JPWO2004048976A1

JPWO2004048976A1 - 黄色ブドウ球菌の検査方法

Info

Publication number: JPWO2004048976A1
Application number: JP2004555007A
Authority: JP
Inventors: 俊伸堀井; 明近藤; 剛史菅野; 真人前川
Original assignee: 第一化学薬品株式会社
Priority date: 2002-11-22
Filing date: 2003-11-21
Publication date: 2006-03-23
Also published as: WO2004048976A1; EP1580558A4; US20060024765A1; AU2003284636A1; EP1580558A1

Abstract

本発明は、検体中の黄色ブドウ球菌を検査する方法であって、免疫学的測定法により、黄色ブドウ球菌が産生するＤＮａｓｅを、該菌を培養することなく直接検出又は定量することを特徴とする黄色ブドウ球菌の検査方法、該検査方法により検体中の黄色ブドウ球菌を検査するための検査キットに関する。これを用いることにより、検体中の黄色ブドウ球菌を、培養することなく、短時間で且つ感度よく検査することができる。

Description

本発明は、検体中の黄色ブドウ球菌を培養することなく直接検査する方法に関する。

黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ，Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、グラム染色で陽性を呈し、顕微鏡下で不規則なブドウの房状を呈するブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する細菌で、各種の毒素や酵素を産生し、ヒトや哺乳動物に化膿性疾患を惹起する主要な病原性細菌である。また、ヒトの食中毒の原因となる代表的菌種でもある。
黄色ブドウ球菌の検出は、選択分離培地を用いて前培養を行い、疑わしいコロニーを拾って、菌鑑別のための同定試験を行う培養法が従来から多用され、菌の同定試験は、黄色ブドウ球菌がヒト又はウサギ血漿を凝固させるコアグラーゼという酵素を産生することを利用し、当該酵素の産生能の有無を調べることにより、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ｃｏａｇｕｌａｓｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ，ＣＮＳ）と区別することにより行われている。
また、通常黄色ブドウ球菌はＤＮａｓｅを産生するが、ＣＮＳはこれを産生しないことから、両者の鑑別には、上記コアグラーゼに次いでＤＮａｓｅ試験が利用されている。ＤＮａｓｅ試験は、ＤＮＡ平板培地に菌を画線塗沫し、一夜培養後１．５Ｎの塩酸を添加し、ＤＮＡが存在すると白濁するが、ＤＮａｓｅにより分解が起こると菌苔周辺に白濁しない部分ができることによって、黄色ブドウ球菌を判定するものである。
しかし、斯かる従来法は、いずれも菌の培養が必要であり、細菌の同定には長時間を要し、同定結果がでた時点では、既に患者の様態が悪化しており、同定結果が意味をなさないことが多い。また、多量の抗菌薬を投与している患者では微量の細菌が血液中に存在していても検出されない可能性もある。更に前者の方法においては、当該培養条件にて、ブドウ球菌以外の雑菌が生育することがある。
また、菌を前培養した後、培養上清中のＤＮａｓｅを酵素免疫測定法により測定することによって、判定までの時間の短縮化と黄色ブドウ球菌の特異的な検出方法も考案されているが（Ｂｒａｋｓｔａｄら、ＡＰＩＭＳ９７，Ｐ．１６６−１７４（１９８９）、Ｂｒａｋｓｔａｄら、ＡＰＩＭＳ１０３，Ｐ．２０９−２１８（１９９５））、これによって菌の同定のための純培養は不要となるものの、検出感度を上げるために前培養が必要であることには変わりがない（検出限界０．４ｎｇ／ｍＬ以上）。また、蛍光法による酵素免疫測定法も考案されているが、検出限界は１ｎｇ／ｍＬである（Ｍｅｙｒａｎｄら、ＬｅｔｔＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ２９，Ｐ．２１６−２２０（１９９９））。
一方、迅速かつ高感度に細菌感染を検出する方法として、遣伝子増幅法（加藤郁之進、蛋白質・核酸・酵素、Ｖｏｌ．３５，ｐ．２９５７（１９９０））も試みられているが、黄色ブドウ球菌は常在菌の一つであるため、外部から微量の細菌遺伝子が混入することによって、非感染者においても陽性判定される恐れが多く、黄色ブドウ球菌のような常在菌による感染症の判定には問題がある。
他方、ＭＲＳＡ（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）は、黄色ブドウ球菌の中でも病院感染の原因菌として特に注目されており、簡易迅速に同定することは重要である。従来、ＭＲＳＡの同定は、臨床材料から分離された菌について培養試験で薬剤感受性を見ることによって行われていたが、近年、ＭＲＳＡの薬剤耐性に関与しているｍｅｃＡ遺伝子を検出することによって、感受性試験の結果を待たずに、ＭＲＳＡの判定を行える方法が遺伝子増幅法を応用して開発され（生方ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３０，Ｐ．１７２８−１７３３（１９９２））、すでに実用化されている。
しかし、ｍｅｃＡ遺伝子は黄色ブドウ球菌だけでなく他のブドウ球菌（ＣＮＳ）でも有していることがあり、ｍｅｃＡ遺伝子の検出ではＭＲＳＡとＣＮＳが明確に区別できないという問題があった。

