PL172125B1 - Sposób wykrywania trwajacych infekcji Helicobacter pyroli w komórkach ssaków PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wykrywania trwajacych infekcji Helicobacter pyroli w komórkach ssaków, znamienny tym, ze doprowadza sie do kontaktu wydzieliny sluzówki ssaka z preparatem antygenowym H.pyroli przez czas i w warunkach odpowiednich dla przeciwciala IgG z wydzielmy sluzówki, specyficznego do skladnika antygenowego w preparacie antygeno- wym, tworzy sie z nim kompleks, i wystawia sie ten kompleks na dzialanie srodka wykrywajacego w celu wykrycia kompleksu, przy czym stosuje sie preparat antygenowy zawierajacy pochodzace z H.pyroli skladniki o wielkosci 238,5 - 291,5 kDa jako natywna PAGE i 306 - 374 kDa jako natywna PAGE i jest zasadniczo wolny od pochodzacego z H.pyroli skladnika o wielkosci 440 kDa jako natywna PAGE. PL PL PL

Description

Wynalazek dotyczy sposobu szybkiego wykrywania in vitro infekcji Helicobacter pyroli w komórkach ssaków. Bardziej szczegółowo, wynalazek obecny rozważa sposób wykrywania przeciwciał IgG przeciw H.pyroli w wydzielinach śluzówki i w ten sposób dostarcza środka do monitorowania trwających infekcji bakteryjnych u ssaków.

Infekcja przewodu pokarmowego ssaków, a szczególnie człowieka stymulują odpowiedź immunologiczną w wydzielinach śluzówki, takich jak ślina, poprzez aktywację systemu immunologicznego śluzówki. Taka odpowiedź często początkowo towarzyszy odpowiedzi immunologicznej w surowicy, chociaż jest ogólnie scharakteryzowana przez obecność przeciwciał IgA. Jednakże, odpowiedź immunologiczna w wydzielinach, włączając ślinę, gwałtownie zanika wraz z zanikiem w organizmie antygenu (na przykład, bakterii lub wirusów). Tak więc, obecność przeciwciał w wydzielinach śluzówki odzwierciedla obecne, to znaczy trwające infekcje. Na przykład, w przypadku infekcji bakteryjnych, przeciwciała w wydzielinach śluzówki, nazywane tu i dalej przeciwciałami wydzielniczymi, odzwierciedlają obecny stan zasiedlenia mikroorganizmami, na przykład,

172 125 przewodu pokarmowego, i dlatego są użyteczne do monitorowania trwających infekcji. Z drugiej strony, przeciwciała surowicy, obecne są przez pewien czas po wyeliminowaniu mikroorganizmu z ciała. Dodatni wynik testu opartego na przeciwciałach surowicy, odzwierciedla obecne i przeszłe narażenie na antygen, co jest mniej użyteczne dla klinicystów. Z drugiej strony, dodatni wynik testu opartego na przeciwciałach wydzielniczych, odzwierciedla obecną lub trwającą infekcję przez mikroorganizm. Wynalazek obecny powstał w wyniku badań infekcji Helicobacter pyroli (znanej także jako Campylobacter pyroli) przewodu pokarmowego ssaków. Postawienie diagnozy o infekcji H.pyroli jest możliwe za pomocą mikroskopu, hodowli bakterii, wykrycia ureazy w biopsji śluzówki przewodu pokarmowego, testu na rozkład mocznika lub wykrycia obecności specyficznych przeciwciał w surowicy przy użyciu testu ELISA. Można przewidzieć, że infekcja H.pyroli, która jest infekcją śluzówki przewodu pokarmowego, zwiększy odpowiedź humoralną przeciwciał IgA w wydzielinach przewodu pokarmowego. Jednakże, w czasie prac poprzedzających obecny wynalazek, odkryto, specyficzne do H.pyroli przeciwciała występujące w wydzielinach śluzówki należą do klasy IgG, a nie do IgA, jak można się było spodziewać. Wykrywano, bardzo mało lub w ogóle nie wykrywano przeciwciał IgA. Tak więc, AU-A-9067676 jest nakierowany na wykrywanie w wydzielinach śluzówki przeciwciał IgG przeciw specyficznym antygenom H.pyroli i w ten sposób zapewnia środek do monitorowania obecnych, to znaczy trwających infekcji bakteryjnych w organizmach ssaków. Odpowiednia publikacja naukowa to Witt i wsp., Frontiers in Mucosal Immunology 1 693-696 (1991).

Obecność przeciwciał IgG w ślinie pacjentów zainfekowanych Campylobacter pyroli wzbudziła pewne zainteresowanie na dorocznym zjeździe Amerykańskiego Towarzystwa Gastroenterologicznego. Po wykryciu przez Czinn i wsp., obecności takich przeciwciał (publikacja po zjeździe w 1989 roku) Larsen i wsp., stwierdzili w publikacji po zjeździe w maju 1991 roku, że poziom IgG w ślinie jest praktycznym, nieinwazyjnym markerem odpowiedzi terapeutycznej w czasie trwania leczenia antybiotykami. W publikacji po zjeździe w kwietniu 1992 roku Landes i wsp., potwierdził wcześniejsze obserwacje i stwierdził, że mierzenie poziomu IgG przeciw Helicobacter pyroli w ślinie jest prostym, nieinwazyjnym testem do wykrywania infekcji H.pyroli u pacjentów szczególnie w populacjach szeroko rozprzestrzenionych lub u dzieci, gdzie inne testy są niepraktyczne.

