TWI477284B - C-met抗體 - Google Patents
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Description
本發明係關於結合c-Met之抗體及其在治療發病機制係由此受體介導之病狀及病症中的用途。
c-Met為酪胺酸激酶超家族之一員,為肝細胞生長因子(HGF)之受體。HGF與c-Met結合導致受體二聚或多聚、細胞內區域中之多個酪胺酸殘基磷酸化、催化活化及下游信號傳導。c-Met亦可經由不依賴配位體之機制活化,包括受體過度表現、擴增及突變。c-Met活化增強細胞增殖、遷移、形態發生、存活(包括免於細胞凋亡影響)及蛋白酶合成、與侵入性細胞表型相關的特徵以及癌症患者之不良臨床結果及藥物抗性。c-Met信號傳導路徑為人類癌症中最頻繁發生調節異常的路徑之一,且存在於幾乎所有類型的實體腫瘤中。
PCT國際公開案WO 09/007427揭示鼠類c-Met抗體及CDR移植人類化c-Met抗體。其中所揭示之鼠類抗體224G11不與c-Met Sema域結合。此鼠類抗體之人類化IgG1衍生物(表示為h224G11 Mab)的其他功能性質係報導於在美國癌症研究協會(American Association for Cancer Research;Denver,CO)於2009年4月之會議上所提出之摘要第835號(活體外資料)及第2792號(活體內資料)及其隨附海報中。此等摘要及海報揭示,二價h224G11 Mab缺乏固有拮抗性質,可充當c-Met之完全拮抗劑,且有效減少c-Met二聚。據報導,鼠類224G11可在活體內下調c-Met且阻斷c-Met磷酸化。在其他受體情況下,二聚為受體內化及降解的先決條件。此等摘要及海報未揭示與c-Met內化相關之資料。此外,亦未鑑別人類化抗體在c-Met內所結合之抗原決定基。
PCT國際公開案WO 05/016382亦揭示c-Met抗體,但未鑑別該等抗體所結合之抗原決定基。提供一個抗原決定基定位實例,然而,所報導之結果僅指示,6個c-Met抗體與共同抗原決定基結合,而第7個c-Met抗體與不同抗原決定基結合。並未提供此等c-Met抗體所結合之特定抗原決定基。
需要如下針對人類c-Met之拮抗劑抗體:其與人類c-Met之α鏈的結合促進受體在存在及/或不存在HGF之情況下自細胞表面內化。亦需要如下針對人類c-Met之拮抗劑抗體:其與人類c-Met之α鏈的結合促進受體在包含c-Met變異體(含有功能獲得性突變)的細胞中自細胞表面內化。亦需要可誘導c-Met降解及磷酸化c-Met減少的針對人類c-Met之拮抗劑抗體。該等拮抗劑活性可減少腫瘤細胞表面上可用HGF結合位點之數目,並終止由c-Met之過度表現、擴增或突變所致之路徑活化。同時,該等拮抗劑抗體應抑制HGF與c-Met之結合及HGF誘導之c-Met活化,且其自身極少或不誘導促效劑活性。
本發明之抗體化合物滿足此等需要。其與人類c-Met Sema域之α鏈中的抗原決定基結合,從而抑制HGF與c-Met之結合及受體活化,同時極少或不誘導促效劑活性。本發明抗體亦在存在或不存在HGF之情況下且亦在包含含有功能獲得性突變之c-Met變異體的細胞中誘導受體之內化。其誘導c-Met降解,且誘導磷酸化人類c-Met減少,並且抑制表現此受體之腫瘤細胞的依賴HGF及不依賴HGF之增殖。鑒於此等性質,此等抗體化合物應在治療上適用於治療由c-Met經由多種不同機制介導之癌症。
此外,本發明抗體化合物具備許多其他合意性質。其展現對於c-Met具高親和性(KD
),阻斷HGF介導之c-Met磷酸化及下游信號傳導、細胞增殖及細胞遷移;且僅誘導c-Met弱磷酸化而極少或不誘導類HGF生物促效劑活性,諸如誘導腫瘤細胞增殖、運動、侵入、腫瘤生成、血管生成或抗細胞凋亡效應。其抑制依賴配位體(HGF)及不依賴配位體之c-Met路徑活化。此外,與緊密相關之受體RON及叢蛋白A2(PlexinA2)的c-Met細胞外域(ECD)相比,本發明之抗體化合物優先結合人類ECD,且不會導致c-Met ECD「脫落」。
因此,本發明提供:
一種單株抗體或其抗原結合片段,其:
a) 結合人類c-Met之α鏈內的抗原決定基;且
b) 誘導細胞表面人類c-Met內化。
任一種上述抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段誘導細胞表面人類c-Met之不依賴肝細胞生長因子之內化。在一較佳實施例中,單株抗體或其抗原結合片段包含1個輕鏈及1個重鏈,其中該輕鏈包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列且該重鏈包含SEQ ID NO:40之胺基酸序列。在另一較佳實施例中,單株抗體或其抗原結合片段包含1個輕鏈及1個重鏈,其中該輕鏈包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列且該重鏈包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列。
任一種上述單株抗體或其抗原結合片段,其在包含含有功能獲得性突變之人類c-Met變異體之細胞中誘導人類c-Met內化。功能獲得性突變可為c-Met激酶域突變M1149T或近膜域突變R988C。
任何上述抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段誘導細胞中之細胞表面人類c-Met至少40%內化。任何上述抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段誘導細胞中之細胞表面人類c-Met至少45%內化。任何上述抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段誘導細胞中之細胞表面人類c-Met至少50%內化。任何上述抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段誘導細胞中之細胞表面人類c-Met至少55%內化。任何上述抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段誘導細胞中之細胞表面人類c-Met至少60%內化。任何上述抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段誘導細胞中之人類c-Met至少65%內化。任何上述抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段誘導細胞中之細胞表面人類c-Met至少70%內化。
任一種上述單株抗體或其抗原結合片段,其在不依賴肝細胞生長因子之腫瘤細胞中誘導總c-Met減少。在一較佳實施例中,在不依賴肝細胞生長因子之腫瘤細胞中誘導總c-Met減少的單株抗體或其抗原結合片段包含1個輕鏈及1個重鏈,其中該輕鏈包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列且該重鏈包含SEQ ID NO:40之胺基酸序列。在另一較佳實施例中,在不依賴肝細胞生長因子之腫瘤細胞中誘導總c-Met減少的單株抗體或其抗原結合片段包含1個輕鏈及1個重鏈,其中該輕鏈包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列且該重鏈包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列。
任一種上述單株抗體或其抗原結合片段,其在不依賴肝細胞生長因子之腫瘤細胞中誘導磷酸化c-Met減少。
任一種上述單株抗體或其抗原結合片段,其結合人類c-Met之α鏈中與包含具有SEQ ID NO:28中所示胺基酸序列之輕鏈及具有SEQ ID NO:40中所示胺基酸序列之重鏈的抗體實質上相同之抗原決定基,或結合人類c-Met之α鏈中與包含具有SEQ ID NO:29中所示胺基酸序列之輕鏈及具有SEQ ID NO:41中所示胺基酸序列之重鏈的抗體實質上相同之抗原決定基。
任一種上述單株抗體或其抗原結合片段,不包括彼等包含具有SEQ ID NO:26中所示胺基酸序列之輕鏈及具有SEQ ID NO:38中所示胺基酸序列之重鏈的抗體或其抗原結合片段,其中該抗原決定基包含144
HVFPHNHTADIQS156
(SEQ ID NO:82)(首末均包括在內)內的一或多個胺基酸殘基。
任一種上述抗體或抗原結合片段,其中該抗原決定基進一步包含123
DTYYDD128
(SEQ ID NO:81)(首末均包括在內)內的一或多個胺基酸殘基。
任一種上述抗體或抗原結合片段,其中該抗原決定基進一步包含192
FINF195
(SEQ ID NO:83)(首末均包括在內)內的一或多個胺基酸殘基。
任一種上述抗體或抗原結合片段,其中該抗原決定基進一步包含220
KETKDGFM227
(SEQ ID NO:84)(首末均包括在內)內的一或多個胺基酸殘基。
任一種上述抗體或其抗原結合片段,其中該抗體在選自由以下組成之群的胺基酸序列內結合:
a)121
VVDTYYDDQL130
(SEQ ID NO:77);
b)131
ISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQS156
(SEQ ID NO:78);
c)179
ALGAKVLSSVKDRFINF195
(SEQ ID NO:79);及
d)216
VRRLKETKDGFM227
(SEQ ID NO:80),
首末均包括在內。
任一種上述抗體或其抗原結合片段,其中該抗體在選自由以下組成之群的胺基酸序列內結合:
a)123
DTYYDD128
(SEQ ID NO:81);
b)144
HVFPHNHTADIQS156
(SEQ ID NO:82);
c)192
FINF195
(SEQ ID NO:83);及
d)220
KETKDGFM227
(SEQ ID NO:84),
首末均包括在內。
任一種上述單株抗體或其抗原結合片段,其與以121
VVDTYYDDQL130
(SEQ ID NO:77)、131
ISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQS156
(SEQ ID NO:78)、179
ALGAKVLSSVKDRFINF195
(SEQ ID NO:79)及216
VRRLKETKDGFM227
(SEQ ID NO:80)(首末均包括在內)為特徵之抗原決定基內的胺基酸序列結合。
任一種上述單株抗體或其抗原結合片段,其與以123
DTYYDD128
(SEQ ID NO:81)、144
HVFPHNHTADIQS156
(SEQ ID NO:82)、192
FINF195
(SEQ ID NO:83)及220
KETKDGFM227
(SEQ ID NO:84)(首末均包括在內)為特徵之抗原決定基內的胺基酸序列結合。
任一種上述抗體或其抗原結合片段,其中該抗體在95
CFPCQDCSSKA105
(SEQ ID NO:86)(首末均包括在內)之胺基酸序列內結合。
任一種上述單株抗體或其抗原結合片段,不包括彼等包含具有SEQ ID NO:29中所示胺基酸序列之輕鏈及具有SEQ ID NO:41中所示胺基酸序列之重鏈的抗體或其抗原結合片段,其中該抗原決定基包含95
CFPCQDCSSKA105
(SEQ ID NO:86)(首末均包括在內)內的一或多個胺基酸殘基。
任一種結合人類c-Met之上述單株抗體或其抗原結合片段,其包含3個輕鏈互補決定區(LCDR)及3個重鏈互補決定區(HCDR),其中該3個LCDR及該3個HCDR係選自由以下組成之群:
a) 包含胺基酸序列SVSSSISSTNLH(SEQ ID NO:49)之LCDR1;包含胺基酸序列GTSX1
LX2
S(SEQ ID NO:87)之LCDR2,其中X1
為Y或R,且X2
為A或R;包含胺基酸序列QQWSSYPYS(SEQ ID NO:51)之LCDR3;包含胺基酸序列GYTFTSRYIH(SEQ ID NO:59)之HCDR1;包含胺基酸序列WIYPVTGDTYYX7
EX8
FKG(SEQ ID NO:90)之HCDR2,其中X7
為N、I或R,且X8
為K或P;及包含胺基酸序列GYGAFX9
Y(SEQ ID NO:91)之HCDR3,其中X9
為Y或F;及
b) 包含胺基酸序列SVSSSVX3
SIYLH(SEQ ID NO:88)之LCDR1,其中X3
為S或R;包含胺基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:54)之LCDR2;包含胺基酸序列X4
X5
YX6
GYPLT(SEQ ID NO:89)之LCDR3,其中X4
為I或Q,X5
為Q或V,且X6
為S或R;包含胺基酸序列GYTFTDYYMH(SEQ ID NO:65)之HCDR1;包含胺基酸序列RVNPX10
RX11
X12
TTYNQKFEG(SEQ ID NO:92)之HCDR2,其中X10
為N或Y,X11
為G或R,且X12
為G或S;及包含胺基酸序列X13
NX14
LDY(SEQ ID NO:93)之HCDR3,其中X13
為T或A,且X14
為W或I;其中該單株抗體或其抗原結合片段結合該人類c-Met之α鏈內的抗原決定基,且誘導細胞表面人類c-Met內化。
任一種結合人類c-Met之上述單株抗體或其抗原結合片段,其包含3個輕鏈互補決定區(LCDR)及3個重鏈互補決定區(HCDR),其中該抗體包含3個輕鏈互補決定區(LCDR)及3個重鏈互補決定區(HCDR),其中:LCDR1包含胺基酸序列SVSSSISSTNLH(SEQ ID NO:49);LCDR2包含胺基酸序列GTSX1
LX2
S(SEQ ID NO:87),其中X1
為Y或R,且X2
為A或R;LCDR3包含胺基酸序列QQWSSYPYS(SEQ ID NO:51);HCDR1包含胺基酸序列GYTFTSRYIH(SEQ ID NO:59);HCDR2包含胺基酸序列WIYPVTGDTYYX7
EX8
FKG(SEQ ID NO:90),其中X7
為N、I或R,且X8
為K或P;且HCDR3包含胺基酸序列GYGAFX9
Y(SEQ ID NO:91),其中X9
為Y或F。
任一種結合人類c-Met之上述單株抗體或其抗原結合片段,其包含3個輕鏈互補決定區(LCDR)及3個重鏈互補決定區(HCDR),其中:LCDR1包含胺基酸序列SVSSSVX3
SIYLH(SEQ ID NO:88),其中X3
為S或R;LCDR2包含胺基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:54);LCDR3包含胺基酸序列X4
X5
YX6
GYPLT(SEQ ID NO:89),其中X4
為I或Q,X5
為Q或V,且X6
為S或R;HCDR1包含胺基酸序列GYTFTDYYMH(SEQ ID NO:65);HCDR2包含胺基酸序列RVNPX10
