DE69319240T2

DE69319240T2 - In vitro-test für helicobacter pylori

Info

Publication number: DE69319240T2
Application number: DE69319240T
Authority: DE
Inventors: Robert Llewellyn Newcastle Nsw 2300 Clancy; Allan East Maitland Nsw 2323 Cripps; Daniel East Lindfield Nsw 2070 Stiel; Campbell Bicton W.A. 6157 Witt
Original assignee: Auspharm International Ltd
Current assignee: Auspharm International Ltd
Priority date: 1992-04-29
Filing date: 1993-04-29
Publication date: 1999-04-08
Anticipated expiration: 2013-04-30
Also published as: EP0638175B1; ATE167573T1; NZ252719A; AU4267793A; CA2134667A1; EP0638175A1; DK0638175T3; AU687002B2; JPH07509308A; DE69319240D1; ES2119900T3; HK1008847A1; CA2134667C; PL172125B1; WO1993022682A1; SG42897A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen ein Verfahren und einen Kit, die einen raschen in-vitro-Nachweis einer Infektion mit Heliobacter pylori in Säugetieren ermöglichen. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren für den Nachweis von IgG-Antikörpern gegen H. pylori in Schleimsekreten und schafft dadurch ein Mittel zur Beobachtung einer bestehenden Infektion durch die Mikrobe in Säugetieren.
Darminfektionen bei Säugetieren und insbesondere bei Menschen stimulieren eine Immunreaktion in Schleimsekreten wie Speichel durch Aktivierung des allgemeinen Schleimhautimmunsystems. Diese Reaktion verläuft zu Beginn häufig parallel zu einer Antikörperreaktion im Serum, ist aber im allgemeinen durch die Gegenwart von IgA-Antikörpern charakterisiert. Die Immunreaktion im Sekret, einschließlich Speichel, verschwindet jedoch häufig nach der Ausscheidung des Antigens (z. B. der Bakterie oder des Virus) aus dem Körper. Daher widerspiegelt die Gegenwart von Antikörper im Schleimsekret eine gegenwärtige, d. h. bestehende Infektion. Im Falle einer Mikrobeninfektion zum Beispiel geben Antikörper in Schleimsekreten, die in der Folge als Sekretantikörper bezeichnet werden, den gegenwärtigen Status der Mikrobenkolonisierung, zum Beispiel im Darm, an, und dies ist somit eine zweckdienliche Anzeige einer bestehenden Infektion. Serumantikörper bleiben andererseits einige Zeit nach dem Ausscheiden der Mikrobe aus dem Körper bestehen. Ein positiver Serum-Antikörpertest widerspiegelt daher sowohl eine vergangene als auch gegenwärtige Antigenbelastung, was für den Arzt weniger hilfreich ist. Ein positiver Sekretantikörpertest zeigt andererseits eine derzeitige oder bestehende Infektion durch die Mikrobe an.
Die vorliegende Erfindung ist das Ergebnis einer Untersuchung der Infektion mit Heliobacter pylori (auch als Campylobacter pylori bekannt) im Darm von Säugetieren. Die Diagnose einer Infektion mit Heliobacter pylori kann durch Mikroskopie, mikrobiologische Kultur oder Urease-Nachweis in Magenschleimhautbiopsien, Harnstoffbelastungstest oder durch die Gegenwart spezifischer Antikörper in Serum-ELISAs erfolgen. Es könnte vorausgesagt werden, daß die Infektion mit H. pylori, die eine Infektion der Magenschleimhaut ist, eine IgA-Antikörperreaktion in der Magensaftsekretion hervorruft. Während der Arbeit, die der vorliegenden Erfindung voranging, wurde jedoch entdeckt, daß ein H. pylori-spezifischer Antikörper in Schleimsekreten zur IgG- und nicht zur IgA-Klasse gehört, wie zu erwarten gewesen wäre. Es wird, wenn überhaupt, nur wenig IgA-Antikörper nachgewiesen. Daher betrifft AU-A-9067676 den Nachweis von IgG im Schleimsekret, das für H. pylori-Antigen spezifisch ist und somit ein Mittel zur Beobachtung einer gegenwärtigen, d. h. bestehenden Infektion durch diesen Mikroorganismus in Säugetieren bereitstellt. Die entsprechende wissenschaftliche Publikation ist Witt et al., Frontiers in Mucosal Immunology 1 693-696 (1991).
Der Gegenwart von IgG-Antikörpern im Speichel von Campylobacter pylori-positiven Patienten wurde eine gewisse Beachtung in den Protokollen der Annual Meetings of the American Gastroenterological Association geschenkt. Nach der Beschreibung von Czinn et al. der Gegenwart solcher Antikörper in den Protokollen von 1989 schlossen Larsen et al. in den Protokollen von Mai 1991, daß IgG-Werte im Speichel ein praktischer, nichtinvasiver Marker einer therapeutischen Reaktion im Verlauf einer Antibiotikatherapie sind. In den Protokollen von April 1992 bestätigten Landes et al. frühere Beobachtungen und stellten fest, daß die Messung von Speichel-IgG gegen Heliobacter pylori ein einfacher, nichtinvasiver Test für das Auffinden H. pylori-positiver Patienten ist, insbesondere bei einem weit gestreuten oder kindlichen Patientengut; wo andere Tests nicht praktisch sind.
Aus dem Vorhergesagten geht hervor, daß ein weitgehendes Interesse an und ein klinisches Potential für einen diagnostischen, auf Speichel-IgG basierenden Test auf H. pylori besteht. Ebenso ist offensichtlich, daß ein solcher Test zuverlässig und auch praktisch sein muß. Invasive Techniken sind bekannt (z. B. aus US-A-4882271, Schaber et al., J. Clin. Microbiol. 27(2) 327-330 (1989), Loffeld et al., The Lancet, 27. Mai 1989, 1182-1185, und Evans et al., Gastroenterology 96 1004-1008 (1989)) und etabliert (z. B. das CLOTESTM-Kit, der von Delta West Ltd., Perth, West-Australien erhältlich ist und die Gegenwart von Urease in Biopsieproben nachweist). Die Zuverlässigkeit eines nichtinvasiven Tests muß jener invasiver Tests gleichkommen, um Akzeptanz zu finden und zweckdienlich zu sein.
Pateraki et al. (FEMS Microbiology Immunology 64 : 129-136 (1990)) stellten ein Antigen-Präparat her, das aus einer ultrazentrifugierten, ganzzelligen, ultraschallbehandelten H. pylori-Kultur bestand.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verbesserung der Zuverlässigkeit von auf Speichel (und anderen Schleimen) basierenden IgG-Tests auf H. pylori. Es hat sich gezeigt, daß die immunologische Spezifität des Testverfahrens durch den Nachweis von Schleim-IgG unter Verwendung bestimmter Antigene von H. pylori und Vermeidung der Verwendung anderer verbessert werden kann.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Auffinden einer bestehenden Infektion mit Heliobacter pylori in einem Säugetier geschaffen, wobei das Verfahren umfaßt, daß ein Schleimsekret von dem Säugetier mit einem Antigen-Präparat aus H. pylori für eine Zeit und unter Bedingungen in Kontakt gebracht wird, die ausreichen, damit ein IgG-Antikörper in dem Schleimsekret, der für die Antigen-Komponente spezifisch ist, einen Komplex mit dieser bildet, und der Komplex anschließend einem Detektionsmittel ausgesetzt wird, um den Komplex aufzufinden, wobei das Antigen-Präparat aus einer von H. pylon stammenden Komponente von 238,5-291,5 kDa, wie durch native PAGE bestimmt, und einer von 306-374 kDa, wie durch native PAGE bestimmt, besteht und im wesentlichen frei von einer von H. pylori stammenden Komponente von 440 kDA ist.