Z powyższego jasno wynika, że istnieje duże zainteresowanie i zapotrzebowanie kliniczne na oparty na pomiarze poziomu ślinowych IgG test do wykrywania Hi.pyroli. Jasne jest także, że taki test musi być wiarygodny, a także wygodny. Znane są sposoby inwazyjne (na przykład, US-A-4 882 271, Schaber i wsp., J. Clin. Microbiol. 27(2) 327-330 (1989), Loffeld i wsp., The Lancet, 27 maja 1989,1182-1185 i Evans i wsp., Gastroenterology 96 1004-1008 (1989)) i wykorzystane (na przykład, zestaw CLOtest™, który jest dostępny od Delta West Ltd., Perth, Australia Zachodnia i który wykrywa obecność ureazy w próbkach biopsji). Test nieinwazyjny musi mieć niezawodność porównywalną z testami inwazyjnymi, żeby zostać zaakceptowanym i użytecznym.

Wynalazek obecny dotyczy ulepszenia niezawodności testu do wykrywania H.pyroli opartego na oznaczaniu IgG ślinowych (lub innych śluzowych). Stwierdzono, że specyficzność immunologiczną wykrywania można ulepszyć przez wykrywanie IgG śluzowych, dzięki użyciu pewnych antygenów H.pyroli i unikanie użycia innych.

Sposób wykrywania trwających infekcji Helicobacter pyroli w komórkach ssaków według wynalazku polega na tym, że doprowadza się do kontaktu wydzieliny śluzówki ssaka z preparatem antygenowym H.pyroli przez czas i w warunkach odpowiednich dla przeciwciała IgG z wydzieliny śluzówki, specyficznego do składnika antygenowego w preparacie antygenowym, tworzy się z nim kompleks, i wystawia się ten kompleks na działanie środka wykrywającego w celu wykrycia kompleksu, przy czym stosuje się preparat antygenowy zawierający pochodzące z H.pyroli składniki o wielkości 238,5 291,5 kDa jako natywna PAGE i 306 - 374 kDa jako natywna PAGE i jest zasadniczo wolny od pochodzącego z H.pyroli składnika o wielkości 440 kDa jako natywna PAGE.

m 125

W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się preparat antygenowy zawierający dodatkowo pochodzące z H.pyroli antygeny o masie cząsteczkowej wynoszącej 144 - 176 kDa jako natywna PAGE i/lub 63 - 77 kDa jako natywna PAGE. Korzystnie jako wydzielinę śluzówki stosuje się ślinę. Sposób według wynalazku polega na tym, że korzystnie stosuje się preparat antygenowy związany ze stałym nośnikiem. Jako stały nośnik korzystnie stosuje się pasek nitrocelulozowy. W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się środek wykrywający, będący drugim przeciwciałem, sprzężonym cząsteczką reportera, która jest specyficzna przynajmniej do części klasy specyficznego przeciwciała przeciw H.pyroli znajdującego się w wydzielinie. Korzystnie jako cząsteczkę reportera stosuje się enzym lub fluorofor. Korzystniej jako cząsteczkę reportera stosuje się enzym, przy czym enzymem tym jest fosfataza alkaliczna. W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się wydzielinę śluzówki ssaka którym jest człowiek.

Stwierdzono, że jeśli składnik o wielkości około 440 kDa jest obecny, u niektórych pacjentów można otrzymać fałszywy wynik pozytywny. Natomiast, jeżeli brak jest antygenu o wielkości około 265 kDa można otrzymać fałszywy wynik negatywny. Ponadto, jeżeli brak jest antygenu H.pyroli o wielkości około 340 kDa, u niektórych pacjentów można otrzymać fałszywy wynik negatywny, dlatego obecność antygenu o wielkości około 340 kDa jest wysoce pożądana. Inne składniki antygenowe H.pyroli, które mogą lecz nie muszą być obecne, obejmują składniki o masie cząsteczkowej około 160 kDa i około 70 kDa.

Do celów tego wynalazku, antygen jest obecny jeżeli można go wykryć metodą western blotting. Jest więc nieobecny jeżeli nie można go wykryć tą metodą. Czułość metody western blotting rzędu 20 μ g/ml jest powszechnie akceptowana.

Masa cząsteczkowa składników antygenowych użytecznych sposobem według wynalazku jest z konieczności przybliżona, z powodu ograniczeń obecnie stosowanych sposobów określania masy cząsteczkowej. Specyficznie określone masy cząsteczkowe otrzymano zwykłym zestawem do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE) sprzedawanym przez firmę Pharmacia pod znakiem handlowym PHASTGEL™, przy użyciu gradientu 8-25 PHASTGEL. Zestaw ten daje liniową zależność pomiędzy odległością migracji białka w żelu a logarytmem jego masy cząsteczkowej, dla białek globuralnych o masie cząsteczkowej z zakresu od 50000 do 750000. W swoim zestawie do kalibracji elektroforezy Pharmacia dostarcza zestaw markerów o wysokiej masie cząsteczkowej, ten zestaw markerów był użyty do kalibracji wspomnianych w tym wynalazku żelów. Biegli w sztuce wiedzą, że w innych rękach lub w tych samych rękach przy innej okazji można otrzymać nieco inne wyniki, i że przybliżone masy cząsteczkowe wyszczególnione w niniejszym opisie powinny być czytane jako ±5% lub nawet +10%. Z tego powodu antygen około 265 kDa czasami jest oznaczany jako antygen 255-275 kDa.

