗α４β７抗体が、配列番号１に記載の重鎖可変領域と、配列番号２に記載の軽鎖可変領域とを含む、方法を特徴とする。

上記の態様の一実施形態では、方法は、抗α４β７抗体及び１つ以上の不純物を含む液体溶液から低減されたレベルのＨＭＷ凝集体を含む製剤を得るためのものであり、前記方法は、抗α４β７抗体及び１つ以上の不純物を含む液体溶液をＣＥＸ樹脂と前記接触させることにより、抗α４β７抗体を樹脂に結合させることと、前記ＣＥＸ樹脂を洗浄溶液により前記洗浄することと、１６ｍＳ／ｃｍ以下の導電率を有する溶出溶液と樹脂を接触させることによりＣＥＸ樹脂から抗α４β７抗体を前記溶出することにより、低減されたレベルのＨＭＷ凝集体を含む製剤が得られることと、を含む。

上記の態様のいくつかの実施形態では、溶出溶液は、１４ｍＳ／ｃｍ以下の導電率を有する。他の実施形態では、溶出溶液は、約１１～１６ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。さらに他の実施形態では、溶出溶液は、約１２～１４ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。

上記の態様のいくつかの実施形態では、溶出溶液は、約７０ｍＭ～約１１０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む。

上記の態様のいくつかの実施形態では、溶出溶液は、約ｐＨ５～約ｐＨ６のｐＨを有する。特定の実施形態では、溶出溶液は、約ｐＨ５．１～約ｐＨ５．８のｐＨを有する。

上記の態様のいくつかの実施形態では、抗α４β７抗体が、樹脂１Ｌ当たり約２５～７０ｇの抗体の濃度でＣＥＸ樹脂にロードされる。特定の実施形態では、抗α４β７抗体は、樹脂１Ｌ当たり約３０～６０ｇの抗体の濃度でＣＥＸ樹脂にロードされる。

上記の態様のいくつかの実施形態では、ＣＥＸ樹脂は、Ｎｕｖｉａ ＨＲ－Ｓである。

上記の態様のいくつかの実施形態では、方法は、混合モードクロマトグラフィー樹脂を用いて抗α４β７抗体を精製することをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、混合モードクロマトグラフィー樹脂は、結合／溶出モードで操作される。

別の態様では、本発明は、抗α４β７抗体の主要アイソフォーム及び１つ以上の塩基性アイソフォーム種を含む液体溶液から抗α４β７抗体を含む製剤を生成するための方法であって、抗α４β７抗体及び１つ以上の塩基性アイソフォーム種を含む液体溶液をカチオン交換（ＣＥＸ）樹脂と接触させることにより、抗α４β７抗体を樹脂に結合させることと、ＣＥＸ樹脂を洗浄溶液で洗浄することと、１１ｍＳ／ｃｍ以上の導電率を有する溶出溶液と樹脂を接触させることによりＣＥＸ樹脂から抗α４β７抗体を溶出することによって、精製された抗α４β７抗体を含む製剤を得ることと、抗α４β７抗体が、配列番号１に記載の重鎖可変領域と、配列番号２に記載の軽鎖可変領域とを含む、方法を特徴とする。

上記の態様の一実施形態では、方法は、抗α４β７抗体の主要アイソフォーム及び１つ以上の塩基性アイソフォーム種を含む液体溶液から低減されたレベルの抗α４β７抗体の塩基性アイソフォーム種を含む製剤を得るためのものであり、前記方法は、抗α４β７抗体及び１つ以上の塩基性アイソフォーム種を含む液体溶液をＣＥＸ樹脂と前記接触させることにより、抗α４β７抗体を樹脂に結合させることと、前記ＣＥＸ樹脂を洗浄溶液により前記洗浄することと、１１ｍＳ／ｃｍ以上の導電率を有する溶出溶液と樹脂を接触させることによりＣＥＸ樹脂から抗α４β７抗体を前記溶出することにより、低減されたレベルの塩基性アイソフォーム種を含む製剤が得られることと、を含む。

一実施形態では、精製された組成物は、約４％～約２０％の塩基性アイソフォームを含む。

上記の態様のいくつかの実施形態では、溶出溶液は、１２ｍＳ／ｃｍ以上の導電率を有する。他の実施形態では、溶出溶液は、約１１～１６ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。さらに他の実施形態では、溶出溶液は、約１２～１４ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。

上記の態様のいくつかの実施形態では、溶出溶液は、約ｐＨ５～約ｐＨ６のｐＨを有する。特定の実施形態では、溶出溶液は、約ｐＨ５．１～約ｐＨ５．８のｐＨを有する。

上記の態様のいくつかの実施形態では、抗α４β７抗体が、樹脂１Ｌ当たり約２５～７０ｇの抗体の濃度でＣＥＸ樹脂にロードされる。特定の実施形態では、抗α４β７抗体は、樹脂１Ｌ当たり約３０～６０ｇの抗体の濃度でＣＥＸ樹脂にロードされる。

いくつかの実施形態では、溶出溶液は、塩化ナトリウム、例えば、７０～１１０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。

上記の態様のいくつかの実施形態では、ＣＥＸ樹脂は、Ｎｕｖｉａ ＨＲ－Ｓである。

上記の態様のいくつかの実施形態では、方法は、混合モードクロマトグラフィー樹脂を用いて抗α４β７抗体を精製することをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、混合モードクロマトグラフィー樹脂は、結合／溶出モードで操作される。

上記の態様のいずれの一実施形態では、抗体は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞内で産生されたものである。

一実施形態では、宿主細胞は、ＧＳ－ＣＨＯ細胞である。

上記の態様のいずれの一実施形態では、抗α４β７抗体は、配列番号１に記載の重鎖可変領域配列及び配列番号５に記載の軽鎖可変領域配列を含む。

上記の態様のいずれの一実施形態では、抗α４β７抗体はベドリズマブである。

さらに、本発明は以下の実施形態も含む。

１． 抗α４β７抗体及び１つ以上の不純物を含む液体溶液から１％未満のＨＭＷ凝集体を含む組成物を得るための方法であって、
前記抗α４β７抗体及び前記１つ以上の不純物を含む前記液体溶液をプロテインＡを含むマトリクスと接触させることにより、前記抗α４β７抗体を前記プロテインＡに結合させることと、
前記プロテインＡを含む前記マトリクスを洗浄溶液で洗浄することと、
前記マトリクスをｐＨ３．２～４の溶出溶液と接触させることにより、前記プロテインＡを含む前記マトリクスから前記抗α４β７抗体を溶出して、１％未満のＨＭＷ凝集体を含む組成物を得ることと、を含み、
前記抗α４β７抗体がヒト化抗体であり、ＩｇＧ１抗体であり、配列番号４に記載されるＣＤＲ３ドメイン、配列番号３に記載されるＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号２に記載されるＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域を含み、配列番号８に記載されるＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載されるＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６に記載されるＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域を含む、前記方法。

２． 前記プロテインＡが固相上に固定化される、項目１に記載の方法。

３． 前記固相が、ビーズ、ゲル、及び樹脂のうちの１つ以上を含む、項目２に記載の方法。

４． 前記洗浄溶液のｐＨが、約７である、項目１～３のいずれか１つに記載の方法。

５． 前記溶出溶液が、クエン酸を含む、項目１～４のいずれか１つに記載の方法。

６． 前記溶出溶液のｐＨが、３．２～３．７である、項目１～５のいずれか１つに記載の方法。

７． 抗α４β７抗体及び１つ以上の不純物を含む液体溶液から抗α４β７抗体及び０．６％未満のＨＭＷ凝集体を含む組成物を得るための方法であって、
抗α４β７抗体及び少なくとも１つの不純物を含む溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂と、前記ＨＩＣ樹脂を通じた前記抗α４β７抗体のフロースルーを可能とする条件下で接触させることにより、前記抗α４β７抗体及び０．６％未満のＨＭＷ凝集体を含む組成物を得ることを含み、
前記ＨＩＣ樹脂が高疎水性樹脂として特徴付けられ、
前記抗α４β７抗体がヒト化抗体であり、ＩｇＧ１抗体であり、配列番号４に記載されるＣＤＲ３ドメイン、配列番号３に記載されるＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号２に記載されるＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域を含み、配列番号８に記載されるＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載されるＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６に記載されるＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域を含む、前記方法。

８． 前記ＨＩＣ樹脂が、ｐＨ約７．２未満のリン酸塩バッファーで平衡化される、項目７に記載の方法。

９． 前記リン酸塩バッファーが、約０．３５ｍＭ～約０．１５ｍＭのリン酸カリウムを含む、項目８に記載の方法。

１０． 前記樹脂ロードが、約５５～７５ｍｇ／ｍｌである、項目項７～９のいずれか１つに記載の方法。

１１． 前記組成物が、約０．２２ｐｐｍ未満の残留プロテインＡを含む、項目７～１０のいずれか１つに記載の方法。

１２． 前記組成物が、約０．３ｐｐｍ未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含む、項目７～１１のいずれか１つに記載の方法。

１３． 前記高疎水性ＨＩＣ樹脂が、約５０～１５０μｍの平均孔径を有する、項目７～１２のいずれか１つに記載の方法。

１４． 前記高疎水性ＨＩＣ樹脂が、約１００ｎｍの平均孔径及び／または約１００μｍの孔径を有する、項目７～１２のいずれか１つに記載の方法。

１５． 前記抗体が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内で産生されたものである、項目１～１４のいずれか１つに記載の方法。

１６． 前記宿主細胞が、ＧＳ－ＣＨＯ細胞である、項目１５に記載の方法。

１７． 前記抗α４β７抗体が、配列番号１に記載の重鎖可変領域配列及び配列番号５に記載の軽鎖可変領域配列を含む、項目１～１６のいずれか１つに記載の方法。

１８． 前記抗α４β７抗体が、ベドリズマブである、項目１～１６のいずれか１つに記載の方法。

凝集体をプロテインＡ溶出液のｐＨの関数として示す。 性能結果についてスクリーニングした、予測プロファイラーアッセイの結果を示すプロットである。 性能結果についてスクリーニングした、予測プロファイラーアッセイの結果を示すプロットである。 性能結果についてスクリーニングした、予測プロファイラーアッセイの結果を示すプロットである。 ベドリズマブと他の３つのＩｇＧ抗体との比較、及びカチオン交換カラムから各抗体を溶出するためのｐＨ特性を示すグラフである。 溶出バッファーのｐＨ及び導電率に対するＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓの工程回収率を示す、線形回帰モデルの表面プロットである。 溶出バッファーのｐＨ及びロード量に対するＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓの工程回収率を示す、線形回帰モデルの表面プロットである。 溶出バッファーのｐＨ及び導電率に対するＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓのＨＭＷ種の割合（％）を示す、線形回帰モデルの表面プロットである。 溶出バッファーのｐＨ及びロード量に対するＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓのＨＭＷ種の割合（％）を示す、線形回帰モデルの表面プロットである。 ＨＭＷ種の割合（％）に対する溶出バッファーのｐＨ及び溶出バッファーの導電率の影響を示すＨＭＷの表面プロットである。 ＨＭＷクリアランスに対する溶出バッファーのｐＨ及び溶出バッファーの導電率の影響を示すＨＭＷクリアランスの表面プロットである。 モノマー種の割合（％）に対する溶出バッファーのｐＨ及び溶出バッファーの導電率の影響を示すモノマーの表面プロットである。 酸性アイソフォーム種の割合（％）に対する溶出バッファーのｐＨ及び溶出バッファーの導電率の影響を示す酸性表面プロットである。 主要アイソフォーム種の割合（％）に対する溶出バッファーのｐＨ及び溶出バッファーの導電率の影響を示す主要表面プロットである。 塩基性アイソフォーム種の割合（％）に対する溶出バッファーのｐＨ及び溶出バッファーの導電率の影響を示す塩基性表面プロットである。

本発明は、抗α４β７抗体またはその抗原結合断片、例えばベドリズマブの精製された製剤中に存在する生成物関連物質（例えば、高分子量（ＨＭＷ）凝集体などの凝集体、ミスフォールドした化学種、またはタンパク質断片）及び／またはプロセス関連不純物（例えば、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、宿主細胞核酸、ウイルス、クロマトグラフィー材料、及び／または培地成分）の量を制御するための精製方法に特に関する。

Ｉ．定義
本発明をより容易に理解できるようにするため、最初に特定の用語を定義する。

細胞表面分子である「α４β７インテグリン」、または「α４β７」（本明細書全体を通じて互換的に用いられる）は、α４鎖（ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ４）とβ７鎖（ＩＴＧＢ７）とのヘテロ二量体である。ヒトα４インテグリン及びβ７インテグリン遺伝子（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＭ＿０００８８５及びＮＭ＿０００８８９）は、Ｂ及びＴリンパ球、特にメモリーＣＤ４＋リンパ球によって発現される。多くのインテグリンに典型的な点として、α４β７は、休止または活性化状態で存在し得る。α４β７のリガンドとしては、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）、フィブロネクチン及び粘膜アドレシン（ＭＡｄＣＡＭ（例えば、ＭＡｄＣＡＭ－１））が挙げられる。α４β７インテグリンに結合する抗体は、本明細書では、「抗α４β７抗体」と呼ばれる。

本明細書で使用される、「α４β７複合体に対する結合特異性」を有する抗体または抗体結合断片は、α４β７に結合するが、α４β１にもα_Ｅβ７にも結合しない。ベドリズマブは、α４β７複合体に対する結合特異性を有する抗体の一例である。

本明細書で使用される「抗体」なる用語は、ジスルフィド結合によって相互連結された２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖の４本のポリペプチド鎖からなる免疫グロブリン分子を指す。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略称する）と重鎖定常領域とからなる。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３の３つのドメインからなる。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略称する）と軽鎖定常領域とからなる。軽鎖定常領域は１個のドメインＣＬからなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が間に介在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に更に分けることができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へとＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配列された３つのＣＤＲと４つのＦＲとから構成されている。いくつかの実施形態では、抗体は、「結晶化可能な断片」（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）（Ｆｃ）領域を有する。特定の実施形態では、抗体はＩｇＧ１アイソタイプであり、κ軽鎖を有する。

「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域内に介在する超可変性の領域である。

本明細書で使用される、抗体の「抗原結合断片」または「抗原結合部分」なる用語は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、及びＦv断片、一本鎖抗体、機能性重鎖抗体(ナノボディー)、ならびに、特異的結合についてインタクトな抗体と競合する、少なくとも１つの所望のエピトープに対する特異性を有する抗体の任意の部分を指す（例えば、エピトープに特異的に結合するのに十分なフレームワーク配列を有する相補性決定領域の単離された部分）。抗原結合断片は、組換え技術、または抗体の酵素的もしくは化学的切断によって作製することができる。

非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体の「ヒト化」型とは、非ヒト抗体に由来する最小限の配列を含むキメラ抗体である。多くの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び機能性を有する、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などのヒト以外の種の超可変領域（ドナー抗体）に由来する残基で置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合により、ヒト免疫抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基で置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでもよい。これらの改変は、抗体の性能を更に向上させるために行われる。一般に、ヒト化抗体は、超可変ＣＤＲループのすべてまたはほぼすべてが非ヒト抗体のものに相当し、ＦＲのすべてまたはほぼすべてがヒト抗体配列のものであるような、少なくとも１つ、一般的には２つの可変ドメインのほぼすべてを含む。ヒト化抗体は、場合により、抗体定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、一般的にはヒト抗体のものをさらに含む。さらなる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－５９６（１９９２）を参照されたい。

本明細書で使用される「組換え抗体」とは、例えば哺乳動物細胞などの宿主細胞内に導入された組換え発現ベクター（複数可）に組み込まれた遺伝子（複数可）の転写及び翻訳の結果として産生される抗体を指す。特定の実施形態では、組換えタンパク質は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、またはＩｇＥからなる群から選択されるアイソタイプの抗体である。特定の実施形態では、組換え抗体は、ＩｇＧ１である。

「組換え宿主細胞」なる用語（本明細書では「宿主細胞」なる用語と互換的に用いられる）には、組換え発現ベクターが導入された細胞が含まれる。かかる用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫のことも指すことも意図している点は理解されるべきである。特定の改変は突然変異または環境の影響により後続世代で生じ得ることから、そのような子孫は実際には親細胞と同一でない場合もあるが、本明細書で使用するところの「宿主細胞」なる用語の範囲内に含まれる。さらに、特に断らない限り、例えば、宿主細胞または哺乳動物細胞または哺乳動物宿主細胞などのように「細胞」なる用語が使用される場合、細胞の集団を含むことを意図している点は理解されるべきである。

本明細書中で使用される「ベクター」なる用語は、それが連結された別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語には、自己複製する核酸構造としてのベクター、及び導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターが含まれる。特定のベクターは、ベクターが機能的に連結された核酸の発現を誘導することができる。かかるベクターは、本明細書中で「発現ベクター」と呼ばれる。

本明細書においてタンパク質との関連で使用される「上流プロセス」なる用語は、宿主細胞からのタンパク質（例えば、抗体）の生成及び回収を行う活動を指す（例えば、抗体などの目的のタンパク質を生成するための細胞培養に際して）。

本明細書で使用される「下流プロセス」なる用語は、例えば、目的の抗体などのタンパク質を精製するための上流プロセス後に用いられる１つ以上の手法を指す。例えば、下流プロセスの手法としては、例えば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを含むアフィニティークロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換イオン交換クロマトグラフィーのようなイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、または置換クロマトグラフィーを使用したタンパク質生成物の精製が挙げられる。

本明細書で使用される「培養」及び「細胞培養」なる用語は、細胞が制御された条件下、一般的にはその天然環境の外側で増殖されるプロセスを一般的に指す。細胞を「培養する」とは、細胞を、細胞の生存及び／または成長及び／または増殖に適した条件下で細胞培地と接触させることを指す。特定の実施形態では、細胞培養とは、目的の組換えタンパク質、例えば、抗α４β７抗体を産生することができる宿主細胞の集団を生成及び維持するための方法、ならびに目的のタンパク質を生成及び回収するための方法及び手法を指す。例えば、発現ベクターが適当な宿主、例えば、培養中の宿主細胞に組み込まれた後、宿主を、関連するヌクレオチドコーディング配列の発現、ならびに所望の組換えタンパク質の回収及び精製に適した条件下で維持することができる。「細胞培養」は、細胞を含む溶液を指す場合もある。

