CN114524864B - SARS-CoV-2相关多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及临床检验试剂领域，具体而言，涉及一种SARS‑CoV‑2相关多肽。该多肽为具有如SEQ ID NO:1或2的氨基酸片段，可用于原核表达，制备方便，且用于检测SARS‑CoV‑2抗体时临床特异性和检出率高。

Description

SARS-CoV-2相关多肽
技术领域
本发明涉及临床检验试剂领域，具体而言，涉及一种SARS-CoV-2相关多肽。
背景技术
2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引发新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。由于新冠肺炎潜伏期长、初时发病症状不明显且传播迅速，因此，实现早期临床高效检出病毒感染是全面控制病毒的一个重要方面。核酸检测被推荐为新冠肺炎的主要确诊手段，但在临床实践中，核酸检测可能受样本采集部位、采集方法、病程等因素的影响而出现假阴性结果；而且由于核酸检测对检测环境和人员的要求较高，给疾控中心和医院带来很大挑战；相比之下基于病毒结构蛋白的免疫学检测抗体抗原法具有快速、方便、安全、有效的特点，建立此方法具有重要意义，2020年3月4日国家公布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》将抗体检测纳入诊断标准。新冠病毒抗体检测主要为IgM和IgG，IgM产生早但维持时间短，可作为早期感染的指标，IgG产生晚但维持时间长，可作为感染和既往感染的指标。检测方法主要有化学发光免疫分析法、胶体金免疫层析法以及酶联免疫吸附测定法等。
SARS-CoV-2属于β冠状病毒属，其基因组为一长约29kb的正单链RNA，可编码至少四种病毒结构蛋白，分别为刺突蛋白(Spike,S)、膜蛋白(Membrane,M)、包膜蛋白(Envelope,E)以及核蛋白(Nucleocapsid,N)。S蛋白作为SARS-CoV-2的主要跨膜糖蛋白，与它的近亲们一样，是依赖于S蛋白完成细胞的识别和入侵。S蛋白又分成S1和S2两个亚基，S1形成了刺突蛋白的球状头，包含S蛋白的大受体结合结构域N端结构域(NTD)和受体结合结构域(RBD)，负责识别宿主细胞受体，完成病毒与细胞的结合；而S2形成了刺突蛋白的茎，参与膜融合，负责完成病毒包膜与人细胞膜的融合，完成入侵过程。而对于SARS-CoV-2而言，开发用于检测病毒特异性抗体抗原的免疫学检测方法主要是针对具有高免疫原性的结构蛋白S蛋白和N蛋白。
发明内容
本发明通过筛选，意外地获得了SARS-CoV-2病毒S蛋白区域中的SEQ ID NO:1或2所示的特定区段(实施例中称之为COVS8和COVS8B)，该区段可用于原核表达，且表达出抗原活性高，用于检测SARS-CoV-2抗体时临床特异性和检出率高。该多肽免疫原性也很好，能刺激动物体产生反应性较高的多种抗体。
COVS8的氨基酸序列：
ENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQ(SEQ ID NO:1)。
COVS8B的氨基酸序列：
ENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQ(SEQ ID NO:2)。
由此，本发明提供了基于该多肽的重组肽、试剂盒、试纸条、缀合物及应用。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。
本发明涉及一种多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示。
本发明还涉及重组肽，其含有如上所述的多肽，以及至少另外一种能够结合SARS-CoV-2抗体的第二抗原肽。
在一些实施方式中，所述第二抗原肽为SARS-CoV-2的N抗原。
在一些实施方式中，所述多肽具有多个拷贝。
多肽之间可以通过连接肽相连，在一些实施方式中，所述连接肽为柔性连接肽；
在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸序列选自Gly、Ser、Pro、Ala以及Glu中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸序列选自(GGGGS)n、(GGGS)n、(GGS)n、(GS)n或(G)n，其中n选自1，2，3，4，5或6。
在另外一些实施方式中，所述多肽或所述重组肽成簇聚集以增加于待捕获抗体的结合能力。
本发明还涉及编码如上所述多肽或重组肽的核酸。
本发明还涉及含有如上所述核酸的载体。
术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。
本发明还涉及宿主细胞，其含有如上所述的核酸，或被如上所述的载体所转化。
在一些实施方式中，所述宿主细胞为原核细胞，例如大肠杆菌。
本发明还涉及如上所述多肽或重组肽的制备方法，包括：
在合适的培养环境下培养如上所述的宿主细胞，并从培养产物中回收所述多肽或重组肽。
