NO317151B1 - Pavisning av antistoffproduksjon - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåte for å detektere aktiv antistoffproduksjon og ikke-spesifikke infeksjonsindikatorer, og spesielt deteksjon av aktiv antistoffsyntese i blodprøver som respons på infeksjon eller vaksinasjon etc, ved hjelp av en modifisert enzymbundet immunosorbent analyse (ELISA).

ELISA har lenge blitt anvendt for å detektere og måle antistoff (eller antigen). Vanligvis benyttes ELISA som en serologisk analyse, men den benyttes også i studier av immunokjemiske egenskaper til antistoffer og antigener, og har ofte funnet anvendelse i for eksempel evaluering og karakterisering av immunresponser, i undersøkelse av antistoffproduksjon i cellekulturer, i hybridomteknologi etc.

På grunn av sin sensitivitet, enkelhet og lette utførelse og hastigheten på operasjonen, har denne teknikken blitt benyttet i stort omfang som et diagnostisk verktøy og blir nå rutinemessig benyttet i kliniske laboratorier for å detektere antistoffer mot infektiøse agenser som følger infeksjon eller vaksinasjon, i serum eller plasma. Mange tester for HIV infeksjon som er avhengig av å detektere antistoffer mot viruset i serum eller plasma fra pasienter, benytter derfor konvensjonell ELISA-analyse.

EP 0 526 952 beskriver en sandwich-metode og et sett for testing av IL-2-reseptoren i en prøve ved å bestemme reaktiviteten av denne reseptoren med en pluralitet av ligander, hver ligand har bindingsaffinitet for et spesifikt sete av reseptoren. Oppfinnelsen kan benyttes til å påvise tilstander i hvilke løselig IL-2R er frigjort inn i kroppsvæsken. Fremgangsmåten er en enkel ELISA-metode som ikke vil være egnet til å påvise aktiv antistoffproduksjon.

Atkinson et al., Journal of Immunological Methods, 1985, vol.76, s.365-373 beskriver et ELISA for å måle antistoffsekresjon i miltcellesuspensjoner. Påvisning utføres ved benyttelse av avidin-biotinylerte peroksidasereagenser. In vivo antistoffproduksjon måles ved bruk av ELISA-teknikk. Antistoffproduksjon kan derfor sammenlignes i ulike cellepopulasjoner.

US 5 188 942 beskriver en kompetitiv ELISA-metode. I denne fremgangsmåten bestemmes virale antistoffer ved bruk av et biotinylert monoklonalt antistoff for viruset og streptavidin konjugert med den syntetiske forbindelsen eller med et enzymkonjugert monoklonalt antistoff for deteksjon av antistoffene spesifikke for viruset.

Ingen av de ovennevnte referanser beskriver imidlertid påvisning av antistoffer sekretert fra lymfocytter ved bruk av proteinsynteseinhibitorer for å påvise aktiv antistoffproduksjon.

Siden en slik enkel serologisk ELISA-test bare måler til stedeværelsen av mål-antistoffet i en prøve, så kan den ikke skille mellom pågående antistoffsyntese som reaksjon på antigenet, og allerede eksisterende antistoffer fra tidligere infeksjoner eller fra passiv overføring etc. Mens det i noen tilfeller vil være tilstrekkelig å oppnå informasjon angående tilstedeværelsen av antistoffet, vil det i andre tilfeller være ønskelig å kunne bestemme om det detekterte mål-antistoffet virkelig er blitt syntetisert av lymfocytter på tidspunktet for testing, for eksempel under et vaksinasjonsprogram, eller ved diagnose av infeksjoner i spedbarn, for å kunne skille de fra passivt overførte antistoffer fra mor. Dette kan ikke oppnås med en klassisk ELISA-metode.

Andre metoder som muliggjør deteksjon av pågående antistoffsyntese har derfor blitt utviklet. Spesielt skal det i denne sammenheng nevnes enzymbundet immunospot (ELISPOT) analyse (også kjent som spot ELISA eller ELISA-plakk-analyse) som beskrevet av for eksempel Czerkinsky et al, i «ELISA and other Solid Phase Immunoassays», Ed D. M. Kenneny og S. J. Challacombe, 1988, kapittel 10, 217-139. Denne teknikken, basert på ELISA-metoden, muliggjør en bestemmelse av lymfocytter som utskiller antistoffer rettet mot ett eller flere mål antigener. Forenklet sette er ELISPOT en variant av ELISA-métoden, hvor antistoff utskillende celler (ASC) kan bli funnet ved å dyrke lymfocytter i spesielle modifiserte ELISA-brønner dekket med mål antigenet, og ved å erstatte standard ELISA-reagenser med enzymsubstrat komplekser som gir fargede presipitater (flekker), nært opp til de utskillende cellene. Flekkene kan så telles for å gi et mål for antallet av antistoffproduserende celler. Proteinsyntese inhibitorer kan bli inkludert i dyrkningsmediet under in wfro-inkuberingsperioden for å bekrefte at de detekterte flekkene skyldes de /røvo-antistoffsyntese.

Mens ELISPOT-teknikken har vist seg godt egnet ved studering av dynamikken i humorale immunresponser og har blitt benyttet for deteksjon av spontane ASC som opptrer forbigående i den perifere sirkulasjonen hos immuniserte personer, er det momenter som betviler dens anvendelse innen klinisk diagnostikk. For det første, siden hver enkelt flekk må telles i hver prøve, noe som er tidkrevende og slitsomt, er ikke metoden spesielt godt egnet for analyse av et stort antall prøver slik det forekommer i et klinisk diagnostisk laboratorie. For det andre, bare antallet celler som utskiller antistoff i hver prøve blir medregnet og generelt sett vil dette medføre rimelig store prøvevolumer, for eksempel flere ml. ELISPOT-platene er også kostbare og metoden er ikke lett å automatisere.

Det viser seg derfor, til tross for fremskrittene innen antistoff deteksjons-teknikker, at det fortsatt er et behov for en metode som er enkel, hurtig og kostnadseffektiv å utføre, som lett muliggjør nøyaktig kvantifisering av spontant utskilte antistoffer, som kan skille ut de novo-antistoffsyntese og som spesielt kan utføres på blodprøver i diagnostisk henseende. Den foreliggende oppfinnelsen henvender seg tii disse behovene.

Et aspekt ved foreliggende oppfinnelse tilveiebringer derfor en fremgangsmåte for å detektere aktiv antistoffproduksjon som respons på mål-antigen i en blodprøve, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter: bringe i kontakt, i nærvær eller fravær av proteinsynteseinhibitor, alikvoter av nevnte prøve eller eventuelt av lymfocytter direkte isolert fra nevnte prøve, med en fast fase under betingelser som tillater lymfocyttene å produsere og utskille antistoffer;

detektere i løsning, binding av antistoff til nevnte antigen(er) på den faste fasen; og

sammenligne nevnte antistoffbinding i nærvær og fravær av proteinsynteseinhibitor, for derved å oppnå bestemmelse av mengden av aktiv antistoff utskillelse som respons på nevnte antigen(er).

I dette dokumentet refererer «aktiv antistoffproduksjon» til spontant utskilte antistoffer produsert av lymfocytter i prøve, hvor lymfocyttene aktivt produserer antistoffer mens analysen pågår som en konsekvens av en aktiv pågående immunrespons. I alle tilfeller så er antistoffene rettet mot antigener som er presentert in vivo og ikke in vitro enten før eller under analysemetoden ifølge foreliggende oppfinnelse.

