KR100868560B1

KR100868560B1 - 렙토스피라증 진단 키트

Info

Publication number: KR100868560B1
Application number: KR1020070023093A
Authority: KR
Inventors: 김윤원; 조민기; 장인애; 우수동; 김영진; 이미정; 김진숙; 변용환
Original assignee: 주식회사 이뮨메드
Priority date: 2007-03-08
Filing date: 2007-03-08
Publication date: 2008-11-13
Also published as: CN101600965A; CN101600965B; KR20080082337A; WO2008108510A1

Abstract

본 발명은 렙토스피라균의 지질다당류(LPS)로부터 유래한 다당류를 항원으로 포함하는 렙토스피라증 진단용 조성물 및 상기 다당류를 포함하는 렙토스피라증 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 진단용 키트를 이용하여 렙토스피라증을 조기에 정확하고 간단하게 렙토스피라균 감염 여부를 진단할 수 있다.

렙토스피라균, 지질다당류(LPS), 다당류, 진단용 키트

Description

렙토스피라증 진단 키트{Diagnostic kit for Leptospirosis}

도 1은 patoc 및 lai에서 분리한 다당류의 SDS-PAGE (A)및 웨스턴 블롯팅(B) 결과로 정제한 다당류의 항원성을 나타내주는 그림이다.

도 2는 면역크로마토그래피를 이용한 렙토스피라증 진단용 스트립의 구조를 나타낸 그림이다.

도 3은 렙토스피라증 진단키트의 민감도와 특이도 검사 결과이다.

본 발명은 렙토스피라균의 지질다당류(LPS)로부터 유래한 다당류를 포함하는 렙토스피라증 진단용 조성물, 상기 다당류를 포함하는 렙토스피라증 진단 키트 및 상기 다당류를 생물학적 시료와 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체의 존재를 확인하여 렙토스피라균에 대한 항체를 검출하는 방법에 관한 것이다.

렙토스피라증은 나선균의 일종인 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans)의 감염으로 발병되는 사람과 동물의 공통 감염병의 하나로, 1887년 황달과 신질환을 동반한 급성 열성질환을 와일스병(Weil's disease)으로 명명하면 서 감염성 질환으로 처음 소개되었다.

1918년 최초로 와일스병 환자로부터 원인균을 분리하여 스피로게타 익테로헤모레지아(Spirochaeta icterohaemorrhagiae)로 명명하였고, 후에 렙토스피라 익테로헤모레지아(Leptospira icterohaemorrhagiae)로 개칭되었다. 분류학상, 렙토스피라(Leptospira)는 렙토스피라세어(Leptospiraceae)과에 속하며, 렙토스피라 속은 병원성 유무에 따라 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans)와 렙토스피라 비프렉사(Leptospira biflexa)로 분류된다. 병원성이 있는 렙토스피라 인테로간스는 현재까지 19개의 혈청군으로 분류되어, 약 180여개의 혈청형(serovar)을 포함하고 있는 것으로 알려졌으며, 이들은 지역에 따라 혈청형 분포가 다른 것으로 알려져 있다.

와일즈병(또는 렙토스피라증)은 발병 초기에 발열, 두통, 근육통, 허탈감 등의 전형적인 임상증상을 나타내는 급성 열성질환이며, 심한 경우에는 내부 장기 출혈, 황달, 신부전증의 증세까지 유발된다. 렙토스피라증의 역학적 특징은 감염된 동물(들쥐, 소, 말, 돼지 등)의 소변을 통해 배설된 균이 토양이나 물에서 생존하다가 사람의 상처난 피부, 코 및 입 등의 점막을 통해 침입하여 감염시키므로 주로 농부, 도살장 종사자, 야외 훈련하는 군인 등이 환자로 발견되며, 특히 홍수 발생 후는 배설물이 광범위한 지역을 오염시키므로 환자 발생이 증가할 수 있다.

