CN113788895B

CN113788895B - 一种兔多克隆抗体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113788895B
Application number: CN202111195161.7A
Authority: CN
Inventors: 陈洪栋; 王保丹
Original assignee: Shaanxi Jianjiyue Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shaanxi Jianjiyue Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-10-14
Filing date: 2021-10-14
Publication date: 2023-09-15
Anticipated expiration: 2041-10-14
Also published as: CN113788895A

Abstract

本发明涉及一种磷酸化兔多克隆抗体及其制备方法和应用，属于生物工程技术领域，制备方法包括：合成包含STIM1L位点的多肽，并在多肽的氨基酸上添加磷酸化基团，同时在其N末端偶联一个半胱氨酸与载体蛋白钥孔血蓝蛋白，得到包含STIM1L位点的抗原合成肽，所述STIM1L位点为STIM1L S257位点或STIM1L S512位点；将合成的抗原合成肽免疫动物并收集抗血清；使用纯化抗原对收集的抗血清进行纯化，得到磷酸化兔多克隆抗体。本发明基于STIM1L氨基酸序列预测免疫优势表位，设计目标位点S257位点和S512位点的特异性免疫原，产生针对小鼠STIM1L蛋白S257位点和STIM1L蛋白S512位点的特异性磷酸化兔多克隆抗体。

Description

一种兔多克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体是一种兔多克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

在真核细胞中钙离子是细胞内重要的第二信使，细胞质内钙浓度的改变和多种生理功能变化密切相关。STIM1(基质相互作用分子)蛋白是在钙耗竭时介导钙离子填充内质网所必须的蛋白质，其结构域包括3部分：N-端内质网膜内对钙含量敏感的EF手形结构、跨膜段和一个长的伴随并激活Orai的细胞质链。在细胞静止时STIM1成管状贯穿于内质网，在质膜中也能检测到少量的STIM1。当内质网中的钙被耗竭时，STIM1的EF手形结构丢失钙离子，引发STIM1的同聚作用并迁移至细胞周围靠近质膜位置，形成ER-PM连接。STIM1的低聚物形成簇状群集与Orai通道相互作用并激活Orai通道。较长的剪接变体STIM1L形成永久的ER膜簇，并介导肌肉中Ca²⁺快速流入。

STIM1含有685个氨基酸，分子量约77.46KD；大蛋白STIM1L含有791个氨基酸，分子量约88.66KD，主要表达于质膜、内质网。

基于免疫优势表位设计原则，设计磷酸化多肽作为特异性免疫原，由于多肽相对分子量较小，免疫原性弱。为了增强免疫原性，本研究中，用钥孔血蓝蛋白KLH和半胱氨酸偶联磷酸化多肽，纯化获得高纯度抗原合成肽作为特异性免疫原。基于兔子免疫应答规律，合理设计免疫方案。本研究中对新西兰大白兔进行5次免疫，整个周期达62天，充分诱导高亲合力，高成熟度的抗原特异性抗体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种兔多克隆抗体及其制备方法和应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种兔多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

合成包含STIM1L位点的多肽，并在多肽的氨基酸上添加磷酸化基团，同时在其N末端偶联一个半胱氨酸与载体蛋白钥孔血蓝蛋白，得到包含STIM1L位点的抗原合成肽，所述STIM1L位点为STIM1L S257位点或STIM1L S512位点，所述STIM1L S257位点氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，所述STIM1L S512位点氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示；

将合成的抗原合成肽免疫动物并收集抗血清；

使用纯化抗原对收集的抗血清进行纯化，得到兔多克隆抗体。

作为本发明的进一步技术方案，所述抗原合成肽通过以下步骤合成：

以小鼠STIM1L蛋白S257或S512位点为中心两侧各毗邻6-7个氨基酸设计氨基酸序列，并按照氨基酸序列合成多肽，将合成的多肽纯化并检测，然后在多肽的氨基酸S257或氨基酸S512上添加磷酸化基团，同时在其N末端偶联一个半胱氨酸与载体蛋白钥孔血蓝蛋白，分别得到包含STIM1L位点的抗原合成肽。