RX11
X12
TTYNQKFEG(SEQ ID NO:92),其中X10
為N或Y,X11
為G或R,且X12
為G或S;且HCDR3包含胺基酸序列X13
NX14
LDY(SEQ ID NO:93),其中X13
為T或A,且X14
為W或I。
任一種結合人類c-Met之上述單株抗體或其抗原結合片段,其包含3個輕鏈互補決定區(LCDR)及3個重鏈互補決定區(HCDR),且其中該3個LCDR及該3個HCDR係選自由以下組成之群:
a) 包含胺基酸序列SVSSSISSTNLH(SEQ ID NO:49)之LCDR1;包含胺基酸序列GTSYLAS(SEQ ID NO:50)之LCDR2;包含胺基酸序列QQWSSYPYS(SEQ ID NO:51)之LCDR3;包含胺基酸序列GYTFTSRYIH(SEQ ID NO:59)之HCDR1;包含胺基酸序列WIYPVTGDTYYNEKFKG(SEQ ID NO:60)之HCDR2;及包含胺基酸序列GYGAFYY(SEQ ID NO:61)之HCDR3;
b) 包含胺基酸序列SVSSSISSTNLH(SEQ ID NO:49)之LCDR1;包含胺基酸序列GTSYLAS(SEQ ID NO:50)之LCDR2;包含胺基酸序列QQWSSYPYS(SEQ ID NO:51)之LCDR3;包含胺基酸序列GYTFTSRYIH(SEQ ID NO:59)之HCDR1;包含胺基酸序列WIYPVTGDTYYIEKFKG(SEQ ID NO:62)之HCDR2;及包含胺基酸序列GYGAFFY(SEQ ID NO:63)之HCDR3;
c) 包含胺基酸序列SVSSSISSTNLH(SEQ ID NO:49)之LCDR1;包含胺基酸序列GTSRLRS(SEQ ID NO:52)之LCDR2;包含胺基酸序列QQWSSYPYS(SEQ ID NO:51)之LCDR3;包含胺基酸序列GYTFTSRYIH(SEQ ID NO:59)之HCDR1;包含胺基酸序列WIYPVTGDTYYREPFKG(SEQ ID NO:64)之HCDR2,及包含胺基酸序列GYGAFYY(SEQ ID NO:61)之HCDR3;
d) 包含胺基酸序列SVSSSVSSIYLH(SEQ ID NO:53)之LCDR1;包含胺基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:54)之LCDR2;包含胺基酸序列IQYSGYPLT(SEQ ID NO:55)之LCDR3;包含胺基酸序列GYTFTDYYMH(SEQ ID NO:65)之HCDR1;包含胺基酸序列RVNPNRGGTTYNQKFEG(SEQ ID NO:66)之HCDR2,及包含胺基酸序列TNWLDY(SEQ ID NO:67)之HCDR3;
e) 包含胺基酸序列SVSSSVSSIYLH(SEQ ID NO:53)之LCDR1;包含胺基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:54)之LCDR2;包含胺基酸序列QVYSGYPLT(SEQ ID NO:56)之LCDR3;包含胺基酸序列GYTFTDYYMH(SEQ ID NO:65)之HCDR1;包含胺基酸序列RVNPNRRGTTYNQKFEG(SEQ ID NO:68)之HCDR2;及包含胺基酸序列ANWLDY(SEQ ID NO:69)之HCDR3;及
f) 包含胺基酸序列SVSSSVRSIYLH(SEQ 1D NO:57)之LCDR1;包含胺基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:54)之LCDR2;包含胺基酸序列QVYRGYPLT(SEQ ID NO:58)之LCDR3;包含胺基酸序列GYTFTDYYMH(SEQ ID NO:65)之HCDR1;包含胺基酸序列RVNPYRGSTTYNQKFEG(SEQ ID NO:70)之HCDR2;及包含胺基酸序列ANILDY(SEQ ID NO:71)之HCDR3;且其中該單株抗體或其抗原結合片段結合該人類c-Met之α鏈內的抗原決定基,且誘導細胞表面人類c-Met內化。
任一種包含3個輕鏈互補決定區(LCDR)及3個重鏈互補決定區(HCDR)之上述單株抗體或其抗原結合片段,其中該3個LCDR及該3個HCDR係選自由以下組成之群:
a) 包含胺基酸序列SVSSSISSTNLH(SEQ ID NO:49)之LCDR1;包含胺基酸序列GTSYLAS(SEQ ID NO:50)之LCDR2;包含胺基酸序列QQWSSYPYS(SEQ ID NO:51)之LCDR3;包含胺基酸序列GYTFTSRYIH(SEQ ID NO:59)之HCDR1;包含胺基酸序列WIYPVTGDTYYNEKFKG(SEQ ID NO:60)之HCDR2;及包含胺基酸序列GYGAFYY(SEQ ID NO:61)之HCDR3;
b) 包含胺基酸序列SVSSSISSTNLH(SEQ ID NO:49)之LCDR1;包含胺基酸序列GTSYLAS(SEQ ID NO:50)之LCDR2;包含胺基酸序列QQWSSYPYS(SEQ ID NO:51)之LCDR3;包含胺基酸序列GYTFTSRYIH(SEQ ID NO:59)之HCDR1;包含胺基酸序列WIYPVTGDTYYIEKFKG(SEQ ID NO:62)之HCDR2;及包含胺基酸序列GYGAFFY(SEQ ID NO:63)之HCDR3;
c) 包含胺基酸序列SVSSSISSTNLH(SEQ ID NO:49)之LCDR1;包含胺基酸序列GTSRLRS(SEQ ID NO:52)之LCDR2;包含胺基酸序列QQWSSYPYS(SEQ ID NO:51)之LCDR3;包含胺基酸序列GYTFTSRYIH(SEQ ID NO:59)之HCDR1;包含胺基酸序列WIYPVTGDTYYREPFKG(SEQ ID NO:64)之HCDR2;及包含胺基酸序列GYGAFYY(SEQ ID NO:61)之HCDR3。
任一種包含3個輕鏈互補決定區(LCDR)及3個重鏈互補決定區(HCDR)之上述單株抗體或其抗原結合片段,其中該3個LCDR及該3個HCDR係選自由以下組成之群:
a)包含胺基酸序列SVSSSVSSIYLH(SEQ ID NO:53)之LCDR1;包含胺基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:54)之LCDR2;包含胺基酸序列IQYSGYPLT(SEQ ID NO:55)之LCDR3;包含胺基酸序列GYTFTDYYMH(SEQ ID NO:65)之HCDR1;包含胺基酸序列RVNPNRGGTTYNQKFEG(SEQ ID NO:66)之HCDR2;及包含胺基酸序列TNWLDY(SEQ ID NO:67)之HCDR3;
b)包含胺基酸序列SVSSSVSSIYLH(SEQ ID NO:53)之LCDR1;包含胺基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:54)之LCDR2;包含胺基酸序列QVYSGYPLT(SEQ ID NO:56)之LCDR3;包含胺基酸序列GYTFTDYYMH(SEQ ID NO:65)之HCDR1;包含胺基酸序列RVNPNRRGTTYNQKFEG(SEQ ID NO:68)之HCDR2;及包含胺基酸序列ANWLDY(SEQ ID NO:69)之HCDR3;及
c) 包含胺基酸序列SVSSSVRSIYLH(SEQ ID NO:57)之LCDR1;包含胺基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:54)之LCDR2;包含胺基酸序列QVYRGYPLT(SEQ ID NO:58)之LCDR3;包含胺基酸序列GYTFTDYYMH(SEQ ID NO:65)之HCDR1;包含胺基酸序列RVNPYRGSTTYNQKFEG(SEQ ID NO:70)之HCDR2;及包含胺基酸序列ANILDY(SEQ ID NO:71)之HCDR3。
任一種包含3個輕鏈互補決定區(LCDR)及3個重鏈互補決定區(HCDR)之上述單株抗體或其抗原結合片段,其中:LCDR1包含胺基酸序列SVSSSVSSIYLH(SEQ ID NO:53);LCDR2包含胺基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:54);LCDR3包含胺基酸序列IQYSGYPLT(SEQ ID NO:55);HCDR1包含胺基酸序列GYTFTDYYMH(SEQ ID NO:65);HCDR2包含胺基酸序列RVNPNRGGTTYNQKFEG(SEQ ID NO:66);且HCDR3包含胺基酸序列TNWLDY(SEQ ID NO:67)。
任一種包含3個輕鏈互補決定區(LCDR)及3個重鏈互補決定區(HCDR)之上述單株抗體或其抗原結合片段,其中:LCDR1包含胺基酸序列SVSSSVSSIYLH(SEQ ID NO:53);LCDR2包含胺基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:54);LCDR3包含胺基酸序列QVYSGYPLT(SEQ ID NO:56);HCDR1包含胺基酸序列GYTFTDYYMH(SEQ ID NO:65);HCDR2包含胺基酸序列RVNPNRRGTTYNQKFEG(SEQ ID NO:68);且HCDR3包含胺基酸序列ANWLDY(SEQ ID NO:69)。
任一種包含1個輕鏈可變區(LCVR)及1個重鏈可變區(HCVR)之上述單株抗體或其抗原結合片段,其中該LCVR及該HCVR分別包含選自由以下組成之群的胺基酸序列:
a) SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:96;及
b) SEQ ID NO:95及SEQ ID NO:97,
其中該單株抗體或其抗原結合片段結合該人類c-Met之α鏈內的抗原決定基,且誘導細胞表面人類c-Met內化。
任一種包含1個輕鏈可變區(LCVR)及1個重鏈可變區(HCVR)之上述單株抗體或其抗原結合片段,其中該LCVR包含SEQ ID NO:94且該HCVR包含SEQ ID NO:96。
任一種包含1個輕鏈可變區(LCVR)及1個重鏈可變區(HCVR)之上述單株抗體或其抗原結合片段,其中該LCVR包含SEQ ID NO:95且該HCVR包含SEQ ID NO:97。
任一種上述單株抗體或其抗原結合片段,其中該LCVR及該HCVR包含選自由以下組成之群的胺基酸序列:
a) LCVR為SEQ ID NO:1且HCVR為SEQ ID NO:13;
b) LCVR為SEQ ID NO:2且HCVR為SEQ ID NO:14;
c) LCVR為SEQ ID NO:3且HCVR為SEQ ID NO:15;
d) LCVR為SEQ ID NO:4且HCVR為SEQ ID NO:16;
e) LCVR為SEQ ID NO:5且HCVR為SEQ ID NO:17;及
f) LCVR為SEQ ID NO:6且HCVR為SEQ ID NO:18。
任一種上述單株抗體或其抗原結合片段,其中該LCVR及該HCVR分別包含選自由以下組成之群的胺基酸序列:
a) LCVR為SEQ ID NO:1且HCVR為SEQ ID NO:13;
b) LCVR為SEQ ID NO:2且HCVR為SEQ ID NO:14;及
c) LCVR為SEQ ID NO:3且HCVR為SEQ ID NO:15。
任一種上述單株抗體或其抗原結合片段,其中該LCVR及該HCVR分別包含選自由以下組成之群的胺基酸序列:
a) LCVR為SEQ ID NO:4且HCVR為SEQ ID NO:16;
b) LCVR為SEQ ID NO:5且HCVR為SEQ ID NO:17;及
c) LCVR為SEQ ID NO:6且HCVR為SEQ ID NO:18。
任一種上述單株抗體或其抗原結合片段,其中該LCVR包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列且該HCVR包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列。
任一種上述單株抗體或其抗原結合片段,其中該LCVR包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列且該HCVR包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列。
任一種上述單株抗體,其中該抗體包含1個輕鏈及1個重鏈,其中該輕鏈及該重鏈包含選自由以下組成之群的胺基酸序列:
a) 輕鏈為SEQ ID NO:25且重鏈為SEQ ID NO:37;
b) 輕鏈為SEQ ID NO:26且重鏈為SEQ ID NO:38;
c) 輕鏈為SEQ ID NO:27且重鏈為SEQ ID NO:39;
d) 輕鏈為SEQ ID NO:28且重鏈為SEQ ID NO:40;
e) 輕鏈為SEQ ID NO:29且重鏈為SEQ ID NO:41;及
f) 輕鏈為SEQ ID NO:30且重鏈為SEQ ID NO:42。
任一種上述單株抗體,其中該抗體包含1個輕鏈及1個重鏈,其中該輕鏈及該重鏈包含選自由以下組成之群的胺基酸序列:
a) 輕鏈為SEQ ID NO:25且重鏈為SEQ ID NO:37;
b) 輕鏈為SEQ ID NO:26且重鏈為SEQ ID NO:38;及
c) 輕鏈為SEQ ID NO:27且重鏈為SEQ ID NO:39。
任一種上述單株抗體,其中該抗體包含1個輕鏈及1個重鏈,其中該輕鏈及該重鏈包含選自由下列組成之群的胺基酸序列:
a) 輕鏈為SEQ ID NO:28且重鏈為SEQ ID NO:40;
b) 輕鏈為SEQ ID NO:29且重鏈為SEQ ID NO:41;及
c) 輕鏈為SEQ ID NO:30且重鏈為SEQ ID NO:42。
任一種上述單株抗體,其中該輕鏈包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列且該重鏈包含SEQ ID NO:40之胺基酸序列。
任一種上述單株抗體,其中該輕鏈包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列且該重鏈包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列。
任一種上述單株抗體,其中該抗體包含2個輕鏈及2個重鏈,其中各輕鏈包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列且各重鏈包含SEQ ID NO:40之胺基酸序列。
任一種上述單株抗體,其中該抗體包含2個輕鏈及2個重鏈,其中各輕鏈包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列且各重鏈包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列。