이 질환은 유럽, 미주, 호주, 베트남, 태국, 말레이시아, 대만, 중국, 일본 등지에서 발생하는 것으로 알려져 있고, 우리나라도 1942년 혈청학적으로 증명된 렙토스피라증 환자의 발생이 보고되었으나, 이후 인체감염의 보고가 없었다가 1984년 처음으로 폐출혈 환자로부터 렙토스피라균이 분리되어 이 질환이 국내에 존재함이 확인되었다. 이후 국내에서는 쯔쯔가무시병, 신증후출혈열, 발진열과 함께 제3군 법정 전염병으로 지정되어 있다.

한편, 렙토스피라증을 진단하기 위한 방법이 연구되어 왔다. 예를 들어, 한국 특허출원 제1990-0000871호에서는 다가항원-Ⅰ, 다가항원-Ⅱ 및 양성 대조혈청으로 구성된 렙토스피라증 진단용 슬라이드 응집반응 시약에 관하여 개시하고 있으며, 한국 등록특허 제561687호는 렙토스피라 인테로간스 혈청형 라이(Leptospira interrogans serovar lai HY10)에 특이적인 재조합 단백질을 포함하는 진단 키트에 관하여 개시하고 있으며, 한국 등록특허 제234876호는 렙토스피라 인테로간스 항원을 포함하는 면역블럿을 이용한 진단키트에 관하여 개시하고 있다.

그러나, 지금까지 연구된 렙토스피라증 진단 방법은 렙토스피라균에 특이적인 단백질을 이용하는 방법으로서, WHO(World Health Organization) 표준방법인 MAT(microscopic agglutination test)에서 사용하는 항원과는 차이를 보인다. MAT는 혈청형에 특이적인 Leptospira균의 표면 항원인 LPS(lipopolysaccharide)의 구성성분 중 외부에 노출된 다당류를 이용하는 방법이다. 본 발명에서는 항원으로 레 토스피라(Leptospira)속에 특이적인 항원을 포함한 LPS의 다당류를 사용하기 때문에 표준방법인 MAT과 진단 원리가 유사하여, 보다 정확한 진단을 할 수 있을 뿐만 아니라 모든 렙토스피라증을 하나의 항원으로 진단 할 수 있다. 또한 MAT 방법은 다른 진단 방법에 비하여 정확한 진단을 할 수 있다는 장점이 있으나, 생균을 사용하기 때문에 이를 유지 및 관리하는데 번거로움이 있으며, 고가의 장비가 필요하고, 숙련된 전문가만이 시험가능한 복잡하고 어려운 방법이라는 단점 때문에 병원에서 일반적으로 사용하기 어렵다. 때문에 본 발명자는 간단하고 손쉽게 렙토스피라증을 진단하는 방법을 개발하고자 노력하였으며, 이에 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 하나의 목적은 렙토스피라증 진단을 위한 새로운 항원으로서 렙토스피라균의 지질다당류 유래 다당류를 제공하고, 상기 다당류가 포함된 렙토스피라증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 다당류를 포함하는 렙토스피라증 진단 키트 및 그를 이용한 렙토스피라균에 대한 항체 검출 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 렙토스피라균의 지질다당류(lipopolysaccharide; LPS)로부터 유래한 다당류를 포함하는 렙토스피라증 진단 용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 사용된 용어, “진단”은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 렙토스피라증을 확인하는 것이다. 상기 “렙토스피라증”이란 렙토스피라(Leptospira) 속의 병인성 나선균이 일으키는 질환을 말한다.

