JP2007501013A - ｃ−Ｍｅｔに対する抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、c-Met、好ましくはヒトc-Metに特異的に結合し、またc-Metを阻害するように機能するヒト抗体を含む抗体、およびこの抗原結合部分に関する。本発明はまた、ヒト抗c-Met抗体、およびこの抗原結合部分にも関する。本発明はまた、キメラ抗体、二重特異性抗体、誘導体化抗体、単鎖抗体、または融合タンパク質の一部である抗体にも関する。本発明はまた、ヒト抗c-Met抗体に由来する、単離された重鎖および軽鎖の免疫グロブリン、ならびにこのような免疫グロブリンをコードする核酸分子にも関する。本発明はまた、ヒト抗c-Met抗体、このような抗体を含む組成物を作製する方法、ならびに抗体および組成物を診断および治療に使用する方法にも関する。本発明はまた、本発明のヒト抗c-Met抗体を含む、重鎖および/または軽鎖の免疫グロブリン分子をコードする核酸分子を用いる遺伝子治療法も提供する。本発明はまた、本発明の核酸分子を含むトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物にも関する。

Description

発明の背景
散乱因子としても知られる肝細胞成長因子（HGF）は、有糸分裂誘発および細胞運動性を誘導することで形質転換および腫瘍発生を促進する多機能性の成長因子である。さらにHGFは、細胞運動性および浸潤を、さまざまなシグナル伝達経路を介して促進することで転移を促す。

細胞に対する作用を生じるためには、HGFは、その受容体、c-Met、受容体チロシンキナーゼと結合しなければならない。c-Metは、50キロダルトン（kDa）のαサブユニットと145 kDaのβサブユニットを含む、広く発現されるヘテロダイマータンパク質である（Maggiora et al., J. Cell Physiol., 173: 183-186 (1997)）。c-Metのβサブユニットは、チロシンキナーゼドメイン、ならびにHGFシグナルの伝達に重要な役割を果たす2か所の自己リン酸化部位であるY1349およびY1356を含む（Maggiora et al., J. Cell Physiol., 173: 183-186 (1997)；Ponzetto et al., Cell, 77: 2610271 (1994)；Maina et al., Cell, 87: 531-542 (1996)）。

HGFがc-Metと結合すると、癌などの疾患と関連するさまざまな細胞活性を生じる、いくつかのシグナル伝達経路の活性化が生じる。これには、いずれも形質転換および疾患の進行を促進する活性である、有糸分裂誘発の促進、細胞生存の促進、細胞運動性の促進、細胞外マトリックス（ECM）の浸潤の促進、血管形成の促進、ならびに転移の促進などが含まれる(Jeffers et al., J. Mol. Med., 74: 505-513 (1996)；Amicone et al., EMBO J., 16: 495-503 (1997)；MatsumotoおよびNakamura, Biochem. Biophys. Res. Comm., 239: 639-644 (1997)；Corps et al., Int. J. Cancer, 73: 151-155 (1997))。HGFおよびc-Metの両方の発現または過剰発現は、複数の種類の細胞の形態学的な形質転換、および腫瘍形成能を生じる場合がある（Jeffers et al., J. Mol. Med., 74: 505-513 (1996)）。HGFおよびc-Metの発現もしくは過剰発現は、有糸分裂誘発および足場非依存性の成長も促進する（Rubin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 514-419 (1991)；Kan et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 174: 331-337 (1991)）。特にECMの浸潤は、c-Metの活性化が、ウロキナーゼ様プラスミノーゲンアクチベーターやコラゲナーゼなどのプロテアーゼの発現を引き起して、細胞が分解して局所的に組織に浸潤することを可能とする際に報告されている（Jeffers et al., J. Mol. Med., 74: 505-513 (1996)）。また、HGFではなくc-Metのみを発現するか、または過剰発現する複数の腫瘍は、腫瘍形成を支持するために、自己分泌性シグナル伝達機構ではなく傍分泌性シグナル伝達機構を利用する（Beviglio et al., Int. J. Cancer, 74: 301-309 (1997)）。

HGFおよびc-Metは、多くのヒトの癌の病因に関連付けられてもいる。HGFおよびc-Metの同時発現または過剰発現は、乳癌（Nagy et al., Surg. Oncol., 5: 15-21 (1996)；Tuck et al., Am. J. Pathol., 148: 225-232 (1996)）、膵癌（Ebert et al., Cancer Res., 54: 5775-5778 (1994)）、口腔扁平細胞癌（Marshall and Komberg, Laryngoscope, 108: 1413-1417 (1998)）、グリオーマ（Koochekpour et al., Cancer Res., 57: 5391-5398 (1997)）、および悪性の胸膜中皮腫（Tolpay et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol., 124: 291-296 (1998)；Klominek et al. Intl. J. Cancer, 76: 240-249 (1998)）で観察されている。またc-Metの過剰産生は、HGFの果たす役割が未だ実証されていない他の腫瘍の発生に重要な役割を果たす可能性がある。このような癌には、肝細胞癌（Suzuki et al., Hepatology, 20: 1231-1236 (1996)）、腎細胞癌（Natali et al., Intl. J. Cancer, 69: 212-217 (1996)）、肺癌（Harvey et al., J. Pathol., 180: 389-394 (1996)）、胃癌（Taniguchi et al., Cancer, 82: 2112-2122 (1998)）、および結腸直腸癌（Hiscox et al., Cancer Invest., 15: 513-521 (1997)）、卵巣癌（Nagy et al., J. Surg. Oncol., 60: 95-99 (1995)）などがある。また乳頭状腎癌の患者で、HGFの非存在下でc-Met受容体を活性化する生殖系列および体細胞における変異が報告されている（Schmidt et al., Nat. Genet., 16: 68-73 (1997)；Jeffers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 11445-11450 (1997)）。胃癌、直腸癌、肺癌、膵臓癌、乳癌、および胆管癌を含む他の癌は、活性化変異を含むc-Metを有する個体で検出されている（Zbar et al., J. Urol., 151: 561-566 (1994））。

癌などの疾患に至る経路の活性化を妨げるために、c-Met結合を阻害する戦略が求められている。c-Metの機能は、c-Metの活性化、および/またはHGFによって誘導される生物学的反応を弱める場合がある（Date et al., FEBS Letters, 420: 1-6 (1997)）；（Kaji et al., Cancer Gene Ther., 3: 393-404 (1996)）；（Li et al., Clin. Exp. Metastasis, 16: 74-82 (1998)）ので、腫瘍の進行を阻害する。培養細胞の抗分裂促進活性を有するマウスの抗c-Metモノクローナル抗体が報告されているが（US 5646036、US 6207152、US 6214344）、マウス抗体をヒト患者の治療に使用することは容易ではない。したがって、c-Metに結合する、また例えば有糸分裂誘発、浸潤、転移、および/または生存を阻害することでHGFおよびc-Metに依存した腫瘍成長を阻害するために使用可能な、改善された組成物が求められている。

発明の概要
本発明は、c-Metと特異的に結合し、また主に、c-Metのアンタゴニストとして、また場合によってはc-Metアゴニスト抗体として、またこのような抗体または抗体の一部を含む組成物として作用する、単離された抗体、または抗体の抗原結合部分を提供する。

本発明は、抗c-Met抗体の重鎖および/または軽鎖、これらの可変部ドメイン、もしくはこれらの抗原結合部分、または本発明の抗体、抗体鎖、もしくはこの可変部ドメインをコードする核酸分子、および薬学的に許容可能な担体を含む組成物を提供する。本発明の組成物は、治療薬や診断薬などの別の成分をさらに含む場合がある。本発明では、診断法および治療法も提供される。

本発明はさらに、抗c-Met抗体または抗体の抗原結合部分を産生する単離された細胞系列を提供する。

本発明は、抗c-Met抗体の重鎖および/または軽鎖、この可変部ドメインもしくはこの抗原結合部分をコードする核酸分子も提供する。

本発明は、核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞、ならびに、このような核酸分子にコードされたポリペプチドを組換えによって産生させる方法を提供する。

抗c-Met抗体の重鎖および/または軽鎖、もしくはこれらの抗原結合部分を発現する、非ヒトのトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物も提供する。

発明の詳細な説明
定義および一般的手法
本明細書で明確に定義しない限り、本発明に関連して使用される科学技術用語は、当業者によって一般に理解される意味をもつものとする。また文脈上で必要とされない限り、単数形は複数形を含むものとし、また複数形は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載された細胞および組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸の化学、およびハイブリダイゼーションの手法に関連して使用される命名法は当業者に周知であり、当技術分野で一般に使用される。

本発明の方法および手法は一般に、特に明記しない限り、当技術分野で周知であって、本明細書で引用および言及されている、さまざまな一般的な参考文献、および、より専門的な参考文献に記載されている従来の方法にしたがって実施される。これについては例えば、参照として本明細書に組み入れられるSambrookら、「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.(1989)、およびAusubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」、Greene Publishing Associates(1992)、ならびにHarlowおよびLane、「Antibodies：A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、 Cold Spring Harbor、N.Y.(1990)を参照されたい。酵素反応および精製法は、当技術分野で一般的に達成される、または本明細書に記載された、製造業者の説明書にしたがって実施される。本明細書に記載された、分析化学、有機合成化学、ならびに医学および薬学化学の実験手順および手法に関連して使用される命名法は当業者に周知であり、当技術分野で一般的に使用されている。化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤化、ならびに輸送、および患者の治療には、標準的な手法が使用される。

以下の用語は、特に明記しない限り、以下の意味をもつと理解される。

「ポリペプチド」という用語は、天然または人工のタンパク質、タンパク質断片、およびタンパク質配列のポリペプチド類似体を意味する。ポリペプチドは単量体または多量体の場合がある。

「単離されたタンパク質」、「単離されたポリペプチド」、または「単離された抗体」という用語は、起源または供給源に関して以下の性質を有するタンパク質、ポリペプチド、または抗体である：(1)天然の状態でともに存在する、天然に結合した成分に結合しないこと、(2)同じ種に由来する他のタンパク質を含まないこと、(3)異なる種に由来する細胞で発現されること、または(4)天然に存在しないこと。したがって、化学的に合成されたポリペプチド、または天然の細胞とは異なる細胞系で合成されたポリペプチドは、天然の状態で結合した状態の成分から「単離」される。タンパク質は、当技術分野で周知のタンパク質精製法で単離することで、天然の状態で結合した成分を実質的に含まないようにすることもできる。

単離された抗体の例には、c-Metを用いてアフィニティ精製された抗c-Met抗体、ハイブリドーマまたは他の細胞株によってインビトロで合成された抗c-Met抗体、およびトランスジェニックマウスに由来するヒト抗c-Met抗体が含まれる。

タンパク質またはポリペプチドは、試料の少なくとも約60〜75％が1種のポリペプチドを示す場合に「実質的に純粋であり」、「実質的に均一であり」、または「実質的に精製されている」。このようなポリペプチドまたはタンパク質は単量体または多量体の場合がある。実質的に純粋なポリペプチドまたはタンパク質は通常、タンパク質試料の約50％、60％、70％、80％、または90％(重量/重量)、より一般的には約95％を含むか、また好ましくは99％以上純粋である。タンパク質の純度または均一性は、タンパク質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動と、これに続く1本のポリペプチドバンドの、当技術分野で周知の染色剤によるゲルの染色による描出などの、当技術分野で周知の複数の手段で示すことができる。目的によっては、HPLC、または精製分野で周知における他の手段を用いることで、高分解能が得られる場合がある。

本明細書で用いる「ポリペプチド断片」という用語は、アミノ末端および/またはカルボキシ末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列は天然の配列の対応する位置と同一であるポリペプチドを意味する。いくつかの態様では、断片の長さは少なくとも5アミノ酸、6アミノ酸、8アミノ酸、または10アミノ酸である。他の態様では、断片の長さは少なくとも14アミノ酸、少なくとも20アミノ酸、少なくとも50アミノ酸、または少なくとも70アミノ酸、80アミノ酸、90アミノ酸、100アミノ酸、150アミノ酸、もしくは200アミノ酸である。

本明細書で用いる「ポリペプチド類似体」という用語は、アミノ酸配列の一部と実質的な同一性を有し、以下の特性の少なくとも1つを有するセグメントを含むポリペプチドを意味する：(1)適切な結合条件でc-Metと特異的に結合すること、(2)c-Metを阻害または活性化可能なこと。典型的には、ポリペプチド類似体は、天然型の配列に対して、保存的アミノ酸の置換(または挿入もしくは欠失)を含む。類似体は典型的には、少なくとも20アミノ酸もしくは25アミノ酸の長さであり、好ましくは少なくとも50アミノ酸、60アミノ酸、70アミノ酸、80アミノ酸、90アミノ酸、100アミノ酸、150アミノ酸、または200アミノ酸、またはそれ以上の長さであり、また完全長のポリペプチドを含む場合もある。本発明のいくつかの態様は、生殖細胞系列アミノ酸配列由来の1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個の置換を有するポリペプチド断片またはポリペプチド類似体を含む。

ある特定の態様において、抗c-Met抗体またはこの抗体結合部分に対するアミノ酸置換は以下の通りである：(1)タンパク質分解に対する感受性を低下させる置換、(2)酸化に対する感受性を低下させる置換、(3)タンパク質複合体を形成する結合親和性を変化させる置換、ならびに(4)このような類似体の他の物理的化学的特性または機能的特性を付与したり修飾したりするが、c-Metへの特異的結合を以前保持している置換。類似体は、通常存在するペプチド配列以外の配列のさまざまな突然変異を含む場合がある。例えば1つまたは複数のアミノ酸の置換、好ましくは保存的アミノ酸置換は、天然の配列内、好ましくは、分子間接触を形成するドメイン外のポリペプチドの一部に作られる場合がある。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造特性を実質的に変化させないはずである。例えば、置換アミノ酸は、親配列に存在する免疫グロブリン結合ドメインを構成する逆平行βシートを変化させたり、または親配列を特徴づける他の種類の二次構造を壊したりする傾向がないはずである。一般的には、グリシンおよびプロリンを逆平行βシートでは用いない。当技術分野で周知のポリペプチドの二次構造および三次構造の例は、参照として本明細書に組み入れられる「Proteins, Structures and Molecular Principles」(Creighton編、W.H. Freeman and Company、New York(1984))、「Introduction to Protein Structure」(C. BrandenおよびI. Tooze編、Garland Publishing、New York、N.Y.(1991))；ならびにThorntonら、Nature 354：105(1991)に記載されている。

非ペプチド類似体は一般に、テンプレートペプチドの性質に似た性質を有する薬剤として製薬業界で使用されている。このような種類の非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣体(peptide mimeticsまたはpeptidomimetics)」と呼ばれる。これについては、参照として本明細書に組み入れられるFauchere、J. Adv. Drug Res. 15：29(1986)；VeberおよびFreidinger、TINS p.392(1985)；ならびにEvansら、J. Med. Chem. 30：1229(1987)に記載されている。このような化合物は、コンピュータによる分子モデリングを援用して開発することができる。治療的に有用なペプチドと構造的に類似したペプチド模倣体は、同等の治療または予防の効果を誘導するために使用することができる。一般にペプチド模倣体は、ヒト抗体などのパラダイムポリペプチド(所望の生化学的性質または薬学的性質を有するポリペプチド)と構造的に類似しているが、以下からなる群より選択される結合によって、当技術分野で周知の方法で任意に置換された1つまたは複数のペプチド結合を有する：--CH₂NH--、--CH₂S--、--CH₂-CH₂--、--CH=CH--(シスおよびトランス)、--COCH₂--、--CH(OH)CH₂--、ならびに-CH₂SO--。コンセンサス配列の1個または複数のアミノ酸と、同じ種類のD-アミノ酸との系統的な置換(例えばL-リシンの代わりにD-リシン)を行うことで、より安定なペプチドを作製することもできる。また、コンセンサス配列、または実質的に同一であるコンセンサス配列の変形形態を含む、制約を受けるペプチドを、当技術分野で周知の方法(参照として本明細書に組み入れられるRizoおよびGierasch、Ann. Rev. Biochem. 61：387(1992))で、例えば、ペプチドを環状化する分子内ジスルフィド架橋を形成可能な内部システイン残基を付加することで作製することができる。

「抗体」は、本明細書に関して、本明細書において言及する場合、その抗原、結合部分もまた用いることができるということを通常理解される。抗原結合部分は、特異的な結合に関して完全抗体と競合する、この抗原結合部分を意味する。これについては一般に、「Fundamental Immunology」、第7章(Paul, W.編、第2版、Raven Press、N.Y.(1989))(全ての目的に関して全体が参照として組み入れられる)を参照されたい。いくつかの態様において、抗原結合部分は、組換えDNA手法によって、または完全抗体を酵素的もしくは化学的に切断することで作製することができる。抗原結合部分は特に、Fab、Fab'、F(ab')₂、Fd、Fv、dAb、および相補性決定領域(CDR)断片、単鎖抗体(scFv)、キメラ抗体、ダイアボディ(diabody)、および特異的な抗原をポリペプチドに十分付与する抗体の少なくとも一部を含むポリペプチドを含む。

N末端からC末端に向かって、成熟軽鎖および重鎖の両可変領域は、領域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4を含む。本明細書における各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」(National Institutes of Health、Bethesda, Md.(1987および1991))、ChothiaおよびLesk、J. Mol. Biol. 196：901-917(1987)またはChothiaら、Nature 342：878-883(1989)に記載された定義に基づく。

本明細書では、数字を付して指定される抗体は、同じ数字を付したハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体と同じものである。例えばモノクローナル抗体13.3.2は、ハイブリドーマ13.3.2またはこのサブクローンから得られたものである。

本明細書では、Fd断片はV_HドメインおよびC_H1ドメインからなる抗体断片を意味する。Fv断片は、抗体の1本の腕のV_LドメインおよびV_Hドメインからなる。またdAb断片(Wardら、Nature 341：544-546(1989))はV_Hドメインからなる。

いくつかの態様では、抗体は、V_LドメインとV_Hドメインが対を形成して、1本のタンパク質鎖の形成を可能とする合成リンカーを挟んで一価の分子を形成する単鎖抗体(scFv)である(Birdら、Science 242：423-426(1988)、およびHustonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：5879-5883(1988))。いくつかの態様では、抗体は二重特異性抗体、すなわちV_HドメインとV_Lドメインを1本のポリペプチド鎖上で発現させるが、非常に短いために同じ鎖上の上記2つのドメイン間で対を形成できないリンカーを用いることで、強制的にドメインを、別の鎖の相補的なドメインと対形成させることで2つの抗原結合部位を作る二価抗体である(例えばHolliger P.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：6444-6448(1993)、およびPoljak R.J.ら、Structure 2：1121-1123(1994)を参照)。いくつかの態様では、本発明の抗体に由来する1つまたは複数のCDRを、分子内に共有結合的または非共有結合的に導入することで、c-Metに特異的に結合する免疫接着分子(immunoadhesin)とすることができる。このような態様では、1つまたは複数のCDRを、より長いポリペプチド鎖の一部として組み入れたり、別のポリペプチド鎖に共有結合的に結合させたり、または非共有結合的に組み入れたりすることができる。

一か所または複数の箇所の結合部位を有する態様では、結合部位は相互に同一であるか、または異なる可能性がある。

本明細書で用いる「ヒト抗体」という用語は、可変ドメインおよび定常ドメインの配列の全てがヒトの配列である、任意の抗体を意味する。この用語は、ヒト遺伝子由来の配列を有するが、例えば予想される免疫原性を低下させたり、望まれない折りたたみが生じる可能性のあるシステインを除去するなど変更された抗体を含む。この用語は、非ヒト細胞において非組換えにより作製され、ヒト細胞特有のものではないグリコシル化を付与する可能性のあるこのような抗体を含む。このような抗体は、後述するさまざまな方法で調製することができる。

本明細書で用いる「キメラ抗体」という用語は、2つまたはそれ以上の異なる抗体に由来する領域を含む抗体を意味する。1つの態様では、1つまたは複数のCDRは、ヒト抗c-Met抗体に由来する。別の態様では、全てのCDRがヒト抗c-Met抗体に由来する。別の態様では、複数のヒト抗c-Met抗体に由来するCDRが、キメラ抗体内で結合状態にある。例えばキメラ抗体は、第1のヒト抗c-Met抗体の軽鎖のCDR1、第2のヒト抗c-Met抗体の軽鎖のCDR2、ならびに第3のヒト抗c-Met抗体の軽鎖のCDR3を含む場合があり、また重鎖のCDRは、1つもしくは複数の他の抗c-Met抗体に由来する場合がある。またフレームワーク領域は、複数のCDRが選ばれた同じ抗c-Met抗体の1つか、または一人または複数の異なるヒト抗体に由来する場合がある。

いくつかの態様では、本発明のキメラ抗体は、ヒト化抗c-Met抗体である。本発明のヒト化抗c-Met抗体は、1つもしくは複数のフレームワーク領域のアミノ酸配列、および/または1つもしくは複数の本発明のヒト抗c-Met抗体の定常部ドメインの少なくとも一部、および非ヒト抗c-Met抗体に由来するCDRのアミノ酸配列を含む。

本明細書で用いる「活性化抗体」(本明細書では「アゴニスト抗体」とも呼ばれる)という用語は、c-Metを発現する細胞、組織、または生物体に添加した場合に、1つまたは複数のc-Met活性を少なくとも約40％高める抗体を意味する。いくつかの態様では、抗体はc-Met活性を少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、100％または100％以上高める。いくつかの態様では、活性化抗体をHGFの存在下で添加する。いくつかの態様では、本発明のアゴニスト抗体がc-Metの少なくとも1つの活性が10倍だけ増加する。

抗体または免疫グロブリン分子の断片または類似体を、当業者であれば本明細書に記載した手順で容易に調製することができる。断片または類似体の好ましいアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能ドメインの境界の近傍に存在する。構造ドメインおよび機能ドメインは、ヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列のデータを、公共または民間の配列データベースと比較することで同定することができる。好ましくは、コンピュータを利用した比較法で、構造および/または機能が既知の他のタンパク質に存在する配列モチーフまたは推定タンパク質構造ドメインを同定する。既知の3次元構造に折りたたまれるタンパク質配列を同定する方法は既知である(Bowieら、Science 253：164(1991)を参照)。

本明細書で用いる「表面プラズモン共鳴」という用語は、リアルタイムの生物特異的相互作用の解析を、バイオセンサーマトリックス内におけるタンパク質濃度の変化の検出によって、例えばBIACORE（商標）システム(Pharmacia Biosensor AB、Uppsala、Sweden and Piscataway、N.J.)を用いることで可能とする光学的現象を意味する。詳細についてはJonsson U.ら、Ann. Biol. Clin. 51：19-26(1993)；Jonsson U.ら、Biotechniques 11：620-627(1991)；Jonsson B.ら、J. Mol. Recognit. 8：125-131(1995)；およびJohnsson B.ら、Anal. Biochem. 198：268-277(1991)を参照されたい。

「K_D」という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の平衡解離定数を意味する。

「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンもしくはT細胞受容体との特異的な結合を可能とするか、または分子と相互作用することを可能とする、任意のタンパク質決定要素を含む。エピトープ決定基は一般に、アミノ酸または炭水化物もしくは糖の側鎖などの分子の化学的に活性な表面基群（surface grouping）を含み、また一般に、特異的な3次元構造上の特徴、ならびに特異的な荷電特性を有する。エピトープは、「線状」または「立体状」の場合がある。線状エピトープの場合、タンパク質と相互作用性分子（抗体など）間の相互作用点の全ては、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線的に存在する。立体状エピトープの場合、相互作用点は、タンパク質上で相互に隔てられたアミノ酸残基を超えて生じる。抗体は、解離定数が1 mMまたはそれ以下、好ましくは100 nMまたはそれ以下、また最も好ましくは、10 nMまたはそれ以下の場合に、抗原に特異的に結合すると言われる。ある態様ではK_Dは1 pM〜500 pMである。他の態様ではK_Dは500 pM〜1μMである。他の態様ではK_Dは1μM〜100 nMである。他の態様ではK_Dは100 mM〜10 nMである。抗原上の所望のエピトープが決定されると、エピトープに対する抗体を、例えば、本発明において説明される手法で作製することができる。あるいは、発見プロセス中に、抗体の作製および特性解析を行うことにより、所望のエピトープに関する詳細な情報を得ることができる。このような情報を元に、同じエピトープに対する結合に関する抗体のスクリーニングを競合的に行うことが可能となる。これを達成するための手法は、交差競合試験を行い、相互に競合的に結合する抗体、例えば、抗原との結合に関して競合する抗体を見つけることである。抗体を、その交差競合性に基づいて「ビニング（binning）」する高スループットのプロセスは、WO 03/48731に記載されている。

本明細書で用いる20種類の従来のアミノ酸、およびこれらの省略形は従来の用法にしたがう。これについては、参照として本明細書に組み入れられる「Immunology-A Synthesis」(第2版、E.S. GolubおよびD.R. Gren編、Sinauer Associates、Sunderland、Mass.(1991))を参照されたい。

本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドである、長さが少なくとも10塩基の多量体の状態のヌクレオチドであるか、またはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾型を意味する。この用語は1本鎖および2本鎖の形状を含む。

本明細書で用いる「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、起源に関して「単離されたポリヌクレオチド」が以下の性質を有するゲノム、cDNA、もしくは合成起源、またはこれらのいくつかの組み合わせのポリヌクレオチドを意味する：(1)「単離されたポリヌクレオチド」が、自然界に存在するポリヌクレオチドの全体または一部に結合していないこと、(2)自然界では連結した状態にないポリヌクレオチドに機能的に連結されていること、または(3)より長い配列の一部として自然界に存在しないこと。

本明細書で用いる「天然のヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。本明細書で用いる「修飾型ヌクレオチド」は、修飾型または置換型の糖官能基などを有するヌクレオチドを含む。本明細書では「オリゴヌクレオチド結合」という用語は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート(phosphoroanilothioate)、ホスホラニラデート(phosphoranilidate)、ホスホロアミデートなどのオリゴヌクレオチド結合を含む。これについては例えば、参照として本明細書に組み入れられるLaPlanche et al.、Nucl. Acids Res. 14：9081（1986）；Stec et al.、J. Am. Chem. Soc. 106：6077；Stein et al.、Nucl. Acids Res. 16：3209（1988）；Zoc et al.、Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach、pp.87-108(F. Eckstein, Ed.、Oxford University Press、Oxford England（1991））；米国特許第5,151,510号；UhlmannおよびPeyman、Chemical Reviews 90543（1990）を参照されたい。オリゴヌクレオチドは、望ましいならば、検出用の標識を含む場合がある。

「機能的に連結された」配列は、対象遺伝子と連続した発現制御配列と、トランスに(距離をおいて)作用して対象遺伝子を制御作用する発現制御配列の両方を含む。本明細書で用いる「発現制御配列」という用語は、連結した状態でコード配列の発現およびプロセシングを有効とするために必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列は、適切な転写の開始配列、終結配列、プロモーター配列、およびエンハンサー配列；スプライシングシグナルやポリアデニル化シグナルなどの効率的なRNAプロセシングシグナル；細胞質内のmRNAを安定化させる配列；翻訳効率を促進する配列(コザック(Kozak)コンセンサス配列)；タンパク質の安定性を高める配列；ならびに望ましいならば、タンパク質の分泌を高める配列を含む。このような制御配列の性質は宿主生物に応じて異なる。原核生物では、このような制御配列は一般に、プロモーター配列、リボソーム結合部位配列、および転写終結配列を含む。また真核生物では一般に、このような制御配列は、プロモーター配列および転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、存在することが発現およびプロセシングに不可欠な、少なくとも全ての成分を含むことを意図し、存在することが利点となる、例えばリーダー配列および融合パートナー配列などの他の成分を含む場合もある。

本明細書で用いる「ベクター」という用語は、連結された別の核酸を移す能力を有する核酸分子を意味する。いくつかの態様では、ベクターは、追加的なDNAセグメントを連結可能なプラスミド(環状の2本鎖DNA片)である。いくつかの態様では、ベクターは、追加的なDNAセグメントをウイルスゲノムに連結可能なウイルスベクターである。いくつかの態様では、ベクターは、導入された宿主細胞内で自律的に複製する能力をもつ(例えば細菌の複製起点や、エピソーム型哺乳類ベクターを有する細菌ベクター)。他の態様では、ベクター(例えば非エピソーム型哺乳類ベクター)は、宿主細胞に導入後に宿主細胞ゲノムに組み込まれて、宿主ゲノムとともに複製可能である。また一部のベクターは、機能的に連結させた遺伝子の発現を誘導する能力を有する。このようなベクターを本明細書では「組換え発現ベクター」(または単に「発現ベクター」)と呼ぶ。