本发明还涉及新冠肺炎检测试剂盒，其含有如上所述的多肽或重组肽，以及抗抗体；
所述抗抗体为抗受试样品来源种属免疫球蛋白的抗体。
在一些实施方式中，所述新冠肺炎检测试剂盒还包含固相载体。
在一些实施方式中，所述免疫球蛋白为IgG、IgM或IgA中的至少任意一种。
在一些实施方式中，所述多肽与所述固相载体缀合，所述抗抗体与信号物质缀合。
在一些实施方式中，所述新冠肺炎检测试剂盒还含有SARS-CoV-2的N蛋白抗原。
在一些实施方式中，所述N蛋白抗原与所述固相载体缀合。
在一些实施方式中，所述多肽或重组肽与信号物质缀合，所述抗抗体与所述固相载体缀合。
在一些实施方式中，所述N蛋白抗原与信号物质缀合。
在另外一些实施方式中，新冠肺炎检测试剂盒含有如上所述的多肽或重组肽，以及包含所述多肽的全部或部分的SARS-CoV-2的S蛋白抗原。
在一些实施方式中，所述新冠肺炎检测试剂盒还包含固相载体。
在一些实施方式中，所述S蛋白抗原是S1全长或RBD。
在一些实施方式中，所述S蛋白抗原与所述多肽的至少10个连续的氨基酸相同，优选20个、或30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409个相同。
在一些实施方式中，所述多肽或重组肽与所述固相载体缀合，所述S蛋白抗原与信号物质缀合；
在一些实施方式中，所述多肽或重组肽与信号物质缀合，所述S蛋白抗原与所述固相载体缀合。
在另外一些实施方式中，新冠肺炎检测试剂盒含有如上所述的多肽或重组肽。
在一些实施方式中，所述新冠肺炎检测试剂盒还包含固相载体。
在一些实施方式中，所述多肽或重组肽分为两部分，一部分与所述固相载体缀合，一部分与信号物质缀合。
在一些实施方式中，所述新冠肺炎检测试剂盒中还可以包含样品预处理试剂(如样品纯化富集试剂，裂解液等)、清洗液(如PBS等)、缓冲液、针对信号物质的显色试剂(如信号物质为辣根过氧化物酶，则显色试剂为ECL)等。
本发明还提供新冠肺炎检测试纸条，包括样品垫、结合垫、反应膜和吸收垫，所述反应膜上设置有检测区和质检区；
所述结合垫包被有第一抗原物质，且所述第一抗原物质与信号物质缀合；
所述检测区缀合有第二抗原物质；
其中：
a)所述第一抗原物质和所述第二抗原物质均独立地选自如上所述的多肽或如上所述的重组肽；或；
b)所述第一抗原物质和所述第二抗原物质中的任意一种为如上所定义的S蛋白抗原，另一种为如上所述的多肽或如上所述的重组肽；或；
c)所述第一抗原物质为如上所述的多肽或如上所述的重组肽，所述第二抗原物质为抗抗体；或；
d)所述第一抗原物质为抗抗体，所述第二抗原物质为如上所述的多肽或如上所述的重组肽；
所述抗抗体为抗受试样品来源种属免疫球蛋白的抗体。
在一些实施方式中，所述免疫球蛋白为IgG、IgM或IgA中的至少任意一种。
在一些实施方式中，在c)中，所述结合垫还包被有SARS-CoV-2的N蛋白抗原。
在一些实施方式中，结合垫还包被有内参物，所述质检区固定包被有能够捕获所述内参物的物质。
在一些实施方式中，所述内参物为蛋白或抗体，例如鼠IgG抗体。
本发明还提供缀合物，包括如上所述的多肽或重组肽，以及与所述多肽或重组肽缀合的信号物质、固相载体或结合配偶体。
在一些实施方式中，结合配偶体是生物素/亲和素之一、抗原/抗体之一、受体/配体之一、地高辛/地高辛配基之一、碳水化合物/凝集素之一、互补的两条核酸之、或核酸适配体/核酸适配体靶标之一。利用结合配偶体，可以实现间接缀合，例如多肽与生物素缀合，亲和素与固相载体缀合，进而使多肽与固相载体缀合。再如多肽与GST缀合，GST抗体与信号物质缀合，进而使多肽与信号物质缀合。
在一些实施方式中，所述缀合为直接或间接地进行缀合。
在一些实施方式中，所述信号物质是金属粒子、荧光标记、发色团标记、电子致密标记、化学发光标记、放射性标记或酶。
在一些实施方式中，所述信号物质是胶体金、荧光素、荧光微球、吖啶酯、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。
在一些实施方式中，在所述试剂盒或缀合物中，所述固相载体是塑料、微粒或膜载体；所述塑料可以是聚苯乙烯；微粒可以是磁微粒；所述膜载体可以是硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜或尼龙膜。
在一些实施方式中，所述固相载体选自试管、EP管、多孔板、层析柱、微量反应板凹孔。
在本发明中，术语“微粒”可以为球体、近球体、立方体、多面体或不规则形状。微球的直径优选为10nm～1mm，例如100nm、500nm、1μm、10μm、100μm、500μm；优选为400nm～10μm。
微粒优选为磁微粒，其成分中含有磁性物质。磁性物质可以为金属(金属单质或合金)、非金属，或金属与非金属所形成的复合物。金属例如铁、铝镍钴金属等；非金属例如铁氧体非金属(优选为Fe2O3或Fe3O4磁性纳米粒子)；金属与非金属所形成的复合物例如钕铁硼橡胶磁复合材料。
多孔板优选为酶标板，其含有的孔位可以为8、16、32、48、64、96或更多。
本发明还涉及如上所述的多肽或如上所述的重组肽在SARS-CoV-2抗体检测、或制备SARS-CoV-2抗体检测试纸条或试剂盒中的应用。
