JPH03504412A - カンピロバクター・ピロリの高分子型細胞関連蛋白の調製法とカンピロバクター・ピロリ感染の血清学的検出のための用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 カンピロバクタ−・ピロリの高分子型細胞関連蛋白の調製法とカンピロバクタ− ・ピロリ感染の血清学的検出のための用法発明の分野 この発明はカンピロバクタ−・ピロリ感染に対する抗体の検出のための抗原とし て使われる高・分子細胞関連蛋白に関する。それは抗原を調製するためと同様感 染を検出し、モニターすることにも有用である。

発明の背景 カンピロバクタ−・ピロリ（旦４廻旦ム）は１９８２年にはじめて単離された。

それは胃炎の重要な原因となることで知られており、十二指腸潰瘍、胃潰瘍、胃 弱、胃癌などにも関わっている６１９８２年に発見されて以来、Ω、■旦ユにつ いて、またその胃病や潰瘍の形成に対する現実の役割について詳細に調べようと して多大の世界的な関心がもたれている。Ω、■１ｏｒｉと異常な胃病理との間 に密接な関連を示す多くの研究があるにも拘らず、その菌が病原性が、あるいは 日和見的なのか結論するに足る証拠はない。しかしながら、Ｃ，ｕ旦ユの存在は 胃の病気を治療するのに重要な着眼点である。

Ω、■１ｏｒｉをもっている患者は臨床検査に役立ち、治療の間の病状を追跡す るのに有用な特別の抗体応答を示す。従って多くの系が血清の抗凪■Ｉｏｒｉ抗 体を検出するために開発されてきた。しかしながら、予備的な研究によれば、Ω 。

■且ムは好熱性のカンピロバクｌ−である９、ｍやΩ。

ｃｏｌｉなどと抗原的交差反応を示す。この交差反応は特異性の欠除をもたらす 。

交差反応に関連した問題を避ける試みとして、研究者はり、肛包■の酸可溶性表 層蛋白と外膜蛋白について強力に研究してきた。Ｎｅｗａｌｌ、　Ｄ、Ｇ、、ジ ャーナル・オブ・マイクロバイオロジー誌、１３３巻、　１６３−１７０　（１ ９８７年）　　；　Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ、　Ｇ、１．、　Ｂｌａ−ｓｅｒ、 Ｍ、Ｊ、、インフエクション・アンド・イムニテイ誌、５５巻１２５６−１２６ ３頁（１９８７年）。

Ｎｅｗａ　ｌ　ｌは酸で抽出される蛋白はΩ、■几亘に特有の分子量が２０，０ ００から１００，０００ダルトンの蛋白であることを示した。

しかしながら、これらの蛋白のうちいくつかはＣ０」包…の蛋白と類似しており 、多くはまたΩ、且皿旦と交差反応を示した。少くとも１つの主要抗原（約６０ ．０００ダルトン）はΩ。

二坦肚とは殆んど交差反応を示さなかったが、少しはまだ交差反応した。他方、 Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚは約６２．０００ダルトンの抗原が重大な交差反応をす ることを示した。Ｃ，ｕ旦旦は急性の胃炎患者において全身性及び局所性の抗体 反応を示しつるが、この分泌性抗体反応は宿生をなくすことにはならないようで ある。Ｒａｔｈｂｏｒ＋ｅ、　Ｂ、Ｊ、ら、ゲート誌、２７巻。

６２４−６４７　（１９８６年）　。Ｒａｔｈｂｏｎｅらはその免疫学的測定に 全菌体を使った。

イムノプロット法を使った他の研究によってΩ、以ｄ旦口、は分子量１００．０ ００ダルトンまたはそれ以下の範囲に多くの免疫反応性の成分をもっていること が示された。Ｋａｌｄｏｒ、　Ｊら、ザ・メディカル・ジャーナル・オブ・オー ストラリア誌、１４５巻、　１３３−１３５頁（１９８６年）。

全菌体を使うＥＬＩＳＡ法でΩ、■旦二の抗体を検出できるが、まだ交差反応の 問題は解決できない。Ｍｏｒｒｉｓら、ザ・ニューシーラント・メディカル・ジ ャーナル誌、９９巻、　６５７−６５９頁（１９８６年）。

Ω、ｄ旦ムの酸グリシン抽出物はＥＬＩＳＡ法で抗体を検出する。しかしながら 、多くの誤陽性、誤陰性が存在する。個々の擬似的な結果の相当な数がカットオ フする点を調整することで調節はできるけれど、グループ間で大きな重複がみら れる。Ｇｏｏｄｗ−ｉｎら、ザ・ジャーナル・オブ・インフエクシャス・ディシ ーズ誌、１５５巻、　４８８−４９４頁（１９８７年）。

同様な結果が補体固定、細菌凝集、イムノブロッティング等でもみられている。

　Ｊｏｎｅｓら、ジェネラル・クリニカル・パソロジー誌、３７巻、　１００２ −１００６頁（１９８４年）　、　Ｊｏｎｅｓら、ジャーナル・オブ・モルキュ ラー・バイオロジー誌、２２巻。

５７−６２頁（１９８６年）。酸で洗った両分は補体結合法でも５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅイムノプロット法でも同様な結果を示す。Ｗｕｌｆｆｅｎら、ジャーナル・オ ブ・クリニカル・マイクロバイオロジー誌。

２４巻、　７１６−７２０頁（１９８６年）。

罹患したヒトの血清中にはΩ、■Ｉｏｒｉ抗体がみられるという多くの報告があ る。これらは全て微生物の外側の表面を扱ったものである。これらの検定系では 、抗原は全菌体または鞭毛の一部分かであり、大凡１００．０００ダルトンまで の分子量範囲にある外層膜である。これらの研究はいずれも感染を正確に検出す るには十分でない。重大な誤分類、誤陽性、誤陰性、あるいはΩ、二匹旦やΩ１ 匹豆のような他の生物との交差反応がある。かくして、Ｃ４Ｌ旦妖抗体を特異的 に検出する迅速な免疫学的方法が必要となる。本発明はこの要求に適合する。本 発明はΩ、■１ｏｒｉ感染を診断するための新規で正確な血清学的方法を述べて いる。これまでに報告された結果はより低分子物質を使っており、他の細菌との 交差反応がかなり高いレベルにある。同じように全体に信頼される方法は他にな い（感度と特異性の点で）。

