KR101920961B1

KR101920961B1 - 다중 진단 키트

Info

Publication number: KR101920961B1
Application number: KR1020160027066A
Authority: KR
Inventors: 김윤원; 강희근; 김영진; 박성만; 김민수; 박상진; 최은지; 이남택; 허영택; 서원준
Original assignee: 주식회사 이뮨메드
Priority date: 2016-03-07
Filing date: 2016-03-07
Publication date: 2018-11-21
Also published as: MY174791A; WO2017155160A1; CN107167606B; KR20170104260A; CN107167606A

Abstract

본 발명의 실시예들에 따른 다중 진단 키트는, 스트립을 포함하고, 상기 스트립은 오리엔티아 쯔쯔가무시 길리암, 카프, 및 카토의 56kDa의 융합 단백질(cr56) 및 오리엔티아 쯔쯔가무시 강원의 56kDa의 단백질(kr56)을 포함하는 쯔쯔가무시 항원 단백질, 렙토스피라 항원, 및 신증후출혈열 항원 단백질을 포함한다.

Description

다중 진단 키트{Multiple Diagnostic kit}

본 발명은 다중 진단 키트에 관한 것이다.

일반적으로 쯔쯔가무시병, 렙토스피라증, 및 신증후출혈열 등의 질병을 진단하기 위한 방법으로는 진단 스트립에 상기 질병이 의심되는 환자의 혈액이나 소변 등의 시료를 묻혀 상기 스트립에 고정된 물질과의 반응을 판단하여 상기 질병의 감염 여부를 확인하는 방법이 많이 사용되고 있다.

그러나 상기와 같은 종래기술은 단일 질병에 한하여 진단할 수 있고, 복수의 질병의 감염 여부를 확인하기 위해서는 개별적으로 검사를 실시해야 하고, 복수의 시료를 주입하여야 하므로 진단 과정이 복잡해지는 문제점이 있다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 쯔쯔가무시병, 렙토스피라증, 및 신증후출혈열의 감염 여부를 신속하고 간편하게 진단할 수 있는 다중 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 목적들은 다음의 상세한 설명과 첨부한 도면으로부터 명확해 질 것이다.

상기 렙토스피라 항원은 렙토스피라균의 지질다당류(LPS)로부터 제조된 핵심 다당류(cord polysaccharide) 및 0-특이적 곁사슬(0-specific side chain)을 포함할 수 있다.

상기 신증후출혈열 항원 단백질은 진핵세포로부터 제조된 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열을 가지는 수청바이러스로부터 제조된 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid protein)을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예들에 따르면, 다중 진단 키트는 쯔쯔가무시병, 렙토스피라증, 및 신증후출혈열의 감염 여부를 진단할 수 있다. 상기 다중 진단 키트는 한 번의 시료 주입으로 복수의 질병의 감염 여부를 동시에 진단할 수 있다. 또, 상기 다중 진단 키트는 비특이적 항체를 제거하므로 높은 정확도의 진단 결과를 얻을 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 진단 키트를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 진단 키트의 스트립을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 쯔쯔가무시 항원 단백질 농도에 따른 키트 반응을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 쯔쯔가무시 항원 단백질 조성에 따른 키트 반응을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 patoc 및 lai에서 분리한 다당류의 SDS-PAGE(A) 및 웨스턴 블로팅(B) 결과로 정제한 다당류의 항원성을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 수청바이러스의 S 분절에 있어서 뉴클레오캡시드 단백질, 전체 단백(Complete NP; CNP) 및 파편단백(Truncated NP; TNP)의 유전자 구조를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 반응 후의 단편단백(TNP)의 DNA 밴드(약 370bp) 및 전체단백(CNP)의 DNA 밴드(약 1300bp)를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 단편단백(TNP) DNA 및 전체단백(CNP) DNA를 pGem-T-Easy PCR 클로닝 벡터에 클로닝한 것을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 N-말단에 His-Taq를 가지는 바큘로바이러스 플라스미드 벡터에 pGT-SooV2-TNP 및 pGT-SooV2-CNP의 PCR산물을 클로닝한 것을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 pBac-SooV2-TNP 및 pBac-SooV2-CNP를 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템을 이용하여 Bac-SooV2-TNP와 Bac-SooV2-CNP로 제작한 것을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 단편단백(TNP)의 분리 검출을 위해 환자 및 정상인 혈청을 이용한 웨스턴 블롯 실시 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 단편단백(TNP) 및 전체단백(CNP)의 정제된 분획에 대한 웨스턴 블롯을 실시한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 실시예들을 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명의 목적, 특징, 장점은 이하의 실시예들을 통해 쉽게 이해될 것이다. 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고, 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 따라서, 이하의 실시예들에 의하여 본 발명이 제한되어서는 안된다.

본 명세서에서 제1, 제2 등의 용어가 다양한 요소들(elements)을 기술하기 위해서 사용되었지만, 상기 요소들이 이 같은 용어들에 의해서 한정되어서는 안 된다. 이러한 용어들은 단지 상기 요소들을 서로 구별시키기 위해서 사용되었을 뿐이다. 또, 어떤 요소가 다른 요소 위에 있다고 언급되는 경우에 그것은 다른 요소 위에 직접 형성될 수 있거나 또는 그들 사이에 제3의 요소가 개재될 수도 있다는 것을 의미한다.

도면들에서 요소의 크기, 또는 요소들 사이의 상대적인 크기는 본 발명에 대한 더욱 명확한 이해를 위해서 다소 과장되게 도시될 수 있다. 또, 도면들에 도시된 요소의 형상이 제조 공정상의 변이 등에 의해서 다소 변경될 수 있을 것이다. 따라서, 본 명세서에서 개시된 실시예들은 특별한 언급이 없는 한 도면에 도시된 형상으로 한정되어서는 안 되며, 어느 정도의 변형을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 사용된 용어, '쯔쯔가무시병'은 오리엔티아 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi)가 병원성을 일으키는 질환을 말한다.

본 명세서에서 사용된 용어, '렙토스피라증'은 렙토스피라(Leptospira) 속의 병인성나선균이 일으키는 질환을 말한다.

본 명세서에서 사용된 용어, '신증후출혈열'은 한탄바이러스와 서울바이러스에 의하여 유발되는 질환을 말한다.

본 명세서에서 사용된 용어, '진단'은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 말하며, 본 발명의 목적상, 진단은 쯔쯔가무시병, 렙토스피라증, 및 신증후출혈열을 확인하는 것을 말한다.

본 명세서에서 사용된 용어, '시료'는 쯔쯔가무시병, 렙토스피라증, 및 신증후출혈열이 의심되는 인간을 포함한 포유동물의 혈액, 혈청, 및 혈장 등을 말한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 진단 키트를 나타내고, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 진단 키트의 스트립을 나타낸다.

도 1 및 도 2를 참조하면, 다중 진단 키트(10)는 스트립(100)을 포함할 수 있고, 스트립(100)은 제1 스트립(100a) 및 제2 스트립(100b)을 포함할 수 있다.

제1 스트립(100a) 및 제2 스트립(100b)은 시료 내의 쯔쯔가무시 항체, 렙토스피라 항체, 및 신증후출혈열 항체를 검출할 수 있다. 제1 스트립(100a)은 쯔쯔가무시 IgM 항체, 렙토스피라 IgM 항체, 및 신증후출혈열 IgM 항체를 검출할 수 있고, 제2 스트립(100b)은 쯔쯔가무시 IgG 항체, 렙토스피라 IgG 항체, 및 신증후출혈열의 IgG 항체를 검출할 수 있다.

제1 스트립(100a) 및 제2 스트립(100b) 각각은 지지부재(110), 반응막(120), 샘플패드(130), 골드 컨쥬게이트 패드(140), 전반응선(150), 반응선(160), 대조선(170), 및 흡수패드(180)를 포함할 수 있다.

지지부재(110)는 스트립(100)의 베이스층으로, 지지부재(110) 상에는 반응막(120), 샘플패드(130), 골드 컨쥬게이트 패드(140), 및 흡수패드(180)가 배치될 수 있다.

반응막(120)은 니트로셀룰로오스막일 수 있다. 반응막(120)에는 전반응선(150), 반응선(160) 및 대조선(170)이 배치될 수 있다. 전반응선(150), 반응선(160) 및 대조선(170)은 2.0 내지 4.5mm의 간격으로 배치될 수 있다.