在一些实施方式中，所述检测的受试样品选自生物组织或其灌洗液、细胞、体液。
在一些实施方式中，所述检测的受试样品选自血液、血清、血浆、抗凝血、细胞培养上清、唾液、精液、羊水、绒毛、组织或组织裂解液、咽拭子、鼻拭子、眼结膜拭子、粪便标本、粪便、尿液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、痰液。
上述用途的受试者可以指患者或怀疑携带有SARS-CoV-2的动物，特别是哺乳动物，例如蝙蝠、果子狸；优选为灵长类动物，更优选为人。
本发明还涉及如上所述的多肽作为抗原在制备抗SARS-CoV-2抗体中的应用。
可以通过各种本领域普通技术人员已知的技术的任意一种制备抗体。在一种这样的技术中，包含抗原性多肽的免疫原起初注射进任何哺乳动物的各种品种(例如，小鼠，大鼠，兔，绵羊以及山羊)。在这一过程中，本发明的多肽可以不经修饰作为免疫原。此外，多肽也可以连接到载体蛋白(如牛血清白蛋白或匙孔血蓝蛋白)上，则可以激发高级免疫应答。多肽也可以联合免疫佐剂(如福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂)将免疫原注射进动物宿主；更优选地是按照多次加强免疫的预定方案注射，并且周期性地使动物放血。然后，对多肽特异性的抗体可以通过例如使用连接到合适的固相支持物上的多肽的亲和层析从血清等成分中纯化出来。
本发明还涉及一种检测SARS-CoV-2抗体的方法，包括：
使用如上所述的多肽、重组肽、试剂盒或试纸条检测SARS-CoV-2抗体。
实施例
一、SARS-CoV-2S蛋白的制备
依据下表构建不同片段的SARS-CoV-2S蛋白(即COVS1-COVS15)，其中氨基酸片段的位置对应S蛋白氨基酸序列(GeneBank编号为YP_009724390.1)。
针对大肠杆菌偏好密码子对COVS1-COVS15对应蛋白进行密码子优化，得到编码该区域的基因序列；按照pET28a载体的多克隆位点序列信息，在基因序列两端分别添加NcoI和XhoI酶切位点；全基因合成后，亚克隆到pET28a表达载体中。
将测序验证正确的表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单菌落进行培养，0.6mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)于28℃诱导表达4h；蛋白包涵体表达后，以8M尿素溶解，利用镍柱亲和柱介质以及DEAE离子交换介质对目的蛋白进行纯化；后对目的蛋白进行复性，最终保存于20mm CB,pH9.51溶液中。
Figure BDA0002793164870000081
Figure BDA0002793164870000091
二、试纸条的制备与检测
1.标记
胶体金标记S蛋白的制备包括如下步骤，向4/万胶体金溶液中添加0.2M K2CO3，调节pH至7.5，向调好pH的溶液中添加S蛋白，使其蛋白含量为20μg/ml，偶联5min，向其中添加终止液(质量分数10％的BSA或酪蛋白)进行终止偶联反应；离心处理，参数为9000rpm/9min，之后弃上清，复溶后2℃～8℃保存备用。
所述胶体金溶液通过如下方法制备，将氯金酸配制成1％的溶液，再向煮沸的纯化水中添加终浓度为万分之四的氯金酸溶液，继续煮沸3min，将0.1M的柠檬酸钠，按每100ml氯金酸溶液中添加580μl的量，继续搅拌加热10min，冷却至室温，即制备出粒径均一浓度为4/万的胶体金溶液，2℃～8℃保存备用。
将标记了S蛋白的胶体金溶液稀释后铺匀在玻璃纤维素膜上，然后放入冻干机冻干(1-2h)或者放入37℃干燥房干燥过夜，得标记垫。
2.包被
将抗人IgM、抗人IgG稀释至1.0mg/ml，使用喷金滑膜仪分别包被两条线于硝酸纤维素膜上，放置于37℃烘箱干燥2h以上，得反应膜。
其中，抗人IgM、抗人IgG来自广东菲鹏生物有限公司。
3.组装
将上述样品垫、结合垫、反应膜与其它材料(底板、吸水纸、样品垫)组装，裁切成2.7mm，制成相应的免疫检测试纸条。
4.检测(夹心法)
如果样本冷藏或者冷冻储存，将待测样本平衡至室温(20-30℃)，用移液枪或滴管吸取待测样本10μl滴加至试纸条的样品垫上，加入50ul PBS溶液进行层析反应。
5.检测结果的解释
计时15min，判读结果，超过20min以后的判读结果无效。结果记录为胶体金色卡读值，数值越小，即显色越强，说明灵敏度越高。
三、测试
例1、
将COVS1-COVS15按上述方法制备试纸条，对4份阳性确诊样本(ncov-P1至ncov-P4)进行测试，显色结果中，B表示阴性，C1-C9表示阳性，其中C1至C9显色强度由强至弱，+表示同一色号显色更强，例如C1+强度高于C1。
Figure BDA0002793164870000101
例2、临床特异性放大评估
选取COVS8抗原进行标记，通过上述方法制备试纸条，进行300份临床阴性标本测试。
捕获法： 检出假阳标本 假阳率
300份临床 7份在B+～C9的反应性 97.60％
例3、临床阳性放大
