JP2901296B2 - カンピロバクター・ピロリの高分子型細胞関連蛋白の調製法とカンピロバクター・ピロリ感染の血清学的検出のための用法 - Google Patents

カンピロバクター・ピロリの高分子型細胞関連蛋白の調製法とカンピロバクター・ピロリ感染の血清学的検出のための用法

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Description

【発明の詳細な説明】 この発明はカンピロバクター・ピロリ感染二対する抗
体の検出のための抗原として使われる高分子細胞関連蛋
白に関する。それは抗原を調製するためと同様感染を検
出し、モニターすることにも有用である。
発明の背景 カンピロバクター・ピロリ（C.pylori）は1982年には
じめて単離された。それは胃炎の重要な原因となること
で知られており、十二指腸潰瘍、胃潰瘍、胃弱、胃癌な
どにも関わっている。1982年に発見されて以来、C.pylo
riについて、またその胃病や潰瘍の形成に対する現実の
役割について詳細に調べようとして多大の世界的な関心
がもたれている。C.pyloriと異常な胃病理との間に密接
な関連を示す多くの研究があるにも拘らず、その菌が病
原性か、あるいは日和見的なのか結論するに足る証拠は
ない。しかしながら、C.pyloriの存在は胃の病気を治療
するのに重要な着眼点である。
C.pyloriをもっている患者は臨床検査に役立ち、治療
の間の病状を追跡するのに有用な特別の抗体応答を示
す。従って多くの系が血清のC.pylori抗体を検出するた
めに開発されてきた。しかしながら、予備的な研究によ
れば、C.pyloriは好熱性のカンピロバクターであるC.je
juniやC.coliなどと抗原的交差反応を示す。この交差反
応は特異性の欠陥をもたらす。
交差反応に関連した問題を避ける試みとして、研究者
はC.pyloriの酸可溶性表層蛋白と外膜蛋白について強力
に研究してきた。Newall,D.C.,ジャーナル・オブ・マイ
クロバイオロジー誌,133巻,163-170（1987年）;perez-P
erez,G.I.,Bla-ser,M.J.,インフェクション・アンド・
イムニテイ誌,55巻1256-1263頁（1987年）。
Nowallは酸で抽出される蛋白はC.pyloriに特有の分子
量が20,000から100,000ダルトンの蛋白であることを示
した。しかしながら、これらの蛋白のうちいくつかはC.
jejuniの蛋白と類似しており、多くはまたC.jejuniと交
差反応を示した。少くとも１つの主要抗原（約60,000ダ
ルトン）はC.jejuniとは殆んど交差反応を示さなかった
が、少しはまだ交差反応した。他方、Perez-Perezは約6
2,000ダルトンの抗原が重大な交差反応をすることを示
した。C.pyloriは急性の胃炎患者において全身性及び局
所性の抗体反応を示しうるが、この分泌性抗体反応は宿
生をなくすことにはならないようである。Rathbone,B.
J.ら、グート誌,27巻,624-647（1986年）。Rathboneら
はその免疫学的測定に全菌体を使った。
イムノブロット法を使った他の研究によってC.pylori
は分子量100,000ダルトンまたはそれ以下の範囲に多く
の免疫反応性の成分をもっていることが示された。Kald
or,Jら、ザ・メディカル・ジャーナル・オブ・オースト
ラリア誌,145巻,133-135頁（1986年）。
全菌体を使うELISA法でC.pyloriの抗体を検出できる
が、まだ交差反応の問題は解決できない。Morrisら、ザ
・ニュージーランド・メディカル・ジャーナル誌,99巻,
657-659頁（1986年）。
C.pyloriの酸グリシン抽出物はELISA法で抗体を検出
する。しかしながら、多くの誤陽性、誤陰性が存在す
る。個々の擬似的な結果の相当な数がカットオフする点
を調整することで調節はできるけれど、グループ間で大
きな重複がみられる。Goodw-inら、ザ・ジャーナル・オ
ブ・インフェクシャス・ディジーズ誌,155巻,488-494頁