Die vorliegende Erfindung schafft somit einen effektiven In-vizro-Test für eine Infektion mit H. pylori durch das Durchsuchen von Schleimsekreten auf IgG-Antikörper.
Es hat sich gezeigt, daß bei Vorhandensein der ca. 440 kDa Komponente falsch positive Ergebnisse bei gewissen Patienten erhalten werden können. Wenn das ca. 265 kDa Antigen fehlt, können falsch negative Ergebnisse auftreten. Wenn zusätzlich ein ca. 340 kDa Antigen, das von H. pylori stammt, fehlt, können bei gewissen Patienten falsch negative Ergebnisse erhalten werden; die Gegenwart des ca. 340 kDa Antigens ist daher besonders bevorzugt. Andere Antigen-Komponenten von H. pylori, die vorhanden sein können, aber nicht vorhanden sein müssen, umfassen jene mit einem Molekulargewicht von 144-176 kDa und etwa 63-77 kDa, wie in beiden Fällen durch native PAGE bestimmt.
Eine Antigen-Komponente ist für den Zweck dieser Erfindung vorhanden, wenn sie durch Western-Blot-Analyse nachweisbar ist. Im Gegensatz dazu fehlt sie, wenn sie durch dieses Mittel nicht nachweisbar ist. Die allgemein anerkannte Empfindlichkeit der Western-Blot-Analyse ist in der Größenordnung von 20 ug/ml.
Die für die Komponenten genannten Bereiche zeigen die Grenzen der gegenwärtigen Verfahren zur Molekulargewichtsbestimmung. Somit wird die etwa 265 kDa Komponente als eine 238,5-291,5 kDa Komponente beschrieben, was die 1010% Schwankung widerspiegelt, die mit der Bestimmung zusammenhängt. Die Molekulargewichte, auf die insbesondere Bezug genommen wird, wurden durch ein natives Polyacrylamid-Gelelektrophorese-(PAGE)-System, das von Pharmacia unter dem Handelsnamen PHASTGELTM und PHASTSYSTEMTM vertrieben wird, unter Verwendung des PHASTGEL-Gradienten 8-25 erhalten. Dieses System liefert ein lineares Verhältnis zwischen einer Protein-Wanderungsstrecke und dem Logarithmus seines Molekulargewichts für den Molekulargewichtsbereich von 50000 bis 750000 für Sphäroproteine. Pharmacia stellt einen Satz von Markern für hohes Molekulargewicht in ihrem Elektrophorese-Kalibrierungskit bereit; dieser Markersatz wurde zum Kalibrieren der Gele verwendet, auf die in dieser Beschreibung Bezug genommen wird. Für Fachleute ist offensichtlich, daß verschiedene Benutzer oder dieselben Benutzer bei verschiedenen Gelegenheiten geringfügig unterschiedliche Ergebnisse erhalten können, und somit sollten die ungefähren Molekulargewichtszahlen, die in dieser Beschreibung genannt werden, als S % oder sogar 10% verstanden werden. Aus diesem Grund wird das ca. 265 kDa Antigen manchmal als das 255-275 kDa Antigen bezeichnet.
Eines der effektivsten Verfahren zur Gewährleistung, daß die notwendigen Antigene vorhanden sind, während viele irrelevanten Komponenten entfernt werden, ist die Verwendung der Chromatographie an Rohextrakten (zum Beispiel ultraschallbehandelten Kulturen) von H. pylori Zellen. Zum Beispiel ist die schnelle Protein-Flüssigkeitschromatographie (FPLC), wie unter Verwendung einer SUPEROSETM Ausschlußsäule der Größe 6, besonders wirksam, wenn sie an einem rohen, ultraschallbehandelten Zellenmaterial angewendet wird, das einer Ionenaustauschchromatographie unterzogen wurde. Andere Verfahren sind den Fachleuten sehr wohl bekannt.
Dementsprechend ist eines der effektivsten Verfahren zur Gewährleistung, daß das unerwünschte ca. 440 kDa Antigen fehlt, die Verwendung der Gefriertrocknung bei einem Extrakt von H. pylori Zellen, insbesondere nach einer chromatographischen Reinigung wie FPLC. Die Gefriertrocknung kann für diesen Zweck in jeder geeigneten Vorrichtung ausgeführt werden. Die tatsächlich verwendeten Ausrüstungsgegenstände und Bedingungen hängen vom Maßstab der Zubereitung ab. Es wird bevorzugt, daß das Gefriertrocknungsverfahren im wesentlichen innerhalb der Grenzen der verwendeten Ausrüstungsgegenstände bis zur Vollendung durchgeführt wird.
Die Erfindung erstreckt sich auf die Verwendung einer natürlich vorkommenden Form von Antigenen und synthetischer (z. B. rekombinanter) Formen und immunologisch aktiver Derivate, Analoge und verwandter Formen davon. Es ist daher klar, daß ein effektiver Antigensatz zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung entweder selektiv von einem H. pylori Zellenpräparat extrahiert oder aus einzelnen Komponenten oder Mischungen von Komponenten aufgebaut werden kann.
In dem Verfahren der Erfindung wird Antikörper im Schleimsekret nachgewiesen. Unter "Schleimsekret" wird die Sekretion schleimsezernierender Epithelzellen (d. h. der Schleimhaut) wie jener verstanden, welche die Kanäle, Hohlräume und Wege auskleiden, die mit der Außenluft in Verbindung stehen, und insbesondere die Nase, Kehle, Atemwege, Augen, Genital- und Harnwege und das Verdauungssystem. In bevorzugten Ausführungsbeispielen ist das Schleimsekret Nasensekret, Sputum oder insbesondere Speichel.
Der Speichel oder ein anderes Schleimsekret kann unverdünnt oder mit einem geeigneten Verdünnungsmittel (wie zum Beispiel destilliertem Wasser) verdünnt getestet werden. Bei zunehmenden Empfindlichkeiten kann eine Verdünnung bevorzugt sein (insbesondere wenn Sammelvorrichtungen verwendet werden).
Das Antigen-Präparat ist aus praktischen Gründen und bevorzugt an einen festen Träger gebunden. Zu geeigneten festen Trägern zählen eine Nitrozellulosemembran, Glas oder ein Polymer. Die am häufigsten verwendeten Polymere für diesen Zweck sind Zellulose, Polyacrylamid, Nylon, Polystyrol, Polyvinylchlorid oder Polypropylen, aber die Erfindung ist nicht auf diese beschränkt. Die festen Träger können die Form von Streifen, Röhrchen, Perlen, Scheiben oder Mikroplatten oder jeder anderen Oberfläche aufweisen, die zur Durchführung eines Immuntests geeignet ist.
Antigenkomponenten von H. pylori, die in dieser Erfindung zweckdienlich sind, können entweder kovalent oder nichtkovalent ("passiv") an die festen Oberflächen gebunden sein. Geeignete Bindungsverfahren sind in der Wissenschaft bekannt und bestehen im allgemeinen aus der Vernetzung, kovalenten Bindung oder physikalischen Absorption des Antigens an den festen Träger.