选取COVS8抗原与N抗原(来自广东菲鹏生物有限公司)分别进行标记，其中N抗原的标记方法参考实施例步骤二，其中N抗原标记含量为20μg/ml，将COVS8抗原与N抗原混合铺金，制得标记垫。其余方法参考实施例。
通过上述方法制备试纸条，进行57份临床阳性标本测试。
临床阳性放大 阳性份数 检出份数 阳性检出率
厂家一 57份阳性 57份 100％
厂家二 57份阳性 55份 96.40％
捕获法N+COVS8： 57份阳性 57份 100％
例4：
包被：将S蛋白(来自广东菲鹏生物有限公司，S1全长)进行包被0.8mg/ml，使用喷金滑膜仪包被于硝酸纤维素膜上，放置于37℃烘箱干燥2h以上，得包被膜。
标记：将COVS1～COVS15分别进行标记(参考实施例步骤二)。
其余方案参考实施例。
对4份阳性确诊样本(ncov-P1至ncov-P4)进行测试，显色结果中，B表示阴性，C1-C9表示阳性，其中C1至C9显色强度由强至弱，+表示同一色号显色更强，例如C1+强度高于C1。
Figure BDA0002793164870000111
Figure BDA0002793164870000121
例5：
选取COVS8抗原进行标记，通过例4的方法制备试纸条，进行300份临床阴性标本测试。
夹心法 检出假阳标本 假阳率
300份临床 3份在B+～C9的反应性 99.00％
例6：
选取COVS8抗原进行标记，通过例4的方法制备试纸条，进行57份临床阳性标本测试。
临床阳性放大 检阳性份数 检出份数 阳性检出率
厂家一 57份阳性 57份 100％
厂家二 57份阳性 55份 96.40％
COVS8夹心法： 57份阳性 57份 100.00％
从上述实施例可以看出，本发明的多肽可用于原核表达，制备方便，且临床特异性和检出率高。
四、免疫原及抗体的制备
采用COVS8作为免疫原，免疫动物，取8～12周龄与骨髓瘤细胞同种系的BALB/c小鼠，以含蛋白质100μg/只的COVS8与等量福氏完全佐剂充分混匀，注入小鼠腹腔内，每隔2周100μg/只的COVS8与等量福氏不完全佐剂充分混匀，多次注入小鼠腹腔内加强免疫。经检测小鼠血清(间接ELISA法)，滴度在1:2000以上者可用于融合，融合前3天经小鼠腹腔内再次加强免疫，剂量为50μg/只。以BALB/c鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。在融合前1天，BALB/c鼠拉颈处死，无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器腹腔注入RPMI 1640基础培养液5mL，反复冲洗，回收冲洗液，1000rpm，离心5分钟，留沉淀，用RPMI 1640筛选培养液(含HAT的RPMI 1640完全培养液中)重悬，调整细胞浓度1×105个/mL，加入96孔板，150μL/孔，37℃，5％CO2培养过夜。小鼠末次免疫后三天，在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，RPMI 1640基础培养液冲洗一次，放于小烧杯的尼龙网上磨碎过滤，制成细胞悬液。离心，弃上清，RPMI 1640基础培养液重悬，如此重复三次，计数。随后进行细胞融合：(1)取40mL HAT培养液，15mL DMEM无血清培养液和1mL 50％PEG(M12000)分别置于37℃水浴中预温；(2)分别取小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0(菲鹏生物股份有限公司保存)(2-5×107)、上述免疫脾细胞(108)悬液加入50mL离心管中混匀，并加DMEM无血清培养液至40mL。离心10分钟，倒尽上清液，混匀；(3)将离心管置于37℃预温的水中，取0.7mL预温的50％PEG溶液，静置90秒钟。立即滴加37℃15mL预温的无血清培养液；(4)补加DMEM无血清培养液至40mL，离心10分钟，倒尽上清液。加40mL含15％～20％胎牛血清的HAT培养液。用吸管混匀，滴加到已含有饲养细胞的4块96孔细胞培养板的小孔中，每孔2滴，置37℃、7％CO2的培养箱中培养。接下来进行杂交瘤细胞的选择培养，免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞，经PEG处理后，通过筛选培养出骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的导核体。吸取每个培养孔的上清液，用间接ELISA法检测出培养液中含SARS-CoV-2抗体的培养孔。采用有限稀释法使杂交瘤细胞克隆化。经过培养后单个细胞可增殖为同源性细胞克隆；通过反应性筛选得到反应性较好且稳定分泌SARS-CoV-2单克隆抗体的细胞株。
采用以上方法，获得以下反应性较高的细胞株，例如包括细胞株COVS8-4B1、COVS8-6D2、COVS8-10E6，反应性检测OD405≥0.5。
反应性筛选的方法：在室温下，在搅拌时微量滴定板(Nunc，Maxisorb)用100μL/孔含2.5μg/mL COVS8(作为抗原)的包被缓冲液包被1小时。包被后处理在PBS缓冲液和1％单克隆抗体中进行孵育30分钟。随后，用洗涤缓冲液进行洗涤。在室温下，在搅拌时将100μL/孔抗体样品孵育1小时。然后用洗涤溶液再洗涤2次。然后在室温下，在搅拌时再与100μL/孔按1:40000用PBS缓冲液稀释的检测抗体过氧化物酶缀合的羊抗鼠IgG孵育1小时。用洗涤缓冲液再次洗涤后，用常规方法测定过氧化物酶活性(例如用ELISA读板器读取405nm处的反应值)。