（1987年）。同様な結果が補体固定、細菌凝集、イムノ
ブロッティング等でもみられている。Jonesら、ジェネ
ラル・クリニカル・パソロジー誌,37巻,1002-1006頁（1
984年）,Jonesら，ジャーナル・オブ・メディカル・マ
イクロバイオロジー誌,22巻,57-62頁（1986年）。酸で
洗った画分は補体結合法でもSDS-PAGEイムノブロット法
でも同様な結果を示す。Wulffenら、ジャーナル・オブ
・クリニカル・マイクロバイオロジー誌,24巻,716-720
頁（1986年）。
罹患したヒトの血清中にはC.pylori抗体がみらえると
いう多くの報告がある。これらは全て微生物の外側の表
面を扱ったものである。これらの検定系では、抗原は全
菌体または鞭毛の一部分かであり、大凡100,000ダルト
ンまでの分子量範囲にある外層膜である。これらの研究
はいずれも感染を正確に検出するには十分でない。重大
な誤分類、誤陽性、誤陰性、あるいはC.jejuniやC.coli
のような他の生物との交差反応がある。かくして、C.py
lori抗体を特異的に検出する迅速な免疫学的方法が必要
となる。本発明はこの要求に適合する。本発明はC.pylo
ri感染を診断するための新規で正確な血清学的方法を述
べている。これまでに報告された結果はより低分子物質
を使っており、他の細菌との交差反応がかなり高いレベ
ルにある。同じように全体に信頼される方法は他にない
（感度と特異性の点で）。
消化不良の症状は西欧世界で大きなヘルスケア出費を
伴っている。この消化不良の頻度について正確な統計は
つかめてないが、最近の研究で公共的な問題となってい
ることが示されている。例えば、英国では開業医によっ
て扱われた患者の約１％が毎年最初に消化不良を訴える
とされている。消化不良の費用は多く、次のようなもの
が含まれる。（１）制酸剤あるいはH2受容体拮抗剤（シ
メチジン、ラニチジンの売上げは20億ドル以上）、
（２）消化器官バリウムやファイバースコープ内視とい
った診断のための費用、（３）仕事からはなれることに
よる費用等。消化不良の薬物使用に及ぼす影響はスウェ
ーデンで胃炎や非潰瘍性の消化不良の診断がなされた患
者をみることで研究された。
Tyllstromら、スカンジナビアン・ジャーナル・オブ
・ガストロエンテロロジー,1984年,19巻,755-760頁 Tyllstromは、制酸剤あるいはH2受容体拮抗剤治療が
これらの患者に一般的であるとした。事実、医者を訪れ
る多くの患者は処方薬を与えられた。この結果はそのよ
うな患者の91％が一般的に制酸剤を使用されているとい
う英国のデータと同様である。Tyllstromはスウェーデ
ンの全人口の１％が毎日投薬され、非潰瘍性消化不良が
シメチジン投与を最初に指示され、それが処方箋の35％
とみなして計算した。シメチジンで治療される患者の割
合は増加の傾向にあることも注目されている。
胃腸障害や潰瘍の発生が西欧社会で高まり、コストも
上っているので、これらの病気を検出し、モニターし、
治療することは大いに望まれる。かくして、本発明はこ
の病気と関連し、その消失が臨床的に改善されることと
関係しているC.pyloriを特異的に検出することのできる
ことで重要である。
発明の要約 本発明の目的はC.pyloriの高分子細胞関連蛋白から抗
原を単離精製することである。
本発明のもう一つの目的はヒトにおいてC.pyloriの感
染を検出する方法である。
本発明のさらにもう一つの目的は診断用キットであ
る。
かくして前記の目的に付随して、本発明の態様に従え
ばC.pyloriの高分子細胞関連蛋白（HM-CAP）から抗原が
提供されるがその抗原は分子量300,000から700,000ダル
トン、焦点電気泳動でのpIは5.9〜6.3、燐酸緩衝化した
生理食塩水やトリス塩酸バッファーに可溶の形でほヾ精
製される。好適具体例の一つでは抗原はウレアーゼ活性
を示している。
初の具体例には、HM-CAPから分離された抗原を検査す
べき血清試料と結合し、酵素結合免疫法、ラジオイムノ
アッセイ、補体結合法、ラテックス凝集法、予めグルタ
ルアルデヒドあるいはタンニン酸で処理（活性化）した