Eine Infektion wird mit Hilfe der vorliegenden Erfindung durch den Nachweis der Bildung eines Komplexes zwischen IgG-Antikörper in einer Schleimprobe und H. pylori-Antigenen diagnostiziert. Daher ist irgendeine Art von Detektionsmittel zur Identifizierung der Gegenwart (oder, falls erforderlich, der Menge) des Antikörper-Antigen-Komplexes notwendig.
Das Detektionsmittel kann ein zweiter Antikörper sein, der mit einem Reportermolekül konjugiert ist, und der für wenigstens einen Teil der in dem Sekret gefundenen H. pylori-spezifischen Antikörperklasse spezifisch ist; wie zuvor erklärt, ist dieser Antikörper IgG.
Ein "Reportermolekül" ist ein Molekül oder eine Gruppe, die aufgrund ihrer chemischen Eigenschaft ein analytisch identifizierbares Merkmal aufweist oder ein analytisch identifizierbares Signal liefert, das den Nachweis von Antigen-gebundenem Antikörper ermöglicht. Der Nachweis kann entweder qualitativ oder quantitativ sein. Die am häufigsten verwendeten Reportermoleküle in dieser Art von Test sind entweder Enzyme, Fluorophore oder radionuklidhaltige Moleküle (d. h. Radioisotope). Bei einem Enzymimmungssay wird ein Enzym an den zweiten Antikörper, im allgemeinen durch Glutaraldehyd oder Periodat, konjugiert. Wie sofort zu erkennen ist, gibt es jedoch eine Vielzahl verschiedener Konjugationstechniken, die für Fachleute fertig verfügbar sind. Zu allgemein verwendeten Enzymen zählen unter anderem Meerrettichperoxidase, Glucoseoxidase, β-Galactosidase und alkalische Phosphatase. Die Substrate, die mit den spezifischen Enzymen zu verwenden sind, werden im allgemeinen für die Erzeugung einer nachweisbaren Farbveränderung, bei Hydrolyse durch das entsprechende Enzym, gewählt. Substrate können abhängig von der gewählten Anwendung löslich oder unlöslich sein. Zum Beispiel ist 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphatlnitroblautetrazolium zur Verwendung mit alkalischen Phosphatase-Konjugaten geeignet; für Peroxidase-Konjugate werden allgemein 1,2-Phenylendiamin-5-aminosalicylsäure, 3,3,5,5-Tetramethylbenzidin, Tolidin oder Dianisidin verwendet. Es ist auch möglich, anstelle der zuvor genannten chromogenen Substrate fluorogene Substrate zu verwenden, die ein fluoreszierendes Produkt ergeben. Beispiele für fluorogene Substrate sind Fluorescein und Rhodamin. Bei Aktivierung durch Beleuchtung mit einem Licht einer besonderen Wellenlänge absorbiert der mit Fluorochrom markierte Antikörper die Lichtenergie, wodurch in dem Molekül ein Erregbarkeitszustand herbeigeführt wird, auf den die Ausstrahlung des Lichts in einer charakteristischen Farbe folgt, die für gewöhnlich mit einem Lichtmikroskop visuell nachweisbar ist. Immunfluoreszenz- und EIA-Techniken sind beide in der Wissenschaft gut etabliert und sind für das vorliegende Verfahren besonders bevorzugt. Es können jedoch auch andere Reportermoleküle wie Radioisotope-, chemilumineszierende und biolumineszierende Moleküle und/oder Farbstoffe und andere chromogene Substanzen verwendet werden.
Die Wahl eines bestimmten, an ein Reportermolekül konjugierten Antikörpers wird daher weitgehend durch die beabsichtigte Verwendung und den Benutzer der vorliegenden Erfindung bestimmt. Obwohl der Test für alle Säugetiere geeignet ist, die für Infektionen mit H. pylori anfällig sind, ist er des weiteren besonders zur Beobachtung einer Infektion mit H. pylori bei Menschen anwendbar und zweckdienlich.
Daher schafft die vorliegende Erfindung in einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ein Verfahren zum Auffinden einer bestehenden Infektion mit H. pylori in einem Menschen, welches umfaßt:
(a) In Kontakt bringen eines Schleimsekretes von dem Menschen mit einem Antigen-Präparat aus auf einem festen Träger immobilisierten H. pylori für eine Zeit und unter Bedingungen, die ausreichen, daß ein IgG-Antikörper in dem Schleimsekret, der für die Antigen-Komponente spezifisch ist, einen Komplex mit dieser bildet, wobei das Antigen-Präparat aus einer von H. pylori stammenden Komponente von 238,5-291,5 kDa, wie durch native PAGE bestimmt, und einer von 306-374 kDa, wie durch native PAGE bestimmt, besteht und im wesentlichen frei von einer von H. pylori stammenden Komponente von 440 kDA ist;
(b) In Kontakt bringen des Komplexes mit einer effektiven Menge eines zweiten Antikörpers, der mit einem Reportermolekül markiert und für den H. pylori-spezifischen IgG-Antikörper spezifisch ist; und
(c) Nachweisen der Bindung des zweiten Antikörpers an den IgG-Antikörper durch das Reportermolekül.
Somit kann ein Mediziner, Arzt, eine Schwester oder sogar der Patient einen Nitrozellulose- oder anderen geeigneten Festphasen-Trägermembranstreifen verwenden, der immobilisierte H. pylori-Antigene trägt, wie ein gefriergetrocknetes, FPLC-fraktioniertes, lösliches, ultraschallbehandeltes Material. Der Streifen wird dann mit dem Schleimsekret über eine Zeit und unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die ausreichen, daß mögliche H. pylori-spezifische Antikörper der IgG-Klasse im Speichel an die immobilisierten Antigene binden. Anstelle von Speichel kann die Quelle des Schleimsekretes ein Nasensekret oder Sputum sein.
Der Teststreifen wird dann, sobald er dem Schleimsekret ausgesetzt wurde, mit einem zweiten Antikörper, der mit einem Reportermolekül konjugiert ist, über eine Zeit und unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die ausreichen, daß der zweite Antikörper an den ersten Antikörper binden kann. Vorzugsweise ist das Reportermolekül ein Enzym wie alkalische Phosphatase. Der Teststreifen wird dann gewaschen und ein Substrat für das Reportermolekül (wenn das Reportermolekül alkalische Phosphatase ist, 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat/nitroblautetrazolium) wird mit dem Streifen in Kontakt gebracht. Das Substrat reagiert mit dem Reportermolekül, wobei eine nachweisbare Veränderung stattfindet. Zum Beispiel hydrolysiert alkalische Phosphatase 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat zu einem purpurroten Produkt. Dieses gesamte Verfahren kann im Behandlungsraum oder im Sprechzimmer des Arztes durchgeführt werden.
Wenn ein stärker quantitativer Enzymimmungssay (ELISA) erforderlich ist, wie in einem klinischen Labor, kann eine Mikrotiterschale verwendet werden, die immobilisierte H. pylori-Antigene in den Vertiefungen der Schale enthält. In diesem Fall werden Proben des Schleimsekretes, z. B. Speichel, der Vertiefung zugegeben, so daß mögliche H. pylori-spezifische IgG-Antikörper an das immobilisierte Antigen binden können. Überschüssiges Sekret wird abgewaschen und ein zweiter, für IgG spezifischer Antikörper, der an ein Reportermolekül konjugiert ist, wird zugegeben, so daß sich ein Antigen-Antikörper-konjugierter Antikörper-Komplex bilden kann. Dieser Komplex wird durch Zugabe eines Substrats zu dem Reportermolekül, wie zuvor beschrieben, nachgewiesen, so daß zum Beispiel ein sichtbares Signal entsteht, das dann spektrophotometrisch oder durch andere Mittel quantifiziert werden kann.