作为本发明的更进一步技术方案，所述免疫动物包括以下步骤：

用合成的抗原合成肽与佐剂联合免疫兔子，连续多次免疫，每次免疫间隔2-3周，第4次免疫后10天采集兔血清进行抗体检测；

待抗体效价大于1:100000，单独使用抗原合成肽进行第5次免疫，免疫后10天收集抗血清，对抗血清进行抗体纯化，获得针对抗原合成肽的兔多克隆抗体。

作为本发明的再进一步技术方案，所述纯化包括以下步骤：

将收集的抗血清以酶联免疫吸附实验测定抗血清针对抗原合成肽的效价及其是否能够特异性识别抗原合成肽，利用亲和分离-亲和纯化循环技术对抗血清进行纯化。

作为本发明的再进一步技术方案，所述亲和分离-亲和纯化循环技术包括以下步骤：

首次采用非磷酸化纯化抗原偶联琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和分离除去抗血清中的非磷酸化抗体，得到含磷酸化抗体流出液；然后使用磷酸化纯化抗原偶联琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和纯化，除去磷酸化抗体中低亲和力的低序列复杂性表位抗体。

作为本发明的再进一步技术方案，所述非磷酸化纯化抗原为非磷酸化S257纯化抗原或非磷酸化S512纯化抗原，所述磷酸化纯化抗原为磷酸化S257纯化抗原或磷酸化S512纯化抗原，所述磷酸化S257纯化抗原的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示，所述磷酸化S512纯化抗原的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示。

一种兔多克隆抗体，所述抗体采用如上述所述的兔多克隆抗体的制备方法制备而成。

一种兔多克隆抗体在制备抗STIM1L药物中的应用

与现有技术相比，本发明的有益效果是：基于STIM1L氨基酸序列预测免疫优势表位，设计目标位点S257位点和S512位点的特异性免疫原，分别免疫新西兰大白兔，产生针对小鼠STIM1L蛋白S257位点和STIM1L蛋白S512位点的特异性兔多克隆抗体。

附图说明

图1为新西兰大白兔血清中抗体效价检测结果图；

图2为新西兰大白兔血清中抗体效价检测结果图；

图3为十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测纯化后的抗体图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1

一种兔多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

S1、分别以小鼠STIM1L蛋白S257和S512位点为中心两侧各毗邻6-7个氨基酸设计氨基酸序列，序列如下：LHRAEQSLHDLQER和EPQLGLGSQRDLTH；委托吉尔生化（上海）有限公司按照上述序列合成两种多肽，合成的多肽经HPLC纯化和Mass Spectral检测，其纯度为80%，合成量为9mg；在两种多肽的氨基酸S257和S512上添加磷酸化基团，同时在其N末端偶联一个半胱氨酸(C)与载体蛋白钥孔血蓝蛋白(KLH)，分别得到STIM1L S257位点的抗原合成肽[序列为KLH-CLHRAEQS(p)LHDLQER]和STIM1L S512位点的抗原合成肽[序列为KLH-CEPQLGLGS(p)QRDLTH]，所述STIM1L S257位点氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，所述STIM1L S512位点氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示；小鼠STIM1L蛋白核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：5所示；

S2、用S1合成的抗原合成肽与佐剂联合免疫新西兰大白兔；免疫方式为多部位多点注射，其中颈部、背部皮肤较薄、松弛的部位及爪垫进行两侧皮下注射，臀肌与大腿部两侧分别进行肌肉注射，腰部两侧进行皮内注射；免疫剂量为400μg/只，连续5次免疫，间隔2-3周，第4次免疫后10天采集兔血清进行抗体检测；待抗体效价大于1:100000，单独使用抗原合成肽进行第5次免疫，免疫后10天收集抗血清，采用多肽亲和柱和纯化抗原对血清进行抗体纯化，获得针对抗原合成肽的兔多克隆抗体，并进行抗体效价、纯度和浓度检测；