本明細書で使用される「清澄化された回収物」とは、材料から細胞破片及び粒子状不純物などの固体粒子を除去するための１つ以上の工程が行われた後の、細胞培養、例えば発酵バイオリアクターから抽出された目的のタンパク質、例えば抗α４β７抗体を含む液体材料を指す。細胞培養後、回収物は通常、遠心分離及び濾過などの分離技術を用いて精製されて細胞及び細胞破片が除去される。最初の清澄化、粒子除去工程によって、例えば、後のクロマトグラフィー工程（下流プロセス）で使用することができる「清澄化された回収物」が得られる。清澄化された回収物は、一般的には、本明細書に記載される下流プロセスのような下流プロセスにおける出発物質である。

本明細書で使用される「クロマトグラフィー支持体」とは、特定の化学組成または特定の三次元構造を有する、または、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過（サイズ排除クロマトグラフィー）、またはイオン交換クロマトグラフィーを含むクロマトグラフィーを行うために特定の化学基またはマクロ分子を固定化することができる中実または多孔質のマトリクスのことを指す。クロマトグラフィー支持体の例としては、これらに限定されるものではないが、樹脂（例えば、アガロース）または膜が挙げられる。本明細書で使用される「クロマトグラフィーハウジング」とは、クロマトグラフィー支持体を収容する構造体を指す。クロマトグラフィーハウジングの例としては、カラムもしくはカートリッジ、または他の容器が挙げられる。

本明細書で使用される「バッファー」とは、その酸－塩基コンジュゲート成分の作用によりｐＨの変化に抗する水溶液を指す。「バッファー」は、プロセス工程、またはクロマトグラフィー樹脂または膜などのクロマトグラフィー支持体の制御を調整する特定の条件のセットを確立するために用いられる。

本明細書で使用される「平衡化溶液」なる用語は、プロセス工程またはクロマトグラフィー支持体、例えばクロマトグラフィー操作の初期操作条件を確立するように配合された水性液を指す。平衡化溶液は、目的のタンパク質、例えば抗体をロードするための例えば固相、例えばクロマトグラフィー支持体、例えば樹脂または膜を調製するために用いられる。

本明細書で使用される「洗浄液」または「洗浄溶液」なる用語は、樹脂または膜などのクロマトグラフィー支持体から結合していない夾雑物を置換するように配合された水性液を指す。いくつかの実施形態では、洗浄液は、目的のタンパク質、例えば抗体をロードした後で、かつ目的のタンパク質、例えば抗体を溶出する前に、固体支持体、例えば樹脂または膜に通される。一実施形態では、洗浄液は、平衡化溶液と同様の生化学的特性を有する。

本明細書で使用される「フロースルー操作」とは、洗浄の間にタンパク質がマトリクス、例えば疎水性クロマトグラフィー樹脂に実質的に結合しないか、かつ／または溶出するのに対して、不純物はクロマトグラフィー支持体に結合したままとなるようなプロセスを指す。

本明細書で使用される「溶出溶液」または「溶出液」なる用語は、クロマトグラフィー支持体、例えば樹脂または膜から目的のタンパク質、例えば抗体を置換するように配合された水性液を指す。一実施形態では、溶出溶液は、目的のタンパク質、例えば抗体が、クロマトグラフィー支持体、例えば樹脂または膜よりも溶出溶液と会合しやすいように、平衡化溶液及び／または洗浄溶液とは異なる生化学的特性を有する。

精製しようとする抗体を含む溶液中に含まれる不純物に関して本明細書で使用される「不純物」なる用語には、プロセス関連不純物と生成物関連不純物の両方が含まれる。

本明細書で使用される「プロセス関連不純物」なる用語は、タンパク質を含む組成物、例えば溶液中に存在するが、タンパク質自体に由来するものではない不純物（または複数の不純物）を指す。例えば、プロセス関連不純物には、これらに限定されるものではないが、細胞培地成分、宿主細胞成分（例えば、タンパク質（ＨＣＰ）、宿主細胞核酸、または脂質含有細胞内構造またはその断片など）、ウイルス、バッファーからの微量金属またはイオン、材料の取り扱い用容器またはクロマトグラフィー支持体からの浸出性物質が挙げられる。プロセス関連不純物は、タンパク質、例えば抗体の調製（上流及び／または下流プロセス）時に生成され得る。

本明細書で使用される「宿主細胞不純物」なる用語は、宿主細胞株、細胞培養液、または細胞培養により導入されるあらゆるタンパク質性、核酸夾雑物、脂質夾雑物、または副生成物を指す。不純物の例としては、これらに限定されるものではないが、チャイニーズハムスター卵巣タンパク質（ＣＨＯＰ）、大腸菌タンパク質、酵素タンパク質、サルＣＯＳタンパク質、または骨髄腫細胞タンパク質（例えば、ＮＳ０タンパク質（ＢＡＬＢ／ｃマウスに由来するマウス形質細胞腫））が挙げられる。

本明細書で使用される「生成物関連不純物」なる用語には、目的のタンパク質、例えば抗体自体に由来する不純物が含まれる。例えば、生成物関連不純物には、これらに限定されるものではないが、凝集体（例えば、ＨＭＷ）、ミスフォールドした化学種、酸化または脱アミド化された化学種、または目的の抗体の低分子量断片が挙げられる。

本明細書で使用される「凝集体」または「凝集体（複数）」なる用語は、複数の抗体または抗体断片の結合を指す。例えば、凝集体は、抗体及び／または抗体断片の二量体、三量体、四量体、または四量体よりも大きな多量体であり得る。抗体凝集体は、可溶性または不溶性であり得る。凝集した分子間の結合は、分子が結合する機構に関係なく、共有性または非共有性であり得る。結合は、凝集した分子間の直接的なものの場合もあり、または分子同士を互いに連結する他の分子を介した間接的なものの場合もある。後者の例としては、これらに限定されるものではないが、他のタンパク質とのジスルフィド結合、脂質との疎水性結合、ＤＮＡとの電荷結合、浸出したプロテインＡとのアフィニティー結合、または複数成分との混合モード結合が挙げられる。凝集体は、細胞培養中でのタンパク質発現時に、下流プロセスのタンパク質精製時に、または医薬品の保管時に不可逆的に形成され得る。溶液中の凝集体の存在は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（例えば、ＵＶ検出によるＳＥＣ、光散乱検出によるＳＥＣ（ＳＥＣ－ＬＳＤ））、フィールドフローフラクショネーション、超遠心分析の沈降速度法、またはキャピラリー電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ－ＳＤＳ、還元型及び非還元型）を使用して判定することができる。

「高分子量」または「ＨＭＷ」なる用語は、モノマー抗体よりも大きな分子量を有する抗体複合体を指して用いられる。一実施形態では、ＨＭＷ凝集体は、約１４７ｋＤａよりも大きな分子量を有する。高分子量凝集体の存在は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）などの当該技術分野では周知の標準的な兵法によって判定することができる。

所望のタンパク質に関して「実質的に精製された」とは、タンパク質を含む精製された試料が、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、または少なくとも９９％の所望の組換えタンパク質を含み、不純物が３％未満、２．５％未満、２％未満、１．５％未満、１％未満、または０．５％未満であることを意味する。

「約」なる用語は、その後に続く値が正確な値ではないが、その値の±５％である範囲の中心点であることを意味する。その値がパーセンテージで与えられる相対値である場合、「約」なる用語は、その後に続く値が正確な値ではないが、その値の±５％である範囲の中心点であり、範囲の上限が１００％の値を超え得ないことを意味する。

ＩＩ．抗体精製に関連する方法及び組成物
本明細書では、例えば液体溶液から、例えば哺乳動物の細胞培養の清澄化回収物から、ベドリズマブなどの抗α４β７抗体を精製するための方法が提供される。本発明は、抗体溶液中に存在する、例えば、細胞培地成分、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、宿主細胞核酸、ウイルス、及びクロマトグラフィー材料などのプロセス関連不純物、ならびに凝集体（ＨＭＷ凝集体を含む）、ミスフォールドした化学種、または目的のタンパク質の断片などの生成物関連不純物を含む不純物のレベルを低下させる抗体精製プロセスの特定の態様に少なくとも一部基づいたものである。本発明の方法は、抗α４β７抗体、特にベドリズマブまたはベドリズマブの結合領域（すなわちＣＤＲまたは可変領域）を有する抗体を精製するうえで有用であり、これにより、抗体をヒト患者で使用するために製剤化することができる。

詳細には、本明細書に開示される方法は、低レベルの抗体凝集、例えばＨＭＷ抗体凝集体を得るうえで有用である。特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、約０％～５．０％（例えば、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４％、４．１％、４．２％、４．３％、４．４％、４．５％、４．６％、４．７％、４．８％、４．９％、または５％）の凝集体、例えば、ＨＭＷ凝集体を有する組成物を提供する。特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、約０％～２％、２％以下、１．９％以下、１．８％以下、１．７％以下、１．６％以下、１．５％以下、１．４％以下、１．３％以下、１．２％以下、１．１％以下、１％以下、０．９％以下、０．８％以下、０．７％以下、０．６％以下または０．５％以下の凝集体、例えば、ＨＭＷ凝集体を有する組成物を提供する。本発明には、抗α４β７抗体と前記低レベルのＨＭＷ凝集体とを含む組成物も含まれる。
詳細には、本明細書に開示される方法を使用して、抗α４β７抗体ベドリズマブ、またはベドリズマブの抗原結合領域を有する抗体を製造することができる。ベドリズマブはまた、ＥＮＴＹＶＩＯ（登録商標）（武田薬品工業）の商品名で知られている。ベドリズマブは、ヒトＩｇＧ１のフレームワーク領域及び定常領域と、マウス抗体Ａｃｔ－１由来の抗原結合ＣＤＲとを含むヒト化抗体である。ベドリズマブのＣＤＲ、可変領域、及び変異Ｆｃ領域（Ｆｃエフェクター機能を消失させるように変異させたもの）は、参照によって本明細書にその全容を援用する米国特許第７，１４７，８５１号に記載されている。

ベドリズマブは、α４β７インテグリン、例えばα４β７複合体に特異的に結合し、α４β７インテグリンと粘膜アドレシン細胞接着分子１（ＭＡｄＣＡＭ－１）との相互作用を遮断し、メモリーＴリンパ球が内皮を通過して炎症した消化管実質組織中に遊走することを阻害するヒト化モノクローナル抗体である。ベドリズマブは、α４β１及びαＥβ７インテグリンには結合せず、その機能も阻害せず、α４インテグリンと血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ－１）との相互作用をアンタゴナイズしない。

α４β７インテグリンは、消化管に選択的に遊走するメモリーＴリンパ球の個別のサブセットの表面に発現される。ＭＡｄＣＡＭ－１は、腸の内皮細胞で主に発現され、Ｔリンパ球の腸リンパ組織へのホーミングに重要な役割を果たしている。α４β７インテグリンとＭＡｄＣＡＭ－１との相互作用は、潰瘍性大腸炎及びクローン病の特徴である慢性炎症などの粘膜炎症の重要な寄与因子としての関与が示されている。ベドリズマブを使用して、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、慢性回腸嚢炎を含む回腸嚢炎、移植片対宿主病、ならびにＨＩＶを治療することができる。

ベドリズマブの重鎖可変領域は、本明細書では配列番号１として提供され、ベドリズマブの軽鎖可変領域は本明細書では配列番号５として提供される。ベドリズマブは、配列番号２のＣＤＲ１、配列番号３のＣＤＲ２、及び配列番号４のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む。ベドリズマブは、配列番号６のＣＤＲ１、配列番号７のＣＤＲ２、及び配列番号８のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。ベドリズマブ及びベドリズマブの配列は、いずれも参照によって本明細書にその全容を援用するところの米国特許出願公開第２０１４／０３４１８８５号及び米国特許出願公開第２０１４－０３７７２５１号にも記載されている。本明細書に開示される方法は、上記及び添付の配列表に記載される結合領域（例えば、ＣＤＲまたは可変領域）を含む抗体を使用して実施することができる。

抗体を作製する方法は当該技術分野では周知のものである。哺乳動物宿主は、抗α４β７抗体（例えば、ベドリズマブ）を安定的に発現するように操作される。ベドリズマブなどのモノクローナル抗体の作製における全体的な細胞培養プロセス及び考慮事項は、参照によって本明細書に援用するＬｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ｍＡｂｓ ２：５，４６６－４７７、及びＢｉｒｃｈ ａｎｄ Ｒａｃｈｅｒ（２００６）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．５８：６７１－６８５に記載されている。

細胞培養法を使用する場合、抗α４β７抗体は、細胞内で産生されてもよく、細胞膜周辺腔内で産生されてもよく、または培地に直接分泌されてもよい。抗α４β７抗体が細胞内で産生される実施形態では、宿主細胞または溶解された細胞（例えば、ホモジナイゼーションによって生じる）の粒子状破片を、これらに限定されるものではないが遠心分離または濾過を含むさまざまな手段により除去することができる。抗α４β７抗体が培地中に分泌される場合、かかる発現系からの上清を、市販のタンパク質濃縮フィルターを使用して最初に濃縮する。

培地またはライセートに、沈殿、凝集、遠心分離、及び／または濾過などの１つ以上の処理工程を行って粒子状の細胞破片を除去して清澄化した細胞培養上清、または清澄化回収物を形成する。その後、抗体、例えば抗α４β７抗体（例えば、ベドリズマブまたはベドリズマブに相当する結合領域を有する抗体）を下記に詳細に述べるようにして精製して、不純物（例えば、細胞培地成分、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、宿主細胞核酸、ウイルス、及びクロマトグラフィー材料などのプロセス関連不純物、ならびに凝集体（ＨＭＷ凝集体を含む）、ミスフォールドした化学種、または目的のタンパク質の断片などの生成物関連不純物）を除去する。

精製プロセスは、上記に述べた上流製造法を用いて、かつ／または従来の別の製造法によって抗体が製造された後に始めることができる。抗体を含む清澄化された溶液または混合物が得られた後、細胞によって産生された他のタンパク質などのプロセス関連不純物、ならびに生成物関連不純物からの目的の抗体の分離を行う。特定の非限定的な実施形態では、かかる分離は、ＣＥＸ、ＡＥＸ、及び／またはＭＭクロマトグラフィーを使用して行われる。特定の実施形態では、アフィニティー分離工程（複数可）、イオン交換分離工程（複数可）、混合モード工程（複数可）、及び／または疎水性相互作用分離工程（複数可）を含む、１つ以上の異なる精製法の組み合わせを用いることもできる。かかるさらなる精製工程は、抗体の混合物を、抗体の電荷、疎水性度、及び／またはサイズに基づいて分離するものである。本発明の一態様では、かかるさらなる分離工程は、疎水性、アニオン性、またはカチオン性相互作用（またはこれらの組み合わせ）を含むクロマトグラフィーを用いて行われる。多くのクロマトグラフィー樹脂がこれらの方法のそれぞれについて市販されており、関係する特定の抗体に合わせて精製スキームを正確に調整することができる。これらの分離方法のそれぞれは、抗体をカラムを通じて異なる速度で流し、抗体がカラムをさらに通過するにしたがって増加する物理的分離を実現するか、または分離用樹脂（または媒質）に選択的に付着することを可能とする。次いで、異なる溶離剤を用いて抗体を差次的に溶出する。ある場合では、目的の抗体は、不純物がカラムの樹脂に特異的に結合し、目的の抗体は結合しない場合に不純物から分離され（すなわち、目的の抗体はフロースルーに含まれる）、他の場合では、目的の抗体がカラムの樹脂に付着し、不純物及び／または生成物関連物質は洗浄サイクルの間にカラムの樹脂から溶出され、その後、抗体は樹脂の周囲の液体を換えることで放出され、目的の抗体がカラムから溶出される。

特定の実施形態では、「捕捉工程」において、抗体を含む溶液をアフィニティークロマトグラフィーにかけて不純物から抗体を精製する。特定の実施形態では、クロマトグラフィー材料は、目的の抗体に選択的または特異的に結合することが可能である（「捕捉」）。かかるクロマトグラフィー材料の非限定的な例としては、プロテインＡ、プロテインＧ、例えば、目的の抗体が結合する抗原を含むクロマトグラフィー材料、及び、Ｆｃ結合タンパク質を含むクロマトグラフィー材料が挙げられる。

特定の実施形態では、本明細書に記載されるアフィニティークロマトグラフィー工程は、抗α４β７抗体を含む清澄化された回収物をプロテインＡマトリクス（例えば、プロテインＡ樹脂を含むクロマトグラフィーカラム）に供することを含む。特定の実施形態では、プロテインＡは、さまざまな抗体アイソタイプ、特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４のアフィニティー精製及び単離に有用である。プロテインＡは、主としてそのＦｃ領域を介して哺乳動物のＩｇＧに結合する細菌細胞壁のタンパク質である。プロテインＡは、その天然状態において、５つのＩｇＧ結合ドメイン、及び他の不明な機能のドメインを有する。

プロテインＡ樹脂を用いた抗α４β７抗体の精製
一態様では、本明細書に記載される方法は、プロテインＡを使用した、抗体及び１つ以上の不純物を含む液体溶液、例えば、清澄化された回収物からの抗α４β７抗体（例えば、ベドリズマブ）の精製を含む。本方法は、抗α４β７抗体をプロテインＡなどのアフィニティークロマトグラフィーのマトリクスに結合させることを含む。特定の実施形態では、抗体溶液は、１０ｇ／Ｌ超、例えば、１０～５０ｇ／Ｌ、２０～４５ｇ／Ｌまたは３０～４０ｇ／Ｌでアフィニティークロマトグラフィーのマトリクス上にロードすることができる。例えば、抗体溶液は、抗体溶液は、約１０ｇ／Ｌ、１１ｇ／Ｌ、１２ｇ／Ｌ、１３ｇ／Ｌ、１４ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、１６ｇ／Ｌ、１７ｇ／Ｌ、１８ｇ／Ｌ、１９ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２１ｇ／Ｌ、２２ｇ／Ｌ、２３ｇ／Ｌ、２４ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、２６ｇ／Ｌ、２７ｇ／Ｌ、２８ｇ／Ｌ、２９ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３１ｇ／Ｌ、３２ｇ／Ｌ、３３ｇ／Ｌ、３４ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、３６ｇ／Ｌ、３７ｇ／Ｌ、３８ｇ／Ｌ、３９ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４１ｇ／Ｌ、４２ｇ／Ｌ、４３ｇ／Ｌ、４４ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、４６ｇ／Ｌ、４７ｇ／Ｌ、４８ｇ／Ｌ、４９ｇ／Ｌ、または５０ｇ／ＬでプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーのマトリクス上にロードすることができる。

