CN103524601B - 人卵透明带蛋白4中的表位肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了人卵透明带蛋白4中的表位肽及其应用。具体地,本发明人提供了一种来自人卵透明带蛋白-4(人ZP4蛋白227位-463位)的分离的抗原短肽,所述短肽的结构如式I所示:X1-X-X2(式I),并满足以下特征:(a)式I中X为6-7个氨基酸的核心片段;(b)式I中X1、X2的氨基酸个数总和≤2个;(c)所述的核心片段的序列选自SEQ?ID?NO.:1-6;和(d)所述的短肽具有与抗人ZP4C抗体结合的活性;其中,“-”表示肽键或肽接头。本发明表位肽可组合应用于检测样品中抗人ZP4蛋白各抗体的存在或含量,从而可高特异性高灵敏度地诊断ZP自身免疫引起的妇女不孕症,此外,本发明表位肽还可用于制备具有安全有效优点的重组人ZP多表位肽避孕疫苗。
Description
技术领域
本发明属于生物工程和免疫学技术领域,具体地,涉及一组人卵透明带蛋白4中的表位肽及其应用。
背景技术
ZP蛋白(人卵透明带蛋白),包括组成蛋白之一的ZP4蛋白,在精卵受精过程中也起者重要的作用,是精子第二受体。在正常妇女血清中抗ZP抗体一般为阴性,而抗ZP抗体的存在会结合ZP蛋白,使精子的运动能力下降,影响精子穿过宫颈粘液及上行,并影响精子和ZP蛋白的结合,从而阻止精卵结合并导致不孕。在发生ZP自身免疫的不孕症妇女中,血清中存在抗ZP蛋白抗体,但由于ZP蛋白抗原的不可获得性,现有一般检测抗原多用与人ZP具交叉反应性的猪ZP蛋白,故目前对抗人ZP抗体的检测存在较高的假阳性率。
而在转化医学领域,建立特异、灵敏的疾病诊断方法一直是重要研究方向之一。在一般用18或20聚长表位肽抗原的酶联免疫测定法(ELISA)诊断自身免疫疾病以及诸如流感病毒感染的场合,往往出现30%左右的假阳性率,从而影响临床诊断的准确性和所建立诊断方法的广泛应用。
造成此种场合高假阳性率的原因很简单,即:由于已清楚线性表位由3-8个氨基酸残基组成,18或20聚或更长的合成肽(太短不易作为抗原包被ELISA检测板)中显然有可能存在N个不被知晓的表位,以及由于病毒和细菌自然感染(如流感病毒感染等)和自身免疫疾病等诸多原因导致人体内通常存在成千上万种但抗体滴度不高的抗体,因此这两个因素在以上患者血清稀释度不可能高(一般1:20-1:100)的情况下,极易产生非特异性交叉反应,从而导致高假阳性率检测结果。
另外,基于一旦发生人ZP自身免疫疾病,暴露在ZP蛋白表面的抗原表位都会产生它们的抗体这一认知,因此解码靶蛋白的线性抗原表位组显得尤为重要,因为如此就能知晓人ZP可诱发多少和哪些ZP表位抗体,进而据此构建可替代天然ZP蛋白(由ZP1-ZP4四个蛋白组成)重组多表位肽抗原,以解决ZP抗体检测的抗原来源和检测ZP抗体的特异性和灵敏度等问题,也包括为研制安全可逆和有效的人ZP避孕疫苗提供尽可能多的线性抗原表位肽。
发明内容
本发明提供了一组可联合应用于检测抗人ZP4蛋白抗体,从而诊断妇女ZP自身免疫不孕病因的ZP4蛋白小分子表位肽,本发明还提供了该组表位肽在制备避孕疫苗中的应用。
本发明第一方面,提供了一种来自人卵透明带蛋白-4(人ZP4蛋白)227位-463位的分离的短肽,所述短肽的结构如式I所示:
X1-X-X2
式I,
并满足以下特征:
(a)式I中X为6-7个氨基酸的核心片段;
(b)式I中X1、X2为无、1或2个氨基酸,且X1和X2氨基酸个数总和≤2;
(c)所述的核心片段的序列选自SEQIDNO.:1-6;和
(d)所述的短肽具有与抗人ZP4C抗体结合的活性;
其中,“-”表示肽键或肽接头。
在另一优选例中,所述的短肽选自如SEQIDNO.:7-18所示的短肽。
本发明第二方面,提供了一种多肽,所述多肽是经本发明第一方面所述的短肽经过1-3个氨基酸的添加、1-2个缺失并仍含有所述核心片段X,且具有与抗人ZP4C抗体结合活性的多肽。
本发明的第三方面,提供了一种分离的肽集合,所述的肽集合由选自下组的肽或多肽构成:(i)一种或多种选自本发明第一方面所述的短肽;和/或(ii)一种或多种选自本发明第一方面所述的多肽。
在另一优选例中,(i)中所述短肽与(ii)中所述多肽的核心片段X的序列可以相同或不相同。
在另一优选例中,(i)中所述各短肽的核心片段X的序列可以相同或不相同。
在另一优选例中,(ii)中所述各多肽的核心片段X的序列可以相同或不相同。
在另一优选例中,所述的肽集合还包括除SEQIDNO.:1-6以外的分离的人ZP4蛋白线性表位肽。
