CN110305204B

CN110305204B - 一种抗人dctn1多克隆抗体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110305204B
Application number: CN201910566600.7A
Authority: CN
Inventors: 田沃土; 曹立
Original assignee: Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Current assignee: Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Priority date: 2019-06-27
Filing date: 2019-06-27
Publication date: 2020-11-20
Anticipated expiration: 2039-06-27
Also published as: CN110305204A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体是一种抗人DCTN1蛋白的多克隆抗体及其制备方法和应用。本发明设计并制备了兔抗人DCTN1‑N末端多克隆抗体，具有高度特异性和敏感性，解决了目前商品化的DCTN1抗体缺乏有效的仅识别和结合N末端的问题，为进一步研究DCTN1在dHMN7B、Perry Syndrome和ALS发病中的作用提供了工具，具有重要应用前景。

Description

一种抗人DCTN1多克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种抗人DCTN1蛋白的多克隆抗体、及其制备方法和应用。

背景技术

人DCTN1位于2p13.1，有32个外显子，编码含1278个氨基酸的动力蛋白亚基1亚型1(dynactin subunit 1isoform 1，DCTN1)。DCTN1蛋白，又称p150(Glued)，是动力蛋白复合物(dynactin complex)构成中分子量最大的多肽，属于CD225家族，其靠近C端有2个跨膜结构域。DCTN1基因突变相关的临床表型具有很大的异质性，可以仅累及下运动神经元，表现为遗传性远端运动神经病7B型(distal hereditary motor neuropathy type VIIB，dHMN7B)；也可以同时累及上下运动神经元，表现为肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophiclateral sclerosis，ALS)；亦可以仅累及上运动神经元，表现为以帕金森样症状为主的Perry综合征(Perry Syndrome)。

目前，几种商品化的DCTN1抗体多为识别和结合蛋白中间区域或C末端，对于N末端截短突变体无法识别与结合，从而对人DCTN1基因谱-表型谱研究和功能研究受到限制。因此，制备特异性识别N末端较好的兔抗人DCTN1多克隆抗体，并应用于表达谱分析及在DCTN1相关谱系病中的作用具有实际作用。

但是关于兔抗人DCTN1蛋白的多克隆抗体、及其制备方法和应用目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离的DCTN1蛋白N末端多肽及其制备方法和应用。

本发明的另一目的在于提供一种特异性识别和/或结合N末端的抗人DCTN1蛋白的多克隆抗体及其制备方法和应用。

本发明的第一方面，提供一种分离的DCTN1蛋白N末端多肽，其氨基酸序列如SEQID NO:2所示。

其中，所述的多肽片段是长度为97个氨基酸、高亲水性、高抗原性、非信号肽、非跨膜区并且位于无序区域的肽。

本发明的第二方面，提供一种分离的多核苷酸，其编码如上所述的多肽。

进一步的，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明的第三方面，提供一种重组载体，其含有如上所述的多核苷酸。

本发明的第四方面，提供一种宿主细胞，其含有如上所述的重组载体，或其基因组中整合有如上所述的多核苷酸。

本发明还提供一种如上所述的多肽的制备方法，包括以下步骤：(a)培养一种如上所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出所述的多肽。

本发明的第六方面，提供一种如上所述的分离的DCTN1蛋白N末端多肽在制备特异性抗人DCTN1的抗体中的应用。

本发明还提供一种用于免疫的组合物，所述的组合物含有如上所述的分离的DCTN1蛋白N末端多肽。

本发明的第七方面，提供一种抗人DCTN1多克隆抗体，其特异性识别和/或结合如上所述的分离的DCTN1蛋白N末端多肽。

本发明的第八方面，提供一种如上所述的抗人DCTN1多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：以如上所述的分离的DCTN1蛋白N末端多肽免疫动物，从免疫后的动物体内分离出特异性抗人DCTN1多克隆抗体。

进一步的，所述的制备方法包括以下步骤：

(1)从DCTN1蛋白序列中选择N末端起始处15-111氨基酸肽片段作为抗原表位，所述的抗原表位的序列如SEQ ID NO:2所示；

(2)合成抗原表位对应的目的cDNA序列，诱导表达多肽免疫原；

(3)佐剂联合所述的多肽免疫原多点免疫兔。

进一步的，所述的抗原表位对应的目的cDNA可以通过本领域常规基因工程技术手段获得，或者采用全基因组化学合成的方法获得。

进一步的，所述的多肽免疫原的表达是通过将多肽免疫原的cDNA重组到PET28a表达质粒，转化Rosetta感受态细胞，诱导表达获得。

进一步的，免疫过程中所使用的佐剂选自：弗氏完全佐剂、铝、CpG、或其任意组合。

进一步的，所述的多点免疫在选自以下位点中4-6个位点进行：双肩周围皮肤下、背部脊柱两侧皮肤下进行皮下注射和后大腿肌肉进行肌肉注射。

进一步的，本发明是从DCTN1蛋白序列的N末端起始处15-111氨基酸肽段作为抗原表位，并进一步合成抗原表位对应的目的cDNA序列；任选组合佐剂联合所述免疫原多点免疫兔，并进一步获得多克隆抗体。

