RU1780006C - Способ диагностики туберкулеза - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к области медицины и биологии, а именно к способам определени  микобактерий туберкулеза. Целью изобретени   вл етс  ускорение способа и повышение чувствительности диагностики. В среде дл  культивировани  микобактерий после посева мокроты, методом непр мого иммуноферментного анализа в сроки 1-3 недели определ ют антигены микобактерий туберкулеза с помощью моно- клональных антител МГ-1 и антител из ги- периммуных сывороток к микобактери м туберкуле за штамма H37RV, Дл  этого на полистироловые 96-луночные планшеты нанос т моноклональные антитела, затем смыв с питательной среды, на которую была посе на мокрота больного, затем антитела из гипериммунной сыворотки к микобактери м туберкулеза, реакцию про вл ют антителами против глобулинов кролика, меченными пероксидазой хрена и истощенными на глобулинах мыши! После добавлени  ортофенилендиамина с перекисью водорода измер ют оптическую плотность окрашенного раствора при длине волны 492 нм. Превышение оптической плотности на 0.2 единицы и больше по сравнению с контролем считают положительной реакцией. По сравнению с прототипом сокращаютс  сроки диагностики туберкулеза в среднем в 2 раза, 1 табл.

Description

Изобретение относитс  к области медицины и биологии, а именно, к способам определени  микобактерий туберкулеза.

Прототипом данного метода  вл етс  определение микобактерий в мокроте бактериоскопическим и бактериологическим методами.

Однако при массовом исследовании бактериоскопический метод дает только 40 ,60% положительных результатов, а результаты бактериологического исследовани  (посева) бывают положительными только у половины бопьных с положитепьным результатом бактериоскопии и лишь у 10-20% с отрицательным результатс)м. При этом положительные результаты посева удаетс  получить в сроки от 2-Зх недель (50% среди положительных результатов посева) - до 2-х мес цев.

Целью изобретени   вл етс  ускорение способа и повышение чувствительности диагностики туберкулеза.

Способ осуществл ют следующим образом ,

В среде дл  культивировани  микобактерий методом непр мого твердофазного, иммуноферментного анализа (ИФА) в сроки 1-3 недели определ ют антиген микобактерий с помощью моноклональных антител МТ-1 и антител из гипериммунных сывороТОК к микобактери м туберкулеза вида human штамма H37RV. В качестве диагностических препаратов используют моноклональные антитела к антигену микобактерий МТ-1 (регистрационный № 488 Д во Всесоюзном банке клеточных культур) л глобулиновую фракцию, полученную ocaждeн /ie i сульфатом аммони  при 33% насыщении из гиперир1мунных сывороток к микобактери м туберкулеза штамма Н37Р. Дл  определени  микобактерий туберкулеза мокроту после обработки в щелочной среде заливают в количестве 0,2 мл на плотную питательную среду с добавлением жидкой питательной среды Школьникова с 10%ным содержанием плазмы. Культуральную Ж1у1дкость исследуют, начина  с 1-ой недели. При постановке МФА на полистироловые планшеты нанос т 25 мкл моноклональных антител MT-I в концентрации 100 мкг/мл, и /1нкубируют 1 ч в термостате при 37°С, затем от -1ывают трижды (50 мкл) забуфе)енн ы м ф и 3 и о л о г и ч е с к и м р а с т в о р о F.I с 0,05%-твина-20 (ЗФР-твин) и в течение 1 ч блокируют раствором ЗФР-твин с 0,5% бычьего сывороточного альбумина (ЗФРтвин-БСА ), после отмывани  ЗФР-твином (трижды по 50 мкл) в лунки нанос т по 25 мкл культуральной жидкости, инкубируют в течение 1 ч при 37°С и после отмывани  ЗФР-твином (трижды по 50 мкл) нанос т по 25 мкл глобулиновой фракции кроличьей гипериммунной сыворотки к микобактери м губеркулеза вида hurnanus, штамма Н37Р. После инкубации в течение 1 часа в термостате и отмывани  ЗФР-твином (трижды по 50 мкл нанос т по 25 мкл антител, против глобулинов кролика, и меченных пероксидазой хрена и истощенных на глобулинах мыши. После инкубации в течение часа в термостате и отмывани  ЗФР-твином (трижды по 50 мкл) реакцию про вл ют добавлением субстрата - 25 мкл ортофеН1илендиамина с перекисью водорода в цитратно-фосфатном буфере рН 5,0. Реакцию останавливают добавлением 25 мкл 1,25 Н серной кислоты. Реакцию оценивают спектрометрически при длине волны 492 нм.

Пример 1. Производ т забор мокроты и посев ее. Начина  с 1-ой недели, исследуiOT Культуральную жидкость на наличие микобактерий туберкулеза, сравнива  с отрицательным и положительным контролем. В качестве отрицательного контрол  используют Культуральную жидкость после посева

мокроты от больного хроническим бронхитом , в качестве положительного - стандарт спец ально отобранную Культуральную жидкость после посева мокроты от больного туберкулезом легких. Превышение уровн 

иммуноферментной реакции на 0,2 единицы оптической плотности и больше, чем в отрицательном контроле, свидетельствует о положительной реакции. Использование положительного контрол  необходимо дл 

проверки точности проведени  реакции.

Так, было обследовано 64 больных туберкулезом легких (инфильтративный и очаговый, впервые вы вленный) - окончательный диагноз был установлен на основе

комплекса клинико-лабораторных признаков и результатов лечени . Результаты сопоставлени  бактериологического и иммунологического исследований представлены в таблице.

Таким образом, предложенным способом было вы влено 49 случаев туберкулеза из 64-х, причем в срок 2 недели у 50% больных , по сравнению с 23% больных, вы вленных бактериологическим методом. У

больных хроническим бронхитом микобактерии в мокроте обнаружены не были.

Сопоставление результатов определени  микобактерий микробиологическим и иммуноферментным методами (исследованы культуры от 64 больных) приведено в таблице.

Claims (1)

1. Формула изобретени  Способ диагностики туберкулеза, включающий забор крови, высев ее на селективную среду, инкубирование с последующим вы влением бактерий туберкулеза, о т л и ч а ю, щ и и с   тем, что, с целью повышени  чувствительности способа и сокращени  времени диагностики, после инкубировани 

   производ т смыв, вы вл ют в нем антигены бактерий туберкулеза иммуноферментным методом с фиксированными на твердой подложке моноклональными антителами типа МГ-1 с вторичными антителами из гипериммунной сыворотки к микобактери м туберкулеза H37RV и при наличии антигена диагностируют туберкулез.