Die Erfindung kann als Alternative oder zusätzlich in einem Immunoblot-System ausgeführt werden, das auch quantitativ sein kann (indem zum Beispiel die Farbstärke des Blots und/oder die Strecke gemessen wird, die durch einen chromatographischen Streifen gewandert wird).
Die vorliegende Erfindung hat viele Vorteile gegenüber gegenwärtig im Handel erhältlichen Tests auf H. pylori, insbesondere in der Form des Nitrozellulosestreifens. Die Verwendung von Schleimsekret und insbesondere Speichel zum Testen auf H. pylori Antikörper ermöglicht eine Diagnose einer derzeitigen oder bestehenden Infektion und ermöglicht dem Arzt daher:
(a) Darmsymptome mit H. pylori in Zusammenhang zu bringen, wodurch Entscheidungen in Bezug auf weitere Untersuchungen (einschließlich invasiver Verfahren) und/oder eine Behandlung (z. B. die Verwendung spezifischer Anti-H. pylori-Mittel) getroffen werden können. Es ist zu erwarten, daß letztgenanntes eine besondere Bedeutung in Bezug auf nichtulzerative Dyspepsie, Gastritis, Zwölffingerdarmgeschwürbildung, Magengeschwürbildung und verwandte und andere Zuständen haben könnte, die mit H. pylori in Zusammenhang stehen.
(b) zum ersten Mal einen praktischen, nichtinvasiven Test im Arztzimmer, in der Klinik oder im Spital zur Verfügung zu haben, so daß Patienten mit bestätigtem Magendarmgeschwür beobachtet werden können, um ein frühes Wiederauftreten festzustellen. Ein positiver Test ermöglicht eine frühe Diagnose und Vermeidung oder frühe Behandlung eines wiederauftretenden Magengeschwürs. Ein negativer Test hat eine entsprechende Nützlichkeit in der Analyse der diagnostischen Vorgangsweise bei Dyspepsie.
Zusätzlich liefert der Test, auf den sich die vorliegende Erfindung bezieht, eine einfache Ja/Nein-Antwort, wobei zum Beispiel keine Blutentnahme erforderlich ist. Er kann in Minuten abgelesen und ohne besondere Zubereitung einer Probe durch den Arzt entwickelt werden. Ein wesentlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Schleimsekret (z. B. Speichel) für den Test auf Antikörper, die für H. pylori spezifisch sind.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird einem Testkit zum Nachweis von H. pylori in einem Schleimsekret eines Säugetiers geschaffen, wobei dieser Testkit beeinhaltet:
(a) einen festen Träger mit einem darauf immobilisierten Antigen-Präparat, wobei das Antigen-Präparat aus einer von H. pylori stammenden Komponente von 238,5-291,5 kDa, wie durch native PAGE bestimmt, und einer von 306-374 kDa, wie durch native PAGE bestimmt, besteht und im wesentlichen frei von einer von H. pylori stammenden Komponente von 440 kDA ist; und
(b) ein Detektionsmittel, das bei Gebrauch auffindet, ob IgG in dem Schleimsekret an eine oder mehrere Komponenten des Antigen-Präparats bindet.
Das Detektionsmittel kann ein Antikörper sein, der mit einem Reportermolekül konjugiert ist, das imstande ist, ein nachweisbares Signal zu erzeugen oder entstehen zu lassen; der Antikörper wäre für IgG-Antikörper des fraglichen Säugetiers spezifisch. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist das Reportermolekül ein Enzym, das zur Katalyse einer Reaktion imstande ist, in der sich das oder die Produkte nachweislich von dem oder den Reaktionsmittel(n) unterscheiden. In einem solchen Fall ist für gewöhnlich auch ein Substrat für das Enzym, das zum Beispiel andere kolorimetrische Eigenschaften als das Enzymprodukt besitzt, in dem Kit vorhanden.
Somit erstreckt sich die vorliegende Erfindung in einem bevorzugten Ausführungsbeispiel auf ein Kit zum Nachweis von H. pylori -spezifischem Antikörper in einem Schleimsekret eines Säugetiers, wie eines Menschen, wobei der Testkit in Form von Abteilungen vorliegt und beeinhaltet:
(a) eine erste Abteilung, die dafür vorgesehen ist, einen festen Träger mit einem darauf immobilisierten Antigen-Präparat aus H. pylori zu enthalten; wobei das Antigen-Präparat aus einer von H. pylori stammenden Komponente von 238,5-291,5 kDa, wie durch native PAGE bestimmt, und einer von 306-374 kDa, wie durch native PAGE bestimmt, besteht und im wesentlichen frei von einer von H. pylori stammenden Komponente von 440 kDA ist;
(b) eine zweite Abteilung, die einen Antikörper enthält, welcher mit einem Reportermolekül konjugiert ist, das ein Signal erzeugen kann, wobei der Antikörper spezifisch für IgG-Antikörper ist; und
(c) wenn das Reportermolekül ein Enzym ist, eine dritte Abteilung, die ein Substrat für das Enzym enthält.
Der Kit kann auch zusätzliche Abteilungen enthalten, die zum Beispiel zur Aufnahme von geeignetem Schleimmaterial und/oder für ein oder mehrere Verdünnungsmittel und/oder Puffer vorgesehen sind. Der Kit kann auch für den Verkauf in einer geeigneten Form verpackt sein.
Die Kombination der ca. 265 kDa und ca. 340 kDa Antigene ohne das ca. 440 kDa Antigen von H. pylori ist bei der Durchführung des Verfahrens nach dem ersten Aspekt der Erfindung und in der Zubereitung von Kits gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung zweckdienlich. Gemäß einem dritten Aspekt der Erfindung wird daher ein H. pylori-Antigen-Präparat geschaffen, das aus einer von H. pylori stammenden Komponente von 238,5-291,5 kDa, wie durch native PAGE bestimmt, und einer von 306-374 kDa, wie durch native PAGE bestimmt, besteht und im wesentlichen frei von einer von H. pylori stammenden Komponente von 440 kDA ist.
Ein solches Antigen-Präparat kann, wie zuvor angeführt wurde, durch Gefriertrocknen eines Extrakts von H. pylori-Zellen zur Entfernung des ca. 440 kDa Antigens hergestellt werden. Gemäß einem vierten Aspekt der Erfindung wird daher ein Verfahren zur Herstellung eines Antigen-Präparats, wie zuvor beschrieben, geschaffen, wobei das Verfahren das Gefriertrocknen eines Extrakts von H. pylori-Zellen umfaßt. Der Extrakt, der einer Gefriertrocknung unterzogen wird, ist vorzugsweise eine ca. 67 kDa bis ca. 440 kDa Fraktion, die durch Größenausschlußchromatographie eines H. pylori-Rohextrakts erhältlich ist.
Weitere bevorzugte Merkmale jedes Aspekts der Erfindung gelten mit den nötigen Abänderungen für die anderen Aspekte.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, schränken aber deren Umfang nicht ein.