HM-CAPコートした赤血球を用いる受動的血球凝集法等か
ら成る群から選ばれる免疫学的方法を行うことによって
ヒトのC.pylori感染の検出をする血清学的方法が含まれ
ている。
具体例の一つに酵素結合免疫吸着法が使われている。
この方法は抗原を固相の支持体に固定し、固定化された
抗原に血清試料を加え、血清試料を反応させ、固定化し
た抗原と抗原−抗体結合体を作らせることを含んでい
る。その抗原抗体結合体に酵素を結合した抗ヒトIgGを
加えて、抗原−抗体酵素結合抗ヒトIgG結合体を作らせ
る。望ましい具体例には、酵素はアルカリホスファター
ゼ、西洋ワサロペルオキシダーゼ、あるいはβ−ガラク
トシダーゼ等が含まれる。アルカリホスファターゼが使
われる場合、ｐ−ニトロフェニル燐酸（酵素の基質）が
複合体に使われる。この基質はアルカリホスファターゼ
と反応して抗体の量を測定しうる色を発する。
もう一つの具体例は固相支持体に固定化したC.pylori
の高分子細胞関連蛋白の抗原を包含するキットを含む。
その他の目的、特徴、及び利点については発明の明細
の目的に対して添付の図面と一緒に示される発明の具体
例について以下の明細から明らかになるだろう。
図面の簡単な説明 本発明は以下の明細書を読み、添付の図面を参照する
ことによっても容易に理解されよう。
図１は、アガロースA-5mカラムにかけられた粗HM-CAP
の典型的溶出プロフィールである。
図２は、 で生育した細菌からとったHM-CAP標品の典型的溶出パタ
ーンでウレアーゼ活性の領域が示されている。
図３は、抗C.pyloriを検出するために平板培地で培養
した細菌からとった抗原でELISA法を行ったとき４つの
異なる陽性、陰性血清試料を比較している。
図４は、C.pyloriを検出するのに液体培養した細菌で
ELISAを行ったとき４種の異なる陽性及び陰性の血清を
比較している。
詳細な記載 図面は必ずしも尺度を合わせたものでなく、発明のあ
る特徴のために尺度は誇張されたり、明瞭さのために模
式的に示される。この技術分野に通じるものにとってい
ろいろな置きかえや修正が、この発明の目的や精神から
はなれることなく、ここに記した発明について行うこと
ができるということは容易に考えられる。
C.pyloriの高分子細胞関連蛋白（HM-CAP）からの抗原
は分子量約300,000〜700,000ダルトン、焦点電気泳動の
pIは約5.9〜6.3でPBS（燐酸塩緩衝化生理食塩水で約0.0
5M燐酸バッファーと、約0.85％NaClを含みpH約7.2のも
の）やトリス塩酸バッファー（約0.05Mトリス、pHは約
8.0）を含む一般に使われる緩衝液に溶けるような形に
ほゞ精製されている。蛋白部分は280nmの吸収によって
検出され、蛋白量の分析は少なくされた。ゲルはクマシ
ー・ブルーで染色された。HM-CAPはC.pylori細胞をｎ−
オクチル−ブルコシド（NOG）で処理することで抽出
（可溶化）される。NOGは膜や表層蛋白を細胞をこわす
ことなく抽出する。望ましい具体例ではこれらの抗原は
ウレアーゼ活性を示す。
C.pyloriの細胞を集菌し、洗ってもウレアーゼ活性は
細菌細胞に結合したままである。超音波破砕と遠心分離
をした後ウレアーゼ活性はペレットにあり、ウレアーゼ
活性をもった蛋白は膜の外層に結合しているという証拠
を示している。「膜の外層に結合している蛋白」とはそ
の蛋白が膜の中にあるか膜の表面上にあるかのいずれか
を示している。さらに、細胞をこわすことなく細胞表面
をこわすとウレアーゼ活性は上清画分に放出される。
抗原はいろいろな方法で調製できる。望ましくはC.py
loriはまず血液寒天平板で培養される。血液寒天平板は
約７％の新鮮な（８日以上経っていない）馬血液とDIFC
O社の脳−心臓浸出液で作られる。37℃で48時間約12％
のCO2下、約100％の湿度の環境で培養した後、C.pylori
を平板から集菌する。集菌した細菌はPBSにより約12分
間、約8000rpmで遠心分離して洗われる。これを少くと
も２回くり返す。
もう一つの具体例ではC.pyloriを約10％馬血清、約0.
