JP2012509881A - ｃ−Ｍｅｔ抗体 - Google Patents

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Abstract

ｃ−Ｍｅｔに結合し、ｃ−Ｍｅｔの活性を阻害し、且つ病原がｃ−Ｍｅｔにより媒介される癌、及び他の疾患、障害、又は状態の治療に有効である、モノクローナル抗体、その抗原結合断片、及び前述の組み合わせを提供する。

Description

本発明は、ｃ−Ｍｅｔに結合する抗体と、病原がこの受容体により媒介される状態及び障害の治療における前記抗体の使用とに関する。
チロシンキナーゼスーパーファミリーの一員であるｃ−Ｍｅｔは、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の受容体である。ＨＧＦがｃ−Ｍｅｔに結合すると、受容体の二量体化又は多量体化、細胞内領域の複数のチロシン残基のリン酸化、触媒活性化、及び下流のシグナル伝達が導かれる。また、ｃ−Ｍｅｔは、受容体の過剰発現、増幅、及び突然変異を含む、リガンド非依存性機構を介しても活性化される。ｃ−Ｍｅｔの活性化は、細胞の増殖、遊走、形態形成、生存（アポトーシスからの保護を含む）、及びプロテアーゼ合成、浸潤細胞の表現型、並びに癌患者における臨床転帰不良及び薬剤耐性に関連する特徴を増強する。ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路は、ヒトの癌で最も調節不全になることの多い経路の１つであり、実質的に全ての種類の固形腫瘍で生じる。
特許文献１は、マウス、及びＣＤＲ移植ヒト化ｃ−Ｍｅｔ抗体について開示している。特許文献１に開示されているマウス抗体２２４Ｇ１１は、ｃ−ＭｅｔのＳｅｍａドメインに結合しなかった。ｈ２２４Ｇ１１Ｍａｂと命名されたこのマウス抗体のヒト化ＩｇＧ１誘導体の更なる機能的特性は、非特許文献１及び２に報告されている。非特許文献１及び２は、二価ｈ２２４Ｇ１１Ｍａｂは、固有のアゴニスト特性を欠き、ｃ−Ｍｅｔのフルアンタゴニストとして挙動し、ｃ−Ｍｅｔの二量体化を大きく減少させることを開示している。マウス２２４Ｇ１１は、インビボでｃ−Ｍｅｔをダウンレギュレートし、ｃ−Ｍｅｔのリン酸化をブロックすることが報告されている。他の受容体の場合、二量体化は、受容体の内部移行及び分解の必須条件である。非特許文献１及び２は、ｃ−Ｍｅｔの内部移行に関するデータを開示していない。更に、ｃ−Ｍｅｔ内におけるヒト化抗体が結合するエピトープは同定されていない。
特許文献２もｃ−Ｍｅｔ抗体について開示しているが、抗体が結合するエピトープ（単数又は複数）は同定していない。エピトープマッピング例が記載されているが、報告された結果は、６種のｃ−Ｍｅｔ抗体が共通のエピトープに結合するが、７番目のｃ−Ｍｅｔは異なるエピトープに結合することを単に示すものである。これらｃ−Ｍｅｔ抗体が結合する具体的なエピトープは、記載されていない。
国際特許公開第０９／００７４２７号パンフレット 国際特許公開第０５／０１６３８２号パンフレット
要旨番号８３５及びそれに付随するポスター、米国癌学会大会（コロラド州デンバー）、２００９年４月（インビトロデータ） 要旨番号２７９２及びそれに付随するポスター、米国癌学会大会（コロラド州デンバー）、２００９年４月（インビボデータ）
ヒトｃ−Ｍｅｔに対するアンタゴニスト抗体であって、前記抗体がヒトｃ−Ｍｅｔのα鎖に結合すると、ＨＧＦの存在下及び／又は非存在下において、細胞表面から受容体が内部移行するのを促進する抗体が必要とされている。また、ヒトｃ−Ｍｅｔに対するアンタゴニスト抗体であって、前記抗体がヒトｃ−Ｍｅｔのα鎖に結合すると、機能獲得型突然変異を有するｃ−Ｍｅｔ変異体を含む細胞において細胞表面から受容体が内部移行するのを促進する抗体も必要とされている。また、ｃ−Ｍｅｔの分解及びリン酸化ｃ−Ｍｅｔの減少を誘導するヒトｃ−Ｍｅｔに対するアンタゴニスト抗体も必要とされている。かかるアンタゴニスト活性は、腫瘍細胞表面上におけるＨＧＦが利用可能な結合部位の数を減少させ、且つｃ−Ｍｅｔの過剰発現、増幅、又は突然変異により引き起こされる経路の活性化を終結させることができた。同時に、かかるアンタゴニスト抗体は、ＨＧＦのｃ−Ｍｅｔへの結合及びＨＧＦ誘導性ｃ−Ｍｅｔ活性化を阻害し、且つ殆ど又は全くアゴニスト活性自体を誘導しないはずである。
本発明の抗体化合物は、これらの要求を満たす。前記抗体化合物は、ヒトｃ−ＭｅｔのＳｅｍａドメインのα鎖のエピトープに結合して、ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合及び受容体の活性化を阻害するが、アゴニスト活性は殆ど又は全く誘導しない。また、本発明の抗体は、ＨＧＦの存在下又は非存在下において、また機能獲得型突然変異を有するｃ−Ｍｅｔ変異体を含む細胞において、受容体の内部移行を誘導する。前記抗体は、ｃ−Ｍｅｔの分解を誘導し、リン酸化ヒトｃ−Ｍｅｔの減少を誘導し、この受容体を発現する腫瘍細胞のＨＧＦ依存性及びＨＧＦ非依存性増殖を阻害する。これらの特性を鑑み、これら抗体化合物は、種々の異なる機序を介してｃ−Ｍｅｔにより媒介される癌の治療において治療上有用であるはずである。
更に、本抗体化合物は、多数の他の所望の特性を有する。前記抗体化合物は、ｃ−Ｍｅｔに対して高い親和性（ＫＤ）を示し、ＨＧＦが媒介するｃ−Ｍｅｔのリン酸化及び下流のシグナル伝達、細胞増殖、並びに細胞遊走をブロックし；ｃ−Ｍｅｔのリン酸化を弱くしか誘導せず、更に腫瘍細胞の増殖、運動性、浸潤、管形成、血管新生、又は抗アポトーシス作用の誘導等のＨＧＦ様生物学的アゴニスト活性を殆ど又は全く誘導しない。前記抗体化合物は、リガンド（ＨＧＦ）依存性及びリガンド非依存性ｃ−Ｍｅｔ経路活性化の両方を阻害する。更に、本発明の抗体化合物は、近縁関係にある受容体ＲＯＮ及びプレキシンＡ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に比べて、ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤに優先的に結合し、ｃ−ＭｅｔのＥＣＤの「脱落（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）」を引き起こさない。
したがって、本発明は、以下を提供する：
ａ）ヒトｃ−Ｍｅｔのα鎖内のエピトープに結合し、
ｂ）細胞表面のヒトｃ−Ｍｅｔの内部移行を誘導する、
モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
前記抗体又はその抗原結合断片が、細胞表面のヒトｃ−Ｍｅｔの肝細胞成長因子非依存性内部移行を誘導する、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。好ましい実施形態では、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖及び重鎖を含み、前記軽鎖は、配列番号２８のアミノ酸配列を含み、前記重鎖は、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖及び重鎖を含み、前記軽鎖は、配列番号２９のアミノ酸配列を含み、前記重鎖は、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。
機能獲得型突然変異を有するヒトｃ−Ｍｅｔ変異体を含む細胞におけるヒトｃ−Ｍｅｔの内部移行を誘導する、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。前記機能獲得型突然変異は、ｃ−Ｍｅｔキナーゼドメインの突然変異Ｍ１１４９Ｔ、又は膜近傍ドメインの突然変異Ｒ９８８Ｃであり得る。
前記抗体又はその抗原結合断片が、細胞における細胞表面のヒトｃ−Ｍｅｔの内部移行を少なくとも４０％誘導する、前述の抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。前記抗体又はその抗原結合断片が、細胞における細胞表面のヒトｃ−Ｍｅｔの内部移行を少なくとも４５％誘導する、前述の抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。前記抗体又はその抗原結合断片が、細胞における細胞表面のヒトｃ−Ｍｅｔの内部移行を少なくとも５０％誘導する、前述の抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。前記抗体又はその抗原結合断片が、細胞における細胞表面のヒトｃ−Ｍｅｔの内部移行を少なくとも５５％誘導する、前述の抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。前記抗体又はその抗原結合断片が、細胞における細胞表面のヒトｃ−Ｍｅｔの内部移行を少なくとも６０％誘導する、前述の抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。前記抗体又はその抗原結合断片が、細胞におけるヒトｃ−Ｍｅｔの内部移行を少なくとも６５％誘導する、前述の抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。前記抗体又はその抗原結合断片が、細胞における細胞表面のヒトｃ−Ｍｅｔの内部移行を少なくとも７０％誘導する、前述の抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
肝細胞成長因子非依存性腫瘍細胞において全ｃ−Ｍｅｔの減少を誘導する、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。好ましい実施形態では、肝細胞成長因子非依存性腫瘍細胞において全ｃ−Ｍｅｔの減少を誘導する前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖及び重鎖を含み、前記軽鎖は、配列番号２８のアミノ酸配列を含み、前記重鎖は、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、肝細胞成長因子非依存性腫瘍細胞において全ｃ−Ｍｅｔの減少を誘導する前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖及び重鎖を含み、前記軽鎖は、配列番号２９のアミノ酸配列を含み、前記重鎖は、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。
肝細胞成長因子非依存性腫瘍細胞においてリン酸化ｃ−Ｍｅｔの減少を誘導する前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
配列番号２８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号４０に示されるアミノ酸配列を有する重鎖とを含む抗体と実質的に同じエピトープでヒトｃ−Ｍｅｔのα鎖に結合する、又は配列番号２９に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号４１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖とを含む抗体と実質的に同じエピトープでヒトｃ−Ｍｅｔのα鎖に結合する前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖とを含むモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を除く、前記エピトープが、包括的に、１４４ＨＶＦＰＨＮＨＴＡＤＩＱＳ１５６（配列番号８２）内の１以上のアミノ酸残基を含む、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
前記エピトープが、包括的に、１２３ＤＴＹＹＤＤ１２８（配列番号８１）内の１以上のアミノ酸残基を更に含む、前述の抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
前記エピトープが、包括的に、１９２ＦＩＮＦ１９５（配列番号８３）内の１以上のアミノ酸残基を更に含む、前述の抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
前記エピトープが、包括的に、２２０ＫＥＴＫＤＧＦＭ２２７（配列番号８４）内の１以上のアミノ酸残基を更に含む、前述の抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
前記抗体が、包括的に、
ａ）１２１ＶＶＤＴＹＹＤＤＱＬ１３０（配列番号７７）、
ｂ）１３１ＩＳＣＧＳＶＮＲＧＴＣＱＲＨＶＦＰＨＮＨＴＡＤＩＱＳ１５６（配列番号７８）、
ｃ）１７９ＡＬＧＡＫＶＬＳＳＶＫＤＲＦＩＮＦ１９５（配列番号７９）、及び
ｄ）２１６ＶＲＲＬＫＥＴＫＤＧＦＭ２２７（配列番号８０）
から成る群から選択されるアミノ酸配列内で結合する、前述の抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
前記抗体が、包括的に、
ａ）１２３ＤＴＹＹＤＤ１２８（配列番号８１）、
ｂ）１４４ＨＶＦＰＨＮＨＴＡＤＩＱＳ１５６（配列番号８２）、
ｃ）１９２ＦＩＮＦ１９５（配列番号８３）、及び
ｄ）２２０ＫＥＴＫＤＧＦＭ２２７（配列番号８４）
から成る群から選択されるアミノ酸配列内で結合する、前述の抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
包括的に、１２１ＶＶＤＴＹＹＤＤＱＬ１３０（配列番号７７）、１３１ＩＳＣＧＳＶＮＲＧＴＣＱＲＨＶＦＰＨＮＨＴＡＤＩＱＳ１５６（配列番号７８）、１７９ＡＬＧＡＫＶＬＳＳＶＫＤＲＦＩＮＦ１９５（配列番号７９）、及び２１６ＶＲＲＬＫＥＴＫＤＧＦＭ２２７（配列番号８０）を特徴とするエピトープ内のアミノ酸配列に結合する、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
包括的に、１２３ＤＴＹＹＤＤ１２８（配列番号８１）、１４４ＨＶＦＰＨＮＨＴＡＤＩＱＳ１５６（配列番号８２）、１９２ＦＩＮＦ１９５（配列番号８３）、及び２２０ＫＥＴＫＤＧＦＭ２２７（配列番号８４）を特徴とするエピトープ内のアミノ酸配列に結合する、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
包括的に、９５ＣＦＰＣＱＤＣＳＳＫＡ１０５（配列番号８６）のアミノ酸配列内で結合する、前述の抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
配列番号２９に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号４１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖とを含むモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を除く、前記エピトープが、包括的に、９５ＣＦＰＣＱＤＣＳＳＫＡ１０５（配列番号８６）の１以上のアミノ酸残基を含む、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
ヒトｃ−Ｍｅｔと結合し、３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）と、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）とを含むモノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって、
前記３つのＬＣＤＲ及び前記３つのＨＣＤＲが、
ａ）アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＩＳＳＴＮＬＨ（配列番号４９）を含むＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＧＴＳＸ１ＬＸ２Ｓ（配列番号８７）（配列中、Ｘ１はＹ又はＲであり、且つＸ２はＡ又はＲである）を含むＬＣＤＲ２、
アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＹＰＹＳ（配列番号５１）を含むＬＣＤＲ３、
アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＲＹＩＨ（配列番号５９）を含むＨＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＷＩＹＰＶＴＧＤＴＹＹＸ７ＥＸ８ＦＫＧ（配列番号９０）（配列中、Ｘ７はＮ、Ｉ、又はＲであり、且つＸ８はＫ又はＰである）を含むＨＣＤＲ２、及び
アミノ酸配列ＧＹＧＡＦＸ９Ｙ（配列番号９１）（配列中、Ｘ９はＹ又はＦである）を含むＨＣＤＲ３、並びに
ｂ）アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＶＸ３ＳＩＹＬＨ（配列番号８８）（配列中、Ｘ３はＳ又はＲである）を含むＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５４）を含むＬＣＤＲ２、
アミノ酸配列Ｘ４Ｘ５ＹＸ６ＧＹＰＬＴ（配列番号８９）（配列中、Ｘ４はＩ又はＱであり、Ｘ５はＱ又はＶであり、且つＸ６はＳ又はＲである）を含むＬＣＤＲ３、
アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号６５）を含むＨＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＲＶＮＰＸ１０ＲＸ１１Ｘ１２ＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号９２）（配列中、Ｘ１０はＮ又はＹであり、Ｘ１１はＧ又はＲであり、且つＸ１２はＧ又はＳである）を含むＨＣＤＲ２、及び
アミノ酸配列Ｘ１３ＮＸ１４ＬＤＹ（配列番号９３）（配列中、Ｘ１３はＴ又はＡであり、且つＸ１４はＷ又はＩである）を含むＨＣＤＲ３、
から成る群から選択され、
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片が、前記ヒトｃ−Ｍｅｔのα鎖内のエピトープに結合し、且つ細胞表面のヒトｃ−Ｍｅｔの内部移行を誘導する、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
ヒトｃ−Ｍｅｔと結合し、３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）と、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）とを含むモノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって、
前記抗体が、３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）と、前記３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）とを含み、
ＬＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＩＳＳＴＮＬＨ（配列番号４９）を含み、
ＬＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＧＴＳＸ１ＬＸ２Ｓ（配列番号８７）（配列中、Ｘ１はＹ又はＲであり、且つＸ２はＡ又はＲである）を含み、
ＬＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＹＰＹＳ（配列番号５１）を含み、
ＨＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＲＹＩＨ（配列番号５９）を含み、
ＨＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＷＩＹＰＶＴＧＤＴＹＹＸ７ＥＸ８ＦＫＧ（配列番号９０）（配列中、Ｘ７はＮ、Ｉ、又はＲであり、且つＸ８はＫ又はＰである）を含み、
ＨＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＧＹＧＡＦＸ９Ｙ（配列番号９１）（配列中、Ｘ９はＹ又はＦである）を含む、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
ヒトｃ−Ｍｅｔと結合し、３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）と、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）とを含むモノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって、
ＬＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＶＸ３ＳＩＹＬＨ（配列番号８８）（配列中、Ｘ３はＳ又はＲである）を含み、
ＬＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５４）を含み、
ＬＣＤＲ３が、アミノ酸配列Ｘ４Ｘ５ＹＸ６ＧＹＰＬＴ（配列番号８９）（配列中、Ｘ４はＩ又はＱであり、Ｘ５はＱ又はＶであり、且つＸ６はＳ又はＲである）を含み、
ＨＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号６５）を含み、
ＨＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＲＶＮＰＸ１０ＲＸ１１Ｘ１２ＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号９２）（配列中、Ｘ１０はＮ又はＹであり、Ｘ１１はＧ又はＲであり、且つＸ１２はＧ又はＳである）を含み、
ＨＣＤＲ３が、アミノ酸配列Ｘ１３ＮＸ１４ＬＤＹ（配列番号９３）（配列中、Ｘ１３はＴ又はＡであり、且つＸ１４はＷ又はＩである）を含む、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
ヒトｃ−Ｍｅｔと結合し、３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）と、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）とを含むモノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって、
前記３つのＬＣＤＲ及び前記３つのＨＣＤＲが、
ａ）アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＩＳＳＴＮＬＨ（配列番号４９）を含むＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＧＴＳＹＬＡＳ（配列番号５０）を含むＬＣＤＲ２、
アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＹＰＹＳ（配列番号５１）を含むＬＣＤＲ３、
アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＲＹＩＨ（配列番号５９）を含むＨＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＷＩＹＰＶＴＧＤＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号６０）を含むＨＣＤＲ２、及び
アミノ酸配列ＧＹＧＡＦＹＹ（配列番号６１）を含むＨＣＤＲ３、
ｂ）アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＩＳＳＴＮＬＨ（配列番号４９）を含むＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＧＴＳＹＬＡＳ（配列番号５０）を含むＬＣＤＲ２、
アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＹＰＹＳ（配列番号５１）を含むＬＣＤＲ３、
アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＲＹＩＨ（配列番号５９）を含むＨＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＷＩＹＰＶＴＧＤＴＹＹＩＥＫＦＫＧ（配列番号６２）を含むＨＣＤＲ２、及び
アミノ酸配列ＧＹＧＡＦＦＹ（配列番号６３）を含むＨＣＤＲ３、
ｃ）アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＩＳＳＴＮＬＨ（配列番号４９）を含むＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＧＴＳＲＬＲＳ（配列番号５２）を含むＬＣＤＲ２、
アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＹＰＹＳ（配列番号５１）を含むＬＣＤＲ３、
アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＲＹＩＨ（配列番号５９）を含むＨＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＷＩＹＰＶＴＧＤＴＹＹＲＥＰＦＫＧ（配列番号６４）を含むＨＣＤＲ２、及び
アミノ酸配列ＧＹＧＡＦＹＹ（配列番号６１）を含むＨＣＤＲ３、
ｄ）アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号５３）を含むＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５４）を含むＬＣＤＲ２、
アミノ酸配列ＩＱＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号５５）を含むＬＣＤＲ３、
アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号６５）を含むＨＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＲＶＮＰＮＲＧＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号６６）を含むＨＣＤＲ２、及び
アミノ酸配列ＴＮＷＬＤＹ（配列番号６７）を含むＨＣＤＲ３、
ｅ）アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号５３）を含むＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５４）を含むＬＣＤＲ２、
アミノ酸配列ＱＶＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号５６）を含むＬＣＤＲ３、
アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号６５）を含むＨＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＲＶＮＰＮＲＲＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号６８）を含むＨＣＤＲ２、及び
アミノ酸配列ＡＮＷＬＤＹ（配列番号６９）を含むＨＣＤＲ３、並びに
ｆ）アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＶＲＳＩＹＬＨ（配列番号５７）を含むＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５４）を含むＬＣＤＲ２、
アミノ酸配列ＱＶＹＲＧＹＰＬＴ（配列番号５８）を含むＬＣＤＲ３、
アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号６５）を含むＨＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＲＶＮＰＹＲＧＳＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号７０）を含むＨＣＤＲ２、及び
アミノ酸配列ＡＮＩＬＤＹ（配列番号７１）を含むＨＣＤＲ３
から成る群から選択され、
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片が、前記ヒトｃ−Ｍｅｔのα鎖内のエピトープに結合し、且つ細胞表面のヒトｃ−Ｍｅｔの内部移行を誘導する、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）と、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）とを含み、前記３つのＬＣＤＲ及び前記３つのＨＣＤＲが、
ａ）アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＩＳＳＴＮＬＨ（配列番号４９）を含むＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＧＴＳＹＬＡＳ（配列番号５０）を含むＬＣＤＲ２、
アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＹＰＹＳ（配列番号５１）を含むＬＣＤＲ３、
アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＲＹＩＨ（配列番号５９）を含むＨＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＷＩＹＰＶＴＧＤＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号６０）を含むＨＣＤＲ２、及び
アミノ酸配列ＧＹＧＡＦＹＹ（配列番号６１）を含むＨＣＤＲ３、
ｂ）アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＩＳＳＴＮＬＨ（配列番号４９）を含むＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＧＴＳＹＬＡＳ（配列番号５０）を含むＬＣＤＲ２、
アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＹＰＹＳ（配列番号５１）を含むＬＣＤＲ３、
アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＲＹＩＨ（配列番号５９）を含むＨＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＷＩＹＰＶＴＧＤＴＹＹＩＥＫＦＫＧ（配列番号６２）を含むＨＣＤＲ２、及び
アミノ酸配列ＧＹＧＡＦＦＹ（配列番号６３）を含むＨＣＤＲ３、並びに
ｃ）アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＩＳＳＴＮＬＨ（配列番号４９）を含むＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＧＴＳＲＬＲＳ（配列番号５２）を含むＬＣＤＲ２、
アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＹＰＹＳ（配列番号５１）を含むＬＣＤＲ３、
アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＲＹＩＨ（配列番号５９）を含むＨＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＷＩＹＰＶＴＧＤＴＹＹＲＥＰＦＫＧ（配列番号６４）を含むＨＣＤＲ２、及び
アミノ酸配列ＧＹＧＡＦＹＹ（配列番号６１）を含むＨＣＤＲ３
から成る群から選択される、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）と、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）とを含み、前記３つのＬＣＤＲ及び前記３つのＨＣＤＲが、
ａ）アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号５３）を含むＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５４）を含むＬＣＤＲ２、
アミノ酸配列ＩＱＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号５５）を含むＬＣＤＲ３、
アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号６５）を含むＨＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＲＶＮＰＮＲＧＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号６６）を含むＨＣＤＲ２、及び
アミノ酸配列ＴＮＷＬＤＹ（配列番号６７）を含むＨＣＤＲ３、
ｂ）アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号５３）を含むＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５４）を含むＬＣＤＲ２、
アミノ酸配列ＱＶＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号５６）を含むＬＣＤＲ３、
アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号６５）を含むＨＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＲＶＮＰＮＲＲＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号６８）を含むＨＣＤＲ２、及び
アミノ酸配列ＡＮＷＬＤＹ（配列番号６９）を含むＨＣＤＲ３、並びに
ｃ）アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＶＲＳＩＹＬＨ（配列番号５７）を含むＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５４）を含むＬＣＤＲ２、
アミノ酸配列ＱＶＹＲＧＹＰＬＴ（配列番号５８）を含むＬＣＤＲ３、
アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号６５）を含むＨＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＲＶＮＰＹＲＧＳＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号７０）を含むＨＣＤＲ２、及び
アミノ酸配列ＡＮＩＬＤＹ（配列番号７１）を含むＨＣＤＲ３
から成る群から選択される、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）と、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）とを含み、
ＬＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号５３）を含み、
ＬＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５４）を含み、
ＬＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＩＱＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号５５）を含み、
ＨＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号６５）を含み、
ＨＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＲＶＮＰＮＲＧＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号６６）を含み、
ＨＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＴＮＷＬＤＹ（配列番号６７）を含む、前述のモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）と、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）とを含み、
ＬＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号５３）を含み、
ＬＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５４）を含み、
ＬＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＱＶＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号５６）を含み、
ＨＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号６５）を含み、
ＨＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＲＶＮＰＮＲＲＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号６８）を含み、
ＨＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＡＮＷＬＤＹ（配列番号６９）を含む、前述のモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）とを含むモノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって、前記ＬＣＶＲ及び前記ＨＣＶＲが、それぞれ、
ａ）配列番号９４及び配列番号９６、並びに
ｂ）配列番号９５及び配列番号９７、
から成る群から選択されるアミノ酸配列を含み、
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片が、前記ヒトｃ−Ｍｅｔのα鎖内のエピトープと結合し、且つ細胞表面のヒトｃ−Ｍｅｔの内部移行を誘導する、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）とを含み、前記ＬＣＶＲが配列番号９４を含み、且つ前記ＨＣＶＲが配列番号９６を含む、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）とを含み、前記ＬＣＶＲが配列番号９５を含み、且つ前記ＨＣＶＲが配列番号９７を含む、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
前記ＬＣＶＲ及び前記ＨＣＶＲが、
ａ）ＬＣＶＲが配列番号１であり、且つＨＣＶＲが配列番号１３である、
ｂ）ＬＣＶＲが配列番号２であり、且つＨＣＶＲが配列番号１４である、
ｃ）ＬＣＶＲが配列番号３であり、且つＨＣＶＲが配列番号１５である、
ｄ）ＬＣＶＲが配列番号４であり、且つＨＣＶＲが配列番号１６である、
ｅ）ＬＣＶＲが配列番号５であり、且つＨＣＶＲが配列番号１７である、及び
ｆ）ＬＣＶＲが配列番号６であり、且つＨＣＶＲが配列番号１８である、
から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
前記ＬＣＶＲ及び前記ＨＣＶＲが、それぞれ、
ａ）ＬＣＶＲが配列番号１であり、且つＨＣＶＲが配列番号１３である、
ｂ）ＬＣＶＲが配列番号２であり、且つＨＣＶＲが配列番号１４である、及び
ｃ）ＬＣＶＲが配列番号３であり、且つＨＣＶＲが配列番号１５である、
から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
前記ＬＣＶＲ及び前記ＨＣＶＲが、それぞれ、
ａ）ＬＣＶＲが配列番号４であり、且つＨＣＶＲが配列番号１６である、
ｂ）ＬＣＶＲが配列番号５であり、且つＨＣＶＲが配列番号１７である、及び
ｃ）ＬＣＶＲが配列番号６であり、且つＨＣＶＲが配列番号１８である、
から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
前記ＬＣＶＲが配列番号４のアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＶＲが配列番号１６のアミノ酸配列を含む、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
前記ＬＣＶＲが配列番号５のアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＶＲが配列番号１７のアミノ酸配列を含む、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
前記抗体が、軽鎖と重鎖とを含み、前記軽鎖及び重鎖が、
ａ）軽鎖が配列番号２５であり、且つ重鎖が配列番号３７である、
ｂ）軽鎖が配列番号２６であり、且つ重鎖が配列番号３８である、
ｃ）軽鎖が配列番号２７であり、且つ重鎖が配列番号３９である、
ｄ）軽鎖が配列番号２８であり、且つ重鎖が配列番号４０である、
ｅ）軽鎖が配列番号２９であり、且つ重鎖が配列番号４１である、及び
ｆ）軽鎖が配列番号３０であり、且つ重鎖が配列番号４２である、
から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、前述のモノクローナル抗体のいずれか１つ。
前記抗体が、軽鎖と重鎖とを含み、前記軽鎖及び重鎖が、
ａ）軽鎖が配列番号２５であり、且つ重鎖が配列番号３７である、
ｂ）軽鎖が配列番号２６であり、且つ重鎖が配列番号３８である、
ｃ）軽鎖が配列番号２７であり、且つ重鎖が配列番号３９である、
から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、前述のモノクローナル抗体のいずれか１つ。
前記抗体が、軽鎖と重鎖とを含み、前記軽鎖及び重鎖が、
ａ）軽鎖が配列番号２８であり、且つ重鎖が配列番号４０である、
ｂ）軽鎖が配列番号２９であり、且つ重鎖が配列番号４１である、及び
ｃ）軽鎖が配列番号３０であり、且つ重鎖が配列番号４２である、
から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、前述のモノクローナル抗体のいずれか１つ。
前記軽鎖が配列番号２８のアミノ酸配列を含み、且つ前記重鎖が配列番号４０のアミノ酸配列を含む、前述のモノクローナル抗体のいずれか１つ。
前記軽鎖が配列番号２９のアミノ酸配列を含み、且つ前記重鎖が配列番号４１のアミノ酸配列を含む、前述のモノクローナル抗体のいずれか１つ。
前記抗体が、２本の軽鎖と２本の重鎖とを含み、各軽鎖が配列番号２８のアミノ酸配列を含み、各重鎖が配列番号４０のアミノ酸配列を含む、前述のモノクローナル抗体のいずれか１つ。
前記抗体が、２本の軽鎖と２本の重鎖とを含み、各軽鎖が配列番号２９のアミノ酸配列を含み、各重鎖が配列番号４１のアミノ酸配列を含む、前述のモノクローナル抗体のいずれか１つ。
ｃ−Ｍｅｔに対する結合について、前述のｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片のいずれか１つと競合する、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。かかる競合モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、前述のｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つと同じｃ−Ｍｅｔのエピトープに結合することができる。好ましい実施形態では、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖と重鎖とを含み、前記軽鎖が配列番号２８のアミノ酸配列を含み、前記重鎖が配列番号４０のアミノ酸配列を含む抗体と競合する。別の好ましい実施形態では、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖と重鎖とを含み、前記軽鎖が配列番号２９のアミノ酸配列を含み、前記重鎖が配列番号４１のアミノ酸配列を含む抗体と競合する。
前記ヒトｃ−Ｍｅｔを恒常的に過剰発現する肝細胞成長因子非依存性腫瘍細胞における全ヒトｃ−Ｍｅｔ及びリン酸化ヒトｃ−Ｍｅｔの減少を誘導する、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。好ましい実施形態では、前記ヒトｃ−Ｍｅｔを恒常的に過剰発現する肝細胞成長因子非依存性腫瘍細胞における全ヒトｃ−Ｍｅｔ及びリン酸化ヒトｃ−Ｍｅｔの減少を誘導する前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖と重鎖とを含み、前記軽鎖は配列番号２８のアミノ酸配列を含み、前記重鎖は配列番号４０のアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、前記ヒトｃ−Ｍｅｔを恒常的に過剰発現する肝細胞成長因子非依存性腫瘍細胞における全ヒトｃ−Ｍｅｔ及びリン酸化ヒトｃ−Ｍｅｔの減少を誘導する前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖と重鎖とを含み、前記軽鎖は配列番号２９のアミノ酸配列を含み、前記重鎖は配列番号４１のアミノ酸配列を含む。
前記ヒトｃ−Ｍｅｔを恒常的にリン酸化する肝細胞成長因子非依存性腫瘍細胞における全ヒトｃ−Ｍｅｔ及びリン酸化ヒトｃ−Ｍｅｔの減少を誘導する前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。好ましい実施形態では、前記ヒトｃ−Ｍｅｔを恒常的にリン酸化する肝細胞成長因子非依存性腫瘍細胞における全ヒトｃ−Ｍｅｔ及びリン酸化ヒトｃ−Ｍｅｔの減少を誘導する前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖と重鎖とを含み、前記軽鎖が配列番号２８のアミノ酸配列を含み、前記重鎖が配列番号４０のアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、前記ヒトｃ−Ｍｅｔを恒常的にリン酸化する肝細胞成長因子非依存性腫瘍細胞における全ヒトｃ−Ｍｅｔ及びリン酸化ヒトｃ−Ｍｅｔの減少を誘導する前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖と重鎖とを含み、前記軽鎖が配列番号２９のアミノ酸配列を含み、前記重鎖が配列番号４１のアミノ酸配列を含む。
肝細胞成長因子応答性である肝細胞成長因子非依存性腫瘍細胞における全ヒトｃ−Ｍｅｔ及びリン酸化ヒトｃ−Ｍｅｔの減少を誘導する、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
ヒトＲＯＮ細胞外ドメイン又はヒトプレキシンＡ２細胞外ドメインに比べて、ヒトｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメインに優先的に結合する、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
ヒトｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメインの脱落を誘導しない、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。好ましい実施形態では、ヒトｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメインの脱落を誘導しない前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖と重鎖とを含み、前記軽鎖は配列番号２８のアミノ酸配列を含み、前記重鎖は配列番号４０のアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、ヒトｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメインの脱落を誘導しない前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖と重鎖とを含み、前記軽鎖は配列番号２９のアミノ酸配列を含み、前記重鎖は配列番号４１のアミノ酸配列を含む。
ヒトｃ−Ｍｅｔを発現する腫瘍細胞をスタウロスポリン誘導アポトーシスから保護しない、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。好ましい実施形態では、ヒトｃ−Ｍｅｔを発現する腫瘍細胞をスタウロスポリン誘導アポトーシスから保護しない、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖と重鎖とを含み、前記軽鎖が配列番号２８のアミノ酸配列を含み、前記重鎖が配列番号４０のアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、ヒトｃ−Ｍｅｔを発現する腫瘍細胞をスタウロスポリン誘導アポトーシスから保護しない、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖と重鎖とを含み、前記軽鎖が配列番号２９のアミノ酸配列を含み、前記重鎖が配列番号４１のアミノ酸配列を含む。
ヒトｃ−Ｍｅｔを発現する腫瘍細胞の肝細胞成長因子依存性及び肝細胞成長因子依存性増殖を阻害する、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
ヒト肝細胞成長因子のヒトｃ−Ｍｅｔに対する結合を阻害する、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。
ＨＧＦ様生物学的アゴニスト活性を誘導しない、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。ＨＧＦ様生物学的アゴニスト活性としては、腫瘍細胞の増殖、腫瘍細胞の運動性、腫瘍細胞の浸潤、管形成、血管新生、及び抗アポトーシス作用が挙げられる。好ましい実施形態では、ＨＧＦ様生物学的アゴニスト活性を誘導しない前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖と重鎖とを含み、前記軽鎖は配列番号２９のアミノ酸配列を含み、前記重鎖は配列番号４１のアミノ酸配列を含む。
前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つと、薬学的に許容できる担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む、医薬組成物。
治療で用いるための、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。好ましい実施形態では、治療で用いるための前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖と重鎖とを含み、前記軽鎖は配列番号２８のアミノ酸配列を含み、前記重鎖は配列番号４０のアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、治療で用いるための前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖と重鎖とを含み、前記軽鎖は配列番号２９のアミノ酸配列を含み、前記重鎖は配列番号４１のアミノ酸配列を含む。
ヒトの癌の治療で用いるための、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。好ましい実施形態では、ヒトの癌の治療で用いるための前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖と重鎖とを含み、前記軽鎖は配列番号２８のアミノ酸配列を含み、前記重鎖は配列番号４０のアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、ヒトの癌の治療で用いるための前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖と重鎖とを含み、前記軽鎖は配列番号２９のアミノ酸配列を含み、前記重鎖は配列番号４１のアミノ酸配列を含む。
別の治療剤と併用してヒトの癌の治療で用いるための、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ。好ましい実施形態では、別の治療剤と併用してヒトの癌の治療で用いるための前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖と重鎖とを含み、前記軽鎖は配列番号２８のアミノ酸配列を含み、前記重鎖は配列番号４０のアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、別の治療剤と併用してヒトの癌の治療で用いるための前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖と重鎖とを含み、前記軽鎖は配列番号２９のアミノ酸配列を含み、前記重鎖は配列番号４１のアミノ酸配列を含む。
前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つと、薬学的に許容できる担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む、医薬組成物。
ヒトの癌を治療する医薬を製造するための、前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つの使用。
癌を治療する方法であって、前記治療を必要としているヒト患者に、有効量の前述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つを投与することを含む方法。
定義
自然界に存在するとき完全長抗体は、ジスルフィド結合により相互に連結されている２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖とを含む免疫グロブリン分子である。各鎖のアミノ末端部は、可変領域内に含まれる相補性決定領域（ＣＤＲ）を介して抗原認識に主に関与する、約１００〜１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部は、エフェクタ機能に主に関与する定常領域を画定する。
ＣＤＲには、フレームワーク領域（「ＦＲ」）と呼ばれる、より保存されている領域が散在している。各軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）及び重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順にアミノ末端からカルボキシ末端に配置されている、３つのＣＤＲと４つのＦＲとから構成される。軽鎖の３つのＣＤＲは、「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３」と呼ばれ、重鎖の３つのＣＤＲは、「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３」と呼ばれる。ＣＤＲは、抗原と特異的相互作用を形成する残基の大部分を含む。ＬＣＶＲ及びＨＣＶＲ領域内のＣＤＲアミノ酸残基の番号付け及び位置付けは、周知のＫａｂａｔ番号付け規則に従う。
軽鎖は、カッパ鎖又はラムダ鎖に分類され、当該技術分野において既知である特定の定常領域を特徴とする。重鎖は、ガンマ鎖、ミュー鎖、アルファ鎖、デルタ鎖、又はイプシロン鎖に分類され、抗体のアイソトープをそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥと定義する。ＩｇＧ抗体は、更にサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に分類することができる。各種重鎖は、当該技術分野において周知である配列を有する特定の定常領域を特徴とする。
本明細書で使用するとき、本抗体化合物に適用される「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）という用語は、例えば、任意の真核生物、原核生物、又はファージクローンを含む単一コピー又は単一クローンに由来する抗体を指し、生成される方法は限定されない。本発明のＭａｂは、均質又は実質的に均質な集団中に存在することが好ましい。完全Ｍａｂは、２本の重鎖と２本の軽鎖とを含む。かかるモノクローナル抗体の「抗原結合断片」としては、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単鎖Ｆｖ断片、及び１本の軽鎖と１本の重鎖とを含む単腕抗体が挙げられる。本発明のモノクローナル抗体及びその抗原結合断片は、例えば、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術、例えばＣＤＲ移植、若しくはかかる技術の組み合わせ、又は当該技術分野において既知である他の技術により生成され得る。
「抗体化合物」とは、本明細書に開示されるＭａｂ及びＦａｂを指す。本発明に係る類似の機能特性を示す更なる抗体化合物を、従来の方法により作製することができる。例えば、マウスをヒトｃ−Ｍｅｔ又はその断片で免疫し得、得られる抗体を回収及び精製し得、前記抗体が本明細書に開示される抗体化合物と類似の又は同じ結合特性及び機能特性を有しているかどうかを、以下の実施例２〜１９に開示される方法により評価し得る。また、抗原結合断片は、従来の方法により調製することができる。抗体及び抗原結合断片を生成及び精製する方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８年）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，第５〜８、及び１５章，ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３１４−２に見出すことができる。
「ヒト改変抗体」という語句は、本明細書に開示される抗体に類似する本発明に係る結合特性及び機能特性を有し、且つ非ヒト抗体に由来するＣＤＲを取り囲む実質的にヒト又は完全にヒトのフレームワーク領域を有する、本明細書に開示される抗体化合物に加えて、モノクローナル抗体及び抗原結合断片を指す。「フレームワーク領域」又は「フレームワーク配列」は、フレームワーク領域１〜４のいずれか１つを指す。本発明に包含されるヒト改変抗体及び抗原結合断片は、フレームワーク領域１〜４のうちいずれか１つ以上が、実質的に又は完全にヒト由来である、即ち、個々の実質的に又は完全にヒトのフレームワーク領域１〜４の任意の可能な組み合わせが存在する分子を含む。例えば、これは、フレームワーク領域１及びフレームワーク領域２、フレームワーク領域１及びフレームワーク領域３、フレームワーク領域１、２、及び３等が実質的に又は完全にヒト由来である分子を含む。実質的にヒトのフレームワークは、既知のヒト生殖系フレームワーク配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有するフレームワークである。好ましくは、実質的にヒトのフレームワークは、既知のヒト生殖系フレームワーク配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、又は約９９％の配列同一性を有する。
完全にヒトのフレームワークは、既知のヒト生殖系フレームワーク配列と同一のフレームワークである。ヒト生殖系フレームワーク配列は、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）から前記企業のウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒを通じて、又はＴｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ＦａｃｔｓＢｏｏｋ，Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ及びＧｅｒａｒｄ Ｌｅｆｒａｎｃ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２００１年，ＩＳＢＮ ０１２４４１３５１から入手することができる。例えば、生殖系軽鎖フレームワークは、Ａｌ１、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２０、Ａ２７、Ａ３０、ＬＩ、Ｌ１Ｉ、Ｌ１２、Ｌ２、Ｌ５、Ｌ１５、Ｌ６、Ｌ８、Ｏ１２、Ｏ２、及びＯ８から成る群から選択することができ、生殖系重鎖フレームワーク領域は、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−７２、ＶＨＩ−４６、ＶＨ３−９、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−３１、ＶＨＩ−１８、ＶＨＩ−６９、ＶＩ−１３−７、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−４８、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、及びＶＨ５−５Ｉから成る群から選択することができる。
本発明に係る類似の機能特性を示す本明細書に開示される抗体に加えて、ヒト改変抗体は、幾つかの異なる方法を用いて作製することができる。１つのアプローチでは、親抗体化合物のＣＤＲを、親抗体化合物のフレームワークと高い配列同一性を有するヒトフレームワークに移植する。新規フレームワークの配列同一性は、一般に、親抗体化合物の対応するフレームワークの配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％同一である。１００個未満のアミノ酸残基を有するフレームワークの場合、１個、２個、又は３個のアミノ酸残基を変化させてもよい。この移植により、親抗体の結合親和性に比べて、結合親和性が低下する可能性がある。この場合、フレームワークは、Ｑｕｅｅｎら（１９９１年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：２８６９により開示された特定の基準に基づいて、特定の位置で親フレームワークに逆突然変異し得る。マウス抗体のヒト化において有用な方法を記載している更なる参照文献としては、米国特許第４，８１６，３９７号；同第５，２２５，５３９号、及び同第５，６９３，７６１号；Ｌｅｖｉｔｔ（１９８３年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６８：５９５−６２０に記載されているようなコンピュータプログラムＡＢＭＯＤ及びＥＮＣＡＤ；Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら（１９８６年）Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８年）Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３−３２７；及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４−１５３６）が挙げられる。
逆突然変異を検討する残基の特定は、以下のように実施することができる。
アミノ酸が以下の分類に該当する場合、用いられるヒト生殖系配列のフレームワークアミノ酸（「アクセプタフレームワーク」）を、親抗体化合物のフレームワーク由来のフレームワークアミノ酸（「ドナーフレームワーク」）に置換する：
（ａ）アクセプタフレームワークのヒトフレームワーク領域におけるアミノ酸が、その位置におけるヒトフレームワークとしては珍しいアミノ酸であるが、ドナー免疫グロブリンにおける対応するアミノ酸が、その位置におけるヒトフレームワークに典型的なアミノ酸である；
（ｂ）アミノ酸の位置が、ＣＤＲの１つに直接隣接する；又は
（ｃ）フレームワークアミノ酸の任意の側鎖原子が、三次元免疫グロブリンモデルにおけるＣＤＲアミノ酸の任意の原子の約５〜６オングストローム以内に存在する（中心間）。
アクセプタフレームワークのヒトフレームワーク領域におけるアミノ酸、及びドナーフレームワークにおける対応するアミノ酸のそれぞれが、一般に、その位置におけるヒトフレームワークとして珍しいアミノ酸である場合、かかるアミノ酸を、その位置におけるヒトフレームワークに典型的なアミノ酸に置換してもよい。この逆突然変異基準により、親抗体化合物の活性を回復させることができる。
本明細書に開示される抗体化合物に類似の機能特性を示すヒト改変抗体を作製する別のアプローチは、フレームワークを変化させることなく、移植されたＣＤＲ内のアミノ酸をランダムに突然変異させ、親抗体化合物と同程度であるか又は親抗体化合物を上回る結合親和性及び他の機能特性について、得られた分子をスクリーニングすることを含む。また、単一突然変異を各ＣＤＲ内の各アミノ酸位置に導入し、次いでかかる突然変異の結合親和性及び他の機能特性の効果を評価してもよい。特性を改善させる単一突然変異を組み合わせて、互いに組み合わせたときの効果を評価してもよい。
更に、前述のアプローチの両方を組み合わせることも可能である。ＣＤＲ移植後、ＣＤＲのアミノ酸を変化させることに加えて、特定のフレームワーク領域を逆突然変異してもよい。この方法は、Ｗｕら（１９９９年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１５１−１６２に記載されている。
本発明の教示を適用して、当業者は、一般的な技術、例えば部位特異的突然変異誘発を用いて、本明細書に開示されるＣＤＲ及びフレームワーク配列内のアミノ酸を置換することにより、本配列に由来する更なる可変領域アミノ酸配列を作製することができる。殆ど全ての天然に存在するアミノ酸を特定の置換部位に導入することができる。次いで、本明細書に開示される方法を用いて、これら更なる可変領域アミノ酸配列をスクリーニングして、指定のインビボ機能を有する配列を同定することができる。この方法では、本発明に係るヒト改変抗体及びその抗原結合断片を調製するのに好適な更なる配列を同定することができる。フレームワーク内のアミノ酸置換は、本明細書に開示される４つの軽鎖及び／又は重鎖フレームワーク領域のうちのいずれか１つ以上内の１箇所、２箇所、又は３箇所に限定されることが好ましい。ＣＤＲ内のアミノ酸置換は、３つの軽鎖及び／又は重鎖ＣＤＲのうちのいずれか１つ以上内の１箇所、２箇所、又は３箇所に限定されることが好ましい。上記フレームワーク領域及びＣＤＲ内の種々の変化を組み合わせることも可能である。
上述のアミノ酸修飾を導入することにより作製される抗体化合物の機能特性が、本明細書に開示される特定の分子が示す機能特性に一致することは、実施例２〜１９において以下で論じられる方法により確認することができる。
「エピトープ」という用語は、抗体又は抗体断片が結合する、ペプチド又はタンパク質上に位置するアミノ酸の特定の配列を指す。エピトープは、アミノ酸又は糖側鎖等の分子の化学的に活性のある表面群から成り、特定の三次元構造特性及び特定の電荷特性を有することが多い。エピトープは、直線状（即ち、アミノ酸の単一配列への結合に関与する）であってもよく、又は立体構造（即ち、必ずしも隣接しているとは限らない抗原の種々の領域におけるアミノ酸の２つ以上の配列への結合に関与する）であってもよい。本明細書に開示されるエピトープは、実施例３に開示されるアミノ酸配列から成る、実質的に成る、又は含むことができる。
本明細書に開示される分子と「競合」するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、本分子が結合する部位（単数又は複数）と同一であるか、又は前記部位と重複する部位（単数又は複数）でヒトｃ−Ｍｅｔに結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。競合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、例えば、抗体競合アッセイを用いて同定することができる。例えば、精製された又は部分的に精製されたヒトｃ−Ｍｅｔのサンプルは、固体支持体に結合していてもよい。次いで、本発明の抗体化合物又はその抗原結合断片と、かかる本発明の抗体化合物と競合する可能性があると疑われるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片とを添加する。２つの分子のうち１つを標識する。標識化合物及び非標識化合物がｃ−Ｍｅｔの別々且つ異なる部位に結合する場合、標識化合物は、競合が疑われる化合物が存在するか否かにかかわらず、同じ量結合するであろう。しかし、相互作用部位が同一であるか又は重複している場合、非標識化合物が競合し、抗原に結合する標識化合物の量は減少するであろう。非標識化合物が過剰に存在する場合、結合するとしても非常に少量の標識化合物が結合するであろう。本発明の目的のために、競合モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ｃ−Ｍｅｔに対する本抗体化合物の結合を約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９９％減少させるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。かかる競合アッセイを実行するための手順の詳細は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８年）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，５６７〜５６９頁，ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３１４−２中に見出すことができる。かかるアッセイは、精製された抗体を用いることにより定量的に行うことができる。ある抗体をその抗体自体に対して滴定する、即ち、同じ抗体を標識及び競合者の両方として用いることにより検量線を作成する。非標識競合モノクローナル抗体又はその抗原結合断片が、標識分子のプレートへの結合を阻害する能力を滴定する。結果をプロットし、所望の程度の結合阻害に達するのに必要な濃度を比較する。かかる競合アッセイにおいて本発明の抗体化合物と競合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片が、本抗体化合物と同じ又は類似の機能特性を有するかどうかは、本明細書の実施例２〜１９に開示される方法を通して判定することができる。