S3、将S2收集的抗血清以酶联免疫吸附（ELISA）实验测定抗血清针对抗原合成肽的效价及其是否能够特异性识别抗原合成肽，利用亲和分离-亲和纯化循环技术对抗血清进行纯化，并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测，得到兔多克隆抗体；其中，亲和分离-亲和纯化循环技术对抗血清进行纯化的步骤包括：采用非磷酸化纯化抗原（非磷酸化S257纯化抗原或非磷酸化S512纯化抗原）偶联琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和分离除去抗血清中的非磷酸化抗体，得到含磷酸化抗体流出液；然后使用磷酸化纯化抗原（磷酸化S257纯化抗原或磷酸化S512纯化抗原）偶联琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和纯化，除去磷酸化抗体中低亲和力的低序列复杂性表位抗体；得到兔多克隆抗体。

上述制备方法可以采用以下方法实现：

一、抗血清的制备

四只新西兰大白兔，分别编号为：S257-1#、S257-2#，S512-1#、S512-2#。首次免疫前，通过兔子耳缘静脉采血3ml，离心后收集血清，作为阴性对照。

取两种抗原合成肽(第一次为1mg/ml；其余针次为2mg/ml，PBS溶解)，分别加入等体积的弗氏完全佐剂（第一次免疫）或弗氏不完全佐剂（后续免疫）进行乳化，乳化至滴入水中不散开，呈现油包水，对大白兔进行背部皮下8-10点免疫注射。免疫和采血时间程序见表1-1，全部免疫程序完成后对新西兰大白兔进行心脏采血，并收集血清。

表1-1 动物免疫及采血程序

上述免疫细节如下：

兔的多克隆抗体制备方案：每两周给新西兰大白兔注射一次抗原合成肽（合成肽-Cys-KLH）。免疫前对兔子的注射部位进行剃毛和消毒。使用无菌PBS溶解抗原，抗原合成肽浓度为2mg/ml，按照400μg/400ul/只准备，抗原合成肽与佐剂1:1配制（v:v）。初次免疫使用弗氏完全佐剂，第二次、第三次及第四次使用弗氏不完全佐剂，第五次免疫使用抗原合成肽。