렙토스피라증의 진단은 환자의 혈액, 뇌척수막액 및 소변에서 균을 직접 분리 동정하거나, 혈청 내 항체를 검출함으로써 이루어진다. 본 발명의 구체적 실시에서는 혈청 내 항체를 검출함으로써 렙토스피라증을 진단한다. 상기 혈청 내 항체를 검출하는 방법으로 본 발명에서는 렙토스피라 속의 지질다당류(LPS)에서 지질이 분리된 다당류(polysaccharide)를 항원으로서 이용한다. 본 발명자는 렙토스피라 속의 지질다당류에서 분리된 다당류가 렙토스피라증 진단을 위한 항원으로 작용할 수 있음을 웨스턴 블롯 및 점적 검사(dot blotting)로 확인하였다. 또한, 상기 다당류를 ELISA로 실제 환자의 혈액에 대해 실험을 수행한 결과, 상기 다당류를 이용하여 렙토스피라증에 감염된 환자의 혈청 내 항체를 유의성 있게 진단할 수 있음을 확인하였다. 상기 용어, “유의성”이란, 진단하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고 반복 측정 시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도(reliability)가 높다는 것을 의미한다. MAT로 진단한 환자 혈청을 가지고 단백 항원을 이용한 진단 방법으로 검사했을 때, 민감도 및 특이도가 다소 떨어지나, 본 발명에서는 항원으로 MAT 방법에서 항원으로 사용되는 다당류를 이용하므로, 단백 항원을 이용한 방법보다 좀더 정확한 진단을 할 수 있다.

혈장, 혈청, 혈액 등을 포함하는 생물학적 시료에 존재하는 렙토스피라균에 대한 항체를 검출하기 위하여, 렙토스피라균의 지질다당류로부터 유래한 다당류를 항원으로 사용한다. 렙토스피라균의 지질다당류(LPS)는 지질 A(lipid A), 핵심 다당류(core polysaccharide) 및 O-특이적 곁사슬(O-specific side chain)으로 구성된다. 지질 A와 핵심 다당류는 2-케토-3-디옥시옥탄산(2-keto-3-deoxyoctanic acid, KDO)으로 연결되어 있으며, 핵심 다당류는 글루코스, 갈락토스 및 N-아세틸글루코사민으로 구성되어 있다. 본 발명의 구체적 실시에서는 항원 항체 반응성을 증가시키기 위해 지질 A를 제거한, 속(genus) 특이적인 O-특이적 곁사슬과 핵심다당류로 구성된 다당류를 항원으로 이용한다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 렙토스피라균의 지질다당류(LPS)로부터 유래한 다당류를 포함하는 렙토스피라증 진단 키트에 관한 것이다.

상기 키트는 생물학적 시료에서 렙토스피라균에 대한 항체 수준을 측정하여 렙토스피라증을 진단하기 위한 키트로, 항원-항체 복합체 형성을 살펴보기 위하여 렙토스피라균에 대한 항체에 반응하는 항원으로 작용하는 렙토스피라균의 지질다당류로부터 유래한 다당류를 포함한다.

항원-항체 복합체 형성을 살펴보는 면역 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 렙토스피라증 진단용 키트는 항체와 특이적으로 결합하는 상기 다당류 뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다. 이러한 도구 또는 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등을 포함하나 이로 제한하지 않는다. 또한 본 발명의 진단용 키트는 이에 한정되는 것은 아니나 마이크로 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립, 방사 분할 면역검정 디바이스, 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등의 타입일 수 있다. 또한, 본 발명의 진단용 키트는 양성 및 음성 표준 대조구를 포함할 수 있다.

바람직한 진단 키트는 면역크로마토그래피법을 이용한 스트립 타입의 진단 키트 또는 디바이스 형태의 진단 키트이다. 면역크로마토그래피법을 이용한 진단은, 생물학적 시료의 혈청 중에 들어 있는 항체가 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)에 결합된 표식자 항체(tracer antibody)와 반응한 다음, 모세관 현상에 의해 니트로셀룰로오스 막의 미세구멍(micropore)을 통하여 이동하는 도중에 미세구멍의 내부 표면에 고정되어 있는 포획 항원(capture antigen)과 결합하여 발색띠를 형성함으로써, 양성 및 음성을 육안으로 판별가능하도록 한다. 상기 “표식자 항체”는 렙토스피라균에 대한 항체와 반응하며 색채입자와 결합되어 있는 항체를 말한다.

본 발명의 진단 키트에서, 항원-항체 복합체는 색채입자결합법으로 검출할 수 있으며, 색채입자로는 예를 들어 콜로이드성 금 입자 또는 칼라 유리 또는 플라스틱(예, 폴리스틸렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드(bead)를 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 골드 콜로이드를 이용한다.