03％の精製したウサギヘモグロビン、及び約0.15％のDI
FCO酵母エキスを含むDIFCOの脳−心臓浸出液からなる液
体培地で培養する。液体培養では接種菌は血液平板培地
（前出）から調製される。培養条件は血液寒天平板培養
と同じである。培養液から細菌を約8000rpmで約12分間
遠心分離して集め、平板で生育した菌について記したと
同じ洗滌方法を行う。
次に、洗われたC.pylori菌体は液体であろうが平板か
らであろうが、約pH7.2のPBS中約１％のｎ−オクチル−
グルコシド溶液に遠沈した菌体 当り約2.5ml入れて再び懸濁することによって抽出され
る。室温で20分間抽出した後、抽出懸濁液は約15,000rp
mで15分間遠心分離される。上清を取り出し、保存剤と
して0.024％のアジ化ナトリウムを含む1/2濃度のPBSの1
600容量を外液にして（約4l）18から24時間透析する。
透析内液を約18000rpmで約15分間遠心分離する。沈殿し
た物質を除き、上清液を貯える。上清液は粗製のHM-CAP
を含んでいる。粗HM-CAP標品をアガロースA-5mカラムに
のせ、約0.05Mのトリス−塩酸バッファー（約pH8.0で約
0.025％のNaN3を含む）で溶出する。カラムは径1.6cm長
さ100cmのカラムである。カラムから約2.5mlの分画とし
て集め、それをモニターする。これらの画分の吸光度は
280nmで測定され、ウレアーゼ活性は基質として尿素を
用いて測定された。最大のウレアーゼ活性を含む画分
（約６から８のところ）を集める。集めた画分は約300,
000から700,000ダルトンの分子量範囲を示す。この点で
HM-CAP標品は少くとも２つの別の蛋白を含んでいる。
図１は、粗HM-CAP標品2.5mlをアガロースA-5mカラム
に通したとき得られた結果を示している。画分47-49の2
80nm吸収のある物質のピークはウレアーゼ活性のピーク
と一致しており、画分51-52に低分子量の280nm吸収物質
のもう一つのピークがそれに続く。これら２つのピーク
はかなりオーバーラップしていて部分精製されたHM-CAP
の画分47-49は少くとも２つ、おそらくそれ以上の分子
種を含んでいる。これら個々の蛋白を分離するためにさ
らに分画を行える。
分子量（MW）は同じアガロースA-5mカラムを既知の分
子量をもった蛋白を流し、その溶出位置を見つけること
できめられる。例えば、画分46にチログロブリン（MW66
9,000）、画分51にアポフェリチン（MW443,000）、画分
55に酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（MW150,000）、
画分62にウシ血清アルブミン（MW66,000）である。これ
らの標準蛋白から部分精製されたHM-CAPは300,000（画
分53）から700,000（画分46）までの分子量範囲の分子
を含んでいると計算される。
個々の蛋白画分の抗原性は図２〜４に示されている。
HM-CAP画分を選別しウレアーゼ活性にもとづいてプール
してELISA法の抗原として用いた。これら抗原に抗C.pyl
ori血清IgG抗体の有無を検出するのに非常に効果的であ
った。その生物の存、不存在は抗原の存、不在と相関し
ていた。この関係は他の不便ではあるが認識はできる方
法でもC.pylori菌体を検出されることによっても確めら
れた。２つのバッチのC.pyloriを培養し、１つを平板培
養、もう１つを液体培養し、（１）この特異性のどれだ
けがウレアーゼ以外の抗原によるとみなされるか、また
（２）抗原生産に対する菌の培養方法（平板に対して液
体培地）がELISAの特異性に影響するかどうかを確かめ
た。粗HM-CAPを両方の菌体バッチから調整され、個別に
同じアガロースA-5mカラムに通した。溶出図は図２に示
される。
いずれの場合も２つあるいはそれ以上のカラム画分を
貯えられ、図２に示すように８つの異なる画分とした。
蛋白量の定量を各画分について行い、夫々から蛋白とし
て当量になるようマイクロタイタープレートにコーティ
ングされた（ml当り0.007mgの蛋白と抗原として100μｌ
を）。蛋白量の定量は次の表の中にみられる。
プール２は標準法で使われるHM-CAP抗原標品に相当す
る。４個のELISA陽性と４つのELISA陰性血清試料は無作
為に選別され、ELISA法を行うために用いられた。その
結果は図3,4に示されている。
図３と図４の試験によってアガロース画分53〜60のプ
ール１〜４がプール５〜８に比べてELISA陽性とELISA陰
性の血清の間で最大のちがいがみられることが示されて
いる。プール５〜８は試料の抗原としていくらか選択性
を示し、C.pylori特異的なELISA法にするにはさらにHM-
CAPを精製する必要はないことを示唆している。
これらの結果はウレアーゼ陽性のカラム画分をC.pylo
ri特異的なELISA法におけるHM-CAP抗原として使うのに
選択することが十分な感度と選択性を与えることを示し
ている。それ故、特異的な成分にさらに分離することは
必要ない。さらに、平板培養と液体培養の最近はELISA
抗原のためのHM-CAPの素材として等しく有効である。HM
-CAPの液体培養したバッチにウレアーゼ蛋白が高収量で
あったこと（図２参照）は２つの主要なピークが効率よ
くわけられないために液体培養された抗原のプール５〜
８は平板培養された抗原のプール５〜８よりもよく作用
するということが明らかであろう。
かくして図３と図４は少くとも２つの蛋白が血清中の
C.pyl-ori抗体を検出するのに個々の蛋白夫々と同等に
効果的であることを示している。これらのデータはウレ
アーゼ活性と一致している高分子量成分が低分子抗原よ
りよい抗原であることを示しているが、それらはまたC.