プロテインＡ樹脂は、複数の販売元がある。適当な樹脂の１つとして、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅより販売されるＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）がある。適当な樹脂としては、これらに限定されるものではないが、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅより販売されるＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＬＸ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＰｒｏＡ樹脂、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅより販売されるＰｒｏＳｅｐ ＨＣ、ＰｒｏＳｅｐ Ｕｌｔｒａ、及びＰｒｏＳｅｐ Ｕｌｔｒａ Ｐｌｕｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより販売されるＭａｂＣａｐｔｕｒｅが挙げられる。

プロテインＡカラムは、試料のローディングに先立って適当な平衡化溶液で平衡化することができる。カラムのローディング後、カラムを適当な溶液のセットを用いて１回または複数回洗浄して、１つ以上の不純物を低減させることができ、抗α４β７抗体はプロテインＡに結合したままとなる。

いくつかの実施形態では、プロテインＡマトリクスは、複数回洗浄される。いくつかの実施形態では、プロテインＡマトリクスは、３回洗浄される。一実施形態では、洗浄液のうちの１つ以上はリン酸を含む。一実施形態では、アフィニティーカラムは、ＰＢＳを含む最初の洗浄溶液で洗浄した後、ＮａＣｌ及びＰＢＳを含む第２の洗浄溶液で洗浄し、その後、ＰＢＳを含む第３の洗浄溶液で洗浄することができる。一実施形態では、第１と第３の洗浄溶液は同じである。一実施形態では、第２の洗浄溶液は、ＮａＣｌ（例えば、１Ｍ ＮａＣｌ）及びＰＢＳを含み、ｐＨ７．２である。別の実施形態では、洗浄溶液のうちの１つ以上のｐＨは、約７．０～７．４である。一実施形態では、洗浄溶液のうちの１つ以上のｐＨは、約７．２である。

他の実施形態では、アフィニティーカラムは、ＰＢＳを含む最初の洗浄溶液で洗浄された後、例えば、クエン酸塩、酢酸塩、またはリン酸塩などのバッファーを含む第２及び第３の溶液で洗浄される。一実施形態では、第２及び第３の溶液は、クエン酸ナトリウムバッファーを含む。一実施形態では、第２と第３の洗浄溶液中のクエン酸ナトリウムバッファーは同じである。一実施形態では、第２と第３の洗浄溶液中のクエン酸ナトリウムバッファーは異なる。一実施形態では、第２の洗浄溶液中のクエン酸ナトリウムバッファーは、第３の洗浄溶液中のクエン酸ナトリウムバッファーよりも高いモル濃度を有する。一実施形態では、第２の洗浄溶液中のクエン酸ナトリウムバッファーは、７５ｍＭ～１２５ｍＭまたは１００ｍＭのモル濃度を有し、第３の洗浄溶液中のクエン酸ナトリウムバッファーは１５ｍＭ～４０ｍＭまたは２５ｍＭのモル濃度を有する。一実施形態では、最後の洗浄液のｐＨは、５．６～６．２である。一実施形態では、溶出溶液は、最後の洗浄液とほぼ同じ導電率を有する。

次いで、適当な溶出溶液を使用してプロテインＡカラムを溶出することができる。例えば、グリシン－ＨＣＬ、酢酸、またはクエン酸を溶出溶液として使用することができる。一実施形態では、溶出溶液は、クエン酸、例えば、クエン酸ナトリウム溶出溶液である。いくつかの実施形態では、溶出溶液は、約３．０～４．０（例えば、約３．１～４．０、３．２～４．０、３．３～４．０、３．４～４．０、３．５～４．０、３．６～４．０、３．７～４．０、３．８～４．０、または３．９～４．０）のｐＨを有することができる。特定の実施形態では、溶出溶液は、約３．０～３．４のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、溶出溶液は、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、または約４．０のｐＨを有することができる。いくつかの実施形態では、溶出溶液は、３．３またはそれよりも高いｐＨを有する。いくつかの実施形態では、溶出溶液は、３．４またはそれよりも高いｐＨを有する。いくつかの実施形態では、溶出溶液は、３．５またはそれよりも高いｐＨを有する。いくつかの実施形態では、溶出溶液は、３．６またはそれよりも高いｐＨを有する。いくつかの実施形態では、溶出溶液は、３．７またはそれよりも高いｐＨを有する。いくつかの実施形態では、溶出溶液は、３．８またはそれよりも高いｐＨを有する。いくつかの実施形態では、溶出溶液は、３．９またはそれよりも高いｐＨを有する。溶出溶液は、当該技術分野では周知の手法を用いて監視することができる。目的の溶出液画分を回収した後、さらなるプロセスを行うために調製することができる。

実施例に示されるように、プロテインＡアフィニティーカラムの溶出バッファーｐＨのｐＨがより低い（例えば、２．９～３．３）実施形態と比較して、プロテインＡアフィニティーカラムの溶出バッファーｐＨのｐＨがより高い（例えば、３．３～４．０）実施形態では、抗α４β７抗体を含む溶出液は、ＨＭＷ凝集体のような不純物が少ない。いくつかの実施形態では、溶出液は抗α４β７抗体を含み、かつ約０％～５．０％（例えば、０～０．１％、０～０．２％、０～０．３％、０～０．４％、０～０．５％、０～０．６％、０～０．７％、０～０．８％、０～０．９％、０～１％、０～１．１％、０～１．２％、０～１．３％、０～１．４％、０～１．５％、０～１．６％、０～１．７％、０～１．８％、０～１．９％、０～２％、０～２．５％、０～３％、０～３．５％、０～４％、０～４．５％、または０～５％）のＨＭＷ凝集体を含む。いくつかの実施形態では、溶出液は、抗α４β７抗体を含み、かつ約２％以下（例えば、約１．９％以下、１．８％以下、１．７％以下、１．６％以下、１．５％以下、１．４％以下、１．３％以下、１．２％以下、１．１％以下、１％以下、０．９％以下、０．８％以下、０．７％以下、０．６％以下、０．５％以下、０．４％以下、０．３％以下、０．２％以下、または０．１％以下）のＨＭＷ凝集体を含む。特定の実施形態では、プロテインＡ樹脂の溶出液は、抗α４β７抗体を含み、かつ約０％～２％、２％以下、１．９％以下、１．８％以下、１．７％以下、１．６％以下、１．５％以下、１．４％以下、１．３％以下、１．２％以下、１．１％以下、１％以下、０．９％以下、０．８％以下、０．７％以下、０．６％以下、０．５％以下、０．４％以下、０．３％以下、０．２％以下、または０．１％以下の凝集体、例えばＨＭＷ凝集体を含む。一実施形態では、溶出液は抗α４β７抗体を含み、かつ約１．２％以下のＨＭＷ凝集体を含む。一実施形態では、溶出液は抗α４β７抗体を含み、かつ約１．１％以下のＨＭＷ凝集体を含む。一実施形態では、溶出液は抗α４β７抗体を含み、かつ、約１％以下（例えば、約０．９％以下、０．８％以下、０．７％以下、０．６％以下、０．５％以下、０．４％以下、０．３％以下、０．２％以下、または０．１％以下）のＨＭＷ凝集体を含む。一実施形態では、溶出液は抗α４β７抗体を含み、かつ約０．９％以下のＨＭＷ凝集体を含む。

本明細書に記載されるバッファー及び方法は、プロテインＡから溶出された、抗α４β７抗体を含む組成物などの組成物中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）のレベルを、本明細書に記載される１つ以上のパラメータを有さない溶出バッファーが用いられた場合のＨＣＰのレベルと比較して低減させることができる。いくつかの実施形態では、プロテインＡ樹脂の溶出液は、抗α４β７抗体と約２５０ｐｐｍ未満（例えば、約２４０ｐｐｍ、２３０ｐｐｍ、２２０ｐｐｍ、２１０ｐｐｍ、２００ｐｐｍ、１９０ｐｐｍ、１８０ｐｐｍ、１７０ｐｐｍ、１６０ｐｐｍ、１５０ｐｐｍ、１４０ｐｐｍ、１３０ｐｐｍ、１２０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、９０ｐｐｍ、８０ｐｐｍ、７０ｐｐｍ、６０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、４０ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、９ｐｐｍ、８ｐｐｍ、７ｐｐｍ、６ｐｐｍ、５ｐｐｍ、４ｐｐｍ、３ｐｐｍ、２ｐｐｍ、または１ｐｐｍ未満）のＨＣＰとを含む組成物を含む。いくつかの実施形態では、プロテインＡ樹脂の溶出液は、抗α４β７抗体と約１～２５０ｐｐｍ（例えば、約１～２４０ｐｐｍ、１～２３０ｐｐｍ、１～２２０ｐｐｍ、１～２１０ｐｐｍ、１～２００ｐｐｍ、１～１９０ｐｐｍ、１～１８０ｐｐｍ、１～１７０ｐｐｍ、１～１６０ｐｐｍ、１～１５０ｐｐｍ、１～１４０ｐｐｍ、１～１３０ｐｐｍ、１～１２０ｐｐｍ、１～１００ｐｐｍ、１～９０ｐｐｍ、１～８０ｐｐｍ、１～７０ｐｐｍ、１～６０ｐｐｍ、１～５０ｐｐｍ、１～４０ｐｐｍ、１～３０ｐｐｍ、１～２０ｐｐｍ、１～１０ｐｐｍ、１～９ｐｐｍ、１～８ｐｐｍ、１～７ｐｐｍ、１～６ｐｐｍ、１～５ｐｐｍ、１～４ｐｐｍ、１～３ｐｐｍ、または１～２ｐｐｍ）のＨＣＰとを含む組成物を含む。

一実施形態では、プロテインＡに結合した抗α４β７抗体を、ｐＨが３．３よりも高い（例えば、ｐＨ３．３～４．０、ｐＨ３．４～４．０、ｐＨ３．５～４．０、ｐＨ３．６～４．０、ｐＨ３．７～４．０、ｐＨ３．８～４．０、またはｐＨ３．９～４．０）溶出バッファーで溶出することで、抗α４β７抗体及び減少したレベルのＨＭＷ凝集体を含む溶出液及び／または抗α４β７抗体及び／または減少したレベルのＨＣＰを含む溶出液が得られる。一実施形態では、溶出溶液は、３．３～３．９のｐＨを有する。一実施形態では、溶出バッファーは、３．３～３．８のｐＨを有する。一実施形態では、溶出バッファーのｐＨは、３．４～３．６である。一実施形態では、溶出バッファーのｐＨは、３．４～４．０である。一実施形態では、溶出バッファーは、クエン酸、例えばクエン酸ナトリウム、例えば１００ｍＭクエン酸または２５ｍＭクエン酸を含む。一実施形態では、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムは、２５ｍＭクエン酸ナトリウムを含むバッファーで洗浄及び溶出され、洗浄バッファーは、５．６～６．２、５．７～５．９または５．８のｐＨであり、溶出バッファーは、３．３～３．９、３．４～３．６または３．５のｐＨである。

特定の実施形態では、プロテインＡ樹脂にロードされる材料は、例えば、抗α４β７抗体を発現する組換え細胞株から得られた清澄化された細胞培養回収物である。いくつかの実施形態では、組換え細胞株（すなわち、宿主細胞株）は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞とすることができる。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞は、グルタミンシンテターゼをコードする遺伝子が欠損したＧＳ－ＣＨＯ細胞とすることができる。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞は、ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子が欠損したＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞とすることができる。

プロテインＡ溶出液は、後の精製工程のためにｐＨ及び／または導電率を調整することができる。プロテインＡ溶出液は、さらなるクロマトグラフィー磨き工程に先立ってデプスフィルターを通じた濾過を行って濁度及び／または目的の抗体からさまざまな不純物を除去してもよい。

ＨＩＣを使用した抗α４β７抗体の精製
抗体、例えば、抗α４β７抗体（例えば、ベドリズマブまたはベドリズマブに相当する結合領域を有する抗体）は、下記に詳細に述べ、また、実施例２に記載されるように、プロテインＡによる精製後に下流プロセス技術を用いて精製することもできる。下流プロセスの後半に行われる精製工程は、しばしば「磨き」工程と呼ばれ、不純物のレベルが比較的低くなり得るもののヒトでの使用を意図した抗体の性質を考慮すると更に低いレベルが望ましいという点で固有の課題を与える。

一態様では、本明細書に記載される方法は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂を使用した、抗体及び１つ以上の不純物を含む液体溶液、例えば清澄化された回収物からの抗α４β７抗体の精製を含む。

一実施形態では、本発明は、抗α４β７抗体溶液から高分子量（ＨＭＷ）凝集体を低減する方法であって、抗体溶液を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂と接触させることを含む、方法を提供する。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、タンパク質とＨＩＣ樹脂（例えば、疎水性リガンドで修飾されたポリマーマトリクス）の疎水性表面との間の可逆的相互作用を利用することにより、それらの表面疎水性の差に基づいてタンパク質を分離する。ベドリズマブのような抗α４β７抗体の疎水性を考慮すると、精製プロセスで高疎水性ＨＩＣ樹脂を使用することで、ＨＭＷ凝集体、残留プロテインＡ、及び／または宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）夾雑物を除去することができ、抗α４β７抗体はＨＩＣ樹脂を通過して流れ、結合しない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法で使用するのに適した高疎水性ＨＩＣ樹脂は、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｈｅｘｙｌ－６５０Ｃ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のような、Ｃ６基に結合されたポリメタクリレート系材料を含む。

いくつかの実施形態では、ＨＩＣは、「フロースルーモード」で使用される。したがって、本明細書で使用される「フロースルー画分」とは、本明細書で提供される樹脂を含むカラムを通過した画分中に回収される、移動相バッファー中のタンパク質を指す。

いくつかの実施形態では、抗α４β７抗体及び少なくとも１つの不純物を含む溶液を、ＨＩＣ樹脂を通じた抗α４β７抗体のフロースルーを可能とする条件下で疎水性相互作用（ＨＩＣ）樹脂と接触させる。一実施形態では、ＨＩＣ樹脂は、約１００ｎｍの平均孔径及び／または約１００μｍの孔径を有する。一実施形態では、ＨＩＣ樹脂は、約７．２未満のｐＨを有するバッファーで平衡化される。一実施形態では、ＨＩＣ樹脂は、約５．５～約７．２のｐＨを有するバッファーで平衡化される。一実施形態では、ＨＩＣ樹脂は、約５．５～約７のｐＨを有するバッファーで平衡化される。一実施形態では、バッファーは、リン酸塩バッファーである。一実施形態では、リン酸塩バッファーは、約０．３５Ｍ～約０．１５Ｍのリン酸カリウムを含む。一実施形態では、樹脂ロードは約５５～７５ｍｇ／ｍｌである。

一実施形態では、ＨＩＣカラムにより抗α４β７抗体を精製する方法は、抗α４β７抗体含有溶液をカラムを通じて流すことを含む。すなわち、精製は、カラムのフロースルー中の抗α４β７抗体を回収することを含み、夾雑物はカラムに結合したままであり、抗α４β７抗体及びカラムは、ｐＨ５．２～６．５、５．７～６．２、または約５．９の１５０～３００ｍＭ、１７５～２５０ｍＭ、または約２００ｍＭの濃度のリン酸塩、例えば、リン酸カリウムを含む溶液中にある。

いくつかの実施形態では、高疎水性ＨＩＣ樹脂を使用したかかる方法を用いて、抗α４β７抗体と約０％～２．０％（例えば、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％未満、または２％未満）のＨＭＷ凝集体とを含む組成物を得ることができる。いくつかの実施形態では、高疎水性ＨＩＣ樹脂を使用したかかる方法を用いて、抗α４β７抗体と約２％以下（例えば、約１．９％以下、１．８％以下、１．７％以下、１．６％以下、１．５％以下、１．４％以下、１．３％以下、１．２％以下、１．１％以下、１％以下、０．９％以下、０．８％以下、０．７％以下、０．６％以下、０．５％以下、０．４％以下、０．３％以下、０．２％以下、または０．１％以下）のＨＭＷ凝集体とを含む組成物を得ることができる。特定の実施形態では、高疎水性ＨＩＣ樹脂を使用したかかる方法を用いて、抗α４β７抗体と約０％～２％、２％以下、１．９％以下、１．８％以下、１．７％以下、１．６％以下、１．５％以下、１．４％以下、１．３％以下、１．２％以下、１．１％以下、１％以下、０．９％以下、０．８％以下、０．７％以下、０．６％以下、０．５％以下、０．４％以下、０．３％以下、０．２％以下、または０．１％以下のＨＭＷ凝集体とを含む組成物を得ることができる。特定の実施形態では、高疎水性ＨＩＣ樹脂を使用したかかる方法を用いて、抗α４β７抗体と０．６％未満のＨＭＷ凝集体とを含む組成物を得ることができる。一実施形態では、抗α４β７抗体及び０．５％未満のＨＭＷ凝集体を含む組成物が得られる。一実施形態では、抗α４β７抗体及び０．４％未満のＨＭＷ凝集体を含む組成物が得られる。さらに、組成物は、約０．３ｐｐｍ未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含むことができ、宿主細胞は例えばＧＳ－ＣＨＯ細胞などのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞とした。一実施形態では、組成物は、約０．２２ｐｐｍ未満の残留プロテインＡを含む。