Beispiel 1

In diesem Beispiel wird ein ultraschallbehandeltes Rohmaterial von H. pylori hergestellt, einer FPLC-Fraktionierung unterzogen und gefriergetrocknet. Die Western-Blot-Analyse zeigt, daß etwa 265 und 340 kDa Proteine verantwortliche Faktoren in der immunologischen Spezifität des Tests der vorliegenden Erfindung sind. Diese Proteine zeigen nur eine Reaktionsfähigkeit in richtig positiven Ergebnissen, im Gegensatz zu einem möglicherweise kontaminierenden 440 kDa Protein. Dieses Protein wird durch Gefriertrocknung entfernt, auf die es empfindlich zu sein scheint.

Herstellung von Heliobacter pylori Antigen

Zentrifugiertes, ultraschallbehandeltes Material einschließlich Anionenaustauschchromatographie

i) Kulturen von H. pylori werden aus Schokolade-Agarplatten in PBS geerntet. Die Bakterien werden als zwei getrennte Kulturen, einem Wildstamm mit der Bezeichnung "Traub" und einem NCTC Stamm 11637, gezüchtet.
ii) Die Bakterien werden dreimal in PBS durch Zentrifugation über 5 Minuten bei 10000xg gewaschen.
iii)Gewaschene Bakterien werden in 2 ml PBS resuspendiert, und CFUs werden durch Ablesen eines Spektrophotometers bei 405 nm geschätzt.
iv) Die Suspension wird 5 Ultraschallbehandlungszyklen unterzogen (ein Zyklus besteht aus 30 Sekunden bei 6 u und anschließend 60 Sekunden Ruhe).
v) Ultraschallbehandelte Organismen werden 10 Minuten bei 10000xg zentrifugiert.
vi) Der Überstand wird gewonnen und durch einen 0,45 um, dann einen 0,22 um Filter gefiltert, um alle zurückbleibenden Zelltrümmer zu entfernen.
vii) Nach dem Filtern wird eine Proteinschätzung durchgeführt.
Achtung: Wenn es nicht möglich ist, das ultraschallbehandelte Material direkt zu verarbeiten, kann es an diesem Punkt im Verfahren bei -70ºC eingefroren werden, bis sich die Möglichkeit bietet, das Verfahren fortzusetzen.
viii) Die MONO QTM Anionenaustauschsäule kann 20-50 mg Protein pro 500 ul Einspritzung aufnehmen (somit kann das ultraschallbehandelte Material bis zu 40-100 mg Protein pro ml enthalten).
ix) An diesem Punkt muß das ultraschallbehandelte Material für gewöhnlich konzentriert werden, um die Anzahl von Einspritzungen zu verringern, die zur Verarbeitung des gesamten ultraschallbehandelten Materials erforderlich sind, und um die Proteinkonzentration auf den zulässigen Wert zu erhöhen. Die Konzentrierung wird unter Verwendung von CENTRISARTTM Konzentrationsröhrchen ausgeführt, die jeweils mit 2500 rpm 20 Minuten hindurch bei 4ºC drehen. Das ultraschallbehandelte Material wird für gewöhnlich konzentriert, um 2 bis 3 · 500 ul Einspritzungen zu erhalten.
x) Nach der Konzentration wird das Präparat in die MONO Q-Säule in 500 ul Einspritzungen eingebracht. Für jede Einspritzung gibt es eine Ablesung, und alle Parameter werden aufgezeichnet.
xi) Sobald das Präparat durchgelaufen ist, werden die MONO Q-Fraktionen auf einen Urease-Peak geprüft.
xii) Die aus dem Urease-Test erhaltenen Werte werden in das Proteinprofil eingetragen, das von der FPLC (siehe unten) erhalten wurde. Die erforderlichen Fraktionen werden dann gepoolt, und es wird eine Proteinschätzung durchgeführt. Diese Proteinkonzentration wird zur Bestimmung der Anzahl von Umdrehungen verwendet, die zum Konzentrieren des Pools auf etwa 1 ml erforderlich ist. Das Präparat wird unter Verwendung von CENTRISART-Konzentrationsröhren konzentriert.
FPLC Antigen-Fraktionen
i) Das ultraschallbehandelte Material wird durch schnelle Protein-Flüssigkeitschromatographie auf einer SUPEROSETM Ausschlußsäule der Größe 6 weiter gereinigt.
ii) Die Säule wird mit PBS, pH 7,6-7, 7, enthaltend 0,02 Gew.-/Vol.-% Natriumazid, äquilibriert.
iii) 200 ul ultraschallbehandeltes Material werden auf die Säule aufgebracht und 0,5 ml Fraktionen gesammelt.
iv) Fraktionen werden gesammelt, und ein Ureasetest wird durchgeführt, um den Urease-Peak zu finden. Die Werte werden in die Ablesung eingetragen, die von der FPLC erhalten worden war. Die erforderlichen Fraktionen werden gepoolt.
v) Eine kleine Teilmenge wird zur Durchführung einer nativen PAGE-Analyse entnommen, um die Beschaffenheit der Bindung zu prüfen. Diese Fraktionen enthalten nicht den Urease-Peak, sondern entsprechen einem Peak, der eine Gruppe kleinerer Moleküle mit einem Molekulargewicht zwischen 440 kDa und 67 kDa darstellt.
vi) Der Rest wird bei -20ºC gelagert und später mit anderen, gleichen Zubereitungen zur Bildung von Chargen gepoolt.