本明細書で用いる「組換え宿主細胞」(または単に「宿主細胞」)という用語は、組換え発現ベクターが導入された細胞を意味する。「組換え宿主細胞」および「宿主細胞」は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫も意味すると理解すべきである。変異または環境の影響を受けることで、一部の修飾は、続く世代に存在する場合があるので、このような子孫は、実際には親細胞と同一でない場合があるが、それでも本明細書で用いる「宿主細胞」という用語の範囲に含まれる。

「選択的にハイブリダイズする」という用語は、本明細書では、検出目的で、また特異的に結合させることを意味する。本発明におけるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびこれらの断片は、非特異的な核酸に対する検出可能な量の結合を最小とするハイブリダイゼーション条件および洗浄条件で、核酸鎖と選択的にハイブリダイズする。「高ストリンジェンシー」、または「高度にストリンジェントな」条件を、当技術分野で周知であり、本明細書に記載された選択的なハイブリダイゼーション条件を達成するために使用することができる。「高ストリンジェンシー」、または「高度にストリンジェントな」条件の一例は、ポリヌクレオチドと別のポリヌクレオチドのインキュベーションであって、一方のポリヌクレオチドを、6×SSPE、またはSSC、50％ホルムアミド、5×デンハルト試薬、0.5％ SDS、100 μg/ml変性断片化サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション緩衝液中で、42℃のハイブリダイゼーション温度で12〜16時間かけて膜などの固体表面上に結合させた後に、1×SSC、0.5％ SDSの洗浄緩衝液を用いて55℃で2回洗浄する、ポリヌクレオチドと別のポリヌクレオチドのインキュベーションである。これについては、前出のSambrookら、pp.9.50〜9.55も参照されたい。

核酸配列に関する「配列同一性％」という用語は、最大の一致を示すようにアライメントさせたときに、2つの配列内で同じ残基を意味する。配列同一性の比較の長さは、少なくとも約9ヌクレオチド、通常少なくとも約18ヌクレオチド、より一般的には少なくとも約24ヌクレオチド、典型的には少なくとも約28ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約32ヌクレオチド、また好ましくは少なくとも約36ヌクレオチド、48ヌクレオチド、またはそれ以上のヌクレオチドの場合がある。ヌクレオチド配列の同一性を測定するために使用可能な、当技術分野で周知の多種多様なアルゴリズムがある。例えばポリヌクレオチド配列は、Wisconsin Package、バージョン10.0、Genetics Computer Group(GCG)、Madison、Wisconsinに含まれるプログラムであるFASTA、Gap、またはBestfitで比較することができる。例えばプログラムFASTA2およびFASTA3を含むFASTAは、問合わせ配列と探索配列間において最高の重複を示す領域のアライメントおよび配列同一性％を提供する(参照として本明細書に組み入れられるPearson、Methods Enzymol. 183：63-98(1990)；Pearson、Methods Mol. Biol. 132：185-219(2000)；Pearson、Methods Enzymol. 266：227-258(1996)；Pearson、J. Mol. Biol. 276：71-84(1998)を参照)。特に明記しない限り、個々のプログラムまたはアルゴリズムのデフォルトパラメータを使用する。例えば核酸配列間の配列同一性％は、FASTAの場合では、デフォルトパラメータ(ワードサイズ＝6、スコアリングマトリックス用にNOPAMファクターを使用)を用いることで、またはGapの場合では、参照として本明細書に組み入れられるGCGバージョン6.1で提供されるデフォルトパラメータを用いることで決定することができる。

ヌクレオチド配列に関しては、特に明記しない限り、その相補物を含む。したがって、特定の配列を有する核酸について言及する際は、その相補鎖を、その相補的配列とともに含むと理解すべきである。

本明細書で用いる場合の「配列同一性％」および「配列相同性％」という用語は、互換的に使用される。

核酸、またはこれらの断片について言及する際に、「実質的な類似性」、または「実質的な配列類似性」という用語は、別の核酸(またはこの相補鎖)と、適切なヌクレオチドの挿入または欠失を許容しつつ最適にアライメントする際に、ヌクレオチド配列の同一性が、上述のPASTA、BLAST、またはGapなどの配列同一性の任意の既知のアルゴリズムで測定される場合に、ヌクレオチド塩基の少なくとも約85％、好ましくは少なくとも約90％、またより好ましくは少なくとも約95％、96％、97％、98％、または99％であることを意味する。

ポリペプチドに関して、「実質的な同一性」という用語は、2つのペプチド配列が、GAPやBESTFITなどのプログラムで、デフォルトのギャップ重み(gap weight)を用いて最適にアライメントさせた際に、少なくとも70％、75％、もしくは80％の配列同一性、好ましくは少なくとも90％もしくは95％の配列同一性、またより好ましくは少なくとも97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示すことを意味する。ある特定の態様において、同一ではない残基の位置は、保存的アミノ酸置換が異なる。「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基が、類似の化学的性質(例えば電荷や疎水性)を有する側鎖R基を有する別のアミノ酸残基と置換されている置換である。一般に保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変えない。2つもしくはそれ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって相互に異なる場合、配列同一性％は、置換の保存的性質を正すために上方に調整することができる。このような調整を行う手段は当技術分野で周知である(Pearson、Methods Mol. Biol. 243：307-31(1994)参照)。類似の化学的性質を有する側鎖を有するアミノ酸のグループの例には、1)脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；2)脂肪族-ヒドロキシル側鎖：セリンおよびスレオニン；3)アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；4)芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；5)塩基性側鎖：リシン、アルギニン、およびヒスチジン；6)酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸；ならびに7)硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンなどがある。保存的アミノ酸置換のグループは、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リシン-アルギニン、アラニン-バリン、グルタミン酸-アスパラギン酸、およびアスパラギン-グルタミンである。

または、保存的置換は、参照として本明細書に組み入れられるGonnetら、Science 256：1443-45(1992)に記載されたPAM250の対数確率行列で正の値を有する任意の変化である。「中程度に保存的な」置換は、PAM250対数確率行列で負でない値を有する任意の変化である。

ポリペプチドの配列類似性は通常、配列解析ソフトウェアで測定される。タンパク質解析ソフトウェアで、保存的アミノ酸置換を含む、さまざまな置換、欠失、および他の修飾に割り当てる類似性の尺度を用いて類似の配列とマッチさせる。例えばGCGは、プログラムにより指定されるようなデフォルトのパラメータを使用して、異種の生物に由来する相同ポリペプチドなどの、密接に関連したポリペプチド間における、または野生型タンパク質とこの変異体との間における、配列相同性もしくは配列同一性を決定することが可能な「Gap」や「Bestfit」などのプログラムを含む(GCGバージョン6.1を参照)。ポリペプチド配列は、GCGバージョン6.1（Wisconsin大学、WI）に含まれるプログラムであるFASTAで、デフォルトのパラメータまたは推奨パラメータを用いて比較することもできる。FASTA(例えばFASTA2およびFASTA3)は、問合わせ配列と探索配列間において最高の重複を示す領域のアライメントおよび配列同一性％を提供する(Pearson、Methods Enzymol. 183：63-98(1990)；Pearson、Methods Mol. Biol. 132：185-219(2000))。本発明の配列を、異なる生物の大量の配列を含むデータベースと比較する際の別の好ましいアルゴリズムが、プログラムで与えられるようなデフォルトのパラメータを用いるコンピュータプログラムBLAST(特にblastpまたはtblastn)である。これについては例えば、Altschulら、J. Mol. Biol. 215：403-410(1990)；Altschulら、Nucleic Acids Res. 25：3389-402(1997)を参照されたい。

相同性を比較する対象のポリペプチド配列の長さは一般に、少なくとも約16アミノ酸残基であり、通常少なくとも約20残基であり、より一般的には少なくとも約24残基であり、典型的には少なくとも約28残基であり、また好ましくは約35残基を上回る。多種多様な生物の配列を含むデータベースを検索する際は、アミノ酸配列を比較することが好ましい。

本明細書で用いる「標識」または「標識された」という用語は、別の分子を抗体に導入することを意味する。1つの態様では、標識は検出マーカーであり、例えば放射標識アミノ酸を導入したり、マークのつけられたアビジン(例えば光学的方法または熱量測定法で検出可能な蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン)で検出可能なビオチン部分のポリペプチドに結合させたりする。別の態様では、標識またはマーカーは、治療目的のもの(例えば薬剤コンジュゲートや毒素)とすることができる。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識するさまざまな方法は当技術分野で周知であり、使用することができる。ポリペプチド用の標識の例には、以下のようなものがあるがこれらに限定されない：放射性同位元素または放射性核種(例えば³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I)、蛍光標識(例えばFITC、ローダミン、ランタニド蛍光体(lanthanide phosphor))、酵素標識(例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ)、化学発光マーカー、ビオチニル基、2次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ(例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ)、ガドリニウムキレート剤などの磁気薬剤、百日咳毒素などの毒素、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにこれらの類似体または相同物。いくつかの態様では標識を、潜在的な立体障害を小さくするために、さまざまな長さのスペーサーアームによって結合させる。

本明細書および特許請求項の全体において、「〜を含む(comprise)」という表現、または「〜を含む(comprises、comprising)」などの変形例は、記載された整数値、または記載された整数値群を含むが、他の任意の整数値または整数値群を除外しないように理解される。

ヒト抗c-Met抗体とその特徴
1つの態様では、本発明はヒト化抗c-Met抗体を提供する。別の態様では、本発明はヒト抗c-Met抗体を提供する。いくつかの態様では、ヒト抗c-Met抗体は、ゲノムがヒト免疫グロブリンの遺伝子を含むことでトランスジェニック動物がヒト抗体を産生するようになる、非ヒトトランスジェニック動物（例えば齧歯類）を免疫化する段階によって作製される。

本発明の抗c-Met抗体は、ヒトκ軽鎖もしくはヒトλ軽鎖、またはこれらに由来するアミノ酸配列を含む場合がある。κ軽鎖を含む、いくつかの態様では、軽鎖の可変部ドメイン（V_L）は部分的に、ヒトのL5 V_κ1遺伝子またはA27_κ3遺伝子にコードされる。

いくつかの態様では、c-Met抗体のV_Lは、生殖系列のアミノ酸配列に対して、1つもしくは複数のアミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、抗c-Met抗体のV_Lは、生殖系列のアミノ酸配列に対して1か所、2か所、3か所、4か所、5か所、6か所、7か所、8か所、9か所、または10か所のアミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、生殖系列に由来する、このような置換の1つもしくは複数は、軽鎖のCDR領域中に存在する。いくつかの態様では、生殖系列に対するアミノ酸の置換は、抗体13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3、または13.3.2L-A91TのV_Lの任意の1つもしくは複数において、生殖系列に対する置換の場合と同じ位置の1か所もしくは複数の箇所における置換である。例えば、抗c-Met抗体のV_Lは、抗体9.1.2.のV_L中に存在する生殖系列と比較して1つもしくは複数のアミノ酸置換を含む場合があるほか、または抗体8.70.2と同じV_K遺伝子を利用する、抗体13.3.2のV_L中に存在する生殖系列と比較して1つもしくは複数のアミノ酸置換の場合がある。いくつかの態様では、アミノ酸の変化は、同じ位置の1か所もしくは複数の箇所に存在するが、標準抗体とは異なる置換を含む。

いくつかの態様では、生殖系列に対するアミノ酸の変化は、抗体13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3、または13.3.2L-A91TのV_Lの任意のV_Lと同じ位置の1か所もしくは複数の箇所において生じるが、アミノ酸の変化は、標準抗体のアミノ酸に対して、（1つまたは複数の）このような位置における保存的なアミノ酸置換の場合がある。例えば仮に、これらの抗体の1つの特定の位置が、生殖系列に対して変化する場合、またこれがグルタミン酸である場合、この位置でアスパラギン酸に置換することができる。同様に、仮に生殖系列と比較した場合のアミノ酸の置換がセリンの場合、同位置においてセリンの代わりにスレオニンに保存的に置換することができる。保存的なアミノ酸置換については上述した。

いくつかの態様では、ヒト抗c-Met抗体の軽鎖は、抗体13.3.2（X₈がアラニンであるSEQ ID NO：4）：13.3.2L-A91T（X₈がスレオニンであるSEQ ID NO：4）：9.1.2（SEQ ID NO：8）：8.70.2（SEQ ID NO：12）：もしくは8.90.3（SEQ ID NO：16）のV_Lのアミノ酸配列を含み、または同アミノ酸配列は、最大1か所、2か所、3か所、4か所、5か所、6か所、7か所、8か所、9か所、もしくは10か所の保存的なアミノ酸置換を有するか、および/または、全体で最大3か所の非保存的なアミノ酸置換を有する。いくつかの態様では、軽鎖は、前述の抗体の任意の1つのCDR1の先頭からCDR3の末端に至るアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様では、軽鎖は、それぞれが抗体13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3、もしくは13.3.2L-A91Tの軽鎖のCDR1、CDR2、およびCDR3から独立に選択されるCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域を含むか、または、それぞれ4か所未満もしくは3か所未満の保存的なアミノ酸置換を含むか、および/または全体で3か所もしくはこれより少ない非保存的アミノ酸置換を含むCDR領域を含む場合がある。いくつかの態様では、抗c-Met抗体の軽鎖は、それぞれがモノクローナル抗体13.3.2（X₈がアラニンであるSEQ ID NO：4；X₇がグアノシンであるSEQ ID NO：3）：13.3.2L-A91T（X₈がスレオニンであるSEQ ID NO：4；X₇がアデノシンであるSEQ ID NO：3）；9.1.2.（SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：7）；8.70.2（SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：11）；または8.90.3（SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：15）の軽鎖のCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域から独立に選択される、軽鎖のCDR1、CDR2、およびCDR3を含む。ある態様では、抗c-Met抗体の軽鎖は、13.3.2（X₈がアラニンであるSEQ ID NO：4）；9.1.2.（SEQ ID NO：8）；8.70.2（SEQ ID NO：12）；8.90.3（SEQ ID NO：16）、もしくは13.3.2L-A91T（X₈がスレオニンであるSEQ ID NO：4）から選択される抗体のV_L領域のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖のCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域、またはそれぞれが4か所未満もしくは3か所未満の保存的なアミノ酸置換、および/または全体で3か所もしくは3か所未満の非保存的なアミノ酸置換を含むCDR領域を含む。

重鎖に関しては、いくつかの態様では、可変部ドメイン（V_H）は、ヒトのV_H 1-18、V_H 4-31、V_H 4-39、またはV_H 3-48の遺伝子に部分的にコードされる。いくつかの態様では、抗c-Met抗体のV_H配列は、生殖系列のアミノ酸配列に対して1つもしくは複数のアミノ酸置換、欠失、または挿入（付加）を含む。いくつかの態様では、重鎖の可変部ドメインは、生殖系列のアミノ酸配列に由来する1か所、2か所、3か所、4か所、5か所、6か所、7か所、8か所、9か所、10か所、11か所、12か所、13か所、14か所、15か所、16か所、または17か所の変異を含む。いくつかの態様では、（1つまたは複数の）変異は、生殖系列のアミノ酸配列と比較して、非保存的置換である。いくつかの態様では、変異は重鎖のCDR領域中に存在する。いくつかの態様では、アミノ酸の変化は、抗体13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3；13.3.2H-A14P；13.3.2H-E42K；13.3.2H-S97T；13.3.2H-A14P, E42K；13.3.2H-E42K, S97T；または13.3.2H-A14P, E42K, S97TのV_Hの1つもしくは複数において、生殖系列に由来する変異と同じ位置の1か所もしくは複数の箇所において作られる。他の態様では、アミノ酸の変化は、同じ位置の1か所もしくは複数の箇所における変化であるが、標準抗体とは異なる変異を含む。

いくつかの態様では、重鎖は、抗体13.3.2（X₂がグルタミン酸であり、X₄がセリンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-E42K（X₂がリシンであり、X₄がセリンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-E42K, S97T（X₂がリシンであり、X₄がスレオニンであるSEQ ID NO：2）；9.1.2（SEQ ID NO：6）；8.70.2（SEQ ID NO：10）、もしくは8.90.3（SEQ ID NO：14）のV_Hのアミノ酸配列を含み、またはV_Hのアミノ酸配列は、最大で1か所、2か所、3か所、4か所、6か所、8か所、または10か所の保存的なアミノ酸置換、および/または全体で最大3か所の非保存的アミノ酸置換を有する。いくつかの態様では、重鎖は、前述の抗体の任意の1つのCDR1の先端からCDR3の末端に至るアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様では、重鎖は、抗体13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3；13.3.2H-A14P；13.3.2H-E42K；13.3.2H-S97T；13.3.2H-A14P, E42K；13.3.2H-E42K, S97T；もしくは13.3.2H-A14P, E42K, S97Tの重鎖のCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域を含み、またはこれらのCDR領域はそれぞれ、8か所未満、6か所未満、4か所未満、または3か所未満の保存的なアミノ酸置換、および/または全体で3か所もしくはそれ以下の非保存的アミノ酸置換を有する。

いくつかの態様では、重鎖のCDR領域は、13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3；13.3.2H-A14P；13.3.2H-E42K；13.3.2H-S97T；13.3.2H-A14P, E42K；13.3.2H-E42K, S97T、または13.3.2H-A14P, E42K, S97Tの2種類もしくはこれ以上の抗体のCDR領域から独立に選択される。別の態様では、重鎖は、13.3.2（X₂がグルタミン酸であり、X₄がセリンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-E42K（X₂がリシンであり、X₄がセリンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-E42K, S97T（X₂がリシンであり、X₄がスレオニンであるSEQ ID NO：2）；9.1.2（SEQ ID NO：6）；8.70.2（SEQ ID NO：10）、または8.90.3（SEQ ID NO：14）から選択される2つもしくはこれ以上のV_H領域から独立に選択されるCDR領域を含む。別の態様では、抗体は、上述の軽鎖と上述の重鎖を含む。別の態様では、軽鎖のCDRおよび重鎖のCDRは、同じ抗体に由来する。

作製される場合のある、1つのタイプのアミノ酸置換は、化学的に反応する可能性のある、抗体中の1つもしくは複数のシステインを、アラニンまたはセリンに代表されるがこれらに限定されない別の残基に変化させることである。1つの態様では、非標準的なシステインの置換が存在する。このような置換は、抗体の可変部ドメインのCDR領域もしくはフレームワーク領域中に、または定常部ドメイン中に作られる場合がある。いくつかの態様では、このシステインは標準的なシステインである。

作られる可能性のある別のタイプのアミノ酸置換は、抗体中の任意の潜在的なタンパク質切断部位を変化させることである。このような部位は、抗体の可変部ドメインのCDR領域もしくはフレームワーク領域、または定常部ドメイン内に存在する場合がある。システイン残基の置換、およびタンパク質切断部位の除去は、抗体産物中における任意の不均一性のリスクを低下させることで、その均一性を高める可能性がある。別のタイプのアミノ酸置換は、潜在的なアミド分解部位を形成しているアスパラギン-グリシン対を、これらの残基の一方または両方を変えることによって除去することである。

いくつかの態様では、本発明の抗c-Met抗体の重鎖のC末端のリシンが切断される。本発明のさまざまな態様では、抗c-Met抗体の重鎖および軽鎖は、任意でシグナル配列を含む場合がある。

1つの局面では、本発明は、4種類の阻害性のヒト抗c-Metモノクローナル抗体、およびこれらを産生するハイブリドーマ細胞系列に関する。表1に、完全長の重鎖および軽鎖（リーダー配列を含む）をコードする核酸、ならびに対応する完全長の推定アミノ酸配列の配列識別子（SEQ ID NO：）を挙げた。

（表１）ヒト抗c-Met抗体

本発明はさらに、1か所もしくは複数のアミノ酸置換を含む、上記のヒト抗c-Met抗体の重鎖および/または軽鎖のバリアントを提供する。バリアントの命名に際しては、先頭の文字は、天然の抗体鎖のアミノ酸を示す1文字記号であり、数字は、アミノ酸の位置を意味し（1位はN末端のアミノ酸である）、また2番目の文字は、バリアントのアミノ酸を示す1文字記号である。いくつかの態様では、本発明は、モノクローナル抗体13.3.2の重鎖のバリアントを提供する。13.3.2の重鎖のバリアントの1つはE42Kであり、SEQ ID NO：2のX₂位にリシンを有する。E42K 13.3.2のバリアントをコードするDNA配列は、SEQ ID NO：1のX₁にアデノシンを有する。

第2の13.3.2の重鎖のバリアントはS97Tであり、これはX₄位にスレオニン残基を有する。S97T 13.3.2のバリアントをコードするDNA配列は、SEQ ID NO：1のX₃位にアデノシンを有する。第3の13.3.2の重鎖のバリアントはA14Pであり、これはSEQ ID NO：2のX₆位にプロリン残基を有する。DNA配列では、A14P 13.3.2のバリアントは、SEQ ID NO：1にコードされる（X₅はシトシン）。本発明は、モノクローナル抗体13.3.2のバリアント軽鎖も提供する。A91Tは、SEQ ID NO：4で表される13.3.2の軽鎖のバリアントである（X₈はスレオニン残基）。DNA配列では、A91T 13.3.2のバリアントは、SEQ ID NO：3にコードされる（X₇はアデノシン）。バリアントの重鎖または軽鎖、および野生型の鎖を含む抗体は、バリアント鎖によって命名される。したがって、抗体13.3.2およびE42Kの重鎖のバリアントの野生型の軽鎖を含む抗体は、13.3.2H-E42Kと命名される。

本発明の他の態様では、アミノ酸のバリアントの組み合わせを含む抗体を作製することができる（例えば、13.3.2H-E42K, S97T）。13.3.2のバリアント重鎖とバリアント軽鎖の別の組み合わせが含まれる。好ましい態様では、抗c-Met抗体は、13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3；13.3.2H-A14P；13.3.2H-E42K；13.3.2H-A14P, E42K；13.3.2H E42K, S97T；13.3.2H-A14P, E42K, S97T；13.3.2H-S97T；13.3.2L-A91T；13.3.2L A91T, H-A14P；13.3.2L-A91T, H-E42K；13.3.2L-A91T, H-A14P, E42K；13.3.2L A91T, H-E42K, S97T、または13.3.2L-A91T, H-A14P, E42K, S97Tである。さらに別の態様では、本発明は、上述の任意のヒト抗c-Met抗体の可変部ドメインのアミノ酸配列に対して80%を上回る、85%を上回る、90%を上回る、95%を上回る、96%を上回る、97%を上回る、98%を上回る、または99%を上回る配列同一性を有する、可変部ドメインのアミノ酸配列を含む抗体を含む。

抗c-Met抗体のクラスおよびサブクラス
抗c-Met抗体のクラスおよびサブクラスは、当技術分野で周知の任意の方法で決定することができる。一般に、抗体のクラスおよびサブクラスは、特定の抗体のクラスおよびサブクラスに特異的な抗体を用いて決定することができる。このような抗体は市販されている。クラスおよびサブクラスは、ELISA、またはウェスタンブロット、ならびに他の手法で決定することができる。あるいは、クラスおよびサブクラスは、抗体の重鎖および/または軽鎖の定常ドメインの全体または一部の配列を決定し、それらのアミノ酸配列を、さまざまなクラスおよびサブクラスの免疫グロブリンの既知のアミノ酸配列と比較し、ならびに抗体のクラスおよびサブクラスを決定することで決定することができる。

いくつかの態様では、本発明の抗c-Met抗体はモノクローナル抗体である。抗c-Met抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、またはIgDの分子の場合がある。好ましい態様では、抗c-Met抗体はIgGであり、またIgG1、IgG2、IgG3、IgG4のサブクラスである。別の好ましい態様では、抗体のサブクラスはIgG2である。

c-Metに対する抗c-Met抗体の結合親和性
本発明のいくつかの態様では、抗c-Met抗体はc-Metと高親和性で結合する。いくつかの態様では、抗c-Met抗体はc-Metと2×10^-7 Mまたはそれ以下のK_Dで結合する。他の好ましい態様では、抗体はc-Metと2×10^-8 M、2×10^-9 M、または5×10^-8 Mもしくはそれ以下のK_Dで結合する。さらにより好ましい態様では、抗体はc-Metと、13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3；13.3.2H-A14P；13.3.2H-E42K；13.3.2H-S97T；13.3.2H-A14P, E42K；13.3.2H-E42K, S97T；13.3.2H-A14P, E42K, S97T；13.3.2L-A91T；13.3.2L A91T, H-A14P；13.3.2L-A91T, H-E42K；13.3.2L-A91T, H-A14P, E42K；13.3.2L-A91T, H-E42K, S97T、または13.3.2L-A91T, H-A14P, E42K, S97Tからなる群より選択される抗体に対する場合と実質的に同じK_Dで結合する。さらに別のより好ましい態様では、抗体はc-Metと、SEQ ID NO：2［13.3.2（X₂がグルタミン酸であり、X₄がセリンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-E42K（X₂がリシンであり、X₄がセリンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-E42K, S97T（X₂がリシンであり、X₄がスレオニンであるSEQ ID NO：2）］、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、またはSEQ ID NO：14のV_H領域のアミノ酸配列を有する重鎖の可変部ドメイン、SEQ ID NO：4［13.3.2（X₈がアラニンであるSEQ ID NO：4）；13.3.2L-A91T（X₈がスレオニンであるSEQ ID NO：4）］、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：12、またはSEQ ID NO：16のV_L領域のアミノ酸配列を有する軽鎖の可変部ドメイン、またはこの両方を含む抗体と実質的に同じK_Dで結合する。別の好ましい態様では、抗体はc-Metと、SEQ ID NO：4［13.3.2（X₈がアラニンであるSEQ ED NO: 4）；13.3.2L-A91T（X₈がスレオニンであるSEQ ID NO：4）］、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：12、またはSEQ ID NO：16のV_L領域のアミノ酸配列を有する軽鎖の可変部ドメインのCDR領域、またはSEQ ID NO：2［13.3.2（X₂がグルタミン酸であり、X₄がセリンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-E42K（X₂がリシンであり、X₄がセリンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-E42K, S97T（X₂がリシンであり、X₄がスレオニンであるSEQ ID NO：2）］、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、またはSEQ ID NO：14のV_H領域のアミノ酸配列を有する重鎖の可変部ドメインのCDR領域を含む抗体と実質的に同じK_Dで結合する。

いくつかの態様では、抗c-Met抗体の解離速度定数（k_off）は小さい。いくつかの態様では、抗c-Met抗体のk_offは、1.0×10^-3 s^-1もしくはそれ以下、または5.0×10^-4 s^-1もしくはそれ以下である。他の好ましい態様では、抗体はc-Metと2×10^-4 s^-1もしくはそれ以下のk_offで結合する。いくつかの態様では、k_offは、13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3；13.3.2H-A14P；13.3.2H-S97T；13.3.2H-E42K；13.3.2H-A14P, E42K；13.3.2H-E42K, S97T；13.3.2H-A14P, E42K, S97T；13.3.2L-A91T；13.3.2L-A91T, H-A14P；13.3.2L A91T, H-E42K；13.3.2L-A91T, H-A14P, E42K；13.3.2L-A91T, H-E42K, S97T、または13.3.2L-A91T, H-A14P, E42K, S97Tからなる群より選択される抗体を含む、本明細書に記載された抗体と実質的に同じである。いくつかの態様では、抗体はc-Metと、13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3、または13.3.2L-A91Tから選択される抗体に由来する重鎖のCDR領域もしくは軽鎖のCDR領域を含む抗体と実質的に同じk_offで結合する。いくつかの態様では、抗体はc-Metと、SEQ ID NO：2［13.3.2（X₂がグルタミン酸であり、X₄がセリンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-E42K（X₂がリシンであり、X₄がセリンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-E42K, S97T（X₂がリシンであり、X₄がスレオニンであるSEQ ID NO：2）］、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、もしくはSEQ ID NO：14のV_H領域のアミノ酸配列を有する重鎖の可変部ドメイン、SEQ ID NO：4［13.3.2（SEQ ID NO：4）；13.3.2L-A91T（X₈がスレオニンであるSEQ ID NO：4）］、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：12、もしくはSEQ ID NO：16のV_L領域のアミノ酸配列を有する軽鎖の可変部ドメインもしくはこの両方を含む抗体と実質的に同じk_offで結合する。別の好ましい態様では、抗体はc-Metと、SEQ ID NO：4［13.3.2（X₈がアラニンであるSEQ ID NO：4）、および13.3.2L-A91T（X₈がスレオニンであるSEQ ID NO：4）］、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：12、もしくはSEQ ID NO：16のV_L領域のアミノ酸配列を有する軽鎖の可変部ドメインのCDR領域、またはSEQ ID NO：2［13.3.2（X₂がグルタミン酸であり、X₄がセリンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H E42K（X₂がリシンであり、X₄がセリンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-E42K, S97T（X₂がリシンであり、X₄がスレオニンであるSEQ ID NO：2）］、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、またはSEQ ID NO：14のV_H領域のアミノ酸配列を有する重鎖の可変部ドメインのCDR領域を含む抗体と実質的に同じk_offで結合する。

c-Metに対する抗c-Met抗体の結合親和性および解離速度は、当技術分野で周知の方法で決定することができる。結合親和性は、ELISA、RIA、フローサイトメトリー、BIACORE（商標）などの表面プラズモン共鳴で測定することができる。解離速度は、表面プラズモン共鳴によって測定することができる。好ましくは、結合親和性および解離速度は、表面プラズモン共鳴によって測定される。より好ましくは、結合親和性および解離速度は、BIACORE（商標）によって測定される。抗体が、抗c-Met抗体と実質的に同じK_Dを有するか否かについては、当技術分野で周知の方法で決定することができる。実施例VIIIでは、BIACORE（商標）による抗c-Metモノクローナル抗体の親和性定数を決定する方法を例示する。