试剂：佐剂，包括弗氏完全/不完全佐剂；抗原合成肽（合成肽-Cys-KLH）；戊巴比妥；磷酸盐缓冲溶液。

动物：新西兰大白兔（2.5-3.0kg；12-16周龄；雌性）。

仪器：移液枪；注射器。

兔的标准多克隆抗体制备流程：

第0天免疫前耳缘静脉采血+初始抗原注射；

第14天第一次抗原加强剂；

第24天耳缘静脉采血；

第28天第二次抗原加强剂；

第38天第三次抗原加强剂；

第48天耳缘静脉采血；

第52天第四次抗原加强剂；

第62天心脏采血。

1）取100-200μg抗原合成肽用适量磷酸盐缓冲液稀释，然后将其与弗氏完全/不完全佐剂按1:1体积比混合，制备用于免疫的抗原。

2）用400µl制备的抗原合成肽/佐剂乳剂皮下免疫兔。注射应分成八次或十次注射，每个部位注射40-50µl。

3）14天后，用200-400μg抗原合成肽/400µl（用适当的佐剂稀释）皮下注射加强免疫新西兰大白兔。

4）末次免疫后10天（24d），耳缘静脉采血，分离血清500-1000µl，用血清测定对免疫抗原的抗体反应（滴度）。

5）根据滴度确定下一步免疫计划。

6）如果响应不充分：

i.让动物休息3周；

ii.再次进行一两次免疫（相隔1-2周），在200µlPBS或盐水中加入50-100µg抗原合成肽，通过腹腔注射；

上述操作可以使用相同或者不同的佐剂，通过募集不同的免疫细胞来帮助增加对抗原的反应。

7）28天后，用200-400μg抗原合成肽/400µl（用适当的佐剂稀释）皮下注射加强免疫新西兰大白兔。

8）38天后，用200-400μg抗原合成肽/400µl（用适当的佐剂稀释）皮下注射加强免疫新西兰大白兔。

9）末次免疫后10天（48d），耳缘静脉采血，分离血清500-1000µl，用血清测定对免疫抗原的抗体反应（滴度）。

10）52天后，用400μg抗原合成肽/400μl皮下和静脉注射加强免疫新西兰大白兔。

11）10天后的最后一次免疫（62d），收集多克隆抗血清。

可以根据抗体产生的需要在额外的时间交替进行抗原注射和采血，但如果动物在第四次加强免疫后未能产生令人满意的滴度，则应认为该动物不适合该抗原并退出研究。

备注：

a、在当天最后一次注射或采血后至少观察动物15分钟。

b、动物在免疫后必须每周至少检查3次，持续4周。

c、如果发现并发症，必须每天检查动物。

d、研究人员、兽医人员和动物技术人员应监测兔子是否有疼痛或痛苦的迹象以及注射部位的肿胀、脓肿或溃疡

上述免疫抗原种类及剂量如下表1-2。

表1-2 免疫抗原种类及剂量

备注：免疫抗原Ag为抗原合成肽（合成肽-半胱氨酸-钥孔血蓝蛋白）；CF:弗氏完全佐剂；ICF弗氏不完全佐剂。

二、制备抗原亲和柱

Bromohydrin Purose® 4 Fast Flow是溴代预活化的交联琼脂糖基质，可通过氨基、巯基、羟基等基团与该活化基团进行反应，主要用于快速、简便和高效的蛋白质或多肽的偶联。

2.1理化性能

预活化介质理化性质参数见表2-1，易于蛋白、多肽偶联，满足重力预装柱纯化要求。

表2-1 Bromohydrin Purose 4 Fast Flow

2.2偶联方法

2.2.1缓冲液的准备

标准偶联缓冲液：0.2M Na₂CO₃，0.5M NaCl，偶联反应在pH=10条件下进行。用偶联缓冲液配置精确浓度的配体溶液（7mg/ml多肽溶液），介质体积和配体溶液按照1:1进行反应。配置缓冲液的水和化学试剂，在使用前用0.45微米的滤膜过滤，除去不溶解颗粒。

2.2.2配体偶联

用10倍体积纯水将介质中的乙醇洗净，然后用筛板通过注射器抽干介质；用偶联缓冲液配置一定浓度的S257-p纯化抗原溶液、S257-np纯化抗原溶液、S512-p纯化抗原溶液和S512-np纯化抗原溶液（8mg/ml）；将活化介质与上述抗原溶液混合，搅拌，25℃下反应约20h，均匀颠倒。使用Nanodrop测定抗原流出液的浓度，计算偶联效率，大于95%表明配体偶联成功。

2.2.3清洗和封闭

偶联结束后，用10倍柱体积的去离子水冲液亲和柱洗去抗原溶液。然后使用1mol/l的乙醇胺(pH=9)封闭未反应的活性基团，反应8h。反应结束后用去离子水冲洗干净。