샘플패드(130)는 샘플주입구(200)를 통해 주입된 상기 시료가 흡수될 수 있다. 제1 스트립(100a)의 샘플패드(130)는 50mM Tris(pH 8.0), 1% Tween 20, 0.5M NaCl, 0.1% NaN₃를 포함하는 용액에 담가 흡수시킨 후에, 건조하여 제조될 수 있다. 제2 스트립(100b)의 샘플패드(130)는 50mM Tris(pH 8.0), 1% Tween 20, 0.2% BSA, 0.1% NaN₃를 포함하는 용액에 담가 흡수시킨 후에, 건조하여 제조될 수 있다.

골드 컨쥬게이트 패드(140)는 샘플패드(130)와 겹쳐지게 배치될 수 있다. 샘플패드(130)에 흡수된 상기 시료는 모세관 현상에 의해 골드 컨쥬게이트 패드(140)로 이동할 수 있다.

골드 컨쥬게이트 패드(140)는 표식자 항체를 포함할 수 있다. 상기 표식자 항체는 항-인간 IgM 컨쥬게이트 골드(Anti-human IgM conjugated gold), 항-인간 IgG 컨쥬게이트 골드(Anti-human IgG conjugated gold), 및 닭 IgY 컨쥬게이트 골드를 포함할 수 있다. 상기 항-인간 IgM 컨쥬게이트 골드는 OD 1 내지 3의 농도로 포함될 수 있고, 상기 항-인간 IgG 컨쥬게이트 골드는 OD 2 내지 4의 농도로 포함될 수 있으며, 상기 닭 IgY 컨쥬게이트 골드는 OD 0.1 내지 1의 농도로 포함될 수 있다.

제1 스트립(100a)은 상기 항-인간 IgM 컨쥬게이트 골드 및 상기 닭 IgY 컨쥬게이트 골드를 포함할 수 있고, 제2 스트립(100b)은 상기 항-인간 IgG 컨쥬게이트 골드 및 상기 닭 IgY 컨쥬게이트 골드를 포함할 수 있다.

상기 표식자 항체는 상기 쯔쯔가무시 항체, 상기 렙토스피라 항체, 및 상기 신증후출혈열 항체와 결합되어 복합체를 형성할 수 있다. 골드 컨쥬게이트 패드(140)는 반응막(120)과 겹쳐지게 배치되어, 상기 복합체가 반응막(120)으로 이동할 수 있다. 상기 쯔쯔가무시 항체, 상기 렙토스피라 항체, 및 상기 신증후출혈열 항체와 결합하지 않은 나머지 상기 표식자 항체는 반응막(120)으로 이동할 수 있다.

상기 표식자 항체는 색채입자를 포함할 수 있다. 상기 색채입자는 콜로이드성 금 입자, 칼라 유리, 및 플라스틱 비드(bead)일 수 있다.

반응선(160)은 제1 반응선(161), 제2 반응선(162), 및 제3 반응선(163)을 포함할 수 있다.

제1 반응선(161)은 렙토스피라 항원을 포함할 수 있다. 상기 렙토스피라 항원은 렙토스피라균의 지질다당류로부터 유래한 핵심 다당류 및 0-특이적 곁사슬을 포함할 수 있다. 상기 렙토스피라 항원은 2 내지 4 mg/ml의 농도로 포함될 수 있다.

상기 시료 내에 상기 렙토스피라 항체가 있는 경우, 골드 컨쥬게이트 패드(140)에서 상기 렙토스피라 항체와 상기 표식자 항체가 결합되어 복합체가 형성될 수 있다. 상기 복합체가 제1 반응선(161)을 통과할 때, 상기 렙토스피라 항체와 제1 반응선(161)의 상기 렙토스피라 항원이 결합될 수 있다. 상기 결합에 의해 상기 표식자 항체의 상기 색채입자가 제1 반응선(161)에 침전되면서 붉은 보라색 밴드를 형성할 수 있다.

제2 반응선(162)은 쯔쯔가무시 항원 단백질을 포함할 수 있다. 상기 쯔쯔가무시 항원 단백질은 오리엔티아 쯔쯔가무시 길리암, 카프, 및 카토의 56kDa의 유전자 재조합 단백질과 오리엔티아 쯔쯔가무시 강원의 56kDa의 단백질이 5:3의 부피비로 혼합될 수 있다. 상기 쯔쯔가무시 항원 단백질은 0.4 내지 0.8 mg/ml의 농도로 포함될 수 있다.

상기 시료 내에 상기 쯔쯔가무시 항체가 있는 경우, 골드 컨쥬게이트 패드(140)에서 상기 쯔쯔가무시 항체와 상기 표식자 항체가 결합되어 복합체가 형성될 수 있다. 상기 복합체가 제2 반응선(162)을 통과할 때, 상기 쯔쯔가무시 항체와 제2 반응선(162)의 상기 쯔쯔가무시 항원 단백질이 결합될 수 있다. 상기 결합에 의해 상기 표식자 항체의 상기 색채입자가 제2 반응선(162)에 침전되면서 붉은 보라색 밴드를 형성할 수 있다.

제3 반응선(163)은 신증후출혈열 항원 단백질을 포함할 수 있다. 상기 신증후출혈열 항원 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 수청바이러스 유래 뉴클레오캡시드 단백질(CNP) 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 수청바이러스 유래 뉴클레오캡시드 단백질 단편(TNP)을 포함할 수 있다. 상기 신증후출혈열 항원 단백질은 0.1 내지 1.0 mg/ml의 농도로 포함될 수 있다.

상기 시료 내에 상기 신증후출혈열 항체가 있는 경우, 골드 컨쥬게이트 패드(140)에서 상기 신증후출혈열 항체와 상기 표식자 항체가 결합되어 복합체가 형성될 수 있다. 상기 복합체가 제3 반응선(163)을 통과할 때, 상기 신증후출혈열 항체와 제3 반응선(163)의 상기 신증후출혈열 항원 단백질이 결합될 수 있다. 상기 결합에 의해 상기 표식자 항체의 상기 색채입자가 제3 반응선(163)에 침전되면서 붉은 보라색 밴드를 형성할 수 있다.

상기 쯔쯔가무시 항체, 상기 렙토스피라 항체, 및 상기 신증후출혈열 항체와 결합하지 않은 나머지 상기 표식자 항체는 반응선(160)을 통과하여 대조선(170)으로 이동할 수 있다.

전반응선(150)은 제1 전반응선(151) 및 제2 전반응선(152)을 포함할 수 있다.

제1 전반응선(151)은 대장균 추출물을 포함할 수 있다. 상기 대장균 추출물은 제1 비특이적 항체와 결합될 수 있다. 상기 제1 비특이적 항체는 대장균 유래의 단백질과 결합되는 항체일 수 있다.

제1 전반응선(151)은 상기 쯔쯔가무시 항원 단백질에 포함되어 있는 상기 대장균 유래의 단백질과 상기 비특이적 항체가 결합하여 실제로 상기 쯔쯔가무시 항원 단백질에 대한 항체를 보유하고 있지 않음에도, 보유하고 있는 것으로 오판될 수 있는 가능성을 배제할 수 있다.

제2 전반응선(152)은 곤충세포 Sf(Spodoptera frugiperda) 추출물을 포함할 수 있다. 상기 곤충세포 Sf 추출물은 제2 비특이적 항체와 결합될 수 있다. 상기 제2 비특이적 항체는 곤충세포 Sf 유래의 단백질과 결합되는 항체일 수 있다.

제2 전반응선(152)은 상기 신증후출혈열 항원 단백질에 포함되어 있는 곤충세포 Sf21 유래의 단백질과 상기 비특이적 항체가 결합하여 실제로 상기 신증후출혈열 항원 단백질에 대한 항체를 보유하고 있지 않음에도, 보유하고 있는 것으로 오판될 수 있는 가능성을 배제할 수 있다.

대조선(170)은 대조군 단백질을 포함할 수 있다. 상기 대조군 단백질은 상기 표식자 항체와 결합될 수 있다. 상기 결합에 의해 상기 표식자 항체의 상기 색채입자가 대조선(170)에 침전되면서 붉은 보라색 밴드를 형성할 수 있다.

상기 대조군 단백질은 산양 항-닭 IgY 다클론 항체(Goat anti-chicken IgY), 토끼 항-산양 IgG 다클론 항체, 및 토끼 항-산양 IgM 다클론 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 일 수 있다. 상기 대조군 단백질은 0.1 내지 2 mg/ml의 농도로 포함될 수 있다.

흡수패드(180)는 반응막(120)을 따라 이동한 상기 시료의 잔량이 흡수될 수 있다. 흡수패드(180)는 반응막(120)과 겹쳐지게 배치될 수 있다.