I dette dokumentet benyttes uttrykket« aktiv antistoffutskillelse som respons på nevnte antigen» i den betydning at de aktivt utskilte antistoffene binder til antigenet benyttet i analysen, skjønt antigenet som anvendes ikke nødvendigvis må være det immunogenet som stimulerte immunresponsen i første omgang. Derfor har man at mens både antigenet som anvendes i analysen og immunogenet som har stimulert eller stimulerer produksjonen av antistoffer in vivo binder til antistoffene som skal detekteres med tilnærmet identiske eller meget like epitoper, så kan også antigenet og immunogenet være forskjellige. Derfor, mens antigenet som anvendes i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte hele eller deler av det relevante immunogen, for eksempel kan det stamme fra smittede individer eller rensede deler fra samme eller lignende materiale, kan antigenet på tilsvarende måte bli laget syntetisk for eksempel ved . kjemisk syntese eller rekombinant ekspresjon hvor det er lagt til eller fjernet deler av det native antigenet. Fusjonsproteiner eller molekyler som bare uttrykker den aktuelle epitopen(e) kan også benyttes.

Generelt sett så omfatter fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse at lymfocytter fra blodprøven inkuberes i kontakt med en egnet fast fase for å immobilisere antistoffene som skal detekteres under betingelser som tillater antistoffproduksjon og utskillelse fra lymfocyttene, og deretter fjerne cellene og detektere binding mellom antistoff og antigen på den faste fasen. Ved å sammenligne detektert nivå av antistoff binding ved tilstedeværelse og fravær av proteinsyntese inhibitor så kan de novo-antistoffsyntese bli detektert og kvantifisert.

Overraskende så tillater fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen at det benyttes små blodprøve volumer (f. eks. \ i\ volumer, mindre enn 1 ml) direkte for å detektere spontan antistoffproduksjon av ikke stimulerte lymfocytter uten et første trinn med fordyrking av lymfocyttene før inkuberingen med den faste fasen. Med andre ord så anvendes lymfocyttene fra prøven direkte i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen uten noen form for forbehandling eller stimulering som for eksempel in vtfro-stimulering med antigen. Antistoffene som utskilles av lymfocyttene på tidspunktet for prøvetaking vil derfor bli detektert. På denne måten, selv ved bruk av så små prøvevolumer, vil man på en fordelaktig måte kunne skille spontant pågående antistoffsyntese som respons på test antigenet fra allerede til stede-værende aktivering av lymfocyttene. I tillegg så blir lymfocyttene analysert i en situasjon hvor de spontant utskiller antistoffer uten å stimulere cellene til å benytte noe av hukommelsen. Dette er i kontrast til andre publiserte metoder som drar fordel av in wfrø-stimulering med antigener for å øke sensitiviteten til testen. Foreliggende oppfinnelse tar derimot fordel av spontan antistoffproduksjon for å tillate deteksjon av antistoffer i blod som indikerer en pågående infeksjon med test antigenet; plasma lymfocytter vil utskille antistoffer rettet mot test antigenet i de første par ukene etter infeksjon eller vaksinasjon etc. Deteksjon av slike antistoffer ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen muliggjør at infeksjonen diagnostiseres eller bestemmes eller overvåkning av antistoffer som respons på vaksinering etc. Dette er spesielt nyttig i spedbarn og nyfødte barn hvor det er viktig å skille nylig syntetisert antistoff fra antistoffer som passivt er overført fra mor. Den samme blodprøven kan bli analysert for antistoffer rettet mot flere ulike infeksiøse agens enten i separate analyser eller i samme analyse ved bruk av flere relevante antigener. På denne måten tillates anvendelse av relevante antigener som svarer til det kliniske syndrom som pasienten presenterer. Ved diagnose av infeksjoner er det også viktig å kunne skille mellom pågående antistoffproduksjon og allerede eksisterende antistoffer fra tidligere infeksjoner. Gjenkalle immunologisk hukommelse ved antigenstimulering in vitro er ikke i overensstemmelse med en metode som har til hensikt å identifisere en pågående akutt infeksjon og av dette følger at tidligere metoder som baseres på antigenstimulering ikke har disse fordelene. I tillegg så vil det å inkludere et trinn med antigenstimulering ikke være i overensstemmelse med den fordelaktige tidsfaktoren man har i metoden ifølge oppfinnelsen som er veldig rask å utføre sammenlignet med tidligere kjente metoder.

Antigenene som antistoffene man skal detektere ifølge fremgangsmåten i foreliggende oppfinnelse, er rettet mot kan være både bakterie og virus-antigener. Klinisk viktige antigener omfatter, men er ikke begrenset til antigener fra for eksempel Herpes Simplex virus, Cytomegalovirus, menneskelig immunsvikt virus (HIV) og enhver type Hepatitt virus. Deteksjon av slike antigener kan bli benyttet for raskt å stadfeste om en pasient er smittet for eksempel med hensikt å under-søke blod eller for stadfestelse av infeksjon og/eller overvåking av en infeksjon. Denne metoden er spesielt anvendbar på grunn av sin enkelhet og kan anvendes når avansert utstyr ikke er tilgjengelig for eksempel i feltsituasjoner.

I dette dokumentet omfatter uttrykkene «detektere» og «bestemme mengden av» både kvantitativ og kvalitativ vurdering av nivået av antistoffproduksjon i betydning av å oppnå en absolutt verdi for mengden av antistoff produsert i prøven, også en indeks, et forhold, prosentvis eller lignende indikasjoner for nivået av antistoffproduksjon så vel som semi-kvantitative og kvalitative vurderinger.

En stor fordel med foreliggende oppfinnelse er at bare små prøvevolumer er nødvendige, for eksempel 50-500 fil, foretrukket 100-300 ul og mest foretrukket 100-200 ul, av blod eller blodprodukter som i volum kan sammenlignes med hele blodkilden, i kontrast til klassiske diagnostiske tester som vanligvis er avhengig av volumer på flere ml av serum. Dette er spesielt nyttig i de tilfeller man skal ta blodprøver fra nyfødte barn da metoden ifølge foreliggende oppfinnelse bare har behov for (il volumer.

Blodprøven, som vanligvis er en perifer blodprøve, kan bli benyttet direkte selv om det kan være fordelaktig å isolere lymfocyttene fra prøven først. Dette kan bli utført ved standard teknikker vel kjent innenfor fagområdet. Derfor kan ulike typer preparater av helblod med fordel benyttes for eksempel heparinisert blod, EDTA-blod osv., slike som rutinemessig tilberedes i kliniske laboratorier. Selv om, man ikke avgjørende, erytrocytter som er tilstede i prøven kan lyseres for eksempel ved å benytte vanlige metoder med kortvarig eksponering til destillert vann eller ammoniumklorid eller ved å benytte vel kjente haemolyse teknikker. Det skal understrekes at alle bearbeidede eller rensede preparater må inneholde lymfocyttene som er i helblodet som preparatene stammer fra for å muliggjøre deteksjon av spontan antistoffproduksjon. Dersom det er nødvendig så kan lymfocyttene separeres, for eksempel ved å benytte standard lymfocytt separerings løsninger som Lymphprep (Nyegaard Co. Oslo, Norge) eller ved å benytte immunomagnetisk separasjon (IMS) eller et tilsvarende fast fase basert separerings system eller andre vanlige teknikker. I tilfelle bruk av IMS eller lignende separeringsteknikker kan det anvendes en fast fase for eksempel magnetiske partikler dekket med antistoffer spesifikke for et spesielt sett av leukocytter for å selektivt separere de anvendbare lymfocyttene. Dersom separerte lymfocytter anvendes kan cellene vaskes før bruk ved anvendelse av gjeldende vaskemetoder. Det har imidlertid blitt observert at overdreven vasking av cellene ikke er å anbefale. Riktignok ved ikke å vaske overdrevent, vil cellenes levedyktighet forbedres og metoden vil kunne utføres hurtigere.