本发明的第九方面，提供一种如上所述的抗人DCTN1多克隆抗体的应用，用于制备特异性识别和/或结合DCTN1蛋白的试剂或试剂盒。

本发明还提供一种如上所述的抗人DCTN1多克隆抗体在表达谱分析及在DCTN1相关谱系病中的应用。

本发明还提供一种如上所述的抗人DCTN1多克隆抗体在DCTN1蛋白的功能研究及其在dHMN7B，ALS和Perry Syndrome发病过程中的具体作用研究中的应用。

本发明的第十方面，提供一种特异性识别和/或结合DCTN1蛋白的试剂盒，其含有如上所述的抗人DCTN1多克隆抗体。

本发明从DCTN1蛋白序列中设计串联的多肽抗原表位，进行抗原合成，进而制备筛选出DCTN1多克隆抗体，并进行应用。

本发明抗原表位设计采用Abmart公司的Antigen Auto Designer抗原设计程序。通过计算如下参数来确定表面肽：溶剂可接近性、无序指数、蛋白-蛋白相互作用的结构域预测、或以上任意组合。选择位于蛋白N末端，长度为97个氨基酸、高亲水性、高抗原性、非信号肽、非跨膜区以及位于无序区域的肽作为抗原表位。通过全基因组化学合成的方法合成抗原表位对应的目的cDNA序列，重组到表达载体，诱导表达免疫原，纯化后多点免疫兔。经过了3年多时间、数以千次的试验，最终得到本发明的抗体。

本发明的兔抗人DCTN1多克隆抗体的制备方法具体如下：

1.人DCTN1免疫抗原设计

人DCTN1蛋白全长氨基酸序列：如SEQ ID NO:1所示。

采用Abmart公司的Antigen Auto Designer抗原设计软件从目标蛋白DCTN1的aa序列中挑选位于N末端的1条长度为97aa的肽段。

最终确定DCTN1蛋白多肽序列：如SEQ ID NO:2所示。

将设计好的序列用DNA Works软件进行密码子优化，生成核苷酸序列，如SEQ IDNO:3所示。

由金开瑞(中国武汉)生物科技公司采用全基因组化学合成的方法合成上述抗原DNA序列。

2.抗原表达与纯化

全基因合成的抗原序列利用BamHI/EcoRI酶切后，再与BamHI/EcoRI酶切并回收好的PET28a载体通过T4连接酶在室温进行2h连接。连接产物与CaCl₂法制备的Rosetta感受态细胞(Novagen，Merck，Germany)在冰上(4℃)孵育0.5h，再于42℃热激活90s，热激后的菌液补加500ul无抗性LB液体培养基后在37℃摇床上250rpm慢摇45min，最后涂板于含相应抗生素的LB平板上。在37℃培养箱将细菌平板培养过夜(16h)。

次日，挑转化菌落于自身诱导系统培养基中，37℃，250rpm表达过夜。次日将菌液离心(6000g，5min)，上清弃去，沉淀用裂解液(50mM Tris、500mM NaCl、4M urea、1mM PMSF，pH7.4)重悬并于室温裂解过夜。

预先用25ml(5倍柱体积)裂解液平衡Ni²⁺–NTA柱，静置待用。细胞裂解液离心(15,000g,10min)后将上清上柱，室温孵育1h。孵育后，待裂解液从柱上自然流净，用30ml洗涤液(4M urea，50mM Tris，500mM NaCl，30mM imidazole，pH 7.4)洗涤，最后用5ml洗脱液(4Murea，50mM Tris，500mM NaCl，500mM imidazole，pH 7.4)洗脱收集蛋白。洗脱的蛋白透析到缓冲液(pH5.8的磷酸盐缓冲液)中，中途换液2次，共透析24小时。共得到1.2mg透析后蛋白，浓度为0.3mg/ml，纯度>95％。