쯔쯔가무시 항원 단백질의 실시예

실시예 1. 항원 단백질 발현 및 분리

1-1. 카이메릭 재조합 56kDa(cr56)의 단백질 발현

오리엔티아 쯔쯔가무시 길리암, 카프, 카토(Orientia tsutsugamushi Gilliam, Karp, Kato)의 주요 항원 부위를 포함하는 카이메릭 재조합 단백질(cr56)은 대한민국 특허공개 제 2002-0020281호의 실시예에 기재된 방법과 동일한 방법으로 발현 및 분리 정제하였다.

즉, 오리엔티아 쯔쯔가무시의 길리엄, 카프, 카토를 마우스 L-929 세포에서배양하여 수확한 후 정제한다. 정제된 균주를 효소 분해시킨 후 페놀 추출과 에탄올 침전으로 DNA를 정제한다. 또한, 오리엔티아 쯔쯔가무시 56kDa 단백 유전자의 염기서열을 근거로 하여, 길리엄, 카프, 카토 혈청형간 아미노산 서열이 30% 이상상동성을 보이는 단백 부위를 선택하여, 길리엄, 카프, 카토 주에서 각각 한쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제조한다. 이들 각각의 프라이머쌍을 가지고 상기에서 추출한 오리엔티아 쯔쯔가무시 DNA를 주형으로 하여 PCR 반응을 실시하여 길리엄, 카프 및 카토의 DNA 절편을 증폭시킨다. PCR 산물을 정제하여 pTYB12 벡터의해당 제한효소 절단 부위에 연결되도록 클로닝한다. 먼저 pTYB12 벡터에 길리엄의DNA 절편을 도입하여 벡터 pTG3를 제작하고, pTG3에 카프의 DNA 절편을 도입하여 벡터 pTGP1을 제작한 후, pTGP1에 카토의 DNA 절편을 도입하여 pTGPT2를 제작한다.또한, 벡터 pTGPT2로부터 길리엄, 카프 및 카토의 DNA 절편의 직렬 연결체를 절단하여 pET22b(+) 벡터에 도입하여 벡터 pETb7을 제작한다. 제작한 발현 벡터로 대장균을 형질전환하고, 형질전환된 대장균을 배양하여 융합 단백질 발현을 유도한다. 전기영동 및 웨스턴 블롯으로 확인한 후 발현된 융합 단백 항원을 분리 정제하였다.

1-2. 재조합 Kangwon 56kDa 단백( kr56 )의 발현

계통발생 분석(Phylogenic analysis) 결과(FEMA Microbiology Letters, 1999, 180:163-169)를 참고하면 전세계적 주혈청형(prototype)인 카프(Karp), 길리엄(Gilliam), 카토(Kato)와 연천(Yonchon) (Kangwon과 가장 유사)으로 크게 분류될수 있음을 고려할 때 이들 4가지 균주를 항원으로 이용하는 것이 매우 적절할 것으로 여겨졌다. 카프(Karp), 길리엄(Gilliam) 및 카토(Kato)는 cr56으로 제시된다. 또한 연천(Yonchon)은 유사한 강원(Kangwon)의 kr56으로 제시된다. 이에 본발명자들은 강원 56kDa 재조합단백질(kr56)을 카이메릭 재조합 단백(cr56)의 보조항원으로 사용하기로 하였다.

(1) Kangwon 56kDa protein (kr56) 발현의 개요

강원(Kangwon) 87-61의 주 항원 도메인(major antigenic domain)으로 알려진 부분 아미노산 84(250bp)부터 445(1,335bp)까지 NcoⅠ과 SalⅠ인식부위를 함유하도록 변형하여 프라이머 한 쌍을 제작하였으며, PCR 반응을 수행하였다. PCR 산물과 발현벡터 pET30a를 NcoⅠ과 SalⅠ 제한효소를 처리하여 절단한 다음, 이들을 서로 라이게이션 시켰다. 이 플라스미드를 대장균주 BL21에 형질전환 시킨 후 단백을 추출하였다. 상기 프라이머는 아래 표 1에 나타내었다.

프라이머 서열	Enzyme site	Cloning vector	폴리펩티드
F: 5'-CCATGGCGCCAGGATTTAGAGCA-3'	Nco I Sal I	pET30a*	48kDa
R: 5'-GTCGACCAAGACCAGCATAATATGAGAA-3'

*플라스미드 pET30a는 His-Tagged 융합 단백질을 발현함.

(2) 유전자의 클로닝 및 발현

중합효소 연쇄반응으로 증폭한 DNA (amino acid 84(250bp)부터 445 (1,335bp)까지 362 a.a. (total 1,086bp))를 1.2% 아가로즈 겔에서 전기영동한 다음 QIAGEN gel elution kit (QIAGEN Inc., USA)를 사용하여 회수하였다. UV 투과조명기(transilluminator)상에서 예상크기에 맞게 증폭된 밴드를 잘라내어 마이크로튜브로 옮겼다. 아가로즈 겔 부피의 3배량의 NaI 용액을 첨가한 다음 60℃에서 5분간 방치하여 겔을 완전히 녹였다. 여기에 글라스 밀크(glass milk)를 첨가하여 10초간 교반하였다. 이를 상온에서 17,000 g(Hanil, AI.5S-24,12,000rpm)로 1분간 원심분리한 다음 상층액을 제거하였다. 마이크로튜브를 상온에서 5분간 방치하여 건조시킨 다음 elution buffer를 첨가하여 교반한 후, 17,000 x g(12,000rpm)로 원심분리하여 상층액을 새로운 마이크로튜브로 옮겼다. 이렇게 정제된 PCR 산물과pET30a 백터를 제한효소 NcoⅠ과 SalⅠ으로 완전절단한 후, Geneclean kit Ⅱ를 이용하여 동일한 방법으로 회수하였다. 절단된 백터 100ng과 절단된 PCR 산물 100ng을 혼합하고, 여기에 10배 농도의 리가제 완충액 (250mM Tris-HCl pH 7.8, 100mM MgCl2, 20mM DTT, 4mM ATP)과 리가제를 혼합하여 4℃에서 18시간 동안 반응시켰다.

(3) 적격세포(competent cell) 제작 및 형질전환

LB 배지에서 18시간 배양한 대장균 BL21을, LB 배지에 100배 희석하여 600nm에서 흡광도가 0.3이 될 때까지 재배양하였다. 얼음 속에서 30분간 방치한 후 배지상층액을 버리고, 0.1M CaCl2를 배지의 1/2 부피가 되도록 첨가하여 대장균을 부유시켰다. 얼음 속에서 1시간 동안 방치하고, 10분 동안 2,000 g(4,100rpm)에서 원심분리한 후, 배양한 배지의 1/10부피의 0.1M CaCl2로 부유하여 이를 형질전환에 사용하였다.

(4) 형질전환

상기 (3)에서 제작한 리게이션 산물과 적격세포(competent cell)를 혼합하여얼음 속에서 방치한 후 42℃에서 1분 30초간 열충격을 주었다. LB 배지를 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양액을 LB 한천 평판배지에 접종한 후 37℃에서 배양하였다.

(5) 형질전환된 대장균의 plasmid DNA 분리

형질전환된 대장균 단일집락을 카나마이신(Kanamycin)이 함유된 LB배지에 접종하여 37℃에서 진탕배양하였다. 플라스미드 DNA 추출은 AccuPrep Plasmid Extraction kit를 이용하였다. 배양액을 상온에서 750g (2,500rpm)로 10분간 원심분리한 다음 세포침전물만 회수하였다. 여기에 resuspenstion buffer를 첨가한 다음 교반하여 lysis buffer를 첨가하고 상온에서 5분간 방치하였다. Neutralization buffer를 첨가하여 상온에서 방치한 후 17,000xg (12,000rpm)로 원심분리하여 상층액을 바인딩 컬럼튜브(binding column tube)로 옮겼다. 이를 상온에서 17,000xg (12,000rpm)로 원심분리한 다음 추출액을 제거하였다. 여기에 80% 에탄올을 분주하여 원심분리한 다음 바인딩 컬럼만을 새로운 튜브로 옮겼다. 여기에 Elution buffer를 분주하여 상온에서 방치한 후 원심분리하여 상층액을 새로운 마이크로튜브로 옮겼다.