Blodprøven, behandlet som over dersom det er nødvendig, eller de separerte lymfocyttene blir så fordelaktig satt i kontakt med en fast fase som bærer en egnet bindingspartner for å immobilisere antistoffet eller antistoffene som skal detekteres. Fordelaktig så er bindingspartneren målantigenet eller antigener som gjenkjennes av antistoffet eller antistoffene som skal detekteres. I en utførelsesform, tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen en fremgangsmåte for deteksjon av aktiv antistoffproduksjon i en blodprøve, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter: bringe i kontakt, i nærvær eller fravær av proteinsynteseinhibitor, alikvoter av nevnte prøve eller mer fordelaktig av lymfocytter direkte isolert fra nevnte prøve, med en fast fase som bærer en eller flere antigener som gjenkjennes av antistoffet eller antistoffene som skal detekteres;

detektere i løsning binding av antistoff til nevnte antigen(er) på den faste fasen; og

sammenligne binding av antistoff i nærvær eller fravær av proteinsynteseinhibitor, for på den måten å oppnå en bestemmelse av mengden av aktiv antistoff utskillelse som reaksjon på nevnte antigen (er).

Alternative bindingspartnere kan også anvendes som for eksempel protein A, protein G eller antistoffer som gjenkjenner og binder til antistoffet som skai detekteres. I det siste tilfellet er det ikke nødvendig med meget spesifikk binding da spesifisiteten til metoden introduseres i metoden som følge av binding av antigener som binder spesifikt til antistoffene som skal detekteres. Derfor vil det i alle utførelsesformene dannes et spesifikt antigen-antistoffkompleks. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen sikrer derfor at det i deteksjonstrinnet forefinnes slike komplekser immobilisert på den faste fasen. Den faste fasen kan være hvilken som helst av de vel kjente bærere og matrikser som i dag blir benyttet i stor grad eller som blir foreslått for immobilisering, separering osv. Disse kan være utformet som partikler, ark, geler, filtre, membraner eller mikrotiter strips, rør eller plater o.s.v og med fordel være laget av et polymert materiale. For enkelhetens skyld anvendes det imidlertid med fordel standard mikrotiterplater og brønner, foretrukket vanlige ELISA-plater.

Den faste fasen kan også modifiseres for å tillate deteksjon av antistoffer spesifikke for en rekke ulike antigener. På den måten kan plater eller strips o.s.v av et egnet fast fasemateriale som for eksempel nitrocellulose eller tilsvarende, dekkes med ulike antigener og tilsettes samtidig til en mikrotiterbrønn eller en annen egnet beholder som ikke inneholder noe bundet antigen. Antistoffbindings-metoder kan så benyttes for å skille mellom de ulike antigenene. Sett av plater dekket med relevante antigener som stemmer overens med en spesiell klinisk tilstand eller syndrom kan anvendes for å identifisere hvilke av de mistenkte antigenene som forårsaker sykdommen. Platene vil så bli individuelt undersøkt i separate brønner. Dette er i særdeleshet en materialbesparende prosedyre da man kan utføre tester for mange ulike antigener samtidig (enten fra det samme infeksiøse agens eller fra ulike agens som er relevante for det kliniske syndrom eller tilstand i hvert tilfelle) ved anvendelse av det samme lille blodvolumet. En alternativ metode er å benytte mange blodprøver i adskilte brønner, hvor alle brønnene er dekket med ulike bindingspartnere som for eksempel antigener eller antistoffer, og deretter utføre testen.

Teknikker for binding av bindingspartnere som for eksempel antigen til en fast fase, er også vel kjent og omfattende beskrevet i litteraturen. Mange standard antigenbindingsprosedyrer er beskrevet for eksempel i «ELISA and other solid phase Immunoassays, Theoretical and Practical Aspects; 1988, ed D. M. Kemeny & S. J. Challacombe, John Wiley & Sons. Hvis ønskelig så kan platene vaskes og blokkeres ved bruk av standardteknikker. Således kan derfor standard mikrotiterplater for eksempel ELISA-plater, enkelt bli dekket med bindingspartner ved å inkubere platene over natten ved 4°C i en egnet buffer som for eksempel fosfat-bufret saltvann (PBS), som inneholder bindirvgspartneren i en konsentrasjon på 0,01 til 150 ug/ml, etterfulgt av blokkering ved anvendelse av et egnet blokkerings-medium (vanligvis et celledyrkingsmedium) og inkubere ved for eksempel 37°C i 1 til 5 timer. Etter å ha fjernet blokkeringsløsningen er platene klare for bruk.

Imidlertid kan man med fordel tilby materialet som er nødvendig for å utføre metoden ifølge oppfinnelsen som et kitt hvor den faste fasen leveres ferdig med bindingspartneren bundet på og tilstrekkelig blokkert.

Som nevnt over så vil vanligvis kontakttrinnet involvere inkubasjon av prøven eller separerte lymfocytter i nærvær av den faste fasen under betingelser som tillater antistoffsyntese og utskillelse. Det kan med fordel benyttes standard ELISPOT-inkuberingsbetingelser, som beskrevet av for eksempel Czerkinsky et al., 1988 ( supra). Vanligvis inkuberes prøven eller cellene ved 37°C i luft med 5% CO2 når mediet som cellene inkuberes i benytter CO2 som én del av sitt buffersystem. Det kan også anvendes C02-uavhengige medier hvor alternative buffer-systemer virker, slik som medier som benytter den vel kjente HEPES-bestand-delen. I disse tilfellene kan cellene simpelthen inkuberes ved 37 °C og således ytterligere forenkle metoden og dens behov for avansert utstyr. Inkuberingstiden kan variere, men vanligvis så er minst 1-2 timer nødvendig. Inkuberingstider på 2 til 6 timer, for eksempel 2 til 4 timer har vist seg å gi gode resultater, selv om det i noen situasjoner kan være ønskelig med lange inkuberingsperioder, for eksempel opp til 12 til 24 timer eller over natten. Egnede medier for inkubasjon er vel kjent innenfor teknikken og omfatter alle standard celledyrkings medier, for eksempel Dulbecco's modifiserte Eagle's medium (DMEM) eller RPMI eller andre vel kjente celledyrkingsmedier som benytter HEPES som et CCvuavhengig buffersystem, inneholdende egnet sera som for eksempel føtalt kalveserum (FCS) eller andre nødvendige komponenter som for eksempel glutamin. Optimaliserende komponenter tilsatt i mediet kan innbefatte antibiotika som for eksempel gentamycin, penicillin, streptamycin osv., andre aminosyrer, vekstfaktorer osv.

Det kan være ønskelig å fortynne prøven/cellesuspensjonen i forkant av kontakttrinnet og det kan med fordel anvendes en serie av celle/prøvefortynninger. Fortynning vil vanligvis bli utført ved anvendelse av kulturdyrkningsmediet som fortynningsløsning.