消化不良の症状は西欧世界で大きなヘルスケア出費を伴っている。この消化不良 の頻度について正確な統計はつかめてないが、最近の研究で公共的な問題となっ ていることが示されている。例えば、英国では開業医によって扱われた患者の約 １％が毎年最初に消化不良を訴えるとされている。消化不良の費用は多く、次の ようなものが含まれる。

（＋）制酸剤あるいはＨ１受容体拮抗剤（シメチジン、ラニチジンの売上げは２ ０億ドル以上）１．（２）消化器官バリウムやファイバースコープ内視といった 診断のための費用、（３）仕事からはなれることによる費用等。消化不良の薬物 使用に及ぼす影響はスウェーデンで胃炎や非潰瘍性の消化不良の診断がなされた 患者をみることで研究された。

Ｔｙｌｌｓｔｒｏｍら、スカンジナビアン・ジャーナル・オブ・ガストロエンテ ロロジー、　１９８４年、１９巻、　７５５−７６０頁Ｔｙ１１ｓｔｒｏｍは、 制酸剤あるいはＨ１受容体拮抗剤治療がこれらの患者に一般的であるとした。事 実、医者を訪れる多くの患者は処方薬を与えられた。この結果はそのような患者 の９１％が一般的に制酸剤を使用されているという英国のデータと同様である。

Ｔｙｌｌｓｔｒｏｍはスウェーデンの全人口の１％が毎日投薬され、非潰瘍性消 化不良がシメチジン投与を最初に指示され、それが処方箋の３５％とみなして計 算した。シメチジンで治療される患者の割合は増加の傾向にあることも注目され ている。

胃腸障害や潰瘍の発生が西欧社会で高まり、コストも上っているので、これらの 病気を検出し、モニターし、治療することは大いに望まれる。かくして、本発明 はこの病気と関連し、その消失が臨床的に改善されることと関係しているＣＬ、 肛旦旦を特異的に検出することのできることで重要である。

且里辺ｌ笠 本発明の目的はΩ、ｕ旦旦の高分子細胞関連蛋白から抗原を単離精製することで ある。

本発明のもう一つの目的はヒトにおいてＣ，ｕ包亘の感染を検出する方法である 。

本発明のさらにもう一つの目的は診断用キットである。

かくして前記の目的に付随して、本発明の態様に従えばΩ、■旦旺の高分子細胞 関連蛋白（ＨＭ−ＣＡＰ）から抗原が提供されるがその抗原は分子量３００．０ ００から７００，０００ダルトン、焦点電気泳動でのｐｉは５．９〜６．３、燐 酸緩衝化した生理食塩水やトリス塩酸バッファーに可溶の形ではゾ精製される。

好適具体例の一つでは抗原はウレアーゼ活性を示している。

別の具体例には、ＨＭ−ＣＡＰから分離された抗原を検査すべき血清試料と結合 し、酵素結合免疫法、ラジオイムノアッセイ、補体結合法、ラテックス凝集法、 予めグルタルアルデヒドあるいはタンニン酸で処理（活性化）したＩ（Ｍ−ＣＡ Ｐコートした赤血球を用いる受動的血球凝集法等から成る群から選ばれる免疫学 的方法を行うことによってヒトのΩ。

■旦り感染の検出をする血清学的方法が含まれている。

具体例の一つに酵素結合免疫吸着法が使われている。この方法は抗原を固相の支 持体に固定し、固定化された抗原に血清試料を加え、血清試料を反応させ、固定 化した抗原と抗原−抗体結合体を作らせることを含んでいる。その抗原抗体結合 体に酵素を結合した抗ヒトＩｇＧを加えて、抗原−抗体酵素結合抗ヒトＩｇＧ結 合体を作らせる。望ましい具体例には、酵素はアルカリホスファターゼ、西洋ワ サロベルオキシダーゼ、あるいはβ−ガラクトシダーゼ等が含まれる。アルカリ ホスファターゼが使われる場合、ｐ−ニトロフェニル燐酸（酵素の基質）が複合 体に使われる。この基質はアルカリホスファターゼと反応して抗体の量を測定し つる色を発する。

もう一つの具体例は固相支持体に固定化したＣ、、ｕハムの高分子細胞関連蛋白 の抗原を包含するキットを含む。

その他の目的、特徴、及び利点については発明の明細の目的に対して添付の図面 と一緒に示される発明の具体例について以下の明細から明らかになるだろう。

図面の簡単な説明 本発明は以下の明細書を読み、添付の図面を参照することによってもっと容易に 理解されよう。

図１は、アガロースＡ−５ｍカラムにかけられた粗ＨＭ−ＣＡＰの典型的溶出プ ロフィールである。

図２は、液体培地（０−０）と平板培地（）−４）で生育した細菌からとった） ＩＭ−ＣＡＰ標品の典型的溶出パターンでウレアーゼ活性の領域が示されている 。

図３は、抗Ω、■１ｏｒｉを検出するために平板培地で培養した細菌からとった 抗原でＥＬＩＳＡ法を行ったとき４つの異なる陽性、陰性血清試料を比較してい る。

図４は、Ω−ｕ旦亘を検出するのに液体培養した細菌でＥＬＩＳＡを行ったとき ４種の異なる陽性及び陰性の血清を比較している。

ｌ亙皇里監 図面は必ずしも尺度を合わせたものでなく、発明のある特徴のために尺度は誇張 されたり、明瞭さのために模゛式的に示される。この技術分野に通じるものにと っているいろな置きかえや修正が、この発明の目的や精神からはなれることなく 、ここに記した発明について行うことができるということは容易に考えられる。

Ω、ｐＬｉｉ！；２Ｘｉの高分子細胞関連蛋白（ＨＭ−ＣＡＰ）からの抗原は分 子量約３００．０００〜７００，０００ダルトン、焦点電気泳動のｐｌは約５． ９〜６．３でＰＢＳ　（燐酸塩緩衝化生理食塩水で約０．０５Ｍ燐酸バッファー と、約０．８５％ＮａＣＱを含みｐＨ約７．２のもの）やトリス塩酸バッファー （約０．０５Ｍ　トリス、ｐＨは約８．０）を含む一般に使われる緩衝液に溶け るような形にほず精製されている。蛋白部分は２８０ｎｍの吸収によって検出さ れ、蛋白量の分析は少なくされた。ゲルはクマシー・ブルーで染色された。ＨＭ −ＣＡＰはΩ、乞ｄ旦劇−細胞をｎ−オクチルーブルコシド（ＮＯＧ）で処理す ることで抽出（可溶化）される。ＮＯＧは膜や表層蛋白を細胞をこわすことなく 抽出する。望ましい具体例ではこれらの抗原はウレアーゼ活性を示す。