混合モード樹脂を用いた抗α４β７抗体の精製
一態様において、本明細書では、混合モードクロマトグラフィー樹脂を結合／溶出モードで用いて、抗体及び１つ以上の不純物を含む液体溶液、例えば清澄化された細胞培養回収物から抗α４β７抗体、例えばベドリズマブを精製するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、混合モードクロマトグラフィー樹脂は、高い不純物除去率及び高い容量に適した特性を有する。一実施形態では、抗α４β７抗体を精製するための混合モードクロマトグラフィー樹脂は、強いアニオン交換、水素結合、及び疎水性結合性能を有する。別の実施形態では、抗α４β７抗体を精製するための混合モードクロマトグラフィー樹脂は、より小さいビーズ、例えば、直径約３５～４５μｍのビーズ上で強いアニオン交換、水素結合、及び疎水性結合能力を有する。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法及び組成物で使用される混合モードクロマトグラフィー樹脂は、ＣＡＰＴＯ（商標）Ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，現在のＧｌｏｂａｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，ＬＬＣ）である。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法及び組成物で使用される混合モードクロマトグラフィー樹脂は、ＣＡＰＴＯ（商標）Ａｄｈｅｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，現在のＧｌｏｂａｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，ＬＬＣ）である。清澄化された細胞培養回収物は、抗α４β７抗体を組換えにより発現する宿主細胞から得ることができる。特定の実施形態では、宿主細胞は、ＧＳ－ＣＨＯ細胞、またはＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞などのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞とすることができる。

本明細書で提供される混合モードクロマトグラフィー法は、抗α４β７抗体を混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させることを含む。これらに限定されるものではないが、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡクロマトグラフィー）、アニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー、カチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を含むさらなる精製工程を、本明細書に記載される混合モードクロマトグラフィー法の前及び／または後で使用することができる。したがって、いくつかの実施形態では、混合モードクロマトグラフィーで使用されるロード材料は、プロテインＡ溶出液、ＡＥＸ溶出液、ＣＥＸ溶出液、またはＨＩＣ溶出液もしくは回収されたＨＩＣフロースルー材料を含み得る。本明細書で提供される混合モードクロマトグラフィー法は、いくつかの実施形態において、混合モード樹脂を洗浄溶液で洗浄することと、抗体を樹脂から溶出することとをさらに含むことができる。

特定の実施形態では、少なくとも２５ｇ／Ｌ（例えば、少なくとも２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、または１００ｇ／Ｌ）の抗体溶液を混合モードクロマトグラフィー樹脂にロードすることができる。例えば、少なくとも５５ｇ／Ｌの抗体溶液を混合モードクロマトグラフィー樹脂にロードすることができる。特定の実施形態では、約２５ｇ／Ｌ～約１００ｇ／Ｌ、例えば、約２５ｇ／Ｌ～約９５ｇ／Ｌ、約２５ｇ／Ｌ～約９０ｇ／Ｌ、約２５ｇ／Ｌ～約８５ｇ／Ｌ、約２５ｇ／Ｌ～約８０ｇ／Ｌ（例えば、約３０ｇ／Ｌ～約８０ｇ／Ｌ、約３５ｇ／Ｌ～約８０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ～約８０ｇ／Ｌ、約４５ｇ／Ｌ～約８０ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌ～約８０ｇ／Ｌ、約５５ｇ／Ｌ～約８０ｇ／Ｌ、約６０ｇ／Ｌ～約８０ｇ／Ｌ、約６５ｇ／Ｌ～約８０ｇ／Ｌ、約７０ｇ／Ｌ～約８０ｇ／Ｌ、または約７５ｇ／Ｌ～約８０ｇ／Ｌ）の抗体溶液を混合モードクロマトグラフィー樹脂にロードすることができる。例えば、約５５ｇ／Ｌ～約８０ｇ／Ｌの抗体溶液を混合モードクロマトグラフィー樹脂にロードすることができる。

樹脂は、必要に応じて、樹脂から結合した抗体を溶出しない適当な洗浄バッファーで洗浄することができる。一実施形態では、樹脂は、必要に応じて、リン酸ナトリウム洗浄バッファーで洗浄することができる。いくつかの実施形態では、洗浄バッファーは、ｐＨが中性またはその周辺（例えば、ｐＨ６～８）である１０ｍＭリン酸ナトリウム、２５ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、または７５ｍＭリン酸ナトリウムを含むことができる。混合モードクロマトグラフィーと適合する他の適当な洗浄バッファーも広く入手可能である。

本明細書では、混合モードクロマトグラフィー樹脂からの溶出後の抗α４β７抗体の製剤中の抗α４β７抗体の収率を高め、かつ／または凝集体のレベル（例えば、ＨＭＷ種（％））を低減するバッファーについて記載する。抗α４β７抗体の収率を高め、かつ／または凝集体のレベル（例えば、ＨＭＷ種（％））を低減するため、混合モード溶出バッファーのｐＨ及び／または導電率を調節することができる。混合モードクロマトグラフィーと適合する適当な溶出溶液は広く入手可能である。いくつかの実施形態では、混合モードクロマトグラフィー溶出溶液は、クエン酸塩、酢酸塩、またはリン酸塩などのバッファーを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法で混合モードクロマトグラフィー樹脂と使用するための溶出バッファーは、ｐＨ３．５またはそれよりも高いｐＨ（例えば、ｐＨ３．６またはそれよりも高い、ｐＨ３．７またはそれよりも高い、ｐＨ３．８またはそれよりも高い、ｐＨ３．９またはそれよりも高い、ｐＨ４．０またはそれよりも高い、ｐＨ４．１またはそれよりも高い、ｐＨ４．２またはそれよりも高い、ｐＨ４．３またはそれよりも高い、またはｐＨ４．４またはそれよりも高い、またはｐＨ４．５またはそれよりも高い）を有する。例えば、混合モードクロマトグラフィー樹脂と使用するための溶出バッファーは、ｐＨ３．９またはそれよりも高いｐＨを有することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法で混合モードクロマトグラフィー樹脂と使用するための溶出バッファーは、約ｐＨ３．９～約ｐＨ４．５のｐＨ（例えば、約ｐＨ３．９～約ｐＨ４．５、約ｐＨ３．９～約ｐＨ４．４、約ｐＨ３．９～約ｐＨ４．３、約ｐＨ３．９～約ｐＨ４．２、約ｐＨ３．９～約ｐＨ４．１、または約ｐＨ３．９～約ｐＨ４．０のｐＨ）を有する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される混合モードクロマトグラフィー法で使用するための溶出バッファーは、約ｐＨ３．９～約ｐＨ４．４のｐＨを有することができる。

上記に加えての、または上記に代わる実施形態では、本明細書に記載される方法で混合モードクロマトグラフィー樹脂と使用するための溶出バッファーは、ｐＨ４．５またはそれよりも低いｐＨ（例えば、ｐＨ４．４またはそれよりも低い、ｐＨ４．３またはそれよりも低い、ｐＨ４．２またはそれよりも低い、ｐＨ４．１またはそれよりも低い、ｐＨ４．０またはそれよりも低い、ｐＨ３．９またはそれよりも低い、ｐＨ３．８またはそれよりも低い、ｐＨ３．７またはそれよりも低い、ｐＨ３．６またはそれよりも低い、またはｐＨ３．５またはそれよりも低い）を有する。例えば、混合モードクロマトグラフィー樹脂と使用するための溶出バッファーは、ｐＨ４．２またはそれよりも低いｐＨを有することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法で混合モードクロマトグラフィー樹脂と使用するための溶出バッファーは、約ｐＨ４．２～約ｐＨ３．５のｐＨ（例えば、約ｐＨ４．２～約ｐＨ３．６、約ｐＨ４．２～約ｐＨ３．７、約ｐＨ４．２～約ｐＨ３．８、約ｐＨ４．２～約ｐＨ３．９、約ｐＨ４．２～約ｐＨ４．０、または約ｐＨ４．２～約ｐＨ４．１のｐＨ）を有する。例えば、混合モードクロマトグラフィー樹脂と使用するための溶出バッファーは、約ｐＨ４．２～約ｐＨ３．８のｐＨを有することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法において混合モードクロマトグラフィー樹脂と使用するための溶出バッファーは、約４０ｍＳ／ｃｍ以下（例えば、約３９ｍＳ／ｃｍ、３８ｍＳ／ｃｍ、３７ｍＳ／ｃｍ、３６ｍＳ／ｃｍ、３５ｍＳ／ｃｍ、３４ｍＳ／ｃｍ、３３ｍＳ／ｃｍ、３２ｍＳ／ｃｍ、３１ｍＳ／ｃｍ、３０ｍＳ／ｃｍ、２９ｍＳ／ｃｍ、２８ｍＳ／ｃｍ、２７ｍＳ／ｃｍ、２６ｍＳ／ｃｍ、２５ｍＳ／ｃｍ、２４ｍＳ／ｃｍ、２３ｍＳ／ｃｍ、２２ｍＳ／ｃｍ、２１ｍＳ／ｃｍ、２０ｍＳ／ｃｍ、１９ｍＳ／ｃｍ、１８ｍＳ／ｃｍ、１７ｍＳ／ｃｍ、１６ｍＳ／ｃｍ、１５ｍＳ／ｃｍ、１４ｍＳ／ｃｍ、１３ｍＳ／ｃｍ、１２ｍＳ／ｃｍ、１１ｍＳ／ｃｍ、または１０ｍＳ／ｃｍ以下）の導電率を有する。例えば、混合モードクロマトグラフィー樹脂と使用するための溶出バッファーは、約３０ｍＳ／ｃｍ以下の導電率を有することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法において混合モードクロマトグラフィー樹脂と使用するための溶出バッファーは、約１０ｍＳ／ｃｍ～約４０ｍＳ／ｃｍ、例えば約１５ｍＳ／ｃｍ～約３５ｍＳ／ｃｍまたは約２０ｍＳ／ｃｍ～約３０ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。例えば、混合モードクロマトグラフィー樹脂と使用するための溶出バッファーは、約２０ｍＳ／ｃｍ～約３０ｍＳ／ｃｍの導電率を有することができる。

上記に加えての、または上記に代わる実施形態では、本明細書に記載される方法において混合モードクロマトグラフィー樹脂と使用するための溶出バッファーは、約３０ｍＳ／ｃｍ以下（例えば、２９ｍＳ／ｃｍ、２８ｍＳ／ｃｍ、２７ｍＳ／ｃｍ、２６ｍＳ／ｃｍ、２５ｍＳ／ｃｍ、２４ｍＳ／ｃｍ、２３ｍＳ／ｃｍ、２２ｍＳ／ｃｍ、２１ｍＳ／ｃｍ、２０ｍＳ／ｃｍ、１９ｍＳ／ｃｍ、１８ｍＳ／ｃｍ、１７ｍＳ／ｃｍ、１６ｍＳ／ｃｍ、１５ｍＳ／ｃｍ、１４ｍＳ／ｃｍ、１３ｍＳ／ｃｍ、１２ｍＳ／ｃｍ、１１ｍＳ／ｃｍ、または１０ｍＳ／ｃｍ以下）の導電率を有する。例えば、混合モードクロマトグラフィー樹脂と使用するための溶出バッファーは、２８ｍＳ／ｃｍ以下の導電率を有することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法において混合モードクロマトグラフィー樹脂と使用するための溶出バッファーは、約１０ｍＳ／ｃｍ～約４０ｍＳ／ｃｍ（例えば、約１５ｍＳ／ｃｍ～約３５ｍＳ／ｃｍ、約１８ｍＳ／ｃｍ～約３５ｍＳ／ｃｍ、約１１ｍＳ／ｃｍ～約３０ｍＳ／ｃｍ、約１２ｍＳ／ｃｍ～約３０ｍＳ／ｃｍ、約１３ｍＳ／ｃｍ～約３０ｍＳ／ｃｍ、約１４ｍＳ／ｃｍ～約３０ｍＳ／ｃｍ、約１５ｍＳ／ｃｍ～約３０ｍＳ／ｃｍ、約１６ｍＳ／ｃｍ～約３０ｍＳ／ｃｍ、約１７ｍＳ／ｃｍ～約３０ｍＳ／ｃｍ、約１８ｍＳ／ｃｍ～約３０ｍＳ／ｃｍ、約１９ｍＳ／ｃｍ～約３０ｍＳ／ｃｍ、約２０ｍＳ／ｃｍ～約３０ｍＳ／ｃｍ、約２１ｍＳ／ｃｍ～約３０ｍＳ／ｃｍ、約２２ｍＳ／ｃｍ～約３０ｍＳ／ｃｍ、約２３ｍＳ／ｃｍ～約３０ｍＳ／ｃｍ、約２４ｍＳ／ｃｍ～約３０ｍＳ／ｃｍ、約２５ｍＳ／ｃｍ～約３０ｍＳ／ｃｍ、約２６ｍＳ／ｃｍ～約３０ｍＳ／ｃｍ、または約２７ｍＳ／ｃｍ～約３０ｍＳ／ｃｍ）の導電率を有する。例えば、いくつかの実施形態では、混合モードクロマトグラフィー樹脂と使用するための溶出バッファーは、約１８ｍＳ／ｃｍ～約２８ｍＳ／ｃｍの導電率を有することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法において混合モードクロマトグラフィー樹脂と使用するための溶出バッファーは、イオン性塩、例えばＮａＣｌを、約１００～３００ｍＭ（例えば、約１１０～２９０ｍＭ、１２０～２８０ｍＭ、１３０～２７０ｍＭ、１４０～２６０ｍＭ、１５０～２５０ｍＭ、１６０～２４０ｍＭ、１７０～２３０ｍＭ、１８０～２２０ｍＭ、または１９０～２１０ｍＭ）の濃度で含むことができる。例えば、混合モードクロマトグラフィー樹脂と使用するための溶出バッファーは、約１６０ｍＭ～約２４０ｍＭの濃度のＮａＣｌを有することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法において混合モードクロマトグラフィー樹脂と使用するための溶出バッファーは、約１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭ、２００ｍＭ、２１０ｍＭ、２２０ｍＭ、２３０ｍＭ、２４０ｍＭ、２５０ｍＭ、２６０ｍＭ、２７０ｍＭ、２８０ｍＭ、２９０ｍＭ、または３００ｍＭの濃度のＮａＣｌを有する。

いくつかの実施形態では、混合モードクロマトグラフィー樹脂を使用して液体溶液、例えば清澄化された細胞培養回収物から抗α４β７抗体、例えばベドリズマブを精製するための方法は、抗α４β７抗体を、混合モード樹脂を含むカラム上に、樹脂１Ｌ当たり４０～９０、５０～８０、または約６５ｇのタンパク質の濃度でロードすることと、カラムを洗浄することと、カラムを、ｐＨ３．５～４．５、３．９～４．４、または約４．１の溶出バッファー、例えばクエン酸ナトリウムバッファーで溶出することと、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、溶出バッファーの導電率が、１５～３５、２０～３０または約２４ｍＳ／ｃｍとなるように、イオン性塩、例えばＮａＣｌを含めることをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、抗体を、混合モード樹脂を含むカラム上に、樹脂１Ｌ当たり５３～７７ｇのタンパク質の濃度でロードすることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、約３．９～４．４のｐＨ及び約２０～２８ｍＳ／ｃｍの導電率を有する溶出バッファーを用いてカラムから抗体を溶出することを含む。

いくつかの実施形態では、抗α４β７抗体の精製は、本明細書に記載される混合モードクロマトグラフィー法をカチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーと組み合わせて用いることにより行うことができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、混合モードクロマトグラフィーカラムから溶出される抗α４β７抗体の収率を、本明細書に記載される１つ以上のパラメータを有さない溶出バッファーを使用した適当な対照プロセスの収率と比較して、例えば、ｐＨが３．７以下、３．６以下、３．５以下、３．３以下、または３．０以下の溶出バッファーを使用して行ったプロセスと比較して改善することができる。いくつかの実施形態では、収率は、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上高くなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるバッファー及び方法は、混合モードクロマトグラフィーカラムから溶出する抗α４β７抗体の５０％以上（例えば、５５％、６０％、６５％，７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の回収率をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるバッファー及び方法は、混合モードクロマトグラフィーカラムから溶出する抗α４β７抗体の５０％～９５％（例えば、５５～９５％、６０～９５％、６５～９５％、７０～９５％、７５～９５％、８０～９５％、８５～９５％、９０～９５％、またはそれ以上）の回収率をもたらすことができる。

いくつかの実施形態では、混合モードクロマトグラフィー樹脂を使用したかかる組成物及び方法を用いて、抗α４β７抗体と約０％～２．０％（例えば、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％未満、または２％）のＨＭＷ凝集体とを含む組成物を得ることができる。いくつかの実施形態では、混合モードクロマトグラフィー樹脂を使用したかかる方法を用いて、抗α４β７抗体と約２％以下（例えば、約１．９％以下、１．８％以下、１．７％以下、１．６％以下、１．５％以下、１．４％以下、１．３％以下、１．２％以下、１．１％以下、１％以下、０．９％以下、０．８％以下、０．７％以下、０．６％以下、０．５％以下、０．４％以下、０．３％以下、０．２％以下、または０．１％以下）のＨＭＷ凝集体とを含む組成物を得ることができる。特定の実施形態では、混合モードクロマトグラフィー樹脂を使用したかかる方法を用いて、抗α４β７抗体と約０％～２％、２％以下、１．９％以下、１．８％以下、１．７％以下、１．６％以下、１．５％以下、１．４％以下、１．３％以下、１．２％以下、１．１％以下、１％以下、０．９％以下、０．８％以下、０．７％以下、０．６％以下、０．５％以下、０．４％以下、０．３％以下、０．２％以下、または０．１％以下の凝集体とを含む組成物を得ることができる。他の実施形態では、ＨＭＷ凝集体のレベルは、ロード材料中のＨＭＷ凝集体のレベルに対して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上低減される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される混合モードクロマトグラフィー法を用いることで、抗α４β７抗体を含む組成物中のＨＭＷ凝集体のレベルを、本明細書に記載される１つ以上のパラメータを有さない溶出バッファーを使用した適当な対照プロセスから得られるＨＭＷ凝集体のレベルと比較して、例えば、ｐＨが３．７以下、３．６以下、３．５以下、３．３以下、または３．０以下の溶出バッファーを使用して行ったプロセスと比較して、低減することができる。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ凝集体のレベルは、適当な対照と比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上低減される。