一種單株抗體或其抗原結合片段,其與任何上述c-Met單株抗體或其抗原結合片段競爭與c-Met之結合。該競爭性單株抗體或其抗原結合片段可與任一種上述c-Met單株抗體或其抗原結合片段結合相同c-Met抗原決定基。在一較佳實施例中,單株抗體或其抗原結合片段與包含1個輕鏈及1個重鏈之抗體競爭,其中該輕鏈包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列且該重鏈包含SEQ ID NO:40之胺基酸序列。在另一較佳實施例中,單株抗體或其抗原結合片段與包含1個輕鏈及1個重鏈之抗體競爭,其中該輕鏈包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列且該重鏈包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列。
任一種上述單株抗體或其抗原結合片段,其在不依賴肝細胞生長因子之腫瘤細胞中誘導總人類c-Met及磷酸化人類c-Met減少,其中該等腫瘤細胞組成性過度表現該人類c-Met。在一較佳實施例中,在不依賴肝細胞生長因子之腫瘤細胞中誘導總人類c-Met及磷酸化人類c-Met減少的單株抗體或其抗原結合片段(其中該等腫瘤細胞組成性過度表現該人類c-Met)包含1個輕鏈及1個重鏈,其中該輕鏈包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列且該重鏈包含SEQ ID NO:40之胺基酸序列。在另一較佳實施例中,在不依賴肝細胞生長因子之腫瘤細胞中誘導總人類c-Met及磷酸化人類c-Met減少的單株抗體或其抗原結合片段(其中該等腫瘤細胞組成性過度表現該人類c-Met)包含1個輕鏈及1個重鏈,其中該輕鏈包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列且該重鏈包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列。
任一種上述單株抗體或其抗原結合片段,其在不依賴肝細胞生長因子之腫瘤細胞中誘導總人類c-Met及磷酸化人類c-Met減少,其中該等腫瘤細胞組成性磷酸化該人類c-Met。在一較佳實施例中,在不依賴肝細胞生長因子之腫瘤細胞中誘導總人類c-Met及磷酸化人類c-Met減少的單株抗體或其抗原結合片段(其中該等腫瘤細胞組成性磷酸化該人類c-Met)包含1個輕鏈及1個重鏈,其中該輕鏈包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列且該重鏈包含SEQ ID NO:40之胺基酸序列。在另一較佳實施例中,在不依賴肝細胞生長因子之腫瘤細胞中誘導總人類c-Met及磷酸化人類c-Met減少的單株抗體或其抗原結合片段(其中該等腫瘤細胞組成性磷酸化該人類c-Met)包含1個輕鏈及1個重鏈,其中該輕鏈包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列且該重鏈包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列。
任一種上述單株抗體或其抗原結合片段,其在具肝細胞生長因子反應性的不依賴肝細胞生長因子之腫瘤細胞中誘導總人類c-Met及磷酸化人類c-Met減少。
任一種上述單株抗體或其抗原結合片段,與人類RON細胞外域或人類叢蛋白A2細胞外域相比,其優先結合人類c-Met細胞外域。
任一種上述單株抗體或其抗原結合片段,其不會誘導人類c-Met細胞外域脫落。在一較佳實施例中,不會誘導人類c-Met細胞外域脫落的單株抗體或其抗原結合片段包含1個輕鏈及1個重鏈,其中該輕鏈包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列且該重鏈包含SEQ ID NO:40之胺基酸序列。在另一較佳實施例中,不會誘導人類c-Met細胞外域脫落的單株抗體或其抗原結合片段包含1個輕鏈及1個重鏈,其中該輕鏈包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列且該重鏈包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列。
任一種上述單株抗體或其抗原結合片段,其不保護表現人類c-Met之腫瘤細胞免受星孢菌素(staurosporine)誘導之細胞凋亡。在一較佳實施例中,不保護表現人類c-Met之腫瘤細胞免受星孢菌素誘導之細胞凋亡的單株抗體或其抗原結合片段包含1個輕鏈及1個重鏈,其中該輕鏈包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列且該重鏈包含SEQ ID NO:40之胺基酸序列。在另一較佳實施例中,不保護表現人類c-Met之腫瘤細胞免受星孢菌素誘導之細胞凋亡的單株抗體或其抗原結合片段包含1個輕鏈及1個重鏈,其中該輕鏈包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列且該重鏈包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列。
任一種上述單株抗體或其抗原結合片段,其抑制表現人類c-Met之腫瘤細胞的依賴肝細胞生長因子及不依賴肝細胞生長因子之增殖。
任一種上述單株抗體或其抗原結合片段,其抑制人類肝細胞生長因子與人類c-Met之結合。
任一種上述單株抗體或其抗原結合片段,其不會誘導類HGF生物促效劑活性。類HGF生物促效劑活性包括腫瘤細胞增殖、腫瘤細胞運動、腫瘤細胞侵入、腫瘤生成、血管生成或抗細胞凋亡效應。在一較佳實施例中,不會誘導類HGF生物促效劑活性的單株抗體或其抗原結合片段包含1個輕鏈及1個重鏈,其中該輕鏈包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列且該重鏈包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列。
一種醫藥組合物,其包含任一種上述單株抗體或其抗原結合片段,以及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
任一種上述單株抗體或其抗原結合片段,其係用於治療。在一較佳實施例中,用於治療中的單株抗體或其抗原結合片段包含1個輕鏈及1個重鏈,其中該輕鏈包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列且該重鏈包含SEQ ID NO:40之胺基酸序列。在另一較佳實施例中,用於治療中的單株抗體或其抗原結合片段包含1個輕鏈及1個重鏈,其中該輕鏈包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列且該重鏈包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列。
任一種上述單株抗體或其抗原結合片段,其係用於治療人類之癌症。在一較佳實施例中,用於治療人類之癌症的單株抗體或其抗原結合片段包含1個輕鏈及1個重鏈,其中該輕鏈包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列且該重鏈包含SEQ ID NO:40之胺基酸序列。在另一較佳實施例中,用於治療人類之癌症的單株抗體或其抗原結合片段包含1個輕鏈及1個重鏈,其中該輕鏈包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列且該重鏈包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列。
任一種上述單株抗體或其抗原結合片段,其係與另一治療劑組合用於治療人類之癌症。在一較佳實施例中,與另一治療劑組合用於治療人類之癌症的單株抗體或其抗原結合片段包含1個輕鏈及1個重鏈,其中該輕鏈包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列且該重鏈包含SEQ ID NO:40之胺基酸序列。在另一較佳實施例中,與另一治療劑組合用於治療人類之癌症的單株抗體或其抗原結合片段包含1個輕鏈及1個重鏈,其中該輕鏈包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列且該重鏈包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列。
一種醫藥組合物,其包含任一種上述單株抗體或其抗原結合片段以及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
任一種上述單株抗體或其抗原結合片段之用途,其係用於製造供治療人類之癌症的藥劑。
一種治療癌症之方法,其包含向有需要之人類患者投與有效量的任一種上述單株抗體或其抗原結合片段。
天然存在之全長抗體為包含由二硫鍵相互連接之2個重(H)鏈及2個輕(L)鏈的免疫球蛋白分子。各鏈之胺基末端部分包括具有約100至110個或更多個胺基酸且主要負責經由其中所含之互補決定區(CDR)識別抗原的可變區。各鏈之羧基末端部分確定主要負責效應功能之恆定區。
CDR中間雜有稱為構架區(「FR」)的更保守區域。各輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)由3個CDR及4個FR構成,自胺基末端至羧基末端以如下順序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。輕鏈之3個CDR稱為「LCDR1、LCDR2及LCDR3」,且重鏈之3個CDR稱為「HCDR1、HCDR2及HCDR3」。CDR含有可與抗原形成特定相互作用的大部分殘基。LCVR及HCVR區內之CDR胺基酸殘基的編號及定位係根據熟知的Kabat編號規約。
輕鏈分類為κ或λ,且特徵在於此項技術中已知的特定恆定區。重鏈分類為γ、μ、α、δ或ε,且分別將抗體之同型定義為IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。IgG抗體可進一步分成子類,例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。各重鏈類型之特徵在於具有此項技術中熟知之序列的特定恆定區。
如本文中所使用,當應用於本發明抗體化合物時,術語「單株抗體」(Mab)係指來源於單一複本或純系(包括例如任何真核、原核或噬菌體純系)的抗體,而非其製造方法。本發明之Mabs較佳以均質或實質上均質之群存在。完全Mabs含有2個重鏈及2個輕鏈。該等單株抗體之「抗原結合片段」包括例如Fab片段、Fab'片段、F(ab')2
片段、單鏈Fv片段,及包含1個輕鏈及1個重鏈的單臂抗體。本發明之單株抗體及其抗原結合片段可藉由例如重組技術、噬菌體呈現技術、合成技術(例如CDR移植)或該等技術之組合,或此項技術已知之其他技術製造。
「抗體化合物」係指本文中揭示之Mabs及Fabs。展現類似功能性質之本發明其他抗體化合物可由習知方法產生。舉例而言,可用人類c-Met或其片段免疫小鼠,可回收及純化所得抗體,及測定其是否具備本文中揭示之抗體化合物相似或相同之結合及功能性質可藉由下文實例2至19中揭示之方法評估。亦可藉由習知方法製備抗原結合片段。用於製造及純化抗體及抗原結合片段之方法在此項技術中熟知,且可見於例如Harlow及Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual
,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,第5至8章及第15章,ISBN 0-87969-314-2中。
短語「人類工程改造抗體」係指除了本文中揭示之抗體化合物以外,根據本發明具有與本文中揭示者相似的結合及功能性質,且具有實質上為人類的或完全為人類的且包圍來源於非人類抗體之CDR的構架區的單株抗體及抗原結合片段。「構架區」或「構架序列」係指構架區1至4中之任一者。本發明涵蓋之人類工程改造抗體及抗原結合片段包括如下分子:其中構架區1至4中之任一或多者實質上或完全為人類的,亦即,其中存在個別實質上或完全人類構架區1至4之任何可能的組合。舉例而言,此包括如下分子:其中構架區1及構架區2,構架區1及構架區3,構架區1、2及3,等等實質上或完全為人類的。實質上人類構架為彼等與已知人類生殖系構架序列具有至少約80%序列一致性的構架。實質上人類構架較佳與已知人類生殖系構架序列具有至少約85%、約90%、約95%或約99%的序列一致性。
完全人類構架為彼等與已知人類生殖系構架序列一致的構架。人類構架生殖系序列可經由ImMunoGeneTics(IMGT)之網站http://imgt.cines.fr獲自ImMunoGeneTics,或獲自The Immunoglobulin FactsBook
,Marie-Paule Lefranc及Gerard Lefranc,Academic Press,2001,ISBN 012441351。舉例而言,生殖系輕鏈構架可選自由以下組成之群:A11、A17、A18、A19、A20、A27、A30、LI、L1I、L12、L2、L5、L15、L6、L8、O12、O2及O8;且生殖系重鏈構架區可選自由以下組成之群:VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-20、VH3-72、VHI-46、VH3-9、VH3-66、VH3-74、VH4-31、VHI-18、VHI-69、VI-13-7、VH3-11、VH3-15、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-48、VH4-39、VH4-59及VH5-5I。
根據本發明,除了本文中所揭示者以外亦展現類似功能性質的人類工程改造抗體可使用若干不同的方法來產生。在一種方法中,母體抗體化合物CDR移植至與該母體抗體化合物構架具有高序列一致性的人類構架中。新構架之序列一致性一般將為與母體抗體化合物中之相應構架之序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約99%一致。在構架具有少於100個胺基酸殘基的情況下,可改變1、2或3個胺基酸殘基。此移植可能導致與母體抗體相比結合親和性降低。若情況如此,則該構架可根據Queen等人(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88:2869揭示之特定準則在某些位置回復突變成母體構架。描述適用於人類化小鼠抗體之方法的其他參考文獻包括美國專利第4,816,397號、第5,225,539號及第5,693,761號;如Levitt (1983)J. Mol. Biol.