Ω、■１ｏｒｉの細胞を集菌し、洗ってもウレアーゼ活性は細菌細胞に結合した ままである。超音波破砕と遠心分離をした後ウレアーゼ活性はベレットにあり、 ウレアーゼ活性をもった蛋白は膜の外層に結合しているという証拠を示している 。「膜の外層に結合している蛋白」とはその蛋白が膜の中にあるか膜の表面上に あるかのいずれかを示している。

さらに、細胞をこわすことなく細胞表面をこわすとウレアーゼ活性は上清画分に 放出される。

抗原はいろいろな方法で調製できる。望ましくはΩ０ｍ１一部」はまず血液寒天 平板で培養される。血液寒天平板は約７％の新鮮な（８日以上経っていない）馬 面液とＤＩＦＣＯ社の脳−心臓浸出液で作られる。３７℃で４８時間約１２％の ００１下、約ｌＯＯ％の湿度の環境で培養した後、Ω、■旦旦を平板から集菌す る。集菌した細菌はＰＢＳにより約１２分間、約８０００ｒｐｍで遠心分離して 洗われる。これを少くとも２回くり返す。

もう一つの具体例ではり、■１ｏｒｊを約１０％馬血清、約０．０３％の精製し たウサギヘモグロビン、及び約０．１５％のＤＩＦＣＯ酵母エキスを含むＤＩＦ ＣＯの脳−心臓浸出液からなる液体培地で培養する。液体培養では接種菌は血液 平板培地（前出）から調製される。培養条件は血液寒天平板培養と同じである。

培養液から細菌を約８００Ｏｒｐｍで約１２分間遠心分離して集め、平板で生育 した菌について記したと同じ洗滌方法を行う。

次に、洗われたり、肛胆ム菌体は液体であろうが平板からであろうが、約ｐＨ７ ，２のＰＢＳ中約１％のｎ−オクチル−グルコシド溶液に遠沈した菌体１゜Ｏｄ 当り約２．５−入れて再び懸濁することによって抽出される。室温で２０分間抽 出した後、抽出懸濁液は約１５．　ＯＯＯｒｐｍで１５分間遠心分離される。上 清を取り出し、保存剤として０．０２４％のアジ化ナトリウムを含む１／２濃度 のＰＢＳの１６００容量を外液にして（約４Ｑ）１８から２４時間透析する。透 析内液を約１８０００ｒｐｍで約１５分間遠心分離する。沈殿した物質を除き、 上清液を貯える。上清液は粗製のＨＭ−ＣＡＰを含んでいる。粗ＨＭ−ＣＡＰ標 品をアガロースＡ−５ｍカラムにのせ、約０．０５Ｍのトリス−塩酸バッファー （約ｐＨ８，０で約０．０２５％のＮａＮ、を含む）で溶出する。カラムは径１ ．６ｃｒｎ長さ１００ｃｍのカラムである。カラムから約２．５−の分画として 集め、それをモニターする。これらの両分の吸光度は２８０ｎｍで測定され、ウ レアーゼ活性は基質として尿素を用いて測定された。最大のウレアーゼ活性を含 む両分（約６から８のところ）を集める。集めた両分は約３００、０００から７ ００．０００ダルトンの分子量範囲を示す。この点でＨＭ−ＣＡＰ標品は少くと も２つの別の蛋白を含んでいる。

図１は、粗ＨＭ−ＣＡＰ標品２．５０ＩＩ２をアガロースＡ−５ｍカラムに通し たとき得られた結果を示している。画分４７−４９の２８０ｎｕ吸収のある物質 のピークはウレアーゼ活性のピークと一致しており、画分５１−５２に低分子量 の２８０ｎｍ吸収物質のもう一つのピークがそれに続く。これら２つのピークは かなりオーバーラツプしていて部分精製されたＨＭ−ＣＡＰの画分４７−４９は 少くとも２つ、おそらくそれ以上の分子種を含んでいる。これら個々の蛋白を分 離するためにさらに分画を行える。

分子量（ＭＷ）は同じアガロースＡ−５ｍカラムを既知の分子量をもった蛋白を 流し、その溶出位置を見つけることできめられる。例えば、両分４６にチログロ ブリン（毘６６９、０００）、画分５１にアポフェリチン（ｌｉＩＷ４４３，０ ００）、画分５５に酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（ＭＷ１５０．０００）、 画分６２にウシ血清アルブミン（ＭＷ６６．０００）である。これらの標準蛋白 から部分精製された朋−ＣＡＰは３００，０００　（画分５３）から７００．０ ００　（画分４６）までの分子量範囲の分子を含んでいると計算される。

個々の蛋白画分の抗原性は図２〜４に示されている。聞−ＣＡＰ画分を選別しウ レアーゼ活性にもとづいてプールしてＥＬＩＳＡ法の抗原として用いた。これら 抗原に抗Ω、■旦旦血清ＩｇＧ抗体の有無を検出するのに非常に効果的であった 。

その生物の存、不存在は抗原の存、不在と相関していた。

この関係は他の不便ではあるが認識はできる方法でもΩ。

■旦旦菌体を検出されることによっても確められた。２つのバッチのΩ、互旦亘 を培養し、１つを平板培養、もう１つを液体培養し、（１）この特異性のどれだ けがウレアーゼ以外の抗原によるとみなされるか、また（２）抗原生産に対する 菌の培養方法（平板に対して液体培地）がＥＬＩＳＡの特異性に影響するかどう かを確かめた。粗ＨＭ−ＣＡＰを両方の菌体バッチから調整され、個別に同じア ガロースＡ−５ｍカラムに通した。溶出図は図２に示される。