For å kunne skille ut pågående antistoffsyntese utføres inkuberingen i nærvær og fravær av proteinsynteseinhibitor. Derfor vil man før inkuberingen tilsette inhibitor til en del av prøve/cellealikvotene for å blokkere protein, og derfor antistoff, syntese og deler av prøven inkuberes uten inhibitor. Enhver av de vanlig kjente proteinsynteseinhibitorene kan anvendes som for eksempel cycloheximid. Konsentrasjoner på 10-5000 ug/ml for eksempel 50-500 rø/ml cycloheximid kan anvendes.

Det er anbefalt også å inkludere en ATPase-inhibitor slik som natriumazid eller andre lignende inhibitorer sammen med proteinsynteseinhibitoren for dermed hurtig og fullstendig stanse cellens metabolisme.

Etter inkubasjonen fjernes prøven/cellene fra den faste fasen. Dette etterfølges vanligvis av vasking hvor det anvendes et egnet medium som for eksempel en buffer som PBS. Det har imidlertid blitt oppdaget at overdreven vasking ikke er tilrådelig.

Den faste fasen er så gjenstand for trinnet hvor man detekterer bundet antistoff. Deteksjonstrinnet, med andre ord avlesning av signalet, finner sted i løsning. Enhver kjent måte å detektere antistoffbinding på kan anvendes så lenge det dannes et lesbart signal i løsningen; for eksempel beroende på fluorescens, kjemiluminescens, "kolorimetri" eller en enzymreaksjon som produserer et detekterbart signal. Det kan imidlertid med fordel anvendes en immunoanalyse hva angår deteksjon og mest fordelaktig en enzymbundet immunosorbent analyse

(ELISA).

Immunoanalyser, og spesielt ELISA-teknikker er vel kjent innenfor fagområdet og er beskrevet i litteraturen (se for eksempel «ELISA and other solid phase Immunoassays, Theoretical and Practical Aspects; 1988, ed. D. M. Kemeny & S. J. Challacombe, John Wiley & Sons).

Etter fjerning av prøven/cellene, kan det tilsettes et enzym-antistoffkonjugat, for eksempel i ELISA-detekteringsmetoden, som binder til antistoffet som er bundet til antigenet på den faste fasen. Dersom antistoffet som skal detekteres er bundet ikke-spesifikt til den faste fasen via en bindingspartner, for eksempel ved anvendelsen av et antistoff rettet mot antistoffer fra ulike arter, vil man på tilsvarende måte tilsette et enzym-antigenkonjugat som spesifikt vil binde til det immobiliserte antistoffet som skal detekteres. Deretter tilsettes det et enzymsubstrat for å fremkalle et detekterbart signal. I den foreliggende oppfinnelse anvendes det med fordel et løselig substrat som gir et detekterbart signal i løsning. Dette er fordelaktig da det forenkler og letter håndteringen og behandlingen av et stort antall prøver og tillater beregning av antistoffproduksjon, selv om det som nevnt over ikke er nødvendig med en absolutt kvantifisering og man kan om ønskelig oppnå et kvalitativt eller semi-kvantitativt resultat. For enkelhetens skyld så kan man velge et substrat som gir et spektrofotometrisk detekterbart signal, som enkelt kan leses ved å avlese absorbans for eksempel ved å anvende en standard ELISA-plate-avleser. Standard ELISA-reagenser kan så menn anvendes og det har den fordel at fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blir kompatibel med eksisterende metoder og teknikker som rutinemessig benyttes i kliniske laboratorier. Det kan imidlertid også benyttes andre deteksjons-/signal<-genererende systemer som gir signaler som kan detekteres ved hjelp av fluorescens, kjemiluminescens osv.

Immunenzymatiske amplifiseringsmetoder kan også benyttes for å forbedre signalet og øke sensitiviteten, som for eksempel avidin-biotinmetoder slik som Extravidin-systemet som er tilgjengelig fra Sigma. Det anvendes da biotinylerte sekundære antistoffer som ELISA-reagenser i kombinasjon med et peroksidase-: avidinkompleks. Siden et molekyl av avidin har muligheten for å binde flere molekyler av biotin, vil anvendelse av avidin-biotin-peroksidasekomplekser øke overflatekonsentrasjonen av peroksidasemolekyler, noe som gir metoden ytterligere øket sensitivitet.

Materialene og midlene som er nødvendige for celleinkuberings- (kontakt) trinnet og trinnet for detektering av antistoffbinding kan også fordelaktig tilbys som et kitt sammen med den bindingspatrner-dekkede faste fasen. Informasjonen som oppnås ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan suppleres ved å anvende andre analysemetoder. Det kan oppnås ytterligere og nyttige data angående pre-eksisterende serum/plasma-antistoffer i en klassisk ELISA-test. I tillegg kan man, etter separasjon av lymfocytter fra blodprøven dersom dette utføres, anvende den resterende plasmavæsken for deteksjon av pre-eksisterende antistoffer ved å benytte den samme bindingspartner-dekkede faste fasen som i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

For å sikre at analysefremgangsmtåen ifølge oppfinnelsen fungerer tilfredsstillende, må det inkluderes passende kontroller. For det første sikrer man at oppfinnelsen fastslår en akutt antistoffproduksjon av testcellene og ikke bare fastslår pre-eksisterende antistoffer fra perifert blod ved å sammenligne protein-synteseblokkerte brønner med brønner som ikke er blokkert. I de tilfeller hvor man benytter rensede lymfocyttpreparater som prøve, vil man sikre at spor mengder av antistoffer fra perifert blod i lymfocyttprøven ikke påvirker analysen. For det andre benyttes det et negativt antigen som kontroll for å forsikre seg om at den fastslåtte forskjellen mellom signaler fra blokkerte og ikke blokkerte brønner ikke skyldes sporadiske eller ikke-spesifikke (tilstedeværende) aktiverte lymfocytter. Dette antigenet vil stamme fra et infeksiøst agens som mest sannsynlig er årsaken til den akutte sykdommen til pasienten, for eksempel tetanus toksoid. Antallet av slike tilstedeværende lymfocytter vil under alle omstendigheter være mye lavere enn det som kreves for å få et positivt testresultat ved bruk av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Utformingen av oppfinnelsen tar hensyn til dette punktet.

Som nevnt over, på grunn av sin enkle og hurtige gjennomføring og enkelhet så egner analysen ifølge oppfinnelsen seg for bruk innen for diagnostikk eller andre kliniske og vetrinærmessige anvendelser som for eksempel fiskeoppdrett. I tillegg til små prøvevolumer, har man ytterligere en fordel ved at man bare trenger en prøve og ikke par av serum som er tatt med 2 til 3 ukers mellomrom slik det er behov for i de fleste konvensjonelle serologiske tester. Avansert utstyr er ikke nødvendig og analysen lar seg lett automatisere. I tillegg er det enkelt å muliggjøre testing av ulike immunoglobulin-isotyper dersom det er behov for det.

Den før nevnte analysemetoden ifølge oppfinnelsen skaffer til veie en fremgangsmåte for å avgjøre om en pågående infeksjon er til stede eller er fraværende ved å analysere for spontan ekspresjon av spesifikke antistoffer rettet mot et definert antigen. En slik metode er klart anvendbar for å avgjøre en sykdomstilstand som er kjent og hvor antigenet som relateres til det relevante immunogen er tilgjengelig og således utgjør en spesifikk markør for infeksjonen. I noen kliniske situasjoner er imidlertid den spesifikke sykdommen eller infeksjonen ikke identifisert og/eller det egnede antigenet er ikke tilgjengelig for anvendelse i analysen. I slike tilfeller kan analysen modifiseres slik at den bestemmer til stedeværelsen eller fraværet av ikke-spesifikke indikatorer for infeksjoner. Derfor kan for eksempel lymfocyttinneholdende prøver som helblod eller derfra opparbeidede lymfocyttpreparater, bli undersøkt med hensyn på deres produksjon av infeksjons-markører som cytokiner og interferoner som for eksempel interferon-y.