カチオン交換（ＣＥＸ）樹脂を用いた抗α４β７抗体の精製
一態様において、本明細書では、カチオン交換（ＣＥＸ）樹脂を結合／溶出モードで用いて、抗体及び１つ以上の不純物を含む液体溶液、例えば清澄化された細胞培養回収物から抗α４β７抗体、例えばベドリズマブを精製するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗α４β７抗体を精製するためのＣＥＸ樹脂は強力なカチオン交換樹脂である。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法及び組成物での使用に適合したＣＥＸ樹脂は、－ＳＯ３^－官能基を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＥＸ樹脂はＮｕｖｉａ ＨＲ－Ｓである。清澄化された細胞培養回収物は、抗α４β７抗体を組換えにより発現する宿主細胞から得ることができる。特定の実施形態では、宿主細胞は、ＧＳ－ＣＨＯ細胞、またはＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞などのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞とすることができる。

本明細書で提供されるＣＥＸ法は、抗α４β７抗体をカチオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させることを含む。これらに限定されるものではないが、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡクロマトグラフィー）、アニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を含むさらなる精製工程を、本明細書に記載されるＣＥＸ法の前及び／または後で使用することができる。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＥＸクロマトグラフィーで使用されるロード材料は、プロテインＡ溶出液、ＡＥＸ溶出液、混合モード溶出液、またはＨＩＣ溶出液を含み得る。本明細書で提供されるＣＥＸ法は、いくつかの実施形態において、ＣＥＸ樹脂を洗浄溶液で洗浄することと、抗体を樹脂から溶出することとをさらに含むことができる。ＣＥＸクロマトグラフィーと適合するタンパク質、例えば抗α４β７抗体を例えばロードする、洗浄する、及び溶出するのに適した溶液は広く入手可能である。いくつかの実施形態では、ＣＥＸクロマトグラフィー溶液は、クエン酸塩、酢酸塩、またはリン酸塩などのバッファーを含む。

特定の実施形態では、少なくとも２０ｇ／Ｌ（例えば、少なくとも２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、または１００ｇ／Ｌ）の抗体溶液をＣＥＸ樹脂にロードすることができる。例えば、少なくとも２５ｇ／Ｌの抗体溶液をＣＥＸ樹脂にロードすることができる。特定の実施形態では、約２５～１００ｇ／Ｌ（例えば、約２５～９０ｇ／Ｌ、２５～８０ｇ／Ｌ、２５～７０ｇ／Ｌ、２５～６０ｇ／Ｌ、２５～５０ｇ／Ｌ、２５～４０ｇ／Ｌ、または２５～３０ｇ／Ｌ）の抗体溶液をＣＥＸ樹脂にロードすることができる。特定の実施形態では、約２５～７０ｇ／Ｌ（例えば、約２５～６５ｇ／Ｌ、３０～６０ｇ／Ｌ、３５～５５ｇ／Ｌ、または４０～５０ｇ／Ｌ）の抗体溶液をＣＥＸ樹脂にロードすることができる。例えば、約３０～６０ｇ／Ｌの抗体溶液をＣＥＸ樹脂にロードすることができる。

樹脂は、必要に応じて、樹脂から結合した抗体を溶出しない適当な洗浄バッファーで洗浄することができる。いくつかの実施形態では、洗浄バッファーは、抗体を樹脂にロードするために使用されるバッファーと同じ組成を有する。一実施形態では、樹脂は、必要に応じて、クエン酸ナトリウムバッファー、例えば２５ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム、または１００ｍＭクエン酸ナトリウムで洗浄することができる。いくつかの実施形態では、洗浄バッファーは、ｐＨ５～７の範囲のｐＨ、例えば、ｐＨ５～６、ｐＨ５．５～６．５、ｐＨ５．１～５．８、ｐＨ５．３～５．６、ｐＨ６～７またはｐＨ５．４を有する。ＣＥＸクロマトグラフィーと適合する他の適当な洗浄バッファーも広く入手可能である。

溶出バッファーのｐＨ及び／または導電率を調整することで、ＣＥＸ樹脂から溶出された抗α４β７抗体の製剤中のＨＭＷ凝集体のレベル、主要（主）アイソフォーム種のレベル、酸性アイソフォーム種のレベル、及び／または塩基性アイソフォーム種のレベルを調節することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法においてＣＥＸ樹脂と使用するための溶出バッファーは、ｐＨ６．０以下（例えば、ｐＨ４．５、ｐＨ４．６、ｐＨ４．７、ｐＨ４．８、ｐＨ４．９、ｐＨ５．０、ｐＨ５．１、ｐＨ５．２、ｐＨ５．３、ｐＨ５．４、ｐＨ５．５、ｐＨ５．６、ｐＨ５．７、ｐＨ５．８、ｐＨ５．９、またはｐＨ６．０以下）のｐＨを有する。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法においてＣＥＸ樹脂と使用するための溶出バッファーは、約ｐＨ４．５～約ｐＨ６．０のｐＨ（例えば、約ｐＨ４．５～約ｐＨ５．８、約ｐＨ４．９～約ｐＨ５．９、約ｐＨ５．０～約ｐＨ６．０、約ｐＨ５．０～約ｐＨ５．９、約ｐＨ５．０～約ｐＨ５．８、約ｐＨ５．０～約ｐＨ５．７、約ｐＨ５．０～約ｐＨ５．６、または約ｐＨ５．０～約ｐＨ５．５のｐＨ）を有する。例えば、ＣＥＸ樹脂と使用するための溶出バッファーは、約ｐＨ５．１～約ｐＨ５．８のｐＨを有することができる。いくつかの実施形態では、ＣＥＸ溶出バッファーのｐＨは、洗浄バッファーと同じである。

上記に加えての、または上記に代わる実施形態では、本明細書に記載される方法においてＣＥＸ樹脂と使用するための溶出バッファーは、約２０ｍＳ／ｃｍ以下（例えば、１９ｍＳ／ｃｍ、１８ｍＳ／ｃｍ、１７ｍＳ／ｃｍ、１６ｍＳ／ｃｍ、１５ｍＳ／ｃｍ、１４ｍＳ／ｃｍ、１３ｍＳ／ｃｍ、１２ｍＳ／ｃｍ、１１ｍＳ／ｃｍ、または１０ｍＳ／ｃｍ以下）の導電率を有する。例えば、ＣＥＸ樹脂と使用するための溶出バッファーは、１６ｍＳ／ｃｍ以下の導電率を有することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法においてＣＥＸ樹脂と使用するための溶出バッファーは、約１０ｍＳ／ｃｍ～約２０ｍＳ／ｃｍ（例えば、約１０ｍＳ／ｃｍ～約１９ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ～約１８ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ～約１７ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ～約１６ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ～約１５ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ～約１４ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ～約１３ｍＳ／ｃｍ、または約１０ｍＳ／ｃｍ～約１２ｍＳ／ｃｍ）の導電率を有する。いくつかの実施形態では、ＣＥＸ樹脂と使用するための溶出バッファーは、約１１ｍＳ／ｃｍ～約１６ｍＳ／ｃｍの導電率を有することができる。上記に加えて、または上記に代えて、ＣＥＸ樹脂と使用するための溶出バッファーは、１４ｍＳ／ｃｍ以下の導電率を有することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法においてＣＥＸ樹脂と使用するための溶出バッファーは、約１１ｍＳ／ｃｍ～約１４ｍＳ／ｃｍ、例えば約１２ｍＳ／ｃｍ～約１４ｍＳ／ｃｍまたは約１３ｍＳ／ｃｍ～約１４ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。例えば、ＣＥＸ樹脂と使用するための溶出バッファーは、約１２ｍＳ／ｃｍ～約１４ｍＳ／ｃｍの導電率を有することができる。上記に加えて、または上記に代えて、ＣＥＸ樹脂と使用するための溶出バッファーは、１１ｍＳ／ｃｍ以上（例えば、１２ｍＳ／ｃｍ、１３ｍＳ／ｃｍ、１４ｍＳ／ｃｍ、１５ｍＳ／ｃｍ、１６ｍＳ／ｃｍ、１７ｍＳ／ｃｍ、１８ｍＳ／ｃｍ、１９ｍＳ／ｃｍ、または２０ｍＳ／ｃｍ以上）の導電率を有することができる。例えば、ＣＥＸ樹脂と使用するための溶出バッファーは、いくつかの実施形態では、１２ｍＳ／ｃｍ以上の導電率を有することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法においてＣＥＸ樹脂と使用するための溶出バッファーは、約５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、または１５０ｍＭの濃度のＮａＣｌを有することができる。例えば、ＣＥＸ樹脂と使用するための溶出バッファーは、約９０ｍＭ～約１２０ｍＭの濃度のＮａＣｌを有することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法においてＣＥＸ樹脂と使用するための溶出バッファーは、約５０～１５０ｍＭ（例えば、約５０～１４０ｍＭ、６０～１３０ｍＭ、７０～１２０ｍＭ、８０～１１０ｍＭ、または９０～１００ｍＭ）の濃度のＮａＣｌを有する。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法においてＣＥＸ樹脂と使用するための溶出バッファーは、約７０～１２０ｍＭ（例えば、約７０～１１０ｍＭ、７０～１００ｍＭ、７０～９０ｍＭ、または７０～８０ｍＭ）の濃度のＮａＣｌを有する。例えば、ＣＥＸ樹脂と使用するための溶出バッファーは、約７０ｍＭ～約１１００ｍＭの濃度のＮａＣｌを有することができる。

いくつかの実施形態では、ＣＥＸ樹脂を使用して液体溶液、例えば清澄化された細胞培養回収物から抗α４β７抗体、例えばベドリズマブを精製するための方法は、抗α４β７抗体を、ＣＥＸ樹脂を含むカラム上に、樹脂１Ｌ当たり４０～９０、５０～６５、または約５７ｇのタンパク質の濃度でロードすることと、カラムを洗浄することと、カラムを、ｐＨ５～６、５．２～５．６、または約５．４のバッファー、例えば酢酸ナトリウムバッファーで溶出することと、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、溶出バッファーの導電率が、５～２５、１０～１７または約１３ｍＳ／ｃｍとなるように、イオン性塩、例えばＮａＣｌを含めることをさらに含む。他の実施形態では、ＣＥＸ樹脂、例えば強力なカチオン交換樹脂を使用して、液体溶液、例えば清澄化された細胞培養回収物から抗α４β７抗体、例えばベドリズマブを精製するための方法は、５～６、５．２～５．６、または約５．４のｐＨ及び５～２５、１０～１５、または約１３ｍＳ／ｃｍの導電率を有するバッファー、例えば酢酸ナトリウムバッファーでカラムを溶出ことを含む。一実施形態では、方法は、約５．４のｐＨ及び約１３ｍＳ／ｃｍの導電率を有する溶出バッファーでカラムを溶出することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＥＸ樹脂に、樹脂１Ｌ当たり約５７ｇのタンパク質の抗体をロードする。

いくつかの実施形態では、抗α４β７抗体の精製は、本明細書に記載されるＣＥＸ樹脂を混合モードクロマトグラフィーと組み合わせて用いることにより行うことができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣＥＸ方法を用いて、抗α４β７抗体と約０％～２．０％（例えば、約０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、または２％）のＨＭＷ凝集体とを含む組成物を得ることができる。いくつかの実施形態では、ＣＥＸ樹脂を使用したかかる方法を用いて、抗α４β７抗体と約２％以下（例えば、約１．９％以下、１．８％以下、１．７％以下、１．６％以下、１．５％以下、１．４％以下、１．３％以下、１．２％以下、１．１％以下、１％以下、０．９％以下、０．８％以下、０．７％以下、０．６％以下、０．５％以下、０．４％以下、０．３％以下、０．２％以下、０．１％以下、０．０９％以下、０．０８％以下、０．０７％以下、０．０６％以下、０．０５％以下、０．０４％以下、０．０３％以下、０．０２％以下、または０．０１％以下）のＨＭＷ凝集体とを含む組成物を得ることができる。特定の実施形態では、ＣＥＸ樹脂を使用したかかる方法を用いて、抗α４β７抗体と約０％～２％、２％以下、１．９％以下、１．８％以下、１．７％以下、１．６％以下、１．５％以下、１．４％以下、１．３％以下、１．２％以下、１．１％以下、１％以下、０．９％以下、０．８％以下、０．７％以下、０．６％以下、０．５％以下、０．４％以下、０．３％以下、０．２％以下、０．１％以下、０．０９％以下、０．０８％以下、０．０７％以下、０．０６％以下、０．０５％以下、０．０４％以下、０．０３％以下、０．０２％以下、または０．０１％以下の凝集体、例えばＨＭＷ凝集体とを含む組成物を得ることができる。他の実施形態では、ＨＭＷ凝集体のレベルは、ロード材料中のＨＭＷ凝集体のレベルに対して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上低減される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＥＸ法を用いることで、抗α４β７抗体を含む組成物中のＨＭＷ凝集体のレベルを、本明細書に記載される１つ以上のパラメータを有さない溶出バッファーを使用した適当な対照ＣＥＸプロセスを使用して得られる抗α４β７抗体の製剤中のＨＭＷ凝集体のレベルと比較して、例えば、ｐＨが６．３以上、６．５以上、６．７以上、または６．９以上、かつ／または導電率が１８ｍＳ／ｃｍ以上、１９ｍＳ／ｃｍ以上、２０ｍＳ／ｃｍ以上、２２ｍＳ／ｃｍ以上、または２４ｍＳ／ｃｍ以上である溶出バッファーを使用して行ったプロセスと比較して、低減することができる。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ凝集体のレベルは、適当な対照と比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上低減される。

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、ＣＥＸ樹脂から抗α４β７抗体を溶出するために使用される溶出バッファーのｐＨ及び／または導電率を用いて、溶出液中に存在する抗α４β７抗体のアイソフォーム分布を調節することができる。例えば、溶出バッファーのｐＨ及び／または導電率を用いて、主要（主）抗体アイソフォームの割合（％）を高くし、酸性アイソフォーム種の割合（％）を低くし、かつ／または塩基性アイソフォーム種の割合（％）を低くすることができる。

いくつかの実施形態では、６．０以下、例えば、５．９以下、５．８以下、５．７以下、５．６以下、５．５以下、５．４以下、５．３以下、または５．２以下、例えば、ｐＨ４．５～６．０、ｐＨ４．５～５．５、またはｐＨ５．０～６．０のｐＨを有する溶出バッファーを選択することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１０ｍＳ／ｃｍ、例えば、少なくとも１１ｍＳ／ｃｍ、少なくとも１２ｍＳ／ｃｍ、少なくとも１３ｍＳ／ｃｍ、少なくとも１４ｍＳ／ｃｍ、少なくとも１５ｍＳ／ｃｍ、少なくとも１６ｍＳ／ｃｍ以上、例えば、１０～１７ｍＳ／ｃｍ、１２～１７ｍＳ／ｃｍ、１３～１７ｍＳ／ｃｍ、１４～１７ｍＳ／ｃｍ、１５～１７ｍＳ／ｃｍ、１６～１７ｍＳ／ｃｍ、１０～１６ｍＳ／ｃｍ、１２～１６ｍＳ／ｃｍ、１３～１６ｍＳ／ｃｍ、１４～１６ｍＳ／ｃｍ、または１５～１６ｍＳ／ｃｍの導電率を有する溶出バッファーを選択することができる。いくつかの実施形態では、上記の溶出バッファー条件を用いて、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、またはそれよりも多い抗α４β７抗体の主要アイソフォームを含む組成物を得ることができる。いくつかの実施形態では、上記の溶出バッファー条件を用いて、２０％以下（例えば、約１９％以下、１８％以下、１７％以下、１６％以下、１５％以下、１４％以下、１３％以下、１２％以下、１１％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、または１％以下）の塩基性アイソフォーム種を含む組成物を得ることができる。特定の実施形態では、ＣＥＸ樹脂を使用したかかる方法を用いて、抗α４β７抗体の主要アイソフォームと約２０％以下、１９％以下、１８％以下、１７％以下、１６％以下、１５％以下、１４％以下、１３％以下、１２％以下、１１％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、または１％以下の塩基性アイソフォーム種を含む組成物を得ることができる。他の実施形態では、塩基性アイソフォーム種のレベルは、ロード材料中の塩基性アイソフォーム種のレベルに対して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上低減される。

ＩＩＩ．分析方法
特定の実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて生成されたクロマトグラフィー試料中の凝集体、モノマー、及び断片のレベルを分析する。特定の実施形態では、凝集体、モノマー、及び断片は、各分子についてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）法を用いて測定される。例えば、限定しようとするものではないが、ＴＳＫ－ゲルＧ３０００ＳＷｘＬ，５μｍ，１２５オングストローム，７．８×３００ｍｍカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を特定の実施形態と組み合わせて使用することができ、別の実施形態では、ＴＳＫ－ゲルＳｕｐｅｒ ＳＷ３０００，４μｍ，２５０オングストローム，４．６×３００ｍｍカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用することができる。特定の実施形態では、上記のカラムはＡｇｉｌｅｎｔまたはＳｈｉｍａｚｈｕ ＨＰＬＣシステムと共に使用される。特定の実施形態では、試料の注入は、例えば、ｐＨ６．８の１００ｍＭ硫酸ナトリウム及び１００ｍＭリン酸ナトリウムからなる移動相を用いたアイソクラティック溶出条件下で行われ、２１４ｎｍのＵＶ吸光度で検出される。特定の実施形態では、移動相は、ｐＨ７．４の１Ｘ ＰＢＳからなり、溶出プロファイルは２８０ｎｍのＵＶ吸光度で検出される。特定の実施形態では、定量は検出されたピークの相対面積に基づく。