いずれの場合も２つあるいはそれ以上のカラム画分を貯えられ、図２に示すよう に８つの異なる両分とした。蛋白量の定量を各両分について行い、夫々から蛋白 として当量になるようマイクロタイタープレートにコーティングされた（７１当 り０．００７■の蛋白と抗原として１００μＱを）。蛋白量の定量は次の表の中 にみられる。

希釈前のアガロース画分の蛋白量 １　　　　　　５３−５８　　　　０．２８　　　０．１６２　　　　　　５５ −５６　　　　０．３８　　　０．１９３　　　　　　５７−５８　　　　０． ２６　　　０．１６４　　　　　　５９−６０　　　　０．２２　　　０．１４ ５　　　　　　６１−６２　　　　０．２４　　　０．２０６　　　　　　６３ −６４　　　　０．２０　　　０．１５７　　　　　　５９−６４　　　　０． ２８　　　０．２４８　　　　　　５３−６４　　　　０．２８　　　０．２０ プール２は標準法で使われるＨＭ−ＣＡＰ抗原標品に相当する。

４個のＥＬＩＳＡ陽性と４つのＥＬＩＳＡ陰性血清試料は無作為に選別され、Ｅ ＬＩＳＡ法を行うために用いられた。その結果は図３．４に示されている。

図３と図４の試験によってアガロース画分５３〜６０のプール１〜４がプール５ 〜８に比べてＥＬＩＳＡ陽性とＥＬＩＳＡ陰性の血清の間で最大のちがいがみら れることが示されている。

プール５〜８は試料の抗原としていくらか選択性を示し、Ｃ，ｄ包■特異的なＥ ＬＩＳＡ法にするにはさらにＨＭ−ＣＡＰを精製する必要はないことを示唆して いる。

これらの結果はウレアーゼ陽性のカラム画分をΩ、肛包■特異的なＥＬＩＳＡ法 におけるＨＭ−ＣＡＰ抗原として使うのに選択することが十分な感度と選択性を 与えることを示している。

それ故、特異的な成分にさらに分離することは必要ない。

さらに、平板培養と液体培養の最近はＥＬＩＳＡ抗原のためのＨＭ−ＣＡＰの素 材として等しく有効である。ＨＭ−ＣＡＰの液体培養したバッチにウレアーゼ蛋 白が高収量であったこと（図２参照）は２つの主要なピークが効率よくわけられ ないために液体培養された抗原のプール５〜８は平板培養された抗原のプール５ 〜８よりもよく作用するということが明らかであろう。

かくして図３と図４は少くとも２つの蛋白が血清中のΩ。

以佳−ｏｒｉ抗体を検出するのに個々の蛋白量々と同等に効果的であることを示 している。これらのデータはウレアーゼ活性と一致している高分子量成分が低分 子抗原よりよい抗原であることを示しているが、それらはまたΩ、ｕ旦り感染を 決定するのによくないとしても、その混合物はよいということも示唆している。

かくしてその蛋白はさらに個々の成分に精製されるけれどその混合物を分離する 前に精製をやめても十分である。

血清中のΩ、肛旦ユ抗体を検出するのに多くの方法が使われる。この分野技術に 通じる人は酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＴＡ ）、補体結合、ラテックス粒子凝集法、イムノプロット法、受動的免疫凝集法等 全てが使えることを認識しよう。望ましい方法には血清学的方法にＥＬＩＳＡが 含まれる。この方法は固相支持体にＨＭ−ＣＡＰ抗原を固定化することを含んで いる。抗原を固定化した後、検査すべき血清試料を固定化した抗原と結合させ、 それらを約９０分間室温で湿潤な条件でインキュベートする。

抗原−抗体結合体がそのインキュベーションの間に形成される。抗原抗体結合体 が形成されると、アルカリホスファターゼ結合の抗ヒトＩｇＧを固相支持体上の 抗原−抗体結合体に加え、約９０分間室温、湿潤状態で反応させ、抗原−抗体− アルカリホスファターゼ結合抗ヒトＩｇＧ複合体を形成させる。そこで起こる結 合の量を測るのに多くの基質が使われる。好適な具体例ではｐ−ニトロフェニル 燐酸がこの結合体に加えられ生じる黄色物質を形成される抗原抗体複合体の量、 従って血清中に存在する抗体の量を定量するために測定する。

実施例 旦フ法族：約０．００７■／−の蛋白濃度にＰＢＳで希釈したＨＭ−ＣＡＰ抗原 １００μαでマイクロタイタープレートをコートする。−例では標準的な９６ウ エルプレートが使われる。１８〜２４時間、３７℃、湿潤な場所においた後、抗 原はプラスチック表面に付着し、非特異的に永久に結合させる。余分なプラスチ ックの蛋白結合部分を約３０分間、約３７℃の湿潤なところでＰＢＳに溶かした 約１％ＢＳＡ　（ウシ血清アルブミン）とインキュベートすることでブロックす る。余分のＢＳＡを３回ＰＢＳＴ　（約０．０２％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢ Ｓ　）で洗うことによって取除く。次に、うエル当り約１００μＱの血清をＰＢ Ｓで１＝５０か１：１００に希釈して添加する。室温で約９０分間、湿潤所にお いてインキュベートした後、過剰の抗体はＰＢＳＴで３回洗うことによって除く 。ウェル当り約１００μΩの適当に希釈した結合体（アルカリホスファターゼを 結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体）を加え、混合液を約９０分間、湿潤なところで 室温でインキュベートする。過剰の結合体、すなわち未反応の結合体をＰＢＳＴ で３回洗った後、ウェル当り約１００μ２のアルカリホスファターゼ基質、例え ばｐ−ニトロフェニル燐酸を加える。さらに約６０分間、湿ったところでインキ ュベートした後、黄色く発色した酵素反応物を測定する。

夫々のマイクロタイタープレートには一連のコントロールが含まれている。例え ば、既知のＥＬＩＳＡ陽性血清や既知のＥＬＩＳＡ陰性の血清、あるいは反応ブ ランク等である。約０．２００あるいはそれ以上の吸光度値は陽性とする。次の ような結果が得られた。