本发明第四方面,提供了本发明第三方面所述肽集合的用途,用于制备检测抗人ZP4蛋白抗体的试剂或试剂盒,其中,所述的试剂或试剂盒用于诊断是否由ZP自身免疫导致的妇女不孕。
在另一优选例中,所述的试剂点样于试剂盒检测板中。
在另一优选例中,所述的试剂包括肽集合或偶联于载体蛋白的肽集合。
在另一优选例中,所述的载体蛋白包括GST蛋白。
在另一优选例中,所述的检测包括酶联免疫反应法(ELISA法)检测。
在另一优选例中,所述可检测标记可选用本领域常规的各种可检测标记物,如生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶等。
本发明第五方面,提供了本发明第三方面所述的肽集合、本发明第一方面所述的短肽或本发明第二方面所述的多肽的用途,用于制备避孕疫苗组合物。
本发明第六方面,提供了一种避孕疫苗组合物,所述的避孕含有安全有效量的本发明第二方面所述的肽集合、本发明第一方面所述的短肽或本发明第二方面所述的多肽,以及药学上可接受的载体。
本发明第七方面,提供了一种避孕方法,向所需的对象施用安全有效量的本发明第六方面所述的避孕疫苗组合物。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一赘述。
附图说明
图1A显示了人ZP4C系列18肽融合蛋白表达的SDS-PAGE分析,22-49代表电泳样品P22-P49融合蛋白所在的各泳道;图1B显示了用兔抗人ZP4C抗血清的免疫印迹鉴定,箭头分别指示印迹反应性18肽(P23-P25、P30-34、P39-40、P42-43、P46和P49)。
图2-图7显示了用人ZP4C抗血清的ZP4-1~ZP4-6表位系列8肽免疫印迹鉴定,印迹膜上(图2-图7的A图)的各泳道代表反应性蛋白的电泳样品八肽融合蛋白,箭头分别指示反应性8肽;图2-图7的B图分别显示了列表共有序列分析,阴影部分指示反应性8肽中共有氨基酸残基。
图8显示了人ZP4C蛋白片段的线性抗原表位扫描作图鉴定的技术路线。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究,运用改良生物合成肽的方法,首次鉴定了另一组位于人卵透明带蛋白4片段(ZP4C)上的六个小分子表位肽,这组表位肽作为最小基序肽,能够特异地与抗ZP4蛋白抗体结合,可用于筛选测定样品中抗人ZP4六个表位抗体,从而可用于诊断妇女ZP自身免疫导致的不孕症。此外,本发明表位肽还可以用于制备抗生育疫苗的组合物,从而达到人口生育控制的效果。
人ZP4
人ZP由ZP1-ZP4四个蛋白组成,其中人ZP4已被确定为人精子第二受体,是参与精卵结合生殖事件中的重要蛋白之一。人ZP4基因Genbank登录号为:NM_021186.3,它编码540个氨基酸残基(人ZP4蛋白登录号为Q12836.1),其成熟蛋白,即去除N端信号肽和C端跨膜区的蛋白由58位到463位氨基酸残基组成。
人ZP4C蛋白片段
解码靶蛋白的线性B细胞表位组(简称线性表位)的首要条件,是必须获得用于线性表位扫描作图的兔抗多克隆抗体或抗血清,因为妇女每月排卵数极为有限,因此纯化获得天然ZP抗原几乎不可能。随着基因工程技术的日益成熟,一个替代方法就是通过真核或原核生物系统表达重组靶蛋白,然后纯化之用作免疫原。
由于成熟人ZP4分子量过大,不适合原核表达系统,因此本发明采用将靶蛋白分段表达的策略,即将人ZP4蛋白拆分成相互重叠8个残基的ZP4N(由58位-234位残基组成)和ZP4C(由227位-463位残基组成)两个大片段。结果人ZP4C蛋白在大肠杆菌中获得高表达,从而为其纯化和制备兔多克隆抗体奠定了基础。
线性B细胞表位
一般而言,绝大多数蛋白都具有抗原性,即在哺乳动物体内诱发针对特异抗原的线性(非构象型)B细胞表位和构象型表位抗体,或诱发辅助性T细胞或细胞毒性T细胞分泌特定的细胞因子应答。相对检测抗原和抗体有效疫苗研制用途,目前研究最多的是用化学合成肽法和噬菌体展示文库等技术鉴定靶蛋白中氨基酸序列连续的线性表位。
兔抗重组人ZP4抗血清
本发明线性表位的鉴定可采用变性蛋白作为制备特异兔多克隆抗血清的抗原。
一种优选的用兔抗人ZP4抗血清鉴定靶蛋白表位肽的流程见图8。
作为由重组人ZP4蛋白诱导产生的抗人ZP4多克隆抗体,制备过程如下:
利用兔抗人ZP4抗血清检测ZP4抗原表位的原理,本发明构建了大量重叠肽,从而筛选并鉴定了能与抗人ZP4抗血清相结合的各表位最小基序序列。本发明原理的技术路线如下及图8。