本明細書に開示されるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片と実質的に同じｃ−Ｍｅｔのエピトープ（単数又は複数）に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、本分子が結合する部位（単数又は複数）と重複する部位（単数又は複数）でヒトｃ−Ｍｅｔに結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。本明細書に開示されるｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体又はその抗原結合断片と実質的に同じｃ−Ｍｅｔのエピトープに結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の同定を容易にする方法は、当該技術分野において周知であり、例えば国際特許公開第００／６４９４６号に記載されている。本明細書に開示されるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片と実質的に同じｃ−Ｍｅｔのエピトープ（単数又は複数）に結合するかかるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片が、本抗体化合物と同じ又は類似の機能特性を有するかどうかは、本明細書の実施例２〜１９に開示される方法を通して判定することができる。
「ｃ−Ｍｅｔ」又は「ヒトｃ−Ｍｅｔ」とは、任意のヒトｃ−Ｍｅｔに加えて、その機能的に活性な突然変異型を指す。ｃ−Ｍｅｔの構造は、以下のように概略的に表される。
Figure 2012509881
ＳＥＭＡ：Ｓｅｍａドメイン
ＰＳＩ：プレキシン、セマフォリン、及びインテグリンドメイン
ＩＰＴ：４つの免疫グロブリン、プレキシン、及び転写因子ドメイン
ＴＭ：膜貫通領域
ＪＭ：膜近傍ドメイン
ＫＤ：キナーゼドメイン
ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤ（配列番号７５）では、アミノ酸１〜２４は、シグナル配列を含む。成熟タンパク質は、アミノ酸２５（Ｅ）で始まる。Ｓｅｍａドメインは、ｃ−ＭｅｔのＮ末端における約５００個のアミノ酸残基から成り、α鎖（アミノ酸残基２５〜３０７）及びβ鎖の一部（アミノ酸残基３０８〜５１９）を含む。
「阻害する」という用語は、ｃ−Ｍｅｔの生物学的作用を実質的に拮抗する、妨げる、阻止する、限定する、緩徐にする、中断させる、除く、停止させる、低減する、又は逆行させる能力を意味する。
「治療している」（又は「治療する」若しくは「治療」）という用語は、症状、障害、状態、若しくは疾患の進行又は重篤度を緩徐にする、遮断する、抑止する、管理する、停止させる、低下させる、又は逆行させるが、必ずしも疾患に関連する症状、状態、又は障害全てを完全に除く訳ではないことを意味する。
急性の事象及び慢性的状態が治療され得る。急性の事象では、抗体又はその抗原結合断片は、症状、障害、状態、又は疾患の発症時に投与され、前記急性の事象が終了したら打ち切られる。対照的に、慢性症状、障害、状態、又は疾患は、より長い時間枠にわたって治療される。
「有効量」という用語は、単回用量又は複数回用量を患者に投与した際、所望の治療又は予防をもたらす、本発明の抗体化合物の量又は用量を指す。本抗体化合物の治療的有効量は、単回用量当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの範囲の量を含み得る。任意の個々の患者に対する治療的有効量は、腫瘍組織又は非腫瘍組織、腫瘍縮小等における細胞表面のｃ−Ｍｅｔ等のバイオマーカーに対する抗体化合物の効果をモニタすることにより、医療提供者が決定することができる。これらの方法により得られたデータを解析することにより、治療剤を単独で用いようと互いに組み合わせて用いようと最適量の抗体化合物が投与されるように、且つ治療期間も同様に決定できるように、治療中に治療レジメを修正することができる。この方法では、投与／治療レジメは、腫瘍低減効果を十分に示す、単独で又は組み合わせて用いられる抗体化合物の最低量が投与されるように、且つ患者を成功裏に治療する必要がある間のみ、かかる化合物の投与が継続されるように、治療過程の間に修正することができる。
本発明の抗体化合物は、ヒト医学において医薬として用いることができ、種々の経路により投与することができる。最も好ましくは、かかる組成物は、非経口投与用である。かかる医薬組成物は、当該技術分野において周知である方法により調製することができ（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第１９版（１９９５年），Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏら，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．を参照のこと）、本明細書に開示される１つ以上の抗体化合物と、薬学的に許容できる担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む。
「腫瘍」という用語は、悪性であろうと良性であろうと、全ての新生細胞の成長及び増殖と、全ての前癌及び癌細胞並びに癌組織とを指す。「癌」、「癌性」、及び「腫瘍」という用語は、本明細書で使用されるとき相互排他的ではない。
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には、異常な細胞の成長／増殖を特徴とする、哺乳類における生理学的状態を指す、又はそれを説明する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、及び白血病が挙げられるが、これらに限定されない。
ｃ−Ｍｅｔ及び癌
調節が解除されたｃ−Ｍｅｔ経路は、転写のアップレギュレーション、ｃ−Ｍｅｔ遺伝子の増幅、特定の遺伝子変化、又はリガンド依存性自己分泌若しくは傍分泌機構により誘導され得る。ヒト腫瘍における恒常的なｃ−Ｍｅｔの活性化の最も多い原因は、遺伝子増幅の非存在下において、転写がアップレギュレーとされた結果としてタンパク質発現が増加することである。更に、後にタンパク質の過剰発現及び恒常的なキナーゼの活性化が結果として生じる、ＭＥＴ遺伝子の増幅が、胃癌及び食道癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌、及び髄芽腫を含むヒト原発腫瘍の多くで報告されている。骨肉腫及び黄紋筋肉種等の間葉系起源の腫瘍は、ＨＧＦの生成による自己分泌機構を用いることが多い。高濃度のＨＧＦ及びｃ−Ｍｅｔの過剰発現は、より侵攻性の高い疾患、腫瘍転移の増加、及び患者の生存期間の短縮を含む臨床転帰不良に関連することが多い。更に、腫瘍における高濃度のＨＧＦ及び／又はｃ−Ｍｅｔタンパク質は、化学療法及び放射線療法に対する耐性を付与する。異常なＨＧＦ及びｃ−Ｍｅｔ発現に加えて、ｃ−Ｍｅｔ経路は、ｃ−Ｍｅｔの突然変異、遺伝子の増幅、及び遺伝子の再構成等の遺伝子変化を通じて活性化され得る。ｃ−ＭＥＴのミスセンス突然変異は、特徴のはっきりした遺伝性乳頭状腎細胞癌（ＰＲＣＣ）の全ての個体、及び散発性ＰＲＣＣサンプルの小集団（１３％）で見られる。前記突然変異の一部は、キナーゼ活性が高いので発癌能を有している。ＨＧＦ及びｃ−ＭＥＴ遺伝子の両方が存在する場合、７番染色体のトリソミーがＰＲＣＣで頻繁に生じ、その結果突然変異体のｃ−ＭＥＴ対立遺伝子が非ランダムに重複する。更に、ｃ−ＭＥＴの体細胞突然変異は、胃癌、頭頸部癌、肝癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、及び甲状腺癌を含む他のヒト癌に加えて、これら癌のうちの幾つかの転移で同定されている。典型的には突然変異がキナーゼドメインに限定されているＰＲＣＣとは異なり、これら突然変異は、受容体の他の領域、例えば膜近傍ドメインに位置することが多い。突然変異に加えて、ｃ−ＭＥＴ遺伝子は、乳癌、肝癌、脳癌、結腸直腸癌、胃癌、肺癌、及び胃癌で増幅されることが多く、これは一部の患者において疾患進行と相関している。
治療指標
異常なＨＧＦ／ｃ−ＭＥＴシグナル伝達は、膀胱癌、乳癌、頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、腎癌、肝癌、肺癌、上咽頭癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、及び甲状腺癌に加えて、胆管癌、骨肉腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、及びＭＦＨ／線維肉腫を含む広範囲のヒト悪性腫瘍で報告されている。更に、異常なＨＧＦ及び／又はｃ−Ｍｅｔ発現は、急性骨髄性白血病、成人Ｔ細胞白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ腫、及び多発性骨髄腫等の血液悪性腫瘍に加えて、黒色腫、中皮腫、ウィルムス腫瘍、神経膠芽細胞腫、及び星状細胞腫等の他の腫瘍でも報告されている（Ｌｉｕら（２００８年）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ１７（７）：９９７−１０１１に要約されている）。本発明のｃ−Ｍｅｔ抗体は、ＨＧＦ依存性及びＨＧＦ非依存性腫瘍の両方を阻害することができる。
以下の非限定的な実施例は、本発明の種々の態様を説明する。
以下の実施例では、ヒト化ＩｇＧ２及びＩｇＧ４、並びにマウスＩｇＧ（時にｍＩｇＧ１とも呼ばれる）対照抗体は、本ｃ−Ｍｅｔ抗体とは無関係のアイソタイプ対照抗体である。抗体Ｃ８、Ｄ１１、及びｏｐｔＤ１１は、マウス抗体である。全ての場合において、ヒトＨＧＦは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（＃２９４）から入手した。
実施例１
ｃ−Ｍｅｔ抗体
本ヒト改変抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のアミノ酸配列、完全軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列、並びに前述のアミノ酸をコードするそれぞれのヌクレオチド配列を、「アミノ酸及びヌクレオチド配列」と題した以下の段落に列挙する。軽鎖及び重鎖ＣＤＲアミノ酸配列を、それぞれ表１及び表２に示す。
表１．軽鎖ＣＤＲ
Figure 2012509881
 Ｘ１はＹ又はＲであり、且つＸ２はＡ又はＲである；
Ｘ３はＳ又はＲである；
Ｘ４はＩ又はＱであり、Ｘ５はＱ又はＶであり、且つＸ６はＳ又はＲである；
表２．重鎖ＣＤＲ
Figure 2012509881
 Ｘ７はＮ、Ｉ、又はＲであり、且つＸ８はＫ又はＰである；
Ｘ９はＹ又はＦである；
Ｘ１０はＮ又はＹであり、Ｘ１１はＧ又はＲであり、且つＸ１２はＧ又はＳである；
Ｘ１３はＴ又はＡであり、且つＸ１４はＷ又はＩである；
Ｄ１１−及びＣ８−抗体の軽鎖及び重鎖可変領域の共通配列は、以下の通りである：
Ｄ１１−抗体軽鎖可変領域共通配列（配列番号９４）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＳＶＳＳＳＩＳＳＴＮＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹ
ＧＴＳＸ１ＬＸ２ＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＹＳＦＧ
ＱＧＴＫＬＥＩＫ
（配列中、Ｘ１はＹ又はＲであり、且つＸ２はＡ又はＲである）；
Ｃ８−抗体軽鎖可変領域共通配列（配列番号９５）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＶＳＳＳＶＸ３ＳＩＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ
ＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＸ４Ｘ５ＹＸ６ＧＹＰＬＴＦＧ
ＧＧＴＫＶＥＩＫ
（配列中、Ｘ３はＳ又はＲであり、Ｘ４はＩ又はＱであり、Ｘ５はＱ又はＶであり、且つＸ６はＳ又はＲである）；
Ｄ１１−抗体重鎖可変領域共通配列（配列番号９６）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＲＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷ
ＩＹＰＶＴＧＤＴＹＹＸ７ＥＸ８ＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹ
ＧＡＦＸ９ＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳ
（配列中、Ｘ７はＮ、Ｉ、又はＲであり、Ｘ８はＫ又はＰであり、且つＸ９はＹ又はＦである）；
Ｃ８−抗体重鎖可変領域共通配列（配列番号９７）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲ ＶＮＰＸ１０ＲＸ１１Ｘ１２ＴＴＹＮＱＫＦＥＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＸ１３ＮＸ１４ＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳ
（配列中、Ｘ１０はＹ又はＮであり、Ｘ１１はＧ又はＲであり、Ｘ１２はＳ又はＧであり、Ｘ１３はＡ又はＴであり、且つＸ１４はＩ又はＷである）。
標準的なトランスフェクション手順を用いてＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、＃９０５００１３０）で、抗体を一過的に発現させる。トランスフェクション後、３７℃で４８〜１２０時間、ジェネテシン（Ｇ４１８）及びトブラマイシンを含有する標準無血清培地中で、トランスフェクトされた細胞を培養する。製造業者の説明書に従って、６０ｍＬのｒプロテインＡセファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃１７−１２７９−０４）で抗体を精製し、更に濃縮し、移動相としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）を用いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＸＫ５０／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により精製する。次いで、Ｍｉｌｌｅｖ−ＧＶ、ＰＶＤＦ膜、０．２２μｍ、３３ｍｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，＃ＳＬＧＶ０３３ＲＳ）を用いて抗体を濾過し、４〜８℃で保存する。
以下の実施例の多くで論じられるマウスＩｇＧ１ ｃ−Ｍｅｔ抗体５Ｄ５（米国特許第５，６８６，２９２号）を、上記のようにアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手したハイブリドーマＨＢ−１１８９５から単離し、精製する。
実施例２
種々のｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメインに対するｃ−Ｍｅｔ抗体の結合動態
ヒト、カニクイザル、及びラットのｃ−Ｍｅｔ配列の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を、Ｆｃ（配列番号７２〜７４）のＣ末端にｆｌａｇタグ及びＨｉｓタグ（Ｆｌｉｓタグ）を有するＦｃ融合タンパク質として発現させる。これらｃ−Ｍｅｔ ＥＣＤ Ｆｃ融合タンパク質を、実施例１に記載のように、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞中で別個に一過的に発現させ、精製する。
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）２０００機器を用いて、ｃ−Ｍｅｔ抗体のヒト、カニクイザル、及びラットｃ−ＭｅｔのＥＣＤに対する結合動態を測定する。測定は、２５℃で実施する。サンプルをＨＢＳ−ＥＰバッファ（１５０ｍＭの塩化ナトリウム、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％（ｗ／ｖ）の界面活性剤Ｐ−２０、及び１０ｍＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．４）；＃ＢＲ−１００１−８８）に溶解させる。ヤギ抗ヒトＩｇＧのＦ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ’）２断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ，＃１０９−００６−０９７）を、アミンカップリング化学反応を用いて４０００反応単位（ＲＵ）の濃度でＣＭ５センサチップのフローセル１〜４に固定化して、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を捕捉する。
複数サイクルを用いて結合を評価する。各サイクルは、５０μＬ／分の流速で実施され、以下の工程から成る：４０〜１００ＲＵを捕捉するために、１０μｇ／ｍＬのｃ−Ｍｅｔ抗体約１０μＬを注入し、２５０μＬのヒト、カニクイザル、又はラットｃ−Ｍｅｔ−Ｆｌｉｓ−Ｆｃ ＥＣＤを注入し（各サイクル共１００ｎＭで開始し、２倍段階希釈を用いる）、続いて２０分間解離させ、１０ｍＭの塩酸グリシン（ｐＨ１．５）約３０μＬを用いて再生する。各サイクルについて、会合及び解離速度を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア、バージョン４．１の「１：１（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合」モデルを用いて評価する。抗体Ｄ１１−Ｓ１７Ｙのラットｃ−Ｍｅｔ−Ｆｌｉｓ−Ｆｃ ＥＣＤに対する結合では、異種リガンドモデルを用いてデータを適切に適合させることにより、２つの結合親和性が得られる。
結果を以下の表３〜５に示す。
表３．ｃ−Ｍｅｔ抗体のヒトｃ−Ｍｅｔ−Ｆｌｉｓ−Ｆｃ ＥＣＤに対する結合動態及び親和性
Figure 2012509881
表４．ｃ−Ｍｅｔ抗体のカニクイザルｃ−Ｍｅｔ−Ｆｌｉｓ−Ｆｃ ＥＣＤに対する結合動態及び親和性
Figure 2012509881
表５．ｃ−Ｍｅｔ抗体のラットｃ−Ｍｅｔ−Ｆｌｉｓ−Ｆｃ ＥＣＤに対する結合動態及び親和性
Figure 2012509881
これらデータは、抗体Ｃ８−Ｈ２４１、Ｃ８−６、及びＣ８−ｃｏ１６が、同程度の親和性でヒト及びカニクイザルｃ−ＭｅｔのＥＣＤの両方に結合するが、ラットｃ−ＭｅｔのＥＣＤには結合しないことを示す。更なるデータ（示さない）は、これら抗体が、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされた１μｇ／ｍＬのＥＣＤを含む最高１００ｎＭの抗体において、マウスｃ−ＭｅｔのＥＣＤに結合しないことを示す。しかし、抗体Ｄ１１−８Ｂ８、Ｄ１１−Ｃ２７Ｇ３、及びＤ１１−Ｓ１７Ｙは、ヒト、カニクイザル、及びラットｃ−ＭｅｔのＥＣＤに結合する。
実施例３
エピトープマッピング
本ｃ−Ｍｅｔ抗体のエピトープを、水素−重水素交換質量分析（ＨＤＸＭＳ）（Ｙａｍａｄａら（２００２年）Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１６（４）：２９３−２９９）及びピロ炭酸ジエチル（ＤＥＰＣ）標識（Ｍｅｎｄｏｚａら（２００８年）Ａｎａｌｙ．Ｃｈｅｍ．８０（８）：２８９５−２９０４）の組み合わせによりマッピングする。ヒトｃ−ＭｅｔのＳｅｍａドメインの水素−重水素交換反応は、ｃ−Ｍｅｔ抗体の存在下又は非存在下で実施する。抗体の非存在下よりも抗体の存在下の方が重水素の獲得が少ないＳｅｍａドメイン領域を、抗体のエピトープ（単数又は複数）として同定する。ＤＥＰＣは、Ｓｅｍａドメインの表面に露出しているリジン又はヒスチジン残基のアミノ基と反応して、エチルカルバメートリジン又はヒスチジンを形成し得る。これらアミノ酸がエピトープ領域に位置する場合、抗体と結合した際に前記アミノ酸は保護され、ＤＥＰＣとは反応しないであろう。これは、ＨＤＸＭＳにより決定されるエピトープ領域の場所を更に特定及び／又は確認するのに役立つ。
ｃ−ＭｅｔのＳｅｍａドメインの発現及び精製。ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞中でＣ末端（配列番号７６）にＦｌｉｓタグを有するヒトｃ−ＭｅｔのＳｅｍａドメインを発現させ、実施例１及び２に記載のように精製する。次いで、精製したタンパク質をｐＨ７．４のＰＢＳ中で４℃にて保存する。このドメインは、完全長ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤと同程度の親和性で本発明のｃ−Ｍｅｔ抗体に結合し、このことはこれら抗体のエピトープがヒトｃ−Ｍｅｔのこの領域に位置することを示す。
ｃ−ＭｅｔのＳｅｍａドメインの脱グリコシル化及び脱シアリル化。１．２ｍｇ／ｍＬのヒトｃ−ＭｅｔのＳｅｍａドメイン溶液１００μＬを、脱−Ｎ−グリコシル化するために、３７℃で一晩ＰＮＧａｓｅ Ｆ溶液（Ｐｒｏｚｙｍｅ，ＧＫＥ−５００６Ｂ）１μＬで処理する。ＬＣ／ＭＳ分析は、この処理後タンパク質の大部分が脱グリコシル化されることを示す。別個に、１．２ｍｇ／ｍＬのヒトｃ−ＭｅｔのＳｅｍａドメイン溶液１００μＬを、３７℃で１時間、１０Ｕ／ｍＬのノイラミニダーゼ溶液（Ｒｏｃｈｅ，カタログ番号１０ ２６９ ６１１ ００１）２μＬで処理して、Ｓｅｍａドメインを脱シアリル化する。
ｃ−ＭｅｔのＳｅｍａドメイン／抗体複合体の形成。脱グリコシル化されたｃ−ＭｅｔのＳｅｍａドメイン溶液（１．２ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを、抗体溶液（２．０７μＬのＣ８−Ｈ２４１、２．０１μＬのＤ１１−８Ｂ８、又は３．８７μＬの未処理対照Ｍａｂ）の２９μｇのタンパク質を含有するアリコートと混合し、次いで最終体積が４０μＬになるように１×ＰＢＳ溶液で希釈する。別個に、脱シアリル化されたヒトｃ−ＭｅｔのＳｅｍａドメイン溶液（１．２ｍｇ／ｍＬ）５μＬを、抗体溶液（１．０４μＬのＣ８−Ｈ２４１、１．０１μＬのＤ１１−８Ｂ８、又は１．９４μＬの未処理対照Ｍａｂ）の１４μｇのタンパク質を含有するアリコートと混合し、次いで最終体積が１５μＬになるように１×ＰＢＳ溶液で希釈する。次いで、各抗体の混合溶液をそれぞれＨＤＸＭＳ分析に供する。
ＨＤＸＭＳ分析。脱グリコシル化又は脱シアリル化されたｃ−ＭｅｔのＳｅｍａドメイン／抗体混合物４μＬを、１００％Ｄ２Ｏ（Ａｃｒｏｓ，Ｃｏｄｅ １６６３１０５００；交換中８０％ Ｄ）１６μＬと混合し、９０秒間周囲温度でインキュベートする。次いで、０℃で水中０．５％（ｖ／ｖ）ギ酸５０μＬを用いて、交換をクエンチする。クエンチされた溶液を、速やかに０℃で３．５又は４分間、５ｍｇ／ｍＬ（ｖ／ｖ）ペプシン溶液（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｐ６８８７）２μＬで処理する。消化された溶液を、速やかにＲＰ−ＨＰＬＣカラム（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，部品番号１９１２−１８０２；２．１×５０ｍｍ、孔径１０００Å、粒径８μＭ）に用手的に注入する。ＨＰＬＣポンプ（Ｗａｔｅｒｓ，２７９５ ＨＰＬＣ）からのＨＰＬＣバッファ流は、金属管（約１ｍＬ）を通過して、手動注入器に入る。次いで、カラム溶出液は、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＴプレミア又はＳＹＮＡＰＴ質量分析計に移動する。金属管、注入器ループ、及びカラムを氷水浴に浸漬する。
０．２ｍＬ／分の流速で、９９％のＡ（０．０５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）水溶液）及び１％のＢ（アセトニトリル中０．０４％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ）を用いてカラムを平衡化する。定組成勾配溶離を１分間、１〜１０％のＢで１分間、〜４０％のＢで１２分間、〜９０％のＢで４分間実施し、３分間保持し、次いで速やかに初期状態に戻す。ポジティブスプレー、Ｗモード、及び以下の設定：キャピラリ電圧１．５ｋＶ、コーン電圧１００Ｖ、開口部１ ２５Ｖ、質量範囲２００〜２０００、脱溶媒和温度１５０℃、及び脱溶媒和気流５００Ｌ／時間を用いて、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＴプレミア質量分析計で質量分析を実施する。ｃ−Ｍｅｔ抗体を用いて又は用いずにＤ／Ｈ交換した後、ｃ−Ｍｅｔの各ペプシン処理ペプチドの質量スペクトルが得られる。各ペプチドの平均質量を、最も強いイオンピークの同位体分布に従って算出する。
ｃ−Ｍｅｔ／抗体複合体のＤＥＰＣ標識。１．２ｍｇ／ｍＬのヒトｃ−ＭｅｔのＳｅｍａドメイン溶液８．３μＬを、抗体溶液（２４μｇのタンパク質：１．７１μＬのＣ８−Ｈ２４１、１．６７μＬのＤ１１−８Ｂ８、又は３．２μＬの未処理対照Ｍａｂ）及び１×ＰＢＳ溶液と混合して、最終体積を７６μＬにする。各ｃ−Ｍｅｔ／抗体混合物を、５分間周囲温度で、イソプロパノール中１０ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）ＤＥＰＣ４μＬで処理し、次いで、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファ（ｐＨ８）中２０ｍｇ／ｍＬヒスチジン１０μＬ、及び０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファ（ｐＨ８）中０．２ｍｇ／ｍＬリジン１０μＬでクエンチする。各溶液を、０．２ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）ブタトリプシン溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ，カタログ番号Ｖ５２８Ａ）５μＬと混合し、混合物の半分を５０ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）ジチオスレイトール溶液０．５μＬと混合する。各サンプル溶液を３７℃で５時間インキュベートし、次いで更に１時間ＰＮＧａｓｅ Ｆ溶液０．５μＬで処理する。各消化された溶液を、１０％（ｖ／ｖ）酢酸溶液２μＬで酸性化する。１００ｍｇ／ｍＬのＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｃ４７０２−２Ｇ）溶液２μＬを、ジチオスレイトールを添加していない非還元消化物に添加する。各溶液を、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ及びＷａｔｅｒｓ ＳＹＮＡＰＴ質量分析計を用いてＬＣ／ＭＳ分析に供する。ＨＰＬＣは、６０℃でＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ８カラム（２．１×５０ｍｍ，１．７μｍ，Ｗａｔｅｒｓ，部品番号１８６００２８７７）を用い、ペプチドは、水／アセトニトリル／ＴＦＡ ＨＰＬＣ移動相系中のアセトニトリル勾配を用いて溶出する。前記消化物には、４５分間のランタイムを用いる。カラムを、０．２ｍＬ／分の流速で、９９％のＡ（０．０５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ水溶液）及び１％のＢ（アセトニトリル中０．０４％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ）で平衡化する。定組成状態で勾配溶離を２分間、１〜２５％のＢで２５分間、〜４５％のＢで１０分間、〜９０％のＢで１分間実施し、１．５分間保持し（同じ期間、流速０．３ｍＬ／分）、次いで速やかに１％のＢに戻す。
結果。Ｍａｂ Ｃ８−Ｈ２４１は、ヒトｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメインのα鎖（配列番号７５のアミノ酸残基２５〜３０７）に位置する、ｃ−ＭｅｔのＳｅｍａドメインの以下の４つの領域を含む立体構造エピトープに結合すると思われる：
１２１ＶＶＤＴＹＹＤＤＱＬ１３０（配列番号７７）、
１３１ＩＳＣＧＳＶＮＲＧＴＣＱＲＨＶＦＰＨＮＨＴＡＤＩＱＳ１５６（配列番号７８）、
１７９ＡＬＧＡＫＶＬＳＳＶＫＤＲＦＩＮＦＦ１９６（配列番号７９）、及び
２１６ＶＲＲＬＫＥＴＫＤＧＦＭ２２７（配列番号８０）。
より具体的には、Ｍａｂ Ｃ８−Ｈ２４１は、以下の配列内の１つ以上のアミノ酸と相互作用することによりｃ−Ｍｅｔに結合する：
１２３ＤＴＹＹＤＤ１２８（配列番号８１）（包括的）、
１４４ＨＶＦＰＨＮＨＴＡＤＩＱＳ１５６（配列番号８２）（包括的）、
１９２ＦＩＮＦ１９５（配列番号８３）（包括的）、及び
２２０ＫＥＴＫＤＧＦＭ２２７（配列番号８４）（包括的）。
領域１４４ＨＶＦＰＨＮＨＴＡＤＩＱＳ１５６（配列番号８２）に対してＭａｂ Ｃ８−Ｈ２４１が結合すると、結合アッセイにおける最高１００ｎＭの抗体と同程度の親和性で、ヒト（配列番号７５）及びカニクイザル（配列番号７３のアミノ酸２５〜９３２）のｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメインの両方に結合できるようになるが、ラット又はマウスｃ−Ｍｅｔに結合できるようにはならない。
ｃ−ＭｅｔのＳｅｍａドメインのα鎖に結合するＭａｂ Ｄ１１−８Ｂ８は、１つの領域、即ち、アミノ酸配列８４ＹＫＴＧＰＶＬＥＨＰＤＣＦＰＣＱＤＣＳＳＫＡＮＬ１０７（配列番号８５）（包括的）、より具体的には領域９５ＣＦＰＣＱＤＣＳＳＫＡ１０５（配列番号８６）（包括的）内の直線状エピトープ内のアミノ酸に局在するように思われる。Ｍａｂ Ｄ１１−８Ｂ８のエピトープは、エピトープ抽出実験によって更に確認される（Ｄｈｕｎｇａｎａら（２００９） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．５２４：８７−１０１）。ｃ−ＭｅｔのＳｅｍａドメインをブタトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化し、次いで消化物を、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンキット（Ｐｉｅｒｃｅ，製品番号１７５４２１０）を用いて、ビオチン化Ｍａｂ Ｄ１１−８Ｂ８と混合し、ｃ−Ｍｅｔペプチドに結合させる。ｃ−Ｍｅｔペプチドの結合している又は結合してしないビオチン化Ｄ１１−８Ｂ８を、大容量ストレプトアビジンアガロース樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，製品番号２０３５９）により捕捉する。結合しているペプチドを、Ｈ２Ｏ中０．１５％ギ酸（ｖ／ｖ）に放出させ、次いでＬＣ／ＭＳにより同定する。
実施例４
ＲＯＮ及びプレキシンＡ２のＥＣＤへの抗体の結合に対する、ｃ−ＭｅｔのＥＣＤへの抗体の優先的結合
ｃ−Ｍｅｔに対して最も高い配列同一性を有するヒトタンパク質は、ＲＯＮ及びプレキシンＡ２である。この実験では、ｃ−Ｍｅｔ、ＲＯＮ、及びプレキシンＡ２のＥＣＤに対するｃ−Ｍｅｔ抗体の結合特異性を比較する。
９６ウェルのＥＩＡ／ＲＩＡ高結合プレート（Ｃｏｓｔａｒ，＃２５９２）のウェルを、４℃で一晩、コーティングバッファ（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｓ，＃ ＣＯＡＴ−１０００−０１）中１μｇ／ｍＬのヒトｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）−Ｆｃ−Ｆｌｉｓ融合物（配列番号７２）、ＲＯＮ−ＥＣＤ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃１９４７−ＭＳ）、又はプレキシンＡ２−ＥＣＤ−Ｆｃ（Ａｂｎｏｖａ，Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ ＃Ｈ００００５３６２−Ｐ０１）１００μＬでコーティングした。ウェルを吸引し、ブロッキングバッファ（０．０５％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）（ＴＢＳ−Ｔ）（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｓ，＃ ＷＳＨＷ−１０００−０１）に加えて１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ，＃００１−０００−１６２）を含むトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ８．０））２００μＬを添加し、室温で１時間インキュベートすることにより、非特異的結合部位をブロックする。洗浄バッファ（ＴＢＳ−Ｔ）でプレートを３回洗浄した後、ブロッキングバッファでｃ−Ｍｅｔ抗体を１：６に段階希釈したもの（１００μｇ／ｍＬから開始）を１００μＬ／ウェル添加し、室温で２時間インキュベートする。プレートを洗浄し、９０分間ブロッキングバッファ中で、１００μＬ／ウェルのＨＲＰ−共役ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ）２ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ ＃１０９−０３６−０９７）と共にインキュベートする。プレートを洗浄した後、１００μＬ／ウェルの基質溶液（ＢｉｏＦｘ，＃ＴＭＢＷ−１０００−０１）を添加し、プレートを室温で１０分間インキュベートする。１００μＬ／ウェルの停止溶液（ＢｉｏＦｘ，＃ ＬＳＴＰ−１０００−０１）を添加して、反応を停止させる。発色シグナルを生じさせ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて４５０ｎｍで読み取る。ｃ−Ｍｅｔ、ＲＯＮ、及びプレキシンＡ２のＥＣＤに対するｃ−Ｍｅｔ抗体の結合は、色シグナルの発生に比例する。
表６に示すように、本発明のＣ８及びＤ１１ｃ−Ｍｅｔ抗体は両方、ＲＯＮのＥＣＤ又はプレキシンＡ２のＥＣＤに比べてヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤに優先的に結合する。
表６．ＲＯＮ及びプレキシンＡ２のＥＣＤへのｃ−Ｍｅｔ抗体の結合に対する、ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤへのｃ−Ｍｅｔ抗体の優先的結合
Figure 2012509881
Figure 2012509881
実施例５
ｃ−Ｍｅｔ抗体によるＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔ結合のブロック
インビトロ結合アッセイを用いて、本ｃ−Ｍｅｔ抗体による、ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合阻害を測定する。