Ｃ１ｏｒｉ　　　の多 十　　　　　　　　　　　− Ω、ｕ旦ユ感染は組織化学的検査と生検試料の培養、あるいは”１Ｃ尿素の呼気 試験によって陽性か陰性かを診断した。

ＨＭ−ＣＡＰ　ＥＬＩＳＡ法ではΩ、ｄ垣■感染のある患者からの１１６検体中 １１３を検出した。これは９７．４％の特異性である。この方法の感度は陰性の ＨＭ−ＣＡＰ　ＥＬＩＳＡの結果をみることで決められる。その結果は９３のΩ 、公ｄ旦灼−陰性患者のうち９０が検出されたことを示している。これは９６． ８％の感度である。

全体の信頼性は９７．１％である（２０９検体から２０３が正確に予測された） 。このデータはＥＬＩＳＡ法によれば、もしあっても誤分類は殆んどないことを 強く示している。

１凰■蛮 ヱユ上：固相の支持体上でＨＭ−ＣＡＰ抗原をインキュベートすることによって キットを調整した。固相支持体は電荷をもった膜あるいはプラスチック素材いず れでもよい。固相支持体と抗原の複合体は別々に包装しても、あるいは組み合わ せて包装してもよい。キットはまた誤陽性と誤陰性に対するコントロールと試薬 を含んでいる。このキットは１検体あるいは複数の検体用に使うことができる。

１Ｌ丘主 ラーツクス　　　：Ω、■１ｏｒｉに対する抗体がＨＭ−ＣＡＰをコーティング したラテックス粒子を入れた血清検体で測ることができる。さらに、単一特異的 抗体（抗ＨＭ−ＣＡＰ　）をコーティングしたラテックス粒子によって抗原の存 在を測定できる。約０．７７ミクロンの径のポリビニル、あるいはトルエンラテ ックス粒子、あるいは約０．８１から１．７７ミクロンのポリスチレンラテック ス粒子がＨＭ−ＣＡＰでコーティングされる。ラテックス粒子的２．０ｄを約２ ０ｍ１２の蒸留水に懸濁し、混合し、そしてフットマン階４０濾紙で濾過する。

ｐＨ７，２のＰＢＳあるいは相応する緩衝液でろ液の波長６４０ｎｍにおける吸 光度を約２．０に調整した後、約０．１ｍｌのラテックス懸濁液を約５．０ｄの ＰＢＳで希釈する。希釈したラテックス懸濁液に約０．５−の０．５％抗原溶液 を加える。この混液を約３７℃で３０分間インキュベートする。それからラテッ クス粒子を２回、夫々１０倍量のＰＢＳで洗滌する。最後に懸濁液をｏ、１％の ウシ血清アルブミンを含む０．１Ｍグリシン緩−液で吸光度０．３に調整される 。測定ではコートしたラテックス粒子と０．１Ｍグリシン緩衝液で希釈した血清 を等量混合する。コントロールの試験管は血清の代りに食塩水を入れる。試験管 は５０℃で２時間インキュベートし、＋５，０ＯＯＸ　ｇ、３分間遠心分離し、 それから静かに上澄を流す。凝塊の程度を記録する。

凝塊は抗原抗体複合体の形成を通してビーズが凝集することによっている。

ス】目生先 ラジオ　ムノ　ッセ　：適当な濃度の抗原的１００μＱで９６ウエルマイクロタ イタープレートをコーティングする。約３７℃で約１８−２４時間インキュベー トした後、ウェル中の過剰の結合部分をＰＢＳで溶かした１％ＢＳＡあるいはそ れに相当するものでブロックする。測定すべき血清の適当量をウェル当り約＋０ ０μＱを２つのウェルに加え室温で約２時間インキュベートする。ＰＢＳＴで数 回プレートを洗った後、適当に希釈したヤギまたはウサギの抗ヒトＩｇＧをウェ ル当り１００μＱを加える。抗ヒトＩｇＧは予め”“Ｉで標識しておく６マイク ロタイタープレートを室温で約４時間インキュベートし、ＰＢＳＴで数回洗い、 風乾する。各ウェルの残留する放射活性の量をガンマカウンターで計測する。陽 性と陰性の血清をコントロールとして各プレートに含ませておく。この方法は陽 性と陰性の血清の間のちがいを測るために常に行われる。

この技術分野に通じる者は本発明がその目的を実行し、上に記した目的と利点を それに内在されているものも含め得られるように適合されることを実際に評価す るだろう。

ここに記された方法、やり方、技術等は実施例の代表的なものであり例示として あげたつもりであって、その目指すところをそれに限定するつもりはない。この 分野に通じた者にとっては、この発明の精神の中に含まれ特許請求の範囲によっ て規定される変更や他の目的での利用も行えるであろう。

吸光度（２８０ｎｍ） ゝＮ２ 吸光度（２８０ｎｍ） ＥＬＩＳＡの値 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）ＥＬＩＳＡの値 平成２年９月７日 特許庁長官　植　松　　　敏　殿 １、国際出願番号 ＰＣＴ／Ｌ７Ｓ８９１００９４１ ２、　発明の名称 ３、　特許出願人 住　所　アメリカ合衆国、　７７０３０　　テキサス。

ヒユーストン、ベイラー　プラザ　１番地名　称　ベイラー　カレッジ　オブ　 メディシン代表者　サムエル　ニス、クロッカー 国　籍　アメリカ合衆国 ５、　補正書の提出年月日 １９９０年３月２０日 ６、　添付書類の目録 補正書の写しく翻訳文）　　　　　　　　　　１通Ｃ，互凡亘と異常な胃病環と の間に密接な関係を示す多くの研究があるにも拘らず、その菌が病原性か、ある いは日和見的なのか結論するに足る証拠はない。しかしながらΩ、肛とムの存在 は胃の病気を治療するのに重要な着眼点となる。

Ω、■１ｏｒｉをもっている患者は臨床検査に役立ち、治療の間病状を追跡する のに有用な特別の抗体反応を示す。従って多くの系が血清の抗Ω、肛旦ユ抗体を 検出するために開発されてきた。しかしながら、予備的な研究によれば、Ω、■ 旦二は好熱性のカンピロバグターであるΩ、且血旦やΩ０皿旦などと抗原的交差 反応を示す。この交差反応は特異的の欠除をもたらす。