1,用常规PCR方法从人ZP4cDNA克隆中扩增出编码ZP4成熟蛋白C端大片段(去除C端跨膜区的残基227-463,简称为ZP4C227-463)的cDNA,然后重组插入pSY621表达质粒[沈芸,应康,徐万祥,谢毅:大肠杆菌高效表达载体pSY621的构建.复旦学报(自然科学版)2000;39(3):313–317],转化大肠杆菌后进行热诱导表达,在用MA-1662单抗的蛋白印迹鉴定后,用纯化表达的重组人ZP4C蛋白主动免疫三只雄性新西兰白兔,最后获得兔抗重组人ZP4C蛋白抗血清。
2,采用8/18肽pXXGST-1融合表达载体。
分别构建一组跨越人ZP4C全长度相互重叠10个残基的28个系列18肽(以GST188蛋白为融合表达载体。具体操作步骤:外送合成所设计的系列18肽并含两端BamHI和SalI粘性末端的编码DNA正负链片段;DNA正负链片段配对退火后重组插入表达质粒;转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌;挑选重组克隆测序验证插入片段DNA序列;以及热诱导表达目的GST188-18肽融合蛋白)。
3.用兔抗重组人ZP4蛋白抗血清进行第一轮识别18肽的蛋白印迹鉴定,即将分别含人ZP4C的28个18肽(如编号P22-P49,人ZP4N的系列18肽编号P1-P21)融合蛋白的各诱导菌总蛋白进行SDS-PAGE分析,继而电转移到硝酸纤维素膜上,最后用抗人ZP4C抗血清完成免疫印迹鉴定。
3,按前述系列18肽融合蛋白构建表达步骤,进一步表达GST188为载体跨越9个反应性18肽长度相互重叠7个残基的系列8肽融合蛋白(编号P94-P204,用于人ZP4C表位最小基序的系列8肽编号为P50-P93),继而实施第二轮可被抗人ZP4C抗血清识别的精细表位免疫印迹鉴定(步骤同第一轮18肽鉴定)。
表位肽
在本案发明人建立“改良生物合成肽法”(XuWX,etal.Minimalmotifmappingofaknownepitopeonhumanzonapellucidaprotein-1usingpeptidebiosynthesisstrategy.JReprodImmunol,2009;81:9–16;XuWX,etal.XuWan-xiang,HeYaping,WangJian,TangHai-ping,ShiHui-juan,SunXiao-xi,JiChao-neng,GuShao-huaandYiXie,MappingofminimalmotifsofB-cellepitopesonhumanzonapellucidaglycopotein-3.ClinDevImmunol,2012;2012:831010.)之前,无法用抗重组蛋白多抗鉴定小于或等于8个残基多肽的抗体识别表位最小基序,因此,严格地说,未经过表位最小基序鉴定的肽不能称为表位或表位肽,只能称之为“抗原性肽”。换言之,在靶蛋白表位扫描作图鉴定中,只有经过表位最小基序鉴定的肽序列,才能称作“表位”或“表位肽”。
在本发明中,“本发明表位肽”、“本发明多肽”、“本发明活性片段”、可互换使用,指符合式I结构式的短肽或含有核心序列X的表位多肽的统称。
术语“符合式I结构式的表位短肽”、“本发明短肽”可互换使用,指符合下式且所示的短肽满足以下特征的短肽:
X1-X-X2;
式I
并满足以下特征:
(a)式I中X为6-7个氨基酸的核心片段;
(b)式I中X1、X2为无、1或2个氨基酸,且X1和X2氨基酸个数总和≤2;
(c)所述的核心片段的序列选自SEQIDNO.:1-6;和
(d)所述的短肽具有与抗人ZP4C抗体结合的活性;
其中,“-”表示肽键或肽接头。
在本发明中,一种优选的符合式I结构式的短肽序列如SEQIDNO.:7-18所示。
术语“基序肽”、“表位肽”、“核心片段”可互换使用,均指ZP4蛋白上可为抗ZP4C抗体识别结合的最小6-7个氨基酸的核心精细片段,即式I中的X。
术语“含有核心序列X的多肽”、“本发明多肽”可互换使用。应理解,所述术语还包括符合式I的短肽以及含有核心序列X的多肽的衍生物,指符合式I结构式的短肽在经过1-3个氨基酸添加、1-2个缺失并仍含有所述核心片段X的序列,且具有与抗人ZP4C抗体结合活性的多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
最初的残基 | 代表性的取代 | 优选的取代 |
Ala(A) | Val;Leu;Ile | Val |
Arg(R) | Lys;Gln;Asn | Lys |