Ser man således på et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen så tilveiebringer den en fremgangsmåte for detektering av tilstedeværelse av ikke-spesifikke infeksjonsindikatorer i en blodprøve, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter: bringe i kontakt, i nærvær eller fravær av proteinsynteseinhibitor, alikvoter av nevnte prøve eller eventuelt av lymfocytter direkte isolert fra nevnte prøve, med en fast fase under betingelser som tillater lymfocyttene å produsere og utskille - infeksjonsindikatorer;

detektere i løsning, binding av infeksjonsindikatorer til en bindingspartner på den faste fasen; og

sammenligne binding av infeksjonsindikator ved nærvær eller fravær av proteinsynteseinhibitor, for så å oppnå en bestemmelse av mengden av infeksjonsindikatorer i prøven.

For å utføre denne fremgangsmåten, må den faste fasen skaffes tilveie med egnede innfangelsesmolekyler for eksempel antistoffer rettet mot infeksjons-indikatorene som skal detekteres. For deteksjon av tilstedeværelsen av nevnte infeksjonsindikatorer immobilisert på den faste fasen, kan det anvendes metoder som allerede er beskrevet i foreliggende beskrivelse for eksempel ved bruk av merkede antistoffer eller ligander. Spesifikke markører kan bli identifisert ved denne metoden hvis de rette valg av immobiliseringsdel eller deteksjonsmolekyl gjøres. Således kan for eksempel alle proteinene i prøven immobiliseres på den faste fasen og deteksjonen kan utføres ved bruk av merkede spesifikke antistoffer eller ligander. Alternativt kan en spesifikk bindingspartner anvendes for immobilisering av relevante infeksjonsindikatorer som deretter kan merkes hensiktsmessig, enten positivt eller negativt, for eksempel som i det tidligere tilfellet ved binding til et domene som er tilstede på infeksjons indikatoren, men ikke eksklusivt til dette molekylet, eller i et andre tilfelle ved å merke ubundne bindingspartnere på den faste fasen.

Oppfinnelsen vil nå bli beskrevet i mer detalj i de påfølgende eksemplene, hvori analysemetoden ifølge oppfinnelsen vil omtales som Plasmacute-analysen.

Eksempel 1

Generell prosedyre

Celler: Heparinisert blod tappet fra frivillige ved ulike tider etter vaksinering med inaktivert influensavaksine. Blodet ble blandet med like deler PBS. Lymfocyttene ble separert med Lymphoprep (Nyegaard & Co, Oslo). Cellene ble vasket to ganger med PBS og resuspendert (fortynninger) i Dulbecco's modifiserte Eag1e's medium tilsatt 20 % FCS, 2 mM L-glutamin, 100 IU/ml penicillin og 100 ug/ml streptomycin (Pen + Strep) = MEDIUM.

STOPP- løsninq: 1 mg/mt cykloheximid laget i PBS inneholdende 10 % natriumazid.

ELISA og influensa- antigener: Rensede overflateantigener fra de tre stammene som anvendes i influensavaksinene som benyttes klinisk, betegnes her forkortet somH3N2, H1N1 og B.

ELISA- plater: Greiner EIA-plater 655001 F-form eller Costar EIA-plater 3590. Dekket med 100 ul/brønn med en løsning av 10 ug/ml protein i PBS over natten ved 4°C. Blokkering med MEDIUM i 1 time ved romtemperatur. Vaskes en gang med PBS.

Test: 100 \ x\ fortynninger av cellesuspensjonene i MEDIUM ble tilsatt til tripletter av like brønner i to parallelle sett for hver av de tre influensa-antigenene. Et sett av triplettbrønner ble blokkert ved det innledende trinnet ved tilsats av 50 ul av STOPP-løsningen. Det ble inkubert ved ulike tider ved 37°C i en inkubator med 5% CO2 i luft. ELISA-platene ble vasket en gang med PBS og deretter to ganger med PBS med 0,05% Tween 20. Det ble tilsatt 50 ul/brønn av et hensiktsmessig fortynnet kanin anti-human Ig-peroksidasekonjugat (Sigma) og satt ved romtemperatur i 1 time. Platene ble deretter fremkalt ved bruk av o-fenylendiamin-(OPD) substrat og absorbans avleses ved 492 nm.

Blod tappet 11 dager etter vaksinasjon

Celleinkubasjonstider: 4 timer, 0 timer = blokkerte brønner

Alle verdier er gjennomsnitt av brønntriplettene angitt som absorbans x 1000.

avvik+ 10%.

Konklusjon: 6,6 x 10<4> = 66 000 celler gir en signifikant økning i signalet ved en 4 timers inkubasjon. H3N2 absorbansen øker med 98 %, H1N1 med 153 % og B med 50 %.

Dette er et representativt eksperiment. Ytterligere tester viste at ved å inkubere cellene over natten så oppnås det enda større forskjell mellom blokkerte og ikke-blokkerte brønner ved absorbans over 1000. Systemet virker også med kortere inkuberingstider som for eksempel 2-3 timer. Ti ganger flere celler, for eksempel 6,6 x 10<5>celler/brønn kan også, men ikke alltid, gi en klarere forskjell.

Eksempel 2 Generell prosedyre

Celler: Heparinisert blod ble tappet av frivillige 7 dager etter vaksinering med inaktivert influensavaksine. Blodet ble blandet med likt volum av PBS. Lymfocyttene ble separert med Lymphoprep (Nyegaard & Co, Oslo). Cellene ble vasket to ganger i PBS og resuspendert i Dulbecco's modifiserte Eagle's medium tilsatt 20 % FCS, 2 mM L-glutamin, Pen + Strep (som tidligere) = MEDIUM.

STOPP- løsnina: 1 mg/ml cykloheximid laget i PBS inneholdende 10 % natriumazid.

Testantiaen: Rensede overflateantigener fra de tre virus stammene som anvendes i influensavaksinene som benyttes klinisk, betegnes her forkortet som H3N2, H1N1 og B.

Kont roi I antigen: Tetanus-toksoid (ikke aluminium adsorbert; Ledede).

ELISA- Dlater: Greiner EIA-plater 655001 F-form eller Costar EIA-plater 3590. Dekket med 100ul/brønn med en løsning av 10 ug/ml protein i PBS over natten ved 4°C, tetanus: 10 Lf/ml. Det blokkeres med MEDIUM i 1 time ved romtemperatur. Vask en gang med PBS.

TEST: 100 ul fortynninger av cellesuspensjonen i MEDIUM ble tilsatt til tripletter av brønner i to parallelle serier for hvert av de tre influensa-antigenene og tetanus-kontrollantigenet. Et sett av brønner ble blokkert ved det innledende trinnet ved tilsats av 50 ul av STOPP-løsningen. Det ble inkubert ved 37°C i en inkubator med 5 % C02 i luft i 3 timer. Etter inkubering ble ELISA-platene vasket en gang med PBS og så to ganger med PBS med 0,05 % Tween 20. Det ble tilsatt 50 ul/brønn av passende fortynnet kanin anti-human Ig-peroksidasekonjugat (Sigma) og inkubert ved romtemperatur i 1 time. Platene ble deretter fremkalt ved bruk av o-fenylendiamin- (OPD; Sigma) substrat og absorbans ble avlest ved 492 nm.