(6) 단백질의 발현 및 분리

본배양배지에 종배양공정의 배양액을 접종하였다. 상기 접종은 37℃에서 이루어졌으며, 접종 후 1시간 45분동안 220 rpm 으로 교반되었다. O.D 값이 0.5 내지 0.6 의 값을 나타낼 때, IPTG를 0.5mM 접종하여 3시간 동안 배양하였다. 이후, 4℃에서 30분 동안 3,000rpm으로 원심분리하여, 펠렛에 1xbinding Buffer(6 M Urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM Imidazole)를 넣고 Sonicator를 사용하여 (pulse: 10 sec on, 20 sec off, time: 6 min X 2회 (중간에 한 번inverting), Amp.: 45%) 세포를 파쇄하였다. kr56은 4 ℃에서 15분 동안 14,000rpm으로 원심분리 (rotor 7 in autoclaved ultra centrifuge bottle)한 후, 상층액은 냉장 보관하고, 펠렛은 1X Binding buffer (1L Erlenmeyer flask 배양액 기준으로 50 ml)로 재현탁 하였다. Ice에서 1시간 동안 (30분 방치 후, inverting)놓아둔 후, 4 ℃에서 30분 동안 14,000 rpm으로 원심분리 (rotor 7 in autoclaved ultracentrifuge bottle)한 후, 상층액을 얻었다. 상층액은 1X Binding buffer (6M urea)로 2배 희석 후, 여과하여 (0.45 μm syringe filter) 4℃에 보관하였다.

(7) 단백질 정제

Hisbind 레진 (Novagen)을 컬럼에 2ml이 되도록 채운 후, 증류수와 1 X charge buffer, 1 X binding buffer를 사용해 컬럼을 준비하였다. 항원단백을 컬럼에 통과시킨 후, 1 X washing buffer로 세척하였다. 1 X Elution 버퍼 (6 M Urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 500 mM Imidazole)를 통과시켜 단백질을 1 ml씩 회수하였다. 각각 분획내의 단백질 농도는 BCA protein assay 을 이용하여 정량하였으며, Amicon Ultra 30K로 농축한 후에 BCA protein assay를 이용하여 정량하였다.

본 실시예 1의 쯔쯔가무시 항원 단백질에 포함되는 오리엔티아 쯔쯔가무시 강원 56kDa 단백질의 구체적인 아미노산 서열은 등록특허 제10-0796772호에 개시된 아미노산 서열을 참고할 수 있다.

실시예 2. 항원 농도에 따른 키트의 반응 (위양성 유무 판단)

상기 실시예 1에 따라 제조되는 쯔쯔가무시 항원 단백질을 각각 0.6 mg/ml, 0.9 mg/ml, 1.2 mg/ml 및 1.5 mg/ml 농도로 준비하였다. 각 농도의 쯔쯔가무시 항원 단백질을 포함하는 키트를 4개씩 준비하였다. 쯔쯔가무시병을 진단하는 표준진단시험법의 일종인 면역형광항체법을 이용하여 환자의 시료를 평가한 후, 음성 혈청 1개 (DK13)와, 양성 혈청 3개 (90-202, 00-350, 89-129)를 준비하여, 이를 서로 다른 항원 농도를 갖는 진단 키트에 각각에 적용하여 반응을 측정하였다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 쯔쯔가무시 항원 단백질 농도에 따른 키트 반응을 나타낸 것이다.

표 2는 쯔쯔가무시 항원 단백질 농도에 따른 키트 반응을 나타낸 것이다.

	음성혈청		양성혈청
	DK13		90-202		00-350		89-129
	IgM	IgG	IgM	IgG	IgM	IgG	IgM	IgG
IFA	-	-	++	+	+	+	++	+
0.6 mg/ml	-	-	++	+	+	+	++	+
0.9 mg/ml	+	+	++	+	+	+	++	+
1.2 mg/ml	+	+	++	+	+	+	++	+
1.5 mg/ml	+	+	++	+	+	+	++	+

표 2 및 도 3을 참조하면, 쯔쯔가무시 항원 단백질의 농도가 0.9, 1.2, 1.5 mg/mL인 진단 키트에서는 위양성이 나타났으나, 쯔쯔가무시 항원 단백질의 농도가 0.6mg/mL인 진단 키트 에서는 위양성이 나타나지 않았다.

실시예 3. 혼합 항원 조성에 따른 키트 반응

실시예 1의 쯔쯔가무시 항원 단백질을 0.6 mg/ml로 준비하고, 종래의 쯔쯔가무시 항원 단백질을 동일한 농도로 준비하였다. 종래의 쯔쯔가무시 항원 단백질은, cr56, kr56, 및 r21 단백질을 각각 5 : 2: 1 비율로 혼합된 것이다. 실시예 1의 쯔쯔가무시 항원 단백질을 포함하는 진단 키트와, 종래의 쯔쯔가무시 항원 단백질을 포함하는 진단 키트를 제조하여, 음성 혈청과 양성 혈청에 대한 반응도를 측정하였다. 대조군으로서, 각각의 음성 혈청과 양성 혈청은 IFA에 따른 Ab 역가가 측정되었다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 쯔쯔가무시 항원 단백질 조성에 따른 키트 반응을 나타낸 것이다.

표 3은 종래의 쯔쯔가무시 항원 단백질과 실시예 1의 쯔쯔가무시 항원 단백질 각각의 항체에 대한 반응 민감도를 - = 0 , + = 1 , ++ = 2 , +++ = 3 , ++++ = 4 와 같이 나타낸 것이다.

구분	음성혈청		양성혈청
	음성혈청		양성혈청1		양성혈청2		양성혈청3		양성혈청4		양성혈청5
	IgM	IgG	IgM	IgG	IgM	IgG	IgM	IgG	IgM	IgG	IgM	IgG
Indirect immunofluorescent antibody test(IFA)	-	-	640	80	640	80	640	1280	-	1280	640	80
종래의 쯔쯔가무시 항원 단백질 (cr56:kr56:r21:=5:2:1)	0	0	1	0.5	1	0.5	1	2	0	2	1	0.5
실시예 1의 쯔쯔가무시 항원 단백질 (cr56:kr56=5:3)	0	0	1.5	0.75	1.5	0.75	1.5	2.5	0	2.5	1.5	0.75

표 3 및 도 4를 참조하면, 쯔쯔가무시 항원 단백질에 r21이 포함되지 않고 kr56의 비율을 증가시킨 경우, 항체에 대한 반응 민감도가 향상되었다.

렙토스피라 항원의 실시예

실시예 4. 렙토스피라 항원 확보

4-1. 렙토스피라 균주 배양

EMJH(Leptospira medium base Ellinghausen McCullough Hohnson Harris)를 0.23g/90ml로 녹여 멸균한 후,leptospira enrichment EMJH 10ml을 첨가하여 배지를 만들었다. 이 배지에 렙토스피라균을 접종하여 30℃에서 5일간 진탕 배양하였다.

4-2. 렙토스피라 항원 제조

EMJH 배지에서 5일간 배양한 렙토스피라균을 4,000xg에서 20분간 원심분리하여 균체를 1X PBS buffer (137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 2mM KH2PO4)로 3회 세척한 후 100℃에서 1시간 동안 가열하였다. 여기에 단백분해효소(Proteinase) K가 150㎍/㎖이 되도록 처리하여 37℃에서 16시간 동안 반응 시켰다. 그 후 EGTA가 2mM이 되도록 첨가하여 70 ℃에서 15분간 반응 시킨 후, 4℃, 180,000xg로 2시간 동안 원심분리하였다. 침전물에 H2O를 가하여 부유시켜 지질다당류(lipopolysaccharide)를 제조하였다 (Westpha & Jann, 1965). 이렇게 정제된 LPS 항원에 아세트산이 1% 되도록 처리하여 100℃에서 1시간 동안 가온한 후 3,000xg로 20분간 원심 분리하고침전 부분인 지질 A(lipid A)를 제거하여 다당류 항원을 제조하였다. 제조된 항원은 에스케리시아 콜리(Escherichia coli)에서 정제된 LPS(Sigma)를 위 방법과 동일하게 처리하여 얻은 다당류를 대조군(standard)으로 사용하여 양을 측정하였다.

실시예 5. 렙토스피라 다당류의 항원성 조사

5-1. 웨스턴 블록 분석

SDS-PAGE는 1㎜ 또는 1.5㎜ 두께의 12% 겔을 만들어 Bio-Rad Protean II 전기영동장치를 사용하였다. 전기 영동된 겔로부터 단백질의 막(membrane)으로의 전사는 Bio-Rad Transblot cell을 사용하여 80V에서 30분간 실시하였다. 전사된 막(membrane)은 5% skim milk, 0.1% Tween 20을 첨가한 1× TBS buffer를 사용하여 블로킹하고, 1차 항체로는 가토 면역 혈청 (L. interrogans strain WH-19)을 사용하였으며, 2차 항체로는 horse-radish peroxidase conjugated anti-rabbit IgG (Bio-Rad)를 1: 10,000으로 희석하여 사용하였다. 면역 반응이 끝난 후 ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech)로 발색시켰다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 patoc 및 lai에서 분리한 다당류의 SDS-PAGE(A) 및 웨스턴 블로팅(B) 결과로 정제한 다당류의 항원성을 나타낸다.