Asn(N) | Gln;His;Lys;Arg | Gln |
Asp(D) | Glu | Glu |
Cys(C) | Ser | Ser |
Gln(Q) | Asn | Asn |
Glu(E) | Asp | Asp |
Gly(G) | Pro;Ala | Ala |
His(H) | Asn;Gln;Lys;Arg | Arg |
Ile(I) | Leu;Val;Met;Ala;Phe | Leu |
Leu(L) | Ile;Val;Met;Ala;Phe | Ile |
Lys(K) | Arg;Gln;Asn | Arg |
Met(M) | Leu;Phe;Ile | Leu |
Phe(F) | Leu;Val;Ile;Ala;Tyr | Leu |
Pro(P) | Ala | Ala |
Ser(S) | Thr | Thr |
Thr(T) | Ser | Ser |
Trp(W) | Tyr;Phe | Tyr |
Tyr(Y) | Trp;Phe;Thr;Ser | Phe |
Val(V) | Ile;Leu;Met;Phe;Ala | Leu |
在本发明中,一种优选的含有核心序列X的短肽序列如SEQIDNO.:7-18所示。
如本文所用,术语“肽集合”指由(i)一种或多种选自符合式I结构式的短肽;和/或(ii)一种或多种含有核心序列X的多肽所构成的多肽的集合和/或组合,且所述的短肽和多肽的核心序列X不相同。
如本文所用,“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质,原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多肽是没有分离纯化的,但同样的多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开,则为分离纯化的。
如本文所用,“分离的肽”是指本发明多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化本发明多肽。基本上纯化的多肽(融合蛋白)在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。在本发明中,本发明多肽包括符合式I结构式的短肽或含有核心序列X的多肽。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽,优选重组多肽。
一旦鉴定获得了相关的肽序列,就可以用重组法来大批量地获得相关肽序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到相关肽(融合蛋白)。
此外,还可用化学方法直接合成相关肽序列。
应用
动物模型研究证实抗人卵透明带蛋白疫苗可有效抑制精卵结合,进而达到抗生育效果。但其研制一直受到ZP免疫往往导致卵巢功能障碍这一主要副作用的困扰。作为一个突破,美国NIH的Dean实验室首先用一单克隆抗体(以下简称单抗)鉴定出小鼠精子受体ZP3蛋白羧基端的一个线性B细胞表位,并制备了其可导致高比率不育的化学合成肽疫苗(MillarSE,etal.Vaccinationwithasyntheticzonapellucidapeptideproduceslong-termcontraceptioninfemalemice.Science1989;246:935-938)。随后的研究证明:此大于8个残基的小鼠ZP3抗原性肽中仍存在由其表位肽上套叠的一个ZP致病性特异T细胞表位,由其导致一些被免疫的近交系小鼠中形成卵巢炎,替换了此T细胞表位的一个关键残基后,免疫不同近交系小鼠则不再出现卵巢炎地产生不完全的抗生育效果(LouYH,etal.Azonapellucida3peptidevaccineinducesantibodiesandreversibleinfertilitywithoutovarianpathology.JImmunol1995;155:2715-2720)。这些进展和观察提示,研制抗生育效果完全(至少达到95%以上)且无卵巢炎发生的ZP避孕疫苗是可能的,但选择的抗原性肽必须经过抗体识别表位最小基序鉴定(因为这是排除T细胞表位最可行的方法),以及组合多个表位肽以实现接近100%的抗生育效果。
因此,在ZP避孕疫苗研究领域内,合成肽疫苗,特别是研制重组多表位肽疫苗是一个重要发展方向。因此,本发明多肽除了可用于妇女ZP自身免疫不孕症的诊断外,还可用作制备既能增加疫苗有效性也能避免疫苗引发卵巢炎的重组多表位肽抗生育疫苗的候选表位肽及其组合物。