Wyrażenie antygen używane jest w swoim szerszym znaczeniu i obejmuje całe komórki H.pyroli lub homogenne, prawie homogenne lub heterogenne ekstrakty H.pyroli, wszystkie zdolne do wiązania się ze specyficznym przeciwciałem w wydzielinie śluzówki, pod warunkiem, że zawsze obecny jest pochodzący z H.pyroli antygen około 265 kDa (i korzystnie około 340 kDa), i że pochodzący z H.pyroli antygen około 440 kDa jest całkowicie nieobecny. Składniki antygenowe rozważane w obecnym wynalazku obejmują białka, polisacharydy lub lipidy lub ich każdą kombinację. Korzystnie, antygenem jest białko, lipopolisacharyd lub ekstrakt komórkowy H.pyroli, otrzymany na przykład, przez sonifikację, rozbicie nadciśnieniem, ekstrakcję detergentami lub frakcjonowanie.

Jedną z najbardziej efektywnych metod stwierdzenia, że pożądane antygeny są obecne po usunięciu wielu nieodpowiednich składników jest chromatografia surowego ekstraktu (na przykład, sonikatu) komórek H.pyroli. Na przykład, szczególnie wydajna przy zastosowaniu do surowego sonifikatu komórek, który został poddany chromatografii jonowymiennej jest szybka, ciekła chromatografia białka (FLPC), taka jak chromatografia

17.125 wykluczania przy użyciu kolumn SUPEROSE™ 6. Inne metody dostępne dla biegłych w sztuce też są dobre.

Jedną z najbardziej wydajnych metod gwarantujących, że niepożądany antygen około 440 kDa jest nieobecny, jest liofilizacja ekstraktu komórek H.pyroli, szczególnie po oczyszczaniu chromatograficznym, takim jak FPLC. Liofilizację ekstraktu można prowadzić w każdym odpowiednim do tego celu aparacie. Konkretne wyposażenie i użyte warunki zależą od skali preparacji.

Korzystnie jest gdy, proces liofilizacji prowadzi się do całkowitego zakończenia, w zakresie możliwości stwarzanych przez użyte wyposażenie.

Wynalazek obejmuje użycie naturalnie występujących form antygenu i form syntetycznych (na przykład, zrekombinowanych) i ich immunologicznie aktywnych pochodnych, analogów i pokrewnych. Dlatego jest jasne, że wydajny zestaw antygenowy do użycia sposobem według wynalazku może być selektywnie uzyskany z preparatu komórek H.pyroli lub zbudowany z pojedynczych składników lub mieszaniny powyższych.

Sposobem według wynalazku przeciwciała wykrywa się w wydzielinie śluzówki. Przez wydzielinę śluzówki rozumie się wydzielinę komórek nabłonka wydzielniczego śluzówki (to jest błonę śluzówki), takich jak te, które wyścielają kanaliki, jamki i przewody, które komunikują się z powietrzem zewnętrznym, a szczególnie nosa, gardła, dróg oddechowych, oczu, przewodów płciowych i moczowych i układu trawiennego. W korzystnym przykładzie wykonania wynalazku, wydzieliną śluzówki jest wydzielina z nosa, plwocina, a szczególnie ślina.

Ślinę i inne wydzieliny śluzówki można testować nierozcieńczone lub po rozcieńczeniu odpowiednim rozcieńczalnikiem (takim jak woda destylowana). Wraz ze zwiększeniem czułości, rozcieńczanie może być korzystne (szczególnie gdy używa się urządzeń zbierających).

Preparat antygenowy jest dla wygody i preferencyjnie związany ze stałym nośnikiem. Odpowiednie stałe nośniki obejmują błony nitrocelulozowe, szkło lub polimery. Najbardziej powszechnie używane do tego celu polimery to celuloza, poliakrylamid, nylon, polistyren, chlorek poliwinylu lub polipropylen, ale wynalazek nie jest do nich ograniczony. Stały nośnik może występować w formie pasków, rurek, perełek, krążków lub mikropłytek, lub każdej innej powierzchni odpowiedniej do prowadzenia testu immunologicznego.

Składnik antygenowy H.pyroli użyteczny w tym wynalazku może być kowalencyjnie lub niekonwalencyjnie (pasywnie) związany ze stałą powierzchnią. Odpowiednie procesy wiązania są dobrze znane biegłym w sztuce i ogólnie obejmują wiązanie krzyżowe, wiązanie kowalencyjne lub fizyczną adsorbcję antygenu na stałym nośniku.