pylori感染を決定するのによくないとしても、その混合
物はよいということも示唆している。かくしてその蛋白
はさらに個々の成分に精製されるけれどその混合物を分
離する前に精製をやめても十分である。
血清中のC.pylori抗体を検出するのに多くの方法が使
われる。この分野技術に通じる人は酵素結合免疫吸着法
（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、補体結合、
ラテックス粒子凝集法、イムノブロット法、受動的免疫
凝集法等全てが使えることを認識しよう。望ましい方法
には血清学的方法にELISAが含まれる。この方法は固相
支持体にHM-CAP抗原を固定化することを含んでいる。抗
原を固定化した後、検査すべき血清試料を固定化した抗
原と結合させ、それらを約90分間室温で湿潤な条件でイ
ンキュベートする。抗原−抗体結合体がそのインキュベ
ーションの間に形成される。抗原抗体結合体が形成され
ると、アルカリホスファターゼ結合の抗ヒトIgGを固相
支持体上の抗原−抗体結合体に加え、約90分間室温、湿
潤状態で反応させ、抗原−抗体−アルカリホスファター
ゼ結合抗ヒトIgG複合体を形成させる。そこで起こる結
合の量を測るのに多くの基質が使われる。好適な具体例
ではｐ−ニトロフェニル燐酸がこの結合体に加えられ生
じる黄色物質を形成される抗原抗体複合体の量、従って
血清中に存在する抗体の量を定量するために測定する。
実施例１ ELISA法：約0.007mg/mlの蛋白濃度にPBSで希釈したHM
-CAP抗原100μｌでマイクロタイタープレートをコート
する。一例では標準的な96ウエルプレートが使われる。
18〜24時間、37℃、湿潤な場所においた後、抗原はプラ
スチック表面に付着し、非特異的に永久に結合させる。
余分なプラスチックの蛋白結合部分を約30分間、約37℃
の湿潤なところでPBSに溶かした約１％BSA（ウシ血清ア
ルブミン）とインキュベートすることでブロックする。
余分のBSAを３回PBST（約0.02％のTween20を含むPBS）
で洗うことによって取除く。次に、ウエル当り約100μ
ｌの血清をPBSで1:50か1:100に希釈して添加する。室温
で約90分間、湿潤な場所においてインキュベートした
後、過剰の抗体はPBSTで３回洗うことによって除く。ウ
エル当り約100μｌの適当に希釈した結合体（アルカリ
ホスファターゼを結合したヤギ抗ヒトIgG抗体）を加
え、混合液を約90分間、湿潤なところで室温でインキュ
ベートする。過剰の結合体、すなわち未反応の結合体を
PBSTで３回洗った後、ウエル当り約100μｌのアルカリ
ホスファクターゼ基質、例えばｐ−ニトロフェニル燐酸
を加える。さらに約60分間、湿ったところでインキュベ
ートした後、黄色く発色した酵素反応物を測定する。夫
々のマイクロタイタープレートには一連のコントロール
が含まれている。例えば、既知のELISA陽性血清や既知
のELISA陰性の血清、あるいは反応ブランク等である。
約0.200あるいはそれ以上の吸光度値は陽性とする。次
のような結果が得られた。
C.pylori感染は組織化学的検査と生検試料の培養、あ
るいは13C尿素の呼気試験によって陽性か陰性かを診断
した。
HM-CAP ELISA法ではC.pylori感染のある患者からの11
6検体中113を検出した。これは97.4％の特異性である。
この方法の感度は陰性のHM-CAP ELISAの結果をみること
で決められる。その結果は93のC.pylori陰性患者のうち
90が検出されることを示している。これは96.8％の感度
である。全体の信頼性は97.1％である（209検体から203
が正確に予測された）。このデータはELISA法によれ
ば、もしあっても誤分類は殆んどないことを強く示して
いる。
実施例２ キット：固相の支持体上でHM-CAP抗原をインキュベー
トすることによってキットを調整した。固相支持体は電
荷をもった膜あるいはプラスチック素材いずれでもよ
い。固相支持体と抗原の複合体は別々に包装しても、あ
るいは組み合わせて包装してもよい。キットはまた誤陽
性と誤陰性に対するコントロールと試薬を含んでいる。
このキットは１検体あるいは複数の検体用に使うことが
できる。
実施例３ ラテックス凝集法:C.pyloriに対する抗体がHM-CAPを
コーティングしたラテックス粒子を入れた血清検体で測
ることができる。さらに、単一特異的抗体（抗HM-CAP）
をコーティングしたラテックス粒子によって抗原の存在
を測定できる。約0.77ミクロンの径のポリビニル、ある
いはトルエンラテックス粒子、あるいは約0.81から1.77
ミクロンのポリスチレンラテックス粒子がHM-CAPでコー
ティングされる。ラテックス粒子約2.0mlを約20mlの蒸
留水に懸濁し、混合し、そしてフットマンNo.40紙で
過する。pH7.2のPBSあるいは相応する緩衝液で液の
波長640nmにおける吸光度を約2.0に調整した後、約0.1m
lのラテックス懸濁液を約5.0mlのPBSで希釈する。希釈
したラテックス懸濁液に約0.5mlの0.5％抗原溶液を加え