本発明は、検体中の黄色ブドウ球菌を、培養することなく、短時間で且つ感度よく検査するための方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、検体中の黄色ブドウ球菌の迅速な検査法に関して、鋭意検討したところ、黄色ブドウ球菌が特異的に産生するＤＮａｓｅに対する抗体を用いた高感度且つ高精度な免疫学的測定法を行うことによって、黄色ブドウ球菌に感染した患者の血液、尿、喀痰、髄液、胸水、腹水、膿等の体液成分中に存在するＤＮａｓｅ抗原を、菌を培養することなく直接検出又は定量でき、検体中の黄色ブドウ球菌が迅速に検査できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、検体中の黄色ブドウ球菌を検査する方法であって、免疫学的測定法により、黄色ブドウ球菌が産生するＤＮａｓｅを、該菌を培養することなく直接検出又は定量することを特徴とする黄色ブドウ球菌の検査方法を提供するものである。
また本発明は、当該検査方法により検体中の黄色ブドウ球菌を検査するためのキットであって、少なくともＤＮａｓｅに対する抗体及び標識体を検出する試薬を含有する検査キットを提供するものである。
本発明によれば、体液成分中の黄色ブドウ球菌を、培養することなく直接検査することができ、簡易且つ迅速に黄色ブドウ球菌感染症の有無を検査することができる。また、黄色ブドウ球菌がＭＲＳＡであっても、感染症の有無を検査することができる。

図１は、サンドイッチ酵素免疫測定法１によって測定した精製ＤＮａｓｅの標準曲線を示した図である。
図２は、サンドイッチ酵素免疫測定法２によって測定した精製ＤＮａｓｅの標準曲線を示した図である。
図３は、サンドイッチ酵素免疫測定法３によって測定した精製ＤＮａｓｅの標準曲線を示した図である。
図４は、培養上清中のＤＮａｓｅ量を経時的に測定した図である。
図５は、健常人の血清（３人）及び黄色ブドウ球菌感染患者の血中（８人）及び尿中（４人）のＤＮａｓｅを測定した図である。