三、抗原特异性抗体纯化

将偶联好的纯化抗原介质装填重力柱，抗体纯化方法如下：

1）预平衡：上样前先用5倍柱体积0.1mol/L，pH=9.5的十二水合磷酸氢二钠冲洗亲和柱，进行预平衡，检测穿出液pH至碱性。

2）上样：加入抗血清，每次10ml，弃去流出液。用NanoDrop™One检测样品浓度及流出液浓度，检测A280到基线水平。

3）冲洗：再加入5倍柱体积的0.1mol/L，pH=9.5的十二水合磷酸氢二钠溶液淋洗，弃去淋洗液，检测穿出液pH至碱性。

4）洗脱：以3倍柱体积的0.2mol/L，pH=4.0的柠檬酸溶液对保留的抗体进行洗脱，洗脱液立即用1mol/L，pH=8.0的Tris缓冲液中和。

5）透析：洗脱抗体溶液使用PBS缓冲液透析2小时，0.22μm滤器过滤，4℃储存备用。

6）再生：用5倍柱体积的平衡溶液淋洗，使亲和柱再生。

四、抗体效价检测

1）包板：使用磷酸化/非磷酸化多肽（257-p/S257-np纯化抗原、S512-p/S512-np纯化抗原）包被96孔酶标板（600ng/孔，碳酸盐缓冲液pH=9.6)，4℃过夜。

2）封闭：使用封闭液按照200µl/孔，封板2小时37℃，用150µl/孔的洗板液洗板三次，每次3min。

3）梯度稀释样品：在U型96孔板，提前用稀释液对纯化后的抗原特异性抗体进行10倍比梯度稀释。

4）加入一抗：按照每孔100µl加入稀释后的样品，于37℃静置1h，弃去一抗，洗板5次，每次3分钟。

5）加入二抗：分别每孔加入100µl以1：5000稀释的HRP标记的羊抗兔二抗，37℃静置30分钟，弃去二抗，洗板5次，每次3分钟。

6）显色：每孔加入新鲜配置的TMB显色液，显色10分钟。

7）终止：最后每孔分别加入50µl的2mol/L稀硫酸，终止显色反应。使用酶标仪测定450nm的光吸收值。

检测孔OD450值/阴性对照孔OD450平均值>2.1的判定为阳性。可检测到阳性信号的抗体最低稀释倍数为抗体效价。

经过两次免疫后，新西兰大白兔产生针对抗原合成肽的抗体，通过间接ELISA法检测，S257多抗血清效价在1:100000，兔子抗体反应性较好，S512多抗血清效价在1:1000，数据见表4-1及图1，从图1中可以发现：经过两次免疫后，产生针对目标抗原合成肽的抗体，通过间接ELISA法检测效价；S257多抗血清效价为1:100000，兔子抗体反应性较好；S512多抗血清效价为1:1000。针对S512改变免疫策略，补加静脉免疫抗原合成肽一次，其余针次不变，继续程序免疫，进一步诱导多肽特异性抗体，增加抗体亲和力成熟及抗体多样性，按照实验免疫方案继续进行免疫。

第五次免疫后10天，即就是第62天，采用心脏取血，收集血清，基于抗原亲和纯化，进行2轮消减纯化。使用磷酸化/非磷酸化多肽（257-p/S257-np纯化抗原、S512-p/S512-np纯化抗原）包被酶标板，按照600ng/孔包被，利用间接ELISA检测纯化后抗体反应性，数据见表4-2。抗体效价测定见图2，可以发现：纯化后抗体效价1:100000（阴性参考值为OD450=0.15），针对S512改变免疫策略，补加静脉免疫目标磷酸化多肽一次，其余针次不变，继续程序免疫，进一步诱导多肽特异性抗体，增加抗体亲和力及抗体多样性，按照实验免疫方案继续进行免疫。

经过抗原亲和纯化后的抗体，通过间接ELISA法测定抗体效价，结果表明样品经过1-10万倍稀释后，仍与对应抗原有显著的反应性，为进一步消减非特异性反应，做第三轮消减纯化，满足后续实验需求。