抗c-Met抗体によって認識されるc-Metのエピトープの同定
本発明は、c-Metと結合し、また以下と競合または交差競合するか、および/または同じエピトープと結合するヒト抗c-Metモノクローナル抗体を提供する：（a）13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3；13.3.2H-A14P；13.3.2H-E42K；13.3.2H-A14P, E42K；13.3.2H-E42K, S97T；13.3.2H A14P, E42K, S97T；13.3.2H-S97T；13.3.2L-A91T；13.3.2L-A91T, H-A14P；13.3.2L-A91T, H-E42K；13.3.2L-A91T, H-A14P, E42K；13.3.2L-A91T, H-E42K, S97T、または13.3.2L-A91T, H-A14P, E42K, S97Tからなる群より選択される抗体；（b）SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、もしくはSEQ ID NO：14のアミノ酸配列を有する重鎖の可変部ドメインを含む抗体、（c）SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：12、もしくはSEQ ID NO：16のアミノ酸配列を有する軽鎖の可変部ドメインを含む抗体、または（d）（b）に記載された重鎖の可変部ドメインと（c）に記載された軽鎖の可変部ドメインの両方を含む抗体。

抗体が、抗c-Met抗体と同じエピトープと結合するか、または同抗体との結合に関して交差競合するか否かについては、当技術分野で周知の方法で決定することができる。1つの態様では、飽和条件下で、本発明の抗c-Met抗体とc-Metを結合させた後に、試験抗体のc-Metと結合する能力を測定することが可能である。仮に試験抗体がc-Metと、抗c-Met抗体と同じ時間で結合可能ならば、試験抗体は、抗c-Met抗体とは異なるエピトープと結合する。しかし仮に、試験抗体が同じ時間にc-Metと結合できないならば、試験抗体は、同じエピトープ、重複するエピトープ、またはヒト抗c-Met抗体が結合するエピトープに近接するエピトープと結合する。この実験は、ELISA、RIA、BIACORE（商標）、またはフローサイトメトリーによって実施することができる。好ましい態様では、実験はELISAによって実施される。K_Dを決定する方法については後述する。

抗c-Met抗体によるc-Met活性の阻害
別の態様では、本発明は、HGFとc-Met受容体の結合を阻害する抗c-Met抗体を提供する。好ましい態様では、c-Met受容体はヒト由来の受容体である。別の好ましい態様では、抗c-Met抗体はヒト抗体である。IC₅₀は、ELISA、RIA、または他のアッセイ法、また散乱アッセイ法（scattering assay）、ソフトアガー成長、および管腔形成アッセイ法などの細胞ベースのアッセイ法によるリガンド結合アッセイ法で測定することができる。1つの態様では、抗体または抗体の一部は、HGFとc-Met間のリガンド結合を、ELISA法によって測定される、最大5μg/ml、好ましくは最大1μg/ml、より好ましくは最大0.5μg/ml、さらにより好ましくは最大0.20μg/mlのIC₅₀で阻害する（図1A参照）。実施例IIIでは、このタイプのアッセイ法について例示する。

別の態様では、本発明は、HGFの存在下でc-Metの活性化を妨げる抗c-Met抗体を提供する。好ましい態様では、抗c-Met抗体は、c-Metとの結合に伴って生じるHGF誘導型のチロシンリン酸化を阻害する。抗c-Met抗体が、HGFの存在下でc-Metの活性化を妨げることが可能か否かについては、ウエスタンブロッティングまたはELISA法によってc-Metの自己リン酸化のレベルを決定することで判断することができる。好ましい態様では、c-Metの自己リン酸化のレベルをELISA法で決定する場合がある。別の好ましい態様では、ELISA法で測定されるIC₅₀は最大5μg/mlであり、好ましくは最大1μg/mlであり、より好ましくは最大0.5μg/mlであり、さらにより好ましくは最大0.20μg/mlである。実施例IVでは、HGFの存在下で、抗c-Met抗体によってc-Met活性の阻害化を測定する1つのタイプのアッセイ法を例示する（図1B参照）。

本発明の別の局面では、抗体は、抗体とのインキュベーション後に、細胞表面におけるc-Metレベルの発現抑制を引き起す場合がある。いくつかの態様では、インキュベーションは、短期間（例えば4時間）、または長期間（例えば24時間）の場合がある。細胞表面のc-Metレベルの発現抑制は、ウエスタンブロッティングまたはELISAで測定することができる。本発明の特定の態様では、抗体は、ウエスタンブロッティングもしくはELISAによって測定される場合に、細胞表面のc-Metレベルの好ましくは6%の発現抑制、好ましくは10%の発現抑制、またはより好ましくは、細胞表面のc-Metレベルの20%の発現抑制、より好ましくは50%の発現抑制、またはさらにより好ましくは少なくとも50%の発現抑制を引き起す可能性がある。実施例Vでは、抗体との短時間のインキュベーション後における細胞表面のc-Metレベルの発現抑制を測定する1つのタイプのELISAを例示する。

別の態様では、本発明は、ソフトアガー中におけるコロニー形成を阻害する抗c-Met抗体を提供する。さまざまな態様では、ソフトアガー成長アッセイ法で測定されるIC₅₀は、最高25μg/ml、好ましくは最高20μg/ml、より好ましくは最高5μg/ml、さらにより好ましくは最高1μg/mlである。別の態様では、管腔形成アッセイ法で、HGFの存在下で成長させ、本発明の抗体で処理した細胞において、c-Met依存性の形態変化の阻害のパーセントを測定することができる。好ましくは、管腔形成アッセイ法で測定される阻害のパーセントは、20%以上、好ましくは60%以上、またはさらにより好ましくは80%以上である。実施例VIおよびVIIでは、さまざまなタイプのアッセイ法を例示する。

抗c-Met抗体によるインビボにおける腫瘍細胞の成長の阻害
いくつかの態様にしたがって、本発明は、腫瘍細胞の増殖をインビボで阻害する抗c-Met抗体を提供する。このような腫瘍細胞は、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、または中胚葉性細胞を含むがこれらに限定されない任意の種類の細胞に由来する場合がある。腫瘍細胞は、白血病、肉腫、多発性骨髄腫、膠芽腫、絨毛癌、カポジ肉腫、または頚部上皮内癌を含むがこれらに限定されない、固形腫瘍または非固形腫瘍に由来する場合がある。別の態様では、抗c-Met抗体は、動物の前立腺癌、結腸癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、および膠芽腫の成長を阻害する。c-Met抗体が、S114（ヒトHGFおよびヒトc-Metを発現するように改変されたNIH-3T3細胞系列）を阻害する細胞の例は、文献に記載されている（Rong et al., Mol. Cell. Biol., 12 (11): 5152-5158；(1992)；米国特許第4,405,712号）。いくつかの態様では、本発明の抗c-Met抗体は、肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部の癌、皮膚もしくは眼内の黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、結腸癌、乳癌、婦人科腫瘍（例えば子宮肉腫、卵管の癌、子宮内膜の癌、子宮頚部の癌、膣の癌、もしくは陰門の癌）、ホジキン病、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌（例えば、甲状腺、副甲状腺、もしくは副腎の癌）、軟組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、前立腺癌、慢性もしくは急性の白血病、小児の固形腫瘍、リンパ性リンパ腫、膀胱の癌、腎臓もしくは輸尿管の癌（例えば腎細胞癌、腎盂の癌）、または中枢神経系の新生物（例えば原発性CNSリンパ腫、脊髄の軸の腫瘍、脳幹グリオーマ、もしくは下垂体腺腫）の治療に使用される。

好ましい態様では、抗体は、抗体で処理しなかった動物における腫瘍の成長と比較して、腫瘍細胞の成長を阻害する。より好ましい態様では、抗c-Met抗体は、腫瘍細胞の成長を少なくとも30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%を阻害する。1つの態様では、腫瘍細胞の成長の阻害は、抗体による動物の処理が開始されてから少なくとも7日後に測定される。別の態様では、腫瘍細胞の成長の阻害は、抗体による動物の処理が開始されてから少なくとも14日後に測定される。これについては実施例IXを参照されたい。別の態様では、抗c-Met抗体は少なくとも10%〜100%の腫瘍の縮退を生じる

抗c-Met抗体によるc-Metの活性化
本発明の別の局面は、活性化抗体である抗c-Met抗体（すなわちc-Metアゴニスト）に関する。活性化抗体は、c-Metに対するHGFの作用を増幅するか、または同作用を肩代わりする。いくつかの態様では、活性化抗体は本質的にHGFの模倣体であり、またc-Metとの結合に関してHGFと競合する。いくつかの態様では、このような抗体は、c-Metとの結合に関してHGFと競合しないが、c-Metに対するHGFの結合の作用を増幅はする。いくつかの態様では、抗c-Met抗体は、HGFの存在下または非存在下でc-Metを活性化する。抗c-Met抗体のアゴニスト活性は、c-Met活性化ELISA法で測定することができる。本発明のいくつかの態様では、アゴニスト活性は、HGFで刺激されなかった細胞の2〜3倍の促進である。他の態様では、アゴニスト活性は少なくとも6倍である。実施例Xでは、c-Met活性化アッセイ法の例について述べる。抗c-Met抗体アゴニストの活性は、管腔形成アッセイ法で測定することができる。本発明の1つの態様では、c-Metアゴニスト活性を測定する管腔形成アッセイ法によって、弱いアゴニスト活性が測定される場合がある。実施例Xでは、c-Metアゴニスト活性を測定する1つのタイプの管腔形成アッセイ法を例示する。

分子種および分子の選択
本発明の別の局面では、抗c-Met抗体は、分子種と分子の選択の両方を示す。いくつかの態様では、抗c-Met抗体は、ヒトならびにカニクイザルおよびアカゲザルのc-Metと結合する。別の態様では、抗c-Met抗体はさらにラットのc-Metと結合する。別の態様では、抗c-Met抗体は、マウスまたはイヌのc-Metと結合しない。本明細書の記載内容に従うことで、抗c-Met抗体に対する分子種の選択性を、当技術分野で周知の方法で決定することができる。分子種の選択性は例えば、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、ELISA、免疫沈降法、またはRIAで決定することができる。好ましい態様では、分子種の選択性はフローサイトメトリーで決定することができる。

別の態様では、抗c-Met抗体は、c-Metに対して、IGF-1R（インスリン様成長因子1受容体）に対する選択性よりも100倍大きい選択性を有する（図2参照）。いくつかの態様では、抗c-Met抗体は、c-Met以外の他の任意のタンパク質に対する特記すべき特異的な結合を示さない。c-Metに対する抗c-Met抗体の選択性は、本明細書に記載に従って、当技術分野で周知の方法で決定することができる。例えば選択性は、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、ELISA、免疫沈降法、またはRIAで決定することができる。

抗体および抗体産生細胞株の作製法
免疫化
いくつかの態様では、ゲノムにヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の座位の一部または全体を含む非ヒトのトランスジェニック動物をc-Met抗原で免疫化することでヒト抗体を産生させる。好ましい態様では、非ヒト動物はXENOMOUSE(商標)動物（Abgenix, Inc., Fremont, CA）である。

XENOMOUSE(商標)マウスは、ヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の座位の大きな断片を含み、またマウスの抗体が産生されない、人工的に作製されたマウス系列である。例えば、

別の局面では、本発明は、非ヒト・非マウス動物から、ヒト免疫グロブリン座位を含む非ヒトトランスジェニック動物を、c-Met抗原で免疫化することで抗c-Met抗体を作製する方法を提供する。このような動物は、既に引用した文献に記載された方法で作製することができる。これらの文献に開示されているような方法は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,994,619号に記載されているように一部改変することができる。米国特許第5,994,619号では、ブタおよびウシに由来する新しい培養内部細胞塊（CICM）細胞および細胞系列、ならびに異種DNAが挿入されているトランスジェニックCICM細胞の作製法が述べられている。CICMトランスジェニック細胞は、クローン化されたトランスジェニックの胚、胎仔、および子孫を作製するために使用することができる。同特許は、異種DNAをその子孫に伝えることが可能なトランスジェニック動物の作製法についても述べている。本発明の好ましい態様では、非ヒト動物は、哺乳類、特にラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、またはウマである。

XENOMOUSE(商標)マウスは、完全ヒト抗体の成体様ヒトレパートリーを産生し、抗原特異的ヒト抗体を生じる。いくつかの態様では、XENOMOUSE(商標)マウスは、酵母人工染色体(YAC)におけるヒト重鎖座位およびκ軽鎖座位の、大きさがメガ塩基の生殖細胞型の断片の導入によって、約80％のヒト抗体V遺伝子レパートリーを含む。その他の態様において、XENOMOUSE（商標）マウスはヒトλ軽鎖座位のほぼすべてを含む。これについては、参照として本明細書に組み入れられるMendez ら、Nature Genetics 15：146-156(1997)、GreenおよびJakobovits、J. Exp. Med. 188：483-495(1998)、およびWO 98/24893を参照されたい。

いくつかの態様では、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含む非ヒト動物は、ヒトの免疫グロブリンの「minilocus」を有する動物である。minilocusを用いる方法では、外因性Ig座位を、Ig座位に由来する各遺伝子を含めることで模倣する。したがって、1個または複数のV_H遺伝子、1個または複数のD_H遺伝子、1個または複数のJ_H遺伝子、mu定常ドメイン、および第2の定常ドメイン(好ましくはγ定常ドメイン)を、動物挿入用の構築物中に作り込む。この方法は特に、参照として本明細書に組み入れられる

に記載されている。

別の局面では、本発明は、ヒト化抗c-Met抗体の作製法を提供する。いくつかの態様では、非ヒト動物を、後述するように抗体産生を可能とする条件でc-Met抗原で免疫化する。抗体産生細胞を動物から単離し、ミエローマと融合させてハイブリドーマを作り、対象となる抗c-Met抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸を単離する。得られた核酸を次に、当技術分野で周知の手法、および詳しく後述する手法で操作することで、(抗体をヒト化してヒトにおける免疫応答を低下させるために)非ヒト配列の量を減らす。

いくつかの態様では、c-Met抗原を単離し、および/またはc-Metを精製する。好ましい態様では、同c-Met抗原はヒトc-Metである。いくつかの態様では、同c-Met抗原はc-Metの断片である。いくつかの態様では、c-Met断片はc-Metの細胞外ドメインである。いくつかの態様では、c-Met断片はc-Metの少なくとも1つのエピトープを含む。他の態様では、c-Met抗原は、表面にc-Metもしくはこの免疫原性断片を発現するか、または過剰に発現する細胞である。いくつかの態様では、c-Met抗原はc-Met融合タンパク質である。いくつかの態様において、c-Metは合成ペプチド免疫原である。

動物の免疫化は、当技術分野で周知の任意の方法に実施することができる。これについては例えばHarlowおよびLane、「Antibodies：A Laboratory Manual」、New York：Cold Spring Harbor Press、1990を参照されたい。マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマなどの非ヒト動物を免疫化する方法は当技術分野で周知である。これについては例えばHarlowおよびLane、前掲、ならびに米国特許第5,994,619号を参照されたい。好ましい態様では、本発明のc-Met抗原を、免疫応答を高めるためにアジュバントとともに投与する。例示的なアジュバントには、完全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジュバント、RIBI(ムラミルジペプチド)、またはISCOM(免疫刺激複合体)などがある。このようなアジュバントは、ポリペプチドを局所的な沈着部位に隔離することによって、ポリペプチドの迅速な分散を防ぐことができるほか、宿主を刺激して、マクロファージに化学走性をもたらす諸因子、および免疫系の他の成分を分泌させる物質を含む場合がある。好ましくは、ポリペプチドを投与する場合には、ポリペプチドの2回もしくは2回以上の投与を免疫化のスケジュールに含め、数週間をかけて拡散させる。実施例Iで、XenoMouse（商標）マウスにおける抗c-Metモノクローナル抗体の産生法について説明する。

抗体および抗体産生細胞株の作製
動物をc-Met抗原で免疫化した後に、抗体および/または抗体産生細胞を個体から回収することができる。いくつかの態様では、抗c-Met抗体を含む血清を、個体の血液を採取して入手するか、個体を殺すことで入手する。動物から得た血清をそのまま使用することができるほか、血清から免疫グロブリン画分を回収したり、抗c-Met抗体を血清から精製したりすることができる。

いくつかの態様では、抗体を産生する不死化細胞株を、免疫化した動物から単離された細胞から調製する。免疫化後に、個体を殺して、リンパ節および/または脾臓のB細胞を当技術分野で周知の任意の方法により不死化させる。細胞を不死化する方法は、細胞に癌遺伝子を導入する段階、細胞に発癌性ウイルスを感染させる段階、および不死化細胞が選択される条件で細胞を培養する段階、細胞に発癌性または変異原生をもつ化合物を添加する段階、ならびに細胞を不死化細胞(例えばミエローマ細胞)と融合させる段階、ならびに腫瘍抑制遺伝子を不活性化させる段階を含むがこれらに限定されない。これについては例えばHarlowおよびLane(前掲)を参照されたい。仮にミエローマ細胞との融合を行う場合、対象ミエローマ細胞は好ましくは、免疫グロブリンのポリペプチドを分泌しない(非分泌細胞株)。不死化細胞を、c-Met、この一部、またはc-Met発現細胞を用いてスクリーニングする。好ましい態様では初期スクリーニングを、酵素結合免疫アッセイ法(ELISA)、または放射免疫アッセイ法で行う。ELISAによるスクリーニングの例は、参照として本明細書に組み入れられるWO 00/37504に記載されている。

抗c-Met抗体産生細胞(例えばハイブリドーマ)を選択し、クローニングし、またさらに確実な成長、高抗体産生、および所望の抗体特性を含む所望の特徴に関して、後述する手順でスクリーニングを行う。ハイブリドーマは、インビボの場合は同系動物で、免疫系を欠く動物(例えばヌードマウス)で、またはインビトロの場合は培養細胞で増殖させることができる。ハイブリドーマを選択し、クローニングし、および増殖させる方法は当技術分野で周知である。

好ましい態様では、免疫化された動物は、ヒトの免疫グロブリン遺伝子を発現する非ヒト動物であり、脾臓のB細胞を、非ヒト動物と同じ種に由来するミエローマ細胞株と融合させる。より好ましい態様では、免疫化動物はXENOMOUSE(商標)マウスあり、またミエローマ細胞株は非分泌型マウスミエローマである。さらにより好ましい態様では、ミエローマ細胞株はP3-X63-Ag8.653（アメリカン・タイプカルチャー・コレクション）である(例えば実施例I参照)。

したがって1つの態様では、本発明は、以下の段階を含む、c-Metに対するヒトモノクローナル抗体またはこの断片を産生する細胞系列を作製する方法を提供する：（a）本明細書に記載された非ヒトトランスジェニック動物を、c-Met、c-Metの一部、またはc-Metを発現する細胞もしくは組織で免疫化する段階；（b）トランスジェニック動物がc-Metに対する免疫応答を惹起可能とする段階；（c）トランスジェニック動物から抗体産生細胞を単離する段階；（d）抗体産生細胞を不死化する段階；（e）不死化された抗体産生細胞の個々のモノクローナル集団 を作製する段階；ならびに（f）不死化された抗体産生細胞をスクリーニングしてc-Metに対する抗体を同定する段階。

別の局面では、本発明は、ヒト抗c-Met抗体を産生するハイブリドーマを提供する。好ましい態様では、ハイブリドーマは、上述したマウスのハイブリドーマである。他の態様では、ハイブリドーマは、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、またはウマなどの非ヒト・非マウスの種で作られる。別の態様では、ハイブリドーマはヒトのハイブリドーマである。

本発明の1つの態様では、抗体産生細胞を単離して、宿主細胞（例えば骨髄腫細胞）内で発現させる。別の好ましい態様では、トランスジェニック動物をc-Metで免疫化し、一次細胞（例えば脾臓細胞または末梢血細胞）を、免疫化されたトランスジェニック動物から単離し、所望の抗原に特異的な抗体を産生する個々の細胞を同定する。個々の細胞から、ポリアデニル化されたmRNAを単離し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を、可変部ドメイン配列にアニーリングするセンスプライマー（例えば、ヒト重鎖および軽鎖の可変部ドメインの遺伝子のFR1領域の大半または全体を認識する縮重プライマー）、および定常部ドメインまたは結合領域配列にアニーリングするアンチセンスプライマーを用いて行う。次に、重鎖および軽鎖の可変部ドメインのcDNAをクローニングし、任意の適切な宿主細胞で（例えば骨髄腫細胞で）、重鎖およびκ定常部ドメインまたはλ定常部ドメインなどの、個々の免疫グロブリンの定常部ドメインを有するキメラ抗体として発現させる。これについては、参照により本明細書に組み入れられる、Babcook, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7843-48, 1996を参照されたい。次に抗c-Met抗体を、本明細書に記載された手順で同定して単離することができる。

別の態様では、ファージディスプレイ法によって、c-Metに対して、多様な親和性を有する抗体のレパートリーを含むライブラリーを提供することができる。このようなレパートリーの作製に関しては、免疫化された動物に由来するB細胞を不死化する必要はない。むしろ、一次B細胞をDNA源として直接使用することができる。例えば脾臓に由来するB細胞から得られたcDNAの混合物を用いて、発現ライブラリー（例えば、大腸菌へトランスフェクトするためのファージディスプレイライブラリー）を作製する。結果として得られる細胞において、c-Metに対する免疫応答性の検討を行う。このようなライブラリーから高親和性のヒト抗体を同定するための手法は、参照により本明細書に組み入れられる、Griffiths et al., EMBO J., 13: 3245-3260 (1994)；Nissim et al., ibid, pp.692-698、およびGriffiths et al., ibid, 12: 725-734に記載されている。最終的に、抗原に対して所望の規模の結合親和性を示すクローンがライブラリーから同定され、また、このような結合に関与する産物をコードするDNAが回収されて、標準的な組換えによる発現を目的として操作される。ファージディスプレイライブラリーは、以前操作されたヌクレオチド配列を用いて構築し、類似の様式でスクリーニングすることもできる。一般に、重鎖および軽鎖をコードするcDNAは独立に提供されるか、または連結されてファージライブラリーでの作製ためのFv類似体が形成される。

次にファージライブラリーのスクリーニングを、c-Metに対して最大の親和性を有する抗体、および適切なクローンから回収された遺伝材料に対して行う。さらなるラウンドのスクリーニングを行うことで、単離された当初の抗体の親和性を高めることができる。

核酸、ベクター、宿主細胞、および抗体の組換えによる作製法
核酸
本発明は、抗c-Met抗体をコードする核酸分子も含む。いくつかの態様では、さまざまな核酸分子が、抗c-Met免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする。他の態様では、同じ核酸分子が、抗c-Met免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする。1つの態様において、核酸は本発明のc-Met抗体をコードする。

いくつかの態様では、軽鎖（V_L）の可変部ドメインをコードする核酸分子は、ヒトのL5V_κ1またはA27V_κ3遺伝子、およびJ_κ1、J_κ2、J_κ3、もしくはJ_κ4の遺伝子を含む。

いくつかの態様では、軽鎖をコードする核酸分子は、（1つまたは複数の）生殖系列のアミノ酸配列に由来する1か所、2か所、3か所、4か所、5か所、6か所、7か所、8か所、9か所、または10か所の置換を含むアミノ酸配列をコードする。いくつかの態様では、核酸分子は、生殖系列のV_L配列およびJ_K配列と比較して1か所、2か所、3か所、4か所、5か所、6か所、7か所、8か所、9か所、または10か所の保存的アミノ酸置換、および/または1か所、2か所、または3か所の非保存的置換を含むV_Lのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。置換は、CDR領域内、フレームワーク領域内、または定常部ドメイン内に存在する場合がある。

いくつかの態様では、核酸分子は、抗体13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3、または13.3.2L-A91Tの1つの抗体のV_L中に見られる差違と同一である、生殖系列の配列と比較して1つもしくは複数のバリアントを含むV_Lのアミノ酸配列をコードする。

いくつかの態様では、核酸分子は、抗体13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3、または13.3.2L-A91Tの1つのV_L中に見られる、生殖系列の配列と比較して少なくとも3か所のアミノ酸置換をコードする。

いくつかの態様では、核酸分子は、モノクローナル抗体13.3.2（X₈がアラニンであるSEQ ID NO：4）；13.3.2L-A91T（X₈がスレオニンであるSEQ ID NO：4）；9.1.2（SEQ ID NO：8）；8.70.2（SEQ ID NO：12）；もしくは8.90.3（SEQ ID NO：16）、またはこれらのバリアントもしくは部分のV_Lのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、核酸は、上述の抗体の1つの軽鎖のCDRを含むアミノ酸配列をコードする。いくつかの態様では、上記の「部分」は、CDR1〜CDR3を含む近接部分である。

いくつかの態様では、核酸分子は、SEQ ID NO：4［13.3.2（X₈がアラニンであるSEQ ID NO：4）；13.3.2L-A91T（X₈がスレオニンであるSEQ ID NO：4）］、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：12、もしくはSEQ ID NO：16、またはシグナル配列を欠く同配列の1つのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの好ましい態様では、核酸分子は、SEQ ID NO：3［13.3.2（X₇がグアノシンであるSEQ ID NO：3）；13.3.2L-A91T（X₇がアデノシンであるSEQ ID NO：3）］、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：11、もしくはSEQ ID NO：15、またはこれらの一部のヌクレオチド配列を含む（これらの配列は任意でシグナル配列を欠く）。

いくつかの態様では、核酸は、上記抗体の軽鎖のCDRのアミノ酸配列をコードする。いくつかの態様では、上記の「部分」は、抗c-Met抗体の軽鎖のCDR1〜CDR3に由来する近接領域をコードする。

いくつかの態様では、核酸分子は、図3A〜3Dに記載されたV_Lのアミノ酸配列と、または抗体13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3、もしくは13.3.2L-A91TのV_L領域の任意の1つのV_Lのアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：4［13.3.2（X₈がアラニンであるSEQ ID NO：4）；13.3.2L-A91T（X₈がスレオニンであるSEQ ID NO：4）］、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：12、もしくはSEQ ID NO：16の任意の1つのV_L領域のアミノ酸配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、または99%が同一であるV_Lのアミノ酸配列をコードする。本発明の核酸分子は、上述したような高度にストリンジェントな条件で、SEQ ID NO：4［13.3.2（X₈がアラニンであるSEQ ID NO：4）；13.3.2L-A91T（X₈がスレオニンであるSEQ ID NO：4）］、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：12、もしくはSEQ ID NO：16のV_L領域をコードする核酸分子のアミノ酸配列をコードする核酸配列とハイブリダイズする核酸、またはSEQ ID NO：3［13.3.2（X₇がグアノシンであるSEQ ID NO：3）；13.3.2L-A91T（X₇がアデノシンであるSEQ ID NO：3）］、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：11、もしくはSEQ ID NO：15のV_L領域をコードする核酸分子の核酸配列を有する核酸とハイブリダイズする核酸を含む。