(Testen kan modifiseres for å øke sensitiviteten ved et ytterligere trinn før tilsats av substratet ved å benytte et 1 times Extravidin/peroksidasetrinn (Sigma). Dette er avhengig av biotinylert konjugat i steden for peroksidasekonjugater (Sigma)).

Representative eksperimentelle resultater futen extravidin):

7 dager etter vaksinering (2 personer; # 1 og # 2)

Celleinkubasjonstid: 3 timer, 0 timer = blokkerte brønner

Alle data er gjennomsnitt av brønntriplettene angitt som absorbans x 1000. Avvik + 16%.

Forsøkspersonene er tenåringer (16 år). Det er vel kjent at ungdom reagerer spesielt godt på A / H1N1 influensavaksine. Dette sees tydelig over, begge personene # 1 og # 2 reagerer godt. Ulikheter i økningen i absorbans må forventes da vaksinerte personer vanligvis reagerer forskjellig på ulike vaksine-komponenter. Dette er vist her ved person # 1 som reagerer dårlig på B viruset, men # 2 bare reagerer signifikant til H1N1 viruset. Som ventet så reagerer ingen på tetanustoksoid. Men dersom cellene hadde blitt stimulert in vitro med toksoid i en tidsperiode på flere dager, kunne deres tidligere immunologiske hukommelse (gjennom vaksinering i barndommen) ha resultert i tetanus antistoffproduksjon. I et virkelig infeksjonstilfelle analysert i et diagnostisk laboratorium ved anvendelsen av oppfinnelsen, ville bare et testagens/antigen gitt positivt signal.

Eksempel 3

Generell prosedyre:

Celler: Heparinisert blod tappet av en voksen ( mann på 24 år) og et barn (gutt på 3 år) 6 dager etter vaksinering med inaktiverte underenheter av influensavaksine. Lymfocyttene ble separert som beskrevet under Eksempel 1 og 2. Cellene ble satt i kontakt med en fast fase som bærer antigenene H3N2, H1N1 og B som beskrevet i Eksempel 1 og 2, og inkubert i 3 timer ved 37°C og. testen ble fremkalt som beskrevet (ingen STOPP-løsning eller kontroll antigen ble benyttet i dette eksperimentet).

Tabell 1 viser resultatene fra de to personene hvor avlesningen av hvert antigen er et gjennomsnitt av brønntriplettene angitt som absorbans x 1000.

Resultatene viser at barnet, som bare har hatt en tidligere influensaepisode, en A/H3N2-infeksjon, gav en veldig sterk respons på A/H3N2-komponenten i den

trivalente vaksinen. Som forventet for barnet så var det ingen respons på A/H1N1 og B-komponentene. Slike små barn trenger vanligvis to doser av en vaksine med noen ukers mellomrom for å gi en tilfredsstillende immunrespons. Omkring 70 000 lymfocytter som tilsvarer omkring 70 ul av fullblod, var tilstrekkelig for å gi et tydelig positivt resultat. For den voksne personen som har hatt mange influensa-episoder, var responsen ikke kraftig, men i alle fall signifikant for alle tre komponentene i vaksinen om enn i varierende grad. For B-komponenten er det nødvendig med omtrent 100 000 lymfocytter for å få en positiv respons, mens det for de to A-komponentene var det nødvendig med minimum 100 000 celler, foretrukket 200 000 celler.

Eksperiment 4: Deteksjon av Herpes simplex type 2 ved klassisk og Plasmacute-analysemetoder.

Generelle prosedyre

Vevskulturer og serologiske analyser

Materiale fra kjønnsorganene fra fem personer som har symptomer som tyder på en kjønnsrelatert herpes virusinfeksjon, ble underkastet rutinemessige vevskultur prosedyrer for å forsøke og detektere replikerende virus fra prøvene ( utført ved Viruslaboratoriet, Haukeland Universitetssykehus, Bergen ). Det samme laboratoriet utførte rutinemessig serologiske analyser av serumprøver ved anvendelse av kommersielle ELISA-testsett (Behringer Enzygnost fra Behringer, Tyskland ) inneholdende HSV-antigener for å detektere IgG og IgM.

Separering av lymfocytter

Lymfocytter ble isolert ved anvendelse av lymphoprep (Nycomed) tetthetsgradient-seritrifugering av heparinisert blod som ble tappet samtidig som sykehusprøvene ble tatt fra de fem personer som hadde symptomer som tydet på en kjønnsrelatert herpes virusinfeksjon. Cellene ble vasket tre ganger i PBS og resuspendert i DMEM -dyrkningsmedium inneholdende 20 % FCS, 1 mM L-glutamin, 50 IU/ml penicillin og 50 ug/ml streptomycin ( DMEM /FCS). Levedyktige celler ble telt ved hjelp av trypanblå ekskludering {0,2 %).

Plasmacute- analyse hvor det anvendes Behringer Enzygnost anti- HSV IgM og IgG ELISA- er

Behringer Enzygnost anti-HSV IgM og IgG leveres som strips inneholdende 8 brønner dekket med antigen avledet fra permanente apenyreceller infektert med HSV og 8 brønner dekket med antigen fra ikke-infekterte celler. Stripsene var blokkert med 200 ul/brønn av DMEM/FCS ved 37°C i 5 % C02 i 1 time. Ett hundre ul per brønn av en passende fortynning av lymfocytter ble tilsatt og inkubert i 3

timer ved 37°C i 5 % C02. Resten av prosedyren ble utført nøyaktig etter instruksene fra leverandøren av kittet. Platene ble fremkalt ved bruk av konjugater, reagenser og buffere levert av den samme leverandør. Substratet, tetrametyl-benzidinhydroklorid (TMB), måtte avleses ved OD på 450 nm ved bruk av den tilgjengelige Titertek Multiskan MCC/340 plateavleser {Flow Laboratories).

Plasmacute- analvse ved bruk av Bioelisa HSV- 2 IgG

Bioelisa IgG HSV-2 ELISA (BIOKIT, Spania) blir levert som strips inneholdende 8 brønner som er dekket med inaktivert HSV-2 antigen. Stripsene ble blokkert med 200 ul/brønn av DMEM/FCS ved 37°C i 5 % C02 i 1 time. Ett hundrede ul per brønn av en passende fortynning av lymfocytter ble tilsatt og inkubert i 3 timer ved 37°C i 5 % C02. Resten av prosedyren ble utført nøyaktig etter instruksene fra leverandøren av settet. Platene ble fremkalt ved bruk av konjugater, reagenser og buffere levert av den samme leverandør. Substratet, tetrametylbenzidin-

hydroklorid (TMB), måtte avleses ved OD på 450 nm ved bruk av den tilgjengelige Titertek Multiskan MCC/340 plateavleser (Flow Laboratories).

Plasmacute- analvse ved bruk av Bioelisa HSV IgM flmmunocapture) analyse Bioelisa HSV IgM (Immunocapture) analyse (BIOKIT, Spania) blir levert som strips inneholdende 8 brønner som er dekket med kanin anti-human IgM-antistoffer. Stripsene ble blokkert med 200 ul/brønn av DMEM/FCS ved 37°C i 5 % C02 i 1 time. Ett hundrede ul per brønn av en passende fortynning av lymfocytter ble tilsatt og inkubert i 3 timer ved 37 °C i 5 % C02- Alle prosedyrer ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Spesifikt bundet antistoff ble detektert med 100 ul/brønn av HSV-antigen merket med pepperrotperoksidase (renset og inaktivert HSV som har blitt uttrykt in vitro i humane fibroblaster) og for å minimere ikke-spesifikke reaksjoner umerket kontrollantigen, bestående av ikke-infiserte cellulære komponenter (levert med settet), 10 ul HSV-antigen og 10 ul kontroll antigen per strips. Platene ble avlest i en Titertek Multiskan MCC/340 plateavleser ved 450 nm (Flow Laboratories)

Resultatene av eksperimentene er vist i Tabell 2.