도 5를 참조하면, Leptospira interrogans serovar lai의 다당류는 Leptospira interrogans serovar patoc strain Patoc과 SDS-PAGE gel profile에서 비슷한 양상을 나타냈고, 14kDa 이상의 다당류 성분이 lai와 patoc에서 공통적으로 존재하며, 항원으로 작용하는 것으로 추정되었다.

5-2. Dot blotting

항원 1ug (1ug/1ul)을 니트로셀룰로오스 막에 점적한 후, 37℃에서 1시간 동안 건조시킨다. 건조된 막을 5% skim milk-TBST로 1시간 동안 블로킹하였으며, 1차 항체인 환자 혈청은 1: 3,000으로 희석해 1시간 동안 반응시켰다. 2차 항체는 horse-radish peroxidase conjugate anti-human IgG를 1: 10,000으로 희석해 반응시켰다. 반응이 끝난 후 ECL kit를 사용해 발색시켜 MAT 결과와 비교하였다. 대부분의 환자 혈청에서 양성 시그널이 보이는 것을 확인되었다.

표 4는 MAT와 Dot-blotting 결과를 비교하여 나타낸 것이다.

Patient NO.	MAT		Dot-Blotting
Patient NO.	lai	canicola	Dot-Blotting
90-34	320	-	-
90-94	640	160	+++
90-227	1280	40	+++
91-23	-	20	-
91-121	-	20	+
91-211	320	-	+++
91-276	20	-	-
94-200	320	-	+
95-2	20	320	-
95-85	-	-	+
96-40	80	80	-
97-39	80	-	+
97-163	1280	80	++
97-212	1280	80	+++
97-330	80	160	+
98-111	640	80	+++
98-156	320	160	+++
98-166	640	-	++

5-3. 효소면역측정법(ELISA)

다당류(polysaccharide) ELISA는 Engvall과 Perlmann (1972)이 사용했던 방법을 기초로 하여 실시하였다. 0.01M PBS에 poly-L-lysine (10㎍/㎖)을 희석하여 플레이트(plate)를 전처리한 후 상온에서 24시간 동안 반응시켰다. 0.05% Tween 20이 포함된 PBS buffer로 2회 세척한 후 다당류를 PBS에 부유시켜 웰당 100㎕씩 플레이트에 처리하였다. 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 0.05% Tween 20이 포함된 PBS buffer로 3회 세척하고, 염소 혈청을 처리하여 37℃에서 블로킹하였다. 1차 항체는 렙토스피라증으로 확진된 20명의 환자 혈청과 20명의 정상인의 혈청을 사용하였으며, 2차 항체로는 horse-radish peroxidase conjugated anti-human IgG (Bio-Rad)를 1: 10,000으로 희석하여 사용하였다. 각 웰에 기질을 처리하여 발색을 관찰하고, ELISA reader를 사용하여 490nm에서 값을 측정하였다. 그 결과 렙토스피라 편모(Leptospira flagella) 재조합 단백질은 72~88%의 민감도와 88~90%의 특이도를 나타낸 것에 비하여, 본 다당류는 95%의 민감도와 95%의 특이도를 보여줌으로써 렙토스피라증의 조기 진단용 항원 후보로는 단백질보다 다당류가 우수함을 보여주었다.

표 5는 효소면역측정법을 이용하여 다당류의 민감도와 특이도를 나타낸 것이다.

Antigen	Polysaccharide
Antigen	patoc	lai
Sensitivity(%)^a	95	95
Sensitivity(%)^b	95	95

a : Number of sera of patients diagnosed by MAT : 20

b : Number of normal sera : 20

신증후출혈열 항원 단백질의 실시예

실시예 6. 수청바이러스 및 배양세포

국내 흰넓적다리붉은쥐(Apodemus peninsulae)에서 분리된 수청바이러스주(Soochong virus strain) SooV-2을 베로세포(Vero cell)에서 계대 배양하였다. 베로세포(Vero cell)의 증식과 유지에는 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 함유된 EMEM(Eagel's minimal essential medium)으로 5% CO2가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였으며, 90% 정도 단층 배양되었을 때 사용하였다.

실시예 7. 바이러스 RNA의 분리

수청 바이러스가 증식된 세포를 1,075g (3000rpm)으로 3분간 원심분리 한 후, Trizol LS(Gibco) 용액 750ul을 넣어 실온에서 5분간 방치한 후, 클로로포름을 200ul 첨가하고 잘 섞어준 후, 다시 실온에서 10분간 방치하였다. 4℃에서 17,000g (12,000rpm)으로 15분간 원심분리하여 침전물을 제거하고, 상층액에 동일 부피의 이소프로필 알코올을 첨가하고 실온에서 10분간 방치한 후, 다시 4℃에서 17,000g (12,000rpm)으로 15분간 원심분리하여 RNA를 침전시키고, 75% 에탄올로 한번 씻어 주었다. RNA 침전물을 공기 중에서 10분간 건조시킨 후 DEPC가 처리된 물에 녹였다.

실시예 8. cDNA 합성과 연쇄효소중합반응

도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 수청바이러스의 S 분절에 있어서 뉴클레오캡시드 단백질, 전체 단백(Complete NP; CNP) 및 파편단백(Truncated NP; TNP)의 유전자 구조를 나타내고, 도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 반응 후의 단편단백(TNP)의 DNA 밴드(약 370bp) 및 전체단백(CNP)의 DNA 밴드(약 1300bp)를 나타낸 것이다.

표 6은 수청바이러스 재조합 항원 생산을 위한 PCR 프라이머를 나타낸 것이다.

Primer	전체 단백(CNP)	파편 단백(TNP)
Foward primer	5' AGA TCTA ATG GCA ACT ATG GAG GAA TTG 3' (서열번호 4) <Bgl Ⅱ(AGATCT) ; AGATCT 첨가>	5' AGA TCTA ATG GCA ACT ATG GAG GAA TTG 3' (서열번호 6) <Bgl Ⅱ ; AGATCT 첨가>
Reverse primer	5' AAGC TTA TAG TTT TAA AGG TTC TTG GTT TG 3' (서열번호 5) <Hind Ⅲ(AAGCTT) ; AAGC 첨가>	5' A AGC TTA CCA GTC TGC AGT CTG ACC TGT 3' (서열번호 7) <Hind Ⅲ ; AAGCTTA 첨가>

도 6 및 표 6을 참조하면, 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid protein, NP)을 코딩하는 서열번호 1의 핵산서열(GenBank accession No. AY675350)로부터 cDNA를 합성하기 위해 실시예 7에서 분리한 RNA 용액 4 ul에 표 6의 각 프라이머 (10 pmole)를 1 ul씩, 5X reverse transcriptase buffer), 10mM dNTPs, 100pmole/ul Oligo(dT), 40units/ul RNasin, 200units/ul MMLV reverse transcriptase 혼합물을 넣어주었다. 30℃에서 10분간 반응을 시킨 후, 45℃에서 30분, 99℃에서 5분, 5℃에서 5분간 반응을 시켜 cDNA를 합성하였다.

PCR은 cDNA 산물 5ul, 10pmole primer 한쌍, 10mM dNTPs, 10X taq buffer, 5units/ul Taq polymerase를 잘 섞은 후 95℃ 5분, 52℃ 2분, 72℃ 2분을 주기로 1회 반응, 95℃ 1분, 52℃ 1분, 72℃ 1분을 주기로 5회 반응을 시켰다. 95℃ 1분, 60℃ 1분. 72℃ 1분을 주기로 20회 반응을 시켰으며, 95℃ 1분, 60℃ 1분, 72℃ 7분을 주기로 1회 반응시켜 DNA를 증폭하였다. 증폭된 DNA는 -20℃에서 보관하였다.

도 7은 PCR 반응 후의 단편단백(TNP)의 DNA 밴드(약 370bp) 및 전체단백(CNP)의 DNA 밴드(약 1300bp)를 나타낸 것이다.

도 7을 참조하면, 각 프라이머로 PCR 수행하여 파편단백(Truncated NP: TNP)의 DNA를 약 370bp에서 확인하였고, 전체단백(Complete NP: CNP)의 DNA도 약 1,300bp에서 band로 확인하였다.

실시예 9. 증폭 산물의 클로닝

도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 단편단백(TNP) DNA 및 전체단백(CNP) DNA를 pGem-T-Easy PCR 클로닝 벡터에 클로닝한 것을 나타낸 것이다.