る。この混液を約37℃で30分間インキュベートする。そ
れからラテックス粒子を２回、夫々10倍量のPBSで洗滌
する。最後に懸濁液を0.1％のウシ血清アルブミンを含
む0.1Mグリシン緩衝液で吸光度0.3に調整される。測定
ではコートしたラテックス粒子と0.1Mグリシン緩衝液で
希釈した血清を等量混合する。コントロールの試験管は
血清の代りに食塩水を入れる。試験管は50℃で２時間イ
ンキュベートし、15,000×ｇ、３分間遠心分離し、それ
から静かに上澄を流す。凝塊の程度を記録する。凝塊は
抗原抗体複合体の形成を通してビーズが凝集することに
よっている。
実施例４ ラジオイムノアッセイ：適当な濃度の抗原約100μｌ
で96ウエルマイクロタイタープレートをコーティングす
る。約37℃で約18-24時間インキュベートした後、ウエ
ル中の過剰の結合部分をPBSで溶かした１％BSAあるいは
それに相当するものでブロックする。測定すべき血清の
適当量をウエル当り約100μｌを２つのウエルに加え室
温で約２時間インキュベートする。PBSTで数回プレート
を洗った後、適当に希釈したヤギまたはウサギの抗ヒト
IgGをウエル当り100μｌを加える。抗ヒトIgGは予め125
Iで標識しておく。マイクロタイタープレートを室温で
約４時間インキュベートし、PBSTで数回洗い、風乾す
る。各ウエルの残留する放射活性の量をガンマカウンタ
ーで計測する。陽性と陰性の血清をコントロールとして
各プレートに含ませておく。この方法は陽性と陰性の血
清の間のちがいを測るために常に行われる。
この技術分野に通じる者は本発明がその目的を実行
し、上に記した目的と利点をそれに内在されているもの
も含め得られるように適合されることを実際に評価する
だろう。ここに記された方法、やり方、技術等は実施例
の代表的なものであり例示としてあげたつもりであっ
て、その目指すところをそれに限定するつもりはない。
この分野に通じた者にとっては、この発明の精神の中に
含まれ特許請求の範囲によって規定される変更や他の目
的での利用も行えるであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 グレイアム，デェイヴィッド ワイ. アメリカ合衆国，77054 テキサス，ヒ ューストン，ミシレ 4051番地 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 14/205 C12P 21/00 - 21/06 G01N 33/569 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】アガロースA-5mカラムで定量された約300,
    000から700,000の分子量をもち； 焦点電気泳動で約5.9から6.9のpIをもち； ウレアーゼ活性をもち； PBSやトリス塩酸バッファーに可溶で； カンピロバクター・ピロリの膜の外層から由来し； ｎ−オクチル−グルコシドで膜の外層から可溶化しうる
    ようなカンピロバクター・ピロリの高分子細胞関連蛋白
    から本質的に精製された抗原を含む組成物。
  2. 【請求項２】請求項１の抗原を酵素結合免疫吸着法、ラ
    ジオイムノアッセイ、補体固定法、間接的血球凝集法、
    ラテックス凝集法等からなる群から選んだ方法により、
    検査すべき血清試料と結合させ、その抗原−抗体複合体
    が血清試料中のカンピロバクター・ピロリの量と比例関
    係にあるようなカンピロバクター・ピロリ感染の検出の
    ための血清学的方法。
  3. 【請求項３】血清試料を固相支持体に固定化した抗原に
    加え； その血清試料と固定化した支持体をインキュベートして
    抗原−抗体複合体を形成させ； その抗原−抗体複合体に酵素を結合した抗ヒトIgGを加
    え； 抗原−抗体複合体と酵素結合抗ヒトIgG結合物をインキ
    ュベートして抗原−抗体−酵素結合抗ヒトIgG複合体を
    作らせ； その抗原−抗体−酵素結合抗ヒトIgG複合体に基質を加
    え； 生成物すなわち基質の変化を測定して上記の抗体の量を
    定量し、その測定される生成物すなわち基質の変化が血
    清試料中のカンピロバクター・ピロリの量と比例してい
    る。 ステップを含む酵素結合免疫吸着法による請求項２の血
    清学的測定法。
  4. 【請求項４】その酵素がアルカリホスファターゼ、西洋
    ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼからな
    る群から選ばれる請求項３の血清学的測定法。
  5. 【請求項５】治療される患者から一連の血清試料を集
    め、その各々の試料について請求項４のステップをくり
    返すことを含むカンピロバクター・ピロリ感染を検査す
    る方法。
  6. 【請求項６】血清試料を抗原でコーティングされたウエ
    ルに添加し； その血清をウエルの中でインキュベートとし抗原−抗体
    複合体を形成させ； 放射性物質で標識した抗ヒトIgGを加え； 抗原−抗体複合体と抗ヒトIgGの混合物をインキュベー