ZP自身免疫不孕症的检测
本发明涉及定性和定量检测抗ZP4蛋白抗体水平诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中检测抗ZP4蛋白抗体,可用于诊断妇女由ZP自身免疫导致的不孕症。
检测样品中是否存在抗ZP4蛋白抗体的方法可利用本发明多肽与样品中抗ZP4特异性结合的原理进行检测,它包括:通过样品与本发明多肽或其融合表达蛋白的抗原抗体反应,观察检测样品OD值是否大于对照二倍,或者观察是否形成抗体复合物(印迹条带),OD值高或形成印迹条带就表示样品中存在抗ZP4蛋白抗体或某一表位的抗体。
本发明可用于诊断妇女不孕症病因。例如,本发明多肽可用于妇女不孕症的诊断或用于制备疫苗。可以将本发明表位肽固定点样在蛋白质芯片上从而形成试剂或试剂盒,用于检测样品中的抗ZP4蛋白抗体。
此外,可将本发明多肽(化学合成肽,或与载体蛋白偶联的融合蛋白,或通过构建重组多表位肽抗原),点样于检测板或检测试纸条。在检测时,使待测样品与本发明多肽发生免疫反应,从而诊断待测样品中是否存在人ZP抗体和/或存在哪些人ZP4表位的抗体。
在本发明中,检测板可采用本领域常用的检测板材料,采用常规的检测板制备方法制成。代表性的免疫检测板包括测试条和支撑测试条的支撑板,如可采用PVC聚脂胶板等;所述的测试条由滤纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成,搭接部位可以采用常规的方法,如胶带等固定连接;其中:层析材料预包被胶体金或有色标记的本发明多肽或肽集合,优选地与偶联有载体蛋白的本发明的肽集合,且层析材料预包被有胶体金,硝酸纤维素膜上吸附检测线和质控线。
避孕疫苗
本发明还提供了一种可用作避孕疫苗的疫苗组合物,该疫苗(组合物)可用于实现妇女避孕或抗生育的ZP疫苗研制。通常,该疫苗含有:(i)本发明多肽作为免疫活性成分,以及(ii)药学上或免疫学上可接受的载体。
本发明中,术语“含有”表示各种成分可一起应用于或存在于本发明的组合物中。因此,术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
在本发明中,这些疫苗包含免疫性抗原(包括本发明多肽或其衍生物),并且通常与“药学上可接受的载体”组合,这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体的例子包括(但并不限于)蛋白质、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外,这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。
此外,本发明的疫苗组合物还可含有额外的佐剂。代表性的疫苗佐剂包括(但并不限于)以下种类:无机佐剂,如氢氧化铝,明矾等;合成佐剂,如人工合成的双链多聚核苷酸(双链多聚腺苷酸、尿苷酸)、左旋咪唑、异丙肌苷等;油剂,如弗氏佐剂、花生油乳化佐剂、矿物油、植物油等。
通常,可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂,例如液体溶液或悬液;还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中,以增强佐剂效果。
在本发明中,避孕疫苗可用常规方式适用于需要的对象。
用于表位鉴定的8肽或18肽融合蛋白原核表达质粒
本发明可采用了用于表位鉴定的8肽或18肽融合蛋白原核表达质粒,(8/18肽表达质粒)。其制备方法参见XuWX,etal.Minimalmotifmappingofaknownepitopeonhumanzonapellucidaprotein-4usingapeptidebiosynthesisstrategy.JReprodImmunol2009;81:9-16。
本发明8/18肽表达质粒具有表达方便经济,特别是插入片段(克隆)外送测序前确定阳性克隆方法简便等优点,还适合用抗重组蛋白抗血清进行表位扫描作图,产生的蛋白印迹ECL显色结果清晰可靠,经得起重复验证,其效果验证参见XuWX,etal.MappingofminimalmotifsofB-cellepitopesonhumanzonapellucidaglycoprotein-3.ClinDevImmunoldoi:10:1155/2012/831010。换言之,实现用抗重组蛋白多抗鉴定出一靶蛋白上全部或接近全部的表位。