도 8을 참조하면, 연쇄효소중합반응에 의해 증폭된 약 370 bp와 약 1,300 bp의 DNA를 아가로즈겔에서 전기용출(electroelution)하여 클로닝 벡터인 pGem-T-Easy PCR 클로닝 벡터(Invitrogen)에 클로닝하였다. 제한효소 Bgl Π와 Hind Ⅲ로 절단하여 TNP와 CNP의 DNA를 확인하였다. 이는 CNP(1287bp:37-1323)와 TNP(357bp:37-393) 폴리펩티드 생산을 위한 것이고, 이의 아미노산서열은 서열번호 2와 3에 나타내었다. TNP를 포함하는 369bp가 삽입된 플라스미드를 pGT-SooV2-TNP로, CNP를 포함하는 1299bp가 삽입된 plasmid를 pGT-SooV2-CNP로 명명하였다.

실시예 10. 발현벡터에 클로닝

도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 N-말단에 His-Taq를 가지는 바큘로바이러스 플라스미드 벡터에 pGT-SooV2-TNP 및 pGT-SooV2-CNP의 PCR산물을 클로닝한 것을 나타낸 것이다.

도 9를 참조하면, N-말단에 His-Taq이 포함된 발현 융합 벡터(expression fusion vector)인 pBlue-Bac-His2B (Invitrogen)를 제한효소 Bgl Π와 Hind Ⅲ로 처리하였으며, pGT-SooV2-TNP와 pGT-SooV2-CNP의 PCR 산물(product)도 제한효소 Bgl Π와 Hind Ⅲ로 처리하여 클로닝시켜 pBac-SooV2-TNP와 pBac-SooV2-CNP를 얻었다.

실시예 11. 재조합 바큘로바이러스(baculovirus)의 제작

도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 pBac-SooV2-TNP 및 pBac-SooV2-CNP를 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템을 이용하여 Bac-SooV2-TNP와 Bac-SooV2-CNP로 제작한 것을 나타낸 것이다.

도 10을 참조하면, pBac-SooV2-TNP와 pBac-SooV2-CNP는 Bac-N-Blue 바큘로바이러스 발현벡터 시스템(baculovirus expression vector system)을 이용하여 Bac-SooV2-TNP와 Bac-SooV2-CNP로 제작하였다

Log phase에 있는 Sf9 세포(2X10⁶개)를 60mm 디쉬에 부어 단층(monolayer)이 되게 하였다. 트랜스펙션 혼합물 (transfection mixture)을 준비하기 위해, 10ul (0.5ug)의 Bac-N-Blue^TM DNA를 마이크로원심분리기(microcentrifuge)에 넣고 아래의 용액을 넣었다.

pBac-SooV2-TNP 또는 pBac-SooV2-CNP (1ug/ul) : 4ul

Grace's insect media (without supplements or FBS) : 1 ㎖

Cellfectin reagent (mix well before use and always ) : 20 ul

실온에서 15분간 방치 하면서, 디쉬의 배지를 제거하고 supplement나 FBS가 함유되지 않은 Grace's insect media 2 ml을 첨가하였다가, 다시 모노레이어(monolayer)로부터 배지를 제거한 후, 준비된 트랜스펙션 혼합물을 60mm 디쉬에 방울방울 넣는다. 이 디쉬를 실온에서 4시간정도 방치한 후, TNM-FH medium 1 ml을 첨가하고 디쉬를 봉인하여 27℃에서 72시간 인큐베이션하였다. 이렇게 동시트랜스펙션(cotransfection)되어 복제된 재조합 바큘로바이러스를 바이러스 스톡(virus stock)으로 한다.

실시예 12. 재조합 바큘로바이러스 정제

종말점 희석법(End-point dilution method)에 의해 virus stock의 농도를 측정하였다.

바이러스의 농도(titer)를 결정하기 위한 종말점(end-point) 희석은 바이러스 접종액을 10^-5 내지 10^-8배까지 단계 희석하고, 96웰 플레이트에 각 웰 당 세포 1X10⁴개의 농도로 분주된 배양세포에 각 희석액을 접종하고 27℃에서 계속 배양하였다. 바이러스 농도는 바이러스가 감염된 웰과 감염되지 않은 웰의 비율로부터 계산하여 PFU(plaque Forming Unit)를 결정하였다.

순수한 바이러스의 선발을 위해서는 바이러스 접종액을 10^-2 내지 10^-8배까지 희석하고, 96웰 플레이트에 웰 당 세포 1X10⁴개의 농도로 분주된 배양세포에 각 희석액을 접종하고 27℃에서 계속 배양하였다. 접종 4일 후부터 세포내 다각체 형성 및 바이러스 감염유무를 현미경으로 관찰하여 최대 희석배수의 웰에 있는 바이러스를 선발하고, 동일한 방법으로 3회 이상의 순화과정을 거쳐 순수한 바이러스를 선발하였다.

실시예 13. 재조합 단백질의 발현 및 분리

곤충세포 Sf9 cell을 75㎠ 플라스크에 약 5 X 10⁶정도를 파종(seeding) 한 후, 5 MOI의 재조합 바이러스를 접종하였다. 감염 후 5일에 봉입체(inclusion body) 형성을 확인한 후 세포를 모두 수거하였다. 수거한 세포는 6,000g (7,000 rpm)으로 원심분리하여 침사를 모으고 1 X binding buffer (5 mM imidazole, 20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl)로 부유한 후, 초음파분쇄기로 18 Hz에서 15초간 6회 교반하였다. 23,400g (14,000rpm)에서 15분간 원심분리하여 상층액을 용해분획(soluble form)으로 보관하였다. 또한 침사인 비용해분획(insoluble form)을 6M Urea가 포함된 1 X binding buffer로 부유한 후 4℃에서 1시간동안 방치를 시켰다가 23,400g (14,000rpm)에서 30분간 원심분리를 하여 상층액(lysed pellet)을 수거하였다. 수거된 상층액(lysed pellet)을 His-bind 크로마토그라피를 통해 정제하였다(purified pellet). 용해분획(soluble form), 상층액(lysed pellet), 그리고 정제된 분획(purified pellet)을 SDS-PAGE를 시행하여 어느 분획에 재조합 단백이 존재하는지를 웨스턴 블롯을 실시하여 확인하였다. 대조로는 야생형 바이러스 감염세포의 용해분획(soluble form)을 사용하였다. 웨스턴 블롯을 수행하는데 1차 항체로는 신증후출혈열(HFRS) 환자 및 정상인 혈청을 사용하였다.

도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 단편단백(TNP)의 분리 검출을 위해 환자 및 정상인 혈청을 이용한 웨스턴 블롯 실시 결과를 나타낸 것이다. 아래쪽 화살표의 밴드는 단편단백의 부분적인 분해에 의한 것으로 보인다. 왼쪽 사진은 1차 항체로 신증후출혈열 환자혈청을, 오른쪽 사진은 1차 항체로 정상인의 혈청을 사용한 결과이다. (1 lane: 야생형 바큘로 바이러스를 감염시킨 세포의 용액분획, 2 lane: 재조합 바큘로바이러스를 감염시킨 세포의 용해분획, 3 lane: 세포의 비용해분획을 요소가 포함된 버퍼로 처리하고 원심분리한 후 상층액, 4 lane: 3을 정제한 분획)

도 11을 참조하면, TNP의 경우 세포 침사(insoluble form)에서 보다는 용해(soluble) 형태로 더 많은 단백질이 존재함을 확인하였다. TNP 분획인 22kDa의 특정 밴드(specific band) 외에 그 밑에 약하게 보이는 밴드에 대해서는 용해 분획(soluble form)뿐만 아니라 정제된 분획(purified pellet)에서도 환자혈청에 의한 웨스턴블롯 결과 강하게 나타남으로써 특이반응에 의한 결과인 것으로 추정되었다. 또한 정상인에 대해서는 두 밴드 모두 나타나지 않음으로써 이를 입증하였다. 아래 밴드는 TNP의 부분 분해(degradation)에 의한 것으로 추정되었다.

도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 단편단백(TNP) 및 전체단백(CNP)의 정제된 분획에 대한 웨스턴 블롯을 실시한 결과를 나타낸 것이다. (1 lane: 바이러스를 감염시키지 않은 세포, 2 lane: 바큘로바이러스를 감염시킨 세포, 3 lane: 전체단백(CNP)을 클로닝한 재조합 바큘로바이러스를 감염시킨 세포, 4 lane: 단편단백(TNP)을 클로닝한 재조합 바큘로바이러스를 감염시킨 세포, 5 lane: 전체단백(CNP)을 클로닝한 재조합 바큘로바이러스를 감염시킨 세포, 6 lane: 단편단백(TNP)을 클로닝한 재조합 바큘로바이러스를 감염시킨 세포)

도 12를 참조하면, CNP는 신증후출혈열(HFRS) 환자에만 반응하고 약 50kDa의 재조합 단백질을 생성함을 확인하였다.