하나의 구체적 양태로서, 도 2에 볼 수 있는 바와 같이, 시료가 흡수되는 샘플패드(sample pad); 시료 내의 항체와 결합하는 표식자 항체를 포함하는 금 결합 패드(gold conjugation pad); 본 발명의 다당류를 포함하는 반응선(test line)과 대조군 단백질을 포함하는 대조선(control line) 및 비특이적 항체를 제거하기 위한 전반응선(pre-test line)이 처리되어 있는 반응막(test membrane); 및 잔량의 시료가 흡수되는 흡수패드(absorption pad)를 포함하는 테스트 스트립으로 구성되 는 생물학적 시료 내의 렙토스피라균에 대한 항체를 검출하는 렙토스피라증 진단 키트이다. 상기 반응선은 본 발명의 다당류를 0.5 내지 2.5mg/ml, 바람직하게 1 내지 2mg/ml의 농도로 포함하고 있으며, 상기 대조선은 토끼 항-염소 IgG, 토끼 항-프로테인 A 등의 대조군 단백질을 0.1 내지 1mg/mL, 바람직하게 0.1 내지 0.2mg/mL 농도로 포함하고 있다. 또한 전반응선은 본 발명의 렙토스피라균의 지질다당류(LPS)와 구조가 유사한 그람 음성 세균, 예를 들어 E. coli, 슈도모나스 등의 지질다당류(LPS)를 0.5 내지 1mg/ml의 농도로 포함하고 있다. 상기 금 결합 패드는 골드-라벨된 염소항-인간 IgM, 염소 항-인간 IgG 또는 골드-라벨된 프로테인 A 등을 포함하고 있다.

상기 면역크로마토그래피법을 이용한 스트립 타입의 진단 키트를 이용하여 렙토스피라증을 진단하는 방법은 다음과 같다. 먼저, 검체하고자 하는 생물학적 시료를 상기 진단 키트의 시료가 흡수되는 부위인 샘플패드(sample pad)에 점적하면, 생물학적 시료는 모세관 현상에 의해 금 결합 패드(gold conjugation pad)에 도달하여 시료 내의 항체가 금 결합 패드 내의 표식자 항체, 예를 들어 골드-라벨된 항 인간 IgM 염소 항체(gold-labeled anti-human IgM goat antibody) 및 골드-라벨된 항 인간 IgG 염소 항체(gold-labeled anti-human IgG goat antibody) 또는 골드-라벨된 프로틴 A(gold-labeled protein A) 등에 결합하여 콜로이드를 형성하게 된다. 이때, 검체하고자 하는 생물학적 시료는 상기 금 결합 패드에 고정화되지 않고 계속 이동하여 본 발명의 다당류 항원이 고정화되어 있는 반응선(test line)에 도달하게 된다. 렙토스피라균에 감염된 환자의 생물학적 시료인 경우에는 상기 다당류 항원과 항원-항체 반응을 일으키게 되는데, 즉 환자의 금 결합 패드 내의 특정 표식자 항체에 결합된 렙토스피라균에 대한 항체는 반응선에 고정된 다당류 항원에 결합하여 붉은 보라색 밴드를 형성함으로써 육안으로 관찰할 수 있게 된다. 그리고, 생물학적 시료 내 항체와 반응하지 않은 나머지 금 결합 패드 내의 표식자 항체는 대조선에 도달하여 대조군 단백질과 반응하여 붉은 보라색 밴드를 형성함으로써 검사의 적합성을 나타내게 된다. 이와 같이 본 발명의 상기 진단 키트는 항원-항체 반응에 의한 면역크로마토그래피 방법을 이용함으로써 특별한 장비 없이 육안으로 검사결과를 빠르게 확인할 수 있다. 또한, 상기 진단키트는 전반응선(pretest line)에 의해 실제로 렙토스피라균에 대한 항체를 보유하고 있지 않음에도 보유하고 있는 것으로 오판될 수 있는 가능성을 제거함으로써 렙토스피라증 진단의 정확성이 향상된다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 다당류를 생물학적 시료와 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 렙토스피라균에 대한 항체를 검출하는 방법에 관한 것이다.

