RU2196335C1 - Способ определения гетерогенных антигенов, сходных для микроорганизмов и органов человека и животного - Google Patents
Способ определения гетерогенных антигенов, сходных для микроорганизмов и органов человека и животного Download PDFInfo
- Publication number
- RU2196335C1 RU2196335C1 RU2001121413/14A RU2001121413A RU2196335C1 RU 2196335 C1 RU2196335 C1 RU 2196335C1 RU 2001121413/14 A RU2001121413/14 A RU 2001121413/14A RU 2001121413 A RU2001121413 A RU 2001121413A RU 2196335 C1 RU2196335 C1 RU 2196335C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antigens
- sorption
- human
- carrier
- microorganisms
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии. Способ обеспечивает повышение чувствительности и специфичности определения гетерогенных антигенов, сходных для микроорганизмов и органов человека или животного, а также ускорение исследования и возможность одновременного количественного определения общих анитигенных детерминант к нескольким микроорганизмам. Проводят сорбцию исследуемого материала фиксированной на носителе иммунной сывороткой и учет результатов реакции по образованию иммунного комплекса антиген-антитело. При этом в качестве носителя используют магноиммуносорбенты, сорбцию осуществляют перемешиванием магноиммуносорбентов с исследуемым материалом в течение 1-2 ч при 18-24oС и ведут учет количественных результатов реакции в присутствии специфических иммуноглобулинов, меченных соответствующими метками, одномоментно определяют общие антигены к нескольким видам бактерий без предварительного концентрирования.
Description
Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано в анализе и при производстве антигенных препаратов из органов человека или животного, а также при разработке тест-систем для диагностики особо опасных инфекций (ООИ).
Известен способ определения гетерогенных антигенов бактерий, сходных с группой АВО человека, заключающийся в выращивании бактерий, добавлении в их взвесь 1,5-2,0 гемагглютинирующей дозы соответствующей антиэритроцитарной сыворотки, инкубации смеси 15-20 мин при комнатной температуре, добавлении соответствующей группы эритроцитов человека и определении количества гетерогенных антигенов по отсутствию агглютинации [А. с. СССР N 1337102, А 61 К 39/02, on. 15.09.87, Бюл. N 34 ]. Способ недостаточно специфичен и чувствителен при низком содержании гетерогенных антигенов в крови человека.
Известен способ одновременного определения 2-х антигенов или антител в одном опыте иммуноферментного анализа [А.с. СССР N 1291155, А 61 К 39/00, G 01 N 33/535, oп. 23.02.87, Бюл. 7].
Согласно этому способу на полистироловую твердую фазу адсорбируют антиген (АГ) или антитело (AT), инкубируют с исследуемой пробой, содержащей АГ или AT, вносят смесь специфических конъюгатов соответственно АГ или AT со щелочной фосфатазой или пероксидазой, затем вносят хромогенный субстрат для щелочной фосфатазы или пероксидазы, колориметрически определяют концентрацию одного АГ или AT, затем твердую фазу отмывают и вносят хромогенный субстрат для пероксидазы, по оптической плотности которого определяют концентрацию второго АГ или AT.
Способ испытан при определении антигенной специфичности иммунного ответа in vitro супернатантов 5-дневных культур клеток селезенки мышей по линии СВА.
Недостатком способа является то, что при использовании в качестве твердой фазы полистирола для иммобилизации на нем АГ или AT возникают сложности в процессе иммуносорбции (длительность процесса, недостаточная адсорбционная емкость). Недостаточная концентрация АГ или AT ограничивает чувствительность ИФА. Повышение концентрации АГ или AT на твердой фазе приводит к адсорбции свободносвязанных клеток, которые элюируют на последующих этапах инкубирования и отмывки и тем самым снижают чувствительность и специфичность метода. Качество адсорбции зависит от температуры, рН, ионной силы, времени инкубации [Иммуноферментный анализ: современное состояние и тенденции развития. Обзорная информация. Серия. Медицинская генетика и иммунология. В.И.Покровский и др., вып.3, М., 1986, с.4-5, 39].
Известен способ определения чувствительности антигенного препарата для определения антикардиальных антител (АКА) [Пат. РФ N 20568862, А 61 К 39/385, oп. 27.03.96. Бюл. 9].
Антигенный препарат получали иммобилизацией концентрированного антигена из ткани сердца белой крысы путем полимеризации с акриламидом, метиленбисакриламидом и магнитным материалом. Препарат представляет 10% взвесь сферических гранул с размерами 10-100 мкм.
Чувствительность препарата определяли постановкой реакции иммунофлюоресценции с 40 сыворотками больных ревматизмом, АКА выявлены в 100% случаев, при этом титр АКА составлял в 95% случаев 1:40 - 1:320, а в 5% - 1:640. Такая высокая чувствительность обусловлена повышенной концентрацией антигена в иммобилизованном препарате.