Sposobem według wynalazku stawia się diagnozę o infekcji przez wykrycie tworzenia kompleksu pomiędzy przeciwciałem IgG z próbki śluzu i antygenu H.pyroli. Potrzebna jest więc pewna forma środka wykrywającego w celu określenia obecności (lub, jeśli to konieczne, określenia ilości) kompleksu przeciwciało-antygen.

Środkiem wykrywającym może być drugie przeciwciało połączone z cząsteczką reportera, przeciwciało które jest specyficzne przynajmniej do części klasy specyficznego przeciwciała przeciw H.pyroli znajdującego się w wydzielinie, jak wyjaśniono powyżej, tym przeciwciałem jest IgG.

Cząsteczka reportera jest cząsteczką lub grupą cząsteczek, które przez swoją naturę chemiczną, mają identyfikowalną analitycznie charakterystykę lub zapewniają identyfikowalny analitycznie sygnał, który pozwala na wykrycie związanego z antygenem przeciwciała. Wykrywanie może być ilościowe lub jakościowe. Najbardziej powszechnie używane w testach tego typu cząsteczki reportera to enzymy, fluorofory, lub cząsteczki zawierające izotopy promieniotwórcze (to znaczy radioizotopy). W przypadku enzymatycznych testów immunologicznych, enzym jest sprzężony z drugim przeciwciałem, ogólnie za pomocą aldehydu glutarowego lub najdodanu. Jednakże, łatwo można rozpoznać, że istnieje wiele różnych technik sprzęgania, które mogą być łatwo

125 dostępne dla biegłych w sztuce. Powszechnie używane enzymy obejmują, między innymi, peroksydazę korzenia chrzanu, oksydazę glukozy, β-galaktozydazę i fosfatazę alkaliczną. Substraty, których można użyć ze specyficznymi enzymami, ogólnie wybiera się pod kątem wytwarzania, po hydrolizie przez odpowiedni enzym, wykrywalnej zmiany koloru. Substraty mogą być rozpuszczalne lub nierozpuszczalne, w zależności od wybranego zastosowania.

Na przykład, 5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforan/błękit nitrotetrazolowy jest odpowiedni do użycia z koniugatami fosfatazy alkalicznej, dla koniugatów peroksydazy przeważnie używa się kwasu l,2-fenylenodiamino-5-aminosaiicylowego, 3,3,5,5tetrametylobenzydyny, tolidyny lub dwuanizydyny. Możliwe jest także zastosowanie substratów fluorogennych, dających substraty fluorescencyjne, zamiast wspomnianych powyżej substratów chromogennych. Przykładem substratów fluorogennych są fluoresceina i rodamina. Po wzbudzeniu przez naświetlenie światłem o określonej długości fali przeciwciało znakowane fluorochromem adsorbuje energię świetlną, wywołując stan wzbudzenia cząsteczki, po czym następuje emisja światła o charakterystycznym kolorze, który można przeważnie wykryć wizualnie pod mikroskopem świetlnym. Techniki immunofluorescencji i ETA są dobrze znane w sztuce i są szczególnie korzystne w obecnym wynalazku. Jednakże inne cząsteczki reportera, takie jak, radioizotopy, cząsteczki chemiluminescencyjne i bioluminescencyjne i/lub barwniki i inne substancje chromogenne także mogą być użyte.

Wybór określonego przeciwciała sprzężonego z cząsteczką reportera jest w największym stopniu uzależniony od zamierzonego użycia i użytkownika sposobu według wynalazku. Ponadto, chociaż test jest odpowiedni dla wszystkich ssaków wrażliwych na infekcje H.pyroli jest najlepszy i najbardziej użyteczny do monitorowania infekcji H.pyroli u ludzi.

Użycie wydzieliny śluzówki, a szczególnie do wykrywania przeciwciał przeciw H.pyroli umożliwia diagnozowanie trwających lub obecnych infekcji i w ten sposób pozwala praktykującemu lekarzowi na:

a) powiązanie objawów jelitowych z H.pyroli, co umożliwia podjęcie decyzji pod kątem dalszych badań (włączając procedury inwazyjne) i/lub leczenia (na przykład, użycia specyficznych związków przeciw H.pyroli). Można się spodziewać, że to ostatnie ma szczególnie znaczenie w odniesieniu do związanej z H.pyroli niewrzodowej niestrawności, zapalenia żołądka, owrzodzeniu dwunastnicy, owrzodzeniu żołądka i podobnych, a także w innych warunkach.

b) Mając po raz pierwszy wygodny nieinwazyjny test w pokoju lekarskim, klinice lub szpitalu można badać pacjentów z wykrytym wrzodem trawiennym w celu wczesnego wykrycia nawrotów. Dodatni wynik pozwala na wczesną diagnozę i zapobieganie lub wczesne leczenie nawrotów wrzodu trawiennego. Wynik ujemny ma użyteczne znaczenie dla analizy podejścia diagnostycznego do niestrawności.

Ponadto, test dostarcza prostej odpowiedzi tak/nie, nie wymagającej, na przykład, pobieranie krwi. Może być odczytany w ciągu minut i wykonany bez żadnych specjalnych przygotowań przez klinicystę. Znaczną przewagą obecnego wynalazku jest użycie wydzieliny śluzówki (na przykład, śliny) do wykrywania przeciwciał specyficznych do H.pyroli.