3.动物免疫

将成功获得的抗原与不同佐剂混合后皮下多点注射体重为2-3kg雌性日本大耳白兔2只。第1天、第19天、40天和54天分别加强免疫一次，第66天兔耳动脉取血，ELISA方法检测血清滴度，兔血清效价均大于1：32000。

Elisa Titer：将抗体进行一定的梯度稀释，大于NC(NC：免疫抗原包板，检测抗体为牛奶+细胞培养基)两倍且大于0.25的OD450值对应的稀释度值即为该抗体的效价。

4.血清、抗体纯化

以离心管收集兔颈动脉血，放置于37℃烘箱2小时，之后转移到4℃沉淀过夜，第二天早上离心，离心速度10000RCF，离心时间10分钟。在血清中加入NaN3至终浓度为0.02％。采用Western blot和免疫荧光进行特异性验证，最终针对N末端抗原表位15-111aa(SEQ IDNO:2)制备的多克隆抗体血清经检测具有较好的特异性和敏感性；采用Protein G柱纯化血清，得到纯化抗体，检测浓度并分装，保存于-80℃。

5.兔抗人DCTN1多克隆抗体的应用

(1).免疫印记：用构建的pCDNA3.1-DCTN1(15-111aa)表达质粒转染HEK-293T细胞，将收集的细胞裂解液按20μg上样电泳，转膜，5％脱脂奶粉做为封闭液，室温封闭蛋白电转膜60min，同样的方法电泳、转膜3次，然后将封闭的电转膜分别孵育His标签抗体(1:5000)和本发明兔抗人DCTN1多克隆抗体(1:1000)，室温摇育2小时，或4℃摇育过夜，1×TBST缓冲液摇洗3次，每次5分种；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG做为二抗，1：5000稀释，室温摇育60分钟，1×TBST缓冲液摇洗3次，每次5-15分种，ECL显色，曝光仪曝光成像。结果显示，本发明的DCTN1检测结果同His标签抗体检测结果一致，在空转的细胞中未检测到条带，在转染的His-DCTN1(15-111aa)过表达质粒的细胞中检测到单一条带，表明本发明抗体特异性好。两种抗体检测结果均在约30KD处出现特异条带，而根据DCTN1的氨基酸序列预测His-DCTN1(15-111aa)融合蛋白分子量约30KD。

(2).细胞免疫荧光染色：将转染的pCDNA3.1-DCTN1(15-111aa)或pCDNA3.1-DCTN1(全长)的HEK-293T细胞滴片于多聚赖氨酸处理过的盖玻片上，4％多聚甲醛固定细胞，10％驴血清室温封闭细胞60min；分别用GFP标签抗体(1:500)和本发明的兔抗人DCTN1抗体(1:200)稀释，室温反应2小时，1×PBS摇洗3次，每次5-10分钟；带绿色荧光的驴抗鸡或驴抗兔IgG作为二抗，1：1000稀释，室温反应30-60分钟，二抗封闭结束前5分钟，DAPI染核，1×PBS摇洗3次，每次5-10分钟；封片镜下观察。

结果显示，本发明的兔抗人DCTN1抗体同GFP抗体检测一致，在空转的细胞中均未检测到表达，而在转染His-DCTN1质粒的HEK-293T细胞中两种抗体检测结果均表明pCDNA3.1-DCTN1(15-111aa)-GFP融合蛋白表达在细胞核中，而pCDNA3.1-DCTN1(15-111aa)-GFP融合蛋白表达在细胞浆中，也表明本发明抗体具有较好的特异性。

本发明公开了一种兔抗人DCTN1多克隆抗体及其制备与应用。DCTN1是重要的细胞骨架相关蛋白，尤其在神经元轴突的逆向运输中发挥总要作用。该基因突变所致的表型谱十分广泛，可仅累及下运动神经元，表现为遗传性远端运动神经病7B型(distalhereditary motor neuropathy type VIIB,dHMN7B)；也可以同时累及上下运动神经元，表现为肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)；亦可仅累及上运动神经元表现为帕金森样症状为主的Perry综合征(Perry Syndrome)。目前国内外尚无特异性较好的兔来源的DCTN1抗体。本发明所制备的抗体具有高度特异性和敏感性，为进一步明确DCTN1在人不同组织中的表达分布提供了基础，并有助于研究DCTN1在dHMN7B,ALS和PerrySyndrome发病中的作用，具有重要应用前景。

本发明的有益效果在于：

本发明设计并制备了兔抗人DCTN1-N末端多克隆抗体，具有高度特异性和敏感性，解决了目前商品化的DCTN1抗体缺乏有效的仅识别和结合N末端的问题，为进一步研究DCTN1在dHMN7B、Perry Syndrome和ALS发病中的作用提供了工具，具有重要应用前景。