실시예 14. His-bind 친화 크로마토그라피로 재조합 단백질의 정제

His-bind resin (Novagen)을 column에 2 ml이 되도록 채운 후, 증류수와 1 X charge buffer, 1 X binding buffer를 사용해 column을 준비하였다. 항원단백을 column에 통과시킨 후 1 X binding buffer (5 mM imidazole, 20 mM Tris-HCl pH 7.9, 0.5 M NaCl)와 1 X washing buffer (40 mM imidazole, 20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl)로 세척하였다. Elution buffer (300 mM imidazole, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-Cl pH 7.9)를 통과시켜 단백질을 1 ml씩 회수하였다. 각각 분획내의 단백질 농도는 롤리법을 이용하여 정량하였으며 SDS-PAGE와 Western blot을 하여 단백질을 확인하였다.

실시예 15. 재조합 단백질 분석

15-1. Western-blot

1 mm 또는 1.5 mm 두께의 10% gel에 정제한 재조합 단백을 웰당 10 ug씩 전기영동을 실행하였다. 전기영동한 겔을 Bio-rad transport 기계를 이용해 80 volt에서 40분간 트랜스퍼(transfer)하였다. 트랜스퍼(transfer)된 막(membrane)을 5% skim milk-TBST (Tris-buffered Saline Tween 20)로 1시간 동안 블로킹하였으며, 1차 항체인 환자 혈청은 1:3000으로 희석해 1시간동안 반응을 시켰다. 2차 항체는 Horse-radish peroxidase conjugate anti-human IgG를 1:10000으로 희석해 반응시켰다. 반응이 끝난 후 ECL kit를 사용해 발색시켰다.

웨스턴 블롯 결과, 재조합 CNP와 TNP는 신증후출혈열 환자 혈청에서는 CNP의 경우 50kDa, TNP는 22kDa 정도에서 반응을 하지만 일반 정상인 혈청과는 반응하지 않는 것으로 나타났다.

15-2. Dot-blot

니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)에 1 ug의 재조합 단백질을 점적하여 37℃에서 1시간 동안 건조시켰다. 건조된 막은 5% skim milk-TBST로 1시간 동안 블로킹하였으며, 1차 항체인 환자 혈청과 정상인 혈청을 1:3,000으로 희석해 1시간 동안 반응을 시켰다. 2차 항체인 Horse-radish peroxidase conjugate anti-human IgG를 1:10,000으로 희석해 반응시켰다. 반응이 끝난 후 ECL kit를 사용해 발색시켰다.

한탄바이러스 또는 서울바이러스에 감염된 신증후출혈열 환자 혈청을 가지고 Dot-blotting을 실시한 결과, 아래 표 7에 나타낸 바와 같이 CNP가 TNP보다는 양성 시그널(positive signal)이 강하게 나타나고 있으며, 일반 정상인 혈청과는 모두 반응을 하지 않는 것으로 나타났다.

HRFS patients serum No.	IFA value (HTN)	^aDot-blot Value
HRFS patients serum No.	IgG	TNP (IgG)	CNP (IgG)
2001-216	1280	+++	+++
2001-193	80	+	+
2001-36	160	++	+++
2001-42	1280	+++	+++
2000-449	1280	+++	+++
99-445	640	+++	+++
99-485	320	+	++
99-444	640	+++	+++
99-235	320	+	++

a : Data are presented as a strong positive(+++), middle positive(++) or scarcely positive(+) result by Dot-blot.

* Ten normal sera did not react with recombinant NP antigens

15-3. ELISA

재조합 단백항원을 1ug/ml이 되도록 0.05M 탄산염완충용액(pH 9.6)에 희석하여 96웰 마이크로플레이트에 코팅한 후 4℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 0.05% Tween 20이 포함된 인산완충용액(PBST)로 2회 세척한 후 3% BSA로 37℃에서 2시간동안 블로킹을 하였다. 1차 항체를 한탄(Hantaan), 서울(Seoul), 푸말라(Pummala) 또는 프로스펙트힐(Prospect Hill) 바이러스가 감염된 랫의 혈청을 희석하여 사용하였고, 2차 항체는 Horse-radish conjugate anti-rat IgG (IgM)를 1:6000으로 희석해 사용하였다. 발색기질용액으로 발색시킨 후 ELISA 판독기로 파장 490nm에서 OD를 측정하였다.

표 8에서 보는 것과 같이 재조합 항원 CNP는 한탄바이러스와 서울 바이러스에는 반응을 하지만, 푸말라바이러스와 프로스펙트힐바이러스와는 반응하지 않는 것으로 나타났다.

Rat Antisera against	Hantaan	Seoul	Pummala	Prospect Hill
Reactivity of CNP by ELISA	+++	+++	-	-

이제까지 본 발명에 대한 구체적인 실시예들을 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

10 : 다중 진단 키트 100 : 스트립
100a : 제1 스트립 100b : 제2 스트립
110 : 지지부재 120 : 반응막
130 : 샘플패드 140 : 골드 컨쥬게이트 패드
150 : 전반응선 151 : 제1 전반응선
152 : 제2 전반응선 160 : 반응선
161 : 제1 반응선 162 : 제2 반응선
163 : 제3 반응선 170 : 대조선
180 : 흡수패드 200 : 샘플주입구