Наиболее близким к заявленному является способ определения гетерогенных антигенов, сходных для возбудителей ООИ и тканей человека и животного [ Бочко Т. М., Некляев В.Н., Ефременко В.И. К методике получения фракции Y.pestis, содержащей гетерогенные антигены. //Лабораторное дело, 9, 1979, с. 554-555].
Целесообразность исследования таких антигенов обоснована тем, что экспериментально установлены общие антигенные детерминанты тканей человека и животного со многими микроорганизмами, в том числе возбудителями ООИ, например чумы и холеры.
Из препарата, полученного из эритроцитов человека, выделяли гетерогенную антигенную фракцию путем сорбции антигена из клеток человека фиксированными антителами против Y. pestis на основе полиакриламидного геля с последующим элюированием фракции и ее концентрированием. Определение гетерогенных антигенов осуществляли в реакции преципитации по Оухтерлоне. Путем последовательного внесения в гель иммунной сыворотки против Y.pestis и исследуемой фракции гетерогенных антигенов с последующим инкубированием при 37oС в течение 24-48 часов. Учет результатов реакции проводили по наличию или отсутствию полос преципитации.
С иммунологической точки зрения способ определения антигенов представляет сорбцию исследуемого материала фиксированной в геле противомикробной сывороткой с последующим учетом результата реакции по образованию иммунного комплекса АГ-АТ - полосы преципитации.
Способ недостаточно чувствителен при низкой концентрации антигенов в исследуемом материале, длителен, не предусматривает количественного определения антигенов, сложен при необходимости одновременного определения общих антигенных детерминант к нескольким микроорганизмам.
Технической задачей изобретения является повышение чувствительности и специфичности, ускорение способа и обеспечение возможности одновременного количественного определения общих антигенных детерминант к нескольким микроорганизмам.
Решение технической задачи достигается тем, что в способе определения гетерогенных антигенов, сходных для микроорганизмов и органов человека и животных, основанном на сорбции исследуемого материала фиксированной на носителе иммунной сывороткой и учете результатов реакции по образованию иммунного комплекса антиген-антитело, в качестве носителя используют магноиммуносорбенты, при этом сорбцию осуществляют перемешиванием магноиммуносорбентов с исследуемым материалом в течение 1-2 часов при 18-24oС и ведут количественный учет результатов реакции в присутствии специфических иммуноглобулинов, меченных соответствующими метками, одномоментно определяют общие антигены к нескольким видам бактерий без предварительного концентрирования.
По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки.
Использование магноиммуносорбентов в качестве носителя в процессе иммунной сорбции антигенов обеспечивает высокую сорбционную емкость и селективное концентрирование на них антигенов даже при их низкой концентрации, сокращение времени иммуносорбции и образование иммунного комплекса АГ-АТ с 20 до 2 часов.
Наличие в настоящее время высокоспецифичных магноиммуносорбентов и приспособлений для манипуляций с ними значительно упрощает процедуру одномоментного дифференциального, качественно-количественного определения антигенных детерминант в присутствии специфических иммуноглобулинов, меченных соответствующими метками для иммунофлюоресцентного и иммуноферментного анализов.
Совокупность селективного концентрирования антигенов высокоспецифическими магноиммуносорбентами и возможность использования современных методов анализа обеспечивают высокую чувствительность и специфичность заявляемого способа и технический результат изобретения.
Возможность практического использования заявляемого способа подтверждается примером его конкретного выполнения.
Пример. При проведении иммунофлюоресцентного анализа с магноиммуносорбентными диагностикумами применяется метод количественной иммунофлюоресценции (КИФА). Прибором, регистрирующим уровень свечения магнитных гранул, служит люминесцентный микроскоп ЛЮМАМ Р-8, оборудованный фотометрической насадкой типа ФМЭЛ-14. К насадке подсоединяют источник тока УБПВ-1 и вольтметр цифровой универсальный типа В7-76. Рабочее напряжение составляет 800-900В, увеличение объектива и окуляра •10. Применяются возбуждающие светофильтры БС-8-2, С3С-7-2, ФС-1-6, диаметр зонда фотометрической насадки 0,5 мм.
К 50 мкл 10% взвеси магноиммуносорбента добавляют 250 мкл полученных антигенных детерминант из органов человека и морской свинки (печень, легкое, селезенка), инкубируют в течение 20-30 мин в термостате при (24±1)oС.