別の態様では、核酸は、13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3、もしくは13.3.2L-A91Tからなる群より選択される抗体の完全長の軽鎖、またはSEQ ID NO：4［13.3.2（X₈がアラニンであるSEQ ID NO：4）；13.3.2L-A91T（X₈がスレオニンであるSEQ ID NO：4）］、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：12、もしくはSEQ ID NO：16のアミノ酸配列を含む軽鎖、または本明細書に記載されたような変異を含む軽鎖をコードする。さらに、このような核酸は、SEQ ID NO：3［13.3.2（X₇がグアノシンであるSEQ ID NO：3）；13.3.2L-A91T（X₇がアデノシンであるSEQ ID NO：3）］、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：11、もしくはSEQ ID NO：15のヌクレオチド配列、または本明細書に開示されたような変異を含む軽鎖をコードする核酸分子を含む場合がある。

別の好ましい態様では、核酸分子は、ヒト1-18、4-31、4-39、または3-48のV_Hの遺伝子配列、またはこれらに由来する配列を含む重鎖（V_H）の可変部ドメインをコードする。さまざまな態様では、核酸分子は、ヒトの1-18 V_Hの遺伝子、D2-15の遺伝子、およびヒトのJ_H4bの遺伝子；ヒトの4-31 V_Hの遺伝子、ヒトのD2-2およびD7-27の遺伝子およびJ_H6bの遺伝子；ヒトの4-31 V_Hの遺伝子、ヒトのD2-2の遺伝子およびヒトのJ_H6bの遺伝子；ヒトの4-31 V_Hの遺伝子、ヒトのD7-27の遺伝子およびヒトのJ_H6bの遺伝子；ヒトの4-39 V_Hの遺伝子、ヒトのD2-2の遺伝子およびヒトのJ_H4bの遺伝子；ヒトの3-48 V_Hの遺伝子、ヒトのD4-17の遺伝子、およびヒトのJ_H4bの遺伝子、またはヒトの遺伝子に由来する配列を含む。

いくつかの態様では、核酸分子は、ヒトのV遺伝子、D遺伝子、またはJ遺伝子の生殖系列のアミノ酸配列と比較して1か所、2か所、3か所、4か所、5か所、6か所、7か所、8か所、9か所、10か所、11か所、12か所、13か所、14か所、15か所、16か所、17か所、または18か所の変異を含むアミノ酸配列をコードする。いくつかの態様では、変異はV_H領域中に存在する。いくつかの態様では、変異はCDR領域中に存在する。

いくつかの態様では、核酸分子は、生殖系列の配列と比較して、モノクローナル抗体13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3；13.3.2H-A14P；13.3.2H-E42K；13.3.2H-S97T；13.3.2H-A14P, E42K；13.3.2H-E42K, S97T、または13.3.2H-A14P, E42K, S97TのV_H中に存在するアミノ酸変異と同一である、1つもしくは複数のアミノ酸変異をコードする。いくつかの態様では、核酸は、生殖系列の配列と比較して、上述のモノクローナル抗体の1つに存在する少なくとも3か所のアミノ酸変異と同一である、少なくとも3か所のアミノ酸変異をコードする。

いくつかの態様では、核酸分子は、13.3.2（X₂がグルタミン酸であり、かつX₄がセリンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-E42K（X₂がリシンであり、かつX₄がセリンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-E42K, S97T（X₂がリシンであり、かつX₄がスレオニンであるSEQ ID NO：2）；9.1.2（SEQ ID NO：6）；8.70.2（SEQ ID NO：10）；または8.90.3（SEQ ID NO：14）からなる群より選択されるモノクローナル抗体のV_Hのアミノ酸配列の少なくとも一部、これらのバリアント、または保存的なアミノ酸変異、および/または全部で3か所もしくはそれ以下の非保存的アミノ酸置換を有する配列をコードするヌクレオチド配列を含む。さまざまな態様では、配列は、1つもしくは複数のCDR領域、好ましくはCDR3領域、3つ全てのCDR領域、CDR1〜CDR3を含む近接部分、またはV_H領域全体をコードする（シグナル配列は含む場合も含まない場合もある）。

いくつかの態様では、核酸分子は、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、もしくはSEQ ID NO：14のうちの1つのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、またはシグナル配列を欠く同配列を含む。いくつかの好ましい態様では、核酸分子は、SEQ ID NO：1［13.3.2（X₁がグアノシンであり、X₃がスレオニンであり、かつX₅がグアノシンであるSEQ ID NO：1）；13.3.2H-E42K（X₁がアデノシンであり、X₃がスレオニンであり、かつX₅がグアノシンであるSEQ ID NO：1）；13.3.2H-E42K, S97T（X₁がアデノシンであり、X₃がアデノシンであり、かつX₅がグアノシンであるSEQ ID NO：1）；13.3.2H-A14P（X₁がグアノシンであり、X₃がスレオニンであり、かつX₅がシトシンであるSEQ ID NO：1）；13.3.2H-A14P, E42K（X₁がアデノシンであり、X₃がスレオニンであり、かつX₅がシトシンであるSEQ ID NO：1）；13.3.2H-A14P, E42K, S97T（X₁がアデノシンであり、X₃がアデノシンであり、かつX₅がシトシンであるSEQ ID NO：1）］、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9、もしくはSEQ ID NO：13のヌクレオチド配列の少なくとも一部、またはシグナル配列を欠く同配列を含む。いくつかの態様では、上記の「部分」は、V_H領域（シグナル配列は含む場合もあれば含まない場合もある）、CDR3領域、3つの全てのCDR領域、またはCDR1〜CDR3を含む近接領域をコードする。

いくつかの態様では、核酸分子は、図3E〜3HのV_Hのアミノ酸配列と、またはSEQ ID NO：2［13.3.2（X₂がグルタミン酸であり、X₄がセリンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-E42K（X₂がリシンであり、かつX₄がセリンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-E42K, S97T（X₂がリシンであり、かつX₄がスレオニンであるSEQ ID NO：2）］、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、もしくはSEQ ID NO：14の任意の1つのV_Hのアミノ酸配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、または99%が同一であるV_Hのアミノ酸配列をコードする。本発明の核酸分子は、SEQ ID NO：2［13.3.2（X₂がグルタミン酸であり、X₄がセリンであり、かつX₆がアラニンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-E42K（X₂がリシンであり、X₄がセリンであり、かつX₆がアラニンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-E42K, S97T（X₂がリシンであり、X₄がスレオニンであり、かつX₆がアラニンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-A14P（X₂がグルタミン酸であり、X₄がセリンであり、かつX₆がプロリンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-A14P, E42K（X₂がリシンであり、X₄がセリンであり、かつX₆がプロリンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-A14P, E42K, S97T（X₂がリシンであり、X₄がスレオニンであり、かつX₆がプロリンであるSEQ ID NO：2）］、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、もしくはSEQ ID NO：14のアミノ酸配列、またはこれらのV_H領域のアミノ酸配列をコードする核酸配列と、上述したような高度にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸、または、SEQ ID NO：1［13.3.2（X₁がグアノシンであり、X₃がスレオニンであり、かつX₅がグアノシンであるSEQ ID NO：1）；13.3.2H-E42K（X₁がアデノシンであり、X₃がスレオニンであり、かつX₅がグアノシンであるSEQ ID NO：1）；13.3.2H-E42K, S97T（X₁がアデノシンであり、X₃がアデノシンであり、かつX₅がグアノシンであるSEQ ID NO：1）；13.3.2H-A14P（X₁がグアノシンであり、X₃がスレオニンであり、かつX₅がシトシンであるSEQ ID NO：1）；13.3.2H-A14P, E42K（X₁がアデノシンであり、X₃がスレオニンであり、かつX₅がシトシンであるSEQ ID NO：1）；13.3.2H-A14P, E42K, S97T（X₁がアデノシンであり、X₃がアデノシンであり、かつX₅がシトシンであるSEQ ID NO：1）］、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9、もしくはSEQ ID NO：13のアミノ酸配列、またはこれらのV_H領域をコードする核酸配列を含む。

別の態様では、核酸は、13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3；13.3.2H-A14P；13.3.2H-E42K；13.3.2H-S97T；13.3.2H-A14P, E42K；13.3.2H-E42K, S97T、もしくは13.3.2H-A14P, E42K, S97Tからなる群より選択される抗体の完全長の重鎖をコードするか、またはSEQ ID NO：2［13.3.2（X₂がグルタミン酸であり、X₄がセリンであり、かつX₆がアラニンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-E42K（X₂がリシンであり、X₄がセリンであり、かつX₆がアラニンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-E42K, S97T（X₂がリシンであり、X₄がスレオニンであり、かつX₆がアラニンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-A14P（X₂がグルタミン酸であり、X₄がセリンであり、かつX₆がプロリンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-A14P, E42K（X₂がリシンであり、X₄がセリンであり、かつX₆がプロリンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-A14P, E42K, S97T（X₂がリシンであり、X₄がスレオニンであり、かつX₆がプロリンであるSEQ ID NO：2）］、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、もしくはSEQ ID NO：14のアミノ酸配列（シグナル配列は含む場合もあれば含まない場合もある）を有する重鎖をコードするか、または、本明細書に記載されたバリアントの1つのような変異を含む重鎖をコードする。さらに核酸は、SEQ ID NO：1［13.3.2（X₁がグアノシンであり、X₃がスレオニンであり、かつX₅がグアノシンであるSEQ ID NO：1）；13.3.2H-E42K（X₁がアデノシンであり、X₃がスレオニンであり、かつX₅がグアノシンであるSEQ ID NO：1）；13.3.2H-E42K, S97T（X₁がアデノシンであり、X₃がアデノシンであり、かつX₅がグアノシンであるSEQ ID NO：1）；13.3.2H-A14P（X₁がグアノシンであり、X₃がスレオニンであり、かつX₅がシトシンであるSEQ ID NO：1）；13.3.2H-A14P, E42K（X₁がアデノシンであり、X₃がスレオニンであり、かつX₅がシトシンであるSEQ ID NO：1）；13.3.2H-A14P, E42K, S97T（X₁がアデノシンであり、X₃がアデノシンであり、かつX₅がシトシンであるSEQ ID NO：1）］、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9、もしくはSEQ ID NO：13のヌクレオチド配列（シグナル配列は含む場合もあれば含まない場合もある）を含むか、または本明細書に記載されたバリアントの1つなどの変異を含む重鎖をコードする核酸分子を含む場合がある。

抗c-Met抗体の重鎖、または軽鎖の全体、もしくはこの一部をコードする核酸分子を、このような抗体を産生する任意の供給源から単離することができる。さまざまな態様では、核酸分子を、c-Metで免疫化した動物から、または抗c-Met抗体を発現する、このようなB細胞に由来する不死化細胞から単離したB細胞から単離する。抗体をコードするmRNAを単離する方法は当技術分野で周知である(例えばSambrookらの文献を参照)。このようなmRNAを用いて、抗体遺伝子を対象としたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、またはcDNAクローニングに使用するためのcDNAを作ることができる。好ましい態様では、核酸分子を、その融合パートナーの1つとして、非ヒトトランスジェニック動物に由来するヒト免疫グロブリン産生細胞を有するハイブリドーマから単離する。さらにより好ましい態様では、ヒト免疫グロブリン産生細胞をXENOMOUSE(商標)動物から単離する。別の態様では、ヒト免疫グロブリン産生細胞は、上述のように、非ヒト、非マウスのトランスジェニック動物に由来する。別の態様では、核酸を、非ヒトの非トランスジェニック動物から単離する。非ヒトの非トランスジェニック動物から単離した核酸分子は、例えばヒト化抗体に使用することができる。

いくつかの態様では、本発明の抗c-Met抗体の重鎖をコードする核酸は、任意の供給源に由来する重鎖の定常ドメインをコードするヌクレオチド配列にインフレームで連結された、本発明のV_Hドメインをコードするヌクレオチド配列を含む場合がある。同様に、本発明の抗c-Met抗体の軽鎖をコードする核酸分子は、任意の供給源に由来する軽鎖の定常ドメインをコードするヌクレオチド配列にインフレームで連結された、本発明のV_Lドメインをコードするヌクレオチド配列を含む場合がある。

本発明の他の局面では、重鎖の可変ドメイン(V_H)および/または軽鎖の可変ドメイン(V_L)をコードする核酸分子を、完全長の抗体遺伝子に変換する。1つの態様では、V_HドメインもしくはV_Lドメインをコードする核酸分子を、V_Hセグメントがベクター内のC_Hセグメントに機能的に連結され、および/またはV_Lセグメントがベクター内のC_Lセグメントに機能的に連結されるように、重鎖の定常ドメイン（C_H）もしくは軽鎖の定常ドメイン（C_L）をそれぞれ既にコードする発現ベクターに挿入することによって、完全長の抗体遺伝子に変換する。別の態様では、V_Hドメインおよび/またはV_Lドメインをコードする核酸分子を、V_Hドメインおよび/またはV_Lドメインをコードする核酸分子をC_Hドメインおよび/またはC_Lドメインをコードする核酸分子に、標準的な分子生物学的手法で連結する(例えばリガーゼで結合する)ことで、完全長の抗体遺伝子に変換する。ヒトの重鎖および軽鎖の免疫グロブリンの定常ドメインの遺伝子の核酸配列は、当技術分野で周知である。これについては例えばKabatら、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、第5版、NIH Publ. No. 91-3242、1991を参照されたい。完全長の重鎖および/または軽鎖をコードする核酸分子を次に、核酸分子を導入した細胞で発現させて、抗c-Met抗体を単離することができる。

このような核酸分子を用いて、大量の抗c-Met抗体を組換えによって発現させることができる。また同核酸分子を用いて、詳しく後述するように、キメラ抗体、二重特異性抗体、単鎖抗体、免疫接着分子(immunoadhesin)、ダイアボディ、変異型抗体、および抗体誘導体を産生させることもできる。仮に同核酸分子が、非ヒトの非トランスジェニック動物に由来する場合、同核酸分子を、後述する抗体のヒト化に用いることができる。

別の態様では、本発明の核酸分子を、特定の抗体配列に対するプローブまたはPCR用プライマーとして使用する。例えば、同核酸を診断法におけるプローブとして、またはDNAの領域を増幅させて、特に、抗c-Met抗体の可変ドメインをコードする、追加した核酸分子を単離するPCR用プライマーとして使用することができる。いくつかの態様では、同核酸分子はオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様では、同オリゴヌクレオチドは、対象抗体の重鎖および軽鎖の高度の可変性を示す領域に由来する。いくつかの態様では、同オリゴヌクレオチドは、本明細書記載の抗体13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3またはそのバリアントのCDRの1つまたは複数の全体または一部をコードする。

ベクター
本発明は、本発明の抗c-Met抗体またはその抗原結合部分の重鎖をコードする核酸分子を含むベクターを提供する。本発明はまた、このような抗体の軽鎖、またはこの抗原結合部分をコードする核酸分子を含むベクターも提供する。本発明はさらに、融合タンパク質、修飾型抗体、抗体断片、およびこのプローブをコードする核酸分子を含むベクターを提供する。

いくつかの態様では、本発明の抗c-Met抗体、または抗原結合部分を、上述の手順で得られた一部または完全長の軽鎖および重鎖をコードするDNAを、対象遺伝子が転写および翻訳の制御配列などの必要な発現制御配列に機能的に連結されるように、発現ベクターに挿入することで発現させる。発現ベクターは、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス(AAV)、植物ウイルス(カリフラワーモザイクウイルスやタバコモザイクウイルスなど)、コスミド、YAC、EBVに由来するエピソームなどを含む。抗体遺伝子を、ベクター内の転写および翻訳の制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を調節する意図した機能を発揮するようにベクターに連結する。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用する発現宿主細胞に適合するように選択する。抗体の軽鎖遺伝子、および抗体の重鎖遺伝子は、別個のベクターに挿入することができる。好ましい態様では、両遺伝子を同じ発現ベクター挿入する。抗体遺伝子を、標準的な方法(例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上における相補的な制限酵素切断部位の連結、または制限酵素切断部位が存在しない場合は平滑末端の連結)で発現ベクターに挿入する。

好都合のベクターとは、上述のように、任意のV_H配列またはV_L配列の挿入および発現が容易なように作り込まれた適切な制限酵素切断部位を有する、機能性の完全な、ヒトのC_HまたはC_Lの免疫グロブリン配列をコードするベクターである。このようなベクターにおけるスプライシングは通常、挿入されたJ領域のスプライスドナー部位と、ヒトのCドメインに先行するスプライスアクセプター部位との間で、またヒトC_Hのエキソン内に存在するスプライス領域でも起きる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流の、天然の染色体部位で起きる。組換え発現ベクターは、宿主細胞からの、抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードする場合もある。抗体鎖の遺伝子は、シグナルペプチドが免疫グロブリン鎖のアミノ末端にインフレームで連結されるようにベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンのシグナルペプチド、または異種シグナルペプチド(非免疫グロブリンタンパク質に由来するシグナルペプチド)の場合がある。

抗体鎖の遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有する。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計が、形質転換対象の宿主細胞の選択や、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に影響されうることは当業者には明らかであると思われる。哺乳類の宿主細胞における発現に好ましい調節配列は、レトロウイルスのLTRに由来するプロモーターおよび/またはエンハンサー、サイトメガロウイルス(CMV)(CMVのプロモーター/エンハンサーなど)、シミアンウイルス40(SV40)(SV40プロモーター/エンハンサーなど)、アデノウイルス(例えばアデノウイルス主要後期プロモーター(AdMLP))、ポリオーマおよび強力な哺乳類のプロモーター(天然の免疫グロブリンおよびアクチンのプロモーターなど)などの、哺乳類細胞における高レベルのタンパク質の発現を誘導するウイルスエレメントを含む。ウイルスの調節エレメント、およびこの配列の詳細については、例えば米国特許第5,168,062号、米国特許第4,510,245号、および米国特許第4,968,615号を参照されたい。プロモーターおよびベクターに関する記述を含む、植物で抗体を発現させる方法、ならびに植物の形質転換法は当技術分野で周知である。これについては例えば、参照として本明細書に組み入れられる米国特許第6,517,529号を参照されたい。細菌細胞または真菌細胞(例えば酵母細胞)でポリペプチドを発現させる方法は当技術分野で周知である。

抗体鎖の遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列(例えば複製起点)、および選択マーカー遺伝子などの、追加の配列を含む場合がある。選択マーカー遺伝子があることで、ベクターを導入した宿主細胞の選択が容易になる(例えば本明細書に参照として組み入れられる米国特許第4,399,216号、第4,634,665号、および第5,179,017号を参照)。例えば典型的には、選択マーカー遺伝子は、G418、ハイグロマイシン、またはメトトレキセートなどの薬剤に対する耐性を、ベクターを導入した宿主細胞にもたらす。好ましい選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)遺伝子(dfhr-宿主細胞を用いたメトトレキセートによる選択/増幅用に使用)、neo遺伝子(G418による選択用)、およびグルタミン酸合成酵素の遺伝子などがある。

非ハイブリドーマ宿主細胞、およびタンパク質を組換えによって産生させる方法
抗c-Met抗体をコードする核酸分子、およびこのような核酸分子を含むベクターを、適切な哺乳類、植物、細菌または酵母の宿主細胞のトランスフェクションに用いることができる。形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する任意の既知の方法とすることができる。異種ポリヌクレオチドを哺乳類細胞に導入する方法は当技術分野で周知であり、デキストランを用いるトランスフェクション、カルシウムリン酸沈殿、ポリブレンを用いるトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチドの封入、およびDNAの核への直接マイクロインジェクションを含む。また核酸分子は、ウイルスベクターを用いて哺乳類細胞に導入することができる。細胞を形質転換する方法は当技術分野で周知である。これについては例えば参照として本明細書に組み入れられる米国特許第4,399,216号、第4,912,040号、第4,740,461号、および第4,959,455号を参照されたい。例えばアグロバクテリウムを用いる形質転換、微粒子銃による形質転換、直接注入、エレクトロポレーション、およびウイルスによる形質転換を含む、植物細胞を形質転換する方法は当技術分野で周知である。細菌および酵母細胞を形質転換する方法も当技術分野で周知である。

発現用の宿主として利用可能な哺乳類細胞株は当技術分野で周知であり、またAmerican Type Culture Collection(ATCC)から入手可能な多くの不死化細胞株を含む。このような細胞には特に、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、NSO、SP2細胞、HEK-293T細胞、NIH-3T3細胞、HeLa細胞、幼若ハムスター腎臓(BHK)細胞、アフリカミドリザル腎細胞(COS)、ヒト肝細胞癌細胞(例えばHep G2)、A549細胞、およびいくつかの他の細胞株などがある。特定の選択性を有する細胞株は、どの細胞株が高発現レベルを有するかを決定することで選択される。使用可能な他の細胞株は、Sf9細胞またはSf21細胞などの昆虫細胞株である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳類の宿主細胞に導入する場合は、宿主細胞内における抗体の発現、またはより好ましくは、宿主細胞を成長させた培地中への抗体の放出を可能とする十分な期間、宿主細胞を培養することで抗体を産生させる。抗体は、標準的なタンパク質精製法で培地から回収できる。植物の宿主細胞は、例えばタバコ(Nicotiana)、シロイヌナズナ、ウキクサ、トウモロコシ、コムギ、イモなど含む。細菌の宿主細胞は大腸菌およびストレプトマイセス種を含む。酵母の宿主細胞は、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、およびピキア・パストリス(Pichia pastoris)を含む。

また、産生細胞株による、本発明の抗体の発現を、いくつかの既知の手法で高めることができる。例えば、グルタミン合成酵素遺伝子の発現系(GS系)は、特定の条件で発現を高める一般的な方法である。GS系については、欧州特許第0 216 846号、第0 256 055号、第0 323 997号、および第0 338 841号の全体または一部で説明されている。

さまざまな細胞株、またはトランスジェニック動物で発現される抗体が、さまざまな糖修飾を相互に受けている可能性は高い。しかし、本明細書に記載された核酸分子にコードされた全ての抗体、または本明細書に記載されたアミノ酸配列を含む抗体は、抗体の糖修飾の有無にかかわらず本発明の一部である。

トランスジェニック動物およびトランスジェニック植物
本発明の抗c-Met抗体は、対象となる免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の配列に関してトランスジェニックである哺乳類または植物を作製し、抗体の産生を回収可能な状態で行う、トランスジェニック技術で作製することもできる。哺乳類におけるトランスジェニック技術による産生に関連して、抗c-Met抗体を産生させて、ヤギ、ウシ、または他の哺乳類の乳から回収することができる。これについては例えば参照として本明細書に組み入れられる米国特許第5,827,690号、第5,756,687号、第5,750,172号、および第5,741,957号を参照されたい。いくつかの態様では、上述したように、ヒト免疫グロブリン座位を含む非ヒトトランスジェニック動物を、上述したようにc-Met、またはこの免疫原性部分で免疫化する。植物で抗体を作製する方法は、例えば参照として本明細書に組み入れられる米国特許第6,046,037号および米国特許第5,959,177号に記載されている。

いくつかの態様では、ヒト以外のトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物を、本発明の抗c-Met抗体をコードする1つまたは複数の核酸分子を、標準的なトランスジェニック法で動物または植物に導入することで作製する。これについては上述のHoganの文献、および米国特許第6,417,429号を参照されたい。トランスジェニック動物を作製するために使用するトランスジェニック細胞は、胚性幹細胞または体細胞または受精卵の場合がある。トランスジェニックの非ヒト生物は、キメラ、非キメラのヘテロ接合体、および非キメラのホモ接合体の場合がある。これについては例えばすべてが参照として組み入れられるHoganら、「Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual」、第2版、Cold Spring Harbor Press(1999)；Jacksonら、「Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach」、Oxford University Press(2000)；およびPinkert、「Transgenic Animal Technology: A Laboratorv Handbook」、Academic Press(1999)を参照されたい。いくつかの態様では、トランスジェニックの非ヒト動物は、対象となる重鎖および/または軽鎖をコードする構築物を標的とすることにより、標的破壊および標的置換を有する。好ましい態様では、このようなトランスジェニック動物は、c-Met、好ましくはヒトc-Metに特異的に結合する重鎖および軽鎖をコードする核酸分子を含み、発現する。いくつかの態様では、トランスジェニック動物は、単鎖抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体などの修飾型抗体をコードする核酸分子を含む。本発明の抗c-Met抗体は、任意のトランスジェニック動物で作製することができる。好ましい態様では、非ヒト動物はマウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、またはウマである。非ヒトトランスジェニック動物は、コードされたポリペプチドを、血液、乳、尿、唾液、涙液、粘液、および他の体液中に発現する。

ファージディスプレイライブラリー
本発明は、ファージ上にヒト抗体のライブラリーを合成する段階、c-Metまたはこの一部でライブラリーをスクリーニングする段階、c-Metに結合するファージを単離する段階、およびファージから抗体を回収する段階を含む、抗c-Met抗体またはその抗原結合部分を作製する方法を提供する。例として、ファージディスプレイ手法に使用する抗体のライブラリーを調製する1つの方法は、ヒトの免疫グロブリン座位を含む非ヒト動物をc-Met、またはこの抗原性部分で免疫化して、免疫応答を誘導する段階、免疫化した動物から抗体産生細胞を抽出する段階、抽出後の細胞から本発明の抗体の重鎖および軽鎖をコードするRNAを単離する段階、RNAを逆転写してcDNAを作製する段階、cDNAをプライマーで増幅する段階、ならびに抗体がファージ上で発現されるようにcDNAをファージディスプレイベクターに挿入する段階を含む。本発明の組換え抗c-Met抗体は、このようにして得ることができる。

本発明の組換え抗c-Metヒト抗体は、組換え型コンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングすることによって単離できる。好ましくは同ライブラリーは、B細胞から単離されたmRNAから調製されたヒトのV_LおよびV_HのcDNAを用いて作製されるscFvファージディスプレイライブラリーである。このようなライブラリーの調製法およびスクリーニング法は当技術分野で周知である。ファージディスプレイライブラリーを作製するキットは市販されている(例えばPharmacia Recombinant Phage Antibody System、カタログ番号27-9400-01；およびStratagene SurfZAP(商標)ファージディスプレイキット、カタログ番号240612)。抗体ディスプレイライブラリーの作製およびスクリーニングに使用可能な他の方法および試薬もある(例えば、すべてが参照として本明細書に組み入れられる

を参照されたい)。

1つの態様では、所望の特徴をもつヒト抗c-Met抗体を単離するために、本明細書に記載されたヒト抗c-Met抗体を最初に用いて、c-Metに対する類似の結合活性を有する、ヒトの重鎖および軽鎖の配列を、参照として本明細書に組み入れられるWO 93/06213に記載されたエピトープインプリンティング(epitope imprinting)法で選択する。この方法で使用される抗体ライブラリーは好ましくは、参照として本明細書に組み入れられるWO 92/01047、McCaffertyら、Nature 348：552-554(1990)；およびGriffithsら、EMBO J. 12：725-734(1993)に記載された手順で調製されてスクリーニングされたscFvライブラリーである。scFv抗体ライブラリーは好ましくは、ヒトc-Metを抗原としてスクリーニングする。

最初のヒトのV_LドメインおよびV_Hドメインが選択されたら、最初に選択されたV_LおよびV_Hのセグメントの異なる対をc-Met結合に関してスクリーニングを行う「ミックス・アンド・マッチ(mix and match)」実験を行うことで、好ましいV_L/V_H対の組み合わせ選択する。また抗体の質をさらに改善するために、好ましいV_L/V_H対のV_LおよびV_Hのセグメントに、好ましくは、V_Hおよび/またはV_LのCDR3領域内にランダムな変異を、天然の免疫応答における抗体の親和性成熟に関与するインビボ体細胞変異過程に類似の過程で導入することができる。インビトロにおける親和性成熟は、V_HのCDR3またはV_LのCDR3にそれぞれ相補的なPCR用プライマーを用いて、V_HドメインおよびV_Lドメインを増幅することで達成できる(プライマーは、特定の位置における4種類のヌクレオチド塩基のランダム混合物で「スパイク」されたものを使用し、結果として得られるPCR産物が、V_Hおよび/またはV_LのCDR3領域にランダム変異が導入されたV_HおよびV_Lのセグメントをコードするようにする)。このような、ランダムに変異が導入されたV_HおよびV_Lのセグメントを対象に、c-Metへの結合に関するスクリーニングを行う場合がある。