Następujące przykłady ilustrują wynalazek ale nie ograniczają jego zakresu.

Przykład I. W tym przykładzie wytwarza się surowy sonifikat H.pyroli, poddaje go frakcjonowaniu metodą FPLC i liofilizacji. Analiza metodą western blotting wykazała, że białka o wielkości około 265 kDa i 340 kDa są czynnikiem odpowiedzialnym za specyficzność immunologiczną testu wykonanego sposobem według wynalazku. Białka te dają tylko prawdziwe wyniki dodatnie, w odróżnieniu od potencjalnych zanieczyszczeń białkiem o wielkości 440 kDa. Białko to usuwa się przez liofilizację, na którą okazało się ono wrażliwe.

172 125

Otrzymywanie antygenu Helicobacterpyroli.

Odwirowany sonifikat, włączając chromatografię anionowymienną

i) Hodowla H.pyroli zbiera się z płytek z agarem czekoladowym do PBS. Bakterie rosną w dwóch osobnych hodowlach, szczep dziki oznaczony Traub i szczep NCTC 11637.

ii) Bakterie przemywa się trzy razy PBS wirując przez 5 minut przy 10000 x g.

iii) Przemyte bakterie zawiesza się w 2 ml PBS i oznacza się ilość bakterii przez odczyt na spektrofotometrze przy długości fali 405 nm.

iv) Zawiesinę poddaje się 5 cyklom sonifikacji (jeden cykl tworzy 30 sekund sonifikacji przy 6 μ i 00 sekund pnrerwy.

v) Sonifikowane mikroorganizmy wirowuje się przez 10 minut przy 10000 x g.

vi) Zbiera się supernatant i filtruje przez filtr o wielkości porów 0,45 um. a następnie 0,22 μm w celu usunięcia wszystkich pozostałości komórkowych.

vii) Po przefiltrowaniu wykonuje się oznaczenie białka.

Uwaga Jeśli bezpośrednia obróbka sonifikatu nie jest możliwa, w tym punkcie sposobu według wynalazku, można go zamrozić do temperatury -70°C, az do momentu, gdy nadarzy się możliwość kontynuowania metody.

viii) Kolumna anionowymienna Mono Q™ może nieść 20-50 mg białka na 500 μΐ injekcję (tak więc, sonifikat może mieć do 40-100 mg białka na ml).

ix) W tym pwkcie sonifikat przeważnie wymnga κήφΟϊηίa w żelu zmniejszenin liczby iniekcji koniecznych do obróbki całego sonifikatu i do zwiększenia stężenia białka do dopuszczalnego poziomu. Zatężanie prowadzi się przy użyciu probówek do zatężenia CENTRISART™, które wiruje przy 2500 obrotów na minutę przez 20 minut w temperaturze 4°C.

Sonifikat przeważnie zatęża się do uzyskania 2 do 3 injekcji po 500 μΐ.

x) Po zatężeniu preparatu nanosi się go na kolumnę MONO Q w 500 μΐ injekcjach. Dla każdej injekcji prowadzi się odczyt i nagrywa wszystkie parametry.

xi) W czasie przepuszczania przez MONO Q frakcje sprawdza się pod kątem wystąpienia piku ureazowego.

xii) Wartości otrzymane za pomocą testu ueaazomego nanosi się na profil białkowy uzyskany metodą FPLC (patrz poniżej).

Następnie zbiera się pożądane frakcje i prowadzi oszacowanie białek. Stężenie białka potrzebne jest do określenia liczby obrotów koniecznych do zatężenia porcji do około 1 ml. Preparat zatęża się przy użyciu probówek do zatężenia CENTRISART.

FPLC frakcji antygenowych

i) Następnie sonifikat oczyszcza się metodąszybkiej, ciekłej chromatografii białka na kolumnie wykluczania SUpErOSE™ 6.

ii) Kolumnę równoważy się PBS pH 7,6 - 7,7, zawierającym 0,02% (wag./obj.) azydku sodowego.

iii) Na kolumnę nanosi się 200 μl sonifikatu i zbiera frakcje po 0,5 ml.

iv) Frakcje zbiera się, poddaje badaniu testem ureazowym w celu znalezienia piku ureazowego. Wartości nanosi się na odczyt uzyskany metodą FPLC. Pożądane frakcje zbiera się.

v) Pobiera się małe próbki w celu przeprowadzenia analizy metodą naturalnej PAGE w celu sprawdzenia zgodności wiązania. Frakcje które nie zawierały piku ureazowego, ale leżały blisko piku odpowiadają grupie mniejszych białek o ciężarze cząsteczkowym pomiędzy 440 kDa i 67 kDa.

vi) Pozostałość przechowuje się w temperaturze -20°C i następnie zlewa z innymi, podobnymi preparatami w celu utworzenia porcji.

Liofilizacja

Antygen z powyższej porcji liofilizuje się w liofilizatorze FSE składającym się z:

(a) pompy TRIVAC , model D4A, firmy Leybold (USA);

(b) silnika na prąd zmienny 240 V firmy General Electric (USA);

(c) komory próżniowej VIRTIS™ (Virtis Co. Inc., New York, USA); i (d) jednostki chłodzącej włączonej w obudowę liofilizatora.