168:595-620中描述之電腦程式ABMOD及ENCAD;及Winter及合作者之方法(Jones等人(1986)Nature
321:522-525;Riechmann等人(1988)Nature
332:323-327;及Verhoeyen等人(1988)Science
239:1534-1536)。
可按照下文鑑別考慮進行回復突變之殘基。
當胺基酸屬於以下類別時,將所使用之人類生殖系序列之構架胺基酸(「受體構架」)用來自母體抗體化合物之構架(「供體構架」)的構架胺基酸置換:
(a) 受體構架之人類構架區中的胺基酸在該位置對於人類構架並不常見,而供體免疫球蛋白中之相應胺基酸在該位置處對於人類構架為典型的;
(b) 胺基酸之位置緊接於CDR之一;或
(c) 在三維免疫球蛋白模型中,構架胺基酸之任何側鏈原子均在CDR胺基酸之任何原子的約5至6埃以內(中心至中心)。
當受體構架之人類構架區中的各胺基酸及供體構架中之相應胺基酸在該位置處對於人類構架一般不常見時,則該胺基酸可以在該位置處對人類構架較為典型之胺基酸置換。此回復突變準則使得能夠恢復母體抗體化合物之活性。
產生展現與本文中揭示之抗體化合物相似之功能性質之人類工程改造抗體的另一方法包括在經移植CDR內隨機突變胺基酸而不改變構架,且篩選結合親和性及其他功能性質與母體抗體化合物一樣良好或比母體抗體化合物更佳的所得分子。亦可在各CDR內之各胺基酸位置引入單一突變,接著評估該等突變對結合親和性及其他功能性質的影響。可組合產生改良性質之單一突變,以便評估其在與彼此組合時的效應。
此外,亦有可能組合上述兩種方法。在CDR移植之後,除了在CDR中引入胺基酸變化以外,亦可回復突變特定構架區。此方法描述於Wu等人(1999)J
.Mol
.Biol
. 294:151-162中。
藉由應用本發明之教示,熟習此項技術者可使用常見技術(例如定點突變誘發)取代本發明揭示之CDR及構架序列內的胺基酸,且從而產生來源於本發明序列之其他可變區胺基酸序列。幾乎所有天然存在之胺基酸均可在特定取代位點引入。接著,可使用本文中揭示之方法來篩選此等其他可變區胺基酸序列,以鑑別具有指定活體內功能的序列。以此方式,可鑑別適用於製備本發明之人類工程改造抗體及其抗原結合部分的其他序列。構架內之胺基酸取代較佳侷限於本文中揭示之4個輕鏈及/或重鏈構架區中之任一或多者內的1、2或3個位置。CDR內之胺基酸取代較佳侷限於3個輕鏈及/或重鏈CDR中之任一或多者內的1、2或3個位置。亦有可能在以上描述之此等構架區及CDR內組合各種變化。
藉由引入上文論述之胺基酸修飾產生之抗體化合物的功能性與本文中揭示之特定分子展現之功能性質一致可藉由下文實例2至19中揭示之方法證實。
術語「抗原決定基」係指位於抗體或抗體片段所結合之肽或蛋白質上的特定胺基酸排列。抗原決定基通常由化學活性表面分子分組(諸如胺基酸或糖側鏈)組成,且具有特定三維結構特徵以及特定電荷特徵。抗原決定基為線性抗原決定基,亦即涉及與單一胺基酸序列結合;或為構形抗原決定基,亦即涉及在抗原之不同區(該等區可能不必鄰近)中與兩個或兩個以上胺基酸序列結合。本文中揭示之抗原決定基可由實例3中揭示之胺基酸序列組成,基本上由實例3中揭示之胺基酸序列組成,或包含實例3中揭示之胺基酸序列。
與本文中揭示之分子「競爭」的單株抗體或其抗原結合片段為在與本發明分子所結合之位點一致或重疊的位點結合人類c-Met者。競爭性單株抗體或其抗原結合片段可經由例如抗體競爭檢定來鑑別。舉例而言,可使經純化或經部分純化之人類c-Met的樣本與固體支撐物結合。接著,添加本發明之抗體化合物或其抗原結合片段以及懷疑能夠與該本發明抗體化合物競爭之單株抗體或其抗原結合片段。該兩種分子中之一者經標記。若經標記化合物及未經標記化合物與c-Met上之獨立且不連續之位點結合,則無論存在疑似競爭化合物與否,經標記化合物均將以相同程度結合。然而,若相互作用位點一致或重疊,則未經標記化合物將競爭,且與抗原結合之經標記化合物的量將降低。若未經標記化合物以過量存在,則極少經標記化合物將結合(若發生)。出於本發明之目的,競爭性單株抗體或其抗原結合片段為使本發明抗體化合物與c-Met之結合降低約50%、約60%、約70%、約80%、約85%、約90%、約95%或約99%者。進行該等競爭檢定之程序的詳情在此項技術中熟知,且可見於例如Harlow及Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual
,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,New York,第567至569頁,ISBN 0-87969-314-2中。該等檢定可藉由使用經純化抗體進行定量。藉由以一種抗體對其自身滴定來確定標準曲線,亦即,相同抗體用作標記及競爭抗體。滴定未經標記競爭性單株抗體或其抗原結合片段抑制經標記分子與板結合的能力。將結果繪圖,且比較為達到所要結合抑制程度所需之濃度。與本發明抗體化合物競爭之單株抗體或其抗原結合片段在該等競爭檢定中是否具備與本發明抗體化合物相同或相似之功能性質可經由本文實例2至19中揭示之方法來測定。
與本文中揭示之單株抗體或抗原結合片段結合實質上相同之c-Met抗原決定基的單株抗體或其抗原結合片段為彼等在與本發明分子所結合之位點重疊之位點處結合人類c-Met的單株抗體或其抗原結合片段。有助於鑑別與本文中揭示之c-Met單株抗體或抗原結合片段結合實質上相同之c-Met抗原決定基的單株抗體或其抗原結合片段的方法在此項技術中熟知,且描述於例如PCT國際公開案WO 00/64946中。與本文中揭示之彼等單株抗體或其抗原結合片段結合實質上相同之c-Met抗原決定基的該等單株抗體或其抗原結合片段是否具備與本發明抗體化合物相同或相似之功能性質可經由本文實例2至19中揭示之方法來測定。
「c-Met」或「人類c-Met」係指任何人類c-Met,以及其功能活性突變形式。c-Met之結構示意性描繪如下:
SEMA:Sema域
PSI:叢蛋白、信號蛋白(Semaphorin)及整合素(Integrin)域
IPT:4個免疫球蛋白、叢蛋白及轉錄因子域
TM:跨膜區
JM:近膜域
KD:激酶域
在人類c-Met ECD(SEQ ID NO:75)中,胺基酸1-24包含信號序列。成熟蛋白質起始於胺基酸25(E)。Sema域由c-Met之N末端的約500個胺基酸殘基組成,且含有α鏈(胺基酸殘基25-307)及β鏈之一部分(胺基酸殘基308-519)。
術語「抑制」意謂實質上拮抗、阻止、預防、制止、減緩、破壞、消除、終止、降低或逆轉c-Met之生物學作用的能力。
術語「治療」意謂減緩、中斷、遏制、控制、終止、降低或逆轉症狀、病症、病狀或疾病之進展或嚴重程度,但未必包括完全消除所有與疾病相關之症狀、病狀或病症。
可能治療急性狀況及慢性病狀。在急性狀況中,在症狀、病症、病狀或疾病發作時投與抗體或其抗原結合片段,且當急性狀況結束時停止。相反,慢性症狀、病症、病狀或疾病治療持續更長時限。
術語「有效量」係指在向患者投與單劑量或多劑量之後,亦即提供所要治療或預防的本發明抗體化合物之量或劑量。本發明抗體化合物之治療有效量可包含處於每單劑量約0.1mg/kg至約20mg/kg範圍內的量。用於任何個別患者之治療有效量均可由衛生保健提供者藉由監測抗體化合物對生物指標之作用來測定,該生物指標諸如腫瘤或非腫瘤組織中之細胞表面c-Met、腫瘤退化,等等。藉由此等方法分析所獲得之資料允許在治療期間修改治療方案,從而投與最佳量的抗體化合物(無論是單獨使用,抑或與另一種治療劑組合使用),且從而亦可確定治療持續時間。以此方式,可在治療過程中修改給藥/治療方案,以便投與最低量的展現令人滿意之腫瘤減少效果的抗體化合物(單獨使用或組合使用),且以便僅在成功治療患者必要之情況下繼續投與該等化合物。
本發明之抗體化合物可用作人類醫學中藉由多種途徑投與的藥劑。該等組合物最佳用於非經腸投藥。該等醫藥組合物可藉由此項技術熟知之方法製備。參看,例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第
19版(1995),A. Gennaro等人,Mack Publishing Co.,且包含本文中揭示之一或多種抗體化合物及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
術語「腫瘤」係指所有贅生性細胞生長及增殖(不論是惡性抑或良性),以及所有前癌性及癌性細胞及組織。如本文中所使用,術語「癌症」、「癌性」及「腫瘤」並不相互排斥。
術語「癌症」及「癌性」係指或描述哺乳動物之生理病狀,通常其特徵在於異常細胞生長/增殖。癌症之實例包括(但不限於)癌瘤、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤及白血病。
c-Met路徑調節異常可能由轉錄上調、c-Met基因擴增、特定基因變化或依賴配位體之自分泌或旁分泌機制誘導。人類腫瘤中組成性c-Met活化之最常見原因為在不存在基因擴增時蛋白質表現由於轉錄上調而增加。此外,已在包括胃癌及食道癌、非小細胞肺(NSCL)癌及髓母細胞瘤之許多人類原發性腫瘤中報導MET基因擴增,以及所致之蛋白質過度表現及組成性激酶活化。間葉細胞來源之腫瘤(諸如骨肉瘤及橫紋肌肉瘤)往往藉由產生HGF而利用自分泌機制。HGF含量升高及c-Met過度表現往往與不良臨床結果相關,該等不良臨床結果包括更具侵襲性之疾病、腫瘤轉移增加及患者存活時間縮短。此外,腫瘤中HGF及/或c-Met蛋白之高含量導致對化學療法及放射線療法之抗性。除異常HGF及c-Met表現以外,c-Met路徑亦可能因遺傳變異(諸如c-Met突變、基因擴增及基因重排)而活化。在所有患有經充分表徵之遺傳性乳頭狀腎細胞癌(PRCC)的個體及偶發性PRCC樣本之較小子集(13%)中均發現誤義c
-MET
突變。一些突變由於激酶活性增加而具備致癌潛能。HGF
及c
-MET
基因所歸屬之染色體7的三染色體症頻繁發生於PRCC中,且導致突變型c
-MET
等位基因之非隨機複製。此外,已在其他人類癌症(包括胃癌、頭頸部癌、肝癌、卵巢癌、非小細胞肺癌及甲狀腺癌)中,以及一些此等癌症之轉移中鑑別出體細胞c-MET
突變。與突變通常侷限於激酶域的PRCC不同,此等突變通常位於受體之其他區域中,例如近膜域。除了突變以外,c-MET
基因亦往往在乳癌、肝癌、腦癌、結腸直腸癌、胃癌(gastric cancer)、肺癌及胃癌(stomach cancer)中擴增,此現象與一些患者之疾病進展有關。
已在較大範圍之人類惡性疾病中證明異常HGF/c-Met信號傳導,包括膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、腎癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌及甲狀腺癌,以及膽管癌、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、滑膜肉瘤、卡堡氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、平滑肌肉瘤,及MFH/纖維肉瘤。此外,亦已在諸如急性骨髓性白血病、成人T細胞白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴瘤及多發性骨髓瘤之血液科惡性疾病中,以及諸如黑素瘤、間皮瘤、威爾姆斯瘤(Wilms'tumor)、神經膠母細胞瘤及星形細胞瘤之其他腫瘤中報導異常HGF及/或c-Met表現(概述於Liu等人(2008)Expert Opin. Investig. Drugs
17(7):997-1011中)。本發明之c-Met抗體可抑制依賴HGF及不依賴HGF之腫瘤。
以下非限制性實例說明本發明之各種態樣。
在以下實例中,人類化IgG2及IgG4以及鼠類IgG(有時亦稱為mIgG1)對照抗體為與本發明c-Met抗體無關的同型對照抗體。抗體C8、D11及optD11為鼠類抗體。在所有情況下,人類HGF係獲自R & D Systems(#294)。
本發明人類工程改造抗體之輕鏈及重鏈可變區、完整輕鏈及重鏈的胺基酸序列,以及上述之各別編碼核苷酸序列在下文名為「胺基酸及核苷酸序列」之部分中列出。輕鏈及重鏈CDR胺基酸序列分別展示於表1及表2中。
D11-抗體及C8-抗體之輕鏈可變區及重鏈可變區之共同序列為:
其中X1
為Y或R,且X2
為A或R;
其中X3
為S或R,X4
為I或Q,X5
為Q或V,且X6
為S或R;
其中X7
為N、I或R,X8
為K或P,且X9
為Y或F;
其中X10
為Y或N,X11
為G或R,X12
為S或G,X13
為A或T,且X14
為I或W。
藉由使用標準轉染程序在HEK293 EBNA細胞(Edge BioSystems,#90500130)中暫時表現抗體。在轉染之後,經轉染之細胞在37℃下於含有遺傳黴素(geneticin)(G418)及妥布黴素(tobramycin)之標準無血清培養基中培養48至120小時。抗體用60mL rProtein A Sepharose管柱(Amersham Biosciences,#17-1279-04)按照製造商說明書純化,且藉由尺寸排阻層析法(XK50/60 Superdex200,Pharmacia)用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)(pH 7.4)作為移動相進一步濃縮及純化。接著,使用0.22μm、33mm之Millev-GV、PVDF膜(Millipore,#SLGV033RS)過濾抗體,且在4℃至8℃下儲存。
下文許多實例中論述之鼠類IgG1 c-Met抗體5D5(美國專利第5,686,292號)係如上文所述自獲自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection,Manassas,VA)之融合瘤HB-11895分離及純化而來。
人類、食蟹猴及大鼠c-Met序列之細胞外域(ECD)表現為在Fc之C末端具有flag及His標籤(Flis標籤)的Fc融合蛋白(SEQ ID NO:72至SEQ ID NO:74)。此等c-Met ECD Fc融合蛋白獨立暫時表現於HEK293 EBNA細胞中,且如實例1中所述進行純化。
使用Biacore2000儀器來量測c-Met抗體與人類、食蟹猴及大鼠c-Met ECD之結合動力學。量測在25℃下進行。樣本溶解於HBS-EP緩衝液(150mM氯化鈉、3mM EDTA、0.005%(w/v)界面活性劑P-20,及10mM N-2-羥基乙基哌嗪-N'-2-乙烷磺酸(HEPES),pH 7.4;#BR-1001-88)中。山羊抗人IgG之F(ab')2
片段,亦即特異性F(ab')2
片段(Jackson Immunoresearch Inc.,#109-006-097)係使用胺偶合化學以4000個反應單位(RU)之含量固定在CM5感應器晶片之流量槽1至4上,以捕獲抗c-Met抗體。