렙토스피라균에 대한 항체가 검출되는 생물학적 시료는 혈액, 혈청, 혈장 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이는 본 발명의 이해를 돕기 위해 추가된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 렙토스피라 항원 확보

1-1. 렙토스피라 균주 배양

EMJH(Leptospira medium base Ellinghausen McCullough Hohnson Harris)를 0.23g/90ml로 녹여 멸균한 후, leptospira enrichment EMJH 10ml을 첨가하여 배지를 만들었다. 이 배지에 렙토스피라균을 접종하여 30℃에서 5일간 진탕 배양하였다.

1-2. 렙토스피라 항원 제조

EMJH 배지에서 5일간 배양한 렙토스피라균을 4,000xg에서 20분간 원심분리하여 균체를 1X PBS buffer (137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na₂HPO₄ _,2mM KH₂PO₄)로 3회 세척한 후 100℃에서 1시간 동안 가열하였다. 여기에 단백분해효소(Proteinase) K가 150㎍/㎖이 되도록 처리하여 37℃에서 16시간 동안 반응 시켰다. 그 후 EGTA가 2mM이 되도록 첨가하여 70 ℃에서 15분간 반응 시킨 후, 4℃, 180,000xg로 2시간 동안 원심분리하였다. 침전물에 H₂O를 가하여 부유시켜 지질다당류(lipopolysaccharide)를 제조하였다 (Westpha & Jann, 1965). 이렇게 정제된 LPS 항원에 아세트산이 1% 되도록 처리하여 100℃에서 1시간 동안 가온한 후 3,000xg로 20분간 원심 분리하고 침전 부분인 지질 A(lipid A)를 제거하여 다당류 항원을 제조하였다. 제조된 항원은 에스케리시아 콜리(Escherichia coli)에서 정제된 LPS(Sigma)를 위 방법과 동일하게 처리하여 얻은 다당류를 대조군(standard)으로 사용하여 양을 측정하였다.

실시예 2 : 렙토스피라 다당류의 항원성 조사

2-1. 웨스턴 블롯 분석

SDS-PAGE는 1㎜ 또는 1.5㎜ 두께의 12% 겔을 만들어 Bio-Rad Protean II 전기영동장치를 사용하였다. 전기 영동된 겔로부터 단백질의 막(membrane)으로의 전사는 Bio-Rad Transblot cell을 사용하여 80V에서 30분간 실시하였다. 전사된 막(membrane)은 5% skim milk, 0.1% Tween 20을 첨가한 1× TBS buffer를 사용하여 블로킹하고, 1차 항체로는 가토 면역 혈청 (L. interrogans strain WH-19)을 사용하였으며, 2차 항체로는 horse-radish peroxidase conjugated anti-rabbit IgG (Bio-Rad)를 1: 10,000으로 희석하여 사용하였다. 면역 반응이 끝난 후 ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech)로 발색시켰다. 이에 대한 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 보는 바와 같이, Leptospira interrogans serovar lai의 다당류는 Leptospira interrogans serovar patoc strain Patoc과 SDS-PAGE gel profile에서 비슷한 양상을 나타냈고, 14kDa 이상의 다당류 성분이 lai와 patoc에서 공통적으로 존재하며, 항원으로 작용하는 것으로 추정되었다.

2-2. Dot blotting

항원 1ug (1ug/1ul)을 니트로셀룰로오스 막에 점적한 후, 37℃에서 1시간 동안 건조시킨다. 건조된 막을 5% skim milk-TBST로 1시간 동안 블로킹하였으며, 1차 항체인 환자 혈청은 1: 3,000으로 희석해 1시간 동안 반응시켰다. 2차 항체는 horse-radish peroxidase conjugate anti-human IgG를 1: 10,000으로 희석해 반응시켰다. 반응이 끝난 후 ECL kit를 사용해 발색시켜 MAT 결과와 비교하였다(표 1). 대부분의 환자 혈청에서 양성 시그널이 보이는 것을 확인되었다.