９６ウェルのＥＩＡ／ＲＩＡ高結合プレート（Ｃｏｓｔａｒ，＃２５９２）のウェルを、室温で一晩、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）中ヒトｃ−Ｍｅｔ ＥＣＤ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓ（配列番号７２）（２μｇ／ｍＬ）１００μＬでコーティングし；プレート洗浄器内で、洗浄バッファ（０．０５％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）（ＴＢＳ−Ｔ）（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｓ，＃ ＷＳＨＷ−１０００−０１）を含むトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ８．０））で４回洗浄し；ブロッキングバッファ（１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ，＃００１−０００−１６２）を加えたＴＢＳ−Ｔ）３００μＬを添加することによりブロッキングし；３７℃で６０分間インキュベートする。次いで、ブロッキングバッファをウェルから除去し、それぞれ、表７に示すような最終濃度の、ブロッキングバッファ中抗体５０μＬを各ウェルに添加する。ブロッキングバッファをＨＧＦのみの対照ウェルに添加する。ｃ−Ｍｅｔ抗体の入っているプレートを３７℃で９０分間インキュベートする。次いで、最終濃度１０ｎｇ／ｍＬの、ブロッキングバッファ中ヒト肝細胞成長因子（ＨＧＦ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃２９４）５０μＬを、抗体のみの対照ウェルを除く各ウェルに添加する。ｃ−Ｍｅｔ抗体／ＨＧＦ混合物の入っているプレートを、室温で２時間プレート振盪器上にてインキュベートする。次いで、プレート洗浄器内にて、ＴＢＳ−Ｔでウェルを４回洗浄する。次に、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬの、ブロッキングバッファ中ビオチン化抗ＨＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃ ＢＡＦ２９４）１００μＬを、各ウェルに添加する。プレートを室温で９０分間インキュベートする。再度、プレート洗浄器内にて、ＴＢＳ−Ｔでウェルを４回洗浄する。ブロッキングバッファでストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＤＹ９９８）を１：２００に希釈したもの１００μＬを各ウェルに添加する。プレートを室温で３０分間インキュベートする。プレート洗浄器内にて、ウェルをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄する。次いで、１００μＬ／ウェルの基質溶液（ＢｉｏＦｘ，＃ＴＭＢＷ−１０００−０１）を添加し、プレートを室温で１０分間インキュベートする。反応を停止させるために、１００μＬ／ウェルの停止溶液（ＢｉｏＦｘ，＃ ＬＳＴＰ−１０００−０１）を添加する。マイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ，ＭＡＸ１９０）を用いて４５０〜５７０ｎｍの波長でサンプルを読み取り、バッググラウンドは減じない。
表７に示すように、本発明のＣ８−及びＤ１１ｃ−Ｍｅｔ抗体は両方、ヒトＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔ結合をブロックする。
表７．Ｃ８−及びＤ１１−抗体による、ヒトｃ−Ｍｅｔに対するヒトＨＧＦ結合の阻害
Figure 2012509881
実施例６
肝細胞成長因子及びアゴニストＭａｂ ５Ｄ５と比べて弱い、ｃ−Ｍｅｔ抗体によるｃ−Ｍｅｔリン酸化誘導
ＨＧＦで刺激すると、Ａ５４９肺癌腫細胞株は、チロシン残基１３４９におけるｃ−Ｍｅｔのリン酸化増加を示す。リン酸化ｃ−Ｍｅｔ（ｐ−Ｍｅｔ）ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＨＧＦの非存在下における種々のｃ−Ｍｅｔ抗体のアゴニスト活性、並びにＭａｂ ５Ｄ５及びＨＧＦ自体のアゴニスト活性を測定する。
Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ，＃ＣＣＬ−１８５）を、ハムＦ１２Ｋ＋２ｍＭのグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃２１１２７−０２２）＋１０％ＦＢＳ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１００８２）中で培養する。９６ウェルプレート内の上記のような完全血清培地中に、細胞を６×１０４細胞／ウェルでプレーティングし、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２下、３７℃で一晩インキュベートする。ウェルから培地を除去し、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２下、３７℃で６時間、１００μＬのハムＦ１２Ｋ＋２ｍＭのグルタミン培地＋０．５％ＦＢＳ中で細胞を飢餓状態にする。抗体又はＨＧＦを飢餓培養培地で希釈し、表８に示す最終濃度で添加し、３７℃で１５分間インキュベートする。培地を吸引し、１ウェル当たり５０μＬの溶解バッファ（１０ｎＭのトリス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１５５６７−０２７）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１５５７５−０３８）、５０ｍＭのＮａＦ（Ｓｉｇｍａ，＃Ｓ１５０４）、１％（ｖ／ｖ）オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）−Ｘ １００；Ｓｉｇｍａ，＃Ｔ８７８７）、２ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ，＃５６７５４０）、プロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；＃Ｐ８３４０）、ホスファターゼ阻害剤カクテルＩ（Ｓｉｇｍａ ＃Ｐ２８５０）、及びホスファターゼ阻害剤カクテルＩＩ（Ｓｉｇｍａ ＃Ｐ５７２６））中で細胞を溶解させ、１５〜２０分間氷上でインキュベートする。細胞溶解物を下記ＥＬＩＳＡアッセイで用いて、Ｙ１３４９残基におけるｃ−Ｍｅｔのリン酸化を測定する。
ｃ−Ｍｅｔ捕捉抗体をＢｕｐ Ｈコーティングバッファ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，＃２８３８２）で２μｇ／ｍＬに希釈し、ＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｍｏｎｒｏｅ，ＮＣ，＃６５５０８１）に添加し、４℃で一晩インキュベートする。ウェルを吸引し、ＴＢＳ−Ｔ（ＢｉｏＦＸ，Ｏｗｉｎｇｓ Ｍｉｌｌｓ，ＭＤ，ＷＳＨ−１０００−０１）で３回洗浄し、次いで室温で１時間、２００μＬのブロッキングバッファ（２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを加えたＴＢＳ−Ｔ）でブロッキングする。プレートをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄する。次に、２５μＬの細胞溶解物及び７５μＬのブロッキングバッファを添加し、プレートを４℃で一晩インキュベートする。次いで、プレートをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄する。ブロッキングバッファ中０．５μｇ／ｍＬのｐＹ１３４９ｃ−Ｍｅｔポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，＃３１３３）１００μＬを各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートする。次いで、プレートをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄する。ブロッキングバッファで１／１０，０００に希釈したペルオキシダーゼ共役ヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，＃１１１−０３５−１４４）１００μＬを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートする。次いで、プレートをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄する。１００μＬの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン溶液（ＢｉｏＦＸ，＃ＴＭＢＷ−１０００−０１）を各ウェルに添加し、次いで１００μＬの停止溶液（ＢｉｏＦＸ，＃ＬＳＴＰ−１０００−０１）を添加する。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて４５０ｎｍでプレートを読み取り、ＳＯＦＴｍａｘ Ｐｒｏ ４．８ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてサンプルの値を測定する。
その結果を表８に示す。
表８．Ａ５４９細胞におけるｃ−Ｍｅｔのリン酸化に対するｃ−Ｍｅｔ抗体、ＨＧＦ、及びアゴニストＭａｂ ５Ｄ５の効果
Figure 2012509881
上記データは、ＨＧＦ及びアゴニストｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂ ５Ｄ５が、ｃ−Ｍｅｔのリン酸化を強く刺激するが、本ｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂ Ｃ８−Ｈ２４１及びＣ８−６はｃ−Ｍｅｔのリン酸化を弱く刺激することを示す。ＨＣＴ１１６、Ｈ４６０、及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株でも同様の結果が得られる。
Ｍａｂ Ｄ１１−８Ｂ８でも同様の結果が得られる。
実施例７
ｃ−Ｍｅｔ抗体のＨＧＦ誘導性ｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害
ＨＧＦがｃ−Ｍｅｔに結合すると、ｃ−Ｍｅｔ分子のチロシンがリン酸化され、ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路が活性化される。この実施例では、ＨＧＦに対して応答性であるヒト結腸癌細胞株ＨＣＴ１１６を用いて、本ｃ−Ｍｅｔ抗体による、ｃ−Ｍｅｔのチロシン残基１２３０、１２３４、及び１２３５におけるＨＧＦ誘導性リン酸化の阻害を評価する。
ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，＃ＣＣＬ−２４７）をペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１５１４０−１２２）及び１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１００８２−１４７）を加えたマッコイ５Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，＃１６６００−０８２）に、１５０，０００細胞／ｍＬになるように再懸濁させる。再懸濁したＨＣＴ１１６細胞０．２ｍＬを、３０，０００細胞／ウェルで９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ，＃３５９６）に添加し、次いで前記細胞を５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２下、３７℃で４８時間インキュベートする。次いで、培養培地を吸引し、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２下、３７℃で２４時間、ペニシリン／ストレプトマイシン及び０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを加えたマッコイ５Ａ培地１００μＬ中で細胞を飢餓状態にする。アジ化ナトリウム（最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ））（Ｓｉｇｍａ，＃Ｓ２００２）２５μＬを添加し、その直後に、ペニシリン／ストレプトマイシン及び０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを加えたマッコイ５Ａ培地に８×ｃ−Ｍｅｔ抗体希釈液２５μＬを添加し、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２下、３７℃で３０分間、細胞をインキュベートする。最終濃度２００ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ５０μＬを各ウェルに添加し、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２下、３７℃で更に１５分間、細胞をインキュベートする。次いで、培地を吸引し、５０μＬの細胞溶解バッファを添加する（１０ｍＭのトリス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１５５６７−０２７）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１５５７５−０３８）、５０ｍＭのＮａＦ（Ｓｉｇｍａ，＃Ｓ１５０４）、１％（ｖ／ｖ）オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）−Ｘ １００；Ｓｉｇｍａ，＃Ｔ８７８７）、２ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ，＃５６７５４０）、及び完全プロテアーゼ阻害剤、ＥＤＴＡ不含（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，＃１１８３６１７０００１）。室温で１５〜３０分間、細胞を溶解バッファ中でインキュベートする。以下のようにＥＬＩＳＡによりｃ−Ｍｅｔのチロシンのリン酸化について、細胞溶解物をアッセイする。
ｃ−Ｍｅｔ捕捉抗体をコーティングバッファ（ＢｉｏＦＸ，Ｇｌｅｎｄｏｒａ，ＣＡ，ＣＯＡＴ−１０００−０１）で２μｇ／ｍＬに希釈する。１ウェル当たり１１０μＬの希釈抗体をＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｍｏｎｒｏｅ，ＮＣ，＃６５５０８１）に添加し、プレートを４℃で一晩インキュベートする。ウェルを吸引し、ＴＢＳ−Ｔで２回洗浄し、次いで１時間、２００μＬのブロッキングバッファ（２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを加えたＴＢＳ−Ｔ）でブロッキングする。プレートをＴＢＳ−Ｔで２回洗浄する。次に、７５μＬのブロッキングバッファを加えた２５μＬの細胞溶解物、又は１００μＬのＭＫＮ４５細胞溶解物希釈液（ブロッキングバッファで希釈、標準物質として）を添加し、プレートを室温で２時間インキュベートする。次いで、プレートをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄する。次いで、ブロッキングバッファ中０．５μｇ／ｍＬのｐＹｐＹｐＹ１２３０／１２３４／１２３５ｃ−Ｍｅｔポリクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃４４−８８８Ｇ）１００μＬを各ウェルに添加し、プレートを室温で２時間インキュベートする。次いで、プレートをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄する。ブロッキングバッファで１／１２，０００に希釈したペルオキシダーゼ共役ヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，＃１１１−０３５−１４４）１００μＬを添加し、混合物を室温で１時間インキュベートする。次いで、プレートをＴＢＳ−Ｔで６回洗浄する。１００μＬの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン溶液（ＢｉｏＦＸ，＃ＴＭＢＷ−１０００−０１）を各ウェルに添加し、次いで１００μＬの停止溶液（ＢｉｏＦＸ，＃ＬＳＴＰ−１０００−０１）を添加する。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、５７０ｎｍで補正し、４５０ｎｍでプレートを読み取る。４−パラ−メータ分析を用いて検量線を作成し、ＳＯＦＴｍａｘ Ｐｒｏ ３．１．２ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてサンプルの値を測定する。
ｃ−Ｍｅｔのチロシンリン酸化の阻害率を、ｃ−Ｍｅｔ抗体を添加しないＨＧＦ処理の平均に設定し（０％阻害）、１００％阻害を、アジ化ナトリウム処理（ＨＧＦ又はｃ−Ｍｅｔ抗体処理を行わない）の平均に設定する。
表９は、標準誤差と共に、３つの実験について１実験当たり３回処理を行った平均を示す。データは、本発明の６つのｃ−Ｍｅｔ抗体のうちの５つが、ヒトＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプ対照に比べて、ｃ−ＭｅｔのＨＧＦ誘導性チロシンリン酸化を有意に阻害することを示す。
表９．Ｃ８−及びＤ１１−抗体によるＨＧＦ誘導性ｃ−Ｍｅｔチロシンリン酸化の阻害率
Figure 2012509881
実施例８
ｃ−Ｍｅｔ抗体によるｃ−Ｍｅｔの内部移行の誘導
この実施例に記載される実験は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析を使用して、本ｃ−Ｍｅｔ抗体が細胞表面のｃ−Ｍｅｔ分子に結合し、ｃ−Ｍｅｔの内部移行を誘導することを示す。使用されるＭＫＮ４５細胞は、高レベルの全ｃ−Ｍｅｔを恒常的に発現し、且つＭＥＴ遺伝子増幅の結果としてｃ−ＭｅｔのＨＧＦ非依存性リン酸化を示す。ｃ−Ｍｅｔの内部移行は、ｃ−Ｍｅｔ分解を誘導し（実施例１０及び１９を参照）、その結果ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路を阻害すると思われる。
６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ，＃３５９８）のウェルの、２ｍＬの培養培地（ＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１１８３５）；１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１００８２）；２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃２５０３０）；１００Ｕ／５００ｍＬのペニシリンＧ、及び１００μｇ／５００ｍＬのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１５１４０））中に、１．５×１０５個のヒト胃癌ＭＫＮ４５細胞（Ｊａｐａｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｂａｎｋ，＃ＪＣＲＢ０２５４）を播種する。相対湿度９５％及び５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２下、３７℃で２４時間、プレートをインキュベートする。次いで、最終濃度５μｇ／ｍＬで抗体をウェルに添加する。一晩処理した後、培養培地をウェルから除去し、１ｍＬの酵素不含細胞解離溶液（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，＃Ｓ−０１４−Ｂ）で置換する。室温で５分間インキュベートした後、遠心管に細胞を回収し、培養培地で１回洗浄し、次いで結合バッファ（１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び０．０１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム含むＤＰＢＳ）でもう１回洗浄する。細胞を染色する前に、供給業者の説明書に従ってＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８モノクローナル抗体標識キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，＃Ａ−２０１８１）を用いて、本ｃ−Ｍｅｔ抗体とは異なるエピトープを認識するｃ−Ｍｅｔ抗体を標識する。２μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８−標識抗体を含有する結合バッファ１００μＬを細胞に添加し、次いで、氷上で６０分間インキュベートする。次いで、結合バッファで１回細胞を洗浄し、（死細胞を染色するために）２μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウムを含有するＤＰＢＳに再懸濁させる。細胞表面上に残存しているｃ−Ｍｅｔ分子の量をＦＡＣＳ分析により分析し、各サンプルについて１０，０００個の事象を得る。
細胞表面上の平均蛍光強度は、ｃ−Ｍｅｔ抗体処理後に細胞表面上に残存しているｃ−Ｍｅｔ分子の量を反映する。
１つの代表的な実験のデータを表１０に示す。
表１０．ＦＡＣＳ分析により測定したときのｃ−Ｍｅｔ内部移行に対するＣ８−及びＤ１１−抗体の効果
Figure 2012509881
上記データは、本ｃ−Ｍｅｔ抗体で処理した細胞の表面上の平均蛍光強度が、対応するＩｇＧアイソタイプ対照抗体又はｍＩｇＧ抗体で処理した細胞よりも低いことを示し、このことは、本ｃ−Ｍｅｔ抗体がｃ−Ｍｅｔの内部移行を誘導することを示唆する。更に、本ｃ−Ｍｅｔ抗体で処理した細胞の表面上の平均蛍光強度は、対照アゴニストｃ−Ｍｅｔ抗体５Ｄ５で処理した細胞よりも低い。内部移行率（％）は、以下のように算出することができる：
内部移行率（％）＝［１−（試験抗体の平均蛍光／アイソタイプ抗体対照の平均蛍光）］×１００
内部移行データは、本抗体がヒトｃ−Ｍｅｔの二量体化を誘導することを示唆する。実施例９及び１９のデータは、Ｃ８−及びＤ１１−抗体もｃ−Ｍｅｔの分解を誘導し、且つｃ−Ｍｅｔのリン酸化を低減することを示す。
相補的内部移行の結果は、ＭＫＮ４５細胞及びＣａｋｉ−１細胞において、蛍光標識されたマウスＣ８抗体を用いて共焦点顕微鏡により得られる。
Ｃ８−Ｈ２４１、Ｃ８−６、Ｃ８−ｃｏ−１６、及びマウスＤ１１抗体を用いて、カニクイザルｃ−Ｍｅｔをコードする核酸でトランスフェクトされたカニクイザルＮＩＨ３Ｔ３細胞でも同様の内部移行結果が得られる。
Ｃ８−Ｈ２４１、Ｃ８−６、Ｃ８−ｃｏ−１６、及びｏｐｔＤ１１抗体も、ヒトｃ−Ｍｅｔキナーゼドメイン突然変異Ｍ１１４９Ｔをコードする核酸でトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるｃ−Ｍｅｔの内部移行を誘導する。抗体Ｃ８−Ｈ２４１、Ｃ８−６、Ｃ８−ｃｏ−１６、及びマウスＤ１１も、ｃ−Ｍｅｔ膜近傍ドメイン突然変異Ｒ９８８Ｃを有する非小細胞肺癌Ｈ１４３７細胞におけるｃ−Ｍｅｔの内部移行を誘導する。両方の突然変異は、ｃ−Ｍｅｔの機能獲得型恒常的活性化を惹起する。
実施例９
インビトロにおける抗体のリガンド非依存性腫瘍細胞増殖の阻害
このアッセイでは、ＨＧＦリガンドの非存在下のＨＧＦ非依存性ＭＫＮ４５細胞における、ｃ−Ｍｅｔ抗体によるインビトロの腫瘍細胞増殖阻害を評価する。
ｃ−Ｍｅｔ及びアイソタイプ対照抗体を、表１１に示す最終濃度の２倍の濃度になるよう、培養培地（ＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１１８３５）、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃２５０３０）、１００Ｕ／５００ｍＬのペニシリンＧ、及び１００μｇ／５００ｍＬのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１５１４０））で希釈し、５０μＬの２×抗体溶液を、９６ウェル組織培養プレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ＃１４５０−５１７）の各ウェルに添加する。ＭＫＮ４５細胞（Ｊａｐａｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｂａｎｋ，＃ＪＣＲＢ０２５４）を上記培地中で維持し、１×１０５細胞／ｍＬになるよう同培地に再懸濁させる。このＭＫＮ４５細胞再懸濁液５０μＬを、５×１０３細胞／ウェルになるように各ウェルに添加する。次いで、相対湿度９５％及び５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２下、３７℃で４８時間インキュベートする。培養の最後の６時間、３７℃、相対湿度９５％、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２下にて、１μｃｉ／ウェルで３Ｈ−チミジン（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ ＃２４０６６）を細胞にパルスする。次いで、培地を除去し、ＤＰＢＳで細胞を１回洗浄する。この後、Ｏｐｔｉｐｈａｓｅ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，＃１２００−４３９）２００μＬを各ウェルに添加する。プレートをシールし、室温で少なくとも１時間インキュベートする。シンチレーションカウンタを用いて、３Ｈ−チミジンの細胞への取り込みを１分間計数する。
１つの代表的な実験のデータを表１１に示す。
表１１. ＭＫＮ４５細胞における種々のＣ８−及びＤ１１−抗体による３Ｈ−チミジン取り込み阻害
Figure 2012509881
これらのデータは、本発明の種々のＣ８−及びＤ１１−ｃ−Ｍｅｔ抗体が、３Ｈ−チミジンの取り込みを低下させることにより証明されるように、ＨＧＦ非依存性ＭＫＮ４５細胞増殖を阻害することを示す。それぞれｃ−Ｍｅｔの恒常的過剰発現及びリン酸化を示す、ＳＮＵ５及びＮＵＧＣ−４腫瘍細胞でも同様の結果が得られる。
実施例１０
ｃ−Ｍｅｔ抗体に応答する、リン酸化ｃ−Ｍｅｔ及び全ｃ−Ｍｅｔの減少、並びにｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメインの脱落の欠如
この実施例は、本発明のｃ−Ｍｅｔ抗体でＭＫＮ４５細胞を処理すると、リン酸化ｃ−Ｍｅｔ（ｐ−Ｍｅｔ）及び全ｃ−Ｍｅｔが減少するかどうかを調べる。更に、このアッセイを用いて、ｃ−Ｍｅｔ抗体処理が、ｃ−Ｍｅｔ ＥＣＤのＭＫＮ４５馴化培地中への脱落を誘導するかどうかを判定する。
ｃ−Ｍｅｔ及びアイソタイプ対照抗体を、表１２に示す最終濃度の２倍の濃度になるよう、培養培地（ＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１１８３５）、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１００８２）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃２５０３０）、１００Ｕ／５００ｍＬのペニシリンＧ、及び１００μｇ／５００ｍＬのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１５１４０））で希釈し、５０μＬの２×抗体溶液を、９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ，＃３５９６）の各ウェルに添加する。ＭＫＮ４５細胞（Ｊａｐａｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｂａｎｋ，＃ＪＣＲＢ０２５４）を上記培地中で維持し、１×１０５細胞／ｍＬになるよう同培地に再懸濁させる。このＭＫＮ４５細胞再懸濁液５０μＬを、５×１０３細胞／ウェルになるように各ウェルに添加する。次いで、相対湿度９５％及び５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２下、３７℃で２４時間プレートをインキュベートし、細胞溶解物を実施例７に記載のように調製する。更に、ｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤを定量するために、各処理を行った馴化培地を回収する。細胞溶解物中のｐ−Ｍｅｔ及び全ｃ−Ｍｅｔ数を、ＥＬＩＳＡにより測定し、溶解物のタンパク質濃度に正規化する（ＢＣＡにより測定されるように、Ｐｉｅｒｃｅ＃２３２２５）。
リン酸化ｃ−Ｍｅｔ
チロシン残基１２３０、１２３４、及び１２３５におけるｃ−Ｍｅｔのリン酸化は、実施例７に記載のように測定される。
全ｃ−Ｍｅｔ及びｃ−ＭｅｔのＥＣＤの脱落
全ｃ−Ｍｅｔ及びｃ−ＭｅｔのＥＣＤのＥＬＩＳＡのために、ｃ−Ｍｅｔ捕捉抗体をコーティングバッファ（ＢｉｏＦＸ，Ｇｌｅｎｄｏｒａ，ＣＡ，ＣＯＡＴ−１０００−０１）で２μｇ／ｍＬに希釈する。１１０μＬの希釈抗体をＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｍｏｎｒｏｅ，ＮＣ，＃６５５０８１）の各ウェルに添加し、４℃で一晩プレートをインキュベートする。ウェルを吸引し、ＴＢＳ−Ｔで２回洗浄し、次いで室温で１時間、ブロッキングバッファ（２％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを加えたＴＢＳ−Ｔ）２００μＬでブロッキングする。次いで、プレートをＴＢＳ−Ｔで２回洗浄する。次に、ＭＫＮ４５細胞溶解物、ＭＫＮ４５馴化培地、又はｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（配列番号７５）（標準物質として）を添加し、室温で２時間プレートをインキュベートする。次いで、プレートをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄する。ブロッキングバッファで希釈した捕捉抗体とは異なるｃ−Ｍｅｔエピトープに結合する、０．５μｇ／ｍＬのビオチン化された第２のｃ−Ｍｅｔ抗体（Ｍａｂ５Ｄ５）１００μＬを各ウェルに添加し、室温で２時間プレートをインキュベートする。次に、プレートをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄する。次いで、ブロッキングバッファで１／１２，０００に希釈したペルオキシダーゼ共役ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，＃０１６−０３０−０８４）１００μＬを添加し、混合物を室温で１時間インキュベートする。次いで、プレートをＴＢＳ−Ｔで６回洗浄する。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン溶液（ＢｉｏＦＸ，＃ＴＭＢＷ−１０００−０１）１００μＬを各ウェルに添加し、続いて１００μＬの停止溶液（ＢｉｏＦＸ，＃ＬＳＴＰ−１０００−０１）を添加する。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、５７０ｎｍで補正し、４５０ｎｍでプレートを読み取る。４−パラ−メータ分析を用いて検量線を作成し、ＳＯＦＴｍａｘ Ｐｒｏ３．１．２ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてサンプルの値を測定する。
表１２に示すように、ｐ−Ｍｅｔ及び全ｃ−ＭｅｔのＥＬＩＳＡのデータは、Ｍａｂ Ｃ８−Ｈ２４１処理が、ｐ−Ｍｅｔを最大７７％、全ｃ−Ｍｅｔを最大約６７％減少させることを明らかにする。Ｄ１１−８Ｂ８処理は、ｐ−Ｍｅｔを最大約７５％、全ｃ−Ｍｅｔを最大６３％減少させる。
実施例８に記載するように、これらのデータは、Ｃ８−及びＤ１１−抗体が、ｃ−Ｍｅｔの分解を誘導し、且つｃ−Ｍｅｔのリン酸化を減少させることを示す。
表１２のデータはまた、Ｃ８−Ｈ２４１及びＤ１１−８Ｂ８ｃ−Ｍｅｔ抗体による処理が、ｃ−ＭｅｔのＥＣＤの切断及び脱落を誘導しないことも示す。
表１２．ＭＫＮ４５細胞溶解物及び馴化培地における、リン酸化ｃ−Ｍｅｔ、全ｃ−Ｍｅｔ、及びｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメインの脱落に対するＣ８−及びＤ１１−抗体の効果
Figure 2012509881
Figure 2012509881
Figure 2012509881
実施例１１
ＨＧＦ非存在下のＣａｋｉ−１腫瘍細胞における抗体のアゴニスト活性
Ｃａｋｉ−１腎癌細胞は、ＨＧＦに応答して増殖する。本発明のｃ−Ｍｅｔ抗体のアゴニスト活性を評価するために、この実施例では、ＨＧＦの非存在下における、ｃ−Ｍｅｔ抗体によるＣａｋｉ−１細胞中のｃ−Ｍｅｔの活性化について調べる。
９６ウェル組織培養プレートのウェルの、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃２５０３０）、１００Ｕ／５００ｍＬのペニシリンＧ、及び１００μｇ／５００ｍＬのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１５１４０）を添加したマッコイ５Ａ培養培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１６６００）中に、５，０００個のヒト腎臓明細胞癌腫Ｃａｋｉ−１細胞（ＡＴＣＣ，＃ＨＴＢ−４６）を播種する。２４時間培養した後、更に２４時間、低血清培地（０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ）中で細胞を飢餓状態にする。次いで、３７℃、相対湿度９５％、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２下で、２４時間、表１３に示す最終濃度の低血清培地中にて、抗ｃ−Ｍｅｔ及び対照抗体の存在下で細胞を培養する。培養の最後の６時間、３７℃、相対湿度９５％、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２下にて、１μｃｉ／ウェルで３Ｈ−チミジン（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ ＃２４０６６）を細胞にパルスする。次に、培地を除去し、ＤＰＢＳで細胞を１回洗浄する。この後、Ｏｐｔｉｐｈａｓｅ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，＃１２００−４３９）２００μＬを各ウェルに添加する。次いで、プレートをシールし、室温で少なくとも１時間インキュベートする。シンチレーションカウンタを用いて、３Ｈ−チミジンの細胞への取り込みを１分間計数する。
１つの代表的な実験のデータを表１３に示す。
表１３．ＨＧＦ非存在下のＣａｋｉ−１細胞における３Ｈ−チミジン取り込みに対するＣ８−及びＤ１１−抗体の効果
Figure 2012509881
これらのデータは、ｃ−Ｍｅｔ抗体Ｃ８−Ｈ２４１、Ｃ８−６、Ｃ８−ｃｏ−１６、及びＤ１１−８Ｂ８は、ＩｇＧアイソタイプ対照に比べて、Ｃａｋｉ−１細胞中におけるチミジン−［メチル−３Ｈ］の取り込みを有意に増加させないことを示す。Ｄ１１−Ｃ２７Ｇ３及びＤ１１−Ｓ１７Ｙは、ＩｇＧアイソタイプ対照に比べて、Ｃａｋｉ−１細胞中におけるチミジン−［メチル−３Ｈ］の取り込みを、低度で可変的ではあるが、統計的に有意に刺激する。対照ｃ−Ｍｅｔアゴニスト抗体５Ｄ５は、同実験条件下で、Ｃａｋｉ−１細胞において本ｃ−Ｍｅｔ抗体よりも強くチミジン−［メチル−３Ｈ］の取り込みを誘導する。
実施例１２
ＨＧＦ非存在下の初代ヒト肝細胞における抗体のアゴニスト活性
ＨＧＦの非存在下で、ＨＧＦ応答性である初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）における本ｃ−Ｍｅｔ抗体のアゴニスト活性を更に評価する。