Затем гранулы отмывают 5-6 раз физиологическим раствором и 1 раз дистиллированной водой, фиксируя постоянным магнитом, вносят 250 мкл диагностических люминесцирующих иммуноглобулинов в рабочем разведении. Выдерживают при температуре (24±1)oС 20-30 мин и отмывают вышеуказанным способом. Одновременно проводят контроль: гранулы магноиммуносорбента, не контактировавшие с антигенными детерминантами, контактировавшие с нормальной кроличьей сывороткой (НКС) и бычьим сывороточным альбумином (БСА), окрашивают диагностическими люминесцирующими иммуноглобулинами и отмывают аналогично опыту. Исследуемые опытные и контрольные взвеси в объеме 20 мкл наносят на предметное стекло и помещают на столик микроскопа. После обнаружения в поле зрения гранул сорбента закрывают полевую диафрагму и снимают цифровые показания уровня свечения 10-15 гранул на вольтметре. Определяют среднеарифметические значения величины флюоресценции опытных и контрольных гранул и пространства между ними - фона. Интенсивность люминесценции магноиммуносорбента (М) представляет собой разницу между среднеарифметическими показателями уровня свечения гранул и фона: (М)=Мгранул - Мфона. Положительными считали результаты, при которых уровень флюоресценции опытных гранул в 1,5 и более раз превышал аналогичный показатель контрольных гранул.
Claims (1)
- Способ определения гетерогенных антигенов, сходных для микроорганизмов и органов человека или животного, включающий сорбцию исследуемого материала фиксированной на носителе иммунной сывороткой и учет результатов реакции по образованию иммунного комплекса антиген - антитело, отличающийся тем, что в качестве носителя используют магноиммуносорбенты, сорбцию осуществляют перемешиванием магноиммуносорбентов с исследуемым материалом в течение 1-2 ч при 18-24oС и ведут учет количественных результатов реакции в присутствии специфических иммуноглобулинов, меченных соответствующими метками, одномоментно определяют общие антигены к нескольким видам бактерий без предварительного концентрирования.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2001121413/14A RU2196335C1 (ru) | 2001-07-30 | 2001-07-30 | Способ определения гетерогенных антигенов, сходных для микроорганизмов и органов человека и животного |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2001121413/14A RU2196335C1 (ru) | 2001-07-30 | 2001-07-30 | Способ определения гетерогенных антигенов, сходных для микроорганизмов и органов человека и животного |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2196335C1 true RU2196335C1 (ru) | 2003-01-10 |
Family
ID=20252222
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2001121413/14A RU2196335C1 (ru) | 2001-07-30 | 2001-07-30 | Способ определения гетерогенных антигенов, сходных для микроорганизмов и органов человека и животного |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2196335C1 (ru) |
-
2001
- 2001-07-30 RU RU2001121413/14A patent/RU2196335C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
БОЧКО Т.М. и др. К методике получения фракции Y. pestis, содержащей гетерогенные антигены. - Лабораторное дело, 1979, № 9, с.554-555. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4332783A (en) | Process for immunologic determination tests | |
US4294817A (en) | Method of fluoro immunoassay | |
US4407943A (en) | Immobilized antibody or antigen for immunoassay | |
US6916626B1 (en) | Detection of Candida | |
DK160108C (da) | Fremgangsmåde og udstyr til direkte eller indirekte påvisning af reaktion mellem et specifikt bindingsmiddel og den tilsvarende acceptorsubstans | |
DK174032B1 (da) | Sæt samt fremgangsmåde til immunometrisk dosering, der kan anvendes på hele celler | |
JPH0795065B2 (ja) | 水不溶性試薬、それを含む要素及びその使用方法 | |
JP2011257243A (ja) | 試料中のc反応性蛋白質の測定試薬、測定方法及び測定範囲の拡大方法 | |
GB1597345A (en) | Diagnostic immunochemical test materials and procedure | |
US4582699A (en) | Assay of immunoglobulin A protease and the rapid diagnosis of gonorrhea | |
RU2196335C1 (ru) | Способ определения гетерогенных антигенов, сходных для микроорганизмов и органов человека и животного | |
JPWO2004048975A1 (ja) | 黄色ブドウ球菌の検査方法 | |
JPS60177265A (ja) | 抗体の免疫グロブリンのクラス別検出法 | |
EP0217845A1 (fr) | Procede de determination immunologique d'une substance biologique dans un echantillon. | |
CN112129933B (zh) | 一种免疫分析系统中抗生物素干扰的试剂、试剂盒及方法 | |
EP0196873A2 (en) | Diagnostic testing for micro-organisms | |
JPH02503951A (ja) | アッセイ | |
EP0152254A2 (en) | Chromogenic support immunoassay utilizing labeled complement components | |
EP0233048B1 (en) | Method of detecting urinary tract infection or inflammation | |
JP2000088854A (ja) | 微生物(細菌,眞菌,ウイルス,産生物質)の高感度な免疫 学的検出測定法および定量方法 | |
JPWO2004048976A1 (ja) | 黄色ブドウ球菌の検査方法 | |
JPH08193999A (ja) | 免疫測定法 | |
JP3536191B2 (ja) | ヒトラクトフェリンの分析方法、感染症のスクリーニング方法及びスクリーニング用キット | |
RU2582941C1 (ru) | Композитный чумной антигенный f1-диагностикум для индикации специфических антител | |
JPH07113641B2 (ja) | 梅毒診断試薬の製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20030731 |