使用多個循環來評估結合。各循環均以50μL/min之流速進行,且由以下步驟組成:以10μg/mL注射約10μL c-Met抗體旨在捕獲40-100RU;注射250μL人類、食蟹猴或大鼠c-Met-Flis-Fc ECD(對於各循環均以100nM起始,且使用2倍連續稀釋),接著解離20分鐘;及使用約30μL 10mM甘胺酸鹽酸鹽(pH 1.5)再生。各循環之結合及解離速率係使用BIAevaluation軟體4.1版中之「1:1(Langmuir)結合」模型來評估。對於抗體D11-S17Y與大鼠c-Met-Flis-FcECD之結合,使用非均質配位體模型來充分擬合資料;因此,獲得兩種結合親和性。
結果展示於下表3至表5中。
此等資料顯示,抗體C8-H241、C8-6及C8-co16以相似親和性結合人類及食蟹猴c-Met ECD,而非大鼠c-Met ECD。其他資料(未展示)表明,此等抗體在以具有1μg/mL ECD之至多100nM抗體塗布於ELISA板上時不結合小鼠c-Met ECD。然而,抗體D11-8B8、D11-C27G3及D11-S17Y結合人類、食蟹猴及大鼠c-Met ECD。
本發明c-Met抗體之抗原決定基係藉由氫氘交換質譜(HDXMS)(Yamada等人,(2002)Rapid Commun. Mass Spectrom
. 16(4):293-299)與焦碳酸二乙酯(DEPC)標記(Mendoza等人(2008)Analy. Chem
. 80(8):2895-2904)之組合加以定位。人類c-Met Sema域之氫氘交換反應係在存在或不存在c-Met抗體的情況下進行。與不存在抗體時相比,在存在抗體時獲得較少氘之Sema域區域鑑別為抗體之抗原決定基。DEPC可與Sema域中之表面曝露離胺酸或組胺酸殘基之胺基反應,形成胺基甲酸乙酯離胺酸或組胺酸。若此等胺基酸位於抗原決定基區域中,則其將受保護,且在抗體結合之後將不會與DEPC反應。此有助於進一步定位及/或證實藉由HDXMS測定之抗原決定基區域。
c-Met Sema域之表現及純化。
如實例1及2中所述,在HEK293 EBNA細胞中使人類c-Met之Sema域與C末端之Flis標籤一起表現(SEQ ID NO:76)且加以純化。接著,經純化之蛋白質在4℃下儲存於PBS(pH 7.4)中。此域以與全長人類c-Met ECD相似之親和性與本發明之c-Met抗體結合,表明此等抗體之抗原決定基位於人類c-Met之此區域中。
c-Met Sema域之脫糖基化及脫唾液酸化。
100μL 1.2mg/mL人類c-Met Sema域溶液在37℃下用1μL PNGaseF溶液(Prozyme,GKE-5006B)處理隔夜,以便脫除N-糖基。LC/MS分析顯示,在此處理之後,大部分蛋白質已脫除糖基。另外,100μL 1.2mg/mL人類c-Met Sema域溶液在37℃下用2μL 10U/mL神經胺糖酸苷酶溶液(Roche,目錄號10 269 611 001)處理1小時,以便脫除Sema域之唾液酸。
c-Met Sema域/抗體複合物之形成。
10μL脫除糖基之c-Met Sema域溶液(1.2mg/mL)與含有29μg蛋白質之抗體溶液等分試樣(2.07μL C8-H241、2.01μL D11-8B8,或3.87μL無關對照Mab)混合,且接著用1×PBS溶液稀釋至40μL之最終體積。另外,5μL脫除糖基之c-Met Sema域溶液(1.2mg/mL)與含有14μg蛋白質之抗體溶液等分試樣(1.04μL C8-H241、1.01μL D11-8B8,或1.94μL無關對照Mab)混合,且接著用1×PBS溶液稀釋至15μ1之最終體積。接著,對各抗體之各混合溶液進行HDXMS分析。
HDXMS檢定。
4μL脫除糖基或脫除唾液酸基之c-Met Sema域/抗體混合物與16μL 100% D2
O(Acros,編號166310500;交換期間80% D)混合,且在環境溫度下培育90秒。接著,在0℃下用50μL 0.5%(v/v)甲酸水溶液中止交換。經中止之溶液立即在0℃用2μL 5mg/mL(v/v)胃蛋白酶溶液(Sigma,目錄號P6887)處理3.5或4分鐘。經消化之溶液立即手動注射至RP-HPLC管柱(Polymer Laboratories,部分號1912-1802;2.1×50mm,微孔尺寸1000,粒度8μM)上。來自HPLC泵(Waters,2795 HPLC)之HPLC緩衝液流經過金屬管(約1mL)傳遞至手動注射器。管柱溶離液接著傳遞至Micromass LCT Premier或SYNAPT質譜儀。金屬管、注射器環管及管柱浸入冰水浴中。
管柱用99% A(0.05%(v/v) TFA(三氟乙酸)水溶液)及1% B(0.04%(v/v) TFA乙腈溶液)以0.2mL/min之流速平衡。進行等度梯度溶離1分鐘,經1分鐘自1%達到10% B,經12分鐘達到40% B,經4分鐘達到90% B,保持3分鐘,且接著快速返回至初始條件。質譜在Micromass LCT Premier質譜儀上以正噴霧、W模式進行,且設定如下:毛細管電壓為1.5kV;錐孔電壓為100V;孔口1為25V;質量範圍為200至2000;去溶劑化溫度為150℃;且去溶劑化氣體流速為500L/h。在有或無c-Met抗體存在下進行D/H交換之後,獲得c-Met之各胃蛋白酶肽之質譜。根據最強離子峰之同位素分布計算各肽之平均質量。
c-Met/抗體複合物之DEPC標記。
8.3μL 1.2mg/mL人類c-Met Sema域溶液與抗體溶液(24μg蛋白質:1.71μL C8-H241、1.67μL D11-8B8,或3.2μL無關對照Mab)及1×PBS溶液混合至76μL之最終體積。各c-Met/抗體混合物在環境溫度下用4μL 10mg/mL(w/v) DEPC異丙醇溶液處理5分鐘,且接著用10μL於0.1M Tris-HCl緩衝液(pH 8)中之20mg/mL組胺酸及10μL於0.1M Tris-HCl緩衝液(pH 8)中之0.2mg/mL離胺酸中止。各溶液與5μL 0.2mg/mL(w/v)豬胰蛋白酶溶液(Promega,目錄號V528A)混合,且一半混合物與0.5μL 50mg/mL(w/v)二硫蘇糖醇溶液混合。各樣本溶液在37℃下培育5小時,且接著用0.5μL PNGase F溶液再處理1小時。各經消化之溶液用2μL 10%(v/v)乙酸溶液酸化。向未添加二硫蘇糖醇之未經還原消化物中添加2μL 100mg/mL TCEP(參(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(Sigma,目錄號C4702-2G))溶液。各溶液均使用Waters Acquity UPLC及Waters SYNAPT質譜儀進行LC/MS分析。HPLC在60℃下使用Waters Acquity UPLC BEH C8管柱(2.1×50mm,1.7μm,Waters,部分號186002877),且用於水/乙腈/TFA HPLC移動相系統中之乙腈梯度來溶離肽。對於該等消化物使用45分鐘之操作時間。管柱用99% A(0.05%(v/v) TFA水溶液)及1%B(0.04%(v/v) TFA乙腈溶液)以0.2mL/min之流速平衡。梯度溶離在等度狀態下進行2分鐘,經25分鐘自1%達到25% B,經10分鐘達到45% B,經1分鐘達到90% B,保持1.5分鐘(在同一時段,流速為0.3mL/min),且接著快速返回至1% B。
結果:
Mab C8-H241似乎與位於人類c-Met細胞外域之α鏈(SEQ ID NO:75之胺基酸殘基25-307)中且包含c-Met Sema域之4個區域的構形抗原決定基結合:121
VVDTYYDDQL130
(SEQ ID NO:77);131
ISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQS156
(SEQ ID NO:78);179
ALGAKVLSSVKDRFINFF196
(SEQ ID NO:79);及216
VRRLKETKDGFM227
(SEQ ID NO:80)。
更特定言之,Mab C8-H241藉由與以下序列內之一或多個胺基酸殘基相互作用來結合c-Met:123
DTYYDD128
(SEQ ID NO:81),首末均包括在內;144
HVFPHNHTADIQS156
(SEQ ID NO:82),首末均包括在內;192
FINF195
(SEQ ID NO:83),首末均包括在內;及220
KETKDGFM227
(SEQ ID NO:84),首末均包括在內。
在結合檢定中,高達100nM抗體的情況下,Mab C8-H241與區域144
HVFPHNHTADIQS156
(SEQ ID NO:82)之結合使其能夠以類似親和性結合人類(SEQ ID NO:75)及食蟹猴(SEQ ID NO:73之胺基酸25至932)之c-Met細胞外域,而非大鼠或小鼠c-Met。
Mab D11-8B8與c-Met Sema域之α鏈結合似乎侷限於一個區域,亦即胺基酸序列84
YKTGPVLEHPDCFPCQDCSSKANL107
(SEQ ID NO:85)(首末均包括在內),更特定言之,區域95
CFPCQDCSSKA105
(SEQ ID NO:86)(首末均包括在內)內之線性抗原決定基內的胺基酸殘基。Mab D11-8B8之抗原決定基進一步藉由抗原決定基萃取實驗證實(Dhungana等人(2009)Methods Mol. Biol.
524:87-101)。c-Met Sema域用豬胰蛋白酶(Promega)消化,且消化物接著與經生物素標記之Mab D11-8B8混合,使用EZ-LinkTM
磺基-NHS-LC-生物素套組(Pierce,產品號1754210)以結合c-Met肽。有或無結合之c-Met肽的經生物素標記之D11-8B8由高容量抗生蛋白鏈菌素瓊脂糖樹脂(Thermo Scientific,產品號20359)捕獲。結合之肽藉由0.15%甲酸(v/v)水溶液釋放,且接著藉由LC/MS鑑別。
與c-Met具有最大序列一致性的人類蛋白質為RON及叢蛋白A2。此實驗比較c-Met抗體與c-Met、RON及叢蛋白A2 ECD之結合特異性。
96孔EIA/RIA高結合板(Costar,#2592)之孔在4℃下用100μL於塗布緩衝液(BioFX Labs,#COAT-1000-01)中之1μg/mL人類c-Met細胞外域(ECD)-Fc-Flis融合蛋白(SEQ ID NO:72)、RON-ECD-Fc(R&D Systems,#1947-MS)或叢蛋白A2-ECD-Fc(Abnova,Taipei,Taiwan,#H00005362-P01)塗布隔夜。對孔進行抽吸,且藉由添加200μL阻斷緩衝液(含0.05%(v/v)聚山梨醇酯20(Tween-20)(TBS-T)(BioFX Labs,#WSHW-1000-01)加1%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)(Jackson Immuno,#001-000-162)之Tris緩衝鹽水(pH 8.0))且在室溫下培育1小時來阻斷非特異結合位點。板用洗滌緩衝液(TBS-T)洗滌三次之後,每孔添加100μL於阻斷緩衝液中之c-Met抗體之1:6連續稀釋液(自100μg/mL起始),且在室溫下培育2小時。洗滌板,且每孔與100μL於阻斷緩衝液中之HRP結合山羊抗人類F(ab)2
IgG(Jackson ImmunoResearch Labs,#109-036-097)一起培育90分鐘。洗滌板之後,每孔添加100μL受質溶液(BioFx,#TMBW-1000-01),且板在室溫下培育10分鐘。每孔添加100μL終止溶液(BioFx,#LSTP-1000-01)以終止反應。發展比色信號,且在450nm使用SpectraMax 190板讀取器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)讀取。c-Met抗體與c-Met、RON及叢蛋白A2 ECD之結合與顏色信號產量成比例。
如表6中所示,與RON ECD或叢蛋白A2 ECD相比,本發明之C8及D11 c-Met抗體均優先結合人類c-Met ECD。
使用活體外結合檢定來測定本發明c-Met抗體對HGF與c-Met結合之抑制。
96孔EIA/RIA高結合板(Costar,#2592)之孔在室溫下用100μL於杜氏磷酸鹽緩衝鹽水(Dulbecco's phosphate buffered saline,DPBS)中之人類c-Met ECD-Fc-Flis(SEQ ID NO:72)(2μg/mL)塗布隔夜;在板洗滌器中用洗滌緩衝液(含0.05%(v/v)聚山梨醇酯20(-20)(TBS-T)(BioFX Labs,#WSHW-1000-01)之Tris緩衝鹽水(pH 8.0))洗滌4次;藉由添加300μL阻斷緩衝液(TBS-T加1%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)(Jackson Immuno,#001-000-162))阻斷;且在37℃下培育60分鐘。接著,自該等孔移除阻斷緩衝液,且分別以表7中指示之最終濃度向各孔中添加50μL於阻斷緩衝液中之抗體。向僅含HGF之對照孔中添加阻斷緩衝液。具有c-Met抗體之板在37℃下培育90分鐘。接著,向各孔中添加50μL最終濃度為10ng/mL的於阻斷緩衝液中之人類肝細胞生長因子(HGF)(R&D Systems,#294),僅含抗體之對照孔除外。含有c-Met抗體/HGF混合物之板在室溫下於板搖動器上培育2小時。接著,在板洗滌器中用TBS-T洗滌該等孔4次。接著,向各孔中添加100μL最終濃度為100ng/mL的於阻斷緩衝液中之經生物素標記之抗HGF抗體(R&D Systems,#BAF294)。在室溫下培育板90分鐘。在板洗滌器中用TBS-T再洗滌該等孔4次。向各孔中添加100μL於阻斷緩衝液中之抗生蛋白鏈菌素-辣根過氧化酶(HRP)(R & D Systems,DY998)之1:200稀釋液。在室溫下培育板30分鐘。在板洗滌器中用TBS-T洗滌該等孔4次。接著,每孔添加100μL受質溶液(BioFx,#TMBW-1000-01),且板在室溫下培育10分鐘。為終止反應,每孔添加100μL終止溶液(BioFx,#LSTP-1000-01)。樣本在微板讀取器(Spectra,MAX 190)上在450-570nm之波長下讀取,且未減去背景。
如表7中所示,本發明之C8及D11 c-Met抗體均阻斷人類HGF/c-Met結合。
用HGF刺激之後,A549肺癌細胞株展現c-Met在酪胺酸殘基1349處之磷酸化增加。使用磷酸化c-Met(p-Met) ELISA檢定來量測各種c-Met抗體在不存在HGF時的促效活性,以及Mab 5D5及HGF本身的促效活性。
在Ham's F12K+2mM麩醯胺酸(Invitrogen,#21127-022)+10% FBS培養基(Invitrogen,#10082))中培養A549細胞(ATCC,#CCL-185)。細胞以每孔6x104
個細胞塗鋪於如上文96孔板中之全血清培養基中,且在37℃於5%(v/v) CO2
下培育隔夜。自該等孔移除培養基,且使細胞在37℃於5%(v/v) CO2