交差反応に関連した問題を避ける試みとして、研究者はり。

■１ｏｒｉの酸可溶性表層蛋白と外膜蛋白について強力に研究してきた。Ｎｅｗ ａｌｌ、　Ｄ、Ｇ、、ジャーナル・オブ・ジェネラル　マイクロバイオロジー誌 、１３３巻、　１６３−１７０　（１９８７年）；Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ、　 Ｇ、ｌ、　Ｂｌａｓｅｒ、Ｍ、Ｊ、、インフェクション・アンド・イムニテイ誌 、５５巻＋２５６−１２６３頁（１９８７年）。

Ｎｅｗａｌｌは酸で抽出される蛋白はΩ、肛江ユに特有の分子量が２０．０００ から１００．０００ダルトンの蛋白であることを示した。しかしながら、これら の蛋白のうちいくつかはＣ，且ユ旦の蛋白と類似しており、多くはまたΩ、ユ坦 旦と交差反応を示した。

少くとも１つの主要抗原（約６０，０００ダルトン）はり、」血■とは殆んど交 差反応を示さなかったが、少しはまだ交差反応した。他方、Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒ ｅｚは約６２．０００ダルトンの抗原が重大な交差反応をすることを示した。Ω 、公住旦Ｌ２は急性の胃炎患者において全身性及び局所性の抗体反応を示しつる が、この分泌性抗体反応は宿生をなくすことにはならないようである。

Ｒａｔｈｂｏｎｅ、　Ｂ、Ｊ、ら、ゲート誌、２７巻、　６２４−６４７　（１ ９８６年）。

Ｒａｔｈｂｏｎｅらは、その免疫学的測定に全菌体を使った。

イムノプロット法を使った他の研究によってΩ、Ｌ里旦は分子量１００．０００ ダルトンまたはそれ以下の範囲に多くの免疫反応性の成分をもっていることが示 された。ＫａｌｄＯｒ、　Ｊら、ザ・メディカル・ジャーナル・オブ・オースト ラリア誌、１４５巻。

１３３−１３５頁（１９８６年）。

全菌体を使うＥＬＩＳＡ法でΩ、■１ｏｒｉの抗体を検出できるが、まだ交差反 応の問題は解決できない。Ｍｏｒｒｉｓら、ザ・ニューシーラント・メディカル ・ジャーナル誌、９９巻、　６５７−６５９頁（１９８６年）。

Ω、■旦ムの酸グリシン抽出物はＥＬＩＳＡ法で抗体を検出する。

しかしながら、多くの誤陽性、誤陰性が存在する。個々の擬似的な結果の相当な 数がカットオフする点を調整することで調節はできるけれど、グループ間で大き な重複がみられる。

Ｇｏｏｄｉｉｎら、ザ・ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディシーズ誌、 １５５巻、　４８８−４９４頁（１９８７年）。同様な結果が補体固定、細菌凝 集、イムノブロッティング等でもみられている。Ｊｏｎｅｓら、ジェネラル・ク リニカル・バソロジー誌。

３７巻、　１００２−１００６頁（１，９８４年）　、　Ｊｏｎｅｓら、ジャー ナル・オブ・メディカル・マイクロバイオロジー誌、２２巻、　５７−６２頁（ １９８６年）。酸で洗った画分は補体結合法でも５ＤＳ−ＰＡＧＥイムノプロッ ト法でも同様な結果を示す。Ｗｕｌｆｆｅｎら、ジャーナル・オブ・クリニカル ・マイクロバイオロジー誌、２４巻。

７１６−７２０頁（１９８６年）。

罹患したヒトの血清中にはΩ０匹旦ム抗体がみられるという多くの報告がある。

これらは全て微生物の外側の表面を扱ったものである。これらの検定系では、抗 原は抗原を固定化した後、検査すべき血清試料を固定化した抗原と結合させ、そ れらを約９０分間室温で湿潤な条件でインキュベートする。抗原−抗体結合体が そのインキュベーションの間に形成される。

抗原抗体結合体が形成されると、アルカリホスファターゼ結合の抗ヒトＩｇＧを 固相支持体上の抗原−抗体結合体に加え、約９０分間室温、湿潤状態で反応させ 、抗原−抗体−アルカリホスファターゼ結合抗ヒトＩｇＧ複合体を形成させる。

そこで起こる結合の量を測るのに多くの基質が使われる。好適な具体例ではｐ− ニトロフェニル燐酸がこの結合体に加えられ生じる黄色物質を形成される抗原抗 体複合体の量、従って血清中に存在する抗体の量を定量するために測定する。上 記の測定法は治療される患者から一連の血清試料を採取し、その検体について上 記の方法を実施することによってΩ、■旦旦感染の治療を追跡するのにも利用で きる。

叉五五上 旦上人族：約０．００７■／ｍｌの蛋白濃度にＰＢＳで希釈したＨＭ−ＣＡＰ抗 原ｌＯＯμΩでマイクロタイタープレートをコートする。−例では標準的な９６ ウエルプレートが使われる。１８〜２４時間、３７℃、湿潤な場所においた後、 抗原はプラスチック表面に付着し、非特異的に永久に結合させる。余分なプラス チックの蛋白結合部分を約３０分間、約３７℃の湿潤なところでＰＢＳに溶かし た約１％ＢＳＡ　（ウシ血清アルブミン）とインキュベートすることでブロック する。余分のＢＳＡを３回ＰＢＳＴ　（約０．０２％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰ ＢＳ）で洗うことによって取除く。次に、ウェル当り約１００μ２の血清をＰＢ Ｓで１：５０かｌ：］ｏｏに希釈して添加する。室温で約９０分間、湿潤な場所 においてインキュベートした後、過剰の抗体はＰＢＳＴで３回洗うことによって 除く。

ウェル当り約１００μＱの適当に希釈した結合体（アルカリホスファターゼを結 合したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体）を加え、混合液を約９０分間、湿潤なところで室 温でインキュベートする。過剰の結合体、すなわち未反応の結合体をＰＢＳＴで ３回洗った後、ウェル当り約１００μＱのアルカリホスファターゼ基質、例えば ｐ−ニトロフェニル燐酸を加える。さらに約６０分間、湿ったところでインキュ ベートした後、黄色く発色した酵素反応物を測定する。夫々のマイクロタイター プレートには一連のコントロールが含まれている。例えば、既知のＥＬＴＳＡ陽 性血清や既知のＥＬＩＳＡ陰性の血清、あるいは反応ブランク等である。