質量分析などの任意のさらなる手法を、サイズ変種をアッセイするために使用することができる。

本明細書に報告される抗体、またはその抗原結合部分のさまざまなパラメータを、下記に述べるもののような、標準的な分析方法及び手法を用いて測定することができる。

本明細書に記載される異なる実施形態では、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を使用して、抗体またはその抗原結合部分、例えば、ベドリズマブの集団中に存在する主要アイソフォーム、塩基性アイソフォーム（複数可）、及び酸性アイソフォーム（複数可）の相対量を決定することができる。ＣＥＸ法は、全体の表面電荷に基づいて抗体種を分画する。移動相を用いて低イオン強度に希釈した後、試験試料を適当なバッファー、例えば１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．６）で平衡化した、例えば、Ｄｉｏｎｅｘ Ｐｒｏ－Ｐａｃ（商標）ＷＣＸ－１０カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ（ＵＳＡ））のようなＣＥＸカラムに注入することができる。抗体は、同じバッファー中で塩化ナトリウム勾配を用いて溶出することができる。タンパク質の溶出を２８０ｎｍで監視し、各ピークを酸性、塩基性、または主要アイソフォームのカテゴリーに割り当てることができる。酸性のピークは、主要アイソフォームのピークよりも短い保持時間でカラムから溶出し、塩基性のピークは、主要アイソフォームのピークよりも長い保持時間でカラムから溶出する。主要アイソフォームの割合（％）、酸性種の割合（％）の合計、及び塩基性種の割合（％）の合計を報告する。試料の主要アイソフォームの保持時間を参照基準の保持時間と比較して適合性を決定する。一実施形態では、ＣＥＸアッセイ法は、試験試料を低イオン強度にまで希釈することと、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．６）で平衡化したＣＥＸカラムに注入することと、このバッファー中のＮａＣｌ勾配でカラムを溶出することと、２８０ｎｍでピークを監視することと、各ピークを、酸性、主要、または塩基性として割り当てることと、を含み、酸性ピークは最も短い保持時間で溶出し、主要ピークは２番目に溶出し、塩基性ピークは最も長い保持時間で溶出し、各ピークの面積が定量化され、その量がピーク面積全体の割合（％）として計算される。

本明細書に記載される異なる実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を使用して、抗体またはその抗原結合部分、例えば、ベドリズマブの集団中に存在するモノマー、高分子量（ＨＭＷ）凝集体、及び低分子量（ＬＭＷ）分解産物の相対レベルを決定することができる。ＳＥＣ法は、ＨＭＷ種及びＬＭＷ分解産物からの抗体モノマーのサイズに基づく分離を可能とする。各試験試料及び参照基準を、適当なバッファーを用いて、市販のＳＥＣカラムを使用して分析することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＳＥＣ分析は、Ｇ３０００ ＳＷｘｌカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ （ＵＳＡ））、または直列に接続した２本のＧ３０００ ＳＷｘｌカラムと、アイソクラティックなリン酸－塩化ナトリウムバッファーシステム（ｐＨ６．８）を用いて行うことができる。タンパク質種の溶出を２８０ｎｍで監視する。主ピーク（モノマー）及び全ピーク面積を評価して純度を決定する。一実施形態では、ＳＥＣ分析は、直列に接続された２本のＧ３０００ ＳＷｘｌカラムに試料を注入することと、アイソクラティックなリン酸－塩化ナトリウムシステム（ｐＨ６．８）中で流すことと、を含み、タンパク質種の溶出が２８０ｎｍで監視され、主ピーク（モノマー）及び全ピーク面積が測定される。試料の純度（％）（モノマー（％）として計算）、ＨＭＷ凝集体（％）、及び／またはＬＭＷ分解産物（％）を報告する。

抗体製剤中に存在する残留ＣＨＯ宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）不純物を、必要に応じて、標準的な技法を用いた、素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定することができる。Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ（ＵＳＡ））から販売されるＣＨＯ ＨＣＰ ＥＬＩＳＡキット３Ｇなど、この目的で設計された多くのＥＬＩＳＡキットが市販されている。試験試料中の宿主細胞タンパク質は、固定化したポリクローナル抗ＣＨＯ ＨＣＰ抗体を使用して捕捉することができる。次いで、捕捉されたタンパク質を、同じ抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したものなどの適当な検出試薬を用いて検出することができる。この例示的な実施形態では、ＣＨＯ ＨＣＰの濃度に正比例する捕捉されたペルオキシダーゼの量を、ペルオキシダーゼ基質である３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いて４５０ｎｍで比色分析により測定することができる。したがって、ＣＨＯ ＨＣＰアッセイは、ポリクローナル抗ＣＨＯ ＨＣＰ抗体を使用してＨＣＰを捕捉することを含み、ＨＣＰは、ペルオキシダーゼ基質である３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を４５０ｎｍで比色分析により測定される基質に変換する、ポリクローナル抗ＣＨＯ ＨＣＰ抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼ標識した抗体を結合させた後で検出される。ＨＣＰの濃度は、試験キットに含まれるものなどのＣＨＯ ＨＣＰ検量線との比較により決定することができ、抗体製剤中の総タンパク質レベルの割合（％）として報告される。

ＩＶ．下流プロセス及び製剤化
抗α４β７抗体（例えば、ベドリズマブまたはベドリズマブに相当する結合領域を有する抗体）は、夾雑する可溶性タンパク質及びポリペプチドからさらに精製することができ、適当な精製法の例としては以下の方法があり、これらを必要に応じて単独または組み合わせで、本明細書で提供される方法の１つ以上と併せて使用することができる：例えば、プロテインＡなどの抗体のＦｃ領域に結合する樹脂を使用したアフィニティークロマトグラフィー；例えば、ＳＰ－セファロース（商標）またはＣＭ－セファロース（商標）ヒドロキシアパタイトなどのカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）などのイオン交換カラムまたは樹脂を用いた分画；アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）；疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）；混合モードクロマトグラフィー；エタノール沈殿；クロマトフォーカシング；硫酸アンモニウム沈殿；例えばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５（商標）を用いたゲル濾過；限外濾過及び／またはダイアフィルトレーション、または上記のものの組み合わせ。精製法の例は、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ，２：４８０－４９９（２０１０）に記載されている。精製プロセスの終了時には、組換えタンパク質の純度は高く、例えば、下記に述べる医薬抗体製剤におけるヒトの治療用途に適している。精製の後、高純度の組換えタンパク質に限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）を行って、ヒトへの投与に適した医薬製剤とすることができる。

限外濾過／ダイアフィルトレーションの後、抗体製剤は液体のままとしてもよく、または凍結乾燥して乾燥抗体製剤としてもよい。一態様では、乾燥した凍結乾燥抗体製剤は、１８０ｍｇ、２４０ｍｇ、３００ｍｇ、３６０ｍｇ、４５０ｍｇまたは６００ｍｇの抗α４β７抗体を含む単回用量バイアル中で提供され、滅菌水などの液体で戻して投与することができる。別の態様では、抗α４β７抗体、例えばベドリズマブは、投与を要する対象に投与されるまで例えば、バイアル、注射器、またはカートリッジなどの容器中、約２～８℃で保存される安定した液体医薬組成物中にある。いくつかの実施形態では、抗α４β７抗体の戻された凍結乾燥製剤または安定した液体医薬組成物は、約０％～５．０％、０％～２％、２％以下、１％以下、０．６％以下、または０．５％以下の凝集体を含む。

したがって、いくつかの実施形態では、本明細書では、ヒト化抗α４β７抗体、またはその抗原結合部分を含む抗α４β７抗体の戻された凍結乾燥製剤または安定した液体医薬組成物が提供される。抗α４β７抗体、例えばベドリズマブを含む凍結乾燥製剤の例は、米国特許第９，７６４，０３３号に記載されており、その内容を参照によって本明細書に援用する。抗α４β７抗体、例えばベドリズマブを含む液体製剤の例は、米国特許第１０，０４０，８５５号に記載されており、その内容を参照によって本明細書に援用する。いくつかの実施形態では、抗α４β７抗体の戻された凍結乾燥製剤または安定した液体医薬組成物は、約１１％～１６％、１２％～１５％、１４％以下、１３％以下、１２％以下、または１１％以下の塩基性アイソフォーム種を含む。いくつかの実施形態では、抗α４β７抗体の戻された凍結乾燥製剤または安定した液体医薬組成物は、６５％～７５％、６６％～７４％、６７％～７３％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、または少なくとも７０％の主要アイソフォームを含む。

精製された抗体、例えば、抗α４β７抗体（例えば、ベドリズマブまたはベドリズマブに相当する結合領域を有する抗体）を濃縮して、濃縮されたタンパク質組成物、例えば、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬもしくは１２５ｍｇ／ｍＬもしくは１５０ｍｇ／ｍＬの抗体濃度、または約１００ｍｇ／ｍＬもしくは１２５ｍｇ／ｍＬもしくは１５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有するタンパク質組成物を提供することができる。濃縮された抗体産物は、濃度条件下で可能なレベルにまで、例えば、ポリペプチドが溶液に溶けなくなる濃度にまで濃縮することができる点は理解されよう。

いくつかの実施形態では、本明細書で得られる組成物は、ベドリズマブなどの精製された抗α４β７抗体を含み、この後、ヒトで使用するために製剤化される。一実施形態では、精製された抗体は、乾燥した凍結乾燥製剤として製剤化され、これを滅菌水などの液体で戻して投与することができる。戻された製剤の投与は、上記に述べた経路のうちの１つによる非経口注射によって行うことができる。静脈内注射は、滅菌等張生理食塩水、バッファー、例えば、リン酸緩衝生理食塩水またはリンゲル（乳酸またはデキストロース）溶液などで更に希釈することにより、点滴によって行うことができる。いくつかの実施形態では、精製された抗体は液体製剤として製剤化され、抗α４β７抗体は例えば、約５４ｍｇ、１０８ｍｇまたは１６５ｍｇまたは約２１６ｍｇの用量で皮下注射により投与される。

本明細書に記載される精製された組成物を保存及び凍結するために使用することができる容器としては、ポリカーボネートボトル（ＩＶ製剤用）またはＰＥＴＧボトル（皮下製剤用）が挙げられる。製剤をボトルに分注した後、凍結を行うことができる（例えば、－６０℃以下）。

以下の実施例は、抗体を精製するための改良された方法及び組成物を例示するものである。下記の実施例１～５を用いて、抗α４β７抗体、特にベドリズマブの精製された組成物を得ることができる。本明細書には、下記の実施例で記載されるさまざまなパラメータを含む、下記の実施例に記載される方法が含まれる。

実施例
以下の実施例では、ＣＨＯ細胞を発現系として使用した細胞培養物中で産生されたベドリズマブの精製プロセスについて記載する。

実施例１：プロテインＡ樹脂を使用したベドリズマブの精製に対する溶出バッファーの影響
本実施例では、治療用の抗α４β７抗体、例えば、ベドリズマブの製造に使用することができる、プロテインＡ樹脂を使用した抗体精製法を示す。本明細書に記載されるように、プロテインＡ樹脂の溶出ｐＨの調整によって、ベドリズマブの精製組成物中の凝集体のレベルが低下した。

ベドリズマブを、抗体を発現するように遺伝子操作された組換えチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＧＳ－ＣＨＯ）の細胞培養により製造した（一般的な細胞培養法については、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ｍＡｂｓ ２：５，４６６－４７７を参照）。

ＣＨＯ細胞内での細胞培養後、プロテインＡアフィニティーカラムを使用した一次回収後にベドリズマブの選択的捕捉を行った。組換えプロテインＡ樹脂を使用したアフィニティークロマトグラフィーを行って上流の一次回収プロセスから得られた清澄化回収物から抗体を選択的に除去した。このステップで、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）などのプロセス関連不純物も除去した。

プロテインＡ樹脂は、ＰＢＳ平衡化溶液（ｐＨ７．２）で最初に平衡化した。次いで、清澄化回収物をロードした。３回の洗浄を行った。洗浄１は平衡化溶液と同じＰＢＳ洗浄溶液（ｐＨ７．２）で行い、洗浄２は１Ｍ ＮａＣｌのＰＢＳ洗浄溶液（ｐＨ７．２）で行い、洗浄３は洗浄１（ＰＢＳ）及び平衡化に用いた溶液と同じ溶液で行った。抗体は樹脂に結合したままであるため、各洗浄は抗体から不純物を洗い流す役割を果たした。次いで、異なるｐＨの溶出バッファーを使用して抗体を樹脂から溶出した。図１に示されるように、ｐＨ３～３．５の溶出バッファーを試した。図１に示される結果は、ｐＨが高くなるにつれて凝集体の割合（％）が減少することを示している。図１に示されるように、ｐＨ３でプロテインＡからベドリズマブを溶出すると、高いレベル（すなわち約１～１．２％）の凝集体を有する溶出液が得られたのに対して、より高いｐＨ（例えば、ｐＨ約３．５）を有する溶出バッファーを用いて抗体を溶出して得られた溶出液は、約０．６～０．８５％の凝集体を有していた。

さらなる試験を行って、ベドリズマブの製品品質に大きく影響するプロテインＡ精製に関連したプロセスパラメータを特定した。組換えによりベドリズマブを発現するＧＳ－ＣＨＯ細胞からの清澄化回収物をＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅＬＸ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）にロードした。結合した抗体を、溶出に先立ってクエン酸ナトリウムバッファー及びＰＢＳで洗浄した。溶出ｐＨをｐＨ３．３～ｐＨ３．９の範囲で評価した。溶出にはクエン酸ナトリウムバッファーを用いた。凝集体のレベル（ＨＭＷ種の割合（％））及びベドリズマブの精製組成物中のＨＣＰのレベルに対する溶出バッファーの影響を表１及び図２に示す。

表１に示されるように、線形回帰モデルは、溶出ｐＨがすべてのアッセイの結果に有意な影響を有することを示した（ｐ＜０．０５）。データのばらつきはＬＭＷ割合（％）及びＨＣＰでわずかに大きかったが、ロード量がＨＣＰのクリアランスに影響した。ロード量とロード流量の組み合わせがＬＭＷ（％）にわずかに影響した。

・モノマー（％）：
溶出ｐＨは、モノマー割合（％）に有意な影響を示した（ｐ＜０．０５）。他のいずれの入力パラメータもモノマー割合（％）との相関は示さなかった。溶出ｐＨを上げるにしたがって、モノマー割合（％）は増加した。

・ＨＭＷ割合（％）：
溶出ｐＨは、ＨＭＷ割合（％）に有意な影響を示した（ｐ＜０．０５）。他のいずれの入力パラメータもＨＭＷ割合（％）との相関は示さなかった。溶出ｐＨを上げるにしたがって、ＨＭＷ割合（％）は減少した。

・ＬＭＷ割合（％）：
溶出ｐＨ、及びロード量とロード流量との組み合わせは、ＬＭＷ割合（％）に影響した（ｐ＜０．０５）が、ＬＭＷ割合（％）に対する入力パラメータの影響は最小限と考えられる。

・ＨＣＰ：
溶出ｐＨ及びロード量は、ＨＣＰに対して、ｐｐｍ及び対数減少係数の両方で有意な影響を示した（ｐ＜０．０５）。

ベドリズマブは、ベドリズマブを他のＩｇＧ抗体よりも優れたものものとする、例えば高い疎水性などの特性を有する。図３は、ベドリズマブと３つの他のＩｇＧ抗体との比較を示し、各抗体（ベドリズマブ（ＭＬＮ０００２）、ＩｇＧ Ａ、ＩｇＧ Ｂ、またはＩｇＧ Ｃ）を、ｐＨを増加させた（左から右へとｐＨが増加する）溶出バッファーを用いてカチオン交換カラム（Ｎｕｖｉａ Ｓ、Ｂｉｏ Ｒａｄ）から溶出させた場合の溶出液中にみられる凝集体の量（ＨＭＷ割合（％））を示す。ベドリズマブの凝集体クリアランスの性能の変動は、それぞれの最適条件における他の３つの試験したＩｇＧよりも変動が大きかった。したがって、図３にみられるように、ｐＨは、ベドリズマブの精製時の凝集体レベルに影響を与え得る。

実施例２：疎水性ＨＩＣ樹脂を用いたベドリズマブの精製
ベドリズマブの疎水性の性質を考慮すると、ＨＭＷ凝集体を減少させることは下流プロセスでは困難な場合がある。さらに、ベドリズマブが例えばＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞内で生成される場合、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）のレベルを最小限に抑えることも不可欠である。ＨＩＣ、混合モード、及びアニオン交換樹脂、及び膜を、高スループットの方法により性能についてスクリーニングした。この後、８種類のＨＩＣ樹脂を、ベドリズマブの精製において凝集体を減少させ、ＨＰＣを最小化するそれぞれの能力について、異なる平衡化、ロード、及び溶出条件下で試験した。許容される凝集体クリアランスを示し、ＨＣＰを最小化することができた唯一の樹脂は、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｈｅｘｙｌ－６５０Ｃ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）疎水性ＨＩＣ樹脂であった。より具体的には、Ｈｅｘｙｌ－６５０Ｃは、適当な結合条件下（例えば、ｐＨ６．７で０．５Ｍの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）で凝集体レベルをＨＭＷ凝集体約１．５％～０．３５％に減少させた。試験した他の樹脂としては、ブチル－６５０Ｍ、ブチル－６００Ｍ、スーパーブチル－５５Ｃ、フェニル－６５０Ｍ、フェニル－６００Ｍ、ＰＰＧ－６００Ｍ、及びエーテル－６５０Ｍが含まれたが、凝集体のこのような低いレベルは達成できなかった。

Ｈｅｘｙｌ－６５０Ｃは、エーテル、ＰＰＧ、フェニル、及びブチルを含む、試験した他の樹脂と比べて最も疎水性の高い樹脂であった。Ｈｅｘｙｌ－６５０Ｃは約１０００Ａの平均孔径及び約１００μｍの平均粒径を有するものである。

さらなる実験を、Ｈｅｘｙｌ－６５０Ｃを用いて結合／溶出及びフロースルーモードの両方で行った。結合／溶出実験では、Ｈｅｘｙｌ－６５０Ｃは、凝集体をＨＭＷ約０．３０％まで減少させることができたが、結合容量は低かった（樹脂１ｍｌ当たり約２０ｍｇ）。これに対して、Ｈｅｘｙｌ－６５０Ｃ及びベドリズマブを用いたフロースルーモードでは、凝集体の減少及びロード容量の増加の両方が示された。１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．７）中、０．２Ｍ塩化ナトリウムで１０８ｍｇ／ｍｌの初期の未調整ロードを用いてフロースルー実験を行った。フロースルーのこれらの条件で、ＨＭＷ１．３９％～ＨＭＷ０．７１％への減少がもたらされた。塩化ナトリウムのリン酸カルシウムへの置換を含む、塩の増加により、凝集体の低減がさらにいっそう改善された。２５０ｍＭリン酸カリウム、５０ｍＭ塩化カリウム（平衡化及びロード調整用）を用いた６７．５ｍｇ／ｍｌの少ないロードによって、ＨＭＷ約０．７２％～ＨＭＷ約０．３％への凝集体の減少がもたらされた（回収率９５．５％）。

