RU2362170C1 - Способ дифференциации инфекционного и поствакцинального антительного ответа при туляремии у человека - Google Patents
Способ дифференциации инфекционного и поствакцинального антительного ответа при туляремии у человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2362170C1 RU2362170C1 RU2008118075/15A RU2008118075A RU2362170C1 RU 2362170 C1 RU2362170 C1 RU 2362170C1 RU 2008118075/15 A RU2008118075/15 A RU 2008118075/15A RU 2008118075 A RU2008118075 A RU 2008118075A RU 2362170 C1 RU2362170 C1 RU 2362170C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lps
- tularensis
- tularemia
- infectious
- novicida
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике туляремии у людей, и касается дифференциации инфекционного и поствакцинального антительного ответа при туляремии у человека. Сущность изобретения заключается в том, что в качестве антигенного препарата дополнительно к ЛПС Fransicella tularensis в дот-блоттинге параллельно используют ЛПС Fransicella novicida, для этого предварительно выделяют из соответствующих штаммов препараты ЛПС, которые растворяют в дистиллированной воде и наносят на нитроцеллюлозную мембрану в объеме 1 мкл из раствора 1-5 мг/мл, с последующей обработкой забуференным физиологическим раствором при рН 7.0-7.1 с 1% бычьим сывороточным альбумином и 0.5% твина 20 в течение одного часа, после этого фильтры промывают и инкубируют в исследуемой сыворотке, разведенной не менее чем 1:100, в течение часа при температуре 37С°, затем образцы трехкратно отмывают и выявляют наличие комплексов антиген-антитело путем выдерживания в течение 1 часа при комнатной температуре в рабочем растворе белка А, меченного пероксидазой хрена, с последующим отмыванием и размещением в окрашивающем растворе, при этом учет и оценку результатов проводят по наличию двух коричневых пятен на месте нанесения препаратов ЛПС F.tularensis и ЛПС F.novicida, наличие которых свидетельствует об инфекционном процессе у исследуемого больного, а при вакцинальном процессе наблюдают одно пятно на месте нанесения только ЛПС F.tularensis. Преимущество изобретения заключается в одновременном выявлении инфекционного и поствакцинального антительных ответов.
Description
Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике туляремии у человека.
Приоритетным направлением в диагностике туляремии у человека являются иммунологические методы, направленные на выявление противотуляремийных антител. Однако специфические иммуноглобулины могут обнаруживаться не только в сыворотках заболевших туляремией людей, но также и в сыворотках людей, иммунизированных живой туляремийной вакциной. Поэтому на этапе исследований первичной сыворотки больного существует актуальная проблема в определении данной ситуации в экспрессном варианте.
Известен способ микроточечного иммуноферментного анализа с визуальной индикацией для определения туляремийных антител (Юров С.В., Пчелинцев С.Ю. и др. «Использование микроточечного иммуноферментного анализа с визуальной индикацией для определения туляремийных антител». ЖМЭИ, 1991, №3, стр.61-64), заключающийся в том, что при постановке дот-ИФА антигенный препарат, представляющий собой ультразвуковой дезинтеграт клеток туляремийного микроба, наносят в виде точки на нитроцеллюлозные мембраны и далее последовательно инкубируют их с исследуемой сывороткой и антивидовыми антителами (против IgG человека), коньюгированными с пероксидазой хрена. Однако использование ультразвукового дезинтеграта клеток бактерий, представляющего собой ЛПС-белковый комплекс, может обусловливать наличие неспецифических реакций с антителами исследуемых сывороток. Кроме того, данный способ не позволяет провести дифференциацию инфекционного и поствакцинального антительного ответа при туляремии у человека, так как выявляет наличие противотуляремийных антител как в сыворотках больных туляремией, так и в сыворотках вакцинированных людей.
Наиболее близким техническим решением является способ обнаружения противотуляремийных антител путем точечного твердофазного иммуноферментного анализа с использованием препаратов липополисахарида (ЛПС) Francisella tularensis (H.B.Аронова, Н.В.Павлович «Использование препаратов липополисахарида Francisella tularensis в точечном твердофазном иммуноферментном анализе». ЖМЭИ, 2000, №5, стр.75-78), заключающийся в обнаружении в сыворотке крови человека противотуляремийных антител с помощью дот-блоттинга с применением в качестве высокоспецифичного антигенного препарата очищенного ЛПС, выделенного из F.tularensis.
Однако и данный метод не позволяет осуществлять дифференциацию принадлежности противотуляремийных к вакцинальному или инфекционному процессу у человека, что затрудняет лечение больного, так как в течение 7-10 дней до исследования парной сыворотки человек остается без подтвержденного диагноза и адекватной антибиотикотерапии.
Задача предлагаемого изобретения состояла в сокращении времени установления диагноза и повышения его достоверности.