組換え免疫グロブリンディスプレイライブラリーを対象に、本発明の抗c-Met抗体のスクリーニングおよび単離を行った後に、選択された抗体をコードする核酸を、ディスプレイパッケージ(例えばファージゲノム)から回収し、標準的な組換えDNA技術で他の発現ベクターにサブクローニングすることができる。望ましいならば、このような核酸をさらに操作して、後述するように、本発明の他の抗体型を作ることができる。コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによって単離された組換え型ヒト抗体を発現させるためには、上述のように、抗体をコードするDNAを組換え発現ベクターにクローニングして、哺乳類宿主細胞に導入する。

クラススイッチ
本発明の別の局面は、抗c-Met抗体のクラスまたはサブクラスを、別のクラスまたはサブクラスに変換する方法を提供する。いくつかの態様では、C_LまたはC_Hをコードする核酸配列を含まないV_LまたはV_Hをコードする核酸分子を、当技術分野で周知の方法で単離する。この核酸分子を次に、所望の免疫グロブリンのクラスまたはサブクラスに由来するC_LまたはC_Hをコードする核酸配列に機能的に連結する。これは、上述のようにC_L鎖またはC_H鎖を含むベクターまたは核酸分子で達成することができる。例えば、当初IgMであった抗c-Met抗体をIgGにクラスを変えることができる。また、このようなクラススイッチを行うことで、あるIgGサブクラスを別のサブクラスに(例えばIgG1からIgG2に)変換することができる。所望のアイソタイプを含む本発明の抗体を作製する別の方法は、抗c-Met抗体の重鎖をコードする核酸、および抗c-Met抗体の軽鎖をコードする核酸を単離する段階、V_H領域をコードする配列を単離する段階、V_H配列を所望のアイソタイプの重鎖定常ドメインをコードする配列に連結する段階、軽鎖遺伝子および重鎖の構築物を細胞内で発現させる段階、ならびに所望のアイソタイプを有する抗c-Met抗体を回収する段階を含む。

脱免疫化抗体
本発明の別の局面では、抗体を、例えば参照として本明細書に組み入れられるPCT WO 98/52976およびWO 00/34317に記載された手法で脱免疫化し、その免疫原性を低下させる。

変異導入抗体
別の態様では、変異導入抗c-Met抗体を作製するために、核酸分子、ベクター、および宿主細胞を使用することができる。このような抗体には、例えば抗体の結合特性を変化させるために、重鎖または軽鎖の可変部ドメインに変異を導入することができる。例えば、c-Metに対する抗体のK_Dを高めたり低めたりするために、k_offを高めたり低めたりするために、または抗体の結合特異性を変化させたりするために、1つもしくは複数のCDR領域中に変異を作製することができる。部位特異的変異導入の手法は、当技術分野で周知である。これについては例えば、Sambrook et al.およびAusubel et al.（上述）を参照されたい。別の態様では、1つもしくは複数の変異が、モノクローナル抗体13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3；13.3.2H-A14P；13.3.2H-E42K；13.3.2H-S97T；13.3.2H-A14P, E42K；13.3.2H-E42K, S97T；13.3.2H-A14P, E42K, S97T；13.3.2L-A91T；13.3.2L-A91T, H-A14P；13.3.2L-A91T, H-E42K；13.3.2L-A91T, H-A14P, E42K；13.3.2L-A91T, H-E42K, S97T、または13.3.2L-A91T, H-A14P, E42K, S97Tにおいて、生殖系列に比較して変化したことがわかっているアミノ酸残基に作られる。このような変異は、可変部ドメインのCDR領域またはフレームワーク領域中に、または定常部ドメイン中に作られる場合がある。好ましい態様では、変異は可変部ドメイン中に作られる。いくつかの態様では、1つもしくは複数の変異は、SEQ ID NO：2［13.3.2（X₂がグルタミン酸であり、X₄がセリンであり、かつX₆がアラニンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-E42K（X₂がリシンであり、X₄がセリンであり、かつX₆がアラニンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-E42K, S97T（X₂がリシンであり、X₄がスレオニンであり、かつX₆がアラニンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-A14P（X₂がグルタミン酸であり、X₄がセリンであり、かつX₆がプロリンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-A14P, E42K（X₂がリシンであり、X₄がセリンであり、かつX₆がプロリンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-A14P, E42K, S97T（X₂がリシンであり、X₄がスレオニンであり、かつX₆がプロリンであるSEQ ID NO：2）］、SEQ ID NO：4［13.3.2（X₈がアラニンであるSEQ ID NO：4）、および13.3.2L-A91T（X₈がスレオニンであるSEQ ID NO：4）］、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、もしくはSEQ ID NO：16からなる群より選択されるアミノ酸配列の可変部ドメインのCDR領域もしくはフレームワーク領域において、生殖系列と比較して変化することがわかっているアミノ酸残基において作られる（これらに対応する核酸配列は、SEQ ID NO：1［13.3.2（X₁がグアノシンであり、X₃がスレオニンであり、かつX₅がグアノシンであるSEQ ID NO：1）；13.3.2H-E42K（X₁がアデノシンであり、X₃がスレオニンであり、かつX₅がグアノシンであるSEQ ID NO：1）；13.3.2H-E42K, S97T（X₁がアデノシンであり、X₃がアデノシンであり、かつX₅がグアノシンであるSEQ ID NO：1）；13.3.2H-A14P（X₁がグアノシンであり、X₃がスレオニンであり、かつX₅がシトシンであるSEQ ID NO：1）；13.3.2H-A14P, E42K（X₁がアデノシンであり、X₃がスレオニンであり、かつX₅がシトシンであるSEQ ID NO：1）；13.3.2H-A14P, E42K, S97T（X₁がアデノシンであり、X₃がアデノシンであり、かつX₅がシトシンであるSEQ ID NO：1）］、SEQ ID NO：3［13.3.2（X₇がグアノシンであるSEQ ID NO：3）；13.3.2L-A91T（X₇がアデノシンであるSEQ ID NO：3）］、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、もしくはSEQ ID NO：15で表される）。

別の態様では、フレームワーク領域に、結果として得られるフレームワーク領域(群)が、対応する生殖系列遺伝子のアミノ酸配列を有するように変異を導入する。変異をフレームワーク領域または定常ドメインの内部に導入することで、抗c-Met抗体の半減期を長くすることができる。これについては例えば、参照として本明細書に組み入れられるPCT WO 00/09560を参照されたい。フレームワーク領域または定常ドメイン内に変異を導入することで、抗体の免疫原性を変えたり、別の分子に対する共有結合または非共有結合の結合部位を提供したり、または補体結合、FcR結合、および抗体依存性細胞障害（ADCC）のような特性を変えたりすることもできる。本発明では、1つの抗体が、任意の1つまたは複数の可変ドメインまたは定常ドメイン内のCDRまたはフレームワーク領域、定常ドメイン、および可変領域に変異をもつ場合がある。

いくつかの態様では、変異導入前の抗c-Met抗体と比較して、変異型の抗c-Met抗体のV_HドメインまたはV_Lドメインのいずれかにおけるアミノ酸変異の数は1〜8の間の任意の数である。上記のいずれかにおいて、変異は1つまたは複数のCDR領域内に存在する場合がある。また任意の変異が保存的アミノ酸置換である場合がある。いくつかの態様では、定常ドメインにおけるアミノ酸の変化は、わずか5、4、3、2、または1個である。

修飾型抗体
別の態様では、別のポリペプチドに連結させた本発明の抗c-Met抗体の全体または一部を含む融合抗体または免疫接着分子を作製することができる。好ましい態様では、抗c-Met抗体の可変ドメインのみをポリペプチドに連結させる。別の好ましい態様では、抗c-Met抗体のV_Hドメインを第1のポリペプチドに連結させ、一方で抗c-Met抗体のV_Lドメインを、V_HドメインおよびV_Lドメインが相互に作用して抗原結合部位を形成するように第1のポリペプチドと結合する第2のポリペプチドに連結させる。別の好ましい態様では、V_Hドメインは、リンカーによってV_HドメインとV_Lドメインが相互作用可能なようにV_Lドメインから隔てられている(後述する「単鎖抗体」を参照)。次にV_H-リンカー-V_L抗体を対象ポリペプチドに連結させる。この融合抗体は、c-Metを発現する細胞または組織にポリペプチドを導く際に有用である。このようなポリペプチドは、毒素などの治療薬、成長因子、または他の調節タンパク質となる可能性があるほか、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの、容易に可視化可能な酵素などの診断薬となる可能性がある。また融合抗体は、2本(またはこれ以上)の単鎖抗体を相互に連結するように作製することができる。これは、1本のポリペプチド鎖上に二価抗体または多価抗体を作製を試みる際に、または二重特異性抗体の作製を試みる際に有用である。

単鎖抗体(scFv)を作製するためには、V_HおよびV_LをコードするDNA断片を、柔軟なリンカーをコードする別の断片(例えばアミノ酸配列(Gly₄-Ser)₃をコードする断片)に機能的に連結させる。こうすることでV_HおよびV_Lの配列を、接触する単鎖タンパク質として、柔軟なリンカーで連結されたV_LドメインおよびV_Hドメインとともに発現させることができる。これについては例えばBirdら、Science 242：423-426(1988)；Hustonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：5879-5883(1988)；McCaffertyら、Nature 348：552-554(1990)を参照されたい。単鎖抗体は、1つのV_HおよびV_Lのみが用いられる場合には一価の場合があり、2つのV_HおよびV_Lが用いられる場合には二価の場合があり、または2つを越えるV_HおよびV_Lが用いられる場合には多価の場合がある。二重特異性抗体または多価抗体は、c-Metおよび別の分子に特異的に結合するように作製することができる。

他の態様では、他の修飾型抗体を、抗c-Met抗体をコードする核酸分子を用いて調製することができる。例えば「κ体」(Illら、Protein Eng. 10：949-57(1997))、「ミニボディ(Minibody)」(Martinら、EMBO J. 13：5303-9(1994))、「ディアボディ」(Holligerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：6444-6448(1993))、または「ジャヌシン(Janusin)」(Trauneckerら、EMBO J. 10：3655-3659(1991)、ならびにTrauneckerら、Int. J. Cancer(補遺)7：51-52(1992))を標準的な分子生物学的手法で、本明細書の記述にしたがって調製することができる。

二重特異性抗体または抗原結合断片は、ハイブリドーマの融合やFab'断片の連結を含む、さまざまな方法で作製することができる。これについては例えばSongsivilaiおよびLachmann、Clin. Exp. Immunol. 79：315-321(1990)、Kostelnyら、J. Immunol. 148：1547-1553(1992)を参照されたい。また二重特異性抗体は、「ダイアボディ」または「ジャヌシン(Janusin)」として形成される場合がある。いくつかの態様では、二重特異性抗体は、c-Metの2種類の異なるエピトープと結合する。いくつかの態様では、二重特異性抗体は、モノクローナル抗体13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3;13.3.2H-A14P;13.3.2H-E42K;13.3.2H-A14P,E42K；13.3.2H-S97T;13.3.2H-E42K,S97T;13.3.2H-A14P,E42K,S97T;13.3.2L-A91T;13.3.2L-A91T,H-A14P;13.3.2L-A91T,H-E42K;13.3.2L-A91T,H-A14P,E42K;13.3.2L-A91T,H-E42K,S92Tまたは13.3.2L-A91T,H-A14P,E42K,S97Tならびに追加的な抗体の重鎖および軽鎖に由来する第1の重鎖および第1の軽鎖を有する。いくつかの態様では、追加的な軽鎖および重鎖は、上述のモノクローナル抗体の1つにも由来するが、第1の重鎖および軽鎖とは異なる。

いくつかの態様では、上述の修飾型抗体を、本明細書に記載されたヒト抗c-Metモノクローナル抗体に由来する、1つまたは複数の可変ドメインまたはCDR領域を用いて調製する。

誘導体化抗体および標識化抗体
本発明の抗c-Met抗体または抗原結合部分は、誘導体化するか、または別の分子(例えば別のペプチドもしくはタンパク質)と連結させることができる。一般に、このような抗体またはその一部を、c-Metとの結合が誘導体化または標識化によって悪影響を受けないように誘導体化する。したがって本発明の抗体および抗体部分は、本明細書に記載された完全型と修飾型のヒト抗c-Met抗体の両方を含むことが意図される。例えば、本発明の抗体または抗体部分を、(化学的結合、遺伝子融合、非共有結合性会合、またはこれ以外の手法で)、別の抗体(例えば二重特異性抗体もしくはディアボディ)、検出用薬剤、細胞障害性薬剤、薬物、および/または抗体もしくは抗体部分と別の分子(ストレプトアビジンのコア領域またはポリヒスチジンタグなど)との結合に介在可能なタンパク質もしくはペプチドなどの1個もしくは複数の他の分子体と機能的に連結させることができる。

誘導体化抗体の1つの種類は、(例えば二重特異性抗体を作るために、同じ種類または異なる種類の)2つまたはそれ以上の抗体を架橋することで作られる。適切な架橋剤には、適切なスペーサーで隔てられた2つの異なる反応基を有する異種二機能性の薬剤(例えばm-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)、または同種二機能性の薬剤(例えばスベリン酸ジスクシンイミジル)などが含まれる。このようなリンカーは、Pierce Chemical Company(Rockford、Ill)から購入することができる。

別の種類の誘導体化抗体は標識化抗体である。本発明の抗体または抗原結合部分を誘導体化可能な有用な検出用薬剤には、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、5-ジメチルアミン-1-塩化ナフタレンスルホニル、フィコエリトリン、ランタニド蛍光体などを含む蛍光化合物がある。抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどの、検出に有用な酵素によっても標識できる。抗体を検出用酵素で標識する場合は、酵素を用いて、識別可能な反応産物を産生させる他の試薬を添加することで検出を行う。例えば、薬剤西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンを添加することで、検出可能な発色反応産物が得られる。抗体をビオチンで標識して、アビジンまたはストレプトアビジンの結合を間接的に測定することで検出することもできる。抗体を、2次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ(例えばロイシンジッパー対の配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ)で標識することもできる。いくつかの態様では、標識を、さまざまな長さのスペーサーアームで結合することで、潜在的な立体障害を小さくする。

抗c-Met抗体は放射性アミノ酸でも標識することができる。放射標識は、診断と治療の両方の目的に使用することができる。例えば放射標識を用いて、c-Metを発現する腫瘍をX線、または他の診断法で検出することができる。また放射標識は、癌性細胞または腫瘍に対する毒素として治療目的で使用することができる。ポリペプチド用の標識の例には、³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、および¹³¹Iなどの放射性同位元素または放射性核種などがあるがこれらに限定されない。

抗c-Met抗体は、ポリエチレングリコール(PEG)、メチル基もしくはエチル基、または糖鎖グループなどの官能基で誘導体化することもできる。これらの官能基は、抗体の生物学的特性を改善するために、例えば血清半減期を延長したり、組織に対する結合を強めたりするために有用である。

薬学的組成物およびキット
本発明は、組織再生または創傷治癒を含むがこれらに限定されない治療的処置を必要とする患者を治療に有用なアゴニスト特性を有するヒト抗c-Met抗体を含む組成物に関する。いくつかの態様では、治療対象はヒトである。他の態様では、治療対象は、獣医学的対象である。組織再生を必要とする組織の例には、肝臓組織（急性、慢性、またはアルコール性の肝炎もしくは肝硬変の場合）、肺組織、胃組織（胃潰瘍の場合）、および腎臓組織（急性腎不全の場合）などがあるが、これらに限定されない。アゴニストである、本発明の抗c-Met抗体群およびこれらを含む組成物を、1種類もしくは複数の他の治療的、診断的、または予防的な薬剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの態様では、1種類もしくは複数のアゴニストである本発明のc-Met抗体をワクチンとして、またはワクチン用のアジュバントとして使用することができる。治療においては、1種類もしくは複数のアゴニストである本発明の抗c-Metモノクローナル抗体、もしくはこの抗原結合断片を単独で、または薬学的に許容可能な担体とともに投与することができる。

別の局面では、阻害特性を有する本発明の抗c-Met抗体は、脳腫瘍、肺癌、扁平細胞癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、乳癌、頭部癌、頚部癌、肝臓癌、腎臓癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌、食道癌、婦人科癌、上咽頭癌、もしくは甲状腺癌、黒色腫、リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、絨毛癌、カポジ肉腫、または頚部上皮内癌を含むがこれらに限定されない、任意の組織もしくは臓器に関与する場合がある。阻害特性を有する本発明の抗c-Met抗体によって治療可能または予防可能な他の障害には、増殖性硝子体網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、子宮内膜症、および関節炎などがあるがこれらに限定されない。本発明の他の態様では、抗c-Met抗体を、アルツハイマー病におけるプラーク形成を阻害するために、また細胞の分裂促進応答を阻害するために使用できる。本発明の抗c-Met抗体は、注射避妊薬中に含めることで、胚の着床を阻害するために使用することができる。抗c-Met抗体は、増殖を阻害することによって腫瘍成長を治療するために腫瘍血管形成を治療/阻害するために、または転移の拡散/散在を治療するために使用することができる。特に、阻害特性を有する、本発明のヒト抗c-Met抗体は、膠芽腫、肉腫、または、例えば乳癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、もしくは肺癌の治療に有用である。

治療が、1種類もしくは複数の、本発明の阻害性の抗c-Metモノクローナル抗体、またはこの抗原結合断片を単独で、または薬学的に許容可能な担体とともに投与することを含む場合がある。本発明の阻害性の抗c-Met抗体、およびこれを含む組成物は、1種類もしくは複数の他の治療的、診断的、または予防的な薬剤と組み合わせて投与することができる。追加的な治療用薬剤には、他の抗新生物薬剤、抗腫瘍薬剤、抗血管薬剤、または化学療法剤などがある。このような追加的薬剤は、同じ組成物中にまとめることができるほか、個別に投与することができる。いくつかの態様では、1種類もしくは複数の本発明の阻害性の抗c-Met抗体をワクチンとして、またはワクチン用のアジュバントとして使用することができる。

癌関連抗原を含む癌ワクチンのほかに、抗体との組み合わせに有用なワクチンには、GM-CSFのDNA、および細胞ベースのワクチン、樹状細胞ワクチン、組換え型ウイルス（例えばワクシニアウイルス）ワクチン、および熱ショックタンパク質（HSP）ワクチンなどがあるがこれらに限定されない。有用なワクチンには、黒色腫細胞から作られるワクチンなどの腫瘍ワクチンなどもあり、またこれは、自家ワクチンの場合もあれば異種ワクチンの場合もある。ワクチンは例えば、ペプチドベース、DNAベース、または細胞ベースのワクチンである場合がある。

本明細書で用いる「薬学的に許容される担体」という用語は、生理学的に適合する任意の、また全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤、および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを意味する。薬学的に許容可能な担体のいくつかの例は、水、生理食塩水、リン酸 緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、またこれらの組み合わせである。多くの場合、等張剤（例えば、糖、マンニトールやソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウム）を組成物中に含めることが好ましい。薬学的に許容可能な物質の他の例には、湿潤剤、または抗体の有効期間を延ばしたり有効性を高めたりする、湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤、または緩衝液などの少量の補助物質などがある。

本発明の組成物は、例えば、溶液(例えば注射溶液および不溶解性溶液)、分散媒もしくは懸濁液、錠剤、丸薬、粉末剤、リポソーム、および坐剤といった、液体、半固体、および固形の剤形などの、さまざまな状態をとりうる。好ましい形状は、意図された投与様式、および治療における応用によって変わる。典型的な好ましい組成物は、ヒトの受動免疫に用いられる組成物に似た組成物などの、注射溶液または注入可能溶液の状態である。好ましい投与様式は、非経口(例えば静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内)への投与である。好ましい態様では、抗体を静脈内への注入または注射で投与する。別の好ましい態様では、抗体を筋肉内または皮下への注射で投与する。

治療的組成物は典型的には、製造および貯蔵の条件で無菌性で安定でなければならない。同組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散、リポソーム、または高薬剤濃度に適した他の秩序構造として製剤化することができる。無菌性注射用溶液は、必要量の抗c-Met抗体を適切な溶媒中に、上述の成分の単剤または複合剤を混合し、必要に応じて濾過滅菌して調製することができる。一般に分散液は、活性化合物を、基礎分散媒と、上述の必要な他の成分を含む無菌性溶媒に混合することで調製する。無菌性注射用溶液を調製するための無菌性粉末の場合、好ましい調製法は、活性成分に加えて、過去に無菌濾過した同溶液に由来する任意の追加的な所望の成分の粉末が得られる真空乾燥および凍結乾燥である。例えばレシチンなどのコーティング剤を用いることで、分散液の場合であれば必要な粒子径を維持することで、また界面活性剤を使用することで、溶液の適切な流動性を保つことができる。注射用組成物の長時間の吸収は、例えばモノステアレート塩やゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤を組成物に含めることで達成することができる。

本発明の抗体は、当技術分野で周知のさまざまな方法によって投与することができるが、一部の治療的応用では、好ましい投与の経路/様式は、皮下、筋肉内、または静脈内への注入である。当業者であれば理解するように、投与の経路および/または様式は所望の結果に応じて変わる。

ある態様では、抗体組成物の活性化合物は、インプラント、経皮吸収製剤(パッチ)、およびマイクロカプセル輸送系を含む放出制御薬剤などの、抗体の速やかな放出を防ぐ担体を用いて調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生分解性で生体適合性のポリマーを使用することができる。このような製剤の多くの調製法は特許の対象であり、一般に当業者に知られている。これについては例えば「Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems」(J.R. Robinson編、Marcel Dekker社、New York、1978)を参照されたい。

ある態様では、本発明の抗c-Met抗体は、例えば不活性希釈物、または吸収性で可食可能な担体とともに経口投与することができる。このような化合物(および、望ましいならば他の成分)を、硬軟のシェルのゼラチンカプセルで包んだり、錠剤中に圧縮したり、または被験者の食事に直接混ぜたりすることもできる。経口による治療的投与の場合、抗c-Met抗体に賦形剤を混ぜて、摂取可能な錠剤、舌下錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェハースなどの状態で使用することができる。本発明の化合物を、非経口投与以外で投与するには、化合物の不活性化を防ぐ材料で化合物を被覆したり、このような材料を化合物と同時投与したりする必要がある場合がある。

他の活性化合物を組成物に混ぜることもできる。ある態様では、本発明の阻害性抗c-Met抗体を、1種類もしくは複数の追加的な治療薬と同時に製剤化するか、および/または同時に投与する。このような薬剤は、他の標的に結合する抗体、抗悪性腫瘍剤、抗腫瘍剤、化学療法剤、c-Met、またはHGFに結合し、かつc-Metへのその結合、およびc-Metの活性化を妨げる抗体またはその他の分子を阻害するペプチド類似体を含むがこれらに限定されない。このような併用療法は、低用量の阻害性抗c-Met抗体、ならびに同時投与することで、さまざまな単独療法に関連した潜在的な毒性または合併症を避ける薬剤を必要とする場合がある。

本発明の阻害性抗c-Met抗体、およびこれを含む組成物は、他の治療法と組み合わせて、特に放射線療法と組み合わせて投与することもできる。

ある態様では、本発明の活性性または阻害性の抗c-Met抗体は、1種類もしくは複数の追加的な治療用薬剤と同時に製剤化されるか、および/または同時に投与される。活性化性のc-Met抗体の場合、このような薬剤は、c-Metを活性化する1種類もしくは複数の化合物、および/または組織再生または創傷治癒などの治療の手技を円滑化する、当技術分野で周知の他の薬剤を含むがこれらに限定されない。阻害性の抗体の場合、これらの薬剤に、c-Metを阻害する薬剤などを含む。さらに、こうした併用療法は、動脈硬化性閉塞症、腎尿細管間質性の線維症、難治性の皮膚潰瘍、胃潰瘍のような疾患、または移植に関連する問題を治療するためにも使用できる。このような併用療法では、低用量の阻害性または作動性の抗c-Met抗体、ならびに同時投与薬剤が必要な場合があるので、さまざまな単独療法に関連する、起こりうる毒性または合併症が避けられる。

本発明の組成物は、「治療的有効量」または「予防的有効量」の本発明の抗体もしくは抗原結合部分を含む場合がある。「治療的有効量」は、所望の治療効果を達成するために必要な用量および期間における有効量を意味する。抗体または抗体部分の治療的有効量は、個体の疾患段階、年齢、性別、および体重、ならびに抗体もしくは抗体部分が所望の反応を個体で発生させる能力などの諸因子によって変動する場合がある。治療的有効量は、抗体もしくは抗体部分の任意の毒性作用または有害作用が、治療的に有効な効果を上回る量でもある。「予防的有効量」とは、所望の予防的結果を達成するために必要な用量および期間における有効量を意味する。典型的には、予防的用量は、疾患の発症前、または初期段階で被験者に用いられるので、予防的有効量は治療的有効量より少なくなる場合がある。

投与方法を調節して、最適な所望の反応(例えば治療反応または予防反応)を得ることができる。例えば単回ボーラスで投与できるほか、複数回に分けた用量を時間をかけて投与したり、または治療状況の緊急性に応じて、用量を比例的に減少したり増加したりすることが可能である。投与を容易にするため、また投与量を均一にするために、非経口組成物を投与単位で製剤化することは特に有利である。本明細書で用いる用量単位とは、投与対象の哺乳類個体を対象とした単一の用量に適した物理的に明瞭な単位を意味し；各単位は、必要な薬学的担体と関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の用量単位の仕様は、(a)抗c-Met抗体、もしくはこの一部の固有の特徴、および達成されるべき特定の治療効果もしくは予防効果、ならびに(b)個体で感受性のある抗体のような、配合の分野における固有の限界によって決定され、またこれらに直接依存する。

治療的または予防的に有効な量の本発明の抗体もしくは抗体部分の例示的な非制限的な範囲は0.025〜50 mg/kg、より好ましくは0.1〜50 mg/kg、より好ましくは0.1〜25 mg/kg、0.1〜10 mg/kg、または0.1〜3 mg/kgである。いくつかの態様において、製剤は、20mM クエン酸ナトリウム、pH5.5、140mM NaCl、および0.2 mg/ml ポリソルベート80の緩衝液中の5mg/ml 抗体を含む。用量の値が、緩和対象の状態の種類および重症度とともに変動する場合があることは重要である。また、任意の特定の被験者にとって、特定の投与方法を、個人の必要性、および専門家による、対象組成物の投与を受ける者、または投与を監視する者に対する判断にしたがって経時的に調製すべきであること、また本明細書に記載された用量範囲が例示的なものであって、主張された組成物の範囲もしくは実践を制限する意図がないことを理解すべきである。

本発明の別の局面は、本発明の抗c-Met抗体もしくは抗体部分、またはこのような抗体を含む組成物を含むキットを提供する。キットは、抗体もしくは組成物に加えて、診断薬または治療薬を含む場合がある。キットはまた、診断法または治療法における使用に際しての指示書を含む場合もある。好ましい態様では、キットは、抗体、または抗体と、後述する方法で使用可能な診断薬を含む組成物を含む。別の好ましい態様では、キットは、抗体、または抗体と、後述する方法で使用可能な1種類もしくは複数の治療薬を含む組成物を含む。

本発明はまた、一定量の化学療法薬と併用した、一定量の本発明の抗体を含む、哺乳類における異常な細胞成長を抑えるための組成物にも関する(化合物、塩、溶媒和化合物、またはプロドラッグの量、ならびに化学療法薬の量は、ともに異常な細胞成長を抑えるのに有効である)。いくつかの化学療法薬が現在、当技術分野で周知である。いくつかの態様では、化学療法薬は、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、抗代謝物、インターカレートする抗生物質、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、生物学的反応修飾物質、抗ホルモン(例えば抗アンドロゲン)、ならびに抗血管新生剤からなる群より選択される。

MMP-2(マトリックスメタロプロテイナーゼ2)阻害剤、MMP-9(マトリックスメタロプロテイナーゼ9)阻害剤、およびCOX-II(シクロオキシゲナーゼII)阻害剤などの抗血管新生剤を、本発明の抗c-Met抗体と併用することができる。有用なCOX-II阻害剤の例にはCELEBREX(商標)(セレコキシブ(celecoxib))、バルデコキシブ(valdecoxib)、およびロフェコキシブ(rofecoxib)などがある。有用なマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤の例は、いずれも参照として全体が本明細書に組み入れられる