下於100μL Ham's F12K+2mM麩醯胺酸培養基+0.5% FBS中饑餓6小時。抗體或HGF於饑餓培養基中稀釋,以表8中指示之最終濃度添加,且在37℃下培育15分鐘。吸出培養基,且細胞於每孔50μL溶解緩衝液(10mM Tris(Invitrogen,#15567-027)、150mM NaCl、2mM乙二胺四乙酸(EDTA)(Invitrogen,#15575-038)、50mM NaF(Sigma,#S1504)、1%(v/v)辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(-X 100;Sigma,#T8787)、2mM原釩酸鈉(EMD Chemicals,Gibbstown,NJ,#567540)、蛋白酶抑制劑(Sigma,St. Louis,MO;#P8340)、磷酸酶抑制劑混合液I(Sigma,#P2850)及磷酸酶抑制劑混合液II(Sigma,#P5726))中溶解,且在冰上培育15至20分鐘。細胞溶解產物用於下文所述之ELISA檢定中,以測定c-Met在殘基Y1349處之磷酸化。
c-Met捕獲抗體稀釋於Bup H塗布緩衝液(Thermo FisherScientific,Waltham,MA,#28382)中至2μg/mL,添加至ELISA板(Greiner Bio-One,Monroe,NC,#655081)中,且在4℃下培育隔夜。對該等孔進行抽吸,用TBS-T(BioFX,Owings Mills,MD,WSH-1000-01)洗滌3次,且接著在室溫下用200μL阻斷緩衝液(TBS-T加2%(w/v)BSA)阻斷1小時。板用TBS-T洗滌3次。接著,添加25μL細胞溶解產物加75μL阻斷緩衝液,且板在4℃下培育隔夜。接著,板用TBS-T洗滌3次。向各孔中添加100μl於阻斷緩衝液中之0.5μg/mL pY1349 c-Met多株抗體(Cell Signaling Technology,Danvers,MA,#3133),且在室溫下培育2小時。接著,板用TBS-T洗滌3次。向各孔中添加100μL於阻斷緩衝液中之1/10,000稀釋之過氧化酶結合之山羊抗兔IgG多株抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA,#111-035-144),且在室溫下培育1小時。接著,板用TBS-T洗滌3次。向各孔中添加100μL3,3',5,5'-四甲基聯苯胺溶液(BioFX,#TMBW-1000-01),接著添加100μl終止溶液(BioFX,#LSTP-1000-01)。板在SpectraMax M5板讀取器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)上在450nm讀取,且使用SOFTmax Pro 4.8軟體(Molecular Devices)測定樣本值。
結果展示於表8中。
資料顯示,HGF及促效劑c-Met Mab 5D5強烈刺激c-Met磷酸化,而本發明c-Met Mab C8-H241及C8-6較弱地刺激c-Met磷酸化。在HCT116、H460及MDA-MB-231細胞株中獲得類似結果。
Mab D11-8B8產生類似結果。
HGF與c-Met結合導致c-Met分子之酪胺酸磷酸化及c-Met信號傳導路徑之活化。在此實例中,使用對HGF有反應之人類結腸癌細胞株HCT116來評估本發明c-Met抗體對HGF誘導之c-Met之酪胺酸殘基1230、1234及1235之磷酸化的抑制。
HCT116細胞(ATCC,Manassas,VA,#CCL-247)再懸浮於含10%(v/v)胎牛血清(FBS)(Invitrogen,#10082-147)之McCoy's 5A培養基(Invitrogen,Carlsbad,CA,#16600-082)加青黴素/鏈黴素(Invitrogen,#15140-122)中至150,000個細胞/毫升。0.2mL再懸浮HCT116細胞以30,000細胞個/孔添加至96孔微量滴定板(Corning,Lowell,MA,#3596)中,且細胞接著在37℃於5%(v/v) CO2
下培育48小時。接著,吸出培養基且使細胞在37℃於5%(v/v) CO2
下於100μL含0.1%(w/v) BSA之McCoy's 5A培養基加青黴素/鏈黴素中饑餓24小時。添加25μL疊氮化鈉(最終濃度為0.01%(w/v))(Sigma,#S2002),接著立即向含0.1%(w/v) BSA之McCoy's 5A培養基加青黴素/鏈黴素中添加25μL 8×c-Met抗體稀釋液,且細胞在37℃於5%(v/v) CO2
下培育30分鐘。向各孔中添加50μL最終濃度為200ng/mL之HGF,且細胞在37℃於5%(v/v) CO2
下再培育15分鐘。接著,吸出培養基,且添加50μL細胞溶解緩衝液(10mM Tris(Invitrogen,#15567-027)、150mM NaCl、2mM乙二胺四乙酸(EDTA)(Invitrogen,#15575-038)、50mM NaF(Sigma,#S1504)、1%(v/v)辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(-X 100;Sigma,#T8787)、2mM原釩酸鈉(EMD Chemicals,Gibbstown,NJ,#567540),及不含EDTA之完全蛋白酶抑制劑(Roche,Basel,Switzerland,#11836170001))。在室溫下於溶解緩衝液中培育細胞15至30分鐘。藉由如下ELISA來檢定細胞溶解產物之c-Met酪胺酸磷酸化。
c-Met捕獲抗體稀釋於塗布緩衝液(BioFX,Glendora,CA,COAT-1000-01)中至2μg/mL。向ELISA板(Greiner Bio-One,Monroe,NC,#655081)每孔中添加110μL經稀釋抗體,且板在4℃下培育隔夜。對該等孔進行抽吸,用TBS-T洗滌2次,且接著用200μL阻斷緩衝液(TBS-T加2%(w/v) BSA)阻斷1小時。板用TBS-T洗滌2次。接著,添加25μL細胞溶解產物加75μL阻斷緩衝液或100μL MKN45細胞溶解產物稀釋液(用阻斷緩衝液稀釋,作為標準物),且板在室溫下培育2小時。接著,板用TBS-T洗滌4次。接著,向各孔中添加100μL於阻斷緩衝液中之0.5μg/mL pYpYpY1230/1234/1235c-Met多株抗體(Invitrogen,#44-888G),且板在室溫下培育2小時。接著,板用TBS-T洗滌4次。接著,添加100μL於阻斷緩衝液中之1/12,000稀釋之過氧化酶結合之山羊抗兔IgG多株抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA,#111-035-144),且混合物在室溫下培育1小時。接著,板用TBS-T洗滌6次。向各孔中添加100μL 3,3',5,5'-四甲基聯苯胺溶液(BioFX,#TMBW-1000-01),接著添加100μL終止溶液(BioFX,#LSTP-1000-01)。使用SpectraMax 190板讀取器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)在450nm(以570nm校正)讀取板。使用四參數分析確定標準曲線,且使用SOFTmax Pro 3.1.2軟體(Molecular Devices)測定樣本值。
c-Met酪胺酸磷酸化之抑制百分比設定為不添加c-Met抗體時HGF處理的平均值(0%抑制),且100%抑制設定為疊氮化鈉處理之平均值(無HGF或c-Met抗體處理)。
表9展示對3次實驗每次實驗一式三份處理的平均值及標準誤差。資料顯示,與人類IgG2及IgG4同型對照相比,本發明之6種c-Met抗體中有5種顯著抑制HGF誘導之c-Met酪胺酸磷酸化。
此實例中描述之實驗採用螢光活化細胞分類(FACS)分析來證明本發明c-Met抗體與細胞表面c-Met分子結合且誘導c-Met內化。所採用之MKN45細胞組成性表現高量之總c-Met,且展現由於MET
基因擴增所致的HGF不依賴之c-Met磷酸化。c-Met內化似乎誘導c-Met降解(參看實例10及19),導致c-Met信號傳導路徑抑制。
6孔組織培養板(Costar,#3598)之孔接種1.5×105
個人類胃腫瘤MKN45細胞(Japan Health Sciences Foundation,Health Science Research Resource Bank,#JCRB0254)於2mL培養基(RPMI-1640(Invitrogen,#11835);10%(v/v) FBS(Invitrogen,#10082);2mM L-麩醯胺酸(Invitrogen,#25030);100U/500mL青黴素G,及100μg/500mL鏈黴素(Invitrogen,#15140))中。板在37℃於95%相對濕度及5%(v/v) CO2
下培育24小時。接著抗體加入孔中,最終濃度5μg/mL。隔夜處理之後,自孔移除培養基,且用1mL無酶細胞解離溶液(Chemicon,#S-014-B)替換。在室溫培育5分鐘之後,細胞收集至離心管中,在培養基中洗一次,接著在結合緩衝液(含1%(w/v) BSA及0.01%(w/v)疊氮化鈉之DPBS)中再洗一次。在細胞染色之前,使用Alexa Fluor 488單株抗體標記套組(Molecular Probes,Eugene,OR,#A-20181)根據供應商說明書標記識別本發明c-Met抗體之不同抗原決定基的c-Met抗體。向細胞添加100μL含有2μg/mL經Alexa Fluor 488標記之抗體的結合緩衝液,接著在冰上培育60分鐘。接著,細胞用結合緩衝液洗1次,再懸浮於含有2μg/mL碘化丙錠(propidium iodide)之DPBS中(以染色死亡細胞)。由FACS分析法分析保留在細胞表面上c-Met分子的量,各樣本獲取10,000個結果。
細胞表面上之平均螢光強度反映用c-Met抗體處理後保留在細胞表面上c-Met分子的量。
一個代表性實驗之資料展示於表10中。
資料顯示,用本發明c-Met抗體處理之細胞表面上的平均螢光強度比用相應IgG同型對照抗體或mIgG抗體處理之細胞低,表明本發明c-Met抗體誘導c-Met內化。此外,用本發明c-Met抗體處理之細胞表面上的平均螢光強度比用對照促效劑c-Met抗體5D5處理之細胞低。內化百分比可如下計算:
%內化=[1-(測試抗體之平均螢光÷同型抗體對照之平均螢光)]×100]。
內化資料表明,本發明抗體誘導人類c-Met二聚。實例9及19中之資料顯示,C8-抗體及D11-抗體亦誘導c-Met降解,且減少c-Met磷酸化。
藉由共焦顯微術使用經螢光標記之鼠類C8抗體在MKN45及Caki-1細胞中獲得互補之內化結果。
使用C8-H241、C8-6、C8-co-16及鼠類D11抗體,在以編碼食蟹猴c-Met之核酸轉染的食蟹猴NIH3T3細胞中獲得類似內化結果。
C8-H241、C8-6、C8-co-16及optD11抗體在以編碼人類c-Met激酶域突變M1149T之核酸轉染的NIH3T3細胞中亦誘導內化。抗體C8-H241、C8-6、C8-co-16及鼠類D11在含有c-Met近膜域突變R988C的非小細胞肺癌H1437細胞中亦誘導c-Met內化。兩種突變均導致c-Met之功能獲得性組成性活化。
在此檢定中,檢驗在不存在HGF配位體時,c-Met抗體在不依賴HGF之MKN45細胞中對活體外腫瘤細胞生長之抑制。
c-Met及同型對照抗體用培養基(RPMI-1640(Invitrogen,#11835)、10%(v/v)FBS、2mM L-麩醯胺酸(Invitrogen,#25030)、100U/500mL青黴素G,及100μg/500mL鏈黴素(Invitrogen,#15140))稀釋達到表11中指示之最終濃度的2倍,且向96孔組織培養板(PerkinElmer,#1450-517)之各孔中添加50μL 2×抗體溶液。MKN45細胞(Japan Health Sciences Foundation,Health Science Research Resource Bank,#JCRB0254)維持於上文指示之培養基中,且再懸浮於相同培養基中至1×105
個細胞/毫升。向各孔中添加50μL此MKN45再懸浮液達到5×103
個細胞/孔。接著,板在37℃於95%相對濕度及5%(v/v) CO2
下培育48小時。在培養之最後6小時,細胞在37℃、95%相對濕度、5%(v/v) CO2
下以每孔1μci之3
H-胸苷(MP Biomedicals,Solon,OH #24066)脈衝。接著,移除培養基,且細胞用DPBS洗滌1次。此後,向各孔中添加200μL Optiphase Supermix(PerkinElmer,#1200-439)。密封板,且在室溫下培育至少1小時。使用閃爍計數器計數併入細胞中之3
H-胸苷1分鐘。
一個代表性實驗之資料展示於表11中。
此等資料顯示,如3
H-胸苷併入減少所證明,本發明之各種C8-c-Met抗體及D11-c-Met抗體抑制不依賴HGF之MKN45細胞增殖。在各展現c-Met之組成性過度表現及磷酸化的SNU5及NUGC-4腫瘤細胞中獲得類似結果。
此實例研究用本發明c-Met抗體處理MKN45細胞是否會導致磷酸化c-Met(p-Met)及總c-Met減少。此外,使用此檢定來測定c-Met抗體處理是否誘導c-Met ECD脫落至MKN45調節之培養基中。
c-Met及同型對照抗體用培養基(RPMI-1640(Invitrogen,#11835)、10%(v/v) FBS(Invitrogen,#10082)、2mM L-麩醯胺酸(Invitrogen,#25030)、100U/500mL青黴素G,及100μg/500mL鏈黴素(Invitrogen,#15140))稀釋達到表12中指示之最終濃度的2倍,且向96孔組織培養板(Costar,#3596)之各孔中添加50μL 2×抗體溶液。MKN45細胞(Japan Health Sciences Foundation,Health Science Research Resource Bank,#JCRB0254)維持於上文指示之培養基中,且再懸浮於相同培養基中至1×105
個細胞/毫升。向各孔中添加50μL此MKN45再懸浮液達到5×103
個細胞/孔。接著,板在37℃於95%相對濕度及5%(v/v) CO2
下培育24小時,且如實例7中所述製備細胞溶解產物。此外,收集各處理之經調節培養基供c-Met-ECD定量。細胞溶解產物中之p-Met及總c-Met含量係藉由ELISA測定,且校正為溶解蛋白質濃度(如藉由BCA,Pierce #23225所測定)。
磷酸化c-Met
如實例7中所述測定c-Met在酪胺酸殘基1230、1234及1235之磷酸化。
總c-Met及c-Met ECD脫落