    トとして抗原−抗体−抗ヒトIgG複合体を形成させ；そ
    して 抗原−抗体−抗ヒトIgG複合体に結合している放射活性
    の量を測定し、その結合した放射能が血清中のカンピロ
    バクター・ピロリの量に比例している。 ステップを含むラジオイムノアッセイによる請求項３の
    血清学的測定法。
  7. 【請求項７】血清試料を抗原をコートされたラテックス
    粒子に添加し； 血清試料とコーティングされたラテックス粒子をインキ
    ュベートし； 凝集塊の程度を測定し、その凝集塊の程度が血清試料中
    のカンピロバクター・ピロリの量に比例している； ステップを含むラテックス粒子凝集法による請求項４の
    血清学的測定法。
  8. 【請求項８】固相の支持体上に固定化された請求項１の
    抗原を含む組成物をつけた容器を含むカンピロバクター
    ・ピロリ抗体の存在を決定するためのキット。
  9. 【請求項９】誤陰性の対照、誤陽性の対照を含んでいる
    請求項８のキット。
  10. 【請求項１０】pH約7.2の約１％のｎ−オクチル−グル
    コシドPBS溶液でカンピロバクター・ピロリから高分子
    細胞関連蛋白を抽出し； 約0.024％のアジ化ナトリウムを含むPBSに対してその抽
    出液を透析し； その抗原が上澄に含まれるようにその透析内液を遠心分
    離し； その上澄液をアガロースA-5mカラムにかけ、約0.025％
    アジ化ナトリウムを含むpH約8.0の約0.05Mトリス塩酸緩
    衝液でクロマトグラフイーを行い； 分子量範囲300,000から700,000に溶出される画分を集め
    る。 ステップを含む請求項１の抗原を含む組成物を調製する
    方法。
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Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5459041A (en) * 1988-02-18 1995-10-17 Enteric Research Laboratories, Inc. Campylobacter pylori antigens and uses thereof for detection of Campylobacter pylori infection
FR2637612B1 (fr) * 1988-10-06 1993-09-10 Pasteur Institut Sequences de nucleotides codant pour une proteine a activite ureasique
US5234910A (en) * 1989-07-18 1993-08-10 University Hospital Acid inhibitor of bacterial origin
US5200344A (en) * 1990-11-13 1993-04-06 Blaser Martin J Diagnostic testing for campylobacter jejuni or campylobacter coli infections using novel antigens
DE4139840B4 (de) * 1990-12-04 2005-06-02 Quidel Corp., San Diego Antigen-Zubereitung zum Nachweis von H. pylori
US5262156A (en) * 1991-08-12 1993-11-16 Hycor Biomedical, Inc. Antigenic compositions and their use for the detection of Helicobacter pylori
CA2117490C (en) * 1992-02-26 2009-01-06 Timothy L. Cover Purified vacuolating toxin from helicobacter pylori and methods to use same
US5859219A (en) * 1992-02-26 1999-01-12 Vanderbilt University Purified vacuolating toxin from Helicobacter pylori and methods to use same
US7141244B1 (en) * 1992-03-02 2006-11-28 Chiron Srl Helicobacter pylori proteins useful for vaccines and diagnostics
IT1262895B (it) * 1992-03-02 1996-07-22 Proteina estratta da ceppi citotossici di helicobacter pylori, gene che la esprime, uso della proteina come vaccino o diagnostico.