以上实施例可见，本发明的多肽可以作为免疫原应用，并且可以制备得到反应性较高的抗体。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广东菲鹏生物有限公司
<120> SARS-CoV-2相关多肽
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 410
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu
1 5 10 15
Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile
20 25 30
Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg
35 40 45
Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala
50 55 60
Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn
65 70 75 80
Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr
85 90 95
Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe
100 105 110
Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg
115 120 125
Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys
130 135 140
Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn
145 150 155 160
Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe
165 170 175
Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile
180 185 190
Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys
195 200 205
Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly
210 215 220
Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala
225 230 235 240
Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn
245 250 255
Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu
260 265 270
Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp
275 280 285
Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile
290 295 300
Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro
305 310 315 320
Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn
325 330 335
Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr
340 345 350
Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly
355 360 365
Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile
370 375 380
Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser
385 390 395 400
Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala Ser Gln
405 410
<210> 2
<211> 410
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu
1 5 10 15
Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile
20 25 30
Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg
35 40 45
Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala
50 55 60
Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn
65 70 75 80
Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr
85 90 95
Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe
100 105 110
Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg
115 120 125
Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys
130 135 140
Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn
145 150 155 160
Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe
165 170 175
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180 185 190
Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys
195 200 205
Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly
210 215 220
Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala
225 230 235 240
Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn
245 250 255
Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu
260 265 270
Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp
275 280 285
Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile
290 295 300
Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro
305 310 315 320
Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Gly Val Asn
325 330 335
Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr
340 345 350
Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly
355 360 365
Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile
370 375 380
Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser
385 390 395 400
Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala Ser Gln
405 410

Claims (41)

1. 多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1或2所示。
2.编码权利要求1所述的多肽的核酸。
3.含有权利要求2所述的核酸的载体。
4.含有权利要求2所述的核酸的宿主细胞。
5.权利要求3所述的载体所转化的宿主细胞。
6.根据权利要求4或5所述的宿主细胞，所述宿主细胞为原核细胞。
7.根据权利要6所述的宿主细胞，所述原核细胞为大肠杆菌。
8.权利要求1所述多肽的制备方法，所述方法包括：在合适的培养环境下培养如权利要求4~7任一项所述的宿主细胞，并从培养产物中回收所述多肽。
9.新冠肺炎检测试剂盒，其含有权利要求1所述的多肽，以及抗抗体；
所述抗抗体为抗受试样品来源种属免疫球蛋白的抗体。
10.根据权利要求9所述的新冠肺炎检测试剂盒，所述新冠肺炎检测试剂盒还包含固相载体。
11.根据权利要求9或10所述的新冠肺炎检测试剂盒，所述免疫球蛋白为IgG、IgM或IgA中的至少任意一种。
12.根据权利要求10所述的新冠肺炎检测试剂盒，所述多肽与所述固相载体缀合，所述抗抗体与信号物质缀合，或所述多肽与信号物质缀合，所述抗抗体与所述固相载体缀合。
13.根据权利要求9或10所述的新冠肺炎检测试剂盒，所述新冠肺炎检测试剂盒还含有SARS-CoV-2的N蛋白抗原。