3θ ml roztworu zawierającego antygen, zamrożone pod kątem, w celu zwiększenia powierzchni, w 50 ml naczyniu o średnicy 5 cm umieszcza się w komorze próżniowej i uruchamia urządzenie. Temperaturę w działającym urządzeniu ustawia się na -55°C. Działające urządzenie utrzymuje obniżone ciśnienie na poziomie 80 - 100 mTorr (około 0,001 atmosfery), zakres wartości zależy od początkowej objętości zamrażanego płynu i jego powierzchni, a więc, objętości pary w komorze. Próbkę liofilizuje się do całkowitego wysuszenia, co zajmuje 16 - 18 godzin.

PAGE w natywnym gradiencie przy użyciu PHASTSYSTEM firmy Pharmacia

Antygeny z powyższych frakcji, przed i po liofilizacji, poddaje się natywnej PAGE przy użyciu liniowego gradientu żelu akrylamidowego i wizualizuje się profile białkowe metodą szybkiego barwienia srebrem, jak następuje:

i) Paski buforu były paskami natywnego buforu PHASTGEL™ do rozdzielania białek w ich naturalnym stanie.

ii) Żelem był gradient 8 - 25 PHASTGEL™. Zestaw ten daje liniową zależność pomiędzy odległością migracji białka w żelu a logarytmem jego masy cząsteczkowej, dla białek globuralnych o masie cząsteczkowej z zakresu od 50 kDa do 750 kDa.

iii) Użyte markery były zestawem do kalibracji elektroforezy firmy Pharmacia do oznaczeń o wysokiej masie cząsteczkowej. 1 pojemnik (Numer katalogowy 170445-01) liofilizowanego markera rozpuszcza się w 100 μ. wody destylowanej . Do barwienia żelu zrekonstytuowany marker rozcieńcza się 1/10. Elektroforezie poddaje się 1 μl markera w dwóch powtórzeniach.

iv) Elektroforezie poddaje się w dwóch powtórzeniach próbki antygenu, każda po 1 μl oczyszczonego metodą FPLC na kolumnie SUPEROSE™ 6 ekstraktu.

v) Warunki rozdziału: próbki poddawano elektroforezie przy użyciu optymalizowanej metody natywnej PAGE z PHASTSYSTEM™ Separation Technique File numer 120. Czas trwania elektroforezy wynosił 120 votogodzin.

vi) Warunki rozwijania: żel barwi się srebrem według metody z Tabeli 3 z PHASTSYSTEM Development Technique File numer 210. (Metoda barwienia srebrem optymalizowana natywnej PAGE).

vii) Masę cząsteczkową określono przy użyciu markerów o wysokiej masie cząsteczkowej, które poddawano elektroforezie razem z antygenami na żelu. Krzywe standardowe określono rysując zależność logarytmu masy cząsteczkowej od wartości Rf.

Porównanie antygenów przed i po liofilizowaniu

Za pomocą powyższej metodyki natywnej PAGE otrzymano następujące wyniki. Wartości podano jako średnie minus odchylenie standardowe, (n) oznacza liczbę oznaczeń, które można było wykonać na żelu.

172 125

	Oczyszczony	Liofilizowany
Antygen 1	436±20,6 (4)	nie oznaczano (4)
Antygen 2	338,6±14,1 (4)	334,0± 18,5 (4)
Antygen 3	248,0 ±18,1 (4)	262,0±0 (2)
Antygen 4	162,7+23,0 (3)	162,0 (1)
Antyegn 5	70,0 ±0 (3)	70,0 (1)

Dalsza charakterystyka antygenów

i) Względne masy cząsteczkowe można oznaczyć na podstawie standardów zawierających tyrogloglulinę, ferrytynę, katalazę, dehydrogenazę laktozową i albuminę.

ii) Metodę western blotting można zastosować do wykrycia odpowiednich prążków białkowych wykorzystując dodatni odczyn na H.pyroli.

iii) Frakcjonowanie metodą FPLC usuwa prążki o niższej masie cząsteczkowej, które reagując dają odczyn ujemny.

iv) Liofilizowanie preparatu antygenowego wydaje się zmniejszać obecność jednostki o dużej masie cząsteczkowej (około 440 kDa) która reagując daje fałszywy odczyn dodatni. Brak prążka 440 kDa jest ważny przy odróżnianiu odczynu dodatniego, fałszywego dodatniego i ujemnego.

Wynikiem tej metody oczyszczania jest zidentyfikowanie białka o masie cząsteczkowej z zakresu 255 - 275 kDa, ale ogólnie około 265 kDa i białka, którego masa cząsteczkowa wynosi około 340 kDa, które reagując dają odczyn dodatni, ale nie ujemny.