2-3. 효소면역측정법(ELISA)

다당류(polysaccharide) ELISA는 Engvall과 Perlmann (1972)이 사용했던 방법을 기초로 하여 실시하였다. 0.01M PBS에 poly-L-lysine (10㎍/㎖)을 희석하여 플레이트(plate)를 전처리한 후 상온에서 24시간 동안 반응시켰다. 0.05% Tween 20이 포함된 PBS buffer로 2회 세척한 후 다당류를 PBS에 부유시켜 웰당 100㎕씩 플레이트에 처리하였다. 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 0.05% Tween 20이 포함된 PBS buffer로 3회 세척하고, 염소 혈청을 처리하여 37℃에서 블로킹하였다. 1차 항체는 렙토스피라증으로 확진된 20명의 환자 혈청과 20명의 정상인의 혈청을 사용하였으며, 2차 항체로는 horse-radish peroxidase conjugated anti-human IgG (Bio-Rad)를 1: 10,000으로 희석하여 사용하였다. 각 웰에 기질을 처리하여 발색을 관찰하고, ELISA reader를 사용하여 490nm에서 값을 측정하였다. 그 결과 렙토스피라 편모(Leptospira flagella) 재조합 단백질은 72~88%의 민감도와 88~90%의 특이도를 나타낸 것에 비하여, 본 다당류는 95%의 민감도와 95%의 특이도를 보여줌으로써 렙토스피라증의 조기 진단용 항원 후보로는 단백질보다 다당류가 우수함을 보여주었다(표 2).

Sensitivity and specificity of ELISA

Antigen	Polysaccharide
Antigen	patoc	lai
Sensitivity(%)^a	95	95
Specificity(%)^b	95	95

a: Number of sera of patients diagnosed by MAT : 20

b: Number of normal sera : 20

실시예 3 : 진단키트 제작

3-1. 니트로셀룰로오스 막상에 렙토스피라 항원(polysaccharide) 고정화

분석 특이항체를 포획하는 역할을 하는 특이 항원의 고정화는 니트로셀룰로오스(NC) 막(5um 세공크기)상에서 정전기 상호작용(electrostatic interaction)에 의해 수행하였다. 정제된 항원(polysaccharide)을 플라스틱 백킹된 NC 막 스트립(5X25mm)의 하단으로부터 1cm 떨어진 부분에, 대조군 항체(rabbit anti-goat IgG 또는 rabbit anti-protein A)는 1.4cm 떨어진 위치에 디스펜서(dispenser)를 사용하여 1ul/cm의 속도로 점적하였다. 점적된 막은 37℃에서 1시간동안 건조시켰다.

정제된 다당류를 농도를 달리하여 실험한 결과, 발색된 신호는 항원농도 1mg/ml에서 최대로 나타났으며, 그 이하나 이상의 농도에서는 감소하는 것으로 나타났다. 이는 신호발색이 크기 위해서는 분석항체와 결합할 충분한 양의 항원이 필요하나 과량의 항원이 일정지역에 밀집된 경우에는 항원-항체 반응을 위한 공간적 접근이 어려워져서 면역부착반응 확률이 낮아지기 때문으로 판단되었다.

3-2. 항원 점적용 버퍼(buffer)

Tween 20의 경우, 항원 단백의 비특이적 반응에 영향을 주고 있으며 농도가 높을수록 시그널의 강도가 감소되나 교차반응을 없애기 위해서는 Tween 20의 첨가가 필요하다. Tween 20의 농도범위 0.01, 0.05 및 0.1%에서 테스트하였다. 그 결과 0.05%에서 교차반응을 제거하는데 가장 효과적이었다. 따라서 0.05% tween 20을 최적 농도로 결정하였다.

3-3. 전반응선(pre-test line)에 사용할 항원 결정

항원(polysaccharide)에 의한 비특이적 시그널이 발생할 시, 비특이항체를 제거하기 위해 항원 점적위치 앞쪽에 전반응선(pretest line)을 점적함으로써 제거할 수 있었다. 따라서 본 연구에서 렙토스피라 LPS와 일부 유사한 다른 세균 (E. coli, Psudomonas aeruginosa)의 LPS를 각각 또는 혼합한 후 점적하여 실험하였다. 그 결과 E. coli LPS 0.6mg/ml에서 가장 효과적이었다.