本発明の黄色ブドウ球菌の検査方法は、検体中における黄色ブドウ球菌が産生するＤＮａｓｅを免疫学的測定法により直接検出するものである。
従って、検体（被検試料）の前培養や、遠心法、カラム分離法、沈殿法等によって検体中のＤＮａｓｅを濃縮する操作は必要としない。
尚、黄色ブドウ球菌とは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓを意味し、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）も包含する。
本発明に用いる検体としては、黄色ブドウ球菌が存在しうる生体試料であればいずれのものでもよく、例えば血液、尿、喀痰、髄液、胸水、腹水、膿等の体液成分等が挙げられる。すなわち、喀痰、尿等の菌濃度が高いものだけでなく、血液、胸水、腹水等の菌濃度が低い（例えば、１０〜１０^３ｃｆｕ／ｍＬ）ものであっても、被検試料の前培養や被検試料中のＤＮａｓｅを濃縮する操作をすることなく、直接検出又は定量することが可能である。
尚、検体はそのまま用いるだけでなく、リン酸緩衝液等の緩衝液で希釈したものを用いてもよく、斯かる検体の希釈用緩衝液には、抗原を安定化するために、適当な蛋白、例えばＢＳＡ、ＨＳＡ、ゼラチン等の蛋白を共存させることができる。
本発明における免疫学的測定法としては、黄色ブドウ球菌が産生するＤＮａｓｅが１００ｐｇ／ｍＬ以下まで、より好ましくは１０ｐｇ／ｍＬ以下まで測定できる高感度な方法であれば特に限定されず、酵素免疫測定法、放射標識免疫測定法（ラジオイムノアッセイ）、イムノクロマト法、蛍光免疫測定法等の公知の免疫学的測定法が使用できるが、特に安全性及び感度の点から酵素免疫測定法が好ましい。
酵素免疫測定法は、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等の酵素を用いた酵素標識抗体の酵素活性を検出することにより、相関性を有する抗体又は抗原の量を測定するものであるが、当該酵素活性を検出する方法により比色法、蛍光法、化学発光法（化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ））が知られている。比色法は、過酸化水素／ｏ−フェニレンジアミン、ｐ−ニトロフェニルリン酸、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等の酵素基質の酵素による分解反応に伴い生成する発色性物質の発色量を測定して酵素活性を定量するものであり、蛍光法は、酵素の触媒活性により、４−ヒドロキシフェニル酢酸、４−メチルウムベリフェリルリン酸、４−メチルウムベリフェリル−β−ガラクトシド等の蛍光基質を分解して蛍光を発生させた後、この蛍光強度を測定して酵素活性を定量するものである。そして、化学発光法（ＣＬＥＩＡ）は、酵素の触媒活性によって化学発光物質が励起状態となり、この状態から基底状態に戻る際に放出される発光量を測定して酵素活性を定量するものである。本発明においては、このうち、化学発光性物質を発光させるため光源が不要であり、比色法及び蛍光法を上回る高感度な検出が可能である化学発光酵素免疫測定法を用いるのが特に好ましい。
ＣＬＥＩＡに用いられる酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素等が挙げられ、化学発光物質としては、ルミノール誘導体、イソルミノール誘導体等のルミノール類、ルシゲニン（Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムナイトレート）、ビス（２，４，６−トリクロロフェニル）オキザレート等が挙げられ、このうち、ルミノール／過酸化水素の基質とペルオキシダーゼとの組み合わせが好ましい（辻章夫ら、蛋白質・核酸・酵素、別冊Ｖｏｌ．３１、ｐ．５１−６３（１９８７））。そして、必要があればＤ−（−）−ルシフェリン、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、ｐ−ヨードフェノール等を化学発光反応系に共存させることによって、その発光を増発光させることができる。