に記載されている。

好ましいMMP阻害剤は、関節痛を生じない薬剤である。より好ましくは、他のマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP-1、MMP-3、MMP-4、MMP-5、MMP-6、MMP-7、MMP-8、MMP-10、MMP-11、MMP-12、およびMMP-13)に対して、MMP-2および/またはMMP-9を選択的に阻害する薬剤である。本発明に有用なMMP阻害剤のいくつかの特定の例は、AG-3340、RO 32-3555、RS 13-0830、および以下に列挙した化合物である：3-［［4-(4-フルオロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニル］-(1-ヒドロキシカルバモイル-シクロペンチル)アミノ］-プロピオン酸；3-エキソ-3-［4-(4-フルオロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニルアミノ］-8-オキサ-ビシクロ［3.2.1］オクタン-3-カルボン酸ヒドロキシアミド；(2R, 3R)1-［4-(2-クロロ-4-フルオロ-ベンジルオキシ)-ベンゼンスルホニル］-3-ヒドロキシ-3-メチル-ピぺリジン-2-カルボン酸ヒドロキシアミド；4-［4-(4-フルオロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニルアミノ］-テトラヒドロ-ピラン-4-カルボン酸ヒドロキシアミド；3-［［4-(4-フルオロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニル］-(1-ヒドロキシカルバモイル-シクロブチル)-アミノ］-プロピオン酸；4-［4-(4-クロロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニルアミノ］-テトラヒドロ-ピラン-4-カルボン酸ヒドロキシアミド；(R)3-［4-(4-クロロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニルアミノ］-テトラヒドロ-ピラン-3-カルボン酸ヒドロキシアミド；(2R, 3R)1-［4-(4-フルオロ-2-メチル-ベンジルオキシ)-ベンゼンスルホニル］-3-ヒドロキシ-3-メチル-ピぺリジン-2-カルボン酸ヒドロキシアミド；3-［［4-(4-フルオロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニル］-(1-ヒドロキシカルバモイル-1-メチル-エチル)-アミノ］-プロピオン酸；3-［［4-(4-フルオロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニル］-(4-ヒドロキシカルバモイル-テトラヒドロ-ピラン-4-イル)-アミノ］-プロピオン酸；3-エキソ-3-［4-(4-クロロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニルアミノ］-8-オキサ-ビシクロ［3.2.1］オクタン-3-カルボン酸ヒドロキシアミド；3-エンド-3-［4-(4-フルオロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニルアミノ］-8-オキサ-ビシクロ［3.2.1］オクタン-3-カルボン酸ヒドロキシアミド酸；および(R)3-［4-(4-フルオロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニルアミノ］テトラヒドロ-フラン-3-カルボン酸ヒドロキシアミド；ならびにこれらの化合物の薬学的に許容される塩および溶媒和物である。

本発明の抗c-Met抗体は、EGF-R抗体、EGF抗体、およびEGF-R阻害剤となる分子を含むがこれらに限定されない、EGF-R（表皮成長因子受容体）反応を阻害可能な薬剤；VEGF（血管内皮成長因子）およびVEGF受容体（VEGF-R）の阻害剤；ならびにerbB2受容体と結合する有機分子または抗体などのerbB2受容体阻害剤（例えばHERCEPTIN（商標）（Genentech, Inc.））などのシグナル伝達阻害剤とともに使用することもできる。EGF-R阻害剤は例えば、いずれも参照により本明細書に組み入れられる、WO 95/19970（1995年7月27日公開）、WO 98/14451（1998年4月9日公開）、WO 98/02434（1998年1月22日公開）、および米国特許第5,747,498号（1998年5月5日公開）に記載されており、またこのような物質を、本明細書に記載された手順で本発明に使用することができる。

EGF-R阻害性薬剤には、モノクローナル抗体C225および抗EGF-R 22Mab（ImClone Systems Incorporated）、ABX-EGF（Abgenix/Cell Genesys）、EMD-7200（Merck KgaA）、EMD-5590（Merck KgaA）、MDX-447/H-477（Medarex Inc. and Merck KgaA）、ならびに化合物ZD-1834、ZD-1838、およびIRESSA（商標）（ZD-1839）（AstraZeneca）、PKI-166（Novartis）、PKI-166/CGP-75166（Novartis）、PTK 787（Novartis）、CP 701（Cephalon）、レフルノマイド（Pharmacia/Sugen）、Tarceva（商標）（OSI, Roche and Genetech）、CI-1033（Warner Lambert Parke Davis）、CI-1033/PD 183、805（Warner Lambert Parke Davis）、CL-387、785（Wyeth-Ayerst）、BBR-1611（Boehringer Mannheim GmbH/Roche）、Naamidine A（Bristol Myers Squibb）、RC-3940-II（Pharmacia）、BIBX-1382（Boehringer Ingelheim）、OLX-103（Merck & Co.）、VRCTC-3101（Ventech Research）、EGF融合トキシン（Seragen Inc.）、DAB-389（Seragen/Lilgand）、ZM-252808（Imperial Cancer Research Fund）、RG-50864（INSERM）、LFM-A12（Parker Hughes Cancer Center）、WHI-P97（Parker Hughes Cancer Center）、GW-282974（Glaxo）、KT-8391（Kyowa Hakko）、ならびにEGF-Rワクチン（York Medical/Centro de Immunologia Molecular (CIM)）などがあるがこれらに限定されない。これらの、また他のEGF-R阻害性薬剤を本発明に使用することができる。

VEGF-R阻害剤、VEGF阻害剤、例えばSU-5416、SU-1124、およびSU-6668(Sugen社)、SH-268(Schering)、およびNX-1838(NeXstar)を、本発明の化合物と組み合わせることもできる。VEGF阻害剤およびVEGF-R阻害剤は例えば、全て参照として全体が本明細書に組み入れられる

に記載されている。

本発明で有用ないくつかの特異的なVEGF-R阻害剤およびVEGF阻害剤の他の例は、IM862(Cytran社)；GAvastin（商標）；ならびにRibozyme社およびChiron社の合成リボザイムであるアンジオザイム(angiozyme)である。これらのVEGF阻害剤および他のVEGF阻害剤ならびにVEGF-R阻害剤は、本明細書に記載されたように本発明に使用することができる。

GW-282974(Glaxo Wellcome plc)などのErbB2受容体阻害剤、ならびにモノクローナル抗体AR-209(Aronex Pharmaceuticals社)、および2B-1(Chiron)はさらに、例えば全体が参照として本明細書に組み入れられる

に記載されている本発明の化合物と組み合わせることができる。本発明で有用なErbB2受容体阻害剤は、いずれも全体が参照として本明細書に組み入れられる米国特許第6,465,449号(2002年10月15日発行)、および米国特許第6284,764号(2001年9月4日発行)にも記載されている。上述の特許明細書に記載されたerbB2受容体阻害剤の化合物および物質、ならびにerbB2受容体を阻害する他の化合物および物質を、本発明の化合物とともに、本発明で使用することができる。

本発明の抗c-Met抗体を、Gleevec（商標）（Novartis）などのPDGFR、BCR-ABL、またはc-kitの阻害剤とともに使用することもできる。

本発明の抗c-Met抗体は、WO 02053596（2002年7月11日公開）に記載された抗体などの抗-IGFIR抗体、例えば、抗体2.12.1、2.13.2、2.14.3、3.1.1、4.9.2または4.17.3の配列を有する抗体とともに使用することもできる。本発明の抗体は、抗体3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1、または12.9.1.1の配列を有する抗体を含む、米国特許第6,682,736号に記載された抗体などのCTLA-4抗体とともに使用することもできる。このような抗体は、抗体3.1.1、3.1.1H-A78T、3.1.1H-A78T-V88A-V97A、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、22.1.1H-C109A、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.28.1H-D16E、23.29.1、または24.2の配列を有する抗体を含む、WO 03040170（2003年5月15日公開）に記載された抗体などのCD40抗体とともに使用することもできる。抗体は、抗インテグリン抗体などの抗インテグリン薬剤と組み合わせて使用することもできる。

抗体を組み合わせ可能な薬剤の一部の特定の例には、（1）アルキル化剤のナイトロジェンマスタードN-オキシド、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、ブスルファンミトブロニトール、カルボコン、チオテパ、ラニムスチン、ニムスチン、およびテモゾロミド；（2）抗代謝剤のメトトレキセート、6-メルカプトプリン、リボシド、メルカプトプリン、5-FU、テガフール、ドキシフルリジン、カルモフール、シタラビン、シタラビンオクホスファート、エノシタビン、S-1、ゲムシタビン、フルダラビン、およびカペシタビン；（3）抗生物質のアクチノマイシンD、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ネオカルチノスタチン、ブレオマイシン、ペプロマイシン、マイトマイシン C、アクラルビシン、ピラルビシン、エピルビシン、ジノスタチンスチマラマー、およびイダルビシン；（4）植物由来の抗腫瘍剤のビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、エトポシド、ソブゾキサン、ドセタキセル、パクリタキセル、およびビノレルビン；（5）白金系化合物のシスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、およびオキサリプラチン；（6）カンプトセシン誘導体イリノテカン、トポテカン、およびカンプトセシン；（7）チロシンキナーゼ阻害剤のIRESSA（商標）（ゲフィチニブ）およびSU5416；（8）Rituxan（商標）（リツキシマブ）、Bexxar（トシツモマブ）、およびZevalin（商標）（イブリツマブ・ティウキセタン）などの抗CD20薬剤；（9）インターフェロンα、インターフェロンα-2a、インターフェロンα-2b、インターフェロンβ、インターフェロンガンマ-1a、およびインターフェロンガンマ-n1などのインターフェロン；（10）クレスチン、レンチナン、シゾフィラン、ピシバニール、およびウベニメクスなどの生物学的応答修飾剤；または（11）他の抗腫瘍薬剤ミトキサントロン、1-アスパラギナーゼ、プロカルバジン、ダカルバジン、ヒドロキシカルバミド、ペントスタチン、およびトレチノインなどがある。また、本発明の抗体は、エキセメスタン、Edotecarin（商標）（J-107088）、およびSU11248などの抗癌剤を組み合わせることができる。

使用する診断法
別の局面では、本発明は診断法を提供する。抗c-Met抗体を使用して、生物学的試料中のc-Metをインビトロまたはインビボで検出することができる。1つの態様では、本発明は、抗体を被験者に注射する段階、抗体結合位置を決定することで被験者におけるc-Metの発現を判定する段階、被験者における発現を、正常標準被験者または標準における発現と比較する段階、ならびに腫瘍の存在または位置を診断する段階を含む、処置を必要とする被験者における、c-Metを発現する腫瘍の存在または位置を診断する方法を提供する。

抗c-Met抗体は、ELISA、RIA、フローサイトメトリー、組織免疫組織化学的手法、ウェスタンブロット、または免疫沈殿を含むがこれらに限定されない、従来の免疫アッセイ法に使用することができる。本発明の抗c-Met抗体は、ヒトに由来するc-Metの検出に使用することができる。別の態様では、抗c-Met抗体は、カニクイザルまたはアカゲザルに由来するc-Metの検出に使用することができる。別の態様では、抗c-Met抗体をラット由来のc-Metの検出に使用することができる。

本発明は、生物学的試料に本発明の抗c-Met抗体を接触させる段階、および結合状態の抗体を検出する段階を含む、生物学的試料中のc-Metを検出する方法を提供する。1つの態様では、抗c-Met抗体を、検出可能な標識で直接標識する。別の態様では、抗c-Met抗体(一次抗体)を標識せず、抗c-Met抗体に結合可能な二次抗体または他の分子を標識する。当業者に周知なように、特定の種およびクラスの一次抗体に特異的に結合可能な二次抗体を選択する。例えば抗c-Met抗体がヒトIgGの場合、二次抗体は抗ヒトIgGとなる場合がある。抗体に結合可能な他の分子には、いずれも例えばPierce Chemical社から市販されているプロテインA(Protein A)やプロテイン(Protein G)などがあるがこれらに限定されない。

抗体または二次抗体用の適切な標識は、上述の通りであり、さまざまな酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、および放射性材料を含む。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどがあり；適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン/ビオチン、およびアビジン/ビオチンなどがあり；適切な蛍光材料の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンなどがあり；発光材料の例にはルミノールがあり；また適切な放射性物質の例には¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S、または³Hなどがある。

他の態様では、c-Metを、検出用物質で標識したc-Met標準、および非標識抗c-Met抗体を用いる競合免疫アッセイ法で生物学的試料中で調べることができる。このアッセイ法では、生物学的試料、標識されたc-Met標準、および抗c-Met抗体を混合して、非標識抗体に結合した標識c-Met標準の量を決定する。生物学的試料中のc-Metの量は、抗c-Met抗体に結合した標識c-Met標準の量に逆比例する。

上記に開示の免疫アッセイ法を、いくつかの目的で使用することができる。例えば、抗c-Met抗体を用いて、培養細胞内のc-Metを検出することができる。好ましい態様では、抗c-Met抗体を用いて、さまざまな化合物で処理した細胞の表面上におけるc-Metの量を決定することができる。この方法で、c-Metタンパク質レベルを調節する化合物を同定することができる。この方法では、ある細胞試料を、試験化合物で一定期間処理し、別の試料を処理せずにおく。c-Metの全体濃度を測定するのであれば、細胞を溶解し、上述の免疫アッセイ法の1つでc-Metの全体濃度を測定する。処理細胞と非処理細胞におけるc-Metの全体濃度を比較することで、試験化合物の作用を決定する。

総c-Met量を測定する好ましい免疫アッセイ法は、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学である。c-Metの細胞表面量を測定するのであれば、細胞を溶解せず、上述の免疫アッセイ法の1つでc-Metの細胞表面量を測定する。c-Metの細胞表面量を決定する好ましい免疫アッセイ法は、細胞表面タンパク質をビオチンや¹²⁵Iなどの検出用標識で標識する段階、c-Metを抗c-Met抗体で免疫沈殿させる段階、また続いて、標識されたc-Metを検出する段階を含む。

c-Metの(例えば細胞表面レベル)局在を決定する別の好ましい免疫アッセイ法は、免疫組織化学的手法で行う。c-Metの細胞表面レベルを検出するための好ましい免疫アッセイ法は、フルオレセインまたはフィコエリトリンなどの適切なフルオロフォアで標識した抗c-Met抗体の結合、およびフローサイトメトリーを用いた一次抗体の検出を含む。別の態様においては、抗c-Met抗体は、未標識であり、かつ二次抗体または抗c-Met抗体に結合できる他の分子は標識されている。ELISA、RIA、ウェスタンブロット、免疫組織化学的手法、膜内在性タンパク質の細胞表面標識、および免疫沈殿などの方法は当技術分野で周知である(HarlowおよびLane(前掲)を参照)。また、この免疫アッセイ法は、c-Metの活性化または阻害に関して大量の化合物を検討する目的の高スループットのスクリーニング用にスケールアップすることができる。

本発明の抗c-Met抗体を用いて、組織中、または組織に由来する細胞中におけるc-Met量を決定することもできる。いくつかの態様では、このような組織は疾患組織である。いくつかの態様では、組織は、腫瘍または腫瘍の生検である。この方法のいくつかの態様では、組織、またはこの生検を患者から切除する。組織または生検試料を次に免疫アッセイ法に用いて、例えば総c-Met量、c-Metの細胞表面量、またはc-Metの局在を上述の方法で決定する。

上述の診断法で、抗c-Met抗体を用いた治療の標的であることの指標となりうる、高量のc-Metを腫瘍が発現するか否かを判定することができる。このような診断法は、組織もしくは細胞が、c-Metもしくは活性化c-Metを不十分な量しか発現していないかどうかという判定にも使用できるので、活性化抗c-Met抗体、HGF、および/またはc-Metの量または活性を高める他の治療薬を用いる治療法の候補となる。

本発明の抗体をインビボで用いて、c-Metを発現する組織および器官を同定することもできる。いくつかの態様では、抗c-Met抗体を用いて、c-Metを発現する腫瘍を同定する。本発明のヒト抗c-Met抗体を使用することの1つの利点は、非ヒト起源の抗体またはヒト化抗体もしくはキメラ抗体とは異なり、投与時に抗体に対する十分な免疫応答を引き起こすことなく、インビボで安全に使用できる点である。

この方法は、検出目的で標識された抗c-Met抗体、または同抗体を含む組成物を、このような診断試験を必要とする患者に投与する段階、ならびに患者を対象に画像解析を行ってc-Metを発現する組織の位置を決定する段階を含む。画像解析は医学分野でよく知られており、X線解析、磁気共鳴画像法(MRI)、またはコンピュータ断層撮影(CT)を含むがこれらに限定されない。抗体は、X線解析に使用可能な、インビボにおける画像解析に適した任意の薬剤(例えばバリウムなどの造影剤)、またはMRIもしくはCTに使用可能なガドリニウムキレート剤などの磁気造影剤で標識することができる。他の標識用薬剤には、⁹⁹Tcなどの放射性同位元素が含まれるがこれらに限定されない。別の態様では、抗c-Met抗体を標識せず、2次抗体、または検出可能で抗c-Met抗体に結合可能な他の分子を投与することで描出する。態様では、患者から生検を得て、対象組織がc-Metを発現しているか否かを判定する。

有用な治療法
別の態様では、本発明は、治療を必要とする患者に抗c-Met抗体を投与することでc-Met活性を阻害する方法を提供する。別の態様では、本発明は、治療を必要とする患者に抗c-Met抗体を投与することでc-Met活性を活性化する方法を提供する。本明細書に記載された任意の種類の抗体を治療的に使用することができる。好ましい態様では、抗c-Met抗体は、ヒト抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。別の好ましい態様では、c-Metはヒト抗体であり、また患者はヒト患者である。あるいは、抗c-Met抗体と交差反応するc-Metを発現する患者は哺乳類である場合がある。抗体は、獣医学的目的で、またはヒトの疾患の動物モデルとして、抗体交差反応する（ラットもしくはカニクイザル）、c-Metを発現する非ヒト哺乳類に投与することができる。このような動物モデルは、本発明の抗体の治療効果の評価に有用な場合がある。

本明細書で用いる「c-Met活性が有害に作用する障害」という用語は、障害を有する治療対象における高レベルのc-Metの存在が、障害の病態生理、または障害の悪化に寄与する因子のいずれかに関与することが疑われている、報告済みの疾患および他の障害を含む。このような障害は例えば、細胞表面におけるc-Metのレベルの上昇、または障害を有する治療対象の、影響を受けた細胞または組織におけるc-Metのチロシン自己リン酸化の増加によって顕在化する場合がある。c-Metレベルの上昇は例えば、上述の抗c-Met抗体を用いて検出することができる。

1つの態様では、抗c-Met抗体は、c-Metを発現する腫瘍を有する患者に投与することができる。腫瘍は、固形腫瘍の場合があるほか、リンパ腫などの非固形腫瘍の場合がある。より好ましい態様では、抗c-Met抗体は、癌性であるc-Metを発現する腫瘍を有する患者に投与することができる。さらにより好ましい態様では、抗c-Met抗体を、肺、乳房、前立腺、または結腸の、c-Metを発現する腫瘍を有する患者に投与する。別の好ましい態様では、抗c-Met抗体を、c-Metを発現する膠芽腫を有する患者に投与する。より好ましい態様では、このような方法は、重量または体積を増加しないか、または重量もしくは体積を減少しない腫瘍を生じる。別の態様では、このような方法は、腫瘍細胞表面におけるHGFとc-Metとの結合を防ぐか、またはc-Met細胞表面タンパク質の発現低下を招く。好ましい態様では、抗体は、13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3；13.3.2H-A14P；13.3.2H-E42K；13.3.2H-A14P, E42K；13.3.2H-S97T；13.3.2H-E42K, S97T；13.3.2H-A14P, E42K, S97T；13.3.2L-A91T；13.3.2L-A91T, H-A14P；13.3.2L-A91T, H-E42K；13.3.2L-A91T, H-A14P, E42K；13.3.2L-A91T, H-E42K, S97T、もしくは13.3.2L-A91T, H-A14P, E42K, S97Tから選択されるか、またはこれらの重鎖、軽鎖、もしくは抗原結合領域を含む。

別の好ましい態様では、抗c-Met抗体は、不適当に高いレベルのc-Metを発現する患者に投与することができる。c-Metの高レベルの発現が、さまざまな一般的な癌の発生につながる場合があることは当技術分野で周知である。1つの態様では、このような方法は、脳腫瘍、扁平細胞癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、乳癌、頭頸部癌、食道癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肺癌、直腸癌、腎臓癌、卵巣癌、婦人科癌、もしくは甲状腺癌などの癌の治療に関する。本発明の方法に従って、本発明の化合物によって治療可能な患者には、肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部の癌、皮膚もしくは眼内の黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、結腸癌、乳癌、婦人科癌（例えば、子宮肉腫、卵管の癌、子宮内膜の癌、子宮頚部の癌、膣の癌、もしくは陰門の癌）、ホジキン病、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌（例えば、甲状腺、副甲状腺、もしくは副腎の癌）、軟組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、前立腺癌、慢性もしくは急性の白血病、小児の固形腫瘍、リンパ性リンパ腫、膀胱の癌、腎臓もしくは輸尿管の癌（例えば、腎細胞癌、特に、c-Metキナーゼドメインに活性化変異を有する遺伝性および散発性の乳頭状の腎細胞癌、腎盂の癌）、または中枢神経系の新生物の（例えば、原発性のCNSリンパ腫、脊髄の軸の腫瘍、脳幹グリオーマもしくは下垂体腺腫）であると診断された患者が含まれる。より好ましい態様では、抗c-Met抗体は、乳癌、前立腺癌、肺癌、結腸癌、もしくは膠芽腫の患者に投与される。さらにより好ましい態様では、このような方法は、異常に増殖する癌を停止させたり、重量もしくは体積を増加させなかったり、または重量もしくは体積を減少させなかったりする。

抗体は、1回投与することができるが、より好ましくは複数回投与される。抗体は、1日3回〜6か月またはこれ以上において1回投与することができる。投与する段階は、1日3回、1日2回、1日1回、2日毎に1回、3日に1回、週に1回、2週間に1回、月に1回、2か月に1回、3か月に1回、また6か月に1回などのスケジュールで行うことができる。抗体は、小型ポンプ経由で連続的に投与することもできる。抗体は、経口、粘膜、頬内、鼻腔内、吸入可能、静脈内、皮下、筋肉内、非経口的、腫瘍内を経由して、または局所経路で投与することができる。抗体は、腫瘍の部位に、腫瘍内部に、または腫瘍の部位から離れた部位に投与することができる。抗体は、1回、少なくとも2回、または少なくとも、条件が治療されたり、緩和されたり、治癒されたりするまでの期間、投与することができる。抗体は通常、抗体が、腫瘍もしくは癌の成長を停止させたり、または重量もしくは体積を減少させたりする場合に、腫瘍が存在する期間に限って投与される。抗体は通常、上記の薬学的組成物の一部として投与される。抗体の用量は一般に0.1〜100 mg/kg、より好ましくは0.5〜50 mg/kg、より好ましくは1〜20 mg/kg、またさらにより好ましくは1〜10 mg/kgの範囲とする。抗体の血清濃度は、当技術分野で周知の任意の方法で測定することができる。

別の局面では、抗c-Met抗体は、抗新生物性の薬剤または分子などの他の治療用薬剤とともに、癌または腫瘍などの過増殖障害の患者に同時投与される場合がある。1つの局面では、本発明は、治療的有効の量の本発明の化合物を、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、抗代謝剤、挿入剤、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、生物学的応答修飾剤、抗ホルモン剤、キナーゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、遺伝学的治療薬（genetic therapeutics）、および抗アンドロゲンからなる群より選択されるがこれらに限定されない抗癌剤と組み合わせて哺乳類に投与する段階を含む、哺乳類における過増殖障害の治療法に関する。より好ましい態様では、抗体は、アドリアマイシンやタキソールなどの抗悪性腫瘍剤とともに投与することができる。別の好ましい態様では、抗体もしくは併用療法は、放射線療法、化学療法、光線力学療法、外科手術、または他の免疫療法とともに実施することができる。さらに別の好ましい態様では、抗体は別の抗体とともに投与される。例えば抗c-Met抗体は、腫瘍もしくは癌細胞の増殖を阻害することが知られている抗体もしくは他の薬剤（例えばerbB2受容体、EGF-R、CD20、またはVEGFを阻害する抗体もしくは薬剤）とともに投与することができる。

抗体と他の治療薬の同時投与（併用療法）は、抗c-Met抗体および追加的な治療薬を含む薬学的組成物を投与する段階、ならびに2種類またはこれ以上の別個の薬学的組成物を投与する段階（一方は抗c-Met抗体を含み、他方（複数の薬剤の場合もある）は、（1つまたは複数の）追加的な治療薬を含む）を含む。さらに、同時投与または併用療法は一般に、抗体および追加的な治療用薬剤が、相互に同じ時間に投与されることを意味するが、抗体および追加的な治療用薬剤が異なる時間に投与される場合も含む。例えば抗体は3日に1回投与することが可能である一方で、追加的な治療薬は1日1回投与される。あるいは抗体は、追加的な治療薬による障害の治療に先だって、または治療後に、例えば患者が追加的な薬剤による治療が成功しなかった後に投与することができる。同様に、抗c-Met抗体の投与を、放射線療法、化学療法、光線力学療法、外科手術、または他の免疫療法などの治療に先だって、または治療後に実施することができる。

抗体、および1つもしくは複数の追加的な治療用薬剤（併用療法）は、1回、2回、または少なくとも、条件が治療されたり、緩和されたり、または治癒されたりするまでの期間、投与することができる。好ましくは、併用療法は複数回実施される。併用療法は、1日3回〜6か月に1回、実施することができる。投与する段階は、1日3回、1日2回、1日1回、2日に1回、3日に1回、週に1回、2週間に1回、月に1回、2か月に1回、3か月に1回、および6か月に1回などのスケジュールで実施することができるほか、小型ポンプ経由で連続的に投与することができる。併用療法は、経口、粘膜の、頬内、鼻腔内、吸入可能、静脈内、皮下、筋肉内、非経口的な、腫瘍内経由で、または局所経路で実施することができる。併用療法は、腫瘍の部位から離れた部位を対象に実施することができる。併用療法は一般に、抗体が、腫瘍または癌の成長を停止させるか、または重量もしくは体積を減少させる場合に、対象となる腫瘍が存在する限りにおいて実施される。

さらに別の態様では、抗c-Met抗体は、放射標識、免疫毒素、もしくはトキシンで標識されるか、またはトキシンペプチドを含む融合タンパク質である。抗c-Met抗体または抗c-Met抗体の融合タンパク質は、放射標識、免疫毒素、トキシン、またはトキシンペプチドを、c-Metを発現する腫瘍もしくは癌細胞に誘導する。好ましい態様では、放射標識、免疫毒素、トキシン、またはトキシンペプチドは、抗c-Met抗体が、腫瘍もしくは癌細胞の表面のでc-Metと結合した後に内在化される。

別の局面では、抗c-Met抗体は、c-Metが関連する非癌性の疾患または条件の治療に使用することができる。1つの態様では、この方法は、c-Met活性に起因するか、またはc-Met活性によって悪化した非癌性の病的状態を示す患者に抗c-Met抗体を投与する段階を含む。より好ましい態様では、抗c-Met抗体は、非癌性の病的状態の進行を遅らせる。より好ましい態様では、抗c-Met抗体は、非癌性の病的状態を少なくとも部分的に停止させるか逆転させる。

別の局面では、本発明は、治療を必要とする患者に活性化抗c-Met抗体を投与する方法を提供する。いくつかの態様では、活性化抗体またはこれを含む薬学的組成物は、治療を必要とする患者に、c-Met活性を高めるために有効な量が投与される。好ましい態様では、活性化抗体は、正常なc-Met活性を回復することが可能である。別の好ましい態様では、活性化抗体は、組織再生を必要とする患者に投与される場合がある。別の態様では、活性化抗体は、腎臓または尿細管間質の線維症を治療するために患者に投与される場合がある。別の態様では、活性化抗c-Met抗体は、移植外科手術に関連する問題を治療するために、例えば腎臓移植の拒絶に関連する虚血を治療するために、患者に投与される場合がある。別の態様では、移植手術後のシクロスポリン投与に関連した毒性を減じるために、活性化抗体を使用することができる。別の態様では、再潅流傷害、血管形成術後の再狭窄、または動脈硬化性閉塞症などの血管疾患に起因する心筋梗塞、心虚血を治療するために、活性化抗c-Met抗体を投与することができる。別の態様では、創傷、例えば難治性の皮膚潰瘍を治癒するために、または胃潰瘍を治療するために、活性化抗体を投与することができる。別の好ましい態様では、活性化抗体を、組織再生などの治療手技を容易にするか、またはc-Met活性を高める1種類もしくは複数の他の因子とともに投与することができる。このような因子には、HGFなどの成長因子、および/またはc-Metを活性化するHGFの類似体などがある。好ましい態様では、抗体は、13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3、およびこのバリアントからなる群より選択され、または重鎖、軽鎖、またはこれらの抗原結合部分を含む。