3-4. 유리섬유상에 탐지항체-gold 중합체의 축적

(1) 유리섬유의 선택 및 전처리 조건 결정

염소 항-인간 IgM(μ-specific) 콜로이드성 골드 중합체 및 염소 항-인간 IgG(H+L) 콜로이드성 골드 중합체 또는 프로틴 A 라벨된 콜로이드성 골드 중합체 용액은 OD 3이 되도록 50% 트레할로즈(trehalose) (최종농도 5% trehalose) 용액과 증류수로 희석하여 제조하였다. 유리섬유막(Millipore 사)에 제조된 용액이 충분히 젖게 흡수시킨 후 37℃에서 2시간 동안 건조시켜 폭 0.5㎝로 잘라 준비하였다.

(2) 골드-중합체의 점적량 및 건조 조건 결정

분석시스템으로부터 발생된 특정신호 세기는 사용된 골드-항체 중합체의 양에 비례하여 증가된다. 그러나 과량으로 사용되면 분석물질 농도가 비교적 낮은 영역에서 비특정신호가 증가되어 위양성 결과가 초래된다. 따라서, 본 실험에서는 골드-중합체로 염소 항-인간 IgM(μ-specific) 라벨된 골드(40nm) 및 염소 항-인간 IgG(γ-specific) 또는 (H+L) 라벨된 골드(40nm) 또는 프로테인 A 라벨된 골드(40nm)를 사용하였다. 각 중합체의 농도(OD)에 따라 비교 테스트를 실시한 결과, IgG의 경우는 사용된 모든 골드 중합체에서 검출이 잘 되지 않는 결과를 보였다(표 3). 이러한 결과는 LPS가 대개 T-세포 비의존성 항원이기 때문으로 판단되었다. T-세포 비의존성 항원 면역반응으로 생성되는 항체는 IgM이기 때문에 IgG 검출이 일부에서만 되는 것으로 추정되었다. 그러므로 렙토스피라증 진단에서는IgM의 측정이 중요하고 IgG의 검출은 상대적으로 의미가 적다고 결론지었다(표 3). 골드-라벨된 IgM은 OD 3에서 효과적인 결과를 나타냄으로써 최적 농도로 결정하였다.

MAT와 진단키트 결과 비교

Patient NO.	MAT			Kit
Patient NO.	lai	canicola	yeonchon	proteinA	IgG (H+L)	IgG (r)	IgM
2000-100	-	640	-	-	-	-	++
2000-224	40	80	-	+++	+	+	+++
2000-307	40	320	320	-	-	-	++
2000-355	-	80	-	+/-	-	-	++
2000-407	80	640	160	-	-	-	++
2001-21	40	160	160	-	-	-	++
2001-116	-	80	-	-	-	-	++
2001-404	80	1280	160	+/-	-	-	+++
2001-478	80	640	80	-	-	-	++
2001-479	1280	40	1280	++	-	+/-	+++

3-5. 스트립 제조

고안된 시스템은 플라스틱 백킹(backing)된 NC 막을 기본골격으로 중간에 항원을 고정하고 중합체가 축적된 유리섬유막(콘쥬게이트 패드)을 하부에 붙이고, 과량의 수용액을 흡수하는 셀룰로오스 막을 양쪽 끝부분에 (샘플 패드, 흡수 패드) 접촉되게 붙여서 상호간에 연결된 형태로 구성된다. 하단에 위치한 유리섬유막은 흡수력이 높아 단시간 내에 시료를 흡수할 수 있을 뿐만 아니라, 용해된 중합체가 상부의 면역 스트립으로 이동되기 전에 정체시간을 연장시킴으로써 분석물질과 중합체간의 효율적인 반응을 유도할 수 있다. 중간의 면역 스트립상에는 분석물질 측정항원(테스트 라인 또는 고정 라인(capture line))과 중합체를 감지할 수 있는 특이항체(대조 라인(control line))를 공간적으로 분리하여 고정화시켰으며, 면역 스트립 상단에 위치한 흡수패드(absorbent pad)인 셀룰로오스 막은 과량의 시료가 신속히 흡수될 수 있도록 하였다(도 2).