Gefriertrocknung

Antigen von den obengenannten Chargen wird in einem FSE-Gefriertrockner gefriergetrocknet, welcher umfaßt:
(a) eine Leybold (USA) TRIVACTM-Pumpe, Modell Nr. D4A;
(b) einen General Electric (USA) 240 Volt Wechselstrommotor;
(c) eine VIRTISTM Vakuumkammer (Virtis Co., Inc., New York, USA); und
(d) eine Kühleinheit, die in dem Schrank des Gefriertrockners eingebaut ist.
30 ml antigenhaltige Flüssigkeit, die in einem Winkel in einem 50 ml Probenkolben mit 5 cm Durchmesser zur Vergrößerung der Oberfläche gefroren wurde, wurde in die Vakuumkammer eingebracht und das System in Betrieb genommen. Die Temperatur des verwendeten Systems wurde immer auf -55ºC eingestellt. Das Vakuum des verwendeten Systems wurde bei 80-100 umTorr (etwa 0,001 Atmosphären) gehalten; der Bereich des Werts hängt von dem Ausgangsvolumen der gefrorenen Flüssigkeit und ihrem Oberflächenbereich und somit der Dampfmenge in der Kammer ab. Die Probe wurde bis zur vollständigen Trockenheit gefriergetrocknet, was 16-18 Stunden dauerte.

Native Gradient-PAGE unter Verwendung des PHASTSYSTEMTM von Pharmacia

Antigene von den obengenannten Fraktionen werden wie folgt vor und nach der Gefriertrocknung einer nativen PAGE unter Verwendung linearer Gradienten-Acrylamidgele unterzogen, und die Proteinprofile werden mit einer schnellen Silberfärbung sichtbar gemacht.
i) Pufferstreifen waren PHASTGELTM native Pufferstreifen zur Trennung der Proteine in ihrem nativen Zustand.
ii) Das Gel war ein PHASTGELTM Gradient 8-25. Dieses System ergibt ein lineares Verhältnis zwischen einer Wanderungsstrecke des Proteins und dem 10 g seines Molekulargewichts für den Molekulargewichtsbereich von 50 kDa bis 750 kDa für Sphäroproteine.
iii) Die verwendeten Marker waren der Elektrophorese-Kalibrierungskit von Pharmacia für Bestimmungen hoher Mokulargewichte. 1 Ampulle (Kat. Nr. 17-0445-01) eines lyophilisierten Markers wurde in 100 ul destilliertem Wasser aufgelöst. Der rekonstituierte Marker wurde 1/10 zur Silberfärbung des Gels verdünnt. 1 ul Marker wurde doppelt laufen gelassen.
iv) Für die Antigenprobe wurde 1 ul jedes durch SUPEROSETM FPLC-gereinigten Extrakts doppelt laufen gelassen.
v) Trennbedingungen: Proben wurden unter Verwendung der optimierten Methode der nativen PAGE von PHASTSYSTEMTM Separation Technique File No. 120 laufen gelassen. Die Länge des Laufs betrug 120 Volt. Stunden.
vi) Entwicklungsbedingungen: Das Gel wird nach der Methode von Tabelle 3 des PHASTSYSTEMTM Development Technique File No. 210 ("Silver Staining Method Optimised for Native-PAGE") silber gefärbt.
vii) Die Molekulargewichtsbestimmung wird unter Verwendung der Marker für hohes Molekulargewicht erhalten, die mit den Antigenen auf dem Gel laufen. Standardkurven werden bestimmt, indem das log Molekulargewicht gegen den Rf Wert eingetragen wird.

Vergleich von Antigenen vor und nach dem Gefriertrocknen

Unter Verwendung der obengenannten nativen PAGE-Methode wurden die folgenden Ergebnisse erhalten. Die Werte sind als Mittel plus oder minus einer Standardabweichung angegeben. (n) gibt die Anzahl von Bestimmungen an, die an dem Gel vorgenommen werden konnten.

Weitere Charakterisierung von Antigenens

i) Relative Molekularmassen können von einem Standard geschätzt werden, der Thyroglobulin, Ferritin, Katalase, Lactatdehydrogenase und Albumin enthält.
ii) Western-Blot-Methoden können für den Nachweis geeigneter Proteinbanden unter Verwendung von Seren, die H. pylori positiv sind, angewendet werden.
iii) FPLC-Fraktionierung entfernt jene Banden mit geringerem Molekulargewicht, die mit negativen Seren reaktionsfähig sind.
iv) Die Wirkung der Gefriertrocknung auf das Antigen-Präparat scheint die Gegenwart einer Einheit mit großem Molekulargewicht (etwa 440 kDa) zu verringern, die mit falsch positiven Seren reaktionsfähig ist. Das Fehlen der 440 kDa Bande ist für die Unterscheidung zwischen positiven, falsch positiven und negativen Seren wichtig.
Der Effekt dieses Reinigungsverfahrens ist die Identifizierung eines Proteins im Molekulargewichtsbereich von 255-275 kDa, aber im allgemeinen etwa 265 kDa, und eines Proteins, dessen Molekulargewicht etwa 340 kDa beträgt, die auf positive Seren, aber nicht auf negative Seren reagieren.