對於總c-Met及c-Met ECD ELISA,c-Met捕獲抗體稀釋於塗布緩衝液(BioFX,Glendora,CA,COAT-1000-01)中至2μg/mL。向ELISA板(Greiner Bio-One,Monroe,NC,#655081)每孔中添加110μL經稀釋抗體,且板在4℃下培育隔夜。對孔進行抽吸,用TBS-T洗滌2次,且接著在室溫下用200μL阻斷緩衝液(TBS-T加2%(w/v) BSA)阻斷1小時。接著,板用TBS-T洗滌2次。接著,添加MKN45細胞溶解產物、MKN45調節培養基或c-Met細胞外域(ECD)(SEQ ID NO:75)(作為標準物),且板在室溫下培育2小時。接著,板用TBS-T洗滌4次。接著,向各孔中添加100μl 0.5μg/mL經生物素標記之第二c-Met抗體(Mab 5D5),該抗體可結合稀釋於阻斷緩衝液中之捕獲抗體的不同c-Met抗原決定基,且板在室溫下培育2小時。接著,板用TBS-T洗滌4次。接著,添加100μL於阻斷緩衝液中之1/12,000稀釋之過氧化酶結合之抗生蛋白鏈菌素(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA,#016-030-084),且混合物在室溫下培育1小時。接著,板用TBS-T洗滌6次。向各孔中添加100μL 3,3',5,5'-四甲基聯苯胺溶液(BioFX,#TMBW-1000-01),接著添加100μL終止溶液(BioFX,#LSTP-1000-01)。使用SpectraMax 190板讀取器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)在450nm(以570nm校正)讀取板。使用四參數分析確定標準曲線,且使用SOFTmax Pro 3.1.2軟體(Molecular Devices)測定樣本值。
如表12中所示,p-Met及總c-Met ELISA資料揭示,Mab C8-H241處理最大程度上使p-Met減少77%,且使總c-Met減少約67%。D11-8B8處理最大程度上使p-Met減少約75%,且使總c-Met減少63%。
如實例8中所述,此等資料顯示C8-抗體及D11-抗體誘導c-Met降解,且減少c-Met磷酸化。
表12中之資料亦表明,用C8-H241及D11-8B8 c-Met抗體處理不會誘導c-Met ECD裂解及脫落。
Caki-1腎癌細胞回應於HGF而增殖。此實例中檢驗c-Met抗體在不存在HGF時活化Caki-1細胞中之c-Met,以評估本發明之c-Met抗體的促效劑活性。
向96孔組織培養板之孔中接種在補充有10%(v/v)FBS、2mM L-麩醯胺酸(Invitrogen,#25030)、100U/500mL青黴素G及100μg/500mL鏈黴素(Invitrogen,#15140)之McCoy's 5A培養基(Invitrogen,#16600)中的5,000個人類腎透明細胞癌Caki-1細胞(ATCC,#HTB-46)。培養24小時之後,細胞在低血清培養基(0.5%(v/v) FBS)中再饑餓24小時。接著,在抗c-Met抗體及對照抗體存在下,在37℃、95%相對濕度、5%(v/v) CO2
下,在低血清培養基中以表13中指示之最終濃度培養細胞24小時。在培養之最後6小時,細胞在37℃、95%相對濕度、5%(v/v) CO2
下以每孔1μci之3
H-胸苷(MP Biomedicals,Solon,OH #24066)脈衝。接著,移除培養基,且細胞用DPBS洗滌1次。此後,向各孔中添加200μL Optiphase Supermix(PerkinElmer,#1200-439)。接著密封板,且在室溫下培育至少1小時。使用閃爍計數器計數併入細胞中之3
H-胸苷1分鐘。
一個代表性實驗之資料展示於表13中。
此等資料顯示,與IgG同型對照相比,c-Met抗體C8-H241、C8-6、C8-co-16及D11-8B8不會顯著增加Caki-1細胞中胸苷-[甲基-3
H]之攝取。與IgG同型對照相比,D11-C27G3及D11-S17Y展現對Caki-1細胞中胸苷-[甲基-3
H]攝取的低、可變但統計上顯著之刺激。在相同實驗條件下,與本發明c-Met抗體相比,對照c-Met促效劑抗體5D5在Caki-1細胞中誘導較強胸苷-[甲基-3
H]攝取。
在不存在HGF的情況下,在具HGF反應性之初級人類肝細胞(PHH)中進一步評估本發明c-Met抗體之促效劑活性。
極冷保藏之可塗鋪PHH細胞(KQG Celsis,Chicago,IL,RD#00002)在37℃下解凍,且於含Torpedo抗生素混合物(Celsis,#Z99000)之InVitroGRO CP培養基(Celsis,#Z99029)中再懸浮至175,000個細胞/毫升。以35,000個細胞/孔向經膠原蛋白1塗布之96孔微量滴定板(BD,Franklin Lakes,NJ,#354407)之每孔中添加0.2mL再懸浮之PHH細胞,且細胞在37℃、5%(v/v) CO2
下培育24小時。接著吸出培養基,且每孔添加150μL含Torpedo抗生素混合物加0.1%(w/v) BSA之InVitroGRO HI培養基(Celsis,#Z99009),加50μL於含Torpedo抗生素混合物加0.1%(w/v)BSA之InVitroGRO HI培養基中最終濃度範圍為10μg/mL至0.0032μg/mL之c-Met抗體及對照抗體,或最終濃度為200ng/mL之HGF。細胞在37℃、5%(v/v) CO2
下培育48小時,且在培育之最後6小時向每孔添加10μL 0.1mCi/mL胸苷-[甲基-3
H](MP Biomedicals,Solon,OH,#24066)。檢定板在-70℃下冷凍,在37℃解凍,且使用Filtermate收集器(Perkin Elmer)回收至UniFilter-96,GF/C板(Perkin Elmer,Waltham,MA,#6005174)上。乾燥UniFilter板,向每孔添加20μL Microscint 0閃爍劑(Perkin Elmer,#6013611),且在1450Microbeta液體閃爍計數器(Perkin Elmer)上計數板。
表14展示一式三份處理之平均值及標準偏差,且代表三個重複實驗。
資料顯示,與IgG同型對照相比,本發明c-Met抗體C8-H241不會顯著增加PHH細胞中之胸苷-[甲基-3
H]攝取;C8-6、C8-co-16、D11-8B8、D11-C27G3及D11-S17Y展現對胸苷-[甲基-3
H]攝取之低、可變但統計上顯著之刺激。然而,本發明c-Met抗體之促效劑活性顯著低於5D5對照c-Met抗體。促效劑抗體5D5以劑量依賴性方式刺激PHH增殖,在3μg/mL濃度下增加5倍。在200ng/mL時,HGF刺激3
H-胸苷攝取增加5倍。Mab C8-H241並不誘導增殖,即使當以10μg/mL使用時。
在人類腎上皮HK2細胞中獲得類似結果,該等細胞亦回應於HGF刺激而增殖。
HGF誘導MatrigelTM
(Becton-Dickinson,#354234)(其為含有基膜之組分的細胞外基質材料)中生長之HepG2細胞之管狀形態發生變化。在此實驗中,評估本發明抗體在誘導HepG2細胞之管狀形態發生變化方面的類HGF促效劑活性。
在補充有10% FBS之DMEM中培養HepG2細胞(ATCC,#HB-8065)。100μL稀釋於補充有10%(v/v) FBS、2mM L-麩醯胺酸(Invitrogen,#25030)、100U/500mL青黴素G及100μg/500mL鏈黴素(Invitrogen,#15140)之Opi-MEMI(Invitrogen,#31985)中的MatrigelTM
溶液(MatrigelTM
,Becton-Dickinson)塗鋪於96孔組織培養板(Costar,#3596)之孔中。MatigelTM
溶液固化之後,添加於50μL補充有10%血清之培養基中的2000個HepG2細胞。接著,向細胞中添加最終濃度為50μg/mL之c-Met抗體及對照抗體,或最終濃度為50ng/mL之HGF。細胞在37℃於含有5%(v/v) CO2
之含濕氣氛圍中生長4天。4天之後,移除頂部培養基,且替換為50μL於PBS中之1mg/mL對碘硝基-四唑鎓鹽紫(Sigma,#I8377),且細胞在相同條件下再培育48小時。獲取經染色之32mm區域的照片,且使用Image-Pro Plus 6(Media Cybernetics,Inc.,MD)加以分析。
對於50μg/mL之抗體的一個代表性實驗之資料展示於表15中。
此等資料顯示,與同型對照相比,HGF及對照促效劑抗體5D5在HepG2細胞中誘導約5倍管狀形態發生變化。相反,在相同條件下,本發明c-Met抗體C8-H241及C8-co16在HepG2細胞中不誘導顯著管狀形態發生變化,而c-Met抗體C8-6僅誘導低程度之刺激。
以Mab D11-8-B8獲得類似結果。
在用HGF刺激之後,DU145前列腺癌細胞即彼此解離,且H441細胞即填充於在匯合細胞層中製造之劃痕中。H441細胞展現較高程度之c-Met表現及此受體之組成性磷酸化,但仍具HGF反應性。以下實驗評估本發明抗體在擴散檢定及劃痕檢定中對細胞運動的促效劑作用。
DU145細胞擴散檢定
在37℃於5%(v/v)CO2
下,於MEM培養基(Invitrogen,#11095)+10% FBS(Invitrogen,#10082)中生長之DU145細胞(ATCC,#HTB-81)以2×103
個細胞/孔以70μL體積塗鋪於黑色ViewPlate 96孔板(Perkin Elmer,Waltham,MA,#6005182)中,且在37℃於5%(v/v) CO2
下培育隔夜。c-Met抗體及對照抗體稀釋於細胞培養基中,且以20μg/mL之最終濃度添加,且HGF以20ng/mL之最終濃度添加,各以30μL體積以一式十二份進行,且在37℃於5%(v/v) CO2
下培育48小時。接著吸出培養基,且細胞在室溫下於2%甲醛中固定15分鐘。孔用PBS洗滌3次,且在室溫下添加50μL 5U/mL Alexa Fluor 488毒傘素(phalloidin)(Invitrogen,#A12379)歷時30分鐘。孔用PBS洗滌3次,且添加50μL 15μM碘化丙錠(Invitrogen,#P3566)。接著,在Acumen ExplorerTM
雷射掃描螢光微板細胞計數器(TTP Labtech Ltd,Cambridge,MA)上使用Jockyss軟體讀取板,以測定DU145細胞在群落中之百分比。
結果展示於表16中。
資料顯示,促效劑c-MetMab 5D5及HGF顯著刺激DU145細胞擴散/運動,而c-Met Mab C8-H241、C8-co-16、C8-6或D11-8B8並不顯著刺激DU145細胞擴散/運動。
H441細胞劃痕檢定
對於H441劃痕檢定,H441細胞(ATCC,#HTB-174)在RPMI-1640(Invitrogen,#11835)、10%(v/v) FBS(Invitrogen,#10082)、2mM L-麩醯胺酸(Invitrogen,#25030)、100U/500mL青黴素G及100μg/500mL鏈黴素(Invitrogen,#15140)中生長,且以1×106
個細胞/2毫升/孔接種在6孔組織培養板(Costar,#3598)之孔中之培養基中。板在95%相對濕度及5%(v/v) CO2
下培育3天。接著吸出培養基,且細胞在低血清培養基(0.5%(v/v) FBS於RPMI培養基中)中饑餓16小時。以5mL吸管頭在各孔中部對孔底部上之匯合細胞層進行劃痕,且吸出漂浮細胞。剩餘細胞用低血清培養基洗滌1次。添加低血清培養基,且經劃痕區域使用明視野顯微鏡以4×物鏡成像。此等間隙定義為在0小時之間隙。
測試抗體以10μg/mL之最終濃度添加至細胞中,接著在37℃於5% CO2
(v/v)下培育16小時。HGF以200ng/mL之最終濃度進行測試。各處理組至少以一式兩份孔加以測試。在16小時,經劃痕區域再使用明視野顯微鏡成像。此等間隙定義為在16小時之間隙。
c-Met抗體或HGF對H441細胞運動填充間隙之作用計算如下:
結果展示於表17中。
資料顯示,促效劑c-Met Mab 5D5及HGF刺激H441細胞運動/填充於經劃痕之區域中。在相同條件下,c-Met Mab C8-H241及C8-6並不刺激H441細胞運動。
HGF及促效劑c-Met抗體刺激帶有c-Met之細胞的侵入。此實例檢驗本發明c-Met抗體在採用在侵入檢定中具HGF反應性之HepG2細胞之細胞侵入檢定中的促效劑活性。
HepG2細胞(ATCC,#HB-8065)在無血清MEM培養基(Invitrogen,#11095)中饑餓隔夜,且接著向matrigel侵入腔(BD,Franklin Lakes,NJ,#354483)之頂部腔之各孔中添加總體積為500μL之5×104
個細胞,而底部腔含有於總體積為750μL之無血清培養基中濃度為10μg/mL的抗體或於無血清培養基中50ng/mL之HGF,接著在37℃於5%(v/v) CO2
下培育48小時。用拭子自頂部腔移除未侵入細胞,接著用95%乙醇進行膜固定且用0.2%(w/v)結晶紫染色。洗滌及乾燥之後,藉由使用Image-Pro Plus 6 Manual Tag(Media Cybernetics,Inc.,MD)軟體分析以2.5×物鏡獲取之染色細胞之照片來計數侵入細胞之數目。
結果概述於表18中。
資料顯示,促效劑c-Met Mab 5D5及HGF刺激HepG2侵入,而c-Met Mab C8-H241及(鼠類)C8不刺激HepG2侵入。鼠類c-Met Mab optD11較弱地誘導HepG2細胞侵入。
HGF及促效劑c-Met抗體刺激血管生成。評估本發明c-Met抗體在ADSC/ECFC共培養物管形成檢定中之此功能性促效劑性質。脂肪來源之幹細胞(ADSC)表現HGF;內皮群落形成細胞(ECFC)回應於HGF刺激而形成管。
ADCS(Lonza,Allendale,NJ,#PT-5006)解離,再懸浮於基礎培養基(MCDB-131培養基(Sigma,St. Louis,MO #M8537))+30μg/mL L-抗壞血酸2-磷酸酯(Sigma #A8960)、1μM地塞米松(dexamethasone)(Sigma #D4902)、50μg/mL托普黴素(tobramycin)(Sigma #T4014)、10μg/mL Cell Primer 大鼠轉鐵蛋白AF(Millipore #9701)+10μg/mL Nucellin(Lilly人類重組胰島素))中,以4×104
個細胞/孔塗鋪於96孔板中,且在37℃於5%(v/v) CO2
下培育隔夜。吸出培養基,且以每孔100μL添加於基礎培養基中之500μg/mL肝素鈉(Sigma,#H3393),接著細胞在37℃下培育1小時。對孔進行抽吸,用100μL基礎培養基洗滌1次,且如下添加ECFC:ECFC(EndGenitor Technologies,Inc.,Indianapolis,IN #EGT-ECFC100506)解離,在基礎培養基中洗滌,再懸浮於基礎培養基中,且以4×103
個細胞/孔添加在96孔板中之ADSC頂部。在37℃下培育4小時之後,HGF及抗體稀釋於細胞培養基中,且以以下最終濃度添加至獨立孔中:HGF:100ng/mL;抗體:10μg/mL。HGF抗體(R & D Systems #AB-294-NA)亦以10μg/mL之最終濃度添加。細胞在37℃下再培育4天。對孔進行抽吸,且每孔添加100μL 1%三聚甲醛,接著培育20至30分鐘。細胞用PBS-BSA(0.1% BSA,Invitrogen #15260-037)洗滌3次,且在37℃用50μL 1μg/mL抗人類CD31抗體(R & D Systems,#AF806)處理1小時或在4℃處理隔夜。細胞用PBS-BSA洗滌2次,且在室溫下用50μL 4μg/mL抗羊IgG AlexaFluor488結合物(Invitrogen,#A11015)處理1小時。細胞用PBS-BSA洗滌2次,且用100μL Hoechst3342染料染色,且在Cellomics ArrayScan(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)上讀取。使用vHCS View Version 1.4.6軟體來測定總管面積,該面積用於評估各種抗體及HGF對血管生成刺激之影響。