本发明的有益效果:
1.本发明鉴定了ZP4蛋白的一组最小基序表位肽,其可特异性地与抗ZP4抗体进行结合。
2.本发明的多肽可组合应用于鉴定样品(尤其是血清样品)中是否存在抗ZP4抗体,从而诊断妇女ZP自身免疫不孕症;由于多肽抗原是高度特异性的,且可组合应用,因此可提高检测的灵敏度和特异性。
3.本发明表位肽还可用于制备抗生育的ZP避孕疫苗组合物,任一多肽都排除了它们中可能套叠存在的ZP特异致病性T细胞表位(长度在9肽-30肽之间,因而本发明多肽的应用可避免卵巢炎等副作用的产生,更具安全和有效性。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1:兔抗人ZP4C抗血清的制备
材料和方法:
1.人ZP4基因克隆由美国国立卫生院细胞和发育生物学实验室JurrienDean博士赠送。热诱导表达质粒pSY621和pXXGST-1由的构建分别见沈芸,应康,徐万祥,谢毅:大肠杆菌高效表达载体pSY621的构建.复旦学报(自然科学版)2000;39(3):313–317;XuWX,etal.Minimalmotifmappingofaknownepitopeonhumanzonapellucidaprotein-4usingapeptidebiosynthesisstrategy.JReprodImmunol2009;81:9-16。大肠杆菌BL21(DE3)菌株由复旦大学遗传工程国家重点实验室保藏。
2.鼠抗huZP4单抗MA-1662的制备见BukovskyA,GuptaSK,etal.Productionofmonoclonalantibodiesagainstrecombinanthumanzonapellucidaglycoproteins:utilityinimmunolocalizationofrespectivezonaproteinsinovarianfollicles.JReprodImmunol2008;78:102-114。
3.限制性内切酶EcoRI、BamHI、SalI、Taq酶和T4DNA连接酶购自日本TaKaRaBiotechnology公司,预染蛋白分子量标准、辣根过氧化酶标记的羊抗鼠和羊抗兔二抗(IgG/HRP)、二氨基联苯胺(DAB)和0.2μm硝酸纤维素膜购自上海生工生物技术服务公司。免疫印迹化学发光ECL检测试剂盒购自GE公司。QIAprepspinminiprepKit质粒抽提试剂盒、QIAquickPCR产物纯化试剂盒和quick凝胶回收试剂盒购自德国QIAGEN公司。主动免疫用完全和不完全弗氏佐剂购自美国Sigma公司。
4.三只新西兰雄性白兔购自上海BK实验动物有限公司。
兔抗血清制备
1.以人ZP4克隆质粒为模板,用设计的两端分别为EcoRI和TAA-SalI酶切位点的两对引物分别PCR扩增出人ZP4N58-234和ZP4C227-463两个编码基因大片段;用EcoRI和SalI双酶切后,经琼脂糖电泳割胶回收两个DNA大片段后,重组插入经用同样两个限制酶双酶切的热诱导pSY21原核表达质粒;在含氨苄青霉素的LB平板上挑取转化重组ZP4C克隆,外送DNA测序;
2.经DNA测序验证的克隆进行靶蛋白热诱导表达,回收3ml热诱导菌总蛋白进行SDS-PAGE电泳和用MA-1662单抗的免疫印迹试验;
3.在确认人ZP4C表达后,再次进行放大到200mlLB培养液水平的热诱导靶蛋白表达,收集细菌总蛋白进行制备胶SDS-PAGE电泳;从凝胶上切割目的表达条带放入含电泳缓冲液的透析袋中,在琼脂糖电泳槽上进行电泳(以使表达蛋白跑出凝胶加入缓冲液);从透析袋中吸取缓冲液进行冷冻干燥;用少量PBS缓冲液溶解蛋白后进行纯化蛋白的定量SDS-PAGE电泳(以标准牛血清靶蛋白为对照物)。此步操作反复多次,直至纯化获得足够量的免疫用抗原;
4.用电泳均一度达到90%以上的1mg重组人ZP4C蛋白加弗氏完全佐剂分别主动免疫新西兰白兔,两周后用0.5mgZP4C蛋白和不完全弗氏佐剂加强免疫三次(间隔两周)。第三次加强免疫后一周后抽取少量免疫兔血清进行ELISA法抗体滴度测定,在抗血清稀释度(抗体滴度)达到1:100,000上时杀死兔抽取各兔全部血清(20ml左右),储存于-20℃冰箱备用。实际抗体滴度达到1:512,000,符合常规靶蛋白线性表位扫描作图鉴定的要求。
实施例2用18肽的靶蛋白第一轮表位扫描作图
材料:
1.相关实验材料见实施例1部分