Beispiel 2

ENZYMGEBUNDENESIMMUNSORBENTASSAY (ELISA)

1. Beschichten von ELISA-Platten mit Antigen

i) Es werden Polystyrol-ELISA-Platten verwendet (Polysorb, Nung, Dänemark).
ii) Das gefriergetrocknete Antigen-Präparat von Beispiel 1 wird optimal in Beschichtungspuffer (siehe 2(iii) unten) verdünnt (höchste Verdünnung, die eine maximale Empfindlichkeit für Antikörper-positiven Speichel ergibt, ohne die Reaktionsfähigkeit von Antikörper-negativem Speichel zu erhöhen).
iii) Eine Teilmenge von 100 ul verdünntem Antigen wird den "Antigen"-Vertiefungen einer ELISA-Platte zugegeben und 100 ul Beschichtungspuffer (ohne Antigen) werden den "Puffer"-Vertiefungen zugegeben.
iv) Die Platten werden über Nacht bei einer Temperatur von 4ºC inkubiert.
v) Die inkubierten Platten werden geleert, eine Teilmenge von 100 ul Gew.-/Vol.-% getrocknetem Magermilchpulver/Beschichtungspuffer (siehe 2(iii) unten) wird über 30 Minuten zugegeben und sofort durch Herausschlagen des Inhalts entleert.

2. Puffer

i) Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS): 0,14M NaCl, 0,003M Na&sub2;HPO&sub4;, 0,001N NaH&sub2;PO&sub4;.2H&sub2;O in 1 Liter entionisiertem Wasser, eingestellt auf pH 7,2.
ii) Substratpuffer: 10, lg Zitronensäure, 14,2 g Dinatriumhydrogenorthophosphat (Na&sub2;HPO&sub4;), 150 ul H&sub2;O2 (30 Gew.-/Vol.-%) in 1 Liter entionisiertem Wasser, eingestellt auf pH 5,0.
iii) Beschichtungspuffer: 2,42 g TRIS[tris(hydroxymethyl)aminomethan], 58,44 g NaCl in 1 Liter entionisiertem Wasser, eingestellt auf pH 7,5.

3. Behandlung der Platten nach der Antigenbeschichtung

Für eine langfristige Lagerung (6 Monate) von antigenbeschichteten Platten werden die Platten nach dem Beschichten und Blockieren getrocknet und mit einem Trocknungsmittel bei 4ºC gelagert. Dieses Verfahren ist für eine langfristige Konservierung der antigenbeschichteten Platten notwendig.

4. ELISA-Verfahren

a) Meerrettichperoxidaseverfahren

i) Eine Teilmenge von 100 ml Speichel, 1/2 verdünnt in 0,05 Gew.-/ Vol.- getrocknetem Magermilchpulver/PBST (PBSTM) oder 100 ml Speichel, 1/2 verdünnt in PBSTM wird einer Antigenvertiefung und einer Puffervertiefung der ELISA-Platte zugegeben.
ii) Die Platten werden bis zu 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
iii) Die Platten werden fünfmal durch Eintauchen in PBST gewaschen.
iv) Eine Teilmenge von 100 ul Meerrettichperoxidase-Anti-Human-IgG, optimal in PBSTM verdünnt (höchste Verdünnung, die eine maximale Empfindlichkeit für Antikörper-positiven Speichel ergibt, ohne die Reaktionsfähigkeit von Antikörper-negativem Speichel zu erhöhen), wird den Antigen- und Puffervertiefungen zugegeben.
v) Die Platten werden bis zu 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
vi) Die Platten werden fünfmal durch Eintauchen in PBST gewaschen.
vii) Eine Teilmenge von 100 ul Meerrettichperoxidase-Substrat (Produkt T-2885, Sigma, USA) in Substratpuffer wird den Antigen- und Puffervertiefungen zugegeben.
viii) Die Platten werden bis zu 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
ix) 100 ul 1M H&sub2;SO&sub4; werden den Antigen- und Puffervertiefungen zugegeben.
x) Für jede Serum- oder Speichelprobe wird die Extinktion (A) der Puffervertiefung von A der Antigenvertiefung subtrahiert, und die erhaltene A wird unter Verwendung einer Standardkurve (die durch Verdopplung der Verdünnungen eines Antikörper-positiven Standardserums erstellt wird) in ELISA-Einheiten umgewandelt.
xii) Eine Zusammenfassung von 100 Speichelproben von Patienten, bei welchen durch Biopsie eine Infektion festgestellt (oder nicht festgestellt) wurde, wird zur Bestimmung der Anzahl von ELISA-Einheiten verwendet, die einer Infektion entsprechen.

Beispiel 3

IMMUNOBLOTTINGTEST

1. Herstellung von Heliobacter pylori Antigen

Das Verfahren zur Herstellung von H. pylori Antigen für den Immunoblottingtest ist mit jenem von Beispiel 1 identisch.

2. Beschichten der Membran mit Antigen

i) Es wird eine Nitrozellulosemembran verwendet. Es können auch Membrane auf Nylonbasis verwendet werden.
ii) Nach dem Trockenblotten wird die Membran 5 Minuten in einer optimalen Antigenverdünnung. (höchste Verdünnung von Antigen, die eine maximale Empfindlichkeit für Antikörper-positive Proben ergibt, ohne die Reaktionsfähigkeit von Antikörper-negativen Proben zu erhöhen) eingeweicht.
iii) Die Membran wird dann 30 Minuten in 5 Gew.-/Vol.-% Magermilchpulver/TBS inkubiert.
iv) Die Membran wird zweimal 5 Minuten in 0,05 Gew.-/Vol.-% PolyoxyethylensorbitanmonolauratlTBS (TBST) gewaschen. Zur langfristigen Lagerung (bis zu 18 Monate) wird die Membran dann getrocknet und mit einem Trocknungsmittel bei 4ºC gelagert.
v) Die Membran wird bis zu 5 Minuten in unverdünnten Testspeichel in einer Testflasche oder unter der Zunge eingetaucht.
vi) Die Membran wird 30 Sekunden unter fließendem Leitungswasser gewaschen.
vii) Die Membran wird in Anti-Human-IgG, das an alkalische Phosphatase konjugiert und optimal verdünnt ist (um eine Unterscheidung zwischen Antikörper-positivem und Antikörper-negativem Speichel zu ermöglichen), in PBSTM bis zu 5 Minuten eingetaucht.
viii) Die Membran wird 30 Sekunden unter fließendem Leitungswasser gewaschen.
ix) Die Membran wird S Minuten in Substrat (0,3 mg Nitroblautetrazolium, 0,15 mg 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat in 1 ml 0,1M NaHCO&sub3;, 1,0mM MgCl&sub2;, pH 9,8) eingetaucht.
x) Antikörper-positive Proben erzeugen eine malvenfarbene Farbveränderung im Antigenbereich der Membran, während Antikörper-negative Proben die Farbe der Membran im Antigenbereich nicht verändern.

Beispiel 4

Patienten, die sich an das Gastroenterology Department, Royal North Shore Hospital, NSW, zur Untersuchung oberer gastrointestinaler Symptome wandten, wurden untersucht. Falls möglich, wurden bei allen Patienten eine mikrobiologische Kultur, eine Mikroskopie für den Nachweis von H. pylori, Urease-Tests und eine Histologie von Magenbiopsien und ELISAs durchgeführt.