14.根据权利要求13所述的新冠肺炎检测试剂盒，所述N蛋白抗原与所述固相载体缀合，或所述N蛋白抗原与信号物质缀合。
15.新冠肺炎检测试剂盒，其含有权利要求1所述的多肽，以及包含所述多肽全部或部分的SARS-CoV-2的S蛋白抗原。
16.根据权利要求15所述的新冠肺炎检测试剂盒，所述新冠肺炎检测试剂盒还包含固相载体。
17. 根据权利要求15所述的新冠肺炎检测试剂盒，所述S蛋白抗原是S1全长或RBD。
18.根据权利要求15~17任一项所述的新冠肺炎检测试剂盒，所述多肽与所述固相载体缀合，所述S蛋白抗原与信号物质缀合；或
所述多肽与信号物质缀合，所述S蛋白抗原与所述固相载体缀合。
19.新冠肺炎检测试剂盒，其含有权利要求1所述的多肽。
20.根据权利要求19所述的新冠肺炎检测试剂盒，所述新冠肺炎检测试剂盒还包含固相载体。
21.根据权利要求20所述的新冠肺炎检测试剂盒，所述多肽分为两部分，一部分与所述固相载体缀合，一部分与信号物质缀合。
22.新冠肺炎检测试纸条，包括样品垫、结合垫、反应膜和吸收垫，所述反应膜上设置有检测区和质检区；
所述结合垫包被有第一抗原物质，且所述第一抗原物质与信号物质缀合；
所述检测区缀合有第二抗原物质；
其中：
a）所述第一抗原物质和所述第二抗原物质均独立地选自权利要求1所述的多肽；或；
b）所述第一抗原物质和所述第二抗原物质中的任意一种为权利要求15或17中所定义的S蛋白抗原，另一种为权利要求1所述的多肽；或；
c）所述第一抗原物质为权利要求1所述的多肽，所述第二抗原物质为抗抗体；或；
d）所述第一抗原物质为抗抗体，所述第二抗原物质为权利要求1所述的多肽；
所述抗抗体为抗受试样品来源种属免疫球蛋白的抗体。
23.根据权利要求22所述的新冠肺炎检测试纸条，所述免疫球蛋白为IgG、IgM或IgA中的至少任意一种。
24.根据权利要求22或23所述的新冠肺炎检测试纸条，在c）中，所述结合垫还包被有SARS-CoV-2的N蛋白抗原。
25.根据权利要求22或23所述的新冠肺炎检测试纸条，结合垫还包被有内参物，所述质检区固定包被有能够捕获所述内参物的物质。
26.缀合物，包括权利要求1所述的多肽，以及与所述多肽缀合的信号物质、固相载体或结合配偶体。
27.根据权利要求26所述的缀合物，所述结合配偶体是生物素/亲和素之一、抗原/抗体之一、受体/配体之一、地高辛/地高辛配基之一、碳水化合物/凝集素之一、互补的两条核酸之一、或核酸适配体/核酸适配体靶标之一。
28.根据权利要求12、14、18及21中任一项所述的新冠肺炎检测试剂盒，或权利要求22或23所述的新冠肺炎检测试纸条，或权利要求26或27所述的缀合物，所述缀合为直接或间接地进行缀合。
29.根据权利要求12，14，18及21中任一项所述的新冠肺炎检测试剂盒，或权利要求22或23所述的新冠肺炎检测试纸条，或权利要求26或27所述的缀合物，所述信号物质是金属粒子、荧光标记、发色团标记、电子致密标记、化学发光标记、放射性标记或酶。
30.根据权利要求29所述的新冠肺炎检测试剂盒或所述的新冠肺炎检测试纸条或所述的缀合物，所述信号物质是胶体金、荧光素、荧光微球、吖啶酯、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。
31.根据权利要求10,12,14,16,17,20及21中任一项所述的新冠肺炎检测试剂盒或权利要求26或27所述的缀合物，在所述试剂盒或缀合物中，所述固相载体是塑料。
32.根据权利要求31所述的新冠肺炎检测试剂盒或所述的缀合物，所述塑料可以是聚苯乙烯。
33.根据权利要求10,12,14,16,17,20及21中任一项所述的新冠肺炎检测试剂盒或权利要求26或27所述的缀合物，在所述试剂盒或缀合物中，所述固相载体是微粒或膜载体。
34.根据权利要求33所述的新冠肺炎检测试剂盒或所述的缀合物，所述微粒可以是磁微粒；所述膜载体可以是硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜或尼龙膜。
35.根据权利要求10,12,14,16,17,20及21中任一项所述的新冠肺炎检测试剂盒或权利要求26或27所述的缀合物，所述固相载体选自试管、多孔板、层析柱。
36.根据权利要求35所述的新冠肺炎检测试剂盒或所述的缀合物，所述试管为EP管。
37.权利要求1所述的多肽在制备SARS-CoV-2抗体检测试纸条或试剂盒中的应用。
38.根据权利要求37所述的应用，所述检测的受试样品选自生物组织或其灌洗液、细胞、体液。
39.根据权利要求38所述的应用，所述检测的受试样品选自血清、血浆、细胞培养上清、唾液、精液、羊水、绒毛、组织或组织裂解液、咽拭子、鼻拭子、眼结膜拭子、粪便标本、粪便、尿液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、痰液。
40.根据权利要求39所述的应用，所述组织包括血液。
41.权利要求1所述的多肽作为抗原在制备抗SARS-CoV-2抗体中的应用，其中，所述应用为非治疗目的的应用。
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