遺伝子治療
本発明の核酸分子を、処置を必要とする患者に遺伝子治療で投与することができる。遺伝子治療はインビボまたはエキソビボのいずれかの場合がある。好ましい態様では、重鎖と軽鎖の両方をコードする核酸分子を患者に投与する。より好ましい態様では、核酸分子を、B細胞の染色体に同分子が安定に組み入れられるように投与する(B細胞がもっぱら抗体産生に関与するため)。好ましい態様では、B細胞前駆細胞を、トランスフェクトするか、エキソビボで感染させ、処置を必要とする患者に再移植する。別の態様では、B細胞前駆細胞または他の細胞に、対象細胞種に感染することが知られているウイルスを用いてインビボで感染させる。遺伝子治療に使用される典型的なベクターには、リポソーム、プラスミド、およびウイルスベクターなどがある。例示的なウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルスである。インビボまたはエキソビボにおける感染後に、抗体発現のレベルを、投与患者から試料を採取し、当技術分野で周知の、また本明細書に記載された任意の免疫アッセイ法でモニタリングすることができる。

好ましい態様では、遺伝子治療法は、抗c-Met抗体の重鎖、またはこの抗原結合部分をコードする単離された核酸分子を投与する段階、ならびにこの核酸分子を発現させる段階を含む。別の態様では、遺伝子治療法は、抗c-Met抗体の軽鎖、またはこの抗原結合部分をコードする単離された核酸分子を投与する段階、ならびに核酸分子を発現させる段階を含む。より好ましい方法では、遺伝子治療法は、本発明の抗c-Met抗体の、重鎖もしくはこの抗原結合部分をコードする単離された核酸分子、および軽鎖もしくはこの抗原結合部分をコードする単離された核酸分子を投与する段階、ならびにこれらの核酸分子を発現させる段階を含む。遺伝子治療法は、タキソールやアドリアマイシンなどの別の抗癌剤を投与する段階を含む場合もある。

本発明をさらに深く理解するために、実施例を以下に記載する。これらの実施例は、説明する目的でのみ提供するものであり、本発明の範囲をいかなる意味においても制限すると解釈されない。

実施例I
抗c-Met抗体を産生するハイブリドーマの作製
本発明の抗体を以下の手順で調製し、選択し、およびアッセイ法を行った。8〜10週齢のXenoMouse（商標）マウスを腹腔内または後足蹠経由で、c-Met細胞外ドメイン融合タンパク質（10μg/dose/匹）か、またはヒトc-Metを、その血漿膜に発現するNIH-3T3形質転換細胞系列（10×10⁶細胞/用量/匹）（R&D Systems, Catalog #358MT）のいずれかによって免疫化した。この投与は、3〜8週間にわたって5〜7回繰返し行った。融合の4日前に、マウスに、ヒトc-Metの細胞外ドメイン融合タンパク質（PBSに溶解）の最終注射を行った。免疫化したマウスの脾臓およびリンパ節のリンパ球を、非分泌性骨髄腫P3-X63-Ag8.653細胞系列と融合させ、融合後の細胞を対象に、文献に記載された手順でHAT選択を行った（GalfreおよびMilstein, Methods Enzymol. 73: 3-46, 1981）。c-Metに特異的なヒトIgG2抗体を全て分泌するハイブリドーマのパネルを回収した。4種類のハイブリドーマを、後の試験用に選択し、13.3.2；9.1.2；8.70.2、および8.90.3と命名した。これらのハイブリドーマは、ブダペスト条約（American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209）の条項に基づいて2003年3月4日に登録した。ハイブリドーマには、以下のアクセッション番号が割り当てられた。
ハイブリドーマ13.3.2（LN 15883） PTA-5026
ハイブリドーマ9.1.2（LN 15884） PTA-5027
ハイブリドーマ8.70.2（LN 15885） PTA-5028
ハイブリドーマ6.90.3（LN 15886） PTA-5029

実施例II
本発明に従って調製した抗-c-Met抗体の配列
本発明に従って作製された抗体の構造を解析するために、抗c-Metモノクローナル抗体13.3.2；9.1.2；8.70.2、および8.90.3を産生するハイブリドーマから、重鎖および軽鎖の断片をコードする核酸をクローニングした。クローニングおよび配列決定は、以下の手順で行った。

ポリ（A）⁺ mRNAを、Fast-Trackキット（Invitrogen）を用いて、ヒトc-Metで免疫化されたXenoMouse（商標）マウスに由来する、約2×10⁵個のハイブリドーマ細胞から単離した。ランダムプライマーを用いてmRNAからcDNAを合成した。ランダムプライム法で作製されたcDNAの解析は、ヒトV_HまたはヒトV_Kファミリー特異的な可変部ドメインプライマー（Marks et al., 「Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and design of family-specific oligonucleotide probes.」Eur. J. Immunol. 21: 985-991 (1991)）、またはユニバーサルヒトV_Hプライマー［MG-30、

］に、ヒトのC_γ2定常部ドメインに特異的なプライマーMG-40d［

］、またはC_κ定常部ドメイン［h_κP2；Green et al.に記載］に特異的なプライマーを併用して行った。抗c-Met産生ハイブリドーマから、ヒトの重鎖およびκ軽鎖の転写物をコードする核酸分子を、ポリ（A）⁺ RNAから作製したPCR産物を対象とした、上記のプライマーを用いた直接配列決定によって得た。PCR産物をTAクローニングキットを用いてpCRII（Invitrogen）にクローニングし、またPrism色素ターミネーター配列決定キット（Applied Biosystems Inc）、およびABI 377配列決定装置（Applied Biosystems Inc）を用いて、両方の鎖の配列を決定した。全ての配列は、MacVectorおよびGeneworksソフトウェアプログラムを用いて、「V BASE配列ディレクトリ」（Tomlinson et al., MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK）に対するアライメントによって解析した。

モノクローナル抗体13.3.2；9.1.2；8.70.2、および8.90.3を対象に、完全長DNAのクローニングおよび配列決定を行った。このような配列決定の場合、約2×10⁶個のハイブリドーマ細胞から、QIAGEN RNeasy RNA単離キット（QIAGEN）を用いてRNAを単離した。得られたmRNAを、ランダムヘキサマー（Roche Applied Science）、および逆転写酵素キットSuperScript II RNase H（Invitorogen）を用いて逆転写した。V Baseを用いて、制限酵素切断部位、最適なコザック（Kozak）配列、ATG開始部位、および重鎖のシグナル配列の一部を含むフォワード増幅プライマーを設計した。表2に、抗体クローンを得るために用いたフォワード増幅プライマーを挙げる。

（表２）

同じ方法で、3'コード配列、IgG2定常部ドメインの停止コドン

、および制限酵素切断部位を含むプライマーを設計した。

同じ方法で、κ鎖のATG開始部位の周囲に対応するプライマー

を設計した。最適なコザック配列（CCGCCACC）をATG開始部位の5'側に付加した。同プライマーを、抗体クローン13.3.2；8.70.2、および8.90.3の軽鎖をPCRによってクローニングする際に使用した。第2のフォワードプライマー

を用いて、9.1.2の軽鎖をクローニングした。同じ方法で、κ定常部ドメインの停止コドンの周囲に対応するプライマー

を設計した。Platinum Pfx DNAポリメラーゼ（Invitrogen）をプライマー対とともに使用してcDNAを増幅した。PCR産物をpCR-Blunt-II TOPO（Invitrogen）にクローニングし、個々のκ鎖の遺伝子に対応する3〜5個のクローンの配列を、色素ターミネーター配列決定キット、およびABI PRISM 3700 DNA Analyzer（Applied Biosystems Inc）を使用する標準的な手法（例えばプライマーウォーキング）で得た。PCR産物を哺乳類の発現ベクターにクローニングし、またクローンの配列を決定して、体細胞の変異を確認した。各クローンに関して、配列を両鎖について少なくとも3回の反応で検証した。

遺伝子出現頻度（Gene Utilization）の解析
抗体の核酸配列および推定アミノ酸配列から、個々の抗体鎖について遺伝子出現頻度（gene usage）を同定した。表3に、本発明による、選択されたハイブリドーマクローンの遺伝子出現頻度を示す。

（表３）重鎖および軽鎖の遺伝子の出現頻度

重鎖および軽鎖の特定の残基の変異導入を、プライマーを設計することで、またStratagene社のQuickChange Site Directed Mutagenesisキットを使用して、製造業者の指示書に従って行った。変異の存在を自動配列決定によって確認し、変異が導入された挿入物を発現ベクターにサブクローニングした。これらの発現ベクターを、NSO（ECACC # 85110503）、およびHEK-293T細胞（American Type Culture Collection）に導入し、本発明の組換え型の抗体を発現させた。

実施例III
ヒト抗c-Met抗体は、c-Metに対するHGFの結合を阻害する
抗c-Met抗体の存在下におけるHGFとc-Metとの結合を測定するインビトロアッセイ法を実施し、抗c-Met抗体が、c-Metに対するHGFの結合の阻害能力を有するか否かについて、およびその阻害の程度を確認した。

96ウェル組織培養プレートのウェルを、c-Met ECD/Fc（R&D systems #358 MT）（溶媒はリン酸緩衝食塩水（PBS））を含む100μlの5μg/ml溶液で室温で一晩かけて被覆した。このプレートは、実験に必要となるまで4℃で維持した。ウェルを0.05% Tween-20（TBS-T）を含むTris緩衝食塩水（pH=8.0）で4回洗浄した。次に、200μl/ウェルのブロッキング緩衝液（3%ウシ血清アルブミン（BSA）、溶媒はTBS-T）を室温で添加して60分間静置し、非特異的な結合部位をブロッキングした。ウェルを300μl/ウェルのTBS-Tで4回洗浄した。次に、ハイブリドーマ上清に由来する抗c-Met抗体、またはPBSもしくは20 mM酢酸ナトリウム（pH=5.5）、140 mM NaClのいずれかに、さまざまな濃度（例えば、上清中のヒトIgG2濃度を元に10μg/ml、3μg/ml、1μg/ml、0.3μg/ml、0.1μg/ml、0.03μg/ml、および0.01μg/ml）で溶解した精製抗体を含む10% FBSを添加した100μlのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を各ウェルに添加した。抗c-Met抗体は、対照ウェルには添加しなかった。この試料を室温で4時間混合した。次に10μlの100 ng/ml HGF（溶媒は無血清DMEM）を各ウェルに添加した。この試料を室温で15分間混合した。ウェルを300μl/ウェル/洗浄のTBS-Tで4回洗浄した。次に100μlの1:2000希釈率の100μg/ml抗-HGFビオチン化抗体（溶媒はブロッキング緩衝液）を添加した。同溶液をウェル内で、室温で30分間インキュベートした。ウェルを、300μl/ウェルのTBS-Tで5回洗浄した。次に、100μl/ウェルの1.25 mg/mlのストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）（ブロッキング緩衝液で1:5000に希釈）を添加した。同試料を室温で30分間インキュベートした。ウェルをTBS-T、約300μl/ウェル/洗浄で5回洗浄した。次に100μl/ウェルの3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）ペルオキシダーゼ基質（Kirkegaard & Perry Laboratories）を、室温で添加して1〜2分間静置した。反応を停止させるために、100μl/ウェルのTMB停止溶液（Kirkegaard & Perry Laboratories, #50-85-04）を添加した。試料の波長を96ウェルプレートリーダー上によって450ナノメートル（nm）で読み取り、バックグラウンドを差し引くことはしなかった。

これらの実験から、抗c-Met抗体が、対照試料と比較してHGFの結合を阻害することがわかる。リガンド結合アッセイ法（表4）では、抗体13.3.2；9.1.2；8.70.2、および8.90.3に関するリガンド結合の阻害のIC₅₀がわかる。

（表４）

ND:実施せず

実施例IV
抗c-Met抗体によるc-Metのリン酸化の阻害
本発明の抗c-Met抗体を使用して、HGFによる刺激後の細胞内におけるc-Metのリン酸化の阻害を測定した。

A549細胞を、1個のウェル当たり1×10⁵個の細胞密度（総容積として1ウェル当たり、10% FBSを添加した200μLのDMEM）で、96ウェルのU底組織培養処理済みプレート（Falcon、#3077）にプレーティングした。このプレートを、10% CO₂雰囲気下で24時間、37℃でインキュベートした。培地は、プレートの各ウェルから慎重に吸引した。試験対象となるハイブリドーマ上清を微量遠心し（14,000 rpm、5〜10分間）、細胞を200μl/ウェルのハイブリドーマ上清、もしくはこの希釈液で処理し、抗体は、PBSまたは20 mM 酢酸ナトリウム（pH=5.5）、140 mM NaClで精製した。陰性対照ウェルには、無関係のハイブリドーマ上清を添加した。細胞を37℃で短時間（例えば4時間）、または長時間（例えば24時間）インキュベートした後に、無血清DMEM培地またはハンクス緩衝液を溶媒とするHGFの22μl/ウェルの2μg/ml溶液を添加して刺激を加え、最終濃度 44 ng/ウェルのHGFを得た。プレートを37℃で15分間インキュベートした後に、プレートのウェルから溶液を慎重に吸引した。細胞を、1 mM Na₃VO₄を含む冷PBSで洗浄し、プレートから溶液を慎重に吸引した。細胞を、1 mM Na₃VO₄およびプロテアーゼ阻害剤（Complete tablet、Roche #1-873-580；製造業者の指示書を使用）を要時添加した50μlの溶解緩衝液（NP-40溶解緩衝液：150 mM NaCl、20 mM Tris-HCl pH=8.0、1% NP-40、10 mM EDTA、10%グリセロール）に溶解した。プレートを室温で10分間振盪した。次にプレートを、ELISAに必要となるまで-20℃で保存した。

ELISAでc-Metのリン酸化レベルを決定した。ELISA用プレートの調製に関しては、Reacti-Bindヤギ抗ウサギ被覆プレートを、洗浄用緩衝液（TBS-T Sigma #T-9039）で3回洗浄した。次に、100μlのc-Metポリクローナル捕捉抗体（Santa Cruz、sc-10）（溶媒は希釈液（Pierce社の10%のSuperBlock、溶媒TBS-T）（最終濃度5μg/ml））を添加した。プレートを攪拌しながら2時間、室温でインキュベートした後に、TBS-Tで5回洗浄した。非特異的な結合部位は、200μl/ウェルのSuperBlock（溶媒はTBS-T）で、室温で30分間攪拌することでブロッキングした。使用直前に、Reacti-Bindプレートからブロッキング溶液を吸引した。

1 mMのNa₃VO₄を含む100μlの希釈率緩衝液を添加し、溶解液を上下にピペッティングし、ウェルをピペットの先端で掻き取ることで細胞溶解液を調製した。次に、100μl/ウェルの細胞溶解液（希釈率1:3）をReacti-Bindプレートに添加し、同プレートを室温で60分間、攪拌しながらインキュベートした。プレートをTBS-Tで5回洗浄した。次に、100μl/ウェルとなるように、1μg/ml抗ホスホチロシン抗体PY20-HRP（Transduction Labs, #P11625）（溶媒は、1 mM Na₃VO₄を含む3%ウシ血清アルブミン-TBS-T）を添加した。プレートを室温で2時間、攪拌しながらインキュベートした。プレートをTBS-Tで5回洗浄した。洗浄液は吸引して除いた。プレートを、ペーパータオルでブロットして余分な液体を除いた。次に100μl/ウェルのTMBペルオキシダーゼ基質溶液（Kirkegaard & Perry Laboratories, #50-76-04）を添加し、室温で4〜5分間、緩やかに攪拌しながら反応させた。反応は、100μL/ウェルのTMB停止溶液（Kirkegaard & Perry Laboratories, #50-85-04）を添加して停止させた。プレートの波長は、96ウェルプレートリーダーを使用して450 nmで読み取った。

これらの実験から、抗c-Met抗体が、対照細胞と比較して、HGFで刺激された細胞内におけるc-Metのリン酸化を阻害することがわかる。細胞を対象としたホスホチロシンアッセイ法（表4）の結果、抗体13.3.2；9.1.2；8.70.2、および8.90.3に関して、細胞内におけるc-Metのリン酸化における阻害のIC₅₀がわかった（Cellular pTyr Assay）。

実施例V
HGFで刺激された細胞内における抗c-Met抗体によるc-Metの発現抑制
HGFで刺激された細胞において、抗c-Met抗体がc-Met発現レベルに及ぼす阻害作用を測定するアッセイ法を実施した。

A549細胞溶解液は、実施例IVに記載の手順で調製した。c-Metのレベルを決定するために、ELISAを行った。ELISAは、本質的に実施例IVに記載された手順で、また以下の変更を加えて実施した。抗ホスホチロシン抗体を使用する代わりに、100μlのUBI 05-237抗体（腹水）（Anti-Met、ECD、クローンDO24 Upstate Biotechnology、#21601）を3% BSA-TBS-T（1 mM Na₃VO₄を含む）で1:1000に希釈したものを各ウェルに添加した。インキュベーションおよび洗浄段階は、実施例IVに記載された手順と同じ手順で行った。次に、100μl/ウェルの0.8 mg/mlヤギ抗マウスIgG（（H+L）-HRP（Jackson ImmunoResearch Labs, #115-035-146）と結合；750μlの水＋750μlのグリセロールで再調製；これを3% BSA-TBS-Tにより1:5000に希釈）を添加した。プレートを室温で60分間、攪拌しながらインキュベートした。洗浄段階および検出段階は、実施例IVと同じとした。

これらの実験から、c-Metのレベルが、抗c-Met抗体の存在下で、HGFによる刺激を受けた細胞では、HGFで刺激された対照細胞と比較して、ある程度、抑制されることがわかる。（Cellular Met Levels Downregulation、Cellular Met Levelsの表4を参照）。

実施例VI
ソフトアガー中で成長させた細胞に対する抗c-Met抗体の抗増殖作用
ソフトアガー成長アッセイ法を実施して、抗c-Met抗体の抗増殖作用を測定した。

ヒトHGFおよびヒトc-Metを発現するように改変したNIH-3T3細胞であるS114腫瘍細胞を、10%子ウシ血清、1,000単位/mlペニシリン、1,000μg/mlストレプトマイシン、および2 mM L-グルタミンを添加したDMEM（増殖培地）中で維持した。細胞培養物をトリプシン処理し、無血清DMEMで洗浄し、濃度を50,000細胞/mlに調整した。PBSまたは20 mM 酢酸ナトリウム（pH=5.5）、140 mM NaClのいずれかに溶解した精製抗体を、15 ml容のチューブ内に、使用するさまざまな最終濃度の10倍となるように調製した。35 mm径のペトリ皿内で、細胞の成長培地によって希釈した、0.5%（ボトム）および0.35%（トップ）の2種類の寒天層を調製した。ボトム層は、0.5%寒天を含む増殖培地を含む（総体積は2 ml）。トップ層は、0.35%寒天、5,000 S114細胞を含む成長培地を含み、1 ml容量で、最終濃度が0.625〜50μg/mlとなる抗体処理を行い、ボトム寒天層の上面にプレーティングした。この溶液を室温で固化させ、10% CO₂雰囲気下で37℃で一晩インキュベートした。24時間後に0.5 mlの培地を添加し、湿度を維持するために適切な抗体処理を行い、ディッシュを10% CO₂雰囲気下で、37℃で、さらに7〜10日間インキュベートした。培地を除去し、0.5 mlの1 mg/mlのp-ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット（溶媒PBS）と交換して48時間静置した。コロニー数をROBOT（Ludel Electronics, Ltd.）で、ETC3000ソフトウェア（Engineering Technology Center）を用いてカウントした。

これらの実験から、抗c-Met抗体が、ソフトアガー中で成長させた細胞の増殖を阻害したことがわかる。ソフトアガー成長（Soft Agar Growth）実験（表4）からは、抗体13.3.2；9.1.2；8.70.2、および8.90.3に関する、ソフトアガー中における細胞の増殖阻害のIC₅₀がわかる。

実施例VII
抗c-Met抗体による細胞内におけるc-Met依存性の細胞形態学的な変化の阻害
c-Metを発現するHepG2細胞は、基底膜の成分を含む細胞外マトリックス材料であるMATRIGEL（商標）（Becton-Dickinson）内で、HGFの存在下で成長時に管状構造を形成する。HepG2細胞を用いたアッセイ法を実施し、細胞をHGFの存在下で成長させて、抗c-Met抗体で処理した際における、管形成（管腔形成）と、その阻害を測定した。

2 mlの培地-MATRIGEL（商標）溶液（Opti-MEM I（Invitrogen）、10%熱不活性化FBS、2 mM L-グルタミン、および1Xペニシリン/ストレプトマイシンで希釈したMATRIGEL（商標）（Becton-Dickinson））を35 mm径の組織培養プレートにプレーティングした。培地-MATRIGEL（商標）溶液が固化した後に、10%血清および40,000個のHepG2細胞が添加された1 mlの培地を添加した。次に、HGF（最終濃度が50 ng/ml）、および/またはc-Met抗体（最終濃度が1μg/ml、5μg/ml、または10μg/ml）を培地に添加した。この細胞を10% CO₂雰囲気下で、37℃で4日間、成長させた。4日目の終わりに上層の培地を除去し、0.5 mlの1 mg/mlのp-ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット（溶媒PBS）を添加して48時間静置した。染色後の35 mmプレートの写真を撮影し、ImagePro（Media Cybernetics, Silver Spring, MD）で解析した。

これらの実験から、c-Metを発現する細胞をHGFの存在下で成長させた場合に、対照試料と比較して、抗c-Met抗体が、c-Met依存性の管腔形成の変化を阻害することがわかる。表4は、抗体9.1.2；8.70.2、および8.90.3については、1μg/mlの濃度で管腔形成が阻害されることを示す。

実施例VIII
BIACORE（商標）による抗c-Metモノクローナル抗体の親和性定数（K _D ）の決定
精製抗体の結合親和性を、BIACORE（商標） 3000装置（Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ.）を用いて、製造業者のプロトコルに従って表面プラズモン共鳴で決定した。

実験は、BIACORE（商標） 3000装置を使用して、0.0005% Tween-20を含むダルベッコ・リン酸緩衝食塩水中で25℃で行った。タンパク質濃度は、沈降速度実験か、またはアミノ酸配列に基づく理論的な吸光係数を用いて、280 nmにおける試料の波長を測定することで得た。固定された抗原に対する抗体の結合を測定する実験に関しては、220 RU（共鳴単位）のc-Met ECD-Fc（ヒトもしくはカニクイザル）を、B1チップ（BIACORE（商標））上に、標準的な直接アミンカップリング法で固定化した。抗体試料を、13.3.2；8.70.2、および8.90.3については0.69μMに、また9.1.2については0.23μMとなるように調整した。これらの試料を連続的に3倍に希釈して8.5 nMもしくは2.8 nMとし、およそ100倍の濃度範囲を得た。各濃度について、試料を5μl/分の流速で4分間かけて2通りに注入した。解離を2000秒間にわたってモニタリングした。データは、BIACORE（商標）Biavelソフトウェアを用いて、単純な1:1の結合モデルに全体的に適合させた。またk_offが、活性濃度または適合モデルにおける任意の潜在的なエラーに依存しないことを判断するために、解離データを、統合データから、全体的かつ独立に単純な解離モデルに適合させた。いずれの場合においても、この方法でk_offが得られ、統合データおよび解離データの全体的な適合から得られたデータに匹敵することがわかった。

表5は、抗体13.3.2；8.70.2；8.90.3、および9.1.2について得られたK_Dおよびk_offのデータを示す。

（表５）

実施例IX
抗c-Metモノクローナル抗体の親和性定数（K _D ）のフローサイトメトリーによる決定
ヒトA549肺癌細胞およびカニクイザル腎臓細胞の表面で発現させたc-Metに対する精製抗体の結合親和性を、BD（商標） Biosciences LSRフローサイトメーターを用いて、製造業者のプロトコルに従ってフローサイトメトリーによって決定した。

培養して成長させた細胞をPBSで短時間洗浄し、0.25% トリプシン-EDTA（Invitrogen）の存在下でインキュベートし、その後、回収した。回収した細胞を、0.025%アジ化ナトリウムおよび2%熱不活性化血清を含むPBS洗浄用緩衝液で洗浄し、ペレットを得て、5×10⁵個の細胞を500μlの同緩衝液に再懸濁した。各抗体について、各抗体について、結合が室温で平衡に達するまでに必要な時間は、亜飽和濃度の各抗体を細胞とインキュベートすることで、6〜8時間となるように独立に決定した。次に、各抗体の半最大結合（K_D）を、0.1 ng/ml〜3μg/mlの抗体濃度に関する蛍光強度の幾何平均値から決定した。各抗体を、解離状態の細胞とともに室温で6〜8時間、平衡に達するのに必要な時間に応じてインキュベートした。細胞を洗浄し、再懸濁し、500μlの1:500の希釈率のビオチン化マウス抗ヒトIgG（Jackson Labs）（溶媒はPBS洗浄用緩衝液）で、氷上で45分間インキュベートした。次に細胞を洗浄し、再懸濁し、10μg/mlストレプトアビジンR-フィコエリトリンコンジュゲート（Caltag）（溶媒は200μlのPBS洗浄用緩衝液）で、氷上で15分間、遮光条件でインキュベートした。細胞を洗浄し、シグナルを、BD Biosciences LSRフローサイトメトリーで、製造業者のプロトコルに従って検出した。

これらの実験から、上述の抗c-Met抗体のそれぞれが、細胞表面で発現されるヒトおよびカニクイザルのc-Metと同等の親和性で結合することがわかる（表6参照）。

（表６）

実施例X
インビボにおける抗c-Met抗体による腫瘍成長の阻害
インビボアッセイ法を行い、抗c-Met抗体による処理後における固形腫瘍の腫瘍成長阻害を測定した。

S114、U87（ヒト膠芽腫細胞）、GTL-16（ヒト胃癌細胞）、およびA549（ヒト肺癌上皮細胞）を、10%熱不活性化FBS（Invitrogen）、2 mM L-グルタミン（Invitrogen）、および1%（体積/体積）ペニシリン（1,000単位/ml）-ストレプトマイシン（1,000μg/ml）を添加したDMEM（Invitrogen）中で、37℃/10% CO₂組織培養インキュベーター内で維持した。腫瘍細胞を有する胸腺欠損（nu/nu）マウスに接種する際は、0.25%トリプシン（溶媒は1 mM EDTA）を用いて、腫瘍細胞を組織培養フラスコから除去した。細胞数をカウントし、ハンクス緩衝食塩水溶液で希釈した。最終容量が0.2 mlのハンクス緩衝食塩水溶液中の1.0〜5.0×10⁶個の腫瘍細胞を使用して、腫瘍細胞を各対象個体の皮下に接種した。腫瘍が100〜200 mm³の大きさに達した時点（S114およびU87腫瘍の場合は接種後5日目、A549腫瘍の場合は約15〜20日、またGTL-16腫瘍の場合は約6日）で、200μlの抗体溶液を注入した。抗体は、20 mM 酢酸ナトリウム、pH 5.5、140 mM 塩化ナトリウム中に保存し、滅菌済みのリン酸緩衝食塩水で所望の抗体濃度に希釈した。100μgまたは200μgの抗体を、個々の実験対象動物の腹腔内（IP）に注入した。対照個体には溶媒液を投与した。マウスの体内の腫瘍の大きさの測定を、キャリパーを用いて、抗体溶液IP投与後の2〜3日毎に、実験終了時まで行った。