Tabell 2 oppsummerer dataene fra pasient 1-5. Det diagnostiske laboratoriet på Haukeland universitetssykehus forsøkte å isolere viruset fra kliniske prøver og de utførte også rutine ELISA-tester for serum-IgG og IgM ved anvendelse av Behringer Enzygnost ELISA-kitt. Typen virus er bestemt, - ve betyr negativ isolering. Serum ELISA «cut-off»-verdier er definert av produsenten av testsettet; + = OD>0.2, grenseverdi = OD 0,1-0,2, definert som usikre resultater av produsenten av analysen; og - = OD < 0,1.

For Plasmacute-analysen har vi benyttet OD > 0,2 som positive og har stipulert antallet av lymfocytter som er nødvendig for å gi en slik respons.

Bare Bioelisa IgG-testen hevder at den kan identifisere HSV2-antistoffer, mens de andre vil indikere infeksjon med HSV (1 og/eller 2).

Resultater

Pasient 1 hadde kliniske symptomer på en primær HSV-2-infeksjon. Sykehuset mislyktes i å isolere virus fra den kliniske prøven og ikke noe IgM ble funnet ved

standard ELISA-analyser. Det ble funnet grenseverdier av serum IgG-antistoffer ved standard sykehus ELISA-analyser. Som bekreftelse på disse resultatene, ble det ikke funnet noen celler som produserte IgM-antistoffer ved bruk av Plasmacute-analysen. Både Behringer IgG- og Bioelisa IgG-Plasmacute-analysene detekterte celler som produserte IgG-antistoffer mot HSV. 205 000 lymfocytter var nødvendig for å gi en «cut-off»-absorbans ved bruk av Behringer Plasmacute-analysen og ved bruk av Bioelisa-IgG var det nødvendig med 103 000 lymfocytter for å gi «cut-off»-absorbans.

Pasient 2 hadde en primær infeksjon som ble bekreftet ved isolering av HSV type-1. Det ble ikke detektert noe IgM ved sykehus laboratoriet, men IgG-antistoff ble detektert. Ved bruk av Plasmacute-analysen ble det ikke detektert noen celler som produserte IgM, imidlertid detekterte både Behringer og Bioelisa Plasmacute-analysene IgG-produserende celler, respektive 223 000 og 111 000 celler var nødvendig.

Pasient 3 hadde en gjentatt HSV-2-infeksjon som ble bekreftet ved isolering av HSV-2 virus fra kliniske prøver. IgG var tilstede i serum prøver tappet 2 dager etter at de kliniske symptomene startet, derimot ble det ikke detektert noe IgM i serum på dette tidspunktet. I Plasmacute-analysen ble det ikke detektert noe IgM 2 dager etter at de kliniske symptomene startet, imidlertid detekterte både Behringer og Bioelisa Plasmacute-analysene detekterte IgG-produserende celler (48 000 - 96 000 celler var nødvendig). IgM-serumantistoffer ble detektert ved sykehuset i serum prøver tappet 20 dager etter at de kliniske symptomene startet. 182 000 celler var nødvendig for å produsere "cut-off»-absorbans ved Plasmacute Behringer IgM-analysen, imidleretid ble ingen celler detektert ved Bioleisa IgM Plasmacute-analysen.

Pasient 4 hadde en primær infeksjon med HSV. Ingen virus ble detektert i de kliniske prøvene som ble sendt til sykehuslaboratoriet. Grenseverdier av serum IgM-antistoffer ble detektert og positive nivåer av serum IgG-antistoffer ble funnet. Både IgM og IgG-antistoffer ble detektert i Plasmacute-analysen ved anvendelse av både Behringer og Bioelisa-sett, i blodprøver tappet 5 og 19 (ingen Behringer IgM ble detektert) dager etter at de kliniske symptomene startet. I Plasmacute-analysen var det behov for mindre enn 8000 celler for Bioelisa IgM-analyse og 60 500 celler var nødvendig for

Behringer IgM-analyse, begge som da vil trenger mindre enn100 ul heparinisert blod.

Pasient 5 ble mistenkt å ha en primær infeksjon av HSV. Imidlertid ble det ikke isolert noe virus av laboratoriet og det ble ikke detektert noe serumantistoffer. I Plasmacute-analysen ble det ikke detektert noen celler som produserte IgG eller IgM-antistoff mot

HSV.

Diskusjon

Plasmacute-analysen har blitt demonstrert å virker både for primære og gjentatt herpes virusinfeksjoner. I alle tilfeller ble det vist at Plasmacute-analysen virket minst like godt som tradisjonelle ELISA-prosedyrer som er benyttet her. Spesielt for pasient 1, til tross for at det ikke ble isolert noe virus fra den kliniske prøven og det bare ble oppnådd usikre positive verdier (d.v.s. ikke-konkluderende) ved rutineanalysen på sykehuset, viste Plasmacute-analysen (Bioelisa-IgG og Behringer-IgG) at omtrentlig 100 000 celler og 200 000 celler respektivt ga et klart positivt resultat. Det er mulig at denne pasienten hadde en dobbel infeksjon (HSV1 og HSV2) hvor bare HSV1 ble gjenvunnet fra stede ved virusisolering. Det skal derimot ikke utelukkes at det positive HSV2-resultatet (Bioelisa-IgG) skyldes serologiske kryssreaksjoner. For prøvene tatt av pasient 4 ved to ulike tider, hvor det ikke ble isolert noe virus, viste Plasmacute-analysen et skifte av antall herpes spesifikke IgM og IgG-produserende lymfocytter f ra den tidlige fasen til den sene fasen av infeksjonen noe som stemmer overens med vel kjente forløp som følger en primær infeksjon og som klart bekrefter en aktiv immunrespons. Bioelisa IgM Plasmacute-testen var spesielt sensitiv da mindre enn 8000 lymfocytter var nødvendig for å gi et positivt resultat i den første av de to prøvene.

Vi har med dette eksperimentet vist at Plasmacute-metoden virker for kliniske tilfeller av virale infeksjoner i menneske.

Eksperiment 5: Multiple plater - binding av nitrocellulose plater med innfangelsesantistoffer spesifikke mot IgG, IgA og IgM-antistoffer.

Dette eksperimentet ble utført for å fastsette om multiple platesystemer kunne bli benyttet i Plasmacute-analysen for å detektere antistoffer med ulike spesifisiteter.

Generell prosedyre

Prøver av heparinisert fullblod ble tappet fra to friske voksne personer. Siden disse personene ikke var i noen akutt fase av noen infeksjon tok vi sikte på å analysere IgG, IgM og IgA spontanantistoff-utskillelse uavhengig av deres (ukjente) antigen-spesifisitet.

Person 1 ble benyttet for å fastsette om et system ved bruk av plater dekket med 3 ulike antigener kunne anvendes i en enkelt brønn i Plasmacute-analysen . En brønn (No. 1).

Person 2 ble benyttet for å fastsette om der var noen svekkelse av signalet når flere plater dekket med det samme antigenet var tilstede. Tre separate brønner i Plasmacute-analysen (brønn No. 2, 3 og 4).