US6130059A (en) * 1992-03-02 2000-10-10 Covacci; Antonello Helicobacter pylori proteins useful for vaccines and diagnostics
DE69334197T2 (de) * 1992-03-02 2008-12-11 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Helicobacter pylori Cytotoxin verwendbar in Impfstoffe und Diagnostik
IT1262896B (it) * 1992-03-06 1996-07-22 Composti coniugati formati da proteine heat shock (hsp) e oligo-poli- saccaridi, loro uso per la produzione di vaccini.
US5420014A (en) * 1992-04-30 1995-05-30 Auspharm International Ltd. Rapid in vitro test for helicobacter pylori using saliva
CA2067603A1 (en) * 1992-04-29 1993-10-30 Auspharm International Ltd. Rapid in vitro test for helicobacter pylori using saliva
PL172125B1 (pl) * 1992-04-29 1997-08-29 Auspharm Int Ltd Sposób wykrywania trwajacych infekcji Helicobacter pyroli w komórkach ssaków PL PL PL
DE4220653A1 (de) * 1992-06-26 1994-01-13 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren und Mittel zum Nachweis eines Analyten enthaltend glykosidische Tenside
GB9313437D0 (en) * 1993-06-30 1993-08-11 Smith Andrew W Pathogenicity sequences in helicobacter pylori
WO1995005850A1 (en) * 1993-08-27 1995-03-02 Enteric Research Laboratories, Inc. Campylobacter jejuni antigens, and methods for their production and use
US5780040A (en) * 1994-06-08 1998-07-14 Tufts University School Of Medicine Hospital, Inc. Helicobacter pylori nickel binding protein
GB2290866B (en) * 1994-06-29 1998-10-07 Reckitt & Colmann Prod Ltd Detection of Helicobacter pylori infection using antibodies to carbonic anhydrase
CA2194236C (en) * 1994-07-01 2009-02-24 Dermot Kelleher Helicobacter proteins and vaccines
AU3657995A (en) * 1995-10-09 1997-04-30 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Helicobacter lactoferrin receptor
GB2324093A (en) * 1996-01-04 1998-10-14 Rican Limited Helicobacter pylori bacterioferritin
US5716791A (en) 1996-05-09 1998-02-10 Meridian Diagnostics, Inc. Immunoassay for H. pylori in fecal specimens
US5932430A (en) * 1996-05-09 1999-08-03 Meridian Diagnostics, Inc. Immunoassay for H. pylori in fecal specimens
US5942409A (en) * 1998-07-31 1999-08-24 Byk Gulden Lomberg Chemische Fabrik Gmbh Process for identification of substances modulating ureI dependent mechanisms of Helicobacter pylori metabolism
JP2005506322A (ja) * 2001-08-31 2005-03-03 カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉワクチン接種

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0078152B1 (en) * 1981-10-22 1986-05-07 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Salts of sulfodehydroabietic acid and treatment of gastro-intestinal diseases
US4579827A (en) * 1983-03-11 1986-04-01 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Monoclonal antibodies to human gastrointestinal cancers and hybridoma method of production of the monoclonal antibodies
US4785086A (en) * 1985-01-17 1988-11-15 Integrated Genetics, Inc. Test for Campylobacter
CA1274757A (en) * 1985-05-17 1990-10-02 Barry James Marshall Compositions and methods for the detection of urease for the diagnosis of campylobacter pyloridis infection
US4748113A (en) * 1985-06-13 1988-05-31 Marshall Barry J Compositions and methods for the diagnosis of gastrointestinal disorders involving urease
WO1987001119A1 (en) * 1985-08-16 1987-02-26 Gregory Murray Winn Monoclonal antibodies reactive against campylobacter pyloridis

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DE68923882T2 (de) 1996-03-14
WO1989008843A1 (en) 1989-09-21
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EP0439462B1 (en) 1995-08-16
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