<110> Immunemed Co. <120> Multiple Diagnostic kit <130> P160004 <140> 10-2016-0027066 <141> 2016-03-07 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1696 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> S(small) segment of Soochong virus <400> 1 tagtagtaga ctccctaaag agctacgata caaacaatgg caactatgga ggaattgcaa 60 aaggagatca atgcccatga gggtcaactt gtgatagcaa ggcaaaaagt aagggatgca 120 gaaagccaat atgagaagga tccagatgag ttgaaccaaa gagcattaac agacagagaa 180 ggggttgcag catccattca ggcaaaaatt gatgaattaa agaggcagtt ggcagataga 240 atagcaactg gaaaaaacct gggaaaggag caagacccaa caggtgttga acccggggac 300 catttaaaag agagatcaat gctcagctat gggaatgtac tggatttgaa ccatctagac 360 attgatgagc caacaggtca gactgcagac tggctgagca ttgttgttta tcttacatcc 420 tttgtggttc cgatactcct gaaagccctt cagatgctga caacaagggg aagacagaca 480 actaaggaca ataaagggac aagaatccga ttcaaagatg acagctcttt tgaagatgtg 540 aatggaattc ggaagccgaa acatctctat gtgtctttac ctaatgcaca gtctagtatg 600 aaggcagaag agataacacc tggaaggtac aggacagcaa tctgtggatt ataccctgct 660 cagattaaag ccagacagat ggtaagccca gtcatgagtg taattggatt ccttgccttg 720 gctaaagact ggggtgatag gattgagcag tggctaagtg aaccctgtaa gctcctccca 780 gacacagcag cagtaagcct ccatggtggt cctgcaacta atagagatta tctccggcaa 840 aggcaggcag ctttaggaaa catggagact aaggagtcaa aagcaatccg ccaacatgca 900 gaagcagcag gctgtagcat gatagaagat atcgagtcac catcatccat ctgggtgttt 960 gctggggccc cagaccgatg cccaccaaca tgtttattca ttgcagggat tgcagagtta 1020 ggtgcctttt tttccatctt acaagatatg cggaatacta taaaggcatc taagacagtt 1080 ggcacatcag aggaaaagtt gagaaagaag tcatcatttt accagtctta cctcaggaga 1140 acacaatcaa tgggaataca actggaccag agaattattg ttctctttat ggttgcctgg 1200 gggaaggaag cagtggataa tttccatctt ggagatgacg tggatcctga attgaggaca 1260 ctagcacaga gtttgattga tctaaaagtg aaggaaattt caaaccaaga acctttaaaa 1320 ctataatcac tgaatgtata aatcctttta tgtgattatc atatactact gaatcattat 1380 caatcatatt tgcactatta ttatcagggg aatcagtata tcagggcatg ggaacattta 1440 tgggtgggaa tcattactca ggggtgggtc agttaatccg ttgtgggtgg gtttagctcc 1500 aggctacctt aagtagcctt tttttgtata tatggatgta gatttcattt gatccttaac 1560 taatcttgtt ttctttccct ttctttctgc tttctctgct tactaacaac aacattctac 1620 ctcaacacaa aactacctca acttaactac ctcatttgat tgctccttga ttgtcttttt 1680 agggagcata ctacta 1696 <210> 2 <211> 429 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> complete nucleocapsid protein in S segment of Soochong virus <400> 2 Met Ala Thr Met Glu Glu Leu Gln Lys Glu Ile Asn Ala His Glu Gly 1 5 10 15 Gln Leu Val Ile Ala Arg Gln Lys Val Arg Asp Ala Glu Arg Gln Tyr 20 25 30 Glu Lys Asp Pro Asp Glu Leu Asn Gln Arg Ala Leu Thr Asp Arg Glu 35 40 45 Gly Val Ala Ala Ser Ile Gln Ala Lys Ile Asp Glu Leu Lys Arg Gln 50 55 60 Leu Ala Asp Arg Ile Ala Thr Gly Lys Asn Leu Gly Lys Glu Gln Asp 65 70 75 80 Pro Thr Gly Val Glu Pro Gly Asp His Leu Lys Glu Arg Ser Met Leu 85 90 95 Ser Tyr Gly Asn Val Leu Asp Leu Asn His Leu Asp Ile Asp Glu Pro 100 105 110 Thr Gly Gln Thr Ala Asp Trp Leu Ser Ile Val Val Tyr Leu Thr Ser 115 120 125 Phe Val Val Pro Ile Leu Leu Lys Ala Leu His Met Leu Thr Thr Arg 130 135 140 Gly Arg Gln Thr Thr Lys Asp Asn Lys Gly Thr Arg Ile Arg Phe Lys 145 150 155 160 Asp Asp Ser Ser Phe Glu Asp Val Asn Gly Ile Arg Lys Pro Lys His 165 170 175 Leu Tyr Val Ser Leu Pro Asn Ala Gln Ser Ser Met Lys Ala Glu Glu 180 185 190 Ile Thr Pro Gly Arg Tyr Arg Thr Ala Ile Cys Gly Leu Tyr Pro Ala 195 200 205 Gln Ile Lys Ala Arg Gln Met Val Ser Pro Val Met Ser Val Ile Gly 210 215 220 Phe Leu Ala Leu Ala Lys Asp Trp Gly Asp Arg Ile Glu Gln Trp Leu 225 230 235 240 Ser Glu Pro Cys Lys Leu Leu Pro Asp Thr Ala Ala Val Ser Leu His 245 250 255 Gly Gly Pro Ala Thr Asn Arg Asp Tyr Leu Arg Gln Arg Gln Ala Ala 260 265 270 Leu Gly Asn Met Glu Thr Lys Glu Ser Lys Ala Ile Arg Gln His Ala 275 280 285 Glu Ala Ala Gly Cys Ser Met Ile Glu Asp Ile Glu Ser Pro Ser Ser 290 295 300 Ile Trp Val Phe Ala Gly Ala Pro Asp Arg Cys Pro Pro Thr Cys Leu 305 310 315 320 Phe Ile Ala Gly Ile Ala Glu Leu Gly Ala Phe Phe Ser Ile Leu Gln 325 330 335 Asp Met Arg Asn Thr Ile Lys Ala Ser Lys Thr Val Gly Thr Ser Glu 340 345 350 Glu Lys Leu Arg Lys Lys Ser Ser Phe Tyr Gln Ser Tyr Leu Arg Arg 355 360 365 Thr Gln Ser Met Gly Ile Gln Leu Asp Gln Arg Ile Ile Val Leu Phe 370 375 380 Met Val Ala Trp Gly Lys Glu Ala Val Asp Asn Phe His Leu Gly Asp 385 390 395 400 Asp Val Asp Pro Glu Leu Arg Thr Leu Ala Gln Ser Leu Ile Asp Leu 405 410 415 Lys Val Lys Glu Ile Ser Asn Gln Glu Pro Leu Lys Leu 420 425 <210> 3 <211> 119 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> truncated nucleocapsid protein in S segment of Soochong virus <400> 3 Met Ala Thr Met Glu Glu Leu Gln Lys Glu Ile Asn Ala His Glu Gly 1 5 10 15 Gln Leu Val Ile Ala Arg Gln Lys Val Arg Asp Ala Glu Arg Gln Tyr 20 25 30 Glu Lys Asp Pro Asp Glu Leu Asn Gln Arg Ala Leu Thr Asp Arg Glu 35 40 45 Gly Val Ala Ala Ser Ile Gln Ala Lys Ile Asp Glu Leu Lys Arg Gln 50 55 60 Leu Ala Asp Arg Ile Ala Thr Gly Lys Asn Leu Gly Lys Glu Gln Asp 65 70 75 80 Pro Thr Gly Val Glu Pro Gly Asp His Leu Lys Glu Arg Ser Met Leu 85 90 95 Ser Tyr Gly Asn Val Leu Asp Leu Asn His Leu Asp Ile Asp Glu Pro 100 105 110 Thr Gly Gln Thr Ala Asp Trp 115 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for complete nucleocapsid protein <400> 4 agatctaatg gcaactatgg aggaattg 28 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for complete nucleocapsid protein <400> 5 aagcttatag ttttaaaggt tcttggtttg 30 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for truncated nucleocapsid protein <400> 6 agatctaatg gcaactatgg aggaattg 28 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for truncated nucleocapsid protein <400> 7 aagcttacca gtctgcagtc tgacctgt 28

Claims

쯔쯔가무시 IgM 항체, 렙토스피라 IgM 항체, 및 신증후출혈열 IgM 항체를 검출하는 제1 스트립 및 쯔쯔가무시 IgG 항체, 렙토스피라 IgG 항체, 및 신증후출혈열의 IgG 항체를 검출하는 제2 스트립으로 이루어지는 스트립을 포함하는 다중 진단 키트로서,
상기 제1 및 제2 스트립은
오리엔티아 쯔쯔가무시 길리암, 카프, 및 카토의 56kDa의 융합 단백질(cr56) 및 오리엔티아 쯔쯔가무시 강원의 56kDa의 단백질(kr56)을 포함하는 쯔쯔가무시 항원 단백질; 렙토스피라 항원; 및 신증후출혈열 항원 단백질을 포함하고,
제1 비특이적 항체와 결합되는 대장균 추출물을 포함하는 제1 전반응선 및 제2 비특이적 항체와 결합되는 곤충세포 Sf 추출물을 포함하는 제2 전반응선을 포함하며,
상기 제1 비특이적 항체는 대장균 유래의 단백질과 결합되는 항체이고, 상기 제2 비특이적 항체는 곤충세포 Sf 유래의 단백질과 결합되는 항체인 것을 특징으로 하는 다중 진단 키트.
제 1 항에 있어서,
상기 오리엔티아 쯔쯔가무시 길리암, 카프, 및 카토의 56kDa의 융합 단백질(cr56) 및 상기 오리엔티아 쯔쯔가무시 강원의 56kDa의 단백질(kr56)은 5:3의 부피비로 포함되는 것을 특징으로 하는 다중 진단 키트.
제 1 항에 있어서,
상기 렙토스피라 항원은 렙토스피라균의 지질다당류(LPS)로부터 제조된 핵심 다당류(cord polysaccharide) 및 O-특이적 곁사슬(O-specific side chain)을 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 진단 키트.
제 1 항에 있어서,
상기 신증후출혈열 항원 단백질은 진핵세포로부터 제조된 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열을 가지는 수청바이러스로부터 제조된 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid protein)을 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 진단 키트.
제 1 항에 있어서,
상기 제1 및 제2 스트립은,
상기 렙토스피라 항원을 포함하는 제1 반응선;
상기 쯔쯔가무시 항원 단백질을 포함하는 제2 반응선; 및
상기 신증후출혈열 항원 단백질을 포함하는 제3 반응선을 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 진단 키트.
제 1 항에 있어서,
상기 제1 및 제2 스트립은,
쯔쯔가무시 항체, 렙토스피라 항체, 및 신증후출혈열 항체와 결합되는 표식자 항체를 포함하는 골드 컨쥬게이트 패드를 포함하고,
상기 제1 스트립의 상기 표식자 항체는 항-인간 IgM 컨쥬게이트 골드 및 닭 IgY 컨쥬게이트 골드를 포함하며,
상기 제2 스트립의 상기 표식자 항체는 항-인간 IgG 컨쥬게이트 골드 및 닭 IgY 컨쥬게이트 골드를 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 진단 키트.
삭제
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 제1 및 제2 스트립은,
표식자 항체와 결합되는 대조군 단백질을 포함하는 대조선을 포함하고,
상기 대조군 단백질은 산양 항-닭 IgY 항체, 토끼 항-산양 IgG 다클론 항체, 및 토끼 항-산양 IgM 다클론 항체 중에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 진단 키트.
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