Separering av lymfoc<y>tter

Lymfocyttene ble isolert ved anvendelse av Lymphoprep (Nycomed) tetthetsgradient-sentrifugering av heparinisert blod. Cellene ble vasket tre ganger med PBS og resuspendert i dyrkningsmedium av DMEM inneholdende 20 % FCS, 1 mM L-glutamin, 50 IU/ml penicillin og 50 ug/ml streptomycin (DMEM/FCS). Synlige celler ble tellet ved trypanblå ekskludering (0,2 %).

Plasmacute- analyse som benytter plater som den faste fasen

Plater bestående av blandede estere av cellulose med 8 uM porestørrelse (Millipore SCWP 013 00) ble dekket med 10 ug/ml geite anti-human klassespesifikke antistoffer (Sigma, anti-IgG I-3382; anti- IgA I-0884; anti-lgM I-0759) fortynnet i PBS azid (0,001 %) ved inkubering over natten ved romtemperatur. Platene ble blokkert med DMEM/FCS ved 37°C i 5 % C02 i 1 time. Lymfocyttene ble tilsatt til en 12 mm klar "transwell" med porestørrelse på 0,4 uM (Costar 3460) og platene ble plassert under og inkubert i 3 timer ved 37°C i 5 % C02. Individuelle plater ble overført til separate brønner på en 24 brønner plate (Costar) og vasket 3 x med PBS og 3 x med PBS Tween (0,05 %). Bundet antistoff ble detektert med 200 ul/brønn av geite anti-humane klassespesifikke peroksidasekonjugerte antistoffer (Sigma IgG A-6029, IgA A-4165, IgM A-4290) fortynnet i DMEM/FCS og inkubert i 2 timer ved romtemperatur. Platene ble vasket for å fjerne ubundet antistoff som beskrevet tidligere og fremkalt ved anvendelse av 200 ul/brønn av o-fenyldiamindihydroklorid (OPD) (Sigma P-7288) i 0,05 M fosfat-citratbuffer (pH 5,0). Tretti minutter etter tilsetting av substratet, ble fremkallingen stoppet ved anvendelse av 100 ul/brønn av 1 M H2S04. Ett hundrede ul per brønn ble overført til en 96 brønner ELISA-plate (Greiner EIA-plater 655001 F-form) og OD-ene ble avlest i en Titertek Multiskan MCC/340-plateavleser (Flow Laboratories) ved 492 nm.

Resultatene fra dette eksperimentet er vist i Tabell 3 hvor avlesningene for hvert bundet antistoff er gjennomsnitt av triplettbrønner angitt som absorbans x 1000. Brønn 1 inneholdt 2 millioner lymfocytter, brønnene 2-4 inneholdt 1 million lymfocytter. «Cellereferansen er for å indikere hvilket platenummer som var lokalisert nærmest cellelaget.

Resultater:

Testen med person 1 viste at til og med 9 plater lett kunne bli benyttet i en brønn inneholdende lymfocyttene. Responsen for de tre IgG-platene, de tre IgA-platene og de tre IgA-platene var i alle praktiske øyemed identiske for hvert sett og således vises det at den egentlige posisjonen av platene relativt til de antistoffutskillende lymfocyttene ikke var kritisk. Testen med lymfocytter fra person 2, viste at minst 8 identisk dekkede brønner kunne bli plassert i en lymfocytt-inneholdende brønn og gi praktisk talt identiske avlesninger. Således tillater foreliggende oppfinnelse multiple analyser for samme lymfocyttpreparat i en brønn.

Claims (19)

1. Fremgangsmåte for å detektere aktiv antistoffproduksjon som respons på mål-antigen i en blodprøve, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter a) bringe i kontakt, i nærvær og fravær av proteinsynteseinhibitor, alikvoter av nevnte prøve eller eventuelt av lymfocytter direkte isolert fra nevnte prøve, med en fast fase under betingelser som tillater lymfocyttene å produsere og utskille antistoffer; b) detektere i løsning, binding av antistoff tii nevnte antigen(er) på den faste fasen; og c) sammenligne nevnte antistoffbinding i nærvær eller fravær av proteinsynteseinhibitor, for derved å oppnå en bestemmelse av mengden av aktiv antistoff utskillelse som respons på nevnte antigen(er).

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte faste fase bærer ett eller flere antigener som gjenkjennes av antistoffet eller antistoffene som skal detekteres.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte faste fase bærer ett eller flere antistoffer som gjenkjenner antistoffet eller antistoffene som skal detekteres.

4. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 3, karakterisert ved at nevnte blodprøve for anvendelse i fremgangsmåten eller for preparering av lymfocytter for anvendelse i fremgangsmåten, har et volum på mindre enn 1 ml.

5. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 4, karakterisert ved at fremgangsmåten utføres på blodprøver fra nyfødte eller småbarn for å skille mellom nylig syntetiserte antistoffer og passivt overførte antistoffer fra mor.

6. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 5, karakterisert ved at nevnte blodprøve oppnås ved rensing og anrikelses-prosedyrer av blod tappet direkte fra pasienten.

7. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 6, karakterisert ved at lymfocyttene direkte isolerte fra nevnte prøve anvendes i fremgangsmåten.

8. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 7, karakterisert ved at man før kontakttrinnet i krav 1 blokkerer den faste fasen.

9. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 8, karakterisert ved at proteinsynteseinhibitoren er cykloheximid anvendt i en konsentrasjon på 50-500 ug/ml.

10. Fremgangsmåte ifølge ethvert åv kravene 1 til 9, karakterisert ved at ATPase-inhibitor anvendes sammen med proteinsynteseinhibitoren.

11. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1. til 10, karakterisert ved at detekteringstrinnet i krav 1 utføres med en immunoanalyse.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at immunoanalysen er ELISA.

13. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 3 til 12, karakterisert ved at et eller flere antigener gjenkjent av antistoffet eller antistoffene som skal detekteres immobilisert på den faste fasen kontaktes med nevnte faste fasen.

14. Fremgangsmåte ifølge kravene 2 og 4 til 12, karakterisert ved at et eller flere antistoffer som gjenkjenner antistoffet eller antistoffene immobilisert på den faste fasen kontaktes med nevnte faste fase.

15. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 14, karakterisert ved at et løselig substrat anvendes i detekteringstrinnet i krav 1 og medfører et spektrofotometrisk detekterbart signal.

16. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 15, karakterisert ved at et negativt kontrollantigen anvendes.

17. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 16, karakterisert ved at aktiv antistoffproduksjon for Herpes virus detekteres.

18. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 2 og 4 til 17, karakterisert ved at multiple faste faser anvendes hvor hver bærer forskjellige målantigener.

19. Fremgangsmåte for detektering av tilstedeværelsen av ikke-spesifikke infeksjonsindikatorer i en blodprøve, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter: bringe i kontakt, i nærvær eller fravær av proteinsynteseinhibitor, alikvoter av nevnte prøve eller eventuelt av lymfocytter direkte isolert fra nevnte prøve, med en fast fase under betingelser som tillater lymfocyttene å produsere og utskille infeksjonsindikatorer; detektere i løsning, binding av infeksjonsindikatorer til en bindingspartner på den faste fasen ; og sammenligne binding av nevnte infeksjonsindikator i nærvær og fravær av proteinsynteseinhibitor, for derved å oppnå en bestemmelse av mengden av infeksjonsindikatorer i nevnte prøve.