本発明の免疫学的測定法は、測定手段もまた特に限定されるものでなく、競合法又はサンドイッチ法の何れでもよいが、高感度な測定が可能なことから、サンドイッチ法が好ましい。
以下に、サンドイッチ法を用いる場合の黄色ブドウ球菌の検査方法の一例を具体的に説明する。
１）適当な固相担体の表面に黄色ブドウ球菌が産生するＤＮａｓｅに対する抗体を吸着固定する。
２）該抗体と黄色ブドウ球菌を含有する検体とを接触せしめ、検体中の黄色ブドウ球菌が産生するＤＮａｓｅを固相担体に固定された抗ＤＮａｓｅ抗体と特異的に結合させ、検体中のＤＮａｓｅを固相担体に固定する。
３）ＤＮａｓｅが固定された担体を、標識されたＤＮａｓｅに対する抗体（二次抗体）を含有する溶液と接触せしめ、当該二次抗体を、固定化抗ＤＮａｓｅ抗体及びＤＮａｓｅを介して、固相担体に結合させる。
４）固定された二次抗体を二次抗体の標識体に応じて測定することにより、検体中のＤＮａｓｅを検出又は定量する。
本発明検査方法において用いられるＤＮａｓｅに対する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよく、精製抗原を用いて、公知の方法により調製することにより得ることができる。
二次抗体は、抗体をそのまま用いることも可能であるが、より好ましくは非特異反応を可能なかぎり軽減する目的で、上記の他、抗体をペプシン等の酵素処理や還元処理して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２などの抗体断片を用いることもできる。また一次抗体及び二次抗体の組み合わせとしては、異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体又は抗体フラグメントの組み合わせでもよく、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体又は抗体フラグメントの組み合わせでもよい。
一次抗体の固相化に用いられる固相担体としては、ガラス製やプラスチック製のチューブ、プレート、ウェル又はビーズ、磁性粒子、ラテックス、膜、繊維等、特に限定されるものではない。
固相化の方法としては、物理吸着法のほか、グルタールアルデヒド、カルボジイミド等の各種架橋剤による化学結合法を用いることができる。例えば、抗体をリン酸緩衝液で希釈した後、これを固相担体の表面に接触させ、３７℃にて６０分間インキューベートすればよい。
二次抗体の標識は、放射性同位元素、酵素、ビオチン、蛍光物質、化学発光物質、金コロイド、ラテックス、フェライト粒子等で直接標識すればよいが、上述したように、安全性が高く、良好な測定結果が期待できる点から酵素標識するのが好ましい。好適な標識酵素としては、安定性に優れ、酵素活性が測定しやすいペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ等が挙げられる。
結合された二次抗体の検出又は定量は、任意の公知の方法に従って行うことができる。例えば、酵素、発光体、蛍光体等で標識された二次抗体自体を、直接検出または測定することも可能であるし、二次抗体に対して特異的な三次抗体を用い、この三次抗体を種々の方法により標識しておき、三次抗体の標識を検出又は定量することもできる。
好適な検出法としては、上述のとおり、酵素標識された二次抗体に対して、当該その酵素に特異的な基質（発色基質、蛍光基質、化学発光基質）を反応させ、発色、蛍光、発光等を生じさせてそのシグナルを測定機器で検出する方法が挙げられ、特に高感度検出が可能な化学発光基質を用いる方法が好ましい。
本発明の黄色ブドウ球菌感染症の検査用キットは、上記の検体中の黄色ブドウ球菌の検査方法を実施するためのキットであり、少なくとも上記のＤＮａｓｅに対する抗体（用いる免疫学的測定法がサンドイッチである場合には２種類の抗体）の他、酵素等の標識体を検出する試薬を含み、必要に応じて検体の希釈緩衝液、各種の試薬希釈用緩衝液、洗浄液等を含むものである。