五、纯化抗体纯度检测

依照SDS-PAGE配制方法制成12%SDS-PAGE胶，分离胶配方如下表5-1：

待分离胶凝固后，倾去乙醇，ddH2O清洗后用滤纸吸干水分，配制5％积层胶铺于分离胶上，插入梳子；积层胶配方如下表5-2：

将制好的SSDS-PAGE胶固定在电泳槽架上，向槽内倒入新配制的电泳缓冲液，排出样品孔的气泡，等待加样。方法如下：

1）制备样品：纯化后的抗体，按照比例加入5×还原性loadingbuffer到样品中，混合均匀，煮沸5分钟，然后离心，使样品回落管底部。

2）上样：使用2-10µl移液枪，将样品加到胶的样品孔。样品分别为5μg、10μg、蛋白marker2.5µl。

3）跑胶：插上电极，接通电源，电压调为80V，开始电泳，使所有样品压至一条线。出浓缩胶后，电压调到120V，电泳时观察溴酚蓝的位置，待其溴酚蓝到达胶的底部。

4）染色：剥离玻璃板，将胶放置到玻璃培养皿，使用考马斯亮蓝染色30分钟，然后去离子水脱色2小时，清晰可见目的条带及marker，背景透明。

成像：使用GeLDoc2000成像系统，扫描胶片，获得图像及纯度信息。

结果如图3所示，可以发现：泳道1：Protein marker；泳道2：S257磷酸化抗体；泳道3：S257非磷酸化抗体；泳道4：S512磷酸化抗体；泳道5：S512非磷酸化抗体；泳道6：稀释后的S512磷酸化抗体；泳道7：Protein marker；抗体条带清楚，纯度>90%。

六、抗体浓度测定

基于蛋白质中的Tyr、Trp以及Phe在280nm有最大特征吸收的原理，采用紫外分光光度法（NanoDrop™One仪器）测定抗体浓度。

抗体浓度=抗体溶液在280nm波长处的紫外吸收值/换算系数。

不同抗体的换算系数见下表6，本研究获得纯化后的抗体为IgG，换算系数为1.43，即A280为1.43时，IgG抗体浓度为1mg/ml。本研究测得最终产品浓度为0.5-1mg/ml。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

序列表

<110> 陈洪栋

<120> 一种磷酸化兔多克隆抗体及其制备方法和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Leu His Arg Ala Glu Gln Ser Leu His Asp Leu Gln Glu Arg

1 5 10

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Pro Gln Leu Gly Leu Gly Ser Gln Arg Asp Leu Thr His

1 5 10

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Cys Leu His Arg Ala Glu Gln Ser Leu His Asp Leu Gln Glu Arg

1 5 10 15

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Cys Glu Pro Gln Leu Gly Leu Gly Ser Gln Arg Asp Leu Thr His

1 5 10 15

<210> 5

<211> 4165

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctgtcccgg gcctggcccg tgcgcgtccg cctgctgcac cggggcacca ggagccgcag 60