3-6. 사람 혈청 농도의 결정

사람 혈청의 농도를 테스트한 결과, 혈청의 농도도 중합체와 마찬가지로 과량으로 점적될 경우 비특이적 반응을 유도하기도 한다. 혈청을 1/1000, 1/100, 1/50 및 1/10로 희석하거나 원액 혈청 상태로 100㎕씩 테스트한 결과, 혈청 1/100을 사용했을 때 최적임을 확인하였다.

3-7. Rapid diagnostic kit 의 민감도와 특이도

렙토스피라증 진단키트의 진단 민감도와 특이도를 알아보기 위하여 렙토스피라증 환자 혈청과 다른 급성열성질환(발진열, 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병) 환자 혈청을 검체로 하여 검사를 하였다. MAT로 진단된 렙토스피라증 환자 6례의 혈청을 사용하였다. 5분 반응 후 6검체에서 모두 양성을 나타내었으며, 이에 따른 IgM(μ-speicific) 진단 민감도는 100%를 나타내었다(도 3).

건강인 혈청(n=6), 발진열 환자 혈청(n=3), 쯔쯔가무시병 환자 혈청(n=4) 그리고 신증후출혈열 환자혈청(n=6)으로 교차반응을 시험한 결과, 특이도는 95%를 나타내었다(도 3).

3-8. 타 기관에 시제품의 성능 시험 의뢰

본 발명의 렙토스피라증 진단키트의 진단 민감도와 특이도를 알아보기 위하여 위탁기관인 한림대학교에서 렙토스피라증 환자 혈청과 다른 급성열성질환(발진열, 신증후출혈열, 쯔쯔가무시병) 환자 혈청을 검체로 하여 검사를 하였다. MAT로 진단된 렙토스피라증 환자 5례의 혈청을 사용하였다. 5분 반응 후 5검체에서 모두 양성을 나타내었으며, 이에 따른 IgM(μ-speicific) 진단 민감도는 100%를 나타내었다(표 4).

건강인 혈청(n=10), 발진열 환자 혈청, 쯔쯔가무시병 환자 혈청 그리고 신증후출혈열 환자혈청(n=10)으로 교차반응을 시험한 결과, 특이도는 95%를 나타내었다(표 4).

	RDK (1:100) ^a
Leptospirosis (n=5)	5
Other AFI (n=10)	1
Healthy control (n=10)	0

a : dilution ratio of sera

Sensitivity : 5/5 = 100%

Specificity among other acute febrile illness(haemorrhagic fever with renal syndrome patient, murine typhus, tsutsugamushi disease) and healthy control : 19/20 = 95%

상기한 바와 같이, 본 발명의 새로운 항원을 이용함으로써 렙토스피라균 감염 여부를 정확하고 빠르게, 그리고 간단히 진단할 수 있다.

Claims

렙토스피라균의 지질다당류(LPS)로부터 유래한 핵심 다당류(core polysaccharide) 및 O-특이적 곁사슬(O-specific side chain)을 포함하는 렙토스피라증 진단용 조성물.
제1항의 조성물을 포함하는 렙토스피라증 진단 키트.
제2항에 있어서, 면역크로마토그래피법을 이용한 스트립 타입, 면역크로마토그래피법을 이용한 디바이스 타입 또는 마이크로플레이트 타입의 진단 키트.
제2항에 있어서, 항원-항체 복합체를 색체입자결합법으로 검출하는 진단 키트.
제1항의 조성물을 생물학적 시료와 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 렙토스피라균에 대한 항체를 검출하는 방법.
제5항에 있어서, 검출방법이 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography) 및 FACS로 이루어진 군에서 선택되는 방법.