凍結保存したプレーティング可能なＰＨＨ細胞（ＫＱＧ Ｃｅｌｓｉｓ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＲＤ＃００００２）を３７℃で解凍し、ｔｏｒｐｅｄｏ抗生物質ミックス（Ｃｅｌｓｉｓ，＃Ｚ９９０００）を含むＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ ＣＰ培地（Ｃｅｌｓｉｓ，＃Ｚ９９０２９）に１７５，０００細胞／ｍＬになるように再懸濁させる。１ウェル当たり０．２ｍＬの再懸濁させたＰＨＨ細胞を、コラーゲンＩでコーティングした９６ウェルマイクロタイタープレート（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，＃３５４４０７）に３５，０００細胞／ウェルで添加し、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２で２４時間細胞をインキュベートする。次いで、培養培地を吸引し、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを加えたｔｏｒｐｅｄｏ抗生物質ミックスを含むＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ ＨＩ培地（Ｃｅｌｓｉｓ，＃Ｚ９９００９）を１ウェル当たり１５０μＬ添加し、更に１０μｇ／ｍＬ〜０．００３２μｇ／ｍＬの範囲の最終濃度のｃ−Ｍｅｔ抗体及び対照抗体５０μＬ、又は０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを加えたｔｏｒｐｅｄｏ抗生物質ミックスを含むＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ ＨＩ培地中最終濃度２００ｎｇ／ｍＬのＨＧＦを添加する。３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２下で４８時間細胞をインキュベートし、インキュベーションの最後の６時間、０．１ｍＣｉのチミジン−［メチル−３Ｈ］／ｍＬ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ，＃２４０６６）を１ウェル当たり１０μＬ添加する。アッセイプレートを−７０℃で凍結させ、３７℃で解凍し、Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いてＵｎｉＦｉｌｔｅｒ−９６，ＧＦ／Ｃプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，＃６００５１７４）上に収集する。ＵｎｉＦｉｌｔｅｒプレートを乾燥させ、１ウェル当たり２０μＬのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ ０ ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，＃６０１３６１１）を添加し、１４５０ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ液体シンチレーションカウンタ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）でプレートをカウントする。
表１４は、３回の処理の平均を標準偏差と共に示し、３回の反復実験を代表するものである。
表１４．ＨＧＦ非存在下の初代ヒト肝細胞における３Ｈチミジン取り込みに対する種々のＣ８−及びＤ１１−抗体の効果
Figure 2012509881
データは、ＩｇＧアイソタイプ対照と比べて、本ｃ−Ｍｅｔ抗体Ｃ８−Ｈ２４１は、ＰＨＨ細胞におけるチミジン−［メチル−３Ｈ］の取り込みを有意に増加させず；Ｃ８−６、Ｃ８−ｃｏ−１６、Ｄ１１−８Ｂ８、Ｄ１１−Ｃ２７Ｇ３、及びＤ１１−Ｓ１７Ｙは、低度で可変的であるが、統計的に有意にチミジン−［メチル−３Ｈ］の取り込みを刺激する。しかし、本ｃ−Ｍｅｔ抗体のアゴニスト活性は、５Ｄ５対照ｃ−Ｍｅｔ抗体よりも有意に低い。アゴニスト抗体５Ｄ５は、用量依存的様式でＰＨＨ増殖を刺激し、３μｇ／ｍＬの濃度で５倍増加させる。２００ｎｇ／ｍＬでは、ＨＧＦ刺激により、３Ｈチミジンの取り込みは５倍増加する。Ｍａｂ Ｃ８−Ｈ２４１は、１０μｇ／ｍＬで用いられるときでさえも増殖を誘導しない。
ＨＧＦ刺激に応答して増殖するヒト腎臓上皮ＨＫ２細胞でも同様の結果が得られる。
実施例１３
ＨＧＦ非存在下のＨｅｐＧ２細胞における管形態形成に対する抗体の効果
ＨＧＦは、基底膜の成分を含有する細胞外マトリクス物質であるＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，＃３５４２３４）中で増殖するＨｅｐＧ２細胞の管形態形成の変化を誘導する。この実験では、ＨｅｐＧ２細胞における管形態形成の変化誘導に対する、本発明の抗体のＨＧＦ様アゴニスト活性を評価する。
１０％のＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中で、ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ，＃ＨＢ−８０６５）を培養する。１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃２５０３０）、１００Ｕ／５００ｍＬのペニシリンＧ、及び１００μｇ／５００ｍＬのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１５１４０）を添加したＯｐｉ−ＭＥＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃３１９８５）で希釈したＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）溶液（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標），Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）１００μＬを、９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ，＃３５９６）のウェルにプレーティングする。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）溶液を固化させた後、１０％の血清を添加した培養培地５０μＬに２０００個のＨｅｐＧ２細胞を添加する。次いで、最終濃度５０μｇ／ｍＬのｃ−Ｍｅｔ抗体及び対照抗体、又は最終濃度５０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦを細胞に添加する。５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２を含む湿潤雰囲気下、３７℃で４日間細胞を増殖させる。４日後、培地の上部を除去し、ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬのｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット（Ｓｉｇｍａ，＃Ｉ８３７７）５０μＬで置換し、細胞を同条件下で更に４８時間インキュベートする。染色された３２ｍｍの領域の写真を撮影し、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ６（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，ＭＤ）を用いて分析する。
５０μｇ／ｍＬの抗体について、１つの代表的な実験のデータを表１５に示す。
表１５. ＨｅｐＧ２細胞における管形態形成に対するＣ８−抗体の効果
Figure 2012509881
これらのデータは、アイソタイプ対照と比べて、ＨＧＦ及び対照アゴニスト抗体５Ｄ５は、ＨｅｐＧ２細胞における管形態形成変化を約５倍誘導することを示す。対照的に、本ｃ−Ｍｅｔ抗体Ｃ８−Ｈ２４１及びＣ８−ｃｏ−１６は、同条件下でＨｅｐＧ２細胞の有意な管形態形成変化を誘導しないが、ｃ−Ｍｅｔ抗体Ｃ８−６は、僅かな低度の刺激を誘導する。
Ｍａｂ Ｄ１１−８−Ｂ８でも同様の結果が得られる。
実施例１４
細胞の運動性に対する抗体の効果：ＤＵ１４５細胞散乱アッセイ及びＨ４４１細胞スクラッチアッセイ
ＨＧＦで刺激すると、ＤＵ１４５前立腺癌細胞は、互いに解離し、Ｈ４４１細胞は、コンフルエントな細胞層に作製された引っ掻き傷を充填する。Ｈ４４１細胞は、高水準のｃ−Ｍｅｔ発現及びこの受容体の恒常的リン酸化を示すが、依然としてＨＧＦ応答性である。以下の実験は、散乱アッセイ及びスクラッチアッセイによって、細胞の運動性に対する本発明の抗体のアゴニスト効果を評価する。
ＤＵ１４５細胞散乱アッセイ
５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２下、３７℃で、ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１１０９５）＋１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１００８２）中にて増殖させたＤＵ１４５細胞（ＡＴＣＣ，＃ＨＴＢ−８１）を、黒色ＶｉｅｗＰｌａｔｅ９６ウェルプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，＃６００５１８２）に、７０μＬの体積で、２×１０３細胞／ウェルになるようにプレーティングし、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２下、３７℃で一晩インキュベートする。ｃ−Ｍｅｔ抗体及び対照抗体を細胞培養培地で希釈して最終濃度２０μｇ／ｍＬで添加し、ＨＧＦを最終濃度２０ｎｇ／ｍＬで添加し、それぞれ３０μＬの体積で、１２回繰り返し、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２下、３７℃で４８時間インキュベートする。次いで、培地を吸引し、室温で１５分間２％のホルムアルデヒド中にて細胞を固定する。ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、５Ｕ／ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃Ａ１２３７９）５０μＬを室温で３０分間添加する。ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、１５μＭのヨウ化プロピジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃Ｐ３５６６）５０μＬを添加する。次いで、コロニー中のＤＵ１４５細胞の割合を測定するために、Ｊｏｃｋｙｓｓソフトウェアを用いて、Ａｃｕｍｅｎ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（商標）レーザースキャニング蛍光マイクロプレート血球計数器（ＴＴＰ Ｌａｂｔｅｃｈ Ｌｔｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）でプレートを読み取る。
結果を表１６に示す。
表１６．ＤＵ１４５細胞の散乱に対するＣ８−及びＤ１１−抗体の効果
Figure 2012509881
上記データは、アゴニストｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂ ５Ｄ５及びＨＧＦは、ＤＵ１４５細胞の散乱／運動性を有意に刺激するが、ｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂ Ｃ８−Ｈ２４１、Ｃ８−ｃｏ−１６、Ｃ８−６、又はＤ１１−８Ｂ８は有意に刺激しないことを示す。
Ｈ４４１細胞スクラッチアッセイ
Ｈ４４１スクラッチアッセイでは、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１１８３５）；１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１００８２）；２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃２５０３０）；１００Ｕ／５００ｍＬのペニシリンＧ、及び１００μｇ／５００ｍＬのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１５１４０））中でＨ４４１細胞（ＡＴＣＣ，＃ＨＴＢ−１７４）を増殖させ、６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ，＃３５９８）のウェル内の培養培地に１×１０６細胞／２ｍＬ／ウェルで播種する。相対湿度９５％及び５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２下で３日間プレートをインキュベートする。次いで、培地を吸引し、細胞を低血清培地（ＲＰＭＩ培地中０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ）中で１６時間飢餓状態にする。各ウェルの中央の、ウェルの底部に存在するコンフルエンな細胞層を、５ｍＬのピペット先端で引っ掻き、浮遊細胞を吸引する。残りの細胞を低血清培地で１回洗浄する。低血清培地を添加し、引っ掻いた領域を４倍の対物レンズを備える明視野顕微鏡を用いて画像化する。これらの間隙を、０時間における間隙として定義する。
試験抗体を最終濃度１０μｇ／ｍＬで細胞に添加し、次いで、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２下、３７℃で１６時間培養する。ＨＧＦを２００ｎｇ／ｍＬの最終濃度で試験する。各処理群を少なくとも２つ組のウェルで試験する。１６時間後、引っ掻いた領域を、再度、明視野顕微鏡を用いて画像化する。これらの間隙を、１６時間における間隙として定義する。
間隙を埋めるためのＨ４４１細胞の運動に対するｃ−Ｍｅｔ抗体又はＨＧＦの効果を以下のように算出する：
Figure 2012509881
結果を表１７に示す。
表１７．Ｈ４４１スクラッチアッセイにおけるＣ８−抗体の効果
Figure 2012509881
上記データは、アゴニストｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂ ５Ｄ５及びＨＧＦが、引っ掻いた領域のＨ４４１細胞の運動／充填を刺激することを示す。同条件下で、ｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂ Ｃ８−Ｈ２４１及びＣ８−６は、Ｈ４４１細胞の運動性を刺激しない。
実施例１５
ＨｅｐＧ２細胞の侵襲性に対するｃ−Ｍｅｔ抗体の効果
ＨＧＦ及びアゴニストｃ−Ｍｅｔ抗体は、ｃ−Ｍｅｔ保有細胞の侵襲を刺激する。この実施例は、侵襲アッセイにおいてＨＧＦ応答性であるＨｅｐＧ２細胞を使用する細胞侵襲アッセイにおいて、本ｃ−Ｍｅｔ抗体のアゴニスト活性を評価する。
ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ，＃ＨＢ−８０６５）を無血清ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１１０９５）中で一晩飢餓状態にし、次いで総体積５００μＬの５×１０４個の細胞をｍａｔｒｉｇｅｌ侵襲チャンバ（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，＃３５４４８３）の最上チャンバの各ウェルに添加し、最下チャンバには、総体積７５０μＬの、１０μｇ／ｍＬの濃度の無血清培地又は無血清培地中５０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦに抗体を入れ、続いて５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２下、３７℃で４８時間インキュベートする。スワブを用いて最上チャンバから非侵襲細胞を除去し、次いで９５％のエタノールで膜を固定し、０．２％（ｗ／ｖ）のクリスタルバイオレットで染色する。洗浄及び乾燥後、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ６ Ｍａｎｕａｌ Ｔａｇ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，ＭＤ）ソフトウェアで、２．５×対物レンズを用いて染色細胞を撮影した写真を分析することにより、侵襲細胞数を計数する。
結果を表１８に要約する。
表１８．ＨｅｐＧ２細胞細胞の侵襲性に対するＣ８−、Ｃ８、及びＤ１１−抗体の効果
Figure 2012509881
上記データは、アゴニストｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂ ５Ｄ５及びＨＧＦがＨｅｐＧ２細胞の侵襲を刺激するが、ｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂ Ｃ８−Ｈ２４１及び（マウス）Ｃ８は、ＨｅｐＧ２細胞の侵襲を刺激しないことを示す。マウスｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂ ｏｐｔＤ１１は、ＨｅｐＧ２細胞の侵襲を弱く誘導する。
実施例１６
Ｃ８−及びＤ１１−抗体はＣａｋｉ−１細胞をスタウロスポリン誘導性アポトーシスから保護しない
ＨＧＦ及びアゴニストｃ−Ｍｅｔ抗体は、細胞をスタウロスポリン誘導性細胞死から保護する。この実施例は、ＨＧＦ応答性Ｃａｋｉ−１細胞を使用するスタウロスポリン誘導性アポトーシスアッセイにおいて、本発明のｃ−Ｍｅｔ抗体のアゴニスト活性を評価する。
Ｃａｋｉ−１細胞（ＡＴＣＣ，＃ＨＴＢ−４６）を、実施例１１に記載のように増殖させ、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ，＃３５９６）内の培養培地に１×１０４細胞／ウェルで播種し、抗体（細胞培養培地で３００００ｎｇ／ｍＬから３ｎｇ／ｍＬに希釈）又はＨＧＦ（２２５ｎｇ／ｍＬから０．０２ｎｇ／ｍＬに希釈）で１時間前処理し、次いで０．１μＭのスタウロスポリン（最終濃度）で３７℃にて４８時間処理する。培地を吸引し、細胞死検出ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，＃１１７７４４２５００１）の溶解バッファ成分０．２ｍＬを用いて３０分間細胞を溶解させる。このキットは、２０μＬの各溶解物を用いて、４５０ｎｍにおける吸収により測定したときの細胞質性ヒストン関連ＤＮＡ断片の検出により細胞死を測定する。４５０ｎｍにおける光学密度が高いほど、アポトーシスが多いことを示す。
表１９に示す結果は、ＨＧＦはスタウロスポリン誘導性アポトーシスからＣａｋｉ−１細胞を保護するが、ｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂ Ｃ８−Ｈ２４１、Ｃ８−６、及びＤ１１−８Ｂ８は、スタウロスポリン誘導性アポトーシスからＣａｋｉ−１細胞を保護しないことを示す。
表１９．Ｃａｋｉ−１細胞におけるスタウロスポリン誘導性アポトーシスに対するｃ−Ｍｅｔ抗体の効果
Figure 2012509881
実施例１７
血管新生に対するＣ８−抗体の効果
ＨＧＦ及びアゴニストｃ−Ｍｅｔ抗体は、血管新生を刺激する。ＡＤＳＣ／ＥＣＦＣ共培養管形成アッセイにおいて、この機能的アゴニスト特性について本発明のｃ−Ｍｅｔ抗体を評価する。脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）は、ＨＧＦを発現し；内皮コロニー形成細胞（ＥＣＦＣ）は、ＨＧＦによる刺激に応答して管を形成する。
ＡＤＣＳ（Ｌｏｎｚａ，Ａｌｌｅｎｄａｌｅ，ＮＪ，＃ＰＴ−５００６）を解離させ、基本培地（ＭＣＤＢ−１３１培地（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ ＃Ｍ８５３７））＋３０μｇ／ｍＬのＬ−アスコルビン酸２−ホスフェート（Ｓｉｇｍａ ＃Ａ８９６０）、１μＭのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ ＃Ｄ４９０２）、５０μｇ／ｍＬのトブラマイシン（Ｓｉｇｍａ ＃Ｔ４０１４）、１０μｇ／ｍＬのＣｅｌｌ Ｐｒｉｍｅ ｒ−トランスフェリンＡＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＃９７０１）＋１０μｇ／ｍＬのＮｕｃｅｌｌｉｎ（Ｌｉｌｌｙ ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｓｕｌｉｎ））に再懸濁させ、９６ウェルプレートに４×１０４細胞／ウェルでプレーティングし、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２下、３７℃で一晩インキュベートする。培地を吸引し、５００μｇ／ｍＬのヘパリンナトリウム（Ｓｉｇｍａ，＃Ｈ３３９３）を１００μＬ／ウェルで基本培地に添加し；次いで細胞を３７℃で１時間インキュベートする。ウェルを吸引し、１００μＬの基本培地で１回洗浄し、ＥＣＦＣを以下のように添加する：ＥＣＦＣ（ＥｎｄＧｅｎｉｔｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ ＃ＥＧＴ−ＥＣＦＣ１００５０６）を解離させ、基本培地で洗浄し、基本培地に再懸濁させ、９６ウェルプレート内のＡＤＳＣの上部に４×１０３細胞／ウェルとなるように添加する。３７℃で４時間インキュベートした後、ＨＧＦ及び抗体を細胞培養培地で希釈し、以下の最終濃度で別個のウェルに添加する：ＨＧＦ：１００ｎｇ／ｍＬ；抗体：１０μｇ／ｍＬ。また、ＨＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＃ＡＢ−２９４−ＮＡ）を最終濃度１０μｇ／ｍＬで添加する。細胞を３７℃で更に４日間インキュベートする。ウェルを吸引し、１００μＬ／ウェルの１％パラホルムアルデヒドを添加し、次いで２０〜３０分間インキュベートする。細胞をＰＢＳ−ＢＳＡ（０．１％ＢＳＡ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃１５２６０−０３７）で３回洗浄し、１μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３１抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃ＡＦ８０６）５０μＬで、３７℃にて１時間、又は４℃にて一晩処理する。細胞をＰＢＳ−ＢＳＡで２回洗浄し、室温で１時間、４μｇ／ｍＬの抗ヒツジＩｇＧＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８共役体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃Ａ１１０１５）５０μＬで処理する。細胞をＰＢＳ−ＢＳＡで２回洗浄し、１００μＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３４２染料で染色し、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ ＡｒｒａｙＳｃａｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で読み取る。ｖＨＣＳ Ｖｉｅｗバージョン１．４．６ソフトウェアを用いて、総管面積を測定し、これを用いて、血管新生の刺激に対する種々の抗体及びＨＧＦの効果を評価する。
結果を表２０に示す。
表２０．ＥＣＦＣ細胞における管形成に対するＣ８−抗体の効果
Figure 2012509881
上記結果は、Ｃ８−Ｈ２４１及びＣ８−６は、培地又は対応するアイソタイプ対照抗体と比べて管形成を刺激しないが、ＨＧＦ及びアゴニストＭａｂ ５Ｄ５は、管形成を有意に刺激することを示す。
実施例１８
異種移植モデルにおけるＨＧＦ非依存性及びＨＧＦ依存性腫瘍細胞増殖の阻害
本発明のｃ−Ｍｅｔ抗体による、ＨＧＦ非依存性及びＨＧＦ依存性腫瘍細胞増殖の阻害を、それぞれ、ＭＫＮ４５細胞及びＵ８７ＭＧ（ヒト神経膠芽腫）細胞マウス異種移植モデルを使用するインビボアッセイにおいて評価する。ＭＫＮ４５細胞は、高水準のｃ−Ｍｅｔを恒常的に発現し、ＨＧＦの非存在下でｃ−Ｍｅｔをリン酸化する。Ｕ８７ＭＧ細胞は、自己分泌様式でＨＧＦを分泌し、且つＨＧＦ応答性である。
実施例８に記載のように、ＭＫＮ４５細胞（Ｊａｐａｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ，＃ＪＣＲＢ０２５４）を培養液中で拡大し、トリプシン処理して単一細胞にし、収集し、ＰＢＳに再懸濁させる。ＰＢＳ中２００万個のＭＫＮ４５細胞を無胸腺ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）のひ腹に皮下注射する。ｃ−Ｍｅｔ抗体並びに対応するＩｇＧ２及びＩｇＧ４抗体をＰＢＳ（ｐＨ７．２）で希釈し、１、５、又は２０ｍｇ／ｍＬで腫瘍細胞を移植した３又は７日後から開始して、静脈注射により週１回の頻度で投与する。処理過程中、週２回、腫瘍体積を三次元キャリパで測定することにより、腫瘍細胞の増殖阻害を判定する。毒性の一般的な測定値として、体重を測定する。
Ｕ８７ＭＧ細胞（ＡＴＣＣ，＃ＨＴＢ−１４）を３７℃にてＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１１０９５）中で増殖させ、培養液中で拡大し、トリプシン処理して単一細胞にし、収集し、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１４１９０）に再懸濁させる。５００万個の細胞を無胸腺ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）のひ腹に皮下注射する。ｃ−Ｍｅｔ抗体をＰＢＳで希釈し、腫瘍細胞を移植した７日後に開始して、表２２に示す用量を静脈注射により週１回の頻度で投与する。対照ＩｇＧ４抗体は、１０ｍｇ／ｋｇで投与する。処理過程中、週２回、腫瘍体積を三次元キャリパで測定することにより腫瘍細胞の増殖阻害を判定する。毒性の一般的な測定値として、体重を測定する。
ＭＫＮ４５細胞異種移植モデルにおける４種の抗体、Ｄ１１−８Ｂ８、Ｃ８−Ｈ２４１、Ｃ８−６、及びＣ８−ｃｏ−１６の抗腫瘍効果を表２１に要約する。「最大阻害率％」は、対応する対照抗体による処理（０％阻害）と比較した、腫瘍増殖の阻害率を表す。
５ｍｇ／ｋｇ又は２０ｍｇ／ｋｇで投与するとき、４種全てのｃ−Ｍｅｔ抗体は、対応するＩｇＧアイソタイプ対照に比べて、ＭＫＮ４５腫瘍細胞の増殖を有意に阻害する。
表２１．インビボにおけるＨＧＦ非依存性ＭＫＮ４５腫瘍細胞増殖に対するＣ８−及びＤ１１−抗体の効果
Figure 2012509881
表２２に要約するように、Ｃ８−Ｈ２４１による腫瘍細胞増殖の用量依存的阻害は、ＨＧＦ依存性Ｕ８７ＭＧ細胞異種移植モデルでも観察される。「最大阻害率％」は、対応するＩｇＧ４対照抗体による処理（０％阻害）と比較した、腫瘍増殖の阻害率を表す。
表２２．インビボにおけるＨＧＦ依存性Ｕ８７ＭＧ腫瘍細胞増殖に対するＣ８−Ｈ２４１抗体の効果
Figure 2012509881
また、５及び２０ｍｇ／ｋｇでは、Ｃ８−Ｈ２４１抗体は、Ｈ４４１非小細胞肺癌異種移植腫瘍の増殖を、それぞれ５８％及び６０％阻害する。Ｈ４４１細胞は、高水準のｃ−Ｍｅｔ発現、及びｃ−Ｍｅｔの恒常的リン酸化を示すが、依然としてＨＧＦ応答性である。
実施例１９
ＭＫＮ４５異種移植腫瘍における全ｃ−Ｍｅｔ及びリン酸化ｃ−Ｍｅｔの抗体減少
この実施例では、ＭＫＮ４５（ＨＧＦ非依存性）異種移植腫瘍を有するマウスにおける全ｃ−Ｍｅｔ及びリン酸化ｃ−Ｍｅｔに対するｃ−Ｍｅｔ抗体Ｃ８−Ｈ２４１のインビボ活性について調べる。全ｃ−Ｍｅｔ及び（チロシン１３４９が）リン酸化されたｃ−Ｍｅｔの両方が用量依存的に減少することが、抗体投与の２４時間後に観察される。
実施例８に記載のように、ＭＫＮ４５細胞を培養液中で拡大し、トリプシン処理し、収集する。ＰＢＳ中２００万個のＭＫＮ４５細胞を無胸腺ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）のひ腹に皮下注射する。ｃ−Ｍｅｔ抗体Ｃ８−Ｈ２４１をＰＢＳ（ｐＨ７．２）で希釈し、２．５、５、１０、２０、及び４０ｍｇ／ｋｇで、腫瘍細胞を移植した８日後に静脈注射により投与する。対照抗体ｈＩｇＧ４は、４０ｍｇ／ｋｇで投与する。２４時間処理した後、腫瘍を除去し、急速冷凍し、−８０℃で一時的に保存し、溶解バッファ（５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、５ｍＭのエチレングリコール−ビス（ｂ−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２０ｍＭのピロリン酸ナトリウム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，＃Ｓ３９０−５００）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＮａＦ、１％（ｖ／ｖ）オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）−Ｘ１００）、完全プロテアーゼ阻害剤、ＥＤＴＡ不含（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，＃１８３６１５３）ホスファターゼ阻害剤カクテルＩ（Ｓｉｇｍａ ＃Ｐ２８５０）、及びホスファターゼ阻害剤カクテルＩＩ（Ｓｉｇｍａ ＃Ｐ５７２６））で溶解させる。
全ｃ−ＭｅｔＥＬＩＳＡ
全ｃ−ＭｅｔＥＬＩＳＡでは、ｃ−Ｍｅｔ捕捉抗体をＢｕｐ Ｈコーティングバッファ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，＃２８３８２）で２μｇ／ｍＬに希釈する。１ウェル当たり１００μＬの希釈した抗体を、ＥＬＩＳＡプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ ＃４３９４５４）に添加し、プレートを４℃で一晩インキュベートする。ウェルを吸引し、ＴＢＳ−Ｔで２回洗浄し、次いで、室温で１時間、２００μＬのブロッキングバッファ（２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを加えたＴＢＳ−Ｔ）を用いてブロッキングする。プレートをＴＢＳ−Ｔで２回洗浄する。次いで、腫瘍溶解物又はｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメイン（配列番号７５のアミノ酸２５〜９３２）の希釈液を添加し、プレートを４℃で一晩インキュベートする。次いで、プレートをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄する。０．５μｇ／ｍＬのビオチン化Ｍａｂ ５Ｄ５（捕捉抗体とは異なるｃ−Ｍｅｔエピトープに結合する第２のｃ−Ｍｅｔ抗体として）１００μＬをブロッキングバッファで希釈し、次いで各ウェルに添加し、プレートを室温で２時間インキュベートする。次いで、プレートをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄する。次いで、ブロッキングバッファで１／１０，０００に希釈したペルオキシダーゼ共役ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，＃０１６−０３０−０８４）１００μＬを添加し、混合物を室温で１時間インキュベートする。次いで、プレートをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄する。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン溶液（ＢｉｏＦＸ，＃ＴＭＢＷ−１０００−０１）１００μＬを各ウェルに添加し、次いで、１００μＬの停止溶液（ＢｉｏＦＸ，＃ＬＳＴＰ−１０００−０１）を添加する。ＳＯＦＴｍａｘ Ｐｒｏ３．１．２ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を備えるＳｐｅｃｔｒａＭａｘ２５０プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、４５０ｎｍでプレートを読み取る。
リン酸化ｃ−ＭｅｔＥＬＩＳＡ
ホスホ−ｃ−ＭｅｔＥＬＩＳＡでは、ｃ−Ｍｅｔ捕捉抗体をＢｕｐ Ｈコーティングバッファ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，＃２８３８２）で２μｇ／ｍＬに希釈する。１ウェル当たり１００μＬの希釈した抗体を、ＥＬＩＳＡプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ ＃４３９４５４）に添加し、プレートを４℃で一晩インキュベートする。ウェルを吸引し、ＴＢＳ−Ｔで２回洗浄し、次いで、室温で１時間、２００μＬのブロッキングバッファ（２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを加えたＴＢＳ−Ｔ）を用いてブロッキングする。プレートをＴＢＳ−Ｔで２回洗浄する。次いで、ＭＫＮ４５細胞溶解物を添加し、プレートを室温で一晩インキュベートする。次いで、プレートをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄する。次いで、ブロッキングバッファで希釈した０．５μｇ／ｍＬの抗ｐＹ１３４９ ｃ−Ｍｅｔ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，＃３１２１）１００μＬを各ウェルに添加し、プレートを室温で２時間インキュベートする。次いで、プレートをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄する。次いで、ブロッキングバッファで１／１０，０００に希釈したペルオキシダーゼ共役抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，＃１１１−０３５−１４４）１００μＬを添加し、混合物を室温で１時間インキュベートする。次いで、プレートをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄する。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン溶液（ＢｉｏＦＸ，＃ＴＭＢＷ−１０００−０１）１００μＬを各ウェルに添加し、次いで、１００μＬの停止溶液（ＢｉｏＦＸ，＃ＬＳＴＰ−１０００−０１）を添加する。ＳＯＦＴｍａｘ Ｐｒｏ３．１．２ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を備えるＳｐｅｃｔｒａＭａｘ２５０プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、４５０ｎｍでプレートを読み取る。
結果を表２３に示す。
このデータは、ＭＫＮ４５異種移植腫瘍をＭａｂ Ｃ８−Ｈ２４１で２４時間インビボ処理すると、これら条件下で全ｃ−Ｍｅｔは最大約４３％、リン酸化ｃ−Ｍｅｔは最大約７３％減少することを示す。
表２３．インビボにおいてｃ−Ｍｅｔ抗体Ｃ８−Ｈ２４１で２４時間処理した後のＭＫＮ４５異種移植腫瘍における全ｃ−Ｍｅｔ及びリン酸化ｃ−Ｍｅｔの減少
全ｃ−Ｍｅｔの減少
Figure 2012509881
アミノ酸及びヌクレオチド配列