結果展示於表20中。
結果顯示,C8-H241及C8-6與培養基或其相應同型對照抗體相比並不刺激管形成,而HGF及促效劑Mab 5D5顯著刺激管形成。
分別在採用MKN45細胞及U87MG(人類膠質母細胞瘤)細胞小鼠異種移植模型之活體內檢定中,檢驗本發明c-Met抗體對不依賴HGF及依賴HGF之腫瘤細胞生長的抑制。MKN45細胞在不存在HGF時組成性表現高含量之c-Met及c-Met磷酸化。U87MG細胞以自分泌方式分泌HGF,且具HGF反應性。
MKN45細胞(Japan Health Sciences Foundation,Health Science Research Resource Bank,#JCRB0254)如實例8中所述在培養基中擴增,胰蛋白酶處理成單個細胞,收集,且再懸浮於PBS中。於PBS中之兩百萬個MKN45細胞皮下注射至無胸腺裸小鼠(Harlan,Indianapolis,IN)之後脅中。c-Met抗體及相應IgG2及IgG4抗體稀釋於PBS(pH 7.2)中,且自腫瘤細胞植入後3或7天開始每週以1、5或20mg/mL藉由靜脈內注射投與。藉由在治療過程中每週兩次以三維測徑規量測腫瘤體積來測定對腫瘤細胞生長之抑制。量測體重作為毒性之一般度量。
U87MG細胞(ATCC,#HTB-14)在37℃於MEM(Invitrogen,#11095)中生長,在培養物中擴增,胰蛋白酶處理成單個細胞,收集,且再懸浮於PBS(Invitrogen,#14190)中。五百萬個細胞皮下注射至無胸腺裸小鼠(Harlan,Indianapolis,IN)之後脅中。c-Met抗體稀釋於PBS中,且自腫瘤細胞植入後7天開始以表22中指示之劑量、每週藉由靜脈內注射投與。對照IgG4抗體以10mg/kg投與。藉由在治療過程中每週兩次以三維測徑規量測腫瘤體積來測定對腫瘤細胞生長之抑制。量測體重作為毒性之一般度量。
四種抗體(D11-8B8、C8-H241、C8-6及C8-Co-16)在MKN45細胞異種移植模型中之抗腫瘤功效概述於表21中。「%抑制最大值」表示與用相應對照抗體處理(0%抑制)相比,對腫瘤腫瘤生長之抑制百分比。
當以5mg/kg或20mg/kg用藥時,所有四種c-Met抗體與其相應IgG同型對照相比均對MKN45腫瘤細胞生長產生顯著抑制。
C8-H241對腫瘤細胞生長之劑量依賴性抑制亦可在依賴HGF之U87MG細胞異種移植模型中觀察到,如於表22中所概述。「%抑制最大值」表示與用相應IgG4對照抗體處理(0%抑制)相比,對腫瘤腫瘤生長之抑制百分比。
在5mg/kg及20mg/kg時,C8-H241抗體亦分別抑制H441非小細胞肺癌異種移植腫瘤生長達58%及60%。H441細胞展現較高程度的c-Met表現及c-Met組成性磷酸化,但仍對HGF具反應性。
在此實例中,研究c-Met抗體C8-H241在帶有MKN45(不依賴HGF)之異種移植腫瘤的小鼠中對總c-Met及磷酸化c-Met之活體內活性。投與抗體之後24小時,觀察到總c-Met及磷酸化c-Met(在酪胺酸1349)之劑量依賴性減少。
MKN45細胞如實例8中所述在培養物中擴增,經胰蛋白酶處理,且收集。於PBS中之兩百萬個MKN45細胞皮下注射至無胸腺裸小鼠(Harlan,Indianapolis,IN)之後脅中。c-Met抗體C8-H241稀釋於PBS(pH 7.2)中,且在腫瘤細胞植入後8天藉由靜脈內注射以2.5、5、10、20及40mg/kg投與。對照抗體hIgG4以40mg/kg投與。處理24小時之後,移除腫瘤,急驟冷凍,暫時在-80℃下儲存,且於溶解緩衝液(5mM乙二胺四乙酸(EDTA)、5mM乙二醇-雙(b-胺基乙基)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、50mM HEPES、20mM焦磷酸鈉(ThermoFisherScientific,#S390-500)、150mM NaCl、20mM NaF、1%(v/v)辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(-X 100)、無EDTA之完全蛋白酶抑制劑(Roche,Basel,Switzerland,#1836153)磷酸酶抑制劑混合液I(Sigma #P2850)及磷酸酶抑制劑混合液II(Sigma #P5726))中溶解。
總c-Met ELISA
對於總c-Met ELISA,c-Met捕獲抗體稀釋於Bup H塗布緩衝液(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,#28382)中至2μg/mL。向ELISA板(ThermoFisherScientific,Waltham,MA #439454)之每孔中添加100μL經稀釋抗體,且板在4℃下培育隔夜。對孔進行抽吸,用TBS-T洗滌2次,且接著在室溫下用200μL阻斷緩衝液(TBS-T加2%(w/v) BSA)阻斷1小時。板用TBS-T洗滌2次。接著,添加腫瘤溶解產物或c-Met細胞外域(SEQ ID NO:75之胺基酸25-932)之稀釋液,且板在4℃下培育隔夜。接著,板用TBS-T洗滌3次。接著,向各孔添加100μL稀釋於阻斷緩衝液中之0.5μg/mL經生物素標記之Mab 5D5(作為結合與捕獲抗體不同之c-Met抗原決定基的第二c-Met抗體),且板在室溫下培育2小時。接著,板用TBS-T洗滌3次。接著添加100μL於阻斷緩衝液中之1/10,000稀釋之過氧化酶結合之抗生蛋白鏈菌素(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA,#016-030-084),且混合物在室溫下培育1小時。接著,板用TBS-T洗滌3次。向各孔添加100μL 3,3',5,5'-四甲基聯苯胺溶液(BioFX,#TMBW-1000-01),接著添加100μL終止溶液(BioFX,#LSTP-1000-01)。使用SpectraMax 250板讀取器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)用SOFTmax Pro 3.l.2軟體(Molecular Devices)在450nm讀取板。
磷酸化c-Met ELISA
對於磷酸化c-MetELISA,c-Met捕獲抗體稀釋於Bup H塗布緩衝液(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,#28382)中至2μg/mL。向ELISA板(ThermoFisherScientific,Waltham,MA #439454)之每孔中添加100μL經稀釋抗體,且板在4℃下培育隔夜。對孔進行抽吸,用TBS-T洗滌2次,且接著在室溫下用200μL阻斷緩衝液(TBS-T加2%(w/v) BSA)阻斷1小時。板用TBS-T洗滌2次。接著,添加MKN45細胞溶解產物,且板在室溫下培育隔夜。接著,板用TBS-T洗滌3次。接著,向各孔添加100μL稀釋於阻斷緩衝液中之0.5μg/mL抗pY1349 c-Met抗體(Cell Signaling Technology,Danvers,Massachusetts,#3121),且板在室溫下培育2小時。接著,板用TBS-T洗滌3次。接著,添加100μL於阻斷緩衝液中之1/10,000稀釋之過氧化酶結合之抗兔IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA,#111-035-144),且混合物在室溫下培育1小時。接著,板用TBS-T洗滌3次。向各孔添加100μL3,3',5,5'-四甲基聯苯胺溶液(BioFX,#TMBW-1000-01),接著添加100μL終止溶液(BioFX,#LSTP-1000-01)。使用SpectraMax 250板讀取器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)用SOFTmax Pro 3.1.2軟體(Molecular Devices)在450nm讀取板。
結果展示於表23中。
資料顯示,在此等條件下,用Mab C8-H241活體內處理MKN45異種移植腫瘤24小時最大程度上使總c-Met減少約43%,且使磷酸化c-Met減少約73%。
C8-6 IgG2(SEQ ID NO:40)
C8-H241 IgG2(SEQ ID NO:41)
C8-co-16 IgG2(SEQ ID NO:42)
D11-S17Y IgG2 HC(SEQ ID NO:43)
D11-8B8 IgG2 HC(SEQ ID NO:44)
粗體、斜體胺基酸表示信號序列;粗體、加下劃線胺基酸表示Flis標籤。
粗體、斜體胺基酸表示信號序列;粗體、加下劃線胺基酸表示Flis標籤。
粗體、斜體胺基酸表示信號序列;粗體、加下劃線胺基酸表示Flis標籤。
粗體、斜體胺基酸表示信號序列。
粗體、斜體胺基酸表示信號序列;粗體、加下劃線之胺基酸表示Flis標籤。
D11-抗體輕鏈CDR2
GTSX1
LX2
S(SEQ ID NO:87),其中X1
為Y或R,且X2
為A或R;
C8-抗體輕鏈CDR1
SVSSSVX3
SIYLH(SEQ ID NO:88),其中X3
為S或R;
C8-抗體輕鏈CDR3
X4
X5
YX6
GYPLT(SEQ ID NO:89),其中X4
為I或Q,X5
為Q或V,且X6
為S或R;
D11-重鏈抗體CDR2
WIYPVTGDTYYX7
EX8
FKG(SEQ ID NO:90),其中X7
為N、I或R,且X8
為K或P;
D11-抗體重鏈CDR3
GYGAFX9
Y(SEQ ID NO:91),其中X9
為Y或F;
C8-抗體重鏈CDR2
RVNPX10
RX11
X12
TTYNQKFEG(SEQ ID NO:92),其中X10
為N或Y,X11
為G或R,且X12
為G或S;
C8-抗體重鏈CDR3
X13
NX14
LDY(SEQ ID NO:93),其中X13
為T或A,且X14
為W或I;
共同輕鏈可變區序列
其中X1
為Y或R,且X2
為A或R;
其中X3
為S或R,X4
為I或Q,X5
為Q或V,且X6
為S或R;
其中X7
為N、I或R,X8
為K或P,且X9
為Y或F;
其中X10
為Y或N,X11
為G或R,X12
為S或G,X13
為A或T,且X14
為I或W。
Claims (15)
- 一種單株抗體或其抗原結合Fab片段,其包含3個輕鏈互補決定區(LCDR)及3個重鏈互補決定區(HCDR),其中該3個LCDR及該3個HCDR為包含胺基酸序列SVSSSVSSIYLH(SEQ ID NO:53)之LCDR1、包含胺基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:54)之LCDR2、包含胺基酸序列QVYSGYPLT(SEQ ID NO:56)之LCDR3、包含胺基酸序列GYTFTDYYMH(SEQ ID NO:65)之HCDR1、包含胺基酸序列RVNPNRRGTTYNQKFEG(SEQ ID NO:68)之HCDR2及包含胺基酸序列ANWLDY(SEQ ID NO:69)之HCDR3,其中該抗體或其Fab片段結合人類c-Met之α-鏈內的抗原決定基(epitope)。
- 如請求項1之單株抗體或其抗原結合Fab片段,其中該抗體或其Fab片段在選自由以下組成之群的胺基酸序列內結合:a)121 VVDTYYDDQL130 (SEQ ID NO:77);b)131 ISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQS156 (SEQ ID NO:78);c)179 ALGAKVLSSVKDRFINF195 (SEQ ID NO:79);及d)216VRRLKETKDGFM227(SEQ ID NO:80)。
- 如請求項1或2之單株抗體或其抗原結合Fab片段,其中該抗體或其Fab片段在選自由以下組成之群的胺基酸序列內結合:a. 123 DTYYDD128 (SEQ ID NO:81); b.144 HVFPHNHTADIQS156 (SEQ ID NO:82);c.192 FINF195 (SEQ ID NO:83);及d.220 KETKDGFM227 (SEQ ID NO:84)。
- 如請求項1或2之單株抗體或其抗原結合Fab片段,其中該單株抗體或其Fab片段結合特徵在於包括123 DTYYDD128 (SEQ ID NO:81)、144 HVFPHNHTADIQS156 (SEQ ID NO:82)、192 FINF195 (SEQ ID NO:83)及220 KETKDGFM227 (SEQ ID NO:84)在內之構形抗原決定基內的一個胺基酸序列。
- 如請求項1或2之單株抗體或其抗原結合Fab片段,其包含一個輕鏈可變區(LCVR)及一個重鏈可變區(HCVR),其中該LCVR包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列且該HCVR包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列。
- 如請求項1或2之單株抗體或其抗原結合Fab片段,其中該抗體包含具SEQ ID NO:29之胺基酸序列之一個輕鏈,及具IgG4重鏈恆定區之一個重鏈。
- 如請求項1或2之單株抗體或其抗原結合Fab片段,其包含具SEQ ID NO:29之胺基酸序列之兩個輕鏈,及具IgG4重鏈恆定區之兩個重鏈。
- 如請求項1或2之單株抗體或其抗原結合Fab片段,其中該輕鏈之胺基酸序列由SEQ ID NO:35編碼,且該重鏈之胺基酸序列由SEQ ID NO:47編碼。
- 如請求項1或2之單株抗體或其抗原結合Fab片段,其中該抗體包含兩個輕鏈及兩個重鏈,且其中該等輕鏈之胺 基酸序列由SEQ ID NO:35編碼,且該等重鏈之胺基酸序列由SEQ ID NO:47編碼。
- 一種醫藥組合物,其包含如請求項1至9中任一項之單株抗體或其抗原結合Fab片段,及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
- 如請求項1或2之單株抗體或其抗原結合Fab片段,其係用於治療。
- 如請求項1或2之單株抗體或其抗原結合Fab片段,其係用於治療人類之癌症。
- 如請求項12之單株抗體或其抗原結合Fab片段,其中該癌症為胃癌、腎癌、結腸癌、結腸直腸癌、前列腺癌或肺癌。
- 一種如請求項1至9中任一項之單株抗體或其抗原結合Fab片段之用途,其係用以製備用於治療人類之癌症之藥物。
- 如請求項14之用途,其中該癌症為胃癌、腎癌、結腸癌、結腸直腸癌、前列腺癌或肺癌。
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