附图说明

图1.真核表达质粒图谱pET-28a(+)-DCTN1(15-111aa)-sumo。这张图综合显示了真核表达质粒中各区域序列信息。

图2.本发明抗体用于免疫印迹的结果照片。

A.His标签抗体检测结果：1，空转染的细胞裂解液加0.4mg/ml BSA作为对照；2，蛋白Marker；3，转染pCDNA3.1-His-DCTN1(15-111aa)表达质粒的细胞裂解液。

B.本发明的兔抗人DCTN1多克隆抗体检测结果：1，蛋白Marker；2，空转染的细胞裂解液加0.4mg/ml BSA作为对照；3，转染pCDNA3.1-His-DCTN1(15-111aa)表达质粒的细胞裂解液。

C.本发明的兔抗人DCTN1多克隆抗体检测结果：1，空转染的细胞裂解液作为对照；2，转染pCDNA3.1-His-DCTN1(全长)表达质粒的细胞裂解液；3，转染pCDNA3.1-His-DCTN1(15-111aa)表达质粒的细胞裂解液。

图3.本发明抗体用于细胞免疫荧光的结果照片。用pCDNA3.1-DCTN1(15-111aa)-GFP或pCDNA3.1-DCTN1(全长)-GFP转染HEK-293T细胞，分别用本发明的兔抗人DCTN1蛋白N末端多克隆抗体进行免疫荧光检测。Upper line：DCTN1(全长)WT转染的HEK-293T细胞；2，转染DCTN1(15-111aa)转染的HEK-293T细胞。

DAPI，标记细胞核；DCTN1，标记动力蛋白亚基1亚型1；α-micro-Tub，标记细胞骨架；Merge，融合图像。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1：人DCTN1蛋白N末端区域免疫抗原序列

为能特异性识别N末端DCTN1蛋白序列，本发明抗原表位设计采用Abmart公司的Antigen Auto Designer抗原设计程序。通过计算如下参数来确定表面肽：溶剂可接近性、无序指数、蛋白-蛋白相互作用的结构域预测、或以上任意组合。选择了1条长度为97个氨基酸、高亲水性、高抗原性、非信号肽、非跨膜区以及位于无序区域的肽作为抗原表位(附图1)。

最终确定DCTN1蛋白N末端多肽序列如SEQ ID NO:2所示。

上述抗原DNA序列由金开瑞(中国武汉)公司采用全基因组化学合成的方法合成。

实施例2：抗原表达与纯化

预先用25ml(5倍柱体积)裂解液平衡Ni²⁺–NTA柱，静置待用。细胞裂解液离心(15,000g，10min)后将上清上柱，室温孵育1h。孵育后，待裂解液从柱上自然流净，用30ml洗涤液(4M urea，50mM Tris，500mM NaCl，30mM imidazole，pH 7.4)洗涤，最后用5ml洗脱液(4Murea，50mM Tris，500mM NaCl，500mM imidazole，pH 7.4)洗脱收集蛋白。洗脱的蛋白透析到缓冲液(pH5.8的磷酸盐缓冲液)中，中途换液2次，共透析24小时。共得到1.2mg透析后蛋白，浓度为0.3mg/ml，纯度>95％。

实施例3：多克隆抗体制备

A、动物免疫

寡聚核苷酸佐剂：50ul铝佐剂(Thermo Fisher，USA)+1μg DNA佐剂，序列为tccatgacgttcctgacgtT(SEQ ID NO:4)，小写的碱基为需要硫代修饰的位点，委托金开瑞(中国武汉)公司合成。

免疫方法：2只日本白兔，体重2-3kg。首次免疫剂量为400μg抗原与氟氏完全佐剂(Sigma)乳化完全，免疫位点为一下位点中的4-6个：双肩周围皮肤下、背部脊柱两侧皮肤下进行皮下注射和后大腿肌肉进行肌肉注射。加强免疫剂量为首次剂量的1/4。

第19天取100μg抗原与氟氏完全佐剂(Sigma)乳化完全，免疫兔前肢腋下以及腹股沟，每点50-100μL。20μg抗原与寡聚核苷酸佐剂混合，免疫兔尾根以及后腿肌肉，每点50-100μL。