これらの実験から、全ての抗c-Met抗体が、対照動物と比較して、固形腫瘍の成長をインビボで阻害することがわかる。また、さまざまな濃度の抗体を用いて、抗体13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3、および13.3.2L-A91T, H-E42K, S97T（表7参照）による腫瘍成長阻害のパーセントを決定した。表7にまとめた実験では、全ての抗体を単回腹腔内投与によって投与した。ただし、A549腫瘍を有する動物を対象とした41日間の実験では抗体を4回投与し、またGTL-16腫瘍保持個体を対象とした21日間の実験では抗体を2回投与した。使用した用量は、S114腫瘍には200μg、U87腫瘍には100μg、A549腫瘍には200μg、またGTL-16腫瘍には200μgとした。括弧内の値は、U87モデルにおける13.3.2の200μg用量に対応する。「ND」は、実験を行わなかったことを意味する。

（表７）

実施例XI
抗c-Met抗体によるアゴニスト活性
HGF刺激の非存在下における抗c-Met抗体によるc-Metの活性化
HGFの非存在下における、抗c-Met抗体とインキュベートした細胞中におけるc-Metの活性化を測定して、本発明のc-Met抗体のアゴニスト活性を決定した。c-Metのリン酸化を測定することで、細胞中でc-Metが活性化されるか否かをELISAで判定した。0.01〜10μg/mlの抗体を、実施例IVに記載された手順でプレーティングしたA549細胞に添加した（HGFで刺激されなかった細胞は除く）。A549細胞の溶解液は、実施例IVに記載された手順で調製した。ELISAは、実施例IVに記載された手順で実施した。

これらの実験から、検討した抗体のうち3種類が、HGFの非存在下で、抗c-Met抗体またはHGFとインキュベートしなかった細胞と比較して約2〜3倍の弱いc-Metの活性化を示すことがわかる（表4参照）。しかし、抗体9.1.2については、高い倍率の活性化が認められた。

HGFの非存在下で抗c-Met抗体で処理した細胞のc-Met依存性の細胞形態学的な変化
管腔形成アッセイ法で、抗c-Met抗体のアゴニスト活性を測定した。このアッセイ法は、実施例VIIに記載された手順で実施した。ただし細胞は、HGFの非存在下で成長させ、抗c-Met抗体（1μg/ml、10μg/ml、および50μg/ml）で処理した。管腔形成の量は、実施例VIIに記載された手順で決定した。アッセイ法の結果から、検討した3種類の抗c-Met抗体が、弱い〜中程度のアゴニスト活性を有することがわかる。表4には、抗体9.1.2；8.70.2、および8.90.3について、管腔形成によって測定されたアゴニスト活性の量を示す。

実施例XII
インビボにおける抗c-Met抗体によるc-Metリン酸化の阻害、およびc-Metの分解の誘導
本発明者らは、抗c-Met抗体が、インビボでc-Metのリン酸化状態およびタンパク質レベルに作用することを確認した。ヒト腫瘍細胞を、文献（V.A. Pollack et al., 「Inhibition of epidermal growth factor receptor-associated tyrosine phosphorylation in human carcinomas with CP 358,774: Dynamics of receptor inhibition in situ and antitumor effects in athymic mice」、 J. Pharmacol. Exp. Ther. 291: 739-748 (1999)）に記載された方法に従って、胸腺を欠くマウスに導入し、異種移植片腫瘍の形成を誘導した。

U87ヒト膠芽腫細胞（5×10⁶）を、3〜4週齢の無胸腺（nu/nu）マウスの皮下に注入し、続いて本発明の抗c-Met抗体を、樹立した腫瘍（約 300 mm³）を有するマウスの腹腔内に注入した。腫瘍を、抗体注射後の、さまざまな時点（1時間、3時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、168時間、および216時間）で摘出し、c-Metのリン酸化およびタンパク質レベルを評価するためにホモジネート（1 ml溶解緩衝液/100 mg腫瘍重量）を調製した。2ミリグラムのタンパク質を含む溶解液を、c-Metに特異的な、25μlのsc-10アガロースビーズ（Santa Cruz）を用いて、4℃で2時間かけて免疫沈殿させた。ビーズを洗浄し、結合状態のタンパク質をLaemmli試料緩衝液で5分間煮沸することで溶出し、4〜12%の勾配Novex（商標）ゲルを用いたSDS-PAGEで分離した。次に、免疫捕捉されたタンパク質を、0.45μMのPVDF膜 （Invitrogen）に電気的にブロットした。この膜を、3% BSA（溶媒はPBS-T（0.5% Tween 20））で、室温で1時間かけてブロッキング処理し、抗ホスホチロシン特異的抗体PY100（Cell Signaling Technology）でプローブ処理し、続いて抗マウスIgG-HRPで処理して、ホスホMetまたはsc-10-HRP（Invitrogen）を検出して、総Metタンパク質を検出した。シグナルを、ECL試薬（Amersham Biosciences）を用いて現像し、X線フィルム（Kodak）を露光させて検出した。

図5は、経時的な血清中の13.3.2L-A91T, H-E42K, S97T抗体のレベル、ホスホc-Metレベル、および全c-Metタンパク質レベルを示す。この実験から、ホスホc-Metおよび総c-Metタンパク質レベルの減少が抗体と相関すること、またc-Metの阻害の規模が、抗体の血清濃度に用量比例的であることことがわかる。

実施例XIII
エピトープマッピング試験
ELISAフォーマットによる競合実験を実施し、本発明の抗体によって認識されるエピトープのクラスを決定した。

96ウェルプレートのウェルを、50μl/ウェルのヒトMet ECD-Fc（溶媒は0.1 M NaHCO₃緩衝液、pH 9.6）の0.5μg/ml保存液で、4℃で一晩、または37℃で2時間被覆した。プレートをPBS、0.05% Tween-20（PBS-T）で洗浄し、200μl/ウェルのブロッキング緩衝液（0.5% BSA、0.1% Tween-20、および0.01%チメロサールを含むPBS）で、室温で1時間ブロッキング処理した。洗浄後に、さまざまな濃度（15μg/ml、5μg/ml、1.7μg/ml、および0.6μg/ml）の100μlの抗体（溶媒はブロッキング緩衝液）を添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。次に、100μlの83 pg/ml溶液のビオチン化抗体（約4個のビオチン/分子）（溶媒はブロッキング緩衝液）を添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。洗浄後にストレプトアビジン-HRPを添加し、プレートを室温で15分間インキュベートした。結合は、100μl/ウェルの未希釈TMBペルオキシダーゼ溶液（BioFX Labs）の添加後の発色を指標とした。100μl/ウェルの未希釈停止溶液（BioFX Labs）を添加して発色を終了させ、OD_{450 nm}を測定して定量を行った。

これらの実験から、モノクローナル抗体13.3.2、13.3.2L-A91T, H-E42K, S97T、8.70.2、および8.90.3が、c-Met細胞外ドメイン上の共通のエピトープ（bin 1）と結合すること、またモノクローナル抗体9.1.2が、別のエピトープ（bin 2）と結合することがわかる。

本明細書に引用された、全ての出版物および特許出願は、あたかも、個々の出版物または特許出願が、特異的かつ個別に、参照により本明細書に組み入れられることが示されたように、参照により本明細書に組み入れられる。前述の発明は、理解を促すことを目的として、説明および実施例によって、ある程度詳細に説明したが、当業者には、本発明の手法に鑑みて、趣旨または添付の特許請求項の範囲から解離することなく、特定の変更および修正が可能なことが容易に明らかになると思われる。

抗c-Met抗体が、単離されたc-Met ECD/Fcタンパク質に対するリガンド結合を阻害すること、また細胞内で、HGFによる刺激後にc-Metのリン酸化を阻害することを示す。図1Aは、本発明の抗c-Metモノクローナル抗体によってリガンド結合が阻害されることを示すグラフを示す。抗c-Metモノクローナル抗体13.3.2L-A91T, H-E42K, S97T、および13.3.2は、c-Met受容体と結合して、HGF結合を阻害する。図1Bは、c-Metのリン酸化ELISAで阻害されることを示すグラフを示す。抗c-Metモノクローナル抗体13.3.2L-A91T, H-E42K, S97T、および13.3.2は、c-Metのリン酸化ELISAによって測定されるように、細胞内で、HGFによる刺激後にc-Metのチロシンリン酸化を阻害する。 抗c-Metモノクローナル抗体特異性を示すグラフを示す。抗-IGF-1Rモノクローナル抗体2.13.2および2.12.1はIGF-1Rと結合し、IGF-1の処理後にIGF-1Rのチロシンリン酸化を低下を引き起す。抗c-Met抗体9.1.2および13.3.2は、高濃度の抗体であってもIGF-IRと結合せず、またIGF-1Rのチロシンリン酸化の低下を引き起さない。 対応するヒト遺伝子の生殖系列のアミノ酸配列と比較した場合の、4種類の抗c-Met抗体に由来する軽鎖および重鎖の可変部ドメインの推定アミノ酸配列の配列アライメントである。抗体配列と生殖系列の配列間の差は、抗体配列に影を付けて示されている。各アライメント上で下線を付した配列は、左から右に向かって、生殖系列のシグナルペプチド、CDR1、CDR2、およびCDR3の配列を示す。図3Aは、生殖系列L5V_κ1、J_κ4配列（SEQ ID NO：17）に対する、抗体13.3.2（X₈がアラニンであるSEQ ID NO：4）、および抗体13.3.2L-A91T（X₈がスレオニンであるSEQ ID NO：4）バリアントの軽鎖の推定アミノ酸配列のアライメントを示す。図3Bは、生殖系列A27V_κ3、J_κ2配列（SEQ ID NO：18）に対する、抗体9.1.2の軽鎖の推定アミノ酸配列（SEQ ID NO：8）のアライメントを示す。図3Cは、生殖系列L5V_κ1、J_κ3配列（SEQ ID NO：19）に対する、抗体8.70.2の軽鎖の推定アミノ酸配列（SEQ ID NO：12）のアライメントを示す。図3Dは、生殖系列L5V_κ1、J_κ1 配列（SEQ ID NO：20）に対する、抗体8.90.3の軽鎖の推定アミノ酸配列（SEQ ID NO：16）のアライメントを示す。図3Eは、生殖系列のV_H 1-18, D2-15, J_H4bの配列（SEQ ID NO：21）に対する、抗体13.3.2（X₂がグルタミン酸であり、X₄がセリンであり、かつX₆がアラニンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-E42K（X₂がリシンであり、X₄がセリンであり、かつX₆がアラニンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-E42K, S97T（X₂がリシンであり、X₄がスレオニンであり、かつX₆がアラニンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-A14P（X₂がグルタミン酸であり、X₄がセリンであり、かつX₆がプロリンであるSEQ ID NO：2）；13.3.2H-A14P, E42K（X₂がリシンであり、X₄がセリンであり、かつX₆がプロリンであるSEQ ID NO：2）；および13.3.2H-A14P, E42K, S97T（X₂がリシンであり、X₄がスレオニンであり、かつX₆がプロリンであるSEQ ID NO：2）の重鎖の推定アミノ酸配列のアライメントを示す。図3Fは、生殖系列のV_H 4-31, D2-2, D7-27, J_H6bの配列（SEQ ID NO：22）に対する、抗体9.1.2の重鎖の推定アミノ酸配列（SEQ ID NO：6）のアライメントを示す。図3Gは、生殖系列のV_H 4-39, D2-2, J_H4bの配列（SEQ ID NO：23）に対する、抗体8.70.2の重鎖の推定アミノ酸配列（SEQ ID NO：10）のアライメントを示す。図3Hは、生殖系列のV_H 3-48, 4-17, J_H4bの配列（SEQ ID NO：24）に対する、抗体8.90.3の重鎖の推定アミノ酸配列（SEQ ID NO：14）のアライメントを示す。 抗c-Met抗体がインビボで腫瘍成長を阻害することを示す。X軸に示した矢印は、投与された抗c-Met抗体の用量を示す。図4Aは、抗c-Met抗体が3T3-S114腫瘍の成長を阻害することを示す実験結果を示す。図4Bは、抗c-Met抗体がU87腫瘍の成長を阻害することを示す実験結果を示す。図4Cは、抗c-Met抗体がA549腫瘍の成長を阻害することを示す実験結果を示す。図4Dは、抗c-Met抗体がGTL-16腫瘍の成長を阻害することを示す実験結果を示す。図4Eは、抗c-Met抗体13.3.2L-A91T, H-E42K, S97Tが、U87腫瘍の成長を用量依存的に阻害することを示す実験結果を示す。 抗c-Met抗体13.3.2L-A91T, H-E42K, S97Tの血清レベルと、c-Met活性の阻害の間に関連があることを示す。図5はまた、U87腫瘍では抗c-Met抗体13.3.2L-A91T, H-E42K, S97Tの血清レベルとc-Metの発現抑制の間に関係があることも示す。 4種類の抗c-Met抗体の完全長の重鎖および軽鎖のヌクレオチド、ならびに推定アミノ酸配列を示す。重鎖または軽鎖の各配列のシグナルペプチドは、下線を付した下付き文字で示す。重鎖および軽鎖の各配列のCDR1、CDR2、およびCDR3の配列は、下線を付した上付き文字で示す。各配列の可変部ドメインは上付き文字で示す。各配列の定常部ドメインは下付き文字で示す。図6Aは、13.3.2の重鎖DNA配列（SEQ ID NO：1）を示す。図6Bは、13.3.2の重鎖タンパク質配列（SEQ ID NO：2）を示す。図6Cは、13.3.2の軽鎖（κ）DNA配列（SEQ ID NO：3）を示す。図6Dは、13.3.2の軽鎖（κ）タンパク質配列（SEQ ID NO：4）を示す。図6Eは、9.1.2の重鎖DNA配列（SEQ ID NO：5）を示す。図6Fは、9.1.2の重鎖タンパク質配列（SEQ ID NO：6）を示す。図6Gは、9.1.2の軽鎖（κ）DNA配列（SEQ ID NO：7）を示す。図6Hは、9.1.2の軽鎖（κ）タンパク質配列（SEQ ID NO：8）を示す。図6Iは、8.70.2の重鎖DNA配列（SEQ ID NO：9）を示す。図6Jは、8.70.2の重鎖タンパク質配列（SEQ ID NO：10）を示す。図6Kは、8.70.2の軽鎖（κ）DNA配列（SEQ ID NO：11）を示す。図6Lは、8.70.2の軽鎖（κ）タンパク質配列（SEQ ID NO：12）を示す。図6Mは、8.90.3の重鎖DNA配列（SEQ ID NO：13）を示す。図6Nは、8.90.3の重鎖タンパク質配列（SEQ ID NO：14）を示す。図6Oは、8.90.3の軽鎖（κ）DNA配列（SEQ ID NO：15）を示す。図6Pは、8.90.3の軽鎖（κ）タンパク質配列（SEQ ID NO：16）を示す。

Claims (31)

1. c-Metと特異的に結合するヒトモノクローナル抗体、またはこの抗原結合部分。
2. 抗体または抗体の一部が、以下に挙げる特性の少なくとも1つを有する、請求項1記載のヒトモノクローナル抗体または抗原結合部分：
   （a）ヒト細胞と結合すること；
   （b）インスリン様成長因子1受容体に対する選択性より少なくとも100倍大きいc-Metに対する選択性を有すること；
   （c）2.0×10^-7 Mまたはそれ以下のK_Dでc-Metと結合すること；
   （d）c-Metに対して1.0×10^{-3 s-1}またはこれより小さい解離速度定数（k_off）を有すること；
   （e）ヒトHGFの存在下でヒトc-Metと結合すること。
3. 抗体または抗体の一部が、2.0×10^-7 Mもしくはそれ以下のK_Dでc-Metと結合し、かつHGFとc-Metとの結合を阻害する、請求項2記載のヒトモノクローナル抗体または抗体の一部。
4. 抗体または抗体の一部が、以下からなる群より選択される少なくとも1つの特性を有する、ヒトc-Metと特異的に結合して阻害する、ヒト化されたキメラ抗体、またはヒトモノクローナル抗体もしくはこれらの抗原結合部分：
   （a）c-Metとの結合をめぐって、13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3；13.3.2H-E42K；13.3.2H-E42K, S97T；13.3.2L-A91T；および13.3.2L-A91T, H-E42K；13.3.2L-A91T, H-E42K, S97Tからなる群より選択される抗体と交差競合すること；
   （b）c-Metとの結合をめぐって、13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3；13.3.2H-E42K；13.3.2H-E42K, S97T；13.3.2L-A91T；および13.3.2L-A91T, H-E42K；13.3.2L-A91T, H-E42Kからなる群より選択される抗体と競合すること；
   （c）13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3；13.3.2H-E42K；13.3.2H-E42K, S97T；13.3.2L-A91T；13.3.2L-A91T, H-E42K；および13.3.2L-A91T, H-E42Kからなる群より選択される抗体と同様に、c-Metの同じエピトープと結合すること；
   （d）13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3；13.3.2H-E42K；13.3.2H-E42K, S97T；13.3.2L-A91T；13.3.2L-A91T, H-E42K；および13.3.2L-A91T, H-E42K, S97Tからなる群より選択される抗体と実質的に同じK_Dでc-Metと結合すること；ならびに
   （e）13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3；13.3.2H-E42K；13.3.2H-E42K, S97T；13.3.2L-A91T；13.3.2L-A91T, H-E42K；および13.3.2L-A91T, H-E42Kからなる群より選択される抗体と、実質的に同じ解離速度定数でc-Metと結合すること。
5. 以下を含む、c-Metと特異的に結合するモノクローナル抗体：
   （a）X₂がリシンであり、かつX₄がスレオニンである、シグナル配列を含まないSEQ ID NO：2で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；および
   （b）シグナル配列を含まないSEQ ID NO：4で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖（X₈がスレオニン）。
6. 以下からなる群より選択される、c-Metと特異的に結合するモノクローナル抗体：
   （a）シグナル配列を含まない、X₂がグルタミン酸であり、かつX₄がセリンであるSEQ ID NO：2で表されるアミノ酸配列を有する重鎖、およびX₈がアラニンであるSEQ ID NO：4で表されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体；
   （b）シグナル配列を含まない、SEQ ID NO：6で表されるアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、およびSEQ ID NO：8で表されるアミノ酸配列を有する軽鎖；
   （c）シグナル配列を含まない、SEQ ID NO：10で表されるアミノ酸配列を有する重鎖、およびSEQ ID NO：12で表されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体；ならびに
   （d）シグナル配列を含まない、SEQ ID NO：14で表されるアミノ酸配列を有する重鎖、およびSEQ ID NO：16で表されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体。
7. 以下を含む、請求項1記載のヒトモノクローナル抗体または抗原結合部分：
   （a）モノクローナル抗体13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3；13.3.2H-E42K；および13.3.2H-E42K, S97Tからなる群より選択される抗体の重鎖から独立に選択される重鎖のCDR1、CDR2、およびCDR3；または
   （b）モノクローナル抗体13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3；13.3.2L-A91Tからなる群より選択される抗体の軽鎖から独立に選択される軽鎖のCDR1、CDR2、およびCDR3。
8. ヒトのV_H 4-31の遺伝子、ヒトのV_H 4-39の遺伝子、ヒトのV_H 3-7の遺伝子、ヒトのV_H 1-18の遺伝子、またはヒトのV_H 3-33の遺伝子を用いる重鎖を含む、請求項1記載のヒトモノクローナル抗体または抗原結合部分。
9. ヒトのV_K L5の遺伝子またはヒトのV_K A27の遺伝子を用いる軽鎖を含む、請求項8記載のヒトモノクローナル抗体またはこの抗原結合部分。
10. V_LドメインおよびV_Hドメインが、13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3；13.3.2H-E42K；13.3.2H-E42K, S97T；および13.3.2L-A91TのV_LドメインおよびV_Hドメインとアミノ酸配列において、それぞれと少なくとも90%同一である、請求項1記載のヒトモノクローナル抗体。
11. 以下である、c-Metと特異的に結合するモノクローナル抗体またはこの抗原結合部分：
    （a）重鎖が、13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3；13.3.2H-E42K；13.3.2H-E42K, S97T；および13.3.2H-S97Tからなる群より選択される抗体の重鎖のCDR1、CDR2、およびCDR3のアミノ酸配列を含み；
    （b）軽鎖が、13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3；13.3.2L-A91Tからなる群より選択される抗体の軽鎖のCDR1、CDR2、およびCDR3のアミノ酸配列を含み；
    （c）抗体が、（a）の重鎖と（b）の軽鎖を含み；または
    （d）重鎖および軽鎖のCDRのアミノ酸配列が、13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3；13.3.2H-E42K；13.3.2H-E42K, S97T；13.3.2H-S97T；および13.3.2L-A91Tからなる群より選択される同じ抗体から選択される、（c）の抗体。
12. 請求項11記載のヒトモノクローナル抗体または抗体の一部分であって：
    （a）いずれもシグナル配列を含まない、重鎖が、13.3.2（X₂がグルタミン酸であり、かつX₄がセリンであるSEQ ID NO：2）；9.1.2（SEQ ID NO：6）；8.70.2（SEQ ID NO：10）；8.90.3（SEQ ID NO：14）；13.3.2H-E42K；13.3.2H-S97T；13.3.2H-E42K, S97Tからなる群より選択される抗体の重鎖の可変部ドメインのアミノ酸配列を含み；
    （b）いずれもシグナル配列を含まない、軽鎖が、13.3.2（X₈がアラニンであるSEQ ID NO：4）；9.1.2（SEQ ID NO：8）；8.70.2（SEQ ID NO：12）；8.90.3（SEQ ID NO：16）；13.3.2L-A91Tからなる群より選択される抗体の軽鎖の可変部ドメインのアミノ酸配列を含み；
    （c）抗体もしくは抗体の一部分が、両方の可変部ドメインを含み；または
    （d）いずれもシグナル配列を含まない、抗体もしくは抗体の一部分が、13.3.2（X₂がグルタミン酸であり、かつX₄がセリンであるSEQ ID NO：2、およびX₈がアラニンであるSEQ ID NO：4）；9.1.2（SEQ ID NO：6および8）；8.70.2（SEQ ID NO：10および12）；8.90.3（SEQ ID NO：14および16）；13.3.2H-E42K；13.3.2H-S97T；13.3.2H-E42K, S97T；ならびに13.3.2L-A91Tからなる群より選択される同じ抗体に由来する可変部ドメインの配列を含む、ヒトモノクローナル抗体または抗体の一部分。
13. 以下からなる群より選択される、c-Metと特異的に結合する、請求項1記載のヒトモノクローナル抗体：
    （a）X₈がスレオニンであるSEQ ID NO：4、およびX₂がリシンであり、X₄がセリンであるSEQ ID NO：2で表されるアミノ酸配列を含む抗体；
    （b）X₈がスレオニンであるSEQ ID NO：4、およびX₄がスレオニンであり、X₂がリシンであるSEQ ID NO：2で表されるアミノ酸配列を含む抗体；
    （c）X₈がスレオニンであるSEQ ID NO：4、およびX₂がグルタミン酸であり、X₄がセリンである、SEQ ID NO：2で表されるアミノ酸配列を含む抗体；
    （d）X₈がアラニンであるSEQ ID NO：4、およびX₂がグルタミン酸であり、X₄がスレオニンであるSEQ ID NO：2で表されるアミノ酸配列を含む抗体；
    （e）X₈がアラニンであるSEQ ID NO：4、およびX₂がリシンであり、X₄がセリンであるSEQ ID NO：2で表されるアミノ酸配列を含む抗体；ならびに
    （f）いずれもシグナル配列を含まない、X₈がアラニンであるSEQ ID NO：4、およびX₂がリシンであり、X₄がスレオニンであるSEQ ID NO：2で表されるアミノ酸配列を含む抗体。
14. 請求項1〜13のいずれか一項記載の抗体または抗原結合部分、および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
15. 請求項1〜13のいずれか一項記載の抗体もしくは抗原結合部分、または請求項14記載の薬学的組成物を治療対象に投与する段階を含み、抗体または抗体の一部分がc-Metを阻害する、治療を必要とする対象の過増殖障害を治療する方法。
16. 請求項1〜13のいずれか一項記載の抗体もしくは抗原結合部分、または請求項14記載の薬学的組成物を治療対象に投与する段階を含み、抗体、抗原結合部分、または薬学的組成物がc-Metを活性化する、治療を必要とする対象の創傷治癒もしくは組織再生を促す方法。
17. 請求項1〜13のいずれか一項記載の抗体もしくは抗原結合部分、または該抗体もしくは該部分の重鎖または軽鎖を産生する、単離された細胞系列。
18. 請求項1〜13のいずれか一項記載の抗体の重鎖もしくはこの抗原結合部分、または軽鎖もしくはこの抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
19. 核酸分子に機能的に連結させた発現制御配列を任意で含む、請求項18記載の核酸分子を含むベクター。
20. 請求項19記載のベクター、または請求項18記載の核酸分子を含む宿主細胞。
21. 請求項20記載の宿主細胞、または請求項17記載の細胞系列を適切な条件で培養する段階、および抗体または抗原結合部分を回収する段階を含む、抗c-Met抗体またはこの抗原結合部分を作製する方法。
22. 請求項18記載の核酸を含む非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物であって、該核酸を発現する非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物。
23. 請求項22記載の非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物から抗体を単離する段階を含む、ヒトc-Metと特異的に結合する抗体またはこの抗原結合部分を単離する方法。
24. 以下の段階を含む、c-Metと特異的に結合する抗体またはこの抗原結合部分で、治療を必要とする対象を治療する方法：
    （a）重鎖もしくはこの抗原結合部分をコードする、単離された核酸分子、軽鎖もしくはこの抗原結合部分をコードする単離された核酸分子、または軽鎖および重鎖、もしくはこれらの抗原結合部分をコードする核酸分子の両方の有効量を投与する段階；ならびに
    （b）核酸分子を発現させる段階。
25. 以下の段階を含む、c-Metと特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を作製する方法：
    （a）ヒト抗体を産生可能な非ヒトトランスジェニック動物を、c-Met、c-Metの免疫原性部分、またはc-Metを発現する細胞もしくは組織によって免疫化する段階；
    （b）トランスジェニック動物がc-Metに対する免疫応答を惹起可能とする段階；ならびに
    （c）トランスジェニック動物からBリンパ球を単離する段階。
26. 請求項25記載の方法で作製された、単離された抗体。
27. 請求項1〜13のいずれか一項記載の抗体または抗原結合部分を細胞に接触させる段階を含む、c-Metを発現する細胞に対するHGFの結合を阻害する方法。
28. 請求項1〜13のいずれか一項記載の抗体または抗原結合部分を単球に接触させる段階を含む、単球増殖を阻害する方法。
29. 以下からなる群より選択される、請求項1記載の抗体または抗原結合部分：
    （a）シグナル配列を含まない、抗体13.3.2H-E42Kの重鎖のアミノ酸配列、およびX₈がアラニンであるSEQ ID NO：4で表される軽鎖のアミノ酸配列を含む抗体；
    （b）シグナル配列を含まない、抗体13.3.2H-E42K, S97Tの重鎖のアミノ酸配列、およびX₈がアラニンであるSEQ ID NO：4で表される軽鎖のアミノ酸配列を含む抗体；
    （c）シグナル配列を含まない、X₂がグルタミン酸であり、かつX₄がセリンである、SEQ ID NO：2のアミノ酸配列、および抗体13.3.2L-A91Tの軽鎖のアミノ酸配列を含む抗体；
    （d）シグナル配列を含まない、抗体13.3.2H-E42Kの重鎖のアミノ酸配列、および抗体13.3.2L-A91Tの軽鎖のアミノ酸配列を含む抗体；ならびに
    （e）シグナル配列を含まない、抗体13.3.2H-E42K, S97Tの重鎖のアミノ酸配列、および抗体13.3.2L-A91Tの軽鎖のアミノ酸配列を含む抗体。
30. 0抗体13.3.2；9.1.2；8.70.2；8.90.3；13.3.2H-E42K；13.3.2H-E42K, S97T；および13.3.2L-A91Tからなる群より選択される抗体のFR1、FR2、FR3、またはFR4のアミノ酸配列の1つもしくは複数を含む、c-Metと特異的に結合するモノクローナル抗体、またはこの抗原結合部分。
31. 以下を含む、請求項1記載のヒトモノクローナル抗体：
    （a）シグナル配列を含まない、モノクローナル抗体13.3.2、9.1.2、8.70.2、もしくは8.90.3の重鎖のアミノ酸配列と少なくとも90%が同一である重鎖のアミノ酸配列；
    （b）シグナル配列を含まない、モノクローナル抗体13.3.2、9.1.2、8.70.2、もしくは8.90.3の軽鎖のアミノ酸配列と少なくとも90%が同一である軽鎖のアミノ酸配列；または
    （c）（a）および（b）の両方。

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