約０．２００あるいはそれ以上の吸光度値は陽性とする。次のような結果が得ら れた。

０１０ｒ１　　　の袷　′ ＋　　　　　　　　　　　− Ω、■１ｏｒｉ感染は組織化学的検査と生検試料の培養、あるいは“°Ｃ泳素の 呼気試験によって陽性か陰性かを診断した。

ＨＭ−ＣＡＰ　ＥＬＩＳＡ法ではΩ、Σｄ且わ、感染のある患者からの１１６検 体中１１３を検出した。これは９７．４％の特異性である。この方法の感度は陰 性のＨＭ−ＣＡＰ　ＥＬＩＳＡの結果をみることで決められる。その結果は９３ のΩ、江包ハム性患者のうち９０が検出されたことを示している。これは９６． ８％の感度である。全体の信頼性は９７．１％である（２０９検体から２０３が 正確に予測された）。

このデータはＥＬＩＳＡ法によれば、もしあっても誤分類は殆んどないことを強 く示している。

１１五主 エエ上：固相の支持体上でＨＭ−ＣＡＰ抗原をインキュベートすることによって キットを調製した。固相支持体は電荷をもった膜あるいはプラスチック素材いず れでもよい。固相支持体と抗原の複合体は別々に包装しても、あるいは組み合わ せて包装してもよい。キットはまた誤陽性と誤陰性に対するコントロールと試薬 を含んでいる。このキットは１検体あるいは複数の検体用に使うことができる。

ス」ｌ引１ ラーツクス　　法：Ｃ，■旦ムに対する抗体がＨＭ−ＣＡＰをコーティングした ラテックス粒子を入れた血清検体で測ることができる。さらに、単一特異的抗体 （抗ＨＭ−ＣＡＰ　）をコーティングしたラテックス粒子によって抗原の存在を 測定できる。

約０．７７ミクロンの径のポリビニル、あるいはトルエンラテックス粒子、ある いは約０．８１から１．７７ミクロンのポリスチレンラテックス粒子がＨＭ−Ｃ ＡＰでコーティングされる。ラテックス粒子的２．０−を約２０−の蒸留水に懸 濁し、混合し、そしてワットマンＮ１１４０　：ＩＰ紙で濾過する。ｐＨ７，２ のＰＢＳあるいは相応する緩衝液で炉液の波長６４０ｎｍにおける吸光度を約２ ．０に調整した後、約００Ｉ−のラテックス懸濁液を約５．０ｄのＰＢＳで希釈 する。

希釈したラテックス懸濁液に約０．５ｍ１２の０．５％抗原溶液を加える。この 混液を約３７℃で３０分間インキュベートする。それからラテックス粒子を２回 、夫々ＩＯ倍量のＰＢＳで洗滌する。最後に懸濁液を０．１％のウシ血清アルブ ミンを含むＯ，１Ｍグリシン緩衝液で吸光度０．３に調整される。測定ではコー トしたラテックス粒子と０．１Ｍグリシン緩衝液で希釈した血清を等量混合する 。コントロールの試験管は血清の代りに食塩水を入れる。試験管は５０℃で２時 間インキュベートし、１５，０ＯＯＸ　ｇ　。

３分間遠心分離し、それから静かに上澄を流す。凝塊の程度を記録する。凝塊は 抗原−抗体複合体の形成を通してビーズが凝集することによっている。

スＪＪＬ先 ラジオ　ムノ　ッセ　：適当な濃度の抗原約１００μＱで９６ウエルマイクロタ イタープレートをコーティングする。約３７℃で約１８−２４時間インキュベー トした後、ウェル中の過剰の結合部分をＰＢＳで溶かした１％ＢＳＡあるいはそ れに相当するものでブロックする。測定すべき血清の適当量をウェル当り約１０ ０μａを２つのウェルに加え室温で約２時間インキュベートする。ＰＢＳＴで数 回プレートを洗った後、適当に希釈したヤギまたはウサギの抗ヒトＩｇＧをウェ ル当り約１００μＱを加える。

抗ヒトＩｇＧは予め”１″Ｉで標識しておく。マイクロタイタープレートを室温 で約４時間インキュベートし、ＰＢＳＴで数回洗い、風乾する。各ウェルの残留 する放射活性の量をガンマカウンターで計測する。陽性と陰性の血清をコントロ ールとして各プレートに含ませておく。この方法は陽性と陰性の血清の間のちが いを測るために常に行われる。

この技術分野に通じる者は本発明がその目的を実行し、上に記した目的と利点を それに内在されているものも含め得られるように適合されることを実際に評価す るだろう。ここに記された方法、やり方、技術等は実施例の代表的なものであり 、例示としてあげたつもりであって、その目指すところをそれに限定するつもり はない。この分野に通じた者にとっては、この発明の精神の中に含まれ特許請求 の範囲によって規定される変更や他の目的での利用も行えるであろう。

特許請求の範囲 １、　アガロースＡ−５ｍカラムで定量された約３００．０００から７００、０ ００の分子量をもち； 焦点電気泳動で約５．９から６．３のｐＩをもち；ウレアーゼ活性をもち； ＰＢＳやトリス塩酸バッファーに可溶で；カンピロバクタ−・ピロリの膜の外層 から由来し；ｎ−オクチル−グルコシドで膜の外層から可溶化しつるようなカン ピロバクタ−・ピロリの高分子細胞関連蛋白から本質的に精製された抗原を含む 組成物。

２、　請求項１の抗原を酵素結合免疫吸着法、ラジオイムノアッセイ、補体固定 法、間接的血球凝集法、ラテックス凝集法等からなる群から選んだ方法により、 検査すべき血清試料と結合させ、その抗原−抗体複合体が血清試料中のｈ＞ピロ バクター・ピロリの量と比例関係にあるようなカンピロバクタ−・ピロリ感染の 検出のための血清学的方法。

３、　血清試料を固相支持体に固定化した抗原に加え；その血清試料と固定化し た支持体をインキュベートして抗原−抗体複合体を形成させ； その抗原−抗体複合体に酵素を結合した抗ヒトＩｇＧを加え；抗原−抗体複合体 と酵素結合抗ヒトＩｇＧ結合物をインキュベートして抗原−抗体一酵素結合抗ヒ トＩｇＧ複合体を作らせ；その抗原−抗体一酵素結合抗ヒトＩｇＧ複合体に基質 を加え；生成物すなわち基質の変化を測定して上記の抗体の量を定量し、その測 定される生成物すなわち基質の変化が血清試料中のカンピロバクタ−・イ旦旦の 量と比例している。