Поставленная задача достигается тем, что в известном способе, включающем обнаружение в сыворотке человека противотуляремийных антител в точечном твердофазном иммуноферментном анализе (дот-блоттинг) с использованием препарата липополисахарида Francisella tularensis, дополнительно в качестве антигенного препарата параллельно к ЛПС F.tularensis используют ЛПС F.tularensis subsp.novicida Utah 112 (F.novicida), для этого предварительно выделяют из соответствующих штаммов ЛПС F.tularensis и ЛПС F.novicida, которые растворяют в дистиллированной воде и наносят на нитроцеллюлозную мембрану в объеме 1 мкл из раствора 1-5 мг/мл, с последующей обработкой забуференным физиологическим раствором при рН 7.0-7.1 с 1% бычьим сывороточным альбумином и 0.5% твина 20 в течение одного часа, после этого фильтры промывают и инкубируют в исследуемой сыворотке, разведенной не менее чем 1:100, в течение часа при температуре 37С°, затем образцы трехкратно отмывают и выявляют наличие комплексов антиген-антитело путем выдерживания в течение 1 часа при комнатной температуре в рабочем растворе белка А, меченного пероксидазой хрена, с последующим отмыванием и размещением в окрашивающем растворе, при этом учет и оценку результатов проводят по наличию двух коричневых пятен на месте нанесения препаратов ЛПС F.tularensis и ЛПС F.novicida, наличие которых свидетельствует об инфекционном процессе у исследуемого больного, а при вакцинальном процессе наблюдают одно пятно на месте нанесения только ЛПС F.tularensis.
Способ осуществляется следующим образом.
Предварительно, перед проведением дот-иммуноанализа, выделяют липополисахариды (ЛПС) по методу R.P.Darveau и R.E.W.Hancock (1983) из ацетон-высушенной бактериальной массы штаммов F.tularensis и F.novicida. Каждый из препаратов ЛПС, растворенных в дистиллированной воде, наносят на нитроцеллюлозную мембрану в объеме 1 мкл из раствора 1-5 мг/мл. Блокирование свободных сайтов связывания нитроцеллюлезы проводят забуференным физиологическим раствором (ЗФР) (рН 7,0-7,1) с 1% бычьим сывороточным альбумином и 0,5% твин 20 в течение одного часа. Далее нитроцеллюлозную мембрану (НЦМ) промывают ЗФР и инкубируют в исследуемой сыворотке, разведенной не менее чем в 1:100, в течение часа при температуре 37°. В качестве разводящей жидкости для сыворотки используют 0,05% твин 20 на ЗФР. Затем образцы подвергают 3-кратной промывке по 2 минуты 0,01% раствором твина 20 на ЗФР. Для выявления комплексов антиген-антитело пробы инкубируют в рабочем растворе белка А, меченого пероксидазой хрена, 1 час при комнатной температуре.
Следующим этапом НЦМ трехкратно промывают по описанной выше процедуре. Затем блоты промывают в дистиллированной воде и переносят в окрашивающий раствор (20-30 мл ЗФР с добавлением 10-15 мг 3,3-диаминобензидина 4-гидрохлорида (DAB) и 10-20 мкл 30% H2O2). Реакцию проявляют в течение 1-2 минут с последующей остановкой в дистиллированной воде. За положительный результат принимают наличие четкого коричневого пятна на месте нанесения препарата при соответствующем отрицательном контроле с нормальной человеческой сывороткой.
Учет и оценка результатов
Наличие двух четких коричневых пятен на месте нанесения препаратов ЛПС F.tularensis и ЛПС F.novicida в дот-иммуноанализе при исследовании сыворотки человека свидетельствует об инфекционном заболевании, вызванном возбудителем туляремии - F.tularensis.
Наличие только одного четкого коричневого пятна в дот-блоттинге на месте нанесения препарата ЛПС F.tularensis позволяет сделать вывод, что происхождение выявленных противотуляремийных антител обусловлено иммунизацией человека живой туляремийной вакциной.
Для проверки предложенного способа в качестве исследуемых образцов были использованы 6 сывороток от людей больных туляремией (с клинико-лабораторным подтверждением диагноза), 30 сывороток - от иммунизированных живой туляремийной вакциной и 6 нормальных (неиммунных) сывороток человека. Данные сыворотки были протестированы в дот-иммуноанализе с двумя антигенными препаратами: ЛПС F.tularensis и ЛПС F.novicida.
Как показали испытания, во всех сыворотках от больных туляремией людей присутствовали иммуноглобулины, реагирующие как с ЛПС F.tularensis, так и с ЛПС F.novicida. В противоположность этому, в дот-блоттинге с сыворотками вакцинированных людей было зарегистрировано взаимодействия антител только с ЛПС F.tularensis, но не с ЛПС F.novicida. Нормальные (неиммунные) сыворотки людей не давали реакции ни с одним препаратом ЛПС.