第40天，100μg抗原与寡聚核苷酸佐剂完全混合，免疫兔后腿肌肉。

第54天，100μg抗原与寡聚核苷酸佐剂完全混合，免疫兔后腿肌肉。

第66天兔耳动脉取血，ELISA方法检测血清滴度，兔血清效价均大于1：32000。之后以颈动脉取血收集血清，并进行抗体纯化。

B、血清制备、抗体纯化

实施例4：兔抗人DCTN1蛋白N端多克隆抗体的应用

(1)免疫印记：用构建的pCDNA3.1-His-DCTN1(15-111aa)和pCDNA3.1-His-DCTN1(全长)表达质粒分别转染HEK-293T细胞，将收集的细胞裂解液按20μg上样电泳，转膜，5％脱脂奶粉做为封闭液，室温封闭蛋白电转膜60min；兔抗人DCTN1蛋白N端多克隆抗体做为一抗，1:1000稀释，应用His标签抗体作为对照(1:5000)，室温摇育2小时，或4℃摇育过夜，1×TBST缓冲液摇洗3次，每次5分种；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG做为二抗，1：5000稀释，室温摇育60分钟，1×TBST缓冲液摇洗3次，每次5-15分种，ECL显色，曝光仪曝光成像(图2)。

结果显示，本发明的DCTN1检测结果同His标签抗体检测结果一致，在空转的细胞中未检测到条带，在转染的His-DCTN1(15-111aa)过表达质粒的细胞中检测到单一条带，表明本发明抗体特异性好。两种抗体检测结果均在约30KD处出现特异条带，而根据DCTN1的氨基酸序列预测His-DCTN1(15-111aa)融合蛋白分子量约30KD。

(2)细胞免疫荧光染色：将转染的pCDNA3.1-His-DCTN1(15-111aa)和pCDNA3.1-His-DCTN1(全长)的HEK-293T细胞滴片于多聚赖氨酸处理过的盖玻片上，4％多聚甲醛固定细胞，10％驴血清室温封闭细胞60min；兔抗人DCTN1(N端)抗体1：200稀释，室温反应2小时，1×PBS摇洗3次，每次5-10分钟；带绿色荧光的驴抗兔IgG，带红色荧光的驴抗小鼠IgG作为二抗，均以1：1000稀释，室温反应30-60分钟，二抗封闭结束前5分钟，DAPI染核，1XPBS摇洗3次，每次5-10分钟；封片镜下观察(图3)。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海交通大学医学院附属瑞金医院

<120> 一种抗人DCTN1多克隆抗体及其制备方法和应用

<130> /

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1278

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Ala Gln Ser Lys Arg His Val Tyr Ser Arg Thr Pro Ser Gly Ser

1 5 10 15

Arg Met Ser Ala Glu Ala Ser Ala Arg Pro Leu Arg Val Gly Ser Arg

20 25 30

Val Glu Val Ile Gly Lys Gly His Arg Gly Thr Val Ala Tyr Val Gly

35 40 45

Ala Thr Leu Phe Ala Thr Gly Lys Trp Val Gly Val Ile Leu Asp Glu

50 55 60

Ala Lys Gly Lys Asn Asp Gly Thr Val Gln Gly Arg Lys Tyr Phe Thr

65 70 75 80

Cys Asp Glu Gly His Gly Ile Phe Val Arg Gln Ser Gln Ile Gln Val

85 90 95

Phe Glu Asp Gly Ala Asp Thr Thr Ser Pro Glu Thr Pro Asp Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Lys Val Leu Lys Arg Glu Gly Thr Asp Thr Thr Ala Lys Thr