カラムベースの実験計画法（ＤＯＥ）の試験を行って、ベドリズマブの精製において凝集体レベルを減少させる、フロースルーモードにおけるＨｅｘｙｌ－６５０Ｃの能力をさらに評価した。表２に示されるように、低いｐＨ及び高いリン酸塩ロード平衡化条件を用いた場合に、低いＨＭＷ割合（％）及び低いＨＣＰレベル（ｐｐｍ）が得られた。６０ｍｇ／ｍｌの樹脂ロードを用いて表２の実験を行った。低ｐＨ条件ではいずれも、ＨＭＷの減少率はＨＭＷ１．０％～０．３４％以下への値となった。抗体の平均回収率は、約９１．５％であった。高ｐＨと高リン酸カリウムとの組み合わせは、ベドリズマブの主要な種の樹脂への親和性を増加させたようであり、回収率は低くなった。これに対して、より高いレベルのリン酸塩と低ｐＨとの組み合わせでは、ＨＭＷクリアランスは高くなった。低リン酸塩及び低ｐＨでは、低いＨＭＷ、低いＨＣＰ、及び低い残留プロテインＡの滲出が観察された（例えば、下記の１２行目を参照）。したがって、高疎水性ＨＩＣ樹脂は、凝集体（ＨＭＷ）ベドリズマブを０．５％よりも低いレベルにまで効果的に除去することができた。

実施例３： 混合モードクロマトグラフィー樹脂を使用したベドリズマブの精製に対するカラムロード、溶出バッファーｐＨ、及び導電率の影響
ベドリズマブを高い抗体力価（≧５．０ｇ／Ｌ）で発現する生産ＣＨＯ細胞株を作製した。この生産ＣＨＯ細胞株では、大量のこの疎水性の高い抗体に対処できるように設計された精製プロセスの開発が求められる。

Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓは、より小さいビーズ径で強力なアニオン交換、水素結合、及び疎水性相互作用の機能性を有する混合モード（ＭＸＭ）クロマトグラフィー樹脂であり、不純物除去の改善及び容量の増加を可能とする。

フロースルーモードで用いられるＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ混合モード樹脂は、ベドリズマブを精製することは可能であったが、収率及び不純物除去のレベルは理想よりも低かった。結合－溶出モードでＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを使用して行った事前の特性評価実験により、樹脂ロード容量、溶出バッファーのｐＨ、及び溶出バッファーの導電率の３つのプロセス入力パラメータに関連してステップ収率及び／または不純物除去性能の顕著な損失が示された。本実施例では、これらのパラメータの変動がベドリズマブの精製におけるＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓの性能に与える影響、ならびにさまざまな製品品質特性に対するその影響についてさらに調べるように計画された試験について述べる。

材料及び方法
清澄化した細胞培養回収物を、プロテインＡでの精製の後、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）クロマトグラフィーカラムにロードした。混合モードの樹脂をｐＨ７．８のリン酸ナトリウムバッファーを用いて洗浄し、下記に記載するさまざまな条件下で抗体をカラムから溶出した。

試料を直ちにＳＥＣによる分析用に提出し、２～８℃で保存し、１週間以内に処理した。残りのアッセイ（ＣＥＸ，ＣＨＯ ＨＣＰ ＥＬＩＳＡ）は、凍結した保持物（－８０℃）を使用して行った。分析に用いた方法を下記の表３に示し、下記に詳細に述べる。待ち行列に入れられた施行の後にサンプル採取したロード材料を分析してロード材料の品質特性に大きな変化がないことを確認した。

実験計画
完全な要因計画を、樹脂ロード量、溶出バッファーｐＨ、及び溶出バッファー導電率に３つのレベルで用いた。これらの実験ではクエン酸ナトリウム溶出バッファーを用いた。得られた計画には、３つの中心点条件を有する３０回の施行が含まれた。更なる中心点条件を、表５においてＤＯＥパターン２２２で示される実験計画の一部とした。他のすべてのプロセス入力パラメータは、中心点条件に維持した。溶出バッファーの塩化ナトリウム濃度を用いて実験を計画し、溶出バッファーの導電率測定値を統計分析の入力パラメータ値として用いた。試験したパラメータ範囲及び計画の概要をそれぞれ、表４及び表５に記載する。

ＤＯＥパターン（３）：上位レベル、（２）：中位レベル、（１）：下位レベル、（０）：各入力パラメータ範囲の中心点。ＮａＣｌ濃度を入力パラメータとして用いて実験を計画し、実際の導電率測定値を統計分析で用いた。

計算
ＨＭＷクリアランス（％） ＝ （１－（溶出液 ＨＭＷ／ロード ＨＭＷ））＊１００
対数減少係数（ＬＲＦ）を以下のように決定した。

［残留_溶出液］は、溶出溶中のＣＨＯ ＨＣＰまたはプロテインＡの濃度であり、［残留_ロード］は、同じ施行のロード中のＣＨＯ ＨＣＰまたはプロテインＡの濃度であり、いずれの濃度も、対応するＭＬＮ０００２濃度に対するｐｐｍの単位である。

統計分析
計画内のすべての実験におけるアッセイ結果及びＫＰＩを示す生成物品質を、ＪＭＰ １１統計ソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を使用して分析した。それぞれの応答を式１に示される線形モデルへの当てはめによって分析した。

式１ 回帰の一般的線形モデル

ただし、ｙ_ｕは、ｕ番目の観察であり、ｘ_ｉｕは独立変数であり、異なるβ項は、モデル係数の推定値である。

統計分析及びモデリングにおいて、比較的小さいデータ群の、比較的多数の潜在的入力を含むモデルへの当てはめは、しばしばオーバーフィッティングをもたらす。オーバーフィッティングの特徴の１つは、高いＲ^２値を有するが複数の科学的に無意味な（かつ統計的に有意でない）項を有するモデルである。オーバーフィッティングを回避しつつ、最良の統計的に有意なモデルを決定するには、入力パラメータの前方回帰及び目的の応答を用いて各モデルを開発した。回帰の停止規則はｐ値閾値とし、ｐ値＜０．０５の場合に入力パラメータをモデルに組み込んだ。この分析用のアルゴリズムによって、（ｉ）最も高い可能なＲ^２値を達成し、（ｉｉ）できるだけ少ない数の入力パラメータを含み、（ｉｉｉ）マルチモードクロマトグラフィー処理が行われる抗体で物理的に可能な挙動を記述する（かかる知見が初期の技術的期待と一致しないようにみえる場合であっても）モデルが生成された。

結果と考察
統計分析によって求められた各応答のモデルについて、パラメータ推定値、対応するｐ値、及びＲ^２値を含む実験結果を表６及び表７に示す。

抗体の収率に対する溶出バッファーのｐＨ及び導電率の影響
工程回収率またはベドリズマブの収率に対する溶出バッファーのｐＨ及び溶出バッファーの導電率の影響を図４及び図５に示す。図４及び図５に示されるように、観察された工程回収率のデータは、Ｒ^２値が０．９３０であることにより示されるように、線形回帰モデルによく当てはまっている。

図４及び図５は、溶出バッファーのｐＨ及び導電率またはロード量に対するＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓによる工程回収率のプロットを示す。回収率は、溶出バッファーのｐＨ（ｐ＜０．０００１）及び樹脂のロード量（ｐ＝０．００２１）によって有意に影響され、それほどではないが溶出バッファーの導電率による影響もみられた（ｐ＝０．０１８９）。任意のレベルの溶出バッファー導電率及びロード量において約４．４０の溶出バッファーｐＨで、工程回収率は８３．９１％以下となった（施行１、４、１１～１４、１６、１９、及び２７）。低い樹脂ロード量は、回収率に負の影響をもたらした。試料ローディング後の洗浄工程において、樹脂１Ｌ当たり７７ｇのロード量のすべての施行でブレークスルーが観察された。ロード量の影響は、溶出バッファーｐＨに依存した（ｐ＝０．０１７０）。低い溶出バッファーｐＨ（すなわち、ｐＨ ３．８）では、ロード量は回収率に実質的な影響を及ぼさなかったのに対して、溶出バッファーｐＨが高くなるのにしたがって、低い樹脂ロードで回収率は低くなった（溶出バッファーｐＨ約４．４では、樹脂１Ｌ当たり７７ｇのロード量で８１．９４～８３．９１％に対して、樹脂１Ｌ当たり５３ｇのロード量で７３．３６～７８．８４％）。溶出バッファーの導電率は、実験結果及びモデル予測によれば回収率にわずかな影響しか及ぼさなかった。溶出バッファーｐＨ４．４０、溶出バッファー導電率２８．８９ｍＳ／ｃｍ、及び樹脂１Ｌ当たりロード量５３ｇで、７３．３６％と最も低い回収率が観察された（施行１３、モデルにより７６．２２％と予測された）。

したがって、図４及び図５に示されるように、ベドリズマブの収率は、混合モードクロマトグラフィー樹脂が、最適化されたｐＨ及び導電率を有する溶出バッファーと共に使用される場合に高くなっている。

ＨＭＷ凝集体に対する溶出バッファーのｐＨ及び導電率の影響
凝集体のレベルに対する溶出バッファーのｐＨ及び導電率の影響を、ＨＭＷ量に対する入力パラメータの影響を示す図６及び図７に示す。

線形回帰モデルによれば、溶出液中のＨＭＷ種の量は、溶出バッファーのｐＨ（ｐ＜０．０００１）、溶出バッファーの導電率（ｐ＜０．０００１）、及びロード量（ｐ＝０．００１５）により影響される（Ｒ^２＝０．９６２）。溶出ｐＨ及び導電率が高くなると、溶出液中のＨＭＷ種の量は減少し、ロード量を増加させるとレベルが高くなる。このモデルによって、溶出バッファーのｐＨと導電率との間の統計的に有意な（ｐ＝０．０４６２）相互作用も予測された。

下記図６及び図７に示されるように、約１％以上のＨＭＷ種含量が約３．８０の溶出バッファーｐＨで観察された。溶出ｐＨ３．８０、溶出導電率１９．６７ｍＳ／ｃｍ（１６０ｍＭのＮａＣｌ）及び樹脂１Ｌ当たりのロード量６５ｇ（施行２）で、１．２３％の最も高いＨＭＷ含量が得られた（モデルによれば１．１９％と予測された）。予測された最も悪いケースのＨＭＷ含量は、同じ溶出バッファー条件下で７７ｇ／Ｌで１．２４％であった。

線形回帰モデルによれば、溶出バッファーｐＨ（ｐ＜０．０００１）、溶出バッファー導電率（ｐ＝０．０００３）、及びロード量（ｐ＝０．００１６）はそれぞれ、ＨＭＷクリアランス性能に統計的に有意な影響を有する。この試験で評価したすべての条件で一定のレベルのクリアランス（１２．５０～７２．７９％）が達成された。これらの入力の中でも、溶出ｐＨが最も大きい影響があった。溶出バッファーｐＨが高くなるとＨＭＷクリアランスが改善されたが、これは回収率に対する影響と逆である。モデルによれば、溶出バッファー導電率を高くし、ロード量を低くすると、ＨＭＷクリアランスは高くなった。

したがって、図６及び図７に示されるように、ベドリズマブの精製組成物中の凝集体のレベル（ＨＭＷ種の割合（％））は、混合モードクロマトグラフィー樹脂から抗体を溶出するために用いられる溶出バッファーｐＨ及び溶出バッファー導電率の選択によって調節することができる。さらに、凝集体のレベルは、混合モードクロマトグラフィー樹脂を、高いｐＨ及び／または高い導電率を有する溶出バッファーと共に用いた場合に低下させることができる。

実施例４： カチオン交換（ＣＥＸ）を使用したベドリズマブの精製に対する溶出バッファーの影響
ベドリズマブ製剤中の凝集体のレベルをさらに低減するための手段としてカチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーについても調べた。本明細書では、Ｎｕｖｉａ ＨＲ－Ｓ樹脂（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いたＣＥＸクロマトグラフィーをベドリズマブの精製に適合することに焦点を当てた試験について、この疎水性抗体からの凝集体レベルの低減に特に重点をおいて記載する。結合／溶出モードで行ったＣＥＸプロセスの溶出条件を評価した。実験計画法（ＤｏＥ）アプローチを用いて、溶出バッファーのｐＨ及び溶出バッファーの導電率を含むいくつかのパラメータがプロセスの結果に及ぼす影響を評価した。

材料及び方法
本試験で用いたロード材料及び分析法は、上記の実施例３で述べたものと同様である。

実験計画
初期のスクリーニング試験及び予備リスク評価によって、樹脂が結合／溶出モードで使用される場合、溶出バッファーのｐＨ及び溶出バッファーの導電率が、Ｎｕｖｉａ ＨＲ－Ｓのプロセス性能結果（ＰＰＯ）に対する既知の、または潜在的な影響を有するものとして特定された。本試験は、これらのプロセスパラメータの影響を特徴付けるために行ったものである。試験のパラメータ範囲及び実験計画をそれぞれ表８及び表９に示す。溶出バッファーの導電率は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の濃度を調節することにより変化させ、評価したＮａＣｌの範囲を表８に示した。

結果と考察
Ｎｕｖｉａ ＨＲ－Ｓのプロセス性能結果（ＰＰＯ）に対する溶出バッファーのｐＨ及び溶出バッファーの導電率の影響を図８～図１３に示す。

ＨＭＷ凝集体に対する溶出バッファーのｐＨ及び導電率の影響
凝集体のレベルに対する溶出バッファーのｐＨ及び導電率の影響を、ＨＭＷ量に対する入力パラメータの影響を示す図８～図１０に示す。

図８～図１０に示されるように、溶出液のＨＭＷ、モノマー、及びＬＭＷの変動はそれぞれ、０．０１～０．８８％、９８．３３～９９．２７％、及び０．６２～１．３５％であった。ＨＭＷのモデルは、溶出バッファーのｐＨ及び導電率に対して強い線形依存性を、両方のパラメータを含む相互作用の項と共に含む。モデル表面（図８に示される）は、ＨＭＷが極めて低い溶出バッファーのｐＨ及び導電率の値で最も低く、
極めて高い溶出バッファーのｐＨ及び導電率の値で最も高いことを示している。

試験全体を通じてロード材料のＨＭＷ含量の変動を説明するために各施行についてＨＭＷクリアランスを測定した。溶出液のＨＭＷと同様、ＨＭＷのクリアランスは試験を通じて大きく変動し（－３０．６５～９８．６１％）、ＨＭＷクリアランスモデルは、溶出バッファーのｐＨ及び導電率について線形及び相互作用の項を含んでいる。図９に、モデルの挙動を示す。溶出バッファーの低いｐＨ及び導電率の条件で最も高いＨＭＷクリアランスの値が得られたのに対して、多くの試験した条件で７０％を超えるＨＭＷクリアランスを示した。しかしながら、施行９、２０、及び２４（それぞれ、－１．１８％、－２０．５５％、及び－３０．６５％）について報告された負のＨＭＷクリアランス値は、凝集体の除去率の大きなばらつきが、評価した広い条件範囲にわたって観察され、特定の条件では凝集体種が除去されずにむしろ生成される場合もあることを示している。

施行４０～４２では、中心点条件でのＣＥＸによるプロセスにおいてロード材料に一般的に使用されるものよりも高い凝集体レベルを含むＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ溶出液をロード材料として使用した。ＨＭＷ及びＨＭＷクリアランスのモデルは、溶出バッファーのｐＨ及び導電率を高くすることで高いＨＭＷ含量を有する溶出液が生じることを示した。施行４０～４２について選択された条件は、ＣＥＸロード材料の「最も悪い場合」の凝集体レベルを用いて潜在的な溶出条件を探索することを目的としたものである。５．５０～５．５４の溶出バッファーのｐＨ値及び１３．４０ｍＳ／ｃｍの溶出バッファーの導電率では、得られた溶出液ＨＭＷは０．３１～０．３４％であった。しかしながら、溶出液ＨＭＷは、ｐＨ５．６０の溶出液を用いた場合に０．５９％に増加した（対して、導電率は変化しなかった）。その凝集体レベルでは、さらなるプロセスはＨＭＷについてのベドリズマブの許容基準に合わない可能性があった。

ＬＭＷは、溶出バッファーのｐＨまたは溶出バッファーの導電率の増加に対して線形に減少することが示された。このモデルには、溶出バッファーｐＨ／溶出バッファー導電率、溶出バッファーｐＨ／ロード量、及び溶出バッファー導電率／ロード量についての相互作用の項も含まれた。ＨＭＷについてのモデルと同様、モノマーモデルは、溶出バッファーのｐＨ及び導電率に対する強い依存性を、線形及び相互作用の項の形で含んでいた。モデル表面（図１０にサドル関数として示される）は、極めて高い溶出バッファーのｐＨと導電率の条件を組み合わせた場合に最も低いモノマーが得られることを示している。

したがって、図８～図１０に示されるように、溶出バッファーのｐＨ及び導電率を用いて、ＣＥＸ樹脂を使用して精製されたベドリズマブを含む組成物中の凝集体のレベル（ＨＭＷ種の割合（％））を調節することができる。さらに、図８～図１０に示されるように、ベドリズマブの精製組成物中の凝集体のレベルは、ＣＥＸ樹脂を低いｐＨ及び／または低い導電率を有する溶出バッファーと共に使用した場合に低減することができる。

塩基性アイソフォーム種に対する溶出バッファーのｐＨ及び導電率の影響
塩基性アイソフォーム種のレベルに対する溶出バッファーのｐＨ及び導電率の影響を、酸性、主要、及び塩基性アイソフォーム種の含量に対する入力パラメータの影響を示す図１１～図１３に示す。

図１１～図１３に示されるように、酸性、主要、及び塩基性の含量の結果はそれぞれ、１２．４９～３０．２７％、６４．３２～７３．８２％、及び５．４２～１８．０４％の範囲であった。酸性含量についてのモデルは、溶出バッファーのｐＨ、溶出バッファーの導電率、及びロード量を、３つすべてのパラメータの相互作用の項と共に含むものである。溶出バッファーのｐＨ及び溶出バッファーの導電率は、酸性含量に最も強く影響した。図１１のモデル表面にみられるように、最も高い酸性含量が、溶出バッファーのｐＨと導電率の極めて低い値の組み合わせで用いた場合に得られた。