Korrelation von Speichel-Antikörpern mit Biopsietests auf H. pylori

Das Verhältnis zwischen histologischen Magenbiopsie- und Speichel-ELISA-Ergebnissen, gemeinsam mit anderen Tests auf eine Infektion mit H. pylori sind in der folgenden Tabelle angeführt.
Ein Serum-ELISA hat sich beim Nachweis einer Infektion mit H. pylori als empfindlicher und spezifischer als die Biopsietests erwiesen, und wird zunehmend allgemein als der "Goldstandard" für den Nachweis einer Infektion mit H. pylori anerkannt. Die Ergebnisse in dieser Tabelle zeigen, daß das Speichel-Testsystem ebenso gut funktioniert wie Serum. Wenn keine Entzündung oder chronische Entzündung vorliegt, funktionieren alle Tests, die gegenwärtig verfügbar sind, einschließlich Urease, Kultur und Histologie, ziemlich gleich. Bei Patienten mit einer akuten Entzündung wird jedoch häufiger eine Infektion mit H. pylori sowohl beim Serum als auch Speichel-ELISA angezeigt als bei den anderen Systemen. Der Grund dafür kann die Tatsache sein, daß die Biopsie ein ziemlich willkürliches Probenentnahmeverfahren ist und Bereiche mit H. pylori Befall verfehlen kann. Wie offensichtlich ist, korrelieren die Speichel-ELISA Ergebnisse gut mit den Serum-ELISA Ergebnissen. VERHÄLTNIS ZWISCHEN ELISAs UND BIOPSIETESTS MIT MAGENHISTOLOGIE

Claims

1. Verfahren zum Auffinden einer bestehenden Infektion mit Heliobacter pylori in einem Säugetier, wobei das Verfahren umfaßt, daß ein Schleimsekret von dem Säugetier mit einem Antigen-Präparat aus H. pylori für eine Zeit und unter Bedingungen in Kontakt gebracht wird, die ausreichen, damit ein IgG-Antikörper in dem Schleimsekret, der für die Antigen-Komponente spezifisch ist, einen Komplex mit dieser bildet, und der Komplex anschließend einem Detektionsmittel ausgesetzt wird, um den Komplex aufzufinden, wobei das Antigen-Präparat aus einer von H. pylori stammenden Komponente von 238,5-291, 5 kDa, wie durch native PAGE bestimmt, und einer von 306-374 kDa, wie durch native PAGE bestimmt, besteht und im wesentlichen frei ist von einer von H. pylori stammenden Komponente von 440 kDa, wie durch native PAGE bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Antigen-Präparat zusätzlich ein von H. pylori stammendes Antigen mit einem Molekulargewicht von 144-176 kDa, wie durch native PAGE bestimmt, und/oder eines von 63-77 kDa, wie durch native PAGE bestimmt, enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Schleimsekret Speichel ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Antigen-Präparat an einen festen Träger gebunden ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der feste Träger ein Nitrozellulosestreifen ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Detektionsmittel ein zweiter Antikörper ist, der mit einem Reportermolekül konjugiert ist und für wenigstens einen Teil der in dem Sekret gefundenen H. pylori-spezifischen Antikörperklasse spezifisch ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Reportermolekül ein Enzym oder ein Fluorophor ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Reportermolekül ein Enzym ist und das Enzym alkalische Phosphatase ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Säugetier ein Mensch ist.

10. Testkit zum Nachweis von H. pylori in einem Schleimsekret eines Säugetiers, wobei dieses Testkit umfaßt:

(a) einen festen Träger mit einem darauf immobilisierten Antigen-Präparat aus H. pylori, wobei das Antigen-Präparat aus einer von H. pylori stammenden Komponente von 238,5-291, 5 kDa, wie durch native PAGE bestimmt, und einer von 306-374 kDa, wie durch native PAGE bestimmt, besteht und im wesentlichen frei ist von einer von H. pylori stammenden Komponente von 440 kDa, wie durch native PAGE bestimmt.

(b) ein Detektionsmittel, das bei Gebrauch auffindet, ob IgG in dem Schleimsekret an eine oder mehrere Komponenten des Antigen-Präparats bindet.

11. Kit nach Anspruch 10, wobei das Antigen-Präparat zusätzlich ein von H. pylori stammendes Antigen mit einem Molekulargewicht von 144-176 kDa, wie durch native PAGE bestimmt, und/oder eines von 63-77 kDa, wie durch native PAGE bestimmt, enthält.

12. Kit nach Anspruch 10 oder Anspruch 11, wobei das Schleimsekret Speichel ist.

13. Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei der feste Träger ein Nitrozellulosestreifen ist.

14. Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei das Detektionsmittel ein zweiter Antikörper ist, der mit einem Reportermolekül konjugiert ist und für wenigstens einen Teil der in dem Sekret gefundenen H. pylori-spezifischen Antikörperklasse spezifisch ist.

15. Kit nach Anspruch 14, wobei das Reportermolekül ein Enzym oder ein Fluorophor ist.

16. Kit nach Anspruch 15, wobei das Reportermolekül ein Enzym ist und das Enzym alkalische Phosphatase ist.

17. Kit nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei das Testkit in Form von Abteilungen vorliegt und umfaßt:

(a) eine erste Abteilung, die dafür vorgesehen ist, den festen Träger mit einem darauf immobilisierten Antigen-Präparat aus H. pylori zu enthalten;

(b) eine zweite Abteilung, die den zweiten Antikörper enthält, welcher mit einem Reportermolekül konjugiert ist, das ein Signal erzeugen kann, wobei der Antikörper spezifisch für IgG-Antikörper ist; und

(c) wenn das Reportermolekül ein Enzym ist, eine dritte Abteilung, die ein Substrat für das Enzym enthält.

18. Kit nach Anspruch 17, das außerdem zusätzliche Abteilungen enthält, die für die Aufnahme von geeignetem Schleimmaterial und/oder für ein oder mehrere Verdünnungsmittel und/oder Puffer vorgesehen sind.

19. H. pylori-Antigen-Präparat, das aus einer von H. pylori stammenden Komponente von 238,5-291, 5 kDa, wie durch native PAGE bestimmt, und einer von 306-374 kDa, wie durch native PAGE bestimmt, besteht und im wesentlichen frei ist von einer von H. pylori stammenden Komponente von 440 kDa, wie durch native PAGE bestimmt.

20. H. pylori-Antigen-Präparat nach Anspruch 19, das zusätzlich eine von H. pylori stammende Komponente von 144-176 kDa, wie durch native PAGE bestimmt, und/oder eine von 63-77 kDa, wie durch native PAGE bestimmt, enthält.