115 120 125

Ser Lys Leu Arg Gly Leu Lys Pro Lys Lys Ala Pro Thr Ala Arg Lys

130 135 140

Thr Thr Thr Arg Arg Pro Lys Pro Thr Arg Pro Ala Ser Thr Gly Val

145 150 155 160

Ala Gly Ala Ser Ser Ser Leu Gly Pro Ser Gly Ser Ala Ser Ala Gly

165 170 175

Glu Leu Ser Ser Ser Glu Pro Ser Thr Pro Ala Gln Thr Pro Leu Ala

180 185 190

Ala Pro Ile Ile Pro Thr Pro Val Leu Thr Ser Pro Gly Ala Val Pro

195 200 205

Pro Leu Pro Ser Pro Ser Lys Glu Glu Glu Gly Leu Arg Ala Gln Val

210 215 220

Arg Asp Leu Glu Glu Lys Leu Glu Thr Leu Arg Leu Lys Arg Ala Glu

225 230 235 240

Asp Lys Ala Lys Leu Lys Glu Leu Glu Lys His Lys Ile Gln Leu Glu

245 250 255

Gln Val Gln Glu Trp Lys Ser Lys Met Gln Glu Gln Gln Ala Asp Leu

260 265 270

Gln Arg Arg Leu Lys Glu Ala Arg Lys Glu Ala Lys Glu Ala Leu Glu

275 280 285

Ala Lys Glu Arg Tyr Met Glu Glu Met Ala Asp Thr Ala Asp Ala Ile

290 295 300

Glu Met Ala Thr Leu Asp Lys Glu Met Ala Glu Glu Arg Ala Glu Ser

305 310 315 320

Leu Gln Gln Glu Val Glu Ala Leu Lys Glu Arg Val Asp Glu Leu Thr

325 330 335

Thr Asp Leu Glu Ile Leu Lys Ala Glu Ile Glu Glu Lys Gly Ser Asp

340 345 350

Gly Ala Ala Ser Ser Tyr Gln Leu Lys Gln Leu Glu Glu Gln Asn Ala

355 360 365

Arg Leu Lys Asp Ala Leu Val Arg Met Arg Asp Leu Ser Ser Ser Glu

370 375 380

Lys Gln Glu His Val Lys Leu Gln Lys Leu Met Glu Lys Lys Asn Gln

385 390 395 400

Glu Leu Glu Val Val Arg Gln Gln Arg Glu Arg Leu Gln Glu Glu Leu

405 410 415

Ser Gln Ala Glu Ser Thr Ile Asp Glu Leu Lys Glu Gln Val Asp Ala

420 425 430

Ala Leu Gly Ala Glu Glu Met Val Glu Met Leu Thr Asp Arg Asn Leu

435 440 445

Asn Leu Glu Glu Lys Val Arg Glu Leu Arg Glu Thr Val Gly Asp Leu

450 455 460

Glu Ala Met Asn Glu Met Asn Asp Glu Leu Gln Glu Asn Ala Arg Glu

465 470 475 480

Thr Glu Leu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Asp Met Ala Gly Ala Arg Val