aggtaccgga cccggcgggg gcgctgacct cggcctagga gtcttaggat cccggagaca 120

tccgtgtctg ctggggcctg taggtcgcac gccgaagccc tagctgctga ggctcaccgc 180

tgtttctcgg ggcgaggtca ggtgcccccc ttctctcctc tcttctctcc ctcccccacc 240

tcagtgcggg cgggagattc tgcccgcctc ctcccgcagg ggtgcagcag gctgcggagc 300

tgacagcggc cccgcagcca ccctgctcaa actctccgga agcagataga gctcaggccg 360

ccgccgcagc cccggcggac ctacagttgg accggagact ccgatccttc tgcgtccaaa 420

cttggggcac ttgaccttcg cttatcggag gaggtaagcc cgcaggtggc tggacagctg 480

cggcgccgcg agggcatctt gctttggaac cgtcggctgc actccctgac tctgggattt 540

gcttctggga tccaaaggtg tctacagcag gcgcatgttg actgagacct accgtcatgg 600

atgtgtgcgc ccgtcttgcc ctgtggcttc tttgggggct ccttctgcat cagggccaga 660

gtctcagcca tagtcacagt gaaaagaata caggagctag ctccggggcg acttctgaag 720

agtctaccga agcagagttt tgccgaattg acaagcccct gtgccacagt gaggatgaga 780

agctcagctt tgaggccgtc cgaaacatcc ataagctgat ggatgacgat gccaatggtg 840

atgtggatgt ggaagaaagt gatgagttcc taagggaaga cctcaattac catgacccaa 900

cagtgaaaca tagcaccttc catggtgagg ataagcttat cagcgtggag gacctgtgga 960

aggcgtggaa gtcatcagaa gtgtacaact ggactgtgga tgaggtgata cagtggctca 1020

ttacgtatgt ggagctgcca cagtatgagg aaaccttccg gaagttgcag cttactggcc 1080

acgccatgcc aaggctagca gtaaccaaca ccaccatgac agggactgta ctgaagatga 1140

cagatcggag ccacaggcag aagctgcagc tgaaggccct ggacacagtg ctgtttgggc 1200

ctcctctctt gactcggcat aatcacctga aggacttcat gctggtggtg tctatcgtta 1260

ttggtgtggg tggctgctgg tttgcctata tccagaaccg ttactctaag gagcacatga 1320

agaaaatgat gaaggatctg gaagggttac accgggctga gcagagtctg catgaccttc 1380

aggaaaggct gcacaaggcc caggaggagc accgaactgt ggaagtagag aaggtccacc 1440

tggagaagaa gctgcgagat gagatcaacc ttgccaagca ggaagctcag cggctgaagg 1500

agctgaggga gggtactgag aatgagagga gccgtcaaaa atatgctgag gaagagctgg 1560

agcaggttcg ggaggccttg aggaaagcag agaaggagct ggaatcacac agctcatggt 1620

atgctcctga ggccctgcag aagtggctgc agctgaccca tgaggtggag gtgcagtact 1680

acaacatcaa gaagcaaaat gcagagaggc agctgctggt ggccaaggag ggggctgaga 1740

aaataaaaaa gaagagaaac acgctttttg gtaccttcca tgtggcccac agctcttccc 1800

tggatgatgt ggatcataaa atcctaactg ctaagcaagc tctgagtgag gtgacagcgg 1860

cactgaggga gcgcctgcac cggtggcagc agatcgagat cctctgcggt ttccagattg 1920

tcaataaccc cggcatccac tccttggtgg ctgctctcaa catcgacccc agctggatgg 1980

gcagcacccg ccctaacccc gcccacttca tcatgactga cgatgtggat gacatggatg 2040

aggagattgt gtcgcccttg tccatgcagt atgctgcctg gctgatgggg cgtaggttca 2100

gtgaccgctc tctctgctct gcatccgccg gctcggatga tcagtccctc tggaaatacc 2160

cggcccccag cctgcagagc agtgtccggc agcgcctgac ggagccacag cttggcctgg 2220

gatctcagag ggatttgacc cattccgatt cggagtcctc cctccacatg agtgaccgcc 2280

agcgtgtggc ccccaagcct cctcagatgg gccgtgctgc agatgaagct ctcaatgcca 2340

tgccttccaa tggcagccat cggctgattg agggggtcca tccaggatct ctggtggaga 2400

aactgcctga cagccctgct ctggccaaga agacatttat ggcgttgaac catggcctag 2460

acaaggccca cagcctgatg gagctgaacc cctcagtccc acctggtggc tccccacttt 2520

tggattcttc ccattctctt agccccagtt ccccagaccc agacacgcca tctccagttg 2580

gggacaaccg agctctgcag ggtagccgaa acacacgaat tccccacttg gctggcaaga 2640