主要アイソフォーム含量について開発されたモデルは、溶出バッファーのｐＨ、溶出バッファーの導電率、及びロード量の間の相互作用の項を含み、溶出バッファーのｐＨ／溶出バッファーの導電率の相互作用がモデル挙動に最も大きな影響を示している。図１２に示されるように、最も高い主要アイソフォーム含量が、最も高い溶出バッファー導電率と最も低い溶出バッファーｐＨとの組み合わせで得られ、最も低い主要アイソフォーム含量が、極めて低い溶出バッファーのｐＨと導電率との組み合わせで予測される。

溶出バッファーのｐＨ、溶出バッファーの導電率、及びロード量の線形項が、溶出液の塩基性アイソフォーム含量に最も強く影響しており、相互作用の項の寄与はわずかである。図１３のモデル表面にみられるように、塩基性アイソフォーム含量は、溶出バッファーのｐＨ及び溶出バッファーの導電率の増加に応じて増加した。

したがって、図１１～図１３に示されるように、溶出バッファーのｐＨ及び導電率を用いて、ＣＥＸ樹脂を使用して精製されたベドリズマブを含む組成物中の荷電したアイソフォーム分布を調節することができる。図１１に示されるように、ベドリズマブの精製組成物中の酸性アイソフォーム種のレベルは、ＣＥＸ樹脂を高いｐＨ及び／または高い導電率を有する溶出バッファーと共に使用した場合に低減することができる。さらに、図１３に示されるように、ベドリズマブの精製組成物中の塩基性アイソフォーム種のレベルは、ＣＥＸ樹脂を低いｐＨ及び／または低い導電率を有する溶出バッファーと共に使用した場合に低減することができる。

実施例５：製品品質特性の決定
以下の分析アッセイ及び方法をベドリズマブの製品品質特性を決定するために上記の実施例で用いた。

カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）は、全体の表面電荷に基づいてベドリズマブ抗体種（主要アイソフォーム、塩基性種、及び酸性種）を分画する。移動相を用いた低イオン強度への希釈後、試験試料を、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．６）中で平衡化したＤｉｏｎｅｘ Ｐｒｏ－Ｐａｃ（商標）ＷＣＸ－１０カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ（ＵＳＡ））に注入し、同じバッファー中で塩化ナトリウム勾配を用いて溶出した。タンパク質の溶出を２８０ｎｍで監視し、各ピークを酸性、塩基性、または主要アイソフォームのカテゴリーに割り当てた。主要アイソフォームの割合（％）、酸性種の割合（％）の合計、及び塩基性種の割合（％）の合計を報告する。試料の主要アイソフォームの保持時間を参照基準の保持時間と比較して適合性を決定する。

サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いてベドリズマブの純度を決定する。参照基準と試験試料（７５μｇ）を、直列に接続した２本のＧ３０００ ＳＷｘｌカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ （ＵＳＡ））及びアイソクラティックなリン酸－塩化ナトリウムバッファーシステム（ｐＨ６．８）を用いて分析する。本方法は、高分子量（ＨＭＷ）種及び低分子量（ＬＭＷ）の分解産物からの抗体モノマーの分離を提供するものである。タンパク質種の溶出を２８０ｎｍで監視する。主ピーク（モノマー）及び全ピーク面積を評価して純度を決定する。試料の純度（％）（モノマー（％）として計算）及び凝集体（％）を報告する。

均等物
当業者であれば、通常の実験以上のことを行うことなく、本明細書に記載される発明の特定の実施形態の多くの均等物が認識されるかまたは確認できるであろう。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。本願の全体を通じて引用されるすべての参考文献、特許及び特許出願公開の内容を、参照によって本明細書に援用するものである。

配列表

Claims (71)

1. 抗α４β７抗体及び１つ以上の不純物を含む液体溶液から前記抗α４β７抗体を含む組成物を得るための方法であって、
   前記抗α４β７抗体及び前記１つ以上の不純物を含む前記液体溶液をプロテインＡを含むマトリクスと接触させることにより、前記抗α４β７抗体を前記プロテインＡに結合させることと、
   前記プロテインＡを含む前記マトリクスを洗浄溶液で洗浄することと、
   前記マトリクスをｐＨ３．２～４の溶出溶液と接触させることにより、前記プロテインＡを含む前記マトリクスから前記抗α４β７抗体を溶出して、前記抗α４β７抗体を含む組成物を得ることと、を含み、
   前記抗α４β７抗体がヒト化抗体であり、ＩｇＧ１抗体であり、配列番号４に記載されるＣＤＲ３ドメイン、配列番号３に記載されるＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号２に記載されるＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域を含み、配列番号８に記載されるＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載されるＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６に記載されるＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域を含む、前記方法。
2. 前記抗α４β７抗体を含む前記組成物が、１％未満の高分子量（ＨＭＷ）凝集体を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記プロテインＡが固相上に固定化される、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記固相が、ビーズ、ゲル、及び樹脂のうちの１つ以上を含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記洗浄溶液のｐＨが、約７である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記溶出溶液が、クエン酸を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記溶出溶液のｐＨが、３．２～３．７または３．３～３．８である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
8. 抗α４β７抗体及び１つ以上の不純物を含む液体溶液から前記抗α４β７抗体を含む組成物を得るための方法であって、
   抗α４β７抗体及び少なくとも１つの不純物を含む溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂と、前記ＨＩＣ樹脂を通じた前記抗α４β７抗体のフロースルーを可能とする条件下で接触させることにより、前記抗α４β７抗体を含む組成物を得ることを含み、
   前記ＨＩＣ樹脂が高疎水性樹脂として特徴付けられ、
   前記抗α４β７抗体がヒト化抗体であり、ＩｇＧ１抗体であり、配列番号４に記載されるＣＤＲ３ドメイン、配列番号３に記載されるＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号２に記載されるＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域を含み、配列番号８に記載されるＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載されるＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６に記載されるＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域を含む、前記方法。
9. 前記組成物が、前記抗α４β７抗体を含み、０．６％未満のＨＭＷ凝集体を含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記ＨＩＣ樹脂が、ｐＨ約７．２未満のリン酸塩バッファーで平衡化される、請求項８または９に記載の方法。
11. 前記リン酸塩バッファーが、約０．３５Ｍ～約０．１５Ｍのリン酸カリウムを含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記樹脂ロードが、約５５～７５ｍｇ／ｍｌである、請求項８～１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記組成物が、約０．２２ｐｐｍ未満の残留プロテインＡを含む、請求項８～１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記組成物が、約０．３ｐｐｍ未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含む、請求項８～１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記高疎水性ＨＩＣ樹脂が、約５０～１５０μｍの平均孔径を有する、請求項８～１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記高疎水性ＨＩＣ樹脂が、約１００ｎｍの平均孔径及び／または約１００μｍの孔径を有する、請求項８～１４のいずれか１項に記載の方法。
17. 抗α４β７抗体及び１つ以上の不純物を含む液体溶液から前記抗α４β７抗体を含む組成物を生成するための方法であって、
    前記抗α４β７抗体及び１つ以上の不純物を含む前記液体溶液を混合モードクロマトグラフィー樹脂に接触させることにより、前記抗α４β７抗体を前記樹脂に結合させることと、
    前記混合モードクロマトグラフィー樹脂を洗浄溶液で洗浄することと、
    前記樹脂を、ｐＨ３．９またはそれよりも高いｐＨを有する溶出溶液と接触させることにより、前記混合モードクロマトグラフィー樹脂から前記抗α４β７抗体を溶出することにより、前記抗α４β７抗体を含む組成物を得ることと、を含み、
    前記抗α４β７抗体が、配列番号１に記載の重鎖可変領域配列及び配列番号２に記載の軽鎖可変領域配列を含む、前記方法。
18. 前記抗α４β７抗体を含む前記組成物が、１％未満のＨＭＷ凝集体を含む、請求項１７に記載の方法。
19. 前記溶出溶液が、ｐＨ４．１またはそれよりも高いｐＨを有する、請求項１７または１８に記載の方法。
20. 前記溶出溶液が、約ｐＨ３．９～約ｐＨ４．４のｐＨを有する、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記溶出溶液が、３０ｍＳ／ｃｍ以下の導電率を有する、請求項１７～２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記溶出溶液が、約２０ｍＳ／ｃｍ～約３０ｍＳ／ｃｍの導電率を有する、請求項２１に記載の方法。
23. 前記溶出溶液が、約１６０ｍＭ～約２４０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む、請求項１７～２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 前記混合モードクロマトグラフィー樹脂が、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓである、請求項１７～２３のいずれか１項に記載の方法。
25. カチオン交換（ＣＥＸ）樹脂を用いて前記抗α４β７抗体を精製することをさらに含む、請求項１７～２４のいずれか１項に記載の方法。
26. 前記ＣＥＸ樹脂が、結合／溶出モードで操作される、請求項２６に記載の方法。
27. 抗α４β７抗体及び１つ以上の不純物を含む液体溶液から抗α４β７抗体を含む組成物を生成するための方法であって、
    前記抗α４β７抗体及び１つ以上の不純物を含む前記液体溶液を混合モードクロマトグラフィー樹脂に接触させることにより、前記抗α４β７抗体を前記樹脂に結合させることと、
    前記混合モードクロマトグラフィー樹脂を洗浄溶液で洗浄することと、
    前記樹脂を、ｐＨ４．２またはそれよりも低いｐＨを有する溶出溶液と接触させることにより、前記混合モードクロマトグラフィー樹脂から前記抗α４β７抗体を溶出することにより、前記抗α４β７抗体を含む組成物を得ることと、を含み、
    前記抗α４β７抗体が、配列番号１に記載の重鎖可変領域配列及び配列番号２に記載の軽鎖可変領域配列を含む、前記方法。
28. 前記組成物が、ｐＨ４．２よりも高いｐＨ及び／または２８ｍＳ／ｃｍよりも高い対照導電率を有する対照溶出溶液を使用して同様に得られた抗α４β７抗体を含む対照組成物と比較して、抗α４β７抗体の高い収率を有する、請求項２７に記載の方法。
29. 前記溶出溶液が、４．０以下のｐＨを有する、請求項２７または２８に記載の方法。
30. 前記溶出溶液が、約ｐＨ４．２～約ｐＨ３．８のｐＨを有する、請求項２７または２８に記載の方法。
31. 前記溶出溶液が、約１８ｍＳ／ｃｍ～約２８ｍＳ／ｃｍの導電率を有する、請求項２７～３０のいずれか１項に記載の方法。
32. 前記溶出溶液が、約１６０ｍＭ～約２４０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む、請求項２７～３１のいずれか１項に記載の方法。
33. 前記混合モードクロマトグラフィー樹脂が、樹脂１Ｌ当たり少なくとも５５ｇの前記抗α４β７抗体と接触させられる、請求項２７～３２のいずれか１項に記載の方法。
34. 前記混合モードクロマトグラフィー樹脂が、樹脂１Ｌ当たり約５５ｇ～約８０ｇの前記抗α４β７抗体と接触させられる、請求項３３に記載の方法。
35. 前記混合モードクロマトグラフィー樹脂が、より小さいビーズ径で、強力なアニオン交換、水素結合、及び疎水性相互作用を有し、場合により、前記混合モードクロマトグラフィー樹脂がＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓである、請求項２７～３４のいずれか１項に記載の方法。
36. カチオン交換（ＣＥＸ）樹脂を用いて前記抗α４β７抗体を精製することをさらに含む、請求項２７～３５のいずれか１項に記載の方法。
37. 前記ＣＥＸ樹脂が、結合／溶出モードで操作される、請求項３６に記載の方法。
38. 抗α４β７抗体及び１つ以上の不純物を含む液体溶液から抗α４β７抗体を含む組成物を生成するための方法であって、
    前記抗α４β７抗体及び１つ以上の不純物を含む前記液体溶液をカチオン交換（ＣＥＸ）樹脂に接触させることにより、前記抗α４β７抗体を前記樹脂に結合させることと、
    前記ＣＥＸ樹脂を洗浄溶液で洗浄することと、
    前記樹脂を、１６ｍＳ／ｃｍ以下の導電率を有する溶出溶液と接触させることにより、前記ＣＥＸ樹脂から前記抗α４β７抗体を溶出することにより、前記抗α４β７抗体を含む組成物を得ることと、を含み、
    前記抗α４β７抗体が、配列番号１に記載の重鎖可変領域配列及び配列番号２に記載の軽鎖可変領域配列を含む、前記方法。
39. 前記抗α４β７抗体を含む前記組成物が、約１％以下のＨＭＷ凝集体を含む、請求項３８に記載の方法。
40. 前記溶出溶液が、１４ｍＳ／ｃｍ以下の導電率を有する、請求項３８または３９に記載の方法。
41. 前記溶出溶液が、約１１～１６ｍＳ／ｃｍの導電率を有する、請求項３８または３９に記載の方法。
42. 前記溶出溶液が、約１２～１４ｍＳ／ｃｍの導電率を有する、請求項３８または３９に記載の方法。
43. 前記溶出溶液が、約７０ｍＭ～約１１０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む、請求項３８～４２のいずれか１項に記載の方法。
44. 前記溶出溶液が、約ｐＨ５～約ｐＨ６のｐＨを有する、請求項３８～４３のいずれか１項に記載の方法。
45. 前記溶出溶液が、約ｐＨ５．１～約ｐＨ５．８のｐＨを有する、請求項４４に記載の方法。
46. 前記抗α４β７抗体が、樹脂１Ｌ当たり約２５～７０ｇの抗体の濃度で前記ＣＥＸ樹脂にロードされる、請求項３８～４５のいずれか１項に記載の方法。
47. 前記抗α４β７抗体が、樹脂１Ｌ当たり約３０～６０ｇの抗体の濃度で前記ＣＥＸ樹脂にロードされる、請求項３８～４６のいずれか１項に記載の方法。
48. 前記ＣＥＸ樹脂が強力なＣＥＸ樹脂であり、場合により、前記ＣＥＸ樹脂がＮｕｖｉａ ＨＲ－Ｓである、請求項３８～４７のいずれか１項に記載の方法。
49. 混合モードクロマトグラフィー樹脂を用いて前記抗α４β７抗体を精製することをさらに含む、請求項３８～４８のいずれか１項に記載の方法。
50. 前記混合モードクロマトグラフィー樹脂が、結合／溶出モードで操作される、請求項４９に記載の方法。
51. 抗α４β７抗体の主要アイソフォーム及び１つ以上の塩基性アイソフォーム種を含む液体溶液から抗α４β７抗体を含む組成物を生成するための方法であって、
    前記抗α４β７抗体及び１つ以上の塩基性アイソフォーム種を含む前記液体溶液をカチオン交換（ＣＥＸ）樹脂に接触させることにより、前記抗α４β７抗体を前記樹脂に結合させることと、
    前記ＣＥＸ樹脂を洗浄溶液で洗浄することと、
    前記樹脂を、１１ｍＳ／ｃｍ以上の導電率を有する溶出溶液と接触させることにより、前記ＣＥＸ樹脂から前記抗α４β７抗体を溶出することにより、前記抗α４β７抗体を含む組成物を得ることと、を含み、
    前記抗α４β７抗体が、配列番号１に記載の重鎖可変領域配列及び配列番号２に記載の軽鎖可変領域配列を含む、前記方法。
52. 前記抗α４β７抗体を含む前記組成物が、約４％～約２０％の塩基性アイソフォームを含む、請求項５１に記載の方法。
53. 前記溶出溶液が、１２ｍＳ／ｃｍ以上の導電率を有する、請求項５１または５２に記載の方法。
54. 前記溶出溶液が、約１１～１６ｍＳ／ｃｍの導電率を有する、請求項５１または５２に記載の方法。
55. 前記溶出溶液が、約１２～１４ｍＳ／ｃｍの導電率を有する、請求項５１または５２に記載の方法。
56. 前記溶出溶液が、約ｐＨ５～約ｐＨ６のｐＨを有する、請求項５１～５５のいずれか１項に記載の方法。
57. 前記溶出溶液が、約ｐＨ５．１～約ｐＨ５．８のｐＨを有する、請求項５６に記載の方法。
58. 前記抗α４β７抗体が、樹脂１Ｌ当たり約２５～７０ｇの抗体の濃度で前記ＣＥＸ樹脂にロードされる、請求項５１～５７のいずれか１項に記載の方法。
59. 前記抗α４β７抗体が、樹脂１Ｌ当たり約３０～６０ｇの抗体の濃度で前記ＣＥＸ樹脂にロードされる、請求項５８に記載の方法。
60. 前記ＣＥＸ樹脂が、Ｎｕｖｉａ ＨＲ－Ｓである、請求項５１～５９のいずれか１項に記載の方法。
61. 混合モードクロマトグラフィー樹脂を用いて前記抗α４β７抗体を精製することをさらに含む、請求項５１～６０のいずれか１項に記載の方法。
62. 前記混合モードクロマトグラフィー樹脂が、結合／溶出モードで操作される、請求項６１に記載の方法。
63. 前記抗体が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内で産生されたものである、請求項１～６２のいずれか１項に記載の方法。
64. 前記宿主細胞が、ＧＳ－ＣＨＯ細胞である、請求項６３に記載の方法。
65. 前記得られた組成物が、精製された抗α４β７抗体を含み、前記方法が、前記抗α４β７抗体をヒトでの使用に適した製剤として製剤化する後の工程をさらに含む、請求項１～６４のいずれか１項に記載の方法。
66. 前記精製された抗α４β７抗体を、乾燥した凍結乾燥製剤として製剤化することを含む、請求項１～６５のいずれか１項に記載の方法。
67. 投与に適するように前記乾燥した凍結乾燥製剤を液体で戻すことをさらに含む、請求項６６に記載の方法。
68. 前記精製された抗α４β７抗体を、前記抗α４β７抗体が皮下注射による投与に適するように液体製剤として製剤化することを含む、請求項１～６５のいずれか１項に記載の方法。
69. 前記抗α４β７抗体が、配列番号１に記載の重鎖可変領域配列及び配列番号５に記載の軽鎖可変領域配列を含む、請求項１～６８のいずれか１項に記載の方法。
70. 前記抗α４β７抗体が、ベドリズマブである、請求項１～６８のいずれか１項に記載の方法。
71. 請求項１～７０のいずれか１項に記載の方法によって得られる、抗α４β７抗体を含む組成物。
    

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