Таким образом, обнаружение взаимодействия антител исследуемой сыворотки с обоими препаратами ЛПС (F. tularensis и F. novicida) может свидетельствовать в пользу инфекционного заболевания, а связывание иммуноглобулинов только с препаратом ЛПС F. tularensis - в пользу наличия антител, обусловленных поствакцинальным противотуляремийным иммунитетом. На основании данных результатов можно сделать заключение о том, что предложенный способ позволяет дифференцировать инфекционный и поствакцинальный антительный ответы при туляремии у человека.
Пример 1. Исследовали сыворотку человека (37 л) с подозрением на туляремию (лихорадка, лимфаденит).
С помощью дот-иммуноанализа с двумя антигенными препаратами ЛПС F.tularensis и ЛПС F.novicida первичная сыворотка больного изучена по описанной выше технологии. На месте нанесения ЛПС F.tularensis и ЛПС F.novicida зарегистрирована реакция антител первичной сыворотки с обоими антигенными препаратами в виде двух пятен коричневого цвета с выраженностью окраски на 3-4 креста, что свидетельствует в пользу заболевания туляремией у данного человека.
Через 10 дней после забора первичной сыворотки диагноз туляремии был подтвержден лабораторно при исследовании парной сыворотки по нарастанию титра специфических противотуляремийных антител (МУ 3.1.2007-05 «Эпидемиологический надзор за туляремией». М., 2005).
Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет уже на этапе исследования первичной сыворотки подтвердить наличие у человека инфекционного процесса, вызванного F.tularensis, что значительно сокращает время при постановке диагноза.
Пример 2. Сыворотку человека (53 г), иммунизированного живой туляремийной вакциной (3 месяца назад) исследовали в дот-иммуноанализе с двумя антигенными препаратами - ЛПС F.tularensis и ЛПС F.novicida - по описанной выше технологии. В результате исследования сыворотки в дот-иммуноанализе зарегистрирована реакция антител сыворотки только с препаратом ЛПС F.tularensis. Реакция антител с антигенным препаратом ЛПС F.novicida отсутствует. Эти данные свидетельствуют о том, что в сыворотке человека присутствуют только противотуляремийные антитела, обусловленные последствиями иммунизации человека туляремийной вакциной. Таким образом, результаты дот-иммуноанализа в данном случае свидетельствуют в пользу принадлежности выявленных антител не к заболеванию туляремией, а к имевшей место иммунизации живой туляремийной вакциной.
Пример 3. Сыворотку здорового человека (42 г) исследовали в дот-иммуноанализе с двумя антигенными препаратами: ЛПС F.tularensis и ЛПС F.novicida, по описанной выше технологии. В результате не зарегистрировано реакции антител сыворотки ни с одним препаратом ЛПС. Данный факт свидетельствует об отсутствии в сыворотке этого человека специфических противотуляремийных антител.
Использование предлагаемого изобретения позволяет на этапе исследования первичной сыворотки человека в дот-иммуноферментном анализе с препаратами ЛПС F.tularensis и ЛПС F.novicida экспрессно дифференцировать наличие антительного ответа, обусловленного инфекционным или поствакцинальным иммунитетом.
Кроме того, способ позволит повысить достоверность диагностики туляремийной инфекции у человека при исследовании первичной сыворотки со своевременным назначением эффективного лечения заболевания и развертыванием адекватных противоэпидемических мероприятий в очаге.