2.两端分别为BamHI和SalI粘性末端,中间为各18肽编码DNA序列加TAA终止密码子的正负链DNA片段由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
3.系列18肽编码DNA序列依据人ZP4蛋白编码基因和蛋白质氨基酸序列公开信息(HarrisJD,etal.CloningandcharacterizationofzonapellucidagenesandcDNAsfromavarietyofmammalianspecies:theZPA,ZPBandZPCgenefamilies.DNASeq1994;4:361-393)。
方法(抗原性(反应性)18肽(融合蛋白)的鉴定):
1.在用兔抗重组人ZP4C抗血清验证可识别重组人ZP4C蛋白的免疫印迹试验后,设计跨越可被兔抗重组ZP4C蛋白抗血清识别的人ZP4C全长度序列相互重叠10个氨基酸残基的系列18肽(编号P22-P49)编码DNA正负链片段(正链5'-端加5'-gatcc,3'-端加taag-3';负链5'-端加5'-tcgactta,3'-端加g-3'),外送DNA化学合成;
2.将1或2个OD的互补正负链片段用ddH2O溶解成20μmol/μl储存液(根据DNA合成报告单数据);各取10μl储存液和20ddH2O于1.5mlEppendorf管中,94℃水浴加热5min,自然降至室温后,在15μl反应体积中吸入2μl退火片段、1μl约200ng/μl经BamHI和SalI双酶切的pXXGST-1质粒、1μlT4DNA连接酶和其1.5μl缓冲液,连接过夜;连接液转化感受态BL21(DE3)宿主菌,涂布含Amp的LB平板上,于37℃培养过夜;第二天挑取氨苄LB平板上长出的单克隆转接3mlLB培养液诱导表达,以由pXXGST-2表达的GST188蛋白为对照,经15%SDS-PAGE分析确认各表达的GST188-18肽(P22-P49)融合蛋白(与对照蛋白电泳迁移率相差约2个kDa),挑取各重组克隆外送进行DNA测序验证;
3.将插入片段测序结果正确的克隆接种加入Amp的3mlLB培养液中,于30℃振荡培养过夜,翌日晨按1/50比例转接新鲜含Amp的LB培养液中,30℃振荡培养2-3h至菌体浓度达到OD值0.6-0.8后,调高温度至42℃热诱导4h,离心收集菌体,加上样裂解液煮沸5min备用;
4.将诱导的细菌总蛋白样品同时走15%SDS-PAGE,电泳结束后,一块凝胶用考马斯亮蓝染色(图1A),二块凝胶进行硝酸纤维素膜电转移(100mA)2h,用丽春红染色转印迹膜2min,在目的短肽融合蛋白条带处用针头打孔标记,用水冲洗掉丽春红染色;
5.印迹膜用PBS缓冲液反复洗涤四次,用5%脱脂奶粉封闭过夜,PBS缓冲液洗涤四次,分别在8-10ml反应液中加入1μl一抗兔抗人ZP4C抗血清,室温反应2h,PBS缓冲液洗涤后加入5μl二抗羊抗兔IgG/HRP(1:2000稀释),室温反应1h,用PBS缓冲液洗涤后进行ECL化学发光显色。
结果:依据免疫印迹结果确认P23-P25、P30-34、P39-40、P42-43、P46和P49为反应性18肽融合蛋白(图1B)。
实施例3人ZP4C中两个精细表位肽的鉴定
材料
1.相关实验材料见实施例1部分
2.两端分别为BamHI和SalI粘性末端,中间为各8肽编码DNA序列加TAA终止密码子的正负链DNA片段由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
方法
1.依据实施例2中P30-P31和P33-P34两个相邻反应性18肽,设计跨越覆盖它们全长度序列相互重叠7个氨基酸残基的系列8肽(编号P110-P122和P134-P146,图3B中仅显示P134-P141)编码DNA正负链片段(正链5'-端加5'-gatcc,3'-端加taag-3';负链5'-端加5'-tcgactta,3'-端加g-3'),外送DNA化学合成;
2-5.从系列8肽(融合蛋白构建)到两个精细表位基序鉴定步骤同实施例2的相应步骤。
结果:依据免疫印迹中产生三个和二个抗原抗体反应性8肽(图3A)结果,分别确定人ZP4-2表位的抗体识别表位最小基序为FTLPPP(SEQIDNO.:2)(图3B)。
实施例3ZP4最小基序短肽的鉴定
采用实施例2中步骤7-9同样的方法,对ZP4大片段蛋白继续进行最小表位鉴定,确定ZP4-2~ZP4-4表位的最小基序如SEQIDNO.:1-6所示,而表2中的SEQIDNO.:7-18和图2-7显示的是在鉴定过程中具有同样抗原抗体反应性的、含有SEQIDNO.:1-6最小基序的氨基酸序列。