以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

（１）一次抗体固相化プレートの作製
ウサギ又はヒツジ抗ＤＮａｓｅポリクローナル抗体を１５０ｍＭＮａＣｌ含有２５ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で、２μｇ／ｍＬに希釈したものを５０μＬ／ウェルずつプレートへ入れ、４℃で一晩放置し抗体の固相化を行った。翌日、プレートから内容物を除去後、０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳ溶液（０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳ）を２８０μＬ／ウェルずつ加え、４℃で一晩以上放置した。使用時には、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ溶液（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄したものを反応に供した。
（２）ビオチン化二次抗体の作製
ヒツジ抗ＤＮａｓｅポリクローナル抗体５００μＬ（１ｍｇ／ｍＬ）を０．１Ｍ炭酸水素ナトリウムで透析した。抗体液を攪拌しながら、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）０．０５ｍｇを５０μＬの同炭酸緩衝液に溶解したものを滴下した。室温で４時間攪拌後、４℃でＰＢＳ中に一晩透析したものをビオチン化二次抗体として使用した。

（１）サンドイッチ酵素免疫測定法によるＤＮａｓｅの測定１
実施例１の（１）で調製したヒツジ抗ＤＮａｓｅポリクローナル抗体を固相化したマイクロタイタープレートに０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳで０．１、１、１０、１００ｎｇ／ｍＬに希釈した精製ＤＮａｓｅ（ＴｏｘｉｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を５０μＬ／ウェルずつ加える。室温で１時間反応後、各ウェルをＰＢＳ−Ｔで洗浄する。二次抗体として、ウサギ抗ＤＮａｓｅポリクローナル抗体を０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳで２μｇ／ｍＬに希釈したものを５０μＬ／ウェルずつ加える。次いで、室温で１時間反応後、各ウェルをＰＢＳ−Ｔで洗浄する。更に、ＨＲＰ標識ブタ抗ウサギＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ社製）を０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳで４０００倍希釈し、５０μＬ／ウェルずつ加え、室温で１時間反応させる。洗浄後、２ｍｇ／ｍＬオルトフェニレンジアミンと９．５ｍＭ過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ５を５０μＬ／ウェルずつ加え、室温で３０分間反応を行った後、１．５Ｎ硫酸５０μＬ／ウェルずつ加え反応を停止し、ＥＬＩＳＡ用プレートリーダーを用いて、波長４９２ｎｍで測定を行った。
得られた標準曲線を図１に示す。ＤＮａｓｅ濃度０．１から１００ｎｇ／ｍＬの範囲で測定可能であった。
（２）サンドイッチ酵素免疫測定法によるＤＮａｓｅの測定２
実施例１の（１）で調製したウサギ抗ＤＮａｓｅポリクローナル抗体を固相化したマイクロタイタープレートに０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳで０．１、１、１０、１００、１０００ｎｇ／ｍＬに希釈した精製ＤＮａｓｅを５０μＬ／ウェルずつ加える。室温で１時間反応後、各ウェルをＰＢＳ−Ｔで洗浄する。二次抗体として、実施例１の（２）で調製したビオチン化ヒツジ抗ＤＮａｓｅポリクローナル抗体を０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳで３μｇ／ｍＬに希釈したものを５０μＬ／ウェルずつ加える。次いで、室温で１時間反応後、各ウェルはＰＢＳ−Ｔで洗浄する。更に、アビジン化ＨＲＰ（Ｚｙｍｅｄ社製）を０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳで４０００倍希釈し、５０μＬ／ウェルずつ加え、室温で１時間反応させる。洗浄後、２ｍｇ／ｍＬオルトフェニレンジアミンと５．９ｍＭ過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ５を５０μＬ／ウェルずつ加え、室温で３０分間反応を行った後、１．５Ｎ硫酸５０μＬ／ウェルずつ加え反応を停止し、ＥＬＩＳＡ用プレートリーダーを用いて、波長４９２ｎｍで測定を行った。
得られた標準曲線を図２に示す。ＤＮａｓｅ濃度０．１から１００ｎｇ／ｍＬの範囲で測定可能であった。
（３）サンドイッチ酵素免疫測定法によるＤＮａｓｅの測定３
ウサギ抗ＤＮａｓｅポリクローナル抗体を固相化した白色マイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳで１、１０、１００、１０００ｐｇ／ｍＬに希釈した精製ＤＮａｓｅを５０μＬ／ウェルずつ加える。室温で１時間反応後、各ウェルをＰＢＳ−Ｔで洗浄する。二次抗体として、実施例１の（２）で調製したビオチン化ヒツジ抗ＤＮａｓｅポリクローナル抗体を０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳで３μｇ／ｍＬに希釈したものを５０μＬ／ウェルずつ加える。次いで、室温で１時間反応後、各ウェルをＰＢＳ−Ｔで洗浄する。更に、アビジン化ＨＲＰを０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳで４０００倍希釈し、５０μＬ／ウェルずつ加え、室温で１時間反応させる。洗浄後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＥＬＩＳＡＦｅｍｔｏＳｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を１００μＬ／ウェルずつ加え、ルミノメーターで１０秒間の発光量を積算した。
得られた標準曲線を図３に示す。ＤＮａｓｅ濃度１〜１０００ｐｇ／ｍＬの範囲で測定可能であった。
実施例３培養上清中のＤＮａｓｅ量の経時的測定
黄色ブドウ球菌の標準株（ＮＣＴＣ８３２５）の一夜培養液８０μＬをｈｅａｒｔ−ｉｎｆｕｓｉｏｎｂｒｏｔｈ１０ｍＬに加え培養する。その後、経時的に１ｍＬずつ採取し、２分間遠心分離して上清を取り、０．２μｍのフィルターろ過したものをサンプルとして測定するまで、−３０℃に保存した。菌の増殖に応じたＤＮａｓｅ分泌量を測定するため、前記サンプルを０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳで１００から５０００倍に希釈して、ＥＬＩＳＡ法で測定した。
結果を図４に示す。その結果、菌の増殖フェイズに応じたＤＮａｓｅの産生量の増加が確認できた。
実施例４患者血清及び尿中のＤＮａｓｅの測定
実施例２の（３）の方法に従って黄色ブドウ球菌感染患者及び健常人の血清及び尿中のＤＮａｓｅを測定した結果を図５に示す。健常人の血清中にはＤＮａｓｅが検出されないのに対し、感染患者の血清及び尿中にはＤＮａｓｅの存在が確認された。

Claims

検体中の黄色ブドウ球菌を検査する方法であって、免疫学的測定法により、黄色ブドウ球菌が産生するＤＮａｓｅを、該菌を培養することなく直接検出又は定量することを特徴とする黄色ブドウ球菌の検査方法。
免疫学的測定法が酵素免疫測定法である請求項１記載の検査方法。
免疫学的測定法が化学発光酵素免疫測定法である請求項１記載の検査方法。
化学発光酵素免疫測定法が、標識酵素としてペルオキシダーゼ、化学発光物質としてルミノール類を用いるものである請求項３記載の検査方法。
検体が体液成分である請求項１〜４のいずれか１項記載の検査方法。
黄色ブドウ球菌がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌である請求項１〜５のいずれか１項記載の検査方法。
請求項１〜６のいずれか１項記載の検査方法によって検体中の黄色ブドウ球菌を検査するためのキットであって、少なくともＤＮａｓｅに対する抗体及び標識体を検出する試薬を含有する検査キット。