Przykład II. Enzymatyczny test immunosorbcyjny (ELISA)

1. Opłaszczanie płytek ELISA antygenem

i) Używa się polistyrenowych płytek ELISA (Polysorb, Nunc. Dania) ii) Liofilizowany preparat antygenowy z przykładu I rozcieńcza się optymalnie (najwyższe rozcieńczenie dające maksymalną czułość dla przeciwciał ze śliny dodatniej bez zwiększenia reaktywności przeciwciał ze śliny ujemnej) buforem do opłaszczania (patrz 2 (iii) poniżej).

iii) 100 μΐ rozcieńczonego antygenu dodaje się do studzienek płytki ELISA oznaczonych antygen i 100 μl buforu do opłaszczania (bez antygenu) dodaje się do studzienek oznaczonych bufor.

iv) Płytki inkubuje się przez noc w temperaturze 4°C.

v) Inkubowane płytki opróżnia się i dodaje 100 μl 5% (wag./obj.) roztworu suchy puder mleczny/bufor do opłaszczania (patrz 2 (iii) poniżej) na 30 minut i natychmiast opróżnia z zawartości przez odwrócenie.

2. Bufory

i) Roztwór soli buforowany fosforanem (PBS): 0,14 M NaCl, 0,003 M NazHPOą, 0,001 N NaHLPOą ©HpO w 1 litrze wody dejonizowanej, pH doprowadzone do 7,2.

ii) Bufor substratowy: 10,1 g kwasu cytrynowego, 14,2 g ortofosforanu dwusodowego (Na2HPO4), 150 μ l H2O2 (30% wag./obj. ) w 1 litrze wody dejonizowanej, pH doprowadzone do 5,0.

iii) Bufor do opłaszczania: 2,42 g TRIS (tris(hydroksymetylo)aminometan), 58,44 g NaCl w 1 litrze wody dejonizowanej, pH doprowadzone do 7,5.

172 125

3. Traktowanie płytek po opłaszczaniu antygenem

W celu przechowywania opłaszczonych antygenem płytek przez długi czas (6 miesięcy), po opłaszczeniu i zablokowaniu płytki suszy się i przechowuje w temperaturze 4°C w obecności środka pochłaniającego wilgoć. Taki sposób postępowania jest konieczny dla długiego zakonserwowania opłaszczonych antygenem płytek.

4. Test ELISA

a) Metoda z wykorzystaniem peroksydazy korzenia chrzanu

i) 100 μΐ śliny roecieńczonej 1/( raza w 5,05% (wag./obj.) roztworu suchy puder mleczny/PBST (PBSTM) lub 100 μl śliny rozcieńczonej 1/2 raza w PBSTM dodaje się do studzienek antygenowych i do studzienek buforowych płytki ELISA.

ii) Ptaki inkunuje sie do do minut w tempwraturze pokojowej'.

iii) Pł^ttk przprzy^a wia 5 raiy przez zalznie PBnT.

iv) Do studzienek antygenowych i buforowych dodaje się 100 μΊ IgG przeciw człowiekowi sprzężonych z peroksydazą chrzanu optymalnie rgzcinCczttzych (najwyższe rozcieńczenie dające maksymalną czułość dla przeciwciał ze śliny dodatniej bez zwiększenia reaktywności przeciwciał ze śliny ujemnej) w PBSTM.

v) Płyyki inkuZuje jię dę do minm w tempwpokojowet.

vi) PłyUki przamywa wię 5 raiy przez zalanie PBnT.

vii) Do studzienek amtygenowych i buyoyooych dodaje się 100 μ 1 substratu dki pnroksydaoy korzenia chrzanu (Produkt T-2885, Sigma, USA) w buforze substratowym.

y^jPłytki inkubie się do 30 minut w temperaturze pokojowej.

ix) Do studzienek entygenottych i buforowyyh wydaje sta 1 00 iz11. M H2SO4.

x) Dla każdej próbki surowicy lub śliny, absgrbazcjo (A) studzienek buforowych odejmuje się od A studzienek antygenowych a otrzymaną A przelicza się na jednostki ELISA używane w krzywej standardowej (otrzymanej przez dwukrotne rozdieńcoezia standardowego przeciwciała z dodatniej surowicy).

xi) Pomiar 100 próbek śliny od pacjentów u których stwierdzono przez biopsję, że są zainfekowani (lub nie zainfekowani) jest używany do określenia liczby jednostek ELISA odpowiadających infekcji.

Przykład III. Test immuzoblgaizg

1. Przygotowanie antygenu Helicobacter pyroli

Sposób otrzymywania antygenu H.pyroli dla immungblgtingu jest identyczny jak w proyUłaPoie I.

2. Opłaszczanie błony antygenem

i) Używa się błon zitracelulozowyca. Można użyć także błon nylonowych.

ii) Po wysuszeniu blgtaizgu, błonę namacza się na 5 minut w optymalnym rozcieńczonym antygenie (najwyższe rozcieńczenie dające maksymalną czułość dla przeciwciał z próbek dodatnich bez zwiększenia reaktywności przeciwciał z próbek ujemnych).

iii) Następnie błonę inkubuje się przez 30 minut w 5% (wag^obj.) roztworze suchy puder mlecznyjTBS.

iv) Błonę przemywa się dwa razy przez 5 minut 0,05% (wag.jobj.) roztworu mozolauryniaz pglioUsyetylenosorbitazjTBS (TBST). W celu przechowywania błon przez długi czas (18 miesięcy), błony suszy się i przechowuje w temperaturze 4°C w obecności środka pochłaniającego wilgoć.

v) Błonę pokrywa się nierozcieńcooną testowaną śliną w butelce testowej lub pod językiem.