表2
SEQ ID NO.: | 氨基酸序列 |
1 | RAVYEN |
2 | FTLPPP |
3 | PLTLELQ |
4 | DKNYGSY |
5 | HRTDPYL |
6 | SFVNPTVE |
7 | GDRAVYEN |
8 | DRAVYENE |
9 | RAVYENEL |
10 | QVFTLPPP |
11 | VFTLPPPF |
12 | FTLPPPFP |
13 | GPLTLELQ |
14 | PLTLELQI |
15 | KDKNYGSY |
16 | DKNYGSYY |
17 | LHRTDPYL |
18 | HRTDPYLG |
讨论
在用非依据表位最小基序肽构建的第一代人ZP多表位肽抗原(徐万祥等.人卵透明带蛋白多表位嵌合肽抗原及其制备方法.专利号:ZL200910196694.X)的ELISA测定中,对照血清低稀释度(1;20-1:160)下的吸光OD值高达0.4-0.6(虽然阳性血清OD值接近它的二倍),在1:640-1:2560稀释度下才显示正常的本底值。为了分析产生这一高OD值的原因,特用各组合的单表位肽(融合蛋白)和二例正常男女对照血清进行了蛋白印迹试验,结果其中5个大于8个残基的单表位肽均可被低稀释度对照血清识别,而改用它们的含最小基序8肽(融合蛋白)后则不再被识别,从而解释了对照血清产生高OD值现象是由体内不明抗原所产生抗体的交叉反应性所致,并提示构建高特异性高灵敏度多表位肽检测抗原,最好选用基于各组合表位的最小基序肽。
因此,本发明人通过原核表达8/18肽融合蛋白,新鉴定出ZP4蛋白上6个表位,包括另外13个表位肽(已另案申请申请了两个发明专利,专利申请号:201210145968.4和201210161060.2),从而为构建第二代ZP抗体检测抗原(以提高检测抗ZP蛋白抗体的灵敏度与特异性和筛选更多暴露ZP表面表位标志物)奠定了基础。
此外,当前用ZP避孕疫苗一个值得探索的方向显然就是研制重组ZP多表位肽抗原。而要具体予以实施,就有必要对新近被证明是人精子第二受体的人ZP4蛋白(先前被命名为ZPB或ZP1。ChiuPC,etal.Effectsofnativehumanzonapellucidaglycoprotein-3and-4onacrosomereactionandzonapellucidabindingofhumanspermatozoa.BiolReprod2008;79:869-877)开展表位扫描作图和精细表位基序鉴定,因为其意义在于可提供更多基于表位最小基序(可排除可能套叠存在的ZP特异致病性T细胞表位,因为T细胞表位残基数在9个残基以上)的重组多表位肽疫苗原的候选表位。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (8)
1.一种来自人卵透明带蛋白-4(人ZP4蛋白)227位-463位的分离的短肽,其特征在于,所述短肽的结构如式I所示:
X1-X-X2
式I,
并满足以下特征:
(a)式I中X为6个氨基酸的核心片段;
(b)式I中X1、X2为无、1或2个氨基酸,且X1和X2氨基酸个数总和≤2;
(c)所述的核心片段的序列为SEQIDNO.:2;和
(d)所述的短肽具有与抗人ZP4C抗体结合的活性;
其中,“-”表示肽键或肽接头。
2.如权利要求1所述的短肽,其特征在于,所述的短肽选自如SEQIDNO.:10-12所示的短肽。
3.一种分离的肽集合,其特征在于,所述的肽集合由选自下组的肽或多肽构成:一种或多种选自权利要求1所述的短肽;和/或除SEQIDNO.:2以外的分离的人ZP4蛋白线性表位肽。
4.如权利要求3所述的肽集合,其特征在于,所述表位肽包括选自如SEQIDNO.:1、3-18所示的序列。
5.权利要求3或4所述肽集合的用途,其特征在于,用于制备检测抗人ZP4蛋白抗体的试剂或试剂盒,其中,所述的试剂或试剂盒用于诊断是否由ZP自身免疫导致的妇女不孕。
6.权利要求3或4所述肽集合或权利要求1所述的短肽的用途,其特征在于,用于制备避孕疫苗组合物。
7.一种避孕疫苗组合物,其特征在于,所述的避孕含有安全有效量的权利要求3或4所述的肽集合或权利要求1所述的短肽,以及药学上可接受的载体。
8.一种非治疗目的的避孕方法,其特征在于,向所需的对象施用安全有效量的权利要求7所述的避孕疫苗组合物。
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