aggcaatggc tgaggaggat aatggttcca ttggtgagga gacagactcc agtccaggca 2700

ggaagaagtt tcctctcaaa atttttaaga agcctcttaa gaagtaggca gactagggtg 2760

gtagtgttga gacagcctgt ccttccctgg gtcttctgcc ttcacctccc ttcctttctt 2820

tgcaatatct ggctcctaga gtggggcaca gaggggctgg cccaagggcc tgggcactgt 2880

acatatctgc cctgctcatc cttggtcctt catcattatt tattaactga ccaccatggc 2940

ctgcctgtcg ggaaaccctt ccacccatgg gctgctgctg tcacatcttc tccacttcag 3000

tgcatgtctt agttgctctt ccctcagttc ccactccact tttggggtcc agcttctgtc 3060

tctgctgtcc cagttttgag gtttggtttt tgtttctgtc tcctgctttc aggctcctct 3120

ctcccattac tccccaacga tcctagcagt tgtggggaag ataggaggag taacttctga 3180

cacctgtacc tcagatctgt tcatcctact cacagccatt ctgcctaccc cagactgggc 3240

cacggtcctg atctctgggg tttgttctat ggaagtgtgg tagactggag ggaacctcat 3300

cctggagctc ctttggatct ccagggctcc attcagggag tggaaccaac tcccagggaa 3360

caagtcacca gagttttaaa gagagaccag gcttgtgatt gatgggagag acttctccca 3420

gttggaggat gagtagatgc caaagctgtg ggctgtaagg cagttgccat ttctctcttg 3480

ccctgcccac acctgccttc ctcttacctc tgctccccta tattgcagga gtgtatctct 3540

taagaggtgc tgccctgaag ctccccatca gcatcagcac tactggggct cagggcaact 3600

ggctcccctg gctatgggag ccacagtcat gacacagggc tcttgtggag ccctgggcaa 3660

ggatgttata tttgaaccaa aagacaaaca gttttaaaat aaaaaaataa aaaataaaat 3720

aaataaatct cctgaatttc ccaagtgcct gcacagcatc ctccctttgt cagattccat 3780

ttttgtgtta ctgcatagcc tgggccacag gcttaaaaca gacacaattg gtttggggca 3840

ggggtggaga aggaagatgg tatatgtatg tgaaggctgc tgtgtgacca cttctccccc 3900

cacacctccc atcttccaga caactctctc ctttacctgt ttttgctatg gctgtaaagg 3960

tatttttccc tctgccccat tctgtcatgc ctgtaccctg agttcctaat ttgggcctgg 4020

gttgggtgca gctggggctg gtcttaggcg ggtgctaggc tgtagactgc cttgatgccc 4080

cctggacacc ctcacatggg tttttctgtg ttattttcat aagattcttt gaagtccaat 4140

aaagcatgta ggagatttta acctc 4165

Claims

1.一种兔多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

合成包含STIM1L位点的多肽，并在多肽的氨基酸上添加磷酸化基团，同时在其N末端偶联一个半胱氨酸与载体蛋白钥孔血蓝蛋白，得到包含STIM1L位点的抗原合成肽，所述STIM1L位点为STIM1L S257位点或STIM1L S512位点，所述包括STIM1L S257位点的多肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，所述包括STIM1L S512位点的多肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示；

将合成的抗原合成肽免疫兔并收集抗血清；

使用纯化抗原对收集的抗血清进行纯化，得到兔多克隆抗体；

所述抗原合成肽通过以下步骤合成：

2.根据权利要求1所述的兔多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述免疫兔包括以下步骤：

3.根据权利要求1所述的兔多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述纯化包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的兔多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述亲和分离-亲和纯化循环技术包括以下步骤：

采用非磷酸化纯化抗原偶联琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和分离除去抗血清中的非磷酸化抗体，得到含磷酸化抗体流出液；然后使用磷酸化纯化抗原偶联琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和纯化，除去磷酸化抗体中低亲和力的低序列复杂性表位抗体。

5.根据权利要求4所述的兔多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述非磷酸化纯化抗原为非磷酸化S257纯化抗原或非磷酸化S512纯化抗原，所述磷酸化纯化抗原为磷酸化S257纯化抗原或磷酸化S512纯化抗原，所述磷酸化S257纯化抗原的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO：3所示，所述磷酸化S512纯化抗原的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示。

6.一种兔多克隆抗体，其特征在于，所述抗体采用如权利要求1-5任一所述的兔多克隆抗体的制备方法制备而成。