軽鎖可変領域アミノ酸配列

Ｄ１１−Ｓ１７Ｙ（配列番号１）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＳＶＳＳＳＩＳＳＴＮＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＴＳＹＬＡＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＹＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ

Ｄ１１−８Ｂ８（配列番号２）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＳＶＳＳＳＩＳＳＴＮＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＴＳＹＬＡＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＹＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ

Ｄ１１−Ｃ２７Ｇ３（配列番号３）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＳＶＳＳＳＩＳＳＴＮＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＴＳＲＬＲＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＹＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ

Ｃ８−６（配列番号４）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＩＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ

Ｃ８−Ｈ２４１（配列番号５）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＶＹＳＧＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ

Ｃ８−ｃｏ−１６（配列番号６）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＶＳＳＳＶＲＳＩＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＶＹＲＧＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ

軽鎖可変領域核酸配列

Ｄ１１−Ｓ１７Ｙ（配列番号７）
ＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＴＧＴＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＡＴＡＡＧＴＴＣＣＡＣＣＡＡＣＴＴＡＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＧＣＡＣＡＴＣＣＴＡＴＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＴＡＣＡＧＴＴＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＴＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ

Ｄ１１−８Ｂ８（配列番号８）
ＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＴＧＴＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＡＴＡＡＧＴＴＣＣＡＣＣＡＡＣＴＴＡＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＧＣＡＣＡＴＣＣＴＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＴＡＣＡＧＴＴＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＴＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ

Ｄ１１−Ｃ２７Ｇ３（配列番号９）
ＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＴＧＴＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＡＴＡＡＧＴＴＣＣＡＣＣＡＡＣＴＴＡＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＧＣＡＣＡＴＣＣＡＧＡＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＴＡＣＡＧＴＴＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＴＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ

Ｃ８−６（配列番号１０）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＡＧＴＧＴＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＣＣＡＴＴＴＡＣＴＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＡＧＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＴＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＡＴＴＣＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ

Ｃ８−Ｈ２４１（配列番号１１）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＡＧＴＧＴＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＣＣＡＴＴＴＡＣＴＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＡＧＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＴＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＧＴＧＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ

Ｃ８−ｃｏ−１６（配列番号１２）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＡＧＴＧＴＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＣＧＴＴＣＣＡＴＴＴＡＣＴＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＡＧＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＴＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＧＧＧＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ

重鎖可変領域アミノ酸配列

Ｄ１１−Ｓ１７Ｙ（配列番号１３）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＲＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＶＴＧＤＴＹＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＧＡＦＹＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳ

Ｄ１１−８Ｂ８（配列番号１４）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＲＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＶＴＧＤＴＹＹＩＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＧＡＦＦＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳ

Ｄ１１−Ｃ２７Ｇ３（配列番号１５）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＲＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＶＴＧＤＴＹＹＲＥＰＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＧＡＦＹＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳ

Ｃ８−６（配列番号１６）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＶＮＰＮＲＧＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＮＷＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳ

Ｃ８−Ｈ２４１（配列番号１７）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＶＮＰＮＲＲＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＡＮＷＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳ

Ｃ８−ｃｏ−１６（配列番号１８）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＶＮＰＹＲＧＳＴＴＹＮＱＫＦＥＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＡＮＩＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳ

重鎖可変領域核酸配列

Ｄ１１−Ｓ１７Ｙ（配列番号１９）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＡＡＧＴＡＧＧＴＡＴＡＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＴＴＡＴＣＣＴＧＴＡＡＣＴＧＧＴＧＡＴＡＣＴＴＡＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＧＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＡＣＡＡＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＣＴＡＣＧＧＡＧＣＴＴＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣ

Ｄ１１−８Ｂ８（配列番号２０）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＡＡＧＴＡＧＧＴＡＴＡＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＴＴＡＴＣＣＴＧＴＡＡＣＴＧＧＴＧＡＴＡＣＴＴＡＣＴＡＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＧＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＡＣＡＡＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＣＴＡＴＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣ

Ｄ１１−Ｃ２７Ｇ３（配列番号２１）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＡＡＧＴＡＧＧＴＡＴＡＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＴＴＡＴＣＣＴＧＴＡＡＣＴＧＧＴＧＡＴＡＣＴＴＡＣＴＡＣＡＧＡＧＡＧＣＣＴＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＧＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＡＣＡＡＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＣＴＡＴＧＧＧＧＣＴＴＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣ

Ｃ８−６（配列番号２２）
ＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＴＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＧＡＣＴＡＣＴＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＴＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＴＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＴＣＧＴＧＴＴＡＡＴＣＣＴＡＡＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＡＣＴＡＣＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＡＴＴＣＧＡＧＧＧＣＣＧＴＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＣＧＴＡＧＣＣＴＧＣＧＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＣＧＴＡＣＧＡＡＣＴＧＧＣＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣ

Ｃ８−Ｈ２４１（配列番号２３）
ＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＴＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＧＡＣＴＡＣＴＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＴＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＴＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＴＣＧＴＧＴＴＡＡＴＣＣＴＡＡＣＣＧＧＡＧＧＧＧＴＡＣＴＡＣＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＡＴＴＣＧＡＧＧＧＣＣＧＴＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＣＧＴＡＧＣＣＴＧＣＧＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＣＧＴＧＣＧＡＡＣＴＧＧＣＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣ

Ｃ８−ｃｏ−１６（配列番号２４）
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完全軽鎖アミノ酸配列

Ｄ１１−Ｓ１７Ｙ カッパ（配列番号２５）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＳＶＳＳＳＩＳＳＴＮＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＴＳＹＬＡＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＹＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

Ｄ１１−８Ｂ８ カッパ（配列番号２６）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＳＶＳＳＳＩＳＳＴＮＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＴＳＹＬＡＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＹＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

Ｄ１１−Ｃ２７Ｇ３ カッパ（配列番号２７）
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Ｃ８−６ カッパ（配列番号２８）
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Ｃ８−Ｈ２４１ カッパ（配列番号２９）
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Ｃ８−ｃｏ−１６ カッパ（配列番号３０）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＶＳＳＳＶＲＳＩＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＶＹＲＧＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

完全軽鎖核酸配列

Ｄ１１−Ｓ１７Ｙ ＩｇＧ２ ＬＣ（配列番号３１）
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Ｄ１１−８Ｂ８ ＩｇＧ２ ＬＣ（配列番号３２）
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Ｄ１１−Ｃ２７Ｇ３ ＩｇＧ２ ＬＣ（配列番号３３）
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Ｃ８−６ ＩｇＧ４ ＬＣ（配列番号３４）
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Ｃ８−Ｈ２４１ ＩｇＧ４ ＬＣ（配列番号３５）
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Ｃ８−ｃｏ１６ ＩｇＧ４ ＬＣ（配列番号３６）
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完全重鎖アミノ酸配列

Ｄ１１−Ｓ１７Ｙ ＩｇＧ２（配列番号３７）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＲＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＶＴＧＤＴＹＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＧＡＦＹＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＭＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ

Ｄ１１−８Ｂ８ ＩｇＧ２（配列番号３８）
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Ｄ１１−Ｃ２７Ｇ３ ＩｇＧ２（配列番号３９）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＲＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＶＴＧＤＴＹＹＲＥＰＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＧＡＦＹＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＭＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ

Ｃ８−６ ＩｇＧ４（配列番号４０）
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Ｃ８−Ｈ２４１ ＩｇＧ４（配列番号４１）
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Ｃ８−ｃｏ−１６ ＩｇＧ４（配列番号４２）
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完全重鎖核酸配列