vi) Błonę przemywa się przez 30 sekund pod wodą bieżącą.

vii) Błonę pokrywa się roztworem sprzężonego z fosfatazą alkaliczną przeciwciała IgG przeciw człowiekowi rozcieńczonego optymalnie (dla umożliwienia rozróżnienia pomiędzy przeciwciałem ze śliny pozytywnej i negatywnej) w PBSTM przez czas do 5 minut.

viii) Błonę przemywa się przez 30 sekund pod wodą bieżącą.

ix) Błonę ponrywo się n a 5 mmut rontworem substratu (a,3 m0 błęki tb nitrotetrazolowego, 0,15 mg 5-bromr-4-chlorr-3-indolilofosforanu w 1 ml 0,1 M NaHCO₃, 1,0 mM MgCh, pH 9,8).

x) Próbki z przeciwciałami pozytywnymi powodują w rejonie antygenowym błony zmianę koloru na fioletowy, natomiast próbki z przeciwciałami negatywnymi nie powodują zmian w rejonie antygenowym błony.

Przykład IV. Zbadano pacjentów skierowanych na Oddział Gaatsoenterologiczny, Royal North Shore Hospital, NSW w celu zbadania objawów górnych dróg żołądkowo-jelitowych. We wszystkich możliwych przypadkach przeprowadzono hodowle mikrobiologiczne, badania mikroskopowe dla wykrycia H.pyroli, testy ureazowe, biopsję histologiczną i test ELISA.

Korelacja przeciwciał ślinowych z biopsją dla H.pyroli

W następującej tabeli pokazano związek pomiędzy histologicznym badaniem biopsji żołądka i wynikami testu dla śliny oraz innych testów dla H.pyroli.

Okazało się, że test surowicy jest bardziej czuły i specyficzny w wykrywaniu infekcji H.pyroli niż biopsja i jest powszechnie akceptowany jako złoty standard do wykrywania infekcji H.pyroli. Wyniki przedstawione w tabeli pokazują, że test ślinowy jest równie dobry jak test surowkowy. Jeżeli u pacjentów nie występuje stan zapalny lub chroniczny stan zapalny, wszystkie obecnie dostępne testy, włączając ureazowy, hodowle i badanie histologiczne, są równie dobre. Jednakże u pacjentów ze stanem zapalnym częściej stwierdzono infekcje H.pyroli testami ELISA dla surowicy i śliny niż innymi sposobami. Przyczyną tego, może być fakt, że biopsja jest raczej losowym sposobem pobierania próbek i może omijać obszary na których występuje inwazja H.pyroli. Jak widać, wyniki testu ELISA dla śliny dobrze korelują z wynikami testu ELISA dla surowicy.

Biegli w sztuce są świadomi, że opisany tu wynalazek podlega różnym zmianom i modyfikacjom innym niż te specyficznie opisane. Jest zrozumiałe, że wynalazek obejmuje też wszystkie te zmiany i modyfikacje. Wynalazek obejmuje także wszystkie etapy, własności, kompozycje i związki do których wynalazek odnosi się lub wskazuje w tym opisie, pojedynczo lub zbiorowo i każdą i wszystkie kombinacje każdych dwóch lub więcej wspomnianych etapów lub własności.

Porównanie pomiędzy testami ELISA, biopsją i badaniem histologicznym żołądka

Claims (9)

1. Sposób wykrywania trwających infekcji Helicobacter pyroli w komórkach ssaków, znamienny tym, że doprowadza się do kontaktu wydzieliny śluzówki ssaka z preparatem antygenowym H.pyroli przez czas i w warunkach odpowiednich dla przeciwciała IgG z wydzieliny śluzówki, specyficznego do składnika antygenowego w preparacie antygenowym, tworzy się z nim kompleks, i wystawia się ten kompleks na działanie środka wykrywającego w celu wykrycia kompleksu, przy czym stosuje się preparat antygenowy zawierający pochodzące z H.pyroli składniki o wielkości 238,5 - 291,5 kDa jako natywna PAGE i 306 - 374 kDa jako natywna PAGE i jest zasadniczo wolny od pochodzącego z H.pyroli składnika o wielkości 440 kDa jako natywna PAGE.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się preparat antygenowy zawierający dodatkowo pochodzące z H.pyroli antygeny o masie cząsteczkowej wynoszącej 144 - 176 kDa jako natywna PAGe i/lub 63 - 77 kDa jako natywna PAGE.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako wydzielinę śluzówki stosuje się ślinę.

4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się preparat antygenowy związany ze stałym nośnikiem.

5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że jako stały nośnik stosuje się pasek nitrocelulozowy.

6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się środek wykrywający będący drugim przeciwciałem, sprzężonym cząsteczką reportera, która jest specyficzna przynajmniej do części klasy specyficznego przeciwciała przeciw H.pyroli znajdującego się w wydzielinie.

7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako cząsteczkę reportera stosuje się enzym lub fluorofor.

8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że jako cząsteczkę reportera stosuje się enzym, przy czym enzymem tym jest fosfataza alkaliczna.

9. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 5, albo 7, albo 8, znamienny tym, że stosuje się wydzielinę śluzówki ssaka, którym jest człowiek.