485 490 495

Arg Glu Ala Gln Lys Arg Val Glu Ala Ala Gln Glu Thr Val Ala Asp

500 505 510

Tyr Gln Gln Thr Ile Lys Lys Tyr Arg Gln Leu Thr Ala His Leu Gln

515 520 525

Asp Val Asn Arg Glu Leu Thr Asn Gln Gln Glu Ala Ser Val Glu Arg

530 535 540

Gln Gln Gln Pro Pro Pro Glu Thr Phe Asp Phe Lys Ile Lys Phe Ala

545 550 555 560

Glu Thr Lys Ala His Ala Lys Ala Ile Glu Met Glu Leu Arg Gln Met

565 570 575

Glu Val Ala Gln Ala Asn Arg His Met Ser Leu Leu Thr Ala Phe Met

580 585 590

Pro Asp Ser Phe Leu Arg Pro Gly Gly Asp His Asp Cys Val Leu Val

595 600 605

Leu Leu Leu Met Pro Arg Leu Ile Cys Lys Ala Glu Leu Ile Arg Lys

610 615 620

Gln Ala Gln Glu Lys Phe Glu Leu Ser Glu Asn Cys Ser Glu Arg Pro

625 630 635 640

Gly Leu Arg Gly Ala Ala Gly Glu Gln Leu Ser Phe Ala Ala Gly Leu

645 650 655

Val Tyr Ser Leu Ser Leu Leu Gln Ala Thr Leu His Arg Tyr Glu His

660 665 670

Ala Leu Ser Gln Cys Ser Val Asp Val Tyr Lys Lys Val Gly Ser Leu

675 680 685

Tyr Pro Glu Met Ser Ala His Glu Arg Ser Leu Asp Phe Leu Ile Glu

690 695 700

Leu Leu His Lys Asp Gln Leu Asp Glu Thr Val Asn Val Glu Pro Leu

705 710 715 720

Thr Lys Ala Ile Lys Tyr Tyr Gln His Leu Tyr Ser Ile His Leu Ala

725 730 735

Glu Gln Pro Glu Asp Cys Thr Met Gln Leu Ala Asp His Ile Lys Phe

740 745 750

Thr Gln Ser Ala Leu Asp Cys Met Ser Val Glu Val Gly Arg Leu Arg

755 760 765

Ala Phe Leu Gln Gly Gly Gln Glu Ala Thr Asp Ile Ala Leu Leu Leu

770 775 780

Arg Asp Leu Glu Thr Ser Cys Ser Asp Ile Arg Gln Phe Cys Lys Lys

785 790 795 800

Ile Arg Arg Arg Met Pro Gly Thr Asp Ala Pro Gly Ile Pro Ala Ala

805 810 815

Leu Ala Phe Gly Pro Gln Val Ser Asp Thr Leu Leu Asp Cys Arg Lys

820 825 830

His Leu Thr Trp Val Val Ala Val Leu Gln Glu Val Ala Ala Ala Ala

835 840 845

Ala Gln Leu Ile Ala Pro Leu Ala Glu Asn Glu Gly Leu Leu Val Ala

850 855 860

Ala Leu Glu Glu Leu Ala Phe Lys Ala Ser Glu Gln Ile Tyr Gly Thr

865 870 875 880

Pro Ser Ser Ser Pro Tyr Glu Cys Leu Arg Gln Ser Cys Asn Ile Leu

885 890 895

Ile Ser Thr Met Asn Lys Leu Ala Thr Ala Met Gln Glu Gly Glu Tyr

900 905 910

Asp Ala Glu Arg Pro Pro Ser Lys Pro Pro Pro Val Glu Leu Arg Ala

915 920 925

Ala Ala Leu Arg Ala Glu Ile Thr Asp Ala Glu Gly Leu Gly Leu Lys

930 935 940

Leu Glu Asp Arg Glu Thr Val Ile Lys Glu Leu Lys Lys Ser Leu Lys

945 950 955 960

Ile Lys Gly Glu Glu Leu Ser Glu Ala Asn Val Arg Leu Ser Leu Leu

965 970 975

Glu Lys Lys Leu Asp Ser Ala Ala Lys Asp Ala Asp Glu Arg Ile Glu

980 985 990

Lys Val Gln Thr Arg Leu Glu Glu Thr Gln Ala Leu Leu Arg Lys Lys

995 1000 1005

Glu Lys Glu Phe Glu Glu Thr Met Asp Ala Leu Gln Ala Asp Ile

1010 1015 1020

Asp Gln Leu Glu Ala Glu Lys Ala Glu Leu Lys Gln Arg Leu Asn

1025 1030 1035

Ser Gln Ser Lys Arg Thr Ile Glu Gly Leu Arg Gly Pro Pro Pro

1040 1045 1050

Ser Gly Ile Ala Thr Leu Val Ser Gly Ile Ala Gly Glu Glu Gln

1055 1060 1065

Gln Arg Gly Ala Ile Pro Gly Gln Ala Pro Gly Ser Val Pro Gly

1070 1075 1080

Pro Gly Leu Val Lys Asp Ser Pro Leu Leu Leu Gln Gln Ile Ser

1085 1090 1095

Ala Met Arg Leu His Ile Ser Gln Leu Gln His Glu Asn Ser Ile

1100 1105 1110

Leu Lys Gly Ala Gln Met Lys Ala Ser Leu Ala Ser Leu Pro Pro

1115 1120 1125

Leu His Val Ala Lys Leu Ser His Glu Gly Pro Gly Ser Glu Leu

1130 1135 1140

Pro Ala Gly Ala Leu Tyr Arg Lys Thr Ser Gln Leu Leu Glu Thr

1145 1150 1155

Leu Asn Gln Leu Ser Thr His Thr His Val Val Asp Ile Thr Arg

1160 1165 1170

Thr Ser Pro Ala Ala Lys Ser Pro Ser Ala Gln Leu Met Glu Gln

1175 1180 1185

Val Ala Gln Leu Lys Ser Leu Ser Asp Thr Val Glu Lys Leu Lys

1190 1195 1200

Asp Glu Val Leu Lys Glu Thr Val Ser Gln Arg Pro Gly Ala Thr

1205 1210 1215

Val Pro Thr Asp Phe Ala Thr Phe Pro Ser Ser Ala Phe Leu Arg

1220 1225 1230

Ala Lys Glu Glu Gln Gln Asp Asp Thr Val Tyr Met Gly Lys Val

1235 1240 1245

Thr Phe Ser Cys Ala Ala Gly Phe Gly Gln Arg His Arg Leu Val

1250 1255 1260

Leu Thr Gln Glu Gln Leu His Gln Leu His Ser Arg Leu Ile Ser

1265 1270 1275

<210> 2

<211> 97

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Gly Ser Arg Met Ser Ala Glu Ala Ser Ala Arg Pro Leu Arg Val Gly