Ｄ１１−Ｓ１７Ｙ ＩｇＧ２ ＨＣ（配列番号４３）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＡＡＧＴＡＧＧＴＡＴＡＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＴＴＡＴＣＣＴＧＴＡＡＣＴＧＧＴＧＡＴＡＣＴＴＡＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＧＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＡＣＡＡＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＣＴＡＴＧＧＧＧＣＴＴＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＣＡＧＴＴＧＡＧＣＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＡＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴ

Ｄ１１−８Ｂ８ ＩｇＧ２ ＨＣ（配列番号４４）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＡＡＧＴＡＧＧＴＡＴＡＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＴＴＡＴＣＣＴＧＴＡＡＣＴＧＧＴＧＡＴＡＣＴＴＡＣＴＡＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＧＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＡＣＡＡＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＣＴＡＴＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＣＡＧＴＴＧＡＧＣＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＡＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴ

Ｄ１１−Ｃ２７Ｇ３ ＩｇＧ２ ＨＣ（配列番号４５）
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Ｃ８−６ ＩｇＧ４ ＨＣ（配列番号４６）
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Ｃ８−Ｈ２４１ ＩｇＧ４ ＨＣ（配列番号４７）
ＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＴＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＡＣＡＴＴＣＡＣＴＧＡＣＴＡＣＴＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＴＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＴＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＴＣＧＴＧＴＴＡＡＴＣＣＴＡＡＣＣＧＧＡＧＧＧＧＴＡＣＴＡＣＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＡＴＴＣＧＡＧＧＧＣＣＧＴＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＣＧＴＡＧＣＣＴＧＣＧＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＣＧＴＧＣＧＡＡＣＴＧＧＣＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴ

Ｃ８−ｃｏ１６ ＩｇＧ４ ＨＣ（配列番号４８）
ＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＴＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＡＣＡＴＴＣＡＣＴＧＡＣＴＡＣＴＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＴＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＴＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＴＣＧＴＧＴＴＡＡＴＣＣＴＴＡＴＣＧＧＧＧＴＡＧＴＡＣＴＡＣＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＡＴＴＣＧＡＧＧＧＣＣＧＴＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＣＧＴＡＧＣＣＴＧＣＧＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＣＧＴＧＣＧＡＡＣＡＴＴＣＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴ

ヒトｃＭｅｔ−ＥＣＤ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓ（配列番号７２）
ＭＫＡＰＡＶＬＡＰＧＩＬＶＬＬＦＴＬＶＱＲＳＮＧＥＣＫＥＡＬＡＫＳＥＭＮＶＮＭＫＹＱＬＰＮＦＴＡＥＴＰＩＱＮＶＩＬＨＥＨＨＩＦＬＧＡＴＮＹＩＹＶＬＮＥＥＤＬＱＫＶＡＥＹＫＴＧＰＶＬＥＨＰＤＣＦＰＣＱＤＣＳＳＫＡＮＬＳＧＧＶＷＫＤＮＩＮＭＡＬＶＶＤＴＹＹＤＤＱＬＩＳＣＧＳＶＮＲＧＴＣＱＲＨＶＦＰＨＮＨＴＡＤＩＱＳＥＶＨＣＩＦＳＰＱＩＥＥＰＳＱＣＰＤＣＶＶＳＡＬＧＡＫＶＬＳＳＶＫＤＲＦＩＮＦＦＶＧＮＴＩＮＳＳＹＦＰＤＨＰＬＨＳＩＳＶＲＲＬＫＥＴＫＤＧＦＭＦＬＴＤＱＳＹＩＤＶＬＰＥＦＲＤＳＹＰＩＫＹＶＨＡＦＥＳＮＮＦＩＹＦＬＴＶＱＲＥＴＬＤＡＱＴＦＨＴＲＩＩＲＦＣＳＩＮＳＧＬＨＳＹＭＥＭＰＬＥＣＩＬＴＥＫＲＫＫＲＳＴＫＫＥＶＦＮＩＬＱＡＡＹＶＳＫＰＧＡＱＬＡＲＱＩＧＡＳＬＮＤＤＩＬＦＧＶＦＡＱＳＫＰＤＳＡＥＰＭＤＲＳＡＭＣＡＦＰＩＫＹＶＮＤＦＦＮＫＩＶＮＫＮＮＶＲＣＬＱＨＦＹＧＰＮＨＥＨＣＦＮＲＴＬＬＲＮＳＳＧＣＥＡＲＲＤＥＹＲＴＥＦＴＴＡＬＱＲＶＤＬＦＭＧＱＦＳＥＶＬＬＴＳＩＳＴＦＩＫＧＤＬＴＩＡＮＬＧＴＳＥＧＲＦＭＱＶＶＶＳＲＳＧＰＳＴＰＨＶＮＦＬＬＤＳＨＰＶＳＰＥＶＩＶＥＨＴＬＮＱＮＧＹＴＬＶＩＴＧＫＫＩＴＫＩＰＬＮＧＬＧＣＲＨＦＱＳＣＳＱＣＬＳＡＰＰＦＶＱＣＧＷＣＨＤＫＣＶＲＳＥＥＣＬＳＧＴＷＴＱＱＩＣＬＰＡＩＹＫＶＦＰＮＳＡＰＬＥＧＧＴＲＬＴＩＣＧＷＤＦＧＦＲＲＮＮＫＦＤＬＫＫＴＲＶＬＬＧＮＥＳＣＴＬＴＬＳＥＳＴＭＮＴＬＫＣＴＶＧＰＡＭＮＫＨＦＮＭＳＩＩＩＳＮＧＨＧＴＴＱＹＳＴＦＳＹＶＤＰＶＩＴＳＩＳＰＫＹＧＰＭＡＧＧＴＬＬＴＬＴＧＮＹＬＮＳＧＮＳＲＨＩＳＩＧＧＫＴＣＴＬＫＳＶＳＮＳＩＬＥＣＹＴＰＡＱＴＩＳＴＥＦＡＶＫＬＫＩＤＬＡＮＲＥＴＳＩＦＳＹＲＥＤＰＩＶＹＥＩＨＰＴＫＳＦＩＳＧＧＳＴＩＴＧＶＧＫＮＬＮＳＶＳＶＰＲＭＶＩＮＶＨＥＡＧＲＮＦＴＶＡＣＱＨＲＳＮＳＥＩＩＣＣＴＴＰＳＬＱＱＬＮＬＱＬＰＬＫＴＫＡＦＦＭＬＤＧＩＬＳＫＹＦＤＬＩＹＶＨＮＰＶＦＫＰＦＥＫＰＶＭＩＳＭＧＮＥＮＶＬＥＩＫＧＮＤＩＤＰＥＡＶＫＧＥＶＬＫＶＧＮＫＳＣＥＮＩＨＬＨＳＥＡＶＬＣＴＶＰＮＤＬＬＫＬＮＳＥＬＮＩＥＷＫＱＡＩＳＳＴＶＬＧＫＶＩＶＱＰＤＱＮＦＴＬＥＶＬＦＱＧＰＤＩＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＥＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＲＩＤＹＫＤＤＤＤＫＨＶＨＨＨＨＨＨ
太字のイタリック体のアミノ酸は、シグナル配列を表し；太字の下線を引いたアミノ酸はＦｌｉｓタグを表す。

カニクイザルｃＭｅｔ−ＥＣＤ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓ（配列番号７３）
ＭＫＡＰＡＶＬＶＰＧＩＬＶＬＬＦＴＬＶＱＲＳＮＧＥＣＫＥＡＬＡＫＳＥＭＮＶＮＭＫＹＱＬＰＮＦＴＡＥＴＡＩＱＮＶＩＬＨＥＨＨＩＦＬＧＡＴＮＹＩＹＶＬＮＥＥＤＬＱＫＶＡＥＹＫＴＧＰＶＬＥＨＰＤＣＦＰＣＱＤＣＳＳＫＡＮＬＳＧＧＶＷＫＤＮＩＮＭＡＬＶＶＤＴＹＹＤＤＱＬＩＳＣＧＳＶＮＲＧＴＣＱＲＨＶＦＰＨＮＨＴＡＤＩＱＳＥＶＨＣＩＦＳＰＱＩＥＥＰＮＱＣＰＤＣＶＶＳＡＬＧＡＫＶＬＳＳＶＫＤＲＦＩＮＦＦＶＧＮＴＩＮＳＳＹＦＰＨＨＰＬＨＳＩＳＶＲＲＬＫＥＴＫＤＧＦＭＦＬＴＤＱＳＹＩＤＶＬＰＥＦＲＤＳＹＰＩＫＹＩＨＡＦＥＳＮＮＦＩＹＦＬＴＶＱＲＥＴＬＮＡＱＴＦＨＴＲＩＩＲＦＣＳＬＮＳＧＬＨＳＹＭＥＭＰＬＥＣＩＬＴＥＫＲＫＫＲＳＴＫＫＥＶＦＮＩＬＱＡＡＹＶＳＫＰＧＡＱＬＡＲＱＩＧＡＳＬＮＤＤＩＬＦＧＶＦＡＱＳＫＰＤＳＡＥＰＭＤＲＳＡＭＣＡＦＰＩＫＹＶＮＤＦＦＮＫＩＶＮＫＮＮＶＲＣＬＱＨＦＹＧＰＮＨＥＨＣＦＮＲＴＬＬＲＮＳＳＧＣＥＡＲＲＤＥＹＲＡＥＦＴＴＡＬＱＲＶＤＬＦＭＧＱＦＳＥＶＬＬＴＳＩＳＴＦＶＫＧＤＬＴＩＡＮＬＧＴＳＥＧＲＦＭＱＶＶＶＳＲＳＧＰＳＴＰＨＶＮＦＬＬＤＳＨＰＶＳＰＥＶＩＶＥＨＰＬＮＱＮＧＹＴＬＶＶＴＧＫＫＩＴＫＩＰＬＮＧＬＧＣＲＨＦＱＳＣＳＱＣＬＳＡＰＰＦＶＱＣＧＷＣＨＤＫＣＶＲＳＥＥＣＰＳＧＴＷＴＱＱＩＣＬＰＡＩＹＫＶＦＰＴＳＡＰＬＥＧＧＴＲＬＴＩＣＧＷＤＦＧＦＲＲＮＮＫＦＤＬＫＫＴＲＶＬＬＧＮＥＳＣＴＬＴＬＳＥＳＴＭＮＴＬＫＣＴＶＧＰＡＭＮＫＨＦＮＭＳＩＩＩＳＮＧＨＧＴＴＱＹＳＴＦＳＹＶＤＰＩＩＴＳＩＳＰＫＹＧＰＭＡＧＧＴＬＬＴＬＴＧＮＹＬＮＳＧＮＳＲＨＩＳＩＧＧＫＴＣＴＬＫＳＶＳＮＳＩＬＥＣＹＴＰＡＱＴＩＳＴＥＦＡＶＫＬＫＩＤＬＡＮＲＥＴＳＩＦＳＹＲＥＤＰＩＶＹＥＩＨＰＴＫＳＦＩＳＧＧＳＴＩＴＧＶＧＫＮＬＨＳＶＳＶＰＲＭＶＩＮＶＨＥＡＧＲＮＦＴＶＡＣＱＨＲＳＮＳＥＩＩＣＣＴＴＰＳＬＱＱＬＮＬＱＬＰＬＫＴＫＡＦＦＭＬＤＧＩＬＳＫＹＦＤＬＩＹＶＨＮＰＶＦＫＰＦＥＫＰＶＭＩＳＭＧＮＥＮＶＬＥＩＫＧＮＤＩＤＰＥＡＶＫＧＥＶＬＫＶＧＮＫＳＣＥＮＩＨＬＨＳＥＡＶＬＣＴＶＰＮＤＬＬＫＬＮＳＥＬＮＩＥＷＫＱＡＩＳＳＴＶＬＧＫＶＩＶＱＰＤＱＮＦＴＬＥＶＬＦＱＧＰＤＩＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＥＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＲＩＤＹＫＤＤＤＤＫＨＶＨＨＨＨＨＨ
太字のイタリック体のアミノ酸は、シグナル配列を表し；太字の下線を引いたアミノ酸はＦｌｉｓタグを表す。

ラットｃＭｅｔ−ＥＣＤ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓ（配列番号７４）
ＭＫＡＰＴＡＬＡＰＧＩＬＬＬＬＬＴＬＡＱＲＳＨＧＥＣＫＥＡＬＶＫＳＥＭＮＶＮＭＫＹＱＬＰＮＦＴＡＥＴＰＩＨＮＶＶＬＨＧＨＨＩＹＬＧＡＴＮＹＩＹＶＬＮＤＫＤＬＱＫＶＳＥＦＫＴＧＰＶＶＥＨＰＤＣＦＰＣＱＤＣＳＳＫＡＮＶＳＧＧＶＷＫＤＮＶＮＭＡＬＬＶＤＴＹＹＤＤＱＬＩＳＣＧＳＶＮＲＧＴＣＱＲＨＶＬＰＰＤＮＡＡＤＩＱＳＥＶＨＣＭＦＳＰＬＡＥＥＥＳＧＱＣＰＤＣＶＶＳＡＬＧＡＫＶＬＬＳＥＫＤＲＦＩＮＦＦＶＧＮＴＩＮＳＳＹＰＰＤＹＳＬＨＳＩＳＶＲＲＬＫＥＴＱＤＧＦＫＦＬＴＤＱＳＹＩＤＶＬＰＥＦＲＤＳＹＰＩＫＹＩＨＡＦＥＳＮＨＦＩＹＦＬＴＶＱＫＥＴＬＤＡＱＴＦＨＴＲＩＩＲＦＣＳＶＤＳＧＬＨＳＹＭＥＭＰＬＥＣＩＬＴＥＫＲＲＫＲＳＴＲＥＥＶＦＮＩＬＱＡＡＹＶＳＫＰＧＡＮＬＡＫＱＩＧＡＳＰＹＤＤＩＬＹＧＶＦＡＱＳＫＰＤＳＡＥＰＭＮＲＳＡＶＣＡＦＰＩＫＹＶＮＤＦＦＮＫＩＶＮＫＮＮＶＲＣＬＱＨＦＹＧＰＮＨＥＨＣＦＮＲＴＬＬＲＮＳＳＧＣＥＶＲＳＤＥＹＲＴＥＦＴＴＡＬＱＲＶＤＬＦＭＧＲＬＮＨＶＬＬＴＳＩＳＴＦＩＫＧＤＬＴＩＡＮＬＧＴＳＥＧＲＦＭＱＶＶＬＳＲＴＡＨＦＴＰＨＶＮＦＬＬＤＳＹＰＶＳＰＥＶＩＶＥＨＰＳＮＱＮＧＹＴＬＶＶＴＧＫＫＩＴＫＩＰＬＮＧＬＧＣＧＨＦＱＳＣＳＱＣＬＳＡＰＹＦＩＱＣＧＷＣＨＮＲＣＶＨＳＮＥＣＰＳＧＴＷＴＱＥＩＣＬＰＡＶＹＫＶＦＰＴＳＡＰＬＥＧＧＴＭＬＴＩＣＧＷＤＦＧＦＫＫＮＮＫＦＤＬＲＫＴＫＶＬＬＧＮＥＳＣＴＬＴＬＳＥＳＴＴＮＴＬＫＣＴＶＧＰＡＭＳＥＨＦＮＶＳＶＩＶＳＮＳＲＥＴＴＱＹＳＡＦＳＹＶＤＰＶＩＴＳＩＳＰＲＹＧＰＨＡＧＧＴＬＬＴＬＴＧＫＹＬＮＳＧＮＳＲＨＩＳＩＧＧＫＴＣＴＬＫＳＶＳＤＳＩＬＥＣＹＴＰＧＨＴＶＳＡＥＦＰＶＫＬＫＩＤＬＡＤＲＶＴＳＳＦＳＹＲＥＤＰＶＶＳＥＩＨＰＴＫＳＦＩＳＧＧＳＴＩＴＧＩＧＫＮＬＮＳＶＳＴＰＫＬＶＩＥＶＨＤＶＧＶＮＹＴＶＡＣＱＨＲＳＳＳＥＩＩＣＣＴＴＰＳＬＱＱＬＤＬＱＬＰＬＫＴＫＡＦＦＬＬＤＧＩＬＳＫＨＦＤＬＴＹＶＨＤＰＭＦＫＰＦＥＫＰＶＭＩＳＭＧＮＥＮＶＶＥＩＫＧＤＤＩＤＰＥＡＶＫＧＥＶＬＫＶＧＮＫＳＣＥＮＬＨＷＨＳＥＡＬＬＣＴＶＰＳＤＬＬＫＬＮＧＧＥＬＮＩＥＷＫＱＡＶＳＳＴＶＬＧＫＶＩＶＱＰＤＱＮＦＡＬＥＶＬＦＱＧＰＤＩＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＥＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＲＩＤＹＫＤＤＤＤＫＨＶＨＨＨＨＨＨ
太字のイタリック体のアミノ酸は、シグナル配列を表し；太字の下線を引いたアミノ酸はＦｌｉｓタグを表す。

ヒトｃ−Ｍｅｔ ＥＣＤ（配列番号７５）
ＭＫＡＰＡＶＬＡＰＧＩＬＶＬＬＦＴＬＶＱＲＳＮＧＥＣＫＥＡＬＡＫＳＥＭＮＶＮＭＫＹＱＬＰＮＦＴＡＥＴＰＩＱＮＶＩＬＨＥＨＨＩＦＬＧＡＴＮＹＩＹＶＬＮＥＥＤＬＱＫＶＡＥＹＫＴＧＰＶＬＥＨＰＤＣＦＰＣＱＤＣＳＳＫＡＮＬＳＧＧＶＷＫＤＮＩＮＭＡＬＶＶＤＴＹＹＤＤＱＬＩＳＣＧＳＶＮＲＧＴＣＱＲＨＶＦＰＨＮＨＴＡＤＩＱＳＥＶＨＣＩＦＳＰＱＩＥＥＰＳＱＣＰＤＣＶＶＳＡＬＧＡＫＶＬＳＳＶＫＤＲＦＩＮＦＦＶＧＮＴＩＮＳＳＹＦＰＤＨＰＬＨＳＩＳＶＲＲＬＫＥＴＫＤＧＦＭＦＬＴＤＱＳＹＩＤＶＬＰＥＦＲＤＳＹＰＩＫＹＶＨＡＦＥＳＮＮＦＩＹＦＬＴＶＱＲＥＴＬＤＡＱＴＦＨＴＲＩＩＲＦＣＳＩＮＳＧＬＨＳＹＭＥＭＰＬＥＣＩＬＴＥＫＲＫＫＲＳＴＫＫＥＶＦＮＩＬＱＡＡＹＶＳＫＰＧＡＱＬＡＲＱＩＧＡＳＬＮＤＤＩＬＦＧＶＦＡＱＳＫＰＤＳＡＥＰＭＤＲＳＡＭＣＡＦＰＩＫＹＶＮＤＦＦＮＫＩＶＮＫＮＮＶＲＣＬＱＨＦＹＧＰＮＨＥＨＣＦＮＲＴＬＬＲＮＳＳＧＣＥＡＲＲＤＥＹＲＴＥＦＴＴＡＬＱＲＶＤＬＦＭＧＱＦＳＥＶＬＬＴＳＩＳＴＦＩＫＧＤＬＴＩＡＮＬＧＴＳＥＧＲＦＭＱＶＶＶＳＲＳＧＰＳＴＰＨＶＮＦＬＬＤＳＨＰＶＳＰＥＶＩＶＥＨＴＬＮＱＮＧＹＴＬＶＩＴＧＫＫＩＴＫＩＰＬＮＧＬＧＣＲＨＦＱＳＣＳＱＣＬＳＡＰＰＦＶＱＣＧＷＣＨＤＫＣＶＲＳＥＥＣＬＳＧＴＷＴＱＱＩＣＬＰＡＩＹＫＶＦＰＮＳＡＰＬＥＧＧＴＲＬＴＩＣＧＷＤＦＧＦＲＲＮＮＫＦＤＬＫＫＴＲＶＬＬＧＮＥＳＣＴＬＴＬＳＥＳＴＭＮＴＬＫＣＴＶＧＰＡＭＮＫＨＦＮＭＳＩＩＩＳＮＧＨＧＴＴＱＹＳＴＦＳＹＶＤＰＶＩＴＳＩＳＰＫＹＧＰＭＡＧＧＴＬＬＴＬＴＧＮＹＬＮＳＧＮＳＲＨＩＳＩＧＧＫＴＣＴＬＫＳＶＳＮＳＩＬＥＣＹＴＰＡＱＴＩＳＴＥＦＡＶＫＬＫＩＤＬＡＮＲＥＴＳＩＦＳＹＲＥＤＰＩＶＹＥＩＨＰＴＫＳＦＩＳＧＧＳＴＩＴＧＶＧＫＮＬＮＳＶＳＶＰＲＭＶＩＮＶＨＥＡＧＲＮＦＴＶＡＣＱＨＲＳＮＳＥＩＩＣＣＴＴＰＳＬＱＱＬＮＬＱＬＰＬＫＴＫＡＦＦＭＬＤＧＩＬＳＫＹＦＤＬＩＹＶＨＮＰＶＦＫＰＦＥＫＰＶＭＩＳＭＧＮＥＮＶＬＥＩＫＧＮＤＩＤＰＥＡＶＫＧＥＶＬＫＶＧＮＫＳＣＥＮＩＨＬＨＳＥＡＶＬＣＴＶＰＮＤＬＬＫＬＮＳＥＬＮＩＥＷＫＱＡＩＳＳＴＶＬＧＫＶＩＶＱＰＤＱＮＦＴ
太字のイタリック体のアミノ酸は、シグナル配列を表す。

Ｆｌｉｓタグを有するヒトｃ−Ｍｅｔ Ｓｅｍａドメイン（配列番号７６）
ＭＫＡＰＡＶＬＡＰＧＩＬＶＬＬＦＴＬＶＱＲＳＮＧＥＣＫＥＡＬＡＫＳＥＭＮＶＮＭＫＹＱＬＰＮＦＴＡＥＴＰＩＱＮＶＩＬＨＥＨＨＩＦＬＧＡＴＮＹＩＹＶＬＮＥＥＤＬＱＫＶＡＥＹＫＴＧＰＶＬＥＨＰＤＣＦＰＣＱＤＣＳＳＫＡＮＬＳＧＧＶＷＫＤＮＩＮＭＡＬＶＶＤＴＹＹＤＤＱＬＩＳＣＧＳＶＮＲＧＴＣＱＲＨＶＦＰＨＮＨＴＡＤＩＱＳＥＶＨＣＩＦＳＰＱＩＥＥＰＳＱＣＰＤＣＶＶＳＡＬＧＡＫＶＬＳＳＶＫＤＲＦＩＮＦＦＶＧＮＴＩＮＳＳＹＦＰＤＨＰＬＨＳＩＳＶＲＲＬＫＥＴＫＤＧＦＭＦＬＴＤＱＳＹＩＤＶＬＰＥＦＲＤＳＹＰＩＫＹＶＨＡＦＥＳＮＮＦＩＹＦＬＴＶＱＲＥＴＬＤＡＱＴＦＨＴＲＩＩＲＦＣＳＩＮＳＧＬＨＳＹＭＥＭＰＬＥＣＩＬＴＥＫＲＫＫＲＳＴＫＫＥＶＦＮＩＬＱＡＡＹＶＳＫＰＧＡＱＬＡＲＱＩＧＡＳＬＮＤＤＩＬＦＧＶＦＡＱＳＫＰＤＳＡＥＰＭＤＲＳＡＭＣＡＦＰＩＫＹＶＮＤＦＦＮＫＩＶＮＫＮＮＶＲＣＬＱＨＦＹＧＰＮＨＥＨＣＦＮＲＴＬＬＲＮＳＳＧＣＥＡＲＲＤＥＹＲＴＥＦＴＴＡＬＱＲＶＤＬＦＭＧＱＦＳＥＶＬＬＴＳＩＳＴＦＩＫＧＤＬＴＩＡＮＬＧＴＳＥＧＲＦＭＱＶＶＶＳＲＳＧＰＳＴＰＨＶＮＦＬＬＤＳＨＰＶＳＰＥＶＩＶＥＨＴＬＮＱＮＧＹＴＬＶＩＴＧＫＫＩＴＫＩＰＬＮＧＬＧＣＲＨＦＱＳＣＳＱＣＬＳＡＰＰＦＶＱＣＧＷＣＨＤＫＣＶＲＳＥＥＣＬＳＧＴＷＴＱＱＩＣＬＤＹＫＤＤＤＤＫＨＶＨＨＨＨＨＨ
太字のイタリック体のアミノ酸は、シグナル配列を表し；太字の下線を引いたアミノ酸はＦｌｉｓタグを表す。

ヒトｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメインにおけるＣ８−抗体エピトープ
１２１ＶＶＤＴＹＹＤＤＱＬ１３０（配列番号７７）
１３１ＩＳＣＧＳＶＮＲＧＴＣＱＲＨＶＦＰＨＮＨＴＡＤＩＱＳ１５６（配列番号７８）
１７９ＡＬＧＡＫＶＬＳＳＶＫＤＲＦＩＮＦ１９５（配列番号７９）
２１６ＶＲＲＬＫＥＴＫＤＧＦＭ２２７（配列番号８０）
１２３ＤＴＹＹＤＤ１２８（配列番号８１）
１４４ＨＶＦＰＨＮＨＴＡＤＩＱＳ１５６（配列番号８２）
１９２ＦＩＮＦ１９５（配列番号８３）
２２０ＫＥＴＫＤＧＦＭ２２７（配列番号８４）

ヒトｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメインにおけるＤ１１−抗体エピトープ
８４ＹＫＴＧＰＶＬＥＨＰＤＣＦＰＣＱＤＣＳＳＫＡＮＬ９５（配列番号８５）
９５ＣＦＰＣＱＤＣＳＳＫＡ１０５（配列番号８６）

共通ＣＤＲ配列

Ｄ１１−抗体軽鎖ＣＤＲ２
ＧＴＳＸ１ＬＸ２Ｓ（配列番号８７）（配列中、Ｘ１はＹ又はＲであり、且つＸ２はＡ又はＲである）；

Ｃ８−抗体軽鎖ＣＤＲ１
ＳＶＳＳＳＶＸ３ＳＩＹＬＨ（配列番号８８）（配列中、Ｘ３はＳ又はＲである）；

Ｃ８−抗体軽鎖ＣＤＲ３
Ｘ４Ｘ５ＹＸ６ＧＹＰＬＴ（配列番号８９）（配列中、Ｘ４はＩ又はＱであり、Ｘ５はＱ又はＶであり、且つＸ６はＳ又はＲである）；

Ｄ１１−重鎖抗体ＣＤＲ２
ＷＩＹＰＶＴＧＤＴＹＹＸ７ＥＸ８ＦＫＧ（配列番号９０）（配列中、Ｘ７はＮ、Ｉ又はＲであり、且つＸ８はＫ又はＰである）；

Ｄ１１−抗体重鎖ＣＤＲ３
ＧＹＧＡＦＸ９Ｙ（配列番号９１）（配列中、Ｘ９はＹ又はＦである）；

Ｃ８−抗体重鎖ＣＤＲ２
ＲＶＮＰＸ１０ＲＸ１１Ｘ１２ＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号９２）（配列中、Ｘ１０はＮ又はＹであり、Ｘ１１はＧ又はＲであり、且つＸ１２はＧ又はＳである）；

Ｃ８−抗体重鎖ＣＤＲ３
Ｘ１３ＮＸ１４ＬＤＹ（配列番号９３）（配列中、Ｘ１３はＴ又はＡであり、且つＸ１４はＷ又はＩである）；

共通軽鎖可変領域配列

Ｄ１１−抗体軽鎖可変領域共通配列（配列番号９４）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＳＶＳＳＳＩＳＳＴＮＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹ
ＧＴＳＸ１ＬＸ２ＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＹＳＦＧ
ＱＧＴＫＬＥＩＫ
（配列中、Ｘ１はＹ又はＲであり、且つＸ２はＡ又はＲである）；

Ｃ８−抗体軽鎖可変領域共通配列（配列番号９５）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＶＳＳＳＶＸ３ＳＩＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ
ＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＸ４Ｘ５ＹＸ６ＧＹＰＬＴＦＧ
ＧＧＴＫＶＥＩＫ
（配列中、Ｘ３はＳ又はＲであり、Ｘ４はＩ又はＱであり、Ｘ５はＱ又はＶであり、且つＸ６はＳ又はＲである）；

共通重鎖可変領域配列

Ｄ１１−抗体重鎖可変領域共通配列（配列番号９６）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＲＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷ
ＩＹＰＶＴＧＤＴＹＹＸ７ＥＸ８ＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹ
ＧＡＦＸ９ＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳ
（配列中、Ｘ７はＮ、Ｉ又はＲであり、Ｘ８はＫ又はＰであり、且つＸ９はＹ又はＦである）；

Ｃ８−抗体重鎖可変領域共通配列（配列番号９７）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲ
ＶＮＰＸ１０ＲＸ１１Ｘ１２ＴＴＹＮＱＫＦＥＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＸ１３ＮＸ１４ＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳ
（配列中、Ｘ１０はＹ又はＮであり、Ｘ１１はＧ又はＲであり、Ｘ１２はＳ又はＧであり、Ｘ１３はＡ又はＴであり、且つＸ１４はＩ又はＷである）。

Claims (36)

  1. ａ）ヒトｃ−Ｍｅｔのα鎖内のエピトープに結合し、
    ｂ）細胞表面のヒトｃ−Ｍｅｔの内部移行を誘導する、
    モノクローナル抗体。
  2. 抗体又はその抗原結合断片が、細胞表面のヒトｃ−Ｍｅｔの肝細胞成長因子非依存性内部移行を誘導する、請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
  3. ｃ−Ｍｅｔキナーゼドメインの突然変異Ｍ１１４９Ｔ、及び膜近傍ドメインの突然変異Ｒ９８８Ｃから成る群から選択される機能獲得型突然変異を有するヒトｃ−Ｍｅｔ変異体を含む細胞におけるヒトｃ−Ｍｅｔの内部移行を誘導する、請求項１又は２のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
  4. 抗体又はその抗原結合断片が、
    ａ）１２１ＶＶＤＴＹＹＤＤＱＬ１３０（配列番号７７）、
    ｂ）１３１ＩＳＣＧＳＶＮＲＧＴＣＱＲＨＶＦＰＨＮＨＴＡＤＩＱＳ１５６（配列番号７８）、
    ｃ）１７９ＡＬＧＡＫＶＬＳＳＶＫＤＲＦＩＮＦ１９５（配列番号７９）、及び
    ｄ）２１６ＶＲＲＬＫＥＴＫＤＧＦＭ２２７（配列番号８０）
    から成る群から選択されるアミノ酸配列内で結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
  5. 抗体又はその抗原結合断片が、
    ａ）１２３ＤＴＹＹＤＤ１２８（配列番号８１）、
    ｂ）１４４ＨＶＦＰＨＮＨＴＡＤＩＱＳ１５６（配列番号８２）、
    ｃ）１９２ＦＩＮＦ１９５（配列番号８３）、及び
    ｄ）２２０ＫＥＴＫＤＧＦＭ２２７（配列番号８４）
    から成る群から選択されるアミノ酸配列内で結合する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
  6. 抗体又はその抗原結合断片が、包括的に、１２３ＤＴＹＹＤＤ１２８（配列番号８１）、１４４ＨＶＦＰＨＮＨＴＡＤＩＱＳ１５６（配列番号８２）、１９２ＦＩＮＦ１９５（配列番号８３）、及び２２０ＫＥＴＫＤＧＦＭ２２７（配列番号８４）を特徴とする立体構造エピトープ内のアミノ酸配列に結合する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
  7. 抗体又はその抗原結合断片が、包括的に、アミノ酸配列８４ＹＫＴＧＰＶＬＥＨＰＤＣＦＰＣＱＤＣＳＳＫＡＮＬ１０７（配列番号８５）内で結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
  8. 抗体又はその抗原結合断片が、包括的に、アミノ酸配列９５ＣＦＰＣＱＤＣＳＳＫＡ１０５（配列番号８６）内で結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
  9. 抗体又はその抗原結合断片が、３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）と、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）とを含み、前記３つのＬＣＤＲ及び前記３つのＨＣＤＲが、
    ａ）アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＩＳＳＴＮＬＨ（配列番号４９）を含むＬＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＧＴＳＸ１ＬＸ２Ｓ（配列番号８７）（配列中、Ｘ１はＹ又はＲであり、且つＸ２はＡ又はＲである）を含むＬＣＤＲ２、
    アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＹＰＹＳ（配列番号５１）を含むＬＣＤＲ３、
    アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＲＹＩＨ（配列番号５９）を含むＨＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＷＩＹＰＶＴＧＤＴＹＹＸ７ＥＸ８ＦＫＧ（配列番号９０）（配列中、Ｘ７はＮ、Ｉ、又はＲであり、且つＸ８はＫ又はＰである）を含むＨＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＧＹＧＡＦＸ９Ｙ（配列番号９１）（配列中、Ｘ９はＹ又はＦである）を含むＨＣＤＲ３、並びに
    ｂ）アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＶＸ３ＳＩＹＬＨ（配列番号８８）（配列中、Ｘ３はＳ又はＲである）を含むＬＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５４）を含むＬＣＤＲ２、
    アミノ酸配列Ｘ４Ｘ５ＹＸ６ＧＹＰＬＴ（配列番号８９）（配列中、Ｘ４はＩ又はＱであり、Ｘ５はＱ又はＶであり、且つＸ６はＳ又はＲである）を含むＬＣＤＲ３、
    アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号６５）を含むＨＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＲＶＮＰＸ１０ＲＸ１１Ｘ１２ＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号９２）（配列中、Ｘ１０はＮ又はＹであり、Ｘ１１はＧ又はＲであり、且つＸ１２はＧ又はＳである）を含むＨＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列Ｘ１３ＮＸ１４ＬＤＹ（配列番号９３）（配列中、Ｘ１３はＴ又はＡであり、Ｘ１４はＷ又はＩである）を含むＨＣＤＲ３、
    から成る群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
  10. 抗体又はその抗原結合断片が、３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）と、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）とを含み、
    ＬＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＩＳＳＴＮＬＨ（配列番号４９）を含み、
    ＬＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＧＴＳＸ１ＬＸ２Ｓ（配列番号８７）（配列中、Ｘ１はＹ又はＲであり、且つＸ２はＡ又はＲである）を含み、
    ＬＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＹＰＹＳ（配列番号５１）を含み、
    ＨＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＲＹＩＨ（配列番号５９）を含み、
    ＨＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＷＩＹＰＶＴＧＤＴＹＹＸ７ＥＸ８ＦＫＧ（配列番号９０）（配列中、Ｘ７はＮ、Ｉ、又はＲであり、且つＸ８はＫ又はＰである）を含み、
    ＨＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＧＹＧＡＦＸ９Ｙ（配列番号９１）（配列中、Ｘ９はＹ又はＦである）を含む、請求項１、３、７、及び９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片。
  11. 抗体又はその抗原結合断片が、３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）と、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）とを含み、
    ＬＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＶＸ３ＳＩＹＬＨ（配列番号８８）（配列中、Ｘ３はＳ又はＲである）を含み、
    ＬＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５４）を含み、
    ＬＣＤＲ３が、アミノ酸配列Ｘ４Ｘ５ＹＸ６ＧＹＰＬＴ（配列番号８９）（配列中、Ｘ４はＩ又はＱであり、Ｘ５はＱ又はＶであり、且つＸ６はＳ又はＲである）を含み、
    ＨＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号６５）を含み、
    ＨＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＲＶＮＰＸ１０ＲＸ１１Ｘ１２ＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号９２）（配列中、Ｘ１０はＮ又はＹであり、Ｘ１１はＧ又はＲであり、且つＸ１２はＧ又はＳである）を含み、且つ
    ＨＣＤＲ３が、アミノ酸配列Ｘ１３ＮＸ１４ＬＤＹ（配列番号９３）（配列中、Ｘ１３はＴ又はＡであり、且つＸ１４はＷ又はＩである）を含む、請求項１〜６、８及び９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片。
  12. ３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）と、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）とを含み、前記３つのＬＣＤＲ及び前記３つのＨＣＤＲが、
    ａ）アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＩＳＳＴＮＬＨ（配列番号４９）を含むＬＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＧＴＳＹＬＡＳ（配列番号５０）を含むＬＣＤＲ２、
    アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＹＰＹＳ（配列番号５１）を含むＬＣＤＲ３、
    アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＲＹＩＨ（配列番号５９）を含むＨＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＷＩＹＰＶＴＧＤＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号６０）を含むＨＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＧＹＧＡＦＹＹ（配列番号６１）を含むＨＣＤＲ３、
    ｂ）アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＩＳＳＴＮＬＨ（配列番号４９）を含むＬＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＧＴＳＹＬＡＳ（配列番号５０）を含むＬＣＤＲ２、
    アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＹＰＹＳ（配列番号５１）を含むＬＣＤＲ３、
    アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＲＹＩＨ（配列番号５９）を含むＨＣＤＲ１
    アミノ酸配列ＷＩＹＰＶＴＧＤＴＹＹＩＥＫＦＫＧ（配列番号６２）を含むＨＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＧＹＧＡＦＦＹ（配列番号６３）を含むＨＣＤＲ３、
    ｃ）アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＩＳＳＴＮＬＨ（配列番号４９）を含むＬＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＧＴＳＲＬＲＳ（配列番号５２）を含むＬＣＤＲ２、
    アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＹＰＹＳ（配列番号５１）を含むＬＣＤＲ３、
    アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＲＹＩＨ（配列番号５９）を含むＨＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＷＩＹＰＶＴＧＤＴＹＹＲＥＰＦＫＧ（配列番号６４）を含むＨＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＧＹＧＡＦＹＹ（配列番号６１）を含むＨＣＤＲ３、
    ｄ）アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号５３）を含むＬＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５４）を含むＬＣＤＲ２、
    アミノ酸配列ＩＱＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号５５）を含むＬＣＤＲ３、
    アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号６５）を含むＨＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＲＶＮＰＮＲＧＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号６６）を含むＨＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＴＮＷＬＤＹ（配列番号６７）を含むＨＣＤＲ３、
    ｅ）アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号５３）を含むＬＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５４）を含むＬＣＤＲ２、
    アミノ酸配列ＱＶＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号５６）を含むＬＣＤＲ３、
    アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号６５）を含むＨＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＲＶＮＰＮＲＲＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号６８）を含むＨＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＡＮＷＬＤＹ（配列番号６９）を含むＨＣＤＲ３、並びに
    ｆ）アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＶＲＳＩＹＬＨ（配列番号５７）を含むＬＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５４）を含むＬＣＤＲ２、
    アミノ酸配列ＱＶＹＲＧＹＰＬＴ（配列番号５８）を含むＬＣＤＲ３、
    アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号６５）を含むＨＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＲＶＮＰＹＲＧＳＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号７０）を含むＨＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＡＮＩＬＤＹ（配列番号７１）を含むＨＣＤＲ３
    から成る群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片。
  13. ３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）と、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）とを含み、前記３つのＬＣＤＲ及び前記３つのＨＣＤＲが、
    ａ）アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＩＳＳＴＮＬＨ（配列番号４９）を含むＬＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＧＴＳＹＬＡＳ（配列番号５０）を含むＬＣＤＲ２、
    アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＹＰＹＳ（配列番号５１）を含むＬＣＤＲ３、
    アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＲＹＩＨ（配列番号５９）を含むＨＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＷＩＹＰＶＴＧＤＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号６０）を含むＨＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＧＹＧＡＦＹＹ（配列番号６１）を含むＨＣＤＲ３、
    ｂ）アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＩＳＳＴＮＬＨ（配列番号４９）を含むＬＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＧＴＳＹＬＡＳ（配列番号５０）を含むＬＣＤＲ２、
    アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＹＰＹＳ（配列番号５１）を含むＬＣＤＲ３、
    アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＲＹＩＨ（配列番号５９）を含むＨＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＷＩＹＰＶＴＧＤＴＹＹＩＥＫＦＫＧ（配列番号６２）を含むＨＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＧＹＧＡＦＦＹ（配列番号６３）を含むＨＣＤＲ３、並びに
    ｃ）アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＩＳＳＴＮＬＨ（配列番号４９）を含むＬＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＧＴＳＲＬＲＳ（配列番号５２）を含むＬＣＤＲ２、
    アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＹＰＹＳ（配列番号５１）を含むＬＣＤＲ３、
    アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＲＹＩＨ（配列番号５９）を含むＨＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＷＩＹＰＶＴＧＤＴＹＹＲＥＰＦＫＧ（配列番号６４）を含むＨＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＧＹＧＡＦＹＹ（配列番号６１）を含むＨＣＤＲ３
    から成る群から選択される、請求項１〜３、７、９、１０、及び１２のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片。
  14. ３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）と、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）とを含み、前記３つのＬＣＤＲ及び前記３つのＨＣＤＲが、
    ａ）アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号５３）を含むＬＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５４）を含むＬＣＤＲ２、
    アミノ酸配列ＩＱＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号５５）を含むＬＣＤＲ３、
    アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号６５）を含むＨＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＲＶＮＰＮＲＧＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号６６）を含むＨＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＴＮＷＬＤＹ（配列番号６７）を含むＨＣＤＲ３、
    ｂ）アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号５３）を含むＬＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５４）を含むＬＣＤＲ２、
    アミノ酸配列ＱＶＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号５６）を含むＬＣＤＲ３、
    アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号６５）を含むＨＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＲＶＮＰＮＲＲＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号６８）を含むＨＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＡＮＷＬＤＹ（配列番号６９）を含むＨＣＤＲ３、並びに
    ｃ）アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＶＲＳＩＹＬＨ（配列番号５７）を含むＬＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５４）を含むＬＣＤＲ２、
    アミノ酸配列ＱＶＹＲＧＹＰＬＴ（配列番号５８）を含むＬＣＤＲ３、
    アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号６５）を含むＨＣＤＲ１、
    アミノ酸配列ＲＶＮＰＹＲＧＳＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号７０）を含むＨＣＤＲ２、及び
    アミノ酸配列ＡＮＩＬＤＹ（配列番号７１）を含むＨＣＤＲ３
    から成る群から選択される、請求項１〜６、８、９、１１、及び１２のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片。
  15. ３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）と、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）とを含み、
    ＬＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号５３）を含み、
    ＬＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５４）を含み、
    ＬＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＩＱＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号５５）を含み、
    ＨＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号６５）を含み、
    ＨＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＲＶＮＰＮＲＧＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号６６）を含み、且つ
    ＨＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＴＮＷＬＤＹ（配列番号６７）を含む、請求項１〜３、８、９、１１、１２、及び１４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片。
  16. ３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）と、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）とを含み、
    ＬＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号５３）を含み、
    ＬＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５４）を含み、
    ＬＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＱＶＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号５６）を含み、
    ＨＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号６５）を含み、
    ＨＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＲＶＮＰＮＲＲＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号６８）を含み、且つ
    ＨＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＡＮＷＬＤＹ（配列番号６９）を含む、請求項１〜６、９、１１、１２、及び１４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片。
  17. 軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）とを含み、前記ＬＣＶＲ及び前記ＨＣＶＲが、それぞれ、
    ａ）配列番号９４及び配列番号９６、並びに
    ｂ）配列番号９５及び配列番号９７、
    から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片。
  18. 軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）とを含み、前記ＬＣＶＲが配列番号９４を含み、前記ＨＣＶＲが配列番号９６を含む、請求項１〜３、７、９、１０、１２、１３、及び１７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片。
  19. 軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）とを含み、前記ＬＣＶＲが配列番号９５を含み、前記ＨＣＶＲが配列番号９７を含む、請求項１〜６、８、９、１１、１２、及び１４〜１７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片。
  20. 前記ＬＣＶＲ及び前記ＨＣＶＲが、
    ａ）ＬＣＶＲが配列番号１であり、且つＨＣＶＲが配列番号１３である、
    ｂ）ＬＣＶＲが配列番号２であり、且つＨＣＶＲが配列番号１４である、
    ｃ）ＬＣＶＲが配列番号３であり、且つＨＣＶＲが配列番号１５である、
    ｄ）ＬＣＶＲが配列番号４であり、且つＨＣＶＲが配列番号１６である、
    ｅ）ＬＣＶＲが配列番号５であり、且つＨＣＶＲが配列番号１７である、及び
    ｆ）ＬＣＶＲが配列番号６であり、且つＨＣＶＲが配列番号１８である、
    から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片。
  21. 前記ＬＣＶＲ及び前記ＨＣＶＲが、それぞれ、
    ａ）ＬＣＶＲが配列番号１であり、且つＨＣＶＲが配列番号１３である、
    ｂ）ＬＣＶＲが配列番号２であり、且つＨＣＶＲが配列番号１４である、及び
    ｃ）ＬＣＶＲが配列番号３であり、且つＨＣＶＲが配列番号１５である、
    から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３、７、９、１０、１２、１３、１７、１８、及び２０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片。
  22. 前記ＬＣＶＲ及び前記ＨＣＶＲが、
    ａ）ＬＣＶＲが配列番号４であり、且つＨＣＶＲが配列番号１６である、
    ｂ）ＬＣＶＲが配列番号５であり、且つＨＣＶＲが配列番号１７である、及び
    ｃ）ＬＣＶＲが配列番号６であり、且つＨＣＶＲが配列番号１８である、
    から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜６、８、９、１１、１２、１４〜１７、１９、及び２０のいずれか一項に記載の前述のモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片。
  23. 前記ＬＣＶＲが配列番号４のアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＶＲが配列番号１６のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１９、２０、及び２２のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片。
  24. 前記ＬＣＶＲが配列番号５のアミノ酸配列を含み、且つ前記ＨＣＶＲが配列番号１７のアミノ酸配列を含む、請求項１〜６、９、１１、１２、１４、１６、１７、１９、２０、及び２２のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片。
  25. 前記抗体が、軽鎖と重鎖とを含み、前記軽鎖及び重鎖が、
    ａ）軽鎖が配列番号２５であり、且つ重鎖が配列番号３７である、
    ｂ）軽鎖が配列番号２６であり、且つ重鎖が配列番号３８である、
    ｇ）軽鎖が配列番号２７であり、且つ重鎖が配列番号３９である、
    ｈ）軽鎖が配列番号２８であり、且つ重鎖が配列番号４０である、
    ｉ）軽鎖が配列番号２９であり、且つ重鎖が配列番号４１である、及び
    ｊ）軽鎖が配列番号３０であり、且つ重鎖が配列番号４２である、
    から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
  26. 前記抗体が、軽鎖と重鎖とを含み、前記軽鎖及び重鎖が、
    ａ）軽鎖が配列番号２５であり、重鎖が配列番号３７である、
    ｂ）軽鎖が配列番号２６であり、重鎖が配列番号３８である、
    ｄ）軽鎖が配列番号２７であり、重鎖が配列番号３９である、
    から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３、７、９、１０、１２、１３、１７、１８、２０、２１、及び２５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
  27. 前記抗体が、軽鎖と重鎖とを含み、前記軽鎖及び重鎖が、
    ａ）軽鎖が配列番号２８であり、重鎖が配列番号４０である、
    ｂ）軽鎖が配列番号２９であり、重鎖が配列番号４１である、及び
    ｃ）軽鎖が配列番号３０であり、重鎖が配列番号４２である、
    から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜６、８、９、１１、１２、１４〜１７、１９、２０、及び２２〜２５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
  28. 前記軽鎖が配列番号２８のアミノ酸配列を含み、前記重鎖が配列番号４０のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２５、及び２７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
  29. 前記軽鎖が配列番号２９のアミノ酸配列を含み、前記重鎖が配列番号４１のアミノ酸配列を含む、請求項１〜６、９、１１、１２、１４、１６、１７、１９、２０、２２、２４、２５、及び２７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
  30. 前記抗体が、２本の軽鎖と２本の重鎖とを含み、各軽鎖が配列番号２８のアミノ酸配列を含み、各重鎖が配列番号４０のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２５、２７、及び２８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
  31. 前記抗体が、２本の軽鎖と２本の重鎖とを含み、各軽鎖が配列番号２９のアミノ酸配列を含み、各重鎖が配列番号４１のアミノ酸配列を含む、請求項１〜６、９、１１、１２、１４、１６、１７、１９、２０、２２、２４、２５、２７、及び２９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
  32. 請求項１〜３１のいずれか一項に記載のｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体又はその抗原結合断片と競合する、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
  33. 請求項１〜３２のいずれか一項に記載のｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体又はその抗原結合断片と同じｃ−Ｍｅｔのエピトープに結合する、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
  34. 請求項１〜３３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容できる担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む、医薬組成物。
  35. 治療で用いるための、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
  36. ヒトの癌の治療で用いるための、請求項１〜３５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
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