Claims (1)
- Способ дифференциации инфекционного и поствакцинального антительного ответа при туляремии у человека, включающий обнаружение в сыворотке человека противотуляремийных антител в точечном твердофазном иммуноферментном анализе (дот-блоттинг) путем использования препарата липополисахарида Francisella tularensis, отличающийся тем, что дополнительно в качестве антигенного препарата в дот-блоттинге параллельно с ЛПС F.tularensis используют ЛПС F.novicida, для этого предварительно выделяют из соответствующих штаммов ЛПС F.tularensis и ЛПС F.novicida, которые растворяют в дистиллированной воде и наносят на нитроцеллюлозную мембрану в объеме 1 мкл из раствора 1-5 мг/мл, с последующей обработкой забуференным физиологическим раствором при рН 7,0-7,1 с 1% бычьим сывороточным альбумином и 0,5% твина 20 в течение одного часа, после этого фильтры промывают и инкубируют в исследуемой сыворотке, разведенной не менее чем 1:100, в течение часа при температуре 37С°, затем образцы трехкратно отмывают и выявляют наличие комплексов антиген-антитело, путем выдерживания в течение 1 ч при комнатной температуре в рабочем растворе белка А, меченного пероксидазой хрена, с последующим отмыванием и размещением в окрашивающем растворе, при этом учет и оценку результатов проводят по наличию двух коричневых пятен на месте нанесения препаратов ЛПС F.tularensis и ЛПС F.novicida, наличие которых свидетельствует об инфекционном процессе у исследуемого больного, а при вакцинальном процессе наблюдают одно пятно на месте нанесения только ЛПС F.tularensis.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2008118075/15A RU2362170C1 (ru) | 2008-05-06 | 2008-05-06 | Способ дифференциации инфекционного и поствакцинального антительного ответа при туляремии у человека |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2008118075/15A RU2362170C1 (ru) | 2008-05-06 | 2008-05-06 | Способ дифференциации инфекционного и поствакцинального антительного ответа при туляремии у человека |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2362170C1 true RU2362170C1 (ru) | 2009-07-20 |
Family
ID=41047275
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2008118075/15A RU2362170C1 (ru) | 2008-05-06 | 2008-05-06 | Способ дифференциации инфекционного и поствакцинального антительного ответа при туляремии у человека |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2362170C1 (ru) |
-
2008
- 2008-05-06 RU RU2008118075/15A patent/RU2362170C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
PAVLOVICH N.V. et al. Species- and genus-specific antigenic epitopes of Francisella Tularensis Lipopolisaccarides, Mol. Gen. Microbiol. Virusol., 2000, (3), pp.7-12. * |
АРОНОВА Н.В., ПАВЛОВИЧ Н.В. Использование препаратов липополисахарида Francisella Tularensis в точечном твердофазном иммуноферментном анализе, Ж. Микробиол. Эпидемиол. Иммунобиол., 2000. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5187065A (en) | Method and materials for detecting lyme disease | |
US6916626B1 (en) | Detection of Candida | |
JPH03504412A (ja) | カンピロバクター・ピロリの高分子型細胞関連蛋白の調製法とカンピロバクター・ピロリ感染の血清学的検出のための用法 | |
AU2002248996A1 (en) | Detection of candida | |
KR100868560B1 (ko) | 렙토스피라증 진단 키트 | |
US10859575B2 (en) | Mycobacterium tuberculosis specific peptides for detection of infection or immunization in non-human primates | |
WO2000073492A1 (en) | Rapid immunoassay for cariogenic bacteria | |
RU2362170C1 (ru) | Способ дифференциации инфекционного и поствакцинального антительного ответа при туляремии у человека | |
US20150293093A1 (en) | Vitro assays for detecting salmonella enterica serotype typhi | |
CN105388291B (zh) | 一种快速诊断活动性结核病的gamma delta T细胞表面活化分子及试剂盒 | |
KR101894489B1 (ko) | Igm 반정량적 렙토스피라증 진단 키트 | |
NO317151B1 (no) | Pavisning av antistoffproduksjon | |
WO2001081927A1 (fr) | Procede de detection du streptococcus sobrinus et anticorps contre ce dernier | |
US20010026922A1 (en) | Method of diagnosing Crohn's disease | |
JP2021172642A (ja) | SARS−CoV−2由来ヌクレオカプシド断片および該断片を用いて抗SARS−CoV−2抗体を検出する方法およびキット | |
RU2394496C1 (ru) | Способ диагностики сифилиса путем одновременного определения реагиновых и трепонемоспецифических антител к t.pallidum на микроскопных альдегидных слайдах | |
JP4022005B2 (ja) | 簡易抗体検査方法及び検査用キット | |
EP1774336B1 (fr) | Methode de determination du statut vaccinal de personnes | |
KR20200044543A (ko) | 신속 면역크로마토그래피법을 이용한 황색 포도알균 장독소 b 진단·탐지 키트 및 이를 위한 특이항체와 항체생산세포주 | |
RU2800470C1 (ru) | Способ получения моноклонального пероксидазного конъюгата для идентификации типичных и атипичных штаммов Vibrio cholerae O1, включая и R-варианты в дот-ИФА | |
RU2572717C1 (ru) | Способ иммунодиагностики заболеваний, вызванных helicobacter pylori-инфекцией | |
RU2726484C1 (ru) | Способ диагностики риккетсиозов группы клещевой пятнистой лихорадки, иммуноферментная диагностическая тест-система для его осуществления | |
RU2695525C1 (ru) | Способ иммуноферментного выявления возбудителя псевдотуберкулеза 1 серотипа на основе моноклональных антител к о-боковым цепям липополисахарида | |
KR100254414B1 (ko) | 항-결핵균 항체 및 나균 항원에 대한 항혈청을 포함하는 결핵균 항원 검출용 진단키트 | |
RU2133965C1 (ru) | Способ серологической диагностики туберкулеза у больных с иммунодефицитом |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20120507 |