1 5 10 15

Ser Arg Val Glu Val Ile Gly Lys Gly His Arg Gly Thr Val Ala Tyr

20 25 30

Val Gly Ala Thr Leu Phe Ala Thr Gly Lys Trp Val Gly Val Ile Leu

35 40 45

Asp Glu Ala Lys Gly Lys Asn Asp Gly Thr Val Gln Gly Arg Lys Tyr

50 55 60

Phe Thr Cys Asp Glu Gly His Gly Ile Phe Val Arg Gln Ser Gln Ile

65 70 75 80

Gln Val Phe Glu Asp Gly Ala Asp Thr Thr Ser Pro Glu Thr Pro Asp

85 90 95

Ser

<210> 3

<211> 291

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

ggcagcagga tgagtgcgga ggcaagcgcc cggcctctgc gggtgggctc ccgtgtagag 60

gtgattggaa aaggccaccg aggcactgtg gcctatgttg gagccacact gtttgccact 120

ggcaaatggg taggcgtgat tctggatgaa gcaaagggca aaaatgatgg aactgttcaa 180

ggcaggaagt acttcacttg tgatgaaggg catggcatct ttgtgcgcca gtcccagatc 240

caggtatttg aagatggagc agatactact tccccagaga cacctgattc t 291

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

tccatgacgt tcctgacgtt 20

Claims

1.一种分离的DCTN1蛋白N末端多肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，其编码如权利要求1所述的分离的DCTN1蛋白N末端多肽。

3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

4.一种重组载体，其特征在于，其含有如权利要求2或3所述的多核苷酸。

5.一种宿主细胞，其特征在于，其含有如权利要求4所述的重组载体，或其基因组中整合有如权利要求2或3所述的多核苷酸。

6.一种如权利要求1所述的分离的DCTN1蛋白N末端多肽在制备特异性抗人DCTN1的抗体中的应用。

7.一种抗人DCTN1多克隆抗体，其特征在于，其特异性识别和/或结合如权利要求1所述的分离的DCTN1蛋白N末端多肽；其制备方法包括以下步骤：确定DCTN1蛋白N末端多肽序列，并将设计好的序列用DNA Works软件进行密码子优化，生成核苷酸序列，如SEQ ID NO:3所示，随后进行抗原表达与纯化；免疫方法如下：日本白兔，体重2-3kg；首次免疫剂量为400μg抗原与氟氏完全佐剂乳化完全，免疫位点为以下位点中的4-6个：双肩周围皮肤下、背部脊柱两侧皮肤下进行皮下注射和后大腿肌肉进行肌肉注射；加强免疫剂量为首次剂量的1/4；第19天取100μg抗原与氟氏完全佐剂乳化完全，免疫兔前肢腋下以及腹股沟，每点50-100μL；20μg抗原与寡聚核苷酸佐剂混合，免疫兔尾根以及后腿肌肉，每点50-100μL；第40天，100μg抗原与寡聚核苷酸佐剂完全混合，免疫兔后腿肌肉；第54天，100μg抗原与寡聚核苷酸佐剂完全混合，免疫兔后腿肌肉；第66天兔耳动脉取血，ELISA方法检测血清滴度，兔血清效价均大于1：32000；之后以颈动脉取血收集血清，并进行抗体纯化。

8.一种抗人DCTN1多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：确定DCTN1蛋白N末端多肽序列，并将设计好的序列用DNA Works软件进行密码子优化，生成核苷酸序列，如SEQ ID NO:3所示，随后进行抗原表达与纯化；免疫方法如下：日本白兔，体重2-3kg；首次免疫剂量为400μg抗原与氟氏完全佐剂乳化完全，免疫位点为以下位点中的4-6个：双肩周围皮肤下、背部脊柱两侧皮肤下进行皮下注射和后大腿肌肉进行肌肉注射；加强免疫剂量为首次剂量的1/4；第19天取100μg抗原与氟氏完全佐剂乳化完全，免疫兔前肢腋下以及腹股沟，每点50-100μL；20μg抗原与寡聚核苷酸佐剂混合，免疫兔尾根以及后腿肌肉，每点50-100μL；第40天，100μg抗原与寡聚核苷酸佐剂完全混合，免疫兔后腿肌肉；第54天，100μg抗原与寡聚核苷酸佐剂完全混合，免疫兔后腿肌肉；第66天兔耳动脉取血，ELISA方法检测血清滴度，兔血清效价均大于1：32000；之后以颈动脉取血收集血清，并进行抗体纯化。

9.一种如权利要求7所述的抗人DCTN1多克隆抗体的应用，其特征在于，用于制备特异性识别和/或结合DCTN1蛋白的试剂或试剂盒。

10.一种特异性识别和/或结合DCTN1蛋白的试剂盒，其特征在于，其含有如权利要求7所述的抗人DCTN1多克隆抗体。