ステップを含む酵素結合免疫吸着法による請求項３の血清学的測定法。

４、　その酵素がアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β− ガラクトシダーゼからなる群から選ばれる請求項４の血清学的測定法。

５、　治療される患者から一連の血清試料を集め、その各々の試料について請求 項４のステップをくり返すことを含む左ンビロバクター・ピロリ感染を検査し、 治療する方法。

６、　血清試料を抗原でコーティングされたウェルに添加し：その血清をウェル の中でインキュベートして抗原−抗体複合体を形成させ； 放射性物質で標識した抗ヒトＩｇＧを加え；抗原−抗体複合体と抗ヒトＩｇＧの 混合物をインキュベートして抗原−抗体一抗ヒトＩｇＧ複合体を形成させ；そし て抗原−抗体一抗ヒトＩｇＧ複合体に結合している放射活性の量を測定し、その 結合した放射能が血清中のカンピロバク１二・ピロリの量に比例している。

ステップを含むラジオイムノアッセイによる請求項３の血清学的測定法。

７、　血清試料を抗原をコートされたラテックス粒子に添加し；血清試料とコー ティングされたラテックス粒子をインキュベートし； 凝集塊の程度を測定し、その凝集塊の程度が血清試料中の一カン」り月−バクタ ー・ピロリの量に比例している；ステップを含むラテックス粒子凝集法による請 求項４の血清学的測定法。

８、　固相の支持体上に固定化された請求項１の抗原をつけた容器を含むカンピ ロバクタ−・ピロリ抗体の存在を決定するためのキット。

９、　誤陰性の対照、誤陽性の対照を含んでいる請求項９のキット。

１０、　ｐＨ約７．２の約１％のｎ−オクチル−グルコシドＰＢＳ溶液で一カー ンビロバグター・ピロリから高分子細胞関連蛋白を抽出し；約０．０２４％のア ジ化ナトリウムを含むＰＢＳに対してその抽出液を透析し； その抗原が上澄に含まれるようにその透析内液を遠心分離し； その上澄液をアガロースＡ−５ｍカラムにかけ、約０．０２５％アジ化ナトリウ ムを含むｐＨ約８．０の約０．０５Ｍ　トリス塩酸緩衝液でクロマトグラフィー を行い： 分子量範囲３００．０００から７００，０００に溶出される両分を集める。

ステップを含む請求項１の抗原を調製する方法。

国際調査報告

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｃ．ｐｙｌｏｒｉの高分子型細胞関連蛋白で分子量が約３００，０００から ７００，０００ダルトンをもち、焦点電気泳動によるｐＩが約５．９から６．３ にあり、ＰＢＳやトリス塩酸緩衝液に可溶で、Ｃ．ｐｙｌｏｒｉの膜の外層に位 置しており、ｎ−オクチル−グルコシドで膜の外層から可溶化できるような抗原 。
2. ２．ウレアーゼ活性をもつ請求項１の抗原。
3. ３．請求項１の抗原を酵素結合免疫吸着法、ラジオイムノアッセイ、補体固定法 、間接的血球凝集法、ラテックス凝集法からなる群から選ばれる方法に従って検 査すべき血清試料と結合させることを含むＣ．ｐｙｌｏｕｒｉ感染の検出のため の血清学的測定法。
4. ４．血清試料を固相支持体に固定化した抗原に加え；その血清試料と固定化した 支持体をインキュベートして抗原−抗体複合体を形成させ； その抗原−抗体複合体に酵素を結合した抗ヒトＩｇＧを加え；抗原−抗体複合体 と酸素結合抗ヒトＩｇＧ結合物をインキュベートして抗原−抗体−酸素結合抗ヒ トＩｇＧ複合体を作らせ；その抗原−抗体−酵素結合抗ヒトＩｇＧ複合体に基質 を加え；生成物すなわち基質の変化を測定して上記の抗体の量を定量する ステップを含む酵素結合免疫吸着法による請求項３の血清学的測定法。
5. ５．その酵素がアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガ ラクトシダーゼからなる群から選ばれる請求項４の血清学的測定法。
6. ６．治療される患者から一連の血清試料を集め、その各々の試料について請求項 ４のステップをくり返すことを含むＣ．ｐｙｌｏｒｉ感染を検査し、治療する方 法。
7. ７．血清試料を抗原でコーティングされたウエルに添加し；その血清をウエルの 中でインキュベートして抗原−抗体複合体を形成させ； 放射性物質で標識した抗ヒトＩｇＧを加え；抗原抗体複合体と抗ヒトＩｇＧの混 合物をインキュベートして抗原−抗体−抗ヒトＩｇＧ複合体を形成させ；そして 抗原−抗体−抗ヒトＩｇＧ複合体に結合している放射活性の量を測定する。 ステップを含むラジオイムノアッセイによる請求項３の血清学的測定法。
8. ８．血清試料を抗原をコートされたラテックス粒子に添加し；血清試料とコーテ ィングされたラテックス粒子をインキュベートし； 凝集塊の程度を測定する。 ステップを含むラテックス粒子凝集法による請求項４の血清学的測定法。
9. ９．固相の支持体上に固定化された請求項１の抗原を含むＣ．ｐｙｌｏｒｉ抗体 の存在を決定するためのキット。
10. １０．誤陰性のコントロール、誤陽性のコントロール及び試薬を含んでいる請求 項９のキット。
11. １１．ｐＨ約７．２の約１％のｎ−オクチル−グルコシドＰＢＳ溶液でＣ．ｐｙ ｌｏｒｉから高分子型細胞関連蛋白を抽出し；約０．０２４％のアジ化ナトリウ ムを含むＰＢＳに対してその抽出液を透析し； その抗原が上清に含まれるようにその透析内液を遠心分離し； その上清液をアガロースＡ−５ｍカラムにかけ、約０．０２５％アジ化ナトリウ ムを含むｐＨ約８．０の約０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液でクロマトグラフィーを 行い； 分子量範囲３００，０００から７００，０００に溶出される画分を集める。 ステップを含む請求項１の抗原を調製する方法。